特表 2024-513643 ＰＤ－Ｌ１に対する単一ドメイン抗体及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-27

(54)【発明の名称】ＰＤ－Ｌ１に対する単一ドメイン抗体及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20240319BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240319BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240319BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240319BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240319BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240319BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240319BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240319BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240319BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240319BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240319BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240319BHJP

   A61K 47/55 20170101ALI20240319BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240319BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 11/02 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 11/04 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 13/10 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 13/08 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240319BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20240319BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C07K16/46

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

C12P21/08

A61K39/395 N

A61K39/395 L

A61K45/00

A61K47/55

A61K47/68

A61P35/00

A61P17/00

A61P11/00

A61P1/16

A61P25/00

A61P15/00

A61P1/04

A61P1/02

A61P11/02

A61P11/04

A61P13/10

A61P13/12

A61P35/04

A61P13/08

A61P1/18

A61P35/02

A61P7/06

A61P31/00

A61P31/12

A61P43/00 105

G01N33/574 A

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023550153

(86)(22)【出願日】2022-02-21

(85)【翻訳文提出日】2023-09-04

(86)【国際出願番号】 KR2022002529

(87)【国際公開番号】W WO2022177393

(87)【国際公開日】2022-08-25

(31)【優先権主張番号】10-2021-0022807

(32)【優先日】2021-02-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521165873

【氏名又は名称】シャペロン インク．

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＰＥＲＯＮ ＩＮＣ．

【住所又は居所原語表記】＃６０６（Ｊａｇｏｋ－ｄｏｎｇ）， Ｇａｎｇｎａｍ ＡＣＥ Ｔｏｗｅｒ １７４－１０， Ｊａｇｏｋ－ｒｏ Ｇａｎｇｎａｍ－ｇｕ， Ｓｅｏｕｌ ０６３７３ （ＫＲ）

(71)【出願人】

【識別番号】509329800

【氏名又は名称】ソウル大学校産学協力団

【氏名又は名称原語表記】ＳＥＯＵＬ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ Ｒ＆ＤＢ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】ソン、スンヨン

(72)【発明者】

【氏名】イ、サンボム

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA13

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C076CC01

4C076CC10

4C076CC14

4C076CC15

4C076CC16

4C076CC17

4C076CC18

4C076CC26

4C076CC27

4C076CC31

4C076CC35

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF34

4C084AA17

4C084NA14

4C084ZA011

4C084ZA341

4C084ZA551

4C084ZA591

4C084ZA661

4C084ZA671

4C084ZA751

4C084ZA811

4C084ZA891

4C084ZB021

4C084ZB211

4C084ZB261

4C084ZB271

4C084ZB321

4C084ZB331

4C085AA14

4C085AA16

4C085AA25

4C085AA26

4C085AA27

4C085BB36

4C085BB41

4C085BB43

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ＰＤ－Ｌ１に対する単一ドメイン抗体及びその用途に関する。さらに詳しくは、免疫チェックポイントタンパク質（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）であるＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する単一ドメイン抗体を調製し、その免疫抗原に対する親和性及び抗腫瘍効果が確認されたので、免疫療法における免疫チェックポイント阻害剤として、前記単一ドメイン抗体を有用に用いることができる。
【選択図】図４

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む抗体またはその抗原結合断片であって、
前記ｓｄＡｂが、
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１；
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２；及び
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
を含む、抗体またはその抗原結合断片。

【請求項2】

前記ｓｄＡｂが、以下のＶＨＨドメインを含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片：
配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるＦＲ１；
配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるＦＲ２；
配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるＦＲ３；及び
配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるＦＲ４。

【請求項3】

前記ｓｄＡｂが、配列番号１及び１０のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、請求項２に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項4】

少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項5】

少なくとも１つのアミノ酸置換が保存的置換である、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項6】

少なくとも１つのアミノ酸置換がアミノ酸の非遺伝子コードアミノ酸または合成アミノ酸への置換である、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項7】

前記ｓｄＡｂが、Ｆｃ断片に融合された重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項8】

前記ＨＣＡｂが、単量体性または多量体性である、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項9】

前記Ｆｃ断片が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項10】

前記ｓｄＡｂが、ペプチドリンカーを介してＦｃ断片に融合する、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項11】

前記ＨＣＡｂが、配列番号５及び１１のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項12】

少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項13】

少なくとも１つのアミノ酸置換が保存的置換である、請求項１２に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項14】

少なくとも１つのアミノ酸置換がアミノ酸の非遺伝子コードアミノ酸または合成アミノ酸への置換である、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項15】

（ａ）前記ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する第２の抗原結合部分と、を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項16】

前記第２の抗原結合部分が、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、（Ｆａｂ'）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディまたは第２のｓｄＡｂである、請求項１５に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項17】

前記第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が、ペプチドリンカーを介して互いに融合している、請求項１５に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項18】

免疫調節剤、サイトカイン、細胞毒性剤、化学療法剤、診断剤、抗ウイルス剤、抗微生物剤または薬物に結合している、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項19】

免疫調節剤、サイトカイン、細胞毒性剤、化学療法剤、診断剤、抗ウイルス剤、抗微生物剤または薬物に結合している請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、抗体複合体。

【請求項20】

請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする、核酸分子。

【請求項21】

請求項２０に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。

【請求項22】

請求項２１に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。

【請求項23】

（ａ）抗体を発現させる条件下で請求項２２に記載の宿主細胞を培養するステップと、
（ｂ）発現された抗体またはその抗原結合断片を回収するステップと、
を含む、抗体またはその抗原結合断片を産生する方法。

【請求項24】

請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片、あるいは請求項１９に記載の抗体複合体を有効成分として含有する、癌の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項25】

前記癌が、黒色腫、肺癌、肝臓癌、神経膠腫、卵巣癌、大腸癌、頭頸部癌、膀胱癌、腎細胞癌、胃癌、乳癌、転移癌、前立腺癌、膵臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、孤立性骨髄腫及び再生不良性貧血からなる群から選択される、請求項２４に記載の薬学的組成物。

【請求項26】

前記薬学的組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項２４に記載の薬学的組成物。

【請求項27】

請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片、あるいは請求項１９に記載の抗体複合体を薬学的に有効な量で個体に投与するステップを含む、癌の予防または治療方法。

【請求項28】

癌の予防または治療に用いるための、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片、あるいは請求項１９に記載の抗体複合体の用途。

【請求項29】

（ｉ）請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片を試料と接触させるステップと、
（ｉｉ）前記抗体またはその抗原結合断片とＰＤ－Ｌ１との間の複合体形成を検出するか、あるいは複合体の量を決定するステップと、
を含む、試料からＰＤ－Ｌ１を検出するか、あるいはＰＤ－Ｌ１の量を決定する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫チェックポイントタンパク質（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）であるＰＤ－Ｌ１に対する単一ドメイン抗体及びその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

最近、人体の免疫システムを用いて新たに開発された免疫抗癌療法の治療効果が立証されたことから、従来の化学療法剤及び標的治療剤による抗癌治療は、免疫治療剤による免疫抗癌療法に変化しつつある。

【0003】

基本的に、癌患者の免疫細胞は、癌抗原に対する耐性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を獲得しているので、癌細胞を認識することはできるものの、機能的には抑制されており、癌細胞を効果的に除去することができない。耐性に陥った免疫細胞を目覚めさせて活性化された免疫細胞へ誘導し、癌細胞を破壊することが免疫治療の核心である。そのような免疫治療としては、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２などのサイトカイン治療剤、樹状細胞を用いた癌ワクチン、Ｔ細胞を用いた細胞治療剤、免疫チェックポイントタンパク質（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を遮断する免疫チェックポイント阻害剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＩＣＩ）などが挙げられ、通常、そのような治療剤を免疫抗癌剤（ｉｍｍｕｎｏ－ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｔｈｅｒａｐｙ）と呼ぶ。その中でも、国際的な製薬会社が競争的に開発している免疫抗癌剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。

【0004】

免疫チェックポイントタンパク質（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、細胞膜タンパク質であり、免疫細胞の分化、増殖、活性を抑制する。具体的には、このタンパク質は通常、活性化されたＴ細胞で発現され、Ｔ細胞の増殖、サイトカイン分泌、細胞毒性を低下させ、Ｔ細胞の過剰な活性を抑制する機能があるため、ｃｏ－ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ分子とも呼ばれる。代表的には、Ｔ細胞にはｃｏ－ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ受容体であるＣＴＬＡ－４とＰＤ－１が発現されており、それぞれのリガンドであるＢ７．１／２及びＰＤ－Ｌ１との結合によってＴ細胞の活性を調節する。一方、ＰＤ－Ｌ１は、癌細胞で発現され、癌特異的なＴ細胞を不活化させ、アポトーシスを誘導してＴ細胞の免疫攻撃から癌細胞を保護してくれる重要な分子シールド（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｈｉｅｌｄ）の役割を果たしており、癌の免疫回避機構になることがある。また、癌細胞内で異所性（ｅｃｔｏｐｉｃ）なＰＤ－Ｌ１が発現した癌患者は、そうでない癌患者に比べて予後がより悪いと報告されている。

【0005】

免疫チェックポイント阻害剤は、そのようなＴ細胞阻害に関与する免疫チェックポイントタンパク質の活性を遮断することでＴ細胞を活性化させ、癌細胞を攻撃する薬剤であり、代表的には、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１を認識する抗体が用いられる。ＣＴＬＡ－４阻害剤であるイピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ（Ｙｅｒｖｏｙ））が免疫チェックポイント阻害剤の中では初めて転移黒色腫に対する二次治療剤として２０１１年ＦＤＡ承認を獲得した。その後、２０１４年にＰＤ－１遮断剤であるニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ（Ｏｐｄｉｖｏ））とペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ））が転移黒色腫に対してそれぞれＦＤＡ承認を獲得している。それ以来、ＰＤ－Ｌ１に対する免疫チェックポイント阻害剤であるアテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ））が膀胱癌に対して（２０１６年）、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ））が皮膚癌の一種である転移メルケル細胞癌治療に対して、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ（Ｉｍｆｉｎｚｉ））が膀胱癌に対して、２０１７年にＦＤＡ承認を獲得した。２０１８年には、ＰＤ－１阻害剤のセミプリマブ（ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ（Ｌｉｂｔａｙｏ））が皮膚扁平上皮癌に対してＦＤＡ承認を獲得した。現在、これらの薬剤は治療適応症を拡大しながら、ますます多くの癌腫の治療に対してＦＤＡ承認を獲得している。２０１９年基準で、６種のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、合計１８個の癌種に対してＦＤＡ承認を獲得している。さらに、Ｂ７－Ｈ４、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤＬ－２、ＰＶＲＩＧなどの免疫調節タンパク質などが新たなターゲットで前臨床試験に入っている。これらの治療剤のほとんどは、Ｔ細胞上に発現しているターゲットを標的としている。

【0006】

このようにＴ細胞中心の偏向的なターゲット発掘傾向を克服するために、近年ではマクロファージ、樹状細胞などのｍｙｅｌｏｉｄ系列の細胞で発現される免疫チェックポイントタンパク質を標的とする阻害剤が開発されている。その中でも、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ４７、ＴＬＲ７などが重要なターゲットとして浮上している。

【0007】

Ｔ細胞の活性を阻害することで、腫瘍細胞が免疫系から攻撃を回避できるようにする免疫チェックポイントタンパク質の一つであるＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ－Ｌｉｇａｎｄ １）は、リンパ系及び非リンパ性組織の白血球及び非造血（Ｎｏｎｇｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ）細胞で主に発現し、大腸癌、膵臓癌、黒色腫、及び子宮頸癌など、様々な腫瘍細胞の表面にも発現する。特に、活性化Ｔ細胞表面に発現するＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ－１）と相互作用することで、ＴＣＲを介したＴ細胞の活性化（ＴＣＲ ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、サイトカイン発現（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ）及びＴ細胞の増殖（Ｔ－ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を阻害することにより、Ｔ細胞の免疫応答を負に調節する。

