特表 2024-513731 ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるＡＤＣ中のＤＴＰＡ含有量の検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-27

(54)【発明の名称】ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるＡＤＣ中のＤＴＰＡ含有量の検出方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 30/88 20060101AFI20240319BHJP

   G01N 30/72 20060101ALI20240319BHJP

   G01N 30/06 20060101ALI20240319BHJP

   G01N 30/26 20060101ALI20240319BHJP

   G01N 30/34 20060101ALI20240319BHJP

   G01N 30/86 20060101ALI20240319BHJP

   G01N 30/04 20060101ALI20240319BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20240319BHJP

   A61K 39/395 20060101ALN20240319BHJP

   A61K 47/68 20170101ALN20240319BHJP

   A61K 33/24 20190101ALN20240319BHJP

   A61P 35/00 20060101ALN20240319BHJP

【ＦＩ】

G01N30/88 D

G01N30/72 C

G01N30/06 A

G01N30/26 A

G01N30/34 E

G01N30/86 J

G01N30/04 P

G01N27/62 X

G01N27/62 V

A61K39/395 Y

A61K47/68

A61K33/24

A61P35/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023557461

(86)(22)【出願日】2022-03-30

(85)【翻訳文提出日】2023-09-19

(86)【国際出願番号】 CN2022083945

(87)【国際公開番号】W WO2022206806

(87)【国際公開日】2022-10-06

(31)【優先権主張番号】202110349989.7

(32)【優先日】2021-03-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520087262

【氏名又は名称】レメゲン シーオー．，エルティーディー．

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＭＥＧＥＮ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．５８ Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｍｉｄｄｌｅ Ｒｏａｄ， Ｙａｎｔａｉ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ， Ｙａｎｔａｉ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｃｈｉｎａ（Ｓｈａｎｄｏｎｇ）Ｐｉｌｏｔ Ｆｒｅｅ Ｔｒａｄｅ Ｚｏｎｅ， Ｙａｎｔａｉ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ ２６４００６ Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】姚 雪静

(72)【発明者】

【氏名】孫 芳芳

(72)【発明者】

【氏名】孫 文龍

(72)【発明者】

【氏名】斉 桂平

【テーマコード（参考）】

2G041

4C076

4C085

4C086

【Ｆターム（参考）】

2G041CA01

2G041EA04

2G041GA09

2G041LA08

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076DD51

4C076EE41

4C076EE59

4C085AA26

4C085BB11

4C085EE01

4C086AA01

4C086HA12

4C086HA28

4C086NA13

4C086ZB26

(57)【要約】

【解決手段】本発明は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるＡＤＣ中のＤＴＰＡ含有量の検出方法に関する。
【効果】この方法では、サンプルがＦｅ³⁺により弱アルカリ性の誘導体化条件下で誘導化され、同時に弱アルカリ性移動相が採用され、イオン対試薬を加える必要がない。この方法は、高効率、安定性、耐久性に優れるという特徴を有し、従来技術におけるＤＴＰＡ検出方法が少なく、操作が複雑であるという欠点を適合に補うことが可能である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

液体クロマトグラフ－タンデム質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によるＡＤＣ中のＤＴＰＡ含有量の検出方法であって、被検物であるＡＤＣサンプルが弱アルカリ性の誘導体化条件下でＦｅ³⁺により誘導化され、Ｃ１８クロマトカラムが採用される同時に、弱アルカリ性移動相が採用され、イオン対試薬を加える必要がないことを特徴とする、方法。

【請求項2】

前記Ｆｅ³⁺による誘導化がＦｅＣｌ₃を使用して誘導化することであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記弱アルカリ性移動相には、酢酸アンモニウムと水酸化アンモニウムを含む水溶液であり、好ましくは０．２％の酢酸アンモニウム８０～１００ｍＭと０．０１％の水酸化アンモニウムを含む水溶液であり、最も好ましくは０．２％の酢酸アンモニウム１００ｍＭと０．０１％の水酸化アンモニウムを含む水溶液である移動相Ａが含まれることを特徴とする、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記弱アルカリ性移動相には、酢酸アンモニウムと水酸化アンモニウムを含むアセトニトリル溶液であり、好ましくは０．２％の酢酸アンモニウム８０～１００ｍＭと０．０１％の水酸化アンモニウムを含むアセトニトリル溶液であり、最も好ましくは０．２％の酢酸アンモニウム１００ｍＭと０．０１％の水酸化アンモニウムを含むアセトニトリル溶液である移動相Ｂが含まれることを特徴とする、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

