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▶ ユーシービー バイオファルマ エスピーアールエルの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-26
(54)【発明の名称】細胞培養方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240318BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240318BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240318BHJP
C12N 1/00 20060101ALN20240318BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
C12P21/02
C12P21/02 H
C12P21/02 K
C12P21/08
C12N1/00 B
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023563022
(86)(22)【出願日】2022-04-13
(85)【翻訳文提出日】2023-12-12
(86)【国際出願番号】 EP2022059903
(87)【国際公開番号】W WO2022219059
(87)【国際公開日】2022-10-20
(31)【優先権主張番号】2105424.2
(32)【優先日】2021-04-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514232085
【氏名又は名称】ユーシービー バイオファルマ エスアールエル
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ベン ヤイア、バッセム
(72)【発明者】
【氏名】ピエノワール、アントワーヌ フィリペ トマ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC03
4B064CD13
4B064DA01
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065BB01
4B065BC01
4B065BD33
4B065CA25
4B065CA44
(57)【要約】
本発明は、組換えタンパク質、とくに抗体の製造の分野に属する。より具体的には、本発明は、商業規模製造中に収率を改善してタンパク質を発現させるための細胞培養方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下を含む、組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞を培養する方法：培養培地中で前記哺乳動物細胞を培養する工程、及び
培養の１日目と７日目との間にシステイン（Ｃｙｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びチロシン（Ｔｙｒ）の例外的なボーラスを添加する工程、
ただし、例外的なボーラスは、細胞培養物中に高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを提供する。
【請求項2】
以下を含む、組換えタンパク質を産生する方法：組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞を培養培地中で培養する工程、及び
培養の１日目と７日目との間にシステイン（Ｃｙｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びチロシン（Ｔｙｒ）の例外的なボーラスを添加する工程、
ただし、例外的なボーラスは、細胞培養物中に高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを提供する。
【請求項3】
以下を含む、哺乳動物細胞が組換えタンパク質を発現する、培養中の哺乳動物細胞の比生産性（Ｑｐ）を増加させるための方法：培養培地中で前記哺乳動物細胞を培養する工程、及び
培養の１日目と７日目との間にシステイン（Ｃｙｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びチロシン（Ｔｙｒ）の例外的なボーラスを添加する工程、
ただし、例外的なボーラスは、細胞培養物中に高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを提供する。
【請求項4】
例外的なボーラスの添加時に細胞培養物中に存在するＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの総濃度がそれぞれ、ａ．Ｃｙｓについて少なくとも約２．４５ｍＭ；
ｂ．Ｔｒｐについて少なくとも約１．５０ｍＭ；及び
ｃ．Ｔｙｒについて少なくとも約２．７５ｍＭ
である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
例外的なボーラスのＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの濃度が、細胞培養物において高総濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐに到達するように適合され、到達すべきＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの高濃度が、ａ．Ｃｙｓについて少なくとも約２．４５ｍＭ；
ｂ．Ｔｒｐについて少なくとも約１．５０ｍＭ；及び
ｃ．Ｔｙｒについて少なくとも約２．７５ｍＭ
からなる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
哺乳動物細胞が最大生細胞濃度（ＶＣＣ）に達する日を決定するために少なくとも１回の初期実験を行う予備工程、及び／又は例外的なボーラスによって添加されるＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの量を決定するために、培養開始後の培養培地中のＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの１日当たりの濃度を決定するために少なくとも１回の初期実験を行う予備工程
をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
細胞培養物中のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの例外的なボーラスの添加が、最大生細胞濃度（ＶＣＣ）に達する日の前に行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
細胞培養物中のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの例外的なボーラスの添加が、最大ＶＣＣに達する少なくとも１日前に行われる、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項9】
例外的なボーラスの添加時に細胞培養物中に存在するＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの総濃度が、それぞれ少なくとも２．４５ｍＭ、１．５０ｍＭ及び２．７５ｍＭであり、前記総濃度が、最大ＶＣＣに達する少なくとも１日前に達する、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
細胞培養物中のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの例外的なボーラスの添加が、最大ＶＣＣに達する日の１～７日前に行われる、請求項６～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
例外的なボーラスにおいて、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐが、（ｉ）以下のいずれかで同時に添加される：
（ａ）単一の溶液中で組み合わされて、
（ｂ）Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐのうちの１つをそれぞれ含む個々の溶液中で；又は
（ｃ）１つの溶液中の２つのアミノ酸と、残りのアミノ酸を含む第２の溶液との組み合わせ；又は
（ｉｉ）順序を問わず別々に添加される、
請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程が産生段階中に行われる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
細胞培養がフェドバッチ方法に従って行われる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐのいずれかの枯渇を防ぐために、例外的なボーラス添加の後に、培養全体にわたって、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐのさらなる添加が行われる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
主供給培地を細胞培養物に添加する工程をさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
主供給培地がＣｙｓ、Ｔｙｒ又はＴｒｐを含まない、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
組換えタンパク質が、サイトカイン、成長因子、ホルモン、抗体又は融合タンパク質である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
例外的なボーラスによって細胞培養物中に提供されるＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの高濃度が、ａ．Ｃｙｓについて少なくとも約２．４５ｍＭ；
ｂ．Ｔｒｐについて少なくとも約１．５０ｍＭ；及び
ｃ．Ｔｙｒについて少なくとも約２．７５ｍＭ
からなる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、組換えタンパク質、とくに抗体の製造の分野に属する。より具体的には、本発明は、商業規模製造中に収率を改善してタンパク質を発現させるための細胞培養方法に関する。
【0002】
発明の背景
治療用抗体などの治療用タンパク質としての組換えタンパク質の開発には、工業規模での組換えタンパク質の生産が必要である。これを達成するために、原核生物系及び真核生物系の両方の異なる発現系を使用することができる。しかしながら、過去２０年間にわたって、治療薬として承認されたタンパク質の大部分は哺乳動物細胞培養によって製造されており、そのような系は依然としてヒト使用のための大量の組換えタンパク質を産生するための好ましい発現系である。
治療用抗体などの治療用タンパク質としての組換えタンパク質の開発には、工業規模での組換えタンパク質の生産が必要である。これを達成するために、原核生物系及び真核生物系の両方の異なる発現系を使用することができる。しかしながら、過去２０年間にわたって、治療薬として承認されたタンパク質の大部分は哺乳動物細胞培養によって製造されており、そのような系は依然としてヒト使用のための大量の組換えタンパク質を産生するための好ましい発現系である。
【0003】
過去３０年間にわたって、細胞培養培地の組成（例えば、Ｈｅｃｋｌａｕ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｚａｎｇ Ｌｉ．ｅｔ ａｌ．，２０１１を参照）及び操作条件の変更、並びに大型バイオリアクタの開発を通じて最適な細胞増殖に到達することに専念する研究に多くの焦点を当てて、細胞培養及び組換えタンパク質発現の基本パラメータを確立することに多くの努力が払われてきた。
【0004】
収率は依然として哺乳動物細胞培養の非常に重要な側面であるが、近年では、開発及び生産規模のすべての段階における製品品質及び方法の一貫性を制御することに焦点が移行している。哺乳動物細胞培養によって産生される治療用タンパク質は、様々なレベルの不均一性を示す。そのような不均一性には、異なるグリコシル化パターン、脱アミド化又は酸化に起因する差異、異なる電荷又はサイズ変異体が含まれるが、これらに限定されない。近年、治療用タンパク質を高濃度で製剤化することを必要とする治療用タンパク質の皮下送達への着実な傾向がある。高濃度は、凝集体レベルの増加に関連している（Ｐｕｒｄｉｅ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２０１６）。酸性種のレベルの増加などの電荷変異体の増加は、タンパク質の安定性に影響を及ぼし得る（Ｂａｎｋｓ Ｄ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２００９）。細胞培養条件、例えば培地の組成（Ｋｓｈｉｒｓａｇａｒ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，２０１２；米国特許出願公開第２０１３０２８１３５５号；国際公開第２０１３１５８２７５号；Ｂｅｎ Ｙａｈｉａ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｂｅｎ Ｙａｈｉａ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，２０１６）、並びに、供給戦略（国際公開第２０１８２１９９６８号；Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、ｐＨ及び温度（米国特許第８７６５４１３号）を含む生育条件は、治療用タンパク質の収率及び品質属性に影響を及ぼすことが示されている。
【0005】
しかし、タンパク質の不均一性への影響を最小限に抑えながら、治療用タンパク質の産生のための収率を改善した細胞培養方法を提供する必要性が依然として存在する。
【0006】
発明の概要
第１の側面では、本発明は、組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞を培養する方法であって、培養培地中で前記哺乳動物細胞を培養する工程、及び培養の１日目と７日目との間にシステイン（Ｃｙｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びチロシン（Ｔｙｒ）の例外的な（exceptional、通常用いられるものではない）ボーラス（bolus）を添加する工程を含み、前記例外的なボーラスは細胞培養物中に高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを提供する、方法を提供する。
