特表 2024-513919 核酸のエピジェネティックな修飾を検出するためのシステム、方法、及び組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-27

(54)【発明の名称】核酸のエピジェネティックな修飾を検出するためのシステム、方法、及び組成物

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6816 20180101AFI20240319BHJP

   C12Q 1/6834 20180101ALI20240319BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240319BHJP

   C12Q 1/6809 20180101ALI20240319BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6816 C

C12Q1/6834 Z

C12N15/09 Z

C12Q1/6809 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023561697

(86)(22)【出願日】2022-06-02

(85)【翻訳文提出日】2023-11-21

(86)【国際出願番号】 US2022032012

(87)【国際公開番号】W WO2022232709

(87)【国際公開日】2022-11-03

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＢＬＵＥＴＯＯＴＨ

２．ＡＮＤＲＯＩＤ

３．Ｌｉｎｕｘ

４．ＵＮＩＸ

５．ＯＳ Ｘ

６．ＷＩＮＤＯＷＳ

７．ＶＸＷＯＲＫＳ

８．ＴＷＥＥＮ

９．ＷＣＤＭＡ

(71)【出願人】

【識別番号】520187300

【氏名又は名称】エックスゲノムズ コーポレーション

(71)【出願人】

【識別番号】523379166

【氏名又は名称】ミア，カリム

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ミア，カリム

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA13

4B063QA18

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR42

4B063QR56

4B063QS34

4B063QS39

4B063QX02

(57)【要約】

核酸のエピジェネティックな修飾を検出するためのシステム、方法、及び組成物が提供される。本発明は、核酸が修飾されている場合の、核酸が修飾されていない場合と比較したシグナルの違いを検出するためのプローブを使用することによる核酸分子の修飾状態を決定するための方法、組成物、及びシステムを含む。修飾は、核酸塩基上のメチル化などの共有結合的修飾を含み得る。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸分子の識別性及び修飾状態を決定するための方法であって、前記方法は、
ａ．前記核酸を表面に固定して、前記表面に付着した核酸を得ることと、
ｂ．既知の配列の１つ以上のオリゴを前記核酸に曝露し、前記オリゴの１つ以上の前記核酸への結合を検出して前記核酸の前記識別性を決定することであって、前記オリゴの１つ以上または組み合わせが前記核酸の識別性を決定することができる、前記決定することと、
ｃ．既知の配列の１つ以上のオリゴを前記核酸分子に曝露し、前記核酸への前記オリゴの結合を検出し、前記オリゴの結合特性を測定することであって、前記オリゴの１つ以上が、前記配列が修飾されている場合に、前記配列が修飾されていない場合と比較して配列に異なるように結合することができる、前記測定することと、
ｄ．前記測定された特性のシグネチャを評価することによって、決定された識別性の前記分子に修飾ステータスを割り当てることと、
を含む、前記方法。

【請求項2】

前記オリゴヌクレオチドが、標識されたオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記標識が、１つ以上の発蛍光団、ナノ粒子、タンパク質、またはナノ構造を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記１つ以上のオリゴが、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、または３以下のヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記オリゴが、ＬＮＡ残基、３’－Ｕａｑ、またはピレンを含む１つ以上の修飾を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

１つ以上のオリゴの前記結合することが一時的であり、それぞれの標的分子上のそれぞれの部位が複数回、一時的に結合することができる、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記オリゴヌクレオチドの前記核酸への前記結合の差異が、オンタイム及びオフタイム、及び／またはシグナルの蛍光強度の関数として測定される、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

結合することのモニタリングがプロセス中にリアルタイムで行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

修飾核酸配列と非修飾核酸配列との結合の差が二値であり、塩基が修飾されている場合には検出可能な結合の閾値を超える結合が起こり、塩基が修飾されていない場合には検出可能な結合が生じない、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

複数のオリゴが単一サイクルで添加される、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記複数のオリゴが複数のサイクルにわたって添加される、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

同じオリゴが識別性を決定し、修飾状態を決定することができる、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

ステップ１ｃにおけるオリゴヌクレオチドの種類／混合物が、修飾の配列状況に基づいて選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記核酸がＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

複数の核酸が前記基材上の光学的に分離可能な反応部位に固定化され、前記反応部位の１つの単一の核酸が、他の任意の部位に固定化された任意の他の核酸分子から光学的に分離可能である、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記核酸がＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

核酸の前記識別性がそのゲノム起源を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

識別性の前記決定することが、得られた結合パターンをゲノムのセグメントのインシリコ結合パターンと照合することを含むデータベースと比較することによって行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

前記方法が核酸分子のアレイを利用して実施される、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

前記アレイ内の前記核酸が光の回折限界を超えて分解可能である、請求項１に記載の方法。

【請求項21】

前記核酸が超解像イメージングによって分解される、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記修飾が、５－メチルシトシン（５ｍＣ）、５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）、５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）、及びＮ６－メタデニン（ｍｅｔｈａｄｅｎｉｎｅ）（６ｍＡ）を含む化学修飾、または生物体に見られる核酸に一般的なその他の修飾である、請求項１に記載の方法。

【請求項23】

前記修飾がＤＮＡ損傷によるものである、請求項１に記載の方法。

【請求項24】

前記修飾が、タンパク質、核酸、小分子、金属を含むリガンドの結合である、請求項１に記載の方法。

【請求項25】

スパイクイン対照が参照として使用される、請求項１に記載の方法。

【請求項26】

前記反復する結合はその特性が異なるが、前記特性が前記核酸に修飾状態または非修飾状態を割り当てるかを決定するために平均が取られる、請求項１に記載の方法。

【請求項27】

前記オリゴヌクレオチドの結合前に、前記修飾を改変するための処理が前記核酸に施される、請求項１に記載の方法。

【請求項28】

前記修飾状態が、前記分子全体または前記分子の一部分に関するものである、請求項１に記載の方法。

【請求項29】

前記標的が細長く、その長さに沿った修飾の位置が特定される、請求項１に記載の方法。

【請求項30】

前記分子が高密度に配列され、個々の分子を分解するために超解像が使用される、請求項１に記載の方法。

【請求項31】

前記分子上の修飾の数が数えられるか、または推定される、請求項１に記載の方法。

【請求項32】

異なる種類の修飾を区別することのできるオリゴを使用する、請求項１に記載の方法。

【請求項33】

異なるタイプの修飾が異なる条件下で試験される、請求項１に記載の方法。

【請求項34】

核酸修飾を検出するように設計された短い蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブの混合物を含む組成物。

【請求項35】

核酸分子の修飾状態を決定するための方法であって、
ａ．１つ以上のオリゴを前記核酸分子に結合させて、その識別性を決定することと、
ｂ．修飾されている場合と修飾されていない場合とを比較して配列に対して異なる結合を示す１つ以上のオリゴを前記核酸分子に結合させることと、
を含む、前記方法。

【請求項36】

核酸の修飾状態を決定するための方法であって、
ａ．前記核酸を表面に固定して、前記表面上の固定された位置の核酸を得ることと、
ｂ．既知の配列の１つ以上のオリゴを前記核酸分子に曝露することであって、前記オリゴの１つ以上が、配列が修飾されている場合、配列が修飾されていない場合と比較して異なる結合プロファイルを有することができる、前記曝露することと、
ｃ．前記オリゴの前記核酸への結合を検出し、前記結合プロファイルが前記配列が修飾された場合の前記結合プロファイルまたは前記配列が修飾されていない場合の前記結合プロファイルによりよく一致するかどうかを決定することと、
ｄ．前記核酸分子または前記核酸分子上の１つ以上の位置に修飾状態を割り当てることと、
を含む、方法。

【請求項37】

核酸分子の識別性及び修飾状態を決定するための方法であって、
ａ．前記核酸を表面に固定して、前記表面に付着した核酸を得ることと、
ｂ．既知の配列の１つ以上のオリゴを前記核酸に曝露し、前記オリゴの１つ以上の前記核酸への結合を検出して前記核酸の前記識別性を決定することであって、前記オリゴの１つ以上または組み合わせが前記核酸の識別性を決定することができる、前記決定することと、
ｃ．前記表面上の核酸を、前記標的核酸上の修飾されたヌクレオチドに結合するタンパク質に曝露することと、
ｄ．既知の配列の１つ以上のオリゴを前記核酸に曝露することであって、前記オリゴの１つ以上は、特定の配列の識別性を決定し、前記オリゴの１つ以上の前記核酸への結合を検出することができる、前記曝露することと、
ｅ．ステップｂ及びステップｄからの前記結合パターンを比較して、どの部位がステップｃの前記タンパク質によってブロックされたかを決定することと、
を含む、前記方法。

【請求項38】

前記結合タンパク質が抗体またはメチル結合タンパク質である、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

ステップｄの前記オリゴヌクレオチドがステップｂのオリゴヌクレオチドのサブセットである、請求項３７に記載の方法。

【請求項40】

修飾を特定するための方法であって、前記方法が、
ａ．前記修飾を含む核酸を提供することと、
ｂ．前記核酸上の１つ以上の位置に結合できる１つ以上のオリゴヌクレオチド（複数可）を提供することと、
ｃ．前記核酸を前記オリゴヌクレオチド（複数可）と接触させることと、
ｄ．前記オリゴヌクレオチド（複数可）の前記核酸への結合をモニタリングすることと、
ｅ．結合パターンの変化を検出することであって、前記変化が前記修飾を示し、それによって前記修飾を特定する、前記検出することと、
を含む、前記方法。

【請求項41】

核酸分子の識別性及び修飾状態を決定するための方法であって、
ａ．前記核酸分子を表面に固定して、前記表面に付着した核酸分子を得ることと、
ｂ．既知の配列の１つ以上のオリゴを前記核酸に曝露することであって、前記オリゴの１つ以上または組み合わせが、個々の核酸分子のそれぞれの識別性を決定することができ、前記オリゴの１つ以上が、前記核酸分子の配列が修飾されていない場合と比較して、前記配列が修飾されている場合に異なる結合プロファイルを有する、前記曝露することと、
ｃ．前記オリゴの１つ以上の個別の核酸のそれぞれへの結合を検出し、前記核酸の識別性を決定することと、前記結合プロファイルが前記配列が修飾された場合の前記結合プロファイルまたは前記配列が修飾されていない場合の前記結合プロファイルによりよく一致するかどうかを決定することと、
ｄ．前記識別された分子の修飾状態を記録することと、
を含む、前記方法。

【請求項42】

前記核酸分子が、無細胞核酸分子である、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

核酸分子の少なくとも一部の配列及びエピ配列を決定する方法であって、
前記核酸分子が一本鎖分子である場合には、前記核酸分子を試験基材上に固定するか、または前記核酸分子が二本鎖分子である場合には、前記核酸分子を変性して一本鎖分子とし、前記一本鎖核酸分子を前記試験基材上に固定するか、または前記核酸分子が二本鎖分子である場合には、前記試験基材上に前記核酸分子を固定し、前記試験基材上の前記核酸分子を一本鎖分子に変性させ、それによって前記試験基材上に固定された一本鎖核酸を形成することと、
前記固定された一本鎖核酸を、オリゴヌクレオチドプローブ種のセット中のそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブ種に曝露することであって、前記オリゴヌクレオチドプローブ種のセットのそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブ種が、前記固定された一本鎖核酸上の１つ以上の位置に位置するその相補的部分にハイブリダイズすることができ、（ｉ）固有のそれぞれの所定の配列、（ｉｉ）所定の長さ、ならびに（ｉｉｉ）色素、蛍光ナノ粒子、プラズモン共鳴粒子、光散乱粒子、ナノ粒子、及び蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）パートナー（蛍光シグナルを産生することができる）からなる群から選択されるそれぞれの標識を［含む］有する、前記曝露することであって、前記曝露するステップが、
ｉ）前記オリゴヌクレオチドプローブ種のセットの前記それぞれのオリゴヌクレオチドプローブ種のオリゴヌクレオチドプローブが、前記試験基材上の固定された［鎖］一本鎖核酸上の前記１つ以上の位置に反復的に一時的かつ可逆的に結合し、それによって、前記試験基材上の前記固定された一本鎖核酸上の前記１つ以上の位置の各々にそれぞれの一時的なヘテロ二本鎖を形成する；及び
ｉｉ）前記それぞれの標識からの光学活性のそれぞれの発生が、前記オリゴヌクレオチドプローブ種のセットの前記それぞれのオリゴヌクレオチドプローブ種の前記オリゴヌクレオチドプローブを前記試験基材上の前記固定された一本鎖核酸上の前記１つ以上の位置に反復的に一時的かつ可逆的に結合させることによって生成され、検出され、それらが、前記試験基材上の前記固定された一本鎖核酸上の前記１つ以上の位置のそれぞれで検出される
条件下で行われる、前記曝露することと、
前記固定された一本鎖核酸の１つ以上の部分が、前記それぞれの標識から生成される光学活性のそれぞれの発生を検出することができる二次元イメージャを使用して、前記曝露ステップ中に生じる前記試験基材上の前記固定された［鎖］一本鎖上の前記１つ以上の位置のそれぞれにおける光学活性のそれぞれの発生を測定することによって、前記オリゴヌクレオチドプローブ種のセットの前記それぞれのオリゴヌクレオチドプローブ種に相補的であるかどうかを決定し、それによって、前記オリゴヌクレオチドプローブ種のセットの前記それぞれのオリゴヌクレオチドプローブ種に相補的な前記固定された一本鎖核酸上の１つ以上の位置の第１のセットを取得することと；
前記試験基材を洗浄して、前記オリゴヌクレオチドプローブ種のセットの前記それぞれのオリゴヌクレオチドプローブ種を前記試験基材から除去することと；
前記試験基材上の前記固定された一本鎖核酸を前記オリゴヌクレオチドプローブ種のセットの別のそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブ種に暴露することによって曝露ステップ、測定ステップ、及び洗浄ステップを繰り返して、それによって、前記オリゴヌクレオチドプローブ種のセット中の別のそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブ種に相補的である、前記固定された一本鎖核酸上の１つ以上の位置の第２のセットを得ることと；
前記オリゴヌクレオチドプローブ種のセットの前記それぞれのオリゴヌクレオチドプローブ種に相補的である前記固定された一本鎖核酸上の１つ以上の位置の前記第１のセットと、前記オリゴヌクレオチドプローブ種のセットの別のそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブ種に相補的である前記固定された一本鎖核酸上の１つ以上の位置の前記第２のセットとに少なくとも部分的に基づいて、前記核酸の少なくとも前記一部の配列を決定することと；
前記オリゴヌクレオチドプローブ種のセットの前記それぞれのオリゴヌクレオチドプローブ種の前記オリゴヌクレオチドプローブの、前記固定された一本鎖核酸上の１つ以上の位置に位置するそれらの相補的な部分に対する、前記１つ以上の位置がエピジェネティックな修飾を有する場合の、前記１つ以上の位置がエピジェネティックな修飾を有しない場合と比較して、観察された示差的結合挙動に基づいて、前記核酸分子の前記一部が、エピジェネティックな修飾を有するかを判定することと、
を含む、前記方法。