添加されるＦｅＣｌ₃溶液の濃度が約４０～６０μｇ／ｍｌ、好ましくは５０．０μｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記方法では、標準品溶液がＤＴＰＡを採用して作製されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

好ましくは、前記標準品溶液が１．０μｇ／ｍｌのＤＴＰＡ溶液であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ＤＴＰＡ溶液の調製及び標準曲線シリーズ溶液の調製が、
１）ＥＰ管に計量したＤＴＰＡ標準品５～１０ｍｇを、０．１％の水酸化アンモニウム１ｍｌで溶解して母液を得た後、ＤＴＰＡ濃度が１．０μｇ／ｍｌになるまで母液を段階的に希釈するＤＴＰＡ作動液の調製工程と、
２）１．０μｇ／ｍｌのＤＴＰＡ標準品溶液を移動相Ａで、５００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌのシリーズ濃度を有するＤＴＰＡ標準品溶液に希釈する標準曲線シリーズ溶液の調製工程とを含むことを特徴とする、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記方法が、移動相Ａで１．０μｇ／ｍｌのＤＴＰＡ溶液を希釈して調製された、濃度が４００ｎｇ／ｍｌ（ＨＱＣ）、２００ｎｇ／ｍｌ（ＭＱＣ）、１００ｎｇ／ｍｌ（ＬＱＣ）であるＤＴＰＡ品質管理溶液を使用することをさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。

【請求項10】

前記液体クロマトグラには、米国アジレント社のＡｇｉｌｅｎｔ １２００型液体クロマトグラフ、Ｔｅｌｅｄｙｎｅ Ｉｓｃｏ社の高圧分取液体クロマトグラフ、アジレントのＨＰＬＣ１２６０型高速液体クロマトグラフが含まれるが、これらに限定されない、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記タンデム質量分析計には、米国ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社のＡＰＩ ４０００型タンデム質量分析計、島津のトリプル四重極型液体クロマトグラフ質量分析計、ＧＢＣのＯｐｔｉｍａｓｓ誘導結合プラズマ直交加速飛行時間型質量分析計が含まれるが、これらに限定されない、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記Ｃ１８クロマトカラムには、ＹＭＣ－Ｃ１８、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｘｔａｒｄ－Ｃ１８、資生堂のＰＡＫ ＣＲ－１８が含まれるが、これらに限定されない、請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物医薬の分野に属し、精度が高く、耐久性に優れ、再現性が良いＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるＤＴＰＡの検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ジエチルトリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）は、５つのカルボキシメチル基を有するジエチレントリアミン骨格からなるアミノポリカルボン酸である。

【0003】

ＤＴＰＡは、１９５０年代後半に放射性核種の排出促進に広く用いられ、現在では主にそのカルシウム塩が用いられている。ＤＴＰＡ及びその関連カルシウム塩の毒副作用には、主に高用量の致死反応、肝臓や腎臓の損傷、腸粘膜の損傷や造血阻害が含まれる（趙興成など、ＤＴＰＡの毒性及び排出促進応用、国外医学（放射医学分冊）、１９８０年０４期）。

【0004】

現在、ＤＴＰＡは、ＡＤＣ製品の製造に広く使われており、還元後のタンパク質を保護する目的としてモノクローナル抗体の還元工程に添加される。ＤＴＰＡは、抗体薬物複合体のリンカー（Ｖｉｒｇｉｎｉａ ｄｅｌ Ｓｏｌａｒ ｅｔ ａｌ、Ｍｅｔａｌ－ｂａｓｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ． Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｓ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９、２０１９）として、白金金属抗体薬物複合体（Ｍｅｔａｌ－ｂａｓｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）の作製に使用されることもでき、ＤＴＰＡが添加されない場合、ＡＤＣが正常に結合されないか又は結合後の製品の品質が低下してしまったことがＡＤＣの生産プロセスにより示される。既存のＡＤＣ製造のプロセスには、通常、ＤＴＰＡに対する特定の除去プロセスがなく、ＤＴＰＡが製品透析過程のみで除去されるため、ＡＤＣ製品に残留する恐れがあり、その後の薬の安全性に一定の悪影響を及ぼすことが無視できない。ＡＤＣ関連製品におけるＤＴＰＡ検出に関する研究は、従来技術においてまだ見られていない。