第１の側面では、本発明は、組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞を培養する方法であって、培養培地中で前記哺乳動物細胞を培養する工程、及び培養の１日目と７日目との間にシステイン（Ｃｙｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びチロシン（Ｔｙｒ）の例外的な（exceptional、通常用いられるものではない）ボーラス（bolus）を添加する工程を含み、前記例外的なボーラスは細胞培養物中に高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを提供する、方法を提供する。
【0007】
第２の側面では、本発明は、組換えタンパク質を産生する方法であって、前記組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞を培養培地中で培養する工程、及び培養の１日目と７日目との間にシステイン（Ｃｙｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びチロシン（Ｔｙｒ）の例外的なボーラスを添加する工程を含み、前記例外的なボーラスは、細胞培養物中に高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを提供する、方法を提供する。
【0008】
第３の側面では、本発明は、哺乳動物細胞が組換えタンパク質を発現する、培養中の哺乳動物細胞の比生産性（Ｑｐ）を増加させるための方法であって、培養培地中で前記哺乳動物細胞を培養する工程、及び培養の１日目と７日目との間に（Ｃｙｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びチロシン（Ｔｙｒ）の例外的なボーラスを添加する工程を含み、前記例外的なボーラスは細胞培養物中に高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを提供する、方法を提供する。
【0009】
これらの側面のいずれか１つの状況では、例外的なボーラスの添加時に細胞培養物中に存在するＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの総濃度は、それぞれ、Ｃｙｓについて少なくとも約２．４５ｍＭ；Ｔｒｐについて少なくとも約１．５０ｍＭ；及びＴｙｒについて少なくとも約２．７５ｍＭである。
【0010】
これらの側面のいずれかのさらに好ましい実施形態では、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの総濃度は、最大生細胞濃度ピークに達する少なくとも１日前の細胞培養物中、少なくとも約２．４５ｍＭ、少なくとも約２．７５ｍＭ及び少なくとも約１．５０ｍＭにそれぞれ達するように制御される。
【0011】
好ましくは、これらの高濃度は、同時に又は連続的に（sequentially）達する。Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐは、同じ供給培地又は異なる供給培地の一部であり得る。
【0012】
定義
相容れない定義が存在する場合、本明細書の記載が、定義を含め、優先する。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本明細書における発明の対象が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の定義は、本発明の理解を容易にするために提供される。
相容れない定義が存在する場合、本明細書の記載が、定義を含め、優先する。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本明細書における発明の対象が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の定義は、本発明の理解を容易にするために提供される。
【0013】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、本明細書で「Ａ及び／又はＢ」などの句で使用される「及び／又は」の語は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」、及び「Ｂ」を含むことを意図している。
【0014】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「細胞培養」又は「培養」の語は、インビトロ、すなわち生物又は組織の外側での細胞の成長及び増殖を意味する。哺乳動物細胞に適した培養条件は、Ｏｚｔｕｒｋ＆Ｈｕ（２００５）に教示されているように、当技術分野で公知である。哺乳動物細胞は、懸濁液中で、又は固体基質に付着しながら培養され得る。
【0015】
「細胞培養培地」、「培養培地」、「培地」の語及びそれらのあらゆる複数形は、あらゆる種類の細胞を培養することができるあらゆる培地を指す。「基礎培地」は、細胞代謝に有用なすべての必須成分を含有する細胞培養培地を指す。これには、例えば、アミノ酸、脂質、炭素源、ビタミン及びミネラル塩が含まれる。ＤＭＥＭ（ダルベッコス改変イーグル培地）、ＲＰＭＩ（ロズウェルパーク記念研究所培地）又は培地Ｆ１２（ハムＦ１２培地）は、市販の基礎培地の例である。他の適切な培地は、例えば、国際公開第９８／０８９３４号及び米国特許出願公開第２００６／０１４８０７４号に記載されている（両方ともその全体が本明細書に組み込まれる）。さらに適切な市販の培地には、ＡｍｐｌｉＣＨＯ ＣＤ培地、Ｄｙｎａｍｉｓ（商標）培地、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ（商標）ＣＨＯ Ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ Ｓｙｓｔｅｍ、ＣＤ ＦｏｒｔｉＣＨＯ（商標）培地、ＣＰ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉａ（ＭＥＭ）、ＢａｌａｎＣＤ（登録商標）ＣＨＯ Ｇｒｏｗｔｈ Ａ Ｍｅｄｉｕｍ、ＡｃｔｉＰｒｏ（商標）培地、ＤＭＥＭ－ダルベッコ改変イーグル培地及びＲＰＭＩ－１６４０培地が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、前記基礎培地は、本明細書では「化学的に定義された培地」又は「化学的に定義された培養培地」ともいう独自の培地であってもよく、すべての成分が化学式に関して記載され得、特定の濃度で存在する。培養培地は、好ましくはタンパク質を含まず、血清を含まず、培養中の細胞の必要性に応じて、アミノ酸、塩、糖、ビタミン、ホルモン、成長因子などのあらゆる追加の化合物（複数可）を補充することができる。
【0016】
「供給培地」の語（及びその複数形）は、消費される栄養素を補充するためにフェドバッチモードで培養中に補充として使用される培地を指す。供給培地は、市販の供給培地又は独自の供給培地であり得る。適切な市販の供給培地には、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）サプリメント、ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ（商標）サプリメント、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｆｅｅｄｓが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、前記供給培地は、本明細書では「定義された供給培地」又は「化学的に定義された供給培地」ともいう独自の供給培地であってもよく、すべての成分が化学式に関して記載され得、特定の濃度で存在する。供給培地は、典型的には、培養物の総体積を高レベルに増加させないために濃縮される。そのような供給培地は、細胞培養培地の成分の大部分を、例えば、基礎培地中のそれらの通常量の約１．５倍、２倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍又はさらには５００倍で含有することができる。独自の供給培地は、典型的には粉末である。市販の供給物は、液体又は粉末のいずれかである。供給物が既に液体形態である場合、それらはパンフレットに従ってそのまま使用される。粉末状の供給物は、使用前に、例えば水に可溶化する必要がある。それらは、所与の量の水（例えば、１Ｌの水中に１００ｇ、図１Ａを参照）に可溶化されると考えられる。しかしながら、粉末中の供給物をさらに濃縮することができる。そのような場合、それらは、前記量に通常必要とされるよりも少ない液体を使用して可溶化される（例えば、１Ｌの水中に２００ｇ、図１Ｂを参照）。標準プロトコルに従って調製された液体市販供給物又は粉末中供給物は、本明細書では「通常の」供給物ともいう。濃縮方法に従って調製された液体市販供給物又は粉末中供給物は、本明細書では「濃縮供給物」又は「濃縮主供給物」という。
【0017】
本培養方法の全体を通して、異なる組成の異なる供給培地を添加することができる。例えば、３つの異なる供給培地：炭素源（例えば、グルコース）からなる１つの供給培地、消費される栄養素の大部分を含む１つの供給培地（この供給培地は主供給培地ともいう）、及び例えばこれらの栄養素が凝集／安定性の問題を呈する場合、いくつかのさらなる栄養素を含むさらなる供給培地を同じ方法中に使用することができる。
【0018】
「バイオリアクタ」の語は、細胞を培養することができるあらゆる系を指す。これには、フラスコ、静的フラスコ、スピナーフラスコ、チューブ、振盪管、振盪ボトル、ウェーブバッグ、バイオリアクタ、繊維バイオリアクタ、及びマイクロキャリアを含む又は含まない撹拌タンクバイオリアクタが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、この用語は、マイクロタイタープレート、キャピラリー又はマルチウェルプレートも含む。例えば、１ｍＬ、５ｍＬ、０．０１Ｌ、０．１Ｌ、１Ｌ、２Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ（すなわち１ＫＬ）、２０００Ｌ（すなわち２ＫＬ）、５０００Ｌ（すなわち５ＫＬ）、１００００Ｌ（すなわち１０ＫＬ）、１５０００Ｌ（すなわち１５ＫＬ）又は２００００Ｌ（２０ＫＬ）など、１ミリリットル（１ｍＬ、非常に小規模）～２００００リットル（２００００Ｌすなわち２０ＫＬ、非常に大規模）のあらゆるサイズのバイオリアクタを使用することができる。
【0019】
「フェドバッチ培養」の語は、培地を除去することなく、消費される栄養素を補充するためのボーラス（典型的には数回のボーラス）又は連続供給培地（又は供給培地）補充がある、細胞を培養する方法を指す。供給物（複数可）は、例えば、毎日、２日に１回、３日に１回などの所定のスケジュールに従って添加することができる。あるいは、供給が連続的である場合、供給速度は培養全体にわたって変化させることができる。この細胞培養技術は、培地製剤、細胞株、及び他の細胞増殖条件に応じて、１０×１０６細胞／ｍｌ超～３０×１０６細胞／ｍｌ程度の高い細胞密度を得る可能性を有する。二相性培養条件は、様々な供給戦略及び培地製剤によって作成及び維持することができる。
【0020】
代替的に、灌流培養を使用することができる。灌流培養は、細胞培養物が新鮮な灌流供給培地を受け、同時に使用済み培地を除去するものである。灌流は、連続的、段階的、断続的、又はこれらのいずれか又はすべての組み合わせであり得る。灌流速度は、１日当たり作業容量未満～多くの作業容量であり得る。好ましくは、細胞は培養物中に保持され、除去された使用済み培地は、細胞を実質的に含まないか、又は培養物よりも有意に少ない細胞を有する。灌流は、遠心分離、沈降又は濾過を含むいくつかの細胞保持技術によって達成することができる（例えば、Ｖｏｉｓａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００３を参照）。本発明の方法（ｐｒｏｃｅｓｓ）、方法（ｍｅｔｈｏｄ）及び／又は細胞培養技術を使用する場合、哺乳動物細胞では、組換えタンパク質は一般に培養培地に直接分泌される。前記タンパク質が培地に分泌されると、目的のタンパク質の単離を開始し、精製及び製剤化する前であれば濃縮するために、そのような発現系からの上清を最初に清澄化することができる。
【0021】
本発明による「産生段階」の語は、細胞が組換えポリペプチドを発現する（すなわち産生する）場合の、組換えタンパク質を製造するための方法中の細胞培養のその段階を含む。産生段階は、所望の産物の力価が増加したときに始まり、細胞又は細胞培養液又は上清の採取で終わる。典型的には、産生段階の開始時に、細胞培養物をバイオリアクタなどの産生容器に移す。採取は、組換えタンパク質（組換え抗体など）を回収し、その後の工程で精製するために、細胞培養液を産生容器から取り出す工程である。
【0022】
「システイン」は、１２１．１６ｇ／ｍｏｌの分子量を有するアミノ酸である。Ｌエナンチオマーが好ましい（すなわち、Ｌ－システイン）。この用語はまた、そのあらゆる塩又は誘導体、例えば（限定されないが）システイン水和物、システイン二水和物、システイン塩酸塩、システイン二塩酸塩、システイン塩酸塩一水和物、システインＳ－硫酸塩（Ｓ－スルホシステインとしても知られる）、アセチルシステイン、Ｎ－アセチルシステインも包含する。あるいは、国際公開第２０１９１０６０９１号に開示されているあらゆるシステイン／シスチン類似体を使用することができる。
【0023】
「シスチン」は、２４０．３ｇ／ｍｏｌの分子量を有するアミノ酸である。Ｌエナンチオマーが好ましい（すなわち、Ｌ－シスチン）。この用語はまた、そのあらゆる塩又は誘導体、例えば、シスチン塩酸塩、シスチン二塩酸塩、Ｎ，Ｎ’－ジアセチル－Ｌ－シスチン、Ｎ，Ｎ’－ジアセチル－Ｌ－シスチンジメチルエステル又はＬ－シスチンジメチルエステルも包含する。
【0024】
細胞培養培地中の「システイン」及び「シスチン」は一定の平衡状態にあり、２分子のシステインが酸化してシスチンの分子になり、これが還元されて２分子のシステインに戻る。この文書では、読みやすくするために主にシステイン（あるいはＣｙｓ）というが、システインに限定されない。したがって、「Ｃｙｓ」の語は、システイン、シスチン、それらの塩、それらの誘導体又はそれらのあらゆる組み合わせを指す。例えば、「Ｃｙｓについて約２．４５ｍＭ」と言及される場合、当業者は、それが例えば約２．４５ｍＭのＬ－システイン、Ｌ－シスチン、それらの塩、それらの誘導体又はシステインとシスチンの組み合わせを包含することを理解する。ｇ／Ｌで表す場合、「約２．４５ｍＭのＣｙｓ」は、例えば約０．３０ｇ／ＬのＬ－システイン又は約０．６０ｇ／ＬのＬ－シスチンに相当する。
【0025】
本明細書で「Ｔｙｒ」ともいう「チロシン」は、１８１．１９ｇ／ｍｏｌの分子量を有するアミノ酸である。Ｌエナンチオマーが好ましい（すなわち、Ｌ－チロシン）。この用語はまた、そのあらゆる塩又は誘導体、例えば（限定されないが）チロシン二ナトリウム塩、チロシン二ナトリウム水和物、チロシン二ナトリウム二水和物、Ｎ－アセチル－Ｌ－チロシン又はホスホチロシンナトリウムも包含する。ｇ／Ｌで表される場合、「約２．７５ｍＭのＴｙｒ」は、例えば約０．５０ｇ／ＬのＬ－チロシンに相当する。
【0026】
本明細書で「Ｔｒｐ」ともいう「トリプトファン」は、２０４．２３ｇ／ｍｏｌの分子量を有するアミノ酸である。Ｌエナンチオマーが好ましい（すなわち、Ｌ－トリプトファン）。この用語はまた、そのあらゆる塩、例えば（限定されないが）トリプトファンナトリウムも包含する。ｇ／Ｌで表される場合、「約１．５０ｍＭのＴｒｐ」は、例えば約０．３０ｇ／ＬのＬ－トリプトファンに対応する。
