特表 2024-513755 マンノース３グリカン媒介タンパク質分解

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-27

(54)【発明の名称】マンノース３グリカン媒介タンパク質分解

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/18 20060101AFI20240319BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240319BHJP

   A61K 47/61 20170101ALI20240319BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240319BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240319BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20240319BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240319BHJP

【ＦＩ】

C07K16/18

A61P37/06

A61P35/00

A61P29/00

A61P1/16

A61P7/04

A61P35/02

A61K47/61

A61K47/68

A61K39/395 M

A61K39/395 A

A61K38/02

C12N15/13

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023558413

(86)(22)【出願日】2022-03-22

(85)【翻訳文提出日】2023-10-26

(86)【国際出願番号】 EP2022057554

(87)【国際公開番号】W WO2022200388

(87)【国際公開日】2022-09-29

(31)【優先権主張番号】63/164,991

(32)【優先日】2021-03-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523360197

【氏名又は名称】グリコエラ アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】100097456

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 徹

(72)【発明者】

【氏名】アミレザ ファリドモアヤー

(72)【発明者】

【氏名】レイナー フォラドール

(72)【発明者】

【氏名】マニュエラ マリー

(72)【発明者】

【氏名】ジョナサン アルバート バック

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC04

4C076CC07

4C076CC14

4C076CC16

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C084BA34

4C084BA44

4C084NA05

4C084NA06

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA531

4C084ZA532

4C084ZA751

4C084ZA752

4C084ZB111

4C084ZB112

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZB272

4C085AA13

4C085AA14

4C085DD51

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA53

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA71

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、マンノース３グリカン媒介分解のための二機能性結合タンパク質を提供する。そのようなグリカン修飾は、現在の治療を改善し、患者にとってより良好な生活の質を可能にするであろう。したがって、そのような二機能性結合タンパク質は、さまざまな疾患を治療及び予防するために有用である。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的タンパク質に特異的に結合する第１の部分と、下記の構造

【化1】

を含むグリカンを含む第２の部分と、を含む二機能性結合タンパク質であって、
四角はＮ－アセチルグルコサミン残基を表し、黒い縞模様の円はマンノース残基を表し、Ｘは二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表す、前記二機能性結合タンパク質。

【請求項2】

前記グリカンが、Ｘに直接結合しているＮ－アセチルグルコサミンアミンにおいてフコース残基をさらに含む、請求項１に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項3】

Ｘが、前記二機能性結合タンパク質中のアスパラギン残基である、請求項１に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項4】

前記グリカンが、請求項１に記載の構造からなる、請求項１に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項5】

前記標的タンパク質が、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、αｖβ３インテグリン、ＣＥＡ、ＣＸＣＲ４、ＭＵＣ１、ＬＣＡＭ１、ＥｐｈＡ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＶＩＳＴＡ、Ｎｏｔｃｈ受容体、ＥＧＦ、ｃ－ＭＥＴ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、Ｗｎｔ、ＬＲＰ５／６、ＣＤ３８、ＣＤ７３、ＴＧＦ－β、ボンベシンＲ、ＣＡＩＸ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ｖ６、ＣＸＣＲ４、ＥｒｂＢ－２、Ｈｅｒ２、エムプリン、エンドグリン、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ－α、葉酸Ｒ、ＧＲＰ７８、ＩＧＦ－１Ｒ、マトリプターゼ、メソテリン、ｓＭＥＴ／ＨＧＦＲ、ＭＴ１－ＭＭＰ、ＭＴ６－ＭＭＰ、Ｍｕｃ－１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、Ｔｎ抗原、及びｕＰＡＲ、ＴＳＨＲα、ＡＣｈＲ－α１、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖の非コラーゲンドメイン１（α３ＮＣ１）、ＡＤＡＭＴＳ１３、デスモグレイン－１／３、またはＧＰＩｂ／ＩＸ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩａ／ＩＩａ、ＮＭＤＡ受容体、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、アンフィフィシン及びガングリオシドＧＭ１、ＧＤ３、ＧＱ１Ｂ、ＭＯＧ、ＳＩＲＰα、ＣＣＲ２、ＣＳＦ－１Ｒ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＶＥＧＦ－Ｒ、ＣＸＣＲ４、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＣＳＦ－１、ＣＤ４７、またはミスフォールド軽鎖及びミスフォールドしたトランスサイレチンを含む、請求項１に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項6】

前記第２の部分が、マンノース３受容体、分化クラスター２０６（ＣＤ２０６）受容体、ＤＣ－ＳＩＧＮ（分化クラスター２０９またはＣＤ２０９）受容体、Ｃ型レクチンドメインファミリー４メンバーＧ（ＬＳＥＣＴｉｎ）受容体、マクロファージ誘導性Ｃａ^２＋依存性レクチン受容体（Ｍｉｎｃｌｅ）に特異的に結合する、請求項１に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項7】

前記第２の部分が、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を認識する任意のエンドサイトーシス炭水化物結合受容体に特異的に結合する、請求項１に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項8】

前記第２の部分がグリカン構造を含む、請求項１に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項9】

前記グリカン構造がマンノース３である、請求項８に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項10】

前記第１の部分が、重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項11】

前記第１の部分が、モノクローナル抗体のＦａｂ領域を含む、請求項１に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項12】

抗体である、請求項１に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項13】

前記抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項１２に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項14】

前記抗体が組換え体である、請求項１２に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項15】

前記抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、または完全ヒト抗体である、請求項１２に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項16】

前記抗体が、２対１、４対１、６対１、８対１、または１０対１のグリカン対タンパク質の比を有する、請求項１２に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項17】

前記抗体が、所定の特定の残基でグリコシル化されている、請求項１２に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項18】

前記二機能性結合タンパク質が自己抗原である、請求項１に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項19】

前記二機能性結合タンパク質の前記グリカンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％が請求項１に記載のグリカンの構造を有する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項20】

前記標的タンパク質が、細胞表面分子または非細胞表面分子である、請求項１に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項21】

前記細胞表面分子が受容体である、請求項２０に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項22】

前記非細胞表面分子が細胞外タンパク質である、請求項２０に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項23】

前記細胞外タンパク質が、自己抗体、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、血液タンパク質、または中枢神経系（ＣＮＳ）タンパク質である、請求項２２に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項24】

前記標的タンパク質が前記第１の部分によって結合される、請求項２０～２３のいずれか１項に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項25】

肝臓マクロファージに標的タンパク質を送達する方法であって、前記標的タンパク質のエンドサイトーシスを媒介する条件下で、前記標的タンパク質を請求項１～２２のいずれか１項に記載の二機能性結合タンパク質と接触させる、前記方法。

【請求項26】

標的タンパク質を分解する方法であって、宿主細胞による前記標的タンパク質のリソソーム分解を媒介する条件下で、前記標的タンパク質を請求項１～２４のいずれか１項に記載の二機能性結合タンパク質と接触させることを含む、前記方法。

【請求項27】

前記標的タンパク質が、がんにおいてアップレギュレートされるか、またはがんの進行に関与する、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

がんにおいてアップレギュレートされる、またはがんの進行に関与する前記標的タンパク質が、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、αｖβ３インテグリン、ＣＥＡ、ＣＸＣＲ４、ＭＵＣ１、ＬＣＡＭ１、ＥｐｈＡ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＶＩＳＴＡ、Ｎｏｔｃｈ受容体、ＥＧＦ、ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＬ２、ＣＣＲ２、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、Ｗｎｔ、ＬＲＰ５／６、ＣＳＦ－１Ｒ、ＳＩＲＰα、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＣＤ３８、ＣＤ７３、またはＴＧＦ－βを含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記標的タンパク質が自己免疫疾患の自己抗体である、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記標的タンパク質が自己免疫疾患の自己抗原である、請求項２８に記載の方法。

【請求項31】

前記自己免疫疾患の前記自己抗体が、ＭＯＧ、ＴＳＨＲα、ＡＣｈＲ－α１、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖の非コラーゲンドメイン１（α３ＮＣ１）、ＡＤＡＭＴＳ１３、デスモグレイン－１／３、ＧＰＩｂ／ＩＸ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩａ／ＩＩａ、ＮＭＤＡ受容体、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、アンフィフィシン、またはガングリオシドＧＭ１、ＧＤ３もしくはＧＱ１Ｂに結合する抗体である、請求項２９に記載の方法。

【請求項32】

前記標的タンパク質が、神経変性疾患においてアップレギュレートまたは発現される、請求項２６に記載の方法。

【請求項33】

神経変性疾患においてアップレギュレートまたは発現される前記標的タンパク質が、α－シヌクレイン、アミロイドβまたは補体カスケード成分である、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記宿主細胞が、骨髄細胞、免疫細胞、内皮細胞、実質細胞、または上皮細胞である、請求項２６に記載の方法。

【請求項35】

前記免疫細胞が、樹状細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア細胞、顆粒球またはＢリンパ球である、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記宿主細胞が任意の細胞である、請求項２６に記載の方法。

【請求項37】

前記二機能性結合タンパク質が、異なる第２の部分を含む二機能性結合タンパク質の存在下での前記標的タンパク質の分解と比較して、前記標的タンパク質の分解を増強する、請求項２６に記載の方法。

【請求項38】

前記分解が、エンドサイトーシスまたはファゴサイトーシスによって媒介される、請求項２６に記載の方法。

【請求項39】

請求項１～２４のいずれか１項に記載の二機能性結合タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物。

【請求項40】

患者において疾患を治療または予防する方法であって、請求項１～２４のいずれか１項に記載の二機能性結合タンパク質、または請求項３９に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含む、前記方法。

【請求項41】

前記疾患が、自己免疫疾患、がんもしくは腫瘍、肝疾患、炎症性障害、または血液凝固障害である、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記自己免疫疾患が、ＭＯＧＡＤ（ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体関連疾患）、バセドウ病、重症筋無力症、抗ＧＢＭ疾患、免疫性血栓性血小板減少性紫斑病、尋常性後天性天疱瘡、免疫性血小板減少症、自己免疫性脳炎、及びギランバレー症候群から選択される、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記がんが、肺癌、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、悪性黒色腫、多発性骨髄腫、及びホジキンリンパ腫から選択される、請求項４１に記載の方法。

【請求項44】

治療が、標的タンパク質のエンドサイトーシスを媒介する条件下で前記二機能性結合タンパク質を投与することによって腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を再プログラミングすることを含む、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記標的タンパク質が、ＴＡＭにおいてアップレギュレートまたは発現される、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

ＴＡＭにおいてアップレギュレートまたは発現される前記標的タンパク質が、ＳＩＲＰα、ＣＣＲ２、ＣＳＦ－１Ｒ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＶＥＧＦ－Ｒ、ＣＸＣＲ４、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＣＳＦ－１またはＣＤ４７を含む、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記投与ステップが、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、経皮注射、または筋肉内注射を含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項48】

請求項１～２４のいずれか１項に記載の二機能性結合タンパク質、または請求項３９に記載の医薬組成物及び前記二機能性分子または前記医薬組成物をそれを必要とする個体に投与するための説明書を含む、キット。

【請求項49】

前記二機能性結合タンパク質または前記医薬組成物が、１つ以上の単位用量で存在する、請求項４８に記載のキット。

【請求項50】

二機能性結合タンパク質であって、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）下記の構造

【化2】

のＮ－グリカンを含み、
四角はＮ－アセチルグルコサミン残基を表し、黒い縞模様の円はマンノース残基を表し、Ｘは前記二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表し、前記Ｎ－グリカンが、１、２、３、４または５個のＮ－グリコシル化部位で前記二機能性結合タンパク質に連結される、前記二機能性結合タンパク質。

【請求項51】

前記グリカンが、Ｘに直接結合している前記Ｎ－アセチルグルコサミンにおいてフコース残基をさらに含む、請求項５０に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項52】

Ｘが、前記二機能性結合タンパク質中のアスパラギン残基である、請求項５０に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項53】

請求項５０に記載の二機能性結合タンパク質の集団であって、前記二機能性結合タンパク質の特定のアミノ酸位置における前記Ｎ－グリコシル化部位のうちの少なくとも１個について、前記集団のＮ－グリコシル化部位のうち少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または９９％が、請求項５０で特定されるＮ－グリカンでグリコシル化される、前記二機能性結合タンパク質の集団。

【請求項54】

前記Ｎ－グリコシル化部位が１つ以上のアスパラギン残基を含み、前記アスパラギン残基が標準コンセンサス配列のＮ－Ｘ－Ｓ／Ｔ、Ｎ－Ｘ－Ｃモチーフ、及び非標準コンセンサスモチーフ内にある、請求項５０または５３に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項55】

前記Ｎ－グリコシル化部位が、組換え工学によって前記二機能性タンパク質に導入される、請求項５０または５３に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項56】

前記組換え工学が、アミノ酸を付加すること、アミノ酸を欠失させること、アミノ酸を置換すること、またはグリコタグを付加することで実施される、請求項５５に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項57】

前記グリカンが請求項５０に記載の構造からなる、請求項５０または５３に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項58】

前記標的タンパク質が、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、αｖβ３インテグリン、ＣＥＡ、ＣＸＣＲ４、ＭＵＣ１、ＬＣＡＭ１、ＥｐｈＡ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＶＩＳＴＡ、Ｎｏｔｃｈ受容体、ＥＧＦ、ｃ－ＭＥＴ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、Ｗｎｔ、ＬＲＰ５／６、ＣＤ３８、ＣＤ７３、ＴＧＦ－β、ボンベシンＲ、ＣＡＩＸ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ｖ６、ＣＸＣＲ４、ＥｒｂＢ－２、Ｈｅｒ２、エムプリン、エンドグリン、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ－α、葉酸Ｒ、ＧＲＰ７８、ＩＧＦ－１Ｒ、マトリプターゼ、メソテリン、ｓＭＥＴ／ＨＧＦＲ、ＭＴ１－ＭＭＰ、ＭＴ６－ＭＭＰ、Ｍｕｃ－１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、Ｔｎ抗原、及びｕＰＡＲ、ＴＳＨＲα、ＡＣｈＲ－α１、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖の非コラーゲンドメイン１（α３ＮＣ１）、ＡＤＡＭＴＳ１３、デスモグレイン－１／３、またはＧＰＩｂ／ＩＸ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩａ／ＩＩａ、ＮＭＤＡ受容体、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、アンフィフィシン及びガングリオシドＧＭ１、ＧＤ３、ＧＱ１Ｂ、ＭＯＧ、ＳＩＲＰα、ＣＣＲ２、ＣＳＦ－１Ｒ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＶＥＧＦ－Ｒ、ＣＸＣＲ４、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＣＳＦ－１またはＣＤ４７を含む、請求項５０または５３に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項59】

前記二機能性タンパク質が、エンドサイトーシス炭水化物結合受容体に結合し、マンノース３受容体、分化クラスター２０６（ＣＤ２０６）受容体、ＤＣ－ＳＩＧＮ（分化クラスター２０９またはＣＤ２０９）受容体、Ｃ型レクチンドメインファミリー４メンバーＧ（ＬＳＥＣＴｉｎ）受容体、マクロファージ誘導性Ｃａ^２＋依存性レクチン受容体（Ｍｉｎｃｌｅ）に特異的に結合する、請求項５０または５３に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項60】

前記二機能性タンパク質が、前記Ｎ－グリカンを介して前記エンドサイトーシス炭水化物結合受容体に結合する、請求項５９に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項61】

前記Ｎ－グリカンが、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を認識する任意のエンドサイトーシス炭水化物結合受容体に特異的に結合する、請求項５０または５３に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項62】

前記二機能性結合タンパク質が抗体である、請求項５０または５３に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項63】

前記抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項６２に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項64】

前記抗体が組換え体である、請求項６２に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項65】

前記抗体が、重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含む、請求項５０または５３に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項66】

前記抗体がＦａｂ領域を含む、請求項５０または５３に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項67】

前記抗体がＦｃドメインを含む、請求項５０または５３に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項68】

前記抗体が、前記ＦｃドメインにＮ－グリコシル化部位を含み、前記Ｆｃドメインの前記Ｎ－グリコシル化部位に前記Ｎ－グリカンが連結される、請求項６２に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項69】

前記抗体が、前記重鎖可変領域及び／または前記軽鎖可変領域にＮ－グリコシル化部位を含み、前記重鎖可変領域及び／または前記軽鎖可変領域の前記Ｎ－グリコシル化部位に前記Ｎ－グリカンが連結される、請求項６２に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項70】

前記抗体が、所定の特定の残基でグリコシル化されている、請求項６２に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項71】

前記抗体が、２対１、４対１、６対１、８対１、または１０対１のグリカン対タンパク質の比を有する、請求項６２に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項72】

前記抗体が、所定の特定の残基でグリコシル化されている、請求項６２に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項73】

前記二機能性結合タンパク質が、自己抗原を含み、自己抗体に特異的に結合する、請求項５０または５３に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項74】

前記標的タンパク質が、細胞表面分子または非細胞表面分子である、請求項５０または５３に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項75】

前記細胞表面分子が受容体である、請求項７４に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項76】

前記非細胞表面分子が細胞外タンパク質である、請求項７４に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項77】

前記細胞外タンパク質が、自己抗体、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、血液タンパク質、または中枢神経系（ＣＮＳ）タンパク質である、請求項７６に記載の二機能性結合タンパク質。

【請求項78】

肝臓マクロファージに標的タンパク質を送達する方法であって、前記標的タンパク質のエンドサイトーシスを媒介する条件下で、前記標的タンパク質を請求項５０～７７のいずれか１項に記載の二機能性結合タンパク質と接触させる、前記方法。