【請求項44】

修飾を有する可能性のある核酸配列に結合することのできるそれぞれのオリゴヌクレオチドの前記結合プロファイルが、修飾を有する可能性のある核酸配列の合成修飾バージョン及び非修飾バージョンに対して試験することによって事前に特徴づけられ、したがって、前記試料分子について得られた前記結合プロファイルを比較するための参照として機能する、請求項４３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月６日に出願された、「Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」と題する米国仮特許出願第６３，１７１，５６６号の優先権を主張し、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、核酸のエピジェネティックな修飾を検出するためのシステム、方法、及び化合物を対象とする。

【背景技術】

【0003】

機能的な生物学的システムを生成するための情報は、核酸の長さに沿った塩基の配列に書き込まれている。ＤＮＡの構造に関するワトソン－クリックの二重らせんの見方では、生物に見られる核酸ポリマーに対するエピジェネティックな修飾が考慮されていない。５－メチルシトシン（５ｍＣ）、５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）、５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）、及びＮ６メタデニン（ｍｅｔｈａｄｅｎｉｎｅ）（６ｍＡ）などの多くの修飾には、生物学的な役割がある。これらの修飾のうち、５－メチルシトシン（５ｍＣ）はヒトゲノムに豊富に存在し、しばしば５番目の塩基と呼ばれる。標準塩基とは対照的に、それは細胞複製機構によって複製されないため、通常の方法では遺伝しない。

【0004】

哺乳動物では、メチル化は５’－ＣｐＧ－３’に関連して最も広く見られる。二重らせんでは、相補的なＣｐＧダイアド配列の両方のＣが通常メチル化されているが、一方のみがメチル化されているヘミメチル化状態も見られ、メチル化と脱メチル化の間の遷移状態であると考えられている。ＣｐＧ部位（ＣｐＧアイランド）は遺伝子のコード領域の上流に多く見られ、遺伝子活性と組織特異的な転写の制御に関与している。

【0005】

ヒトゲノムの配列決定とは対照的に、ヒトメチロームのマッピングはより複雑な作業である。特定の試料からゲノム全体のメチル化パターンを包括的かつ高解像度で決定することは、試料調製の要求と、配列決定前に核酸を増幅または修飾する必要があるため、困難であった。

【0006】

ゲノムのメチル化部分を単離または検出するためのさまざまな方法が存在する。最も広く使用されている方法には、非メチル化シトシンをウラシルに変換するが、５－メチルシトシンは変換しない重亜硫酸塩によるＤＮＡの処理が含まれる。その後、ＤＮＡが増幅され（すべてのウラシルをチミンに変換する）、続いて、マイクロアレイベースの技術及び第２世代（例えば、イルミナ）配列決定を含むさまざまな方法で分析される。重亜硫酸塩ベースの技術はメチル化ＤＮＡの分析を大きく進歩させたが、いくつかの欠点もある。第一に、重亜硫酸塩配列決定には、試料調製にかなりの時間がかかる。第二に、非メチル化シトシンからウラシルへの完全な変換に必要な厳しい反応条件はＤＮＡの分解を引き起こすため、開始時の大量の試料が必要となり、用途によっては問題となる可能性がある。さらに、重亜硫酸塩配列決定はメチル化状態の読み取りにマイクロアレイまたは第２世代ＤＮＡ配列決定技術に依存しているため、これらの方法論と同じ制限に悩まされる。

【0007】

機能的修飾に加えて、さまざまな因子によるＤＮＡの損傷による修飾は、遺伝子変異を引き起こす。ＲＮＡの場合、ｔＲＮＡには無数の修飾があることが長い間知られていたが、現在では一般にＲＮＡにもそれに関連する修飾があることがますます認識されてきている。さらに、核酸は、金属からＤＮＡ結合タンパク質に至るまで、リガンドの結合によって非共有結合的にエピジェネティックに修飾される可能性がある。

【0008】

上記の背景を考慮すると、当技術分野で必要とされているのは、核酸のエピジェネティックな修飾を検出するための改良されたシステム、方法、及び化合物である。

【発明の概要】

【0009】

本開示は、核酸のエピジェネティックな修飾を検出するためのシステム、方法、及び化合物を提供することによって、上記に開示された欠点に対処する。

【0010】

したがって、本開示の一態様は、核酸分子上のエピジェネティックな修飾の存在を直接決定するための方法、すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ上のメチル化、ヒドロキシメチル化及び他の修飾の検出を提供することを目的とする。

【0011】

本発明の特定の態様では、核酸分子における修飾を検出するための方法が提供される。一般に、修飾の可能性がある核酸配列を含む試料と、その核酸配列に結合できる少なくとも１つのプローブが提供される。いくつかの実施形態では、核酸はプローブによって繰り返し結合され、結合の動態がモニタリングされる。

【0012】

いくつかの実施形態では、核酸分子における修飾の検出は、単一分子上の修飾を直接検出することによって行われる。いくつかの実施形態では、検出は、単一分子上で検出される修飾の別個のシグネチャを介して行われる。いくつかの実施形態では、シグネチャは、標的分子上のそれぞれの相補的配列を標的とする１つ以上のオリゴヌクレオチド（オリゴ）の結合プロファイルである。いくつかの実施形態では、結合プロファイルは、標的配列へのハイブリダイゼーションの程度（例えば、量、速度、寿命）を含む。いくつかの実施形態では、標的分子は平面上に固定化される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド結合は一時的であり、反復可能である。一時的な結合により超解像度イメージング（１）が可能になり、繰り返し結合により真の信号が観察されるという確信が得られる。ここで、結合プロファイルとハイブリダイゼーションの程度には、個々の分子上の結合イベントの数（繰り返し結合数）、これらの結合イベントの「オン」時間または「滞留」時間と「オフ」時間（結合イベント間の時間）が含まれる。いくつかの実施形態では、オリゴは短く、７塩基以下、典型的には３～５塩基の長さである。いくつかの実施形態では、オリゴは光学的に標識され（例えば、蛍光色素、ナノ粒子、または光散乱粒子によって）、滞留時間は「明るい」時間、オフの時間は「暗い」時間である。

【0013】

本開示によって発見された、本発明の重要な実施形態の基礎を形成する驚くべき特徴は、オリゴが一時的に結合する条件下でハイブリダイゼーションが実行されるとき、明時間、暗時間、及び／または反復結合数を使用して、結合部位を非修飾または修飾として分類し、異なる修飾が異なるクラスに分類されることを確認できることである。例えば、いくつかの実施形態では、オリゴ結合の滞留時間は、標的配列がメチル化部位を有する場合、そうでない場合に比べて長い。いくつかの実施形態では、塩基の周囲の配列に相補的な複数のオリゴヌクレオチドの結合プロファイル（例えば、単一の塩基が、結合の塩基フットプリントにその塩基を含む５つの５ｍｅｒを有する）が、塩基が修飾されているかどうかを決定するために考慮される。複数のオリゴヌクレオチドが同じ塩基を標的にすることにより、冗長性が増し、測定の堅牢性も高まる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】標的核酸に結合する一過性オリゴヌクレオチドを検出するための方法の図を提供する。核酸は、例えばストレプトアビジン／ビオチン相互作用を介して表面に固定される。蛍光色素、例えば、Ｃｙ３で標識されたオリゴヌクレオチドプローブは、配列特異的に核酸に結合する。オリゴヌクレオチドは一時的に標的に結合するが、蛍光色素がレーザーによって励起されて発光が検出されるのに十分な長さ（例えば２００ｍｓ）がある。ハイブリダイゼーション動態は、複数の結合及び結合解除イベントにわたって測定される。

【図2】５－ＭｅＣと非メチル化標的ＤＮＡとの間の結合プロファイル動態の違いの説明的な例を提供する。ｔ_ｏｎは、核酸分子上でオリゴヌクレオチド蛍光シグナルが検出される時間である。Ｔ_ｏｆｆは、核酸分子上で蛍光シグナルが検出されない時間である。

【図3A】異なる状況における５－ＭｅＣ及び非メチル化ＤＮＡ標的に対する実験的に生成されたオリゴ結合プロファイルの例を集合的に示す。２つの別個のフローセルを使用する。一方は配列上の指定された部位に５－ＭｅＣを含む標的核酸を含み、他方は同一配列の標的核酸を含むが、指定された部位に５－ＭｅＣを含まないフローセルである。同じＣｙ３標識オリゴヌクレオチドをそれぞれのフローセルに添加し、平均ｔ_ｏｎを決定する。グラフには、それぞれが標的ＤＮＡ分子のメチル化バージョンと非メチル化バージョンに結合する１０種類の異なるオリゴヌクレオチドの平均ｔ_ｏｎが表示される。

【図3B】異なる状況における５－ＭｅＣ及び非メチル化ＤＮＡ標的に対する実験的に生成されたオリゴ結合プロファイルの例を集合的に示す。２つの別個のフローセルを使用する。一方は配列上の指定された部位に５－ＭｅＣを含む標的核酸を含み、他方は同一配列の標的核酸を含むが、指定された部位に５－ＭｅＣを含まないフローセルである。同じＣｙ３標識オリゴヌクレオチドをそれぞれのフローセルに添加し、平均ｔ_ｏｎを決定する。グラフには、それぞれが標的ＤＮＡ分子のメチル化バージョンと非メチル化バージョンに結合する１０種類の異なるオリゴヌクレオチドの平均ｔ_ｏｎが表示される。

【図3C】異なる状況における５－ＭｅＣ及び非メチル化ＤＮＡ標的に対する実験的に生成されたオリゴ結合プロファイルの例を集合的に示す。２つの別個のフローセルを使用する。一方は配列上の指定された部位に５－ＭｅＣを含む標的核酸を含み、他方は同一配列の標的核酸を含むが、指定された部位に５－ＭｅＣを含まないフローセルである。同じＣｙ３標識オリゴヌクレオチドをそれぞれのフローセルに添加し、平均ｔ_ｏｎを決定する。グラフには、それぞれが標的ＤＮＡ分子のメチル化バージョンと非メチル化バージョンに結合する１０種類の異なるオリゴヌクレオチドの平均ｔ_ｏｎが表示される。

【図3D】異なる状況における５－ＭｅＣ及び非メチル化ＤＮＡ標的に対する実験的に生成されたオリゴ結合プロファイルの例を集合的に示す。２つの別個のフローセルを使用する。一方は配列上の指定された部位に５－ＭｅＣを含む標的核酸を含み、他方は同一配列の標的核酸を含むが、指定された部位に５－ＭｅＣを含まないフローセルである。同じＣｙ３標識オリゴヌクレオチドをそれぞれのフローセルに添加し、平均ｔ_ｏｎを決定する。グラフには、それぞれが標的ＤＮＡ分子のメチル化バージョンと非メチル化バージョンに結合する１０種類の異なるオリゴヌクレオチドの平均ｔ_ｏｎが表示される。