【0027】
Ｃｙｓ、Ｔｒｐ又はＴｙｒのいずれか１つについての「高濃度」の語は、システイン（若しくはシスチン又はそのあらゆる塩）については２．０ｍＭ以上、Ｔｙｒについては１．７ｍＭ以上、又はＴｒｐについては１ｍＭ以上の濃度を指す（例えば、Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７を参照されたい。）。
【0028】
本明細書で使用される場合、「細胞濃度」（「細胞密度」としても知られる）は、所与の体積の培養培地中の細胞の数を指す。
【0029】
「生細胞濃度」（又は「ＶＣＣ」）の語は、所与の体積の培養培地中の生きている細胞の数を指す。これは、標準的な生存率アッセイによって決定される。当業者は、各特定の細胞株の最大ＶＣＣを決定する方法を知っていることを理解されたい：これは、典型的には、１回又は複数回の初期実験によって行われる。所与の条件下で所与のタンパク質を発現する１つの細胞株について最大ＶＣＣに達する日が分かれば、本発明による方法を設計することができる。すべての実験についてＶＣＣを決定する必要はない。
【0030】
「ＩＶＣＣ」の語は、積分生細胞数を意味し、細胞培養成長曲線
のもとで面積を見出すことによって決定することができる。
【数1】
のもとで面積を見出すことによって決定することができる。
【0031】
「生存率」又は「細胞生存率」の語は、生細胞の総数と培養中の細胞の総数との間の比を指す。生存率は、典型的には、培養の開始と比較して６０％の閾値を下回らない限り許容可能であるが、許容可能な閾値は、ケースバイケースで決定することができる。生存率は、採取の時期を決定するために使用されることが多い。例えば、フェドバッチ培養では、培養において生存率が少なくとも６０％に達するか、又は約１４日（典型的には１４日＋／－１日）後に採取を行うことができる。標準的な方法を使用して、例えば、ＶＩ－ＣＥＬＬ（登録商標）ＸＲ自動細胞計数装置（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．）の使用によって、細胞生存率又はＶＣＣを決定することができる。
【0032】
「力価」の語は、溶液中の目的のタンパク質の濃度を指す。これは、例のセクションにおいて用いられるように、ＣＥＤＥＸ又はプロテインＡ高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｃ（登録商標）又はＦｏｒｔｅＢＩＯ Ｏｃｔｅｔ（登録商標）法を用いて、検出方法（比色、クロマトグラフィーなど）と組み合わせた段階希釈などの標準的な力価アッセイによって決定される。
【0033】
「比生産性」の語は、「ｑｐ」としても知られ、１日当たりの細胞当たり産生される目的のタンパク質の量を指す。
【0034】
「高力価」又は「より高い生産性」の語及びその等価物は、対照培養条件と比較した場合、力価又は生産性が少なくとも１０％増加することを意味する。力価又は比生産性は、対照培養条件と比較して－１０％～１０％の範囲内にある場合に維持されていると見なされる。「低力価」又は「より低い生産性」の語及びその等価物は、対照培養条件と比較した場合、力価又は生産性が少なくとも１０％減少することを意味する。
【0035】
本明細書で使用される「不均一性」の語は、同じ製造方法又は同じ製造バッチ内で産生された分子の集団における個々の分子、例えば組換えタンパク質間の違いを指す。不均一性は、例えばポリペプチドの翻訳後修飾又は転写若しくは翻訳中の誤組み込みに起因する組換えポリペプチドの不完全又は不均一な修飾に起因し得る。翻訳後修飾は、例えば、脱アミノ化反応及び／又は酸化反応及び／又は小分子の共有結合付加、例えば糖化反応及び／又は異性化反応及び／又は断片化反応及び／又は他の反応の結果であり得、糖化パターンの変動も含む。そのような不均一性の化学物理的発現は、限定されないが電荷変異体プロファイル、色又は色強度及び分子量プロファイルを含む、得られる組換えポリペプチド調製物における様々な特徴をもたらす。
【0036】
電荷不均一性の減少は、好ましくは、細胞培養物中で産生された組換えタンパク質の集団中の酸性ピークグループ（ＡＰＧ）種を測定することによって定義される。ＡＰＧ減少を測定する可能な方法は、画像化キャピラリー電気泳動（例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ ｉＣＥ３）を介して、システイン／システイン類似体を含む又は含まない細胞培養培地中で産生された組換えタンパク質の酸性（酸性ピーク群のＡＰＧ）アイソフォームの相対的割合を決定することによるものであり、この組換えタンパク質は測定時に好ましくは精製される。組換えタンパク質のアイソフォームを測定する場合、ＡＰＧの他に、塩基性アイソフォーム（塩基性ピーク群（ＢＰＧ））及び主電荷種も測定され、主電荷種は、得ることが望まれる組換えタンパク質のアイソフォームを表す。ＡＰＧが減少する場合、ＢＰＧの増加は実質的にないことが好ましい。好ましくは、ＡＰＧが減少すると、主電荷種レベルが増加する。
【0037】
本明細書で使用される「タンパク質」の語は、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を含み、２つ以上のアミノ酸残基を含む化合物を指す。本発明によるタンパク質には、サイトカイン、成長因子、ホルモン、融合タンパク質、抗体又はその断片が含まれるが、これらに限定されない。治療用タンパク質は、治療に使用することができるか、又は治療に使用されるタンパク質を指す。
【0038】
「組換えタンパク質」の語は、組換え技術によって産生されるタンパク質を意味する。組換え技術は、十分に当業者の知識の範囲内である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９、及びアップデートを参照）。
【0039】
本明細書で使用される「抗体」の語は、当技術分野で公知の組換え技術によって生成されるモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び組換え抗体を含むが、これらに限定されない。「抗体」には、あらゆる種、とくに哺乳動物種の抗体；例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＤを含むあらゆるアイソタイプのヒト抗体、及びＩｇＧＡ１、ＩｇＧＡ２を含むこの基本構造の二量体として産生される抗体、又はＩｇＭなどの五量体及びその改変変異体；例えば、チンパンジー、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザル由来の非ヒト霊長類抗体；例えばマウス又はラット由来の齧歯類抗体；ウサギ、ヤギ又はウマの抗体；ラクダ科抗体（例えば、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（商標）などのラクダ又はラマからのもの）及びその誘導体；ニワトリ抗体などの鳥類の抗体；又はサメ抗体などの魚種の抗体が含まれる。「抗体」の語はまた、少なくとも１つの重鎖及び／又は軽鎖抗体配列の第１の部分が第１の種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖抗体配列の第２の部分が第２の種に由来する「キメラ」抗体を指す。本明細書における目的のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルなどの旧世界ザル）に由来する可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が含まれる。「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体に由来する配列を含むキメラ抗体である。大部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性及び活性を有する、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域［すなわち相補性決定領域（ＣＤＲ）］からの残基で置き換えられたヒト抗体（レシピエント抗体）である。ほとんどの場合、ＣＤＲ以外のヒト（レシピエント）抗体の残基；すなわち、フレームワーク領域（ＦＲ）において、対応する非ヒト残基によってさらに置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体には見られない残基を含み得る。これらの改変は、抗体特性をさらに改良するために行われる。ヒト化は、ヒトにおける非ヒト抗体の免疫原性を低下させ、したがって、ヒト疾患の処置への抗体の適用を容易にする。ヒト化抗体及びそれらを生成するためのいくつかの異なる技術は、当技術分野で周知である。「抗体」の語はまた、ヒト化の代替として生成することができるヒト抗体を指す。例えば、免疫化の際に内因性マウス抗体の産生の非存在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが可能である。インビトロでヒト抗体／抗体断片を得るための他の方法は、ファージディスプレイ又はリボソームディスプレイ技術などのディスプレイ技術に基づいており、少なくとも部分的に人工的に又はドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから生成される組換えＤＮＡライブラリーが使用される。ヒト抗体を生成するためのファージ及びリボソームディスプレイ技術は、当技術分野で周知である。ヒト抗体はまた、目的の抗原でエクスビボ免疫され、続いて融合されてハイブリドーマを生成し、次いでこれを最適なヒト抗体についてスクリーニングすることができる、単離されたヒトＢ細胞から生成され得る。「抗体」の語は、グリコシル化抗体と非グリコシル化抗体の両方を指す。さらに、本明細書で使用される「抗体」の語は、完全長抗体を指すだけでなく、抗体断片、より具体的にはその抗原結合断片も指す。抗体の断片は、当該分野で公知の少なくとも１つの重鎖又は軽鎖免疫グロブリンドメインを含み、１つ又は複数の抗原に結合する。本発明による抗体断片の例としては、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ－Ｆｖ、Ｆａｂ－ｄｓＦｖ、Ｆａｂ－Ｆｖ－Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びＢｉｓ－ｓｃＦｖ断片が挙げられる。前記断片はまた、ダイアボディ、トリボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、例えばｓｄＡｂ、ＶＬ、ＶＨ、ＶＨＨ又はラクダ科抗体（例えばラクダ又はラマ由来、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（商標）など）及びＶＮＡＲ断片であり得る。本発明による抗原結合断片はまた、１つ又は２つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖに連結されたＦａｂを含むことができ、各ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは同じ又は異なる標的に結合する（例えば、１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは治療標的に結合し、１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは例えばアルブミンに結合することによって半減期を延長する）。そのような抗体断片の例は、ＦａｂｄｓｓｃＦｖ（ＢＹｂｅ（登録商標）ともいう）又はＦａｂ－（ｄｓｓｃＦｖ）２（ＴｒＹｂｅ（登録商標）ともいう。例えば国際公開第２０１５１９７７７２号を参照）である。上で定義した抗体断片は、当技術分野で公知である。
【0040】
発明の詳細な説明
本開示は、哺乳動物細胞における組換えタンパク質の産生、及び組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞の培養のための方法に関する。とくに、本発明は、１）供給培地（ｆｅｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）（又は供給培地（ｆｅｅｄ ｍｅｄｉａ））によってもたらされるシステイン（Ｃｙｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びチロシン（Ｔｙｒ）の量並びに２）添加のタイミングを制御することによって、組換えタンパク質の品質に影響を与えることなく、細胞の比生産性を高め、生産収率を高めながら、細胞増殖を低下させるという驚くべき効果があるという本発明者らの知見に基づいている。とくに、電荷変異体、脱アミノ化変異体又は酸化種などの生成物関連変異体の形成は、本明細書に記載の方法の実施によって低減される。
本開示は、哺乳動物細胞における組換えタンパク質の産生、及び組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞の培養のための方法に関する。とくに、本発明は、１）供給培地（ｆｅｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）（又は供給培地（ｆｅｅｄ ｍｅｄｉａ））によってもたらされるシステイン（Ｃｙｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びチロシン（Ｔｙｒ）の量並びに２）添加のタイミングを制御することによって、組換えタンパク質の品質に影響を与えることなく、細胞の比生産性を高め、生産収率を高めながら、細胞増殖を低下させるという驚くべき効果があるという本発明者らの知見に基づいている。とくに、電荷変異体、脱アミノ化変異体又は酸化種などの生成物関連変異体の形成は、本明細書に記載の方法の実施によって低減される。
【0041】
本明細書に記載の方法は、目的の組換えタンパク質の産生中の細胞培養物中のＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの濃度の制御に依存する。実際、驚くべきことに、高い制御された濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを含む例外的なボーラス供給物をタイムライン様式で（例えば、培養開始後１日～７日及び／又はＶＣＣに達すると予想される日の少なくとも１日前に）添加することによって、培養培地中のこれらのアミノ酸の各々のより高い濃度に到達し、培養中の細胞の特異的モノクローナル抗体生産性を増加させることが可能であることが分かった。
【0042】
本開示は、産生バイオリアクタ収率を最大化し、細胞増殖を最小化し、産生される組換えタンパク質の微小不均一性を最小化するために、これらのパラメータをどのように制御するかを記載する。本開示は、これらのパラメータが特許請求される範囲内で制御される方法（とくにフェドバッチ方法）の具体例を提供し、システイン、チロシン及びトリプトファンの可能な添加様式（例外的なボーラス及びそのタイミング対連続的／半連続的など）の具体例を提供する。
【0043】
