特表 2024-513664 プロテインＣ及び活性化プロテインＣを測定する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-27

(54)【発明の名称】プロテインＣ及び活性化プロテインＣを測定する方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/62 20210101AFI20240319BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20240319BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20240319BHJP

   C12Q 1/37 20060101ALI20240319BHJP

【ＦＩ】

G01N27/62 V

G01N33/68 ZNA

A61P31/04

A61K38/17

C12Q1/37

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023553423

(86)(22)【出願日】2022-03-01

(85)【翻訳文提出日】2023-10-27

(86)【国際出願番号】 EP2022055176

(87)【国際公開番号】W WO2022184725

(87)【国際公開日】2022-09-09

(31)【優先権主張番号】21382173.9

(32)【優先日】2021-03-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522289275

【氏名又は名称】コンソルシオ セントロ デ インベスティガシオン ビオメディカ エン レッド （セイベエエレ）

(71)【出願人】

【識別番号】519098394

【氏名又は名称】ウニベルシタ デ バレンシア

(71)【出願人】

【識別番号】523332013

【氏名又は名称】インスティテュート デ インベスティガシオン サニタリア インクリヴァ

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ガルシア ヒメネス ホセ ルイス

(72)【発明者】

【氏名】パジャルド カラタユド フェデリコ ビセンテ

(72)【発明者】

【氏名】メナ モーラ サルバドール

(72)【発明者】

【氏名】カルボネル モンレオン ニエベス

【テーマコード（参考）】

2G041

2G045

4B063

4C084

【Ｆターム（参考）】

2G041CA01

2G041EA04

2G041EA12

2G041FA12

2G041FA13

2G041FA22

2G041FA24

2G041GA03

2G041GA09

2G041HA01

2G041JA02

2G041JA05

2G041LA09

2G045AA25

2G045CA25

2G045CA26

2G045CB03

2G045CB07

2G045CB30

2G045DA36

2G045FA33

4B063QA13

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ79

4B063QR16

4B063QS40

4B063QX10

4C084AA02

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA21

4C084BA23

4C084CA18

4C084NA20

4C084ZB351

4C084ZB352

(57)【要約】

本発明は、測定を必要とする被験体におけるプロテインＣ（ＰＲＯＣ）、好ましくは活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）のレベルを測定する方法であって、被験体から単離された１つ以上の生体試料の酵素消化を行う工程と、配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）及び／又は配列番号２（ＴＦＶＬＮＦＩＫ）のペプチドのレベルを測定する工程とを含み、ここで、配列番号１及び／又は配列番号２のレベルが、上記１つ以上の生体試料中に存在するＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣのレベルに対応する、方法に関する。また、被験体を分類し、治療に対する奏功を予後予測する方法も含まれる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクがある被験体をスクリーニング又は分類する質量分析に基づく方法であって、
ｉ）前記被験体から単離された１つ以上の生体試料に対して酵素消化を行う工程と、質量分析計を使用することによって配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のペプチドのレベルを測定する工程とを含み、配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のレベルが、前記１つ以上の生体試料中に存在するＰＲＯＣのレベルに対応する、方法を実施することによって、プロテインＣ（ＰＲＯＣ）のレベルを測定する工程と、
ｉｉ）工程ｉ）において取得された前記レベルと基準値とを比較する工程と、
を含み、ここで、前記基準値は、１４３１．５７ｎｇ／ｍＬであり、少なくとも４０％の低下が、前記被験体が敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクがあることの指標である、方法。

【請求項2】

前記方法は、前記患者が敗血症又は敗血症性ショックを患っていることを臨床的に確認する工程を更に含む、請求項１に記載の質量分析に基づく方法。

【請求項3】

播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を患うリスクがある、敗血症又は敗血症性ショックと診断された被験体をスクリーニング又は分類する質量分析に基づく方法であって、
ｉ）前記被験体から単離された１つ以上の生体試料に対して酵素消化を行う工程と、質量分析計を使用することによって配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のペプチドのレベルを測定する工程とを含み、配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のレベルが、前記１つ以上の生体試料中に存在するＰＲＯＣのレベルに対応する、方法を実施することによって、プロテインＣ（ＰＲＯＣ）のレベルを測定する工程と、
ｉｉ）工程ｉ）において取得された前記レベルと基準値とを比較する工程と、
を含み、ここで、前記基準値は、６００ｎｇ／ｍＬであり、少なくとも２０％の低下が、前記被験体がＤＩＣを患うリスクがあることの指標である、方法。

【請求項4】

前記方法は、前記患者が播種性血管内凝固症候群を患っていることを臨床的に確認する工程を更に含む、請求項３に記載の質量分析に基づく方法。

【請求項5】

前記酵素消化に使用される酵素は、トリプシン及び／又はＡｒｇＣ、又は消化後に配列番号１のＬＧＥＹＤＬＲペプチドを生じさせるプロテアーゼのあらゆる組合せである、請求項１～４のいずれか一項に記載の質量分析に基づく方法。

【請求項6】

配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のペプチドの測定は、配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）の標識プロテオタイプペプチドをスパイクインすることによって行われる、請求項１～５のいずれか一項に記載の質量分析に基づく方法。

【請求項7】

配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のスパイクイン標識プロテオタイプペプチドは、少なくとも１つ以上の重アミノ酸を用いて合成され、前記ペプチドは、好ましくはＣ末端アミノ酸残基においてタグで標識される、請求項１～６のいずれか一項に記載の質量分析に基づく方法。

【請求項8】

前記方法は、前記１つ以上の生体試料を還元剤で還元する工程と、前記１つ以上の生体試料をアルキル化剤でアルキル化する工程とを更に含み、ここで、前記還元工程及び前記アルキル化工程の両方を、前記酵素消化の工程の前に行う、請求項１～７のいずれか一項に記載の質量分析に基づく方法。

【請求項9】

前記１つ以上の生体試料は、血液、血清、血漿、唾液、尿、又は脳脊髄液からなる群より選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の質量分析に基づく方法。

【請求項10】

予後予測を必要とする被験体における組換えプロテインＣ（ＰＲＯＣ）、好ましくは組換え活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）による治療に対する奏効を予後予測する質量分析に基づく方法であって、
ｉ）請求項３～９のいずれか一項に記載の方法の各工程を実施することによって、前記被験体が播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を患うリスクがあるかどうかをスクリーニングする工程と、
ｉｉ）前記被験体がＤＩＣを患うリスクがあると特定されるか、又はＤＩＣと診断される場合に、前記被験体を前記治療に対するレスポンダーとして分類し、前記被験体がＤＩＣを患うリスクがあるとも特定されず、ＤＩＣとも診断されない場合に、前記被験体を前記治療に対するノンレスポンダーとして分類する工程と、
を含む、方法。

【請求項11】

前記予後診断を行った後に、前記被験体を組換えプロテインＣ（ｒＰＲＯＣ）で治療し、好ましくは組換え活性化プロテインＣで治療する、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

敗血症、敗血症性ショック、又は脳卒中の治療において使用される組換えプロテインＣ（ｒＰＲＯＣ）、好ましくは組換え活性化プロテインＣ（ｒＡＰＣ）を含む組成物であって、前記使用は、請求項１０又は１１に従ってレスポンダーとして分類される前記被験体に前記組成物を投与する工程を含む、組成物。

【請求項13】

敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクがある被験体をスクリーニングするバイオマーカーとしての、使用を必要とする被験体から単離された１つ以上の生体試料中の配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のペプチドのレベルのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用。

【請求項14】

播種性血管内凝固症候群を患うリスクがある被験体をスクリーニングするバイオマーカーとしての、敗血症又は敗血症性ショックを患っている被験体から単離された１つ以上の生体試料中の配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のペプチドのレベルのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用。

【請求項15】

敗血症又は敗血症性ショック及び播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を患っている被験体における、組換えＰＲＯＣ、好ましくは組換えＡＰＣによる治療に対する奏効を予後予測するバイオマーカーとしての、使用を必要とする被験体から単離された１つ以上の生体試料中の配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のペプチドのレベルのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、医療分野、特に質量分析に基づく方法を使用することによりバイオマーカーを測定する分野に関する。より詳細には、本発明は、プロテインＣ、好ましくは活性化プロテインＣを、それらのタンパク質と相関する特定のペプチドを使用して測定／定量化する質量分析に基づく方法に関する。

【背景技術】

【0002】

非特許文献１において、敗血症は、感染症に対する身体の応答が自身の組織を損傷する場合に起こる生命を脅かす臓器機能不全（既存の臓器機能不全を有することが分かっていない患者におけるベースラインのＳＯＦＡをゼロと仮定して、ＳＯＦＡスコアの合計が２ポイント以上）と定義された。敗血症性ショックは、重度の循環異常、細胞異常、及び代謝異常が、敗血症単独の場合よりも高められた死亡リスクと関連する敗血症の部分集合として定義された。しかし、ワクチン、抗生物質、及び集中治療室（ＩＣＵ）における急性期治療になされた進歩にもかかわらず、敗血症は４９００万人もの人が罹患し、依然として世界中で年間１１００万人以上が死亡する感染症による主たる死因となっており、ＩＣＵにおける最も頻度の高い死因である。

【0003】

播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）は、血管系におけるフィブリン沈着、臓器機能不全、凝固因子及び血小板の消費を引き起こす凝固の広範な活性化、並びに生命を脅かす出血を特徴とする後天性の臨床生物学的症候群である。

【0004】

プロテインＣ欠乏症（ＰＲＯＣ欠乏症）は、プロテインＣの欠乏を特徴とする稀な遺伝性障害であるため、この稀な疾患に罹患した被験体は凝塊、特に深部静脈血栓症と呼ばれる一種の凝血塊を発症するリスクがある。非常に稀ではあるが、出生時（先天性）に見られる重度の型があり、これは体内に広範囲の小さな凝塊を生じ、幼児期に生命を脅かす合併症を引き起こす可能性がある。プロテインＣレベルが検出不可能な患者は、通常、出生後数時間から数日でその疾患を認め、電撃性紫斑病又は大規模な静脈血栓症を伴う。

【0005】

プロテインＣ（ＰＲＯＣ）は、抗血栓性、抗炎症性、及び線維素溶解促進性の特性を有し、これらはセプチセミア（septicemia）に対する重度の全身応答の有害な効果を抑える役割を担うことができる。ＤＩＣの病因におけるＰＲＯＣ抗凝固経路の役割は、敗血症誘発性ＤＩＣの実験モデル及び敗血症を患う患者において研究されている。プロテインＣ欠乏症は、敗血症を患う患者において、主に消費の増加、肝臓合成障害、及び血管漏出が原因で頻繁に見られる。

【0006】

活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）は５６ｋＤａの血液ビタミンＫ－セリンプロテアーゼであり、プロテインＣ（ＰＲＯＣ）からのＡｒｇ１６９－Ｌｅｕ１７０ペプチド結合が切断され、重鎖からドデカペプチド（残基１５８～残基１６９）が放出されることにより生ずる。ＡＰＣは、抗凝固活性、細胞保護活性、抗炎症活性、及び細胞シグナル伝達活性を示した。ＡＰＣに最近割り当てられた役割の中で、トロンビン生成の主要な調節因子としてのＡＰＣの役割、及びフィブリン凝塊の発生に必須の凝血促進性活性化補因子のタンパク質分解により血液凝固を抑えるというＡＰＣの役割は広く知られている。さらに、ＡＰＣは自己免疫疾患の幾つかの前臨床モデルにおいて適応免疫応答に寄与することが明らかになっている。

【0007】

幾つかの研究によりＡＰＣの治療的使用が実証され、こうして、組換えヒトＡＰＣ（ｒｈＡＰＣ）による治療が市場に現れた。敗血症誘発性ＤＩＣにおける後天性ＡＰＣ欠乏症は、敗血症患者における凝固亢進状態及び死亡率の増加に関連している。ＡＰＣによる治療により、敗血症関連ＤＩＣを伴う部分群に遡及的に割り当てられた患者を含む重度の敗血症を患う患者の２８日死亡率が低下することが実証されている。しかしながら、ＡＰＣによる治療は他の患者群においては一切効能を示さなかったことから、ＤＩＣを患う敗血症患者のみがＡＰＣ治療（すなわち、Ｘｉｇｒｉｓ又は他の組換えＡＰＣ）の使用から便益を受けるであろうことが示唆される。また、ＡＰＣ治療により敗血症を患う患者における出血リスクが増加することも判明したことから、治療前及び治療中の患者におけるＰＲＯＣ及び／又はＡＰＣのレベルを測定することの重要性が強調される。

