2024-513757 グリカン媒介タンパク質分解

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-27

(54)【発明の名称】グリカン媒介タンパク質分解

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20240319BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 5/14 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20240319BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240319BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240319BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46

A61P37/06

A61P35/00

A61P1/16

A61P29/00

A61P7/04

A61P5/14

A61P43/00 111

A61P21/04

A61P17/00

A61P25/28

A61P25/00

A61P13/12

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K39/395 E

A61K39/395 T

C12N15/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023558417

(86)(22)【出願日】2022-03-22

(85)【翻訳文提出日】2023-10-26

(86)【国際出願番号】 EP2022057556

(87)【国際公開番号】W WO2022200390

(87)【国際公開日】2022-09-29

(31)【優先権主張番号】63/164,963

(32)【優先日】2021-03-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523360197

【氏名又は名称】グリコエラ アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】100097456

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 徹

(72)【発明者】

【氏名】アミレザ ファリドモアヤー

(72)【発明者】

【氏名】レイナー フォラドール

(72)【発明者】

【氏名】マニュエラ マリー

(72)【発明者】

【氏名】ジョナサン アルバート バック

【テーマコード（参考）】

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085CC23

4C085EE01

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG06

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045BA53

4H045DA75

4H045EA20

4H045FA50

4H045FA70

4H045GA26

(57)【要約】

本開示は、グリカン媒介分解のための糖鎖改変二機能性結合タンパク質を提供する。そのようなグリカン修飾は、現在の治療を改善し、患者にとってより良好な生活の質を可能にするであろう。したがって、そのような糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、さまざまな疾患を治療及び予防するために有用である。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

疾患に関連する標的タンパク質に特異的に結合する第１の部分と、エンドサイトーシス炭水化物結合タンパク質または受容体に特異的に結合する第２の部分であって、グリカン構造を含む前記第２の部分と、を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項2】

標的タンパク質に特異的に結合する第１の部分と、末端ＧｌｃＮＡｃを含むグリカンを含む第２の部分と、を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項3】

標的タンパク質に特異的に結合する第１の部分と、末端ＧａｌＮＡｃを含むグリカンを含む第２の部分と、を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項4】

標的タンパク質に特異的に結合する第１の部分と、末端Ｇａｌを含むグリカンを含む第２の部分と、を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項5】

標的タンパク質に特異的に結合する第１の部分と、下記の構造を含むグリカンを含む第２の部分と、を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質であって、

【化1】

四角はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を表し、黒い縞模様の丸はマンノース（Ｍａｎ）残基を表し、Ｘは二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表す、前記糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項6】

標的タンパク質に特異的に結合する第１の部分と、下記の構造を含むグリカンを含む第２の部分と、を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質であって、

【化2】

黒い四角はＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を表し、白い四角はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を表し、黒い縞模様の円はマンノース（Ｍａｎ）残基を表し、Ｘは前記二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表す、前記糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項7】

標的タンパク質に特異的に結合する第１の部分と、下記の構造を含むグリカンを含む第２の部分と、を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質であって、

【化3】

白い丸はガラクトース（Ｇａｌ）残基を表し、四角はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を表し、黒い縞模様の丸はマンノース（Ｍａｎ）残基を表し、Ｘは前記二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表す、前記糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項8】

糖鎖改変二機能性結合タンパク質であって、前記二機能性結合タンパク質は、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）下記の構造のＮ－グリカンを含み、

【化4】

前記Ｎ－グリカンは、１、２、３、４または５個のＮ－グリコシル化部位で前記二機能性結合タンパク質に連結される、前記糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項9】

近位ＧｌｃＮＡｃの前記Ｎ－グリカンの任意の分岐構造も含み得る、請求項８に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項10】

ＧｌｃＮＡｃ残基がフコシル化されている、請求項８に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項11】

前記末端Ｎ－グリカンがＧｌｃＮＡｃからなる、請求項８に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項12】

糖鎖改変二機能性結合タンパク質であって、前記二機能性結合タンパク質は、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）下記の構造のＮ－グリカンを含み、

【化5】

前記Ｎ－グリカンは、１、２、３、４または５個のＮ－グリコシル化部位で前記二機能性結合タンパク質に連結される、前記糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項13】

近位ＧｌｃＮＡｃの前記Ｎ－グリカンの任意の分岐構造も含み得る、請求項１２に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項14】

ＧｌｃＮＡｃ残基がフコシル化されている、請求項１２に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項15】

前記末端Ｎ－グリカンがＧａｌＮＡｃからなる、請求項１２に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項16】

糖鎖改変二機能性結合タンパク質であって、前記二機能性結合タンパク質は、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）下記の構造のＮ－グリカンを含み、

【化6】

前記Ｎ－グリカンは、１、２、３、４または５個のＮ－グリコシル化部位で前記二機能性結合タンパク質に連結される、前記糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項17】

近位ＧｌｃＮＡｃの前記Ｎ－グリカンの任意の分岐構造も含み得る、請求項１６に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項18】

ＧｌｃＮＡｃ残基がフコシル化されている、請求項１６に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項19】

前記末端Ｎ－グリカンがＧａｌからなる、請求項１６に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項20】

前記アミノ酸残基がＡｓｎである、請求項５～９のいずれか１項に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項21】

前記タンパク質は、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上のＮ－グリカン構造を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項22】

前記グリカン構造は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＭａｎ－６－Ｐ－Ｎ－グリカンを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項23】

前記グリカン構造がＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である、請求項２２に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項24】

前記グリカン構造がＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である、請求項２２に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項25】

前記グリカン構造がＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である、請求項２２に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項26】

前記二機能性タンパク質は、抗体またはその断片であり、かつ重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項27】

前記二機能性タンパク質は、抗体またはその断片であり、かつＦａｂ断片を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項28】

前記糖鎖改変二機能性結合タンパク質が抗体である、請求項１～２５のいずれか１項に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項29】

前記抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項２８に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項30】

前記抗体が組換え体である、請求項２８に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項31】

前記抗体がヒト化抗体、キメラ抗体、または完全ヒト抗体である、請求項２８に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項32】

前記抗体が、２対１、４対１、６対１、８対１、または１０対１のグリカン対タンパク質の比を有する、請求項２８に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項33】

前記抗体が、所定の特定の残基でグリコシル化されている、請求項２８に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項34】

前記糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、自己抗体に結合し、自己抗原またはその免疫原性断片を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項35】

与えられた糖鎖部位のグリカンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同じである、先行請求項のいずれか１項に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質の集団。

【請求項36】

前記標的タンパク質が細胞表面分子または非細胞表面分子である、先行請求項のいずれか１項に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項37】

前記細胞表面分子が受容体である、請求項３６に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項38】

前記非細胞表面分子が細胞外タンパク質である、請求項３６に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項39】

前記細胞外タンパク質が、自己抗体、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、血液タンパク質、または中枢神経系（ＣＮＳ）タンパク質である、請求項３８に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項40】

前記標的タンパク質が前記第１の部分によって結合される、先行請求項のいずれか１項に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項41】

疾患に関連する前記標的タンパク質が、非疾患状態と比較して前記疾患においてアップレギュレートされている、先行請求項のいずれか１項に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項42】

疾患に関連する前記標的タンパク質が、非疾患状態と比較して前記疾患において発現されている、先行請求項のいずれか１項に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項43】

疾患に関連する前記標的タンパク質が、がんの進行に関与している、先行請求項のいずれか１項に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項44】

前記疾患に関連する前記標的タンパク質は、ＴＮＦα、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、αｖβ３インテグリン、ＣＥＡ、ＣＸＣＲ４、ＭＵＣ１、ＬＣＡＭ１、ＥｐｈＡ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＶＩＳＴＡ、Ｎｏｔｃｈ受容体、ＥＧＦ、ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＬ２、ＣＣＲ２、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、Ｗｎｔ、ＬＲＰ５／６、ＣＳＦ－１Ｒ、ＳＩＲＰα、ＣＤ３８、ＣＤ７３、またはＴＧＦ－β、ボンベシンＲ、ＣＡＩＸ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ｖ６、エンプリン、エンドグリン、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ－α、葉酸Ｒ、ＧＲＰ７８、ＩＧＦ－１Ｒ、マトリプターゼ、メソテリン、ｓＭＥＴ／ＨＧＦＲ、ＭＴ１－ＭＭＰ、ＭＴ６－ＭＭＰ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、Ｔｎ抗原、及びｕＰＡＲ、ＴＳＨＲα、ＭＯＧ、ＡＣｈＲ－α１、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖の非コラーゲンドメイン１（α３ＮＣ１）、ＡＤＡＭＴＳ１３、デスモグレイン－１／３、またはＧＰＩｂ／ＩＸ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩａ／ＩＩａ、ＮＭＤＡ受容体、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、アンフィフィシン及びガングリオシドＧＭ１、ＧＤ３、ＧＱ１Ｂ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＶＥＧＦ－Ｒ、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＬ１２、ＣＳＦ－１、ＣＤ４７、凝集軽鎖または凝集トランスサイレチンを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項45】

前記自己免疫疾患に関連する前記標的タンパク質は、ＴＳＨＲα、ＭＯＧ、ＡＣｈＲ－α１、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖の非コラーゲンドメイン１（α３ＮＣ１）、ＡＤＡＭＴＳ１３、デスモグレイン－１／３、またはＧＰＩｂ／ＩＸ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩａ／ＩＩａ、ＮＭＤＡ受容体、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、アンフィフィシン、またはガングリオシドＧＭ１、ＧＤ３またはＧＱ１Ｂに結合する抗体である、先行請求項のいずれか１項に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項46】

前記エンドサイトーシス炭水化物結合タンパク質及び受容体は、ＤＣ－ＳＩＧＮ、Ｌ－ＳＩＧＮ、ＬＳＥＣＴｉｎ、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）、マンノース－６－リン酸受容体、ミンクル、デクチン－１、デクチン－２、ランゲリン、カチオン非依存性マンノース６－リン酸受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）、マクロファージマンノース受容体２、ＢＤＣＡ－２、ＭＧＬ、ＭＤＬ、ＭＩＣＬ、ＣＬＥＣ２、ＤＮＧＲ１、またはＣＬＥＣ１２Ｂを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項47】

前記疾患ががんを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項48】

前記疾患が自己免疫疾患を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質。

【請求項49】

標的タンパク質を肝細胞エンドソームに送達する方法であって、前記標的タンパク質のエンドサイトーシスを媒介する条件下で、前記標的タンパク質を請求項１～４８のいずれか１項に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質と接触させることを含む、前記方法。

【請求項50】

前記タンパク質上のグリカン構造の数を増加させると、送達速度が増加する、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

グリカン構造の数は、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上を含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記グリカン構造は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＭａｎ－６－Ｐ－Ｎ－グリカンを含む、請求項４９～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

前記グリカン構造がＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記グリカン構造がＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である、請求項５２に記載の方法。

【請求項55】

前記グリカン構造がＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である、請求項５２に記載の方法。

【請求項56】

標的タンパク質を分解する方法であって、宿主細胞による前記標的タンパク質のリソソーム分解を媒介する条件下で、前記標的タンパク質を請求項１～４８のいずれか１項に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質と接触させることを含む、前記方法。

【請求項57】

前記タンパク質上のグリカン構造の数を増加させると、リソソーム分解の速度が増加する、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

グリカン構造の数は、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上を含む、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記グリカン構造は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＭａｎ－６－Ｐ－Ｎ－グリカンを含む、請求項５６～５８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項60】

前記グリカン構造がＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

前記グリカン構造がＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である、請求項５９に記載の方法。

【請求項62】

前記グリカン構造がＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である、請求項５９に記載の方法。

【請求項63】

前記標的タンパク質は、がんにおいてアップレギュレートされるか、またはがんの進行に関与する、請求項５６に記載の方法。

【請求項64】

がんにおいてアップレギュレートされる、またはがんの進行に関与する前記標的タンパク質は、ＴＮＦα、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦＲ ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、αｖβ３インテグリン、ＣＥＡ、ＣＸＣＲ４、ＭＵＣ１、ＬＣＡＭ１、ＥｐｈＡ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＶＩＳＴＡ、Ｎｏｔｃｈ受容体、ＥＧＦ、ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＬ２、ＣＣＲ２、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、Ｗｎｔ、ＬＲＰ５／６、ＣＳＦ－１Ｒ、ＳＩＲＰα、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＣＤ３８、ＣＤ７３、またはＴＧＦ－βを含む、請求項５６に記載の方法。

【請求項65】

前記標的タンパク質が自己免疫疾患における自己抗体である、請求項５６に記載の方法。

【請求項66】

前記標的タンパク質が自己免疫疾患における自己抗原である、請求項５６に記載の方法。

【請求項67】

前記自己免疫疾患における前記自己抗体は、ＴＳＨＲα、ＭＯＧ、ＡＣｈＲ－α１、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖の非コラーゲンドメイン１（α３ＮＣ１）、ＡＤＡＭＴＳ１３、デスモグレイン－１／３、ＧＰＩｂ／ＩＸ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩａ／ＩＩａ、ＮＭＤＡ受容体、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、アンフィフィシン、またはガングリオシドＧＭ１、ＧＤ３またはＧＱ１Ｂに結合する抗体である、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記標的タンパク質が神経変性疾患においてアップレギュレートまたは発現される、請求項５６に記載の方法。

【請求項69】

神経変性疾患においてアップレギュレートまたは発現される前記標的タンパク質は、α－シヌクレイン、アミロイドβ、または補体カスケード成分である、請求項５６に記載の方法。

【請求項70】

前記宿主細胞は、肝臓細胞、骨髄細胞、免疫細胞、内皮細胞、実質細胞、または上皮細胞である、請求項５６に記載の方法。

【請求項71】

前記免疫細胞は、樹状細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア細胞、顆粒球またはＢリンパ球である、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記宿主細胞が任意の細胞である、請求項５６に記載の方法。

【請求項73】

前記糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、異なる第２の部分を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質の存在下での前記標的タンパク質の分解と比較して、前記標的タンパク質の分解を増強する、請求項５６に記載の方法。

【請求項74】

前記分解が、エンドサイトーシスまたはファゴサイトーシスによって媒介される、請求項５６に記載の方法。

【請求項75】

請求項１～４８のいずれか１項に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項76】

患者において疾患を治療または予防する方法であって、前記患者に、請求項１～４８のいずれか１項に記載の糖鎖改変二機能性タンパク質、または請求項７５に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。

【請求項77】

前記疾患は、自己免疫疾患、がんまたは腫瘍、肝疾患、炎症性障害、または血液凝固障害である、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

前記自己免疫疾患は、バセドウ病、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体関連疾患、重症筋無力症、抗ＧＢＭ疾患、免疫性血栓性血小板減少性紫斑病、尋常性後天性天疱瘡、免疫性血小板減少症、自己免疫性脳炎、ギランバレー症候群、及び膜性腎症から選択される、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

前記がんは、肺癌（小細胞または非小細胞）、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、悪性黒色腫、脳癌（例えば、星状細胞腫、神経膠腫、髄膜腫、神経芽腫など）、骨癌（骨肉腫など）、子宮頸癌、胆管癌、消化管癌（例えば、口腔癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌など）、頭頸部癌、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、肝臓癌（肝細胞癌など）、中皮腫、上咽頭癌、神経内分泌癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮膚癌、紡錘細胞癌、精巣癌、甲状腺癌、または子宮癌（子宮内膜癌など）から選択される、請求項７７に記載の方法。

【請求項80】

治療は、標的タンパク質のエンドサイトーシスを媒介する条件下で前記二機能性結合タンパク質を投与することによって腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を再プログラミングすることを含む、請求項７６に記載の方法。

【請求項81】

前記標的タンパク質がＴＡＭにおいてアップレギュレートまたは発現される、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

ＴＡＭにおいてアップレギュレートまたは発現される前記標的タンパク質は、ＳＩＲＰα、ＣＣＲ２、ＣＳＦ－１Ｒ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＶＥＧＦ－Ｒ、ＣＸＣＲ４、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＣＳＦ－１またはＣＤ４７を含む、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

前記投与ステップが、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、経皮注射、または筋肉内注射を含む、請求項７６に記載の方法。

【請求項84】

請求項１～４８のいずれか１項に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質、または請求項７５に記載の医薬組成物、及び前記糖鎖改変二機能性分子または医薬組成物をそれを必要とする個体に投与するための説明書を含む、キット。

【請求項85】

前記糖鎖改変二機能性結合タンパク質または医薬組成物は、１つ以上の単位用量で存在する、請求項８４に記載のキット。

【請求項86】

アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に特異的に結合することができる二重特異性結合タンパク質であって、前記タンパク質は、（ｉ）下記の構造のＮ－グリカンであって、

【化7】

黒い四角はＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を表し、白い四角はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を表し、黒い縞模様の丸はマンノース（Ｍａｎ）を表し、Ｘはタンパク質中のアミノ酸残基を表す、前記Ｎ－グリカンを含み、（ｉｉ）標的タンパク質に特異的に結合する、前記二重特異性結合タンパク質。

【請求項87】

二機能性結合タンパク質を投与することを含む、対象において標的タンパク質を分解する方法であって、前記二機能性結合タンパク質は、前記標的タンパク質に特異的に結合し、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合可能な二分岐ＧａｌＮＡｃを含む、前記方法。

【請求項88】

前記二機能性結合タンパク質が二分岐ＧａｌＮＡｃを含む、請求項８７に記載の方法。

【請求項89】

前記二分岐ＧａｌＮＡｃが下記の構造を有し、

【化8】

黒い四角はＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を表し、白い四角はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を表し、黒い縞模様の丸はマンノース（Ｍａｎ）を表し、Ｘはアミノ酸残基を表す、請求項８７または８８に記載の方法。

【請求項90】

標的タンパク質のレベル上昇を伴う急性症状を治療する方法であって、前記方法は、それを必要とする患者に二機能性結合タンパク質を投与することを含み、前記二機能性結合タンパク質は、（ｉ）前記標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）Ｎ－グリカンを含み、前記Ｎ－グリカンは、前記患者における前記標的タンパク質の半減期が最大１５分、３０分、４５分、６０分、９０分、または最大２時間であるように、２つまたはそれ以上の糖鎖部位で前記二機能性結合タンパク質に連結される、前記方法。

【請求項91】

標的タンパク質のレベル上昇を伴う急性症状を治療する方法であって、前記方法は、それを必要とする患者に二機能性結合タンパク質を投与することを含み、前記二機能性結合タンパク質は、（ｉ）前記標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）Ｎ－グリカンを含み、前記Ｎ－グリカンは、半減期が、前記二機能性結合タンパク質の非存在下または任意の治療の非存在下において、前記患者における前記標的タンパク質の半減期の最大２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％であるように、２つまたはそれ以上の糖鎖部位で前記二機能性結合タンパク質に連結される、前記方法。

【請求項92】

標的タンパク質のレベル上昇を伴う急性症状を治療する方法であって、前記方法は、二機能性結合タンパク質を投与することを含み、前記二機能性結合タンパク質は、（ｉ）前記標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）下記の構造を有するＮ－グリカンを含み、

【化9】

黒い四角はＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を表し、白い四角はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を表し、黒い縞模様の丸はマンノース（Ｍａｎ）を表し、Ｘはタンパク質中のアミノ酸残基を表し、かつ前記投与ステップ後の前記患者における前記標的タンパク質の半減期が、最大１５分、３０分、４５分、６０分、９０分、または最大２時間である、前記方法。

【請求項93】

前記二機能性結合タンパク質は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＭａｎ－６－Ｐ－Ｎ－グリカンを含む、請求項９０に記載の方法。

【請求項94】

標的タンパク質のレベル上昇を伴う慢性症状を治療する方法であって、前記方法は、二機能性結合タンパク質を投与することを含み、前記二機能性結合タンパク質は、（ｉ）前記標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）Ｎ－グリカンを含み、前記Ｎ－グリカンは、前記患者における前記二重特異性タンパク質の半減期が少なくとも１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日であるように、最大で１つまたは２つの糖鎖部位で前記二機能性結合タンパク質に連結される、前記方法。