一態様では、本発明は、組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞を培養する方法であって、培養培地中で前記哺乳動物細胞を培養する工程、及び培養の１日目と７日目との間にシステイン（Ｃｙｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びチロシン（Ｔｙｒ）の例外的なボーラスを添加する工程を含み、前記例外的なボーラスは細胞培養物中に高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを提供する、方法を提供する。
【0044】
別の態様では、本発明は、組換えタンパク質を産生する方法であって、前記組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞を培養培地中で培養する工程、及び培養開始後１日目と７日目との間にシステイン（Ｃｙｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びチロシン（Ｔｙｒ）の例外的なボーラスを添加する工程を含み、前記例外的なボーラスは、細胞培養物中に高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを提供する、方法を提供する。
【0045】
さらなる態様では、哺乳動物細胞が組換えタンパク質を発現する、培養中の哺乳動物細胞の比生産性（Ｑｐ）を増加させるための方法であって、培養培地中で前記哺乳動物細胞を培養する工程、及び培養の１日目と７日目との間に（Ｃｙｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びチロシン（Ｔｙｒ）の例外的なボーラスを添加する工程を含み、前記例外的なボーラスは細胞培養物中に高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを提供する、方法が本明細書に記載される。
【0046】
本発明の内容全体との関連において、組換えタンパク質を産生するための方法、組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞を培養するための方法、又は培養中の哺乳動物細胞の比生産性を高めるための方法は、以下の主要な工程を含む：
ｉ）哺乳動物細胞をバイオリアクタ（産生バイオリアクタなど）内の培養培地に接種する工程であって、培養培地が任意に初期量のシステイン／シスチン、チロシン及びトリプトファンを含む、工程
ｉｉ）組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞を培養培地（細胞培養物ともいう）中で培養する工程、
ｉｉｉ）細胞培養物に、さらに以下を添加する工程：
ａ．培養の１日目と７日目との間に、細胞培養物において高濃度のシステイン、トリプトファン及びチロシンを提供する例外的なボーラス、
ｂ．細胞培養物への一定間隔での主供給物、
ｃ．細胞培養中のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐのいずれかの枯渇を防ぐためのシステイン、トリプトファン及びチロシンのさらなるボーラス（複数可）、
ｉｖ）任意に、細胞培養液（ＣＣＦ）から組換えタンパク質を回収する工程。
ｉ）哺乳動物細胞をバイオリアクタ（産生バイオリアクタなど）内の培養培地に接種する工程であって、培養培地が任意に初期量のシステイン／シスチン、チロシン及びトリプトファンを含む、工程
ｉｉ）組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞を培養培地（細胞培養物ともいう）中で培養する工程、
ｉｉｉ）細胞培養物に、さらに以下を添加する工程：
ａ．培養の１日目と７日目との間に、細胞培養物において高濃度のシステイン、トリプトファン及びチロシンを提供する例外的なボーラス、
ｂ．細胞培養物への一定間隔での主供給物、
ｃ．細胞培養中のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐのいずれかの枯渇を防ぐためのシステイン、トリプトファン及びチロシンのさらなるボーラス（複数可）、
ｉｖ）任意に、細胞培養液（ＣＣＦ）から組換えタンパク質を回収する工程。
【0047】
代替的に、組換えタンパク質を産生するための方法、組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞を培養するための方法、又は培養中の哺乳動物細胞の比生産性を高めるための方法は、以下の主要な工程を含む：
（ｉ）哺乳動物細胞をバイオリアクタ（産生バイオリアクタなど）内の培養培地に接種する工程であって、培養培地が任意に初期量のシステイン／シスチン、チロシン及びトリプトファンを含む、工程、
（ｉｉ）フェドバッチ方法に従って培養物を産生段階まで進行させる工程であって、組換えタンパク質が、哺乳動物細胞によって生産され、前記産生段階の間、細胞培養物は、
ａ）培養の１日目と７日目との間に、システイン（Ｃｙｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びチロシン（Ｔｙｒ）の例外的なボーラスが補充され、前記例外的なボーラスは、細胞培養物において高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを提供する、
ｂ）細胞培養物へ一定間隔で少なくとも１つの主供給培地が補充され、及び
ｃ）細胞培養中のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐのいずれかの枯渇を防ぐために、システイン／シスチン、チロシン及びトリプトファンのうちの１つ又は複数の供給物がさらに供給され、
ｉｉｉ）任意に、細胞培養液（ＣＣＦ）から組換えタンパク質を回収する工程。
（ｉ）哺乳動物細胞をバイオリアクタ（産生バイオリアクタなど）内の培養培地に接種する工程であって、培養培地が任意に初期量のシステイン／シスチン、チロシン及びトリプトファンを含む、工程、
（ｉｉ）フェドバッチ方法に従って培養物を産生段階まで進行させる工程であって、組換えタンパク質が、哺乳動物細胞によって生産され、前記産生段階の間、細胞培養物は、
ａ）培養の１日目と７日目との間に、システイン（Ｃｙｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びチロシン（Ｔｙｒ）の例外的なボーラスが補充され、前記例外的なボーラスは、細胞培養物において高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを提供する、
ｂ）細胞培養物へ一定間隔で少なくとも１つの主供給培地が補充され、及び
ｃ）細胞培養中のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐのいずれかの枯渇を防ぐために、システイン／シスチン、チロシン及びトリプトファンのうちの１つ又は複数の供給物がさらに供給され、
ｉｉｉ）任意に、細胞培養液（ＣＣＦ）から組換えタンパク質を回収する工程。
【0048】
当業者は、「培養の１日目と７日目との間」の語が「培養開始後１日～７日」又はあるいは「バイオリアクタにおける哺乳動物細胞の接種後１日～７日」を意味することを理解するであろう。実際、培養の開始又は哺乳動物細胞がバイオリアクタに接種された日は０日目に対応する。当業者はまた、「培養の１日目と７日目との間」が、培養の１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目又は７日目のいずれかを意味することを理解するはずである。
【0049】
システイン／シスチン、チロシン及びトリプトファンは、同時に又は連続的に添加され得る。３つのアミノ酸が同時に添加される場合、それらは、（ａ）単一の溶液中にすべてが組み合わされたものとして、（ｂ）それぞれがＣｙｓ、Ｔｙｒ又はＴｒｐの１つを含む個々の溶液中に；又は（ｃ）１つの溶液中の２つのアミノ酸と、残りのアミノ酸を含む第２の溶液との組み合わせとして提供され得る。アミノ酸を連続的に添加する場合、あらゆる順序で、好ましくは２時間のウインドウ期間内に添加することができる（例えば、ＣｙｓをＨ０で添加する場合、ＴｙｒをＨ＋１で添加し、ＴｒｐをＨ＋２で添加することができ、又はＴｙｒをＨ０で添加する場合、ＴｒｐをＨ＋０．５で添加し、ＣｙｓをＨ＋１．５で添加することができる）。
【0050】
本発明全体の内容において、高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐは、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの例外的なボーラスの添加時に細胞培養物において到達する。一側面では、例外的なボーラスの添加時に細胞培養物中に存在するＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの総濃度は、それぞれ、
ａ．Ｃｙｓについて少なくとも約２．４５ｍＭ；
ｂ．Ｔｒｐについて少なくとも約１．５０ｍＭ；及び
ｃ．Ｔｙｒについて少なくとも約２．７５ｍＭである。
ａ．Ｃｙｓについて少なくとも約２．４５ｍＭ；
ｂ．Ｔｒｐについて少なくとも約１．５０ｍＭ；及び
ｃ．Ｔｙｒについて少なくとも約２．７５ｍＭである。
【0051】
あるいは、例外的なボーラスの添加時に細胞培養物中に存在するＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの総濃度は、それぞれ、
ａ．Ｃｙｓについて約２．４５ｍＭ～約６．６ｍＭ；
ｂ．Ｔｒｐについて約１．５０ｍＭ～約２．９ｍＭ；及び
ｃ．Ｔｙｒについて約２．７５ｍＭ～約６．２ｍＭである。
ａ．Ｃｙｓについて約２．４５ｍＭ～約６．６ｍＭ；
ｂ．Ｔｒｐについて約１．５０ｍＭ～約２．９ｍＭ；及び
ｃ．Ｔｙｒについて約２．７５ｍＭ～約６．２ｍＭである。
【0052】
当業者は、例外的なボーラスの添加時に細胞培養物中のこれらの高い総濃度に達するために、例外的なボーラスのＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの濃度を適合させる方法を知っている。
【0053】
本発明による方法は、全体として、培養開始後の培養培地中のＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの１日当たりの濃度を決定するために少なくとも１回の初期実験を実施する予備工程をさらに含むことができ、例外的なボーラスを添加する日に応じて、例外的なボーラスを介して添加されるＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの量を決定する。この初期実験は、本発明による方法が行われるたびに繰り返す必要はないことを理解されたい。換言すれば、例外的なボーラスによって添加されるＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの量が決定されると、少なくとも１つの初期実験において、所与の条件下で、１つの特定のクローンについて、本発明による方法を実施するたびにこれらの濃度を制御する必要はない。
【0054】
本発明による方法の内容において、全体として、高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐは、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの例外的なボーラスの添加時に、最大ＶＣＣに達する日の前に（又は最大ＶＣＣに達すると予想される日の前に）細胞培養培地中で達することが好ましい。一側面では、最大ＶＣＣに達する日の前（又は最大ＶＣＣに達すると予想される日の前）の例外的なボーラスの添加時の細胞培養物中に存在するＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの総濃度は、Ｃｙｓについて少なくとも約２．４５ｍＭ；Ｔｒｐについて少なくとも約１．５０ｍＭ；及びＴｙｒについて少なくとも約２．７５ｍＭからなる。別の側面では、最大ＶＣＣに達する日の前（又は最大ＶＣＣに達すると予想される日の前）の例外的なボーラスの添加時の細胞培養物中に存在するＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの総濃度は、Ｃｙｓについて約２．４５ｍＭ～約６．６ｍＭ；Ｔｙｒについて約２．７５ｍＭ～約６．２ｍＭ；及びＴｒｐについて約１．５０ｍＭ～約２．９ｍＭ）からなる。特定の側面では、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの濃度は、最大ＶＣＣに達する（又は達すると予想される）少なくとも１日前に、細胞培養培地中でそれぞれ少なくとも約２．４５ｍＭ、少なくとも約２．７５ｍＭ及び少なくとも約１．５０ｍＭに同時に（又は別々に）達するように制御される。これらの濃度は、最大ＶＣＣに達する（又は達すると予想される）少なくとも１日前にＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの例外的なボーラスを添加することによって達成される。これに関連して、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの添加は、最大ＶＣＣに達する（又は達すると予想される）日の１日前までに開始することが好ましい。あるいは、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの添加は、最大ＶＣＣの日（又は最大ＶＣＣの日と予想される日）の２日前、３日前、４日前、５日前、６日前又は７日前に開始することが好ましい。さらに好ましくは、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの添加は、最大ＶＣＣの日（又は最大ＶＣＣの日と予想される日）の２日前、３日前又は４日前に開始する。例えば、８日目に最大ＶＣＣに達する（又は達すると予想される）場合、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの添加は、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目又は７日目に行うことができる。別の例では、５日目に最大ＶＣＣに達する（又は達すると予想される）場合、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの添加は、１日目、２日目、３日目又は４日目に行うことができる。
【0055】
本発明による方法は全体として、培養中の哺乳動物細胞が最大生細胞濃度（ＶＣＣ）に達する日を決定するために少なくとも１回の初期実験を行う予備工程もさらに含むことができる。この初期実験は、本発明による方法が行われるたびに繰り返す必要はないことを理解されたい。換言すれば、最大ＶＣＣに達する（又は達すると予想される）日が決定されると、少なくとも１つの初期実験において、所与の条件下で、１つの特定のクローンについて、本発明による方法を実施するたびにそれを制御する必要はない。
【0056】