【図3E】異なる状況における５－ＭｅＣ及び非メチル化ＤＮＡ標的に対する実験的に生成されたオリゴ結合プロファイルの例を集合的に示す。２つの別個のフローセルを使用する。一方は配列上の指定された部位に５－ＭｅＣを含む標的核酸を含み、他方は同一配列の標的核酸を含むが、指定された部位に５－ＭｅＣを含まないフローセルである。同じＣｙ３標識オリゴヌクレオチドをそれぞれのフローセルに添加し、平均ｔ_ｏｎを決定する。グラフには、それぞれが標的ＤＮＡ分子のメチル化バージョンと非メチル化バージョンに結合する１０種類の異なるオリゴヌクレオチドの平均ｔ_ｏｎが表示される。

【図3F】異なる状況における５－ＭｅＣ及び非メチル化ＤＮＡ標的に対する実験的に生成されたオリゴ結合プロファイルの例を集合的に示す。２つの別個のフローセルを使用する。一方は配列上の指定された部位に５－ＭｅＣを含む標的核酸を含み、他方は同一配列の標的核酸を含むが、指定された部位に５－ＭｅＣを含まないフローセルである。同じＣｙ３標識オリゴヌクレオチドをそれぞれのフローセルに添加し、平均ｔ_ｏｎを決定する。グラフには、それぞれが標的ＤＮＡ分子のメチル化バージョンと非メチル化バージョンに結合する１０種類の異なるオリゴヌクレオチドの平均ｔ_ｏｎが表示される。

【図3G】異なる状況における５－ＭｅＣ及び非メチル化ＤＮＡ標的に対する実験的に生成されたオリゴ結合プロファイルの例を集合的に示す。２つの別個のフローセルを使用する。一方は配列上の指定された部位に５－ＭｅＣを含む標的核酸を含み、他方は同一配列の標的核酸を含むが、指定された部位に５－ＭｅＣを含まないフローセルである。同じＣｙ３標識オリゴヌクレオチドをそれぞれのフローセルに添加し、平均ｔ_ｏｎを決定する。グラフには、それぞれが標的ＤＮＡ分子のメチル化バージョンと非メチル化バージョンに結合する１０種類の異なるオリゴヌクレオチドの平均ｔ_ｏｎが表示される。

【図3H】異なる状況における５－ＭｅＣ及び非メチル化ＤＮＡ標的に対する実験的に生成されたオリゴ結合プロファイルの例を集合的に示す。２つの別個のフローセルを使用する。一方は配列上の指定された部位に５－ＭｅＣを含む標的核酸を含み、他方は同一配列の標的核酸を含むが、指定された部位に５－ＭｅＣを含まないフローセルである。同じＣｙ３標識オリゴヌクレオチドをそれぞれのフローセルに添加し、平均ｔ_ｏｎを決定する。グラフには、それぞれが標的ＤＮＡ分子のメチル化バージョンと非メチル化バージョンに結合する１０種類の異なるオリゴヌクレオチドの平均ｔ_ｏｎが表示される。

【図3I】異なる状況における５－ＭｅＣ及び非メチル化ＤＮＡ標的に対する実験的に生成されたオリゴ結合プロファイルの例を集合的に示す。２つの別個のフローセルを使用する。一方は配列上の指定された部位に５－ＭｅＣを含む標的核酸を含み、他方は同一配列の標的核酸を含むが、指定された部位に５－ＭｅＣを含まないフローセルである。同じＣｙ３標識オリゴヌクレオチドをそれぞれのフローセルに添加し、平均ｔ_ｏｎを決定する。グラフには、それぞれが標的ＤＮＡ分子のメチル化バージョンと非メチル化バージョンに結合する１０種類の異なるオリゴヌクレオチドの平均ｔ_ｏｎが表示される。

【図4A】３’－Ｕａｑまたはピレンなどのキャップの付加により、オリゴの３’ゆらぎ塩基を使用してメチル化部位と非メチル化部位の識別が可能になることを集合的に示す。この実験例では、標的分子内のメチル化シトシン残基と塩基対を形成するのは、オリゴの末端３’塩基である。同じＤＮＡ標的分子のメチル化バージョン及び非メチル化バージョンに結合する単一のオリゴの動態プロファイルを示している。

【図4B】３’－Ｕａｑまたはピレンなどのキャップの付加により、オリゴの３’ゆらぎ塩基を使用してメチル化部位と非メチル化部位の識別が可能になることを集合的に示す。この実験例では、標的分子内のメチル化シトシン残基と塩基対を形成するのは、オリゴの末端３’塩基である。同じオリゴ及びＤＮＡ標的分子の動態プロファイルを示している。しかしながら、この例では、オリゴには３’－Ｕａｑキャップが付加している。

【図5A】単一の５－ＭｅＣ部位が重複する複数のオリゴについて実験的に生成された動態プロファイルの例をまとめて示しており、標的分子のそれぞれの位置について複数の独立した読み取りが可能であることを実証している。２つの別個のフローセルを使用する。一方は配列上の指定された部位に５－ＭｅＣを含む核酸を含み、他方は同一配列の核酸を含むが、指定された部位に５－ＭｅＣを含まないフローセルである。５つのＣｙ３標識オリゴヌクレオチドがそれぞれのフローセルに逐次的に追加される。グラフには、同じ標的ＤＮＡ分子のメチル化バージョンと非メチル化バージョンに結合する５つの重複オリゴヌクレオチドのそれぞれの平均ｔ_ｏｎが表示される。

【図5B】単一の５－ＭｅＣ部位が重複する複数のオリゴについて実験的に生成された動態プロファイルの例をまとめて示しており、標的分子のそれぞれの位置について複数の独立した読み取りが可能であることを実証している。２つの別個のフローセルを使用する。一方は配列上の指定された部位に５－ＭｅＣを含む核酸を含み、他方は同一配列の核酸を含むが、指定された部位に５－ＭｅＣを含まないフローセルである。５つのＣｙ３標識オリゴヌクレオチドがそれぞれのフローセルに逐次的に追加される。グラフには、同じ標的ＤＮＡ分子のメチル化バージョンと非メチル化バージョンに結合する５つの重複オリゴヌクレオチドのそれぞれの平均ｔ_ｏｎが表示される。

【図6】場合によっては、オリゴが複数のＣｐＧ部位を含む標的分子の領域にハイブリダイズする可能性があることを集合的に示す。これらのＣｐＧ部位は、すべて非メチル化、すべてメチル化、またはメチル化と非メチル化の組み合わせのいずれかになる。これら３つのコンテキストがオリゴハイブリダイゼーション動態の違いに基づいて区別される、２つの実験例が示されている。Ａは、配列ＴＴＣＣＣＧを含む非メチル化、単一メチル化、及び二重メチル化のＤＮＡ標的分子が表面に固定され、配列ＧＧＧＡＡを有する同じＣｙ３標識オリゴヌクレオチドがそれぞれのフローセルに添加されることを示している。Ｂは、配列ＣＣＣＧＣＧを含む非メチル化、単一メチル化、及び二重メチル化のＤＮＡ標的分子が表面に固定され、配列ＧＣＧＧＧを有する同じＣｙ３標識オリゴヌクレオチドがそれぞれのフローセルに添加されることを示している。グラフには、それぞれのプローブでの非メチル化、単一メチル化、及び二重メチル化の標的分子の平均ｔ_ｏｎが表示される。

【図7】メチル化ハプロタイプ識別のプロセスを集合的に示す。オリゴが、複数のＣｐＧ部位を含む標的分子上の位置でハイブリダイズする場合、その動態プロファイルは両方の部位のメチル化状態によって決定される（Ａ）。混合シグナル（例えば、１つのメチル化シトシン残基と１つの非メチル化シトシン残基へのハイブリダイゼーションによって生成される動態シグナル）の場合、ＣｐＧ部位のそれぞれに重複する追加プローブを使用して、どれがメチル化されているか、どれがメチル化されていないかを識別できる（Ｂ）。

【図8A】無細胞ＤＮＡの混合バックグラウンドにおけるスパイクインの検出及びメチル化の識別を集合的に示す。非メチル化及びメチル化の合成一本鎖ＤＮＡ標的の等量混合物を、高い割合（約５０％）で合成血漿にスパイクした。ＤＮＡを混合物から抽出し、ターミナルトランスフェラーゼを使用してビオチン化し、フローセルにロードした。スパイクインを同定するために１０種類のオリゴプローブを逐次的に追加し（８つは結合し、２つは結合しない）、差次的にメチル化された部位にハイブリダイズする１つのオリゴプローブを追加した。最終プローブの動態プロファイルを使用して、スパイクインとして同定されたそれぞれの標的分子のメチル化状態を決定した（図８Ａ）。フローセル表面の一部で検出されたすべての分子のマップを（図８Ｂ）に示す。

【図8B】無細胞ＤＮＡの混合バックグラウンドにおけるスパイクインの検出及びメチル化の識別を集合的に示す。非メチル化及びメチル化の合成一本鎖ＤＮＡ標的の等量混合物を、高い割合（約５０％）で合成血漿にスパイクした。ＤＮＡを混合物から抽出し、ターミナルトランスフェラーゼを使用してビオチン化し、フローセルにロードした。スパイクインを同定するために１０種類のオリゴプローブを逐次的に追加し（８つは結合し、２つは結合しない）、差次的にメチル化された部位にハイブリダイズする１つのオリゴプローブを追加した。最終プローブの動態プロファイルを使用して、スパイクインとして同定されたそれぞれの標的分子のメチル化状態を決定した（図８Ａ）。フローセル表面の一部で検出されたすべての分子のマップを（図８Ｂ）に示す。

【図8C】無細胞ＤＮＡの混合バックグラウンドにおけるスパイクインの検出及びメチル化の識別を集合的に示す。非メチル化及びメチル化の合成一本鎖ＤＮＡ標的の等量混合物を、高い割合（約５０％）で合成血漿にスパイクした。ＤＮＡを混合物から抽出し、ターミナルトランスフェラーゼを使用してビオチン化し、フローセルにロードした。スパイクインを同定するために１０種類のオリゴプローブを逐次的に追加し（８つは結合し、２つは結合しない）、差次的にメチル化された部位にハイブリダイズする１つのオリゴプローブを追加した。最終プローブの動態プロファイルを使用して、スパイクインとして同定されたそれぞれの標的分子のメチル化状態を決定した（図８Ａ）。フローセル表面の一部で検出されたすべての分子のマップを（図８Ｂ）に示す。

【図9A】５ｍｅｒオリゴを使用した核酸中のシトシンとヒドロキシメチルシトシンの識別を集合的に示す。オリゴがヒドロキシメチルシトシンに結合する滞留時間は、シトシンに結合する滞留時間よりも長い。

【図9B】５ｍｅｒオリゴを使用した核酸中のシトシンとヒドロキシメチルシトシンの識別を集合的に示す。オリゴがヒドロキシメチルシトシンに結合する滞留時間は、シトシンに結合する滞留時間よりも長い。

【図10A】４ｍｅｒオリゴを使用した核酸におけるシトシン（青色／濃い灰色）、ヒドロキシメチルシトシン（ピンク色／赤色／黄色／明るい灰色）、及びメチルシトシン（緑色／紫色／灰色）の区別を集合的に示す。実験的に生成された、５－ヒドロキシメチル化（５－ｈｍＣ）、５－メチル化、及び非メチル化ＤＮＡのオリゴ結合プロファイルの例。使用される３つの別個のフローセルを示しており、１つは、示された部位に２つの５－ｈｍＣ残基を含む標的核酸を含み、１つは、示された部位に２つの５－ＭｅＣを含み、もう１つは、同一配列のＤＮＡ標的を含むが、いずれのエピジェネティックな修飾も含まない。同じＣｙ３標識オリゴヌクレオチドをそれぞれのフローセルに添加し、平均ｔ_ｏｎを決定する。

【図10B】４ｍｅｒオリゴを使用した核酸におけるシトシン（青色／濃い灰色）、ヒドロキシメチルシトシン（ピンク色／赤色／黄色／明るい灰色）、及びメチルシトシン（緑色／紫色／灰色）の区別を集合的に示す。実験的に生成された、５－ヒドロキシメチル化（５－ｈｍＣ）、５－メチル化、及び非メチル化ＤＮＡのオリゴ結合プロファイルの例。個々の分子の平均ｔ_ｏｎを、エピジェネティックな修飾の種類または非存在によって色分けして表示する。オリゴがシトシンに結合する滞留時間は、ヒドロキシメチルシトシンより短く、ヒドロキシメチルシトシンはメチルシトゾンよりも短い。