【請求項95】

標的タンパク質のレベル上昇を伴う慢性症状を治療する方法であって、前記方法は、それを必要とする患者に先行請求項のいずれか１項に記載の二機能性結合タンパク質を投与することを含み、前記二機能性結合タンパク質は、（ｉ）前記標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）Ｎ－グリカンを含み、前記Ｎ－グリカンは、半減期が、前記二機能性結合タンパク質の非存在下または任意の治療の非存在下において、前記患者における前記標的タンパク質の半減期の最大２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％であるように、最大で１つまたは２つの糖鎖部位で前記二機能性結合タンパク質に連結される、前記方法。

【請求項96】

前記二機能性結合タンパク質は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＭａｎ－６－Ｐ－Ｎ－グリカンを含む、請求項９４に記載の方法。

【請求項97】

前記慢性症状は、自己免疫疾患、がんまたは腫瘍、肝疾患、炎症性障害、または血液凝固障害である、請求項９０～９５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項98】

前記自己免疫疾患は、バセドウ病、重症筋無力症、抗ＧＢＭ疾患、免疫性血栓性血小板減少性紫斑病、尋常性後天性天疱瘡、免疫性血小板減少症、自己免疫性脳炎、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体関連疾患、ギランバレー症候群、及び膜性腎症から選択される、請求項９７に記載の方法。

【請求項99】

前記がんが、肺癌、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、悪性黒色腫、多発性骨髄腫、及びホジキンリンパ腫から選択される、請求項９７に記載の方法。

【請求項100】

治療は、標的タンパク質のエンドサイトーシスを媒介する条件下で前記二機能性結合タンパク質を投与することによって腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を再プログラミングすることを含む、請求項８６～９９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項101】

前記標的タンパク質がＴＡＭにおいてアップレギュレートまたは発現される、請求項１００に記載の方法。

【請求項102】

ＴＡＭにおいてアップレギュレートまたは発現される前記標的タンパク質は、ＳＩＲＰα、ＣＣＲ２、ＣＳＦ－１Ｒ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＶＥＧＦ－Ｒ、ＣＸＣＲ４、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＣＳＦ－１またはＣＤ４７を含む、請求項１００に記載の方法。

【請求項103】

前記投与ステップが、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、経皮注射、または筋肉内注射を含む、請求項８６～１０２のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０２１年３月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／１６４，９６３号の優先権の利益を主張するものであり、その内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は一般に、さまざまなグリコシル化プロファイルを有する糖鎖改変二機能性結合タンパク質及びそのリソソーム標的化に関する。

【背景技術】

【0003】

エンドサイトーシスレクチンは、特定のグリカン構造を介してグリコシル化タンパク質を捕捉して分解を媒介することにより、受容体媒介エンドサイトーシスに関与している（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（２０１７）。エンドサイトーシスレクチンは人間の体内に遍在しており、さまざまなグリカン構造を認識できる。

【0004】

炭水化物結合受容体は非常に多様であり、糖鎖工学によって利用して、炎症、血液疾患、自己免疫、がんなどを含むがこれらに限定されないさまざまな疾患に対して前例のない有効性をもつ新規治療薬を開発することができる。これにより、グリカン媒介タンパク質分解の概念に基づく新規治療薬の開発が可能になる。モノクローナル抗体のグリコシル化による自然なタンパク質分解を利用することで、新規治療法が得られる可能性がある。Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、またはガラクトース（Ｇａｌ）を含むグリカン（例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ１ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＧａｌ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）のタンパク質上の結合が、レクチンによる効率的な結合を引き起こし、リソソーム分解を媒介できるか否か、またはその程度はこれまで記載されていない。本発明は、特定のグリカン媒介タンパク質分解に関する新規な発見を示す。

【0005】

本明細書で提供される組成物及び方法は、モノクローナル抗体などのグリコシル化タンパク質で治療される、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、及び感染症などのさまざまな難治性疾患に苦しむ患者の満たされていない医療ニーズに対処し、関連する利点を提供する。

【発明の概要】

【0006】

一態様では、疾患に関連する標的タンパク質に特異的に結合する第１の部分と、エンドサイトーシス炭水化物結合タンパク質及び受容体に特異的に結合する第２の部分であって、グリカン構造を含む第２の部分と、を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書で提供される。

【0007】

一態様では、標的タンパク質に特異的に結合する第１の部分と、末端ＧｌｃＮＡｃを含むグリカンを含む第２の部分と、を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書で提供される。

【0008】

一態様では、標的タンパク質に特異的に結合する第１の部分と、末端ＧａｌＮＡｃを含むグリカンを含む第２の部分と、を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書で提供される。

【0009】

一態様では、標的タンパク質に特異的に結合する第１の部分と、末端Ｇａｌを含むグリカンを含む第２の部分と、を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書で提供される。

【0010】

一態様では、標的タンパク質に特異的に結合する第１の部分と、下記の構造を含むグリカンを含む第２の部分と、を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書で提供され、

【化1】

【0011】

四角はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を表し、黒い縞模様の円はマンノース（Ｍａｎ）残基を表し、Ｘは二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表す。一態様では、標的タンパク質に特異的に結合する第１の部分と、下記の構造を含むグリカンを含む第２の部分と、を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書で提供され、

【化2】

黒い四角はＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を表し、白い四角はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を表し、黒い縞模様の円はマンノース（Ｍａｎ）残基を表し、Ｘは二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表す。

【0012】

一態様では、標的タンパク質に特異的に結合する第１の部分と、下記の構造を含むグリカンを含む第２の部分と、を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書で提供され、

【化3】

白い丸はガラクトース（Ｇａｌ）残基を表し、四角はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を表し、黒い縞模様の丸はマンノース（Ｍａｎ）残基を表し、Ｘは二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表す。

【0013】

一態様では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書で提供され、二機能性結合タンパク質は、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）下記の構造のＮ－グリカンを含み、

【化4】

Ｎ－グリカンは、１、２、３、４または５個のＮ－グリコシル化部位で二機能性結合タンパク質に連結される。特定の実施形態では、本明細書で提供される二機能性タンパク質は、末端グリカンとしてＧｌｃＮＡｃ２を有するＮ－グリカンを含む。具体的には、Ｎ－グリカンのＧｌｃＮＡｃ２部分のＮ－グリカンの任意の分岐構造も含まれ得る。

【0014】

一態様では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書で提供され、二機能性結合タンパク質は、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）下記の構造のＮ－グリカンを含み、

【化5】

Ｎ－グリカンは、１、２、３、４または５個のＮ－グリコシル化部位で二機能性結合タンパク質に連結される。特定の実施形態では、本明細書で提供される二機能性タンパク質は、末端グリカンとしてＧａｌＮＡｃ２を有するＮ－グリカンを含む。具体的には、Ｎ－グリカンのＧａｌＮＡｃ２部分のＮ－グリカンの任意の分岐構造も含まれ得る。

【0015】

一態様では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書で提供され、二機能性結合タンパク質は、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）下記の構造のＮ－グリカンを含み、

【化6】

Ｎ－グリカンは、１、２、３、４または５個のＮ－グリコシル化部位で二機能性結合タンパク質に連結される。特定の実施形態では、本明細書で提供される二機能性タンパク質は、末端グリカンとしてＧａｌ２を有するＮ－グリカンを含む。具体的には、Ｎ－グリカンのＧａｌ２部分のＮ－グリカンの任意の分岐構造も含まれ得る。

【0016】

特定の実施形態では、近位ＧｌｃＮＡｃ（糖鎖改変二機能性結合タンパク質に融合したＧｌｃＮＡｃ）のＮ－グリカンの任意の分岐構造も含まれ得る。特定の実施形態では、近位ＧｌｃＮＡｃはフコシル化され得る。特定の実施形態では、Ｎ－グリカンは、上記に示した構造のいずれか１つからなる。

【0017】

いくつかの実施形態では、タンパク質は、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上のグリカン構造を含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、グリカン構造は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＭａｎ－６－Ｐ－Ｎ－グリカンを含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、グリカン構造はＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である。

【0020】

いくつかの実施形態では、グリカン構造はＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である。

【0021】

いくつかの実施形態では、グリカン構造はＧａｌＮＡｃ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である。

【0022】

いくつかの実施形態では、グリカン構造はＧａｌＮＡｃ１ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である。

【0023】

いくつかの実施形態では、グリカン構造はＧａｌ１ ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である。

【0024】

いくつかの実施形態では、グリカン構造はＧａｌ１ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である。

【0025】

いくつかの実施形態では、グリカン構造はＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である。

【0026】

いくつかの実施形態では、グリカン構造はＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である。

【0027】

いくつかの実施形態では、第２の部分は、分化クラスター２０６（ＣＤ２０６）受容体、ＤＣ－ＳＩＧＮ（分化クラスター２０９またはＣＤ２０９）受容体、Ｃ型レクチンドメインファミリー４メンバーＧ（ＬＳＥＣＴｉｎ）受容体、またはマクロファージ誘導性Ｃａ２＋依存性レクチン受容体（Ｍｉｎｃｌｅ）に特異的に結合する。

【0028】

いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質の第２の部分は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を認識する任意のエンドサイトーシス炭水化物結合受容体に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質の第２の部分は、ランゲリン、マクロファージマンノース２受容体、デクチン－１、デクチン－２、ＢＤＣＡ－２、ＤＣＩＲ、ＭＢＬ、ＭＤＬ、ＭＩＣＬ、ＣＬＥＣ２、ＤＮＧＲ１、ＣＬＥＣ１２Ｂ、ＤＥＣ－２０５、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＰＧＲ）、及びマンノース６リン酸受容体に特異的に結合する。

【0029】

いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質の第１の部分は、重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質の第１の部分は、モノクローナル抗体のＦａｂ領域を含む。

【0030】

いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は組換え体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、または完全ヒト抗体である。

【0031】

いくつかの実施形態では、抗体は、２対１、４対１、６対１、８対１、または１０対１のグリカン対タンパク質の比を有する。

【0032】

いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、所定の特定の残基でグリコシル化される。

【0033】

いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、自己抗原である。

【0034】

いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質のグリカンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同じグリカン構造を有する。

【0035】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、細胞表面分子または非細胞表面分子である。いくつかの実施形態では、細胞表面分子は受容体である。いくつかの実施形態では、非細胞表面分子は細胞外タンパク質である。いくつかの実施形態では、細胞外タンパク質は、自己抗体、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、血液タンパク質、または中枢神経系（ＣＮＳ）タンパク質である。

【0036】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、第１の部分によって結合される。

【0037】

いくつかの実施形態では、グリカン構造は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＭａｎ－６－Ｐ－Ｎ－グリカンを含む。

【0038】

いくつかの実施形態では、エンドサイトーシス炭水化物結合タンパク質及び受容体は、マンノース３受容体、マンノース結合受容体（ＣＤ２０６）、ＤＣ－ＳＩＧＮ、Ｌ－ＳＩＧＮ、ＬＳＥＣＴｉｎ、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）、スカベンジャー受容体Ｃ型レクチン（ＳＲＣＬ）、マンノース－６－リン酸受容体、ミンクル、デクチン－１、デクチン－２、ランゲリン、カチオン非依存性マンノース６－リン酸受容体（ＣＩ－Ｍ６ＰＲ）、マクロファージマンノース受容体２、ＢＤＣＡ－２、ヒトマクロファージガラクトースレクチン（ＭＧＬ）、ｃ型レクチンドメインファミリー５、メンバーＡ（ＣＬＥＣ５ＡまたはＭＤＬ）、骨髄抑制性ｃ型レクチン様受容体（ＭＩＣＬ）、ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ２）、樹状細胞ナチュラルキラーレクチングループ受容体１（ＤＮＧＲ１）、またはｃ型レクチンドメインファミリー１２、メンバーＢ（ＣＬＥＣ１２Ｂ）を含む。

【0039】

いくつかの実施形態では、疾患はがんを含むか、またはがんの進行に関与する。いくつかの実施形態では、疾患は自己免疫疾患を含む。いくつかの実施形態では、疾患はアミロイドーシスを含む。いくつかの実施形態では、アミロイドーシスは全身性アミロイドーシスであり得る。いくつかの実施形態では、アミロイドーシスは局所性アミロイドーシスであり得る。

【0040】

いくつかの実施形態では、疾患に関連する標的タンパク質は、非疾患状態と比較して疾患においてアップレギュレートされる。いくつかの実施形態では、疾患に関連する標的タンパク質は、非疾患状態と比較して疾患において発現される。

【0041】

いくつかの実施形態では、疾患に関連する標的タンパク質は、ＴＮＦα、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、αｖβ３インテグリン、ＣＥＡ、ＣＸＣＲ４、ＭＵＣ１、ＬＣＡＭ１、ＥｐｈＡ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＶＩＳＴＡ、Ｎｏｔｃｈ受容体、ＥＧＦ、ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＬ２、ＣＣＲ２、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、Ｗｎｔ、ＬＲＰ５／６、ＣＳＦ－１Ｒ、ＳＩＲＰα、ＣＤ３８、ＣＤ７３、ＴＧＦ－β、ボンベシンＲ、ＣＡＩＸ、ＣＤ１３、ＣＤ４４ｖ６、エンプリン、エンドグリン、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ－α、葉酸Ｒ、ＧＲＰ７８、ＩＧＦ－１Ｒ、マトリプターゼ、メソテリン、ｓＭＥＴ／ＨＧＦＲ、ＭＴ１－ＭＭＰ、ＭＴ６－ＭＭＰ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、Ｔｎ抗原、及びｕＰＡＲ、ＴＳＨＲα、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ＡＣｈＲ－α１、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖の非コラーゲンドメイン１（α３ＮＣ１）、ＡＤＡＭＴＳ１３、デスモグレイン－１／３、またはＧＰＩｂ／ＩＸ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩａ／ＩＩａ、ＮＭＤＡ受容体、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、アンフィフィシン及びガングリオシドＧＭ１、ＧＤ３、ＧＱ１Ｂ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＶＥＧＦ－Ｒ、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＬ１２、ＣＳＦ－１、ＣＤ４７、凝集軽鎖または凝集トランスサイレチンを含む。

【0042】

いくつかの実施形態では、自己免疫疾患に関連する標的タンパク質は、ＴＳＨＲα、ＭＯＧ、ＡＣｈＲ－α１、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖の非コラーゲンドメイン１（α３ＮＣ１）、ＡＤＡＭＴＳ１３、デスモグレイン－１／３、またはＧＰＩｂ／ＩＸ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩａ／ＩＩａ、ＮＭＤＡ受容体、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、アンフィフィシン、またはガングリオシドＧＭ１、ＧＤ３またはＧＱ１Ｂに結合する抗体である。

【0043】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）においてアップレギュレートまたは発現される。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、腫瘍微小環境におけるＴＡＭの動員に関連している。他の実施形態では、標的タンパク質は、腫瘍微小環境におけるＴＡＭの枯渇に関連している。さらなる実施形態では、標的タンパク質は、腫瘍微小環境におけるＴＡＭの再プログラミングに関連している。

【0044】

いくつかの実施形態では、ＴＡＭに関連する標的タンパク質は、ＳＩＲＰα、ＣＣＲ２、ＣＳＦ－１Ｒ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＶＥＧＦ－Ｒ、またはＣＸＣＲ４を含む。他の実施形態では、ＴＡＭに関連する標的タンパク質は、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＣＳＦ－１、またはＣＤ４７を含む。

【0045】

いくつかの実施形態では、エンドサイトーシス炭水化物結合タンパク質及び受容体は、ＤＣ－ＳＩＧＮ、Ｌ－ＳＩＧＮ、ＬＳＥＣＴｉｎ、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）、マンノース－６－リン酸受容体、ミンクル、デクチン－１、デクチン－２、ランゲリン、カチオン非依存性マンノース６－リン酸受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）、マクロファージマンノース受容体２、ＢＤＣＡ－２、ＭＧＬ、ＭＤＬ、ＭＩＣＬ、ＣＬＥＣ２、ＤＮＧＲ１、またはＣＬＥＣ１２Ｂを含む。

【0046】

いくつかの実施形態では、疾患はがんを含む。

【0047】

いくつかの実施形態では、疾患は自己免疫疾患を含む。

【0048】

一態様では、標的タンパク質のエンドサイトーシスを媒介する条件下で、標的タンパク質を本明細書で提供される糖鎖改変二機能性結合タンパク質と接触させることを含む、標的タンパク質を肝細胞エンドソームに送達する方法が本明細書で提供される。

【0049】

いくつかの実施形態では、タンパク質上のグリカン構造の数により、送達速度を増加させる。

【0050】

いくつかの実施形態では、グリカン構造の数は、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上を含む。

【0051】

いくつかの実施形態では、グリカン構造は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＭａｎ－６－Ｐ－Ｎ－グリカンを含む。

【0052】

いくつかの実施形態では、グリカン構造はＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である。

【0053】

いくつかの実施形態では、グリカン構造はＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である。

【0054】

いくつかの実施形態では、グリカン構造はＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である。

【0055】

一態様では、宿主細胞による標的タンパク質のリソソーム分解を媒介する条件下で、標的タンパク質を本明細書で提供される糖鎖改変二機能性結合タンパク質と接触させることを含む、標的タンパク質を分解する方法が本明細書で提供される。

【0056】

いくつかの実施形態では、タンパク質上のグリカン構造の数により、リソソーム分解の速度を増加させる。

【0057】

いくつかの実施形態では、グリカン構造の数は、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上を含む。

【0058】

いくつかの実施形態では、グリカン構造は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＭａｎ－６－Ｐ－Ｎ－グリカンを含む。

【0059】

いくつかの実施形態では、グリカン構造はＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である。

【0060】

いくつかの実施形態では、グリカン構造はＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である。

【0061】

いくつかの実施形態では、グリカン構造はＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である。

【0062】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、がんにおいてアップレギュレートされるか、またはがんの進行に関与する。いくつかの実施形態では、がんにおいてアップレギュレートされる、またはがんの進行に関与する標的タンパク質は、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦＲ ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、αｖβ３インテグリン、ＣＥＡ、ＣＸＣＲ４、ＭＵＣ１、ＬＣＡＭ１、ＥｐｈＡ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＶＩＳＴＡ、Ｎｏｔｃｈ受容体、ＥＧＦ、ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＬ２、ＣＣＲ２、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、Ｗｎｔ、ＬＲＰ５／６、ＣＳＦ－１Ｒ、ＳＩＲＰα、ＣＤ３８、ＣＤ７３、またはＴＧＦ－βを含む。

【0063】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は自己免疫疾患の自己抗体である。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は自己免疫疾患の自己抗原である。

【0064】

いくつかの実施形態では、自己免疫疾患における自己抗体は、ＴＳＨＲα、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（ＭＯＧ）、ＡＣｈＲ－α１、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖の非コラーゲンドメイン１（α３ＮＣ１）、ＡＤＡＭＴＳ１３、デスモグレイン－１／３、ＧＰＩｂ／ＩＸ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩａ／ＩＩａ、ＮＭＤＡ受容体、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、アンフィフィシン、またはガングリオシドＧＭ１、ＧＤ３またはＧＱ１Ｂに結合する抗体である。

【0065】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、神経変性疾患においてアップレギュレートまたは発現される。いくつかの実施形態では、神経変性疾患においてアップレギュレートまたは発現される標的タンパク質は、α－シヌクレイン、アミロイドβ、または補体カスケード成分である。

【0066】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、アミロイドーシスにおいてアップレギュレートされる。いくつかの実施形態では、アミロイドーシスは全身性アミロイドーシスであり得る。他の実施形態では、アミロイドーシスは局所性アミロイドーシスであり得る。いくつかの実施形態では、全身性アミロイドーシスにおいてアップレギュレートされるタンパク質は、トランスサイレチンであり得る。

【0067】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、肝臓細胞、骨髄細胞、免疫細胞、内皮細胞、実質細胞、または上皮細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、樹状細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア細胞、顆粒球またはＢリンパ球である。

【0068】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、任意の細胞である。

【0069】

いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、異なる第２の部分を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質の存在下での標的タンパク質の分解と比較して、標的タンパク質の分解を増強する。