【0008】

したがって、ｒｈＡＰＣ（ドロトレコジンα、ＤｒｏｔＡＡ）、特にＸｉｇｒｉｓ（商標）（Eli Lilly Inc.）は製造業者によって市場から取り下げられ、幾つかの疾患におけるＡＰＣ治療の治療可能性及び安全性を改善する取り組みが行われた。出血リスクを減らすのに、ネイティブのＡＰＣ構造を突然変異させた：３つのリジンをアラニンにより置き換え（Ｋ１９１Ａ、Ｋ１９２Ａ、Ｋ１９３Ａ）、多数の細胞シグナル伝達活性を維持しながら抗凝固活性の９０％超が取り除かれた。このＡＰＣ形態は３Ｋ３Ａ－ＡＰＣと名付けられた。したがって、ZZ Biotechの３Ｋ３Ａ－ＡＰＣ（http://zzbiotech.com/the-company/3k3a-activated-protein-c）は、凝血及び炎症の調節において役割を担う天然に存在するＡＰＣの遺伝子操作された変異体である。ＡＰＣは、細胞保護特性、抗炎症特性、及び抗凝固特性を有する。３Ｋ３Ａ－ＡＰＣは抗凝固能力の低下を示し、それにより未改変のＡＰＣによって誘発される出血のリスクが最小限に抑えられる。脳卒中、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、神経外傷、及び敗血症の動物モデルにおいて、３Ｋ３Ａ－ＡＰＣ療法は、有効性の向上及び出血のリスク低下において組換えＡＰＣよりも優れていることが明らかになっている。脳内の血管内壁に対する３Ｋ３Ａ－ＡＰＣの保護効果は更に、急性虚血性脳卒中の治療に現在適応されている唯一の薬物である組織プラスミノーゲン活性化因子、すなわちｔＰＡによって時々引き起こされる出血の抑制に役立ち、最近ではコロナウイルス感染症２０１９を患う重病の患者に提案されている。

【0009】

組換え天然ヒトＡＰＣ又は突然変異型ヒトＡＰＣの治療的利用に関するこれまでの研究により、内因性及び外因性のヒトＰＲＯＣ又は／及びＡＰＣを測定するための、そしてまた診断的環境及び治療的環境のための検出及びモニタリングの方法が必要であるという考えが強められる。本発明は、三次病院の集中治療室に入院している患者（敗血症及び敗血症性ショック、並びに脳卒中のような脳血管発作を患う重度の罹患者を含む）の血漿中を含む、ヒト被験体から得られた血液中の循環ＰＲＯＣ及び循環ＡＰＣを測定する方法を記載する。本明細書に記載される方法は、多重反応モニタリング標的質量分析（ＭＲＭ－ＭＳ）及び特定の（スパイクイン標識）プロテオタイプペプチドの使用に基づき、感度及び特異度が高い方法が得られる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】敗血症及び敗血症性ショックの国際コンセンサス定義第３版（Ｓｅｐｓｉｓ－３）（Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3)）

【発明の概要】

【0011】

第１の態様において、本発明は、敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクがある被験体をスクリーニング又は分類する質量分析に基づく方法であって、
ｉ）被験体から単離された１つ以上の生体試料に対して酵素消化を行う工程と、質量分析計を使用することによって配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のペプチドのレベルを測定する工程とを含み、配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のレベルが、上記１つ以上の生体試料中に存在するＰＲＯＣのレベルに対応する、方法を実施することによって、プロテインＣ（ＰＲＯＣ）のレベルを測定する工程と、
ｉｉ）工程ｉ）において取得されたレベルと基準値とを比較する工程と、
を含み、ここで、基準値は、１４３１．５７ｎｇ／ｍＬであり、少なくとも４０％の低下が、敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクがあることの指標である、方法に関する。好ましくは、方法は、患者が敗血症又は敗血症性ショックを患っていることを臨床的に確認する工程を更に含む。

【0012】

更なる態様において、本発明は、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を患うリスクがある、敗血症又は敗血症性ショックと診断された被験体をスクリーニング又は分類する質量分析に基づく方法であって、
ｉ）被験体から単離された１つ以上の生体試料に対して酵素消化を行う工程と、質量分析計を使用することによって配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のペプチドのレベルを測定する工程とを含み、配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のレベルが、上記１つ以上の生体試料中に存在するＰＲＯＣのレベルに対応する、方法を実施することによって、プロテインＣ（ＰＲＯＣ）のレベルを測定する工程と、
ｉｉ）工程ｉ）において取得されたレベルと基準値とを比較する工程と、
を含み、ここで、基準値は、６００ｎｇ／ｍＬであり、少なくとも２０％の低下が、被験体がＤＩＣを患うリスクがあることの指標である、方法に関する。好ましくは、方法は、患者が播種性血管内凝固症候群を患っていることを臨床的に確認する工程を更に含む。

【0013】

好ましくは、酵素消化に使用される酵素は、トリプシン及び／又はＡｒｇＣ、又は消化後に配列番号１のＬＧＥＹＤＬＲペプチドを生じさせるプロテアーゼのあらゆる組合せである。好ましくは、配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のペプチドの測定は、配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）の標識プロテオタイプペプチドをスパイクインすることによって行われる。好ましくは、配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のスパイクイン標識プロテオタイプペプチドは、少なくとも１つ以上の重アミノ酸を用いて合成され、上記ペプチドは、好ましくはＣ末端アミノ酸残基においてタグで標識される。好ましくは、方法は、１つ以上の生体試料を還元剤で還元する工程と、１つ以上の生体試料をアルキル化剤でアルキル化する工程とを更に含み、ここで、還元工程及びアルキル化工程の両方を、酵素消化の工程の前に行う。

【0014】

好ましくは、１つ以上の生体試料は、血液、血清、血漿、唾液、尿、又は脳脊髄液からなる群より選択される。

【0015】

更なる態様において、本発明は、予後予測を必要とする被験体における組換えプロテインＣ（ＰＲＯＣ）、好ましくは組換え活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）による治療に対する奏効を予後予測する質量分析に基づく方法であって、
ｉ）上記様態のいずれかに記載の方法の各工程を実施することによって、被験体が播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を患うリスクがあるかどうかをスクリーニングする工程と、
ｉｉ）被験体がＤＩＣを患うリスクがあると特定されるか、又はＤＩＣと診断される場合に、被験体を上記治療に対するレスポンダーとして分類し、被験体がＤＩＣを患うリスクがあるとも特定されず、ＤＩＣとも診断されない場合に、被験体を上記治療に対するノンレスポンダーとして分類する工程と、
を含む、方法に関する。

【0016】

好ましくは、予後診断を行った後に、被験体を組換えプロテインＣ（ｒＰＲＯＣ）で治療し、好ましくは組換え活性化プロテインＣで治療する。

【0017】

更なる態様において、本発明は、敗血症、敗血症性ショック、又は脳卒中の治療において使用される組換えプロテインＣ（ｒＰＲＯＣ）、好ましくは組換え活性化プロテインＣ（ｒＡＰＣ）を含む組成物であって、使用は、上記態様に従ってレスポンダーとして分類される被験体に上記組成物を投与する工程を含む、組成物に関する。

【0018】

更なる態様において、本発明は、敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクがある被験体をスクリーニングするバイオマーカーとしての、又は播種性血管内凝固症候群を患うリスクがある被験体をスクリーニングするバイオマーカーとしての、使用を必要とする被験体から単離された１つ以上の生体試料中の配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のペプチドのレベルのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用に関する。

【0019】

更なる態様において、本発明は、敗血症又は敗血症性ショック及び播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を患っている被験体における、組換えＰＲＯＣ、好ましくは組換えＡＰＣによる治療に対する奏効を予後予測するバイオマーカーとしての、使用を必要とする被験体から単離された１つ以上の生体試料中の配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のペプチドのレベルのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用に関する。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】ＭＳ実験において様々な濃度（ｆｍｏｌ）の重スパイクインペプチド（heavy spike-in peptides）を使用した、選択されたＡＰＣペプチドについての直線性を示す図である。

【図2】ＡＰＣ（ｎｇ／ｍＬ）と、敗血症の生理病理学に関連する様々なパラメーターとの間のスピアマン相関を示す図である。ａ）ヒストンＨ２Ｂ（スピアマンのロー０．４６９、ｐ＝０．０２１）、ｂ）プロカルシトニン（ＰＣＴ）（スピアマンのロー０．４６８、ｐ＝０．０２１）、ｃ）Ｑｕｉｃｋ指数（Quick index）（スピアマンのロー０．５１４、ｐ＝０．０１０）、ｄ）機能的プロテインＣ（スピアマンのロー０．９００、ｐ＝０．０３７）とのＡＰＣ相関。

【図3】ＡＰＣ（ｎｇ／ｍＬ）と、敗血症性ショックの生理病理学に関連する様々なパラメーターとの間のスピアマン相関を示す図である。ａ）血小板（スピアマンのロー０．３７４、ｐ＝０．０００１）、ｂ）Ｑｕｉｃｋ指数（スピアマンのロー０．３０２、ｐ＝０．００３）、ｃ）活性化部分トロンボプラスチン時間（スピアマンのロー－０．２６７、ｐ＝０．０２６）、ｄ）Ｄ－二量体（スピアマンのロー－０．４３７、ｐ＝０．００２）、及びｅ）機能的プロテインＣ（スピアマンのロー０．９００ρ、ｐ＜０．０００１）とのＡＰＣ相関。

【図4】ＤＩＣと診断された患者又はＤＩＣを患っていない患者の試料中の血漿ＡＰＣレベルの研究（ｐ＝０．００１４）を示す図である。

【図5】ＭＳ実験において様々な濃度（ｆｍｏｌ）の重スパイクインペプチドを使用した、選択されたＰＲＯＣペプチドについての直線性を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

一般的な定義
本明細書において使用される場合に、数量を特定していない単数形（the singular forms "a", "an", and "the"）は、文脈上特段の明示がない限り、複数の参照を含むことに留意されたい。さらに、特段の指示がない限り、一連の要素に先立つ「少なくとも」という用語は、一連の中の全ての要素を指すものと理解されるべきである。当業者は、日常の実験を使用するだけで、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識し、又は把握することができるであろう。そのような均等物は、本発明により包含されることが意図される。

【0022】

本明細書において使用される場合、多数の列挙された要素間の接続語「及び／又は」は、個別の選択肢及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」により接続されている場合、１つ目の選択肢は１つ目の要素を２つ目の要素を除いて適用可能であることを指す。２つ目の選択肢は２つ目の要素を１つ目の要素を除いて適用可能であることを指す。３つ目の選択肢は１つ目の要素と２つ目の要素とを一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のいずれか１つがその意味の範囲内に含まれ、したがって本明細書において使用される「及び／又は」という用語の要件を満たすものと理解される。２つ以上の選択肢を同時に適用可能であることもその意味の範囲内に含まれ、したがって「及び／又は」という用語の要件を満たすものと理解される。

【0023】

本明細書及び特許請求の範囲全体を通じて、文脈上特段の必要がない限り、「～を含む（comprise）」という語、並びに「～を含む（comprises）」及び「～を含む（comprising）」等の別形は、指定された整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を含むが、あらゆる他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群も除外しないことを意味するものと理解されるであろう。本明細書において使用される場合、「～を含む（comprising）」という用語を、「～を含有する（containing）」若しくは「～を含む（including）」という用語で置き換えることができ、又は本明細書において使用される場合、時には「～を有する（having）」という用語で置き換えることができる。上述の用語（～を含む（comprising）、～を含有する（containing）、～を含む（including）、～を有する（having））のいずれも、本発明の態様又は実施形態の文脈において本明細書で使用されるときはいつでも、「～のみからなる（consisting of）」という用語で置き換えることができるが、これはあまり好ましくない。

【0024】

本明細書において使用される場合、「約」という用語は、示された値±その値の１％を意味するか、又は「約」という用語は、示された値±その値の２％を意味するか、又は「約」という用語は、示された値±その値の５％を意味するか、又は「約」という用語は、示された値±その値の１０％を意味するか、又は「約」という用語は、示された値±その値の２０％を意味するか、又は「約」という用語は、示された値±その値の３０％を意味し、好ましくは、「約」という用語は、正確に示された値（±０％）を意味する。

【0025】

本明細書において使用される場合、「～のみからなる（consisting of）」は、クレームの要素に特定されていないあらゆる要素、工程、又は成分を除外する。本明細書において使用される場合、「本質的に～のみからなる（consisting essentially of）」は、クレームの基本的な特徴及び新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程を除外しない。

【0026】

本発明の文脈において、「検出」、「定量化」、及び「測定」という用語は同義と見なされ、１つ以上の生体試料中のＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣのレベルを計算することを指す。本明細書において使用される「レベル」という用語は濃度又は量と同義である。したがって、例えば、本発明の文脈におけるＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣのレベルの測定とは、上記タンパク質の濃度又は量を計算することを意味する。