【図11】本開示の例示的な実施形態による、コンピュータシステムを含む例示的なシステムトポロジーを示す。

【0015】

添付の図面は必ずしも縮尺通りではなく、本発明の基本原理を示すさまざまな特徴を若干簡略化して表していることを理解されたい。

【発明を実施するための形態】

【0016】

次に、実施形態を詳細に参照し、その例は、添付する図面に例示されている。以下の発明を実施するための形態では、本開示の完全な理解を提供するために、多くの具体的な詳細が述べられている。しかしながら、本開示は、これらの具体的な詳細なしに実施され得ることが、当業者に明らかになる。他の例では、周知の方法、手順、及び構成要素は、実施形態の態様を不必要に曖昧にしないように、詳細には説明されていない。

【0017】

また、第１の、第２のなどの用語は、種々の要素を説明するために本明細書で使用されてよいが、これらの要素がこれらの用語によって制限されるべきではないことも理解される。これらの用語は、ある要素を別の要素と区別するためだけに使用される。例えば、本開示の範囲から逸脱することなく、第１の主題は第２の主題と称され、同様に第２の主題は第１の主題と称されるであろう。第１の主題及び第２の主題はともに主題であるが、第１の主題及び第２の主題は同じ主題ではない。

【0018】

本開示に使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためだけであり、本発明を限定することを意図するものではない。本発明の説明及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数形も含むことを意図している。また、本明細書で使用される場合、「及び／または」という用語は、関連する列挙された項目の１つ以上のありとあらゆる可能な組み合わせを指し、包含することも理解される。本明細書で使用される場合、「含む」及び／または「含むこと」という用語は、述べられた特徴、整数、ステップ、操作、要素、及び／またはコンポーネントの存在を指定するが、１つ以上のその他の特徴、整数、ステップ、操作、要素、コンポーネント及び／またはそれらの群の存在または追加を排除しないことも理解される。

【0019】

前述の説明には、例示的な実装を具体化する例示的なシステム、方法、技術、命令シーケンス、及びコンピューティングマシンプログラム製品が含まれていた。説明の目的で、本発明の主題のさまざまな実装の理解を提供するために、多数の具体的な詳細が記載される。しかしながら、本発明の主題は、これらの特有の詳細なしでも実施され得ることは当業者に明らかであろう。一般に、よく知られている命令インスタンス、プロトコル、構造、及び技術は詳細には示されていない。

【0020】

上記の説明は、説明の目的で、特定の実装を参照して説明された。しかしながら、下記の例示的な説明は、網羅的であることを意図するものではなく、また、実施態様を開示されている正確な形態に限定することを意図するものでもない。上述の教示に照らして多くの変更形態及び変形形態が考えられる。実施態様は、原理及びその実際的な応用を最もよく説明し、それによって当業者が、実施態様及び種々の変更形態を有する種々の実施態様を、意図される特定の使用に適しているとしてもっともよく利用できるようにするために、選ばれ、説明される。

【0021】

明確にするために、本明細書で説明される実装形態の日常的な特徴のすべてが図示及び説明されているわけではない。このような実際の実装の開発では、ユースケース及びビジネス関連の制約への準拠など、設計者の特定の目標を達成するために、実装固有の多数の決定が行われること、及びこれらの特定の目標は、実装ごとに、また設計者ごとに異なることが理解されるであろう。さらに、そのような設計作業は複雑で時間がかかるかもしれないが、それでも本開示の恩恵を受ける当業者にとっては日常的なエンジニアリング作業であることが理解されるであろう。

【0022】

本明細書で使用される場合、用語「場合（ｉｆ）」は、文脈に応じて「とき（ｗｈｅｎ）」または「時（ｕｐｏｎ）」または「決定することに応えて（ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」、または「検出することに応えて（ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）」を意味すると解釈されてよい。同様に、句「と決定される場合（ｉｆ ｉｔ ｉｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）」または「［述べられている条件またはイベントが（ａ ｓｔａｔｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｒ ｅｖｅｎｔ）］検出される場合」は、文脈に応じて、「決定時（ｕｐｏｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」または「決定することに応えて（ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」または「［述べられている条件またはイベント（ｔｈｅ ｓｔａｔｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｒ ｅｖｅｎｔ）］を検出時（ｕｐｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）」または「［述べられている条件またはイベント（ｔｈｅ ｓｔａｔｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｒ ｅｖｅｎｔ）］を検出したのに応えて（ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）」を意味すると解釈されてよい。

【0023】

本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値に対する許容誤差範囲内であることを意味し得、それは、その値がどのように測定または決定されるか、例えば、測定システムの限界に一部依存し得る。例えば、「約」とは、当技術分野での１実施当たり１または１よりも多くの標準偏差以内を意味し得る。「約」とは、所定の値の±２０％、±１０％、±５％、または±１％の範囲を意味する。別段に記載がない限り、本出願及び特許請求の範囲に特定の値が記載される場合、「約」という用語は、特定の値について許容可能な誤差範囲内にあることを意味する。「約」という用語は、当業者によって一般的に理解されるような意味を有する。「約」という用語は、±１０％を指し得る。「約」という用語は±５％を指し得る。

【0024】

本開示では、明示的に別段の記載がない限り、デバイス及びシステムの説明には、１つ以上のコンピュータの実装が含まれる。例えば、図１１での説明のために、コンピュータシステム１９００は、コンピュータシステム１９００の機能のすべてを含む単一のデバイスとして表されている。しかしながら、本発明はこれに限定されるものではない。例えば、いくつかの実施形態では、コンピュータシステム１９００の機能は、任意の数のネットワーク化されたコンピュータにわたって分散され、及び／またはいくつかのネットワーク化されたコンピュータのそれぞれに常駐し、及び／または通信ネットワーク（例えば、図１１の通信ネットワーク１９０６）を介してアクセス可能な遠隔の場所の１つ以上の仮想マシン及び／またはコンテナ上でホストされることによって、分散される。当業者は、豊富な異なるコンピュータトポロジーが分析コンピュータシステム１９００ならびに本開示の他のデバイス及びシステムに対して考えられ、すべてのそのようなトポロジーは本開示の範囲内にあることを理解するであろう。さらに、物理的な通信ネットワーク１９０６に依存するのではなく、図示のデバイス及びシステムは相互に情報を無線で送信することができる。したがって、図１１に示される例示的なトポロジーは、当業者に容易に理解される方法で本開示の実施形態の特徴を説明するのに役立つだけである。

【0025】

図１１は、本開示のいくつかの実施形態による分散コンピュータシステム（例えば、コンピュータシステム１９００）のブロック図を示す。コンピュータシステム１９００は、少なくとも、核酸のエピジェネティックな修飾を検出するための１つ以上の命令の伝達を容易にする。

【0026】

いくつかの実施形態では、通信ネットワーク１９０６は、インターネット、１つ以上のローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、１つ以上のワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）、他の種類のネットワーク、またはそのようなネットワークの組み合わせを任意選択で含む。

【0027】

通信ネットワーク１９０６の例としては、ワールドワイドウェブ（ＷＷＷ）、イントラネット、及び／または携帯電話ネットワーク、無線ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）及び／またはメトロポリタンエリアネットワーク（ＭＡＮ）などの無線ネットワーク、ならびに無線通信による他のデバイスが挙げられる。無線通信としては、グローバル・システム・フォー・モバイル・コミュニケーションズ（ＧＳＭ）、拡張データＧＳＭ環境（ＥＤＧＥ）、高速ダウンリンク・パケット・アクセス（ＨＳＤＰＡ）、高速アップリンク・パケットアクセス（ＨＳＵＰＡ）、エボリューション、データオンリー（ＥＶ－ＤＯ）、ＨＳＰＡ、ＨＳＰＡ＋、デュアルセルＨＳＰＡ（ＤＣ－ＨＳＰＤＡ）、ロングタームエボリューション（ＬＴＥ）、近距離無線通信（ＮＦＣ）、広帯域符号分割多元接続（Ｗ－ＣＤＭＡ）、符号分割多元接続（ＣＤＭＡ）、時分割多元接続（ＴＤＭＡ）、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ、ワイヤレスフィデリティ（Ｗｉ－Ｆｉ）（例えば、ＩＥＥＥ ８０２．１１ａ、ＩＥＥＥ ８０２．１１ａｃ、ＩＥＥＥ ８０２．１１ａｘ、ＩＥＥＥ ８０２．１１ｂ、ＩＥＥＥ ８０２．１１ｇ及び／またはＩＥＥＥ ８０２．１１ｎ）、ボイスオーバーインターネットプロトコル（ＶｏＩＰ）、Ｗｉ－ＭＡＸ、電子メール用のプロトコル（例えば、インターネットメッセージアクセスプロトコル（ＩＭＡＰ）及び／またはポストオフィスプロトコル（ＰＯＰ））、インスタントメッセージング（例えば、拡張可能なメッセージング及びプレゼンスプロトコル（ＸＭＰＰ）、インスタントメッセージングとプレゼンス利用拡張機能のセッション開始プロトコル（ＳＩＭＰＬＥ）、インスタントメッセージング及びプレゼンスサービス（ＩＭＰＳ））、及び／またはショートメッセージサービス（ＳＭＳ）、またはその他の適切な通信プロトコル（この文書の出願日の時点でまだ開発されていない通信プロトコルを含む）を含む、複数の通信標準、プロトコル、及び技術のいずれかを任意選択で使用する。

【0028】

さまざまな実施形態では、コンピュータシステム１９００は、１つ以上の処理装置（ＣＰＵ）１９０２、ネットワークまたは他の通信インターフェース１９０４、及びメモリ１９１２を含む。

【0029】

いくつかの実施形態では、コンピュータシステム１９００は、ユーザインターフェース１９０６を含む。ユーザインターフェース１９０６は、典型的には、メディアを提示するためのディスプレイ１９０８を含む。いくつかの実施形態では、ディスプレイ１９０８は、コンピュータシステム内に統合される（例えば、ＣＰＵ１９０２及びメモリ１９１２と同じシャーシ内に収容される）。いくつかの実施形態では、コンピュータシステム１９００は、対象がコンピュータシステム１９００とインタラクトすることを可能にする１つ以上の入力デバイス１９１０を含む。いくつかの実施形態では、入力装置１９１０は、キーボード、マウス、及び／または他の入力機構を含む。代替的に、または付加的に、いくつかの実施形態では、ディスプレイ１９０８はタッチ感知面を含む（例えば、ディスプレイ１９０８がタッチ感知ディスプレイであるか、またはコンピュータシステム１９００がタッチパッドを含む場合）。

【0030】

いくつかの実施形態では、コンピュータシステム１９００は、ディスプレイ１９０８を通じてユーザにメディアを提示する。ディスプレイ１９０８によって提示されるメディアの例には、１つ以上の画像（例えば、３Ｃのチャートを提示するディスプレイ１９０８上のユーザインターフェースなど）、ビデオ、オーディオ（例えば、オーディオ試料の波形）、またはそれらの組み合わせが含まれる。典型的な実施形態では、１つ以上の画像、ビデオ、オーディオ、またはそれらの組み合わせが、クライアントアプリケーションを通じてディスプレイ１９０８によって提示される。いくつかの実施形態では、オーディオは、コンピュータシステム１９００からオーディオ情報を受信し、このオーディオ情報に基づいてオーディオデータを提示する外部デバイス（例えば、スピーカ、ヘッドホン、入出力（Ｉ／Ｏ）サブシステムなど）を通じて提示される。いくつかの実施形態では、ユーザインターフェース１９０６はまた、スピーカなどの音声出力デバイス、またはスピーカ、イヤホン、またはヘッドホンに接続するための音声出力を含む。

【0031】

メモリ１９１２は、ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＤＤＲ ＲＡＭ、または他のランダムアクセスソリッドステートメモリデバイスなどの高速ランダムアクセスメモリを含み、また任意選択で、１つ以上の磁気ディスク記憶デバイス、光ディスク記憶デバイス、フラッシュメモリデバイス、またはその他の不揮発性ソリッドステートストレージデバイスなどの不揮発性メモリも含む。メモリ１９１２は、任意選択で、ＣＰＵ（複数可）１９０２から遠隔に配置された１つ以上の記憶装置を含んでもよい。メモリ１９１２、代替的にメモリ１９１２内の不揮発性メモリデバイス（複数可）は、非一時的なコンピュータ可読記憶媒体を含む。ＣＰＵ（複数可）１９０２などのコンピュータシステム１９００の他のコンポーネントによるメモリ１９１２へのアクセスは、任意選択で、コントローラによって制御される。いくつかの実施形態では、メモリ１９１２は、ＣＰＵ（複数可）１９０２に対して遠隔に配置された大容量記憶装置を含むことができる。換言すると、メモリ１９１２に記憶されるいくらかのデータは、事実上、コンピュータシステム１９００にとって外部であるデバイス上でホストされてよいが、それは、インターネット、イントラネット、または通信インターフェース１９０４を使用する他の形のネットワーク１０６もしくは電子ケーブルを介してコンピュータシステム１９００によって電子的にアクセスできる。