【0005】

現在、文献に報告されたＤＴＰＡの検出方法は、主に食品分野及び繊維分野に集中している。ガスクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィー法が用いられる場合が多く、イオンクロマトグラフィーが採用される場合もある。しかし、ガスクロマトグラフィーで検出する場合、ＤＴＰＡ及びその錯体は、極性のカルボニル基を含むために揮発することが困難になり、エステル化反応を行って揮発性化合物を生成する必要があり、操作が複雑になる。また、ＨＰＬＣ法を採用する場合、その検出限界が高く、残留量の検出に適していない。以上の原因から、ＬＣ－ＭＳＭＳ法は、ますます注目されてきた。例えば、特許文献１（ＣＮ１０７３１５０５６Ａ）には、クロマトグラフィー分離効果に優れ、目的物質の回収率に優れた、ＬＣ－ＭＳＭＳ法によるラット血漿生物学的サンプル中のＤＴＰＡ－Ｃａの測定方法が開示されている。特許文献２（ＣＮ１０７１６７５４１Ａ）には、同様に分離効果が良好である、ＬＣ－ＭＳＭＳ法によるラット血漿生物学的サンプル中のＤＴＰＡ－Ｚｎの測定方法を開示されている。しかし、抗体薬物複合体は、タンパク質生体高分子の混合物であり、システムが複雑で、ＤＴＰＡの検出を著しく妨害するため、これらの方法は抗体薬物複合体製品におけるＤＴＰＡに適用できない。

【0006】

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳは、実際にはＬＣ技術と２つのＭＳ技術を組み合わせた総合的な検出技術である。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）とマススペクトル（ＭＳ）の組み合わせたものであり、注入された後のサンプルがまず移動相に連れてクロマトカラムに入り、クロマトカラムによる分離の後に、マススペクトルに入って検出されるという動作原理として働く。質量分析計では、測定物の質量電荷比（ｍ／ｚ）に従って検出を行い、測定物がイオン源でガスイオンに変換されてマススペクトルに入り、トリプル四重極において一次質量分析計が特定の範囲のイオンをスキャンするかまた特定のイオンが衝突室に入ることを許可し、衝突室内において分子イオンが衝突して分解し、子イオンが形成されて二次マススペクトルに入り、二次質量分析計が特定の範囲のイオンをスキャンするか又は特定のイオンが検出器に入ることを許可する。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの併用が非常に顕著な利点を持ている理由は、ガスクロマトグラフィーは揮発性で分解しない物質しか分離できないのに対し、液体クロマトグラフィーは分離範囲を大幅に広げていることにある。ＬＣと高選択性、高感度のＭＳ／ＭＳとの組み合わせにより、複雑なサンプルのリアルタイム分析を実行することが可能になり、ＬＣによる分離が困難である場合でも、ＭＳ１及びＭＳ２により目的化合物の中性破片走査を実行すれば、混合物中の目的化合物を見つけて強調表示することができ、信号対雑音比を大幅に向上させることができる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

ＬＣ－ＭＳＭＳ法によるＤＴＰＡの検出方法では、Ｆｅ³⁺誘導化の手段を採用することが多いが、その誘導体化条件がすべて酸性条件であり、かつ、移動相にイオン対試薬さえ添加すれば良好な分離を実現でき、方法の再現性が悪く、不安定である。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明では、ＤＴＰＡをより迅速かつ効果的に検出するためには、弱アルカリ性の誘導体化条件に基づくＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるＤＴＰＡの検出方法を開発し、従来技術でのＤＴＰＡの検出にあった困難を効果的に解決した。

【発明の効果】

【0009】

本発明では、ＬＣ－ＭＳＭＳ法による検出が抗体薬物複合体製品におけるＤＴＰＡの検出に使用され、精度が高く、耐久性に優れ、再現性がよく、ＡＤＣ製造の品質管理において重要な適用価値がある。
本発明では、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法を採用して抗体薬物複合体製品におけるＤＴＰＡを検出し、弱アルカリ性の誘導体化条件下でサンプルをＦｅＣｌ₃により誘導化し、誘導体化の時間が短く、誘導体化されたサンプルが８ｈ以内に安定しており、また、弱アルカリ性の移動相を採用し、イオン対試薬を添加することなくＣ１８クロマトカラム中に比較的に良いクロマトグラフィーピークを生成することができる。この方法は、効率的であり、安定性及び耐久性に優れている。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】図１は、ＤＴＰＡの線形フィッティング標準曲線を示す。