【0027】

本明細書において使用される場合、「敗血症」という用語は、感染症の疑い又は証明に加えての全身性炎症性応答症候群（例えば、発熱、頻脈、頻呼吸、又は白血球増加症）として定義される。重要なことには、敗血症の多くの症例において感染症の原因を確認することができない。

【0028】

本明細書において使用される場合、「敗血症性ショック」という用語は、全身性感染症が危険なほどの低血圧をもたらした場合に起こる重篤な病態として定義される。敗血症性ショックは通常、呼吸不全又は心不全、脳卒中、他の臓器の不全、及び死亡につながる可能性がある血圧の大幅な低下に関連している。

【0029】

本明細書において使用される場合、「播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）」という用語は、血管系におけるフィブリン沈着、臓器機能不全、凝固因子及び血小板の消費を引き起こす凝固の広範な活性化、並びに生命を脅かす出血を特徴とする後天性の臨床生物学的症候群として定義される。

【0030】

本明細書において使用される場合、「プロテインＣ欠乏症」という用語は、プロテインＣの欠乏を特徴とする遺伝性障害として定義されるため、この稀な疾患に罹患した被験体は凝塊、特に深部静脈血栓症と呼ばれる一種の凝血塊を発症するリスクがある。

【0031】

本明細書において使用される場合、「プロテインＣ」（ＰＲＯＣ）という用語は、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）のチモーゲン（酵素の不活性前駆体）であるビタミンＫ依存性糖タンパク質として定義される。本明細書において使用される場合、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）は、プロテインＣからのＡｒｇ１６９－Ｌｅｕ１７０ペプチド結合が切断され、重鎖からドデカペプチド（残基１５８～残基１６９）が放出されることにより生じた５６ｋＤａの血液ビタミンＫ－セリンプロテアーゼとして定義される。

【0032】

本明細書において使用される場合、「内因性タンパク質」という用語は、被験体内を起源とするタンパク質として定義される。内因性タンパク質は、外因性タンパク質が被験体外を起源とする、例えば、別の被験体に由来するという点で「外因性タンパク質」と異なる。したがって、内因性のＰＲＯＣ又はＡＰＣは、被験体によって合成されたＰＲＯＣ又はＡＰＣを指すのに対し、外因性のＰＲＯＣ又はＡＰＣは、被験体によって合成されず、被験体に投与されたＰＲＯＣ又はＡＰＣを指し、したがって、これらは組換えの（すなわち、実験室法によって作製された）ＰＲＯＣ又はＡＰＣであり得る。

【0033】

詳細な説明
ドロトレコジンαは、ヒト活性化プロテインＣの組換え形態である。Ｘｉｇｒｉｓ（商標）（Eli Lilly製）は、活性物質のドロトレコジンα（活性化型）を含み、多臓器不全を患う成人患者における重度の敗血症を最良の標準治療に加えて治療することについて、例外的な状況下で２００２年に欧州連合において認可された医薬である。

【0034】

後に、Ｘｉｇｒｉｓ（商標）を使用したＰＲＯＷＥＳＳ－ＳＨＯＣＫ研究の結果は、プラセボと比較して、Ｘｉｇｒｉｓで治療された患者における２８日間全死因死亡率が統計的に有意に低下するという主要評価項目を満たすことができなかった。この研究はまた、重度のプロテインＣ欠乏症を患う患者の集団において死亡率が低下するという二次評価項目にも不合格であった。Eli Lillyは世界中の市場から製品を取り下げることを決定した。

【0035】

米国特許出願公開第２０１０／０２８９１０号に開示された３Ｋ３Ａ－ＡＰＣを含む、新しく開発された、ｒｈＡＰＣに基づく、抗凝固活性が明らかに大幅に低下した最適化医薬が開発されている。さらに、ｒｈＡＰＣ療法は脳卒中の治療にも提案されている。しかしながら、ＡＰＣ治療が重篤な出血のリスクの増加と関連していることを示す強力な証拠のため、ＡＰＣ関連治療の転帰に関して重大な不確実性が見られる。

【0036】

組換えＰＲＯＣ治療又は組換えＡＰＣ治療に関連する重要な二次的効果のため、患者における内因性のＰＲＯＣ及びＡＰＣのレベルを測定するのに現在使用されている方法を感度及び特異度を高めた他の方法又は技術に置き換えて、敗血症又は敗血症性ショック又はＤＩＣを患うリスクがある被験体の分類を改善し、組換えＰＲＯＣ（ｒＰＲＯＣ）治療又は組換えＡＰＣ（ｒＡＰＣ）治療に対する奏効を予後予測することが求められている。

【0037】

本発明は、本発明の著者らによって内因性のＰＲＯＣ及びＡＰＣのレベルと相関することが見出された２つの特定のペプチドＬＧＥＹＤＬＲ（配列番号１）及びＴＦＶＬＮＦＩＫ（配列番号２）の質量分析を使用した検出に基づいてＰＲＯＣ及びＡＰＣを測定する効率的かつ正確な方法を提供することによって、上記の問題を解決することを目的とする。さらに、本発明はまた、上記疾患の治療だけでなく患者の選択にも使用されるＰＲＯＣ又はＡＰＣを含む組成物を提供する。最後に、バイオマーカーとしてのペプチドＬＧＥＹＤＬＲ及びＴＦＶＬＮＦＩＫのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用も提供される。

【0038】

ＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣを検出する方法
本発明の第１の態様は、測定を必要とする被験体におけるプロテインＣ（ＰＲＯＣ）、好ましくは活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）のレベルを測定する方法であって、被験体から単離された１つ以上の生体試料の酵素消化を行う工程と、配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）及び／又は配列番号２（ＴＦＶＬＮＦＩＫ）のペプチドのレベルを測定する工程とを含み、ここで、配列番号１及び／又は配列番号２のレベルが、上記１つ以上の生体試料中に存在するＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣのレベルに対応する、方法に関する。

【0039】

このような方法論を提供し、ＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣのレベルと有意な相関を有するペプチドを選択するのに、２つのペプチド（配列番号１：ＬＧＥＹＤＬＲ及び配列番号２：ＴＦＶＬＮＦＩＫ）を選択し、上記タンパク質とのそれらの直線性について試験した。配列番号１及び配列番号２のペプチドのレベルを使用して、ＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣのレベルを計算することが可能であることが本発明の知見であった。これが可能であるのは、図１に示されるように、配列番号１及び配列番号２のペプチドと、ＰＲＯＣ及びＡＰＣとの間に相関が見られるからである。さらに、両方のペプチドの中で、配列番号１のペプチドが配列番号２よりも良好なＰＲＯＣ及びＡＰＣのレベルとの直線性を示したことから、このペプチドが１つ以上の生体試料中のＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣのレベルを測定するのに好ましいペプチドとなることも判明した。

【0040】

したがって、配列番号１のペプチドは、ＰＲＯＣ又はＡＰＣの濃度が１ｆｍｏｌから２５０ｆｍｏｌの間である場合、配列番号２のペプチドよりも良好な直線性を示すだけでなく（Ｒ^２ ０．９９対０．９６３、図１の下のグラフを参照）、より低い濃度範囲でも依然としてＰＲＯＣ又はＡＰＣと相関する唯一のペプチドである（図１における上のグラフ、配列番号２のペプチドは、１ｆｍｏｌから１０ｆｍｏｌの間の範囲ではＡＰＣのレベルと相関しない）。これらの結果は、第３のペプチド（配列番号７ ＡＮＳＦＬＥＥＦＲ）を含めることによって更に裏付けられ、配列番号１が低濃度範囲で直線性を示す唯一のペプチドであると結論付けられた（図５の上のグラフを参照）。最後に、表６は、ＰＲＯＣ濃度又はＡＰＣ濃度が０．８ｆｍｏｌ／μｌから８４ｆｍｏｌ／μｌの間の範囲にある被験体の集団（ｎ＝８６）を示し、この集団には敗血症性ショックに罹患している患者（ｎ＝６６）が含まれ、その中の９人がＤＩＣに罹患しており、これらの患者群のＰＲＯＣレベル又はＡＰＣレベルが配列番号２及び配列番号７等の他のペプチドの検出限界外であるため、これらの患者群は配列番号１のペプチドを使用してのみ特定されることを示している。

【0041】

まとめると、これらの結果は、配列番号１のペプチドが、高い特異度及び感度を維持しながら、敗血症又は敗血症性ショックを患っており、かつＤＩＣを患うリスクがあるより広範囲の被験体を対象に含めるペプチドであることを示している。とりわけ、より低いレベルのＰＲＯＣ又はＡＰＣを有する患者は最も重度の疾患の形態を呈する患者であるため、これらの患者は、ＤＩＣに罹患するリスクが高まった非常に脆弱な集団である。これらの場合に、配列番号１のペプチドを使用したＭＳに基づく方法のみが、ＤＩＣを患っているとして、又はＤＩＣを患うリスクが高いとしてそれらの患者を分類することができることとなる。

【0042】

最後に、機能的プロテインＣは、敗血症又は敗血症性ショックを患う群において質量分析により決定されるＡＰＣの濃度とも相関することも判明した（図２及び図３を参照）。重要なことには、ＰＲＯＣ／ＡＰＣはまた、敗血症患者において、ヒストンＨ２Ｂ（好中球から放出される細胞傷害メディエーター）、ＰＣＴ（活動性感染症の場合に上昇するプロカルシトニン）、Ｑｕｉｃｋ指数（血液凝固に関連するパラメーター）のレベルとも相関する。敗血症性ショック患者の群において、ＰＲＯＣ／ＡＰＣレベルは、血小板（凝固プロセスに関与する）、活性化トロンボプラスチン時間（凝血塊を適切に形成する人の能力を評価するのに使用される）、及びＤ－二量体（このレベルは重篤な凝血塊の存在を除外するのに役立つ）と相関した。

【0043】

したがって、一実施形態において、配列番号１及び／又は配列番号２、好ましくは配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のペプチドのレベルは、上記１つ以上の生体試料中に存在するＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣのレベルと直線的に相関する。別の実施形態において、上記直線的相関は－１．０から１．０の間にあり、これは、Ｙ＝ｂＸの形の等式（式中、Ｘは配列番号１及び／又は配列番号２のペプチドのレベルに対応し、ＹはＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣのレベルに対応し、ｂは１である）を通じて変数を関連付ける。好ましくは、配列番号１のペプチドのレベルは、上記タンパク質が試料中に５６００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは２８００ｎｇ／ｍｌ未満、最も好ましくは５６０ｎｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する場合、ＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣのレベルと直線的に相関する。

【0044】

したがって、一実施形態において、被験体は、好ましくは、１４０００ｎｇ／ｍｌ（＝２５０ｆｍｏｌ／μｌ）未満、６０００ｎｇ／ｍｌ未満、２８００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは８００ｎｇ／ｍｌ未満、６００ｎｇ／ｍｌ未満、又は最も好ましくは５００ｎｇ／ｍｌ未満のＰＲＯＣ又はＡＰＣのレベルを有する被験体の群から選択される。好ましくは、被験体は、１４０００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、１２０００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、１１５００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、１００００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、８０００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、６０００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、５０００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、３０００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、２８００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、２５００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、２０００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、１５００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、１０００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、９００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、８００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、７００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、６５０ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、６００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、５００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、４００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、３００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、２００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、１００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、５０ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間のＰＲＯＣ又はＡＰＣのレベルを有する被験体の群から選択される。ｎｇ／ｍｌでの値は、それらの値を５６（ＰＲＯＣの分子量）で割ることによりｆｍｏｌ／μｌに変換することができる。

【0045】

第１の態様又はその実施形態のいずれかの酵素消化工程は、この方法にとって非常に重要である。この工程を測定工程の前に行うのは、測定前に１つ以上の生体試料を分離されたペプチドに変換又は消化する必要があるからである。酵素消化に使用することができる酵素の例は、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパインペプシン、パパイン、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）（Ｖ８）プロテアーゼ、顎下腺プロテアーゼ、ブロメライン、サーモリシン、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、若しくはＡｒｇＣ、又はそれらのあらゆる組合せである。好ましくは、酵素消化に使用される酵素は、ＰＲＯＣタンパク質及びＡＰＣタンパク質を消化して、配列番号１及び／又は配列番号２のペプチドが含まれる多数のペプチドを生じさせる酵素である。好ましい実施形態において、トリプシン、ＡｒｇＣ、及び／又は消化後に配列番号１及び／又は配列番号２のペプチドを生じさせるプロテアーゼのあらゆる組合せが酵素消化工程に使用される。時間及び温度等の最適な消化条件は当該技術分野において既知である。