【請求項79】

標的タンパク質を分解する方法であって、宿主細胞による前記標的タンパク質のリソソーム分解を媒介する条件下で、前記標的タンパク質を請求項５０～７７のいずれか１項に記載の二機能性結合タンパク質と接触させることを含む、前記方法。

【請求項80】

前記標的タンパク質が、がんにおいてアップレギュレートされるか、またはがんの進行に関与する、請求項７９に記載の方法。

【請求項81】

がんにおいてアップレギュレートされる、またはがんの進行に関与する前記標的タンパク質が、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦＲ ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、αｖβ３インテグリン、ＣＥＡ、ＣＸＣＲ４、ＭＵＣ１、ＬＣＡＭ１、ＥｐｈＡ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＶＩＳＴＡ、Ｎｏｔｃｈ受容体、ＥＧＦ、ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＬ２、ＣＣＲ２、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、Ｗｎｔ、ＬＲＰ５／６、ＣＳＦ－１Ｒ、ＳＩＲＰα、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＣＤ３８、ＣＤ７３、またはＴＧＦ－βを含む、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

前記標的タンパク質が自己免疫疾患の自己抗体である、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

前記標的タンパク質が自己免疫疾患の自己抗原である、請求項８１に記載の方法。

【請求項84】

前記自己免疫疾患の前記自己抗体が、ＭＯＧ、ＴＳＨＲα、ＡＣｈＲ－α１、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖の非コラーゲンドメイン１（α３ＮＣ１）、ＡＤＡＭＴＳ１３、デスモグレイン－１／３、ＧＰＩｂ／ＩＸ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩａ／ＩＩａ、ＮＭＤＡ受容体、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、アンフィフィシン、またはガングリオシドＧＭ１、ＧＤ３もしくはＧＱ１Ｂに結合する抗体である、請求項８２に記載の方法。

【請求項85】

前記標的タンパク質が、神経変性疾患においてアップレギュレートまたは発現される、請求項７９に記載の方法。

【請求項86】

神経変性疾患においてアップレギュレートまたは発現される前記標的タンパク質が、α－シヌクレイン、アミロイドβまたは補体カスケード成分である、請求項８５に記載の方法。

【請求項87】

前記宿主細胞が、骨髄細胞、免疫細胞、内皮細胞、実質細胞、または上皮細胞である、請求項７９に記載の方法。

【請求項88】

前記免疫細胞が、樹状細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア細胞、顆粒球またはＢリンパ球である、請求項８７に記載の方法。

【請求項89】

前記宿主細胞が任意の細胞である、請求項７９に記載の方法。

【請求項90】

前記二機能性結合タンパク質が、Ｎ－グリコシル化されていない二機能性結合タンパク質の存在下での前記標的タンパク質の分解と比較して、または請求項５０で特定されるＮ－グリカンとは異なるＮ－グリカンを含む二機能性結合タンパク質の存在下での前記標的タンパク質の分解と比較して、前記標的タンパク質の分解を増強する、請求項７９に記載の方法。

【請求項91】

前記分解が、エンドサイトーシスまたはファゴサイトーシスによって媒介される、請求項７９に記載の方法。

【請求項92】

請求項５０～７７のいずれか１項に記載の二機能性結合タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物。

【請求項93】

患者において疾患を治療または予防する方法であって、請求項５０～７７のいずれか１項に記載の二機能性結合タンパク質、または請求項９２に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含む、前記方法。

【請求項94】

前記疾患が、自己免疫疾患、がんもしくは腫瘍、肝疾患、炎症性障害、または血液凝固障害である、請求項９３に記載の方法。

【請求項95】

前記自己免疫疾患が、ＭＯＧＡＤ（ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体関連疾患）、バセドウ病、重症筋無力症、抗ＧＢＭ疾患、免疫性血栓性血小板減少性紫斑病、尋常性後天性天疱瘡、免疫性血小板減少症、自己免疫性脳炎、及びギランバレー症候群から選択される、請求項９４に記載の方法。

【請求項96】

前記がんが、急性リンパ芽球性白血病；急性リンパ芽球性リンパ腫；急性リンパ球性白血病；急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）；急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）（成人／小児）；副腎皮質癌；ＡＩＤＳ関連のがん；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星細胞腫；非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；胆管癌、肝外（胆管癌）；膀胱癌；骨の骨肉腫／悪性線維性組織球腫；脳腫瘍（成人／小児）；脳腫瘍、小脳星細胞腫（成人／小児）；脳腫瘍、大脳星細胞腫／悪性グリオーマ脳腫瘍；脳腫瘍、上衣腫；脳腫瘍、髄芽腫；脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍；脳腫瘍、視経路視床下部神経膠腫；脳幹グリオーマ；乳癌；気管支腺腫／カルチノイド；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；小児のがん；カルチノイド胃腸腫瘍；カルチノイド腫瘍；成人の癌腫、原発部位不明；原発不明の癌腫；中枢神経系胎児性腫瘍；中枢神経系リンパ腫、原発；子宮頸癌；小児副腎皮質癌；小児癌；小児大脳星細胞腫；脊索腫、小児；慢性リンパ性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性障害；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚Ｔ細胞リンパ腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；気腫；子宮内膜癌；上衣芽細胞腫；上衣腫；食道癌；ユーイングファミリー腫瘍のユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管癌；胆嚢癌；胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））癌；胃カルチノイド；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質腫瘍；胚細胞性腫瘍：頭蓋外、性腺外、または卵巣妊娠性絨毛性腫瘍；妊娠性絨毛性腫瘍、原発部位不明；神経膠腫；脳幹グリオーマ；神経膠腫、小児視経路及び視床下部；有毛細胞白血病；頭頸部癌；心臓癌；肝細胞性（肝臓）癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；視床下部及び視覚路神経膠腫；眼球内メラノーマ；膵島細胞癌（膵島）；カポジ肉腫；腎臓癌（腎細胞癌）；ランゲルハンス細胞組織球増加症；喉頭癌；口唇癌及び口腔癌；脂肪肉腫；肝癌（原発）；肺癌、非小細胞；肺癌、小細胞；リンパ腫、中枢神経系原発；マクログロブリン血症、ワルデンストレーム；男性乳癌；骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫；髄芽腫；髄様上皮腫；黒色腫；黒色腫、眼球内（眼）；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；中皮腫、成人悪性；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口のがん；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫／形質細胞系腫瘍；菌状息肉症、骨髄異形成症候群；骨髄異形成／骨髄増殖性疾患；骨髄性白血病、慢性；骨髄性白血病、成人急性；骨髄性白血病、小児急性；骨髄腫、多発性（骨髄のがん）；骨髄増殖性疾患、慢性；鼻腔及び副鼻腔癌；上咽頭癌；神経芽腫、非小細胞肺癌；非ホジキンリンパ腫；乏突起神経膠腫；口腔癌；口腔癌；中咽頭癌；骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫；卵巣癌；卵巣上皮癌（表層上皮性・間質性腫瘍）；卵巣胚細胞性腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵癌；膵癌、膵島細胞；乳頭腫症；副鼻腔及び鼻腔癌；副甲状腺癌；陰茎癌；咽頭癌；褐色細胞腫；松果体星状細胞腫；松果体胚腫；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍；下垂体腫瘍；下垂体腺腫；形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系リンパ腫；前立腺癌；直腸癌；腎細胞癌（腎臓癌）；腎孟・尿管、移行上皮癌；１５番染色体上のＮＵＴ遺伝子が関与する気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫、小児；唾液腺癌；肉腫、ユーイングファミリー腫瘍；セザリー症候群；皮膚癌（黒色腫）；皮膚癌（非黒色腫）；小細胞肺癌；小腸癌 軟部組織肉腫；軟部組織肉腫；脊髄腫瘍；扁平上皮癌；原発不明の頸部扁平上皮癌、転移性；胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；Ｔ細胞リンパ腫、皮膚（菌状息肉症及びセザリー症候群）；精巣癌；咽頭癌；胸腺腫；胸腺腫及び胸腺癌；甲状腺癌；小児甲状腺癌；腎孟・尿管の移行上皮癌；尿道癌；子宮癌、子宮内膜；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；またはウィルムス腫瘍から選択される、請求項９４に記載の方法。

【請求項97】

治療が、標的タンパク質のエンドサイトーシスを媒介する条件下で前記二機能性結合タンパク質を投与することによって腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を再プログラミングすることを含む、請求項９６に記載の方法。

【請求項98】

前記標的タンパク質が、ＴＡＭにおいてアップレギュレートまたは発現される、請求項９７に記載の方法。

【請求項99】

ＴＡＭにおいてアップレギュレートまたは発現される前記標的タンパク質が、ＳＩＲＰα、ＣＣＲ２、ＣＳＦ－１Ｒ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＶＥＧＦ－Ｒ、ＣＸＣＲ４、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＣＳＦ－１またはＣＤ４７を含む、請求項９８に記載の方法。

【請求項100】

前記投与ステップが、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、経皮注射、または筋肉内注射を含む、請求項９３に記載の方法。

【請求項101】

請求項５０～７７のいずれか１項に記載の二機能性結合タンパク質、または請求項９２に記載の医薬組成物及び前記二機能性分子または前記医薬組成物をそれを必要とする個体に投与するための説明書を含む、キット。

【請求項102】

前記二機能性結合タンパク質または前記医薬組成物が、１つ以上の単位用量で存在する、請求項１０１に記載のキット。

【請求項103】

標的タンパク質のレベル上昇を伴う急性症状を治療する方法であって、治療を必要とする患者に、先行請求項のいずれか１項に記載の二機能性結合タンパク質を投与することを含み、前記二機能性結合タンパク質が、（ｉ）前記標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）下記の構造

【化3】

を有するＮ－グリカンを含み、
四角はＮ－アセチルグルコサミン残基を表し、黒い縞模様の円はマンノース残基を表し、Ｘは前記二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表し、前記Ｎ－グリカンが前記二機能性結合タンパク質に多数のＮ－グリコシル化部位で連結され、これにより、前記標的タンパク質の半減期が、患者への前記二機能性結合タンパク質の投与後に前記患者において最大５分、１５分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、もしくは６時間となるか、または前記標的タンパク質の半減期が、任意の治療の非存在下での前記患者における前記標的タンパク質の前記半減期の最大１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、もしくは最大９０％となる、前記方法。

【請求項104】

前記グリカンが、Ｘに直接結合している前記Ｎ－アセチルグルコサミンにおいてフコース残基をさらに含む、請求項１０３に記載の方法。

【請求項105】

Ｘが、前記二機能性結合タンパク質中のアスパラギン残基である、請求項１０３に記載の方法。

【請求項106】

前記二機能性タンパク質が、３つ以上のＮ－グリコシル化部位において前記Ｎ－グリカンを担持する、請求項１０３に記載の方法。

【請求項107】

標的タンパク質のレベル上昇を伴う慢性症状を治療する方法であって、治療を必要とする患者に、先行請求項のいずれか１項に記載の二機能性結合タンパク質を投与することを含み、前記二機能性結合タンパク質が、（ｉ）前記標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）下記の構造

【化4】

を有するＮ－グリカンを含み、
四角はＮ－アセチルグルコサミン残基を表し、黒い縞模様の円はマンノース残基を表し、Ｘは前記二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表し、前記Ｎ－グリカンが前記二機能性結合タンパク質に多数のＮ－グリコシル化部位で連結され、これにより、前記標的タンパク質の半減期が、前記患者において少なくとも１日、２日、３日、もしくは４日となるか、または前記標的タンパク質の半減期が、前記患者におけるグリコシル化されていない前記二機能性結合タンパク質の前記半減期の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは少なくとも９５％となる、前記方法。

【請求項108】

前記グリカンが、Ｘに直接結合している前記Ｎ－アセチルグルコサミンにおいてフコース残基をさらに含む、請求項１０７に記載の方法。

【請求項109】

Ｘが、前記二機能性結合タンパク質中のアスパラギン残基である、請求項１０７に記載の方法。

【請求項110】

前記二機能性タンパク質が、２つ以下のＮ－グリコシル化部位において前記Ｎ－グリカンを担持する、請求項１０７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

１．関連出願の相互参照
本願は、２０２１年３月２３日に出願された米国仮出願第６３／１６４，９９１号の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

２．技術分野
本発明は一般に、マンノース３グリコシル化を有する二機能性結合タンパク質及びそのリソソーム標的化に関する。

【背景技術】

【0003】

３．背景技術
炭水化物結合受容体とグリカンの結合により、さまざまな生物学的経路を可能にする。グリカンと受容体の相互作用は、グリカンの構造によって決定される。これらの重要な生物学的経路は、免疫応答の調節、タンパク質排除の媒介、タンパク質代謝回転、ならびに可溶性糖タンパク質、糖脂質及びまたはグリカン部分を含む任意の天然分子の輸送の制御に関与している。

【0004】

エンドサイトーシスレクチンは、特定のグリカン構造を介してグリコシル化タンパク質を捕捉して分解を媒介することにより、受容体媒介エンドサイトーシスに関与している。エンドサイトーシスレクチンは、人間の体内に遍在しており、さまざまなグリカン構造を認識できる。例えば、Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｄ．；ＭｃＥｖｅｒ，Ｒｏｄｇｅｒ Ｐ．（Ｅｄｓ．）（２０１７）：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ［インターネット］．３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ［８］を参照のこと。グリカン及びそれらの受容体についての追加の背景は、参考文献［９］～［１２］に記載されている。

【0005】

炭水化物結合受容体は非常に多様であり、糖鎖工学によって利用して、炎症、血液疾患、自己免疫、がんなどを含むがこれらに限定されないさまざまな疾患に対して前例のない有効性をもつ新規治療薬を開発できる。これにより、グリカン媒介タンパク質分解の概念に基づく新規治療薬の開発が可能になる。ケモカイン、サイトカイン、ポリペプチドまたはモノクローナル抗体などの任意のタンパク質の部位特異的グリコシル化によるヒトグリカン媒介タンパク質分解を利用することで、新規治療法が得られる可能性がある。現在までのところ、タンパク質上に構築されたＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２などのＭａｎ３を含むグリカンが、マンノースまたは受容体を認識するレクチンにどの程度効率的に結合し、リソソーム分解を媒介できるのかは記載されていない。本発明は、特定のグリカン媒介タンパク質分解に関する新規な発見を示す。

【0006】

本明細書で提供される組成物及び方法は、現在の標準治療で治療されるがん、自己免疫疾患、及び炎症性疾患などのさまざまな難治性疾患に苦しむ患者の満たされていない医療ニーズに対処する。

【発明の概要】

【0007】

４．発明の概要
一態様では、標的タンパク質に特異的に結合する第１の部分と、下記の構造

【化1】

を含むグリカンを含む第２の部分と、を含む二機能性結合タンパク質が本明細書で提供され、
四角はＮ－アセチルグルコサミン残基を表し、黒い縞模様の円はマンノース残基を表し、Ｘは二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表す。いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質のＮ－グリカン部分は、マンノトリオース－ジ－（Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン）（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）、すなわち、本段落に示されるマンノース３グリカン構造からなる。

【0008】

特定の実施形態では、本明細書で提供される二機能性タンパク質は、マンノース３構造を有するＮ－グリカンを末端グリカンとして含む。具体的には、Ｎ－グリカンのＧｌｃＮＡｃ２部分上のＮ－グリカンの任意の分岐構造も含まれ得る。例えば、Ｘに直接連結されているＧｌｃＮａｃはフコシル化され得る。本願で使用される場合、「マンノース３構造」または「Ｍａｎ３構造」または「Ｍ３構造」という用語は、３つの末端マンノース残基を有するＮ－グリカンを指す。

【0009】

いくつかの実施形態では、第１の部分が特異的に結合する標的タンパク質は、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、αｖβ３インテグリン、ＣＥＡ、ＣＸＣＲ４、ＭＵＣ１、ＬＣＡＭ１、ＥｐｈＡ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＶＩＳＴＡ、Ｎｏｔｃｈ受容体、ＥＧＦ、ｃ－ＭＥＴ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、Ｗｎｔ、ＬＲＰ５／６、ＣＤ３８、ＣＤ７３、ＴＧＦ－β、ボンベシンＲ、ＣＡＩＸ、ＣＤ１３、ＣＤ４４ｖ６、エムプリン、エンドグリン、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ－α、葉酸Ｒ、ＧＲＰ７８、ＩＧＦ－１Ｒ、マトリプターゼ、メソテリン、ｓＭＥＴ／ＨＧＦＲ、ＭＴ１－ＭＭＰ、ＭＴ６－ＭＭＰ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、Ｔｎ抗原、及びｕＰＡＲ、ＴＳＨＲα、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ＡＣｈＲ－α１、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖の非コラーゲンドメイン１（α３ＮＣ１）、ＡＤＡＭＴＳ１３、デスモグレイン－１／３、またはＧＰＩｂ／ＩＸ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩａ／ＩＩａ、ＮＭＤＡ受容体、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、アンフィフィシン及びガングリオシドＧＭ１、ＧＤ３、ＧＱ１Ｂ、ＳＩＲＰα、ＣＣＲ２、ＣＳＦ－１Ｒ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＶＥＧＦ－Ｒ、ＣＸＣＲ４、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＣＳＦ－１またはＣＤ４７を含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、第２の部分は、マンノース３受容体、分化クラスター２０６（ＣＤ２０６）受容体、ＤＣ－ＳＩＧＮ（分化クラスター２０９またはＣＤ２０９）受容体、Ｃ型レクチンドメインファミリー４メンバーＧ（ＬＳＥＣＴｉｎ）受容体、またはマクロファージ誘導性Ｃａ^２＋依存性レクチン受容体（Ｍｉｎｃｌｅ）に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質の第２の部分は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を認識する任意のエンドサイトーシス炭水化物結合受容体に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質の第２の部分は、ランゲリン、マクロファージマンノース２受容体、デクチン－１、デクチン－２、ＢＤＣＡ－２、ＤＣＩＲ、ＭＢＬ、ＭＤＬ、ＭＩＣＬ、ＣＬＥＣ２、ＤＮＧＲ１、ＣＬＥＣ１２Ｂ、ＤＥＣ－２０５、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＰＧＲ）、及びマンノース６リン酸受容体に特異的に結合する。