【0032】

いくつかの実施形態では、コンピュータシステム１９００のメモリ１９１２は以下を格納する。
・さまざまな基本的なシステムサービスを処理する手順を含むオペレーティングシステム１９２０（例えば、ＡＮＤＲＯＩＤ、ｉＯＳ、ＤＡＲＷＩＮ、ＲＴＸＣ、ＬＩＮＵＸ、ＵＮＩＸ、ＯＳ Ｘ、ＷＩＮＤＯＷＳ、またはＶｘＷｏｒｋｓなどの組み込みオペレーティングシステム）；
・コンピュータシステム１９００を（例えば、通信ネットワーク１９０６内で）識別する、コンピュータシステム１９００に関連付けられた電子アドレス；
・コンピュータシステム１９００に関連する１つ以上のプロセス（例えば、方法）を制御するための１つ以上のモジュール１９２４を含む制御モジュール１９２２；
・任意選択で、コンピュータシステム１９００のディスプレイ１９０８を使用して情報（例えば、メディア）を提示するためのクライアントアプリケーション。

【0033】

いくつかの実施形態では、制御モジュール１９２２は、本開示の方法（例えば、核酸分子の少なくとも一部のメチル化状態を決定するための第１の方法、異なる配列を包含する複数の核酸分子の修飾状態を決定するための第２の方法、１つ以上の核酸分子の修飾（メチル化など）状態を決定する第３の方法、核酸分子の少なくとも一部の配列及びエピ配列を決定する第４の方法、など）の１つ以上のステップを実行するように構成された１つ以上のモデル１９２４を含む。

【0034】

さらに、いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、１つ以上の参照ライブラリ（例えば、がん参照データベース、核酸参照データベースなどの１つ以上の参照データベース）を含む。

【0035】

本明細書で提供される方法によって検出可能な修飾としては、化学修飾塩基、酵素修飾塩基、ＤＮＡ損傷、脱塩基部位、非天然塩基、二次構造、及び核酸に結合した薬剤が挙げられる。本発明の方法によって検出することができる例示的な修飾としては、メチル化塩基（例えば、５－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデノシンなど）、シュードウリジン塩基、７，８－ジヒドロ－８－オキソグアニン塩基、２’－Ｏ－メチル誘導体塩基、ニック、非プリン部位、非ピリミド部位、ピリミジン二量体、シスプラテン架橋生成物、酸化損傷、加水分解損傷、嵩高い塩基付加物、チミン二量体、光化学反応生成物、鎖間架橋生成物、ミスマッチ塩基、二次構造、及び結合薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0036】

いくつかの実施形態では、オリゴの結合特性は、プローブにおける異なる修飾を使用することによって調整され、例えば、短いオリゴ（ＬＮＡ、ＰＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、変化した安定性、マイナーグルーブ結合、スタッキング、インターカレート、カチオン性複合体などを有するアナログ塩基など）の結合安定性を高めるためのいくつかの選択肢があり、特定の修飾は、修飾塩基と非修飾塩基間の結合の違いを強調することができる。いくつかの実施形態では、結合特性は、緩衝液組成、特に塩の濃度及び種類、変性剤の存在、結合促進剤、ｐＨ、温度、及びオリゴプローブ濃度によって調整される。

【0037】

いくつかの実施形態では、オリゴの結合を測定するために、識別性及びメチル化状態を決定するための測定（及びその繰り返し）が同じ分子上で実行できるように、標的を表面に固定しなければならない。

【0038】

いくつかの実施形態では、標的分子の配列または識別性がすでに知られているか特定されている場合、本発明は標的分子の修飾状態のみを決定することを含む。

【0039】

いくつかの実施形態では、本方法は、修飾されている場合と修飾されていない場合と比較して配列に対して異なる結合を示す、１つ以上のオリゴを核酸分子に結合させることを含む。

【0040】

いくつかの実施形態では、標的分子の識別性が事前に知られていない場合、例えば、ゲノムＤＮＡのランダム断片またはショットガン断片を調べる場合、そのような核酸試料におけるエピジェネティックな修飾を検出するためには、核酸分子の識別性を決定する必要がある。したがって、この実施形態は２つの主要な態様を含む。いくつかの実施形態では、第１の主要な態様は、核酸分子から配列情報を取得してその識別性を決定することを含む。いくつかの実施形態では、第２の主要な態様は、修飾されている場合と修飾されていない場合と比較して配列に対して異なる結合を示す１つ以上のオリゴを核酸分子に結合させることを含む。

【0041】

いくつかの実施形態では、配列情報は、配列決定、例えば、ＰａｃＢｉｏ配列決定、Ｈｅｌｉｃｏｓ配列決定、Ｏｘｆｏｒｄナノポア配列決定、ＸＧｅｎｏｍｅｓ配列決定（２、３）によって取得される。いくつかの実施形態では、配列情報は分子プロービングによって取得される（２、３）。

【0042】

いくつかの実施形態では、核酸試料中のエピジェネティックな修飾を検出する方法は、２つの主要な態様を含む。いくつかのそのような実施形態では、第１の態様は、１つ以上のオリゴを核酸分子に結合させて、その識別性を決定することを含む。いくつかのそのような実施形態では、第２の態様は、修飾されている場合と修飾されていない場合と比較して配列に対して異なる結合を示す１つ以上のオリゴを核酸分子に結合させることを含む。

【0043】

いくつかの実施形態では、割り当てられた識別性は、１つであるか、または標的に結合する複数のオリゴのいずれであるか、及びその結合プロファイル（繰り返し結合数、明時間、暗時間）がどのようなものであるかの決定に基づいている。

【0044】

いくつかの実施形態では、核酸の識別性は、そのゲノム起源を含む。

【0045】

いくつかの実施形態では、修飾状態は、１つ以上の修飾が存在する場合に、１つ以上のオリゴの結合プロファイルを予想される結合プロファイルと照合することによって決定される。いくつかの実施形態では、識別性が決定されている場合、修飾状態が目的のものである分子のデータを選択的に処理することができる（例えば、図１１の制御モジュール１９２２のモデル１９２４によって処理する）。

【0046】

いくつかの実施形態では、履歴データまたは訓練データ（例えば、図１１の制御モジュール１９２２のモデル１９２４の履歴データまたは訓練データ）を使用して、取得された結合プロファイルが修飾の存在に対応するかどうかを判定する。

【0047】

いくつかの実施形態では、スパイクイン対照は、取得された結合プロファイルが修飾の存在に対応するかどうかを決定するための参照として使用される。

【0048】

いくつかの実施形態では、修飾相補配列及び非修飾相補配列に対するプローブの結合の程度は、事前に決定されているか、または参照スパイクイン標的への結合を観察することによってインサイチュで決定される。

【0049】

いくつかの実施形態では、スパイクイン対照により、修飾塩基及び非修飾塩基の通常のシグナルレベルの設定が可能になる。例えば、そのような対照は、特定の配列状況において修飾された塩基を有する１つ以上の合成オリゴヌクレオチド、及び修飾された塩基を有しないそれらの配列が一致するオリゴヌクレオチドを含む。

【0050】

いくつかの実施形態では、結合は二重鎖形成を含む。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、核酸分子の少なくとも一部のメチル化状態を決定するための方法を提供する。

【0051】

いくつかの実施形態では、本方法は、試験標的配列に対する相補的オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションの程度を測定することを含む。

【0052】

いくつかの実施形態では、本方法は、試験標的配列に対する異なる相補的オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションの程度を任意に測定することを含む。

【0053】

いくつかの実施形態では、本方法は、ハイブリダイゼーションの程度が参照非メチル化標的配列に対するハイブリダイゼーションの程度よりも大きい場合、及び／または参照メチル化標的配列と同等である場合に、メチル化が存在すると決定することを含む。

【0054】

いくつかの実施形態では、標的配列に対する２つ以上のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのパターンが得られる。

【0055】

いくつかの実施形態では、本開示は、異なる配列を包含する複数の核酸分子の修飾状態を決定するための方法を提供することに関する。

【0056】

いくつかのそのような実施形態では、本方法は、核酸分子の試料を取得することを含む。

【0057】

いくつかのそのような実施形態では、本方法は、表面上に核酸分子を分散させ、固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ）／固定（ｆｉｘｉｎｇ）することを含み、それにより、アレイ内のそれぞれの分子が表面上の別個の位置に固定されている核酸分子のアレイを得ることを含む。

【0058】

いくつかのそのような実施形態では、方法は、既知の配列の１つ以上のオリゴ（典型的にはオリゴのレパートリーまたはパネル）を核酸に曝露することを含み、１つ以上の前記オリゴは、個々の核酸分子のそれぞれの識別性を決定し、１つ以上の前記オリゴの個々の核酸のそれぞれへの結合を検出することができ、そして前記核酸の識別性を決定する。

【0059】

いくつかのそのような実施形態では、本方法は、既知の配列の１つ以上のオリゴを核酸に曝露することを含み、１つ以上の前記オリゴは、配列が修飾されていない場合と比較して、配列が修飾された場合に異なる結合プロファイルを有することができ、１つ以上の前記オリゴの個々の核酸のそれぞれに対する結合プロファイルを検出し、その結合プロファイルが配列が修飾された場合の結合プロファイルまたは配列が修飾されていない場合の結合プロファイルによりよく一致するかどうかを判定する。

【0060】

いくつかのそのような実施形態では、本方法は、同定された分子の修飾状態を記録することを含む。

【0061】

いくつかの実施形態では、本開示は、異なる配列を包含する複数の核酸分子の修飾状態を決定するための方法を提供することに関する。

【0062】

いくつかの実施形態では、本方法は、核酸分子の試料を取得することを含む。

【0063】

いくつかの実施形態では、本方法は、表面上に核酸分子を分散させ、固定化／固定することを含み、それにより、アレイ内のそれぞれの分子が表面上に固定されている核酸分子のアレイを得ることを含む。

【0064】

いくつかの実施形態では、本方法は、既知の配列の１つ以上のオリゴ（典型的には、オリゴのレパートリーまたはパネル）を核酸に曝露することを含み、１つ以上の前記オリゴは、個々の核酸分子のそれぞれの識別性を決定することができ、１つ以上の前記オリゴは、核酸分子の配列が修飾されていない場合と比較して、修飾されている場合に異なる結合プロファイルを有する。

【0065】

いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上の前記オリゴの個別の核酸のそれぞれへの結合を検出することと、前記核酸の識別性を決定することと、１つ以上の前記オリゴの個別の核酸のそれぞれへの結合プロファイルを検出することと、結合プロファイルが、配列が修飾された場合の結合プロファイルまたは配列が修飾されていない場合の結合プロファイルによりよく一致するかどうかを決定することと、を含む。

【0066】

いくつかの実施形態では、本方法は、同定された分子の修飾状態を記録することを含む。

【0067】

いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の核酸分子の修飾（例えば、メチル化）状態を決定する方法を提供することに関する。

【0068】

いくつかの実施形態では、本方法は、既知の配列の１つ以上のオリゴを核酸に曝露することを含む。

【0069】

いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上のオリゴが核酸分子のいずれかにハイブリダイズしたかどうかの検出を含む。

【0070】

いくつかの実施形態では、本方法は、核酸分子を、既知の配列及びメチル化などの核酸の修飾に関して既知のハイブリダイゼーション挙動を有する１つ以上のオリゴに曝露することを含む。

【0071】

いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上のオリゴが核酸分子のいずれかにハイブリダイズしたかどうかの検出を含む。

【0072】

いくつかの実施形態では、本方法は、それぞれの核酸分子の結合プロファイルを構築することを含む。結合プロファイルは、核酸分子に曝露されたそれぞれのオリゴの１つ以上の結合呼び出しのセットを含む。さらに、結合プロファイルには、それぞれの結合呼び出しに対するエラーの可能性の推定値を取得する信頼度メトリックが含まれる。

【0073】

いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上の参照核酸配列のセットを含む。

【0074】

いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上のオリゴヌクレオチド配列と１つ以上の参照配列との間の完全一致の位置を格納するコンピュータデータベース（例えば、図１１のコンピュータシステム１９００）を利用する。

【0075】

いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上の参照配列間の完全一致のデータベースを使用して、それぞれの結合プロファイルを核酸分子に対応する核酸配列を包含する可能性が最も高い参照配列のいずれかのサブセット内の１つ以上のインターバルに変換するコンピュータプログラム（例えば、図１１のコンピュータシステム１９００の制御モジュール１９２２）を利用する。