【図2】図２は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法によるＤＴＰＡ含有量測定の検出結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明における第１の態様は、液体クロマトグラフ－タンデム質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、又はＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によるＡＤＣサンプル中のＤＴＰＡ含有量の検出方法であって、被検物であるＡＤＣサンプルがＦｅ³⁺により弱アルカリ性の誘導体化条件下で誘導化され、Ｃ１８クロマトカラムが採用される同時に、弱アルカリ性移動相が採用され、イオン対試薬を加える必要がないことを特徴とする方法に関する。

【0012】

さらに、本発明における弱アルカリ性とは、７≦ｐＨ≦８を指す。

【0013】

さらに、前記Ｆｅ³⁺による誘導化はＦｅＣｌ₃を使用して誘導化することである。

【0014】

さらに、前記移動相Ａは、酢酸アンモニウムと水酸化アンモニウムを含む水溶液であり、好ましくは０．２％の酢酸アンモニウム（Ｗ／Ｖ）８０～１００ｍＭと０．０１％の水酸化アンモニウム（Ｗ／Ｖ）を含む水溶液であり、最も好ましくは０．２％の酢酸アンモニウム（Ｗ／Ｖ）１００ｍＭと０．０１％の水酸化アンモニウム（Ｗ／Ｖ）を含む水溶液である。

【0015】

さらに、前記移動相Ｂは、酢酸アンモニウムと水酸化アンモニウムを含むアセトニトリル溶液であり、好ましくは０．２％の酢酸アンモニウム（Ｗ／Ｖ）８０～１００ｍＭと０．０１％の水酸化アンモニウム（Ｗ／Ｖ）を含むアセトニトリル溶液であり、最も好ましくは０．２％の酢酸アンモニウム（Ｗ／Ｖ）１００ｍＭと０．０１％の水酸化アンモニウム（Ｗ／Ｖ）を含むアセトニトリル溶液である。

【0016】

さらに、添加されるＦｅＣｌ₃溶液の濃度は、約４０～６０μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは５０．０μｇ／ｍｌである。

【0017】

本発明における第１の態様のいずれかの実施形態に記載の方法においては、標準品溶液がＤＴＰＡを採用して作製される。

【0018】

さらに、前記標準品溶液は、１．０μｇ／ｍｌのＤＴＰＡ溶液であることが好ましい。

【0019】

さらに、前記ＤＴＰＡ溶液の調製及び標準曲線シリーズ溶液の調製は、
１）ＥＰ管に計量したＤＴＰＡ標準品５～１０ｍｇを、０．１％の水酸化アンモニウム１ｍｌで溶解して母液を得た後、ＤＴＰＡ濃度が１．０μｇ／ｍｌになるまで母液を段階的に希釈するＤＴＰＡ作動液の調製工程と、
２）１．０μｇ／ｍｌのＤＴＰＡ標準品溶液を移動相Ａで、５００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌのシリーズ濃度を有するＤＴＰＡ標準品溶液に希釈する標準曲線シリーズ溶液の調製工程とを含む。

【0020】

前記方法は、移動相Ａで１．０μｇ／ｍｌのＤＴＰＡ溶液を希釈して調製された、濃度が４００ｎｇ／ｍｌ（ＨＱＣ）、２００ｎｇ／ｍｌ（ＭＱＣ）、１００ｎｇ／ｍｌ（ＬＱＣ）のＤＴＰＡ品質管理溶液を使用することをさらに含む。

【0021】

本発明における第１の態様のいずれかの実施形態に記載の方法においては、前記液体クロマトグラには、米国アジレント社のＡｇｉｌｅｎｔ １２００型液体クロマトグラフ、Ｔｅｌｅｄｙｎｅ Ｉｓｃｏ社の高圧分取液体クロマトグラフ、アジレントのＨＰＬＣ １２６０型高速液体クロマトグラフが含まれるが、これらに限定されない。