【0011】

いくつかの実施形態では、第２の部分はグリカン構造を含む。いくつかの実施形態では、グリカン構造はマンノース３である。

【0012】

いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質の第１の部分は、重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質の第１の部分は、モノクローナル抗体のＦａｂ領域を含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質は抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は組換え体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、または完全ヒト抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、２対１、４対１、６対１、８対１、または１０対１のグリカン対タンパク質の比を有する。

【0014】

いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質は、所定の特定の残基でグリコシル化されている。

【0015】

いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質は自己抗原である。

【0016】

いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質のグリカンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％がマンノース３グリカン構造を有する。

【0017】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、細胞表面分子または非細胞表面分子である。いくつかの実施形態では、細胞表面分子は受容体である。いくつかの実施形態では、非細胞表面分子は細胞外タンパク質である。いくつかの実施形態では、細胞外タンパク質は、自己抗体、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、血液タンパク質、または中枢神経系（ＣＮＳ）タンパク質である。

【0018】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、第１の部分によって結合される。

【0019】

一態様では、肝マクロファージ、例えば、肝臓常在性クッパー細胞（ＫＣ）及び／または肝臓類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）及び／または単球由来マクロファージ（ＭｏＭφ）の、エンドソームに標的タンパク質を送達する方法が本明細書で提供され、標的タンパク質のエンドサイトーシスを媒介する条件下で、標的タンパク質を本明細書に記載の二機能性結合タンパク質と接触させることを含む。

【0020】

一態様では、標的タンパク質を分解する方法が本明細書で提供され、宿主細胞による標的タンパク質のリソソーム分解を媒介する条件下で、標的タンパク質を本明細書に記載の二機能性結合タンパク質と接触させることを含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、がんにおいてアップレギュレートされるか、またはがんの進行に関与する。

【0022】

いくつかの実施形態では、がんにおいてアップレギュレートされる、またはがんの進行に関与する標的タンパク質は、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦＲ ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、αｖβ３インテグリン、ＣＥＡ、ＣＸＣＲ４、ＭＵＣ１、ＬＣＡＭ１、ＥｐｈＡ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＶＩＳＴＡ、Ｎｏｔｃｈ受容体、ＥＧＦ、ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＬ２、ＣＣＲ２、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、Ｗｎｔ、ＬＲＰ５／６、ＣＳＦ－１Ｒ、ＳＩＲＰα、ＣＤ３８、ＣＤ７３、ＬＩＬＲＢ２またはＴＧＦ－βを含む。

【0023】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、自己免疫疾患の自己抗体である。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、自己免疫疾患の自己抗原である。

【0024】

いくつかの実施形態では、自己免疫疾患の自己抗体は、ＴＳＨＲα、ＭＯＧ（ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質）、ＡＣｈＲ－α１、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖の非コラーゲンドメイン１（α３ＮＣ１）、ＡＤＡＭＴＳ１３、デスモグレイン－１／３、ＧＰＩｂ／ＩＸ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩａ／ＩＩａ、ＮＭＤＡ受容体、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、アンフィフィシン、またはガングリオシドＧＭ１、ＧＤ３もしくはＧＱ１Ｂに結合する抗体である。

【0025】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、神経変性疾患においてアップレギュレートまたは発現される。いくつかの実施形態では、神経変性疾患においてアップレギュレートまたは発現される標的タンパク質は、α－シヌクレイン、アミロイドβ、補体カスケード成分であるか、または全身性アミロイドーシスでは、凝集したミスフォールド軽鎖もしくは凝集しミスフォールドしたトランスサイレチンの蓄積である。

【0026】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）においてアップレギュレートまたは発現される。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、腫瘍微小環境におけるＴＡＭの動員に関連している。他の実施形態では、標的タンパク質は、腫瘍微小環境におけるＴＡＭの枯渇に関連している。さらなる実施形態では、標的タンパク質は、腫瘍微小環境におけるＴＡＭの再プログラミングに関連している。

【0027】

いくつかの実施形態では、ＴＡＭに関連する標的タンパク質は、ＳＩＲＰα、ＣＣＲ２、ＣＳＦ－１Ｒ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＶＥＧＦ－Ｒ、またはＣＸＣＲ４を含む。他の実施形態では、ＴＡＭに関連する標的タンパク質は、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＣＳＦ－１またはＣＤ４７を含む。

【0028】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、骨髄細胞、免疫細胞、内皮細胞、実質細胞、または上皮細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、樹状細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア細胞、顆粒球またはＢリンパ球である。

【0029】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、任意の細胞である。

【0030】

いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質は、異なる第２の部分を含む二機能性結合タンパク質の存在下での標的タンパク質の分解と比較して、標的タンパク質の分解を増強する。

【0031】

いくつかの実施形態では、分解は、エンドサイトーシスまたはファゴサイトーシスによって媒介される。

【0032】

一態様では、本明細書に記載の二機能性結合タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が本明細書で提供される。

【0033】

一態様では、患者において疾患を治療または予防する方法であって、本明細書に記載の二機能性結合タンパク質、または本明細書に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む方法が本明細書で提供される。

【0034】

いくつかの実施形態では、疾患は、自己免疫疾患、がんもしくは腫瘍、肝疾患、炎症性障害、または血液凝固障害である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、バセドウ病、重症筋無力症、抗ＧＢＭ疾患、免疫性血栓性血小板減少性紫斑病、尋常性後天性天疱瘡、免疫性血小板減少症、自己免疫性脳炎、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体関連疾患（ＭＯＧＡＤ）、膜性腎症、全身性アミロイドーシス、及びギランバレー症候群から選択される。

【0035】

いくつかの実施形態では、投与ステップは、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、経皮注射、または筋肉内注射を含む。

【0036】

一態様では、本明細書に記載の二機能性結合タンパク質、または本明細書に記載の医薬組成物、及び二機能性分子または医薬組成物をそれを必要とする個体に投与するための説明書を含む、キットが本明細書で提供される。

【0037】

いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質または医薬組成物は、１つ以上の単位用量で存在する。

【0038】

いくつかの実施形態では、グリカンは、Ｘに直接結合しているＮ－アセチルグルコサミンにおいてフコース残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｘは、二機能性結合タンパク質中のアスパラギン残基である。

【0039】

一態様では、二機能性結合タンパク質が本明細書で提供され、二機能性結合タンパク質は、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）下記の構造

【化2】

のＮ－グリカンを含み、

【0040】

四角はＮ－アセチルグルコサミン残基を表し、黒い縞模様の円はマンノース残基を表し、Ｘは二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表し、Ｎ－グリカンが、１、２、３、４または５個のＮ－グリコシル化部位で二機能性結合タンパク質に連結される。

【0041】

いくつかの実施形態では、グリカンは、Ｘに直接結合しているＮ－アセチルグルコサミンにおいてフコース残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｘは、二機能性結合タンパク質中のアスパラギン残基である。

【0042】

一態様では、二機能性結合タンパク質の集団が本明細書で提供され、二機能性結合タンパク質の特定のアミノ酸位置におけるＮ－グリコシル化部位のうちの少なくとも１個について、集団のＮ－グリコシル化部位のうち少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または９９％が、マンノース３Ｎ－グリカン構造でグリコシル化される。

【0043】

いくつかの実施形態では、Ｎ－グリコシル化部位は、１つ以上のアスパラギン残基を含み、アスパラギン残基は、標準コンセンサス配列Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ、Ｎ－Ｘ－Ｃモチーフ（Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸であり得る）、及び非標準コンセンサスモチーフ内にある。

【0044】

いくつかの実施形態では、Ｎ－グリコシル化部位は、組換え工学によって二機能性タンパク質に導入される。

【0045】

いくつかの実施形態では、組換え工学は、アミノ酸を付加すること、アミノ酸を欠失させること、アミノ酸を置換すること、またはグリコタグを付加することで実施される。いくつかの実施形態では、グリカンはマンノース３Ｎ－グリカン構造からなる。

【0046】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、αｖβ３インテグリン、ＣＥＡ、ＣＸＣＲ４、ＭＵＣ１、ＬＣＡＭ１、ＥｐｈＡ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＶＩＳＴＡ、Ｎｏｔｃｈ受容体、ＥＧＦ、ｃ－ＭＥＴ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、Ｗｎｔ、ＬＲＰ５／６、ＣＤ３８、ＣＤ７３、ＴＧＦ－β、ボンベシンＲ、ＣＡＩＸ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ｖ６、ＣＸＣＲ４、ＥｒｂＢ－２、Ｈｅｒ２、エムプリン、エンドグリン、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ－α、葉酸Ｒ、ＧＲＰ７８、ＩＧＦ－１Ｒ、マトリプターゼ、メソテリン、ｓＭＥＴ／ＨＧＦＲ、ＭＴ１－ＭＭＰ、ＭＴ６－ＭＭＰ、Ｍｕｃ－１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、Ｔｎ抗原、及びｕＰＡＲ、ＴＳＨＲα、ＡＣｈＲ－α１、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖の非コラーゲンドメイン１（α３ＮＣ１）、ＡＤＡＭＴＳ１３、デスモグレイン－１／３、またはＧＰＩｂ／ＩＸ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩａ／ＩＩａ、ＮＭＤＡ受容体、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、アンフィフィシン及びガングリオシドＧＭ１、ＧＤ３、ＧＱ１Ｂ、ＭＯＧ、ＳＩＲＰα、ＣＣＲ２、ＣＳＦ－１Ｒ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＶＥＧＦ－Ｒ、ＣＸＣＲ４、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＣＳＦ－１またはＣＤ４７を含む。

【0047】

いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は、エンドサイトーシス炭水化物結合受容体に結合し、マンノース３受容体、分化クラスター２０６（ＣＤ２０６）受容体、ＤＣ－ＳＩＧＮ（分化クラスター２０９またはＣＤ２０９）受容体、Ｃ型レクチンドメインファミリー４メンバーＧ（ＬＳＥＣＴｉｎ）受容体、マクロファージ誘導性Ｃａ^２＋依存性レクチン受容体（Ｍｉｎｃｌｅ）に特異的に結合する。

【0048】

いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は、Ｎ－グリカンを介してエンドサイトーシス炭水化物結合受容体に結合する。いくつかの実施形態では、Ｎ－グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を認識する任意のエンドサイトーシス炭水化物結合受容体に特異的に結合する。

【0049】

いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質は抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は組換え体である。いくつかの実施形態では、抗体は、重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆａｂ領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆｃドメインを含む。

【0050】

いくつかの実施形態では、抗体は、ＦｃドメインにＮ－グリコシル化部位を含み、ＦｃドメインのＮ－グリコシル化部位にＮ－グリカンが連結される。いくつかの実施形態では、抗体は、重鎖可変領域及び／または軽鎖可変領域にＮ－グリコシル化部位を含み、重鎖可変領域及び／または軽鎖可変領域のＮ－グリコシル化部位にＮ－グリカンが連結される。

【0051】

いくつかの実施形態では、抗体は、所定の特定の残基でグリコシル化されている。

【0052】

いくつかの実施形態では、抗体は、２対１、４対１、６対１、８対１、または１０対１のグリカン対タンパク質の比を有する。

【0053】

いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質は、自己抗原を含み、自己抗体に特異的に結合する。

【0054】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、細胞表面分子または非細胞表面分子である。いくつかの実施形態では、細胞表面分子は受容体である。いくつかの実施形態では、非細胞表面分子は細胞外タンパク質である。

【0055】

いくつかの実施形態では、細胞外タンパク質は、自己抗体、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、血液タンパク質、または中枢神経系（ＣＮＳ）タンパク質である。

【0056】

一態様では、肝臓マクロファージに標的タンパク質を送達する方法、すなわち、標的タンパク質のエンドサイトーシスを媒介する条件下で、標的タンパク質を本明細書に記載の二機能性結合タンパク質と接触させることが本明細書で提供される。

【0057】

一態様では、標的タンパク質を分解する方法が本明細書で提供され、宿主細胞による標的タンパク質のリソソーム分解を媒介する条件下で、標的タンパク質を本明細書に記載の二機能性結合タンパク質と接触させることを含む。

【0058】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、がんにおいてアップレギュレートされるか、またはがんの進行に関与する。いくつかの実施形態では、がんにおいてアップレギュレートされる、またはがんの進行に関与する標的タンパク質は、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦＲ ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、αｖβ３インテグリン、ＣＥＡ、ＣＸＣＲ４、ＭＵＣ１、ＬＣＡＭ１、ＥｐｈＡ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＶＩＳＴＡ、Ｎｏｔｃｈ受容体、ＥＧＦ、ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＬ２、ＣＣＲ２、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、Ｗｎｔ、ＬＲＰ５／６、ＣＳＦ－１Ｒ、ＳＩＲＰα、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＣＤ３８、ＣＤ７３、またはＴＧＦ－βを含む。

【0059】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、自己免疫疾患の自己抗体である。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、自己免疫疾患の自己抗原である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患の自己抗体は、ＭＯＧ、ＴＳＨＲα、ＡＣｈＲ－α１、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖の非コラーゲンドメイン１（α３ＮＣ１）、ＡＤＡＭＴＳ１３、デスモグレイン－１／３、ＧＰＩｂ／ＩＸ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩａ／ＩＩａ、ＮＭＤＡ受容体、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、アンフィフィシン、またはガングリオシドＧＭ１、ＧＤ３もしくはＧＱ１Ｂに結合する抗体である。

【0060】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、神経変性疾患においてアップレギュレートまたは発現される。いくつかの実施形態では、神経変性疾患においてアップレギュレートまたは発現される標的タンパク質は、α－シヌクレイン、アミロイドβまたは補体カスケード成分である。

【0061】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、骨髄細胞、免疫細胞、内皮細胞、実質細胞、または上皮細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、樹状細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア細胞、顆粒球またはＢリンパ球である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、任意の細胞である。

【0062】

いくつかの実施形態では、当該二機能性結合タンパク質は、Ｎ－グリコシル化されていない二機能性結合タンパク質の存在下での標的タンパク質の分解と比較して、またはマンノース３Ｎ－グリカン構造とは異なるＮ－グリカンを含む二機能性結合タンパク質の存在下での標的タンパク質の分解と比較して、標的タンパク質の分解を増強する。いくつかの実施形態では、当該分解は、エンドサイトーシスまたはファゴサイトーシスによって媒介される。

【0063】

一態様では、本明細書に記載の二機能性結合タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が本明細書で提供される。

【0064】

一態様では、患者において疾患を治療または予防する方法であって、本明細書に記載の二機能性結合タンパク質、または本明細書に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む方法が本明細書で提供される。

【0065】

いくつかの実施形態では、疾患は、自己免疫疾患、がんもしくは腫瘍、肝疾患、炎症性障害、または血液凝固障害である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、ＭＯＧＡＤ（ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体関連疾患）、バセドウ病、重症筋無力症、抗ＧＢＭ疾患、免疫性血栓性血小板減少性紫斑病、尋常性後天性天疱瘡、免疫性血小板減少症、自己免疫性脳炎、及びギランバレー症候群から選択される。

