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特表2024-513950キャピラリー電気泳動におけるタンパク質分析のための天然蛍光検出
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-27
(54)【発明の名称】キャピラリー電気泳動におけるタンパク質分析のための天然蛍光検出
(51)【国際特許分類】
G01N 21/64 20060101AFI20240319BHJP
G01N 21/05 20060101ALI20240319BHJP
G01N 33/483 20060101ALI20240319BHJP
【ＦＩ】
G01N21/64 F
G01N21/05
G01N33/483 C
G01N33/483 F
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023562537
(86)(22)【出願日】2022-04-12
(85)【翻訳文提出日】2023-11-14
(86)【国際出願番号】 IB2022053442
(87)【国際公開番号】W WO2022219538
(87)【国際公開日】2022-10-20
(31)【優先権主張番号】63/174,897
(32)【優先日】2021-04-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/292,277
(32)【優先日】2021-12-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510075457
【氏名又は名称】ディーエイチ テクノロジーズ デベロップメント プライベート リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】デリワラ， スニール
(72)【発明者】
【氏名】リー， ティンティン
(72)【発明者】
【氏名】リウ， ヤガン
(72)【発明者】
【氏名】シルゼル， ジョン
(72)【発明者】
【氏名】ジュー， ザイファン
【テーマコード（参考）】
2G043
2G045
2G057
【Ｆターム（参考）】
2G043AA01
2G043AA04
2G043BA16
2G043CA04
2G043DA05
2G043EA01
2G043EA19
2G043HA01
2G043HA05
2G043JA03
2G043KA03
2G043KA09
2G043LA02
2G043NA01
2G045DA36
2G045FA27
2G045FA29
2G045FB05
2G045FB12
2G057AA04
2G057AB04
2G057AC01
2G057BA05
2G057BB01
(57)【要約】
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）システムを使用して試料中の標的タンパク質の濃度を決定する方法およびシステムが開示される。特定の態様において、方法は、ＣＥシステムのキャピラリーチューブを通して試料を流すことと、光源を利用して、試料中の少なくとも１つの標的タンパク質の少なくとも１つの天然蛍光体を励起するために適した少なくとも１つの励起波長を含む放射線を生成することとを含むことができる。少なくとも１つの励起波長を含む励起ビームは、少なくとも１つの天然蛍光体に蛍光放射線を生成させるために、透明部分の管腔を通過する標的タンパク質の前記少なくとも１つの天然蛍光体を励起するためにキャピラリーチューブの透明部分に向かわせられることができ、励起された標的タンパク質によって放出された蛍光放射線の少なくとも一部は、検出されることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）システムにおける試料のタンパク質分析のための方法であって、前記方法は、前記ＣＥシステムのキャピラリーチューブを通して前記試料を流すことと、
放射線を生成するために光源を利用することであって、前記放射線は、前記試料中の少なくとも１つの標的タンパク質の少なくとも１つの天然蛍光体を励起するために適した少なくとも１つの波長を含む、ことと、
前記少なくとも１つの励起波長を含む励起ビームを前記ＣＥシステムの前記キャピラリーチューブの透明部分に向かわせ、前記透明部分の管腔を通過する前記標的タンパク質の前記少なくとも１つの天然蛍光体を励起することによって、前記少なくとも１つの天然蛍光体に蛍光放射線を生成させることと、
前記励起された標的タンパク質によって放出された蛍光放射線の少なくとも一部を検出することと
を含む、方法。
【請求項2】
前記光源は、少なくとも１つの発光ダイオード（ＬＥＤ）を備えている、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記光源は、レーザー駆動光源を備えている、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記光源は、スペクトル範囲にわたる波長を有する放射線を生成し、前記励起ビームは、前記放射線の前記スペクトル範囲より狭いスペクトル帯域幅を示す、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記励起ビームを生成するために前記放射線をスペクトルフィルタリングすることをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記放射線をスペクトルフィルタリングすることは、光学バンドパスまたはショートパスフィルタを利用することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記光学バンドパスまたはショートパスフィルタは、約２００ｎｍ～約３００ｎｍの範囲内の透過帯域幅を示す、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記標的タンパク質は、抗体を備えている、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記少なくとも１つの波長は、約２８５ｎｍである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記蛍光放射線を検出器の上に集中させるためのレンズを利用することをさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記検出器から前記励起波長をフィルタリングすることをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記励起ビーム内に含まれる前記少なくとも１つの励起波長を調整することをさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
試料中の標的タンパク質の濃度を決定するためのシステムであって、前記システムは、放射線を生成するための光源と、
キャピラリー電気泳動システムのキャピラリーチューブ上に前記放射線を誘導するための光学系と
を備え
目的の試料は、前記試料中に存在する場合に少なくとも標的タンパク質を照射するために、前記キャピラリーチューブを通して流れ、
前記光源によって生成された前記放射線は、前記試料中の前記少なくとも１つの標的タンパク質の少なくとも１つの天然蛍光体を励起するために適した少なくとも１つの励起波長を含む、システム。
【請求項14】
前記光源は、少なくとも１つの発光ダイオード（ＬＥＤ）を備えている、請求項１３に記載のシステム。
【請求項15】
前記光源は、レーザー駆動光源を備えている、請求項１３に記載のシステム。
【請求項16】
前記光源は、スペクトル範囲にわたる波長を有する放射線を生成するように構成され、前記励起ビームは、前記放射線の前記スペクトル範囲より狭いスペクトル帯域幅を示す、請求項１３から１５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項17】
前記少なくとも１つの励起波長は、約２８５ｎｍである、請求項１３から１６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項18】
前記キャピラリーチューブは、放射線透明部分を備え、前記励起放射線は、前記放射線透明部分を通して前記キャピラリーチューブの中に導入されることができ、前記励起放射線に応答して前記標的タンパク質によって生成された蛍光放射線の少なくとも一部は、前記放射線透明部分を通して前記キャピラリーチューブを出ることができる、請求項１３から１６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項19】
前記キャピラリーチューブの前記透明部分に光学的に結合された検出器をさらに備え、前記検出器は、前記蛍光放射線の少なくとも一部を受け取り、前記受け取った蛍光放射線の検出に応答して１つ以上の蛍光検出信号を生成する、請求項１８に記載のシステム。
【請求項20】
前記蛍光放射線を前記検出器の上に向かわせるための光学素子をさらに備え、随意に、前記光学素子は、前記蛍光放射線を前記検出器の上に集中させるためのレンズを備え、さらに随意に、励起放射線をフィルタリング除去するために前記検出器の前に配置されたフィルタをさらに備えている、請求項１９に記載のシステム。
【請求項21】
前記検出器と通信する分析器をさらに備え、前記分析器は、前記１つ以上の検出信号を受信し、前記検出信号を処理することによって前記試料中の前記標的タンパク質の濃度を得る、請求項１９および２０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項22】
前記分析器は、前記検出された蛍光放射線の強度に基づいて前記標的タンパク質の前記濃度を決定するように構成されている、請求項２１に記載のシステム。
【請求項23】
前記光学系は、近位端から遠位端まで延びている光ファイバを備え、前記光ファイバの前記近位端は、前記光源によって放出された放射線の少なくとも一部を受け取るために前記光源に光学的に結合されている、請求項１３から２２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項24】
前記光源と前記光ファイバの前記近位端との間に配置された１つ以上のレンズをさらに備え、前記１つ以上のレンズは、記光源から放出された前記放射線を前記光ファイバの前記近位端に透過し、随意に、前記１つ以上のレンズは、前記光ファイバの前記近位端上に前記ＬＥＤの放射面を結像するためにタンデムに設置された２つの収束レンズを備えている、請求項２３に記載のシステム。
【請求項25】
前記２つの収束レンズの間に配置された光学フィルタをさらに備え、前記光学フィルタは、前記放射線の少なくとも一部を受け取り、前記試料を照射するための前記励起波長を選択し、随意に、前記光学フィルタは、光学バンドパスまたはショートパスフィルタを備え、さらに随意に、前記光学バンドパスまたはショートパスフィルタは、約２７０ｎｍ～約２９０ｎｍの範囲の透過帯域幅を示す、請求項２４に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願）
本出願は、２０２１年４月１４日に出願された米国仮出願第６３／１７４，８９７号、および２０２１年１２月２１日に出願された米国仮出願第６３／２９２，２７７号の優先権を主張し、それらの内容全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年４月１４日に出願された米国仮出願第６３／１７４，８９７号、および２０２１年１２月２１日に出願された米国仮出願第６３／２９２，２７７号の優先権を主張し、それらの内容全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
（技術分野）
本開示は、一般に、試料中の１つ以上の標的タンパク質の定量化のためのシステムおよび方法に関し、特に、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）システムのキャピラリーチューブ内に含まれる標的試料について高い感度および選択性を提供することができるような定量化システムおよび方法に関する。
本開示は、一般に、試料中の１つ以上の標的タンパク質の定量化のためのシステムおよび方法に関し、特に、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）システムのキャピラリーチューブ内に含まれる標的試料について高い感度および選択性を提供することができるような定量化システムおよび方法に関する。
【背景技術】
【0003】
