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▶ ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイー・オブ・カリフオルニアの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-27
(54)【発明の名称】神経保護のための遺伝子治療
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20240319BHJP
C12N 9/12 20060101ALI20240319BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20240319BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240319BHJP
C12N 5/0793 20100101ALI20240319BHJP
C07K 16/40 20060101ALI20240319BHJP
A61K 38/45 20060101ALI20240319BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240319BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240319BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240319BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240319BHJP
A61P 27/06 20060101ALI20240319BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240319BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54 ZNA
C12N9/12
C12N15/864 100Z
C12N5/10
C12N5/0793
C07K16/40
A61K38/45
A61K48/00
A61P25/00
A61P43/00 111
A61P27/02
A61P27/06
A61K35/76
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023562543
(86)(22)【出願日】2022-04-11
(85)【翻訳文提出日】2023-11-16
(86)【国際出願番号】 US2022024310
(87)【国際公開番号】W WO2022221218
(87)【国際公開日】2022-10-20
(31)【優先権主張番号】63/190,132
(32)【優先日】2021-05-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/173,904
(32)【優先日】2021-04-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507127440
【氏名又は名称】ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイー・オブ・カリフオルニア
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ウェルスビー，デレク・エス
(72)【発明者】
【氏名】ブー，マイ・ティー
(72)【発明者】
【氏名】リー，キャシディー・ディー
(72)【発明者】
【氏名】パテル，アミット・ケイ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB04
4B065BA02
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084BA44
4C084CA18
4C084DC25
4C084NA14
4C084ZA01
4C084ZA33
4C084ZC19
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZA01
4C087ZA33
4C087ZC19
4H045AA10
4H045BA01
4H045BA54
4H045CA40
4H045DA89
4H045EA21
4H045FA74
(57)【要約】
とりわけ、神経細胞死、例えば、網膜神経節細胞死を治療及び予防するための方法及び化合物が、本明細書に提供される。とりわけ、神経変性を治療及び予防するための方法及び化合物も、本明細書に提供される。本明細書で提供される方法及び化合物は、緑内障を治療又は予防し得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１の領域１～５２０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するアミノ酸セグメントを含むドミナントネガティブデュアルロイシンジッパーキナーゼ（ｄｎＤＬＫ）ポリペプチドをコードする核酸であって、前記ｄｎＤＬＫポリペプチドが、配列番号１を基準として決定される場合、少なくとも１つの変異を含み、前記変異が、３０２位の置換であり、前記置換が、スレオニン以外の任意のアミノ酸である、核酸。
【請求項2】
前記３０２位の置換が、Ｓ３０２Ａである、請求項１に記載の核酸。
【請求項3】
前記ｄｎＤＬＫポリペプチドが、５５０アミノ酸長未満である、請求項１に記載の核酸。
【請求項4】
前記ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４３位に置換を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項5】
前記４３位の置換が、Ｅ又はＤである、請求項４に記載の核酸。
【請求項6】
前記４３位の置換が、Ｅである、請求項５に記載の核酸。
【請求項7】
前記ｄｎＤＬＫポリペプチドが、１８５位に置換を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項8】
前記１８５位の置換が、Ｋ１８５Ａである、請求項７に記載の核酸。
【請求項9】
前記ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４２４位又は４２６位に置換を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項10】
前記ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４３１位、４３８位、４４０位、４４５位、４４７位、４８６位、４９１位、又は４９３位に置換を更に含む、請求項９に記載の核酸。
【請求項11】
前記ｄｎＤＬＫポリペプチドが、配列番号６又は配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項12】
配列番号１１に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項13】
（ＬＺＫ）によりホモ二量体化及びＤＬＫヘテロ二量体化を阻害するロイシンジッパーポリペプチドをコードする単離された核酸であって、前記ポリペプチドが、配列番号８に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号８を含む、核酸。
【請求項14】
前記ポリペプチドが、１５０アミノ酸長未満である、請求項１３に記載の核酸。
【請求項15】
配列番号１の領域１５８～５２０に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むドミナントネガティブデュアルロイシンジッパー（ｄｎＤＬＫ）ポリペプチドをコードする単離された核酸であって、前記ポリペプチドが、配列番号１を基準として決定される場合、少なくとも１つの変異を含み、前記少なくとも１つの変異が、３０２位にある、核酸。
【請求項16】
前記ｄｎＤＬＫポリペプチドが、Ｓ３０２位に置換を含み、前記置換が、スレオニン以外の任意のアミノ酸である、請求項１５に記載の核酸。
【請求項17】
前記置換が、Ｓ３０２Ａである、請求項１６に記載の核酸。
【請求項18】
前記ｄｎＤＬＫポリペプチドが、１８５位に置換を含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項19】
前記１８５位の置換が、Ｋ１８５Ａである、請求項１８に記載の核酸。
【請求項20】
前記ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４２４位及び／又は４２６位に置換を含む、請求項１５に記載の核酸。
【請求項21】
前記ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４３１位、４３８位、４４０位、４４５位、４４７位、４８６位、４９１位、又は４９３位に置換を更に含む、請求項２０に記載の核酸。
【請求項22】
請求項１に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項23】
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項２２に記載のベクター。
【請求項24】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項２３に記載のベクター。
【請求項25】
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１由来又は偽型ＡＡＶ由来のベクターである、請求項２４に記載のベクター。
【請求項26】
前記ベクターが、ＡＡＶ２．７ｍ８である、請求項２５に記載のベクター。
【請求項27】
ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を更に含む、請求項２２に記載のベクター。
【請求項28】
請求項１に記載の核酸又は請求項２２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項29】
前記宿主細胞が、ニューロンである、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項30】
前記ニューロンが、網膜神経節である、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項31】
前記宿主細胞が、哺乳動物細胞である、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項32】
前記宿主細胞が、ヒト細胞である、請求項３１に記載の宿主細胞。
【請求項33】
神経細胞死を阻害する方法であって、請求項１に記載の核酸又は請求項２２に記載のベクターを神経細胞に導入することを含む、方法。
【請求項34】
前記神経細胞が、エクスビボである、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記神経細胞が、インビボである、請求項３３に記載の方法。
【請求項36】
前記神経細胞が、眼ニューロンである、請求項３３に記載の方法。
【請求項37】
前記眼ニューロンが、網膜神経節である、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記神経細胞が、光受容体細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項39】
前記神経細胞が、哺乳動物である、請求項３３に記載の方法。
【請求項40】
前記ニューロンが、ヒト神経細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
神経細胞死の治療又は予防を必要とする対象においてそれを行う方法であって、請求項１に記載の核酸又は請求項２２に記載のベクターを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項42】
前記対象が、緑内障、加齢性黄斑変性、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、近視性ＣＮＶ、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、及び網膜静脈閉塞症を有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記対象が、遺伝性網膜疾患を有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項44】
前記遺伝性網膜疾患が、網膜色素変性症である、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
請求項１に記載の核酸によってコードされる、ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年５月１８日に出願された米国仮出願第６３／１９０，１３２号及び２０２１年４月１２日に出願された米国仮出願第６３／１７３，９０４号の優先権を主張し、これらの各々は、全ての目的のために参照により組み込まれる。
本出願は、２０２１年５月１８日に出願された米国仮出願第６３／１９０，１３２号及び２０２１年４月１２日に出願された米国仮出願第６３／１７３，９０４号の優先権を主張し、これらの各々は、全ての目的のために参照により組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
デュアルロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）及びロイシンジッパーキナーゼ（ＬＺＫ）は、神経細胞（網膜神経節細胞（ＲＧＣ）等の神経節細胞を含む）における軸索変性及び細胞死シグナル伝達を含む、神経キナーゼのシグナル伝達経路において役割を果たす（Ｗｅｌｓｂｉｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ９４：１１４２－５４，２０１７）。ＤＬＫの阻害及びノックダウンは、アルツハイマー病、緑内障、パーキンソン病及び他の神経変性状態の細胞及び動物モデルにおいて神経保護効果を有することが示されている。（Ｆｅｒｒａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｄｕａｌ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ ｋｉｎａｓｅ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５：１６）。ドミナントネガティブＤＬＫ（ｄｎＤＬＫ）活性を有するＤＬＫ変異体が記載されている（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２８：６７２－８０，２００８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】Ｗｅｌｓｂｉｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ９４：１１４２－５４，２０１７
【非特許文献2】Ｆｅｒｒａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｄｕａｌ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ ｋｉｎａｓｅ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５：１６
【非特許文献3】Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２８：６７２－８０，２００８
【発明の概要】
【0004】
一態様では、本明細書において、配列番号１の領域１～５２０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を有するアミノ酸セグメントを含むドミナントネガティブデュアルロイシンジッパーキナーゼ（ｄｎＤＬＫ）ポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドは、配列番号１を基準として決定される場合、少なくとも１つの変異を含み、変異は、４３位の置換、３０２位の置換、及び５１６位の置換から選択される、核酸が提供される。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、３０２位に置換を含み、置換は、スレオニン以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、３０２位の置換は、Ｓ３０２Ａである。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、４３位に置換を含む。いくつかの実施形態では、４３位の置換は、Ｅ又はＤである。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、置換Ｔ４３Ｅ及びＳ３０２Ａを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、１８５位に、Ｋ１８５Ａ等の置換を更に含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、５１６位に置換を含む。いくつかの実施形態では、５１６位の置換は、Ｇ５１６Ｖである。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、４２４位又は４２６位に置換を更に含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、４３１位、４３８位、４４０位、４４５位、４４７位、４８６位、４９１位、又は４９３位に置換を更に含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号６又は配列番号７のアミノ酸配列を含むドミナントネガティブデュアルロイシンジッパーキナーゼ（ｄｎＤＬＫ）ポリペプチドをコードする。
【0005】
別の態様では、本開示は、配列番号１の領域１５８～５２０に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むドミナントネガティブデュアルロイシンジッパー（ｄｎＤＬＫ）ポリペプチドをコードする単離された核酸であって、ポリペプチドは、配列番号１を基準として決定される場合、少なくとも１つの変異を含み、変異は、３０２位の置換及び５１６位の置換から選択される、核酸を提供する。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、Ｓ３０２位に置換を含み、置換は、スレオニン以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、置換は、Ｓ３０２Ａである。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、５１６位に置換、例えば、Ｇ５１６Ｖを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、１８５位に置換、例えば、Ｋ１８５Ａを更に含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、４２４位及び／又は４２６位に置換を含み、更なる実施形態では、４３１位、４３８位、４４０位、４４５位、４４７位、４８６位、４９１位、又は４９３位に置換を含む。
【0006】
更なる態様では、本開示は、（ＬＺＫ）によりホモ二量体化及びＤＬＫヘテロ二量体化を阻害するロイシンジッパーポリペプチドをコードする単離された核酸であって、ポリペプチドは、配列番号８に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、核酸を提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、１５０アミノ酸長未満である。
【0007】
別の態様では、本開示は、本明細書、例えば、本セクションの先行する段落に記載されるような核酸を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１由来又は偽型ＡＡＶ由来のベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ２．７ｍ８である。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を更に含む。
【0008】
更なる態様では、本開示は、本明細書に記載のドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸、又は核酸を含むベクターを含む、宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ニューロンは、網膜神経節である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞である。