【0046】

任意に、酵素消化に際してマイクロ波支援消化を使用してペプチドの形成を促進することもできる（P Muralidhar Reddy, et al.著の「マイクロ波支援反応及び従来のトリプシン触媒反応の消化の完全性（Digestion Completeness of Microwave-Assisted and Conventional Trypsin-Catalyzed Reactions.）」 Journal of the American Society for Mass Spectrometry. Volume 21, Issue 3, March 2010, Pages 421-424）。好ましい実施形態において、酵素消化は、トリプシン及び／又はＡｒｇＣ及び／又は消化後に配列番号１及び／又は配列番号２のペプチドを生じさせるプロテアーゼのあらゆる組合せを用いたマイクロ波支援消化である。

【0047】

さらに、酵素消化の前であっても、１つ以上の生体試料を、任意に還元剤及び／又はアルキル化剤で処理することができる。「還元剤」とは、酸化還元化学反応において電子受容体へと電子を失い（又は供与し）、還元剤の酸化及び受容体化合物の還元をもたらすあらゆる元素又は化合物を意味する。還元剤の例は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチルホスフィン）（ＴＣＥＰ）、アスコルビン酸、塩酸システイン、２－メルカプトエタノール、亜硫酸ナトリウム、又はチオグリコール酸ナトリウムである。「アルキル化剤」とは、アルキル基を別の化合物に転移するあらゆる元素又は化合物を意味する。ペプチドマッピングの目的で使用されるアルキル化剤の一例は、ヨードアセトアミドである。

【0048】

したがって、第１の態様の更なる好ましい実施形態において、上記方法は、１つ以上の生体試料を還元剤で還元する工程、及び／又は１つ以上の生体試料をアルキル化剤でアルキル化する工程を更に含む場合があり、ここで、還元工程及び／又はアルキル化工程の両方は、酵素消化の工程の前、したがって測定工程の前に行われる。

【0049】

一実施形態において、ＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣのレベルを測定するのに使用される１つ以上の生体試料は、血液、血清、血漿、唾液、尿、又は脳脊髄液からなる群より選択される。好ましくは、１つ以上の生体試料は、血液、血清、又は血漿からなる群より選択される。

【0050】

一実施形態において、第１の態様又はその好ましい実施形態のいずれかによる被験体は、哺乳動物、好ましくはヒトである。別の実施形態において、ヒト被験体は、集中治療室（ＩＣＵ）にいる患者から選択される。

【0051】

第１の態様又はその実施形態のいずれかに記載される方法が内因性又は外因性のプロテインＣ及び活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）の両方を測定することができるのは、これらのタンパク質変異体の全てが配列番号１及び配列番号２のペプチドを含むためであることに留意すべきである。さらに、本発明の第１の態様又はその実施形態のいずれかの方法は、上記タンパク質の断片又は変異体が配列番号１及び／又は配列番号２の測定されるペプチドを含む限り、上記タンパク質のあらゆる断片又は変異体を測定することもできる。したがって、第１の態様の一実施形態において、測定されるＰＲＯＣ又はＡＰＣは、外因性及び／又は内因性の起源に由来する。別の実施形態において、測定されるＰＲＯＣ、好ましくは、ＡＰＣは、外因性の３Ｋ３Ａ－ＡＰＣ、又はＸｉｇｒｉｓ（商標）医薬に含まれる活性化ドロトレコジンαである。

【0052】

配列番号２（ＴＦＶＬＮＦＩＫ）のペプチドは配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のペプチドほど良好な直線性を示さなかったが、本発明の一実施形態において、両方のペプチドを組み合わせて両方の測定を含むより頑健な方法を得て、ＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣのレベルのより良好な計算をもたらすことができる。代替的には、これらのペプチドを別々に使用することもできる。第１の態様又はその実施形態のいずれかの好ましい実施形態において、測定工程は、配列番号１のペプチドのみを用いて行われる。

【0053】

第１の態様又はその実施形態のいずれかに存在する測定工程において使用される技術に関して、配列番号１及び／又は配列番号２のペプチドが特異的に検出される限り、あらゆる技術を使用することができる。それというのも、上記のように、かつ図１に示されるように、これらのペプチドはＰＲＯＣ及びＡＰＣのレベルと相関するからである。したがって、例えば、測定工程に使用される技術は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、化学発光ＥＬＩＳＡ若しくは比色ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、ドットブロット、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ及びＰｒｏＱｕａｎｔｕｍイムノアッセイ、又は好ましくは質量分析であり得る。

【0054】

好ましい実施形態において、第１の態様は、測定を必要とする被験体におけるプロテインＣ（ＰＲＯＣ）、好ましくは活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）のレベルを測定する質量分析に基づく方法であって、被験体から単離された１つ以上の生体試料の酵素消化を行う工程と、質量分析計を使用することによって配列番号１及び／又は配列番号２のペプチドのレベルを測定する工程とを含み、ここで、配列番号１及び／又は配列番号２のレベルが、上記１つ以上の生体試料中に存在するＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣのレベルに対応する、方法に関する。

【0055】

更なる好ましい実施形態において、液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析とに基づく方法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）及び多重反応モニタリングアプローチ（ＭＲＭ）に基づく方法（ＭＲＭ－ＭＳ）を使用する。ＭＲＭ－ＭＳは、バイオマーカーの発見及びバイオマーカーの検証の両方にとって有望な方法論を表す。さらに、この方法はバイオマーカーの臨床的検証に必要とされる感度、精度、及び高いスループットをもたらすため、様々な発見方法及び検証方法を実施する必要性が排除される。血漿は診断アッセイ用のバイオマーカーの供給源であるが、この流体中に存在するタンパク質のダイナミックレンジが広いため（１０^１０）、血漿はプロテオミクス研究にとって困難な生体マトリックスでもある。ペプチドごとの単一のトランジションのモニタリングは、血漿等の複雑な混合物中のペプチド定量化に十分に特異的であると提案されている。一方、古典的なバイオマーカーでは、敗血症患者の転帰を予測する際に包括的なスコアよりも多くの情報は付加されない。敗血症の診断を補完するＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びプロカルシトニン（ＰＣＴ）を有し、ＰＣＴが予後診断バイオマーカーとして有用であるにもかかわらず、敗血症の将来の評価には、感度が高く、特異度が高く、かつ経済的に手頃であり得る新しいバイオマーカーを見出すことが必要とされる。

【0056】

好ましくは、第１の態様の質量分析計は、好ましくはクロマトグラフィーシステムを備え、より好ましくはナノＬＣクロマトグラフィーシステム又はマイクロＬＣクロマトグラフィーシステムを備えたトリプル四重極線形イオントラップ質量分析計又はハイブリッドトリプル四重極線形イオントラップ質量分析計である。好ましくは、本発明の第１の態様による、被験体におけるＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣを測定する質量分析に基づく方法では、ＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣのレベル又は濃度は、配列番号１及び／又は配列番号２のペプチドの量と同等である。好ましくは、生体試料中のＰＲＯＣ又はＡＰＣのレベル又は濃度を測定するのに、対象シグナルペプチド／シグナルペプチドスパイクインの比として理解される配列番号１及び／又は配列番号２の平均化比率を得る。より好ましくは、配列番号１及び／又は配列番号２の選択されたペプチド配列は、好ましくは、本発明の第１の態様又はその好ましい実施形態のいずれかによる方法において、ＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣの絶対的定量化用にＳｐｉｋｅＴｉｄｅｓ（商標）ＴＱ（Ａｒｇ：^１３Ｃ６、^１５Ｎ４；Ｌｙｓ：Ａｒｇ：^１３Ｃ６、^１５Ｎ２等の重同位体で標識される）として調製され得る。

【0057】

好ましい実施形態において、配列番号１及び／又は配列番号２のペプチドを測定することによるＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣの測定は、配列番号１及び／又は配列番号２の標識プロテオタイプペプチドをスパイクインすることによって行われる。更なる好ましい実施形態において、配列番号１及び／又は配列番号２のスパイクイン標識プロテオタイプペプチドは、少なくとも１つ以上の重アミノ酸を用いて合成され、ここで、上記ペプチドは、好ましくはＣ末端アミノ酸残基においてタグで標識される。

【0058】

本発明の文脈において、「タグ」という用語は、非標識アミノ酸対応物と同じ物理化学的特性及び同じ化学的活性を共にする安定同位体標識アミノ酸として理解される。タグはまた、ＭＳ実験前のトリプシン処理又は他のプロテアーゼ処理中に切断される小さな化学修飾でもあり得る。プロテオタイプペプチドに連結されたタグは、標的化ＭＳ実験におけるペプチド定量化に使用される。

【0059】

本発明の文脈において、「重アミノ酸」という用語は、ＭＳによって識別され得る重原子、例えば^１３Ｃ、^１５Ｎ、^１７Ｏ、及び／又は^３４Ｓを含むタグに組み込まれる同位体原子を指す。

【0060】

本発明の文脈において、「少なくとも１つ以上の重アミノ酸を用いて合成された」という用語は、配列番号１及び／又は配列番号２に対応するスパイクインアミノ酸配列における少なくとも１つ以上の重原子^１３Ｃ、^１５Ｎ、^１７Ｏ、及び／又は^３４Ｓを含む「タグ」として理解される。

【0061】

敗血症又は敗血症性ショックを患う患者をスクリーニング又は分類する方法
第１の態様又はその実施形態のいずれかにおいて規定される方法はまた、敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクがある患者を、上記患者において測定されたＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣのレベルに従ってスクリーニング又は分類することを可能にする。実施例において、具体的に表２に示されるように、１５７個の血漿試料を分析したところ、敗血症又は敗血症性ショックを患う患者と、これらの疾患に罹患していない患者との間に統計的有意差が見出された。特に、これらの差は、ＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣのレベルが８００ｎｇ／ｍｌ未満の場合に統計的に有意であったことから、第１の態様又はその実施形態のいずれかにおいて規定される方法を使用してＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣのレベルを測定することは、これらの疾患に罹患するリスクがある患者をスクリーニング及び分類するのに有用である可能性があることが示された。

【0062】

これを考慮して、本発明の第２の態様は、敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクがある被験体をスクリーニング又は分類する質量分析に基づく方法、好ましくは多重反応モニタリング標的質量分析に基づく方法（ＭＲＭ－ＭＳ）及び多重反応モニタリングアプローチに基づく方法であって、
ｉ）第１の態様又はその実施形態のいずれかにおいて規定される方法を実施することによって、プロテインＣ（ＰＲＯＣ）、好ましくは活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）のレベルを測定する工程と、
ｉｉ）工程ｉ）において取得されたレベルと基準値とを比較する工程と、
を含み、ここで、工程ｉ）の測定値とｉｉ）の基準値との統計的に有意な変動が、被験体が敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクがあることの指標である、方法に関する。

【0063】

第１の態様において示されるように、測定工程を、配列番号１及び／又は配列番号２のペプチドの定量化を可能にするあらゆる分析技術を用いて実施することができ、ここで、質量分析が好ましい。したがって、第２の態様及び以下の実施形態のいずれかは、特に質量分析について言及しているが、この技術を、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、化学発光酵素結合免疫吸着アッセイ若しくは比色酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、ドットブロット、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、又は好ましくは質量分析等のあらゆる他の技術によって置き換えることができることを理解されたい。

【0064】

好ましい実施形態において、第２の態様の工程ｉｉ）の基準値は、健康な被験体又は健康な被験体の集団から取得される（この場合、基準値は平均値である）。代替的に、第２の態様の基準値は、集中治療室（ＩＣＵ）にいるが、敗血症又は敗血症性ショックに罹患していない被験体又は被験体の集団から取得される。上記基準値を取得するのに、本発明の第１の態様又はその実施形態のいずれかに記載された方法を使用することができる。代替的に、当該技術分野において既知である健康な被験体又は健康な被験体の集団におけるＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣのレベルを測定する他の方法を使用することができる。

【0065】

また好ましくは、工程ｉ）において測定されたレベル（ＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣのレベル）の統計的に有意な変動は、基準値と比較した統計的に有意な低下である。この有意な低下は、被験体が敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクがあることの指標である。有意な低下は、配列番号１及び／又は配列番号２のペプチドのレベルにおける減少として定義され、これはまた、上記レベルを統計的検定によって基準レベルと比較した場合の生体試料中のＰＲＯＣ又はＡＰＣにおける有意な減少を意味する。統計的検定はパラメトリック検定、又は好ましくはノンパラメトリック検定であり得て、有意な結果と非有意の結果とを区別する閾値として定義される有意な閾値は、０．０５以下、０．００５以下、又は０．００１以下として設定され得る。