過去２０年間にわたって、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、バイオ医薬品および生体分子分析のための成熟した分離技術に発展してきた。バイオ医薬品産業では、ＣＥベースの技術（キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ）およびキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）を含む）が、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の分析的特徴づけおよび品質管理を支援するために、ゲルベースの電気泳動技術に取って代わりつつある。
【0004】
ＣＥでは、高い電界強度が適用されることができる細いキャピラリーチューブの使用が、最小限の試料体積を使用した非常に効率的な分離を可能にする環境を提供する。しかしながら、小さいキャピラリー内径は、それらが短い光路長を呈し、したがって、多くの分析物に対して（特に低濃度で存在する分析物に対して）十分な感度を達成するために、大きい試料負荷を必要とするという点で検出課題を引き起こし得る。
【0005】
ＵＶ吸光度検出は、ＣＥにおいて最も広く使用されている技術であり、２～３桁の線形ダイナミックレンジを達成することが示されている。しかしながら、その濃度感度は、多くの用途で必要とされるそれより低くあり得る。
【0006】
レーザー誘起蛍光（ＬＩＦ）検出は、濃度感度を改善し、線形ダイナミックレンジを拡大する試みでよく使用される。しかしながら、市販の励起源は、一般に可視波長範囲で発光し、この範囲では、タンパク質は、本質的に蛍光性ではない。このＬＩＦ検出の課題を回避するために、蛍光体誘導体化が使用されているが、さらなる問題を引き起こし得る。
【0007】
例えば、タンパク質上の標識部位は異なる反応性を有し、標識反応は、常、異なって標識されたタンパク質の混合物を生成し、ピークの広がりまたは分裂のみならず、定量化課題をもたらす。さらに、蛍光色素でタンパク質を標識すると、タンパク質の正味電荷における変化につながり、その結果、タンパク質の等電点（ｐＩ）を変化させ、天然状態と比較してタンパク質の特性における全体的変化をもたらし得る。
【0008】
ＵＶおよびＬＩＦ検出モダリティによってもたらされる課題を回避するための努力において、研究者らは、特定のアミノ酸からの固有の蛍光放出を利用してタンパク質の検出および定量化を容易にするために、励起源として深ＵＶレーザーを使用してきた。タンパク質の天然蛍光検出（ＮＦＤ）は、５１４ｎｍのアルゴン－イオンレーザー生成放射線の周波数倍増によって生成された２５７ｎｍ励起放射線を使用して最初に報告された。データは内径５０μｍのキャピラリーを用いて取得され、コンカルアルブミンに関して１４ｎＭの検出限界（ＬＯＤ）を達成した。
【0009】
同じタンパク質の検出感度が、水冷アルゴン－イオンレーザーから単離された２７５．４ｎｍレーザーラインを使用して、改善された。ＮＤ：ＹＡＧ（２６６ｎｍ）、ＫｒＦ（２４８ｎｍ）、Ｈｅ－Ａｇ（２２４ｎｍ）レーザーを含むパルスレーザーも、ＮＦＤの励起源として評価された。これらのレーザーは、比較的費用対効果が高いが、そのようなレーザーを使用して達成することができる濃度感度は、好ましくない励起波長およびパルス間変動に起因して、ＵＶアルゴン－イオンレーザーを使用して達成可能な濃度感度より低い。
【0010】
キセノンランプおよび重水素ランプなどのランプは、深ＵＶ領域で連続スペクトルを提供し、したがって、ＮＦＤのための励起波長における柔軟性を可能にする。しかしながら、従来のランプは、低い放射出力の発散光を放出し、ＣＥにおける蛍光検出のための十分なエネルギーを送達するための課題を提示する。検出を改善するために、ランプベースの蛍光検出システムが導入されており、ランプベースの蛍光検出システムにおいて、水銀－キセノンランプからの光は、フィルタリングされ、続いて、ボールレンズを使用して検出セルに集中させられるために、光ファイバを介してキャピラリーに向かわせられる。放出された蛍光は、全内部反射によってキャピラリーに沿って細胞の端部に配置された光電子増倍管（ＰＭＴ）に導かれる。この検出システムは、様々な化合物の分析のための市販のＣＥ機器に適合するのに成功した。結果は、トリプトファンの分析のためのＬＯＤが６．７ｎＭであり、２１４ｎｍでの吸光度検出を介して得られた感度より２０倍大きいことを示した。タンパク質分析では、ＬＯＤは１０～２０ｎＭの範囲にあり、２８０ｎｍでの吸光度検出より２５倍感度が高く、２１４ｎｍでの吸光度検出に匹敵した。このシステムのＰＭＴを電荷結合デバイスで置き換えることは、このシステムを波長分解能型蛍光検出器に変えることができ、それは、タンパク質のコンフォメーション変化を調べることができる。
【0011】
従来のアプローチと比較してより高い感度および柔軟な励起波長を提供するＮＦＤを使用したタンパク質試料の定量化が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0012】
本教示の様々な態様において、試料中の標的タンパク質の濃度を決定するためのシステムが提供され、このシステムは、放射線を生成するための光源と、試料中に存在する場合に少なくとも標的タンパク質を照射するために、目的の試料が流れるキャピラリー電気泳動（ＣＥ）システムのキャピラリーチューブ上に放射線を導くための光学系とを含む。光源によって生成された放射線は、試料中の前記少なくとも１つの標的タンパク質の少なくとも１つの天然蛍光体を励起するために適した少なくとも１つの励起波長を含むことができる。
【0013】
様々な光源が、本教示に従って使用されることができる。例えば、いくつかの態様において、光源は、少なくとも１つの発光ダイオードを備えていることができる。代替的に、いくつかの態様において、光源は、レーザー駆動光源を備えていることができる。様々な態様において、光源は、スペクトル範囲にわたる波長を有する放射線を生成することができ、励起ビームは、放射線のスペクトル範囲より狭いスペクトル帯域幅を示すことができる。特定の態様において、少なくとも１つの励起波長は、約２８５ｎｍであり得る。
【0014】
様々な態様において、キャピラリーチューブは、放射線透明部分を備えていることができ、放射線透明部分を通して、励起放射線が、キャピラリーチューブに導入されることができ、かつ励起放射線に応答して前記標的タンパク質によって生成された蛍光放射線の少なくとも一部が、キャピラリーチューブを出ることができる。さらに、いくつかの態様において、システムは、蛍光放射線の少なくとも一部を受け取り、前記受け取った蛍光放射線の検出に応答して１つ以上の蛍光検出信号を生成するために、キャピラリーチューブの透明部分に光学的に結合された検出器をさらに備えていることができる。いくつかの関連する態様において、分析器は、検出信号を受信し、検出信号を処理して前記試料中の前記標的タンパク質の濃度を得るために、検出器と通信することができる。例えば、分析器は、前記蛍光放射線の強度に基づいて標的タンパク質の濃度を決定するように構成されることができる。いくつかの態様において、光学素子が、蛍光放射線を検出器の上に向かわせるために設けられることができ、随時、光学素子は、蛍光放射線を検出器の上に集中させるためのレンズを備えていることができ、さらに随時、フィルタが、励起放射線をフィルタリング除去するために、検出器の前に配置されることができる。
【0015】
様々な態様において、光学系は、近位端から遠位端まで延びている光ファイバを備えていることができ、光ファイバの近位端は、光源によって放出された放射線の少なくとも一部を受け取るために光源に光学的に結合される。いくつかの関連する態様において、システムは、光源から放出された放射線を光ファイバの近位端に透過するために光源と光ファイバの近位端との間に配置された１つ以上のレンズをさらに備えていることができ、随時、いくつかの態様において、１つ以上のレンズは、光ファイバの近位端上にＬＥＤの放射面を結像するためにタンデムに設置された２つの収束レンズを備えていることができる。いくつかの追加の関連する態様において、システムは、放射線の少なくとも一部を受け取り、試料を照射するための励起波長を選択するために、２つの収束レンズの間に配置された光学フィルタをさらに備えていることができる。例えば、光学フィルタは、随時、光学バンドパスまたはショートパスフィルタを備えていることができ、さらに随時、光学バンドパスまたはショートパスフィルタは、約２７０ｎｍ～約２９０ｎｍの範囲の透過帯域幅を示すことができる。
【0016】
一態様において、放射線を生成するためのレーザー駆動光源と、試料中の少なくとも１つの標的タンパク質を照射するために、目的の試料が流れることができるキャピラリー電気泳動システムのキャピラリーチューブ上に放射線を導くための光学系とを含む試料中の標的タンパク質の濃度を決定するためのシステムが開示され、放射線源によって生成された放射線は、試料中の少なくとも１つの標的タンパク質の少なくとも１つの天然蛍光体を励起するために適した少なくとも１つの励起波長を備えている。
【0017】
いくつかの実施形態において、レーザー駆動光源によって生成された放射線は、励起波長を含む連続スペクトル範囲にわたって延びている波長を含む。いくつかのそのような実施形態において、連続スペクトル範囲は、約１７０ｎｍ～約２１００ｎｍに及ぶことができる。
【0018】
システムは、光源によって生成された放射線の少なくとも一部を受け取り、試料を照射するための励起波長を選択するために、レーザー駆動光源に対して配置された光学フィルタをさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、光学フィルタは光学バンドパスフィルタであり得る。いくつかのそのような実施形態において、光学バンドパスフィルタは、励起波長を中心にし得る約５ｎｍ～約５０ｎｍの範囲の透過帯域幅を示す。
【0019】
キャピラリーチューブは、放射線透過部分（本明細書では透明または放射線透明部分とも呼ばれる）、例えば、ガラスまたは他の適切な材料で作製された部分を含むことができ、それを通して、励起放射線は、キャピラリーチューブに導入され、少なくとも１つの目的の標的タンパク質を励起することができ、それを通して、励起されたタンパク質によって放出された蛍光放射線は、キャピラリーチューブを出、下流の検出器によって検出されることができる。より具体的に、検出器は、蛍光放射線の少なくとも一部を受け取り、受け取った蛍光放射線の検出に応答して１つ以上の検出信号を生成するために、キャピラリーチューブの放射透過部分の裏面に光学的に結合することができる。
【0020】
いくつかの実施形態において、光学部品、例えば球面ミラーが、キャピラリーチューブ（すなわち、励起光を受ける部分）の前部（本明細書では「前窓」とも呼ばれる）を通って出る蛍光放射線の少なくとも一部を捕捉し、捕捉された放射線またはその少なくとも一部を反射してキャピラリーチューブに戻すために、キャピラリーチューブの透明部分に光学的に結合され、それによって、反射された放射線またはその少なくとも一部は、キャピラリーチューブの裏面を通って出、検出器によって検出される。いくつかのそのような実施形態において、球面ミラーは、曲率半径を有することができ、球面ミラーによって反射された放射線がキャピラリーチューブの中央部分に位置する焦点に集中させられるように、キャピラリーチューブの透明部分に対して位置することができる。次いで、戻された蛍光放射線は、その焦点から発散してキャピラリーチューブを出ることができる。
【0021】
検出器と通信する分析器は、検出器によって生成された検出信号を受信することができ、検出信号を処理して試料中の標的タンパク質の濃度を計算することができる。例として、分析器は、検出された蛍光放射線の強度に基づいて標的タンパク質の濃度を計算するように構成されることができる。
【0022】
上述したように、レーザー駆動放射線源は、連続スペクトル範囲にわたる波長を有する放射線（本明細書では、放射線の波長は真空波長を指す）を生成することができる。これは、目的の標的タンパク質を励起するために、源によって放出される放射線のスペクトル範囲に存在する波長の中からの所望の励起波長の選択を可能にする。いくつかの実施形態において、異なる透過帯域幅を示す複数の光学フィルタが取り付けられたデバイス、例えばフィルタホイールが、異なる励起波長を選択するために、例えば異なる標的タンパク質を検出するために励起放射線の経路に配置された光学フィルタを切り替えるために使用されることができる。いくつかの実施形態において、励起波長は、例えば、約２００～約３００ｎｍの範囲内であり得る。
【0023】