【0008】

そこで、本発明者らは、免疫チェックポイントタンパク質をターゲットとする免疫チェックポイント阻害剤を開発することにより、本出願に至った。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】米国特許第８，００８，４４９号明細書

【特許文献2】国際公開第９４／０４６７８号

【特許文献3】米国特許出願公開第２００９／０３０７７８７号明細書

【特許文献4】米国特許第８，７５４，２８７号明細書

【特許文献5】米国特許出願公開第２０１５／０２８９４８９号明細書

【特許文献6】米国特許出願公開第２０１０／０１２２３５８号明細書

【特許文献7】国際公開第２００４／０４９７９４号

【特許文献8】国際公開第９９／３７６８１号

【特許文献9】国際公開第０１／９０１９０号

【特許文献10】国際公開第０３／０２５０２０号

【特許文献11】国際公開第０３／０３５６９４号

【特許文献12】国際公開第００／４３５０７号

【特許文献13】国際公開第０６／０３０２２０号

【特許文献14】国際公開第０６／００３３８８号

【特許文献15】米国特許第４，８１６，５６７号明細書

【特許文献16】国際公開第１９９６／３４１０３号

【特許文献17】国際公開第９３／０８８２９号

【特許文献18】米国特許第５７３１１６８号明細書

【特許文献19】国際公開第２００９／０８９００４号

【特許文献20】米国特許第４６７６９８０号明細書

【特許文献21】米国特許出願公開第２０１１／００２８６９５号明細書

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Ｐｏｌ Ｓｐｅｃｅｎｉｅｒ（２０１６）：Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．

【非特許文献2】ＤＢ Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｃ Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ：ｌａｔｅｓｔ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ ２０１５、Ｖｏｌ．７（２）９７－１０６

【非特許文献3】Ｌｉｕ Ｊ、Ｗａｎｇ Ｌ、Ｚｈａｏ Ｆ、Ｔｓｅｎｇ Ｓ、Ｎａｒａｙａｎａｎ Ｃ、Ｓｈｕｒａ Ｌ、ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｐｒｅ－Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ａｎｔｉ－ＣＤ４７ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０（９）：ｅ０１３７３４５．

【非特許文献4】Ｋａｂａｔ、Ｅｌｖｉｎ Ａ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）

【非特許文献5】Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６－４４８（１９９３）

【非特許文献6】Ｓｈｅｒｉｆｆ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３－７３６（１９９６）

【非特許文献7】Ｋａｂａｔ、Ｅｌｖｉｎ Ａ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）

【非特許文献8】Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ １９８９ Ｏｃｔ． １２；３４１（６２４２）：５４４－６、Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．

【非特許文献9】Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００３、２１（１１）：４８４－４９０．

【非特許文献10】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１－６８５５（１９８４）

【非特許文献11】Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３）））

【非特許文献12】Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５（１９９１）

【非特許文献13】Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１（１９８５）

【非特許文献14】Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）

【非特許文献15】Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４－６４４８（１９９３）

【非特許文献16】Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：５３６８（１９９４）

【非特許文献17】Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）

【非特許文献18】Ｃｏｎｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００１；２７６（１０）：７３４６－５０

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明は、免疫チェックポイントタンパク質（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）であるＰＤ－Ｌ１に対する単一ドメイン抗体及びその用途を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明の目的を達成するために、本発明は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む抗体またはその抗原結合断片であって、
前記ｓｄＡｂが、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。

【0013】

本発明の一態様において、前記ｓｄＡｂは、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるＦＲ１、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるＦＲ２、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるＦＲ３、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるＦＲ４を有するＶＨＨドメインを含んでもよく、一部の実現例において、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する。

【0014】

本発明の一態様において、前記ｓｄＡｂは、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、前記少なくとも１つのアミノ酸置換は保存的置換であってもよく、アミノ酸の非遺伝子コードアミノ酸または合成アミノ酸への置換であってもよい。

【0015】

本発明の一態様において、前記ｓｄＡｂは、単量体性または多量体性であってもよい。多量体性である場合、前記ｓｄＡｂ間ペプチドリンカーを介して融合してもよく、一部の実現例において、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有する。

【0016】

本発明の一態様において、前記ｓｄＡｂは、Ｆｃ断片に融合した重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）を提供する。一部の実現例において、前記ＨＣＡｂは、配列番号５及び１１のいずれかで表されるアミノ酸配列からなってもよい。

【0017】

本発明の一態様において、前記ＨＣＡｂは、単量体性または多量体性であってもよい。

【0018】

本発明の一態様において、前記Ｆｃ断片にｓｄＡｂがペプチドリンカーを介して融合してもよく、前記Ｆｃ断片は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４であってもよい。

【0019】

本発明の一態様において、前記ＨＣＡｂは、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、前記少なくとも１つのアミノ酸置換は保存的置換であってもよく、アミノ酸の非遺伝子コードアミノ酸または合成アミノ酸への置換であってもよい。

【0020】

本発明の一態様において、（ａ）前記ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する第２の抗原結合部分と、を含む抗体を提供する。

【0021】

本発明の一態様において、前記抗体は、二重特異性または多重特異性であってもよい。

【0022】

本発明の一態様において、前記第２の抗原結合部分は、第１の抗原結合部分とペプチドリンカーを介して互いに融合してもよく、前記第２の抗原結合部分は、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、（Ｆａｂ'）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディまたは第２のｓｄＡｂであってもよい。

【0023】

本発明の一態様において、免疫調節剤、サイトカイン、細胞毒性剤、化学療法剤、診断剤、抗ウイルス剤、抗微生物剤または薬物が結合されてもよい。よって、本発明は、免疫調節剤、サイトカイン、細胞毒性剤、化学療法剤、診断剤、抗ウイルス剤、抗微生物剤または薬物に結合した抗体またはその抗原結合断片を含む抗体複合体を提供する。

【0024】

また、本発明は、前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子を提供する。

【0025】

さらに、本発明は、前記核酸分子を含む発現ベクターを提供する。

【0026】

また、本発明は、前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。

【0027】

さらに、本発明は、
（ａ）抗体を発現させる条件下で前記宿主細胞を培養するステップと、
（ｂ）発現された抗体またはその抗原結合断片を回収するステップと、
を含む、抗体またはその抗原結合断片を産生する方法を提供する。

【0028】

また、本発明は、前記抗体またはその抗原結合断片、あるいは前記抗体複合体を有効成分として含有する、癌の予防または治療用薬学的組成物と、前記抗体またはその抗原結合断片、あるいは抗体複合体を薬学的に有効な量で個体に投与するステップを含む、癌の予防または治療方法と、癌の予防または治療に用いるための前記抗体またはその抗原結合断片、あるいは抗体複合体の用途を提供する。

【0029】

本発明の一形態において、前記癌は、黒色腫、肺癌、肝臓癌、神経膠腫、卵巣癌、大腸癌、頭頸部癌、膀胱癌、腎細胞癌、胃癌、乳癌、転移癌、前立腺癌、膵臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、孤立性骨髄腫及び再生不良性貧血からなる群から選択されてもよい。

【0030】

本発明の一態様において、前記薬学的組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。

【0031】

また、本発明は、
（ｉ）前記抗体またはその抗原結合断片を試料と接触させるステップと、
（ｉｉ）前記抗体またはその抗原結合断片とＰＤ－Ｌ１との間の複合体形成を検出するか、あるいは複合体の量を決定するステップと、
を含む、試料からＰＤ－Ｌ１を検出するか、あるいはＰＤ－Ｌ１の量を決定する方法を提供する。

【発明の効果】

【0032】

本発明はでは、免疫チェックポイントタンパク質（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）であるＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する単一ドメイン抗体を調製し、それらの免疫抗原に対する親和性及び抗腫瘍効果が確認されたので、免疫療法における免疫チェックポイント阻害剤として、前記単一ドメイン抗体を有用に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1A】本発明の一実施例に従って作製したＣＨＯ－Ｋ１＿ＰＤ－Ｌ１細胞株（ＰＤ－Ｌ１抗原の発現を誘導したＣＨＯ－Ｋ１細胞）と、抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂ（ＰＤＬ１ Ｎｂ＃０１－ＩｇＧ１）を濃度ごとに反応させ、細胞表面に発現するＰＤ－Ｌ１抗原に対する結合能（ＥＣ５０）を確認した図である。

【図1B】本発明の一実施例に従って作製したＣＨＯ－Ｋ１＿ＰＤ－Ｌ１細胞株（ＰＤ－Ｌ１抗原の発現を誘導したＣＨＯ－Ｋ１細胞）と、ＰＤ－１タンパク質との結合後の抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂ（ＰＤＬ１ Ｎｂ＃０１－ＩｇＧ１）がＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の相互作用に及ぼす抑制能（ＩＣ５０）を確認した図である。

【図2A】本発明の一実施例に従って作製したＣＨＯ－Ｋ１＿ＰＤ－Ｌ１細胞株（ＰＤ－Ｌ１抗原の発現を誘導したＣＨＯ－Ｋ１細胞）と、抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）を濃度ごとに反応させ、細胞表面に発現するＰＤ－Ｌ１抗原に対する結合能（ＥＣ５０）を確認した図である。

【図2B】本発明の一実施例に従って作製したＣＨＯ－Ｋ１＿ＰＤ－Ｌ１細胞株（ＰＤ－Ｌ１抗原の発現を誘導したＣＨＯ－Ｋ１細胞）と、ＰＤ－１タンパク質との結合後の抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）がＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の相互作用に及ぼす抑制能（ＩＣ５０）を確認した図である。

【図3】ＣＨＯ－Ｋ１＿ＰＤ－Ｌ１細胞（ＰＤ－Ｌ１タンパク質の過剰発現を誘導したＣＨＯ－Ｋ１細胞）と、ＰＤ－１が発現するＪｕｒｋａｔ細胞を用いて、本発明の一実施例に従って作製した抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）のＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の相互作用阻害能を確認した図である。

【図4】本発明の一実施例に従って作製した抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）を、Ｂ１６Ｆ１０＿ＰＤ－Ｌ１細胞株（ＰＤ－Ｌ１抗原の発現を誘導した腫瘍細胞）で腫瘍形成を誘導したＣ５７ＢＬ／６マウスに腹腔投与した後、抗腫瘍効果を確認した図である。

【発明を実施するための形態】

【0034】

以下、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように、本発明の実施形態を挙げて詳しく説明する。本発明の実施例は、当該技術分野における平均的な知識を有する者に本発明をより完全に説明するために提供するものである。よって、本発明の実施例は様々な他の形態に変形してもよく、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。

【0035】

本発明において、「エピトープ」なる用語は、抗体に特異的結合をすることができるタンパク質決定要因を意味する。エピトープは一般に、分子、例えば、アミノ酸または糖側鎖の化学的に活性な表面のグループ化からなり、通常は特異的な三次元構造特性のみならず、特異的電荷特性を有する。

【0036】

「治療」なる用語は、本明細書に開示される障害または疾患、例えば、疾患の症状または合併症を遅らせたり、中断したり、中止したり、制御したり、停止したり、軽減したり、あるいは改善したりすること、またはその進行を逆転させることでもよいが、必ずしもすべての疾患または障害の症状の完全な除去を示すわけではなく、すべての過程を意味する。