【0066】

いくつかの実施形態では、がんは、急性リンパ芽球性白血病；急性リンパ芽球性リンパ腫；急性リンパ球性白血病；急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）；急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）（成人／小児）；副腎皮質癌；ＡＩＤＳ関連のがん；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星細胞腫；非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；胆管癌、肝外（胆管癌）；膀胱癌；骨の骨肉腫／悪性線維性組織球腫；脳腫瘍（成人／小児）；脳腫瘍、小脳星細胞腫（成人／小児）；脳腫瘍、大脳星細胞腫／悪性グリオーマ脳腫瘍；脳腫瘍、上衣腫；脳腫瘍、髄芽腫；脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍；脳腫瘍、視経路視床下部神経膠腫；脳幹グリオーマ；乳癌；気管支腺腫／カルチノイド；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；小児のがん；カルチノイド胃腸腫瘍；カルチノイド腫瘍；成人の癌腫、原発部位不明；原発不明の癌腫；中枢神経系胎児性腫瘍；中枢神経系リンパ腫、原発；子宮頸癌；小児副腎皮質癌；小児癌；小児大脳星細胞腫；脊索腫、小児；慢性リンパ性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性障害；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚Ｔ細胞リンパ腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；気腫；子宮内膜癌；上衣芽細胞腫；上衣腫；食道癌；ユーイングファミリー腫瘍のユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管癌；胆嚢癌；胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））癌；胃カルチノイド；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質腫瘍；胚細胞性腫瘍：頭蓋外、性腺外、または卵巣妊娠性絨毛性腫瘍；妊娠性絨毛性腫瘍、原発部位不明；神経膠腫；脳幹グリオーマ；神経膠腫、小児視経路及び視床下部；有毛細胞白血病；頭頸部癌；心臓癌；肝細胞性（肝臓）癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；視床下部及び視覚路神経膠腫；眼球内メラノーマ；膵島細胞癌（膵島）；カポジ肉腫；腎臓癌（腎細胞癌）；ランゲルハンス細胞組織球増加症；喉頭癌；口唇癌及び口腔癌；脂肪肉腫；肝癌（原発）；肺癌、非小細胞；肺癌、小細胞；リンパ腫、中枢神経系原発；マクログロブリン血症、ワルデンストレーム；男性乳癌；骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫；髄芽腫；髄様上皮腫；黒色腫；黒色腫、眼球内（眼）；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；中皮腫、成人悪性；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口のがん；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫／形質細胞系腫瘍；菌状息肉症、骨髄異形成症候群；骨髄異形成／骨髄増殖性疾患；骨髄性白血病、慢性；骨髄性白血病、成人急性；骨髄性白血病、小児急性；骨髄腫、多発性（骨髄のがん）；骨髄増殖性疾患、慢性；鼻腔及び副鼻腔癌；上咽頭癌；神経芽腫、非小細胞肺癌；非ホジキンリンパ腫；乏突起神経膠腫；口腔癌；口腔癌；中咽頭癌；骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫；卵巣癌；卵巣上皮癌（表層上皮性・間質性腫瘍）；卵巣胚細胞性腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵癌；膵癌、膵島細胞；乳頭腫症；副鼻腔及び鼻腔癌；副甲状腺癌；陰茎癌；咽頭癌；褐色細胞腫；松果体星状細胞腫；松果体胚腫；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍；下垂体腫瘍；下垂体腺腫；形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系リンパ腫；前立腺癌；直腸癌；腎細胞癌（腎臓癌）；腎孟・尿管、移行上皮癌；１５番染色体上のＮＵＴ遺伝子が関与する気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫、小児；唾液腺癌；肉腫、ユーイングファミリー腫瘍；セザリー症候群；皮膚癌（黒色腫）；皮膚癌（非黒色腫）；小細胞肺癌；小腸癌 軟部組織肉腫；軟部組織肉腫；脊髄腫瘍；扁平上皮癌；原発不明の頸部扁平上皮癌、転移性；胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；Ｔ細胞リンパ腫、皮膚（菌状息肉症及びセザリー症候群）；精巣癌；咽頭癌；胸腺腫；胸腺腫及び胸腺癌；甲状腺癌；小児甲状腺癌；腎孟・尿管の移行上皮癌；尿道癌；子宮癌、子宮内膜；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；またはウィルムス腫瘍から選択される。

【0067】

いくつかの実施形態では、治療は、標的タンパク質のエンドサイトーシスを媒介する条件下で二機能性結合タンパク質を投与することによって腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を再プログラミングすることを含む。

【0068】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＴＡＭにおいてアップレギュレートまたは発現される。いくつかの実施形態では、ＴＡＭにおいてアップレギュレートまたは発現される標的タンパク質は、ＳＩＲＰα、ＣＣＲ２、ＣＳＦ－１Ｒ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＶＥＧＦ－Ｒ、ＣＸＣＲ４、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＣＳＦ－１またはＣＤ４７を含む。

【0069】

いくつかの実施形態では、投与ステップは、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、経皮注射、または筋肉内注射を含む。

【0070】

一態様では、本明細書に記載の二機能性結合タンパク質、または本明細書に記載の医薬組成物、及び二機能性分子または医薬組成物をそれを必要とする個体に投与するための説明書を含む、キットが本明細書で提供される。

【0071】

いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質または医薬組成物は、１つ以上の単位用量で存在する。

【0072】

一態様では、本明細書で提供されるのは、標的タンパク質のレベル上昇を伴う急性症状を治療する方法であって、この方法は、それを必要とする患者に先行請求項のいずれか１項に記載の二機能性結合タンパク質を投与することを含み、二機能性結合タンパク質は、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）下記の構造

【化3】

を有するＮ－グリカンを含み、

【0073】

四角はＮ－アセチルグルコサミン残基を表し、黒い縞模様の円はマンノース残基を表し、Ｘは二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表し、Ｎ－グリカンは、多数のＮ－グリコシル化部位で二機能性結合タンパク質に連結され、標的タンパク質の半減期が最大５分、１５分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、もしくは６時間となるか、または標的タンパク質の半減期が、任意の治療の非存在下での患者における標的タンパク質の半減期の最大１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、もしくは最大９０％となる。

【0074】

いくつかの実施形態では、グリカンは、Ｘに直接結合しているＮ－アセチルグルコサミンにおいてフコース残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｘは、二機能性結合タンパク質中のアスパラギン残基である。

【0075】

いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は、３つ以上のＮ－グリコシル化部位においてＮ－グリカンを担持する。

【0076】

一態様では、本明細書で提供されるのは、標的タンパク質のレベル上昇を伴う急性症状を治療する方法であって、この方法は、それを必要とする患者に先行請求項のいずれか１項に記載の二機能性結合タンパク質を投与することを含み、二機能性結合タンパク質は、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）下記の構造

【化4】

を有するＮ－グリカンを含み、

【0077】

四角はＮ－アセチルグルコサミン残基を表し、黒い縞模様の円はマンノース残基を表し、Ｘは二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表し、Ｎ－グリカンは、多数のＮ－グリコシル化部位で二機能性結合タンパク質に連結され、標的タンパク質の半減期が少なくとも１日、２日、３日、もしくは４日となるか、または標的タンパク質の半減期が、患者におけるグリコシル化されていない二機能性結合タンパク質の半減期の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは少なくとも９５％となる。

【0078】

いくつかの実施形態では、グリカンは、Ｘに直接結合しているＮ－アセチルグルコサミンにおいてフコース残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｘは、二機能性結合タンパク質中のアスパラギン残基である。

【0079】

いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は、２つ以下のＮ－グリコシル化部位においてＮ－グリカンを担持する。

【図面の簡単な説明】

【0080】

５．図面の簡単な説明

【図1】Ｆａｂ上に提示されるＭａｎ３グリカンは、マクロファージに高度に内部移行されることを示す。マクロファージを取得し、ｐＨｒｏｄｏ標識抗体とともに３時間インキュベートした。グラフは、Ｈｕｍｉｒａ（Ｈ－Ａ２Ｆ）を基準として正規化されたｐＨｒｏｄｏの平均平均蛍光強度（ＭＦＩ）±平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。各ポイントは、個々のドナーの値を示す。Ｈ－ＰＮＧａｓｅ（Ｎ＝２）を除く各条件につき少なくとも３ドナー。

【0081】

【図2】抗体上のＭａｎ３グリカンは、ヒト樹状細胞において高い内部移行及びリソソーム区画標的化をもたらす。内部移行は、Ｆｃγ受容体からは独立している。ヒト単球由来樹状細胞を５人の異なるＰＢＭＣドナーから得た。グラフは、Ｎ＝５の個々のドナーからの平均ｐＨｒｏｄｏ ＭＦＩ±標準偏差（ＳＤ）を示す。Ａｂなしは、ｐＨｒｏｄｏ標識抗体を何も加えなかったことを示し、他のすべての条件は、ｐＨｒｏｄｏ標識抗体を１０μｇ／ｍｌで加えたことを示す。ＭｂＴ：対照抗体として使用されたＭａｂｔｈｅｒａ。Ａ－Ｍ：Ｍａｎ３－アダリムマブ。Ａ－Ｓ：シアル化アダリムマブ。Ｈ－Ｍ：ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）（アダリムマブ）。Ｈ－Ｓ：シアル化ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）（アダリムマブ）。＋ＦｃＲブロッキングは、ｐＨｒｏｄｏ標識抗体を加える前にＦｃγ受容体ブロッキング剤Ｈｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸを加えたことを示す。

【0082】

【図3】Ａ及びＢは、Ｆａｂ上に提示されるＭａｎ３グリカンが樹状細胞に高度に内部移行されることを示す。樹状細胞を２人のＰＢＭＣドナーから得た。樹状細胞をｐＨｒｏｄｏ標識抗体とともに６時間インキュベートした。Ａ：Ｈ－Ａ２Ｆ及びＡ８４８６－Ｍ３の条件の高ｐＨｒｏｄｏの集団のゲーティングの例。高ｐＨｒｏｄｏのゲートされた細胞は黒である。Ｂ：グラフは、各ドナーの高ｐＨｒｏｄｏの細胞（Ａに示すようにゲートされている）のパーセンテージを示す。

【0083】

【図4】マンノース３が、ＣＤ２０６などのマンノース結合受容体及びレクチンによって認識される概略図。

【0084】

【図5】分化後のマクロファージの表現型を示す。マクロファージは、ＣＤ１４＋ ＣＤ１６３＋ ＣＤ１ａ－ ＣＤ２０６＋であった。フローサイトメトリーのプロットは、１つの代表的な培養物からのマーカー発現を示す。右のグラフは、ＣＤ２０６＋マクロファージのパーセンテージが、ドナー間及び実験間で一定であることを示す。各ポイントは、１人の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）ドナーからのデータを表す。

【0085】

【図6】Ａ及びＢは、Ｆａｂ上にＭ３構造を提示する抗体が、ＣＤ２０６発現マクロファージにより特異的に内部移行されることを示す。マクロファージを、ｐＨｒｏｄｏ標識抗体とともに３時間（Ａ）または２４時間（Ｂ）インキュベートした。グラフは、標識度（ＤＯＬ）に合わせて調整したｐＨｒｏｄｏ ＭＦＩを示す。ヒストグラムは全ドナーからの平均±ＳＤを示し、各点は、１ドナーからのデータを示す。統計解析、対応のある両側ｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；ｎｓ：有意ではない（ｐ＞０．０５）。

【0086】

【図7】Ｍａｎ３グリカン構造を提示する抗体が、ラットの血液循環から標的抗原を強力かつ急速に除去することを示す。ラットに、ＨＣＡ２０２（０．５ｍｇ／ｋｇ）及び抗体１０ｍｇ／ｋｇを静脈（ｉ．ｖ．）した。グラフは、１群あたり３匹または４匹の動物のＨＣＡ２０２血清濃度の平均±ＳＤをｎｇ／ｍｌで示す。黒い丸は、Ｈ－Ａ２Ｆ（アダリムマブ、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））治療群を示す。白抜きの四角は、Ａ－８４－Ｍ３治療群を示す。黒い三角は、Ａ－８４８６－Ｍ３治療群を示す。黒い四角は、Ａ－８４８６－Ａ２Ｇ２Ｓ２治療群を示す。白抜きの丸は、ＰＢＳ治療群（ＨＣＡ２０２のみ）を示す。白抜きの菱形と点線は、Ａ－Ｍ３治療群を示す。グラフ表示では、ＨＣＡ２０２レベルが、必要最小限の１０倍希釈（ＭＲＤ１０）（点線のＬＬＯＱ／ＭＲＤ１０線＝２０ｎｇ／ｍｌ）でアッセイ定量下限（ＬＬＯＱ）を下回った場合、１９ｎｇ／ｍｌとした。

【0087】

【図8】Ｍａｎ３グリカン構造を提示する抗体が、対照抗体と比較して速い速度で肝臓領域に部分的に分布することを示す。マウスに５ｍｇ／ｋｇのＣＦ７５０標識抗体を静脈注射し、蛍光断層撮影法を用いて画像化した。グラフは、ゲートされた関心対象のある肝臓領域における３匹の動物／時点の平均蛍光をｐｍｏｌ±ＳＤで示す。白抜きの四角と点線はＡ－Ｍ３治療群を示す。黒い丸は、Ｈ－Ａ２Ｆ治療群を示す。黒い三角は、Ａ－８４８６－Ｍ３治療群を示す。

【発明を実施するための形態】

【0088】

６．発明を実施するための形態
本明細書には、対照抗体と比較して改善された機能性を有する二機能性結合タンパク質（例えば、マンノース３グリコシル化二機能性結合タンパク質）が記載される。本明細書に例示されるように、二機能性結合タンパク質は、二機能性結合タンパク質上のグリコシル化部位上にマンノース３を導入することによって操作され、その結果、二機能性結合タンパク質及びそれが結合する標的のエンドサイトーシス受容体分解を媒介する、操作されたグリコシル化プロファイルが得られる。マンノース３グリカン部位をカスタマイズすることにより、本明細書に記載の操作された二機能性結合タンパク質は、１）均一なグリコシル化を有する、２）免疫複合体などの大きな標的を分解できる、３）定義されたリガンド対抗体比を有する、４）定義されたグリコシル化部位を有する、６）より多様で強力な分解受容体を活性化できる、及び／または５）高度に最適化された方法でタンパク質の分解に関与できる。

【0089】

図４に示すように、理論に束縛されるものではないが、本明細書に記載されるように、二機能性結合タンパク質は、マクロファージマンノース結合受容体、ＣＤ２０６、ＬＳＥＣＴｉｎ－、肺サーファクタントタンパク質ＳＰ－Ｄ、Ｍｉｎｃｌｅ、ＤＣ－Ｓｉｇｎ、及びマンノース３を認識する他の任意のレクチンに結合できる。Ｃ型レクチンによるリガンドのエンドサイトーシスは、ファゴリソソームにおける受容体の蓄積及び分解、または細胞表面への受容体のリサイクルをもたらし得る。

【0090】

理論に束縛されるものではないが、マンノース３グリコシル化抗体は、本明細書に記載されるように、自然の分解経路を介して、ヒトの疾患に関連する標的タンパク質を減少させることが期待される。

【0091】

「約」という用語は、数値と併せて使用される場合、参照される数値の±１、±５または±１０％以内の任意の数値を指す。

【0092】

本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、動物（例えば、鳥類、爬虫類、及び哺乳類）を指す。別の実施形態では、対象は、非霊長類（例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、及びマウス）及び霊長類（例えば、サル、チンパンジー、及びヒト）を含む哺乳類である。いくつかの実施形態では、対象はヒト以外の動物である。いくつかの実施形態では、対象は、家畜またはペット（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ロバ、またはニワトリ）である。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書では交換可能に使用され得る。

【0093】

「α［数字］」、「α［数字］、［数字］」、「β［数字］」、または「β［数字］、［数字］」という略語は、炭水化物残基を別の基に結合する共有結合であるグリコシド結合またはグリコシド連結を指す。α－グリコシド結合は、両方の炭素が同じ立体化学を有する場合に形成されるが、β－グリコシド結合は、２つの炭素が異なる立体化学を有する場合生じる。

【0094】

本明細書で使用される場合、「二機能性結合タンパク質」という用語は、第１の部分及び第２の部分を介して２つの異なるリガンドと結合できるタンパク質であって、第１の部分が第２の部分とは異なるタンパク質を意味する。本明細書で使用される場合、「二機能性結合タンパク質」という用語は、３つ以上の結合特異性または機能を有するタンパク質を指す。本開示の二機能性結合タンパク質の一例としては、マンノース３グリコシル化抗ＴＳＨ受容体抗体、または自己抗体に結合するマンノース３グリコシル化可溶性ＴＳＨ受容体細胞外ドメインを挙げることができる。

【0095】

本明細書で使用される場合、「炎症性障害」という用語には、炎症を特徴とする障害、疾患または症状が含まれる。炎症性障害の例としては、とりわけ、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、セリアック病、糸球体腎炎、肝炎、炎症性腸疾患、再潅流傷害及び移植拒絶反応が挙げられる。

【0096】

本明細書で使用される場合、「血液障害」という用語には、血液に影響を与える障害、疾患または症状が含まれる。血液障害の例としては、とりわけ、貧血、血友病などの出血疾患、血栓、及び白血病、リンパ腫、及び骨髄腫などの血液癌が含まれる。

【0097】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、動物における、及びより具体的にはヒトにおける使用について連邦もしくは州政府の規制機関によって承認されているか、または米国薬局方もしくは他の一般的に認識されている薬局方において列挙されていることを意味する。

【0098】

薬学的に許容される担体の文脈において本明細書で使用される「担体」という用語は、医薬組成物がともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。生理食塩水ならびに水性デキストロース及びグリセロール溶液はまた、液体担体として、特に注射可能な溶液に使用することができる。好適な賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。好適な薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。

【0099】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される二機能性結合タンパク質は、（ｉ）１つ以上の標的タンパク質（複数可）に対する結合特異性、及び（ｉｉ）１つ以上のエンドサイトーシス炭水化物結合タンパク質または受容体に対する結合特異性を有する１つ以上のＮ－グリカン（複数可）を含み得る。

【0100】

いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、１つの標的タンパク質に対して１つの結合特異性を有する。より具体的な実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、１つの標的タンパク質に対して１つの結合特異性を有し、単一の二機能性結合タンパク質が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の標的タンパク質分子に結合できるように、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の原子価を有する。

【0101】

いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質は、エンドサイトーシス受容体と会合することができる１つ以上のＮ－グリカン（複数可）を有する。いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質は、エンドサイトーシス受容体と会合することができる２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のＮ－グリカンを有する。Ｎ－グリカンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のＮ－グリコシル化コンセンサス配列（または糖鎖部位）でタンパク質に連結され得る。これらの糖鎖部位は、タンパク質中に天然に存在してもよく、またはアミノ酸の付加、置換、または欠失によって組換えにより導入してもよい。特定の実施形態では、グリコタグをタンパク質に融合させて、二重特異性結合タンパク質を作製する。本明細書で使用される場合、グリコタグは、タンパク質またはポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端、あるいは両方の末端に融合したコンセンサスＮ－グリコシル化部位配列を含むペプチドを指す。いくつかの実施形態では、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上または１０以上のグリカンが同じであり、同じエンドサイトーシス受容体（複数可）と会合する。いくつかの実施形態では、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上または１０以上のグリカンが異なり、異なるエンドサイトーシス受容体と会合する。