いくつかの実施形態において、近位端から遠位端まで延びている光ファイバは、光ファイバがその近位端を介してフィルタを通過する励起放射線の少なくとも一部を受け取り、受け取った放射線の少なくとも一部をその遠位端を介してキャピラリーチューブ上に透過して、試料中に存在するか、または試料中に存在すると疑われる少なくとも１つの標的タンパク質を励起するように、光学フィルタおよびキャピラリーチューブに対して配置される。
【0024】
いくつかの実施形態において、励起放射線の少なくとも一部を光ファイバの近位端に向かわせるように構成された光学系は、放射線を光ファイバに集中させるための１つ以上のレンズを含むことができる。いくつかの実施形態において、そのようなレンズは、タンデムに設置された２つの収束レンズを含むことができる。例えば、２つのレンズは、第１のレンズが入射放射線を実質的にコリメートし、第２のレンズが実質的にコリメートされた放射線を光ファイバの近位端に集中させるように構成されることができる。いくつかのそのような実施形態において、光学フィルタが、目的の励起波長を選択するために、２つのレンズの間に配置されることができる。
【0025】
いくつかの実施形態において、そのようなレンズのｆ数は、光ファイバ（すなわち、光ファイバの近位端）上に集中させられる放射線に関連する収束角が光ファイバの開口数に実質的に等いように選択されることができる。
【0026】
いくつかの実施形態において、システムは、放射線の少なくとも一部を受け取り、試料を照射するための励起波長を選択するために、第１のレンズと第２のレンズとの間に配置された光学フィルタをさらに含むことができる。いくつかのそのような実施形態において、光学フィルタは、光学バンドパスまたはショートパスフィルタを含む。例として、光学バンドパスまたはショートパスフィルタは、約２００ｎｍ～約３００ｎｍの範囲の透過帯域幅を示すことができる。
【0027】
いくつかの実施形態において、レーザー駆動光源は、約０．５～約２００ｍＷ／ｍｍ２．ｓｒ．ｎｍの範囲の放射輝度を有する放射線を生成することができる。例として、いくつかのそのような実施形態において、約２００ｎｍ～約３００ｎｍの真空波長範囲内の放出された放射線の放射輝度は、５～約２００ｍＷ／ｍｍ２．ｓｒ．ｎｍの範囲内であることができる。
【0028】
いくつかの実施形態において、キャピラリーチューブは、約１０μｍ～約２００μｍの範囲、例えば約２０μｍ～約１００μｍの範囲の内径を有することができる。
【0029】
関連する態様において、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）システムにおける試料のタンパク質分析のための方法が開示され、方法は、ＣＥシステムのキャピラリーチューブを通して試料を流すことと、試料中の少なくとも１つの標的タンパク質を励起するために適した少なくとも１つの波長を含むスペクトル範囲にわたって広がる波長を有する放射線を生成するためにレーザー駆動光源を利用することと、励起波長を選択するために放射線をスペクトルフィルタリングすることにより、レーザー駆動放射線源によって生成された放射線のスペクトル範囲より狭く、少なくとも１つの目的の標的タンパク質を励起するために適した少なくとも１つの励起波長を含むスペクトル帯域幅を有する励起ビームを生成することとを含む。励起ビームは、蛍光体に蛍光放射線を生成させ、励起された標的タンパク質によって放出された蛍光放射線の少なくとも一部を検出するために、キャピラリーチューブの透明部分の管腔を通過する標的タンパク質の少なくとも１つの天然蛍光体を励起するように、キャピラリー電気泳動システムのキャピラリーチューブに、その透明部分を介して（例えば、放射線透過窓を介して）向かわせられる。
【0030】
放出された蛍光放射線は、キャピラリーチューブを出る蛍光放射線の少なくとも一部は、例えば、その透明部分を介して（例えば、放射線透過窓を介して）、蛍光放射線の検出に応答して１つ以上の検出信号を生成する検出器上に向けられることによって検出されることができる。
【0031】
いくつかの実施形態において、複数の異なるタンパク質によって放出された蛍光放射線は、電場の影響下で、キャピラリーチューブの入口からチューブの透明部分までのそれらのタンパク質の移動時間の関数として検出される。いくつかのそのような実施形態において、キャピラリーチューブの入口とその透明部分との間の距離は、例えば、励起放射線を介した調査のために目的の異なるタンパク質を分離することにおいてより良好な分解能を可能にするように、例えば約５ｃｍ～約１００ｃｍの近接範囲内であることができる。
【0032】
いくつかの実施形態において、レーザー駆動放射線源によって放出された放射線は、放射線に存在する波長のスペクトル範囲を狭くし、その一方、この狭いスペクトル範囲が目的の励起波長を確実に含むようにするために、放射線を光学フィルタ、例えば光学バンドパスまたはショートパスフィルタに通すことによってスペクトルフィルタリングされることができる。
【0033】
励起されたタンパク質によって放出された蛍光放射線は、研究中の試料中のタンパク質の濃度を決定するために分析されることができる。例えば、目的のタンパク質の濃度は、検出された蛍光放射線の強度および／または蛍光ピークの下の面積に基づいて決定されることができる。
【0034】
いくつかの実施形態において、上記の試料分析方法では、光ファイバが、励起放射線をキャピラリーチューブに（すなわち、キャピラリーチューブの透明部分の上に）向かわせるために利用される。そのような実施形態において、励起放射線は、光ファイバの近位端に結合することができる。光ファイバは、受け取った放射線をその遠位端に透過することができる。光ファイバの遠位端は、キャピラリーチューブの透明部分に光学的に結合され、それによって、光ファイバの遠位端を出る放射線の少なくとも一部は、チューブの透明部分の管腔を通って流れる少なくとも１つのタンパク質を励起するために、キャピラリーチューブにその透明部分を介して導入され得る。
【0035】
いくつかの実施形態において、レーザー駆動光源によって放出される放射線のスペクトル範囲は、例えば、約１７０ｎｍ～約２１００ｎｍに及ぶことができる。さらに、いくつかの実施形態において、１つ以上の標的タンパク質を励起するための励起波長は、約２００ｎｍ～約３００ｎｍに及ぶことができる。
【0036】
関連する態様において、試料中の標的タンパク質の濃度を決定するためのシステムが開示され、システムは、放射線を生成するためのＬＥＤ光源と；近位端から遠位端まで延びている光ファイバであって、光ファイバの近位端はＬＥＤ光源によって放出された放射線の少なくとも一部を受け取るためにＬＥＤ光源に光学的に結合される、光ファイバと；目的の試料が流れるキャピラリー電気泳動システムのキャピラリーチューブであって、光ファイバの遠位端は、キャピラリーチューブを通って流れる試料中の少なくとも１つの標的タンパク質を照射するためにキャピラリーチューブの一部と光学的に結合する、キャピラリーチューブとを含む。ＬＥＤ光源によって生成された放射線は、試料中の少なくとも１つの標的タンパク質の少なくとも１つの天然蛍光体を励起するために適した少なくとも１つの励起波長を含む。
【0037】
いくつかの実施形態において、ＬＥＤ光源によって生成された放射線は、電磁スペクトルのＵＶ範囲内の実質的に単色の波長を有する。例として、実質的に単色の波長は約２８５ｎｍであり得る。
【0038】
いくつかの実施形態において、ＬＥＤ光源は、約５０μＷ～約１０ｍＷの範囲の光出力を提供する。
【0039】
いくつかの実施形態において、キャピラリーチューブは、放射線透明部分を備え、放射線透明部分を通して、励起放射線をキャピラリーチューブに導入することができ、かつ励起放射線に応答して標的タンパク質によって生成された蛍光放射線の少なくとも一部が、キャピラリーチューブを出ることができる。
【0040】
いくつかの実施形態において、システムは、蛍光放射線の少なくとも一部を受け取り、受け取った蛍光放射線の検出に応答して１つ以上の蛍光検出信号を生成するために、キャピラリーチューブの透明部分に光学的に結合された検出器をさらに含むことができる。いくつかのそのような実施形態において、光学素子が、蛍光放射線を検出器に向かわせるためにさらに含まれることができる。いくつかのそのような実施形態において、光学素子は、蛍光放射線を検出器の上に集中させるためのレンズを備えている。いくつかの実施形態において、フィルタが、励起放射線をフィルタリング除去するために検出器の前に配置されることができる。
【0041】
システムは、ＬＥＤ光源から放出された放射線を光ファイバの近位端に透過するためにＬＥＤ光源と光ファイバの近位端との間に配置された光学系をさらに含むことができる。いくつかのそのような実施形態において、光学系は、放射線を光ファイバの近位端に透過するための１つ以上のレンズを備えている。１つ以上のレンズは、ＬＥＤの放出面を光ファイバの近位端に結像するようにタンデムに設置された２つの収束レンズを含むことができる。いくつかの実施形態において、１つ以上のレンズは、第１のレンズおよび第２のレンズを含み、第１のレンズは、ＬＥＤ光源によって生成された放射線を実質的にコリメートするようにＬＥＤ光源に対して構成および配置され、第２のレンズは、コリメートされた放射線を光ファイバの近位端に集中させるように第１のレンズに対して構成および配置される。
【0042】
いくつかの実施形態において、光学フィルタは、放射線の少なくとも一部を受け取り、試料を照射するための励起波長を選択するために、第１のレンズと第２のレンズとの間に配置されることができる。いくつかの実施形態において、光学フィルタは、光学バンドパスまたはショートパスフィルタを備えている。例として、光学バンドパスまたはショートパスフィルタは、約２７０ｎｍ～約２９０ｎｍの範囲の透過帯域幅を示すことができる。
【0043】
本教示の様々な態様に従って、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）システムでタンパク質分析を実行する方法が開示される。例えば、タンパク質分析のための方法は、ＣＥシステムのキャピラリーチューブを通して試料を流すことと、試料中の少なくとも１つの標的タンパク質の少なくとも１つの天然蛍光体を励起するために適した少なくとも１つの励起波長を含む放射線を生成するための光源を利用することとを含み得る。少なくとも１つの励起波長を含む励起ビームは、透明部分の管腔を通過する標的タンパク質の少なくとも１つの天然蛍光体を励起して、少なくとも１つの天然蛍光体に蛍光放射線を生成するように、ＣＥシステムのキャピラリーチューブの透明部分に向かわせられることができる。励起された標的タンパク質によって放出された蛍光放射線の少なくとも一部が、検出されることができる。
【0044】
本教示に従って様々な光源を使用することができる。例えば、いくつかの態様において、光源は、少なくとも１つの発光ダイオードを備えていることができる。代替的に、いくつかの態様において、光源は、レーザー駆動光源を備えていることができる。様々な態様において、光源は、スペクトル範囲にわたる波長を有する放射線を生成することができ、励起ビームは、放射線のスペクトル範囲より狭いスペクトル帯域幅を示すことができる。いくつかの関連する態様において、方法は、励起ビームを生成するために放射線をスペクトルフィルタリングすることをさらに含むことができる。例えば、光学バンドパスまたはショートパスフィルタが、放射線をスペクトルフィルタリングするために利用されることができる。いくつかの関連する態様において、光学バンドパスまたはショートパスフィルタは、約２００ｎｍ～約３００ｎｍの範囲の透過帯域幅を示すことができる。
【0045】
様々な態様において、標的タンパク質は抗体を備え得る。
【0046】
様々な態様において、少なくとも１つの励起波長は、約２８５ｎｍであり得る。追加的または代替的に、いくつかの態様において、方法は、励起ビーム内に含まれる少なくとも１つの励起波長を調整することを含むことができる。
【0047】
特定の態様において、本教示による方法は、蛍光放射線を検出器の上に集中させるためのレンズを利用することができる。いくつかの関連する態様において、方法は、検出器から励起波長をフィルタリングすることをさらに含むことができる。
【0048】
本教示の様々な態様のさらなる理解は、以下で簡単に説明される関連する図面と併せて以下の詳細な説明を参照することによって得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【0049】
【0050】
【0051】
【0052】
【0053】
【0054】
【0055】
【0056】
【0057】
【0058】
【0059】
【0060】
【0061】
【0062】
【0063】
【0064】
【0065】
【発明を実施するための形態】
【0066】