【0070】

いくつかの実施形態では、分解は、エンドサイトーシスまたはファゴサイトーシスによって媒介される。

【0071】

一態様では、本明細書に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が本明細書で提供される。

【0072】

一態様では、患者の疾患を治療または予防する方法であって、本明細書に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質、または本明細書に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む方法が本明細書で提供される。

【0073】

いくつかの実施形態では、疾患は、自己免疫疾患、がんまたは腫瘍、肝疾患、炎症性障害、または血液凝固障害である。

【0074】

いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、バセドウ病、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体関連疾患（ＭＯＧＡＤ）、重症筋無力症、抗ＧＢＭ疾患、免疫性血栓性血小板減少性紫斑病、尋常性後天性天疱瘡、免疫性血小板減少症、自己免疫性脳炎、ギランバレー症候群、及び膜性腎症から選択される。

【0075】

いくつかの実施形態では、がんは固形腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、がんは、血液由来のがんまたは腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、がんは癌腫または肉腫であり得る。いくつかの実施形態では、がんは、肺癌（小細胞または非小細胞）、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、悪性黒色腫、脳癌（例えば、星状細胞腫、神経膠腫、髄膜腫、神経芽腫など）、骨癌（骨肉腫など）、子宮頸癌、胆管癌、消化管癌（例えば、口腔癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌など）、頭頸部癌、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、肝臓癌（肝細胞癌など）、中皮腫、上咽頭癌、神経内分泌癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮膚癌、紡錘細胞癌、精巣癌、甲状腺癌、または子宮癌（子宮内膜癌など）から選択される。特定の実施形態では、がんは、以前の治療後に再発したもの、または従来の治療に抵抗性のものであり得る。特定の実施形態では、がんは播種性または転移性であり得る。いくつかの実施形態では、血液由来のがんまたは腫瘍は、白血病、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫）から選択される。特定の実施形態では、白血病は、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病及び急性骨髄芽球性白血病である。

【0076】

いくつかの実施形態では、治療は、標的タンパク質のエンドサイトーシスを媒介する条件下で二機能性結合タンパク質を投与することによって腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を再プログラミングすることを含む。

【0077】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＴＡＭにおいてアップレギュレートまたは発現される。

【0078】

いくつかの実施形態では、ＴＡＭにおいてアップレギュレートまたは発現される標的タンパク質は、ＳＩＲＰα、ＣＣＲ２、ＣＳＦ－１Ｒ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＶＥＧＦ－Ｒ、ＣＸＣＲ４、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＣＳＦ－１またはＣＤ４７を含む。

【0079】

いくつかの実施形態では、投与ステップは、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、経皮注射、または筋肉内注射を含む。

【0080】

一態様では、本明細書に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質、または本明細書に記載の医薬組成物、及び糖鎖改変二機能性分子または医薬組成物をそれを必要とする個体に投与するための説明書を含む、キットが本明細書で提供される。

【0081】

いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質または医薬組成物は、１つ以上の単位用量で存在する。

【0082】

一態様では、本明細書で提供されるのは、二機能性結合タンパク質を投与することを含む、対象において標的タンパク質を分解する方法であって、二機能性結合タンパク質は、標的タンパク質に特異的に結合し、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合可能な二分岐ＧａｌＮＡｃを含む。

【0083】

いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質は二分岐ＧａｌＮＡｃを含む。

【0084】

いくつかの実施形態では、二分岐ＧａｌＮＡｃは下記の構造を有し、

【化7】

黒い四角はＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を表し、白い四角はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を表し、黒い縞模様の丸はマンノース（Ｍａｎ）を表し、Ｘはアミノ酸残基を表す。

【0085】

一態様では、本明細書に提供されるのは、標的タンパク質のレベル上昇を伴う急性症状を治療する方法であって、この方法は、それを必要とする患者に二機能性結合タンパク質を投与することを含み、二機能性結合タンパク質は、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）Ｎ－グリカンを含み、Ｎ－グリカンは、患者における標的タンパク質の半減期が最大１５分、３０分、４５分、６０分、９０分、または最大２時間であるように、１つ、２つまたはそれ以上の糖鎖部位で二機能性結合タンパク質に連結される。

【0086】

一態様では、本明細書で提供されるのは、標的タンパク質のレベル上昇を伴う急性症状を治療する方法であって、この方法は、それを必要とする患者に二機能性結合タンパク質を投与することを含み、二機能性結合タンパク質は、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）Ｎ－グリカンを含み、Ｎ－グリカンは、半減期が、二機能性結合タンパク質の非存在下または任意の治療の非存在下において、患者における標的タンパク質の半減期の最大２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％であるように、１つ、２つまたはそれ以上の糖鎖部位で二機能性結合タンパク質に連結される。

【0087】

いくつかの実施形態では、Ｎ－グリカンはアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合し、Ｎ－グリカンは下記の構造を有し、

【化8】

黒い四角はＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を表し、白い四角はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を表し、黒い縞模様の丸はマンノース（Ｍａｎ）を表し、Ｘはアミノ酸残基を表す。

【0088】

いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＭａｎ－６－Ｐ－Ｎ－グリカンを含む。

【0089】

一態様では、本明細書に提供されるのは、標的タンパク質のレベル上昇を伴う慢性症状を治療する方法であって、この方法は、それを必要とする患者に二機能性結合タンパク質を投与することを含み、二機能性結合タンパク質は、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）Ｎ－グリカンを含み、Ｎ－グリカンは、患者における標的タンパク質の半減期が少なくとも１２時間、１日、２日、または３日であるように、最大で１つ以上の糖鎖部位で二機能性結合タンパク質に連結される。

【0090】

一態様では、本明細書で提供されるのは、標的タンパク質のレベル上昇を伴う慢性症状を治療する方法であって、この方法は、それを必要とする患者に二機能性結合タンパク質を投与することを含み、二機能性結合タンパク質は、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）Ｎ－グリカンを含み、Ｎ－グリカンは、半減期が、二機能性結合タンパク質の非存在下または任意の治療の非存在下において、患者における標的タンパク質の半減期の最大２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％であるように、１つ、２つまたはそれ以上の糖鎖部位で二機能性結合タンパク質に連結される。

【0091】

いくつかの実施形態では、Ｎ－グリカンはアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合し、Ｎ－グリカンは、下記の構造を有する二分岐ＧａｌＮＡｃであり、

【化9】

黒い四角はＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を表し、白い四角はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を表し、黒い縞模様の丸はマンノース（Ｍａｎ）を表し、Ｘはアミノ酸残基を表す。

【0092】

いくつかの実施形態では、二機能性結合タンパク質は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＭａｎ－６－Ｐ－Ｎ－グリカンを含む。

【0093】

いくつかの実施形態では、慢性症状は、自己免疫疾患、がんまたは腫瘍、肝疾患、炎症性障害、または血液凝固障害である。

【0094】

いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、バセドウ病、重症筋無力症、抗ＧＢＭ疾患、免疫性血栓性血小板減少性紫斑病、尋常性後天性天疱瘡、免疫性血小板減少症、自己免疫性脳炎、ギランバレー症候群、及び膜性腎症から選択される。

【0095】

いくつかの実施形態では、がんは固形腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、がんは、血液由来のがんまたは腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、がんは癌腫または肉腫であり得る。いくつかの実施形態では、がんは、肺癌（小細胞または非小細胞）、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、悪性黒色腫、脳癌（例えば、星状細胞腫、神経膠腫、髄膜腫、神経芽腫など）、骨癌（骨肉腫など）、子宮頸癌、胆管癌、消化管癌（例えば、口腔癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌など）、頭頸部癌、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、肝臓癌（肝細胞癌など）、中皮腫、上咽頭癌、神経内分泌癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮膚癌、紡錘細胞癌、精巣癌、甲状腺癌、または子宮癌（子宮内膜癌など）から選択される。特定の実施形態では、がんは、以前の治療後に再発したもの、または従来の治療に抵抗性のものであり得る。特定の実施形態では、がんは播種性または転移性であり得る。いくつかの実施形態では、血液由来のがんまたは腫瘍は、白血病、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫）から選択される。特定の実施形態では、白血病は、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病及び急性骨髄芽球性白血病である。いくつかの実施形態では、治療は、標的タンパク質のエンドサイトーシスを媒介する条件下で二機能性結合タンパク質を投与することによって腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を再プログラミングすることを含む。

【0096】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＴＡＭにおいてアップレギュレートまたは発現される。

【0097】

いくつかの実施形態では、ＴＡＭにおいてアップレギュレートまたは発現される標的タンパク質は、ＳＩＲＰα、ＣＣＲ２、ＣＳＦ－１Ｒ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＶＥＧＦ－Ｒ、ＣＸＣＲ４、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＣＳＦ－１またはＣＤ４７を含む。

【0098】

いくつかの実施形態では、投与ステップは、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、経皮注射、または筋肉内注射を含む。

【図面の簡単な説明】

【0099】

【図1】グリカン媒介分解を含む、治療に使用できるグリカン媒介作用様式の例を示す。

【0100】

【図2】肝細胞におけるアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を介した細胞外タンパク質の分解を示す。

【0101】

【図3】アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を介したグリカン媒介タンパク質分解を示す。

【0102】

【図4】Ｆａｂ上にＡ２ＧａｌＮＡｃ２グリカンを表示する抗体がＨｅｐＧ２細胞に高度に内部移行されることを示す。ＨｅｐＧ２細胞をｐＨｒｏｄｏ標識抗体とともに４時間インキュベートした。グラフは、三重値のｐＨｒｏｄｏの平均調整平均蛍光強度（ＭＦＩ）±平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。グラフは、３つの代表的な実験のうち１つからのデータを示す。

【0103】

【図5】ＨｅｐＧ２細胞によるＦａｂ上のＡ２ＧａｌＮＡｃ２グリカンを表示する抗体の内部移行がＡＳＧＰＲによって媒介されることを示す。ＨｅｐＧ２細胞を、ｐＨｒｏｄｏ標識抗体（３μｇ／ｍｌ）及び指定の阻害剤とともに３時間インキュベートした。グラフは、２つの独立した実験の平均及び個別に調整されたｐＨｒｏｄｏ ＭＦＩを示す。黒い丸：阻害剤なし。黒い三角：フェツイン。白抜きの四角：アシアロフェツイン。黒い菱形：ＥＧＴＡ。白抜きの丸：クロロキン。白抜きの三角：バフィロマイシン。

【0104】

【図6】Ａ２グリカン構造を表示する抗体が、そのＦａｂグリカンの表示数に応じて、ラットの血液循環から標的抗原を強力に除去することを示す。ラットにＨＣＡ２０２（０．５ｍｇ／ｋｇ）及び抗体１０ｍｇ／ｋｇを静脈（ｉ．ｖ．）注射した。グラフは、１群あたり３匹または４匹の動物のＨＣＡ２０２血清濃度の平均±標準偏差（ＳＤ）をｎｇ／ｍｌで示す。黒い丸は、Ｈ－Ａ２Ｆ（アダリムマブ、Ｈｕｍｉｒａ）治療群を示す。白抜きの四角は、Ａ－８４－Ａ２治療群を示す。黒い三角は、Ａ－８４８６－Ａ２治療群を示す。黒い四角は、Ａ－８４８６－Ａ２Ｇ２Ｓ２治療群を示す。白抜きの丸は、ＰＢＳ治療群（ＨＣＡ２０２のみ）を示す。白抜きの菱形と点線は、Ａ－Ｍ３治療群を示す。グラフ表示では、ＨＣＡ２０２レベルが、必要最小限の１０倍希釈（ＭＲＤ１０）でアッセイ定量下限（ＬＬＯＱ）（点線のＬＬＯＱ／ＭＲＤ１０線＝２０ｎｇ／ｍｌ）を下回った場合、１９ｎｇ／ｍｌとした。

【0105】

【図7】Ａ２Ｇ２グリカン構造を表示する抗体が、そのＦａｂグリカンの表示数に応じて、ラットの血液循環から標的抗原を強力に除去することを示す。ラットにＨＣＡ２０２（０．５ｍｇ／ｋｇ）及び抗体１０ｍｇ／ｋｇを静脈注射した。グラフは、１群あたり３匹または４匹の動物のＨＣＡ２０２血清濃度の平均±ＳＤをｎｇ／ｍｌで示す。黒い丸は、Ｈ－Ａ２Ｆ（アダリムマブ、Ｈｕｍｉｒａ）治療群を示す。白抜きの四角は、Ａ－８４－Ａ２Ｇ２治療群を示す。黒い三角は、Ａ－８４８６－Ａ２Ｇ２治療群を示す。黒い四角は、Ａ－８４８６－Ａ２Ｇ２Ｓ２治療群を示す。白抜きの丸は、ＰＢＳ治療群（ＨＣＡ２０２のみ）を示す。白抜きの菱形と点線は、Ａ－Ｍ３治療群を示す。グラフ表示では、ＨＣＡ２０２レベルがアッセイＬＬＯＱ（点線のＬＬＯＱ／ＭＲＤ１０線＝２０ｎｇ／ｍｌ）を下回った場合、１９ｎｇ／ｍｌとした。

【0106】

【図8】Ａ２ＧａｌＮＡｃ２グリカン構造を表示する抗体が、ラットの血液循環から標的抗原を強力に除去することを示す。ラットにＨＣＡ２０２（０．５ｍｇ／ｋｇ）及び抗体１０ｍｇ／ｋｇを静脈注射した。グラフは、１群あたり３匹または４匹の動物のＨＣＡ２０２血清濃度の平均±ＳＤをｎｇ／ｍｌで示す。黒い丸は、Ｈ－Ａ２Ｆ（アダリムマブ、Ｈｕｍｉｒａ）治療群を示す。白抜きの四角は、Ａ－８４－Ａ２ＧａｌＮＡｃ２治療群を示す。黒い三角は、Ａ－８４８６－Ａ２ＧａｌＮＡｃ２治療群を示す。黒い四角は、Ａ－８４８６－Ａ２Ｇ２Ｓ２治療群を示す。白抜きの丸は、ＰＢＳ治療群（ＨＣＡ２０２のみ）を示す。白抜きの菱形と点線は、Ａ－Ｍ３治療群を示す。グラフ表示では、ＨＣＡ２０２レベルがアッセイＬＬＯＱ（点線のＬＬＯＱ／ＭＲＤ１０線＝２０ｎｇ／ｍｌ）を下回った場合、１９ｎｇ／ｍｌとした。

【0107】

【図9】Ｆａｂ上にＡ２Ｇ２グリカン構造を表示する抗体が、対照抗体と比較して肝臓領域に分布していることを示す。マウスに５ｍｇ／ｋｇのＣＦ７５０標識抗体を静脈注射し、蛍光断層撮影法を用いて画像化した。グラフは、ゲートされた関心のある肝臓領域における３匹の動物／時点の平均蛍光をｐｍｏｌ±ＳＤで示す。白抜きの四角と点線は、Ｐｔｚ－Ａ２Ｆ治療群を示す。黒い丸は、Ｈ－Ａ２Ｆ治療群を示す。白抜きの菱形は、Ａ－８４８６５－Ａ２Ｇ２Ｓ２治療群を示す。黒い三角は、Ａ－８４８６－Ａ２Ｇ２治療群を示す。

【0108】

【図10】Ａ２ＧａｌＮＡｃ２グリカン構造を表示する抗体が、対照抗体と比較して速い速度で肝臓領域に分布することを示す。マウスに５ｍｇ／ｋｇのＣＦ７５０標識抗体を静脈注射し、蛍光断層撮影法を用いて画像化した。グラフは、ゲートされた関心のある肝臓領域における３匹の動物／時点の平均蛍光をｐｍｏｌ±ＳＤで示す。白抜きの四角と点線は、Ｐｔｚ－Ａ２Ｆ治療群を示す。黒い丸は、Ｈ－Ａ２Ｆ治療群を示す。白抜きの菱形は、Ａ－８４８６５－Ａ２Ｇ２Ｓ２治療群を示す。黒い三角は、Ａ－８４８６－Ａ２Ｇ２治療群を示す。

【0109】

【図11】Ａ２グリカン構造を表示する抗体が、対照抗体と比較して速い速度で肝臓領域に部分的に分布することを示す。マウスに５ｍｇ／ｋｇのＣＦ７５０標識抗体を静脈注射し、蛍光断層撮影法を用いて画像化した。グラフは、ゲートされた関心のある肝臓領域における３匹の動物／時点の平均蛍光をｐｍｏｌ±ＳＤで示す。白抜きの四角と点線は、Ｐｔｚ－Ａ２Ｆ治療群を示す。黒い丸は、Ｈ－Ａ２Ｆ治療群を示す。白抜きの菱形は、Ａ－８４８６５－Ａ２Ｇ２Ｓ２治療群を示す。黒い三角は、Ａ－８４８６－Ａ２治療群を示す。

【発明を実施するための形態】

【0110】

本明細書には、対照抗体と比較して改善された機能性を有する糖鎖改変二機能性結合タンパク質（例えば、ＧｌｃＮＡｃグリコシル化二機能性結合タンパク質）が記載される。本明細書に例示されるように、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、糖鎖改変二機能性結合タンパク質上にグリコシル化部位を導入することによって操作され、その結果、糖鎖改変二機能性結合タンパク質及びそれが結合する標的のエンドサイトーシス受容体分解を媒介する、操作されたグリコシル化プロファイルが得られる。Ｎ－グリコシル化をカスタマイズすることにより、本明細書に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、１）均一なグリコシル化を有する、２）免疫複合体などの大きな標的を分解できる、３）定義されたリガンド対抗体比を有する、４）定義されたグリコシル化部位を有する、６）より多様で強力な分解受容体を活性化できる、及び／または６）高度に最適化された方法でタンパク質の分解に関与できる。

【0111】

理論に束縛されるものではないが、エンドサイトーシスの炭水化物結合タンパク質及び受容体とグリカンの結合により、さまざまな生物学的経路を可能にする。これらの重要な生物学的経路は、免疫応答の調節、タンパク質クリアランスの媒介、タンパク質代謝回転、可溶性糖タンパク質、糖脂質、及びグリカン部分を含む天然分子の輸送の制御に関与している。グリカンと受容体の相互作用は、グリカンの構造によって決定される。グリカン結合受容体は非常に多様であり、糖鎖工学によって、炎症性疾患、血液疾患、自己免疫疾患、感染症、がんなどを含むがこれらに限定されないさまざまな疾患を治療するために、グリカン媒介タンパク質分解の概念に基づく新規治療薬を開発するために利用することができる。

【0112】

レクチン受容体は、グリカン媒介エンドサイトーシスに関与する。具体的には、レクチンは特定のグリカン構造を介して糖タンパク質を捕捉し、リソソーム分解を媒介する。これらのエンドサイトーシスレクチンはヒトの体内に遍在しており、さまざまな細胞上で見出される。

【0113】

本明細書で使用される場合、「グリカン」という用語は、Ｎ－グリカンを指し得る。特定の構造に基づいて、当業者は、特定のグリカンがＮ－結合型グリカンであるかどうかを知ることができる。

【0114】

理論に束縛されるものではないが、本明細書に記載される糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、自然の分解経路を活性化すると予想される。したがって、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、ヒトの疾患に関連する標的タンパク質を減少させることが期待される。さらに、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、本明細書に記載されるように、ＧｌｃＮＡｃグリコシル化抗体であり得る。

【0115】

「約」という用語は、数値と併せて使用される場合、参照される数値の±１、±５、または±１０％以内の任意の数値を指す。

【0116】

本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、動物（例えば、鳥類、爬虫類、及び哺乳動物）を指す。別の実施形態では、対象は、非霊長類（例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、及びマウス）及び霊長類（例えば、サル、チンパンジー、及びヒト）を含む哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒト以外の動物である。いくつかの実施形態では、対象は、家畜またはペット（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ロバ、またはニワトリ）である。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書において交換可能に使用され得る。

【0117】

「α［数字］」、「α［数字］，［数字］」、「β［数字］」、または「β［数字］，［数字］」という略語は、炭水化物残基を別の基に結合する共有結合であるグリコシド結合またはグリコシド連結を指す。α－グリコシド結合は、両方の炭素が同じ立体化学を有する場合に形成されるが、β－グリコシド結合は、２つの炭素が異なる立体化学を有する場合生じる。