【0076】

いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上の参照配列の間の１つ以上の一致するインターバル、及び核酸分子のそれぞれの修飾プロファイルを構築するための修飾に感応するオリゴヌクレオチドに対応する結合プロファイルのサブセットを使用するコンピュータプログラム（例えば、図１１のコンピュータシステム１９００の制御モジュール１９２２）を利用する。

【0077】

いくつかの実施形態では、分子は、平均して表面上で２５０ナノメートル（ｎｍ）未満離れて位置し、超解像イメージングによって分離されるように表面上に分散される。

【0078】

いくつかの実施形態では、個々の分子上の結合イベントは、単一分子の位置の特定によって位置が特定される。

【0079】

上記と同じアプローチを一連の修飾に使用することができるが、結合の程度は修飾に応じて未修飾の核酸よりも大きいかまたは小さい場合がある。

【0080】

メチル化はゲノム内で最も一般的な修飾であるが、現実世界の試料では他の修飾がゲノム内に共存するため、異なる修飾を区別し分類する手段が有用である。この複雑さのため、いくつかの実施形態では、特定の修飾に関する情報のみが必要な場合、その修飾にタグを付けて、タグへの結合プロファイルを測定することができる。例えば、β－グルコシルトランスフェラーゼ（βＧＴ）はヒドロキシメチルをタグ付けして、検出可能な顕著なシグナルを提供する。

【0081】

いくつかの実施形態では、標的配列に沿った単一のオリゴのフットプリント内に複数の修飾が存在する可能性があり、これは結合プロファイルに影響を及ぼすことになる。履歴データ及び訓練データ（例えば、図１１の制御モジュール１９２２のモデル１９２４の履歴データ及び訓練データ）を使用して、５ｍｅｒのフットプリントに１つ、２つまたは３つのＣｐＧ修飾があるかどうかを区別することができる。局所を標的とする複数のオリゴからの集計データもこの決定に役立つ。他の場合には、オリゴヌクレオチドのフットプリント内に異なるタイプの修飾が存在する可能性がある。例えば、メチル部位とヒドロキシメチル部位が同じ場所に見られる場合がある。同様に、履歴データと訓練データを使用して、どのような種類の変更が存在するかを決定することができる。どちらの場合も、決定を支援するために、適切に選択されたスパイクイン対照が使用される。

【0082】

いくつかの実施形態では、機械学習を使用して、異なる数の修飾または修飾の種類を有する結合プロファイルを決定することができる。

【0083】

いくつかの実施形態では、測定値は推定値を提供するが、その推定値は、修飾の状態、及びそれが生物学的プロセスまたは医学的状態にどのような影響を及ぼす可能性があるかを判断することに関連する。多くの場合、修飾状態はバイオマーカーとして使用され、可能性、したがって臨床上の決定を提供するために組み合わせて使用されたり、分子現象に関する仮説の基礎となったりする複数のバイオマーカーのうちの１つとなり得る。

【0084】

いくつかの実施形態では、試料ＤＮＡ分子の末端は、表面への固定化及び固定を容易にするために修飾される。いくつかの実施形態では、末端は、ターミナルトランスフェラーゼを使用して１つ以上のヌクレオチドを付加することによって修飾される。いくつかの実施形態では、ターミナルトランスフェラーゼを使用して単一の修飾ヌクレオチドが付加される。いくつかの実施形態では、ホモポリマーが、デオキシヌクレオチドを使用して添加される。ヌクレオチドのいくつかは、表面への捕捉を容易にするために修飾されている。例えば、ストレプトアビジン／ニュートラアビジン表面への固定化のためにビオチンで修飾され、またはＣＯＯＨ表面への固定化のためにアミノアリルで修飾されている。いくつかの実施形態では、ライゲーションを使用して短いオリゴを末端に付加し、オリゴは表面への捕捉を容易にする修飾を担っていてもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはホモポリマーは、表面に付着した相補的配列にハイブリダイズし、したがって標的配列が固定化される。

【0085】

いくつかの実施形態では、複数のオリゴが複数のサイクルで結合される。いくつかの実施形態では、１つのオリゴと別のオリゴの結合の間に１つ以上の洗浄ステップが存在する。いくつかの実施形態では、複数のオリゴが１サイクルで結合及び露出（多重化）される。いくつかの実施形態では、オリゴは同じ標識（例えば、蛍光標識、光散乱標識、またはプラズモン共鳴標識）で標識される。いくつかの実施形態では、オリゴは異なる標識で標識される。いくつかの実施形態では、異なる標識は、異なる発光及び／または励起の波長によって表される。いくつかの実施形態では、異なる標識は、蛍光寿命、異方性、光誘電率を含む異なる物理的特性によって表される。

【0086】

いくつかの実施形態では、標識はオリゴヌクレオチドの一端にある。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの両端に標識がある。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの内部に標識がある。

【0087】

いくつかの実施形態では、メチル化感受性試薬（例えば、抗体または修飾結合タンパク質または他のリガンド）は、修飾ヌクレオチドが存在する部位を占有し、オリゴヌクレオチドの結合を調節する。オリゴヌクレオチドは、メチル化感受性試薬が占める部位に相補的であり得る。

【0088】

いくつかの実施形態では、それぞれの分子の識別及び修飾状態が集約されて、生物学的プロセスまたは医学的状態についての洞察が提供される。

【0089】

いくつかの実施形態では、標的分子ごとの修飾の程度が推定される。

【0090】

いくつかの実施形態では、修飾ハプロタイプが決定される。

【0091】

いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡは、調べられる分子が一本鎖となるように、固定化の前または後に変性される。

【0092】

本方法は、修飾に修飾を必要とせず（例えば、ｈｍＣのβ－グルコシルトランスフェラーゼ（βＧＴ）標識は必要とされない）、試料の処理部分と未処理部分の別々の配列決定、例えばメチル化検出のための重亜硫酸塩配列決定も必要とせず、ポリメラーゼ連鎖反応などの増幅ステップも必要ない。

【0093】

それにもかかわらず、いくつかの実施形態では、本発明の差次的オリゴヌクレオチド結合方法は、Ｔｅｔ支援ピリジン－ボラン配列決定（ＴＡＰＳ、Ｂａｓｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ／Ｅｘａｃｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び酵素ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む一般的なメチル化／ヒドロキシメチル化キットの塩基修飾中間体を区別することができる。

【0094】

いくつかの実施形態では、個々の核酸分子は、核酸分子のアレイの一部として表面に付着される。いくつかの実施形態では、アレイは、ある範囲の異なる種または配列の分子（例えば、完全なトランスクリプトームまたはヒトゲノム全体を含む断片）を含む。アレイ内の多くの分子は、配列を完全または部分的に共有する場合がある。いくつかの実施形態では、アレイは、単一分子アレイである。Ｙｈｅ試料分子は表面上の異なる位置にランダムに配列されている。いくつかの実施形態では、分子は、分子の識別性及び修飾検出プロセス全体を通じて、別個の位置に固定されたままである。いくつかの実施形態では、特定の分子が付着する明確な位置は、本発明の方法の一部として分子の識別性が決定されるまでは分からない。

【0095】

いくつかの実施形態では、標的分子の識別性はすでに知られており、分子の修飾状態のみが決定される。修飾状態には、標的配列に沿った修飾のパターンが含まれる場合がある。いくつかの実施形態では、標的分子は、空間的にアドレス指定可能なアレイまたはマイクロアレイの一部を形成する。いくつかのそのような実施形態では、マイクロアレイのそれぞれの要素／スポットにおける分子の識別性は既知である。いくつかの実施形態では、マイクロアレイ要素／スポットは複数の分子を含み、修飾状態はバルク測定として決定される。いくつかの実施形態では、マイクロアレイスポットは複数の分子を含み、修飾状態は要素／スポット内の個々の分子について決定される。

【0096】

いくつかの実施形態では、標的分子は基材に付着していないが、溶液中で遊離している。いくつかのそのような実施形態では、標的分子は一本鎖である。いくつかのそのような実施形態では、エピジェネティックな状態は、エピジェネティックな修飾の検出オリゴヌクレオチドプローブを溶液に添加し、次いで融解曲線を測定することによって決定される。修飾は、修飾が存在する場合と修飾が存在しない場合を比較して、標的分子とプローブの間に形成されるヘテロ二本鎖を融解するのに異なる温度（ヒドロキシメチルＣ及びメチルＣの場合はより高い）が必要であることによって検出される。

【0097】

いくつかの実施形態では、本開示は、核酸分子の少なくとも一部の配列及びエピ配列を決定する方法を提供することに関する。

【0098】

いくつかの実施形態では、本方法は、核酸分子が一本鎖分子である場合、核酸分子を試験基質上に固定すること、または核酸分子が二本鎖分子である場合には核酸分子を一本鎖分子に変性させて一本鎖核酸分子を試験基材上に固定すること、または、核酸分子が二本鎖分子である場合には試験基材上に核酸分子を固定して試験基材上の核酸分子を一本鎖分子に変性させ、それによって、試験基材上に固定された一本鎖核酸を形成することを含む。

【0099】

いくつかの実施形態では、本方法は、固定された一本鎖核酸を、オリゴヌクレオチドプローブ種のセット中のそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブ種に曝露することを含む。オリゴヌクレオチドプローブ種のセットのそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブ種は、固定された一本鎖核酸上の１つ以上の位置に位置するその相補的部分にハイブリダイズすることができ、（ｉ）固有のそれぞれの所定の配列、（ｉｉ）所定の長さ、ならびに（ｉｉｉ）色素、蛍光ナノ粒子、プラズモン共鳴粒子、光散乱粒子、ナノ粒子、及び蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）パートナー（蛍光シグナルを産生することができる）からなる群から選択されるそれぞれの標識を有する。曝露するステップは、以下のような条件下で行われる：ｉ）オリゴヌクレオチドプローブ種のセットのそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブ種のオリゴヌクレオチドプローブが、試験基材上の固定された一本鎖核酸上の１つ以上の位置に反復的に一時的かつ可逆的に結合し、それによって、試験基材上の固定された一本鎖核酸上の１つ以上の位置の各々にそれぞれの一時的なヘテロ二本鎖を形成する；ｉｉ）それぞれの標識からの光学活性のそれぞれの発生は、オリゴヌクレオチドプローブ種のセットのそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブ種のオリゴヌクレオチドプローブを試験基材上の固定された一本鎖核酸上の１つ以上の位置に反復的に一時的かつ可逆的に結合させることによって生成され、検出され、それらは、試験基材上の固定された一本鎖核酸上の１つ以上の位置のそれぞれで検出される。

【0100】

いくつかの実施形態では、本方法は、固定された一本鎖核酸の１つ以上の部分が、オリゴヌクレオチドプローブ種のセットのそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブ種に相補的であるかどうかを、それぞれの標識から生成された光学活性のそれぞれの発生を検出することができる二次元イメージャを使用して、曝露ステップ中に行われる、試験基材上の固定された一本鎖核酸上の１つ以上の位置のそれぞれにおける光学活性のそれぞれの発生の継続時間を数えて測定することによって決定し、それによってオリゴヌクレオチドプローブ種のセットのそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブ種に相補的である固定一本鎖核酸上の１つ以上の位置の第１のセットを取得することを含む。

【0101】

いくつかの実施形態では、本方法は、試験基材からオリゴヌクレオチドプローブ種のセットのそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブ種を除去するために試験基材を洗浄することを含む。

【0102】

いくつかの実施形態では、本方法は、試験基材上の固定された一本鎖核酸をオリゴヌクレオチドプローブ種のセット中の別のそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブ種に曝露することによって、曝露ステップ、測定ステップ、及び洗浄ステップを繰り返し、それによって、オリゴヌクレオチドプローブ種のセット中の別のそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブ種に相補的である、固定された一本鎖核酸上の１つ以上の位置の第２のセットを得ることを含む。

【0103】

いくつかの実施形態では、本方法は、オリゴヌクレオチドプローブ種のセットのそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブ種に相補的である固定された一本鎖核酸上の１つ以上の位置の第１のセットと、オリゴヌクレオチドプローブ種のセットの別のそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブ種に相補的である固定された一本鎖核酸上の１つ以上の位置の第２のセットとに少なくとも部分的に基づいて、核酸の少なくとも一部の配列を決定することを含む。

【0104】

本方法は、オリゴヌクレオチドプローブ種のセット中のそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブ種のオリゴヌクレオチドプローブの、１つ以上の位置がエピジェネティックな修飾を有しない場合と比較して１つ以上の位置がエピジェネティックな修飾を有する場合の、固定された一本鎖核酸上の１つ以上の位置に位置するそれらの相補的部分に対する観察された示差的結合挙動に基づいて、核酸分子の当該部分が１つ以上のエピジェネティックな修飾を有するかどうかを決定することも含む。