【0066】

人体における循環ＰＲＯＣ又は循環ＡＰＣの平均量は３０００ｎｇ／ｍｌから５０００ｎｇ／ｍｌの間であると推定されている（例えば、https://diapharma.com/protein-c/、https://emedicine.medscape.com/article/2085992-overviewを参照）。特定の実施形態において、ＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣについての基準値は約４０００ｎｇ／ｍＬであり、ここで、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％の低下は、敗血症又は敗血症性ショックのリスクがあることの指標である。定義のセクションにおいて事前に定義したように、「約」という用語は、示された値±１０％を指し得る。

【0067】

表２に示されるように、敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクを示すマンホイットニーＵ検定（ノンパラメトリック）によって得られた有意な低下は、コントロールレベル１４３１．５７ｎｇ／ｍｌ（基準値）と比較して６１３．７０ｎｇ／ｍｌのＡＰＣのレベルであった。この低下は、基準レベルに対する約４０％（０．４倍）の低下に相当する。

【0068】

したがって、好ましい実施形態において、ＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣについての基準値は約１４３１．５７ｎｇ／ｍＬであり、ここで、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、少なくとも約１００％の低下は、敗血症又は敗血症性ショックのリスクがあることの指標である。定義のセクションにおいて事前に定義したように、「約」という用語は、示された値±１０％を指し得る。

【0069】

さらに、敗血症又は敗血症性ショックを患う被験体の比較から得られたコントロール（基準集団＋ＩＣＵコントロール）に対する被験体でのＲＯＣ曲線（表４、実施例５）にも示されるように、上記低下に最適なカットオフ値は約８００ｎｇ／ｍｌと計算され、７９．５％の感度及び９７．１％の特異度を有する（ｐ＜０．０００１）。したがって、別の実施形態において、有意な低下は、本明細書において例示されるＲＯＣ曲線に従ってカットオフ値として選択されるＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣの８００ｎｇ／ｍｌのレベルを少なくとも下回る低下を指す。好ましくは、基準値は９００ｎｇ／ｍｌから８００ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは８００ｎｇ／ｍｌであるため、上記基準値を下回るＰＲＯＣ又はＡＰＣのレベルは、被験体が敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクがあることの指標である。

【0070】

本発明の第２の態様又はその好ましい実施形態のいずれかの方法を実施して、敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクがある被験体が特定されたら、ＣＲＰ又はＰＣＴ等の臨床的確認方法を実施して、特定された被験体が実際に敗血症又は敗血症性ショックを患っているかどうかを確認することが好ましいことに留意されたい。したがって、好ましい実施形態において、第２の態様又はその実施形態のいずれかの方法は、患者が敗血症又は敗血症性ショックを患っていることを臨床的に確認する工程を更に含む。

【0071】

更なる実施形態において、本発明はまた、敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクがある被験体をスクリーニングするバイオマーカーとしての、使用を必要とする被験体から単離された１つ以上の生体試料中の配列番号１及び／又は配列番号２のペプチドのレベルのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用に関する。

【0072】

別の特定の実施形態において、第２の態様又はその実施形態のいずれかによる方法はまた、敗血症反応シグネチャー１（ＳＲＳ１）及び敗血症反応シグネチャー２（ＳＲＳ２）である２つのサブ表現型（エンドタイプ）において敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクがある患者を分類するのにも有用である。このエンドタイプ分類は、Antcliffe and Gordon 2019［David B. Antcliffe, Anthony C. Gordon.（2019年）著の「敗血症性ショックにおけるステロイド試験について敗血症エンドタイプを理解することが重要である理由（Why Understanding Sepsis Endotypes Is Important for Steroid Trials in Septic Shock.）」 Society of Critical Care Medicine and Wolters Kluwer Health, Inc. Volume 47巻. Number 12. DOI: 10.1097/CCM.0000000000003833］によって記載されるように、最適治療にとって、特にコルチコステロイド治療において重要である。

【0073】

第１の態様の場合と同様に、被験体は、好ましくは、１４０００ｎｇ／ｍｌ（＝２５０ｆｍｏｌ／μｌ）未満、６０００ｎｇ／ｍｌ未満、２８００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは８００ｎｇ／ｍｌ未満、６００ｎｇ／ｍｌ未満、又は最も好ましくは５００ｎｇ／ｍｌ未満のＰＲＯＣ又はＡＰＣのレベルを有する被験体の群から選択される。好ましくは、被験体は、１４０００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、１２０００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、１１５００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、１００００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、８０００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、６０００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、５０００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、３０００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、２８００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、２５００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、２０００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、１５００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、１０００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、９００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、８００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、７００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、６５０ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、６００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、５００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、４００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、３００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、２００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、１００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、５０ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間のＰＲＯＣ又はＡＰＣのレベルを有する被験体の群から選択される。ｎｇ／ｍｌでの値は、それらの値を５６（ＰＲＯＣの分子量）で割ることによりｆｍｏｌ／μｌに変換することができる。

【0074】

本発明において記載される方法の別の利点は、これらの方法を、患者が集中治療室（ＩＣＵ）に入室したらすぐに使用することができるか、又は他の確認診断試験を実施する前に使用することができることである。これが重要であるのは、医師が患者の発症の可能性を事前に推論することを可能にし、それにより集中治療及び治療を前もって準備することが可能となるためである。したがって、上記方法を、集中治療設備又はＩＣＵに入ったばかりの患者において実施することが好ましい。好ましくは、上記方法を、患者が入院した後の最初の４時間、５時間、好ましくは６時間で実施する。

【0075】

ＤＩＣを患う患者をスクリーニング又は分類する方法
上述のように、これまでの研究により、敗血症を患う患者の大部分において、組換えＡＰＣによる治療が何ら効果を有しなかったことが明らかになっている。しかしながら、興味深いことに、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）に罹患している患者のみが組換えＡＰＣ治療に対して奏効した。したがって、組換えＡＰＣ関連治療の安全性及び有効性に関する将来の研究では、敗血症又は敗血症性ショックを患い、かつＤＩＣを患うリスクがある患者を特定することが必要とされるであろう。それというのも、これらの患者がひいては上記治療に対する真のレスポンダーとなる可能性があるからである。これに関して、図４に示されるように、ＤＩＣと診断された患者におけるＡＰＣの平均レベルが、ＤＩＣに罹患していない患者よりも低いことが本発明において見出された。特に、４６８ｎｇ／ｍＬを下回るＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣのレベルは、敗血症又は敗血症性ショックに罹患している患者がＤＩＣを患うリスクがあることを示すことが判明した。

【0076】

この知見を考慮して、本発明の第３の態様は、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を患うリスクがある被験体をスクリーニング又は分類する質量分析に基づく方法であって、
ｉ）第１の態様又はその実施形態のいずれかにおいて規定される方法を実施することによって、プロテインＣ（ＰＲＯＣ）、好ましくは活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）のレベルを測定する工程と、
ｉｉ）工程ｉ）において取得されたレベルと基準値とを比較する工程と、
を含み、ここで、工程ｉ）の測定値とｉｉ）の基準値との統計的に有意な変動が、被験体がＤＩＣを患うリスクがあることの指標である、方法に関する。

【0077】

代替的な第３の態様において、本発明は、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）に罹患している被験体を診断する質量分析に基づく方法であって、
ｉ）第１の態様又はその実施形態のいずれかにおいて規定される方法を実施することによって、プロテインＣ（ＰＲＯＣ）、好ましくは活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）のレベルを測定する工程と、
ｉｉ）工程ｉ）において取得されたレベルと基準値とを比較する工程と、
を含み、ここで、工程ｉ）の測定値とｉｉ）の基準値との統計的に有意な変動が、患者がＤＩＣを患っていることの指標である、方法に関する。

【0078】

第１の態様及び第２の態様において示されるように、測定工程を、配列番号１及び／又は配列番号２のペプチドの定量化を可能にするあらゆる分析技術を用いて実施することができ、ここで、質量分析が好ましい。したがって、第３の態様及び以下の実施形態のいずれかは、特に質量分析について言及しているが、この技術を、あらゆる他の技術、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、化学発光酵素結合免疫吸着アッセイ若しくは比色酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、ドットブロット、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ、ＰｒｏＱｕａｎｔｕｍイムノアッセイ、又は好ましくは質量分析によって置き換えることができることを理解されたい。

【0079】

第３の態様の好ましい実施形態において、工程ｉｉ）の基準値は、敗血症又は敗血症性ショックを患っているが、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を患っていない被験体又は被験体の集団から取得される。この基準値を、第１の態様若しくは第２の態様又はそれらの実施形態のいずれかによる方法を実施することによって、上記被験体から取得することができる。

【0080】

また好ましくは、工程ｉ）において測定されたレベル（ＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣのレベル）の統計的に有意な変動は、基準値と比較した統計的に有意な低下である。この有意な低下は、被験体がＤＩＣを患うリスクがあることの指標である。統計的に有意な変動を、第２の態様又はその実施形態のいずれかについて前もって定義された統計的検定によるが、この場合、基準値が第２の態様（健康であるか、又はＩＣＵにいるが、敗血症に罹患していない）とは異なる被験体又は被験体の集団（敗血症又は敗血症性ショックを患っている）に由来することを考慮して計算することができる。

【0081】

図４に示されるように、ＤＩＣと診断された患者の試料中のＡＰＣレベル（平均４６８ｎｇ／ｍｌ）は、ＤＩＣを患っていない被験体のレベル（平均６００ｎｇ／ｍｌ）と比較して統計的に低下している（ｐ＝０．００１４）。この低下は、基準レベルに対する約２０％（０．２倍）の低下に相当する。

【0082】

したがって、一実施形態において、敗血症又は敗血症性ショックを患っているが、ＤＩＣに罹患していない患者のＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣについての基準値は約６００ｎｇ／ｍＬであり、ここで、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、少なくとも２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、少なくとも約１００％の低下は、ＤＩＣを患うリスクがあることの指標である。定義のセクションにおいて事前に定義したように、「約」という用語は、示された値±１０％を指し得る。好ましくは、基準値は５００ｎｇ／ｍｌから４００ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは４６８ｎｇ／ｍｌであるため、上記基準値を下回るＰＲＯＣ又はＡＰＣのレベルは、被験体がＤＩＣを患うリスクがあることの指標である。

【0083】

第１の態様及び第２の態様の場合と同様に、被験体は、好ましくは、１４０００ｎｇ／ｍｌ（＝２５０ｆｍｏｌ／μｌ）未満、６０００ｎｇ／ｍｌ未満、２８００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは８００ｎｇ／ｍｌ未満、６００ｎｇ／ｍｌ未満、又は最も好ましくは５００ｎｇ／ｍｌ未満のＰＲＯＣ又はＡＰＣのレベルを有する被験体の群から選択される。好ましくは、被験体は、１４０００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、１２０００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、１１５００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、１００００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、８０００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、６０００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、５０００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、３０００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、２８００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、２５００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、２０００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、１５００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、１０００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、９００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、８００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、７００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、６５０ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、６００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、５００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、４００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、３００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、２００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、１００ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間、５０ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間のＰＲＯＣ又はＡＰＣのレベルを有する被験体の群から選択される。ｎｇ／ｍｌでの値は、それらの値を５６（ＰＲＯＣの分子量）で割ることによりｆｍｏｌ／μｌに変換することができる。

【0084】

上記と同様に、この方法を、集中治療設備又はＩＣＵに入ったばかりの患者に実施することが好ましい。好ましくは、上記方法を、患者が入院した後の最初の４時間、５時間、好ましくは６時間で実施する。

【0085】

さらに、実施例７において示されるように、敗血症を患う被験体におけるＤＩＣを特定するＲＯＣ曲線（表５ｂ）により、上記低下についての約４６８ｎｇ／ｍｌの最適なカットオフ値がもたらされ、７１．４％の感度及び７１．４％の特異度を有する（ｐ＝０．０００１３）。したがって、別の実施形態において、患者がＤＩＣを患うリスクがあることの指標となる有意な低下は、本明細書において例示されるＲＯＣ曲線に従ってカットオフ値として選択されるＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣの４６８ｎｇ／ｍｌのレベルを少なくとも下回る低下を指す。

【0086】

好ましい実施形態において、被験体は、この態様又はその実施形態のいずれかによる方法を実施する前に、事前に敗血症又は敗血症性ショックと診断されている。

【0087】

第２の態様における定義と同様に、本発明の第３の態様又はその好ましい実施形態のいずれかの方法を実施して、被験体がＤＩＣを患うリスクがあると分類されたら、臨床的確認方法を実施して、特定された被験体がＤＩＣを患っているかどうかを確認することが好ましい。したがって、好ましい実施形態において、第３の態様の方法は、患者がＤＩＣを患っていることを臨床的に確認する工程を更に含む。