【0118】

本明細書で使用される場合、用語「糖鎖工学」、「糖鎖改変（された）」、またはそれらの等価物は、標的タンパク質をグリコシル化するプロセス、またはそのようなプロセスによって作製された標的タンパク質（例えば、二機能性結合タンパク質）をグリコシル化するプロセスを意味し、このプロセスは、標的タンパク質のグリコシル化を提供する１つ以上の酵素（例えば、経路）を有するｉｎ ｖｉｖｏ宿主細胞系を使用する。このような宿主細胞系は、特定のグリカン構造を有する標的タンパク質を選択的にグリコシル化するグリコシル化経路を導入するように遺伝子操作することができる。糖鎖改変標的タンパク質を生成するために使用される宿主細胞には、例えば、標的タンパク質をコードする組換え核酸、及び異種糖転移酵素をコードする組換え核酸が含まれ得る。糖鎖工学（例えば、糖鎖改変タンパク質の生成）に使用される宿主細胞系は、Ｎ－結合型グリコシル化を導入することができる。糖鎖工学または糖鎖改変標的タンパク質の生成に使用される宿主細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、細菌細胞、植物細胞、微細藻類、または原生動物であり得る。糖鎖工学に使用される原生動物は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａの一種であり得る。糖鎖改変標的タンパク質には、宿主細胞系で生成されたときに１つ以上の特定の部位で選択的にグリコシル化されるように操作された標的タンパク質も含まれる。

【0119】

本明細書で使用される場合、「糖鎖部位」または「グリコシル化部位」という用語は、タンパク質におけるグリコシル化の部位を指す。このような糖鎖部位は、タンパク質のアミノ酸配列中に天然に存在してもよく、アミノ酸の付加、または置換、または欠失によってタンパク質に組換え操作してもよい。特定の実施形態では、糖鎖部位は、本明細書に記載の二機能性タンパク質に融合した、いわゆるグリコタグ内に存在する。特定の実施形態では、グリコタグをタンパク質に融合させて、二重特異性結合タンパク質を作製する。本明細書で使用される場合、グリコタグは、タンパク質またはポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端、あるいは両方の末端に融合したコンセンサスＮ－グリコシル化部位配列を含むペプチドを指す。いくつかの実施形態では、グリコタグは、ペプチドリンカーを介して二機能性タンパク質のＣ末端に融合する。いくつかの実施形態では、グリコタグは、ペプチドリンカーを介して二機能性タンパク質のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーはコンセンサスペプチド配列である。いくつかの実施形態では、コンセンサスペプチド配列は、長さが１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上のアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される二機能性タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のグリコタグを含む。

【0120】

本明細書で使用される場合、「炎症性障害」という用語には、炎症を特徴とする障害、疾患、または症状が含まれる。炎症性障害の例としては、とりわけ、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、セリアック病、糸球体腎炎、肝炎、炎症性腸疾患、再灌流傷害、及び移植拒絶反応が挙げられる。

【0121】

本明細書で使用される場合、「血液障害」という用語には、血液に影響を与える障害、疾患、または症状が含まれる。血液障害の例としては、とりわけ、貧血、血友病などの出血疾患、血栓、白血病、リンパ腫、骨髄腫などの血液癌が含まれる。

【0122】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、動物における、及びより具体的にはヒトにおける使用について連邦もしくは州政府の規制機関によって承認されているか、または米国薬局方もしくは他の一般的に認識されている薬局方において列挙されていることを意味する。

【0123】

薬学的に許容される担体の文脈において本明細書で使用される「担体」という用語は、医薬組成物がともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。生理食塩水ならびに水性デキストロース及びグリセロール溶液はまた、液体担体として、特に注射可能な溶液に使用することができる。好適な賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。好適な薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。

【0124】

一態様では、標的タンパク質に特異的に結合する第１の部分と、末端ＧｌｃＮＡｃを含むグリカンを含む第２の部分と、を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書で提供される。

【0125】

一態様では、標的タンパク質に特異的に結合する第１の部分と、末端ＧａｌＮＡｃを含むグリカンを含む第２の部分と、を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書で提供される。

【0126】

一態様では、標的タンパク質に特異的に結合する第１の部分と、末端Ｇａｌを含むグリカンを含む第２の部分と、を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書で提供される。

【0127】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、（ｉ）１つ以上の標的タンパク質に対する結合特異性、及び（ｉｉ）１つ以上のエンドサイトーシス炭水化物結合タンパク質または受容体に対する結合特異性を有する１つ以上のＮ－グリカンを含み得る。いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、１つの標的タンパク質に対して１つの結合特異性を有する。より具体的な実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、１つの標的タンパク質に対して１つの結合特異性を有し、単一の二機能性結合タンパク質が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の標的タンパク質分子に結合できるように、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の原子価を有する。いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、２つの異なる標的タンパク質に対して２つの結合特異性を有する。より具体的な実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、（ｉ）１つの標的タンパク質に対する１つの結合特異性を有し、単一の二機能性結合タンパク質が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の標的タンパク質分子に結合できるように、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の原子価を有し、（ｉｉ）別の標的タンパク質に対して別の結合特異性を有し、単一の二機能性結合タンパク質が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の他の標的タンパク質分子に結合できるように、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の原子価を有する。いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、３つの標的タンパク質に対して３つの結合特異性を有する。より具体的な実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、（ｉ）第１の標的タンパク質に対して第１の結合特異性を有し、単一の二機能性結合タンパク質が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の第１の標的タンパク質分子に結合できるように、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の原子価を有し、（ｉｉ）第２の標的タンパク質にして第２の結合特異性を有し、単一の二機能性結合タンパク質が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の第２の標的タンパク質分子に結合できるように、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の原子価を有し、（ｉｉｉ）第３の標的タンパク質に対して第３の結合特異性を有し、単一の二機能性結合タンパク質が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の第３の標的タンパク質分子に結合できるように、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の原子価を有する。

【0128】

いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、１種類のエンドサイトーシス炭水化物結合タンパク質または受容体に対する結合特異性を有する１種類のＮ－グリカンを含む。より具体的な実施形態では、糖鎖改変二機能性結合は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のＮ－グリコシル化部位（またはＮ－グリコシル化コンセンサス配列などの糖鎖部位）を含む。これらのＮ－グリコシル化部位は、Ｎ－グリカンによってグリコシル化され得、結果として得られる糖鎖改変二機能性結合タンパク質が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のエンドサイトーシス炭水化物結合タンパク質分子または受容体分子に関与または結合できる。

【0129】

いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、２つの異なるエンドサイトーシス炭水化物結合タンパク質または受容体に対する結合特異性を有する２種類のＮ－グリカンを含む。特定の実施形態では、本明細書で提供される糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のポリペプチド鎖を含み得る。各鎖は異なる細胞株で生成できる。特定の実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は抗体であり得、Ｎ－グリカンの１種類は抗体のＦｃドメイン上にあり、Ｎ－グリカンの別の種類は抗体のＦａｂドメイン（例えば、可変領域）上にある。

【0130】

より具体的な実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、（ｉ）第１のエンドサイトーシス炭水化物結合タンパク質または受容体に対する結合特異性を有する第１のタイプのＮ－グリカンであって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の糖鎖部位で存在し、したがって、第１のエンドサイトーシス炭水化物結合タンパク質または受容体の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の分子に係合または結合する第１のタイプのＮ－グリカンと、（ｉｉ）第２のエンドサイトーシス炭水化物結合タンパク質または受容体に対する結合特異性を有する第２のタイプのＮ－グリカンであって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の糖鎖部位で存在し、したがって、単一の二機能性結合タンパク質が、第２のエンドサイトーシス炭水化物結合タンパク質（複数可）または受容体（複数可）の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の分子に係合または結合できる第２のタイプのＮ－グリカンと、を含む。

【0131】

より具体的な実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、（ｉ）第１のエンドサイトーシス炭水化物結合タンパク質または受容体に対する結合特異性を有する第１のタイプのＮ－グリカンであって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の糖鎖部位で存在し、したがって、第１のエンドサイトーシス炭水化物結合タンパク質または受容体の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の分子に係合または結合する第１のタイプのＮ－グリカンと、（ｉｉ）第２のエンドサイトーシス炭水化物結合タンパク質または受容体に対する結合特異性を有する第２のタイプのＮ－グリカンであって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の糖鎖部位で存在し、したがって、単一の二機能性結合タンパク質が、第２のエンドサイトーシス炭水化物結合タンパク質（複数可）または受容体（複数可）の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の分子に係合または結合できる第２のタイプのＮ－グリカンと、（ｉｉｉ）第３のエンドサイトーシス炭水化物結合タンパク質または受容体に対する結合特異性を有する第３のタイプのＮ－グリカンであって、単一の二機能性結合タンパク質が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の糖鎖部位で存在し、したがって、第３のエンドサイトーシス炭水化物結合タンパク質（複数可）または受容体（複数可）の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の分子に係合または結合できる第３のタイプのＮ－グリカンと、を含む。

【0132】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の糖鎖部位を有する。いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質の集団において、集団中の糖鎖部位の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％が１つの特定の位置でグリコシル化される。特定の実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質の集団において、集団中の糖鎖部位の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％がグリコシル化される。本明細書で提供される糖鎖改変二機能性結合タンパク質の糖鎖部位に存在し得るＮ－グリカンを以下に記載する。

【0133】

特定の実施形態では、糖鎖部位はＮ－グリコシル化コンセンサス配列である。コンセンサス配列はＮ－Ｘ－Ｓ／ＴまたはＮ－Ｘ－Ｃとすることができ、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である。

【0134】

いくつかの実施形態では、疾患に関連する標的タンパク質に特異的に結合する、第１の部分及び第２の部分を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、疾患に関連する標的タンパク質に特異的に結合する第１の部分と、エンドサイトーシス炭水化物結合タンパク質及び受容体に特異的に結合する第２の部分であって、グリカン構造を含む第２の部分と、を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書で提供される。

【0135】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質に特異的に結合する第１の部分と、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＭａｎ－６－Ｐ－Ｎ－グリカンからなる群から選択されるＮ－グリカンを含む第２の部分とを含む、糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書で提供される。

【0136】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質に特異的に結合する第１の部分と、下記の構造を含むグリカンを含む第２の部分と、を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書で提供され、

【化10】

四角はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を表し、黒い縞模様の丸はマンノース（Ｍａｎ）残基を表し、Ｘは二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表す。この構造の名称については、表１を参照する。

【0137】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質に特異的に結合する第１の部分と、下記の構造を含むグリカンを含む第２の部分と、を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書で提供され、

【化11】

黒い四角はＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を表し、白い四角はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を表し、黒い縞模様の円はマンノース（Ｍａｎ）残基を表し、Ｘは二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表す。この構造の名称については、表１を参照する。

【0138】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質に特異的に結合する第１の部分と、下記の構造を含むグリカンを含む第２の部分と、を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書で提供され、

【化12】

白い丸はガラクトース（Ｇａｌ）残基を表し、四角はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を表し、黒い縞模様の丸はマンノース（Ｍａｎ）残基を表し、Ｘは二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表す。この構造の名称については、表１を参照する。

【0139】

いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書で提供され、二機能性結合タンパク質は、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）下記の構造のＮ－グリカンを含み、

【化13】

Ｎ－グリカンは、１、２、３、４または５個のＮ－グリコシル化部位で二機能性結合タンパク質に連結される。この構造の名称については、表１を参照する。特定の実施形態では、本明細書で提供される二機能性タンパク質は、末端グリカンとしてＧｌｃＮＡｃ２を有するＮ－グリカンを含む。具体的には、Ｎ－グリカンのＧｌｃＮＡｃ２部分のＮ－グリカンの任意の分岐構造も含まれ得る。

【0140】

いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書で提供され、二機能性結合タンパク質は、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）下記の構造のＮ－グリカンを含み、

【化14】

Ｎ－グリカンは、１、２、３、４または５個のＮ－グリコシル化部位で二機能性結合タンパク質に連結される。この構造の名称については、表１を参照する。特定の実施形態では、本明細書で提供される二機能性タンパク質は、末端グリカンとしてＧａｌＮＡｃ２を有するＮ－グリカンを含む。具体的には、Ｎ－グリカンのＧａｌＮＡｃ２部分のＮ－グリカンの任意の分岐構造も含まれ得る。

【0141】

いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書で提供され、二機能性結合タンパク質は、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）下記の構造のＮ－グリカンを含み、

【化15】

Ｎ－グリカンは、１、２、３、４または５個のＮ－グリコシル化部位で二機能性結合タンパク質に連結される。この構造の名称については、表１を参照する。特定の実施形態では、本明細書で提供される二機能性タンパク質は、末端グリカンとしてＧａｌ２を有するＮ－グリカンを含む。具体的には、Ｎ－グリカンのＧａｌ２部分のＮ－グリカンの任意の分岐構造も含まれ得る。

【0142】

いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、抗体またはその断片である。いくつかの実施形態では、抗体のＦａｂ領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の糖鎖部位を有する。他の実施形態では、Ｆａｂ領域内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の糖鎖部位は、Ｎ－グリカン構造、例えば、表１１に示されるグリカン構造のいずれかに連結される。特定の実施形態では、グリカンは以下の構造のうちの１つを有し、

【化16】

Ｎ－グリカンは１、２、３、４または５個のＮ－グリコシル化部位で二機能性結合タンパク質に結合しており、黒い四角はＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を表し、白い四角はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を表し、黒い縞模様の円はマンノース（Ｍａｎ）残基を表し、白丸はガラクトース（Ｇａｌ）残基を表し、Ｘは二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表す。これらの構造の名称については、表１を参照する。

【0143】

いくつかの実施形態では、抗体のＦｃ領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の糖鎖部位を有する。特定の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のこれらの糖鎖部位は、Ｎ－グリカン構造、例えば、表１１に示されるグリカン構造のいずれかを含む。特定の実施形態では、グリカンは以下の構造のうちの１つを有し、

【化17】

【0144】

Ｎ－グリカンは１、２、３、４または５個のＮ－グリコシル化部位で二機能性結合タンパク質に結合しており、黒い四角はＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を表し、白い四角はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を表し、黒い縞模様の円はマンノース（Ｍａｎ）残基を表し、白丸はガラクトース（Ｇａｌ）残基を表し、Ｘは二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表す。これらの構造の名称については、表１を参照する。

【0145】

いくつかの実施形態では、Ｆａｂ領域及びＦｃ領域はそれぞれ、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の糖鎖部位を有し、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のこれらの糖鎖部位は、Ｎ－グリカン、例えば、表１１に示されるグリカン構造のいずれかでグリコシル化される。特定の実施形態では、グリカンは以下の構造のうちの１つを有し、

【化18】

【0146】

Ｎ－グリカンは１、２、３、４または５個のＮ－グリコシル化部位で二機能性結合タンパク質に結合しており、黒い四角はＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を表し、白い四角はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を表し、黒い縞模様の円はマンノース（Ｍａｎ）残基を表し、白丸はガラクトース（Ｇａｌ）残基を表し、Ｘは二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表す。これらの構造の名称については、表１を参照する。

【0147】

特定の実施形態では、近位ＧｌｃＮＡｃ（糖鎖改変二機能性結合タンパク質に融合したＧｌｃＮＡｃ）のＮ－グリカンの任意の分岐構造も含まれ得る。特定の実施形態では、近位ＧｌｃＮＡｃはフコシル化され得る。特定の実施形態では、Ｎ－グリカンは、上記に示した構造のいずれか１つからなる。

【0148】

いくつかの実施形態では、Ｆａｂ領域は、Ｆｃ領域よりも多くのグリカンを含む。いくつかの実施形態では、Ｆａｂ領域は、Ｆｃ領域と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のグリカンを含む。いくつかの実施形態では、グリカンの１０％がＦｃ領域にあり、グリカンの９０％がＦａｂ領域にある。いくつかの実施形態では、グリカンの２０％がＦｃ領域にあり、グリカンの８０％がＦａｂ領域にある。いくつかの実施形態では、グリカンの３０％がＦｃ領域にあり、グリカンの７０％がＦａｂ領域にある。いくつかの実施形態では、グリカンの４０％がＦｃ領域にあり、グリカンの６０％がＦａｂ領域にある。いくつかの実施形態では、グリカンの５０％がＦｃ領域にあり、グリカンの５０％がＦａｂ領域にある。いくつかの実施形態では、Ｆａｂ領域及びＦｃ領域のグリカン構造は同一である（すなわち、同じである）。いくつかの実施形態では、Ｆａｂ領域及びＦｃ領域のグリカン構造は非同一である（すなわち、同じではない）。

【0149】

いくつかの実施形態では、第１の部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、またはそれらの機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、第１の部分は、モノクローナル抗体のＦａｂ領域を含む。いくつかの実施形態では、第１の部分は、本明細書に開示される標的タンパク質のいずれかと特異的に結合する。

【0150】

いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、ＴＮＦαモノクローナル抗体である。他の実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、ＴＮＦαモノクローナル抗体ではない。

【0151】

いくつかの実施形態では、第２の部分はグリカン構造を含む。いくつかの実施形態では、グリカン構造は、表１に示されるグリカン構造のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、グリカン構造は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＭａｎ－６－Ｐ－Ｎ－グリカンを含む。いくつかの実施形態では、グリカン構造は、本明細書に開示されるＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造である。いくつかの実施形態では、グリカン構造は、本明細書に開示されるＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造である。いくつかの実施形態では、グリカン構造は、本明細書に開示されるＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造である。いくつかの実施形態では、グリカン構造は、本明細書に開示されるマンノース３グリカン構造である。いくつかの実施形態では、グリカン構造は、本明細書に開示されるグリカンのいずれかである。

【0152】

いくつかの実施形態では、第２の部分はエンドサイトーシスレクチンに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、エンドサイトーシスレクチンはマンノース結合受容体である。いくつかの実施形態では、エンドサイトーシスレクチンは、分化クラスター２０６（ＣＤ２０６）受容体である。いくつかの実施形態では、エンドサイトーシスレクチンは、ＤＣ－ＳＩＧＮ（分化クラスター２０９またはＣＤ２０９）受容体である。いくつかの実施形態では、エンドサイトーシスレクチンは、Ｃ型レクチンドメインファミリー４メンバーＧ（ＬＳＥＣＴｉｎ）受容体である。いくつかの実施形態では、エンドサイトーシスレクチンは、マクロファージ誘導性Ｃａ２＋依存性レクチン受容体（Ｍｉｎｃｌｅ）である。いくつかの実施形態では、エンドサイトーシス受容体はＬ－ＳＩＧＮ ＣＤ ２０９Ｌである）。いくつかの実施形態では、エンドサイトーシス受容体はアシアロ糖タンパク質（ＡＳＧＰＲ）である。いくつかの実施形態では、エンドサイトーシス受容体はデクチン－１である。いくつかの実施形態では、エンドサイトーシス受容体はデクチン－２である。いくつかの実施形態では、エンドサイトーシス受容体はランゲリンである。いくつかの実施形態では、第２の部分は、マクロファージマンノース２受容体、ＢＤＣＡ－２、ＤＣＩＲ、ＭＢＬ、ＭＤＬ、ＭＩＣＬ、ＣＬＥＣ２、ＤＮＧＲ１、ＣＬＥＣ１２Ｂ、ＤＥＣ－２０５、及びマンノース６リン酸受容体（Ｍ６ＰＲ）からなる群から選択される受容体に特異的に結合する。

【0153】

ＣＤ２０６はＣ型レクチンであり、ファゴサイトーシス／エンドサイトーシスのリサイクル及びシグナル伝達受容体である。ＣＤ２０６は、主にＭ２抗炎症性マクロファージ、樹状細胞、及び生きた類洞内皮細胞によって発現される。ＤＣ－ＳＩＧＮは非リサイクルのシグナル伝達受容体であり、リガンドと受容体の両方をリソソームに標的にして分解する。ＬＳＥＣＴｉｎは肝臓類洞内皮細胞に発現している。