【0037】

「予防」なる用語は、疾患または障害、例えば、疾患の予防的治療、あるいは疾患または障害の発症または進行を遅延させることを意味する。

【0038】

「個体」または「対象体」なる用語は、非限定的に、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、げっ歯類、または霊長類を含む哺乳動物を指す。一部の実現例において、個体はヒトである。

【0039】

「抗体」なる用語は、その最も広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、非限定的にモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、全長抗体及びその抗原結合断片を含む、様々な抗体構造を包括する。「抗体」なる用語は、従来の４鎖抗体、単一ドメイン抗体、及びそれらの抗原結合断片を含む。

【0040】

基本的な４鎖抗体ユニットは、２つの同じ軽（Ｌ）鎖と２つの同じ重（Ｈ）鎖からなるヘテロ四量体性糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドと共に、基本ヘテロ四量体ユニットのうち５個からなり、１０個の抗原結合部位を含むが、ＩｇＡ抗体は、Ｊ鎖と組み合わせて多価集合体を形成するために、重合化可能な基本４鎖ユニットのうち２～５個を含む。ＩｇＧの場合、４鎖ユニットは一般に約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に結合するが、それに対して２つのＨ鎖はＨ鎖アイソタイプに依存して少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに結合している。各Ｈ鎖及びＬ鎖はまた、規則的に離間した鎖間ジスルフィドブリッジを有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端において、α鎖及びγ鎖のそれぞれに対して可変ドメイン（ＶＨ）、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ）、並びにμ及びεアイソタイプに対して４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端において、その他方の端部に可変ドメイン（ＶＬ）に続いて定常ドメインを有する。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と整列する。ＶＨとＶＬの組み合わせは、共に単一の抗原結合部位を形成する。任意の脊椎動物種におけるＬ鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる、明確に区別される２つのタイプのうちの１つに割り当てられる。それらの重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てられる。免疫グロブリンには５つのクラスがある：α、δ、ε、γ及びμ、それぞれに指定された重鎖を有する、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ。γクラス及びαクラスは、ＣＨ配列及び機能において比較的少ない差に基づいてさらにサブクラスに分割され、例えば、ヒトは以下のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２。

【0041】

「重鎖のみの抗体」または「ＨＣＡｂ」なる用語は、重鎖を含むが、４鎖抗体に一般的に見られる軽鎖を欠いている機能性抗体を指す。

【0042】

「単一ドメイン抗体」、「ナノボディ」または「ｓｄＡｂ」なる用語は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する単一の抗原結合ポリペプチドを指す。ｓｄＡｂ単独は、対応するＣＤＲ含有ポリペプチドと対合することなく抗原に結合することができる。場合によっては、本明細書において、単一ドメイン抗体はラクダ科ＨＣＡｂから操作され、それらの重鎖可変ドメインは「ＶＨＨ」（重鎖抗体の重鎖の可変ドメイン）と呼ばれる。基本ＶＨＨは、Ｎ末端からＣ末端まで以下の構造を有する：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４、ここで、ＦＲ１～ＦＲ４は、フレームワーク領域１～４のそれぞれのことを指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は、相補性決定領域１～３を指す。

【0043】

抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ「ＶＨ」及び「ＶＬ」と呼ばれることがある。それらのドメインは一般に（同じクラスの他の抗体と比較して）抗体の最大可変性部分であり、抗原結合部位を含む。ラクダ科種からの重鎖のみの抗体は、「ＶＨＨ」と呼ばれる単一の重鎖可変領域を有する。

【0044】

「可変」なる用語は、可変ドメインの特定のフラグメントが抗体の配列中で広範囲に異なるという事実を指す。Ｖドメインは抗原結合を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定義する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの全範囲にわたって均等に分布していない。その代わりに、重鎖及び軽鎖可変ドメインの両方において、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのフラグメントで濃縮される。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖のそれぞれの可変ドメインは、３つのＣＤＲで接続されたループ接続を形成し、主にベータシート構成を採用し、場合によってはベータシート構造の一部を形成する、４つのＦＲ領域を有する。各鎖において、ＣＤＲは、ＦＲ領域によって非常に近接して一緒に保持され、他の鎖からのＣＤＲは、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（非特許文献４を参照されたい）。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与を示す。

【0045】

「定常ドメイン」なる用語は、抗原結合部位を含む免疫グロブリンの他の部分、可変ドメインと比較して保存されたアミノ酸配列をより多く有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常ドメインには、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（総称してＣＨ）及び軽鎖のＣＨＬ（またはＣＬ）ドメインが含まれる。

【0046】

「全長抗体」、「無傷抗体」、または「全体抗体」なる用語は、抗体断片とは対照的に、その実質的に完全な形態の抗体を指すために互換的に用いられる。具体的には、全長４鎖抗体は、Ｆｃ領域を含む重鎖及び軽鎖を有するものを含む。全長重鎖のみの抗体は、重鎖可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）及びＦｃ領域を含む。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であってもよい。場合によって、無傷抗体は、少なくとも１つのエフェクター機能を有してもよい。

【0047】

「抗体断片」または「抗原結合断片」は、無傷抗体の一部、好ましくは無傷抗体の抗原結合及び／または可変領域を含む。抗体断片の例は、非限定的に、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体（ｓｃＦｖ）分子；単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）、並びに抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。その断片は、緻密な非共有結合において、１つの重鎖及び１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。「単鎖Ｆｖ」もまた、略称「ｓＦｖ」もしくは「ｓｃＦｖ」は、単一のポリペプチド鎖に連結されたＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成できるようにするＶＨとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。「ダイアボディ」は、Ｖドメインの鎖内ではなく鎖間での対合が達成されるように、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間の短いリンカー（約５～１０個の残基）を有するｓＦｖ断片を構築し、それによって二価断片、すなわち２つの抗原結合部位を有する断片をもたらすことによって作製された小さな抗体断片を指す。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶＨ及びＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する２つの「交差」ｓＦｖ断片のヘテロ二量体である。

【0048】

「ヒト化抗体」なる用語は、「キメラ抗体」のサブセットとして用いられる。

【0049】

非ヒト（例えば、ラマまたはラクダ科）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。一部の実現例において、ヒト化抗体は、レシピエントの（以下で定義される）ＣＤＲからの残基が所望の特異性、親和性、及び／または受容性を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ラクダ、ラマ、アルパカ、またはヒト以外の霊長類のＣＤＲからの残基で置換されるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。

【0050】

いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク（「ＦＲ」）残基は、対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体で見られない残基を含んでもよい。それらの修飾は、抗体性能、例えば、結合親和性をさらに改善するために実施されることがある。

【0051】

「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」なる用語は、本明細書で用いられる場合、配列においてに超可変である、及び／または構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、単一ドメイン抗体は、３つのＨＶＲ（またはＣＤＲ）：ＨＶＲ１（またはＣＤＲ１）、ＨＶＲ２（またはＣＤＲ２）、及びＨＶＲ３（またはＣＤＲ３）を含む。ＨＶＲ３（またはＣＤＲ３）は、３つのＨＶＲの中でも最も高い多様性を示し、抗体に微小特異性を与える際に固有の役割を果たすことが知られている。例えば、非特許文献５、６を参照されたい。

【0052】

「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」なる用語は、カバットシステムによって定義されているように超可変領域を指すために用いられる。非特許文献７を参照されたい。カバット相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づくものであり、最も一般的に用いられる。

【0053】

用語「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されるように、ＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。

【0054】

「特異的」なる用語は、抗原の特定のエピトープに対する抗原結合タンパク質（例えば、ｓｄＡｂ）の選択的認識を指す。

【0055】

天然抗体は、例えば、単一特異性である。本明細書で用いられるように、「多重特異性」なる用語は、抗原結合タンパク質がポリエピトープ特異性を有する（すなわち、１つの生物学的分子において２つ、３つ、またはそれ以上の、異なるエピトープに特異的に結合することができるか、あるいは、２つ、３つ、またはそれ以上の異なる生物学的分子においてエピトープに特異的に結合することができる）ことを示す。本明細書で用いられるように、「二重特異性」は、抗原結合タンパク質が２つの異なる抗原結合特異性を有することを指す。

【0056】

本明細書で用いられるように、「単一特異性」なる用語は、同じ抗原の同じエピトープを結合する少なくとも１つのそれぞれの結合部位を有する抗原結合タンパク質を指す。

【0057】

「価」なる用語は、抗原結合タンパク質中に特定の数の結合部位が存在することを示す。例えば、用語「二価」「三価」、「四価」、「五価」及び「六価」は、抗原結合タンパク質における２つの結合部位、３つの結合部位、４つの結合部位、５つの結合部位、及び６つの結合部位が存在することを示す。

【0058】

「抗体エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因するそれらの生物学的活性を指し、抗体アイソタイプによって様々である。抗体エフェクター機能の例には、以下が含まれる：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害性；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；及びＢ細胞活性化。「補体依存性細胞傷害性」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下における標的細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、補体システムの第１の成分（Ｃ１ｑ）のそれらの同族抗原に結合する（適切なサブクラスの）抗体への結合によって開始される。「抗体依存性細胞媒介細胞傷害性」またはＡＤＣＣは、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合している分泌Ｉｇが、それらの細胞傷害性エフェクター細胞を抗原保有標的細胞に特異的に結合させ、その後標的細胞を細胞毒素で死滅させる細胞毒性の一形態を指す。

【0059】

本明細書において、「Ｆｃ領域」または「断片結晶化可能領域」なる用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために用いられる。本明細書に記載の抗体で用いられるのに適した天然配列Ｆｃ領域には、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が含まれる。

【0060】

「結合親和性」は、一般に、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。特に明記しない限り、本明細書で用いられるように、「結合親和性」は、結合対のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。結合親和性は、Ｋ_ｄ、Ｋ_ｏｆｆ、Ｋ_ｏｎ、またはＫ_ａで表すことができる。本明細書で用いられるように、平衡解離定数「Ｋ_Ｄ」または「Ｋ_ｄ」なる用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離定数を指し、平衡状態で抗体分子の溶液中に存在するすべての抗体結合ドメインの二分の一を占めるのに必要な抗原の濃度を記載し、Ｍの単位で表される。Ｋ_Ｄの測定は、全ての結合剤が溶液中にあることを前提としている。解離定数（Ｋ_ＤまたはＫ_ｄ）は、抗原に対する抗体の親和性を示す指標として用いられる。例えば、容易な分析は、各種のマーカー製剤でマーキングされた抗体を利用するスキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）法によるか、それのみならず、キットに付属の取扱説明書や実験操作方法による、一般医薬品、測定キットを用いることで可能である。それらの方法で導出できるＫ_Ｄ値は、Ｍ（Ｍｏｌｓ）の単位で表される。

【0061】

ペプチド、ポリペプチドまたは抗体配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」及び「相同性」は、最大パーセント配列同一性を達成するために、必要に応じて配列アラインメント及びギャップ導入後、ならびに配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せずに、特異的ペプチドまたはポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同じ候補配列におけるアミノ酸残基の百分率として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性の決定目的のためのアライメントは、当技術分野の技術範囲内にある様々な方法で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭＥＧＡＬＩＧＮＴＭ（ＤＮＡＴＡＲ）ソフトウェアを用いて達成される。当技術分野における当業者であれば、比較されるべき配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを始めとするアライメント測定のための適切なパラメータを決定することができる。

【0062】

本発明は、（以下、「抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂ」と称する）ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む抗体またはその抗原結合断片、例えば、抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂ、抗ＰＤ－Ｌ１重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）（例えば、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の結晶性断片（Ｆｃ断片）に抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂが融合した抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂ－Ｆｃ融合タンパク質）、または他のｓｄＡｂ、全長４鎖抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）に抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂが融合した多重特異性抗原結合タンパク質、並びにその調製及び用途に関する。