本開示は、深ＵＶレーザーを必要とせずに、様々な試料の電気泳動分析におけるタンパク質定量化に使用することができるシステムおよび方法に関する。以下でより詳細に説明するように、多くの実施形態において、本教示によるシステムおよび方法は、２１４ｎｍでの現在のＵＶ吸光度検出技術によって示される感度より少なくとも１０倍高い感度でＮＦＤを実行することを可能にする。さらに、本教示のシステムおよび方法は、励起波長を調整することを可能にし、それは、特定の標的タンパク質のための励起波長を最適化することができる。したがって、高感度に加えて、多くの実施形態において、本教示によるシステムおよび方法は、励起波長の柔軟な選択を可能にする。例えば、多くの実施形態において、励起波長は、検出感度を低下させることなく、バンドパスまたはショートパスフィルタを異なるフィルタまたはモノクロメータに置き換えることによって調整されることができる。例として、励起波長を調整する能力は、量子収率を最適化するために有利に使用されることができるか、または、波長分解能型蛍光検出を実行するために使用されることができる。
【0067】
本明細書では、様々な用語が、当技術分野におけるそれらの通常の意味に従って使用される。本明細書で使用される「レーザー駆動光源」という用語は、連続スペクトル領域に及ぶ波長を有する放射線（例えば、約２００ｎｍ～約３００ｎｍの範囲の波長を有する深ＵＶ放射線）を生成するために、ガスプラズマを高温に加熱するためのレーザー放射線を提供するレーザーを含む放射線源を指す。
【0068】
本明細書で使用される「約」という用語は、数値の周りで最大１０％の変動を示すことを意図している。
【0069】
本明細書で使用される「実質的に」という用語は、存在する場合、最大で１０％、または最大で５％の完全な状態および／または条件からの逸脱を示す。
【0070】
「光」および「放射線」という用語は、本明細書では、可視光だけでなく、より一般的に、電磁スペクトルの他の領域の放射線（ＵＶ放射線を含む）を指すために互換的に使用される。
【0071】
本明細書で使用される「放射輝度」という用語は、放射線源の単位面積によって所与の方向に単位立体角当たりに放出される放射線束として定義される。
【0072】
「透明」、「放射線透過性」という用語および同様の用語は、本明細書では、材料構造を通って入射する放射線の少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％または１００％の通過を可能にする材料構造（例えばＣＥキャピラリーチューブの壁）の特性を示すために使用される。
【0073】
図１Ａおよび図１Ｂを参照すると、ＣＥシステムのキャピラリーチューブを通って流れる試料中の１つ以上の標的タンパク質をレーザー誘起蛍光測定によって定量化するための本教示の一実施形態によるシステム１００は、約１７０ｎｍ～約２１００ｎｍに及ぶスペクトル真空波長範囲にわたって放射線を放出することができる放射線源１を含む。この実施形態において、放射線源は、約２００ｎｍ～約３００ｎｍの範囲にわたる真空波長を有する放射線を放出することができ、この範囲にわたる放射輝度は、この範囲にわたる従来のＵＶランプによって示される放射輝度より少なくとも１０倍高い。例として、放射線源１は、約２００ｎｍ～約３００ｎｍのスペクトル波長範囲にわたって、約５～２００ｍＷ／ｍｍ２．ｓｒ．ｎｍの範囲の放射輝度で放射線を放出することができる。例として、いくつかの実施形態において、ＬＤＬＳ（登録商標）の商標名でマサチューセッツ州ウィルミントンのＥｎｅｒｇｅｔｉｑ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．によって販売されている放射線源が、使用することができ、それは、レーザーを使用してキセノンプラズマを深ＵＶ放射線の生成に必要な高温に直接加熱する。
【0074】
本明細書でさらに説明するように、そのような放射線源は、ＣＥシステムでタンパク質のＮＦＤ分析を実行することにおいて特に有用であり得ることが発見された。
【0075】
この実施形態において、放射線源１によって放出された放射線は、平凸レンズ２によって受け取られ、平凸レンズ２は、その焦点距離だけ放射線源から分離され、放射線を実質的にコリメートする。以下にさらに説明するように、バンドパスまたはショートパスフィルタ３は、研究中の試料に含まれるか、または試料に含まれると疑われる少なくとも１つの標的タンパク質の少なくとも１つの天然蛍光体を励起するために適した少なくとも１つの波長を含む放射線帯域幅を有する励起ビームを生成するように、放出された放射線のスペクトル範囲の一部を選択する。この実施形態において、光学フィルタ３はレンズ２とレンズ４との間に設置されているが、他の実施形態において、光学フィルタは、キャピラリー内の試料への放射線の伝播経路に沿って他の位置に設置され得る。
【0076】
別の平凸レンズ４が、フィルタリングされた放射線を光ファイバ５の近位端（ＰＥ）に集中させる。この実施形態において、レンズ２および４のｆ数は、光ファイバ５の近位端に集中させられる光が光ファイバへの放射線の結合を最適化するように光ファイバの開口数に実質的に等しい収束角を有するように、選択される。
【0077】
光ファイバ５は、受け取った放射線をその近位端（ＰＥ）からその遠位端（ＤＥ）に透過する。光ファイバの遠位端（ＤＥ）は、キャピラリーチューブ７の透明部分７ａ、すなわち試料が流れることができるキャピラリーチューブの透明壁を有する部分に光学的に結合されている。透明部分７ａは、窓を提供し、光ファイバ５の遠位端から出る励起放射線は、その窓を通してキャピラリーチューブ７に導入され、試料がキャピラリーチューブの透明部分の管腔を通って流れているとき、少なくとも１つの標的タンパク質（試料中に存在する場合）を励起することができる。言い換えると、キャピラリーチューブの透明壁の前部、すなわち光ファイバの遠位端に面する部分は、励起放射線がキャピラリーチューブに入ることができる窓として機能することができる。
【0078】
励起放射線による照射に応答して、標的タンパク質の１つ以上の天然蛍光体は、蛍光放射線を放出することができる。タンパク質の天然蛍光は、３つのアミノ酸：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンの励起に由来する。フェニルアラニンに関連付けられた蛍光放出強度は、チロシンまたはトリプトファンの蛍光放出強度の約５０分の１であり、タンパク質の天然蛍光検出では一般に無視できることが知られている。ほとんどのタンパク質では、天然蛍光は主にトリプトファン残基による蛍光に起因するが、いくつかのタンパク質はチロシン蛍光を示し得る。
【0079】
局所環境に敏感であるが、トリプトファンの発光ピークは、典型的に３５０ｎｍ付近である。いくつかの実施形態において、フィルタ３は、標的タンパク質中のトリプトファンアミノ酸を励起するために２８０ｎｍの波長を有する放射線を通過させるように構成することができる。いくつかのそのような実施形態において、励起されたトリプトファンアミノ酸によって放出された蛍光放射線は、研究中の試料中の標的タンパク質の濃度を決定するために、例えば以下に説明する方法で、収集され、分析されることができる。
【0080】
より具体的に、引き続き図１Ａを参照すると、この実施形態において、放出された蛍光放射線は、キャピラリーチューブの透明部分７ａの壁を通ってキャピラリーチューブから出ることができる。放出された蛍光放射線の一部は、透明部分７ａの後部７ａａを介してキャピラリーチューブを出る一方、蛍光放射線の一部は、透明部分７ａの前部７ｂｂを介してキャピラリーチューブを出る。
【0081】
この実施形態において、キャピラリーチューブ７の透明部分７ａの近くに配置された球面ミラー６が、キャピラリーチューブを出る蛍光放射線の少なくとも一部を捕捉し、捕捉した蛍光放射線（またはその少なくとも一部）を反射してキャピラリーチューブに戻し、それによって、反射された蛍光放射線（またはその少なくとも一部）は、透明部分７ａの後部７ａａを通って出る。
【0082】
平凸レンズ８が、キャピラリーチューブ７の透明部分７ａに光学的に結合され、キャピラリーチューブを出る蛍光放射線（またはその少なくとも一部）を受け取り、蛍光放射線をコリメートして実質的にコリメートされた蛍光放射ビーム１１を生成する。蛍光放射ビーム１１はバンドパスフィルタ９を通過し、検出器１０によって受け取られる。
【0083】
例として、バンドパスフィルタは、蛍光放射線の透過を可能にし、その一方、他の波長の放射線の通過を遮断し、または低減させる。例として、いくつかの実施形態において、バンドパスフィルタは、励起された標的タンパク質によって放出された蛍光放射線がその最大強度を示す波長に中心を置かれた透過帯域幅を有することができ、例えば、約５ｎｍ～約５０ｎｍに及ぶ透過帯域幅を有することができる。
【0084】
この実施形態において、検出器１０は、光電子増倍管、例えば、Ｈａｍａｍａｔｓｕによって市販されている光電子増倍管（Ｒ５９８４）である。検出器１０は、蛍光放射線の検出に応答して、１つ以上の検出信号を生成する。分析器２０（本明細書では分析モジュールとも呼ばれる）は、検出器１０によって生成された検出信号を受信し、調査中の試料中の目的の標的タンパク質の濃度を計算するために、それらの信号に基づいて動作する。分析器２０は、本教示によって知らされるような当技術分野で公知の方法でソフトウェア／ファームウェア／ハードウェアにおいて実装されることができる。いくつかの実施形態において、蛍光データの分析のための命令は、分析器の永続メモリに記憶されることができ、分析器のプロセッサによる実行中、実行されるように一過性メモリモジュールに転送されることができる。
【0085】
例として、特定の濃度範囲（「線形ダイナミックレンジ」）では、タンパク質濃度はタンパク質ＵＶ吸光度ピークの面積に比例する。ある場合、例えば、較正曲線をが、５つ以上の異なる濃度のタンパク質を用いて、その範囲わたって確立されることができる。次いで、標的タンパク質の濃度は、ＵＶ吸光度ピーク面積および較正曲線を使用して計算されることができる。
【0086】
本教示は、トリプトファン残基の励起を介して標的タンパク質の濃度を決定することに限定されないことを理解されたい。例えば、いくつかの実施形態において、例えば標的タンパク質が適切な濃度のトリプトファン残基を欠く場合、システムの励起波長は、チロシン蛍光を検出するように調整されることができる。
【0087】
特に図１Ｂを参照すると、高電圧源３０は、キャピラリーチューブ７の両端に高電圧を印加してキャピラリーチューブを通る電界を生成し、次いで、電界は、調査中の試料中に存在する異なるタンパク質に（例えばそれらの移動度の差に起因して）異なる速度でチューブを通って移動させることができる。タンパク質の移動度の差は、それらの電荷の差に少なくとも部分的に起因し得る。結果として、キャピラリーチューブ７の入口７ｂからキャピラリーチューブ７に導入された標的タンパク質を含む試料が電界の影響を受けて出口７ｃに流れると、異なるタンパク質は、移動度の違いにより、キャピラリーチューブの透明部分に異なるタイミングで到達する。次いで、各標的タンパク質の少なくとも１つの天然蛍光体の励起は、例えば本明細書で説明する方法で、ＮＦＤを介したそのタンパク質の定量化を可能にすることにより、試料中の様々なタンパク質の定量化を可能にする。
【0088】
図１Ｃに概略的に示すように、いくつかの実施形態において、複数の異なる光学フィルタ３１、３２、３３、および３４を含むカートリッジ３０が、放出された放射線の経路に設置されることができ、各光学フィルタは、異なる光学バンドパスを示す。カートリッジは、複数の標的タンパク質の異なる蛍光体を励起するための異なる励起波長の選択を可能にする。同様に、複数の光学フィルタを含むカートリッジは、異なる波長の蛍光放射線を検出することを可能にするために、検出器１０の前に設置されることができる。
【0089】
いくつかの実施形態において、内部標準が、試料中に存在する１つ以上の標的タンパク質の正確な定量化のための較正物質として機能するように試料に添加されることができる。適切な内部標準のいくつかの例は、限定されないが、既知の分子量を有するペプチドおよびタンパク質を含む。
【0090】
本教示は、様々なタイプのタンパク質の検出および定量化に使用されることができる。例として、いくつかの実施形態において、タンパク質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの抗体であり得るが、本教示は、試料中の他のタンパク質の濃度を定量化するためにも使用されることができる。
【0091】
【0092】