【0009】
追加の態様では、本開示は、神経細胞死を阻害する方法であって、本明細書に記載のドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸、又は核酸を含むベクターを神経細胞に導入することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、神経細胞は、エクスビボである。いくつかの実施形態では、神経細胞は、インビボである。いくつかの実施形態では、神経細胞は、眼ニューロンである。いくつかの実施形態では、眼ニューロンは、網膜神経節である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、光受容体細胞である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、ヒト神経細胞である。
【0010】
別の態様では、本開示は、神経細胞死の治療又は予防を必要とする対象においてそれを行う方法であって、本明細書に記載のドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸、又は核酸を含むベクターを対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は、緑内障、加齢性黄斑変性、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、近視性ＣＮＶ、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、又は網膜静脈閉塞症を有する。いくつかの実施形態では、対象は、遺伝性網膜疾患を有する。いくつかの実施形態では、遺伝性網膜疾患は、網膜色素変性症である。
【0011】
別の態様では、本発明は、本明細書、例えば、本セクションの先行する段落に記載されるような、ドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸によってコードされるポリペプチドを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1A】新規のＤＬＫ／ＬＺＫベースの導入遺伝子は、既存のアプローチと比較して、網膜神経節細胞の生存率を確実に改善する。（Ａ）イムノパンニングしたＲＧＣを、様々な導入遺伝子を発現するレンチウイルスで形質導入し、ＤＬＫ／ＬＺＫ阻害剤の存在下で培養し、時間をかけてウイルス生活環及び導入遺伝子発現を完了させた。３～４日後、阻害剤を除去し、新規の導入遺伝子（Ｓ３０２Ａ、Ｄｅｌｔａ Ｃ末端ＤＬＫ）又は既知のドミナントネガティブ（Ｋ１８５Ａ）全長ＤＬＫの存在下で、３日後に生存量を測定した。（Ｂ）生存率は、ＬＺＫロイシンジッパー（ＬＺ）又は既知のドミナントネガティブＤＬＫ ＬＺの存在下で測定した。両方の場合において、新規の導入遺伝子は、より効果的であり（阻害剤の存在下で残った対照細胞の生存率に近づいた）、より強力であった。
【図1B】新規のＤＬＫ／ＬＺＫベースの導入遺伝子は、既存のアプローチと比較して、網膜神経節細胞の生存率を確実に改善する。（Ａ）イムノパンニングしたＲＧＣを、様々な導入遺伝子を発現するレンチウイルスで形質導入し、ＤＬＫ／ＬＺＫ阻害剤の存在下で培養し、時間をかけてウイルス生活環及び導入遺伝子発現を完了させた。３～４日後、阻害剤を除去し、新規の導入遺伝子（Ｓ３０２Ａ、Ｄｅｌｔａ Ｃ末端ＤＬＫ）又は既知のドミナントネガティブ（Ｋ１８５Ａ）全長ＤＬＫの存在下で、３日後に生存量を測定した。（Ｂ）生存率は、ＬＺＫロイシンジッパー（ＬＺ）又は既知のドミナントネガティブＤＬＫ ＬＺの存在下で測定した。両方の場合において、新規の導入遺伝子は、より効果的であり（阻害剤の存在下で残った対照細胞の生存率に近づいた）、より強力であった。
【図2】様々な変異体ＤＬＫポリペプチドの活性を示すデータを提供する。
【図3】ｄｎＤＬＫ ＡＡＶ又は対照ＡＡＶの投与後の緑内障のラットモデルにおける軸索の平均軸索健康スコア（左パネル）、及び軸索変性を評価することによって評価される視神経乳頭変性の平均パーセンテージを示すデータ（右パネル）を提供する。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明の様々な実施形態及び態様が本明細書に示され、説明されているが、そのような実施形態及び態様が単なる例として提供されていることは、当業者には理解されよう。本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置換がここで当業者に想起されるであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替案が、本発明の実施において用いられ得ることは理解されるべきである。
【0014】
本発明の実施は、当技術分野で既知の一般的な分子生物学技術を伴う。そのような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ Ｅｄ，２０１２）、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７－Ｖｏｌｕｍｅ １３３，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０２０）等の多数のマニュアルに記載されている。
【0015】
以下の定義は、本明細書で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするために提示され、本開示の範囲を限定することを意図していない。
【0016】
１．用語
「デュアルロイシンジッパーキナーゼ」（「ＤＬＫ」）は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰ３Ｋ）混合系統キナーゼファミリーのメンバーであり、ｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼスーパーファミリーのメンバーである。神経細胞死シグナル伝達を含む、神経キナーゼシグナル伝達経路において役割を果たす。ＤＬＫは、Ｎ末端ドメイン、触媒ドメイン、２つのロイシンジッパーを含むロイシンジッパードメイン、及びＣ末端ドメインを含む。例示的なヒトＤＬＫポリペプチド配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリーＱ１２８５２下で入手可能である。ヒトＤＬＫは、染色体領域１２ｑ１３．１３に細胞遺伝学的に局在するマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ１２遺伝子（ＭＡＰ３Ｋ１２）によってコードされる。「ヒトＤＬＫ」は、ヒトＭＡＰ３Ｋ１２遺伝子によってコードされる任意の対立遺伝子形態を指す。２つのタンパク質アイソフォーム、すなわち、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリーＱ１２８５２に示されるアイソフォーム１（配列番号１３に提供される配列）及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリーＱ１２８５２に示されるアイソフォーム２（配列番号１に提供される配列；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿０１１５３８７２５、タンパク質配列受託番号ＸＰ＿０１１５３７０２７も参照のこと）が同定されている。本明細書で使用される場合、「ＤＬＫ」は、ヒト及び非ヒトＤＬＫポリペプチド及びポリヌクレオチド、例えば、マウス又はラットのＤＬＫ配列等の哺乳動物のＤＬＫ配列を指す。以下の概略図は、Ｎ末端ドメイン、キナーゼドメイン、ロイシンジッパー、及びＣ末端ドメインを含む例示的な断片を示す。ヒトＤＬＫ配列番号１のロイシンジッパードメインは、約アミノ酸４２０～５００に対応し、７残基の繰り返しの４番目の位置にロイシンを有するロイシンジッパーモチーフに基づいて、アミノ酸７個分多く伸長していると定義することもできる。Ｎｉｈａｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：７２７３－７２７９，２０００も参照されたい）
「デュアルロイシンジッパーキナーゼ」（「ＤＬＫ」）は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰ３Ｋ）混合系統キナーゼファミリーのメンバーであり、ｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼスーパーファミリーのメンバーである。神経細胞死シグナル伝達を含む、神経キナーゼシグナル伝達経路において役割を果たす。ＤＬＫは、Ｎ末端ドメイン、触媒ドメイン、２つのロイシンジッパーを含むロイシンジッパードメイン、及びＣ末端ドメインを含む。例示的なヒトＤＬＫポリペプチド配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリーＱ１２８５２下で入手可能である。ヒトＤＬＫは、染色体領域１２ｑ１３．１３に細胞遺伝学的に局在するマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ１２遺伝子（ＭＡＰ３Ｋ１２）によってコードされる。「ヒトＤＬＫ」は、ヒトＭＡＰ３Ｋ１２遺伝子によってコードされる任意の対立遺伝子形態を指す。２つのタンパク質アイソフォーム、すなわち、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリーＱ１２８５２に示されるアイソフォーム１（配列番号１３に提供される配列）及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリーＱ１２８５２に示されるアイソフォーム２（配列番号１に提供される配列；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿０１１５３８７２５、タンパク質配列受託番号ＸＰ＿０１１５３７０２７も参照のこと）が同定されている。本明細書で使用される場合、「ＤＬＫ」は、ヒト及び非ヒトＤＬＫポリペプチド及びポリヌクレオチド、例えば、マウス又はラットのＤＬＫ配列等の哺乳動物のＤＬＫ配列を指す。以下の概略図は、Ｎ末端ドメイン、キナーゼドメイン、ロイシンジッパー、及びＣ末端ドメインを含む例示的な断片を示す。ヒトＤＬＫ配列番号１のロイシンジッパードメインは、約アミノ酸４２０～５００に対応し、７残基の繰り返しの４番目の位置にロイシンを有するロイシンジッパーモチーフに基づいて、アミノ酸７個分多く伸長していると定義することもできる。Ｎｉｈａｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：７２７３－７２７９，２０００も参照されたい）
【表1】
【0017】
ロイシンジッパーキナーゼ（ＬＺＫ）は、ＤＬＫに構造的に関連するＭＡＰ３Ｋファミリーメンバーであり、神経細胞死を含む神経シグナル伝達経路においても役割を果たす。ＬＺＫは、Ｎ末端ドメイン、触媒ドメイン（「キナーゼドメイン」）、２つのロイシンジッパーを含むロイシンジッパードメイン、及びＣ末端ドメインを含む。例示的なヒトＬＺＫポリペプチド配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリーＯ４３２８３下で入手可能である。ヒトＬＺＫは、染色体領域３ｑ２７．２に細胞遺伝学的に局在するマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ１３遺伝子（ＭＡＰ３Ｋ１３）によってコードされる。「ヒトＬＺＫ」は、ヒトＭＡＰ３Ｋ１３遺伝子によってコードされる任意の対立遺伝子形態を指す。ＬＺＫの５つのアイソフォームが同定されている。アイソフォーム１（Ｏ４２２８３－１）は、古典的アイソフォームとしてＵｎｉＰｒｏｔエントリーに示されている。アイソフォーム１のロイシンジッパードメインのアミノ酸配列は、配列番号８に提供される。本明細書で使用される場合、「ＬＺＫ」は、ヒト及び非ヒトＬＺＫポリペプチド及びポリヌクレオチド、例えば、マウス及びラットのＤＬＫ配列等の哺乳動物のＬＺＫ配列を指す。
【0018】
「ドミナントネガティブ」という用語は、内因性野生型ＤＬＫが発現するニューロンで発現したときに神経保護的である、ドミナントネガティブＤＬＫタンパク質バリアント（ｄｎＤＬＫ）又はＬＺＫロイシンジッパードメインポリペプチド（ｄｎＬＺ）若しくはそのバリアントを指す。特定の機構に拘束されることを意図するものではないが、ｄｎＤＬＫは、ＤＬＫホモ二量体化を阻害し得る。
【0019】
ポリペプチド配列の文脈における「バリアント」又は「変異体」は、典型的には、参照アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性、又は少なくとも８５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照アミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性、又は少なくとも９１％、９２％、９３％、若しくは９４％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性、又は少なくとも９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する。「バリアント」という用語は、例えば、参照配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％、又はそれよりも高い同一性を有し得るヌクレオチド配列にも適用される。
【0020】
ポリペプチドを発現するように細胞を遺伝子改変する文脈において、細胞に「導入される」という用語は、ポリヌクレオチドが細胞に入り、発現してタンパク質を生成する条件下で、細胞を、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと接触させることを指す。ｄｎＤＬＫ等のタンパク質に関連して、「細胞に導入される」という用語は、限定ではなく、例えば、ｄｎＤＬＫをコードする核酸を含むウイルスベクターの細胞の形質導入、及びコードされたタンパク質の発現を含む。
【0021】
２つ以上のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列の文脈において、「同一性」又は「パーセント同一性」という用語は、手動アライメント及び目視検査によって、あるいはＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２にそれぞれ記載されるＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴ ２．０の比較アルゴリズム（ヌクレオチド配列の場合）をデフォルトパラメータで使用して、又はアミノ酸配列の場合はＢＬＡＳＴＰをデフォルトパラメータで使用して測定される場合、比較ウィンドウ又は特定の領域にわたって最大の対応について比較し、整列させたときに、同じであるか、又は特定のパーセンテージの同じ（例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれよりも高い）同一性であるアミノ酸若しくはヌクレオチドを有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。ＢＬＡＳＴ分析のためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトから公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、クエリ配列中の長さＷの短いワードを識別することによって高スコアの配列ペア（ＨＳＰ）を識別することを伴い、これは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させたときに、何らかの正の値の閾値スコアＴと一致するか、又はそれを満たすかのいずれかである。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ、上記）。これらの初期近隣ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。次いで、ワードヒットを、累積アライメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に拡張する。ヌクレオチド配列の場合、累積スコアはパラメータＭ（一対の一致する残基に対する報酬スコア、常に＞０）及びＮ（不一致残基に対するペナルティスコア、常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算する。累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ現象した場合、１つ以上の負のスコアの残基アライメントの蓄積に起因して累積スコアがゼロ以下になった場合、又はいずれかの配列の末端に到達した場合は、各方向へのワードヒットの拡張を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、単語長（Ｗ）１１、期待閾値０．０５、Ｍ＝２、Ｎ＝－３、及び両方の鎖の比較をデフォルトとして用いる。アミノ配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、単語長（Ｗ）６、期待閾値０．０５、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照）をデフォルトとして用いる。
【0022】
目的のポリペプチド配列中の所与のアミノ酸残基の同定の文脈において使用される場合、「～に対応する」、「～を基準として決定される」、又は「～を基準として番号付けされる」という用語は、目的のポリペプチド配列を参照配列と最大限に整列させて比較した場合の、特定の参照アミノ酸配列における残基の位置を指す。したがって、例えば、ＤＬＫポリペプチドバリアント中のアミノ酸残基は、バリアントポリペプチド配列を配列番号１と最適に整列させたときに、バリアント中の残基が配列番号１のアミノ酸と整列する場合、ＤＬＫ配列の配列番号１のアミノ酸に「対応する」。参照配列と整列させたポリペプチドは、参照配列と同じ長さである必要はない。同様に、目的の核酸配列中の所与のヌクレオチドの同定の文脈において使用される場合、「～に対応する」、「～を基準として決定される」、又は「～を基準として番号付けされる」は、目的の核酸配列を参照配列と最大限に整列させて比較した場合の、特定のポリヌクレオチド参照配列におけるヌクレオチドの位置を指す。
【0023】
「置換」は、本明細書で使用される場合、１つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドの、それぞれ、異なるアミノ酸又はヌクレオチドによる置き換えを意味する。
【0024】
本明細書で使用される「保存的」置換は、側基鎖の電荷、極性、ヒドロパシー（疎水性、中性、若しくは親水性）、及び／又はサイズが維持されるようなアミノ酸の置換を指す。互いに置換され得るアミノ酸の例示的なセットは、（ｉ）正荷電アミノ酸Ｌｙｓ及びＡｒｇ、並びに約６のｐＨでのＨｉｓ、（ｉｉ）負荷電アミノ酸Ｇｌｕ及びＡｓｐ、（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐ、（ｉｖ）脂肪族疎水性アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅ、並びに疎水性アミノ酸Ｍｅｔ、（ｖ）非極性アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、及びＭｅｔ、（ｖｉ）小極性非荷電アミノ酸、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＡｓｎ等、（ｖｉｉ）中性親水性アミノ酸Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、（ｖｉｉｉ）小疎水性又は中性アミノ酸Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＰｒｏ、（ｉｘ）アミド含有アミノ酸Ａｓｎ及びＧｌｎ、並びに（ｘ）分岐アミノ酸Ｔｈｒ、Ｖａｌ、及びＩｌｅを含む。いくつかの実施形態では、保存的置換は、サイズに基づいてもよく、例えば、小アミノ酸は、Ｇｌｙ又はＡｌａ等の別の小アミノ酸で置換されてもよい。いくつかの実施形態では、ヒドロキシル含有アミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＴｙｒ）は、代替のヒドロキシル含有アミノ酸で置換されてもよい。本段落におけるアミノ酸の電荷への言及は、ｐＨ６～７での電荷を指す。
【0025】