【0063】

そこで、本発明は、抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂを含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。

【0064】

本発明において、前記抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂを含む抗体またはその抗原結合断片は、抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂまたはその抗原結合断片であってもよい。

【0065】

本発明において、抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む。

【0066】

前記ＣＤＲ配列を表６に示す。

【0067】

本発明において、前記抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂは、ＦＲ領域に対して任意の適切な配列を含んでもよい。具体的には、前記ＦＲ配列は、下記表１～表４で表されるアミノ酸配列であってもよい。

【0068】

【表1】

【0069】

【表2】

【0070】

【表3】

【0071】

【表4】

【0072】

より具体的には、前記抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂは、以下のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含んでもよい：
配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるＦＲ１；
配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるＦＲ２；
配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるＦＲ３；及び
配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるＦＲ４。

【0073】

本発明において、前記抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂは、前記ＦＲ領域を含むＶＨＨドメインを含んでもよい。

【0074】

具体的には、前記抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂは、配列番号１で表されるアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列に少なくとも８０％（例えば、少なくとも任意の８０％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列相同性を有するその変異体を含んでもよい。

【0075】

本発明において、前記抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂは、単量体性または多量体性であってもよい。また、多量体性である場合、例えば、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂとは異なる抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂを含む、多重特異性及び多価（例えば、二重特異性及び二価）であってもよく、あるいは、同じ抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂの少なくとも２つのコピーを含む、単一特異性及び多価（例えば、二価）であってもよい。さらに、ｓｄＡｂ同士がペプチドリンカーを介して融合してもよい。一部の実現例において、ペプチドリンカーは、隣接するドメインが互いに対して自由に移動するように、可撓性残基（例えば、グリシン及びセリン）を含む。例えば、グリシン－セリンダブレットは、適切なペプチドリンカーであってもよい。また、ペプチドリンカーは、任意の適切な長さであってもよい。一部の実現例において、ペプチドリンカーは、少なくとも約任意の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００個、もしくはそれ以上のアミノ酸の長さである。一部の実現例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂは、配列番号１０で表されるアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列に少なくとも８０％（例えば、少なくとも任意の８０％、５８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）配列相同性を有するその変異体を含んでもよい。

【0076】

本発明において、前記抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂは、ＰＤ－Ｌ１のエピトープに結合する。

【0077】

また、前記抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂとＰＤ－Ｌ１との結合のＫ_Ｄは、１０^－６Ｍ～１０^－１２Ｍ、１０^－６Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－６Ｍ～１０^－１０Ｍ、１０^－６Ｍ～１０^－９Ｍ、または１０^－６Ｍ～１０^－８Ｍであってもよい。

【0078】

さらに、前記抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂのＥＣ_５０は、ＦＡＣＳ分析において５００ｎＭ未満であってもよく、具体的には０．１ｎＭ～５００ｎＭ、０．１ｎＭ～４００ｎＭ、０．１ｎＭ～３００ｎＭ、０．１ｎＭ～０．００ｎＭ、０．１～５０ｎＭ、０．１～１０ｎＭ、１ｎＭ～５００ｎＭ、１ｎＭ～４００ｎＭ、１ｎＭ～３００ｎＭ、１ｎＭ～２００ｎＭ、１ｎＭ～１００ｎＭ、１ｎＭ～５０ｎＭ、または１ｎＭ～１０ｎＭであってもよい。

【0079】

本発明に係る単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、重鎖のみの抗体からの重鎖可変ドメイン（例えば、ラクダ科におけるＶＨＨ（重鎖抗体の重鎖の可変ドメイン））、従来の４鎖抗体に由来する軽鎖、単一ドメイン（例えば、ＶＨまたはＶＬ）を天然に欠く結合分子、ヒト化重鎖のみの抗体、ヒト重鎖フラグメントを発現する遺伝子移植マウスまたはラットによって産生されたヒト単一ドメイン抗体、並びに抗体に由来するもの以外の操作されたドメイン及び単一ドメイン足場を非限定的に含んでもよい。ｓｄＡｂは、マウス、ラット、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギ、及びウシ科を非限定的に含む任意の種に由来してもよい。また、ラクダ科以外の種からの天然に存在するｓｄＡｂ分子を含んでもよい。

【0080】

さらに、ｓｄＡｂは、軽鎖を欠く重鎖抗体として知られている天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子に由来する。そのような単一ドメイン分子は、例えば、特許文献２及び非特許文献５に開示されている。軽鎖を天然に欠く重鎖分子に由来する可変ドメインは、本明細書ではＶＨＨとして知られており、これを４鎖免疫グロブリンの従来のＶＨと区別する。そのようなＶＨＨ分子は、ラクダ科種、例えば、ラクダ、ラマ、ビキューナ、ヒトコブラクダ、アルパカ及びグアナコから産生される抗体に由来してもよい。ラクダ科以外の他の種は、自然に軽鎖の欠く重鎖分子を産生することができ、そのようなＶＨＨは、本明細書の範囲内である。

【0081】

また、ｓｄＡｂは、組換え、ＣＤＲグラフト化、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化及び／またはインビトロで生成されてもよい（例えば、ファージディスプレイによって選択される）。一部の実現例において、フレームワーク領域のアミノ酸配列は、フレームワーク領域内の特異的アミノ酸残基の「ラクダ化」によって変更されてもよい。ラクダ化は、重鎖抗体のＶＨＨドメインにおける対応する位置に生じるアミノ酸残基の少なくとも１つによって、従来の４鎖抗体からの（天然に存在する）ＶＨドメインのアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の少なくとも１つの代替または置換を指し、当技術分野における公知の方法で実施することができる。

【0082】

さらに、ｓｄＡｂは、ヒト重鎖フラグメントを発現する遺伝子移植マウスまたはラットによって産生されたヒトｓｄＡｂであってもよい。例えば、特許文献３～７を参照されたい。

【0083】

さらに、特定の抗原または標的に対する天然に存在するＶＨＨドメインは、ラクダ科のＶＨＨ配列の（未接触または免疫）ライブラリーから得られてもよい。そのような方法は、前記抗原または標的を利用するそのようなライブラリー、またはそれ自体公知の少なくとも１つのスクリーニング技術を用いるその少なくとも一部、断片、抗原性決定因子またはエピトープスクリーニングを含むか、あるいは含まなくてもよい。そのようなライブラリー及び技術は、例えば、特許文献８～１１に開示されている。代案として、（非接触または免疫）ＶＨＨライブラリーに由来する改良された合成または半合成ライブラリー、例えば、特許文献１２に記載されているように、技術的に、例えば、ランダムな突然変異誘発及び／またはＣＤＲシャッフリングによって（未接触または免疫）ＶＨＨライブラリーから得られたＶＨＨライブラリーを用いてもよい。

【0084】

また、ｓｄＡｂは従来の４鎖抗体から生成されてもよい。例えば、非特許文献８、９と、特許文献１３、１４を参照されたい。

【0085】

さらに、本発明に係るｓｄＡＢは、キメラ抗体であってもよい。特定のキメラ抗体は、例えば、特許文献１５及び非特許文献１０に開示されている。一部の実現例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、ラクダ科種、例えばラマ由来の可変領域）及びヒト定常領域を含んでもよい。また、キメラ抗体はヒト化されてもよい。典型的には、非ヒト抗体はヒト化されて、ヒトに対する免疫原性を低下させるが、親系非ヒト抗体の特異性及び親和性を維持する。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ、（またはその部分）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（またはその部分）がヒト抗体配列に由来する少なくとも１つの可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、場合によってはヒト定常領域の少なくとも１つの部分も含むであろう。一部の実現例において、ヒト化抗体における一部のＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）に対応する残基で置換される。

【0086】

本発明において、前記抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂを含む抗体またはその抗原結合断片は、抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂまたはその抗原結合断片であってもよい。

【0087】

具体的には、抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂは、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂが少なくとも１つのＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメイン、例えば、Ｆｃ断片に融合したものである。

【0088】

前記ＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインは、免疫グロブリンに由来する。前記免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭであり、具体的にはＩｇＧであってもよい。一部の実現例において、抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂは、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃ断片を含んでもよく、前記Ｆｃ断片は、ヒトＦｃ、例えば、ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）Ｆｃ、ｈＩｇＧ２ Ｆｃ、ｈＩｇＧ３ Ｆｃもしくは、ｈＩｇＧ４ Ｆｃであってもよい。

【0089】

前記抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂは、単量体性または多量体性であってもよい。また、多量体性である場合、例えば、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂとは異なる抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂを含む、多重特異性及び多価（例えば、二重特異性及び二価）であってもよく、あるいは、同じ抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂの少なくとも２つのコピーを含む、単一特異性及び多価（例えば、二価）であってもよい。

【0090】

本発明において、前記抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂ並びにＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメイン、具体的にはＦｃ断片は、ペプチドリンカーを介して融合されてもよい。前記ペプチドリンカーの長さ、柔軟性の程度及び／または他の特性は、少なくとも１つの特定の抗原またはエピトープに対して非限定的に、親和性、特異性または結合能を始めとする特性においていくつかの影響を及ぼし得る。例えば、より長いペプチドリンカーは、２つの隣接ドメインが互いに立体的に干渉しないことを保証できるように選択されてもよい。一部の実現例において、ペプチドリンカーは、隣接するドメインが互いに対して自由に移動するように、可撓性残基（例えば、グリシン及びセリン）を含む。例えば、グリシン－セリンダブレットは、適切なペプチドリンカーであってもよい。また、ペプチドリンカーは、任意の適切な長さであってもよい。一部の実現例において、ペプチドリンカーは、少なくとも約任意の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００個、もしくはそれ以上のアミノ酸の長さである。

【0091】

さらに、ペプチドリンカーは、天然に存在する配列、または非天然に存在する配列を有してもい。例えば、重鎖のみの抗体のヒンジ領域に由来する配列をリンカーとして用いることができる。例えば、特許文献１６を参照されたい。一部の実現例において、前記ペプチドリンカーは、ｈＩｇＧ１ヒンジ、ｈＩｇＧ２ヒンジ、ｈＩｇＧ３ヒンジ、ｈＩｇＧ４ヒンジ、またはそれらの変異体であってもよい。

【0092】

本発明において、前記抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂは、配列番号５及び１１のいずれかで表されるアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列に少なくとも８０％（例えば、少なくとも任意の８０％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）配列相同性を有するその変異体を含んでもよい。

【0093】

本発明において、前記抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂを含む抗体またはその抗原結合断片は、他のｓｄＡｂ、全長４鎖抗体またはその抗原結合断片に抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂが融合した多重特異的抗原結合タンパク質（ＭＡＢＰ）（例えば、（以下、抗ＰＤ－Ｌ１ ＢＡＢＰと呼ぶ）抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂが融合した二重特異性抗原結合タンパク質（ＢＡＢＰ））またはその抗原結合断片であってもよい。

【0094】

前記抗ＰＤ－Ｌ１ ＢＡＢＰは、（ａ）本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する第２の抗原結合部分と、を含む。