【0154】

肝細胞におけるＡＳＧＰＲ媒介分解には、多くの用途が可能である。本明細書に開示されるグリカン構造へのＡＳＰＧＲの結合は、可溶性タンパク質または細胞表面タンパク質の選択的分解をもたらし得る。ＡＳＧＰＲ媒介分解により、サイトカイン、ケモカイン、ホルモンが除去され得る。さらに、ＡＳＧＰＲ媒介分解は、肝細胞エンドソームへの活性分子の送達に使用できる。したがって、ＡＳＧＰＲ媒介分解は、全身毒性を制限しながら、さまざまな肝疾患に応用できる。

【0155】

理論に束縛されるものではないが、いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるグリカン構造は、表１に提供される受容体によって結合される。いくつかの実施形態では、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンに結合する任意の受容体が、本明細書に開示される組成物及び方法の説明に含まれる。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンに結合する任意の受容体が、本明細書に開示される組成物及び方法の説明に含まれる。いくつかの実施形態では、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造に結合する任意の受容体が、本明細書に開示される組成物及び方法の説明に含まれる。いくつかの実施形態では、マンノース３グリカンに結合する任意の受容体が、本明細書に開示される組成物及び方法の説明に含まれる。他の実施形態では、第２の部分は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を認識する任意のエンドサイトーシス炭水化物結合受容体に結合する。

【表1】

【0156】

いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはそれらの機能的断片である。いくつかの実施形態では、抗体は組換え抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト対象から単離される。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、または完全ヒト抗体である。他の実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、自己抗原である。他の実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、自己抗体である。

【0157】

いくつかの実施形態では、抗体は、２対１、４対１、６対１、８対１、または１０対１のグリカン対抗体比を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、所定の特定の残基でグリコシル化される。他の実施形態では、抗体はランダムな残基でグリコシル化される。

【0158】

いくつかの実施形態では、以下の構造を有する第２の部分を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書に提供される：

【化19】

四角はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を表し、黒い縞模様の丸はマンノース残基を表し、Ｘは糖鎖改変二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表す。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される糖鎖改変二機能性結合タンパク質のＸアミノ酸残基は、糖鎖改変二機能性結合タンパク質に操作されたＮ結合型グリコシル化コンセンサス配列のＡｓｎである。このようなＮ結合型グリコシル化コンセンサス配列は、いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質の可変ドメインに存在し得る。いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質の集団は、

【化20】

の構造を有するグリカンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％を含み、Ｘはそれぞれの糖部位における糖鎖改変二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表す（記号は上で紹介した意味を有する）。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される糖鎖改変二機能性結合タンパク質のＸアミノ酸残基は、糖鎖改変二機能性結合タンパク質に操作されたＮ結合型グリコシル化コンセンサス配列のＡｓｎである。

【0159】

いくつかの実施形態では、以下の構造を有する第２の部分を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書に提供される：

【化21】

黒い四角はＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を表し、白い四角はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を表し、黒い縞模様の円はマンノース残基を表し、Ｘは糖鎖改変二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表す。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される糖鎖改変二機能性結合タンパク質のＸアミノ酸残基は、糖鎖改変二機能性結合タンパク質に操作されたＮ結合型グリコシル化コンセンサス配列のＡｓｎである。このようなＮ結合型グリコシル化コンセンサス配列は、いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質の可変ドメインに存在し得る。特定の実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質の集団は、

【化22】

の構造を有するグリカンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％を含み、Ｘは特定の糖部位における糖鎖改変二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表す（記号は上で紹介した意味を有する）。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される糖鎖改変二機能性結合タンパク質のＸアミノ酸残基は、糖鎖改変二機能性結合タンパク質に操作されたＮ結合型グリコシル化コンセンサス配列のＡｓｎである。

【0160】

いくつかの実施形態では、以下の構造を有する第２の部分を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書に提供される：

【化23】

白い丸はガラクトースを表し、四角はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を表し、黒い縞模様の丸はマンノース残基を表し、Ｘは糖鎖改変二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表す。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される糖鎖改変二機能性結合タンパク質のＸアミノ酸残基は、糖鎖改変二機能性結合タンパク質に操作されたＮ結合型グリコシル化コンセンサス配列のＡｓｎである。このようなＮ結合型グリコシル化コンセンサス配列は、いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質の可変ドメインに存在し得る。特定の実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質の集団は、

【化24】

の構造を有するグリカンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％を含み、Ｘは特定の糖部位における糖鎖改変二機能性結合タンパク質のアミノ酸残基を表す（記号は上で紹介した通り）。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される糖鎖改変二機能性結合タンパク質のＸアミノ酸残基は、糖鎖改変二機能性結合タンパク質に操作されたＮ結合型グリコシル化コンセンサス配列のＡｓｎである。

【0161】

いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、マンノトリオース－ジ－（Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン）（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）で糖鎖改変された抗ＴＧＦ－βモノクローナル抗体または抗Ｎｏｔｃｈモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ＧａｌＮＡｃ２で糖鎖改変された抗ＴＮＦαモノクローナル抗体である。

【0162】

他の実施形態では、特定の標的タンパク質に結合でき、以下の構造のうちの１つ以上を含む、糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書に提供される。

【表2】

【0163】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される二重特異性タンパク質に存在するＮ－グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＭａｎ－６－Ｐ－Ｎ－グリカンを含む。

【0164】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、細胞表面分子または非細胞表面分子である。いくつかの実施形態では、細胞表面分子は受容体である。いくつかの実施形態では、非細胞表面受容体は細胞外タンパク質である。いくつかの実施形態では、細胞外タンパク質は、自己抗体、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、血液タンパク質、または中枢神経系（ＣＮＳ）で発現するタンパク質である。

【0165】

いくつかの実施形態では、疾患に関連する標的タンパク質は、非疾患状態と比較して疾患においてアップレギュレートされる。いくつかの実施形態では、疾患に関連する標的タンパク質は、非疾患状態と比較して疾患において発現される。いくつかの実施形態では、疾患に関連する標的タンパク質は、疾患の進行に関与する。いくつかの実施形態では、疾患はがんまたは腫瘍である。いくつかの実施形態では、標的タンパク質はがんの進行に関与する。いくつかの実施形態では、疾患は自己免疫疾患である。いくつかの実施形態では、疾患は、神経変性疾患である。

【0166】

いくつかの実施形態では、疾患は、バセドウ病である。バセドウ病は甲状腺機能亢進症の最も一般的な原因である。米国での有病率は１．２％（１）で、女性の生涯リスクは３％にもなる。アゴニスト抗ＴＳＨ受容体（ＴＳＨＲ）抗体（ＴＲＡｂ）の産生により、チロキシンホルモンの過剰産生が引き起こされる（９０％を超える患者がＴＲＡｂ＋）（２）。現在の治療法は５０年間も進歩しておらず、高い再発リスクや甲状腺機能低下症などの重篤な副作用によって制限されている。いくつかの実施形態では、バセドウ病に関連する標的タンパク質は、自己抗体結合ＴＳＨＲである。他の実施形態では、バセドウ病に関連する標的タンパク質はＴＳＨＲである。
いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＴＮＦα、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、αｖβ３インテグリン、ＣＥＡ、ＣＸＣＲ４、ＭＵＣ１、ＬＣＡＭ１、ＥｐｈＡ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＶＩＳＴＡ、Ｎｏｔｃｈ受容体、ＥＧＦ、ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＬ２、ＣＣＲ２ Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、Ｗｎｔ、ＬＲＰ５／６、ＣＳＦ－１Ｒ、ＳＩＲＰα、ＣＤ３８、ＣＤ７３、ＴＧＦ－β、ＴＳＨＲα、ＡＣｈＲ－α１、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖の非コラーゲンドメイン１（α３ＮＣ１）、ＡＤＡＭＴＳ１３、デスモグレイン－１／３、ＧＰＩｂ／ＩＸ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩａ／ＩＩａ、ＮＭＤＡ受容体、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、アンフィフィシン、ガングリオシドＧＭ１、ＧＤ３、及びＧＱ１Ｂからなる群から選択されるタンパク質を含む。他の実施形態では、標的タンパク質は、ＴＳＨＲα、ＭＯＧ、ＡＣｈＲ－α１、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖の非コラーゲンドメイン１（α３ＮＣ１）、ＡＤＡＭＴＳ１３、デスモグレイン－１／３、ＧＰＩｂ／ＩＸ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩａ／ＩＩａ、ＮＭＤＡ受容体、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、アンフィフィシン、ガングリオシドＧＭ１、ＧＤ３、及びＧＱ１Ｂに結合する抗体を含む。

【0167】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質を肝細胞エンドソームに送達する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、標的タンパク質を肝細胞に送達する方法は、本明細書に開示される任意の標的タンパク質のエンドサイトーシスを媒介する条件下で、標的タンパク質を、本明細書に開示される糖鎖改変二機能性結合タンパク質のいずれかと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、標的タンパク質を肝細胞エンドソームに送達する方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏで肝細胞エンドソームに送達する様式は、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、経皮注射または筋肉内注射を含む。いくつかの実施形態では、標的タンパク質を肝細胞エンドソームに送達する方法は、エクスビボで行われる。

【0168】

いくつかの実施形態では、送達速度は、糖鎖改変二機能性結合タンパク質上に存在するグリカン構造の数に基づいて増加させることができる。いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質上のグリカン構造の数を増加させることにより、送達速度を増加させる。いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上のグリカン構造を含み得る。いくつかの実施形態では、グリカン構造は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＭａｎ－６－Ｐ－Ｎ－グリカンを含む。いくつかの実施形態では、グリカン構造は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含む。いくつかの実施形態では、グリカン構造はＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である。いくつかの実施形態では、グリカン構造はＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である。いくつかの実施形態では、グリカン構造はＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である。

【0169】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質を分解する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、標的タンパク質を分解する方法は、宿主細胞による本明細書に開示される標的タンパク質のいずれかの分解を媒介する条件下で、標的タンパク質を、本明細書に開示される糖鎖改変二機能性結合タンパク質のいずれかと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、分解はリソソーム分解である。いくつかの実施形態では、分解は、エンドサイトーシスまたはファゴサイトーシスによって媒介される。いくつかの実施形態では、分解は、本明細書に開示されるあらゆる第２の部分を除くグリカンを含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質によって媒介される分解よりも、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１５倍、１８倍、２０倍、２５倍、または３０倍高い。他の実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、本明細書に開示されるあらゆる第２の部分を除くグリカンを含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質の存在下での標的タンパク質の分解と比較して、開示された標的タンパク質のいずれかの分解を増強する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、骨髄細胞、免疫細胞、内皮細胞、実質細胞または上皮細胞を含むがこれらに限定されない任意の宿主細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、樹状細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア細胞、顆粒球またはＢリンパ球であり得る。

【0170】

いくつかの実施形態では、リソソーム分解の速度は、糖鎖工学を通じて調節することができる。いくつかの実施形態では、リソソーム分解の速度は、糖鎖改変二機能性結合タンパク質上に存在するグリカン構造の数に基づいて調節することができる。いくつかの実施形態では、リソソーム分解の速度は、糖鎖改変二機能性結合タンパク質上に存在するグリカン構造の数に基づいて増加させることができる。いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質上のグリカン構造の数を増加させることにより、リソソーム分解の速度を増加させる。いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上のグリカン構造を含み得る。いくつかの実施形態では、グリカン構造は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ４ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＭａｎ－６－Ｐ－Ｎ－グリカンを含む。いくつかの実施形態では、グリカン構造は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含む。いくつかの実施形態では、グリカン構造はＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である。いくつかの実施形態では、グリカン構造はＧａｌＮＡｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である。いくつかの実施形態では、グリカン構造はＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である。いくつかの実施形態では、糖鎖改変二機能性結合タンパク質上の２つ以上のＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造の存在は、１つのＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を含む糖鎖改変二機能性結合タンパク質と比較して、リソソーム分解の速度を増加させることができる。いくつかの実施形態では、リソソーム分解の速度を微調整することができる。つまり、存在するグリカン構造の数を増やすことによって、リソソーム分解の速度を高めることができる。治療される症状に応じて、異なる内部移行速度が望まれる。急性症状の治療には、本明細書で提供される二機能性タンパク質とその標的タンパク質（複数可）との複合体の迅速な内部移行が望まれる。これを達成するには、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の糖鎖部位を導入してＮ－グリカンに結合させることができ、その結果、急速な内部移行と、１０分未満、１５分未満、３０分未満、４５分未満、６０分未満、９０分未満、２時間未満、３時間未満、または４時間未満の標的タンパク質の短い半減期を引き起こす。標的タンパク質のレベル上昇を伴う急性症状の治療のために、この方法は、それを必要とする患者に二機能性結合タンパク質を投与することを含み、二機能性結合タンパク質は、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）Ｎ－グリカンを含み、Ｎ－グリカンは、半減期が、二機能性結合タンパク質の非存在下または任意の治療の非存在下において、患者における標的タンパク質の半減期の最大２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％であるように、１つ、２つまたはそれ以上の糖鎖部位で二機能性結合タンパク質に連結される。

【0171】

慢性症状の治療には、本明細書で提供される二機能性タンパク質のより長い半減期が望まれる。これを達成するには、多くても１、２、または多くても３個の糖鎖部位が存在してＮ－グリカンに結合し、その結果、半減期は、１２時間超、２４時間超、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日間超、または３週間超、または４週間超となる。標的タンパク質のレベル上昇を伴う慢性症状の治療のために、この方法は、それを必要とする患者に二機能性結合タンパク質を投与することを含み、二機能性結合タンパク質は、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）Ｎ－グリカンを含み、Ｎ－グリカンは、半減期が、二機能性結合タンパク質の非存在下または任意の治療の非存在下において、患者における標的タンパク質の半減期の最大２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％であるように、１つ以上の糖鎖部位で二機能性結合タンパク質に連結される。

【0172】

【0173】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質を分解する方法は、ＧｌｃＮＡｃ媒介分解を含む。いくつかの実施形態では、ＧｌｃＮＡｃ分解は、エンドサイトーシス受容体の関与により最適である。いくつかの実施形態では、ＧｌｃＮＡｃ媒介分解を介して標的タンパク質を分解する方法は選択的である。いくつかの実施形態では、ＧｌｃＮＡｃ分解は、循環から炎症性サイトカインを除去し、不要な血液因子を除去し、自己抗体を除去し、細胞表面受容体を除去する。

【0174】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質を分解する方法は、ＧａｌＮＡｃ媒介分解を含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ分解は、エンドサイトーシス受容体の関与により最適である。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ媒介分解を介して標的タンパク質を分解する方法は選択的である。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ分解は、循環から炎症性サイトカインを除去し、不要な血液因子を除去し、自己抗体を除去し、細胞表面受容体を除去し、細胞外可溶性タンパク質を除去する。

【0175】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質を分解する方法は、Ｇａｌ媒介分解を含む。いくつかの実施形態では、Ｇａｌ分解は、エンドサイトーシス受容体の関与により最適である。いくつかの実施形態では、Ｇａｌ媒介分解を介して標的タンパク質を分解する方法は選択的である。いくつかの実施形態では、Ｇａｌ分解は、循環から炎症性サイトカインを除去し、不要な血液因子を除去し、自己抗体を除去し、細胞表面受容体を除去する。

【0176】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質を分解する方法は、マンノース３媒介分解を含む。いくつかの実施形態では、マンノース３分解は、エンドサイトーシス受容体の関与により最適である。いくつかの実施形態では、マンノース３媒介分解を介して標的タンパク質を分解する方法は選択的である。いくつかの実施形態では、マンノース３分解は、循環から炎症性サイトカインを除去し、不要な血液因子を除去し、自己抗体を除去し、細胞表面受容体を除去する。

【0177】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質の分解を媒介する糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、本明細書に開示されるエンドサイトーシス受容体のいずれかによるＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の認識を介して、ＴＧＦ－βを捕捉し、リソソーム中でＴＧＦ－βを分解するＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含む抗ＴＧＦ－βモノクローナル抗体である。このアプローチは、がん治療のために細胞表面のＮｏｔｃｈなどの受容体を枯渇させるのに応用できる。

【0178】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、がんにおいてアップレギュレートされるタンパク質である。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、がんの進行に関与するタンパク質である。本明細書で提供される糖鎖改変二機能性結合タンパク質によって結合され得る、がんにおいてアップレギュレートされる、またはがんの進行に関与する標的タンパク質の例としては、ＴＮＦα、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、αｖβ３インテグリン、ＣＥＡ、ＣＸＣＲ４、ＭＵＣ１、ＬＣＡＭ１、ＥｐｈＡ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＶＩＳＴＡ、Ｎｏｔｃｈ受容体、ＥＧＦ、ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＬ２、ＣＣＲ２ Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、Ｗｎｔ、ＬＲＰ５／６、ＣＳＦ－１Ｒ、ＳＩＲＰα、ＣＤ３８、ＣＤ７３、ＴＧＦ－β、ボンベシンＲ、ＣＡＩＸ、ＣＤ１３、ＣＤ４４ｖ６、エムプリン、エンドグリン、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ－α、葉酸Ｒ、ＧＲＰ７８、ＩＧＦ－１Ｒ、マトリプターゼ、メソテリン、ｓＭＥＴ／ＨＧＦＲ、ＭＴ１－ＭＭＰ、ＭＴ６－ＭＭＰ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、Ｔｎ抗原、及びｕＰＡＲが挙げられるが、これらに限定されない。

【0179】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、自己免疫疾患に関連するような自己抗体である。本明細書で提供される糖鎖改変二機能性結合タンパク質によって結合され得る自己抗体の例としては、ＴＳＨＲα、ＭＯＧ、ＡＣｈＲ－α１に対する自己抗体、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖の非コラーゲンドメイン１（α３ＮＣ１）、ＡＤＡＭＴＳ１３、デスモグレイン－１／３、またはＧＰＩｂ／ＩＸ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩａ／ＩＩａ、ＮＭＤＡ受容体、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、アンフィフィシン及びガングリオシドＧＭ１、ＧＤ３、ＧＱ１Ｂが挙げられるが、これらに限定されない。

【0180】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）においてアップレギュレートまたは発現されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、腫瘍促進性ＴＡＭにおいてアップレギュレートまたは発現される。ＴＡＭでアップレギュレートまたは発現される標的タンパク質の例としては、ＳＩＲＰα、ＣＣＲ２、ＣＳＦ－１Ｒ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＶＥＧＦ－Ｒ、またはＣＸＣＲ４（９）が挙げられる。他の実施形態では、標的タンパク質は、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＣＳＦ－１、またはＣＤ４７（９）を含む。参考文献（９）に記載されているように、これらの標的は、特にＴＡＭの動員とプログラミングを促進することにより、腫瘍促進性ＴＡＭの促進に役割を果たす。

【0181】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される二機能性結合タンパク質のいずれかを使用してＴＡＭを再プログラミングする方法が本明細書で提供される。参考文献（７）に記載されているように、ＴＡＭの再プログラミングは、マクロファージ受容体を標的にして阻害し、腫瘍形成促進性ＴＡＭを抗腫瘍形成性ＴＡＭに再プログラミングすることを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される二機能性結合タンパク質のいずれかを使用してＴＡＭを枯渇させる方法が本明細書で提供される。ＴＡＭの枯渇は、増殖に重要な受容体を標的とすることによって発生し得る。これらの受容体を標的にすると、腫瘍形成促進性ＴＡＭのアポトーシスを促進することができる。さらなる実施形態では、本明細書に開示される二機能性結合タンパク質のいずれかを使用して、腫瘍微小環境へのＴＡＭの動員を阻害する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＴＡＭを再プログラミングし、枯渇させ、または動員を阻害する方法は、開示された二機能性結合タンパク質のいずれかを使用して、ＴＡＭによってアップレギュレートまたは発現される標的を分解することを含む。いくつかの実施形態では、ＴＡＭにおいてアップレギュレートまたは発現される標的タンパク質は、ＳＩＲＰα、ＣＣＲ２、ＣＳＦ－１Ｒ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＶＥＧＦ－ＲまたはＣＸＣＲ４を含む。他の実施形態では、ＴＡＭに関連する標的タンパク質は、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＣＳＦ－１、またはＣＤ４７を含む。

【0182】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される糖鎖改変二機能性結合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が本明細書で提供される。