【0088】

外因性ＰＲＯＣ、好ましくは組換えＰＲＯＣ（ｒＰＲＯＣ）、及び外因性ＡＰＣ、好ましくは組換えＡＰＣ（ｒＡＰＣ）による治療に対する奏効を予後予測する方法
上記説明のように、組換えＰＲＯＣ治療又は組換えＡＰＣ治療に対する個々の患者の奏効を評価するには、治療を受けている被験体又は治療される被験体がＤＩＣを患うリスクがあるかどうかを知ることが重要である。これを踏まえて、本発明の第４の態様は、予後予測を必要とする被験体における組換えプロテインＣ（ｒＰＲＯＣ）、好ましくは組換え活性化プロテインＣ（ｒＡＰＣ）による治療に対する奏効を予後予測する質量分析に基づく方法であって、
ｉ）第３の態様又はその実施形態のいずれかにおいて規定される方法の各工程を実施することによって、被験体が播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を患うリスクがあるかどうかをスクリーニングする工程と、
ｉｉ）被験体がＤＩＣを患うリスクがあると特定されるか、又はＤＩＣと診断される場合に、被験体を上記治療に対するレスポンダーとして分類し、被験体がＤＩＣを患うリスクがあるとも特定されず、ＤＩＣとも診断されない場合に、被験体を上記治療に対するノンレスポンダーとして分類する工程と、
を含む、方法に関する。

【0089】

第１の態様、第２の態様、及び第３の態様、又はそれらの実施形態のいずれかにおいて示されるように、測定工程を、配列番号１及び／又は配列番号２のペプチドの定量化を可能にするあらゆる分析技術を用いて実施することができ、ここで、質量分析が好ましい。したがって、第４の態様及び以下の実施形態のいずれかは、特に質量分析について言及しているが、この技術を、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、化学発光酵素結合免疫吸着アッセイ若しくは比色酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、ドットブロット、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ、ＰｒｏＱｕａｎｔｕｍイムノアッセイ、又は好ましくは質量分析等のあらゆる他の技術によって置き換えることができることを理解されたい。

【0090】

本発明の文脈において、特定の治療により、治療される疾患の転帰における改善が引き起こされる被験体を「レスポンダー」として理解すべきである。「ノンレスポンダー」は、治療により、期待される改善が一切起こらないか、又は上記被験体の臨床状況が更に悪化する可能性がある被験体である。

【0091】

この態様の好ましい実施形態において、予後診断を行った後に、被験体を組換えプロテインＣで治療し、好ましくは組換え活性化プロテインＣで治療する。

【0092】

別の実施形態において、本発明はまた、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を患うリスクがある被験体をスクリーニングするバイオマーカーとしての、敗血症又は敗血症性ショックを患っている被験体から単離された１つ以上の生体試料中の配列番号１及び／又は配列番号２のペプチドのレベルのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用に関する。

【0093】

その他の実施形態において、本発明はまた、敗血症又は敗血症性ショック及び播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を患っている被験体における、組換えＰＲＯＣ、好ましくは組換えＡＰＣによる治療に対する奏効を予後予測するバイオマーカーとしての、使用を必要とする被験体から単離された１つ以上の生体試料中の配列番号１及び／又は配列番号２のペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用に関する。好ましい実施形態において、このｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用を行った後に、被験体を組換えＰＲＯＣ、好ましくは組換えＡＰＣで治療する。

【0094】

組成物及びキット
上記のように、ＡＰＣ治療は敗血症、敗血症性ショック、又は脳卒中等の様々な病理学的病態に使用されている。これを考慮して、本発明の第５の態様は、内因性ＰＲＯＣ及び内因性ＡＰＣのレベルがそれらの生理学的レベル未満に減少するあらゆる病態生理学的病態の治療において使用される組換えプロテインＣ（ｒＰＲＯＣ）、好ましくは組換え活性化プロテインＣ（ｒＡＰＣ）を含む組成物であって、この使用は、上記で定義される第４の態様又はその実施形態のいずれかに従ってレスポンダーとして分類される被験体に上記組成物を投与する工程を含む、組成物に関する。好ましくは、治療される病態生理学的病態は、敗血症、敗血症性ショック、ＤＩＣ、又は脳卒中である。

【0095】

また好ましくは、第５の態様は、敗血症又は敗血症性ショック又はＤＩＣの治療において使用される組換えプロテインＣ（ｒＰＲＯＣ）、好ましくは組換え活性化プロテインＣ（ｒＡＰＣ）を含む組成物であって、使用は、上記第４の態様又はその実施形態のいずれかに従ってレスポンダーとして分類される被験体に上記組成物を投与する工程を含む、組成物に関する。

【0096】

第６の態様において、本発明は、敗血症又は敗血症性ショック及び播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を患っていることを特徴とする患者選択（patient selection）の治療において使用される組換えプロテインＣ（ｒＰＲＯＣ）、好ましくは組換え活性化プロテインＣ（ｒＡＰＣ）を含む組成物に関する。

【0097】

第７の態様において、本発明は、被験体における敗血症又は敗血症性ショック又はＤＩＣをスクリーニング又は分類するのに適した、及び／又は被験体における組換えプロテインＣ（ｒＰＲＯＣ）、好ましくは組換え活性化プロテインＣ（ｒＡＰＣ）による治療に対する奏効を予測（予後予測）するのに適したキット又はデバイスであって、配列番号１及び／又は配列番号２のペプチドを含み、ここで、ペプチド（複数の場合もある）は、好ましくは少なくとも１つ以上の重アミノ酸を用いて合成され、かつ上記ペプチドは、好ましくはＣ末端アミノ酸残基におけるタグによる標識である、キット又はデバイスに関する。

【0098】

キットは、キット内の材料を用いることができる方法を示す使用説明書も含み得る。

【0099】

任意に（付加的に）、キットはトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパインペプシン、パパイン、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｖ８）プロテアーゼ、顎下腺プロテアーゼ、ブロメライン、テルモリシン、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、及び／又はＡｒｇＣ等の開裂酵素を含んでいてもよい。キットはまた、ＤＴＴ若しくはＩＡＭ等の化学試薬、又はタンパク質由来ポリペプチドの化学的生成のための他の化学試薬を含んでいてもよい。

【0100】

任意に、好ましくはトリプシン、ＡｒｇＣ、及び／又は消化後に配列番号１及び／又は配列番号２のペプチドを生じさせるプロテアーゼのあらゆる組合せによる酵素消化中にマイクロ波支援消化を使用して、ペプチドの形成を促進することもできる（P Muralidhar Reddy, et al.著の「マイクロ波支援反応及び従来のトリプシン触媒反応の消化の完全性（Digestion Completeness of Microwave-Assisted and Conventional Trypsin-Catalyzed Reactions.）」 Journal of the American Society for Mass Spectrometry. Volume 21, Issue 3, March 2010, Pages 421-424）。キットは、トリプシン、ＡｒｇＣ、及び／又は消化後に配列番号１及び／又は配列番号２のペプチドを生じさせるプロテアーゼのあらゆる組合せと、配列番号１及び／又は配列番号２の最適な分析用の特別なマイクロ波支援消化プロトコルとを含み得る。

【0101】

本発明の第８の態様は、敗血症、敗血症性ショック、若しくはＤＩＣを患うリスクがある被験体をスクリーニング若しくは分類するための、又は被験体における組換えプロテインＣ（ｒＰＲＯＣ）、好ましくは組換え活性化プロテインＣ（ｒＡＰＣ）による治療に対する奏効を予測（予後予測）するための、本発明の第７の態様又はその実施形態のいずれかにおいて規定されるキットのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用に関する。キットを、第３の態様又はその実施形態のいずれかに従って、ＤＩＣを患う患者を診断するのに使用することもできる。

【0102】

本発明の第９の態様は、デジタルコンピューターの内部メモリに直接ロード可能なコンピュータープログラム製品であって、上記製品をコンピューター上で実行した場合、比較を必要とする被験体の１つ以上の生体試料からのＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣのレベル又は濃度と基準値とを比較するステップと、敗血症、敗血症性ショック、若しくはＤＩＣを患うリスク、又は組換えＰＲＯＣ治療若しくは組換えＡＰＣ治療に対するレスポンダー／ノンレスポンダーであることの予測を提供するステップとを実行するソフトウェアコード部分を含む、コンピュータープログラム製品に関する。

【0103】

以下の項目又は実施形態も本発明に含まれる：

【0104】

１．測定を必要とする被験体におけるプロテインＣ（ＰＲＯＣ）、好ましくは活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）のレベルを測定する質量分析に基づく方法であって、被験体から単離された１つ以上の生体試料に対して酵素消化を行う工程と、質量分析計を使用することによって配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のペプチドのレベルを測定する工程とを含み、ここで、配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のレベルが、上記１つ以上の生体試料中に存在するＰＲＯＣ、好ましくはＡＰＣのレベルに対応する、方法。

【0105】

２．酵素消化に使用される酵素は、トリプシン及び／又はＡｒｇＣ、又は消化後に配列番号１のＬＧＥＹＤＬＲペプチドを生じさせるプロテアーゼのあらゆる組合せである、項目１の質量分析に基づく方法。

【0106】

３．配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のペプチドの測定は、配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）の標識プロテオタイプペプチドをスパイクインすることによって行われる、項目１及び２の質量分析に基づく方法。

【0107】

４．配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のスパイクイン標識プロテオタイプペプチドは、少なくとも１つ以上の重アミノ酸を用いて合成され、上記ペプチドは、好ましくはＣ末端アミノ酸残基においてタグで標識される、項目１～３のいずれかの質量分析に基づく方法。

【0108】

５．方法は、１つ以上の生体試料を還元剤で還元する工程と、１つ以上の生体試料をアルキル化剤でアルキル化する工程とを更に含み、ここで、還元工程及びアルキル化工程の両方を、酵素消化の工程の前に行う、項目１～４の質量分析に基づく方法。

【0109】

６．１つ以上の生体試料は、血液、血清、血漿、唾液、尿、又は脳脊髄液からなる群より選択される、項目１～５のいずれかの質量分析に基づく方法。

【0110】

７．敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクがある被験体をスクリーニング又は分類する質量分析に基づく方法であって、
ｉ）項目１～６のいずれかの方法を実施することによって、プロテインＣ（ＰＲＯＣ）、好ましくは活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）のレベルを測定する工程と、
ｉｉ）工程ｉ）において取得されたレベルと基準値とを比較する工程と、
を含み、ここで、工程ｉ）の測定値とｉｉ）の基準値との統計的に有意な変動が、被験体が敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクがあることの指標である、方法。

【0111】

８．工程ｉｉ）の基準値は、健康な被験体又は健康な被験体の集団から取得され、プロテインＣ、好ましくは活性化プロテインＣのレベルにおける統計的に有意な低下が、被験体が敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクがあることの指標である、項目７に記載の質量分析に基づく方法。

【0112】

９．方法は、患者が敗血症又は敗血症性ショックを患っていることを臨床的に確認する工程を更に含む、項目７及び８のいずれかに記載の質量分析に基づく方法。

【0113】

１０．播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を患うリスクがある敗血症又は敗血症性ショックと診断された被験体をスクリーニング又は分類する質量分析に基づく方法であって、
ｉ）項目１～６のいずれかの方法を実施することによって、プロテインＣ（ＰＲＯＣ）、好ましくは活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）のレベルを測定する工程と、
ｉｉ）工程ｉ）において取得されたレベルと基準値とを比較する工程と、
を含み、ここで、工程ｉ）の測定値とｉｉ）の基準値との統計的に有意な変動が、被験体がＤＩＣを患うリスクがあることの指標である、方法。

【0114】

１１．工程ｉｉ）の基準値は、敗血症又は敗血症性ショックを患っているが、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を患っていない被験体又は被験体の集団から取得され、プロテインＣ（ＰＲＯＣ）、好ましくは活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）のレベルにおける統計的に有意な低下が、被験体がＤＩＣを患うリスクがあることの指標である、項目１０に記載の質量分析に基づく方法。

【0115】

１２．方法は、患者が播種性血管内凝固症候群を患っていることを臨床的に確認する工程を更に含む、項目１０及び１１のいずれかに記載の質量分析に基づく方法。

【0116】

１３．予後予測を必要とする被験体における組換えプロテインＣ（ＰＲＯＣ）、好ましくは組換え活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）による治療に対する奏効を予後予測する質量分析に基づく方法であって、
ｉ）項目１０～１３のいずれかの方法の各工程を実施することによって、被験体が播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を患うリスクがあるかどうかをスクリーニングする工程と、
ｉｉ）被験体がＤＩＣを患うリスクがあると特定されるか、又はＤＩＣと診断される場合に、被験体を上記治療に対するレスポンダーとして分類し、被験体がＤＩＣを患うリスクがあるとも特定されず、ＤＩＣとも診断されない場合に、被験体を上記治療に対するノンレスポンダーとして分類する工程と、
を含む、方法。