【0095】

前記第２のエピトープは、ＰＤ－Ｌ１以外の抗原、またはＰＤ－Ｌ１における第２のエピトープであってもよい。

【0096】

前記第２の抗原結合部分は、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、（Ｆａｂ'）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディまたは第２のｓｄＡｂであってもよい。また、第２の抗原結合部分は、ＶＨを有する重鎖及びＶＬを有する軽鎖を含んでもよい。一部の実現例において、第１の抗原結合部分は、重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、重鎖のＣ末端、または軽鎖のＣ末端における第２の抗原結合部分に融合されてもよい。一部の実現例において、第２の抗原結合部分は、ＦａｂまたはｓｃＦｖを含んでもよい。一部の実現例において、第１の抗原結合部分は、ＦａｂまたはｓｃＦｖのＣ末端で第２の抗原結合部分に融合されてもよい。一部の実現例において、第２の抗原結合部分は、全長４鎖抗体を含んでもよい。一部の実現例において、第１の抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して第２の抗原結合部分に融合されてもよい。一部の実現例において、第２の抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ、ＩｇＧ２ Ｆｃ、ＩｇＧ３ Ｆｃ、またはＩｇＧ４ Ｆｃを含んでもよい。

【0097】

前記抗ＰＤ－Ｌ１ ＭＡＢＰは、少なくとも２つの異なるエピトープを特異的に結合する少なくとも２つの抗原結合部分を含む。少なくとも２つの抗原結合部分の一部は、ＭＡＢＰが２つの異なるエピトープ用結合部位を有する限り、同一であってもよい。さらに、抗ＰＤ－Ｌ１ ＭＡＢＰは、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂをそれぞれ含む１、２、３、４、５、６、７、８個またはそれ以上の異なる抗原結合部分のいずれかを含んでもよい。

【0098】

また、抗ＰＤ－Ｌ１ ＭＡＢＰは、ＰＤ－Ｌ１の第１のエピトープ及び／または第２のエピトープに対する仮数の任意の適切な数、及び特異性の任意の適切な数を有してもよい。一部の実現例において、抗ＰＤ－Ｌ１ ＭＡＢＰは、ＰＤ－Ｌ１に対して二価、三価、四価、五価、六価、またはより高い価数であってもよい。一部の実現例において、ＭＡＢＰは三重特異性であってもよく、四重特異性であってもよい。

【0099】

本発明に係る多重特異性抗体の製造技術は、非限定的に、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（例えば、非特許文献１１、１２、特許文献１７）、及び「ノブインホール」エンジニアリング（例えば、特許文献１８）を含む。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃ－ヘテロ二量体性分子の製造用静電気操舵効果の操作（特許文献１９）；少なくとも２つの抗体または断片の架橋結合（例えば、特許文献２０、非特許文献１３）；二重特異性抗体を産生するためのロイシンジッパーの利用（例えば、非特許文献１４）；二重特異性抗体断片の製造用「ダイアボディ」技術の利用（例えば、非特許文献１５）；及び単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の利用（例えば、非特許文献１６）；並びに、例えば、非特許文献１７に記載のように、三重特異性抗体の調製；及びタンデム単一ドメイン抗体を含むポリペプチドの創出（例えば、特許文献２１、非特許文献１８）によって実施されてもよい。

【0100】

本発明において、前記抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂを含む抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列変異体を含む。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードする核酸配列への適切な修飾の導入によって、またはペプチド合成によって調製されてもよい。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／または挿入及び／または置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終作製物に至るように作ることができ、ただし、最終作製物は、所望の特徴、例えば、抗原結合を保持する。一部の実現例において、置換、挿入、または欠失は、そのような変更が抗原を結合させる抗体の能力を実質的に低下させない限り、少なくとも１つの超可変領域（ＨＶＲ）内で起こり得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変更は、ＨＶＲで実施されてもよい。そのような変更は、ＨＶＲ「ホットスポット」またはＣＤＲの外部であってもよい。

【0101】

また、前記アミノ酸置換は、少なくとも１つ（例えば、任意の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のアミノ酸置換であってもよい。さらに、少なくとも１つのアミノ酸置換は、保存的置換であってもよく、非遺伝子コードアミノ酸または合成アミノ酸への置換であってもよい。一部の実現例において、前記アミノ酸置換はＣＤＲ領域に存在してもよく、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／またはＣＤＲ３において少なくとも１つ（例えば、任意の１、２、３、または４個）のアミノ酸置換を含んでもよい。一部の実現例において、アミノ酸置換はＦＲ領域に存在してもよく、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／またはＦＲ４における少なくとも１つ（例えば、任意の１、２、３、４、５または６個）のアミノ酸置換を含んでもよい。

【0102】

また、前記アミノ酸配列の挿入は、１つの残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さ範囲のアミノ及び／またはカルボキシル末端融合、並びに単一または多重のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドまたは（例えば、ＡＤＥＰＴの場合）酵素に対する抗体のＮ末端またはＣ末端への融合を含んでもよい。

【0103】

さらに、少なくとも１つのアミノ酸修飾は、本明細書に提供される抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂを含む抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂ、または抗ＰＤ－Ｌ１ ＭＡＢＰ）のＦｃ領域に導入され、それによってＦｃ領域変異体を生成してもよい。Ｆｃ領域変異体は、少なくとも１つのアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ）を含んでもよい。

【0104】

本発明において、前記抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂを含む抗体またはその抗原結合断片は、診断部分（ｍｏｉｅｔｙ）または生体適合性調節剤に連結されたり、それに融合されたり、それに結合されたり（例えば、共有または非共有）、あるいは、そうでなければそれと会合されたりしてもよい。例えば、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、生物毒素、バイオマーカー、精製タグなど）、タンパク質、重合体、核酸分子、小分子、模倣剤、合成薬物、無機分子、有機分子、または放射性同位元素が結合または会合されてもよい。

【0105】

また、前記抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂを含む抗体またはその抗原結合断片は、生物学的分子（例えば、ペプチドまたはヌクレオチド）、小分子、蛍光団、または放射性同位元素であってもよい診断剤または検出可能な作用剤、マーカ、あるいは、レポータに結合または会合されてもよい。標識されたモジュレータは、ＰＤ－Ｌ１に関連する疾患、例えば、癌の発生または進行をモニターしたり、本明細書に開示される抗体を含む特定の療法の有効性を決定したり（すなわち、テラグノシス（ｔｈｅｒａｇｎｏｓｉｓ））、あるいは将来の治療過程を決定する臨床試験手順の一部として役立ったりする。そのようなマーカまたはレポータはまた、本明細書に開示される抗体を精製するのに有用である。

【0106】

さらに、前記抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂを含む抗体またはその抗原結合断片は、免疫調節剤、サイトカイン、細胞毒性剤、化学療法剤、診断剤、抗ウイルス剤、抗微生物剤または薬物に結合してもよい。よって、本発明は、免疫調節剤、サイトカイン、細胞毒性剤、化学療法剤、診断剤、抗ウイルス剤、抗微生物剤または薬物に結合した本発明に係る抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂを含む抗体またはその抗原結合断片を含む抗体複合体を提供する。

【0107】

本発明はまた、本明細書に開示される抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂを含む抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子、核酸分子を含む発現ベクター、及び発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。

【0108】

さらに、本発明は、（ａ）抗体を発現させる条件下で宿主細胞を培養するステップと、（ｂ）発現された抗体またはその抗原結合断片を回収するステップと、を含む、抗体またはその抗原結合断片を産生する方法を提供する。

【0109】

本発明において、本明細書に開示される抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂを含む抗体またはその抗原結合断片をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、抗体重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離及び配列解析されてもよい。単離され、サブクローニングされたハイブリドーマ細胞（またはファージまたは酵母由来のコロニー）は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源としての役割を果たす。また特に、単離されたＤＮＡ（修飾されてもよい）は、抗体の調製のために定常及び可変領域配列をクローニングするために使用されてもよい。

【0110】

１つの例示的な方法は、選択された細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、及び抗体特異的プライマーを用いたＰＣＲによる増幅を伴う。適切なプライマーは関連技術分野で周知であり、本明細書に例示されるように、多くの商業的供給源から容易に入手可能である。組合せライブラリーのスクリーニングによって単離された組換えヒトまたは非ヒト抗体を発現させるために、抗体をコードするＤＮＡを組換え発現ベクターにクローニングし、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及びバクテリアを含む宿主細胞内に導入される。一部の実現例において、他の所望の構築物を産生しないサルＣＯＳ細胞、ＮＳ０細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞にモジュレータが導入され、それによって発現される。

【0111】

本発明において、前記核酸分子は、ベクター中に、適切な場合に核酸の発現を制御するプロモーターと共に存在する。前記ベクターはその最も一般的な意味で使用され、核酸を、例えば、原核細胞及び／または真核細胞中に導入し、適切な場合にゲノムに組み込むことを可能にする、核酸のための任意の中間ビヒクルを含む。その種のベクターは、好ましくは細胞内で複製及び／または発現される。ベクターはプラスミド、ファージミド、バクテリオファージまたはウイルスゲノムを含んでもよい。前記プラスミドは一般に、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる染色体外遺伝物質構築物、典型的には環状ＤＮＡ二重鎖に関する。

【0112】

関連技術分野の当業者であれば周知の方法を用いて、抗体コード配列及び適切な転写及び翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。それらの方法は、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組換えを含む。

【0113】

本発明において、前記宿主細胞または組換え宿主細胞とは、発現ベクターが導入された細胞を意味する。組換え宿主細胞及び宿主細胞は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も意味する。突然変異または環境的影響のために後続世代で特定の修飾が起こり得るので、そのような子孫は実質的に親細胞と同一ではない場合があるが、本明細書で用いられる用語宿主細胞の範囲内に含まれる。そのような細胞は、前記のようなベクターを含んでもよい。

【0114】

また、関連技術分野で認識される分子生物学技術及び現在のタンパク質発現方法論を用いて、本明細書に開示される抗体の実質的な量を産生してもよい。さらに詳しくは、そのような抗体をコードする核酸分子は、様々なタイプの宿主細胞を含む周知で市販されているタンパク質生産システムに組み込まれ、前臨床、臨床、または商業的量の所望の医薬製品を提供することができる。一部の実現例において、抗体をコードする核酸分子は、選択された宿主細胞中への効率的な組み込み及びその後の抗体の高い発現レベルを提供するベクターまたは発現ベクターに操作される。

【0115】

好ましくは、本明細書に開示される抗体をコードする核酸分子及びそれらの核酸分子を含むベクターは、適切な哺乳動物、植物、バクテリアまたは酵母宿主細胞のトランスフェクションに用いることができるが、原核システムを用いてもよい。トランスフェクションは、ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入するための任意の公知の方法によって行う。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入する方法は、当技術分野において周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソーム内ポリヌクレオチドのカプセル化、及びＤＮＡの核内への直接マイクロインジェクションを含む。さらに、核酸分子をウイルスベクターによって哺乳動物細胞に導入してもよい。哺乳動物細胞を形質転換する方法は、当技術分野において周知である。植物細胞を形質転換する方法もまた当技術分野において周知であり、例えば、アグロバクテリウム媒介形質転換、バイオリスティック形質転換、直接注射、電気穿孔、及びウイルス形質転換を含む。細菌及び酵母細胞を形質転換する方法もまた当技術分野において周知である。

【0116】

様々な市販されている多くの宿主発現ベクターシステムを用いて、本明細書に開示の抗体を発現させてもよい。そのような宿主発現システムは、目的のコード配列を発現させ、その後に精製されてもよいビヒクルを示すだけでなく、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされた場合に、本発明の分子をインサイチュで発現することができる細胞を示す。そのようなシステムは、モジュレータ・コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された微生物、例えばバクテリア（例えば、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ））；モジュレータ・コード配列を含む組換え酵母発現ベクターでトランスフェクトされた酵母（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ））；モジュレータ・コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染した昆虫細胞システム；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染するか、あるいはモジュレータ・コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）でトランスフェクトされた植物細胞システム（例えば、ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アオウキクサ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモなど）；あるいは、哺乳動物細胞のゲノムに由来するか（例えば、メタロチオネインプロモーター）、あるいは哺乳動物ウイルスに由来する（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）プロモーターを含む組換え発現構築物を含む哺乳動物細胞システム（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）を含むが、それらに限定されるものではない。