【0183】

いくつかの実施形態では、患者の疾患を治療または予防する方法であって、本明細書に記載される糖鎖改変二機能性結合タンパク質または本明細書に記載される医薬組成物を患者に投与することを含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、疾患は、自己免疫疾患、がんまたは腫瘍、肝疾患、炎症性障害、または血液障害である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、バセドウ病、重症筋無力症、抗ＧＢＭ疾患、免疫性血栓性血小板減少性紫斑病、尋常性後天性天疱瘡、免疫性血小板減少症、ギランバレー症候群、及び膜性腎症から選択される。いくつかの実施形態では、がんまたは腫瘍は、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、肝細胞癌、ならびに血液Ｔ細胞及びＢ細胞悪性腫瘍から選択される。

【0184】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される疾患を治療または予防する方法は、本明細書に記載される糖鎖改変二機能性結合タンパク質または本明細書に記載される医薬組成物の静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、経皮注射、または筋肉内注射を含む投与ステップを含む。

【0185】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される疾患を治療または予防する方法は、異なるグリコシル化プロファイルを有する同じ抗体と比較して同じ効果を達成するために、より低い用量及び／またはより低い投与頻度を必要とし、及び／または長期間（少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは少なくとも１２ヶ月、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは少なくとも１０年）にわたって投与することができ、及び／または患者において糖鎖改変二機能性結合タンパク質に対する免疫応答を誘発しない。

【0186】

いくつかの実施形態では、本開示の糖鎖改変二機能性結合タンパク質を含むキットが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、キットは、二機能性分子または医薬組成物を、それを必要とする個体に投与するための説明書をさらに提供する。

【0187】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、単一剤形、例えば、本明細書に記載される糖鎖改変二機能性結合タンパク質の単一剤形で投与することができる。

【0188】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される糖鎖改変二機能性結合タンパク質の好適な用量は、治療効果をもたらすのに有効な最低用量に対応する量である。例えば、抗ＴＳＨ受容体抗体の有効量は、バセドウ病に罹患している対象のＴＳＨ活性を阻害する量とすることができる。

【0189】

いくつかの実施形態では、患者に投与される本明細書に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質の量は、本明細書に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質とは異なるグリコシル化プロファイルを有する同じ糖鎖改変二機能性結合タンパク質の医薬品のラベルに記載されている量よりも少ない。

【0190】

いくつかの実施形態では、一定期間にわたって患者に投与される本明細書に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質の蓄積量は、本明細書に記載の糖鎖改変二機能性結合タンパク質とは異なるグリコシル化プロファイルを有する同じ糖鎖改変二機能性結合タンパク質の医薬品のラベルに示される蓄積量よりも少ない。いくつかの実施形態では、低減した蓄積量は、低減した頻度で低減した用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、低減した蓄積量は、低減した頻度で標識中の用量と同じまたはそれよりも高い１つ以上の用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、低減した蓄積量は、ラベル中の頻度と同じまたはそれよりも高い頻度で１つ以上の低減した用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、低減した蓄積量は、医薬製品が治療または予防において同じレベルの効果を達成する期間よりも短い期間にわたって投与され得る。

【0191】

いくつかの実施形態では、患者に投与される単回用量中の本明細書に記載される糖鎖改変二機能性結合タンパク質の量は、約１～１５０ｍｇ、約５～１４５ｍｇ、約１０～１４０ｍｇ、約１５～１３５ｍｇ、約２０～１３０ｍｇ、約２５～１２５ｍｇ、約３０～１２０ｍｇ、約３５～１１５ｍｇ、約４０～１１０ｍｇ、約４５～１０５ｍｇ、約５０～１００ｍｇ、約５５～９５ｍｇ、約６０～９０ｍｇ、約６５～５ｍｇ、約７０～８０ｍｇ、または約７５ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、患者に投与される単回用量中の本明細書に記載される糖鎖改変二機能性結合タンパク質の量は、約５～約８０ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、患者に投与される単回用量中の本明細書に記載される糖鎖改変二機能性結合タンパク質の量は、約２５～約５０ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、患者に投与される単回用量中の本明細書に記載される糖鎖改変二機能性結合タンパク質の量は、約１５～約３５ｍｇであり得る。

【0192】

いくつかの実施形態では、患者に投与される単回用量中の本明細書に記載される糖鎖改変二機能性結合タンパク質の量は、４０ｍｇ以下、例えば、４０ｍｇ、３５ｍｇ、３０ｍｇ、２５ｍｇ、２０ｍｇ、１８ｍｇ、１５ｍｇ、１２ｍｇ、１０ｍｇ、７ｍｇ、５ｍｇ、及び２ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、患者に投与される単回用量中の本明細書に記載される糖鎖改変二機能性結合タンパク質の量は、８０ｍｇ以下、例えば、８０ｍｇ、７５ｍｇ、７０ｍｇ、６５ｍｇ、６０ｍｇ、５５ｍｇ、５０ｍｇ、４５ｍｇ、４０ｍｇ、３５ｍｇ、３０ｍｇ、２０ｍｇ、１５ｍｇ、１０ｍｇ、５ｍｇ、及び２ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、患者に投与される単回用量中の本明細書に記載される糖鎖改変二機能性結合タンパク質の量は、１６０ｍｇ以下、例えば１５０ｍｇ、１４０ｍｇ、１３０ｍｇ、１２０ｍｇ、１１０ｍｇ、１００ｍｇ、９０ｍｇ、８０ｍｇ、７５ｍｇ、７０ｍｇ、６５ｍｇ、６０ｍｇ、５５ｍｇ、５０ｍｇ、４５ｍｇ、４０ｍｇ、３５ｍｇ、３０ｍｇ、２０ｍｇ、１５ｍｇ、１０ｍｇ、５ｍｇ、及び２ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、患者に投与される単回用量中の本明細書に記載される糖鎖改変二機能性結合タンパク質の量は、１６０ｍｇ以上、例えば、１７０ｍｇ、１８０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、及び３００ｍｇであり得る。

【0193】

いくつかの実施形態では、本開示の糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、１週間おき、すなわち、１４日毎である頻度で投与することができる。いくつかの実施形態では、本開示の糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、１４日毎よりも低い頻度、例えば、半月毎、２１日毎、毎月、８週間毎、隔月、１２週間毎、３ヶ月毎、４ヶ月毎、５ヶ月毎、または６ヶ月毎に投与することができる。いくつかの実施形態では、本開示の糖鎖改変二機能性結合タンパク質は、１４日毎と同じまたはそれよりも高い頻度、例えば、１４日毎、１０日毎、７日毎、５日毎、１日おき、または毎日投与することができる。

【0194】

いくつかの実施形態では、本開示の糖鎖改変二機能性結合タンパク質の投与は、以下の用量、例えば、以下の維持用量よりも高い誘導用量を含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示の糖鎖改変二機能性結合タンパク質の投与は、誘導用量よりも低くかつ以下の維持用量よりも高い第２の用量を含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示の糖鎖改変二機能性結合タンパク質の投与は、治療期間全体を通してすべての用量で同じ量の糖鎖改変二機能性結合タンパク質を含むことができる。

【0195】

本明細書で提供される糖鎖改変二機能性結合タンパク質を生成する方法は、当技術分野でよく知られている。本明細書で提供される糖鎖改変二機能性結合タンパク質を生成する例示的な方法は、国際特許出願公開ＷＯ２０１９／００２５１２、ＷＯ２０２１／１４０１４３、ＷＯ２０２１／１４０１４４、及びＷＯ２０２２／０５３６７３に記載されており、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれ、本明細書において例示され、そのうちのいずれか１つが、本明細書で提供される糖鎖改変二機能性結合タンパク質を生成するために使用され得る。例えば、当業者は、既知のタンパク質（例えば、モノクローナル抗体）、及び新たに特定されたタンパク質（例えば、モノクローナル抗体）の核酸配列が、当該技術分野で既知の方法を使用して容易に推論され得ることを容易に理解し、よって、任意の糖鎖改変二機能性結合タンパク質をコードする核酸を本明細書で提供される宿主細胞に（例えば、発現ベクター、例えば、プラスミド、例えば、相同組換えによる部位特異的組み込みを介して）導入することは、十分に当業者の能力の範囲内であろう。

【0196】

いくつかの実施形態では、本明細書において、本明細書に記載される糖鎖改変二機能性結合タンパク質を含むＬｅｉｓｈｍａｎｉａ宿主細胞である。そのような宿主細胞は、いくつかの実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ種複合体の一部である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ａｒｉｓｔｉｄｅｓｉ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｅａｎｅｉ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ種複合体の一部である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｃｈａｇａｓｉ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｉｎｆａｎｔｕｍ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｈｅｒｔｉｇｉ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ種複合体の一部である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｒｔｉｎｉｑｕｅｎｓｉｓ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍｅｘｉｃａｎａ種複合体の一部である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍｅｘｉｃａｎａ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｐｉｆａｎｏｉ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔｒｏｐｉｃａ種複合体の一部である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔｒｏｐｉｃａ細胞である。

【0197】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ宿主細胞を培養することと、糖鎖改変二機能性結合タンパク質を単離することとを含む、糖鎖改変二機能性結合タンパク質を作製する方法が本明細書で提供される。

【0198】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生される糖鎖改変二機能性結合タンパク質が本明細書で提供される。

【0199】

Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ宿主細胞を産生する方法、及びそのような宿主細胞を使用して糖鎖改変二機能性結合タンパク質を産生する方法は、当技術分野でよく知られている。例示的な方法は、国際特許出願公開ＷＯ２０１９／００２５１２、ＷＯ２０２１／１４０１４３、ＷＯ２０２１／１４０１４４及びＷＯ２０２２／０５３６７３に記載されており、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれ、本明細書において例示され、そのうちのいずれかが、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ宿主細胞を生成し、ここで提供される糖鎖改変二機能性結合タンパク質を産生するために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される宿主細胞は、すべて５μｇ／ｍｌのヘミンを含有する、ブレインハートインフュージョン、トリプチケースソイブロス、または酵母エキスのような富栄養培地中での増殖が挙げられるが、これに限定されない、当該技術分野で既知の標準的な培養技法のいずれかを使用して培養される。追加的に、インキュベーションは、２～３日にわたって静置または振盪培養物として暗所において２６℃で行うことができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞の培養物は、適切な選択的薬剤を含有する。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるモノクローナル抗体は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び混合モードクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない、当技術分野で知られている標準的な精製技術のいずれかを使用して宿主細胞培養上清から精製される。

【0200】

本明細書で提供される二機能性タンパク質を生成する他の方法を使用することもできる。例えば、化学的結合または化学酵素的修飾を使用して、本明細書で提供される二機能性タンパク質を生成することができる。

【0201】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、標的タンパク質のレベル上昇を伴う急性症状を治療する方法であって、この方法は、それを必要とする患者に二機能性結合タンパク質を投与することを含み、二機能性結合タンパク質は、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）下記の構造を有するＮ－グリカンを含み、

【化25】

Ｎ－グリカンは、少なくとも１、２、３、４、または５つのＮ－グリコシル化部位（記号は上で紹介した意味を有する）で二機能性結合タンパク質に連結され、その結果、半減期は、グリコシル化されていない二機能性結合タンパク質の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％となる。いくつかの実施形態では、患者における本明細書で提供される二機能性タンパク質の存在下での標的タンパク質の半減期は、５分、１０分、１５分、３０分、４５分、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、または３時間である。

【0202】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、標的タンパク質のレベル上昇を伴う慢性症状を治療する方法であって、この方法は、それを必要とする患者に二機能性結合タンパク質を投与することを含み、二機能性結合タンパク質は、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）下記の構造を有するＮ－グリカンを含み、

【化26】

Ｎ－グリカンは、多くとも１、２、３、４、または５つのＮ－グリコシル化部位（記号は上で紹介した意味を有する）で二機能性結合タンパク質に連結され、その結果、半減期は、患者においてグリコシル化されていない二機能性結合タンパク質の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％となる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質の半減期は、少なくとも６時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日である。

【0203】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、標的タンパク質のレベル上昇を伴う慢性症状を治療する方法であって、この方法は、それを必要とする患者に二機能性結合タンパク質を投与することを含み、二機能性結合タンパク質は、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合し、（ｉｉ）Ｎ－グリカンを含み、Ｎ－グリカンは、半減期が、二機能性結合タンパク質の非存在下または任意の治療の非存在下において、患者における標的タンパク質の半減期の最大２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％であるように、１つ、２つまたはそれ以上の糖鎖部位で二機能性結合タンパク質に連結される。

【0204】

いくつかの実施形態では、慢性症状は、自己免疫疾患、がんまたは腫瘍、肝疾患、炎症性障害、または血液凝固障害である。

【0205】

いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、バセドウ病、重症筋無力症、抗ＧＢＭ疾患、免疫性血栓性血小板減少性紫斑病、尋常性後天性天疱瘡、免疫性血小板減少症、自己免疫性脳炎、ギランバレー症候群、及び膜性腎症から選択される。

【0206】

いくつかの実施形態では、がんは固形腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、がんは、血液由来のがんまたは腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、がんは癌腫または肉腫であり得る。いくつかの実施形態では、がんは、肺癌（小細胞または非小細胞）、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、悪性黒色腫、脳癌（例えば、星状細胞腫、神経膠腫、髄膜腫、神経芽腫など）、骨癌（骨肉腫など）、子宮頸癌、胆管癌、消化管癌（例えば、口腔癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌など）、頭頸部癌、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、肝臓癌（肝細胞癌など）、中皮腫、上咽頭癌、神経内分泌癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮膚癌、紡錘細胞癌、精巣癌、甲状腺癌、または子宮癌（子宮内膜癌など）から選択される。特定の実施形態では、がんは、以前の治療後に再発したもの、または従来の治療に抵抗性のものであり得る。特定の実施形態では、がんは播種性または転移性であり得る。いくつかの実施形態では、血液由来のがんまたは腫瘍は、白血病、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫）から選択される。特定の実施形態では、白血病は、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、及び急性骨髄芽球性白血病である。いくつかの実施形態では、治療は、標的タンパク質のエンドサイトーシスを媒介する条件下で二機能性結合タンパク質を投与することにより、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を再プログラミングすることを含む。

【0207】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＴＡＭにおいてアップレギュレートまたは発現される。

【0208】

いくつかの実施形態では、ＴＡＭにおいてアップレギュレートまたは発現される標的タンパク質は、ＳＩＲＰα、ＣＣＲ２、ＣＳＦ－１Ｒ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＶＥＧＦ－Ｒ、ＣＸＣＲ４、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＣＳＦ－１またはＣＤ４７を含む。

【0209】

いくつかの実施形態では、投与ステップは、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、経皮注射、または筋肉内注射を含む。

【0210】

本発明のさまざまな実施形態の活性に実質的に影響を及ぼさない修飾はまた、本明細書で提供される本発明の定義内で提供されることが理解される。したがって、以下の例は、本発明を例示することを意図しているが、本発明を限定するものではない。

【実施例】

【0211】

実施例Ｉ
グリコシル化された二機能性抗体の生成。
抗体は以下のように調製した。モノクローナル抗ＴＮＦα抗体、ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）（ＡｂｂＶｉｅ）またはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ ＣＧＰ由来のアダリムマブ変異体（Ａ－Ｓ、Ａ－Ｍ）、またはＭａｂｔｈｅｒａを、ＺｅｂａＳｐｉｎカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ、ＵＳ）を使用して３０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５に再緩衝した。ガラクトシル化及びアルファ２，６－シアル化（Ｈ－Ｓ及びＡ－Ｓ変異体を生成するため）は、アプリケーションノートに従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏグリコシル化（ＩＶＧＥ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用し、３７℃で穏やかに回転させながら１ポット反応で実行した。ＦＰＬＣ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＮＧＣ、ドイツ）を使用し、メーカーの推奨に従って、プロテインＡセファロース（ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅまたはＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡカラムＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて反応混合物からグリコシル化ｍＡｂを精製した。その後、ＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ２５、Ｓｉｇｍａ、スイス）を使用した脱塩手順を実行し、ＰＢＳ ｐＨ ６（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ ｍＭ ＫＣｌ、８．６ ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１．４ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｓｉｇｍａ、スイス）への緩衝液交換を行った後、０．２μｍＰＥＳフィルター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）を使用して滅菌濾過を行った。抗体の品質とグリコシル化（表２）は、ＧｌｙｃｏＷｏｒｋｓ ＲａｐｉＦｌｕｏｒ－ＭＳ Ｎ－Ｇｌｙｃａｎ Ｋｉｔ（Ｗａｔｅｒｓ、米国）を用いてメーカーの指示に従って分析し、またはＰＮＧａｓｅＦ放出グリカンのプロカインアミド（ＰＣ）標識によって分析した。さらなるＮ－グリカン分析のために、モノクローナル抗体を、ＩｄｅＺでＦ（ａｂ’）２及びＦｃ／２に切断するか（ＩｇＧ１の場合）、または重鎖と軽鎖にし（ＩｇＧ４の場合）、ＳＤＳ ＰＡＧＥ上で分離してバンドを切除し、モノクローナル抗体からのＮ－グリカンの酵素放出を、ＰＮＧａｓｅ Ｆを使用して行った。放出後、グリカンをプロカインアミド（ＰＣ）で直接標識した。ＰＣ標識されたＮ－グリカンを、質量分析計に結合した蛍光検出でＨＩＬＩＣ－ＵＰＬＣ－ＭＳによって分析した。グリカンを、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅカラムを使用して分離した。データ処理及び分析は、Ｕｎｉｆｉを使用して行った。グルコース単位を、プロカインアミド標識デキストランラダーの保持時間に割り当てた。グリカン構造を、そのｍ／ｚ値及びその保持時間に基づいて割り当てた。グリカン形態及び相対パーセンテージを、ピーク面積に基づいて計算した。ＳＥ－ＨＰＬＣ分析は、ＭａｂＰａｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ、米国）カラムで１μｇ／μＬの濃度で行い、メーカーの指示に従って実行した。エンドトキシンレベルは０．２ＥＵ／ｍｇ（Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標））未満であった。表２は、使用した抗体によって表示される主なＮ－グリカン構造を示す。

【表3】

表２は、示された抗体によって表示される主なＮ－グリコフォーム（カノニカルＮ－２９７位）を示す。短いＩｇＧ命名法は通常、ＩｇＧ関連の命名システムで使用される。これは、コアフコースの存在、ガラクトースの数、及び二分岐グリカンの存在を示す。記述できる構造と結合の数は限られているが、簡潔にするためによく使用される。黒い縞模様の円はマンノース（Ｍａｎ）、白い四角はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、白い丸はガラクトース（Ｇａｌ）、白い菱形はシアル酸、Ｎ－アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、白い三角形はフコース（Ｆｕｃ）を表す。

【0212】

抗体は、ｐＨｒｏｄｏ色素（ｐＨｒｏｄｏ ｉＦＬ Ｒｅｄ ＳＴＰ Ｅｓｔｅｒ［アミン反応性］、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ｒｅｆ．Ｐ３６０１１）でメーカーの指示に従って標識した。ｐＨｒｏｄｏの蛍光は低ｐＨで活性化されるため、タンパク質の内部移行とリソソーム経路へのターゲティングを可視化することができる。

【0213】

各抗体のｐＨｒｏｄｏ標識度（ＤＯＬ）は次のように決定された。抗体を変性緩衝液で１：２に希釈し、Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して２８０ｎｍ及び５６０ｎｍの波長（Ａ２８０及びＡ５６０）で分析した。タンパク質濃度とｐＨｒｏｄｏ ＤＯＬは次のように計算された。

【0214】

【数1】

【0215】

【数2】

【0216】

ＭＷは使用した抗体の分子量：１４４０００ｇ／Ｍｏｌである。λｍａｘは５６０ｎｍで測定された吸光度である。ε色素は吸光係数：６５０００Ｍ^－１ｃｍ^－１である。希釈倍率は２である。