図６Ａを参照すると、ＣＥシステムのキャピラリーチューブを通って流れる試料中の１つ以上の標的タンパク質を定量化するための本教示の別の実施形態によるシステム６００は、約１９０ｎｍ～約３１０ｎｍ（例えば、約２８５ｎｍ）の真空波長範囲で実質的に単色の放射線を放出することができる発光ダイオード（ＬＥＤ）放射線源６０１を含む。この実施形態において、ＬＥＤ放射線源は、図１Ａに関して説明したレーザー光源より著しく狭い波長範囲を放出することができる。例として、いくつかの実施形態において、ニュージャージー州ニュートンのＴｈｏｒｌａｂｓ，Ｉｎｃ．によって商品名Ｍ２８０Ｌ６で市販されているＬＥＤが、使用されることができる。いくつかの実施形態において、ＬＥＤ光源６０１は、一般に市販のＣＥシステムに含まれるＤＣ電源によって給電されることができる。したがって、システムの電力効率は、専用の電源を通常は必要とするレーザーベースのシステムより改善されることができる。
【0093】
ＬＥＤ放射線源６０１は、例えば突き合わせ結合技術を介して光ファイバ６０５の近位端に直接結合されることができる。その後、図１Ａに示す実施形態と同様、光ファイバ６０５の遠位端は、キャピラリーチューブ６０７の透明部分６０７ａ、例えば、試料が流れることができるキャピラリーチューブ６０７の透明壁を有する部分に光学的に結合される。透明部分６０７ａは、窓を提供し、光ファイバ６０５の遠位端から出る励起放射線は、その窓を通ってキャピラリーチューブ６０７に導入され、試料がキャピラリーチューブ６０７の透明部分の管腔を通って流れているとき、少なくとも１つの標的タンパク質（試料中に存在する場合）を励起することができる。
【0094】
いくつかの実施形態において、球面ミラー６０６が、キャピラリーチューブを出る蛍光放射線の少なくとも一部を捕捉し、捕捉した蛍光放射線（またはその少なくとも一部）を反射してキャピラリーチューブ６０７に戻すために、キャピラリーチューブ６０７の透明部分６０７ａの近くに配置され、それによって、反射された蛍光放射線（またはその少なくとも一部）は、透明部分６０７ａの後部を通って出る。
【0095】
平凸レンズ６０８が、キャピラリーチューブ６０７の透明部分６０７ａに光学的に結合され、キャピラリーチューブ６０７（またはその少なくとも一部）を出る蛍光放射線を受け取り、蛍光放射線をコリメートして実質的にコリメートされた蛍光放射ビーム６１１を生成する。蛍光放射ビーム６１１は、バンドパスフィルタ６０９を通過し、検出器６１０によって受け取られる。
【0096】
図６Ｂに示すいくつかの実施形態において、バンドパスフィルタ６０９は、励起された標的タンパク質によって放出された蛍光放射線がその最大強度を示す波長に中心を置かれた透過帯域幅を有することができ、例えば、約５ｎｍ～約５０ｎｍに及ぶ透過帯域幅を有することができる。
【0097】
検出器６１０は、光電子増倍管、例えば、Ｈａｍａｍａｔｓｕによって市販されている光電子増倍管（Ｒ５９８４）として実装されることができる。検出器６１０は、蛍光放射線の検出に応答して、１つ以上の検出信号を生成することができる。分析器６２０（本明細書では分析モジュールとも呼ばれる）は、検出器６１０によって生成された検出信号を受信し、調査中の試料中の目的の標的タンパク質の濃度を計算するために、それらの信号に基づいて動作する。
【0098】
いくつかの関連する実施形態において、フィルタ（例えば、バンドパスフィルタ）６０３が、ＬＥＤ放射線源６０１から放出される放射線の波長をより正確に制限するために、ＬＥＤ放射線源６０１の前に配置されることができる。いくつかのそのような実施形態において、例えば、２８０ｎｍバンドパスフィルタが、使用されることができる。いくつかのそのような実施形態において、バンドパスフィルタ６０３は、約２７０ｎｍ～約２９０ｎｍの範囲内の透過帯域（例えば、＞６５％）を有することができる。そのような実施形態において、図６Ｂに示すように、ＬＥＤ放射線源６０１によって放出された放射線は、平凸レンズ６０２によって受け取られ、平凸レンズ６０２は、その焦点距離だけＬＥＤ放射線源から分離され、放射線を実質的にコリメートする。
【0099】
バンドパスフィルタ６０３またはショートパスフィルタは、約３００ｎｍを超える波長の残留発光を排除する。別の平凸レンズ６０４が、フィルタリングされた放射線を光ファイバ６０５の近位端に集中させる。この実施形態において、バンドパスフィルタ６０３はレンズ６０２とレンズ６０４との間に設置されているが、他の実施形態において、バンドパスフィルタ６０３は、キャピラリーチューブ６０７内を流れる試料への放射線の伝播経路に沿った他の位置に設置され得る。
【0100】
図６Ｂに示す実施形態において、球面ミラー６０６、平凸レンズ６０８、バンドパスフィルタ６０９、検出器６１０、および分析器６２０は、同様に配置されることができ、試料内の少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの天然蛍光体を励起し、その励起に応答して蛍光体によって放出された蛍光放射線を収集および分析するために、上述の実施形態と同様に機能することができる。
【0101】
以下の実施例は、本教示の様々な態様のさらなる例示のために提供され、本教示を実施する最適な方法および／または得られ得る最適な結果を必ずしも示すために提示されていない。
【0102】
（実施例１：レーザー駆動光源の使用）
マサチューセッツ州ウィルミントンのＥｎｅｒｇｅｔｉｑ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃによって開発されたレーザー駆動光源（ＬＤＬＳ（登録商標））が、ＣＥシステム内のいくつかのタンパク質の天然蛍光体を励起するために使用された。ＬＤＬＳ（登録商標）は、キセノンガス中に高強度プラズマを生成し、高強度プラズマは、１７０～２１００ｎｍの範囲の連続スペクトルにわたって放射線を生成する。２００～３００ｎｍの領域では、生成された放射線の放射輝度は、従来のランプの放射輝度の約１０倍であり、報告されている典型的な寿命は、約１０，０００時間である。連続スペクトルは、励起波長の選択においてレーザーより大きな柔軟性を可能にする。
マサチューセッツ州ウィルミントンのＥｎｅｒｇｅｔｉｑ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃによって開発されたレーザー駆動光源（ＬＤＬＳ（登録商標））が、ＣＥシステム内のいくつかのタンパク質の天然蛍光体を励起するために使用された。ＬＤＬＳ（登録商標）は、キセノンガス中に高強度プラズマを生成し、高強度プラズマは、１７０～２１００ｎｍの範囲の連続スペクトルにわたって放射線を生成する。２００～３００ｎｍの領域では、生成された放射線の放射輝度は、従来のランプの放射輝度の約１０倍であり、報告されている典型的な寿命は、約１０，０００時間である。連続スペクトルは、励起波長の選択においてレーザーより大きな柔軟性を可能にする。
【0103】
励起波長は、バンドパスフィルタを使用して選択され、バンドパスフィルタは、フィルタホイールに取り付けられ、異なるフィルタの交換可能な選択を可能にした。光電子増倍管（ＰＭＴ）が、検出器として使用された。標準として２００ｎｇ／ｍＬのトリプトファン溶液を使用して、２８０ｎｍの励起および３３３ｎｍ～３７５ｎｍの発光で、信号対雑音比に対するＰＭＴバイアス電圧の効果が、調査された。１０ｋＤａ内部標準および還元型ＩｇＧ１の固有蛍光に対するトリプトファンおよびチロシン残基の寄与は、励起波長および発光波長を調整することによって調査された。
【0104】
開発されたＮＦＤシステムは、ＣＥ－ＳＤＳおよびｃＩＥＦ中のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の分析に成功裏に適用された。ＣＥ－ＳＤＳでは、ＮＦＤは、２１４ｎｍでのＵＶ吸光度検出と比較して濃度感度の１５倍の改善を示した。さらに、検出データは、ベースライン変動または他の吸光種による干渉が少ないことを示した。ｃＩＥＦでは、ＮＦＤは、おそらくＵＶ感受性両性担体細胞のバックグラウンドの減少に起因して、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度検出より１７８倍高い感度を示した。
【0105】
（試薬および材料）
ＳＤＳ－ＭＷ分析キット、１０ｋＤａ内部標準、ＩｇＧ対照標準、ｃＩＥＦペプチドマーカーキット、試料充填溶液、ｃＩＥＦゲルは、ＳＣＩＥＸ（カリフォルニア州ブレア）より入手された。トリプトファン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）およびＩｇＧ対照標準（ＳＣＩＥＸ、カリフォルニア州ブレア）が、光学部品を評価し、ＮＦＤプロトタイプのパラメータを最適化するために使用された。ＵＳＰモノクローナルＩｇＧシステム適合参照標準（ＵＳＰ ＩｇＧ）が、米国薬局方（メリーランド州ロックビル）から入手された。ＮＩＳＴｍＡｂ、ヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体（ＮＩＳＴ ＩｇＧ）は、米国国立標準技術研究所（メリーランド州ゲーサーズバーグ）から購入された。Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ ３－１０が、Ｃｙｔｉｖａ（マサチューセッツ州マルボロー）から入手された。他のすべての化学物質は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から入手された。
ＳＤＳ－ＭＷ分析キット、１０ｋＤａ内部標準、ＩｇＧ対照標準、ｃＩＥＦペプチドマーカーキット、試料充填溶液、ｃＩＥＦゲルは、ＳＣＩＥＸ（カリフォルニア州ブレア）より入手された。トリプトファン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）およびＩｇＧ対照標準（ＳＣＩＥＸ、カリフォルニア州ブレア）が、光学部品を評価し、ＮＦＤプロトタイプのパラメータを最適化するために使用された。ＵＳＰモノクローナルＩｇＧシステム適合参照標準（ＵＳＰ ＩｇＧ）が、米国薬局方（メリーランド州ロックビル）から入手された。ＮＩＳＴｍＡｂ、ヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体（ＮＩＳＴ ＩｇＧ）は、米国国立標準技術研究所（メリーランド州ゲーサーズバーグ）から購入された。Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ ３－１０が、Ｃｙｔｉｖａ（マサチューセッツ州マルボロー）から入手された。他のすべての化学物質は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から入手された。
【0106】
（ＣＥ－ＳＤＳ条件）
還元型ＩｇＧ標準混合物は、９６μＬのＳＣＩＥＸ ＩｇＧ対照標準溶液、２μＬの１０ｋＤａ内部標準、および２μＬの２－メルカプトエタノールを混合することによって調製された。次いで、後続の溶液が、非共有結合種の解離およびＳＤＳ－タンパク質の結合を促進するために、７０℃で１０分間加熱された。非還元型ＳＣＩＥＸ ＩｇＧ対照標準も、使用前に７０℃で１０分間加熱された。
還元型ＩｇＧ標準混合物は、９６μＬのＳＣＩＥＸ ＩｇＧ対照標準溶液、２μＬの１０ｋＤａ内部標準、および２μＬの２－メルカプトエタノールを混合することによって調製された。次いで、後続の溶液が、非共有結合種の解離およびＳＤＳ－タンパク質の結合を促進するために、７０℃で１０分間加熱された。非還元型ＳＣＩＥＸ ＩｇＧ対照標準も、使用前に７０℃で１０分間加熱された。
【0107】
すべてのＣＥ－ＳＤＳ分離は、内径５０μｍ、外径３７５μｍおよび全長／有効長３０／２０ｃｍの裸の溶融シリカキャピラリー（Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、アリゾナ州フェニックス）を使用して実行された。各分離の前、キャピラリーが、０．１Ｍ水酸化ナトリウム、０．１Ｍ塩酸、およびＤＩ水を用いて、５０ｐｓｉで、それぞれ、５、３、および３分間連続して洗い落とされた。ＳＤＳ－ＭＷゲル緩衝液（ＳＣＩＥＸ、カリフォルニア州ブレア）が、５０ｐｓｉで１０分間キャピラリーに充填された。界面動電注入が、－５ｋＶで１０秒間実行された。分離が、気泡を形成するリスクを低減するために、２０ｐｓｉの圧力をかけて－１５ｋＶの電圧を印加することによって実施された。
【0108】
（ｃＩＥＦ条件）
ｃＩＥＦマスターミックスが、以下の溶液を組み合わせることによって、調製された：（１）１ｍＬのｃＩＥＦゲル中３．７５Ｍの尿素；（２）６０μＬのＰｈａｒｍａｌｙｔｅ ３－１０；（３）１００μＬのＤＩ水中５００ｍＭアルギニン；（４）１０μＬのＤＩ水中２００ｍＭイミノ二酢酸。ＮＩＳＴ ＩｇＧ標準混合物が、２００μＬのｃＩＥＦマスターミックス、８μＬの４ｍｇ／ｍＬのＮＩＳＴ ＩｇＧ、および２μＬの各ｐＩマーカー（１０．０、７．０、９．５、５．５）を組み合わせることによって、ＵＶ吸光度検出のために調製された。ＮＩＳＴ ＩｇＧ試料が、ｃＩＥＦマスターミックスで１５０倍希釈することによってＮＦＤのために調製された。