本発明の内容全体との関連において、あらゆる予備工程が（例えば、最大生細胞濃度（ＶＣＣ）の日に決定するために、又は例外的なボーラスによって添加されるＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの量を決定するために）実施される場合、組換えタンパク質を産生するための方法、組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞を培養するための方法、又は培養中の哺乳動物細胞の比生産性を高めるための方法は、以下の主要な工程を含む：
ｉ）任意に、前記例外的なボーラスが添加される日に応じて、例外的なボーラスを介して添加されるＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの量を決定するために、培養開始後に培養培地中のＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの１日当たりの濃度を決定するための少なくとも１回の初期実験を実施する工程、
ｉｉ）任意に、少なくとも１回の初期実験を実施し、培養中の哺乳動物細胞が最大生細胞濃度（ＶＣＣ）に達する日を決定する工程、
ｉｉｉ）哺乳動物細胞をバイオリアクタ（産生バイオリアクタなど）内の培養培地に接種する工程であって、培養培地が任意に初期量のシステイン／シスチン、チロシン及びトリプトファンを含む、工程
ｉｖ）組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞を培養培地（細胞培養物ともいう）中で培養する工程、
ｖ）細胞培養物に、さらに以下を添加する工程：
ａ．培養の１日目と７日目との間に、細胞培養物において高濃度のシステイン、トリプトファン及びチロシンを提供する例外的なボーラス、
ｂ．細胞培養物への一定間隔での主供給物、
ｃ．細胞培養中のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐのいずれかの枯渇を防ぐためのシステイン、トリプトファン及びチロシンのさらなるボーラス（複数可）、
ｖｉ）任意に、細胞培養液（ＣＣＦ）から組換えタンパク質を回収する工程。
ｉ）任意に、前記例外的なボーラスが添加される日に応じて、例外的なボーラスを介して添加されるＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの量を決定するために、培養開始後に培養培地中のＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの１日当たりの濃度を決定するための少なくとも１回の初期実験を実施する工程、
ｉｉ）任意に、少なくとも１回の初期実験を実施し、培養中の哺乳動物細胞が最大生細胞濃度（ＶＣＣ）に達する日を決定する工程、
ｉｉｉ）哺乳動物細胞をバイオリアクタ（産生バイオリアクタなど）内の培養培地に接種する工程であって、培養培地が任意に初期量のシステイン／シスチン、チロシン及びトリプトファンを含む、工程
ｉｖ）組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞を培養培地（細胞培養物ともいう）中で培養する工程、
ｖ）細胞培養物に、さらに以下を添加する工程：
ａ．培養の１日目と７日目との間に、細胞培養物において高濃度のシステイン、トリプトファン及びチロシンを提供する例外的なボーラス、
ｂ．細胞培養物への一定間隔での主供給物、
ｃ．細胞培養中のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐのいずれかの枯渇を防ぐためのシステイン、トリプトファン及びチロシンのさらなるボーラス（複数可）、
ｖｉ）任意に、細胞培養液（ＣＣＦ）から組換えタンパク質を回収する工程。
【0057】
代替的に、あらゆる予備工程が（例えば、最大生細胞濃度（ＶＣＣ）の日に決定するために、又は例外的なボーラスによって添加されるＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの量を決定するために実施される場合、組換えタンパク質を産生するための方法、組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞を培養するための方法、又は培養中の哺乳動物細胞の比生産性を高めるための方法は、以下の主要な工程を含む：
ｉ）任意に、前記例外的なボーラスが添加される日に応じて、例外的なボーラスを介して添加されるＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの量を決定するために、培養開始後に培養培地中のＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの１日当たりの濃度を決定するための少なくとも１回の初期実験を実施する工程、
ｉｉ）任意に、少なくとも１回の初期実験を実施し、培養中の哺乳動物細胞が最大生細胞濃度（ＶＣＣ）に達する日を決定する工程、
（ｉｉｉ）哺乳動物細胞をバイオリアクタ（産生バイオリアクタなど）内の培養培地に接種する工程であって、培養培地が任意に初期量のシステイン／シスチン、チロシン及びトリプトファンを含む、工程、
（ｉｖ）フェドバッチ方法に従って培養物を産生段階まで進行させる工程であって、組換えタンパク質が、哺乳動物細胞によって生産され、前記産生段階の間、細胞培養物は、
ａ）培養の１日目と７日目との間に、システイン（Ｃｙｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びチロシン（Ｔｙｒ）の例外的なボーラスが補充され、前記例外的なボーラスは、細胞培養物において高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを提供する、
ｂ）細胞培養物へ一定間隔で少なくとも１つの主供給培地が補充され、及び
ｃ）細胞培養中のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐのいずれかの枯渇を防ぐために、システイン／シスチン、チロシン及びトリプトファンのうちの１つ又は複数の供給物がさらに供給され、
ｖ）任意に、細胞培養液（ＣＣＦ）から組換えタンパク質を回収する工程。
ｉ）任意に、前記例外的なボーラスが添加される日に応じて、例外的なボーラスを介して添加されるＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの量を決定するために、培養開始後に培養培地中のＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの１日当たりの濃度を決定するための少なくとも１回の初期実験を実施する工程、
ｉｉ）任意に、少なくとも１回の初期実験を実施し、培養中の哺乳動物細胞が最大生細胞濃度（ＶＣＣ）に達する日を決定する工程、
（ｉｉｉ）哺乳動物細胞をバイオリアクタ（産生バイオリアクタなど）内の培養培地に接種する工程であって、培養培地が任意に初期量のシステイン／シスチン、チロシン及びトリプトファンを含む、工程、
（ｉｖ）フェドバッチ方法に従って培養物を産生段階まで進行させる工程であって、組換えタンパク質が、哺乳動物細胞によって生産され、前記産生段階の間、細胞培養物は、
ａ）培養の１日目と７日目との間に、システイン（Ｃｙｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びチロシン（Ｔｙｒ）の例外的なボーラスが補充され、前記例外的なボーラスは、細胞培養物において高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを提供する、
ｂ）細胞培養物へ一定間隔で少なくとも１つの主供給培地が補充され、及び
ｃ）細胞培養中のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐのいずれかの枯渇を防ぐために、システイン／シスチン、チロシン及びトリプトファンのうちの１つ又は複数の供給物がさらに供給され、
ｖ）任意に、細胞培養液（ＣＣＦ）から組換えタンパク質を回収する工程。
【0058】
本発明者らは、とくに細胞の比生産性を高めるための本発明の重要な側面が、本明細書に記載されるように、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの例外的なボーラスが、細胞培養物中のこれら３つのアミノ酸の特定の最小濃度に達するために適時に添加されることであることを示した。しかしながら、この例外的なボーラスを、既に定められた製品品質属性（ＰＱＡ）を有する組換えタンパク質を産生するために既に行われている産生方法に組み込んだ場合、大量のこれらのアミノ酸がＰＱＡに悪影響を及ぼすリスクを冒さないために、（既に行われている方法と比較して）培養全体にわたって提供されるＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの総量を維持することが推奨される。そのような場合、例外的なボーラス後に追加される追加のボーラス中のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの量を適合させることができる。
【0059】
１つの所与の哺乳動物細胞株で発現される１つの所与の組換えタンパク質の製品品質属性の特定の範囲内に維持することが必要な場合、方法中に提供されるＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの総量は、好ましくは、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの例外的なボーラス添加なしの標準的な方法に匹敵するままである（図２を参照）。その後の日の標準的な方法の供給戦略に適合するために、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの例外的なボーラスの添加が実行された後、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの次の添加は、例外的なボーラス中にＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを添加した累積量が、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを例外的にボーラス添加しない標準的な方法の累積量と同等である場合に実施される。例えば、例外的なボーラスが１日目に添加され、例外的なボーラスにおいて添加されたＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの量が、標準的な方法で４日間添加されたＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの量に対応する場合、５日目に供給を再開する。別の例では、例外的なボーラスが３日目に添加され、例外的なボーラスにおいて添加されたＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの量が、標準的な方法で３日間添加されたＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの量に対応する場合、６日目に供給を再開する。同様の戦略を適用して、まだ満たされるべき一定の範囲の製品品質属性を有していない組換えタンパク質を産生することができる。そのような場合、当業者は、標準的な方法又はプラットフォーム方法をどのように適合させるかを理解し、それらは組換えタンパク質を産生するために利用される。
【0060】
この文書内では、読みやすくするために主にシステインというが、システイン自体に限定はなく、すなわち「システイン」と「シスチン」は交換可能である。定義のセクションで説明したように、細胞培養培地中のシステイン及びシスチンは一定の平衡状態にあり、２分子のシステインが酸化してシスチンの分子になり、これが還元されて２分子のシステインに戻る。システインの代わりにシスチンを使用することが好ましい場合、例外的なボーラスの添加時に少なくとも約２．４５ｍＭのシスチンに到達する必要がある。あるいは、システインとシスチンとの組み合わせを使用することができる。さらに、そのあらゆる塩を使用することができる。
【0061】
本発明の内容において、全体として、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐは同じ供給培地の一部である。好ましくは、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを含む供給培地は、いかなる他の栄養素も含有しない（すなわち、好ましくは、供給培地は、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐからなる）。これは、細胞の正しい増殖に必要な他の栄養素が、主供給培地などの他の供給培地を介してもたらされることを意味する。あるいは、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐは、Ｃｙｓを含む又はＣｙｓからなる第１の供給培地、Ｔｙｒを含む又はＴｙｒからなる第２の供給培地、及びＴｒｐを含む又はＴｒｐからなる第３の供給培地などの異なる供給培地の一部である。他の栄養素は、これらの３つの供給培地のうちの１つを介して、細胞要求を満たすために補充され得るか（この供給培地のうちの１つが主供給物である場合）、又は少なくとも第４の供給培地を介してもたらされる。
【0062】