【0105】

いくつかの実施形態では、示差的結合挙動は、光学活性の発生、オンレート、滞留時間を計数することによって得られる反復結合数の差を含む。いくつかの実施形態では、示差的結合挙動は、反復結合数、暗時間（検出可能な光学活性がない場合）及び／または明時間（光学活性がある場合）の差を含む。

【0106】

いくつかの実施形態では、プローブの結合動態（例えば、明時間、暗時間、反復結合イベントの数）を使用して、以下のいずれかまたは両方によってそれぞれの断片におけるシトシンのメチル化状態を決定する：（ｉ）プローブの結合データを、未修飾及び修飾シトシンに結合するプローブから以前に収集されたデータのデータベース（例えば、図１１のコンピュータシステム１９００）と比較すること、及び／または（ｉｉ）それぞれのＤＮＡ断片のプローブ結合データを、試料中のすべてのＤＮＡ断片のそのプローブのプローブ結合ダイナミクス（及び／または試料にスパイクされた対照ＤＮＡに結合するプローブのダイナミクス）と比較すること。

【0107】

いくつかの実施形態では、修飾を有する可能性のある核酸配列に結合することのできるそれぞれのオリゴヌクレオチドの結合プロファイルが、修飾を有する可能性のある核酸配列の合成修飾バージョン及び非修飾バージョンに対して試験することによって事前に特徴づけられ、したがって、試料分子について得られた結合プロファイルを比較するための参照として機能する。

【0108】

いくつかの実施形態では、本発明の方法によって得られる試料分子の修飾状態に関する情報は、生物学的状態または医学的状態を決定するための根拠として使用される。

【0109】

組成物

【0110】

いくつかの実施形態では、既知の配列のオリゴヌクレオチドのための組成物が本発明で使用される。いくつかの実施形態は、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満のヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、すべて同じ長さのオリゴヌクレオチドのレパートリーまたはパネルを含む。いくつかの実施形態では、オリゴの長さは異なる。いくつかの実施形態では、オリゴはＬＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴはＬＮＡ／ＤＮＡオリゴを含む。いくつかの実施形態では、オリゴは、１つ以上の長さのＤＮＡ、ＬＮＡ、ＬＮＡ／ＤＮＡオリゴを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド上の１つ以上の位置がメチル化されている。いくつかの実施形態では、修飾は塩基の５位にある。いくつかの実施形態では、オリゴのいくつかは、未定義のＮまたはユニバーサル塩基位置を含む。いくつかの実施形態では、オリゴのいくつかはコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、ＺＮＡ、スペルミン残基、または他の正に荷電した残基である。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、挿入構造またはスタッキング／キャッピング構造である。いくつかの実施形態では、キャッピング構造は、ＵＡＱ（例えば、試薬を介して結合される：５’－ジメトキシトリチル－ウリジン、２’－（アントラキノン－２－イルカルボキサミド）－３’－スクシノイル－長鎖アルキルアミノ－ＣＰＧ）、ピレン、チアゾールオレンジを含む。いくつかの実施形態では、プローブのいくつかは、一緒に連結されたオリゴの複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プローブ配列のコピーは、スペーサー（例えば、ヘキサエチレン（ｈｅｘａｔｈｅｙｌｅｎｅ）グリコール）を伴って、または伴わずに直列に接続され、そのような一実施形態では、標識がヌクレオシドの１つに結合される。いくつかの実施形態では、プローブは分岐アミダイトを介してデンドリマーに接続され、それぞれのプローブは樹状構造のアームまたは分岐である。いくつかの実施形態では、標識はデンドリマーの１つの分岐にある。いくつかの実施形態では、標識はデンドリマーの複数の分岐にある。いくつかの実施形態では、プローブのいくつかはＰＮＡまたは他の非天然骨格である。いくつかの実施形態では、塩基のいくつかは、二重鎖の安定性を高めるために修飾される。いくつかの実施形態では、塩基のいくつかは、核形成能力を高めるために修飾される。いくつかの実施形態では、塩基のいくつかは、二重鎖の安定性を低下させるために修飾される。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは一端にある。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは両端にある。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは内部にある。いくつかの実施形態は、本発明に有効な緩衝液の組成物：ＴＭＡＣｌ、ＳＳＣ、エチレンカーボネート、デキストラン硫酸、ホルムアミド、ＰＥＧ、尿素、ベタインなどを含む。

【0111】

Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、８－オキソ－７，８－ジヒドログアノシン（８－オキソＧ）、シュードウリジン（Ψ）、５メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、及びＮ４－アセチルシチジン（ａｃ４Ｃ）を含むＲＮＡ修飾は、本発明の方法に適している。

【0112】

５－メチルシトシン（５ｍＣ）、５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）、及び５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）を含むＤＮＡ修飾は、本発明の方法に適している。

【0113】

さらに、本開示のシステム、方法、及び化合物に関する追加の詳細及び情報は、２０１９年５月１６日に公開された、「Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，ａｎｄ Ｐｒｏｇｒａｍ」と題する、米国特許出願公開第２０１９／０１４９６８１ Ａ１号；Ｊｕｎｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，「Ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｓｕｐｅｒ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｎ ＤＮＡ ｏｒｉｇａｍｉ．」Ｎａｎｏ ｌｅｔｔｅｒｓ，１０（１１），ｐｇ．４７５６－４７６１；及び、２０２２年３月３日に公開された、「Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ」と題する、米国特許出願公開第２０２２／００６４７１２ Ａ１号；２０２０年３月１２日に公開された、「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」と題する、米国特許出願公開第２０２０／００８２９１３ Ａ１号；２０２０年２月２０日に公開された、「Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ」と題する、米国特許出願公開第２０２０／００５６２２９ Ａ１号；２０２１年４月２０日に発行された、「Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ」と題する、米国特許第１０，９８２，２６０ Ｂ２号に見出すことができ、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0114】

実施例１：メチル化された一本鎖核酸分子の検出（図４）

【0115】

核酸一本鎖ＤＮＡ分子は、以下の配列で合成された。
標的１：ビオチン－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＣＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＣＴＣＡＡＴＣＣＣＴＧＴＧＣＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴとメチル化バージョンが合成された。
標的２：ビオチン－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＣｃｃＧＣＣＡＣＣＡＴｃＧＣＣＴＣＡＡＴＣｃＣＴＧＴＧＣＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ。

【0116】

プラスチックフローセルチャンバーに取り付けられた、ストレプトアビジンでコーティングされたカバーガラスを使用して、カスタムフローセルを調製した。フローセルをＢＸ（５ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＭｇＣＬ２、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び１ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄した。１０ｐＭの標的１及び標的２をフローセルの別々のチャンバーに添加した。５分後、フローセルを１５０ｕｌのＢＸで洗浄した。ＢＸ＋Ｆ（５ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＭｇＣＬ２、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び１ｍＭのＥＤＴＡ、３０％のホルムアミド）中の５ｎＭのオリゴヌクレオチド（Ｃｙ３－ＧＧＴＡＧ、Ｃｙ３－ＧＴＡＧＣ、Ｃｙ３－ＴＡＧＣＧ、Ｃｙ３－ＡＧＧＴＡ、Ｃｙ３－ＧＧＴＧＧ、Ｃｙ３－ＣＧＧＡＧ）をそれぞれのフローセルに逐次的に添加した。オリゴヌクレオチドイメージングの間の洗浄を、１５０ｕｌのＢＸ＋Ｆで３回行った。イメージングは、フォーカスロックを有効にし、１０％レーザー（５３２ｎｍ）出力を使用して、ＴＩＲＦモードのＯＮＩ Ｎａｎｏｉｍａｇｅｒ Ｓで実行された。オリゴごとに、フレームあたり２００ｍｓ（または２５ｍｓまで低い）で合計２０００（２００、あるいは２００まで少ない、または８，０００まで多い）フレームがキャプチャされた。

【0117】

データは、ドリフト補正アルゴリズム、単一分子位置推定アルゴリズム、及び反復結合イベントの数、個別の分子それぞれの結合の暗時間及び明時間を決定するアルゴリズム（例えば、図１１の制御モジュール１９２２のモデル１９２４）を使用して処理された。標的１（非メチル化）と標的２（メチル化）を標的とするオリゴの滞留時間に関する統計を比較し、データを図３Ａ～５Ｂにまとめる。

【0118】

実施例２：ＦＦＰＥ腫瘍試料からのメチル化状態の検出

【0119】

肺癌患者からの腫瘍試料から、厚さ５ｕｍ、サービスエリア２５０ｍｍ２の８つのＦＦＰＥ切片を得た。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ＦＦＰＥ組織キットを使用してＤＮＡを単離した（製造業者の使用説明書に従う）。次いで、ＭＥ２２０ Ｆｏｃｕｓｅｄ－ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒ（Ｃｏｖａｒｉｓ）を使用してＤＮＡを約１５０ｂｐに断片化した。次いで、以下のターミナルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）反応：２００ｎｇのｃｆＤＮＡ、１×ＴｄＴ反応バッファー、４ｕＭのｄｄＡＴＰ－ビオチン、２５０ｎＭのＣｏＣｌ２、４０ＵのＴｄＴ、９０分間インキュベート、を使用してＤＮＡのビオチン標識を実行した。次いで、製造者の使用説明書に従ってＧｅｎｅＪｅｔ ＰＣＲ精製キットを使用して試料を精製した。対照オリゴヌクレオチドの独自のプールを試料にスパイクした。オリゴヌクレオチドのプールには、メチル化シトシンと非メチル化シトシンが含まれる。

【0120】

プラスチックフローセルチャンバー（Ｓｔｉｃｋｙ－Ｓｌｉｄｅ ＶＩＶ ０．４，Ｉｂｉｄｉ，Ｍａｒｔｉｎｓｔｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に取り付けられた、ストレプトアビジンでコーティングされたカバーガラス（Ｓｃｈｏｔｔ ＡＧ，Ｍａｉｎｚ Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用してカスタムフローセルを調製した。フローセルをＢＸ（５ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＭｇＣＬ２、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び１ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄した。上で説明したＴｄＴプロトコルによって調製されたビオチン標識腫瘍ＤＮＡをフローセルの単一チャネルに追加した。ＤＮＡを一本鎖にし、フローセルを洗浄するために、チャネルを、新たに調製した０．５ＭのＮａＯＨで５回洗浄（室温での１回のＮａＯＨ中２分間のインキュベーションを含む）し、その後ＢＸバッファーで４回洗浄する。ＢＸ＋Ｆ（５ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＭｇＣＬ２、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び１ｍＭのＥＤＴＡ、３０％のホルムアミド）中の５ｎＭの識別オリゴヌクレオチド（ゲノムワイド分析の場合、５ｍｅｒの完全なレパートリーからランダムに選択された最大２５０個のプローブが試験される）をそれぞれのフローセルに添加した。５Ｍｅｒの完全な１０２４個のレパートリーからのオリゴのセットを逐次的に追加した。オリゴヌクレオチドイメージングの間の洗浄を、１５０ｕｌのＢＸ＋Ｆで３回行った。イメージングは、ＯＮＩ Ｎａｎｏｉｍａｇｅｒ ＳのＴＩＲＦモードで実行された。オリゴごとに、フレームあたり２００ｍｓで合計５００フレームがキャプチャされた。分子の識別後、ＢＸ＋Ｆ（５ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＭｇＣＬ２、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び１ｍＭのＥＤＴＡ、３０％ホルムアミド）中のメチル化プローブ（表１を参照されたい）をそれぞれのフローセルに逐次的に添加した。イメージングは、フォーカスロックを有効にし、１０％レーザー（５３２ｎｍ）出力を使用して、ＴＩＲＦモードのＯＮＩ Ｎａｎｏｉｍａｇｅｒ Ｓで実行された。オリゴごとに、フレームあたり２００ｍｓで合計２０００フレームがキャプチャされた。

【0121】

データは、ドリフト補正アルゴリズム、単一分子位置推定アルゴリズム、及び反復結合イベントの数、個別の分子それぞれの結合による蛍光シグナルの暗時間及び明時間を決定するアルゴリズム（例えば、図１１の制御モジュール１９２２の１つ以上のモデル１９２４）を使用して処理された。得られた処理データは、がんデータベースを参照して分子の識別性を推定する統計アルゴリズムを使用してさらに処理され、試料ＤＮＡと対照ＤＮＡの測定された滞留時間に基づいて、シトシン、Ｃ残基を含むすべての部位のメチル化の可能性が提供される。代替として、機械学習アルゴリズムを使用して、分子をメチル化Ｃを含むか否かを分類する。