【0102】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質に特異的に結合する、第１の部分及び第２の部分を含む二機能性結合タンパク質が本明細書で提供される。

【0103】

いくつかの実施形態では、第１の部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、またはそれらの抗原断片を含む。いくつかの実施形態では、第１の部分は、モノクローナル抗体のＦａｂ領域を含む。いくつかの実施形態では、第１の部分は、本明細書に開示される標的タンパク質のいずれかに特異的に結合する。

【0104】

いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質は、ＴＮＦαモノクローナル抗体である。他の実施形態では、二機能性結合タンパク質は、ＴＮＦαモノクローナル抗体ではない。

【0105】

いくつかの実施形態では、第２の部分は、本明細書に開示されるマンノース３グリカン構造を有するグリカン構造を含む。いくつかの実施形態では、グリカン構造は、本明細書に開示されるグリカンのいずれかである。

【0106】

いくつかの実施形態では、マンノース３グリカンと結合する任意の受容体が、本明細書に開示される組成物及び方法の説明に含まれる。他の実施形態では、第２の部分は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を認識する任意のエンドサイトーシス炭水化物結合受容体に結合する。

【0107】

いくつかの実施形態では、第２の部分は、マンノース３受容体に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２の部分は、分化クラスター２０６（ＣＤ２０６）受容体に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２の部分は、ＤＣ－ＳＩＧＮ（分化クラスター２０９またはＣＤ２０９）受容体に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２の部分は、Ｃ型レクチンドメインファミリー４メンバーＧ（ＬＳＥＣＴｉｎ）受容体に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２の部分は、マクロファージ誘導性Ｃａ^２＋依存性レクチン受容体（Ｍｉｎｃｌｅ）に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２の部分は、ランゲリン、マクロファージマンノース２受容体、デクチン－１、デクチン－２、ＢＤＣＡ－２、ＤＣＩＲ、ＭＢＬ、ＭＤＬ、ＭＩＣＬ、ＣＬＥＣ２、ＤＮＧＲ１、ＣＬＥＣ１２Ｂ、ＤＥＣ－２０５、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＰＧＲ）、及びマンノース６リン酸受容体（Ｍ６ＰＲ）からなる群から選択される受容体に特異的に結合する。

【0108】

いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質は抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはそれらの抗原断片である。いくつかの実施形態では、抗体は組換え抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト対象から単離される。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、または完全ヒト抗体である。他の実施形態では、二機能性結合タンパク質は自己抗原である。他の実施形態では、二機能性結合タンパク質は、自己抗体である。

【0109】

いくつかの実施形態では、抗体は、２対１、４対１、６対１、８対１または１０対１のグリカン対抗体比を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、所定の特定の残基でグリコシル化されている。他の実施形態では、抗体は、ランダムな残基でグリコシル化される。

【0110】

いくつかの実施形態では、以下の構造

【化5】

を有する第２の部分を含む二機能性結合タンパク質が本明細書で提供され、
四角はＮ－アセチルグルコサミン残基を表し、黒い縞模様の円はマンノース残基を表し、Ｘは二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表す。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される二機能性結合タンパク質のＸアミノ酸残基は、二機能性結合タンパク質に操作されたＮ結合型グリコシル化コンセンサス配列のＡｓｎである。このようなＮ結合型グリコシル化コンセンサス配列は、いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質の可変ドメインに存在し得る。

【0111】

いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質は、

【化6】

の構造を有するグリカンの少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％を含み、Ｘは、二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表す。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される二機能性結合タンパク質のＸアミノ酸残基は、二機能性結合タンパク質に操作されたＮ結合型グリコシル化コンセンサス配列のＡｓｎである。

【0112】

いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質は、マンノトリオース－ジ－（Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン）（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）で糖鎖改変された抗ＴＧＦ－βモノクローナル抗体または抗Ｎｏｔｃｈモノクローナル抗体である。

【0113】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、細胞表面分子または非細胞表面分子である。いくつかの実施形態では、細胞表面分子は受容体である。いくつかの実施形態では、非細胞表面受容体は細胞外タンパク質である。いくつかの実施形態では、細胞外タンパク質は、自己抗体、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、血液タンパク質、または中枢神経系（ＣＮＳ）で発現するタンパク質である。

【0114】

いくつかの実施形態では、疾患に関連する標的タンパク質は、非疾患状態と比較して疾患においてアップレギュレートされる。いくつかの実施形態では、疾患に関連する標的タンパク質は、非疾患状態と比較して疾患において発現される。いくつかの実施形態では、疾患に関連する標的タンパク質は、疾患の進行に関与する。いくつかの実施形態では、疾患は、がんまたは腫瘍である。いくつかの実施形態では疾患は自己免疫疾患である。いくつかの実施形態では、疾患は神経変性疾患である。

【0115】

いくつかの実施形態では、疾患はバセドウ病である。バセドウ病は、甲状腺機能亢進症の最も一般的な原因である。米国での有病率は１．２％（１）で、女性の生涯リスクは３％にもなる。アゴニスト抗ＴＳＨ受容体（ＴＳＨＲ）抗体（ＴＲＡｂ）の産生により、チロキシンホルモンの過剰産生が引き起こされる（９０％を超える患者がＴＲＡｂ＋）（２）。現在の治療法は５０年間も進歩しておらず、高い再発リスクや甲状腺機能低下症などの重篤な副作用によって制限されている。いくつかの実施形態では、バセドウ病に関連する標的タンパク質は、自己抗体結合ＴＳＨＲαである。他の実施形態では、バセドウ病に関連する標的タンパク質はＴＳＨＲαである。

【0116】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、αｖβ３インテグリン、ＣＥＡ、ＣＸＣＲ４、ＭＵＣ１、ＬＣＡＭ１、ＥｐｈＡ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＶＩＳＴＡ、Ｎｏｔｃｈ受容体、ＥＧＦ、ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＬ２、ＣＣＲ２ Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、Ｗｎｔ、ＬＲＰ５／６、ＣＳＦ－１Ｒ、ＳＩＲＰα、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ３、ＬＩＬＲＢ４、ＣＤ３８、ＣＤ７３、ＴＧＦ－βからなる群から選択されるタンパク質を含む。他の実施形態では、標的タンパク質は、ＴＳＨＲα、ＭＯＧ、ＡＣｈＲ－α１、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖の非コラーゲンドメイン１（α３ＮＣ１）、ＡＤＡＭＴＳ１３、デスモグレイン－１／３、ＧＰＩｂ／ＩＸ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩａ／ＩＩａ、ＮＭＤＡ受容体、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、アンフィフィシン及びガングリオシドＧＭ１、ＧＤ３、及びＧＱ１Ｂに結合する抗体を含む。

【0117】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質を肝細胞エンドソームに送達する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、標的タンパク質を肝細胞に送達する方法は、本明細書に開示される任意の標的タンパク質のエンドサイトーシスを媒介する条件下で、標的タンパク質を、本明細書に開示される二機能性結合タンパク質のいずれかと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、標的タンパク質を肝臓常在性クッパー細胞（ＫＣ）及び／または肝臓類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）及び／または単球由来マクロファージ（ＭｏＭφ）などの肝マクロファージのエンドソームに送達する方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏで肝細胞エンドソームに送達する様式は、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、経皮注射または筋肉内注射を含む。いくつかの実施形態では、標的タンパク質を肝細胞エンドソームに送達する方法は、エクスビボで行われる。

【0118】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質を分解する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、標的タンパク質を分解する方法は、宿主細胞による本明細書に開示される標的タンパク質のいずれかの分解を媒介する条件下で、標的タンパク質を、本明細書に開示される二機能性結合タンパク質のいずれかと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、分解はリソソーム分解である。いくつかの実施形態では、分解は、エンドサイトーシスまたはファゴサイトーシスによって媒介される。いくつかの実施形態では、分解は、本明細書に開示されるあらゆる第２の部分を除くグリカンを含む二機能性結合タンパク質によって媒介される分解よりも、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１５倍、１８倍、２０倍、２５倍、または３０倍高い。他の実施形態では、二機能性結合タンパク質は、本明細書に開示されるあらゆる第２の部分を除くグリカンを含む二機能性結合タンパク質の存在下での標的タンパク質の分解と比較して、開示された標的タンパク質のいずれかの分解を増強する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、骨髄細胞、免疫細胞、内皮細胞、実質細胞または上皮細胞を含むがこれらに限定されない任意の宿主細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、樹状細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア細胞、顆粒球またはＢリンパ球であり得る。

【0119】

いくつかの実施形態では、マンノース３分解は、エンドサイトーシス受容体の関与により最適である。いくつかの実施形態では、マンノース３媒介分解を介して標的タンパク質を分解する方法は選択的である。いくつかの実施形態では、マンノース３分解は、循環から炎症性サイトカインを除去し、不要な血液因子を除去し、自己抗体を除去し、細胞表面受容体を除去する。

【0120】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質の分解を媒介する二機能性結合タンパク質は、本明細書に開示されるエンドサイトーシス受容体のいずれかによるＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の認識を介して、ＴＧＦ－βを捕捉し、リソソーム中でＴＧＦ－βを分解するＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含む抗ＴＧＦ－βモノクローナル抗体である。このアプローチは、がん治療のために細胞表面のＮｏｔｃｈなどの受容体を枯渇させるのに応用できる。

【0121】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、がんにおいてアップレギュレートされるタンパク質である。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、がんの進行に関与するタンパク質である。本明細書で提供される二機能性結合タンパク質によって結合され得る、がんにおいてアップレギュレートされる、またはがんの進行に関与する標的タンパク質の例としては、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、αｖβ３インテグリン、ＣＥＡ、ＣＸＣＲ４、ＭＵＣ１、ＬＣＡＭ１、ＥｐｈＡ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＶＩＳＴＡ、Ｎｏｔｃｈ受容体、ＥＧＦ、ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＬ２、ＣＣＲ２、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、Ｗｎｔ、ＬＲＰ５／６、ＣＳＦ－１Ｒ、ＳＩＲＰα、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ３、ＬＩＬＲＢ４、ＣＤ３８、ＣＤ７３、ＴＧＦ－β、ボンベシンＲ、ＣＡＩＸ、ＣＤ１３、ＣＤ４４ｖ６、ＣＸＣＲ４、ＥｒｂＢ－２、Ｈｅｒ２、エムプリン、エンドグリン、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ－α、葉酸Ｒ、ＧＲＰ７８、ＩＧＦ－１Ｒ、マトリプターゼ、メソテリン、ｓＭＥＴ／ＨＧＦＲ、ＭＴ１－ＭＭＰ、ＭＴ６－ＭＭＰ、Ｍｕｃ－１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、Ｔｎ抗原、及びｕＰＡＲが挙げられるが、これらに限定されない。

【0122】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、自己免疫疾患に関連するような自己抗体である。本明細書で提供される二機能性結合タンパク質によって結合され得る自己抗体の例としては、ＭＯＧ、ＴＳＨＲα、ＡＣｈＲ－α１に対する自己抗体、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖の非コラーゲンドメイン１（α３ＮＣ１）、ＡＤＡＭＴＳ１３、デスモグレイン－１／３、またはＧＰＩｂ／ＩＸ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩａ／ＩＩａ、ＮＭＤＡ受容体、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、アンフィフィシン及びガングリオシドＧＭ１、ＧＤ３、ＧＱ１Ｂが挙げられるが、これらに限定されない。

【0123】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）においてアップレギュレートまたは発現されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、腫瘍促進性ＴＡＭにおいてアップレギュレートまたは発現される。ＴＡＭでアップレギュレートまたは発現される標的タンパク質の例としては、ＳＩＲＰα、ＣＣＲ２、ＣＳＦ－１Ｒ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＶＥＧＦ－Ｒ、またはＣＸＣＲ４（７）が挙げられる。他の実施形態では、標的タンパク質は、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＣＳＦ－１、またはＣＤ４７（７）を含む。参考文献（７）に記載されているように、これらの標的は、特にＴＡＭの動員とプログラミングを促進することにより、腫瘍促進性ＴＡＭの促進に役割を果たす。

【0124】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される二機能性結合タンパク質のいずれかを使用してＴＡＭを再プログラミングする方法が本明細書で提供される。参考文献（７）に記載されているように、ＴＡＭの再プログラミングは、マクロファージ受容体を標的にして阻害し、腫瘍形成促進性ＴＡＭを抗腫瘍形成性ＴＡＭに再プログラミングすることを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される二機能性結合タンパク質のいずれかを使用してＴＡＭを枯渇させる方法が本明細書で提供される。ＴＡＭの枯渇は、増殖に重要な受容体を標的とすることによって発生し得る。これらの受容体を標的にすると、腫瘍形成促進性ＴＡＭのアポトーシスを促進することができる。さらなる実施形態では、本明細書に開示される二機能性結合タンパク質のいずれかを使用して、腫瘍微小環境へのＴＡＭの動員を阻害する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＴＡＭを再プログラミングし、枯渇させ、または動員を阻害する方法は、開示された二機能性結合タンパク質のいずれかを使用して、ＴＡＭによってアップレギュレートまたは発現される標的を分解することを含む。いくつかの実施形態では、ＴＡＭにおいてアップレギュレートまたは発現される標的タンパク質は、ＳＩＲＰα、ＣＣＲ２、ＣＳＦ－１Ｒ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＶＥＧＦ－Ｒ、またはＣＸＣＲ４を含む。他の実施形態では、ＴＡＭに関連する標的タンパク質は、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＣＳＦ－１またはＣＤ４７を含む。

【0125】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される二機能性結合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が本明細書で提供される。

【0126】

いくつかの実施形態では、患者において疾患を治療または予防する方法であって、本明細書に記載される二機能性結合タンパク質または本明細書に記載される医薬組成物を患者に投与することを含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、疾患は、自己免疫疾患、がんまたは腫瘍、肝疾患、炎症性障害、または血液障害である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、バセドウ病、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体関連疾患（ＭＯＧＡＤ）、膜性腎症、重症筋無力症、抗ＧＢＭ疾患、免疫性血栓性血小板減少性紫斑病、尋常性後天性天疱瘡、免疫性血小板減少症、及びギランバレー症候群から選択される。いくつかの実施形態では、がんまたは腫瘍は、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、肝細胞癌、ならびに血液Ｔ細胞及びＢ細胞悪性腫瘍から選択される。

【0127】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される疾患を治療または予防する方法は、本明細書に記載される二機能性結合タンパク質または本明細書に記載される医薬組成物の静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、経皮注射、または筋肉内注射を含む投与ステップを含む。

【0128】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される疾患を治療または予防する方法は、異なるグリコシル化プロファイルを有する同じ抗体と比較して同じ効果を達成するために、より低い用量及び／またはより低い投与頻度を必要とし、及び／または長期間（少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは少なくとも１２ヶ月、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは少なくとも１０年）にわたって投与することができ、及び／または患者において二機能性結合タンパク質に対する免疫応答を誘発しない。

【0129】

いくつかの実施形態では、本開示の二機能性結合タンパク質を含むキットが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、キットは、二機能性分子または医薬組成物を、それを必要とする個体に投与するための説明書をさらに提供する。

【0130】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、単一剤形、例えば、本明細書に記載される二機能性結合タンパク質の単一剤形で投与することができる。

【0131】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される二機能性結合タンパク質の好適な用量は、治療効果をもたらすのに有効な最低用量に対応する量である。例えば、抗ＴＳＨ受容体抗体の有効量は、バセドウ病に罹患している対象のＴＳＨ活性を阻害する量とすることができる。

【0132】

いくつかの実施形態では、患者に投与される本明細書に記載の二機能性結合タンパク質の量は、本明細書に記載の二機能性結合タンパク質のグリコシル化プロファイルを有しないかまたはそれとは異なるグリコシル化プロファイルを有する同じ二機能性結合タンパク質の医薬品のラベルに記載されている量よりも少ない。

【0133】

いくつかの実施形態では、一定期間にわたって患者に投与される本明細書に記載の二機能性結合タンパク質の蓄積量は、本明細書に記載の二機能性結合タンパク質のグリコシル化プロファイルを有しないかまたはそれとはとは異なるグリコシル化プロファイルを有する同じ二機能性結合タンパク質の医薬品のラベルに示される蓄積量よりも少ない。いくつかの実施形態では、低減した蓄積量は、低減した頻度で低減した用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、低減した蓄積量は、低減した頻度で標識中の用量と同じまたはそれよりも高い１つ以上の用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、低減した蓄積量は、ラベル中の頻度と同じまたはそれよりも高い頻度で１つ以上の低減した用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、低減した蓄積量は、医薬製品が治療または予防において同じレベルの効果を達成する期間よりも短い期間にわたって投与され得る。

【0134】

いくつかの実施形態では、患者に投与される単回用量中の本明細書に記載される二機能性結合タンパク質の量は、約１～１５０ｍｇ、約５～１４５ｍｇ、約１０～１４０ｍｇ、約１５～１３５ｍｇ、約２０～１３０ｍｇ、約２５～１２５ｍｇ、約３０～１２０ｍｇ、約３５～１１５ｍｇ、約４０～１１０ｍｇ、約４５～１０５ｍｇ、約５０～１００ｍｇ、約５５～９５ｍｇ、約６０～９０ｍｇ、約６５～５ｍｇ、約７０～８０ｍｇ、または約７５ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、患者に投与される単回用量中の本明細書に記載される二機能性結合タンパク質の量は、約５～約８０ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、患者に投与される単回用量中の本明細書に記載される二機能性結合タンパク質の量は、約２５～約５０ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、患者に投与される単回用量中の本明細書に記載される二機能性結合タンパク質の量は、約１５ｍｇ～約３５ｍｇであり得る。