「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、本明細書で使用される場合、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、並びに上記の合成形態及び混合ポリマーのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を指す。特定の実施形態では、ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、又はいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態、及びそれらの組み合わせを指す。この用語はまた、一本鎖及び二本鎖の形態のＤＮＡを含むが、これらに限定されない。加えて、ポリヌクレオチド、例えば、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡは、天然に存在するヌクレオチド、並びに天然に存在する及び／又は天然には存在しないヌクレオチド結合によって一緒に結合された修飾ヌクレオチドのいずれか又は両方を含み得る。当業者には容易に理解されるように、核酸分子は、化学的若しくは生化学的に修飾され得るか、又は非天然若しくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含有し得る。上記の用語はまた、一本鎖又は二本鎖の形態を含む、任意のトポロジーの立体構造を含むことも意図される。核酸配列への言及は、別途指定されない限り、その相補体を包含する。したがって、特定の配列を有する核酸分子への言及は、その相補配列を有する、その相補鎖を包含すると理解されるべきである。この用語はまた、同じポリペプチド配列をコードするコドン最適化核酸も含む。
【0026】
「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、別途指定されない限り、互換的に使用される。
【0027】
「単離」という用語は、核酸又はタンパク質に適用される場合、核酸又はタンパク質が、それが自然の状態で会合している他の細胞構成要素を本質的に含まないことを示す。これは、例えば、均質な状態であり得、乾式溶液又は水溶液のいずれかであり得る。純度及び均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィー等の分析化学技術を使用して判定される。調製物に存在する優勢な種であるタンパク質が、実質的に精製される。
【0028】
ドミナントネガティブタンパク質又はＬＺドメインポリペプチドの発現に関して本明細書で使用される「ベクター」という用語は、宿主細胞で発現されるｄｎＤＬＫ又はＬＺポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む組換え核酸構築物を指すと理解されたい。
【0029】
「ウイルスベクター」という用語は、宿主細胞内に導入遺伝子を送達するために使用される修飾ウイルスを指す。
【0030】
本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」という用語は、１つ以上のタンパク質の細胞で発現をもたらすように、遺伝子治療ベクターを用いて細胞内に導入することができる組換えポリヌクレオチド構築物を指す。本開示の文脈において、導入遺伝子は、コードされたタンパク質の発現を制御する調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等のうちの１つ以上）、ｍＲＮＡ安定化配列（例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント、ＷＰＲＥ）、バイシストロン性ｍＲＮＡの配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を可能にする配列、エピソームの維持に必要な配列（例えば、ＩＴＲ及びＬＴＲｓ）、Ｔｏｌｌ様若しくはＲＩＧ様受容体によるウイルス認識を回避若しくは阻害する配列（例えば、ＴＬＲ－７、－８、－９、Ｍ ＤＡ－５、ＲＩＧ－１及び／又はＤＡＩ）、及び／又は細胞への形質導入に必要な配列を含み得る。
【0031】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」及び「エンハンサープロモーター」という用語は、コード配列又は機能性ＲＮＡの発現を制御する（例えば、増加させる）ことが可能なＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、最小プロモーター（ＴＡＴＡボックス、及び転写開始部位を特定する役割を果たす他の配列からなる短いＤＮＡ配列）を含み得る。エンハンサー配列（例えば、上流エンハンサー配列）は、コード配列又は機能性ＲＮＡの発現を制御する（例えば、増加させる）ようにプロモーターと相互作用することができる調節エレメントである。本明細書で使用される場合、「プロモーター」への言及は、エンハンサー配列を含み得る。エンハンサーは、それが相互作用するプロモーター又はコード配列と近接している必要はない。
【0032】
プロモーター、エンハンサー、及び他の調節配列は、コードされたｍＲＮＡ又はタンパク質の発現又は安定性にそれらが影響を与える場合、タンパク質又はＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と「動作可能に連結されている」。
【0033】
「対象」、「患者」、又は「個体」という用語は、ヒトを含むがこれらに限定されない任意の哺乳動物を指すために本明細書において互換的に使用される。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジー）、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、又は任意の他の哺乳動物であり得る。いくつかの実施形態では、「対象」、「患者」、又は「個体」は、ヒトである。
【0034】
２．神経保護活性を有するドミナントネガティブポリペプチド。
２．１ ドミナントネガティブＤＬＫ配列
一態様では、本開示は、ドミナントネガティブＤＬＫ（ｄｎＤＬＫ）ポリペプチド、及びｄｎＤＬＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ｄｎＤＬＫは、神経節細胞、例えば、網膜神経節細胞等の神経細胞に導入されたときに神経保護的である。この文脈における「神経保護的」という用語は、ｄｎＤＬＫポリペプチドを発現するように本明細書に記載されるように操作された神経細胞の集団において、ｄｎＤＬＫポリペプチドを発現しない対照神経細胞集団と比較して、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％、又はそれ以上、神経細胞死を阻害するｄｎＤＬＫの能力を指す。限定ではなく、例示として、神経保護活性は、後述のセクション５に記載される方法を用いて測定することができる。神経保護に関する他のアッセイは、画像ベースの生細胞／死細胞の計数、又はリン酸化ＪＵＮ等のレポーター免疫蛍光法を含む。
２．１ ドミナントネガティブＤＬＫ配列
一態様では、本開示は、ドミナントネガティブＤＬＫ（ｄｎＤＬＫ）ポリペプチド、及びｄｎＤＬＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ｄｎＤＬＫは、神経節細胞、例えば、網膜神経節細胞等の神経細胞に導入されたときに神経保護的である。この文脈における「神経保護的」という用語は、ｄｎＤＬＫポリペプチドを発現するように本明細書に記載されるように操作された神経細胞の集団において、ｄｎＤＬＫポリペプチドを発現しない対照神経細胞集団と比較して、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％、又はそれ以上、神経細胞死を阻害するｄｎＤＬＫの能力を指す。限定ではなく、例示として、神経保護活性は、後述のセクション５に記載される方法を用いて測定することができる。神経保護に関する他のアッセイは、画像ベースの生細胞／死細胞の計数、又はリン酸化ＪＵＮ等のレポーター免疫蛍光法を含む。
【0035】
ヒトＤＬＫは、２つのアイソフォームで存在する。配列番号１は、Ｕｎｉｐｒｏｔエントリー１２８５２に「アイソフォーム２」として示されるアイソフォームの配列であり、残基位置の説明のための参照配列として本明細書において使用される。配列番号１に関連して本明細書に記載される変異は、配列番号１及び／又は配列番号１３に導入され得ることが理解されるであろう。アイソフォームは、参照配列の残基４６で互いに異なる。Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１２８５２エントリーのアイソフォーム１（配列番号１３）は、４６位にヒスチジンを含む。このＨ残基は、Ｑ１２８５２アイソフォーム２（配列番号１）において、配列ＱＣＶＬＲＤＶＶＰＬＧＧＱＧＧＧＧＰＳＰＳＰＧＧＥＰＰＰＥＰＦＡＮＳによって置き換えられ、これにより、配列番号１３に示されるポリペプチド配列よりも３３アミノ酸長いが、その他の点では配列が同一であるポリペプチドが得られる。
【表2】
【0036】
いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも８０％、又は少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するＤＬＫ触媒領域、及び配列番号３に対して少なくとも８０％、又は少なくとも８５％の同一性を有するロイシンジッパードメインを含み、ｄｎＤＬＫは、配列番号１を基準として決定される場合、３０２及び／又は５１６位に変異を含み、残基が、配列番号１のその位置に存在する残基に対して置換されている。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、８９０アミノ酸長以下、８５０アミノ酸長以下、７５０アミノ酸長以下、６５０アミノ酸長以下、５５０アミノ酸長以下、４５０アミノ酸長以下、又は４００、３９０、３８０、３７０、若しくは３６０アミノ酸長以下である。例えば、配列番号１の全長配列に関して、いくつかの実施形態では、３００超のアミノ酸、又は３５０超のアミノ酸、又は３７０超のアミノ酸を、配列番号１のＣ末端から欠失させることができる。いくつかの実施形態では、１０、２０、３０、４０、５０、６０、又はそれより多くのアミノ酸を配列番号１のＮ末端から欠失させることができる。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、又は少なくとも９４％の同一性を有するＤＬＫ触媒領域、及び配列番号３に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、又は少なくとも９４％の同一性を有するロイシンジッパードメインを含み、３０２及び／又は５１６位に変異を含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するＤＬＫ触媒領域、及び配列番号３に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するロイシンジッパードメインを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、３０２位に置換を含み、３０２位の残基は、スレオニン以外の任意のアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは３０２位にＡを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫは、３０２位に残基Ｇ、Ｖ、Ｌ、又はＩを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、３０２位のＳに対して、スレオニン以外の保存的置換、例えば、Ｎ又はＱを含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＫポリペプチドは、５１６位に置換を含み、例えば、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、Ｇ以外の任意のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、５１６位にＶを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫは、５１６位にＩ又はＬを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、本明細書、例えば、本段落に記載されるような３０２位の置換及び５１６位の置換を含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、配列番号１を基準として決定される場合、１８５位に置換を更に含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、１８５位にＡを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、１８５位にＧ、Ｖ、Ｌ、又はＩを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、３０２位及び／又は５１６位に置換を含み、配列番号１を基準として決定される場合、４２４位及び／又は４２６位に置換を更に含み、任意選択的に、ポリペプチドが４２４位及び／又は４２６位に置換を含む場合、４３１位、４３８位、４４０位、４４５位、４４７位、４８６位、４９１位、又は４９３位に置換を含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、Ｄ又はＥを４２４位に、及び／又はＤ又はＥを４２６位に含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、以下のうちの１つ以上を更に含む：位置４３１のＲ、位置４３８のＤ又はＥ、位置４４０のＤ又はＥ、位置４４５のＤ又はＥ、位置４４７のＤ又はＥ、位置４８６のＲ、位置４９１のＤ又はＥ、及び位置４９３のＤ又はＥ。
【0037】
いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、又は少なくとも９４％の同一性を有するＤＬＫ触媒領域、及び配列番号３に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、又は少なくとも９４％の同一性を有するロイシンジッパードメイン、又は２つのロイシンジッパーを含む少なくとも９５個の連続アミノ酸のロイシンジッパードメインの断片を含み、ｄｎＤＬＫは、３０２位にＳ又はＴ以外の任意のアミノ酸を含み、その位置は、配列番号１を基準として決定される。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する領域と、配列番号３に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するロイシンジッパードメインと、２つのロイシンジッパーを含む少なくとも９５個の連続したアミノ酸のロイシンジッパードメインの断片とを含み、ｄｎＤＬＫは、３０２位にＳ又はＴ以外の任意のアミノ酸を含み、その位置は、配列番号１を基準として決定される。いくつかの実施形態では、ロイシンジッパードメインの断片は、２つのロイシンジッパー配列を含むが、ロイシンジッパードメインのＣ末端領域から１、２、３、４、若しくは５個のアミノ酸、又は最大１０個のアミノ酸、又は最大２０個のアミノ酸を欠いており、しかしながら、ロイシンジッパー１又はロイシンジッパー２のアミノ酸は欠失していない。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、３０２位にＡを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、３０２位にＧ、Ｖ、Ｌ、又はＩ等の残基を含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、３０２位にＱ又はＮを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、Ｎ末端ドメイン（配列番号１の２位から配列番号１の触媒ドメインの第１の残基までの配列番号１の領域）、又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫは、４３位にＤ又はＥを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、Ｅを４３位に含む。
【0038】
以下のセクション５．２．１で論じられるように、残基３０２に置換変異（例えば、Ｓ３０２Ａ）を導入すると、ＤＬＫ Ｋ１８５Ａバリアントよりも高い神経保護活性を有するｄｎＤＮＫが得られる。以下のセクション５．２．６で論じられるように、残基５１６に置換変異（例えば、Ｇ５１６Ｖ）を導入すると、ｄｎＤＮＫが得られる。以下のセクション５．２．２で論じられるように、ｄｎＤＬＫのＣ末端からの３６２残基の欠失によってセクション５．２．２に示される＞３５０残基の欠失は、ｄｎＤＬＫの保護活性に悪影響を及ぼさない。例えば、セクション５．２．３で論じられるように、Ｓ３０２Ａ ｄｎＤＬＫからのＣ末端領域の欠失は、変異体の保護活性を低下させず、いくつかの実施形態では、保護活性を増強する。
【0039】
いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２～５２０に対して少なくとも８０％、又は少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する領域を含み、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、配列番号１を基準として決定される場合、４３位、３０２位、又は５１６位に１つ以上の変異を含み、残基が、配列番号１のその位置の残基に対して置換されている。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～５２０に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、又は少なくとも９４％の同一性を有する領域を含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～５２０に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する領域を含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～５２０の３００アミノ酸領域に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、又は少なくとも９４％の同一性を有する領域を含み、配列番号１を基準として決定される場合、また以下に更に提供されるように、４３位、３０２位、又は５１６位に１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～５２０の３００アミノ酸領域に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する領域を含み、配列番号１を基準として決定される場合、また以下に更に提供されるように、４３位、３０２位、又は５１６位に１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、配列番号６又は配列番号７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫは、４３位及び３０２位に置換を含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、３０２位及び５１６位に置換を含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、４３位及び５１６位に置換を含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、４３位、３０２位、及び５１６位の各々に変異を含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、３０２位に置換を含み、３０２位の残基は、スレオニン以外の任意のアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、３０２位にＡを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫは、３０２位に残基Ｇ、Ｖ、Ｌ、又はＩを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、３０２位のＳに対して、スレオニン以外の保存的置換、例えば、Ｎ又はＱを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、４３位にＤ又はＥを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、４３位にＥを含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＫポリペプチドは、５１６位に置換を含み、例えば、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、Ｇ以外の任意のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、５１６位にＶを含むか、又は５１６位にＩ若しくはＬを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬｋポリペプチドは、３０２位にＡを含み、４３位にＥを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、８５０アミノ酸長以下、７５０アミノ酸長以下、６５０アミノ酸長以下、又は５５０アミノ酸長以下である。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、４３位、３０２位及び／又は５１６位に置換を含み、配列番号１を基準として決定される場合、１８５位に置換を更に含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、３０２位及び１８５位の置換、３０２位及び５１６位の置換、又は３０２位、５１６位、及び１８５位の置換を含む。いくつかの実施形態では、そのようなｄｎＤＬＫポリペプチドは、４３位に置換を更に含むことができる。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、１８５位にＡを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、４３位、３０２位及び／又は５１６位の置換（及び任意選択的に、１８５位の置換）を含み、配列番号１を基準として決定される場合、４２４位及び／又は４２６位の置換を更に含み、任意選択的に、ポリペプチドが４２４位及び／又は４２６位の置換を含む場合、４３１位、４３８位、４４０位、４４５位、４４７位、４８６位、４９１位、又は４９３位の置換を含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、４２４位にＤ若しくはＥを含み、かつ／又は４２６位にＤ若しくはＥを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、以下のうちの１つ以上を更に含む：４３１位のＲ、４３８位のＤ又はＥ、４４０位のＤ又はＥ、４４５位のＤ又はＥ、４４７位のＤ又はＥ、４８６位のＲ、４９１位のＤ又はＥ、及び４９３位のＤ又はＥ。