【0122】

実施例３：血漿ＤＮＡの全ゲノムメチル化アッセイ。

【0123】

血漿中の無細胞ＤＮＡのメチル化状態を検出するために、以下のステップが実行される。

【0124】

（ｉ）血液試料を遠心分離して血漿を得る。

【0125】

（ｉｉ）市販のキット（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＭａｇＭａｘ無細胞ＤＮＡ分離キット）を使用して血漿からｃｆＤＮＡを精製する（後続のステップでは、ＣｆＤＮＡはＥＤＴＡフリーのバッファー中に存在する必要がある。キットのＥＤＴＡフリーのバッファーを使用してＤＮＡを溶出するか、バッファーを交換する（例えば、ＧｅｎｅＪｅｔ ＰＣＲ精製キットなどの市販のＰＣＲ精製キットを使用する）。

【0126】

（ｉｉ）ビオチン標識を、ＤＮＡをターミナルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）及びｄｄＡＴＰビオチンとともにＴｄＴ緩衝液中でインキュベートすることによって行う。

【0127】

（ｉｖ）Ｇｅｎｅｊｅｔ ＰＣＲ精製キットなどの市販のＤＮＡ精製キットを使用して試料を精製する（ビオチン化対照ＤＮＡをこの時点でスパイクインすることも、プロセスの早い段階で非ビオチン化ＤＮＡをスパイクインすることもできる）。

【0128】

（ｖ）カスタムフローセルを、プラスチックフローセルチャンバー（Ｓｔｉｃｋｙ－Ｓｌｉｄｅ ＶＩＶ ０．４，Ｉｂｉｄｉ，Ｍａｒｔｉｎｓｔｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に取り付けられた、ストレプトアビジンでコーティングされたカバーガラス（Ｓｃｈｏｔｔ ＡＧ，Ｍａｉｎｚ Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して調製する。

【0129】

（ｖｉ）フローセルをＰＢＳ及びＢＸ緩衝液で洗浄する。

【0130】

（ｖｉｉ）上記で調製したビオチン標識ＤＮＡをフローセルの単一チャネルに添加する。４分後、フローセルを１５０ｕｌのＢｘで４回洗浄した。

【0131】

（ｖｉｉｉ）ＤＮＡを一本鎖にし、フローセルを洗浄するために、チャネルを、新たに調製した０．５ＭのＮａＯＨで５回洗浄（室温での１回のＮａＯＨ中２分間のインキュベーションを含む）し、その後ＢＸバッファーで４回洗浄する。

【0132】

（ｉｘ）フローセルを、ＯＮＩナノイメージャ上に取り付ける。

【0133】

（ｘ）チャネルを、最初のラウンドのオリゴに適したイメージングバッファーでプライミングし、その後、蛍光標識されたオリゴをチャネルに追加する。

【0134】

（ｘｉ）イメージングを、２００ｍｓフレームでＴＩＲＦモードで実行する。複数の視野をイメージングのそれぞれラウンドで収集することができる。

【0135】

（ｘｉｉ）さらなるラウンドのオリゴがフローセルを通過する。例えば、最大１０２４個の５ｍｅｒを通過させることができる。以降のオリゴのイメージングのラウンドの間に、チャネルを洗浄バッファーで２回洗浄する。

【0136】

（ｘｉｉｉ）蛍光標識オリゴの全ラウンドの後、フローセル上のそれぞれのＤＮＡ断片に結合するプローブのパターンと結合しないプローブのパターンを参照ゲノムと比較して、ゲノム内のＤＮＡの位置及び同定された断片に沿ったメチル化パターンを同定する。

【0137】

（ｘｉｖ）プローブの結合動態（例えば、明時間、暗時間、反復結合イベントの数）を使用して、それぞれの断片におけるシトシンのメチル化状態を決定する。

【0138】

以下は、メチル検出プローブの配列（ＣｐＧモチーフに結合できるプローブのすべての組み合わせ）のリストである：ＣＣＣＣＧ；ＣＣＣＧＧ；ＣＣＧＧＧ；ＣＧＣＣＣ；ＣＣＧＣＣ；ＣＣＣＧＣ；ＧＣＣＣＧ；ＣＧＧＧＧ；ＣＣＣＧＴ；ＣＧＧＣＣ；ＣＣＧＧＣ；ＧＧＣＣＧ；ＧＣＣＧＧ；ＣＣＣＧＡ；ＣＧＣＣＧ；ＣＣＧＣＧ；ＣＣＧＧＴ；ＣＣＧＧＡ；ＣＧＧＧＣ；ＧＧＧＣＧ，ＧＧＣＧＧ；ＧＣＧＧＧ；ＧＣＧＣＣ；ＧＣＣＧＣ；ＣＧＧＣＧ；ＣＧＣＧＧ；ＣＧＧＧＴ；ＣＧＣＣＡ；ＣＣＧＣＡ；ＧＣＣＧＴ；ＴＣＣＣＧ；ＣＧＧＧＡ；ＧＧＣＧＣ；ＧＣＧＧＣ；ＧＣＣＧＡ；ＡＣＣＣＧ；ＴＧＣＣＧ；ＡＧＣＣＧ；ＣＧＣＣＴ；ＣＣＧＣＴ；ＣＧＣＧＣ；ＧＣＧＣＧ；ＣＧＧＣＡ；ＧＧＣＧＴ；ＧＣＧＧＴ；ＧＧＣＧＡ；ＧＣＧＧＡ；ＴＣＣＧＧ；ＡＣＣＧＧ；ＴＧＧＣＧ；ＴＧＣＧＧ；ＣＧＣＧＴ；ＣＣＧＴＧ；ＣＧＧＣＴ；ＡＧＧＣＧ；ＡＧＣＧＧ；ＣＧＣＧＡ；ＧＣＧＣＡ；ＣＣＧＡＧ；ＴＣＧＣＣ；ＴＣＣＧＣ；ＴＣＧＧＧ；ＡＣＧＣＣ；ＡＣＣＧＣ；ＧＣＧＣＴ；ＴＧＣＧＣ；ＡＧＣＧＣ；ＣＧＧＴＧ；ＣＧＴＧＧ；ＡＣＧＧＧ；ＣＧＧＡＧ；ＣＧＡＧＧ；ＴＣＣＧＴ；ＡＣＣＧＴ；ＡＧＣＧＴ；ＴＧＣＧＴ；ＣＣＧＴＣ；ＣＧＴＣＣ；ＧＴＣＣＧ；ＴＣＧＧＣ；ＴＣＣＧＡ；ＣＧＴＧＣ；ＧＣＧＴＧ；ＧＴＧＣＧ；ＡＣＧＧＣ；ＡＣＣＧＡ；ＡＧＣＧＡ；ＣＣＡＣＧ；ＣＡＣＣＧ；ＴＧＣＧＡ；ＣＧＣＡＧ；ＣＡＧＣＧ；ＣＣＧＴＡ；ＣＣＧＡＣ；ＣＧＡＣＣ；ＣＧＡＧＣ；ＧＣＧＡＧ；ＧＡＣＣＧ；ＧＡＧＣＧ；ＴＣＧＣＧ；ＣＣＴＣＧ；ＣＴＣＣＧ；ＡＣＧＣＧ；ＴＣＧＧＴ；ＣＧＴＧＴ；ＣＧＣＴＧ；ＣＴＧＣＧ；ＡＣＧＧＴ；ＣＣＧＡＴ；ＣＧＧＴＣ；ＧＧＴＣＧ；ＧＴＣＧＧ；ＣＧＡＧＴ；ＣＧＴＧＡ；ＴＣＧＧＡ；ＡＣＧＧＡ；ＣＡＣＧＧ；ＣＧＧＴＡ；ＣＣＧＴＴ；ＣＧＴＣＧ；ＣＧＡＧＡ；ＣＧＧＡＣ；ＧＧＡＣＧ；ＧＡＣＧＧ；ＡＣＧＣＡ；ＴＣＧＣＡ；ＣＴＣＧＧ；ＧＣＧＴＣ；ＧＴＣＧＣ；ＣＧＧＡＴ；ＣＧＣＡＣ；ＣＡＣＧＣ；ＣＧＡＣＧ；ＧＣＡＣＧ；ＧＣＧＴＡ；ＡＣＧＣＴ；ＴＣＧＣＴ；ＧＴＣＧＴ；ＧＣＧＡＣ；ＧＡＣＧＣ；ＣＧＣＡＴ；ＣＧＣＴＣ；ＣＴＣＧＣ；ＧＣＴＣＧ；ＣＧＧＴＴ；ＣＡＣＧＴ；ＣＧＴＣＡ；ＧＣＧＡＴ；ＣＧＣＴＡ；ＣＣＧＡＡ；ＧＴＣＧＡ；ＧＡＣＧＴ；ＣＧＴＣＴ；ＣＴＣＧＴ；ＴＡＧＣＧ；ＣＧＡＣＡ；ＣＡＣＧＡ；ＡＴＣＣＧ；ＧＣＧＴＴ；ＴＡＣＣＧ；ＡＴＧＣＧ；ＡＧＴＣＧ；ＧＡＣＧＡ；ＡＣＧＴＧ；ＴＣＧＴＧ；ＴＧＴＣＧ；ＣＧＡＣＴ；ＣＴＣＧＡ；ＡＣＧＡＧ；ＡＧＡＣＧ；ＣＧＣＴＴ；ＣＧＴＡＧ；ＴＣＧＡＧ；ＣＧＧＡＡ；ＴＧＡＣＧ；ＡＴＣＧＧ；ＣＧＣＡＡ；ＴＡＣＧＧ；ＴＴＣＣＧ；ＴＴＧＣＧ；ＧＣＧＡＡ；ＣＧＡＴＧ；ＡＴＣＧＣ；ＴＡＣＧＣ；ＡＡＧＣＧ；ＡＣＧＴＣ；ＡＡＣＣＧ；ＣＧＴＴＧ；ＴＣＧＴＣ；ＡＴＣＧＴ；ＡＣＧＴＡ；ＴＡＣＧＴ；ＡＣＡＣＧ；ＴＣＧＴＡ；ＴＣＡＣＧ；ＣＧＴＡＣ；ＧＴＡＣＧ；ＴＴＣＧＧ；ＡＣＧＡＣ；ＣＧＴＡＴ；ＡＣＧＡＴ；ＴＣＧＡＣ；ＡＣＴＣＧ；ＡＴＣＧＡ；ＴＣＧＡＴ；ＣＡＴＣＧ；ＴＣＴＣＧ；ＴＡＣＧＡ；ＴＴＣＧＣ；ＣＧＡＴＣ；ＧＡＴＣＧ；ＡＣＧＴＴ；ＡＡＣＧＧ；ＣＧＡＡＧ；ＣＴＡＣＧ；ＣＧＡＴＡ；ＴＣＧＴＴ；ＴＴＣＧＴ；ＡＡＣＧＣ；ＣＧＴＴＣ；ＧＴＴＣＧ；ＣＧＴＴＡ；ＡＡＣＧＴ；ＴＴＣＧＡ；ＣＧＡＴＴ；ＣＴＴＣＧ；ＣＧＴＡＡ；ＣＡＡＣＧ；ＡＣＧＡＡ；ＡＡＣＧＡ；ＣＧＴＴＴ；ＣＧＡＡＴ；ＴＣＧＡＡ；ＣＧＡＡＣ；ＧＡＡＣＧ；ＡＴＡＣＧ；ＴＡＴＣＧ；ＡＴＴＣＧ；ＴＴＡＣＧ；ＣＧＡＡＡ；ＡＡＴＣＧ；ＴＡＡＣＧ；ＴＴＴＣＧ；及びＡＡＡＣＧ。

【0139】

引用された参考文献及び代替実施形態
本明細書に引用されたすべての参考文献は、あたかもそれぞれ個別の刊行物または特許または特許出願がすべての目的のためにその全体の内容が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されるのと同程度にその全体の内容がすべての目的で本明細書に参照により組み込まれる。

【0140】

本発明は、非一時的なコンピュータ可読記憶媒体に埋め込まれたコンピュータプログラム機構を含むコンピュータプログラム製品として実装することができる。例えば、コンピュータプログラム製品は、本明細書に開示され、図面に関して説明されたユーザインターフェースを操作するための使用説明書を含むことができる。これらのプログラムモジュールは、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、磁気ディスクストレージ製品、ＵＳＢキー、またはその他の非一時的なコンピュータ可読データまたはプログラムストレージ製品に保存できる。

【0141】

当業者には明らかなように、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の多くの修正及び変形をなすことができる。本明細書で説明される特定の実施形態は、例としてのみ提供される。実施形態は、本発明の原理及びその実際的な応用を最もよく説明し、それによって当業者が、本発明及び種々の変更形態を有する種々の実施形態を、意図される特定の使用に適しているとしてもっともよく利用できるようにするために、選ばれ、説明された。本発明は、添付の特許請求の範囲の項及びそのような特許請求の範囲に権利を有する均等物の全範囲によってのみ限定されるものである。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図3H】

【図3I】

【図3J】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【国際調査報告】