【0135】

いくつかの実施形態では、患者に投与される単回用量中の本明細書に記載される二機能性結合タンパク質の量は、４０ｍｇ以下、例えば、４０ｍｇ、３５ｍｇ、３０ｍｇ、２５ｍｇ、２０ｍｇ、１８ｍｇ、１５ｍｇ、１２ｍｇ、１０ｍｇ、７ｍｇ、５ｍｇ、及び２ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、患者に投与される単回用量中の本明細書に記載される二機能性結合タンパク質の量は、８０ｍｇ以下、例えば、８０ｍｇ、７５ｍｇ、７０ｍｇ、６５ｍｇ、６０ｍｇ、５５ｍｇ、５０ｍｇ、４５ｍｇ、４０ｍｇ、３５ｍｇ、３０ｍｇ、２０ｍｇ、１５ｍｇ、１０ｍｇ、５ｍｇ、及び２ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、患者に投与される単回用量中の本明細書に記載される二機能性結合タンパク質の量は、１６０ｍｇ以下、例えば１５０ｍｇ、１４０ｍｇ、１３０ｍｇ、１２０ｍｇ、１１０ｍｇ、１００ｍｇ、９０ｍｇ、８０ｍｇ、７５ｍｇ、７０ｍｇ、６５ｍｇ、６０ｍｇ、５５ｍｇ、５０ｍｇ、４５ｍｇ、４０ｍｇ、３５ｍｇ、３０ｍｇ、２０ｍｇ、１５ｍｇ、１０ｍｇ、５ｍｇ、及び２ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、患者に投与される単回用量中の本明細書に記載される二機能性結合タンパク質の量は、１６０ｍｇ以上、例えば、１７０ｍｇ、１８０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、及び３００ｍｇであり得る。

【0136】

いくつかの実施形態では、本開示の二機能性結合タンパク質は、１週間おき、すなわち、１４日毎である頻度で投与することができる。いくつかの実施形態では、本開示の二機能性結合タンパク質は、１４日毎よりも低い頻度、例えば、半月毎、２１日毎、毎月、８週間毎、隔月、１２週間毎、３ヶ月毎、４ヶ月毎、５ヶ月毎、または６ヶ月毎に投与することができる。いくつかの実施形態では、本開示の二機能性結合タンパク質は、１４日毎と同じまたはそれよりも高い頻度、例えば、１４日毎、１０日毎、７日毎、５日毎、１日おき、または毎日投与することができる。

【0137】

いくつかの実施形態では、本開示の二機能性結合タンパク質の投与は、以下の用量、例えば、以下の維持用量よりも高い導入量を含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示の二機能性結合タンパク質の投与は、導入量よりも低くかつ以下の維持用量よりも高い第２の用量を含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示の二機能性結合タンパク質の投与は、治療期間全体を通してすべての用量で同じ量の二機能性結合タンパク質を含むことができる。

【0138】

本明細書で提供される二機能性結合タンパク質を生成する方法は、当技術分野でよく知られている。本明細書で提供される二機能性結合タンパク質を生成する例示的な方法は、国際特許出願公開ＷＯ２０１９／００２５１２、ＷＯ２０２１／１４０１４３、ＷＯ２０２１／１４０１４４、及びＷＯ２０２２／０５３６７３に記載されており、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれ、本明細書において例示され、そのうちのいずれか１つが、本明細書で提供される二機能性結合タンパク質を生成するために使用され得る。例えば、当業者は、既知のタンパク質（例えば、モノクローナル抗体）、及び新たに特定されたタンパク質（例えば、モノクローナル抗体）の核酸配列が、当該技術分野で既知の方法を使用して容易に推論され得ることを容易に理解し、よって、任意の二機能性結合タンパク質をコードする核酸を本明細書で提供される宿主細胞に（例えば、発現ベクター、例えば、プラスミド、例えば、相同組換えによる部位特異的組み込みを介して）導入することは、十分に当業者の能力の範囲内であろう。

【0139】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の二機能性結合タンパク質を含むＬｅｉｓｈｍａｎｉａ宿主細胞が本明細書で提供される。そのような宿主細胞は、いくつかの実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ種複合体の一部である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ａｒｉｓｔｉｄｅｓｉ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｅａｎｅｉ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ種複合体の一部である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｃｈａｇａｓｉ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｉｎｆａｎｔｕｍ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｈｅｒｔｉｇｉ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ種複合体の一部である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｒｔｉｎｉｑｕｅｎｓｉｓ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍｅｘｉｃａｎａ種複合体の一部である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍｅｘｉｃａｎａ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｐｉｆａｎｏｉ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔｒｏｐｉｃａ種複合体の一部である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔｒｏｐｉｃａ細胞である。

【0140】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ宿主細胞を培養することと、二機能性結合タンパク質を単離することとを含む、二機能性結合タンパク質を作製する方法が本明細書で提供される。

【0141】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生される二機能性結合タンパク質が本明細書で提供される。Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ宿主細胞を産生する方法、及びそのような宿主細胞を使用して二機能性結合タンパク質を産生する方法は、当技術分野でよく知られている。例示的な方法は、国際特許出願公開ＷＯ２０１９／００２５１２、ＷＯ２０２１／１４０１４３、ＷＯ２０２１／１４０１４４及びＷＯ２０２２／０５３６７３に記載されており、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれ、本明細書において例示され、そのうちのいずれか１つが、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ宿主細胞を生成し、ここで提供される二機能性結合タンパク質を産生するために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される宿主細胞は、すべて５μｇ／ｍｌのヘミンを含有する、ブレインハートインフュージョン、トリプチケースソイブロス、または酵母エキスのような富栄養培地中での増殖が挙げられるが、これに限定されない、当該技術分野で既知の標準的な培養技法のいずれかを使用して培養される。追加的に、インキュベーションは、２～３日にわたって静置または振盪培養物として暗所において２６℃で行うことができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞の培養物は、適切な選択的薬剤を含有する。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるモノクローナル抗体は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び混合モードクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない、当技術分野で知られている標準的な精製技術のいずれかを使用して宿主細胞培養上清から精製される。

【0142】

いくつかの実施形態では、Ｎ－グリコシル化部位は、Ｎ結合型グリコシル化コンセンサス配列である。特定の実施形態では、Ｎ結合型グリコシル化コンセンサス配列は、１つ以上のアスパラギン残基であり得る。さらなる実施形態では、Ｎ結合型グリコシル化コンセンサス配列は、標準コンセンサス配列Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ、Ｎ－Ｘ－Ｃモチーフ、及び非標準コンセンサスモチーフ内に入る１つ以上のアスパラギン残基であり得る。

【0143】

いくつかの実施形態では、Ｎ－グリコシル化部位は、二機能性タンパク質に操作される。いくつかの実施形態では、Ｎ－グリコシル化部位は、二機能性タンパク質の配列にＮ結合型グリコシル化コンセンサス配列を挿入することにより導入され得る。いくつかの実施形態では、Ｎ結合型グリコシル化コンセンサス配列をコードする１つ以上の配列は、二機能性タンパク質配列に１つ以上の部位で挿入され得る。いくつかの実施形態では、Ｎ結合型グリコシル化コンセンサス配列の挿入は、分子生物学の技法、例えば、ＤＮＡクローニング、ＤＮＡの抽出、細菌形質転換、トランスフェクション、染色体組み込み、細胞スクリーニング、細胞培養、ＤＮＡ塩基配列決定法、ＤＮＡ合成、及び分子ハイブリダイゼーションにより行われ得る。いくつかの実施形態では、Ｎ－グリコシル化部位は、ヌクレアーゼを用いた精密な遺伝子編集ツール、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びクラスター化され規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し／標的化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）により導入され得る。

【0144】

いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は抗体である。いくつかの実施形態では、Ｎ結合型グリコシル化コンセンサス配列は、抗体のＦａｂ上の１つ以上の部位に導入され得る。いくつかの実施形態では、Ｎ結合型グリコシル化コンセンサス配列は、抗体のＦｃ上の１つ以上の部位に導入され得る。

【0145】

いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は、糖鎖部位の数を変化させ、したがって、それぞれの条件について効力及び動態を最適化させることによって条件に合わせて調整される。特定の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の糖鎖部位は、抗体のＦａｂまたはＦｃへと操作される。特定の実施形態では、１つのＦａｂ上にＭａｎ３グリカンを提示する１つの操作された糖鎖部位は、効力及び動態が低いマクロファージ内部移行を示し、１つのＦａｂ上にＭａｎ３グリカンを提示する２つ、３つ、４つ、または５つの操作された糖鎖部位は、効力または動態が速いマクロファージ内部移行を示す。特定の実施形態では、１つのＦａｂ上にＭ３グリカンを提示する１つの操作された糖鎖部位は、効力または動態が低い標的タンパク質分解を示し、１つのＦａｂ上にＭ３グリカンを提示する２つ、３つ、４つ、もしくは５つの操作された糖鎖部位は、効力または動態が速い標的タンパク質分解を示す。いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は、Ｍａｎ３グリカンとは異なる糖鎖部位を含む。

【0146】

Ｍａｎ３担持タンパク質を作製する方法
組換えタンパク質を生成する方法は当該技術分野で知られている。宿主細胞のタンパク質にＮ－グリカンのバイオコンジュゲーションを行う方法もまた、当該技術分野で知られている。本明細書で提供される二機能性結合タンパク質を生成する例示的な方法は、国際特許出願公開ＷＯ２０１９／００２５１２、ＷＯ２０２１／１４０１４３、ＷＯ２０２１／１４０１４４、及びＷＯ２０２２／０５３６７３に記載されている。これらの公開に記載のＮ－グリコシル化の生合成経路は、本明細書に記載のＭａｎ３担持二機能性タンパク質を合成するために使用され得る。特定の実施形態では、Ｎ－グリコシル化は宿主細胞中で行われ、その結果、宿主細胞の分泌経路におけるＭａｎ３担持二機能性タンパク質の産生が得られる。特定の実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ宿主細胞であり得る。Ｍａｎ３グリコシル化二機能性タンパク質は、当該技術分野で知られている標準的精製技法のいずれかを使用して、細胞培養物からさらに精製される。

【0147】

本明細書で提供される二機能性タンパク質を生成する他の方法を使用することもできる。例えば、化学的結合または化学酵素的修飾を使用して、本明細書で提供される二機能性タンパク質を生成することができる。

【0148】

本発明のさまざまな実施形態の活性に実質的に影響を及ぼさない修飾はまた、本明細書で提供される本発明の定義内で提供されることが理解される。したがって、以下の例は、本発明を例示することを意図しているが、本発明を限定するものではない。

【実施例】

【0149】

７．実施例
７．１ 実施例１：Ｍａｎ３グリコシル化抗体は、効率的な内部移行及びリソソーム区画標的化をもたらす。
５人の健常ドナーからのＰＢＭＣを、標準的フィコール勾配法を使用してバフィーコートから採取した。ＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｒｅｆ．１３０－０５０－２０１）をメーカーの指示に従って使用して単球をＰＢＭＣから分離した。１０％熱非働化ウシ胎児血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ．Ｓ８６３６）、ＭＥＭ非必須アミノ酸最終濃度１×（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ．１１１４０－０３）、５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｒｅｆ．２１５－ＧＭ）及び２０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｒｅｆ．２０４－ＩＬ）を添加したＲＰＭＩ培養培地（Ｇｉｂｃｏ、ｒｅｆ．２１８７５－０３４）中で単球を６日間培養した。６日目における単球の未熟樹状細胞への分化を、マーカーであるＣＤ１４、ＣＤ１ａ、ＣＤ８３、ＨＬＡ－ＤＲの染色を行ってフローサイトメトリーによって評価した。未熟樹状細胞が、ＣＤ１４－／ｌｏｗ ＣＤ１ａ＋ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ８３－／ｌｏｗの表現型を提示することが確認された。

【0150】

抗体は以下のように調製した。モノクローナル抗ＴＮＦα抗体、ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）（ＡｂｂＶｉｅ）またはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ ＣＧＰ（ＣｕｓｔｏｍＧｌｙｃａｎ Ｐｌａｔｆｏｒｍ）由来のアダリムマブ変異体（Ａ－Ｓ、Ａ－Ｍ）、またはＭａｂｔｈｅｒａを、ＺｅｂａＳｐｉｎカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ、米国）を使用して３０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５に再緩衝した。ガラクトシル化及びアルファ２，６－シアル化（Ｈ－Ｓ及びＡ－Ｓ変異体を生成するため）は、アプリケーションノートに従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏグリコシル化（ＩＶＧＥ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用し、３７℃で穏やかに回転させながら１ポット反応で実行した。ＦＰＬＣ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＮＧＣ、ドイツ）を使用し、メーカーの推奨に従って、プロテインＡセファロース（ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅまたはＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡカラムＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて反応混合物からグリコシル化ｍＡｂを精製した。その後、ＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ２５、Ｓｉｇｍａ、スイス）を使用した脱塩手順を実行し、ＰＢＳ ｐＨ ６（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、８．６ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１．４ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｓｉｇｍａ、スイス）への緩衝液交換を行った後、０．２μｍＰＥＳフィルター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）を使用して滅菌濾過を行った。抗体の品質とグリコシル化を表１に示す。Ｎ－グリカンを、ＧｌｙｃｏＷｏｒｋｓ ＲａｐｉＦｌｕｏｒ－ＭＳ Ｎ－Ｇｌｙｃａｎ Ｋｉｔ（Ｗａｔｅｒｓ、米国）を用いてメーカーの指示に従って分析し、またはＰＮＧａｓｅＦ放出グリカンのプロカインアミド（ＰＣ）標識によって分析した。さらなるＮ－グリカン分析のために、モノクローナル抗体を、ＩｄｅＺでＦ（ａｂ’）２及びＦｃ／２に切断するか（ＩｇＧ１の場合）、または重鎖と軽鎖にし（ＩｇＧ４の場合）、ＳＤＳ ＰＡＧＥ上で分離してバンドを切除し、モノクローナル抗体からのＮ－グリカンの酵素放出を、ＰＮＧａｓｅ Ｆを使用して行った。放出後、グリカンをプロカインアミド（ＰＣ）で直接標識した。ＰＣ標識されたＮ－グリカンを、質量分析計に結合した蛍光検出でＨＩＬＩＣ－ＵＰＬＣ－ＭＳによって分析した。グリカンを、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅカラムを使用して分離した。データ処理及び分析は、Ｕｎｉｆｉを使用して行った。グルコース単位を、プロカインアミド標識デキストランラダーの保持時間に割り当てた。グリカン構造を、そのｍ／ｚ値及びその保持時間に基づいて割り当てた。グリカン形態及び相対パーセンテージを、ピーク面積に基づいて計算した。ＳＥ－ＨＰＬＣ分析は、ＭａｂＰａｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ、米国）カラムで１μｇ／μＬの濃度で行い、メーカーの指示に従って実行した。エンドトキシンレベルは０．２ＥＵ／ｍｇ（Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標））未満であった。抗体は、ｐＨｒｏｄｏ色素（ｐＨｒｏｄｏ ｉＦＬ Ｒｅｄ ＳＴＰ Ｅｓｔｅｒ［アミン反応性］、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ｒｅｆ．Ｐ３６０１１）でメーカーの指示に従って標識した。表１は、使用した抗体によって提示される主なＮ－グリカン構造を示す。

【0151】

【表1】

【0152】

未熟樹状細胞を、１０μｇ／ｍｌで加えたｐＨｒｏｄｏ標識抗体とともに６時間インキュベートした。いくつかの条件では、ｐＨｒｏｄｏ標識抗体の添加の３０分前に、Ｆｃ受容体ブロッキング試薬（Ｈｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ、ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ｒｅｆ ６４０９２２）をメーカーの推奨に従って加えた。ｐＨｒｏｄｏ標識抗体とのインキュベーションの６時間後、細胞をフローサイトメーターで取得し、ｐＨｒｏｄｏ蛍光強度を記録した。ｐＨｒｏｄｏの蛍光は酸性ｐＨにより活性化されるため、内部移行した分子が後期エンドソーム及びリソソームの区画に到達したことを示す。したがって、ｐＨｒｏｄｏ蛍光強度は、内部移行し、リソソーム経路へルーティングされた分子の量と相関する。

【0153】

図１は、Ｍａｎ３アダリムマブ（Ａ－Ｍ）が、異なるＮ－グリカンを提示するアダリムマブ変異体よりも顕著に内部移行されたことを示す。ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）（Ｈ－Ｍ）及びシアル化ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）（Ｈ－Ｓ）、ならびにシアル化（脱フコシル化）アダリムマブ（Ａ－Ｓ）は、参照として使用された抗ＣＤ２０抗体であるＭａｂｔｈｅｒａ（ＭｂＴ）と比較して、同様の低レベルの内部移行を示した。Ｍａｂｔｈｅｒａは、ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）と同じ主要Ｎ－グリカン構造（Ａ２Ｆ）を表示する。これは、抗体によって提示されるＭａｎ３グリカンが、内部移行、及び内部移行した抗体のリソソーム分解へのターゲティングをもたらすことを示す。この内部移行は、脱フコシル化されているがシアル化はされていないアダリムマブ（Ａ－Ｓ）がＨＵＭＩＲＡ（登録商標）またはＭａｂｔｈｅｒａよりも内部移行されてはいなかったことから、脱フコシル化に依存するものではなかった。Ｍａｎ３－抗体のこの内部移行及び は、Ｆｃ受容体のブロッキングによりＡ－Ｍ抗体の内部移行が減少しなかったことから、これらの受容体とは独立したものである。これらのデータは、Ｍａｎ３構造と結合する特定の受容体が、樹状細胞によって発現されて、効率的なエンドサイトーシス及びリソソーム分解経路へのルーティングを媒介することを示す。