【0040】
いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、配列番号６に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、若しくは少なくとも９４％の同一性、又は配列番号６に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｄｎＤＬＫは、配列番号１を基準として番号付けされる場合、３０２位にＳ又はＴ以外の任意のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、３０２位にＡを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、３０２位にＧ、Ｖ、Ｌ、又はＩ等の残基を含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、３０２位にＱ又はＮを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、配列番号６を含む。
【0041】
いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、配列番号７に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、若しくは少なくとも９４％の同一性、又は配列番号７に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｄｎＤＬＫは、配列番号１を基準として番号付けされる場合、３０２位にＳ又はＴ以外の任意のアミノ酸を含み、配列番号１を基準として決定される場合、４３位に置換を含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、３０２位にＡを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、３０２位にＧ、Ｖ、Ｌ、又はＩ等の残基を含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、３０２位にＱ又はＮを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、４３位にＤ又はＥを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、４３位にＥを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、３０２位にＡを含み、４３位にＥを含む。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチドは、配列番号７を含む。
【0042】
２．２ ＤＬＫのドミナントネガティブ阻害剤であるＬＺＫ配列
セクション５．２．４で論じられるように、我々は、驚くべきことに、ＬＺＫロイシンジッパードメイン（ＬＺポリペプチド）が強力な神経保護活性を有することを発見した。ＬＺドメインを神経細胞、例えば、網膜神経節細胞に導入することにより、治療上の利益を得ることができる。
セクション５．２．４で論じられるように、我々は、驚くべきことに、ＬＺＫロイシンジッパードメイン（ＬＺポリペプチド）が強力な神経保護活性を有することを発見した。ＬＺドメインを神経細胞、例えば、網膜神経節細胞に導入することにより、治療上の利益を得ることができる。
【0043】
一態様では、本開示は、ＤＬＫホモ二量体化を阻害するＬＺＫロイシンジッパードメインを含むポリペプチドを更に提供し、ポリペプチドは、神経節細胞、例えば、網膜神経節細胞等の神経細胞に導入されたときに神経保護的である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号８に対して少なくとも９５％の同一性、又は少なくとも９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＺＫポリペプチドは、配列番号８を含む。いくつかの実施形態では、ＬＺＫポリペプチドは、１５０アミノ酸長未満、又は１２０アミノ酸長未満である。便宜上、ＤＬＫを阻害するそのようなＬＺＫポリペプチド、及びポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書において「ｄｎＤＬＫ／ＬＺＫ」配列と称される。
【0044】
２．３ バリアントの活性
神経細胞死を阻害する本明細書に記載のバリアントは、様々なアッセイを用いて特定することができる。いくつかの実施形態では、バリアントは、神経細胞死を阻害する能力について評価される。
神経細胞死を阻害する本明細書に記載のバリアントは、様々なアッセイを用いて特定することができる。いくつかの実施形態では、バリアントは、神経細胞死を阻害する能力について評価される。
【0045】
神経細胞死の阻害を評価するための例示的なアッセイが、実施例に提供される。このアッセイは、網膜神経節細胞の文脈において説明される。簡潔に述べると、例えば、ｄｎＤＬＫ又はｄｎＤＬＫ／ＬＺＫポリペプチドを発現するレンチウイルスベクターを使用して、バリアント及び対照、例えば空のベクター対照等を、各々、初代網膜神経節細胞の集団に導入する。レンチウイルスｄｎＤＬＫ又はｄｎＤＬＫ／ＬＺＫタンパク質が発現している間に細胞死を防止するために、ＤＬＫ／ＬＺＫ阻害剤、例えば、ＧＮＥ ３５１１を使用して細胞を維持する。形質導入後３～５日目に、ｄｎＤＬＫ又はｄｎＤＬＫ／ＬＺＫタンパク質が発現してから（例えば、ｍＳｃａｒｌｅｔレポーター発現によって示される）、初代ＲＧＣからＧＮＥ ３５１１を除去し、細胞死を開始させる。５０％体積のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ８４６２）を添加することによって、ＧＮＥ除去後３日目の生存［相対光単位（ＲＬＵ）］について細胞をアッセイした。発光は、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定することができる。細胞死のレベルは、アッセイの期間を通してＧＮＥ３５１１（陽性対照）で処理した対照細胞のレベルと比較することができるか、又はＧＮＥ３５１１を除去した対照細胞（陰性対照）と比較して決定することができる。本明細書に記載のバリアントｄｎ ＤＬＫ又はバリアントｄｎＤＬＫ／ＬＺＫポリペプチドは、典型的には、化学的ＤＬＫ／ＬＺＫ阻害剤、例えば、ＧＮＥ３５１１を使用して得られる細胞生存レベルと比較して、少なくとも２０％、しばしば少なくとも３０％、若しくは少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、又はそれ以上の保護を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のバリアントｄｎＤＬＫ又はバリアントｄｎＤＬＫ／ＬＺＫポリペプチドは、対照と比較して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又はそれ以上の保護を有する。
【0046】
いくつかの実施形態では、バリアントの活性を評価するために代替のアッセイが用いられる。フローサイトメトリー、カスパーゼ活性化、及び細胞内ＡＴＰの測定に基づくものを含む、多くのそのようなアッセイが既知である。例えば、好適なアッセイは、示された生細胞に対するカルセインＡＭ等の細胞封入色素、又は死細胞若しくは瀕死の細胞を示すためのＲｅｄｄｏｔ１等の細胞除外ベースの色素を使用した、画像ベースの生細胞／死細胞の計数を含む。代替的に、リン酸化ＪＵＮ又は他の下流ＤＬＫ経路メンバーの免疫蛍光は、ＤＬＫ経路を阻害する際のｄｎＤＬＫ又はｄｎＤＬＫ／ＬＺＫ構築物の有効性のマーカーとして用いることができる。
【0047】
３．ポリヌクレオチド／発現ベクター
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のドミナントネガティブポリペプチドをコードする単離された核酸、核酸を含む発現ベクター、及び発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。ドミナントネガティブポリペプチドを産生するための発現系は、例えば、酵母、昆虫、鳥類、及び哺乳動物の発現系を含む、原核生物系及び真核生物系を含む。例示的な発現系は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（上記）及びＡｕｓｂｅｌ（上記）に記載されている。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のドミナントネガティブポリペプチドをコードする単離された核酸、核酸を含む発現ベクター、及び発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。ドミナントネガティブポリペプチドを産生するための発現系は、例えば、酵母、昆虫、鳥類、及び哺乳動物の発現系を含む、原核生物系及び真核生物系を含む。例示的な発現系は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（上記）及びＡｕｓｂｅｌ（上記）に記載されている。
【0048】
ドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸の発現のための好適な真核生物プロモーター（すなわち、真核細胞内で機能するプロモーター）の非限定的な例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期遺伝子プロモーター；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子プロモーター；早期及び後期ＳＶ４０プロモーター；レトロウイルス由来の長い末端反復；ヒト伸長因子－１プロモーター；ニワトリβアクチンプロモーター；ウシ成長ホルモンプロモーター；ニワトリβアクチンプロモーターに融合されたＣＭＶエンハンサー、ニワトリβアクチン遺伝子の第１のエクソン及び第１のイントロン、並びにβグロビンスプライスアクセプターを含むハイブリッド構築物；マウス幹細胞ウイルスプロモーター、ホスホグリセラートキナーゼ１遺伝子座プロモーター、及びユビキチン遺伝子プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、神経細胞において活性である。
【0049】
発現ベクターはまた、他の要素、例えば、リボソーム結合部位、転写ターミネーター等を含み得る。
【0050】
本開示のドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸は、細胞への送達のための送達ビヒクル中に又は送達ビヒクルの表面に充填することを含む、様々な送達方法を用いて宿主細胞に導入することができる。送達ビヒクルとしては、ナノスフィア、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、ポリエチレングリコール粒子、ヒドロゲル、及びミセルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、標的化部分を使用して、そのようなビヒクルと所望の細胞型又は位置との選択的な相互作用を強化することができる。いくつかの実施形態では、核酸は、ウイルス感染、トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション核酸切除、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、粒子銃技術、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達等によって宿主細胞に導入される。
【0051】
３．１ 遺伝子治療ベクター
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のドミナントネガティブポリペプチドを発現させるように、エクスビボ又はインビボのいずれかで、細胞、例えば、神経細胞を遺伝子改変するための遺伝子治療ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子治療ベクターは、例えば、裸のＤＮＡとして送達することができるか、又は脂質、リポソーム、ナノ粒子若しくはポロキサマー等の送達製剤と複合体を形成することができるプラスミドベクターである。
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のドミナントネガティブポリペプチドを発現させるように、エクスビボ又はインビボのいずれかで、細胞、例えば、神経細胞を遺伝子改変するための遺伝子治療ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子治療ベクターは、例えば、裸のＤＮＡとして送達することができるか、又は脂質、リポソーム、ナノ粒子若しくはポロキサマー等の送達製剤と複合体を形成することができるプラスミドベクターである。
【0052】
他の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターの非限定的な例としては、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、エンテロウイルス、パポバウイルス、ポリオウイルス、並びに他の陽性及び陰性の鎖状ＲＮＡウイルス、ウイロイド、及びウイルソイド、又はそれらの一部が挙げられるが、これらに限定されない。
【0053】
導入遺伝子は、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、翻訳効率、又はドミナントネガティブポリペプチドの効率的かつ安定な発現に影響を及ぼす他の態様に影響を与える、上流、下流、又はコード配列内に位置する調節配列を含み得る。このような調節配列の例としては、プロモーター、エンハンス、ポリアデニル化配列等が挙げられる。
【0054】
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ウイルスベクターを使用して送達される導入遺伝子の発現を増強するように、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）等の転写後調節エレメントを更に含む。
【0055】
３．１．１ ＡＡＶベクター
いくつかの実施形態では、遺伝子治療ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ１１３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ．ＡＮＣ８０、Ａｎｃ８０Ｌ６５及び誘導体、ＡＡＶＤＪ、並びにそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない任意のＡＡＶ血清型を、神経細胞にドミナントネガティブポリペプチドを導入するための組換えＡＡＶを生成するために使用することができる。天然に存在するＡＡＶ血清型のバリアントを含む、例示的なＡＡＶ血清型の広範なリストは、米国特許第１０，６６２，４２５号に提供される。
いくつかの実施形態では、遺伝子治療ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ１１３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ．ＡＮＣ８０、Ａｎｃ８０Ｌ６５及び誘導体、ＡＡＶＤＪ、並びにそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない任意のＡＡＶ血清型を、神経細胞にドミナントネガティブポリペプチドを導入するための組換えＡＡＶを生成するために使用することができる。天然に存在するＡＡＶ血清型のバリアントを含む、例示的なＡＡＶ血清型の広範なリストは、米国特許第１０，６６２，４２５号に提供される。
【0056】
ウイルス配列は、ＤＮＡの複製及びビリオンへのパッケージング（例えば、機能的ＩＴＲ）のためにシスで必要とされるＡＡＶの配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ＷＴ遺伝子のうちの１つ以上が全体的に又は部分的に欠失しているが、機能的な隣接ＩＴＲ配列を保持する。ＡＡＶビリオン又はＡＡＶ粒子は、ＡＡＶキャプシドタンパク質及びＡＡＶベクターを含む。ある場合には、ＡＡＶは、ハイブリッド又はキメラＡＡＶであり、例えば、ＡＡＶ粒子は、キャプシド血清型と比較して異種血清型のものであるＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、又はＡＡＶ８キャプシドを有するＡＡＶ２ ＩＴＲ）を含むことができる。ＡＡＶ ＩＴＲは、特定の用途に好適な任意の血清型であり得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ８Ｒ等のＡＡＶ血清型がベクターとして用いられる。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ２血清型、例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８の誘導体である。
【0057】
ＡＡＶベクターを使用するための方法は、例えば、Ｔａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．７：２７９（２０００）、及びＭｏｎａｈａｎ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ７：２４（２０００）に記載されており、これらの各々の開示は、遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関するものとして、参照により本明細書に組み込まれる。導入遺伝子をビリオンにパッケージングするために、ＩＴＲは、導入遺伝子と同じ構築物中でシスに必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子は、トランスで供給され得る。組換えＡＡＶビリオンの構築は、例えば、米国特許第５，１７３，４１４号、同第５，１３９，９４１号、同第５，８６３，５４１号、同第５，８６９，３０５号、同第６，０５７，１５２号、及び同第６，３７６，２３７号、並びにＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ７６：７９１（２００２）及びＢｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：４２３（２００３）にも記載されており、これらの各々開示は、遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関するものとして、参照により本明細書に組み込まれる。また、Ｚｏｌｏｔｕｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＳＥＲＯＴＹＰＥ １，２，ＡＮＤ ５ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ ＡＤＥＮＯ－ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＶＩＲＡＬ ＶＥＣＴＯＲＳ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８－１６７も参照されたい。