【0022】

本発明における第１の態様のいずれかの実施形態に記載の方法においては、前記タンデム質量分析計には、米国ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社のＡＰＩ ４０００型タンデム質量分析計、島津のトリプル四重極型液体クロマトグラフ質量分析計、ＧＢＣのＯｐｔｉｍａｓｓ誘導結合プラズマ直交加速飛行時間型質量分析計が含まれるが、これらに限定されない。

【0023】

本発明における第１の態様のいずれかの実施形態に記載の方法においては、液体クロマトグラフィーには、Ｃ１８カラムが採用され、ＹＭＣ－Ｃ１８、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｘｔａｒｄ－Ｃ１８、資生堂のＰＡＫ ＣＲ－１８が含まれるが、これらに限定されない。

【0024】

本発明におけるいずれかの態様のいずれかの実施形態においては、いずれかの技術的特徴は、矛盾が生じない限り、他の実施形態における該当技術的特徴に適用する可能性がある。本発明で引用されるすべての文献の全内容が参照により本明細書に組み込まれるが、これらの文献に記載された意味が本発明と一致しない場合、本発明の記載に基準する。

【実施例】

【0025】

実施例１ 液体クロマトグラフ－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）法によるＤＴＰＡ含有量の測定
１）作動液の調製

【0026】

ＤＴＰＡ作動液の調製：５～１０ｍｇのＤＴＰＡ標準品をＥＰ管に計量し、１ｍｌの０．１％の水酸化アンモニウムで溶解して母液を得た後、母液をＤＴＰＡ濃度が１．０μｇ／ｍｌになるまで段階的に希釈した。

【0027】

塩化第二鉄作動液の調製：１０～２０ｍｇの塩化第二鉄をＥＰ管に計量し、適量の水で溶解して母液を得た後、母液を塩化第二鉄の濃度が５０．０μｇ／ｍｌになるまで段階的に希釈した。

【0028】

標準曲線シリーズ溶液の調製：１．０μｇ／ｍｌのＤＴＰＡ（Ａ１とする）標準品溶液を表２に従って移動相Ａで６００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌのシリーズ濃度を有するＤＴＰＡ標準品溶液になるように希釈した。上記の各濃度のＤＴＰＡ標準品溶液をそれぞれ２００μｌ取り、それぞれに５μｌの塩化第二鉄溶液（濃度５０．０μｇ／ｍｌ）を加え、ボルテックスで混合し、室温下暗所で９時間反応させた後、直接に検出を行った。

【0029】

【表1】

【0030】

品質管理溶液の調製：１．０μｇ／ｍｌのＤＴＰＡ（Ａ１’とし、母液から新しく希釈する必要がある）標準品溶液を表２に従って移動相Ａで濃度が４００ｎｇ／ｍｌ（ＨＱＣ）、２００ｎｇ／ｍｌ（ＭＱＣ）、１００ｎｇ／ｍｌ（ＬＱＣ）であるＤＴＰＡ品質管理溶液になるように希釈した。上記の様々な濃度のＤＴＰＡ品質管理溶液をそれぞれ２００μｌ取り、それぞれに５μｌの塩化第二鉄溶液（濃度５０．０μｇ／ｍｌ）を加え、ボルテックスで混合し、室温下暗所で４時間反応させた後、直接に検出を行った。

【0031】

【表2】

【0032】

２）液体クロマトグラフ－タンデム質量分析計による測定
被測定サンプルの処理：移動相Ａ（０．２％の酢酸アンモニウム１００ｍＭと０．０１％の水酸化アンモニウムとを含む水溶液）を希釈液とし、ＡＤＣサンプルの濃度を適切な濃度（サンプルにおけるＤＴＰＡの含有量を線形範囲にするべきであり、範囲を超えた場合には、希釈倍数を増減して再度に検出を行う必要がある）に希釈した。希釈後のサンプルを２００μｌ取り、５μｌの塩化第二鉄溶液（濃度５０．０μｇ／ｍｌ）を加え、ボルテックスで混合し、室温下暗所で４時間反応させた後、直接に検出を行った。