【0154】

７．２ 実施例２：Ｍａｎ３グリコシル化Ｆａｂ抗体は、ヒトマクロファージで効率的な内部移行及びリソソーム標的化をもたらす。
抗体は、ｐＨｒｏｄｏ色素（ｐＨｒｏｄｏ ｉＦＬ Ｒｅｄ ＳＴＰ Ｅｓｔｅｒ［アミン反応性］、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ｒｅｆ．Ｐ３６０１１）でメーカーの指示に従って標識した。ｐＨｒｏｄｏの蛍光は低ｐＨで活性化されるため、タンパク質の内部移行とリソソーム経路へのターゲティングを可視化することができる。

【0155】

各抗体のｐＨｒｏｄｏ標識度（ＤＯＬ）は次のように決定された。抗体を変性緩衝液で１：２に希釈し、Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して２８０ｎｍ及び５６０ｎｍの波長（Ａ２８０及びＡ５６０）で分析した。タンパク質濃度とｐＨｒｏｄｏ ＤＯＬは次のように計算された。

【0156】

【数1】

【0157】

【数2】

【0158】

ＭＷは使用した抗体の分子量：１４４０００ｇ／Ｍｏｌである。λｍａｘは５６０ｎｍで測定された吸光度である。ε色素は吸光係数：６５０００Ｍ^－１ｃｍ^－１である。希釈倍率は２である。

【0159】

この実験で使用した抗体を、ＦｃまたはＦａｂ部分上のそれらの主要Ｎ－グリカン構造とともに表２に示す。ヒト供血者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的フィコール勾配法を使用してバフィーコートから採取した。単球を、ＥａｓｙＳｅｐヒト単球分離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｒｅｆ．１９３５９）を使用してＰＢＭＣから分離した。単球を組織培養皿（Ｆａｌｃｏｎ、ｒｅｆ．３５３００３）にマクロファージ分化培地中５×１０^５細胞／ｍｌにて播種した。マクロファージ分化培地は、Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ、Ｒ８７５８）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＰａｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｐ３０５５００）、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ４３３３）、５０ｎｇ／ｍｌ ｈＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、３００－２５）を添加したＲＰＭＩ－１６４０であった。細胞を細胞培養インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。３日目に、細胞培養培地の半分を新鮮なマクロファージ分化培地で置き換えて交換した。合計６～７日の分化後、マクロファージを回収した。細胞培養プレートをＰＢＳ１×（Ｓｉｇｍａ、Ｄ８５３７）ですすぎ、ＰＢＳ１×＋１ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５５７５－０２０）中で氷上にて１５分間インキュベートした。マクロファージを、細胞擦過及びピペット操作によって回収した。

【0160】

【表2】

【0161】

マクロファージの表現型を、ＣＤ１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ２０６及びＣＤ１６３の染色を行ってフローサイトメトリーにより確認した。細胞の少なくとも９０％がＣＤ１４＋ ＣＤ２０６＋ ＣＤ１６３＋であり、マクロファージが適切に分化していることが確認された。

【0162】

マクロファージを内部移行培地に再懸濁し、９６ウェル平底細胞培養プレートに１０^５細胞／ウェルにて総体積０．１ｍｌで播種した。内部移行培地は、２％ＦＢＳを添加したＬ－グルタミン含有ＲＰＭＩ－１６４０である。マクロファージを、プールされたヒト免疫グロブリン（ＩＶＩｇ、薬局から入手したＨｉｚｅｎｔｒａ）とともに２ｍｇ／ｍｌの最終濃度にて３７℃で３０分間プレインキュベートしてからｐＨｒｏｄｏ標識抗体を１μｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。マクロファージを、ｐＨｒｏｄｏ－抗体＋ＩＶＩｇとともに３７℃で３時間インキュベートした。その後、細胞培養物を洗浄し、トリプシン処理を使用してマクロファージを回収し、直ちにフローサイトメーターで取得した。

【0163】

標準的なフローサイトメトリーソフトウェアを使用して、ゲートされた単一細胞集団に対するｐＨｒｏｄｏの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を分析した。ＭＦＩ値はｐＨｒｏｄｏ ＤＯＬに調整された。その後、調整ＭＦＩ値を、各ドナーについて、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）（アダリムマブ）（Ｈ－Ａ２Ｆ）を基準として正規化した。図２は、マクロファージの内部移行データを示す。Ｍａｂｔｈｅｒａ（リツキシマブ）（Ｍ－Ａ２Ｆ）及びＨｕｍｉｒａ（登録商標）（Ｈ－Ａ２Ｆ）の内部移行は同様であった。Ｆｃ部分上にＭ３グリカンを提示するアダリムマブ変異体（Ａ－Ｍ３）もまた、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）及びＭａｂｔｈｅｒａと同様に内部移行した。Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）及びＡ－Ｍ３（ＰＮＧａｓｅ）の脱グリコシル化は、約６０％の内部移行減少をもたらした。脱グリコシル化は、Ｆｃガンマ受容体の相互作用及びＮ－グリカン受容体の相互作用を破壊し、そのため、ベースラインの内部移行レベルを示す。Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）及びＭａｂｔｈｅｒａは、マクロファージ上のＦｃガンマ受容体により内部移行された。対照的に、Ｆａｂ部分上にＭ３グリカンを提示するＡ８４８６－Ｍ３変異体は、全ドナーで、マクロファージに高レベルで内部移行された。Ａ８４８６－Ｍ３の内部移行は、ドナーに応じて、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）ベースラインよりも１７～３９倍高かった。Ｆａｂ部分上に７０％のシアル酸末端Ｎグリカンを有するＡ８４８６－Ａ２Ｇ２Ｓ２変異体はまた、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）ベースラインよりも６倍効率的に内部移行された。

【0164】

これらの結果は、抗体のＦａｂ部分上に提示されるＭ３グリカンが、ヒトマクロファージによる強力な内部移行及びリソソーム経路へのターゲティングをもたらすことを示す。Ｍａｎ３媒介性リソソーム標的化は、シアル酸媒介性リソソーム標的化よりも強力であった。これらのデータはまた、Ｍａｎ３グリカンの位置により効率的な内部移行が可能になることも示す。Ｆａｂ Ｍａｎ３グリカンはヒトマクロファージによる効率的な内部移行をもたらす。

【0165】

７．３ 実施例３：Ｍａｎ３グリコシル化Ｆａｂ抗体は、ヒト樹状細胞における効率的な内部移行及びリソソーム標的化をもたらす。
２人のヒト供血者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的フィコール勾配法を使用してバフィーコートから採取した。ＥａｓｙＳｅｐヒト単球分離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｒｅｆ．１９３５９Ｃ）をメーカーの指示に従って使用して単球をＰＢＭＣから分離した。

【0166】

精製した単球を樹状細胞分化培地に再懸濁し、Ｔ７５細胞培養フラスコ内に３×１０^５細胞／ｃｍ^２にて播種した。樹状細胞分化培地には、Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ、Ｒ８７５８）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＰａｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｐ３０５５００）、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ４３３３）、５０ｎｇ／ｍｌ（５００Ｕ／ｍｌ）ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、３００－０３－２０ＵＧ）、５０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＩＬ－４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００－０４－２０ＵＧ）を添加したＲＰＭＩ－１６４０が含まれた。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で３日間インキュベートした。３日目に、培養培地の半分を新鮮な樹状細胞分化培地で置き換えた。５日目、培地を、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＡＦ－３００－０１Ａ）ならびに１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１β（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００－０１Ｂ－１０ＵＧ）及びＩＬ－６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００－０６－５ＵＧ）を添加した新鮮な樹状細胞分化培地に置き換えた。細胞をさらに２日間さらに培養した（総分化時間は７日）。細胞培養物を洗浄し、ＰＢＳ０．０２％ＥＤＴＡ中で氷上にて３０分間インキュベートした。接着細胞をピペット操作で採取し、ＰＢＳで洗浄した。

【0167】

樹状細胞分化は、以下の抗体：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７ 抗ヒトＣＤ１６３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３３３６１９、１：２００）、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙａｎｉｎｅ５．５ 抗ヒトＣＤ１ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３００１２９、１：２００）、ＰＥ抗ヒトＣＤ１４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３０１８０５、１：４００）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ 抗ヒトＣＤ２０６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３２１１１３、１：２００）を使用しＣＤ１ａ、ＣＤ１４ ＣＤ２０６及びＣＤ１６３の染色を行い、フローサイトメトリーによって確認した。両ドナーとも、ＣＤ１ａ＋及びＣＤ２０６＋により評価されるように、少なくとも８０％の分化樹状細胞を示した。

【0168】

ｐＨｒｏｄｏで標識した抗体を実施例ＩＩに記載のように調製した。抗体及びそれらのグリカン構造及びｐＨｒｏｄｏ ＤＯＬは表２に記載されている。

【0169】

樹状細胞を平底９６ウェルプレートに０．５×１０^６細胞／ウェルで播種した。樹状細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＩＶＩｇ（Ｈｉｚｅｎｔｒａ、薬局から入手）とともに３７℃で３０分間プレインキュベートしてからｐＨｒｏｄｏ標識抗体を１０μｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。樹状細胞を抗体とともに６時間インキュベートした。その後、細胞を回収し、フローサイトメーターで取得した。

【0170】

フローサイトメトリーのデータを、標準的なフローサイトメトリーソフトウェアを使用して分析した。効率的な内部移行が行われた細胞のパーセンテージを、図３Ａに示すように、ｐＨｒｏｄｏ内部移行が高レベルの細胞をゲーティングすることにより定義した（高ｐＨｒｏｄｏ集団）。図３Ｂは、試験した異なる糖鎖変異体の高ｐＨｒｏｄｏ細胞のパーセンテージを示す。データは、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）（Ｈ－Ａ２Ｆ）及びＭａｂｔｈｅｒａ（Ｍ－Ａ２Ｆ）は低効率で樹状細胞により内部移行されたが、Ａ８４８６－Ｍ３変異体は高度に内部移行されたことを示す。Ａ－Ｍ３変異体は、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）またはＭａｂｔｈｅｒａよりも高いが、Ａ－８４８６－Ｍ３変異体より明らかに劣る内部移行を示した。興味深いことに、Ａ８４８６－Ａ２Ｇ２Ｓ２変異体は低い内部移行を示した。

【0171】

全体として、実施例Ｉ～ＩＩＩのこれらのデータは、マクロファージ及び樹状細胞のいずれについても、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）及びＭａｂｔｈｅｒａ（Ａ２Ｆ構造）に代表される標準的ＩｇＧ抗体により提示される古典的グリカン構造と比較して、Ｍａｎ３グリカンが強力な内部移行及びリソソームへのターゲティングをもたらすことを示す。これらのデータはまた、Ｍａｎ３グリカンの位置を選択することにより、特に効率的な内部移行がもたらされ得ることも示す－Ｆａｂ断片上に提示されたＭａｎ３グリカンは、Ｆｃ断片上（カノニカルＮ２９７上）のＭａｎ３グリカンよりもはるかに強力な内部移行をもたらした。最後に、これらのデータは、グリカン構造が異なれば、標的化する細胞型ならびに内部移行及び分解の効率が異なってくることを強調している。シアル化グリカンはマクロファージにより内部移行されるが、樹状細胞では内部移行されない。したがって、グリカン構造、及びその位置を適応させることにより、タンパク質を特定の細胞型に導き、したがって、内部移行及び分解の効力、ならびにタンパク質分解の機能的結果を調節することが可能である。

【0172】

７．４ 実施例４：ヒトマクロファージにおけるＭａｎ３グリコシル化Ｆａｂ抗体の内部移行及びリソソーム標的化は、マンノース受容体によって媒介され、提示されるＭａｎ３の負荷によって調節される。
Ｆａｂ上にＭａｎ３グリカンを提示する抗体の内部移行が、提示されるＭａｎ３の量によって調節されるのかどうかを評価するため、Ｆａｂ断片に１つ、２つまたは３つの糖鎖部位が挿入された糖鎖変異体を使用して実験を行った。抗体を精製し、実施例Ｉに記載のようにｐＨｒｏｄｏで標識した。表３は、本試験の対象となった抗体の特性を示す。すべての抗体は、サイズ排除ＨＰＬＣ法による評価で凝集レベルが５％未満、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析による評価で９４％超の純度を示し、エンドトキシンレベルが１ＥＵ／ｍｇ（ＬＡＬアッセイ）未満であった。グリカン及びタンパク質の分析方法は実施例Ｉに記載されている。

【0173】

【表3】

【0174】

ヒト単球由来Ｍ２マクロファージを実施例ＩＩに記載のように生成した。マクロファージの表現型を、ＣＤ１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ２０６及びＣＤ１６３の染色を行ってフローサイトメトリーにより確認した。典型的には、マクロファージの純度は８０％超であり、ＣＤ２０６＋マクロファージの平均パーセンテージは８０％超であった（図５）。

【0175】

マクロファージを内部移行培地に再懸濁し、９６ウェル平底細胞培養プレートに１０^５細胞／ウェルにて総体積０．１ｍｌで播種した。内部移行培地は、２％ＦＢＳを添加したＬ－グルタミン含有ＲＰＭＩ－１６４０である。マクロファージを、プールされたヒト免疫グロブリン（ＩＶＩｇ、薬局から入手したＨｉｚｅｎｔｒａ）とともに２ｍｇ／ｍｌの最終濃度にて３７℃で３０分間プレインキュベートしてからｐＨｒｏｄｏ標識抗体を１μｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。マクロファージをｐＨｒｏｄｏ－抗体＋ＩＶＩｇとともに３７℃で３時間または２４時間インキュベートした。いくつかの条件では、ｐＨｒｏｄｏ標識抗体の添加前に、マクロファージをマンナンとともに１ｍｇ／ｍｌで３０分間インキュベートした。その後、細胞培養物を洗浄し、トリプシン処理を使用してマクロファージを回収し、直ちにフローサイトメーターで取得した。標準的なフローサイトメトリーソフトウェアを使用して、ゲートされた単一細胞集団に対するｐＨｒｏｄｏの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を分析した。ＭＦＩ値をｐＨｒｏｄｏ ＤＯＬに調整して、調整ＭＦＩ値を生成した。アダリムマブ変異体（Ａ－８４及びＡ－８４．８６）の調整ＭＦＩを、Ｈ－Ａ２Ｆリファレンスに合わせて正規化した（正規化ＭＦＩ）。５Ｃ９－８４．８６．１６２－Ｍ３の調整ＭＦＩを、５Ｃ９－ＩｇＧ４－Ａ２Ｆ非改変参照抗体を基準として正規化した。

【0176】

図６及び表４は、調整ＭＦＩデータを示す。３時間後、Ａ－８４．８６－Ｍ３は、Ｈ－Ａ２Ｆリファレンスよりも高い内部移行を示した。同様に、５Ｃ９－８４．８６．１６２－Ｍ３は、５Ｃ９－Ａ２Ｆリファレンスよりも高い内部移行を示した。Ｈ－Ａ２Ｆ抗体及び５Ｃ９－Ａ２Ｆ抗体は、非常に類似した内部移行ベースラインを示し、ＩｇＧ１（アダリムマブ）またはＩｇＧ４アイソタイプ（５Ｃ９）が、これらの条件においては、マクロファージによる内部移行のベースラインに大きく影響しないことを示している。これらのデータは、抗体により提示されるＭ３グリカンの負荷と内部移行の効力との間に相関の傾向があることを示しており、Ｆａｂあたりの改変糖鎖部位が１つであるＡ－８４－Ｍ３は最も低い内部移行を示したが、Ｆａｂあたりの改変糖鎖部位が３つある５Ｃ９－８４．８６．１６２－Ｍ３は最も高い内部移行を示した。これらのデータ及び実施例ＩＩからのデータは、ヒト単球由来Ｍ２マクロファージによるＡ－８４８６－Ｍ３の内部移行の効力がＨ－Ａ２Ｆと比べて２～２０倍超の範囲であったことを示し、ドナーによって効力のばらつきが生じることを示している。３時間目、非Ｍ３抗体（Ａ－８４．８６－Ａ２Ｇ２、Ａ－８４．８６－Ａ２及びＡ－８４．８６－Ａ２ＧａｌＮＡｃ２）のいずれも、Ｈ－Ａ２Ｆよりも多い取り込みを示さなかった（図６Ａ）ことから、マクロファージが極めて選択的にＭａｎ３提示抗体を内部移行させることを示している。重要なことには、Ａ－８４８６－Ｍ３の内部移行が、マンノース受容体競合リガンドであるマンナンを１ｍｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ．Ｍ７５０４）で添加したことにより減少したが、Ｈ－Ａ２Ｆの取り込みはマンナンによる影響を受けなかった（表４）。これらのデータは、Ｍ２マクロファージによるＭ３抗体の内部移行がマンノース受容体（ＣＤ２０６）によって媒介されることを示す。２４時間目、内部移行のレベルは高くなっており、内部移行のサイクルの累積によるｐＨｒｏｄｏシグナルの蓄積と一致した。興味深いことに、Ａ－８４－Ｍ３を含め、すべてのＭ３抗体が、Ｈ－Ａ２Ｆ及び５Ｃ９－ＩｇＧ４－Ａ２Ｆのベースラインよりも高い内部移行を示し、糖鎖部位が１つでも操作されたＭ３ Ｆａｂ抗体は特異的に認識されて、Ｍ２マクロファージに内部移行できることを示している（図６Ｂ）。Ａ－８４８６－Ａ２Ｇ２抗体はまた、２４時間において、Ｈ－Ａ２Ｆと比較してかろうじて（ただし、統計学的には有意に）内部移行された。