【0058】
いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫ又はｄｎＤＬＫ／ＬＺＫポリペプチドをコードする導入遺伝子は、神経保護特性を有する別のタンパク質をコードする導入遺伝子と組み合わせて投与される。上述したように、ｄｎＤＬＫのＣ末端部分の欠失は、タンパク質の保護活性を低下させない。切断されたｄｎＤＬＫをコードする導入遺伝子のより小さいサイズは、１つより多くのポリペプチド、例えば、１つより多くの神経保護ポリペプチドをコードする構築物の設計において有利である。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫ又はｄｎＤＬＫ／ＬＺＫポリペプチドをコードする構築物は、例えば、緑内障治療のために眼内圧を低下させるポリペプチドをコードする導入遺伝子、又は疾患の病態に関連するタンパク質をコードする導入遺伝子を更に含んでもよい。限定ではなく、例えば、ｄｎＤＬＫ又はｄｎＤＬＫ／ＬＺＫポリペプチドをコードする導入遺伝子及びドミナントネガティブＳＡＲＭ１が使用されてもよい（ＷＯ２０１９／０７９５７２，“Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓａｒｍ１ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ａｓ Ａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｙ Ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｏｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ”、Ｇｅｉｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１９，“Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＳＡＲＭ１ ｂｌｏｃｋｓ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｘｏｎ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ”Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２１６：２９４－３０３）を参照されたい）。別の例として、組換えＡＡＶベクターは、ｄｎＤＬＫポリペプチド又はｄｎＤＬＫ／ＬＺＫポリペプチド、及びインスリン様成長因子等のポリペプチドを発現し得る（例えば、Ｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７，“Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－Ｉ ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｒａｔｓ．”Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ：Ｓｐｉｎｅ ６（１）、Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，“Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－Ｉ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｎ ｍｏｔｏｒ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｉｎ ａｇｉｎｇ ｒａｔｓ．”Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １７７：１９５－２０６、Ｓｃｈｗｅｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，２０１８，“Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｎｇ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｌｏｎｇ－Ｔｅｒｍ Ｉｎｓｕｌｉｎ－Ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－Ｉ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ ｏｆ Ａｇｅｄ Ｒａｔｓ ｗｉｔｈ Ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．”Ｒｅｊｕｖ．Ｒｅｓ．２１（２）：１０２－１０８を参照されたい）。別の例として、ＮＭＮＡＴ１（ＥＣ２．７．７．１）タンパク質等のニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）ポリペプチドを、ｄｎＤＬＫ又はｄｎＤＬＫ／ＬＺＫポリペプチドとともに発現させてもよい（Ｂａｂｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＮＭＮＡＴ１ ｔｏ ａｘｏｎｓ ａｎｄ ｓｙｎａｐｓｅｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｓ ｉｔｓ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｐｏｔｅｎｃｙ ｉｎ ｖｉｖｏ”Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３０（４０）：１３２９１－３０４）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＮＭＮＡＴポリペプチドは、細胞質に主に見られるＮＭＮＡＴポリペプチド、例えば、核局在化シグナルで変異したＣｙｔＮＭＮＡＴ１（Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２６：８４８４－８４９１，２００６）、ＮＭＮＡＴ２ポリペプチド若しくは細胞内標的化ドメインに欠失を有するＮＭＮＡＴ２ポリペプチド（Ｍｉｌｄｅ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．３：２５６７，２０１３）、又はＮＭＮＡＴ３ポリペプチド（Ｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０（４３），３６３３４－３６３４１，２００５）である。更なる例として、オステオポンチンを発現させてもよい（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，“Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ ｒｅｄｕｃｅｄ ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｓｃｈｅｍｉａ ｎｅｏｎａｔａｌ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ｂｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ａ ｒａｔ ｐｕｐ ｍｏｄｅｌ．”Ｓｔｒｏｋｅ ４２（３）：７６４－７６９を参照されたい）。別の例として、グルカゴン様ペプチド１を発現させてもよい（Ｈｏｌｓｃｈｅｒ，２０１２，“Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｇｌｕｃａｇｏｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ－１（ＧＬＰ－１）ｉｎ Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．”ＣＮＳ Ｄｒｕｇｓ ２６：８７１－８８２、Ｖｅｌｍｕｒｕｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，“Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－１ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．”Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１２３（６）：９１９－９３１、ＷＯ２００９／０３９９６４Ａ２（“Ｕｓｅ ｏｆ ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ”）。別の例として、脳由来神経栄養因子を発現させてもよい（Ｏｓｂｏｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８，“Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｔｉｎａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｔｈａｔ ａｃｈｉｅｖｅｓ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ／ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｂ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．”Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ＆Ｄｉｓｅａｓｅ ９：１００７を参照されたい）。ｄｎＤＬＫ又はｄｎＤＬＫ／ＬＺＫポリペプチドとともに発現させることができるタンパク質の更なる例としては、緩徐なウォーラー変性ポリペプチド（Ｗｌｄｓ）（例えば、Ｃｏｎｆｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７：１１３７７－８２，２０００）、ドミナントネガティブＲｈｏキナーゼ（例えば、Ａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７４：３２４１８－２４，１９９９）、又はＭＭＰ－３等のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）（例えば、Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２６：１２３０－２４６，２０１７）、又はＭＭＰ－１（Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒ．２３：４３８－４９，２０１６）が挙げられる。あるアプローチでは、２つ以上の遺伝子が、同じＲＮＡ転写産物によって（ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶ中のバイシストロン発現カセットを使用して）コードされ得る。例えば、あるアプローチでは、２つの遺伝子の発現が双方向プロモーターによって制御される（Ｖｏｇｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｅｎａｂｌｅ ｒａｐｉｄ ｍｕｌｔｉ－ｇｅｎｅ ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ”Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ９，３５８９、Ｔｒｉｎｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，“Ａｎ Ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｏｆ Ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ”Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１４：６２－６６、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６，“Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｂｙ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｏｕｂｌｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ”Ｃｈｉｎ Ｍｅｄ Ｊ（Ｅｎｇｌ）１１９：１３６５－１３７３）。いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫ又はｄｎＤＬＫ／ＬＺＫポリペプチドをコードする導入遺伝子は、神経保護特性を有するポリペプチドをコードする内因性遺伝子のプロモーターを活性化するために、ガイドＲＮＡと組み合わせて投与される。
【0059】
いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬｋ又はｄｎＤＬＫ／ＬＺＫポリペプチドをコードする導入遺伝子は、神経保護に関与するポリペプチド、例えば、ＳＣＧ１０／ＳＴＭＮ２、ＢＣＬ－ＸＬ、又はＴＲＫＢポリペプチドをコードする核酸と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、アクアポリン、ＣＮＴＦポリペプチド（シグナル配列を有する）、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、又はＮＧＦポリペプチドである。いくつかの実施形態では、補体阻害剤ポリペプチドが発現される。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ－１Ｒ若しくはＧＬＰ－１ポリペプチド、又はＣＤＫＮ２Ｂ－ＡＳ１ポリペプチドが発現される。いくつかの実施形態では、ＧＬＤＮ、ＣＨＬ１、ＱＰＣＴ、ＴＢＸ２０、ＤＧＫＧ、ＴＩＭＰ２、ＥＧＲ１、ＥＯＭＥＳ、ＪＵＮＢ、ＩＧＦＢＰ２、ＯＳＴＦ１、ＦＧＦ１、ＳＥＭＡ５Ａ、ＥＳＲＲＧ、ＫＢＴＢＤ１１、ＲＡＭＰ１、ＥＴＬ４、ＰＲＫＣＱ、ＣＴＸＮ３、ＮＤＮＦ、ＭＡＮ１Ａ、ＳＤＫ２、ＰＲＰＨ、ＳＤＫ１、又はＩＦＩ２７ポリペプチドが発現される。代替的な実施形態では、ｄｎＤＬＫ又はｄｎＤＬＫ／ＬＺＫポリペプチドをコードする導入遺伝子は、内因性神経保護遺伝子のプロモーターを活性化するために、ＣＲＩＳＰＲタンパク質／ガイドＲＮＡと組み合わせて投与される。本段落の目的のために、遺伝子命名法は、ポリペプチドを指定するためにも使用される。
【0060】
いくつかの実施形態では、ｄｎＤＬＫ又はｄｎＤＬＫ／ＬＺＫポリペプチドをコードする導入遺伝子は、神経保護を強化するために、遺伝子の発現又は遺伝子によってコードされる生成物の活性を阻害する阻害剤とともに投与される。いくつかの実施形態では、阻害剤は、核酸、例えば、阻害される遺伝子を標的とするアンチセンスＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである。いくつかの実施形態では、薬剤は、阻害される遺伝子又は遺伝子のプロモーターを標的とするＣＲＩＳＰＲタンパク質／ｇＲＮＡタンパク質である。いくつかの実施形態では、阻害タンパク質、例えば、抗体（本明細書で使用される場合、ナノボディ、一本鎖免疫グロブリン、又は標的タンパク質に結合する他の抗体断片を含む）、ドミナントネガティブポリペプチド、及び／又はプロテアソーム分解のために阻害されるタンパク質に結合し、標的とするタンパク質が、投与される。いくつかの実施形態では、阻害のために標的とされる遺伝子又は遺伝子産物（例えば、ＭＥＫＫ４、ＭＬＫ２／ＭＡＰ３Ｋ１０、ＰＵＭＡ／ＢＢＣ３、ＳＡＲＭ１、ＲＯＣＫ１、ＲＯＣＫ２、ＴＡＯＫ１、ＴＡＯＫ２、ＴＡＯＫ３、ＴＮＩＫ、ＭＡＰ４Ｋ４、ＭＩＮＫ１、ＧＳＫ－３β、ＧＳＫ－３α、ＭＡＰ２Ｋ７／ＭＫＫ７、ＭＡＰ２Ｋ４／ＭＫＫ４、ＰＥＲＫ、ＣＨＯＰ、ＨＳＰ９０、ＳＮＲＫ、ＪＮＫ１（ＭＡＰＫ８）、ＪＮＫ２（ＭＡＰＫ９）、ＪＮＫ３（ＭＡＰＫ１０）、ＪＵＮ、ＡＴＦ２、ＭＥＦ２Ａ、ＳＯＸ１１、ＭＳＴ１／ＳＴＫ４、ＭＳＴ２／ＳＴＫ３、ＥＮＤ１、又はＥＮＤ２）は、軸索また細胞体の保護に関与する。いくつかの実施形態では、阻害のために標的とされる遺伝子又は遺伝子産物は、グリア相互作用に関与するか（例えば、Ｃ１ｑ、ＴＮＦα、若しくはＩＬ－１α）、又は緑内障関連遺伝子である（例えば、ＭＹＯＣ、ＴＢＫ１、若しくはＣＤＫＮ２Ｂ－ＡＳ１）。本段落の目的のために、遺伝子命名法は、ポリペプチドを指定するためにも使用される。
【0061】
３．２ 神経細胞を遺伝子改変するための代替方法
いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブポリペプチドをコードする導入遺伝子を神経細胞に導入するための遺伝子改変は、遺伝子組み込みのためのトランスポザーゼ系、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性遺伝子組み込み、ＴＡＬＥＮＳ又はジンクフィンガーを使用して行われる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性遺伝子組み込みは、ドミナントネガティブポリペプチドをインビボで神経細胞に、又はエクスビボで神経細胞に導入するために用いることができ、これは次いで患者に投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のドミナントネガティブ変異を内因性遺伝子に導入するために、遺伝子改変系、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮＳ、又はジンクフィンガーヌクレアーゼ系が用いられる。そのようなシステムは、ウイルスベクター系を含む任意の系を使用して、神経細胞に送達され得る。
いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブポリペプチドをコードする導入遺伝子を神経細胞に導入するための遺伝子改変は、遺伝子組み込みのためのトランスポザーゼ系、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性遺伝子組み込み、ＴＡＬＥＮＳ又はジンクフィンガーを使用して行われる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性遺伝子組み込みは、ドミナントネガティブポリペプチドをインビボで神経細胞に、又はエクスビボで神経細胞に導入するために用いることができ、これは次いで患者に投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のドミナントネガティブ変異を内因性遺伝子に導入するために、遺伝子改変系、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮＳ、又はジンクフィンガーヌクレアーゼ系が用いられる。そのようなシステムは、ウイルスベクター系を含む任意の系を使用して、神経細胞に送達され得る。
【0062】
３．３ 遺伝子改変された神経細胞は、ドミナントネガティブ変異を発現する
ＤＬＫがキナーゼシグナル伝達に関与する任意の神経細胞は、本開示に記載されるようなドミナントネガティブポリペプチドを発現するように修飾することができる。本明細書で使用される「神経細胞」は、ニューロンに関連する任意の種類の細胞だけでなく、神経経路で役割を果たす膠細胞等の非神経細胞も含む。いくつかの実施形態では、神経細胞は、眼ニューロンである。いくつかの実施形態では、神経細胞は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、光受容体細胞、網膜神経節、ミュラー細胞を含む神経グリア細胞、双極細胞等の他の内部網膜ニューロン、及びアマクリン細胞、角膜内皮細胞等である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、眼ニューロン、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、光受容体細胞、又は網膜神経節である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、内有毛細胞及び外有毛細胞を含む、耳科ニューロンである。いくつかの実施形態では、神経細胞は、らせん神経節ニューロンである。いくつかの実施形態では、神経細胞は、三叉神経ニューロン又は顔面神経ニューロンである。いくつかの実施形態では、神経細胞は、末梢神経系（ＰＮＳ）又はＣＮＳニューロン等の中枢神経系（ＣＮＳ）細胞である。