ｃＩＥＦマスターミックスが、以下の溶液を組み合わせることによって、調製された：（１）１ｍＬのｃＩＥＦゲル中３．７５Ｍの尿素；（２）６０μＬのＰｈａｒｍａｌｙｔｅ ３－１０；（３）１００μＬのＤＩ水中５００ｍＭアルギニン；（４）１０μＬのＤＩ水中２００ｍＭイミノ二酢酸。ＮＩＳＴ ＩｇＧ標準混合物が、２００μＬのｃＩＥＦマスターミックス、８μＬの４ｍｇ／ｍＬのＮＩＳＴ ＩｇＧ、および２μＬの各ｐＩマーカー（１０．０、７．０、９．５、５．５）を組み合わせることによって、ＵＶ吸光度検出のために調製された。ＮＩＳＴ ＩｇＧ試料が、ｃＩＥＦマスターミックスで１５０倍希釈することによってＮＦＤのために調製された。
【0109】
すべてのｃＩＥＦ分離は、内径５０μｍ、外径３７５μｍ、および全長／有効長３０／２０ｃｍの中性被覆キャピラリー（ＳＣＩＥＸ、カリフォルニア州ブレア）を使用して実行された。使用前、キャピラリーが、３５０ｍＭ酢酸、ＤＩ水、およびｃＩＥＦゲル（ＳＣＩＥＸ、カリフォルニア州ブレア）を用いて、５０ｐｓｉで、それぞれ、５、２、および５分間すすぎ落とすことによってコンディショニングされた。各分離の前、キャピラリーは、２０ｐｓｉで試料充填溶液（ＳＣＩＥＸ、カリフォルニア州ブレア）および水を用いて、それぞれ、３分間および２分間すすぎ落された。ＮＩＳＴ ＩｇＧ試料が、２５ｐｓｉで９９秒間キャピラリーの中に充填された。キャピラリー入口が２００ｍＭリン酸に浸漬され、かつ出口が３００ｍＭ水酸化ナトリウムに浸漬されている間、フォーカシングが、２５ｋＶの電圧を１５分間印加することによって実行された。３００ｍＭ水酸化ナトリウムを３５０ｍＭ酢酸に置き換え、化学的可動化が、３０ｋＶの電圧を２０分間印加することによって実行された。
【0110】
（検出システム）
図１Ａに関連して上述したようなＮＦＤシステムが、測定を実行するために使用された。放射線源１（例えば、レーザー駆動プラズマ源）からの光ビームは、順次、平凸レンズ２を用いてコリメートされ、バンドパスまたはショートパスフィルタ３でフィルタリングされ、第２の平凸レンズ４で光ファイバ５の中に集中させられ、励起のためにキャピラリー窓７に送達された。蛍光放出は、平凸レンズ８でコリメートされ、バンドパスフィルタ９でフィルタリングされ、検出器１０（例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ））で検出された。球面ミラー６が、キャピラリー内の分析物によって放出される光の収集効率を高めるために、検出窓の近位に配置された。
図１Ａに関連して上述したようなＮＦＤシステムが、測定を実行するために使用された。放射線源１（例えば、レーザー駆動プラズマ源）からの光ビームは、順次、平凸レンズ２を用いてコリメートされ、バンドパスまたはショートパスフィルタ３でフィルタリングされ、第２の平凸レンズ４で光ファイバ５の中に集中させられ、励起のためにキャピラリー窓７に送達された。蛍光放出は、平凸レンズ８でコリメートされ、バンドパスフィルタ９でフィルタリングされ、検出器１０（例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ））で検出された。球面ミラー６が、キャピラリー内の分析物によって放出される光の収集効率を高めるために、検出窓の近位に配置された。
【0111】
（結果および考察）
（１．ＰＭＴ電圧）
ノイズは、２０秒の期間にわたるブランク試料の応答の標準偏差として定義された。信号対雑音比に対するＰＭＴ電圧の影響が、３５０Ｖ、４７５Ｖ、６５０Ｖ、および８９０Ｖの４つのレベルで調査された。２００ｎｇ／ｍＬのトリプトファン溶液が、０．５ｐｓｉで５秒間注入され、圧力駆動分離をが、水をバックグラウンドとして５ｐｓｉで動作させられた。図２に示すように、信号対雑音比は、ＰＭＴ電圧が３５０Ｖから４７５Ｖに増加すると、１１０から３８０に向上した。信号対雑音比は、６５０ＶでのＰＭＴ電圧で、１，２２９であり、８９０ＶへのＰＭＴ電圧のさらなる増加は、１，６８１のより高い信号対雑音比をもたらした。しかしながら、６５０Ｖを超えるＰＭＴ電圧では、ＵＳＰ ＩｇＧの２．５ｍｇ／ｍＬ溶液は、使用したアナログ－デジタルモジュールを飽和させる電圧信号を生成した（データは示さず）。これは、高濃度レベルでのタンパク質分析のためのこの実施例におけるＮＦＤスキームの適用を制限した。濃度感度と線形ダイナミックレンジとの間の妥協点として、６５０ＶのＰＭＴ電圧が、さらなる実験のために選択された。
（１．ＰＭＴ電圧）
ノイズは、２０秒の期間にわたるブランク試料の応答の標準偏差として定義された。信号対雑音比に対するＰＭＴ電圧の影響が、３５０Ｖ、４７５Ｖ、６５０Ｖ、および８９０Ｖの４つのレベルで調査された。２００ｎｇ／ｍＬのトリプトファン溶液が、０．５ｐｓｉで５秒間注入され、圧力駆動分離をが、水をバックグラウンドとして５ｐｓｉで動作させられた。図２に示すように、信号対雑音比は、ＰＭＴ電圧が３５０Ｖから４７５Ｖに増加すると、１１０から３８０に向上した。信号対雑音比は、６５０ＶでのＰＭＴ電圧で、１，２２９であり、８９０ＶへのＰＭＴ電圧のさらなる増加は、１，６８１のより高い信号対雑音比をもたらした。しかしながら、６５０Ｖを超えるＰＭＴ電圧では、ＵＳＰ ＩｇＧの２．５ｍｇ／ｍＬ溶液は、使用したアナログ－デジタルモジュールを飽和させる電圧信号を生成した（データは示さず）。これは、高濃度レベルでのタンパク質分析のためのこの実施例におけるＮＦＤスキームの適用を制限した。濃度感度と線形ダイナミックレンジとの間の妥協点として、６５０ＶのＰＭＴ電圧が、さらなる実験のために選択された。
【0112】
（２．励起および発光波長）
タンパク質の天然蛍光は、３つの芳香族アミノ酸：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンの励起に由来する。フェニルアラニンの発光強度は、チロシンまたはトリプトファンの発光強度の約５０分の１であり、タンパク質の天然蛍光検出では一般に無視できる。ほとんどのタンパク質では、天然蛍光は、主にトリプトファン残基に起因するが、いくつかのタンパク質は、チロシン蛍光を示す。
タンパク質の天然蛍光は、３つの芳香族アミノ酸：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンの励起に由来する。フェニルアラニンの発光強度は、チロシンまたはトリプトファンの発光強度の約５０分の１であり、タンパク質の天然蛍光検出では一般に無視できる。ほとんどのタンパク質では、天然蛍光は、主にトリプトファン残基に起因するが、いくつかのタンパク質は、チロシン蛍光を示す。
【0113】
トリプトファンの発光ピークは局所環境に敏感ではあるが、トリプトファンの発光ピークは、通常、３５０ｎｍ付近である。セットアップ（上記の図１Ａに関連して説明）で励起および発光フィルタを調整することによって、ＮＦＤ測定プロセスが、最初に、２８０ｎｍでの励起、および３３３～３７５ｎｍの範囲での発光の収集により評価された。１０ｋＤａの内部標準と混合した還元型ＳＣＩＥＸ ＩｇＧ対照標準が、ＮＦＤセットアップを使用してＣＥ－ＳＤＳによって分析された。ＩｇＧ軽鎖（ＬＣ）、非グリコシル化重鎖（ＮＧＨＣ）、および重鎖（ＨＣ）を表す３つのピークは、２１４ｎｍでのＵＶ吸光度検出と比較して増強された信号対雑音比を示した。しかし、１０ｋＤａの内部標準に対する応答は、おそらくトリプトファン残基の欠如により、低かった。
【0114】
チロシン発光ピークは、局所環境に対して非感受性であることが示され、発光最大値は、約３０４ｎｍで見られた。天然蛍光に対するチロシン残基の寄与は、２２０ｎｍでの励起後の３０５～３１５ｎｍの帯域における発光スペクトルを収集することによって調査された。分離は、内径５０μｍ、外径３７５μｍおよび合計／有効長３０／２０ｃｍのコーティングされていないキャピラリーで実行された。印加電圧は、両端での２０ｐｓｉ圧力で－１５ｋＶであった。試料の注入は、１０秒間の－５ｋＶの電圧で達成された。
【0115】
１０ｋＤａの内部標準ピークの大きさは増強されたが（図３Ｂ）、ＬＣ、ＮＧＨＣ、ＨＣを表す３つのピークは１０分の１未満であった（図３Ｂ対図３Ａ）。全体的なチロシン蛍光は、おそらくトリプトファンの吸光およびチロシンからトリプトファン残基へのエネルギー移動との発光重複により、弱かった。
【0116】
ｍＡｂのＣＥ－ＳＤＳおよびｃＩＥＦ分析の濃度感度を最大化するために、ＮＦＤは、２８０ｎｍでの励起および３３３～３７５ｎｍ帯域での発光で使用された。しかしながら、ＮＦＤシステムの励起波長および発光波長は、標的タンパク質が適切な濃度のトリプトファン残基を欠く場合、チロシン蛍光を検出するように調整されることができる。
【0117】
（ＮＦＤを伴うＣＥ－ＳＤＳを使用するｍＡｂの分析）
その高い分解能、使いやすさおよび高い再現性に起因して、ＣＥ－ＳＤＳは、治療用ｍＡｂの分析のための生物医薬産業における日常的なツールとしてＳＤＳ－ＰＡＧＥに取って代わりつつある。ＣＥ－ＳＤＳでは、ＵＶ吸光度検出は、最大濃度感度が達成される２１０～２２０ｎｍの領域で動作させられることが多い。しかしながら、検出は選択的ではなく、他の吸光種またはベースライン異常による干渉を被る。
その高い分解能、使いやすさおよび高い再現性に起因して、ＣＥ－ＳＤＳは、治療用ｍＡｂの分析のための生物医薬産業における日常的なツールとしてＳＤＳ－ＰＡＧＥに取って代わりつつある。ＣＥ－ＳＤＳでは、ＵＶ吸光度検出は、最大濃度感度が達成される２１０～２２０ｎｍの領域で動作させられることが多い。しかしながら、検出は選択的ではなく、他の吸光種またはベースライン異常による干渉を被る。
【0118】
非還元型ＳＣＩＥＸ ＩｇＧ対照標準が、２１４ｎｍでのＵＶ吸光度検出を伴うＣＥ－ＳＤＳを使用して分離された（図４Ａのトレース１を参照）。ＩｇＧ試料が、７０℃で１０分間、使用前に加熱された。ＩｇＧ試料は、直接使用され（図４Ａ）、ＳＤＳ－ＭＷ試料緩衝液（ＳＣＩＥＸ、カリフォルニア州ブレア）での１０倍希釈でも使用された（図４Ｂ）。他のすべてのＣＥ－ＳＤＳ条件は、図３に関連して使用された条件と同じであった。
【0119】
主ピークは、３，３８９の信号対雑音比をもたらした。ベースライン異常を排除する試みにおいて、同じＩｇＧ試料が、２８０ｎｍでの吸光度検出を伴うＣＥ－ＳＤＳを使用して分離された（図４Ａのトレース２を参照）。しかしながら、応答ははるかに低く、それは、主ピークに関して６７の信号対雑音比をもたらし、２１４ｎｍでのＵＶ吸光度検出を用いた場合の５１文の１の感度を表した（トレース２対トレース１）。
【0120】
非還元型ＳＣＩＥＸ ＩｇＧ対照標準をが、ＮＦＤプロトタイプシステムを使用して、ＳＤＳ試料緩衝液（ＳＣＩＥＸ、カリフォルニア州ブレア）で１０倍希釈し、分析された（図４Ｂを参照）。主ピークの信号対雑音比は、５，５６８であり、２１４ｎｍでのＵＶ吸光度検出と比較して１６倍の感度改善を表した。さらに、ベースラインは、異常が少なく、ピーク積分は、２１４ｎｍでの吸光度検出より干渉が少なかった（図４Ｂ対図４Ａのトレース１）。
【0121】
（ＮＦＤを伴うｃＩＥＦを用いたｍＡｂの分析）
ｃＩＥＦは、タンパク質分子をそれらのｐＩに基づいて分離し、ｍＡｂ電荷アイソフォーム分析のために生物医薬産業で日常的に使用されている重要なＣＥベースの技術である。ｃＩＥＦでは、吸光度検出は、両性担体電解質が特に２１４ｎｍでＵＶ感受性である傾向があるので、一般に２８０ｎｍで行われる。ＬＩＦ検出を伴うｃＩＥＦは、蛍光体誘導体化が、多くの場合、様々なタンパク質アイソフォームの電荷における変化につながり、分離がそれらの天然のタンパク質対応物のそれらに匹敵しないことをもたらし得るので、広く使用されていない。
ｃＩＥＦは、タンパク質分子をそれらのｐＩに基づいて分離し、ｍＡｂ電荷アイソフォーム分析のために生物医薬産業で日常的に使用されている重要なＣＥベースの技術である。ｃＩＥＦでは、吸光度検出は、両性担体電解質が特に２１４ｎｍでＵＶ感受性である傾向があるので、一般に２８０ｎｍで行われる。ＬＩＦ検出を伴うｃＩＥＦは、蛍光体誘導体化が、多くの場合、様々なタンパク質アイソフォームの電荷における変化につながり、分離がそれらの天然のタンパク質対応物のそれらに匹敵しないことをもたらし得るので、広く使用されていない。
【0122】
２８０ｎｍでの吸光度検出を伴うｃＩＥＦを使用するＮＩＳＴ ＩｇＧの分離が、実行された（図５Ａ）。分離は、中性コーティングキャピラリー（内径５０μｍ、外径３７５μｍ、および全長／有効長３０／２０ｃｍのＳＣＩＥＸ、カリフォルニア州ブレア）中で実行された。ＮＩＳＴ ＩｇＧ試料が、上記のように調製された。ＮＦＤに関して、ＵＶ吸光度検出に使用した試料は、１５０倍希釈された。試料の注入は、２５ｐｓｉで９９秒間、集中は、２５ｋＶで１５分間、および、化学的可動化は、３０ｋＶで２０分間で達成された。
【0123】