【0217】

これらの実験で使用した抗体を、ＦｃまたはＦａｂ部分上の主なＮ－グリカン構造とともに表３に示す。

【表4】

【0218】

実施例ＩＩ
ＧａｌＮＡｃ２グリコシル化Ｆａｂ抗体は、肝細胞においてＡＳＧＰＲを介して効率的な内部移行をもたらす
ＨｅｐＧ２肝癌細胞（ＡＴＣＣ ＃ＨＢ－８０６５）はＡＳＧＰＲを発現し、１０％ＦＢＳを添加した低グルコースＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ，Ｒｅｆ．Ｄ５５４６）で維持した。アダリムマブ抗体（Ａ－８４８６－Ａ２、－Ａ２Ｇ２、及び－Ａ２ＧａｌＮＡｃ２）は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨｉＴｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ、（Ｃｙｔｉｖａ）及びＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ（Ｃｙｔｉｖａ）を使用してＣＧＰ細胞培養上清から精製して、第１の濃縮器ＰＥＳ、３００００ ＭＷＣＯ、５～２０ｍＬ（１５４５１０２５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、及びＰＤ－１０脱塩カラム（使い捨てＰＤ－１０脱塩カラム、１７０８５１０１；Ｃｙｔｉｖａ）を使用して、ｐＨ６．４のＰＢＳ緩衝液で製剤化した。実施例Ｉに記載したように抗体をｐＨｒｏｄｏで標識した。表４は、本試験の対象となった抗体の特性を示す。すべての抗体は、サイズ排除ＨＰＬＣ法による評価で凝集レベルが５％未満、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析による評価で９０％超の純度を示し、エンドトキシンレベルが１．５ＥＵ／ｍｇ（ＬＡＬアッセイ）未満であった。

【表5】

【0219】

ＨｅｐＧ２細胞単層を、ｐＨｒｏｄｏ抗体（３μｇ／ｍｌ）＋ＩＶＩｇ（１ｍｇ／ｍｌ）（Ｈｉｚｅｎｔｒａ、薬局から入手）とともに３７℃で３～４時間または２４時間インキュベートした。いくつかの条件では、細胞は次の試薬でも処理された：２μＭのフェチュイン（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｆ．Ｆ３３８５）、２μＭのアシアロフェツイン（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｆ．Ａ４７８１）、５０μＭのクロロキン（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｆ．Ｃ６６２８）、１０ｎＭのバフィロマイシン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｒｅｆ．１９１４８）、５０μＭのサイトカラシンＤ（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｆ．Ｃ２６１８）。次いで、細胞培養物を洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ／Ｍｅｒｃｋ、Ｒｅｆ．ＳＣＲ００５）を用いて細胞を回収し、すぐにフローサイトメーターで取得した。標準的なフローサイトメトリーソフトウェアを使用して、ゲートされた単一細胞及び生細胞（ＤＡＰＩ＋細胞を除く）の集団に対するｐＨｒｏｄｏの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を分析した。ＭＦＩ値はｐＨｒｏｄｏ ＤＯＬに調整された。

【0220】

図４は、Ｈ－Ａ２Ｆ（アダリムマブ；Ｈｕｍｉｒａ、薬局から入手）、Ａ－８４８６－Ａ２、Ａ－８４８６－Ａ２Ｇ２、Ａ－８４８６－Ａ２ＧａｌＮＡｃ２、及びＡ－８４８６－Ｍ３抗体を比較して得られたデータを示す。４時間のインキュベーション後、ＧａｌＮＡｃ２表示抗体のみがＨｅｐＧ２細胞に内部移行したことから、ＧａｌＮＡｃ２は、肝細胞による認識と内部移行に強力なグリカンであることが示された。

【0221】

ＧａｌＮＡｃ２抗体の取り込みがＡＳＧＰＲによって媒介されるかどうかを評価する別の実験は、さまざまな阻害剤を使用して実行された。図５は、この阻害実験で得られたデータを示す。Ａ－８４．８６－Ａ２ＧａｌＮＡｃ２の内部移行は、カルシウムイオンキレート剤であるＥＧＴＡによって阻害されたことから、抗体の取り込みがカルシウム依存性のＣ型レクチン受容体によって媒介される可能性が高いことが示された。さらに、内部移行はアシアロフェチュイン（ＡＳＧＰＲのリガンド）によって選択的に阻害されたが、フェチュイン（ＡＳＧＰＲのリガンドではない）によっては阻害されなかったことから、ＧａｌＮＡｃ２抗体の認識と内部移行がＡＳＧＰＲによって媒介されることが示された（Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７１（３５）：２１１６０－６（１９９６）。Ａ－８４．８６－Ａ２ＧａｌＮＡｃ２によって生成されたｐＨｒｏｄｏシグナルは、エンドソームの酸性化をブロッキングすることによってクラスリン媒介エンドサイトーシスを破壊するクロロキン及びバフィロマイシンによって完全に鈍化された（Ｉｐｐｏｌｉｔｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，５６：８６６－８７５（１９９８）。エンドソームの酸性化は、リソソームタンパク質の分解を達成するための重要なステップである。

【0222】

これらの実験で観察された阻害パターンは、ＡＳＧＰＲによって媒介され、他のエンドサイトーシス経路ではなくクラスリンに依存し、エンドサイトーシスされた物質をリソソーム区画に導くエンドサイトーシス機構と一致している。したがって、これらのデータは、ＡＳＧＰＲ媒介内部移行と分解に化合物を標的化するために、ＣＧＰ産生ＧａｌＮＡｃ２表示タンパク質を使用することを支持するものである。

【0223】

実施例ＩＩＩ
Ａ２グリコシル化Ｆａｂ抗体が血中循環抗原をｉｎ ｖｉｖｏで強力に枯渇させる
ＣＧＰで産生され、かつＧｌｃＮＡｃ末端グリカン（Ａ２構造）を提示する抗体の循環抗原枯渇能力を評価するために、ラットを用いた実験が計画された。ラットに抗原と、Ｆａｂ上にＡ２グリカン構造を示す抗体、または抗原に特異的な対照抗体を注射した。末梢血コンパートメントからの抗原の枯渇の程度を測定するために、処置動物の血清中の循環抗原のレベルを経時的に定量した。表５は、本試験の対象となった抗体の特性を示す。すべての抗体は、サイズ排除ＨＰＬＣ法による評価で凝集レベルが５％未満、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析による評価で９４％超の純度を示し、エンドトキシンレベルが１ＥＵ／ｍｇ（ＬＡＬアッセイ）未満であった。すべての糖鎖改変抗体は、ＨＣＡ２０２と高い結合性を保った。

【表6】

【0224】

実験開始時に１８０～２２０ｇのＷｉｓｔａｒ雌ラット（Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ，Ｓｔ Ｂｅｒｔｈｅｖｉｎ，フランス，ｒｅｆ．ＲｊＨａｎ：ＷＩ）に、抗アダリムマブＦａｂ断片ＨＣＡ２０２（Ｂｉｏｒａｄ、ｒｅｆ．ＨＣＡ２０２）（抗原）を０．５ｍｇ／ｋｇ用量、０．５ｍｌ／ラットで静脈内ボーラス注射した。ＨＣＡ２０２化合物は、注入前にＰｉｅｒｃｅ（商標）Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、ｒｅｆ．８８２７４）を使用したエンドトキシン除去ステップに供された。１５分後、ラットに抗体（表４及び表５）またはＰＢＳを注射した。血液サンプルは、抗体注射後１５～３０分、１時間、６時間及び２４時間の時点で穿刺により頚静脈から採取した。４８時間後に終末血液サンプルを腹部大動脈から採取した。血液サンプルを室温で３０分間凝固させた後、遠心分離して血清を採取した。

【0225】

総ＨＣＡ２０２レベル（結合抗体＋遊離ＨＣＡ２０２）をＥＬＩＳＡ法により測定した。抗Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ、Ｒｅｆ．３４６６０）を、コーティング緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ ７．４、最終組成：８ｍＭ Ｎａ－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、８ｍＭ Ｋ－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ）中で、５μｇ／ｍｌで９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上に４℃で一晩コーティングした。ＨＣＡ２０２は重鎖のＣ末端にヒスチジンタグを持っているため、この抗体は抗体結合及び遊離ＨＣＡ２０２の捕捉を可能にする。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳＴ＝０．０５％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。ブロッキング緩衝液（ＰＢＳＴ中２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を各ウェルに添加し、プレートを室温で１～３時間インキュベートした。１：３希釈で５００ｎｇ／ｍｌから０．７ｎｇ／ｍｌまでの７点検量線を別の希釈プレート上で作成した。そのために、希釈していない正常なラットのウィスター血清に５μｇ／ｍｌのＨＣＡ２０２と３倍モル過剰のアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）をスパイクした。スパイクした血清を室温で１０分間インキュベートして、アダリムマブ／ＨＣＡ２０２免疫複合体を形成した。スパイクされた血清を、希釈剤Ｂ（ＰＢＳＴ中の２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を添加することによって１０倍（ＭＲＤ１０）に希釈した。免疫複合体標準曲線の１：３連続希釈は、希釈剤Ｂを使用して実行された。試験サンプルも同様に処理された。希釈剤Ｂを使用して、試験血清サンプルを希釈プレートで（ＭＲＤ１０サンプルを得るために）１０倍に希釈した。標準検量線の線形範囲内にシグナルが収まるように、必要に応じてＭＲＤ１０サンプルを希釈剤Ａ（２％ＢＳＡ＋０．０５％ＰＢＳＴで希釈した１／１０ウィスターラットのプール血清）でさらに希釈した。ブロッキング後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。検量物質及び希釈した検体をＥＬＩＳＡプレートに二重に添加し、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、１０００ｎｇ／ｍｌのＨｕｍｉｒａ溶液を各サンプルに添加した。ＥＬＩＳＡプレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。検出抗体溶液は、ヤギ抗ヒトカッパＬＣ－ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、ｒｅｆ．Ａ１８８５３）を希釈液Ｂで１：５０００に希釈して調製した。検出抗体溶液をＥＬＩＳＡプレートに添加し、遮光して室温で１時間インキュベートした。次いで、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ＴＭＢ基質を添加して、続いてＨ_２ＳＯ_４でクエンチすることによって明らかにした。ＥＬＩＳＡプレートは、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１などのプレートリーダーで４５０及び６５０ｎＭで読み取った。データ分析は、Ｇｅｎ５（Ｂｉｏｔｅｋ）などの標準ソフトウェアを使用して行った。

【0226】

血清サンプル中の抗体レベルはＥＬＩＳＡ法により定量できる。このアッセイは、サンプル中に存在するアダリムマブ及びアダリムマブ変異体を捕捉するために、ヒトＴＮＦαでコーティングするステップから構成される。検出は、抗ヒトガンマＨＣ特異的ＨＲＰタグ付き検出抗体を介して実行できる。したがって、このアッセイでは遊離抗体（ＨＣＡ２０２に結合していない少なくとも１つのＦａｂアームを有する抗体）のみが定量される。簡単に言えば、組換えヒトＴＮＦ－α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ｒｅｆ．ＡＦ－３００－０１Ａ）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上に、通常１μｇ／ｍｌでｐＨ７．４のＰＢＳ中で４℃で一晩コーティングする。ブロッキング緩衝液、希釈緩衝液Ａ及びＢ、及び洗浄緩衝液は、ＨＣＡ２０２ ＥＬＩＳＡで使用したものと同じである。プレートを３回洗浄し、ＨＣＡ２０２ ＥＬＩＳＡに記載されているようにブロッキング緩衝液でブロックする。通常、１：３希釈で３３３．３ｎｇ／ｍｌから０．５ｎｇ／ｍｌまでの７点検量線は、希釈緩衝液Ｂで１０倍希釈（最小必要な１０倍希釈、ＭＲＤ１０）したプールしたウィスターラット血清に１μｇ／ｍｌのアダリムマブをスパイクすることによって作成される。試験血清サンプルも希釈緩衝液Ｂで希釈する（最低ＭＲＤ１０サンプル）。希釈した検体と標準検量線サンプルをＥＬＩＳＡ プレートに移し、ブロッキングステップ後、室温で１時間インキュベートする。その後、プレートを３回洗浄し、検出抗体の溶液を添加する。検出抗体の溶液は、例えばヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）－ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ．Ａ６０２９）抗体（通常希釈率１：１０，０００）を希釈緩衝液Ｂで希釈して調製することができる。ＥＬＩＳＡプレートは検出抗体とともに遮光され、室温で通常１時間インキュベートする。次いで、プレートを３回洗浄し、ＨＣＡ２０２ ＥＬＩＳＡに記載されているようにＴＭＢ基質を添加することによって明らかにする。
図６は、ＨＣＡ２０２レベルについて得られたデータを示す。抗体を注射しない場合（ＰＢＳ条件）、ＨＣＡ２０２は、Ｆａｂ断片で予想されるように、４８時間かけてゆっくりと減衰する。Ｈ－Ａ２Ｆ（非改変アダリムマブ）の治療により、２４時間及び４８時間の時点でＨＣＡ２０２レベルが増加した。同様に、Ａ－Ｍ３、Ａ－８４－Ａ２、及びＡ－８４８６－Ａ２Ｇ２Ｓ２で治療した場合、ＰＢＳ治療と比較してＨＣＡ２０２レベルが増加した（ＰＢＳではＣゼロから７２％枯渇したのに対し、Ｈ－Ａ２Ｆ、Ａ－Ｍ３及びＡ－８４８６－Ａ２Ｇ２Ｓ２では６時間で５２～６３％枯渇した）。Ｃゼロは、即時均一な全血分布を考慮した場合、注射直後に達成されるはずの血清中の（ＨＣＡの）理論的濃度である。対照的に、Ａ－８４８６－Ａ２を注射すると、早い時点で既にＨＣＡ２０２レベルが劇的的に減少した（１時間で９７％枯渇）。表６は、ＨＣＡ２０２の枯渇数を示す

【表7】

【0227】

これらのデータは、Ｆａｂ断片上にＡ２グリカンを表示する抗体が、非常に短時間で血液循環から循環抗原を除去する高い効力を持つことを強調する。これらのデータはまた、Ｆａｂあたり２つの改変糖鎖部位を持つＡ－８４８６－Ａ２抗体のみが枯渇を示したのに対し、Ｆａｂあたり１つの糖鎖部位を持つＡ－８４－Ａ２抗体が非枯渇性であったことから、分子あたり表示されるグリカンの負荷が枯渇効力を可能にするために重要であることを示している。

【0228】

実施例ＩＶ
Ａ２Ｇ２グリコシル化Ｆａｂ抗体が血中循環抗原をｉｎ ｖｉｖｏで強力に枯渇させる
ＣＧＰで産生され、かつガラクトース末端グリカン（Ａ２Ｇ２構造）を提示する抗体の循環抗原枯渇能力を評価するために、ラットを用いた実験が計画された。ラットに抗原と、Ｆａｂ上にＡ２Ｇ２グリカン構造を示す抗体、または抗原に特異的な対照抗体を注射した。末梢血コンパートメントからの抗原の枯渇の程度を測定するために、処置動物の血清中の循環抗原のレベルを経時的に定量した。表７は、本試験の対象となった抗体の特性を示す。すべての抗体は、サイズ排除ＨＰＬＣ法による評価で凝集レベルが５％未満、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析による評価で９４％超の純度を示し、エンドトキシンレベルが１ＥＵ／ｍｇ（ＬＡＬアッセイ）未満であった。すべての糖鎖改変抗体は、ＨＣＡ２０２と高い結合性を保った。

【表8】

【0229】

実験方法は実施例ＩＩＩに記載されている。

【0230】

図７は、ＨＣＡ２０２レベルについて得られたデータを示す。抗体を注射しない場合（ＰＢＳ条件）、ＨＣＡ２０２は、Ｆａｂ断片で予想されるように、４８時間かけてゆっくりと減衰する。Ｈ－Ａ２Ｆ（非改変アダリムマブ）の治療により、２４時間及び４８時間の時点でＨＣＡ２０２レベルが増加した。同様に、Ａ－Ｍ３、及びＡ－８４８６－Ａ２Ｇ２Ｓ２で治療した場合、ＰＢＳ治療と比較してＨＣＡ２０２レベルが増加した（ＰＢＳではＣゼロから７２％枯渇したのに対し、Ｈ－Ａ２Ｆ、Ａ－Ｍ３及びＡ－８４８６－Ａ２Ｇ２Ｓ２では６時間で５２～６３％枯渇した）。Ｃゼロは、即時均一な全血分布を考慮した場合、注射直後に達成されるはずの血清中の（ＨＣＡの）理論的濃度である。対照的に、Ａ－８４８６－Ａ２Ｇ２を注射すると、６時間後にＨ－Ａ２Ｆ及びＰＢＳと比較してＨＣＡ２０２レベルが有意に減少した（９０％枯渇）。表８は、ＨＣＡ２０２の枯渇数を示す。

【表9】

【0231】

これらのデータは、Ｆａｂ断片上にＡ２Ｇ２グリカンを表示する抗体が、非常に短時間で血液循環から循環抗原を除去する高い効力を持つことを強調する。これらのデータはまた、Ｆａｂあたり２つの改変糖鎖部位を持つＡ－８４８６－Ａ２Ｇ２抗体のみが枯渇を示したのに対し、Ｆａｂあたり１つの糖鎖部位を持つＡ－８４－Ａ２Ｇ２抗体が非枯渇性であったことから、分子あたり表示されるグリカンの負荷が枯渇効力を可能にするために重要であることを示している。

【0232】

実施例Ｖ
Ａ２ＧａｌＮＡｃ２グリコシル化Ｆａｂ抗体が血中循環抗原をｉｎ ｖｉｖｏで強力に枯渇させる
ＣＧＰで産生され、かつＧａｌＮＡｃ末端グリカン（Ａ２ＧａｌＮＡｃ２構造）を提示する抗体の循環抗原枯渇能力を評価するために、ラットを用いた実験が計画された。ラットに抗原と、Ｆａｂ上にＡ２ＧａｌＮＡｃ２グリカン構造を示す抗体、または抗原に特異的な対照抗体を注射した。末梢血コンパートメントからの抗原の枯渇の程度を測定するために、処置動物の血清中の循環抗原のレベルを経時的に定量した。表９は、本試験の対象となった抗体の特性を示す。すべての抗体は、サイズ排除ＨＰＬＣ法による評価で凝集レベルが５％未満、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析による評価で９４％超の純度を示し、エンドトキシンレベルが１ＥＵ／ｍｇ（ＬＡＬアッセイ）未満であった。すべての糖鎖改変抗体は、ＨＣＡ２０２と高い結合性を保った。

【表10】

【0233】

実験方法は実施例ＩＩＩに記載されている。

【0234】

図８は、ＨＣＡ２０２レベルについて得られたデータを示す。抗体を注射しない場合（ＰＢＳ条件）、ＨＣＡ２０２は、Ｆａｂ断片で予想されるように、４８時間かけてゆっくりと減衰する。Ｈ－Ａ２Ｆ（非改変アダリムマブ）の治療により、２４時間及び４８時間の時点でＨＣＡ２０２レベルが増加した。Ａ－Ｍ３、及びＡ－８４８６－Ａ２Ｇ２Ｓ２で治療した場合、ＰＢＳ治療と比較してＨＣＡレベルが増加し（ＰＢＳではＣゼロから７２％枯渇したのに対し、Ｈ－Ａ２Ｆ、Ａ－Ｍ３及びＡ－８４８６－Ａ２Ｇ２Ｓ２では６時間で５２～６３％枯渇した）、これらの抗体には枯渇作用がないことが示された。Ｃゼロは、即時均一な全血分布を考慮した場合、注射直後に達成されるはずの血清中の（ＨＣＡの）理論的濃度である。対照的に、Ａ－８４－Ａ２ＧａｌＮＡｃ２を注射すると、非枯渇抗体及びＰＢＳと比較して、１時間（７４％枯渇）及び６時間（９３％枯渇）でＨＣＡ２０２が有意に枯渇した。Ａ－８４８６－Ａ２ＧａｌＮＡｃ２の治療により、ＨＣＡ２０２はより広範かつ迅速に枯渇した（１時間で９７％の枯渇、６時間で１００％の枯渇）。表１０は、ＨＣＡ２０２の枯渇数を示す。

【表11】

【0235】

これらのデータは、Ｆａｂ断片上にＡ２ＧａｌＮＡｃ２グリカンを表示する抗体が、非常に短時間で血液循環から循環抗原を除去する高い効力を持つことを強調する。これらのデータはまた、Ｆａｂあたり２つの改変糖鎖部位を持つＡ－８４８６－Ａ２ＧａｌＮＡｃ２抗体は、Ｆａｂあたり１つの糖鎖部位を持つＡ－８４－Ａ２ＧａｌＮＡｃ２抗体と比較して高い枯渇効力を示したことから、分子あたりに表示されるグリカンの負荷が抗原除去の効力を調節することを示している。