【0117】

１４．予後診断を行った後に、被験体を組換えプロテインＣ（ｒＰＲＯＣ）で治療し、好ましくは組換え活性化プロテインＣで治療する、項目１３の方法。

【0118】

１５．敗血症、敗血症性ショック、又は脳卒中の治療において使用される組換えプロテインＣ（ｒＰＲＯＣ）、好ましくは組換え活性化プロテインＣ（ｒＡＰＣ）を含む組成物であって、使用は、項目１３及び１４のいずれかに従ってレスポンダーとして分類される被験体に上記組成物を投与する工程を含む、組成物。

【0119】

１６．敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクがある被験体をスクリーニングするバイオマーカーとしての、使用を必要とする被験体から単離された１つ以上の生体試料中の配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のペプチドのレベルのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用。

【0120】

１７．播種性血管内凝固症候群を患うリスクがある被験体をスクリーニングするバイオマーカーとしての、敗血症又は敗血症性ショックを患っている被験体から単離された１つ以上の生体試料中の配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のペプチドのレベルのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用。

【0121】

１８．敗血症又は敗血症性ショック及び播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を患っている被験体における、組換えＰＲＯＣ、好ましくは組換えＡＰＣによる治療に対する奏効を予後予測するバイオマーカーとしての、使用を必要とする被験体から単離された１つ以上の生体試料中の配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）のペプチドのレベルのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用。

【0122】

以下の実施例は、本発明を単に説明するものであり、本発明を限定するものではない。

【実施例】

【0123】

実施例１：方法
試料数
合計１５７個の血漿試料を以下の通りに４つの群に分けた：１７個の基準集団コントロールの試料、１７個の関連する敗血症プロセスを一切伴わないＩＣＵコントロール、２４症例の敗血症、及び９９症例の敗血症性ショック。INCLIVAのＢｉｏｂａｎｋからの基準集団のコレクション及び敗血症のコレクションから全ての試料を得た。

【0124】

試料の調製
試料の調製及びトリプシンによる消化について、様々なプロトコルを試験した。敗血症を伴う血清の分析に必要な時間の短縮を考慮して、ＤＴＴによる還元及びトリプシンを用いたマイクロ波消化を含む分析プロトコルを最適化した。最適化した方法を以下に記載する。

【0125】

血漿試料を１５０００ｇで１５分間遠心分離して、脱脂処理した。２μＬの各血漿試料を８μＬのＨ_２Ｏ中で希釈した。２μＬのそれぞれ１／５希釈した血漿（約２５μｇ）を１８μＬの５０ｍＭのＢＡ中で２５ｆｍｏｌの混合重ペプチド（Heavy Mix peptides）とともに２０μＬの最終容量で混合する。システイン残基を５０ｍＭのＡＢＣ中２ｍＭのＤＴＴ（ＤＬ－ジチオトレイトール）により３００Ｗのマイクロ波で３分間還元した。スルフヒドリル基を５０ｍＭのＡＢＣ中５ｍＭのＩＡＭ（ヨードアセトアミド）を用いて暗所にて室温で２０分間アルキル化した。試料を５０ｍＭのＡＢＣ中の５μｇ（２．５μｇ／μｌ）のシーケンシンググレードの改変トリプシン（Promega）を用いて３００Ｗのマイクロ波で４分間トリプシン消化に供した。１％の最終濃度のＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）で反応を停止させた。

【0126】

試料を調製する時間：４５分

【0127】

質量分析による分析
ＭＲＭ実験を、Ｍｉｃｒｏ Ｍ３ ＭｉｃｒｏＬＣクロマトグラフィーシステムを備えた５５００ ＱＴＲＡＰハイブリッドトリプル四重極／線形イオントラップ質量分析計（SCIEX）において実施した。１０μＬのトリプシン消化物（約９μｇのタンパク質及び２５ｆｍｏｌの各スパイクインペプチド）をトラップカラム（１０×０．３ｍｍのＴｒａｐ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｃｈｒｏｍｘｐ Ｃ１８ＣＬ ５μｍ、ABSCIEX）へと注入した後に、分析カラム（ＣｈｒｏｍＸＰ Ｃ１８、１２０Å、３μｍ、１５０×０．３ｍｍ）上にロードして分離した。溶出をＡ中０％→３５％のＢの線形勾配で５μｌ／分の流量にて３０分間行った（Ａ：０．１％のＦＡ；Ｂ：ＡＣＮ、０．１％のＦＡ）。

【0128】

５５００ ＱＴＲＡＰをＭＲＭモードで操作した。ＭＲＭデータを５５００Ｖのスプレー電圧、カーテンガス：２５ｐｓｉ、イオンソースガス：２５ｐｓｉ、入口電位（ＥＰ）：１０、及び出口電位（ＥＸＰ）：１６を用いてポジティブモードで取得した。衝突エネルギー（ＣＥ）及びデクラスタリング電位（ＤＰ）を各トランジションごとに事前に最適化した。

【0129】

データ分析を行い、Ｓｋｙｌｉｎｅ ４．２．１．１９０５８ソフトウェア（MacCoss lab）を使用して全てのトランジションについての面積比（軽／重）を計算し、軽の濃度を初期血清のｆｍｏｌ／μＬとして推定した。分析に使用される重ペプチドは、CNB（Centro Nacional de Biotecnologia-CSIC）によって合成された。

【0130】

試料を分析する時間：３０分。

【0131】

各タンパク質の定量化に使用したペプチドは以下の通りである：

【0132】

【表1】

【0133】

スパイクインされたペプチドについての直線性評価
最初に、配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）及び配列番号２（ＴＦＶＬＮＦＩＫ）の配列を含む市販のＡＰＣ用の軽ペプチドをトリプシン処理し、５６００ ｔｒｉｐｌｅ ＴＯＦ（SCIEX、米国マサチューセッツ州、フレーミングハム）においてＬＣ－ＭＳ／ＭＳ＿ＤＤＡを使用して分析して、良好なシグナルを有するこれらの明白なペプチドを特定した。ＭＲＭパラメーターを、５５００ ＱＴＲＡＰ機器（SCIEX）においてＭＲＭ－ＰＩＬＯＴソフトウェア（SCUEX）によって最適化し、全てのペプチドについてのデクラスタリング電位（ＤＰ）、並びに滞留時間（ＤＴ）及び各トランジションについての衝突エネルギー（ＣＥ）を決定した。その後、検出可能な高いトランジション数、高い感度、及び高い線形ダイナミックレンジを有するペプチドを選択して、ＭＲＭ－ＭＳ実験を実施した。選択したペプチド配列（配列番号１（ＬＧＥＹＤＬＲ）及び配列番号２（ＴＦＶＬＮＦＩＫ））を、絶対的定量化用にＳｐｉｋｅＴｉｄｅｓ（商標）ＴＱ（重同位体で標識される；Ａｒｇ：^１３Ｃ６、^１５Ｎ４；Ｌｙｓ：Ａｒｇ：^１３Ｃ６、^１５Ｎ２）（JPT Peptide Technologies、ドイツ、ベルリン）として調製した。

【0134】

ＲＯＣ曲線
受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成し、分析して、敗血症プロセスの診断用及び敗血症性ショック症例におけるＤＩＣの特定用のＡＰＣバイオマーカーについての曲線下面積（ＡＵＣ）、カットオフ値、感度、及び特異度を取得した。０．５を上回るＡＵＣ（ｐ＜０．０５）を統計的に有意であると見なした。全ての分析をＧｒａＰｈａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ５を使用して実施した。

【0135】

統計分析
各研究群におけるＡＰＣタンパク質について統計パラメーター（平均、標準偏差、最小、最大）を計算した。群間を比較するのに、最初に群間で可変のＡＰＣについて正規性検定（コルモゴロフ－スミルノフ）を実施した。その後、マンホイットニーＵ検定（２つの群の場合）及び３つ以上の群間の比較の場合にクラスカル－ウォリス検定とともにダンの事後検定を使用することによって群間の比較を行った。

【0136】

ＡＰＣ値と他の臨床変数及び生化学変数との間の相関を評価するのに、スピアマンの順位相関係数を計算した。検定のｐ値が０．０５より小さい場合、差異及び関連性を統計的に有意であると見なした。全ての分析をＧｒａＰｈａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ５を使用して実施した。

【0137】

実施例２：活性化プロテインＣの選択されたペプチドについての質量分析の直線性
ＡＰＣの配列及び全配列のバイオインフォマティクス用トリプシン処理（bioinformatic trypsinization）を使用した初期の探索的研究により、幾つかのペプチド候補を得た。しかしながら、最終的にはＬＧＥＹＤＬＲ及びＴＦＶＬＮＦＩＫという２つのペプチドを使用することに決めた。これら２つのペプチド（以下に灰色でマークした）は、ｐｅｐｔｉｄｅｃｕｔｔｅｒ－ＥｘＰａｓｙ［https://web.expasy.org/cgi-bin/peptide_cutter/peptidecutter.pl］によってトリプシンを使用し、かつＬＧＹＤＬＲ（配列番号１）の場合は位置５４から位置６０の間で切断を生じさせ、そしてＴＦＶＬＮＦＩＫ（配列番号２）の場合は位置１５６から位置１６４の間で切断を生じさせて生成した。

【0138】

ＡＰＣのタンパク質一次配列
Ｃ鎖（配列番号５）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/1AUT_C）
1 lidgkmtrrg dspwqvvlld skkklacgav lihpswvlta ahcmdeskkl lvrlgeydlr
61 rwekweldld ikevfvhpny sksttdndia llhlaqpatl sqtivpiclp dsglaereln
121 qagqetlvtg wgyhssreke akrnrtfvln fikipvvphn ecsevmsnmv senmlcagil
181 gdrqdacegd sggpmvasfh gtwflvglvs wgegcgllhn ygvytkvsry ldwihghird
241 keapqkswap

【0139】

Ｌ鎖（配列番号６）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/1AUT_L）
1 skhvdgdqcl vlplehpcas lccghgtcix gigsfscdcr sgwegrfcqr evsflncsld
61 nggcthycle evgwrrcsca pgyklgddll qchpavkfpc grpwkrmekk rshl

【0140】

検量線を上記説明のように成し遂げた。検量線において得られた結果から、ＬＧＥＹＤＬＲペプチドがＴＦＶＬＮＦＩＫよりも良好な直線性を示したため、ＬＧＥＹＤＬＲを定量化に好ましいペプチドとして選択した（図１）。

【0141】

ＬＧＥＹＤＬＲ及びＴＦＶＬＮＦＩＫの両方のペプチドを使用して、内因性型及び組換え型のＰＲＯＣ及びＡＰＣ（Ｘｉｇｒｉｓ及び３Ｋ３Ａ－ＡＰＣ）の両方を測定することができることに留意することが重要である。

【0142】

特により低濃度のＰＲＯＣ又はＡＰＣ（より重度の敗血症を患う被験体の場合）で、ペプチドＬＧＥＹＤＬＲが他のペプチドよりも良好な直線性を示すことを更に裏付けるのに、ＬＧＥＹＤＬＲ及びＴＦＶＬＮＦＩＫと、配列番号７：ＡＮＳＦＬＥＥＬＲの新しいペプチドとを比較する同様の実験を実施した。結果を図５に示す。見て取れるように、より低い濃度（１ｆｍｏｌ／μｌから１０ｆｍｏｌ／μｌの間）を試験した場合、ＡＮＳＦＬＥＥＬＲは直線性を有さず、これらの範囲内のＰＲＯＣ及び／又はＡＰＣのレベルの測定に適した唯一のペプチドはＬＧＥＹＤＬＲである。

【0143】

実施例３：敗血症プロセスの診断
ＡＰＣは、集団及び敗血症コントロール群において通常分布するが、敗血症性ショック及びＩＣＵコントロール群においては通常分布しない。行われる全ての対比には、データが正常に挙動しない場合により頑健であるノンパラメトリック検定を使用する。

【0144】

各研究群におけるＡＰＣ濃度（ｎｇ／ｍＬ）についての記述統計を計算した。表２に、症例（敗血症性ショック＋敗血症）及びコントロール（基準集団＋ＩＣＵの非敗血症患者）において取得された値を示す。