主ピークの信号対雑音比は、９５６であった。ＮＦＤワークフローを使用して、同じＮＩＳＴ ＩｇＧ溶液が、本発明者らのシステム上のアナログ－デジタルモジュールを飽和させる信号を生成した（データは示さず）。ＩｇＧ溶液は、ｃＩＥＦマスターミックスで１５０倍希釈され、ＩｇＧ試料の信号対雑音比は、１，１３７（図５Ｂ）であった。１５０倍の試料希釈を考慮すると、ＮＦＤを使用した分析は、２８０ｎｍでの吸光度検出より主ピークに関して１７８倍の感度改善を提供した。
【0124】
（実施例２：ＬＥＤ光源の使用）
ファイバ結合２８５ｎｍのＬＥＤモジュールは、Ｔｈｏｒｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州ニュートン）から入手された。ＬＥＤ光源は、熱安定性のためにヒートシンクと直接接触する金属コア回路基板に取り付けられた単一のＬＥＤを含んでいた。ＬＥＤは、ＬＥＤの順方向ＤＣ電流を０～１，２００ｍＡの範囲で変調することができるコンパクトなコントローラ（Ｔｈｏｒｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ニュートン）で駆動された。この実験では、ＬＥＤは、５００ｍＡの順方向ＤＣ電流で動作させられ、この電流では、ＬＥＤの典型的な寿命は＞１００００時間である。
ファイバ結合２８５ｎｍのＬＥＤモジュールは、Ｔｈｏｒｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州ニュートン）から入手された。ＬＥＤ光源は、熱安定性のためにヒートシンクと直接接触する金属コア回路基板に取り付けられた単一のＬＥＤを含んでいた。ＬＥＤは、ＬＥＤの順方向ＤＣ電流を０～１，２００ｍＡの範囲で変調することができるコンパクトなコントローラ（Ｔｈｏｒｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ニュートン）で駆動された。この実験では、ＬＥＤは、５００ｍＡの順方向ＤＣ電流で動作させられ、この電流では、ＬＥＤの典型的な寿命は＞１００００時間である。
【0125】
開発されたＮＦＤスキームの性能が、マウス血清からのグリコシル化および非グリコシル化ＩｇＧで構成されるＩｇＧ対照標準（カリフォルニア州ブレアのＳＣＩＥＸ）を使用して評価された。総質量濃度は１ｍｇ／ｍＬであり、非グリコシル化形態の量は、約９．５％である。９５μＬの試料が、５μＬのβ－メルカプトエタノールと混合され、次いで、ＩｇＧ試料が、７０℃で１０分間加熱することによって、還元された。分析前、還元型ＩｇＧ対照標準が、ＳＤＳ試料緩衝液（ＳＣＩＥＸ、カリフォルニア州ブレア）で１０倍希釈された。図７に示すように、３つのピークは、ＩｇＧ軽鎖（ＬＣ）、非グリコシル化重鎖（ＮＧＨＣ）、および重鎖（ＨＣ）を表す。ＮＧＨＣとＨＣとが、１．６２の分解能でベースライン分離された。ここで、ノイズは、３０秒間にわたるブランク試料の応答の標準偏差として定義された。信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）は、ＬＣ、ＮＧＨＣおよびＨＣに関して、それぞれ、３２４０、８６０、５４５８であった。
【0126】
３００ｎｍを超えるＬＥＤの残留発光を特定するために、蛍光が、３２５～３７５ｎｍの範囲で収集された。何故なら、この帯域における残留発光が、バックグラウンド信号を著しく増加させ、結果としてＳ／Ｎを低下させ得るからである。検出感度をさらに改善するために、図６Ｂを参照して上述したように、光を平凸レンズでコリメートし、２８０ｎｍバンドパスフィルタを通して光をフィルタリングし、フィルタリングされた光を第２の平凸レンズで光ファイバに集中させることによって、残留発光を排除した。２８０ｎｍバンドパスフィルタ（ＩＤＥＸ、ニューヨーク州ロチェスター）は、２７０～２９０ｎｍ帯域で＞６５％の透過率を示し、３１０～３８０ｎｍ帯域で＞５ＯＤの平均遮断を示す。２つのレンズと１つの光学フィルタとの組み合わせでは、光ファイバが受け取る光出力は、約５０％減少し、したがって、減少したＩｇＧ試料によって放出される蛍光は、約４５％減少した（線Ａ対線Ｂを参照）。受け取った出力の全体的な減少にもかかわらず、バックグラウンド信号が著しく減少したので、Ｓ／Ｎは、ＬＣ、ＮＧＨＣ、およびＨＣに関して、それぞれ、７４０９、１９１７、および１２５６６に増加した。これは、２８０ｎｍバンドパスフィルタなしの構成より検出感度の約２．３倍の増強を表す。したがって、実施例２では、２枚のレンズと２８０ｎｍのバンドパスフィルタとを組み合わせたＬＥＤ光源を励起に使用した。
【0127】
（試薬および材料）
ＩｇＧ対照標準、ＳＤＳ－ＭＷゲル分離緩衝液、ＳＤＳ試料緩衝液、０．１ＮのＨＣｌ酸性洗浄、０．１ＮのＮａＯＨ塩基性洗浄、およびＣＥグレードの水は、ＳＣＩＥＸ（カリフォルニア州ブレア）からであった。ＮＩＳＴモノクローナル抗体（ＮＩＳＴｍＡｂ）は、米国国立標準技術研究所（メリーランド州ゲーサーズバーグ）から購入された。それは、１２．５ｍＭのＬ－ヒスチジン、１２．５ｍＭのＬ－ヒスチジンＨＣｌ（ｐＨ６．０）中の１０ｍｇ／ｍＬのヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体の溶液である。ヨードアセトアミドおよび２－メルカプトエタノールは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から入手された。エタネルセプトはＭｙｏｎｅｘ（ペンシルバニア州ノリスタウン）から購入された。
ＩｇＧ対照標準、ＳＤＳ－ＭＷゲル分離緩衝液、ＳＤＳ試料緩衝液、０．１ＮのＨＣｌ酸性洗浄、０．１ＮのＮａＯＨ塩基性洗浄、およびＣＥグレードの水は、ＳＣＩＥＸ（カリフォルニア州ブレア）からであった。ＮＩＳＴモノクローナル抗体（ＮＩＳＴｍＡｂ）は、米国国立標準技術研究所（メリーランド州ゲーサーズバーグ）から購入された。それは、１２．５ｍＭのＬ－ヒスチジン、１２．５ｍＭのＬ－ヒスチジンＨＣｌ（ｐＨ６．０）中の１０ｍｇ／ｍＬのヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体の溶液である。ヨードアセトアミドおよび２－メルカプトエタノールは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から入手された。エタネルセプトはＭｙｏｎｅｘ（ペンシルバニア州ノリスタウン）から購入された。
【0128】
２５０ｍＭヨードアセトアミドは、４６．２ｍｇを１ｍＬのＣＥグレードの水（ＳＣＩＥＸ、カリフォルニア州ブレア）に溶解することによって調製された。使用前、ストック溶液は、ＳＤＳ試料緩衝液（ＳＣＩＥＸ、カリフォルニア州ブレア）で２０ｍＭに希釈された。
【0129】
（機器類）
ＬＩＦ検出で構成されたＰＡ８００ Ｐｌｕｓ ＣＥシステム（ＳＣＩＥＸ、カリフォルニア州ブレア）が、この実験において使用された。励起源は、ＬＩＦ検出器との適合性を可能にするために、２８５ｎｍ ＬＥＤ（Ｔｈｏｒｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ニュートン）およびカスタマイズされた光学素子に基づいて設計された。光源は、ＰＡ８００ Ｐｌｕｓ ＣＥシステムにおいて給電され、自己完結型であった。すべてのデータが、収集され、３２Ｋａｒａｔソフトウェア（バージョン１０．１）を用いて処理された。
ＬＩＦ検出で構成されたＰＡ８００ Ｐｌｕｓ ＣＥシステム（ＳＣＩＥＸ、カリフォルニア州ブレア）が、この実験において使用された。励起源は、ＬＩＦ検出器との適合性を可能にするために、２８５ｎｍ ＬＥＤ（Ｔｈｏｒｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ニュートン）およびカスタマイズされた光学素子に基づいて設計された。光源は、ＰＡ８００ Ｐｌｕｓ ＣＥシステムにおいて給電され、自己完結型であった。すべてのデータが、収集され、３２Ｋａｒａｔソフトウェア（バージョン１０．１）を用いて処理された。
【0130】
（試料調製）
還元型ＩｇＧ対照標準が、９５μＬのＳＣＩＥＸ ＩｇＧ対照標準溶液と５μＬの２－メルカプトエタノールを混合することによって、調製された。混合物は、７０℃で１０分間加熱され、次いで、室温まで冷却された。使用前、試料は、ＳＤＳ試料緩衝液（ＳＣＩＥＸ、カリフォルニア州ブレア）で１０倍希釈された。
還元型ＩｇＧ対照標準が、９５μＬのＳＣＩＥＸ ＩｇＧ対照標準溶液と５μＬの２－メルカプトエタノールを混合することによって、調製された。混合物は、７０℃で１０分間加熱され、次いで、室温まで冷却された。使用前、試料は、ＳＤＳ試料緩衝液（ＳＣＩＥＸ、カリフォルニア州ブレア）で１０倍希釈された。
【0131】
非還元型ＳＤＳ－ＮＩＳＴｍＡｂ複合体が、２０ｍＭヨードアセトアミドを含むＳＤＳ試料緩衝液（ＳＣＩＥＸ、カリフォルニア州ブレア）で１０ｍｇ／ｍＬのＮＩＳＴｍＡｂを所望の濃度に希釈することによって、調製された。その後の溶液は、使用前、７０℃で１０分間加熱され、その後、室温まで冷却された。
【0132】
２５ｍｇ／バイアルのエタネルセプトが、１ｍＬの希釈剤で再構成され、ストック溶液が、２０ｍＭヨードアセトアミドを含むＳＤＳ試料緩衝液（ＳＣＩＥＸ、カリフォルニア州ブレア）で所望の濃度に希釈された。試料溶液は、使用前、７０℃で１０分間加熱された後、室温まで冷却された。
【0133】
（ＳＤＳ－ＣＧＥ条件）
すべてのＳＤＳ－ＣＧＥ分離は、内径（ＩＤ）５０μｍおよび外径（ＯＤ）３７５μｍの裸の溶融シリカキャピラリー（Ｐ／Ｎ ３３８４５１、ＳＣＩＥＸ、ブレア）を使用して実行された。キャピラリーは、全長が３０．２ｃｍ、入口から検出窓までの長さが２０．０ｃｍとなるように、カートリッジ（ＳＣＩＥＸ、カリフォルニア州ブレア）に設置された。最初の使用の前、キャピラリーは、０．１ＮのＮａＯＨ塩基性洗浄、０．１ＮのＨＣｌ酸性洗浄、およびＣＥグレードの水で２０ｐｓｉで、それぞれ、１０、５、および２分間すすぎ落とすことによってコンディショニングした。次いで、キャピラリーは、ＳＤＳ－ＭＷゲル分離緩衝液で７０ｐｓｉで１０分間充填され、次いで、入口端と出口端の両方に２０ｐｓｉで－１５ｋＶの電圧を１５分間印加することによって平衡化された。
すべてのＳＤＳ－ＣＧＥ分離は、内径（ＩＤ）５０μｍおよび外径（ＯＤ）３７５μｍの裸の溶融シリカキャピラリー（Ｐ／Ｎ ３３８４５１、ＳＣＩＥＸ、ブレア）を使用して実行された。キャピラリーは、全長が３０．２ｃｍ、入口から検出窓までの長さが２０．０ｃｍとなるように、カートリッジ（ＳＣＩＥＸ、カリフォルニア州ブレア）に設置された。最初の使用の前、キャピラリーは、０．１ＮのＮａＯＨ塩基性洗浄、０．１ＮのＨＣｌ酸性洗浄、およびＣＥグレードの水で２０ｐｓｉで、それぞれ、１０、５、および２分間すすぎ落とすことによってコンディショニングした。次いで、キャピラリーは、ＳＤＳ－ＭＷゲル分離緩衝液で７０ｐｓｉで１０分間充填され、次いで、入口端と出口端の両方に２０ｐｓｉで－１５ｋＶの電圧を１５分間印加することによって平衡化された。
【0134】
各分離の前、キャピラリーは、０．１ＮのＮａＯＨ塩基性洗浄、０．１ＮのＨＣｌ酸性洗浄、およびＣＥグレード水で７０ｐｓｉで、それぞれ、３、１、および１分間連続的にすすぎ落とされた。ＳＤＳ－ＭＷゲル分離緩衝液が、７０ｐｓｉで１０分間キャピラリーに充填された。試料は、－５ｋＶで４０秒間キャピラリーに界面動電的に注入された。分離は、－１５ｋＶの電圧で実施された。気泡を形成するリスクを低減するために、２０ｐｓｉの圧力が、分離中、入口端部と出口端部の両方に加えられた。
【0135】
（結果および考察）
（１．ＰＭＴ利得）
製造業者Ｈａｍａｍａｔｓｕは、ＰＭＴの最大定格を１２５０Ｖに指定している。電圧変動に対する信頼性を提供するために、ＰＭＴは、指定された最大定格より２０％低い１０００Ｖ未満の制御電圧で動作させられた。この実験では、ＰＭＴ制御電圧のＳ／Ｎへの影響は、３８６、４５８、５３０、６２８、７２７、８６２、および９９７Ｖの７つのレベルで調査された。１ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ対照標準は、上記のように減少させられ、ＳＤＳ－ＣＧＥで分析する前、１０倍希釈された。図８Ａに示されるように、制御電圧が３８６Ｖから７２７Ｖに増加させられると、蛍光シグナルは、約１００倍増加した。ＬＣ、ＮＧＨＣおよびＨＣを表す３つすべてのピークに関して、Ｓ／Ｎは、著しく増強された（図８Ｂを参照）。制御電圧の９９７Ｖへのさらに増加は、蛍光シグナルの１０倍のさらなる改善をもたらしたが、Ｓ／Ｎは、プラトーに達した。さらに、７２７Ｖを超えるＰＭＴ電圧では、ＩｇＧの１ｍｇ／ｍＬ溶液が、使用されるアナログ－デジタル変換器の入力電圧範囲外の電圧信号を生成し、これは、高濃度レベルでのタンパク質分析のためのＮＦＤを伴うＳＤＳ－ＣＧＥの適用を制限した。この研究では、本発明者らは、検出感度および線形ダイナミックレンジの両方を追求しながら、ｍＡｂ試料中の微量レベルの不純物を定量化するための解決策を開発した。したがって、７２７ＶのＰＭＴ制御電圧が、さらなる実験のために選択された。