本発明の内容において、全体として、培養開始（０日目）と、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの例外的なボーラスの添加（少なくとも最大ＶＣＣに達する前日又は７日目まで）との間に、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐは添加されない。対照的に、少なくとも、標準的な供給戦略に従って毎日のボーラス又は連続的な供給を介して添加されたであろうＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの量が、例外的なボーラスとして一度に添加され（培養の１日目と７日目との間及び／又は最大ＶＣＣに達すると予想される少なくとも前日）、次いで、その後の日の標準的な方法の供給戦略に適合するために、例えば例外的なボーラス添加中にＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを添加した累積量がＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの例外的なボーラスを添加しない標準的な方法の累積量と同等である場合に、「通常の」供給戦略が再開する（図２を参照）。例えば、例外的なボーラスで１日目に添加されたＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの量が、標準的な方法で４日間添加されたＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの量に対応する場合、５日目に供給を再開する（図２参照）。最大ＶＣＣに達する（又は達すると予想される）日は、本発明による方法が実行されるたびに制御される必要はないことを理解されたい。最大ＶＣＣのこの日は、当業者に周知のように、少なくとも１回の予備実験に従って実際に決定される。上記は非限定的な例である。実際、標準的な方法と比較して、培養全体にわたって添加されるＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの総量を同じに維持したい場合、当業者は、例外的なボーラスの日及び通常の供給が再開される日（すなわち、例外的なボーラスの１日以上後）にかかわらず、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒのための全体的な供給戦略を適合させる方法を知っているであろう。非限定的な例として、基礎培地に提供された各アミノ酸０．５ｍＭを含んで１０日間の培養にわたって細胞培養体積１リットル当たり５ｍｍｏｌのＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの総量を提供することを望む場合、２日目に例外的なボーラスを添加して、細胞培養物中に２．４５ｍＭのＣｙｓ、１．５０ｍＭのＴｒｐ、２．７５ｍＭのＴｙｒを提供し、次いで、４日目、６日目及び８日目にさらに供給物を添加し、各供給物はそれぞれ細胞培養物中に０．８５ｍＭのＣｙｓ、１．１７ｍＭのＴｒｐ、０．７５ｍＭのＴｙｒを提供する方法を設計することができる。別の非限定的な例では、基礎培地に提供された１ｍＭの各アミノ酸を含んで、６日目の最大ＶＣＣを考慮して、１４日間の培養にわたって細胞培養体積１リットル当たり１０ｍｍｏｌのＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの総量を提供することを望むならば、４日目に例外的なボーラスを添加して、細胞培養物中に３ｍＭのＣｙｓ、２ｍＭのＴｒｐ、３ｍＭのＴｙｒを提供し、次いでさらに７日目から１２日目まで供給物を毎日添加し、各供給物はそれぞれ細胞培養物中に１ｍＭのＣｙｓ、１．１７ｍＭのＴｒｐ、１ｍＭのＴｙｒを提供する方法を設計することができる。
【0063】
当業者は、以下の方法を知っていることを理解されたい：
－各特定の細胞株／クローンについて最大ＶＣＣに達する日を決定する：これは通常、１回又は複数回の初期実験によって行われる。所与の条件下で所与のタンパク質を発現する１つの細胞株について最大ＶＣＣに達する（又は達すると予想される）日が分かれば、本発明による方法を設計することができる。すべての実験又はバッチについてＶＣＣを決定する必要はない。
－産生段階などの特定の段階に細胞培養物に添加された及び／又は細胞培養物中に存在するシステイン（及び／又はシスチン）、チロシン及びトリプトファンの濃度を測定する。そのような決定は、典型的には、１回又は複数回の初期実験によって行われる。例えば、これは、本明細書の例に記載されるように行うことができる（これらの方法に限定されない）。所与の条件下で所与のタンパク質を発現する１つの細胞株についてそれぞれの量が既知になると、本発明による方法を設計することができる。あらゆる実験又は製造バッチについてシステイン（及び／又はシスチン）、チロシン及びトリプトファンの量を決定する必要はない。
－所与の条件下で所与のタンパク質を発現する１つの細胞株によって産生された組換えタンパク質の総量を測定し、その結果、所望の技術的効果を達成するために本発明の教示を適用する。これは、本明細書の例に記載されているように、例えばＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔモデルアナライザ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．）又は分析前に－８０°Ｃで保存した細胞培養上清試料を用いたプロテインＡ高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して行うこともできる。所与の条件下で所与のタンパク質を発現する１つの細胞株について、細胞培養によって産生される組換えタンパク質の総量が既知になると、本発明による方法を設計することができる。すべての実験又はバッチについてそのような総量を決定する必要はない。
－各特定の細胞株／クローンについて最大ＶＣＣに達する日を決定する：これは通常、１回又は複数回の初期実験によって行われる。所与の条件下で所与のタンパク質を発現する１つの細胞株について最大ＶＣＣに達する（又は達すると予想される）日が分かれば、本発明による方法を設計することができる。すべての実験又はバッチについてＶＣＣを決定する必要はない。
－産生段階などの特定の段階に細胞培養物に添加された及び／又は細胞培養物中に存在するシステイン（及び／又はシスチン）、チロシン及びトリプトファンの濃度を測定する。そのような決定は、典型的には、１回又は複数回の初期実験によって行われる。例えば、これは、本明細書の例に記載されるように行うことができる（これらの方法に限定されない）。所与の条件下で所与のタンパク質を発現する１つの細胞株についてそれぞれの量が既知になると、本発明による方法を設計することができる。あらゆる実験又は製造バッチについてシステイン（及び／又はシスチン）、チロシン及びトリプトファンの量を決定する必要はない。
－所与の条件下で所与のタンパク質を発現する１つの細胞株によって産生された組換えタンパク質の総量を測定し、その結果、所望の技術的効果を達成するために本発明の教示を適用する。これは、本明細書の例に記載されているように、例えばＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔモデルアナライザ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．）又は分析前に－８０°Ｃで保存した細胞培養上清試料を用いたプロテインＡ高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して行うこともできる。所与の条件下で所与のタンパク質を発現する１つの細胞株について、細胞培養によって産生される組換えタンパク質の総量が既知になると、本発明による方法を設計することができる。すべての実験又はバッチについてそのような総量を決定する必要はない。
【0064】
本発明の内容において、全体として、培養開始時の培養培地（あるいは本明細書では基礎培地と呼ぶ）は、好ましくはタンパク質及び血清を含まない培養培地である。前記タンパク質及び血清を含まない培養培地は、市販の培地又は化学的に定義された培地であり得る。前記培養培地は、初期量のシステイン（及び／又はシスチン）、チロシン及びトリプトファンを含み得る。前記培養培地が初期量のシステイン（及び／又はシスチン）、チロシン及びトリプトファンを含まない場合、初期量のシステイン（及び／又はシスチン）、チロシン及びトリプトファンをバイオリアクタにおける培養の前又は開始時に添加することができる。
【0065】
本発明の内容において、全体として、主供給培地は、標準的な主供給培地又は濃縮された主供給培地、例えば濃縮された規定の主供給培地であり得る。好ましくは、この主供給培地は、Ｃｙｓ（システインもシスチンも含まない）、Ｔｒｐ及びＴｙｒを含まない。
【0066】
本発明の内容において、全体として、組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞は、好ましくはフェドバッチ方法で培養される。一態様では、産生段階は、少なくとも７日間、好ましくは少なくとも１０日間、より好ましくは少なくとも１２日間、例えば１２日間、１３日間、１４日間又は１５日間の持続時間を有する。例外的なボーラスでのＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの添加は本発明に従って行われるが、採取の１日前又は２日前まで、一定の間隔で（毎日又は１日おきなど）又は要求に応じて、残りの必要な栄養素（例えば、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒ以外のアミノ酸、塩、糖）を含む供給物（複数可）（主供給物など）で培養物を補足することができる。
【0067】
本発明の内容において、全体として、培養培地中で前記哺乳動物細胞を培養する工程は、好ましくは産生段階中に行われる。
【0068】
本発明の内容において、全体として、産生段階は、好ましくは５０Ｌ以上、１００Ｌ以上、５００Ｌ以上、１０００Ｌ以上、２，０００Ｌ以上、５，０００Ｌ以上、１０，０００Ｌ以上、又は２０，０００Ｌよりも大きな体積を有するバイオリアクタ（産生バイオリアクタなど）で行われる。換言すれば、組換えタンパク質を産生する哺乳動物細胞は、好ましくは５０Ｌ以上、１００Ｌ以上、５００Ｌ以上、１０００Ｌ以上、２，０００Ｌ以上、５，０００Ｌ以上、１０，０００Ｌ以上、又は２０，０００Ｌよりも大きな体積を有するバイオリアクタ（産生バイオリアクタなど）で培養される。
【0069】
本発明の内容において、全体として、適切な哺乳動物宿主細胞（哺乳動物細胞ともいう）には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）、リンパ球系細胞株、例えばＮＳＯ骨髄腫細胞及びＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞、骨髄腫又はハイブリドーマ細胞が含まれる。好ましい態様では、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。適切なタイプのＣＨＯ細胞には、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯＫ１－ＳＶ、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ、例えばＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＸＢ１、又はＣＨＯ－Ｓ細胞が含まれ得る。宿主細胞は、好ましくは、目的の組換えタンパク質をコードする発現ベクターで安定に形質転換又はトランスフェクトされる。
【0070】
本発明の内容全体として、組換えタンパク質は、サイトカイン、成長因子、ホルモン、融合タンパク質又は抗体などのタンパク質である。タンパク質が抗体である場合、それは、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体であり得、好ましくはＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４である。あるいは、それは、本明細書で与えられる定義によるあらゆる種類であり得る。好ましくは、本発明の方法（ｍｅｔｈｏｄ）、使用及びプロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ）によるタンパク質は、抗体若しくはその抗原結合断片又は融合タンパク質である。本発明による方法は、組換えタンパク質を含む細胞培養液（ＣＣＦ）を回収する工程（採取工程）をさらに含むことができる。採取に続いて、例えばタンパク質が抗体である場合、プロテインＡクロマトグラフィー及び他のクロマトグラフィー／濾過工程を使用して、組換えタンパク質を精製してもよい。方法は、精製された組換えタンパク質を、例えば、１０ｍｇ／ｍｌ以上、例えば５０ｍｇ／ｍｌ以上、例えば１００ｍｇ／ｍｌ以上、１５０ｍｇ／ｍｌ以上、又はさらには２００ｍｇ／ｍＬ以上の濃度などの高タンパク質濃度を有する製剤に製剤化する工程をさらに含んでもよい。限定するものではないが、製剤は、液体製剤、凍結乾燥製剤又は噴霧乾燥製剤であり得る。
【0071】
別の態様では、初期培養培地（又は基礎培地）からＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを枯渇させることができるので、例外的なボーラスによって細胞培養物中に提供されるＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの濃度は、Ｃｙｓについて少なくとも約２．４５ｍＭ；Ｔｒｐについて少なくとも約１．５０ｍＭ；Ｔｙｒについて少なくとも約２．７５ｍＭからなり得る。あるいは、例外的なボーラスによって細胞培養物中に提供されるＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの濃度は、Ｃｙｓについて約２．４５ｍＭ～約６．６ｍＭ；Ｔｒｐについて約１．５０ｍＭ～約２．９ｍＭ；Ｔｙｒについて約２．７５ｍＭ～約６．２ｍＭからなり得る。さらなる態様では、初期培養培地（又は基礎培地）がＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを含有する場合、細胞がこれらの３つのアミノ酸を非常に迅速に消費し得るので、例外的なボーラスによって細胞培養物中に提供されるＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの濃度は、Ｃｙｓについて少なくとも約２．４５ｍＭ；Ｔｒｐについて少なくとも約１．５０ｍＭ；Ｔｙｒについて少なくとも約２．７５ｍＭからなり得る。あるいは、例外的なボーラスによって提供されるＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの濃度は、Ｃｙｓについて約２．４５ｍＭ～約６．６ｍＭ；Ｔｒｐについて約１．５０ｍＭ～約２．９ｍＭ；Ｔｙｒについて約２．７５ｍＭ～約６．２ｍＭからなり得る。したがって、本明細書では、組換えタンパク質を産生するための方法、組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞を培養するための方法、又は培養中の哺乳動物細胞の比生産性を増加させるための方法が提供され、前記哺乳動物細胞を培養培地中で培養し、培養の１日目と７日目との間にシステイン（Ｃｙｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びチロシン（Ｔｙｒ）の例外的なボーラスを添加する工程を含み、例外的なボーラスによって細胞培養物中に提供されるＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの濃度は、Ｃｙｓについて少なくとも約２．４５ｍＭ；Ｔｒｐについて少なくとも約１．５０ｍＭ；Ｔｙｒについて少なくとも約２．７５ｍＭからなる。あるいは、本明細書では、組換えタンパク質を産生するための方法、組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞を培養するための方法、又は培養中の哺乳動物細胞の比生産性を増加させるための方法が提供され、前記哺乳動物細胞を培養培地中で培養し、培養の１日目と７日目との間にシステイン（Ｃｙｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びチロシン（Ｔｙｒ）の例外的なボーラスを添加する工程を含み、例外的なボーラスによって細胞培養物中に提供されるＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの濃度は、Ｃｙｓについて約２．４５ｍＭ～約６．６ｍＭ；Ｔｒｐについて約１．５０ｍＭ～約２．９ｍＭ；Ｔｙｒについて約２．７５ｍＭ～約６．２ｍＭからなる。
【図面の簡単な説明】
【0072】
【図1】Ａ）粉末からの「通常の」供給物の調製。Ｂ）粉末からの「濃縮」供給物の調製。