【0117】

本明細書に開示された抗体が組換え発現または本明細書に開示された他の技術のいずれかによって産生された場合、それは、免疫グロブリンの精製に関する当技術分野で周知の任意の方法によって、あるいはより一般的には、タンパク質の精製のための任意の他の標準技術によって精製されてもよい。

【0118】

また、本発明は、本明細書に開示される抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂを含む抗体またはその抗原結合断片、もしくは前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体複合体を有効成分として含有する、癌の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

【0119】

さらに、本発明は、薬学的に有効な量の本明細書に開示される抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂを含む抗体またはその抗原結合断片、もしくは前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体複合体を包含する薬学的組成物を個体に投与するステップを含む、癌の予防または治療方法を提供する。

【0120】

また、本発明は、癌の予防または治療に用いるための本明細書に開示される抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂを含む抗体またはその抗原結合断片、もしくは前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体複合体の用途を提供する。

【0121】

本発明において、前記癌は、免疫チェックポイントタンパク質の活性を遮断してＴ細胞を活性化する必要がある癌であり、例えば、黒色腫、肺癌、肝臓癌、神経膠腫、卵巣癌、大腸癌、頭頸部癌、膀胱癌、腎細胞癌、胃癌、乳癌、転移癌、前立腺癌、膵臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、孤立性骨髄腫及び再生不良性貧血からなる群から選択されてもよいが、それらに限定されるものではない。

【0122】

本発明において、前記抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂを含む抗体またはその抗原結合断片、もしくは前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体複合体に関する内容は前記と同じであるので、具体的な説明は前記内容を援用し、以下では、薬学的組成物及び用途の特有の構成についてのみを説明する。

【0123】

本発明に係る薬学的組成物は、本明細書に記載の少なくとも１種（例えば、２または３種）の抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂを含む抗体またはその抗原結合断片、もしくは前記抗体またはその抗原結合断片を含んでもよい。

【0124】

本発明に係る薬学的組成物を個体、特に癌患者に投与することによって、癌を予防または治療することができる。

【0125】

また、本発明に係る薬学的組成物は、本明細書に記載の抗体の形態、意図された送達様式、及び他の幾多の変数に応じて、関連技術分野で認識される技術を用いて所望のように製剤化されてもよい。さらに、関連技術分野において周知であり、投与を容易にするか、あるいは送達のために薬学的に最適化された製剤で活性化合物を処理することを助ける、比較的不活性物質である賦形剤及びアジュバントを始めとする薬学的に許容される適切な担体を含有するように製剤化されてもよい。例えば、ビヒクル、アジュバント、及び希釈剤を含む薬学的に許容される様々な担体は、複数の商業的供給源から容易に入手可能である。また、薬学的に許容される補助物質の分類、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤、安定化剤、湿潤剤なども入手可能である。特定の非限定的且つ例示的な担体には、ブライン、緩衝ブライン、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組み合わせが含まれる。

【0126】

また、本発明に係る薬学的組成物は、経腸、非経口または局所投与のために製剤化されてもよい。実際には、３つのタイプの製剤のすべてを同時に用いて活性成分の全身投与を達成してもよい。非経口及び非経口薬物送達のための賦形剤のみならず、製剤は関連技術分野において周知である。非経口投与に適した製剤には、水溶性形態の活性化合物、例えば、水溶性塩の水溶液が含まれる。さらに、油性注射懸濁液に適切な活性化合物の懸濁液を投与してもよい。適切な親脂性溶媒またはビヒクルには、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよく、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、及び／またはデキストランが挙げられる。任意で、懸濁液は、安定化剤を含有してもよい。さらに、リポソームを用いて細胞への送達のために作用剤をカプセル化してもよい。

【0127】

経腸投与に適した製剤には、硬質または軟質ゼラチンカプセル、丸剤、コーティングされた錠剤を始めとする錠剤、エリキシル、懸濁液、シロップまたは吸入剤及びその制御放出形態が含まれる。

【0128】

一般に、本明細書に開示される抗体は、それを必要とする対象体に経口、静脈内、動脈内、皮下、非経口、鼻腔内、筋肉内、心臓内、脳室内、気管内、頬側、直腸、腹腔内、皮内、局所、経皮、及び脊椎腔内、またはそうでなければ移植または吸入によるものを含むが、それらに限定されない様々な経路によってインビボで投与される。投与の適切な製剤及び経路は、意図される用途及び治療法に応じて選択可能である。

【0129】

本発明に係る薬学的組成物は、癌の治療または予防のための薬学的に有効な量で投与される。前記薬学的に有効な量は、医師または他の臨床医によって求められる、対象体における生物学的または医学的応答を引き出すべき抗体またはそれを含む薬学的組成物の量を意味する。さらに、予防及び／または治療効果を有する治療の量を達成するために、特定の頻度で多重容量の抗体またはそれを含む薬学的組成物を投与してもよい。

【0130】

前記薬学的に有効な量は、典型的には治療される対象の体重、その身体状態、治療される状態の広さ、及び治療される対象の年齢に依存する。一般に、本明細書に開示される抗体は、用量当たり約１０ｎｇ／ｋｇ体重～約１００ｍｇ／ｋｇ体重範囲、約５０μｇ／ｋｇ体重～約５ｍｇ／ｋｇ体重範囲、約１００μｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重範囲、約１００μｇ／ｋｇ体重～約２０ｍｇ／ｋｇ体重範囲、０．５ｍｇ／ｋｇ体重～約２０ｍｇ／ｋｇ体重範囲の量で投与してもよいが、それらに限定されるものではない。さらに、抗体は、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、または少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与してもよいが、それらに限定されるものではない。

【0131】

また、本発明に係る薬学的組成物は、約１００ｍｇ～約１０，０００ｍｇの用量、約２００ｍｇ～約９，０００ｍｇの用量、約３００ｍｇ～約８，０００ｍｇの用量、約４００ｍｇ～７，０００ｍｇの用量、５００ｍｇ～５，０００ｍｇの用量で投与してもよいが、それらに限定されるものではない。

【0132】

本発明に係る薬学的組成物は通常、患者に複数回投与される。例示的な治療計画は、２週間ごとに１回、１ヶ月１回、または３～６ヶ月ごとに１回投与を含む。例えば、患者は、サイクルとして４週間ごとに、例えば、２８日ごとに１回の抗体を（例えば、静脈内製剤として）提供される。投与頻度は、患者における抗体の薬物動態学的プロファイルに応じて調整されてもよい。例えば、抗体の半減期は２週間の投与頻度を必要とする。いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する少なくとも２つの抗体を同時に投与してもよく、そのような場合に投与される各抗体の投与量は示された範囲内に属する。

【0133】

投与量及び頻度は、患者における抗体の半減期に依存する。一般に、ヒト抗体は最も長い半減期を示し、次いでヒト化抗体、キメラ抗体、及び非ヒト抗体である。投与量及び投与頻度は、治療が予防的であるか、もしくは治療的であるかに応じて変わり得る。

【0134】

治療計画の持続期間は、治療される疾患、患者の年齢及び状態、患者の疾患の病期及び種類、患者が治療にどのように反応するかなどに依存する。臨床医は、治療の効果を綿密に観察し、必要に応じて任意の調整を行う。作用剤を組み合わせて用いる場合、２種以上の治療剤を同時にまたは任意の順序で逐次投与し、すなわち、本明細書に開示される抗体は、第２の治療剤を投与する前に、第２の治療剤と共同で、あるいは第２の治療剤の投与に続いて投与する。

【0135】

また、本発明は、
（ｉ）本発明に開示される抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂを含む抗体またはその抗原結合断片と試料を接触させるステップと、
（ｉｉ）前記抗体またはその抗原結合断片とＰＤ－Ｌ１との間の複合体形成を検出するか、あるいは複合体の量を決定するステップと、
を含む、試料からＰＤ－Ｌ１を検出するか、あるいはＰＤ－Ｌ１の量を決定する方法を提供する。

【0136】

本発明において、前記抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂを含む抗体またはその抗原結合断片、もしくは前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体複合体に関する内容は前記と同じであるので、具体的な説明は前記内容を援用する。

【0137】

本発明において、前記試料は細胞試料、すなわち癌細胞などの細胞を含む試料であってもよい。

【0138】

本発明の抗体または抗原結合断片を用いて、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ１発現細胞の検出またはＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ１発現細胞の量を決定することができる。ＰＤ－Ｌ１と本発明の抗体または抗原結合断片との間の複合体の量を検出または決定することによって、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ１発現細胞が検出されるか、あるいはＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ１発現細胞の量が決定される。複合体の形成は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ１発現細胞の存在を示す。そのような量の検出または決定は、幾多の方法、本発明の抗体または抗原結合断片を利用する免疫検出を含むが、それらに限定されない方法で実施されてもよい。ペプチドまたはタンパク質を検出するために抗体を用いる方法は周知であり、ＥＬＩＳＡ、競合的結合アッセイ、及びそれと同様の方法を含む。一般に、そのようなアッセイは、検出のために提供する標識、例えば、インジケーター（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）酵素、放射性標識、蛍光団、または常磁性粒子に直接的または間接的に結合した標的ペプチドまたはタンパク質に特異的に結合する抗体または抗体断片を利用する。本発明の方法は、ＰＤ－Ｌ１レベルまたはＰＤ－Ｌ１発現細胞のレベルの定量的及び／または定性的評価（ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ）、例えば、絶対的及び／または相対的評価を可能にする。

【0139】

以下、実施例及び実験例を挙げて本発明を詳細に説明する。

【0140】

但し、下記実施例及び実験例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記実施例及び実験例によって限定されるものではない。

【実施例1】

【0141】

免疫及び採血
免疫抗原としてヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質を免疫アジュバント（ＧＥＲＢＵ）と混合し、１頭のアルパカに３回にかけて筋肉注射により免疫した。３次にわたって免疫を行い、最後の免疫から１４日目にアルパカから１０ｍＬずつ採血し、ＥＬＩＳＡによって免疫応答を解析した。抗体産生の有無を測定するため、１μｇ／ｍＬの濃度で免疫抗原をコーティングバッファーを用いて９６ウェルマイクロプレートに分注し、４℃で一晩コーティングした。９６ウェルマイクロプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで、非特異的結合を阻害するために５％スキームミルク（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）を室温で２時間処理してブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。その後、ＰＢＳＴで３回洗浄後、免疫前（ｄａｙ ０）、免疫後１４日（ｄａｙ １４）、２８日（ｄａｙ ２８）、４２日（ｄａｙ ４２）に確保した血清試料をステップごとの希釈濃度で処理した。その後、９６ウェルマイクロプレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、次いで、ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｌｌａｍａ ＩｇＧ ＨＲＰ抗体と室温で１時間反応させ、ＴＭＢ反応で免疫抗原に結合した抗体有無を確認した。

【実施例2】

【0142】

ライブラリの作成及び評価
＜実施例１＞で確認した免疫抗原に結合する単一ドメイン抗体をコードする遺伝子の増幅によりライブラリーを構築した。ライブラリー構築のために、血液からフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）を用いて末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。単離された末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）から抽出した全ＲＮＡ（Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）から特異的プライマー（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ）を用いて単一ドメイン抗体をコードする遺伝子断片を増幅し、ｐＣｏｍｂ３×ベクターにクローニングした。作製された免疫ライブラリーのサイズは５．４×１０^８であった。