（１．ＰＭＴ利得）
製造業者Ｈａｍａｍａｔｓｕは、ＰＭＴの最大定格を１２５０Ｖに指定している。電圧変動に対する信頼性を提供するために、ＰＭＴは、指定された最大定格より２０％低い１０００Ｖ未満の制御電圧で動作させられた。この実験では、ＰＭＴ制御電圧のＳ／Ｎへの影響は、３８６、４５８、５３０、６２８、７２７、８６２、および９９７Ｖの７つのレベルで調査された。１ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ対照標準は、上記のように減少させられ、ＳＤＳ－ＣＧＥで分析する前、１０倍希釈された。図８Ａに示されるように、制御電圧が３８６Ｖから７２７Ｖに増加させられると、蛍光シグナルは、約１００倍増加した。ＬＣ、ＮＧＨＣおよびＨＣを表す３つすべてのピークに関して、Ｓ／Ｎは、著しく増強された（図８Ｂを参照）。制御電圧の９９７Ｖへのさらに増加は、蛍光シグナルの１０倍のさらなる改善をもたらしたが、Ｓ／Ｎは、プラトーに達した。さらに、７２７Ｖを超えるＰＭＴ電圧では、ＩｇＧの１ｍｇ／ｍＬ溶液が、使用されるアナログ－デジタル変換器の入力電圧範囲外の電圧信号を生成し、これは、高濃度レベルでのタンパク質分析のためのＮＦＤを伴うＳＤＳ－ＣＧＥの適用を制限した。この研究では、本発明者らは、検出感度および線形ダイナミックレンジの両方を追求しながら、ｍＡｂ試料中の微量レベルの不純物を定量化するための解決策を開発した。したがって、７２７ＶのＰＭＴ制御電圧が、さらなる実験のために選択された。
【0136】
（２．試料注入）
ＳＤＳ－ＣＧＥでは、分離ゲル緩衝液は、粘性であり得るが、試料溶液は、ゲルフリーであり得る。この不一致は、圧力注入に問題をもたらすことが多く、試料注入は、一般に界面動電的に行われる。ＳＤＳ変性タンパク質がその分子量にかかわらず均一な電荷対サイズ比を有するので、様々なタンパク質分子が、同じ移動度でゲルフリーの試料溶液中を移動し、注入バイアスを緩和する。
ＳＤＳ－ＣＧＥでは、分離ゲル緩衝液は、粘性であり得るが、試料溶液は、ゲルフリーであり得る。この不一致は、圧力注入に問題をもたらすことが多く、試料注入は、一般に界面動電的に行われる。ＳＤＳ変性タンパク質がその分子量にかかわらず均一な電荷対サイズ比を有するので、様々なタンパク質分子が、同じ移動度でゲルフリーの試料溶液中を移動し、注入バイアスを緩和する。
【0137】
一般に、試料の注入量を増やすとＳ／Ｎを向上させるが、長い試料プラグ注入は、ピークの広がりに寄与し、分離効率を低下させ得る。この実験では、注入電圧が－５ｋＶに固定されている間、試料の注入量は、注入時間を５秒から１２０秒まで変更することによって、調整された。図９Ａは、注入時間が５、２０、６０、および１００秒の場合の１００μｇ／ｍＬの還元型ＩｇＧ試料の代表的な電気泳動図を示す。注入時間が増加するにつれて、補正されたピーク面積は、０．９９９３～０．９９９９の範囲の相関係数（ｒ２）で線形的に増加した（図９Ｂを参照）。図９Ｃに示されるように、より長い注入時間は、ＬＣ、ＮＧＨＣ、およびＨＣを表す３つのピークすべてに関してより高いＳ／Ｎをもたらしたが、ピークの広がりももたらし、分離効率を低下させた。注入時間が４０秒より長い場合、ＮＧＨＣとＨＣとの間の分解能は＜１．５である（図９Ｄを参照）。本研究では、ＳＤＳ－ＣＧＥアッセイの検出感度と分離効率との間で妥協するために、試料注入は、－５ｋＶで４０秒間実行された。
【0138】
（３．線形性および感度）
低レベルの不純物の検出は、ＳＤＳ－ＣＧＥアッセイの主な用途の１つである。この実験では、ＮＦＤを伴うＳＤＳ－ＣＧＥの線形ダイナミックレンジが、ＮＩＳＴｍＡｂを使用して調査された。非還元型ＳＤＳ－ＮＩＳＴｍＡｂ複合体が、１０ｍｇ／ｍＬのＮＩＳＴｍＡｂを２０ｍＭヨードアセトアミドを含むＳＤＳ試料緩衝液（ＳＣＩＥＸ、カリフォルニア州ブレア）で希釈し、７０℃で１０分間加熱することによって、調製された。非還元型ＮＩＳＴｍＡｂ試料は、０．０３～５００μｇ／ｍＬの範囲の１１の濃度レベルで調製され、図１０Ａは、それらのＳＤＳ－ＣＧＥ電気泳動図の重複を示す。挿入図は、０．０５μｇ／ｍＬでの電気泳動図の拡大図である。各試料は、三連で注入され、補正されたピーク面積の平均を濃度に対してプロットすることによって線形回帰を確立した（図１０Ｂを参照）。回帰式はｙ＝６３１．６３ｘであり、ここで、ｙは補正されたピーク面積であり、ｘはＮＩＳＴｍＡｂ濃度であった。相関係数（ｒ２）は０．９９９９であり、補正されたピーク面積とＮＩＳＴｍＡｂ濃度との間に優れた線形関係があることが示された。
低レベルの不純物の検出は、ＳＤＳ－ＣＧＥアッセイの主な用途の１つである。この実験では、ＮＦＤを伴うＳＤＳ－ＣＧＥの線形ダイナミックレンジが、ＮＩＳＴｍＡｂを使用して調査された。非還元型ＳＤＳ－ＮＩＳＴｍＡｂ複合体が、１０ｍｇ／ｍＬのＮＩＳＴｍＡｂを２０ｍＭヨードアセトアミドを含むＳＤＳ試料緩衝液（ＳＣＩＥＸ、カリフォルニア州ブレア）で希釈し、７０℃で１０分間加熱することによって、調製された。非還元型ＮＩＳＴｍＡｂ試料は、０．０３～５００μｇ／ｍＬの範囲の１１の濃度レベルで調製され、図１０Ａは、それらのＳＤＳ－ＣＧＥ電気泳動図の重複を示す。挿入図は、０．０５μｇ／ｍＬでの電気泳動図の拡大図である。各試料は、三連で注入され、補正されたピーク面積の平均を濃度に対してプロットすることによって線形回帰を確立した（図１０Ｂを参照）。回帰式はｙ＝６３１．６３ｘであり、ここで、ｙは補正されたピーク面積であり、ｘはＮＩＳＴｍＡｂ濃度であった。相関係数（ｒ２）は０．９９９９であり、補正されたピーク面積とＮＩＳＴｍＡｂ濃度との間に優れた線形関係があることが示された。
【0139】
この実験では、検出限界（ＬＯＤ）および定量化限界（ＬＯＱ）は、それぞれ、３および１０のＳ／Ｎを生じるタンパク質濃度として定義された。ノイズは、ブランク試料のバックグラウンド応答の大きさを測定し、３０秒間にわたるこれらの応答の標準偏差を計算することによって推定された。最適化された条件下で、非還元型ＮＩＳＴｍＡｂのＬＯＤおよびＬＯＱは、それぞれ、８．３および２７ｎｇ／ｍＬであった。これは、銀染色を用いたＳＤＳ－ＣＧＥ－ＬＩＦおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥで得られた濃度感度に匹敵する。
【0140】
（４．精度および正確さ）
反復性が、３つの濃度レベルでの１８回の決定、各濃度での６回の決定によって評価された。補正されたピーク面積のＲＳＤは、０．０５、５、５００μｇ／ｍＬで、それぞれ、２．３５％、０．７５％、０．５６％であった。
反復性が、３つの濃度レベルでの１８回の決定、各濃度での６回の決定によって評価された。補正されたピーク面積のＲＳＤは、０．０５、５、５００μｇ／ｍＬで、それぞれ、２．３５％、０．７５％、０．５６％であった。
【0141】
ＮＩＳＴｍＡｂ中の不純物の試料を得ることができなかったので、正確さは、非還元型ＮＩＳＴｍＡｂ試料の実験濃度をそれらの理論濃度と比較することによって評価された。非還元型ＩｇＧ試料は、０．０５、０．５、５、５０、および２００μｇ／ｍＬの５つの濃度レベルで調製された。各試料は、５回注入され、補正されたピーク面積の平均値が、実験濃度を算出するために、回帰式に代入された。表１に示すように、回収率は９１．５％～１０４．９％であった。
【表1】
【0142】
（５．エタネルセプトの定量化および純度分析へのＳＤＳ－ＣＧＥ－ＮＦＤの適用）
エタネルセプトは、乾癬性関節炎および関節リウマチを治療するために１９９８年にＦＤＡによって承認された治療用Ｆｃ融合タンパク質である。これは、高度にグリコシル化されており、見かけの分子量は、約１５０ｋＤａである。エタネルセプトおよびそのバイオシミラー中の純度および高分子量（ＨＭＷ）含有量を評価するために、Ｃｈｏら（Ｃｈｏら、‘‘Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ，ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ＳＢ４，ａ ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒ ｏｆ ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ．ｍＡｂｓ’’、２０１６、８（６）、１１３６－１１５５）は、サイズ排除クロマトグラフィー－多角度レーザー光散乱（ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ）を使用し、参照生成物中の決定されたＨＭＷ含有量は、２．３～３．１％であった。しかしながら、主要種と低分子量（ＬＭＷ）種との不十分なＳＥＣ分離に起因して、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳにおけるＬＭＷ含有量の定量化は、正確ではなく、それは、ＳＤＳ－ＣＧＥ－ＵＶを使用して達成された。
エタネルセプトは、乾癬性関節炎および関節リウマチを治療するために１９９８年にＦＤＡによって承認された治療用Ｆｃ融合タンパク質である。これは、高度にグリコシル化されており、見かけの分子量は、約１５０ｋＤａである。エタネルセプトおよびそのバイオシミラー中の純度および高分子量（ＨＭＷ）含有量を評価するために、Ｃｈｏら（Ｃｈｏら、‘‘Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ，ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ＳＢ４，ａ ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒ ｏｆ ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ．ｍＡｂｓ’’、２０１６、８（６）、１１３６－１１５５）は、サイズ排除クロマトグラフィー－多角度レーザー光散乱（ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ）を使用し、参照生成物中の決定されたＨＭＷ含有量は、２．３～３．１％であった。しかしながら、主要種と低分子量（ＬＭＷ）種との不十分なＳＥＣ分離に起因して、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳにおけるＬＭＷ含有量の定量化は、正確ではなく、それは、ＳＤＳ－ＣＧＥ－ＵＶを使用して達成された。
【0143】
２１４ｎｍ領域での吸光度検出は、ＳＤＳ－ＣＧＥで最も広く利用されている検出戦略であるが、選択的ではなく、ベースライン異常による干渉を受けることが多い。図１１Ａは、１ｍｇ／ｍＬ非還元型エタネルセプトのＳＤＳ－ＣＧＥ－ＵＶ電気泳動図を示す。主ピーク付近のベースラインの起伏は、ピーク積分を複雑にし、エタネルセプトの純度分析、特にＨＭＷ領域における課題をもたらした。
【0144】
ＮＦＤはベースライン異常を排除し、濃度感度を向上させた。図１１Ｂは、１００μｇ／ｍＬ非還元型エタネルセプトのＳＤＳ－ＣＧＥ－ＮＦＤ電気泳動図を示す。ＨＭＷおよびＬＭＷのピークの両方は、ノイズおよびベースライン変動からよく区別され、単一のアッセイを使用してＨＭＷおよびＬＭＷ含有量の定量化を可能にした。補正されたピーク面積のパーセンテージは、表２の通りであった。決定されたＨＭＷ含有量は、一貫して２．５７～２．６３％の範囲であり、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳで分析した参照製品の報告されたＨＭＷ含有量に匹敵した。ＬＭＷ含有量は、標的濃度（２００μｇ／ｍＬ）の５０～１５０％の範囲にわたって一貫して、１．１９～１．２７％であると決定された。
【表2】
【0145】
較正曲線が、主ピークに関して標的濃度２００μｇ／ｍＬの５０～１５０％の範囲にわたって確立された。回帰式はｙ＝３５３．４３ｘであり、ｙは補正されたピーク面積を表し、ｘはエタネルセプト濃度を表した。相関係数（ｒ２）は０．９９９０であり、エタネルセプトの定量のためのＳＤＳ－ＣＧＥ－ＮＦＤ法の良好な線形性を示した。補正されたピーク面積の平均が、実験濃度を計算するために回帰式に代入され、回収率は、９７．０２～１０１．６％の範囲であった。
【0146】
当業者は、本教示の範囲から逸脱することなく、上記の実施形態に様々な変更を加えることができることを理解するであろう。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【国際調査報告】