【0145】

【表2】

【0146】

その後、分析した各部分群におけるＡＰＣの濃度（ｎｇ／ｍＬ）についての統計パラメーターを計算した（表３）。

【0147】

【表3】

【0148】

次に、異なる研究群間でＡＰＣ濃度を比較して、実測値における統計的有意差を確認した。

【0149】

症例とコントロールとの間の比較には、マンホイットニーＵ検定を使用する。これは、観察された差異がｐ＜０．０００１の値で統計的に有意であることを示す。４つの研究群間の対比には、ＡＮＯＶＡパラメトリック検定と同等のクラスカル－ウォリス検定を使用する。この検定では、ｐ＜０．０００１の値が示されたことから、異なる研究群間でＰＣＡレベルにおいて統計的有意差が見られることが示される。

【0150】

以下の比較において、統計的有意差が見られた：
ＩＣＵコントロールに対するショック（ｐ＜０．００１）、基準集団に対するショック（ｐ＜０．０００１）
ＩＣＵコントロールに対する敗血症（ｐ＜０．０００１）、基準集団に対する敗血症（ｐ＜０．０００１）。

【0151】

これらの結果から、ＡＰＣはコントロールに対する敗血症プロセスの診断に有用であり得ると推測することができる。

【0152】

実施例４：ＡＰＣと他の臨床パラメーター及び分析パラメーターとの相関
ＡＰＣレベル及び／又はＰＲＯＣレベルの分析は、敗血症又は敗血症性ショックの診断及び予後診断用のｉｎ ｖｉｔｒｏでの診断試験を準備する本発明の一部として考えられた。したがって、幾つかの臨床パラメーター及び生化学的パラメーターも同様に患者から取得したデータベースを作成した。次に、ＡＰＣ及び研究中に取得された他の臨床変数の間の相関分析を続いて実施して、他のどのパラメーターがＡＰＣと相関しているかを調べた。結果を図２及び図３に示す。

【0153】

ＩＣＵコントロール群においては、ＡＰＣレベルは機能的プロテインＣ値と有意な相関を示した（スピアマンのロー０．８８２、ｐ＜０．０００１）。機能的プロテインＣを、クリニコ・デ・バレンシア大学病院（Hospital Universitario Clinico de Valencia）にある臨床研究所からInstrumentation Laboratory（Werfenの会社）製のキットＨｅｍｏｓＩＬ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃを使用することにより取得した。

【0154】

敗血症の群において、ＡＰＣレベルは、ヒストンＨ２Ｂ（スピアマンのロー０．４６９、ｐ＝０．０２１）、ＰＣＴ（スピアマンのロー０．４６８、ｐ＝０．０２１）、Ｑｕｉｃｋ指数（スピアマンのロー０．５１４、ｐ＝０．０１０）、機能的プロテインＣ（スピアマンのロー０．９００、ｐ＝０．０３７）と有意な相関を示した。

【0155】

敗血症性ショックの症例の群において、ＡＰＣレベルは、血小板（スピアマンのロー０．３７４、ｐ＝０．０００１）、Ｑｕｉｃｋ指数（スピアマンのロー０．３０２、ｐ＝０．００３）、活性化部分トロンボプラスチン時間（スピアマンのロー－０．２６７、ｐ＝０．０２６）、Ｄ－二量体（スピアマンのロー－０．４３７、ｐ＝０．００２）、及び機能的プロテインＣ（スピアマンのロー０．９００、ｐ＜０．０００１）と有意な相関を示す。

【0156】

機能的プロテインＣについての基準値は７０％から１４０％の間と判明した。機能的プロテインＣ欠乏症は、例えば敗血症が見られる際にＤＩＣ（播種性血管内凝固症候群）のリスクを高めることを強調することが重要である。

【0157】

次に、本発明者らの研究に含まれる様々な敗血症患者及び敗血症性ショック患者由来の血漿中に見出されるＡＰＣのレベル（ｎｇ／ｍＬ）を調査したところ、ＤＩＣと診断された患者（ＤＩＣ群）におけるＰＲＯＣ／ＡＰＣの平均レベルが、この臨床的機能不全を示さなかった患者（ＤＩＣなし）よりも低いことが判明した（図４）。敗血症プロセスにおいてＡＰＣがＤＩＣを予測する可能性を評価するのに、臨床医が臨床変数を再検討して、敗血症患者をＤＩＣ又は非ＤＩＣに分類した。図４に示されるように、ＤＩＣと診断された患者の試料中の平均ＡＰＣレベル（平均値４６８ｎｇ／ｍｌ）は、ＤＩＣを患っていない被験体の平均レベル（平均６００ｎｇ／ｍｌ）と比較して統計的に低下した（ｐ＝０．００１４）。本発明に基づくこの分類により、本発明の方法によるＡＰＣの測定を使用することによって、ＤＩＣを患う１４人の患者及びＤＩＣを患っていない８５人の患者を特定することが可能となった。対応するＲＯＣ曲線を作成し、分析した（実施例７を参照）。

【0158】

これらの知見は非常に重要である。それというのも、Papageorgiou et al., 2018によって実施された研究［Papageorgiou C, et al.著の「播種性血管内凝固症候群：病因、診断、及び治療戦略に関する最新情報（Disseminated Intravascular Coagulation: An Update on Pathogenesis, Diagnosis, and Therapeutic Strategies.）」 Clin Appl Thromb Hemost. 2018;24(9_suppl):8S-28S. doi:10.1177/1076029618806424］において、ＡＰＣによる治療により、敗血症関連のＤＩＣを患う部分群に遡及的に割り当てられた患者を含む重度の敗血症を患う患者の２８日死亡率が低下することが実証されたからである。興味深いことに、ＡＰＣによる治療は他の患者群においては一切効能を示さなかったことから、ＤＩＣを患う敗血症患者のみがＡＰＣ治療（すなわち、Ｘｉｇｒｉｓ又は他のｒｈＡＰＣ）の使用から便益を受けるであろうことを示唆している。この研究において、ＡＰＣ治療が敗血症を患う患者における出血リスクを高めることも判明したため、敗血症を正確に診断し、同時に内因性ＡＰＣレベルを測定することが非常に重要である。さらに一層、敗血症患者の治療において、出血能力を有しないＡＰＣ誘導体の使用が最も重要となると考えられる。

【0159】

実施例５：コントロールに対する敗血症プロセス（敗血症又は敗血症性ショック）のスクリーニング用のＲＯＣ曲線
コントロール（基準集団＋ＩＣＵコントロール）に対する敗血症プロセスにおけるＡＰＣのスクリーニング可能性を評価するのに、対応するＲＯＣ曲線を作成し、分析した。

【0160】

【表4】

【0161】

［１］簡単な診断試験
信頼水準： ９５．０％
参照試験
診断試験 患者 コントロール 合計
－－－－－ －－－ －－－ －－－
陽性 ９７ １ ９８
陰性 ２５ ３３ ５８
－－－－－ －－－ －－－ －－－
合計 １２２ ３４ １５６
値 ＣＩ（９５％）
－－－－－－－－－ －－－－ －－－－－－－－－－－－－－
感度（％） ７９．５１ ７１．９４ ８７．０８
特異度（％） ９７．０６ ８９．９１ １００．００
妥当性指数（％） ８３．３３ ７７．１６ ８９．５０
陽性的中率（％） ９８．９８ ９６．４８ １００．００
陰性的中率（％） ５６．９０ ４３．２９ ７０．５０
有病率（％） ７８．２１ ７１．４１ ８５．００
ユーデン指数 ０．７７ ０．６７ ０．８６
陽性尤度比検定 ２７．０３ ３．９１ １８６．８１
陰性尤度比検定 ０．２１ ０．１５ ０．３０

【0162】

したがって、本発明者らの統計分析において得られた感度値及び特異度値によれば、ＰＲＯＣ／ＡＰＣバイオマーカーに基づく試験は信頼性があることが分かる。本発明の方法は、敗血症症例（敗血症又は敗血症性ショック）の７９．５％及びコントロールの９７．０６％を適切に分類することができる。

【0163】

この点において、的中率は、陽性の試験結果が得られた場合としての分類に許容可能であり、信頼性があると見なすことができる（ＰＰＶ ９８．９８）。

【0164】

これらの結論は、１よりもはるかに大きい陽性尤度比と、１からはるかに遠い陰性尤度比とによって裏付けられる。

【0165】

実施例６：ＩＣＵコントロールに対する敗血症プロセス（敗血症又は敗血症性ショック）のスクリーニング用のＲＯＣ曲線
三次病院のＩＣＵ内のＩＣＵコントロールに対する敗血症プロセスにおけるＡＰＣの診断可能性を評価するのに、対応するＲＯＣ曲線を作成し、分析した。

【0166】

【表5】

【0167】

簡単な診断試験
信頼水準： ９５．０％
参照試験
診断試験 患者 コントロール 合計
－－－－－ －－－ －－－ －－－
陽性 ９７ １ ９８
陰性 ２５ １６ ４１
－－－－－ －－－ －－－ －－－
合計 １２２ １７ １３９
値 ＣＩ（９５％）
－－－－－－－－－ －－－－ －－－－－－－－－－－－－－
感度（％） ７９．５１ ７１．９４ ８７．０８
特異度（％） ９４．１２ ７９．９９ １００．００
妥当性指数（％） ８１．２９ ７４．４５ ８８．１４
陽性的中率（％） ９８．９８ ９６．４８ １００．００
陰性的中率（％） ３９．０２ ２２．８７ ５５．１８
有病率（％） ８７．７７ ８１．９６ ９３．５８
ユーデン指数 ０．７４ ０．６０ ０．８７
陽性尤度比検定 １３．５２ ２．０１ ９０．６９
陰性尤度比検定 ０．２２ ０．１５ ０．３１

【0168】

したがって、本発明者らの統計分析において得られた感度値及び特異度値によれば、ＰＲＯＣ／ＡＰＣバイオマーカーに基づく試験は信頼性があることが分かる。この試験は、敗血症症例の７９．５％及びコントロールの９４．１２％を適切に分類することができる。

【0169】

この点において、的中率は、陽性の試験結果が得られた場合としての分類に許容可能であり、信頼性があると見なすことができる（ＰＰＶ ９８．９８）。

【0170】

これらの結論は、１よりもはるかに大きい陽性尤度比と、１からはるかに遠い陰性尤度比とによって裏付けられる。

【0171】

実施例７：ＤＩＣを患うリスクがある患者の分類用のＲＯＣ曲線
敗血症プロセスにおいてＡＰＣがＤＩＣを予測する可能性を評価するのに、臨床医が臨床変数を再検討して、敗血症患者をＤＩＣ又は非ＤＩＣに分類した。この分類により、ＭＳによるＡＰＣの測定を使用することによって、ＤＩＣを患う１４人の患者及びＤＩＣを患っていない８５人の患者を特定することが可能となった。対応するＲＯＣ曲線を作成し、分析した。

【0172】

【表6】

【0173】

したがって、本発明者らの統計分析において得られた感度値及び特異度値によれば、ＰＲＯＣ／ＡＰＣタンパク質のレベルの測定に基づく方法は信頼性があることが分かる。この試験は、ＤＩＣ症例の７１．４％及びコントロールの７１．４％を適切に分類することができる。

【0174】

これらの結論は、１よりもはるかに大きい陽性尤度比と、１からはるかに遠い陰性尤度比とによって裏付けられる。

【0175】

実施例７：低い濃度のＰＲＯＣ又はＡＰＣを有する患者におけるＰＲＯＣ又はＡＰＣの測定
上記で示したように、配列番号１のペプチドは、特に上記タンパク質が試料１μｌ当たり１００ｆｍｏｌを下回る濃度で存在する場合、配列番号２又は配列番号７よりも良好なＰＲＯＣレベル又はＡＰＣレベルとの相関を表す。この患者群における配列番号１の有用性を確認するのに、健康なコントロール及び敗血症、敗血症性ショック、又はＤＩＣの患者のＰＲＯＣ又はＡＰＣのレベルを測定した。表６に示される結果によれば、試験した全ての患者（健康及び敗血症）が、配列番号２又は配列番号７の検出限界未満、すなわち１００ｆｍｏｌ／μｌ未満のＰＲＯＣ又はＡＰＣのレベルを有したことが示される。その中で、６６人の患者が敗血症性ショックに罹患しており、その中の９人がＤＩＣに罹患している。全ての測定値は１００ｆｍｏｌ／μｌを下回るため、このコホート研究において上記タンパク質のレベルを正確に測定するのに使用することができる唯一のペプチドは配列番号１である。

【0176】

【表7】

【0177】

この表を考慮すると、ペプチドＬＧＥＹＤＬＲは非常に低濃度のＰＲＯＣ又はＡＰＣを検出することができると結論付けられる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

2024513664000001.app

【国際調査報告】