【実施例3】

【0143】

ライブラリの増幅
＜実施例２＞で作製した免疫ライブラリーをＸＬ１－ｂｌｕｅ株に形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）した。形質転換したＸＬ１－ｂｌｕｅ株を、２％のグルコース、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む１０ｍＬの２×ＹＴ培地に加え、３７℃の振とう攪拌機で培養した。ＯＤ_６００で吸光度が０．５になるまで培養し、Ｍ１３Ｋ０７ファージ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１×１０^１１ ｐｆｕ／ｍＬになるように添加した。その後、３７℃で３０分間静置培養後、３７℃の振とう攪拌機で２００ｒｐｍで３０分間追加培養した。培養液を常温下、４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上清を除去した。その後、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ培地１０ｍＬを添加することで培養液のペレットを再懸濁し、３０℃の振とう培養器で２５０ｒｐｍで一晩培養した。その後、４℃、４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清をＰＥＧ沈殿法を用いて沈殿し、４℃、１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。ペレットをＰＢＳで再懸濁し、４℃、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移して用いるまで４℃で保存した。

【実施例4】

【0144】

バイオパニング（ｂｉｏ－ｐａｎｎｉｎｇ）
免疫抗原に特異的な単一ドメイン抗体を選別するために、９６ウェルマイクロプレートに５μｇ／ｍＬの濃度でコーティングバッファーを用いて免疫抗原を分注し、４℃で一晩コーティングした。単一ドメイン抗体を選別するための用いられるライブラリー（＜実施例３＞のライブラリー）を９６ウェルマイクロプレートに分注し、室温で３０分間反応させた。その後、新しいウェルにライブラリーを移し、常温で３０分間反応させる作業を４回繰り返した。そのような操作は、マイクロプレートウェルに非特異的に結合するライブラリーを減少させるために行われた。ライブラリーを１．７ｍＬチューブに移し、使用するまでは４℃で保存した。免疫抗原でコーティングされたマイクロプレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、次いで、５％のスキームミルクを加えて室温で２時間ブロッキングした。その後、ＰＢＳＴで５回洗浄し、次いで、非特異的結合率が減少したライブラリーをバインディング溶液（２．５％のスキームミルク、０．５％のｔｗｅｅｎ ２０）と共に５×１０^１２ ｖｉｒｉｏｎｓ／ウェルで分注し、常温で３０分間反応した。その後、洗浄溶液（ＰＢＳ、０．５％のｔｗｅｅｎ ２０）で１０回洗浄し、次いで、さらにＰＢＳＴで３回洗浄した。免疫抗原に特異的に結合した単一ドメイン抗体は、１ウェル当たり５μｇの免疫抗原を添加し、次いで、室温、５００ｒｐｍで３０分間反応して選択的に溶出した。溶出したファージを対数増殖期のＸＬ－１ ｂｌｕｅ細胞に感染させた後、２×ＹＴ寒天培地に塗抹した。第２の選別目的のパニングのために、前記と同じ条件下で繰り返した。寒天培地で生成された単一のファージクローンをそれぞれ増幅し、ＦＡＣＳを用いてスクリーニングした。

【実施例5】

【0145】

ファージスクリーニング
Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ細胞における免疫抗原の一時的な過剰発現を誘導するために、免疫抗原をコードする遺伝子をｐＣＭＶ６－ＧＦＰベクターに挿入してｐＣＭＶ６－免疫抗原－ＧＦＰプラスミドを構築した。Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ細胞をＤＰＢＳで洗浄し、次いで、室温、１，２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を除去し、２％のスキームミルクで細胞を再懸濁して４℃、３０分間ブロッキングした。細胞を室温、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離して上清を除去してからＤＰＢＳで２回洗浄し、９６ウェルマイクロプレートに３×１０^５細胞／１００μＬ／ウェルとなるように分注した。各ウェルにモノクローナルファージを加えて４℃で１時間反応させた後、ＤＰＢＳで２回洗浄した。細胞に、ファージに特異的に結合する抗体（Ｍ１３ ｍａｊｏｒ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ））を分注し、光を遮断したまま４℃で３０分間反応する。細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、次いで、新しいＤＰＢＳで再懸濁し、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６（ＢＤ）装置を用いてＦＡＣＳ解析した。ＦＡＣＳシステムを用いてスクリーニングされたクローンを選別し、塩基配列解析を行った。

【実施例6】

【0146】

ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが融合した単一ドメイン抗体の発現及び精製
＜６－１＞ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインが融合した一価単一ドメイン抗体の発現及び精製
＜実施例５＞で選別したクローンをＴＧＥＸ－Ｆｃ（ＩｇＧ１）発現ベクターにクローニングした。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを融合した単一ドメイン抗体の発現のために、９５～９９％の生存率のＥｘｐｉ－ＣＨＯ細胞を計数し、７×１０^６細胞を２５ｍＬの培地（Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ））に添加する。そして、８％ＣＯ_２が維持された３７℃の振とう培養器で、１２５ｒｐｍ、一晩培養した。その後、８０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ ＣＨＯ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ，１０００３３０２１）と９２０μＬのＯｐｔｉＰＲＯ^ＴＭ ｍｅｄｉｕｍ混合液に、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインが融合した単一ドメイン抗体をコードする２０μｇのプラスミドＤＮＡと、１ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯ^ＴＭ ｍｅｄｉｕｍ混合液を加え、室温で５分間反応させた後、培養細胞に添加した。細胞を８％ＣＯ_２が維持された振とう培養器中で１２５ｒｐｍ、２０時間培養した。その後、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインが融合した単一ドメイン抗体の発現を増強する１５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ ＣＨＯ ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｇｉｂｃｏ）と、６ｍＬのＥｘｐｉＣＨＯ Ｆｅｅｄ（Ｇｉｂｃｏ）を入れ、５％のＣＯ_２が維持される３２℃の振とう培養器で１２５ｒｐｍ、５日間培養した。培養した細胞を４℃、４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を０．２μｍのシリンジフィルターを用いてろ過した。その後、ＨｉＴｒａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清をロードし、ＰＢＳで洗浄してから、ＩｇＧ ｅｌｕｔｉｏｎバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインが融合した単一ドメイン抗体をｃｏｌｕｍｎから溶出した。溶出した試料を１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を加えて中和し、次いで、使用するまでは４℃で保存した。

【0147】

＜６－２＞ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインが融合したＰＤ－Ｌ１抗原特異的二価単一ドメイン抗体の発現及び精製
＜実施例５＞で選別したクローンを２つのＧ２Ｓリンカー（ＧＧＳＧＧＳ）を用いて連結することにより、二価単一ドメイン抗体を作製した。前記二価単一ドメイン抗体をコードするヌクレオチドは、遺伝子合成（マクロジェン，韓国）によって確保した。ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインが融合した単一ドメイン抗体の発現及び精製のために合成された遺伝子を、ＴＧＥＸ－Ｆｃ（ＩｇＧ４）発現ベクターにクローニングした。その後、実施例＜６－１＞に記載のものと同様の方法で発現及び精製した。

【実施例7】

【0148】

ＦＡＣＳを用いたヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが融合した単一ドメイン抗体と免疫抗原の結合能評価
＜実施例６＞で精製した抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂ（ＰＤＬ１ Ｎｂ＃０１－ＩｇＧ１）、抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）と免疫抗原との結合能を、ＦＡＣＳにより確認した。

【0149】

具体的には、ＣＨＯ－Ｋ１＿ＰＤ－Ｌ１細胞株（ＰＤ－Ｌ１抗原が過剰発現されるＣＨＯ－Ｋ１細胞）をＤＰＢＳで洗浄し、次いで、常温、１，２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を除去し、２％のスキームミルクで細胞を再懸濁して４℃、３０分間ブロッキングした。細胞を室温、１，２００ｒｐｍで３分間遠心分離して上清を除去し、次いで、ＤＰＢＳで２回洗浄した。その後、各ウェルに３×１０^５細胞／１００μＬ／ウェルで細胞を分注し、次いで、抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂ（ＰＤＬ１ Ｎｂ＃０１－ＩｇＧ１）、抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）をそれぞれ濃度ごとに処理し、陰性対照群としてアイソタイプコントロール（ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）抗体を使用した。細胞を４℃で１時間反応させた後、ＤＰＢＳで２回洗浄した。その後、ヒトＦｃドメインに特異的に結合する抗体（Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ＡＰＣ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ））を処理し、光を遮断したまま４℃で３０分間反応した。細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、次いで、１００μＬのＤＰＢＳで再懸濁し、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６（ＢＤ）装置を用いてＦＡＣＳ解析した。

【実施例8】

【0150】

ＦＡＣＳを用いたヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが融合した単一ドメイン抗体の免疫抗原相互作用に対する阻害能評価
＜実施例６＞で精製した抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂ（ＰＤＬ１ Ｎｂ＃０１－ＩｇＧ１）、抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）がＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の相互作用に及ぼす抑制能を評価した。

【0151】

具体的には、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の相互作用に対する抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂ（ＰＤＬ１ Ｎｂ＃０１－ＩｇＧ１）、抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）の評価のために、ＣＨＯ－Ｋ１＿ＰＤ－Ｌ１細胞株（ＰＤ－Ｌ１抗原が一定に発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞）を９６ウェルマイクロプレートにウェル当たり２×１０^５細胞で分注し、１０μｇ／ｍＬのヒトＰＤ－１－Ｈｉｓタンパク質で処理した。その後、抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂ（ＰＤＬ１ Ｎｂ＃０１－ＩｇＧ１）、抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）をそれぞれ濃度ごとに処理し、陰性対照群として、アイソタイプコントロール抗体で処理した。細胞を４℃で１時間反応させ、ＤＰＢＳで３回洗浄し、次いで、Ｈｉｓ抗原に特異的に結合する抗体（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｉｓ ＰＥ）を加え、光を遮断したまま、４℃で３０分間反応させた。細胞をＤＰＢＳで３回洗浄し、次いで、１００μＬのＤＰＢＳで再懸濁し、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６（ＢＤ）装置でＣＨＯ－Ｋ１＿ＰＤ－Ｌ１細胞（ＰＤ－Ｌ１抗原が一定に発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞）に残っているＰＤ－１－Ｈｉｓタンパク質量を確認することで、抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂ（ＰＤＬ１ Ｎｂ＃０１－ＩｇＧ１）、抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）がＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の相互作用に及ぼす抑制能を評価した。

【実施例9】

【0152】

ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが融合した単一ドメイン抗体の免疫抗原との親和性評価
Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ ９６ｅ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）装置を用いて、＜実施例６＞で精製した抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂ（ＰＤＬ１ Ｎｂ＃０１－ＩｇＧ１）、抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）と、免疫抗原タンパク質との親和性（Ｋｄ）を測定した。

【0153】

具体的には、抗ヒトＦｃでコーティングされたバイオセンサーチップ（ｔｉｐ）（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を、５μｇ／ｍＬの抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂ（ＰＤＬ１ Ｎｂ＃０１－ＩｇＧ１）、抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）がそれぞれ分注された９６ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）で１．５ｎｍレベルで飽和結合させた。ＰＤ－Ｌ１抗原は、１０～４００ｎＭで１×ｋｉｎｅｔｉｃバッファー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて２倍に段階的に希釈し、３０℃、１，０００ｒｐｍで撹拌しながら反応した。試料の結合と解離反応を、それぞれ２００、４００秒間解析した。結果データは、１：１相互作用モデル（Ｇｌｏｂａｌ ｆｉｔｔｉｎｇ）法を用いて解析した。

【実施例10】

【0154】

抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）のｉｎ ｖｉｔｒｏの有効性評価
ＣＨＯ－Ｋ１＿ＰＤ－Ｌ１細胞（ＰＤ－Ｌ１抗原の過剰発現を誘導したＣＨＯ－Ｋ１細胞）と、ＰＤ－１が発現するＪｕｒｋａｔ細胞を用いて、＜実施例６＞で精製した抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）のｉｎ ｖｉｔｒｏの有効性を評価した。