【図2】標準的な供給戦略と本発明による供給戦略を示す図である。各ピックは、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐのボーラス添加に対応する。
【図3】Ｍａｂ－１を産生するＣＨＯ細胞株の生細胞濃度プロファイル。
【図4】Ｍａｂ－１の力価プロファイル。
【図5】比生産性プロファイル。
【図6】ｍＡｂ－１の主な電荷。
【図7】ｍＡｂ－１の薬物色強度。
【図8】比生産性の等高線図である。
【図9】Ｍａｂ－２を産生するＣＨＯ細胞株についての累積生細胞数の等高線図。
【図10】ｍＡｂ－２の比生産性。
【図11】Ａ）Ｍａｂ－３を産生するＣＨＯ細胞株に対するＶＣＣ、Ｂ）Ｍａｂ－３の力価及びＣ）Ｍａｂ－３を産生する細胞株の比生産性。
【図12】ｍＡｂ３の特性評価プロファイル（酸性種、主要な種及び塩基性種）
【図13】ｍＡｂ－４の比生産性。
【0073】
例
細胞株、細胞培養及び実験手順
４つの異なる産生ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞株を使用した（それぞれｍＡｂ－１（７．３～７．９５のｐＩを有する完全ＩｇＧ４抗体）、ｍＡｂ－２（８．６～９．２のｐＩを有するＴｒｙｂｅ抗体）、ｍＡｂ－３（８．１～８．４のｐＩを有する完全ＩｇＧ４抗体）、ｍＡｂ－４（６．１～６．３のｐＩを有する完全ＩｇＧ４抗体）を産生する）。
細胞株、細胞培養及び実験手順
４つの異なる産生ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞株を使用した（それぞれｍＡｂ－１（７．３～７．９５のｐＩを有する完全ＩｇＧ４抗体）、ｍＡｂ－２（８．６～９．２のｐＩを有するＴｒｙｂｅ抗体）、ｍＡｂ－３（８．１～８．４のｐＩを有する完全ＩｇＧ４抗体）、ｍＡｂ－４（６．１～６．３のｐＩを有する完全ＩｇＧ４抗体）を産生する）。
【0074】
細胞を、多発酵制御システム（ＭＦＣＳ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって制御される供給塔（Ｃ－ＤＣＵＩＩ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を有する２Ｌ撹拌タンクガラスバイオリアクタ（ＳＴＲ）又は振盪フラスコ中で培養した。リアクタには３セグメントブレードインペラを装備した。培養開始体積は、培養終了体積が最適であることを確実にするように適合された。産生バイオリアクタに目標播種密度（ＴＳＤ）で播種した。産生バイオリアクタのｐＨ制御を約７．０に制御した。ｐＯ２を特定の範囲に制御するために、空気、窒素及び酸素を、所定の混合物プロファイルを使用してカスケードコントローラに基づいて培養容器に散布した。温度を約３７°Ｃに制御した。製造をフェドバッチモードで１４日間行った。この段階の間、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は培地中に分泌される。試料を毎日採取して、ＶＣＣ、生存率、オフラインｐＨ、ｐＣＯ２、重量オスモル濃度、グルコース－乳酸濃度、アミノ酸濃度及びｍＡｂ濃度（－８０°Ｃで貯蔵）を決定した。消泡剤を要求に応じて手動で添加した。接種７２時間後に、供給培地１（主供給；Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを除く必要な栄養素を含む）を用いて所定の速度で連続栄養供給を開始した。グルコース濃度が特定の閾値を下回ったときに（毎日測定）、グルコース（供給培地２）を必要に応じて培養物に添加した。とくに明記しない限り、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを含有する供給培地３を、（０．３５ｘ１０６細胞／ｍＬで接種したバイオリアクタの場合）３日目から、又は（より高い細胞密度で接種したバイオリアクタの場合）０日目から、産生の１２日目まで毎日ボーラスとして添加した。供給培地３を添加する前に、アミノ酸分析用の試料を採取した。供給後の細胞外濃度は、供給培地３の組成及び供給培地３添加前に測定された栄養素濃度、又は基礎培地組成に基づいて計算された。
【0075】
分析方法
細胞を、トリパンブルー排除に基づいて操作したＶＩ－ＣＥＬＬ（登録商標）ＸＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）自動細胞計数装置を使用して計数した。培養培地中のグルコース及び乳酸レベルを、ＮＯＶＡ ４００ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ自動分析装置（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）又はＣｅｄｅｘ Ｂｉｏ ＨＴ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて決定した。代謝産物濃度もまた、ＣｅｄｅｘＢｉｏＨＴシステム（Ｒｏｃｈｅ）を使用して毎日決定した。製品の力価分析は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔモデルアナライザ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｉｎｃ）、又は分析前に－８０°Ｃで保存した細胞培養上清試料を用いたＣＥＤＥＸ又はプロテインＡ高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で行った。アミノ酸を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ遠心フィルタ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して限外濾過した後、逆相ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ＡｃｃＱ・Ｔａｇｕｌｔｒａ法）によって分析した。細胞培養上清試料を採取し、ＡＫＴＡ ＸｐｒｅｓｓシステムでプロテインＡ精製を用いて精製した。精製ｍＡｂの主要、酸性（酸性ピークグループについてはＡＰＧ）及び塩基性（塩基性ピークグループについてはＢＰＧ）アイソフォームの相対的割合を、画像化キャピラリー電気泳動（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ ｉＣＥ３）によって決定した。精製ｍＡｂの凝集体（ＨＭＷＳ）、モノマー及び断片（ＬＭＷＳ）レベルをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ－ＵＰＬＣ）又はプロテインＡ ＨＰＬＣ勾配によって決定した。濃縮抗体組成物の色強度を、透過型分光光度計（ＵｌｔｒａｓｃａｎＰｒｏ）を使用して濃縮プロテインＡ溶出液中で測定し、ＣＩＥ（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ ｌ’Ｅｃｌａｉｒａｇｅ）スケールと比較した。数値結果を４０ｍｇ／ｍＬの濃度に対して正規化した。統計分析は、ＳＡＳソフトウェアＪＭＰ １１（ｃ）を使用して行った。
細胞を、トリパンブルー排除に基づいて操作したＶＩ－ＣＥＬＬ（登録商標）ＸＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）自動細胞計数装置を使用して計数した。培養培地中のグルコース及び乳酸レベルを、ＮＯＶＡ ４００ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ自動分析装置（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）又はＣｅｄｅｘ Ｂｉｏ ＨＴ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて決定した。代謝産物濃度もまた、ＣｅｄｅｘＢｉｏＨＴシステム（Ｒｏｃｈｅ）を使用して毎日決定した。製品の力価分析は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔモデルアナライザ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｉｎｃ）、又は分析前に－８０°Ｃで保存した細胞培養上清試料を用いたＣＥＤＥＸ又はプロテインＡ高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で行った。アミノ酸を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ遠心フィルタ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して限外濾過した後、逆相ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ＡｃｃＱ・Ｔａｇｕｌｔｒａ法）によって分析した。細胞培養上清試料を採取し、ＡＫＴＡ ＸｐｒｅｓｓシステムでプロテインＡ精製を用いて精製した。精製ｍＡｂの主要、酸性（酸性ピークグループについてはＡＰＧ）及び塩基性（塩基性ピークグループについてはＢＰＧ）アイソフォームの相対的割合を、画像化キャピラリー電気泳動（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ ｉＣＥ３）によって決定した。精製ｍＡｂの凝集体（ＨＭＷＳ）、モノマー及び断片（ＬＭＷＳ）レベルをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ－ＵＰＬＣ）又はプロテインＡ ＨＰＬＣ勾配によって決定した。濃縮抗体組成物の色強度を、透過型分光光度計（ＵｌｔｒａｓｃａｎＰｒｏ）を使用して濃縮プロテインＡ溶出液中で測定し、ＣＩＥ（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ ｌ’Ｅｃｌａｉｒａｇｅ）スケールと比較した。数値結果を４０ｍｇ／ｍＬの濃度に対して正規化した。統計分析は、ＳＡＳソフトウェアＪＭＰ １１（ｃ）を使用して行った。
【0076】
例１
この実験のために、２Ｌのバイオリアクタに、０．３５ｘ１０６細胞／ｍＬの播種密度でｍＡｂ－１を産生するＣＨＯ細胞を接種した。実験手順に記載されているように、フェドバッチ方法で３つの条件を試験した。バイオリアクタ（ＢＲ）ＩＤ １及び２は、同じ供給戦略を有していた（Ｃｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒを毎日添加し、３日目に最初のボーラスを添加した）が、ＢＲ ＩＤ ２では、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの濃度が２倍低かった。ＢＲ ＩＤ ３は、条件２と同じ供給培地組成を有していた（すなわち、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの濃度は、ＢＲ ＩＤ １と比較して２倍低かった）。しかし、３日目から開始してＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒを毎日供給する代わりに、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを含有する供給物を、バイオリアクタＩＤ ２の３日目と７日目との間に添加されるべきＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの量に対応する例外的なボーラス（高ボーラスともいう）として３日目に添加した。３日目の後、７日目までを含んで、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐは、もはやバイオリアクタＩＤ ３の細胞培養の産生物に供給培地を添加しなかった。８日目の時点で、供給戦略はバイオリアクタＩＤ ２と同様である（すなわち、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの供給が再開する）。目的は、高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ及び添加タイミングが組換えｍＡｂ－１の細胞増殖及び比生産性に及ぼす影響を評価することであった（ｍＡｂ－１を発現するこの細胞株の最大ＶＣＣは、予備実験から１０日目に推定され、ＢＲ ＩＤ １及び２を用いてこの例で行われた各バイオリアクタで、すなわち例外的なボーラスなしの条件で確認された）。
この実験のために、２Ｌのバイオリアクタに、０．３５ｘ１０６細胞／ｍＬの播種密度でｍＡｂ－１を産生するＣＨＯ細胞を接種した。実験手順に記載されているように、フェドバッチ方法で３つの条件を試験した。バイオリアクタ（ＢＲ）ＩＤ １及び２は、同じ供給戦略を有していた（Ｃｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒを毎日添加し、３日目に最初のボーラスを添加した）が、ＢＲ ＩＤ ２では、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの濃度が２倍低かった。ＢＲ ＩＤ ３は、条件２と同じ供給培地組成を有していた（すなわち、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの濃度は、ＢＲ ＩＤ １と比較して２倍低かった）。しかし、３日目から開始してＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒを毎日供給する代わりに、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを含有する供給物を、バイオリアクタＩＤ ２の３日目と７日目との間に添加されるべきＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの量に対応する例外的なボーラス（高ボーラスともいう）として３日目に添加した。３日目の後、７日目までを含んで、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐは、もはやバイオリアクタＩＤ ３の細胞培養の産生物に供給培地を添加しなかった。８日目の時点で、供給戦略はバイオリアクタＩＤ ２と同様である（すなわち、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの供給が再開する）。目的は、高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ及び添加タイミングが組換えｍＡｂ－１の細胞増殖及び比生産性に及ぼす影響を評価することであった（ｍＡｂ－１を発現するこの細胞株の最大ＶＣＣは、予備実験から１０日目に推定され、ＢＲ ＩＤ １及び２を用いてこの例で行われた各バイオリアクタで、すなわち例外的なボーラスなしの条件で確認された）。
【表1】
【0077】