ＤＬＫがキナーゼシグナル伝達に関与する任意の神経細胞は、本開示に記載されるようなドミナントネガティブポリペプチドを発現するように修飾することができる。本明細書で使用される「神経細胞」は、ニューロンに関連する任意の種類の細胞だけでなく、神経経路で役割を果たす膠細胞等の非神経細胞も含む。いくつかの実施形態では、神経細胞は、眼ニューロンである。いくつかの実施形態では、神経細胞は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、光受容体細胞、網膜神経節、ミュラー細胞を含む神経グリア細胞、双極細胞等の他の内部網膜ニューロン、及びアマクリン細胞、角膜内皮細胞等である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、眼ニューロン、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、光受容体細胞、又は網膜神経節である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、内有毛細胞及び外有毛細胞を含む、耳科ニューロンである。いくつかの実施形態では、神経細胞は、らせん神経節ニューロンである。いくつかの実施形態では、神経細胞は、三叉神経ニューロン又は顔面神経ニューロンである。いくつかの実施形態では、神経細胞は、末梢神経系（ＰＮＳ）又はＣＮＳニューロン等の中枢神経系（ＣＮＳ）細胞である。
【0063】
４．神経保護／神経細胞死の阻害
本開示は更に、本明細書に記載のｄｎＤＬＫポリペプチド又はｄｎＤＬＫ／ＬＺＫポリペプチドを発現するようにニューロンの集団を遺伝子改変することによって、神経細胞死を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはタンパク質として投与され得るが、典型的な実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチド又はｄｎＤＬＫ／ＬＺＫポリペプチドをコードする核酸が、神経細胞の集団に導入される。以下のセクションは、ポリペプチドをコードする核酸の投与に焦点を当てている。当業者は、ｄｎＤＬＫポリペプチド又はｄｎＤＬＫ／ＬＺＫポリペプチドが、例えば、ポリペプチドの持続的な存在を必要としない、特定の治療用途においても用いられ得ることを理解するであろう。ポリペプチドのための医薬製剤は、対象にポリペプチドを送達するための既知のパラメータに基づいて容易に調製することができる。
本開示は更に、本明細書に記載のｄｎＤＬＫポリペプチド又はｄｎＤＬＫ／ＬＺＫポリペプチドを発現するようにニューロンの集団を遺伝子改変することによって、神経細胞死を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはタンパク質として投与され得るが、典型的な実施形態では、ｄｎＤＬＫポリペプチド又はｄｎＤＬＫ／ＬＺＫポリペプチドをコードする核酸が、神経細胞の集団に導入される。以下のセクションは、ポリペプチドをコードする核酸の投与に焦点を当てている。当業者は、ｄｎＤＬＫポリペプチド又はｄｎＤＬＫ／ＬＺＫポリペプチドが、例えば、ポリペプチドの持続的な存在を必要としない、特定の治療用途においても用いられ得ることを理解するであろう。ポリペプチドのための医薬製剤は、対象にポリペプチドを送達するための既知のパラメータに基づいて容易に調製することができる。
【0064】
組成物は、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、鳥類、又は非ヒト霊長類（例えば、マカク）等の非ヒト対象を含む任意の対象に投与され得る。典型的な実施形態では、対象はヒトである。
【0065】
４．１ 医薬組成物及び投与
一態様では、本開示は、神経細胞死を阻害するための、ドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物を提供する。核酸は、神経変性疾患の治療に好適な投与計画を用いて、治療有効量で投与される。「治療有効量」とは、神経変性疾患等の神経疾患の１つ以上の症状の軽減、遅延、寛解又は任意の改善を含む、所望の結果を達成するのに必要な投与量及び期間での有効な量を指す。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸は、神経疾患の１つ以上の系統を防止するために予防的に投与される。そのような組成物の治療有効量は、病態の程度、個体の年齢、性別、及び体重、又は個体において所望される応答を誘発する遺伝子治療ベクターの能力等の要因に応じて変動し得る。投与計画は、最適な応答を提供するように調整することができる。治療有効量はまた、治療的に有益な効果が、ウイルスベクターのあらゆる毒性又は有害作用を上回る量である。
一態様では、本開示は、神経細胞死を阻害するための、ドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物を提供する。核酸は、神経変性疾患の治療に好適な投与計画を用いて、治療有効量で投与される。「治療有効量」とは、神経変性疾患等の神経疾患の１つ以上の症状の軽減、遅延、寛解又は任意の改善を含む、所望の結果を達成するのに必要な投与量及び期間での有効な量を指す。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸は、神経疾患の１つ以上の系統を防止するために予防的に投与される。そのような組成物の治療有効量は、病態の程度、個体の年齢、性別、及び体重、又は個体において所望される応答を誘発する遺伝子治療ベクターの能力等の要因に応じて変動し得る。投与計画は、最適な応答を提供するように調整することができる。治療有効量はまた、治療的に有益な効果が、ウイルスベクターのあらゆる毒性又は有害作用を上回る量である。
【0066】
組成物は、様々な薬物送達システムで使用するために製剤化することができる。適切な製剤化のために、１つ以上の生理学的に許容される賦形剤又は担体もまた、組成物中に含まれ得る。例えば、ドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸は、患者への投与に好適な溶液、例えば、注射用の滅菌等張溶液中に製剤化され得る。いくつかの実施形態では、担体は、水性、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等である。組成物は、生理学的条件に近づくように、必要に応じて補助的な医薬物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、張度調整剤を含んでもよい。
【0067】
いくつかの実施形態では、医薬組成物の投与を容易にするために、リポソーム、ナノカプセル、ナノ粒子、ミクロスフィア、脂質粒子、小胞等の送達ビヒクルが使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のドミナントネガティブポリペプチドをコードする導入遺伝子を含むウイルスベクターは、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、又はナノ粒子等に封入された送達のために製剤化することができる。
【0068】
典型的な実施形態では、本明細書に記載のドミナントネガティブポリペプチドをコードするウイルスベクターは、対象に投与される。投与量値は、状態の重症度によって異なり得る。任意の特定の対象のために、特定の投与計画は、個々のニーズ、及び組成物を投与する又は組成物の投与を監督する人物の専門的判断に従って経時的に調整することができ、本明細書に記載される投与量範囲は例示目的に過ぎず、特許請求される組成物の範囲又は実施を制限することを意図するものではないことを更に理解されたい。
【0069】
いくつかの実施形態では、対象に投与されるウイルスベクターは、ＡＡＶ粒子調製物である。投与計画は、最適な治療応答を提供するように調整することができる。例えば、単一のボーラス剤が投与されてもよいか、いくつかに分割した用量が経時的に投与されてもよいか、又は治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例的に減少若しくは増加させてもよい。いくつかの実施形態では、例えば、ヒトへの投与では、ＡＡＶの投与量は、１回の注射、例えば、眼内注射当たり１０９～１０１３のＡＡＶ粒子であってもよい。いくつかの実施形態では、注射当たり、１０９～１０１０、１０１０～１０１１、１０１１～１０１２、又は１０１２～１０１３のウイルス粒子が投与され得る。投与量に関して本明細書で使用される場合、ＡＡＶ粒子の数は、ウイルスゲノムの数と同等である。
【0070】
他の遺伝子治療ベクターとの組み合わせを含む複数の治療が、例えば、対象の生涯にわたって、任意の対象に対して施され得る。
【0071】
ドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸は、任意の投与経路を用いて導入され得る。例えば、遺伝子治療ベクターは、全身的に、例えば、静脈内注射若しくは注入によって、あるいは局所的に、例えば、網膜注射、又は眼内投与若しくは注入によって投与されてもよい。本発明は、特定の投与部位又は投与方法に限定されない。
【0072】
４．２ 神経障害
ポリペプチドをコードする導入遺伝子を投与するための遺伝子治療ベクター等の、本明細書に記載のドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸を使用して、限定されないが以下を含む神経障害を治療することができる：緑内障（開放角及び狭隅角／閉塞隅角緑内障、原発性及び続発性緑内障、正常眼圧緑内障及び高眼圧緑内障を含む）、乾燥（非滲出性）及び湿潤（滲出性、新生血管）ＡＭＤを含む加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶＭ）、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、網膜上膜（ＥＲＭ）及び黄斑円孔、近視関連脈絡膜新生血管、網膜色素線条及び血管線条、網膜剥離、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜色素上皮の萎縮性及び肥大性病変、網膜静脈閉塞、脈絡膜網膜静脈閉塞、黄斑浮腫、腎静脈閉塞に関連する黄斑浮腫、網膜色素変性症及び他の遺伝性網膜変性（例えば、シュタルガルト病）、未熟児網膜症、中毒性視神経症を含む他の視神経症（例えば、メタノール、エタンブトール）、非動脈性虚血性視神経症、動脈性虚血性視神経症／巨大細胞動脈炎、外傷性視神経症（外傷性脳損傷を含む）、特発性頭蓋内高血圧症／偽脳腫瘍、炎症性視神経症（例えば、視神経炎）、圧縮視神経症（例えば、下垂体腺腫）、浸潤性視神経症（例えば、サルコイドーシス、リンパ腫）、自己免疫性視神経症、脂質貯蔵疾患（例えば、テイ・サックス病）、栄養性視神経症、レーベル遺伝性視神経症、優性視神経萎縮症、フリードライヒ運動失調症、放射線誘発性視神経症、医原性視神経症、宇宙飛行関連神経眼症候群（ＳＡＮＳ）、眼の炎症性障害、例えば、ブドウ膜炎、強膜炎、白内障、屈折異常、例えば、近視、遠視、乱視又は円錐角膜、神経障害性角膜症、角膜除神経、並びに助長する角膜の神経再支配及び糖尿病性角膜症。
ポリペプチドをコードする導入遺伝子を投与するための遺伝子治療ベクター等の、本明細書に記載のドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸を使用して、限定されないが以下を含む神経障害を治療することができる：緑内障（開放角及び狭隅角／閉塞隅角緑内障、原発性及び続発性緑内障、正常眼圧緑内障及び高眼圧緑内障を含む）、乾燥（非滲出性）及び湿潤（滲出性、新生血管）ＡＭＤを含む加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶＭ）、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、網膜上膜（ＥＲＭ）及び黄斑円孔、近視関連脈絡膜新生血管、網膜色素線条及び血管線条、網膜剥離、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜色素上皮の萎縮性及び肥大性病変、網膜静脈閉塞、脈絡膜網膜静脈閉塞、黄斑浮腫、腎静脈閉塞に関連する黄斑浮腫、網膜色素変性症及び他の遺伝性網膜変性（例えば、シュタルガルト病）、未熟児網膜症、中毒性視神経症を含む他の視神経症（例えば、メタノール、エタンブトール）、非動脈性虚血性視神経症、動脈性虚血性視神経症／巨大細胞動脈炎、外傷性視神経症（外傷性脳損傷を含む）、特発性頭蓋内高血圧症／偽脳腫瘍、炎症性視神経症（例えば、視神経炎）、圧縮視神経症（例えば、下垂体腺腫）、浸潤性視神経症（例えば、サルコイドーシス、リンパ腫）、自己免疫性視神経症、脂質貯蔵疾患（例えば、テイ・サックス病）、栄養性視神経症、レーベル遺伝性視神経症、優性視神経萎縮症、フリードライヒ運動失調症、放射線誘発性視神経症、医原性視神経症、宇宙飛行関連神経眼症候群（ＳＡＮＳ）、眼の炎症性障害、例えば、ブドウ膜炎、強膜炎、白内障、屈折異常、例えば、近視、遠視、乱視又は円錐角膜、神経障害性角膜症、角膜除神経、並びに助長する角膜の神経再支配及び糖尿病性角膜症。
【0073】
眼科以外の神経変性障害もまた、本明細書に記載のドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸を使用して治療され得る。そのような障害としては、限定されないが、以下が挙げられる：筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、外傷性脳損傷、パーキンソンプラス病、ハンチントン病、末梢神経障害、虚血、脳卒中、頭蓋内出血、脳出血、重金属、工業用溶媒、薬物及び化学療法剤からなる群から選択される有毒化合物への曝露によって引き起こされる神経損傷、物理的、機械的又は化学的な外傷によって引き起こされる神経系への損傷、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、進行性筋萎縮症、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、脊髄性筋萎縮症、遺伝性筋萎縮症、無脊椎動物ディスク症候群、頸椎症、神経叢障害、胸郭出口破壊症候群、ポルフィリン症、仮性球麻痺、進行性球麻痺、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、脱髄疾患、ギラン・バレー症候群、多発性硬化症、シャルコー・マリー・トゥース病、プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、ウシ海綿状脳症、ピック病、てんかん、エイズ認知症複合。いくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスの再活性化を防止するために、本明細書に記載のドミナントネガティブポリペプチドが用いられる。いくつかの実施形態では、異常な神経細胞再生を防止するために、本明細書に記載のドミナントネガティブポリペプチドが用いられる。いくつかの実施形態では、障害は、化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）、例えば、化学療法剤への曝露によって引き起こされる神経損傷である。いくつかの実施形態では、疾患は、聴力損失障害、例えば、加齢性聴力損失、化学療法誘発性聴力損失、遺伝性聴力損失、アミノグリコシド誘発性聴力損失、外傷誘発性聴力損失、及び騒音誘発性聴力損失である。
【0074】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードする核酸は、緑内障、加齢性黄斑変性症、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、近視関連脈絡膜新生血管、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、及び網膜静脈閉塞を治療又は予防するために、対象に投与される。
【0075】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードする核酸は、遺伝性網膜疾患、例えば、網膜色素変性症等の網膜疾患を治療するために対象に投与される。いくつかの実施形態では、網膜疾患は、ロドプシンの誤った輸送及び／又は誤った折り畳みを伴う。
【0076】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸は、緑内障、遺伝性網膜変性、非滲出性ＡＭＤ／地図状萎縮、虚血をもたらす網膜血管疾患（糖尿病、静脈閉塞）、網膜剥離及び浮腫をもたらす疾患（滲出性ＡＭＤを含む）を含む視神経症を治療及び／又は予防するために使用することができる。
【0077】
本開示の別の態様は、眼及び他の形態の神経変性の治療のための細胞移植に基づく再生アプローチである。これらには、黄斑変性及び光受容体変性の形態の治療のための光受容体及び／又はＲＰＥ移植、並びに緑内障及び他の形態の視神経疾患の治療のためのＲＧＣ移植が含まれる。したがって、いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードする核酸は、眼変性疾患及び他の形態の神経変性のための神経細胞の移植の前又は後のいずれかに、移植のために細胞に導入することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードする核酸を、幹細胞等の前駆細胞に導入することができる。
【0078】
ヒトにおける上述の十分に特徴付けられた疾患はまた、他の哺乳動物において同等の病因で発生する場合があり、それらにおいても同様に本開示の化合物を用いて治療することができる。
【0079】
Ｐ１実施形態
実施形態Ｐ１－１．配列番号１の領域１～５２０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を有するアミノ酸セグメントを含むドミナントネガティブデュアルロイシンジッパーキナーゼ（ｄｎＤＬＫ）ポリペプチドをコードする核酸であって、
ポリペプチドが、配列番号１を基準として決定される場合、少なくとも１つの変異を含み、変異が、４３位の置換、３０２位の置換、及び５１６位の置換から選択される、核酸。
実施形態Ｐ１－２．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、３０２位に置換を含み、置換が、スレオニン以外の任意のアミノ酸である、実施形態Ｐ１－１に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－３．３０２位の置換が、Ｓ３０２Ａである、実施形態Ｐ１－２に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－４．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４３位に置換を含む、実施形態Ｐ１－１、Ｐ１－２、又はＰ１－３のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態Ｐ１－５．４３位の置換が、Ｅ又はＤである、実施形態Ｐ１－４に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－６．４３位の置換が、Ｅである、実施形態Ｐ１－５に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－７．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、置換Ｔ４３Ｅ及びＳ３０２Ａを含む、実施形態Ｐ１－１に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－８．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、１８５位に置換を含む、実施形態Ｐ１－１～Ｐ１－７のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態Ｐ１－９．１８５位の置換が、Ｋ１８５Ａである、実施形態Ｐ１－８に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－１０．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、５１６位に置換を含む、実施形態Ｐ１－１～Ｐ１－９のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態Ｐ１－１１．５１６位の置換が、Ｇ５１６Ｖである、実施形態Ｐ１－１０に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－１２．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４２４位又は４２６位に置換を含む、実施形態Ｐ１－１～Ｐ１－１１のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態Ｐ１－１３．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４３１位、４３８位、４４０位、４４５位、４４７位、４８６位、４９１位、又は４９３位に置換を更に含む、実施形態Ｐ１－１２に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－１４．配列番号６又は配列番号７のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｐ１－１に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－１５．配列番号１の領域１５８～５２０に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むドミナントネガティブデュアルロイシンジッパー（ｄｎＤＬＫ）ポリペプチドをコードする単離された核酸であって、ポリペプチドが、配列番号１を基準として決定される場合、少なくとも１つの変異を含み、変異が、３０２位の置換及び５１６位の置換から選択される、核酸。