【0155】

具体的には、ＣＨＯ－Ｋ１＿ＰＤ－Ｌ１細胞（ＰＤ－Ｌ１抗原を過剰発現を誘導したＣＨＯ－Ｋ１細胞）を、９６ウェルマイクロプレートにウェルあたり２×１０^４細胞に分注し、次いで、５％のＣＯ_２が維持される培養器で１６時間培養した。その後、培地を除去し、抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）を濃度ごとに処理し、１時間反応した。５×１０^５細胞／１００ｕＬのＪｕｒｋａｔ細胞を用意し、次いで、ＰＨＡを０．５ｍｇ／ｍＬになるように処理し、抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）処理済みのＣＨＯ－Ｋ１＿ＰＤ－Ｌ１細胞に添加してから、４８時間反応した。その後、ＥＬＩＳＡ法により上清のＩＬ－２濃度を測定し、抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）のｉｎ ｖｉｔｒｏの有効性を評価した。

【実施例11】

【0156】

抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）のｉｎ ｖｉｖｏの有効性評価
＜実施例６＞で精製した抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）のｉｎ ｖｉｖｏの有効性は、ヒトＰＤ－Ｌ１発現を誘導した腫瘍細胞株（Ｂ１６Ｆ１０細胞）をＣ５７ＢＬ／６マウスに注入して、抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）による抗腫瘍効果を評価した。

【0157】

具体的には、６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスに、Ｂ１６Ｆ１０＿ＰＤ－Ｌ１細胞株（ＰＤ－Ｌ１の過剰発現を誘導したＢ１６Ｆ１０細胞）を８×１０^５細胞／１００μＬを注入した。横×縦の腫瘍サイズが３×３ｍｍに達するまで腫瘍形成を誘導した。その後、２日間隔で１０ｍｐｋの抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）を７回にわたって腹腔投与し、腫瘍サイズを測定した。最後の腹腔投与後、２日間隔で１週間の腫瘍サイズを測定し、抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）のｉｎ ｖｉｖｏの有効性を評価した。

【0158】

＜実験例１＞抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂ（ＰＤＬ１ Ｎｂ＃０１－ＩｇＧ１）の作製
免疫抗原としてヒトＰＤ－Ｌ１抗原を用いて、＜実施例５＞に記載のものと同様の方法で、ＰＤ－Ｌ１タンパク質に特異的な単一ドメイン抗体クローンを選別して塩基配列解析を行った。前記の選別された抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂ（ＰＤＬ１ Ｎｂ＃０１）のアミノ酸配列を下記表５及び表６に示す。

【0159】

また、前記選別した抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂ（ＰＤ－Ｌ１ Ｎｂ＃０１）を用いて、実施例＜６－１＞に記載のものと同様の方法で、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含むＰＤ－Ｌ１に特異的な一価単一ドメイン抗体を発現及び精製し、精製された一価単一ドメイン抗体を抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂ（ＰＤＬ１ Ｎｂ＃０１－ＩｇＧ１）と命名した。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂ（ＰＤＬ１ Ｎｂ＃０１－ＩｇＧ１）のアミノ酸配列を下記表７に示す。

【0160】

また、前記選別した抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂ（ＰＤＬ１ Ｎｂ＃０１）クローンを用いて、実施例＜６－２＞に記載のものと同様の方法で、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを含むＰＤ－Ｌ１に特異的な二価単一ドメイン抗体を発現及び精製し、精製された二価単一ドメイン抗体を抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）と命名した。抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）から、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを除いた抗ＰＤ－Ｌ１二価ｓｄＡｂ（ＰＰ Ｎｂ）のアミノ酸配列を下記表８に示し、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）のアミノ酸配列を下記表９に示す。

【0161】

【表5】

【0162】

【表6】

【0163】

【表7】

【0164】

【表8】

【0165】

【表9】

【0166】

＜実験例２＞抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂ（ＰＤＬ１ Ｎｂ＃０１－ＩｇＧ１）及び抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）の抗原結合能、並びにＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の相互作用に対する阻害能評価
＜実施例７＞及び＜実施例８＞に記載の方法と同様に、ＦＡＣＳを用いて＜実験例１＞で精製した抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂ（ＰＤＬ１ Ｎｂ＃０１－ＩｇＧ１）及び抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）の抗原結合能（図１Ａ及び図２Ａ）、並びにＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の相互作用に及ぼす阻害能（図１Ｂ及び図２Ｂ）を評価した。

【0167】

その結果、図１Ａ及び図１Ｂに示すように、抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂ（ＰＤＬ１ Ｎｂ＃０１－ＩｇＧ１）は、ＣＨＯ－Ｋ１＿ＰＤ－Ｌ１細胞（ＰＤ－Ｌ１抗原が一定に発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞）において、２３．３１ｎＭ（ＥＣ５０）の抗原結合能が確認され、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の相互作用に及ぼす阻害能が４．６０ｎＭ（ＩＣ５０）であることが確認された。

【0168】

さらに、図２Ａ及び図２Ｂに示すように、抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）は、ＣＨＯ－Ｋ１＿ＰＤ－Ｌ１細胞（ＰＤ－Ｌ１抗原が一定に発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞）において、１．９３ｎＭ（ＥＣ５０）の抗原結合能が確認され、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の相互作用に及ぼす阻害能が２．８６ｎＭ（ＩＣ５０）であることが確認された。

【0169】

＜実験例３＞抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂ（ＰＤＬ１ Ｎｂ＃０１－ＩｇＧ１）及び抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）と、免疫抗原との親和性評価
＜実験例１＞で精製した抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂ（ＰＤＬ１ Ｎｂ＃０１－ＩｇＧ１）及び抗－ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）において、それぞれＰＤ－Ｌ１抗原との親和性を＜実施例９＞に記載のものと同様の方法で評価した。

【0170】

その結果、表１０に示すように、抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂ（ＰＤＬ１ Ｎｂ＃０１－ＩｇＧ１）は、ＰＤ－Ｌ１抗原と７．０８ｎＭの抗原親和力が確認され、抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）は、ＰＤ－Ｌ１抗原と４．５８ｎＭの抗原親和性が確認された。

【0171】

【表10】

【0172】

＜実験例４＞抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）のｉｎ ｖｉｔｒｏの有効性評価
＜実験例１＞で精製した抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏの有効性を評価した。

【0173】

具体的には、＜実施例１０＞に記載のものと同様の方法で、ＣＨＯ－Ｋ１＿ＰＤ－Ｌ１細胞（ＰＤ－Ｌ１を一定に発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞）と、ＰＤ－１を発現するｊｕｒｋａｔ細胞との相互作用を、抗－ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）が阻害して、ｊｕｒｋａｔ細胞から発現されたＩＬ－２の濃度を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏの有効性を評価した。

【0174】

その結果、図３に示すように、抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）は、ＰＤ－１を発現するｊｕｒｋａｔ細胞とＰＤ－Ｌ１を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞とに干渉し、ＣＨＯ－Ｋ１ 細胞とｊｕｒｋａｔ細胞との相互作用に対する０．８０ｎＭ（ＩＣ５０）の阻害能が確認された。

【0175】

＜実験例５＞抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）のｉｎ ｖｉｖｏの有効性評価
＜実験例１＞で精製した抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）のｉｎ ｖｉｖｏの有効性評価は、マウス腫瘍モデルを用いて行った。

【0176】

具体的には、＜実施例１１＞に記載のものと同様の方法で、抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）にＰＤ－Ｌ１抗原を発現する腫瘍細胞（Ｂ１６Ｆ１０細胞）を注入し、腫瘍が形成されたマウスモデルにおける腹腔投与による抗腫瘍効果を観察した。

【0177】

その結果、図４に示すように、抗ＰＤ－Ｌ１二価ＨＣＡｂ（ＰＰ Ｎｂ－ＩｇＧ４）は、陰性対照群（Ｉｓｏｔｙｐｅ ｇｒｏｕｐ）に対して約３９．２％の抗腫瘍効果が示されることを確認した。

【産業上の利用可能性】

【0178】

本発明に係る単一ドメイン抗体は、免疫チェックポイントタンパク質（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）であるＰＤ－Ｌ１に対する優れた親和性及び抗腫瘍効果を示すので、免疫チェックポイント阻害剤として免疫抗癌療法に有用に用いることができる。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【配列表】

2024513643000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-09-04

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む抗体またはその抗原結合断片であって、
前記ｓｄＡｂが、
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１；
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２；及び
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
を含む、抗体またはその抗原結合断片。

【請求項2】

前記ｓｄＡｂが、以下のＶＨＨドメインを含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片：
配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるＦＲ１；
配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるＦＲ２；
配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるＦＲ３；及び
配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるＦＲ４。

【請求項3】

前記ｓｄＡｂが、配列番号１及び１０のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、請求項２に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項4】

少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項5】

少なくとも１つのアミノ酸置換が保存的置換である、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項6】

少なくとも１つのアミノ酸置換がアミノ酸の非遺伝子コードアミノ酸または合成アミノ酸への置換である、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項7】

前記ｓｄＡｂが、Ｆｃ断片に融合された重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項8】

前記ＨＣＡｂが、単量体性または多量体性である、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項9】

前記Ｆｃ断片が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項10】

前記ｓｄＡｂが、ペプチドリンカーを介してＦｃ断片に融合する、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項11】

前記ＨＣＡｂが、配列番号５及び１１のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項12】

少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項13】

少なくとも１つのアミノ酸置換が保存的置換である、請求項１２に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項14】

少なくとも１つのアミノ酸置換がアミノ酸の非遺伝子コードアミノ酸または合成アミノ酸への置換である、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項15】

（ａ）前記ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する第２の抗原結合部分と、を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項16】

前記第２の抗原結合部分が、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、（Ｆａｂ'）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディまたは第２のｓｄＡｂである、請求項１５に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項17】

前記第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が、ペプチドリンカーを介して互いに融合している、請求項１５に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項18】

免疫調節剤、サイトカイン、細胞毒性剤、化学療法剤、診断剤、抗ウイルス剤、抗微生物剤または薬物に結合している、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項19】

免疫調節剤、サイトカイン、細胞毒性剤、化学療法剤、診断剤、抗ウイルス剤、抗微生物剤または薬物に結合している請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、抗体複合体。

【請求項20】

請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする、核酸分子。

【請求項21】

請求項２０に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。

【請求項22】

請求項２１に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。

【請求項23】

（ａ）抗体を発現させる条件下で請求項２２に記載の宿主細胞を培養するステップと、
（ｂ）発現された抗体またはその抗原結合断片を回収するステップと、
を含む、抗体またはその抗原結合断片を産生する方法。

【請求項24】

請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片、あるいは請求項１９に記載の抗体複合体を有効成分として含有する、癌の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項25】

前記癌が、黒色腫、肺癌、肝臓癌、神経膠腫、卵巣癌、大腸癌、頭頸部癌、膀胱癌、腎細胞癌、胃癌、乳癌、転移癌、前立腺癌、膵臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、孤立性骨髄腫及び再生不良性貧血からなる群から選択される、請求項２４に記載の薬学的組成物。

【請求項26】

前記薬学的組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項２４に記載の薬学的組成物。

【請求項27】

（ｉ）請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片を試料と接触させるステップと、
（ｉｉ）前記抗体またはその抗原結合断片とＰＤ－Ｌ１との間の複合体形成を検出するか、あるいは複合体の量を決定するステップと、
を含む、試料からＰＤ－Ｌ１を検出するか、あるいはＰＤ－Ｌ１の量を決定する方法。

【国際調査報告】