図３に示される結果は、最大ＶＣＣに達する前に（ＢＲ ＩＤ ３；すなわち、８日目の前に）、（細胞培養物において）システイン、チロシン及びトリプトファンが高濃度に到達した条件について、より低い細胞増殖を実証する。バイオリアクタＩＤ ３のＶＣＣプロファイルが低いにもかかわらず、その条件の最終的な力価はバイオリアクタＩＤ ２より高かった（図４参照）。比生産性の観点（図５）から、バイオリアクタＩＤ ３についてＱｐが有意に増加したことが示された。最後に、実験手順のセクションに記載されているように測定された主電荷（図６）は、バイオリアクタＩＤ ２と３との間で同等であり、産生されたｍＡｂの総量当たりの産生を通して添加されたＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの総量が変化しない場合、組換えタンパク質電荷変異体に対する高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの影響はないことが確認された。同様の傾向が色強度で観察された（図７）。さらに、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの総量はＢＲ ＩＤ２及びＢＲ ＩＤ３について同一であったが、例外的なボーラスとして特定のタイミングに従って一度に前記量を添加することは、比生産性を高めながら細胞増殖を阻害することにプラスの影響を与えた。
【0078】
例１の結論：多量のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを一度に（同時に又は付随して）、特定のタイミングに従って添加すると、細胞増殖が阻害され、比生産性（ｍＡｂ１）が増加した。実際、この例に示される実験から、高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ、すなわち少なくとも０．３４ｇ／Ｌ、０．３７ｇ／Ｌ及び０．９８ｇ／Ｌが、最大ＶＣＣの日の前に細胞培養物の産生中に（細胞培養物において）到達し、比生産性の増加をもたらしたと結論付けられた。
【0079】
例２
この実験のために、１５×２Ｌのバイオリアクタに、上記の実験手順に記載されるようなフェドバッチ方法において３．７５ｘ１０６細胞／ｍＬの播種密度でｍＡｂ－２を産生するＣＨＯ細胞を接種した。この実験では、様々な最大濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐが最大ＶＣＣの日の前の異なる時点で（細胞培養物において）到達した複数の条件を試験した（表２）。すべての条件について、同じ総量（基礎培地及び異なる供給物を介してもたらされる総量）のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを、産生実行にわたって添加した。ｍＡｂ－２を発現する細胞株の最大ＶＣＣは、予備実験において７日目に推定され、この例における各バイオリアクタ実行について確認された。
この実験のために、１５×２Ｌのバイオリアクタに、上記の実験手順に記載されるようなフェドバッチ方法において３．７５ｘ１０６細胞／ｍＬの播種密度でｍＡｂ－２を産生するＣＨＯ細胞を接種した。この実験では、様々な最大濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐが最大ＶＣＣの日の前の異なる時点で（細胞培養物において）到達した複数の条件を試験した（表２）。すべての条件について、同じ総量（基礎培地及び異なる供給物を介してもたらされる総量）のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを、産生実行にわたって添加した。ｍＡｂ－２を発現する細胞株の最大ＶＣＣは、予備実験において７日目に推定され、この例における各バイオリアクタ実行について確認された。
【表2】
【0080】
システイン、トリプトファン及びチロシンの例外的なボーラスを、それぞれ０．３２ｇ／Ｌ、０．３３ｇ／Ｌ及び０．５１ｇ／Ｌ以上の濃度の例外的なボーラスの後に（細胞培養物において）到達した最高濃度について、最大ＶＣＣに達する前（すなわち、２日前又は４日前）に添加した場合、比生産性（図８）が増加した。最大ＶＣＣの日に、（細胞培養物において）高濃度のシステイン、トリプトファン及びチロシンに達した場合、比生産性に対する影響は観察されなかった。
また、システイン、トリプトファン及びチロシンの例外的なボーラスを、高ボーラスの後に（細胞培養物において）到達した最高濃度について、すなわち、それぞれ０．３２ｇ／Ｌ、０．３３ｇ／Ｌ及び０．５１ｇ／Ｌ以上の濃度について、最大ＶＣＣに達する日の２日前又は４日前に実施した場合、累積ＩＶＣＣ（図９）は減少した。
低濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐが最大ＶＣＣの日前に（細胞培養物において）到達した対照条件（対照条件）と、高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐが最大ＶＣＣに到達した日に（細胞培養物において）到達した条件の比生産性を比較したところ、有意差は認められなかった（図１０）。
また、システイン、トリプトファン及びチロシンの例外的なボーラスを、高ボーラスの後に（細胞培養物において）到達した最高濃度について、すなわち、それぞれ０．３２ｇ／Ｌ、０．３３ｇ／Ｌ及び０．５１ｇ／Ｌ以上の濃度について、最大ＶＣＣに達する日の２日前又は４日前に実施した場合、累積ＩＶＣＣ（図９）は減少した。
低濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐが最大ＶＣＣの日前に（細胞培養物において）到達した対照条件（対照条件）と、高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐが最大ＶＣＣに到達した日に（細胞培養物において）到達した条件の比生産性を比較したところ、有意差は認められなかった（図１０）。
【0081】
例２の結論：Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの例外的なボーラス（細胞培養培地中のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの総濃度が高くなる）を適時に添加すると、細胞増殖が阻害され、比生産性（ｍＡｂ２）が増加した。Ｑｐに対するＣｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒのこの例外的なボーラスの添加（細胞培養培地中のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの総濃度が高くなる）の利点は、前記添加が細胞培養物において最大ＶＣＣに達する日前に行われた場合にのみ観察されるようである。高総濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐは、細胞培養培地中で同時に又は付随して到達しなければならない。
【0082】
例３
この実験のために、５×２Ｌのバイオリアクタに、上記の実験手順に記載されるようなフェドバッチ方法において３．７５ｘ１０６細胞／ｍＬの播種密度で完全抗体（ｍＡｂ－３）を産生するＣＨＯ細胞を接種した。この実験では、様々な最大濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐが最大ＶＣＣに達する４日前に（細胞培養物において）到達した２つの条件を試験した（この細胞株について８日目に最大ＶＣＣが観察された）（表３）。すべての条件について、同じ総量（基礎培地及び異なる供給物を介してもたらされる総量）のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを、産生実行にわたって添加した。図１１Ｃに示される平均比生産性は、産生中に到達した最高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを有するバイオリアクタ、すなわちそれぞれ０．８０ｇ／Ｌ、１．０８ｇ／Ｌ及び０．５８ｇ／Ｌ（ＢＲ ＩＤ １９及びＢＲ ＩＤ ２０）が最高の比生産性をもたらしたことを示している。この例は、他のｍＡｂを産生する他の細胞株で観察されたことを確認し、最大ＶＣＣに達する日の前の細胞培養物の産生中の（細胞培養物における）高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐが、比生産性の増加をもたらすことを確認した。これらの高濃度は、適時に添加された例外的なボーラスによって達成された。図１２に示されるように、ｍＡｂ３（中性形態、酸性種及び塩基性種）の特徴づけプロファイルは、どのような条件であっても類似している（１ポイント未満の変動）。したがって、抗体の品質に対する高ボーラスのタイミングの影響はない（ただし、ＶＣＣに達する少なくとも１日前に実施する必要がある）。
この実験のために、５×２Ｌのバイオリアクタに、上記の実験手順に記載されるようなフェドバッチ方法において３．７５ｘ１０６細胞／ｍＬの播種密度で完全抗体（ｍＡｂ－３）を産生するＣＨＯ細胞を接種した。この実験では、様々な最大濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐが最大ＶＣＣに達する４日前に（細胞培養物において）到達した２つの条件を試験した（この細胞株について８日目に最大ＶＣＣが観察された）（表３）。すべての条件について、同じ総量（基礎培地及び異なる供給物を介してもたらされる総量）のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを、産生実行にわたって添加した。図１１Ｃに示される平均比生産性は、産生中に到達した最高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを有するバイオリアクタ、すなわちそれぞれ０．８０ｇ／Ｌ、１．０８ｇ／Ｌ及び０．５８ｇ／Ｌ（ＢＲ ＩＤ １９及びＢＲ ＩＤ ２０）が最高の比生産性をもたらしたことを示している。この例は、他のｍＡｂを産生する他の細胞株で観察されたことを確認し、最大ＶＣＣに達する日の前の細胞培養物の産生中の（細胞培養物における）高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐが、比生産性の増加をもたらすことを確認した。これらの高濃度は、適時に添加された例外的なボーラスによって達成された。図１２に示されるように、ｍＡｂ３（中性形態、酸性種及び塩基性種）の特徴づけプロファイルは、どのような条件であっても類似している（１ポイント未満の変動）。したがって、抗体の品質に対する高ボーラスのタイミングの影響はない（ただし、ＶＣＣに達する少なくとも１日前に実施する必要がある）。
【表3】
【0083】
例３の結論：本例により、最大ＶＣＣに達する日の前に、細胞培養物中のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの高い総濃度に達する（Ｃｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの場合、例外的なボーラスの添加による）ことの、比生産性の増加に対する正の影響が再度確認された。
【0084】
例４－３つのアミノ酸の相乗効果
この実験は、比生産性に対する、（細胞培養物中の）高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの影響が、３つのアミノ酸の相乗効果によるものであるか否か、又はそれが１つ又は２つのアミノ酸のみによるものであるか否かを評価するために設計された。
この例のために、１９個の振盪フラスコに、材料及び方法に記載されているようにフェドバッチ方法で０．３５ｘ１０６細胞／ｍＬの播種密度でｍＡｂ－４を産生するＣＨＯ細胞を接種した。最大ＶＣＣに達する日の４日前（すなわち、８日目）に到達した様々な最大濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを有する複数の条件を試験し（表４）、３つのアミノ酸の効果を分離した。すべての条件について、同じ総量（基礎培地及び異なる供給物を介してもたらされる総量）のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを、産生実行にわたって添加した。例外的なボーラスの添加直後、（細胞培養物において）Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐについて到達した最大濃度は、それぞれ０．４８ｇ／Ｌ、０．７１ｇ／Ｌ及び０．４１ｇ／Ｌであった。
図１３に示されるすべての条件の平均比生産性は、高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの組み合わせで比生産性の驚くべき相乗的増加が得られたことを示している。
この実験は、比生産性に対する、（細胞培養物中の）高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの影響が、３つのアミノ酸の相乗効果によるものであるか否か、又はそれが１つ又は２つのアミノ酸のみによるものであるか否かを評価するために設計された。
この例のために、１９個の振盪フラスコに、材料及び方法に記載されているようにフェドバッチ方法で０．３５ｘ１０６細胞／ｍＬの播種密度でｍＡｂ－４を産生するＣＨＯ細胞を接種した。最大ＶＣＣに達する日の４日前（すなわち、８日目）に到達した様々な最大濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを有する複数の条件を試験し（表４）、３つのアミノ酸の効果を分離した。すべての条件について、同じ総量（基礎培地及び異なる供給物を介してもたらされる総量）のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを、産生実行にわたって添加した。例外的なボーラスの添加直後、（細胞培養物において）Ｃｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐについて到達した最大濃度は、それぞれ０．４８ｇ／Ｌ、０．７１ｇ／Ｌ及び０．４１ｇ／Ｌであった。
図１３に示されるすべての条件の平均比生産性は、高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの組み合わせで比生産性の驚くべき相乗的増加が得られたことを示している。
【0085】
結論：本例により、さらに別の細胞株（抗体ｍＡｂ－４を発現する）を用いて、最大ＶＣＣの日前に細胞培養物中に高い総濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐが存在する場合（すなわち、Ｃｙｓについて少なくとも約２．４５ｍＭ；Ｔｒｐについて少なくとも約１．５０ｍＭ、Ｔｙｒについては少なくとも約２．７５ｍＭ；例外的なボーラス添加による）、比生産性（Ｑｐ）の増加がもたらされることが確認された。高総濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐは、同時に又は付随して到達しなければならない。同時に又は付随して高濃度のＣｙｓ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの効果は相乗的であり、相加的ではなかった。
【表4】
【0086】
参考文献
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【国際調査報告】