【0236】

実施例ＶＩ
Ａ２Ｇ２グリコシル化Ｆａｂ抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで肝臓を標的とする。
ガラクトース末端グリカン（Ａ２Ｇ２構造）を表示する抗体のｉｎ ｖｉｖｏ分布を研究するために、Ａ２Ｇ２または対照グリカンを表示する蛍光標識抗体を使用し、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの断層撮影イメージングを用いた、マウスによる試験が設計された。

【0237】

抗体は、メーカーの指示に従って、ＣＦ７５０標識キット（Ｂｉｏｔｉｕｍ、ｒｅｆ．９２２２１）を使用して、１ｍｇ／ｍＬで少なくとも１ｍＬの体積で標識した。標識後、標識度（ＤＯＬ）を測定した。ＤＯＬは２．７～５．２の範囲であったため、抗体は同様に標識されていると考えられた。表１１は、本試験の対象となった抗体の特性を示す。実験開始の５～６週間目のＳＫＨ１免疫応答性ヘアレスマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｒｅｆ．Ｃｒｌ：ＳＫＨ１－ｈｒ）に、ＣＦ７５０標識抗体を５ｍｇ／ｋｇの用量で（静脈内ボーラス）注射した。マウスは、ＦＭＴ２５００（商標）蛍光断層撮影ｉｎ ｖｉｖｏイメージングをシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で使用して撮像し、当該システムは、２Ｄ表面蛍光反射率画像（ＦＲＩ）と３Ｄ蛍光断層撮影（ＦＭＴ）画像データセットの両方を収集した。ＦＭＴ（ＮＩＲ励起レーザー７４５ｎｍ／発光７７０～８００ｎｍ）を用いて、各動物について背臥位で２回のスキャン（胸部領域＋腹部領域）を０．２５時間、１時間、３時間、６時間、２４時間、４８時間の時点で実行した。収集した蛍光データは、動物全身の３次元蛍光シグナルを定量化するために、ＦＭＴ２５００システムソフトウェア（ＴｒｕｅＱｕａｎｔ Ｖ２．０、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって再構成された。胸部、腹部、肝臓領域に関連する生物学的領域を含む３次元の関心領域（ＲＯＩ）が描出された。各ＲＯＩにおける標識抗体の量と用量のパーセンテージを各時点で決定した。６時間後及び４８時間後に、甲状腺（気管を含む）、肺、心臓、肝臓、脾臓、腎臓を摘出し、ＦＭＴイメージングに供した。

【表12】

【0238】

図９は、各抗体の胸部及び肝臓ＲＯＩのＦＭＴ画像データを経時的に示す。表１２は、採取された臓器の６時間後のＦＭＴ画像データを示す。２つの非改変対照抗体（Ｈ－Ａ２Ｆ＝アダリムマブ、Ｐｔｚ－Ａ２Ｆ＝ペルツズマブ）は、よく類似した分布プロファイルを示し、胸部または肝臓領域には全体的によく類似した低レベルのシグナルが分布した。肝臓領域ではシグナルは時間の経過とともに増加しなかった（図９）。６時間の時点で、Ｐｔｚ－Ａ２Ｆ及びＨ－Ａ２Ｆの注射用量の８％未満が肝臓に存在したが（表１２）、これら２つの抗体は、低レベルではあるが、他のほとんどの臓器で検出できた。この分布パターンは、正常なヒトＩｇＧ及び広く分布し、依然として主に血液中に存在する抗体の特徴と一致している。抗体Ａ－８４８６－Ａ２Ｇ２Ｓ２及びＡ－Ｍ３は、Ｈ－Ａ２Ｆ及びＰｔｚ－Ａ２Ｆ対照抗体と同様の分布プロファイルを示し、広い臓器に分布し、肝臓への分布は比較的少なかった。６時間の時点で、Ａ－８４８６－Ａ２Ｇ２Ｓ２及びＡ－Ｍ３の注射用量の約２０％が肝臓に存在した。対照的に、Ａ－８４８６－Ａ２Ｇ２抗体は肝臓領域への迅速かつ非常に優先的な分布を示し（図９）、６時間の時点でピークを示し、その後６時間後に減少した。６時間後に観察された減少は、肝細胞による抗体のペプチドへの分解と、分解生成物（蛍光団結合ペプチドを含む）の肝細胞外への排出によるものと考えられる。６時間の時点で、Ａ－８４８６－Ａ２Ｇ２の注射用量の７５％が肝臓に存在した（表１２）。Ａ－８４８６－Ａ２Ｇ２抗体は甲状腺、肺、心臓、脾臓には存在しなかったが、腎臓では低レベルで検出された。この分布パターンは、本質的に肝臓のみに分布するため、血液から枯渇する抗体の特徴である。これらのデータは、Ｆａｂ断片にＡ２Ｇ２構造を表示する抗体がほぼ独占的に肝臓に向けられている一方で、ガラクトース残基をシアル酸でキャップする（Ａ－８４８６－Ａ２Ｇ２Ｓ２）とこの効果がなくなることを示している。これらのデータは、Ａ－８４８６－Ａ２Ｇ２抗体が数時間で循環抗原を有意に枯渇させるという観察結果（実施例ＩＶ）と一致している。これらのデータは、Ａ２Ｇ２グリカンが肝細胞上のＡＳＧＰＲによって認識され、肝細胞の内部移行とリソソーム分解経路へのルーティングを媒介するという仮定を支持している。

【表13】

【0239】

実施例ＶＩＩ
Ａ２ＧａｌＮＡｃ２グリコシル化Ｆａｂ抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで肝臓を標的とする。
ＧａｌＮＡｃ末端グリカン（Ａ２ＧａｌＮＡｃ２構造）を表示する抗体のｉｎ ｖｉｖｏ分布を研究するために、Ａ２ＧａｌＮＡｃ２または対照グリカンを表示する蛍光標識抗体を使用し、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの断層撮影イメージングを用いた、マウスによる試験が設計された。プロトコル及び研究概要は実施例ＶＩに記載されている。表１３は、本試験の対象となった抗体の特性を示す。

【表14】

【0240】

図１０は、各抗体の胸部及び肝臓ＲＯＩのＦＭＴ画像データを経時的に示す。表１４は、採取された臓器の６時間後のＦＭＴ画像データを示す。２つの非改変対照抗体（Ｈ－Ａ２Ｆ＝アダリムマブ、Ｐｔｚ－Ａ２Ｆ＝ペルツズマブ）は、よく類似した分布プロファイルを示し、胸部または肝臓領域には全体的によく類似した低レベルのシグナルが分布した。肝臓領域ではシグナルは時間の経過とともに増加しなかった（図１０）。６時間の時点で、Ｐｔｚ－Ａ２Ｆ及びＨ－Ａ２Ｆの注射用量の８％未満が肝臓に存在したが（表１４）、これら２つの抗体は、他のほとんどの臓器で検出できた。この分布パターンは、正常なヒトＩｇＧ及び広く分布し、依然として主に血液中に存在する抗体の特徴と一致している。抗体Ａ－８４８６－Ａ２Ｇ２Ｓ２及びＡ－Ｍ３は、Ｈ－Ａ２Ｆ及びＰｔｚ－Ａ２Ｆ対照抗体と同様の分布プロファイルを示し、広い臓器に分布し、肝臓への分布は比較的少なかった。６時間の時点で、Ａ－８４８６－Ａ２Ｇ２Ｓ２及びＡ－Ｍ３の注射用量の２０％が肝臓に存在した（表１４）。対照的に、Ａ－８４８６－Ａ２ＧａｌＮＡｃ２抗体は、肝臓領域への迅速かつ本質的に排他的な分布を示し、その後６時間後に減少した（図１０）。６時間後に観察された減少は、リソソーム機構による抗体のペプチドへの分解と、肝細胞からの分解生成物（蛍光団結合ペプチドを含む）の排出によるものと考えられる。６時間の時点で、Ａ－８４８６－Ａ２ＧａｌＮＡｃ２の注射用量の８５％が肝臓に存在した（表１４）。Ａ－８４８６－Ａ２ＧａｌＮＡｃ２抗体は甲状腺、肺、心臓、脾臓には存在しなかったが、腎臓では低レベルで検出された。この分布パターンは、本質的に肝臓のみに分布するため、血液や他の臓器には存在しない抗体の特徴である。

【0241】

これらのデータは、Ｆａｂ断片にＡ２ＧａｌＮＡｃ２構造を表示する抗体がほぼ独占的に肝臓に向けられていることを示す。これらのデータは、ＧａｌＮＡｃ２ Ｆａｂ抗体がＨｅｐＧ２肝細胞によってＡＳＧＰＲを介して特異的に内部移行されるという観察結果（実施例ＩＩ）、及びＧａｌＮＡｃ２ Ｆａｂ抗体が末梢血からの循環抗原の強力かつ迅速な枯渇を媒介するという観察結果（実施例ＶＩＩ）と一致している。まとめると、これらのデータは、抗体のＦａｂ断片上に表示されるＡ２ＧａｌＮＡｃ２グリカンが肝細胞上のＡＳＧＰＲによって効率的に認識され、肝細胞の内部移行とリソソーム分解経路へのルーティングを媒介することを示している。

【表15】

【0242】

実施例ＶＩＩＩ
Ａ２グリコシル化Ｆａｂ抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで肝臓を標的とする。
ＧｌｃＮＡｃ末端グリカン（Ａ２構造）を表示する抗体のｉｎ ｖｉｖｏ分布を研究するために、Ａ２または対照グリカンを表示する蛍光標識抗体を使用し、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの断層撮影イメージングを用いた、マウスによる試験が設計された。プロトコル及び研究概要は実施例ＶＩに記載されている。表１５は、本試験の対象となった抗体の特性を示す。

【表16】

【0243】

図１１は、各抗体の胸部及び肝臓ＲＯＩのＦＭＴ画像データを経時的に示す。表１６は、採取された臓器の６時間後のＦＭＴ画像データを示す。２つの非改変対照抗体（Ｈ－Ａ２Ｆ＝アダリムマブ、Ｐｔｚ－Ａ２Ｆ＝ペルツズマブ）は、よく類似した分布プロファイルを示し、胸部または肝臓領域には全体的によく類似した低レベルのシグナルが分布した。肝臓領域ではシグナルは時間の経過とともに増加しなかった（図１１）。６時間の時点で、Ｐｔｚ－Ａ２Ｆ及びＨ－Ａ２Ｆの注射用量の８％未満が肝臓に存在したが（表１６）、これら２つの抗体は、他のほとんどの臓器で検出できた。この分布パターンは、正常なヒトＩｇＧ及び広く分布し、依然として主に血液中に存在する抗体の特徴と一致している。抗体Ａ－８４８６－Ａ２Ｇ２Ｓ２及びＡ－Ｍ３は、Ｈ－Ａ２Ｆ及びＰｔｚ－Ａ２Ｆ対照抗体と同様の分布プロファイルを示し、広い臓器に分布し、肝臓への分布は比較的少なかった。Ａ－８４８６－Ａ２抗体は、肝臓領域への迅速かつ優先的な分布を示し（１時間でピーク）、その後６時間で急速に減少し、６時間と４８時間の間でゆっくりと減少した（図１１）。６時間の時点で、Ａ－８４８６－Ａ２の注射用量の２０％が肝臓に存在した（表１６）。Ａ－８４８６－Ａ２抗体は甲状腺、肺、心臓、腎臓には存在しなかったが、脾臓では低レベルで検出された。この分布パターンは、血液中に存在しない抗体の特徴である。これは、Ａ－８４８６－Ａ２が迅速かつ強力に循環抗原を枯渇させたというデータ（実施例ＩＩＩ）と一致する。これらのデータは、Ｆａｂ断片にＡ２構造を示す抗体が特異的なグリカン受容体によって認識され、それが内部移行とリソソーム分解経路へのルーティングを引き起こすという仮定を支持している。

【表17】

【0244】

実施例ＩＸ
Ａ２ＧａｌＮＡｃ２グリコシル化抗体は、ＡＳＧＰＲ発現細胞の表面で標的受容体の分解を引き起こす。
標的受容体に特異的で、ＧａｌＮＡｃ２末端グリカン（Ａ２ＧａｌＮＡＣ２構造）を表示する抗体が、ＡＳＧＰＲを発現する細胞表面の標的表面受容体の分解を引き起こすかどうかを評価するために、ペルツズマブ（Ｐｔｚ）抗ＨＥＲ２抗体のＣＧＰ産生糖鎖変異体を用いた実験が行われた。ＨｅｐＧ２細胞はＨＥＲ２とＡＳＧＰＲを共発現する。検証された仮説は、Ｐｔｚ ＣＧＰ産生変異体を表示するＡ２ＧａｌＮＡｃ２がＨｅｐＧ２細胞の表面でＨＥＲ２とＡＳＧＰＲに共結合し、形成された複合体の内部移行と分解を引き起こし、ＨｅｐＧ２細胞上のＨＥＲ２レベルの低下につながる可能性があるというものである。ペルツズマブ抗体（Ｐｔｚ－Ａ２、Ｐｔｚ－８６－Ａ２ＧａｌＮＡｃ２、Ｐｔｚ－ｇｔ１－Ａ２ＧａｌＮＡｃ２、Ｐｔｚ－ｈｇｔ－Ａ２ＧａｌＮＡｃ２）を細胞培養上清からＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨｉＴｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ，（Ｃｙｔｉｖａ）で精製し、Ａｍｉｃｏｎコンセントレーター（４ｍｌ、３００００ ＭＷＣＯ）を使用してＰＢＳ緩衝液ｐＨ７で製剤化した。精製された抗体ではＡ２ＧａｌＮＡｃ２のレベルが低い（＜７０％）ため、Ｐｔｚ上のＡ２ＧａｌＮＡｃ２グリカンの量を増加させるために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ糖鎖工学によって材料をさらに磨き上げた。１０ｍＭのＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、２％（ｗ／ｗ）のＧａｌＴ１（Ｙ２８５Ｌ）、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ ８中１００ｍＭ ＭｎＣｌ２を用いた反応で、３０℃で穏やかに回転させながらｉｎ ｖｉｔｒｏグリコシル化（ＩＶＧＥ）を用いてＧａｌＮＡｃ付加を行った。ＦＰＬＣ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＮＧＣ、ドイツ）を使用し、メーカーの推奨に従って、プロテインＡセファロース（ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡカラムＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて反応混合物からグリコシル化ｍＡｂを精製した。その後、ＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ２５、Ｓｉｇｍａ、スイス）を使用した脱塩手順を実行し、緩衝液をＰＢＳ ｐＨ７に交換した。次に、サンプルをＰｉｅｒｃｅ Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ， ０．２５ｍＬ（カタログ：８８２７３ Ｔｈｅｒｍｏ）で処理し、滅菌濾過し、ＰＢＳ ｐＨ７で０．０５ｍｇ／ｍｌに希釈した。この実験で使用した、生じた抗体及びそのグリカン構造を表１７に記載する。Ｐｔｚ－ｇｔ１抗体は、重鎖のＣ末端部分にグリコタグが挿入されている（グリコタグ配列のＣ末端リジンがアラニンに置換されたＡＮＳＴＭＭＳ付加）。Ｐｔｚ－ｈｇｔ抗体は、上部ヒンジ領域に糖鎖部位が挿入されている（Ｔ２２３位置の後のＬＮＬＳＳ挿入）。

【表18】

【0245】

肝癌細胞（ＡＴＣＣ ＃ＨＢ－８０６５）は、１０％ＦＢＳ及び２ｍＭグルタミンを添加した低グルコースＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ，Ｒｅｆ．Ｄ５５４６）で維持した。ＨｅｐＧ２細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ／Ｍｅｒｃｋ、ＳＣＲ００５）を使用して収集し、平底２４ウェルプレートに１ウェルあたり１０万細胞でプレーティングした。細胞を細胞培養インキュベーター内で３７℃で７２時間静置し、回復させた。次に細胞を、非改変ペルツズマブ（Ｐｔｚ－Ａ２Ｆ；Ｐｅｒｊｅｔａ、薬局から入手）またはＣＧＰ産生ペルツズマブ糖鎖変異抗体１μｇ／ｍｌ ＋ ＩＶＩｇ（Ｈｉｚｅｎｔｒａ、薬局から入手）１ｍｇ／ｍｌとともに、細胞培養培地中、３７℃の細胞培養インキュベーターで２４時間インキュベートした。次いで、細胞を回収し、標準的なフローサイトメトリー染色プロトコルに従って、抗ＨＥＲ２抗体（ヒトＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２抗体、Ｒ＆Ｄ、Ｒｅｆ．ＭＡＢ１１２９）を１μｇ／ｍｌで使用し、抗マウスＩｇＧ蛍光色素二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）交差吸着二次抗体（ＰＥ）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｐ－８５２）を２μｇ／ｍｌで使用して染色した。抗体ＭＡＢ１１２９は、ＨＥＲ２への結合に関してペルツズマブと競合しないことが示されており、ペルツズマブが結合している場合でもＭＡＢ１１２９がＨＥＲ２に結合できることが保証される。細胞は直ちにフローサイトメーターで取得され、ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｉＳｔａｒ）ソフトウェアを使用して分析された。ＨＥＲ２の幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）を条件毎に抽出した。ＨＥＲ２ ＭＦＩはｐＨｒｏｄｏ ＤＯＬに調整した（調整したＭＦＩ）。調整したＭＦＩ値は、Ｐｔｚ－Ａ２Ｆ（正規化されたＭＦＩ）の％として表した。

【0246】

表１８は、調整及び正規化されたＨＥＲ２ ＭＦＩを示す。改変糖鎖部位を持たず、Ｎ２９７ Ｆｃ部位にＡ２構造を示す対照抗体Ｐｔｚ－Ａ２による治療は、Ｐｔｚ－Ａ２Ｆと比較してＨＥＲ２レベルを低下させなかった（治療後の正規化ＨＥＲ２ ＭＦＩの１０７％）。対照的に、Ｐｔｚ－ｇｔ１－Ａ２ＧａｌＮＡｃ２による治療は正規化ＨＥＲ２ ＭＦＩを６４％に減少させ、Ｐｔｚ－ｈｇｔ－Ａ２ＧａｌＮＡｃ２による治療は正規化ＨＥＲ２ ＭＦＩを７２％に減少させた。Ｐｔｚ－ｇｔ１－Ａ２ＧａｌＮＡｃ２及びＰｔｚ－ｈｇｔ－Ａ２ＧａｌＮＡｃ２によるＨＥＲ２の減少は、Ｐｔｚ－Ａ２Ｆ群と比較して統計的に有意であった（調整したＭＦＩデータに対する、比の対応のあるｔ検定）（表１８）。興味深いことに、Ｐｔｚ－８６－Ａ２ＧａｌＮＡｃ２による治療は、Ｐｔｚ－Ａ２Ｆと比較してＨＥＲ２分解を引き起こさなかった（９５％正規化 ＨＥＲ２ ＭＦＩ）。すべての抗体は同様のＨＥＲ２結合能力を示し（表１７）、ＨＥＲ２分解能力の違いがＨＥＲ２結合能力の低下に関連していることは除外された。さらに、Ｆａｂ断片中の同等の改変糖鎖部位８６を含むＡ２ＧａｌＮＡｃ２抗体は、ＨｅｐＧ２細胞による効率的な取り込み（実施例ＩＩ）、動物に注射した場合の効率的なＡＳＧＰＲ結合を示す循環抗原の高い枯渇効力（実施例Ｖ）を示し、部位８６にはアクセス可能な活性グリカンが表示されることを示す。これは、抗体がＨＥＲ２に結合するときにＡＳＧＰＲと効率的に結合するために、抗体上に表示されるグリカンの位置が重要であることを示している。以上のことから、Ａ２ＧａｌＮＡｃ２表示抗体は、ＡＳＧＰＲエンドサイトーシス及びリソソーム分解経路を利用して細胞表面から標的分子を除去することに使用できることが本試験で示される。

【表19】

参考文献
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【国際調査報告】