【0033】

移動相Ａの調製：酢酸アンモニウム０．７７１ｇを計量し、８０ｍｌの水を加えて攪拌して溶解させた後、水を加えて１００ｍｌに定容し、ＧＨＰメンブレンでろ過し、１００ｍＭの酢酸アンモニウムを得た。１００ｍＭの酢酸アンモニウム１０００μｌ、１０％の水酸化アンモニウム５００μｌを正確に採取し、目盛５００ｍｌまで水を加え、ＧＨＰメンブレンでろ過し、移動相Ａを得た。

【0034】

移動相Ｂの調製：１００ｍＭの酢酸アンモニウム１０００μｌ、１０％の水酸化アンモニウム５００μｌを正確に採取し、さらにアセトニトリル５００ｍｌに加え、ＧＨＰメンブレンでろ過し、移動相Ｂを得た。

【0035】

検出では、移動相Ａと移動相Ｂを使用して表３に示すような濃度勾配に従って溶出を行った。

【0036】

【表3】

【0037】

３）データ処理と分
評価基準：標準曲線：ｒ≧０．９８００、定量上限及び定量下限濃度点の回収率が８０．０％～１２０．０％の範囲にあった。

【0038】

品質管理の回収率が８０．０％～１２０．０％の範囲にあった。各濃度の品質管理サンプルの少なくとも５０％がこの範囲を満たし、また、同じ分析ロットで少なくとも４つの品質管理濃度点がこの要件を満たすことにした。

【0039】

具体的な結果は次のとおりであった。

【0040】

【表4】

【0041】

線形フィッティング後に得られた標準曲線は次のとおりであった。
Ｙ＝１６０５８ｘ－４１６７４４、 Ｒ²＝０．９９３６
図１の結果によれば、Ｒ²＞０．９９、フィッティング性が良かったことが分かった。

【0042】

実施例２ 検出方法の結果と評価
１）耐久性（安定性）

【0043】

誘導化温度による耐久性：濃度が６００ｎｇ／ｍｌのＤＴＰＡ標準品溶液２００μｌを取り、５μｌの塩化第二鉄溶液（濃度５０．０μｇ／ｍｌ）を加え、ボルテックスで混合し、暗所で４時間反応させ、誘導化温度をそれぞれ室温、３７℃及び５０℃とした場合の誘導化温度の結果への影響を調査し、具体的な結果を表５に示す。

【0044】

【表5】

【0045】

誘導体化時間による耐久性：濃度が６００ｎｇ／ｍｌのＤＴＰＡ標準品溶液２００μｌを取り、５μｌの塩化第二鉄溶液（濃度５０．０μｇ／ｍｌ）を加え、ボルテックスで混合し、室温下暗所で反応させ、それぞれ４時間、６時間、８時間誘導化し、誘導体化時間の結果への影響を調査し、具体的な結果を表６に示す。

【0046】

【表6】

【0047】

測定された溶液（精度試験用サンプル）の安定性に関する調査：ＤＴＰＡが塩化第二鉄と反応して誘導化された後、サンプルトレイに０時間、４時間、８時間放置されて標準品ＤＴＰＡの含有量の変化を調査した。具体的な結果を表７に示す。

【0048】

【表7】

【0049】

評価基準：濃度（相対標準偏差ＲＳＤ％）≦２５．０％。表５～７の実験結果から、ＲＳＤ％が２５．０％未満であったため、本方法によれば耐久性が強いことが分かった。

【0050】

２）再現性
装置が安定した後、標準品３溶液（ＤＴＰＡ濃度が２００ｎｇ／ｍｌであった）を実験方法に従って誘導化し、注入して分析を行い、６つ溶液の測定結果を評価した。結果を表８に示す。クロマトグラフィーを収集し、メインピークの含有量ＲＳＤを算出した。

【0051】

【表8】

【0052】

定量分析の分野では、再現性とは、同じ操作条件下で、同じ分析者が比較的短い時間間隔内で測定して得られた結果の精度を指す。許容される再現性の基準は、メインピークの濃度ＲＳＤ≦１５．０％である。本試験のＲＳＤ＜１５．０％であったから、本方法では、ＲＳＤが最高比率よりもはるかに小さく、再現性が良いことが分かった。

【0053】

以上、本発明の好ましい実施例を通じて本発明の精神を詳述した。本発明の技術的本質に従って上記の実施例に対してなされた任意の修正や、同等の変更、修飾が本発明の保護範囲内にあるものとすること、を当業者なら理解するであろう。

【図1】

【図2】

【国際調査報告】