実施形態Ｐ１－１６．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、Ｓ３０２位に置換を含み、置換が、スレオニン以外の任意のアミノ酸である、実施形態Ｐ１－１５に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－１７．置換が、Ｓ３０２Ａである、実施形態Ｐ１－１６に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－１８．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、５１６位に置換を含む、実施形態Ｐ１－１５、Ｐ１－１６、又はＰ１－１７に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－１９．５１６位の置換が、Ｇ５１６Ｖである、実施形態Ｐ１－１８に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－２０．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、１８５位に置換を含む、実施形態Ｐ１－１５～Ｐ１－１９のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態Ｐ１－２１．１８５位の置換が、Ｋ１８５Ａである、実施形態Ｐ１－２０に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－２２．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４２４位及び／又は４２６位に置換を含む、実施形態Ｐ１－１５～Ｐ１－２１のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態Ｐ１－２３．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４３１位、４３８位、４４０位、４４５位、４４７位、４８６位、４９１位、又は４９３位に置換を更に含む、実施形態Ｐ１～２２に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－２４．（ＬＺＫ）によりホモ二量体化及びＤＬＫヘテロ二量体化を阻害するロイシンジッパーポリペプチドをコードする単離された核酸であって、ポリペプチドが、配列番号８に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、核酸。
実施形態Ｐ１－２５．ポリペプチドが、１５０アミノ酸長未満である、実施形態Ｐ１－２４に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－２６．実施形態Ｐ１－１～Ｐ１－２５のいずれか１つに記載の核酸を含む、ベクター。
実施形態Ｐ１－２７．ベクターが、ウイルスベクターである、実施形態Ｐ１－２６に記載のベクター。
実施形態Ｐ１－２８．ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、実施形態Ｐ１－２７に記載のベクター。
実施形態Ｐ１－２９．ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１由来又は偽型ＡＡＶ由来のベクターである、実施形態Ｐ１－２８に記載のベクター。
実施形態Ｐ１－３０．ベクターが、ＡＡＶ２．７ｍ８である、実施形態Ｐ１－２９に記載のベクター。
実施形態Ｐ１－３１．ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を更に含む、実施形態Ｐ１－２６～Ｐ１－３１のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態Ｐ１－３２．実施形態Ｐ１－１～Ｐ１－２５のいずれか１つに記載の核酸、又は実施形態Ｐ１－２６～Ｐ１－３１のいずれか１つに記載のベクターを含む、宿主細胞。
実施形態Ｐ１－３３．宿主細胞が、ニューロンである、実施形態Ｐ１－３２に記載の宿主細胞。
実施形態Ｐ１－３４．ニューロンが、網膜神経節である、実施形態Ｐ１－３３に記載の宿主細胞。
実施形態Ｐ１－３５．宿主細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態Ｐ１－３３又はＰ１－３４に記載の宿主細胞。
実施形態Ｐ１－３６．宿主細胞が、ヒト細胞である、実施形態Ｐ１－３５に記載の宿主細胞。
実施形態Ｐ１－３７．神経細胞死を阻害する方法であって、実施形態Ｐ１－１～Ｐ１－２５のいずれか１つに記載の核酸、又は実施形態Ｐ１～２６～Ｐ１－３１のいずれか１つに記載のベクターを、神経細胞に導入することを含む、方法。
実施形態Ｐ１－３８．神経細胞が、エクスビボである、実施形態Ｐ１－３７に記載の方法。
実施形態Ｐ１－３９．神経細胞が、インビボである、実施形態Ｐ１－３７に記載の方法。
実施形態Ｐ１－４０．神経細胞が、眼ニューロンである、実施形態Ｐ１－３７～Ｐ１－３９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｐ１－４１．眼ニューロンが、網膜神経節である、実施形態Ｐ１－４０に記載の方法。
実施形態Ｐ１－４２．神経細胞が、光受容体細胞である、実施形態Ｐ１－３７～Ｐ１－３９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｐ１－４３．神経細胞が、哺乳動物である、実施形態態Ｐ１－３７～Ｐ１－４２に記載の方法。
実施形態Ｐ１－４４．ニューロンが、ヒト神経細胞である、実施形態Ｐ１－４３に記載の方法。
実施形態Ｐ１－４５．神経細胞死の治療又は予防を必要とする対象においてそれを行う方法であって、実施形態Ｐ１－１～Ｐ１－２５のいずれか１つの核酸、又は実施形態Ｐ１－２６～Ｐ１－３１のいずれか１つのベクターを、対象に投与することを含む、方法。
実施形態Ｐ１－４６．対象が、緑内障、加齢性黄斑変性、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、近視性ＣＮＶ、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、及び網膜静脈閉塞症を有する、実施形態Ｐ１－４５に記載の方法。
実施形態Ｐ１－４７．対象が、遺伝性網膜疾患を有する、実施形態Ｐ１－４５に記載の方法。
実施形態Ｐ１－４８．遺伝性網膜疾患が、網膜色素変性症である、実施形態Ｐ１－４７に記載の方法。
実施形態Ｐ１－４９．実施形態Ｐ１－１～Ｐ１－２５のいずれか１つに記載の核酸によってコードされる、ポリペプチド。
実施形態Ｐ１－１．配列番号１の領域１～５２０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を有するアミノ酸セグメントを含むドミナントネガティブデュアルロイシンジッパーキナーゼ（ｄｎＤＬＫ）ポリペプチドをコードする核酸であって、
ポリペプチドが、配列番号１を基準として決定される場合、少なくとも１つの変異を含み、変異が、４３位の置換、３０２位の置換、及び５１６位の置換から選択される、核酸。
実施形態Ｐ１－２．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、３０２位に置換を含み、置換が、スレオニン以外の任意のアミノ酸である、実施形態Ｐ１－１に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－３．３０２位の置換が、Ｓ３０２Ａである、実施形態Ｐ１－２に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－４．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４３位に置換を含む、実施形態Ｐ１－１、Ｐ１－２、又はＰ１－３のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態Ｐ１－５．４３位の置換が、Ｅ又はＤである、実施形態Ｐ１－４に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－６．４３位の置換が、Ｅである、実施形態Ｐ１－５に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－７．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、置換Ｔ４３Ｅ及びＳ３０２Ａを含む、実施形態Ｐ１－１に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－８．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、１８５位に置換を含む、実施形態Ｐ１－１～Ｐ１－７のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態Ｐ１－９．１８５位の置換が、Ｋ１８５Ａである、実施形態Ｐ１－８に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－１０．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、５１６位に置換を含む、実施形態Ｐ１－１～Ｐ１－９のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態Ｐ１－１１．５１６位の置換が、Ｇ５１６Ｖである、実施形態Ｐ１－１０に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－１２．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４２４位又は４２６位に置換を含む、実施形態Ｐ１－１～Ｐ１－１１のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態Ｐ１－１３．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４３１位、４３８位、４４０位、４４５位、４４７位、４８６位、４９１位、又は４９３位に置換を更に含む、実施形態Ｐ１－１２に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－１４．配列番号６又は配列番号７のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｐ１－１に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－１５．配列番号１の領域１５８～５２０に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むドミナントネガティブデュアルロイシンジッパー（ｄｎＤＬＫ）ポリペプチドをコードする単離された核酸であって、ポリペプチドが、配列番号１を基準として決定される場合、少なくとも１つの変異を含み、変異が、３０２位の置換及び５１６位の置換から選択される、核酸。
実施形態Ｐ１－１６．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、Ｓ３０２位に置換を含み、置換が、スレオニン以外の任意のアミノ酸である、実施形態Ｐ１－１５に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－１７．置換が、Ｓ３０２Ａである、実施形態Ｐ１－１６に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－１８．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、５１６位に置換を含む、実施形態Ｐ１－１５、Ｐ１－１６、又はＰ１－１７に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－１９．５１６位の置換が、Ｇ５１６Ｖである、実施形態Ｐ１－１８に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－２０．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、１８５位に置換を含む、実施形態Ｐ１－１５～Ｐ１－１９のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態Ｐ１－２１．１８５位の置換が、Ｋ１８５Ａである、実施形態Ｐ１－２０に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－２２．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４２４位及び／又は４２６位に置換を含む、実施形態Ｐ１－１５～Ｐ１－２１のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態Ｐ１－２３．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４３１位、４３８位、４４０位、４４５位、４４７位、４８６位、４９１位、又は４９３位に置換を更に含む、実施形態Ｐ１～２２に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－２４．（ＬＺＫ）によりホモ二量体化及びＤＬＫヘテロ二量体化を阻害するロイシンジッパーポリペプチドをコードする単離された核酸であって、ポリペプチドが、配列番号８に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、核酸。
実施形態Ｐ１－２５．ポリペプチドが、１５０アミノ酸長未満である、実施形態Ｐ１－２４に記載の核酸。
実施形態Ｐ１－２６．実施形態Ｐ１－１～Ｐ１－２５のいずれか１つに記載の核酸を含む、ベクター。
実施形態Ｐ１－２７．ベクターが、ウイルスベクターである、実施形態Ｐ１－２６に記載のベクター。
実施形態Ｐ１－２８．ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、実施形態Ｐ１－２７に記載のベクター。
実施形態Ｐ１－２９．ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１由来又は偽型ＡＡＶ由来のベクターである、実施形態Ｐ１－２８に記載のベクター。
実施形態Ｐ１－３０．ベクターが、ＡＡＶ２．７ｍ８である、実施形態Ｐ１－２９に記載のベクター。
実施形態Ｐ１－３１．ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を更に含む、実施形態Ｐ１－２６～Ｐ１－３１のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態Ｐ１－３２．実施形態Ｐ１－１～Ｐ１－２５のいずれか１つに記載の核酸、又は実施形態Ｐ１－２６～Ｐ１－３１のいずれか１つに記載のベクターを含む、宿主細胞。
実施形態Ｐ１－３３．宿主細胞が、ニューロンである、実施形態Ｐ１－３２に記載の宿主細胞。
実施形態Ｐ１－３４．ニューロンが、網膜神経節である、実施形態Ｐ１－３３に記載の宿主細胞。
実施形態Ｐ１－３５．宿主細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態Ｐ１－３３又はＰ１－３４に記載の宿主細胞。
実施形態Ｐ１－３６．宿主細胞が、ヒト細胞である、実施形態Ｐ１－３５に記載の宿主細胞。
実施形態Ｐ１－３７．神経細胞死を阻害する方法であって、実施形態Ｐ１－１～Ｐ１－２５のいずれか１つに記載の核酸、又は実施形態Ｐ１～２６～Ｐ１－３１のいずれか１つに記載のベクターを、神経細胞に導入することを含む、方法。
実施形態Ｐ１－３８．神経細胞が、エクスビボである、実施形態Ｐ１－３７に記載の方法。
実施形態Ｐ１－３９．神経細胞が、インビボである、実施形態Ｐ１－３７に記載の方法。
実施形態Ｐ１－４０．神経細胞が、眼ニューロンである、実施形態Ｐ１－３７～Ｐ１－３９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｐ１－４１．眼ニューロンが、網膜神経節である、実施形態Ｐ１－４０に記載の方法。
実施形態Ｐ１－４２．神経細胞が、光受容体細胞である、実施形態Ｐ１－３７～Ｐ１－３９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｐ１－４３．神経細胞が、哺乳動物である、実施形態態Ｐ１－３７～Ｐ１－４２に記載の方法。
実施形態Ｐ１－４４．ニューロンが、ヒト神経細胞である、実施形態Ｐ１－４３に記載の方法。
実施形態Ｐ１－４５．神経細胞死の治療又は予防を必要とする対象においてそれを行う方法であって、実施形態Ｐ１－１～Ｐ１－２５のいずれか１つの核酸、又は実施形態Ｐ１－２６～Ｐ１－３１のいずれか１つのベクターを、対象に投与することを含む、方法。
実施形態Ｐ１－４６．対象が、緑内障、加齢性黄斑変性、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、近視性ＣＮＶ、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、及び網膜静脈閉塞症を有する、実施形態Ｐ１－４５に記載の方法。
実施形態Ｐ１－４７．対象が、遺伝性網膜疾患を有する、実施形態Ｐ１－４５に記載の方法。
実施形態Ｐ１－４８．遺伝性網膜疾患が、網膜色素変性症である、実施形態Ｐ１－４７に記載の方法。
実施形態Ｐ１－４９．実施形態Ｐ１－１～Ｐ１－２５のいずれか１つに記載の核酸によってコードされる、ポリペプチド。
【0080】
実施形態
実施形態１．配列番号１の領域１～５２０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するアミノ酸セグメントを含むドミナントネガティブデュアルロイシンジッパーキナーゼ（ｄｎＤＬＫ）ポリペプチドをコードする核酸であって、
ｄｎＤＬＫポリペプチドが、配列番号１を基準として決定される場合、少なくとも１つの変異を含み、変異が、３０２位の置換であり、置換が、スレオニン以外の任意のアミノ酸である、核酸。
実施形態２．３０２位の置換が、Ｓ３０２Ａである、実施形態１に記載の核酸。
実施形態３．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、５５０アミノ酸長未満である、実施形態１又は２に記載の核酸。
実施形態４．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４３位に置換を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態５．４３位の置換が、Ｅ又はＤである、実施形態３に記載の核酸。
実施形態６．４３位の置換が、Ｅである、実施形態５に記載の核酸。
実施形態７．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、１８５位に置換を含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態８．１８５位の置換が、Ｋ１８５Ａである、実施形態７に記載の核酸。