【0177】

【表4】

表４は、２人のマクロファージドナーからの、指定された条件についての平均正規化ｐＨｒｏｄｏ ＭＦＩを示す。マクロファージを、マンナンを含む場合、または含まない場合で、ｐＨｒｏｄｏ標識抗体とともに２４時間インキュベートした。

【0178】

７．５ 実施例５：Ｍａｎ３グリコシル化Ｆａｂ抗体は、血中循環抗原をｉｎ ｖｉｖｏで強力に枯渇させる。
ＣＧＰで産生され、かつＭａｎ３末端グリカン（Ｍ３構造）を提示する抗体の循環細胞外抗原枯渇能力を評価するために、ラットを用いた実験が計画された。ラットに抗原と、Ｆａｂ上にＭ３グリカン構造を提示する抗体、または抗原に特異的な対照抗体を注射した。末梢血コンパートメントからの抗原の枯渇の程度を測定するために、処置動物の血清中の循環抗原のレベルを経時的に定量した。表５は、本試験の対象となった抗体の特性を示す。すべての抗体は、サイズ排除ＨＰＬＣ法による評価で凝集レベルが５％未満、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析による評価で９４％超の純度を示した。すべての糖鎖改変抗体は、抗原「ＨＣＡ２０２」への高い結合性を保った。

【0179】

【表5】

【0180】

実験開始時に１８０～２２０ｇのＷｉｓｔａｒ雌ラット（Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ， Ｓｔ Ｂｅｒｔｈｅｖｉｎ，フランス，ｒｅｆ．ＲｊＨａｎ：ＷＩ）に、抗アダリムマブＦａｂ断片ＨＣＡ２０２（Ｂｉｏｒａｄ、ｒｅｆ．ＨＣＡ２０２）（抗原）を０．５ｍｇ／ｋｇ用量、０．５ｍｌ／ラットで静脈内ボーラス注射した。ＨＣＡ２０２化合物は、注入前にＰｉｅｒｃｅ（商標） Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、ｒｅｆ．８８２７４）を使用したエンドトキシン除去ステップに供された。１５分後、ラットに抗体（表４及び表５）またはＰＢＳを注射した。血液サンプルは、抗体注射後１５～３０分、１時間、６時間及び２４時間の時点で穿刺により頚静脈から採取した。４８時間後に終末血液サンプルを腹部大動脈から採取した。血液サンプルを室温で３０分間凝固させた後、遠心分離して血清を採取した。

【0181】

総ＨＣＡ２０２レベル（結合抗体＋遊離ＨＣＡ２０２）をＥＬＩＳＡ法により測定した。抗Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ、Ｒｅｆ．３４６６０）を、コーティング緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ ７．４、最終組成：８ｍＭ Ｎａ－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、８ｍＭ Ｋ－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ）中で、５μｇ／ｍｌで９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上に４℃で一晩コーティングした。ＨＣＡ２０２は重鎖のＣ末端にヒスチジンタグを持っているため、この抗体は抗体結合及び遊離ＨＣＡ２０２の捕捉を可能にする。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳＴ＝０．０５％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。ブロッキング緩衝液（ＰＢＳＴ中２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を各ウェルに添加し、プレートを室温で１～３時間インキュベートした。１：３希釈で５００ｎｇ／ｍｌから０．７ｎｇ／ｍｌまでの７点検量線を別の希釈プレート上で作成した。そのために、希釈していない正常なラットのウィスター血清に５μｇ／ｍｌのＨＣＡ２０２と３倍モル過剰のアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）をスパイクした。スパイクした血清を室温で１０分間インキュベートして、アダリムマブ／ＨＣＡ２０２免疫複合体を形成した。スパイクされた血清を、希釈剤Ｂ（ＰＢＳＴ中の２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を添加することによって１０倍（ＭＲＤ１０）に希釈した。免疫複合体標準曲線の１：３連続希釈は、希釈剤Ｂを使用して実行された。試験サンプルも同様に処理された。希釈剤Ｂを使用して、試験血清サンプルを希釈プレートで（ＭＲＤ１０サンプルを得るために）１０倍に希釈した。標準検量線の線形範囲内にシグナルが収まるように、必要に応じてＭＲＤ１０サンプルを希釈剤Ａ（２％ＢＳＡ＋０．０５％ＰＢＳＴで希釈した１／１０ウィスターラットのプール血清）でさらに希釈した。ブロッキング後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。検量物質及び希釈した検体をＥＬＩＳＡプレートに二重に添加し、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、１０００ｎｇ／ｍｌのＨｕｍｉｒａ溶液を各サンプルに添加した。ＥＬＩＳＡプレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。検出抗体溶液は、ヤギ抗ヒトカッパＬＣ－ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、ｒｅｆ．Ａ１８８５３）を希釈液Ｂで１：５０００に希釈して調製した。検出抗体溶液をＥＬＩＳＡプレートに添加し、遮光して室温で１時間インキュベートした。次いで、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）基質を添加して、続いてＨ_２ＳＯ_４でクエンチすることによって明らかにした。ＥＬＩＳＡプレートは、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１などのプレートリーダーで４５０及び６５０ｎＭで読み取った。データ分析は、Ｇｅｎ５（Ｂｉｏｔｅｋ）などの標準ソフトウェアを使用して行った。

【0182】

血清サンプル中の抗体レベルはＥＬＩＳＡ法により定量できる。このアッセイは、サンプル中に存在するアダリムマブ及びアダリムマブ変異体を捕捉するために、ヒトＴＮＦαでコーティングするステップから構成される。検出は、抗ヒトガンマＨＣ特異的ＨＲＰタグ付き検出抗体を介して実行できる。したがって、このアッセイでは遊離抗体（ＨＣＡ２０２に結合していない少なくとも１つのＦａｂアームを有する抗体）のみが定量される。簡単に言えば、組換えヒトＴＮＦ－α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ｒｅｆ．ＡＦ－３００－０１Ａ）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上に、通常１μｇ／ｍｌでｐＨ７．４のＰＢＳ中で４℃で一晩コーティングする。ブロッキング緩衝液、希釈緩衝液Ａ及びＢ、及び洗浄緩衝液は、ＨＣ２０２ ＥＬＩＳＡで使用したものと同じである。プレートを３回洗浄し、ＨＣＡ２０２ ＥＬＩＳＡに記載されているようにブロッキング緩衝液でブロックする。通常、１：３希釈で３３３．３ｎｇ／ｍｌから０．５ｎｇ／ｍｌまでの７点検量線は、希釈緩衝液Ｂで１０倍希釈（最小必要な１０倍希釈、ＭＲＤ１０）したプールしたウィスターラット血清に１μｇ／ｍｌのアダリムマブをスパイクすることによって作成される。試験血清サンプルも希釈緩衝液Ｂで希釈する（最低ＭＲＤ１０サンプル）。希釈した検体と標準検量線サンプルをＥＬＩＳＡプレートに移し、ブロッキングステップ後、室温で１時間インキュベートする。その後、プレートを３回洗浄し、検出抗体の溶液を添加する。検出抗体の溶液は、例えばヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）－ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ．Ａ６０２９）抗体（通常希釈率１：１０，０００）を希釈緩衝液Ｂで希釈して調製することができる。ＥＬＩＳＡプレートは検出抗体とともに遮光され、室温で通常１時間インキュベートする。次いで、プレートを３回洗浄し、ＨＣＡ２０２ ＥＬＩＳＡに記載されているようにＴＭＢ基質を添加することによって明らかにする。

【0183】

図７は、ＨＣＡ２０２（抗原）レベルについて得られたデータを示す。表６は、ＨＣＡ２０２枯渇データを示す。抗体を注射しなかった場合（ＰＢＳ条件）、ＨＣＡ２０２は、Ｆａｂ断片で予想されるように、４８時間かけてゆっくりと減衰する。Ｈ－Ａ２Ｆ（非改変アダリムマブ、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））の治療により、２４時間及び４８時間の時点でＨＣＡ２０２レベル増加がもたらされた。Ａ－Ｍ３及びＡ－８４８６－Ａ２Ｇ２Ｓ２で治療した場合も、ＰＢＳ治療と比較してＨＣＡレベル増加がもたらされた（ＰＢＳではＣゼロから７２％枯渇したのに対し、Ｈ－Ａ２Ｆ、Ａ－Ｍ３及びＡ－８４８６－Ａ２Ｇ２Ｓ２では６時間で５２～６３％枯渇した）。Ｃゼロは、即時均一な全血分布を考慮した場合、注射直後に達成されるはずの血清中の（ＨＣＡの）理論的濃度である。これは、これらの抗体には枯渇作用がないことを示す。対照的に、露出したＭａｎ３グリカンを提示するＡ－８４－Ｍ３及びＡ－８４８６－Ｍ３の注射では、非枯渇抗体及びＰＢＳと比較して１時間ですでにＨＣＡ２０２の完全な枯渇がもたらされ（９９％及び９４％の枯渇）、６時間で検出不可能レベルであった（表６）。

【0184】

【表6】

【0185】

これらのデータは、Ｆａｂ断片上にＭ３グリカンを表示する抗体が、非常に短時間で血液循環から循環抗原を除去する著しく高い効力を持つことを強調する。対照的に、Ｆｃ断片内に提示されたＭ３グリカンは、能動的枯渇を引き起こさない。

【0186】

７．６ 実施例６：Ｍａｎ３グリコシル化Ｆａｂ抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで肝臓を標的とする。
マンノース末端グリカン（Ｍ３構造）を表示する抗体のｉｎ ｖｉｖｏ分布を研究するために、Ｍ３または対照グリカンを表示する蛍光標識抗体を使用し、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの断層撮影イメージングを用いた、マウスによる試験が設計された。

【0187】

抗体は、メーカーの指示に従って、ＣＦ７５０標識キット（Ｂｉｏｔｉｕｍ、ｒｅｆ．９２２２１）を使用して、１ｍｇ／ｍＬで少なくとも１ｍＬの体積で標識した。標識後、標識度（ＤＯＬ）を測定した。ＤＯＬは２．７～５．２の範囲であったため、抗体は同様に標識されていると考えられた。実施例Ｖの表５は、本試験の対象となった抗体の特性を示す。実験開始の５～６週間目のＳＫＨ１免疫応答性ヘアレスマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｒｅｆ．Ｃｒｌ：ＳＫＨ１－ｈｒ）に、ＣＦ７５０標識抗体を５ｍｇ／ｋｇの用量で（静脈内ボーラス）注射した。マウスは、ＦＭＴ２５００（商標）蛍光断層撮影ｉｎ ｖｉｖｏイメージングをシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で使用して撮像し、当該システムは、２Ｄ表面蛍光反射率画像（ＦＲＩ）と３Ｄ蛍光断層撮影（ＦＭＴ）画像データセットの両方を収集した。ＦＭＴ（ＮＩＲ励起レーザー７４５ｎｍ／発光７７０～８００ｎｍ）を用いて、各動物について背臥位で２回のスキャン（胸部領域＋腹部領域）を０．２５時間、１時間、３時間、６時間、２４時間、４８時間の時点で実行した。収集した蛍光データは、動物全身の３次元蛍光シグナルを定量化するために、ＦＭＴ２５００システムソフトウェア（ＴｒｕｅＱｕａｎｔ Ｖ２．０、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって再構成された。胸部、腹部、肝臓領域に関連する生物学的領域を含む３次元の関心領域（ＲＯＩ）が描出された。各ＲＯＩにおける標識抗体の量と用量のパーセンテージを各時点で決定した。６時間及び４８時間の時点で、甲状腺（気管を含む）、肺、心臓、肝臓、脾臓、腎臓を摘出し、ＦＭＴイメージングに供した。

【0188】

図８は、各抗体の胸部及び肝臓ＲＯＩのＦＭＴ画像データを経時的に示す。表７は、採取された臓器の６時間後の取得されたＦＭＴ画像データを示す。非改変対照抗体のＨ－Ａ２Ｆ（アダリムマブ、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））は、肝臓領域に低レベルのシグナルが分布した分布プロファイルを示した。肝臓領域ではシグナルは時間の経過とともに増加しなかった（図８）。６時間の時点で、Ｈ－Ａ２Ｆの注射用量の６％しか肝臓に存在しなかったが（表７）、他のすべての臓器で検出された。この分布パターンは、正常なヒトＩｇＧ及び広く分布し、依然として主に血液中に存在する抗体の特徴と一致している。抗体Ａ－Ｍ３は、Ｈ－Ａ２Ｆと同様の分布プロファイルを示し、広い臓器分布であった。Ａ－８４８６－Ｍ３抗体は、肝臓領域への急速かつ優先的な分布を示した（図８）。６時間の時点で、Ａ－８４８６－Ｍ３の注射用量の１９％が肝臓に存在した（表７）。Ａ－８４８６－Ｍ３抗体は甲状腺、肺、心臓、腎臓には存在せず、脾臓でのみ検出可能であった。この分布パターンは、血液中に存在しない抗体の特徴である。これは、Ａ－８４８６－Ｍ３がＭ２マクロファージ上のマンノース受容体により内部移行され（実施例ＩＶ）、非常に迅速かつ強力な循環抗原の枯渇を示した（実施例Ｖ）ことを示すデータと一致する。これらのデータは、Ｆａｂ断片にＭ３構造を提示する抗体がマンノース受容体（ＣＤ２０６）によって認識され、それが内部移行とリソソーム分解経路へのルーティングを引き起こすという仮定を支持している。

【0189】

【表7】

表は、６時間の時点で示された採取臓器に注入された蛍光団用量の平均（Ｎ＝３）％を示す。

【0190】

本願を通して、さまざまな刊行物が参照されている。これらの刊行物の開示はそれらの全体が、本発明が属する最新技術をより詳細に説明するために本願で参照することにより本明細書に組み込まれる。

【0191】

本発明は、上記で提供された例を参照しながら説明されてきたが、本発明の趣旨から逸脱することなく、さまざまな修正を行うことができることを理解されるべきである。

参考文献
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［５］Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｆｏｒ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ ｅｖｏｌｖｉｎｇ ｖｉｅｗｓ．” Ｃａｎｃｅｒｓ １２．１２（２０２０）：３６３８．
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［７］Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．“Ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ：Ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ．” Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６１（２０２０）：１０５１１１．
［８］Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ＲＤ，Ｓｃｈｎａａｒ ＲＬ，Ｅｓｋｏ ＪＤ，Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ Ｋ，Ｔａｙｌｏｒ ＭＥ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｌｙｃａｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．２０１７．Ｉｎ：Ｖａｒｋｉ Ａ，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ＲＤ，Ｅｓｋｏ ＪＤ，Ｓｔａｎｌｅｙ Ｐ，Ｈａｒｔ ＧＷ，Ａｅｂｉ Ｍ，Ｄａｒｖｉｌｌ ＡＧ，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ Ｔ，Ｐａｃｋｅｒ ＮＨ，Ｐｒｅｓｔｅｇａｒｄ ＪＨ，Ｓｃｈｎａａｒ ＲＬ，Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ ＰＨ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ［インターネット］．３ｒｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（ＮＹ）：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；２０１５－２０１７
［９］Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ Ｋ，Ｔａｙｌｏｒ ＭＥ．Ｒｅｃｅｎｔ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．２０１５ Ｏｃｔ；３４：２６－３４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｂｉ．２０１５．０６．００３．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｊｕｌ ７．ＰＭＩＤ：２６１６３３３３；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４６８１４１１．
［１０］Ｔａｙｌｏｒ ＭＥ，Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ Ｋ．Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｕｇａｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｋｎｏｗｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｕｎｅｘｐｌｏｒｅｄ ｒｏｌｅｓ．ＦＥＢＳ Ｊ．２０１９ Ｍａｙ；２８６（１０）：１８００－１８１４．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｆｅｂｓ．１４７５９．Ｅｐｕｂ ２０１９ Ｆｅｂ ６．ＰＭＩＤ：３０６５７２４７；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ６５６３４５２．
［１０］Ｔａｙｌｏｒ ＭＥ，Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ Ｋ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｗｈａｔ ｇｌｙｃａｎ ａｒｒａｙｓ ｔｅｌｌ ｕｓ ａｂｏｕｔ ｈｏｗ ｇｌｙｃａｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅｉｒ ｌｉｇａｎｄｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００９ Ｎｏｖ；１９（１１）：１１５５－６２．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｇｌｙｃｏｂ／ｃｗｐ０７６．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｊｕｎ １５．ＰＭＩＤ：１９５２８６６４；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２７５７５７２．
［１１］Ｌｅｐｅｎｉｅｓ Ｂ，Ｌｅｅ Ｊ，Ｓｏｎｋａｒｉａ Ｓ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｌｉｇａｎｄｓ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１３ Ａｕｇ；６５（９）：１２７１－８１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１３．０５．００７．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｍａｙ ３０．ＰＭＩＤ：２３７２７３４１．
［１２］Ａｌｌａｖｅｎａ Ｐ，Ｃｈｉｅｐｐａ Ｍ，Ｍｏｎｔｉ Ｐ，Ｐｉｅｍｏｎｔｉ Ｌ．Ｆｒｏｍ ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ：ｔｈｅ ｄｏｕｂｌｅ－ｆａｃｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍａｎｎｏｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；２４（３）：１７９－９２．ｄｏｉ：１０．１６１５／ｃｒｉｔｒｅｖｉｍｍｕｎｏｌ．ｖ２４．ｉ３．２０．ＰＭＩＤ：１５４８２２５３．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【国際調査報告】