実施形態９．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４２４位又は４２６位に置換を含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態１０．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４３１位、４３８位、４４０位、４４５位、４４７位、４８６位、４９１位、又は４９３位に置換を更に含む、実施形態９に記載の核酸。
実施形態１１．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、配列番号６又は配列番号７のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の核酸。
実施形態１２．配列番号１１に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態１３．（ＬＺＫ）によりホモ二量体化及びＤＬＫヘテロ二量体化を阻害するロイシンジッパーポリペプチドをコードする単離された核酸であって、ポリペプチドが、配列番号８に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号８を含む、核酸。
実施形態１４．ポリペプチドが、１５０アミノ酸長未満である、実施形態１３に記載の核酸。
実施形態１５．配列番号１の領域１５８～５２０に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むドミナントネガティブデュアルロイシンジッパー（ｄｎＤＬＫ）ポリペプチドをコードする単離された核酸であって、ポリペプチドが、配列番号１を基準として決定される場合、少なくとも１つの変異を含み、少なくとも１つの変異が、３０２位にある、核酸。
実施形態１６．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、Ｓ３０２位に置換を含み、置換が、スレオニン以外の任意のアミノ酸である、実施形態１５に記載の核酸。
実施形態１７．置換が、Ｓ３０２Ａである、実施形態１６に記載の核酸。
実施形態１８．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、１８５位に置換を含む、実施形態１５～１７のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態１９．１８５位の置換が、Ｋ１８５Ａである、実施形態１８に記載の核酸。
実施形態２０．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４２４位及び／又は４２６位に置換を含む、実施形態１５～１９のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態２１．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４３１位、４３８位、４４０位、４４５位、４４７位、４８６位、４９１位、又は４９３位に置換を更に含む、実施形態２０に記載の核酸。
実施形態２２．実施形態１～１４のいずれか１つに記載の核酸を含む、ベクター。
実施形態２３．ベクターが、ウイルスベクターである、実施形態２２に記載のベクター。
実施形態２４．ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、実施形態２３に記載のベクター。
実施形態２５．ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１由来又は偽型ＡＡＶ由来のベクターである、実施形態２４に記載のベクター。
実施形態２６．ベクターが、ＡＡＶ２．７ｍ８である、実施形態２５に記載のベクター。
実施形態２７．ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を更に含む、実施形態２２～２６のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態２８．実施形態１～２１のいずれか１つに記載の核酸、又は実施形態２２～２７のいずれか１つに記載のベクターを含む、宿主細胞。
実施形態２９．宿主細胞が、ニューロンである、実施形態２８に記載の宿主細胞。
実施形態３０．ニューロンが、網膜神経節である、実施形態２９に記載の宿主細胞。
実施形態３１．宿主細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態２９又は３０に記載の宿主細胞。
実施形態３２．宿主細胞が、ヒト細胞である、実施形態３１に記載の宿主細胞。
実施形態３３．神経細胞死を阻害する方法であって、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の核酸、又は実施形態２２～２７のいずれか１つに記載のベクターを、神経細胞に導入することを含む、方法。
実施形態３４．神経細胞が、エクスビボである、実施形態３３に記載の方法。
実施形態３５．神経細胞が、インビボである、実施形態３３に記載の方法。
実施形態３６．神経細胞が、眼ニューロンである、実施形態３３～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３７．眼ニューロンが、網膜神経節である、実施形態３６に記載の方法。
実施形態３８．神経細胞が、光受容体細胞である、実施形態３３～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３９．神経細胞が、哺乳動物である、実施形態３３～３８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４０．ニューロンが、ヒト神経細胞である、実施形態３９に記載の方法。
実施形態４１．神経細胞死の治療又は予防を必要とする対象においてそれを行う方法であって、実施形態１～２１のいずれか１つの核酸、実施形態２２～２７のいずれか１つのベクターを、対象に投与することを含む、方法。
実施形態４２．対象が、緑内障、加齢性黄斑変性、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、近視性ＣＮＶ、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、及び網膜静脈閉塞症を有する、実施形態４１に記載の方法。
実施形態４３．対象が、遺伝性網膜疾患を有する、実施形態４１に記載の方法。
実施形態４４．遺伝性網膜疾患が、網膜色素変性症である、実施形態４３に記載の方法。
実施形態４５．実施形態１～２１のいずれか１つに記載の核酸によってコードされる、ポリペプチド。
実施形態１．配列番号１の領域１～５２０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するアミノ酸セグメントを含むドミナントネガティブデュアルロイシンジッパーキナーゼ（ｄｎＤＬＫ）ポリペプチドをコードする核酸であって、
ｄｎＤＬＫポリペプチドが、配列番号１を基準として決定される場合、少なくとも１つの変異を含み、変異が、３０２位の置換であり、置換が、スレオニン以外の任意のアミノ酸である、核酸。
実施形態２．３０２位の置換が、Ｓ３０２Ａである、実施形態１に記載の核酸。
実施形態３．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、５５０アミノ酸長未満である、実施形態１又は２に記載の核酸。
実施形態４．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４３位に置換を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態５．４３位の置換が、Ｅ又はＤである、実施形態３に記載の核酸。
実施形態６．４３位の置換が、Ｅである、実施形態５に記載の核酸。
実施形態７．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、１８５位に置換を含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態８．１８５位の置換が、Ｋ１８５Ａである、実施形態７に記載の核酸。
実施形態９．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４２４位又は４２６位に置換を含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態１０．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４３１位、４３８位、４４０位、４４５位、４４７位、４８６位、４９１位、又は４９３位に置換を更に含む、実施形態９に記載の核酸。
実施形態１１．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、配列番号６又は配列番号７のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の核酸。
実施形態１２．配列番号１１に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態１３．（ＬＺＫ）によりホモ二量体化及びＤＬＫヘテロ二量体化を阻害するロイシンジッパーポリペプチドをコードする単離された核酸であって、ポリペプチドが、配列番号８に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号８を含む、核酸。
実施形態１４．ポリペプチドが、１５０アミノ酸長未満である、実施形態１３に記載の核酸。
実施形態１５．配列番号１の領域１５８～５２０に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むドミナントネガティブデュアルロイシンジッパー（ｄｎＤＬＫ）ポリペプチドをコードする単離された核酸であって、ポリペプチドが、配列番号１を基準として決定される場合、少なくとも１つの変異を含み、少なくとも１つの変異が、３０２位にある、核酸。
実施形態１６．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、Ｓ３０２位に置換を含み、置換が、スレオニン以外の任意のアミノ酸である、実施形態１５に記載の核酸。
実施形態１７．置換が、Ｓ３０２Ａである、実施形態１６に記載の核酸。
実施形態１８．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、１８５位に置換を含む、実施形態１５～１７のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態１９．１８５位の置換が、Ｋ１８５Ａである、実施形態１８に記載の核酸。
実施形態２０．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４２４位及び／又は４２６位に置換を含む、実施形態１５～１９のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態２１．ｄｎＤＬＫポリペプチドが、４３１位、４３８位、４４０位、４４５位、４４７位、４８６位、４９１位、又は４９３位に置換を更に含む、実施形態２０に記載の核酸。
実施形態２２．実施形態１～１４のいずれか１つに記載の核酸を含む、ベクター。
実施形態２３．ベクターが、ウイルスベクターである、実施形態２２に記載のベクター。
実施形態２４．ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、実施形態２３に記載のベクター。
実施形態２５．ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１由来又は偽型ＡＡＶ由来のベクターである、実施形態２４に記載のベクター。
実施形態２６．ベクターが、ＡＡＶ２．７ｍ８である、実施形態２５に記載のベクター。
実施形態２７．ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を更に含む、実施形態２２～２６のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態２８．実施形態１～２１のいずれか１つに記載の核酸、又は実施形態２２～２７のいずれか１つに記載のベクターを含む、宿主細胞。
実施形態２９．宿主細胞が、ニューロンである、実施形態２８に記載の宿主細胞。
実施形態３０．ニューロンが、網膜神経節である、実施形態２９に記載の宿主細胞。
実施形態３１．宿主細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態２９又は３０に記載の宿主細胞。
実施形態３２．宿主細胞が、ヒト細胞である、実施形態３１に記載の宿主細胞。
実施形態３３．神経細胞死を阻害する方法であって、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の核酸、又は実施形態２２～２７のいずれか１つに記載のベクターを、神経細胞に導入することを含む、方法。
実施形態３４．神経細胞が、エクスビボである、実施形態３３に記載の方法。
実施形態３５．神経細胞が、インビボである、実施形態３３に記載の方法。
実施形態３６．神経細胞が、眼ニューロンである、実施形態３３～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３７．眼ニューロンが、網膜神経節である、実施形態３６に記載の方法。
実施形態３８．神経細胞が、光受容体細胞である、実施形態３３～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３９．神経細胞が、哺乳動物である、実施形態３３～３８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４０．ニューロンが、ヒト神経細胞である、実施形態３９に記載の方法。
実施形態４１．神経細胞死の治療又は予防を必要とする対象においてそれを行う方法であって、実施形態１～２１のいずれか１つの核酸、実施形態２２～２７のいずれか１つのベクターを、対象に投与することを含む、方法。
実施形態４２．対象が、緑内障、加齢性黄斑変性、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、近視性ＣＮＶ、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、及び網膜静脈閉塞症を有する、実施形態４１に記載の方法。
実施形態４３．対象が、遺伝性網膜疾患を有する、実施形態４１に記載の方法。
実施形態４４．遺伝性網膜疾患が、網膜色素変性症である、実施形態４３に記載の方法。
実施形態４５．実施形態１～２１のいずれか１つに記載の核酸によってコードされる、ポリペプチド。
【0081】
５．アッセイ、方法及び実験結果
５．１ 方法論
５．１．１ レンチウイルスの産生
ＤＮ ＤＬＫ及びＬＺＫを発現するレンチウイルスは、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｋｐｎ２Ｉで消化）を使用して、合成ＤＮＡ断片をｐＬｅｎｔｉ－ＥＦ１－ｍＳｃａｒｌｅｔ骨格にサブクローニングすることによって作製した。その結果、ＤＬＫが小さなリンカーペプチドによってｍＳｃａｒｌｅｔに融合した。ロイシンジッパーについては、翻訳中にリボソームスキッピングを誘導するＰ２Ａ配列を、ｍＳｃａｒｌｅｔと断片との間に挿入した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号１１６６８０１９）を使用して、２９３－ＨＥＫ細胞を様々なレンチウイルス構築物でトランスフェクトした。１Ｍの酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ番号Ｂ５８８７）を、トランスフェクション後２４時間に添加した。ウイルス上清をトランスフェクション後４８時間に回収し、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｔａｋａｒａ）で濃縮した。
５．１ 方法論
５．１．１ レンチウイルスの産生
ＤＮ ＤＬＫ及びＬＺＫを発現するレンチウイルスは、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｋｐｎ２Ｉで消化）を使用して、合成ＤＮＡ断片をｐＬｅｎｔｉ－ＥＦ１－ｍＳｃａｒｌｅｔ骨格にサブクローニングすることによって作製した。その結果、ＤＬＫが小さなリンカーペプチドによってｍＳｃａｒｌｅｔに融合した。ロイシンジッパーについては、翻訳中にリボソームスキッピングを誘導するＰ２Ａ配列を、ｍＳｃａｒｌｅｔと断片との間に挿入した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号１１６６８０１９）を使用して、２９３－ＨＥＫ細胞を様々なレンチウイルス構築物でトランスフェクトした。１Ｍの酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ番号Ｂ５８８７）を、トランスフェクション後２４時間に添加した。ウイルス上清をトランスフェクション後４８時間に回収し、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｔａｋａｒａ）で濃縮した。
【0082】
５．１．２ 初代ＲＧＣ
出生後０～３日目のマウスから網膜を単離し、パパインで解離した。抗ＣＤ１１ｂ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５４８５９）とコンジュゲートしたＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でミクログリアを免疫枯渇させた。網膜細胞の懸濁液を、室温（ＲＴ）で、抗Ｔｈｙ１．２抗体（ＢｉｏＲａｄ、ＭＣＡ０２Ｒ）及びヤギ抗マウスＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、１１５－００１－０２０）と事前にコンジュゲートしたプレート上でイムノパンニングした。洗浄後、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）をトリプシン（ＳｉｇｍａＴ９２０１）でプレートから剥離し、計数し、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎプレート及びＰｏｌｙ－Ｄ－リジンでコーティング）にウェル当たり５，０００～１０，０００の密度で播種した。増殖培地は、ＮＳ２１、Ｓａｔｏ、Ｌ－グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｎ－アセチル－システイン、インスリン、ピルビン酸ナトリウム、トリヨードチロニン（Ｔ３）、フォルスコリン（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）、及びＲＧＣの死滅を予防するための１μＭのＧＮＥ ３５１１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で構成されていた。レンチウイルスＤＮ ＤＬＫ及びＬＺＫの形質導入を、単離時に行った。
出生後０～３日目のマウスから網膜を単離し、パパインで解離した。抗ＣＤ１１ｂ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５４８５９）とコンジュゲートしたＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でミクログリアを免疫枯渇させた。網膜細胞の懸濁液を、室温（ＲＴ）で、抗Ｔｈｙ１．２抗体（ＢｉｏＲａｄ、ＭＣＡ０２Ｒ）及びヤギ抗マウスＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、１１５－００１－０２０）と事前にコンジュゲートしたプレート上でイムノパンニングした。洗浄後、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）をトリプシン（ＳｉｇｍａＴ９２０１）でプレートから剥離し、計数し、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎプレート及びＰｏｌｙ－Ｄ－リジンでコーティング）にウェル当たり５，０００～１０，０００の密度で播種した。増殖培地は、ＮＳ２１、Ｓａｔｏ、Ｌ－グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｎ－アセチル－システイン、インスリン、ピルビン酸ナトリウム、トリヨードチロニン（Ｔ３）、フォルスコリン（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）、及びＲＧＣの死滅を予防するための１μＭのＧＮＥ ３５１１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で構成されていた。レンチウイルスＤＮ ＤＬＫ及びＬＺＫの形質導入を、単離時に行った。
【0083】
５．１．３ 生存率アッセイ
形質導入後３～５日目に、ＧＮＥ ３５１１（ＤＬＫ／ＬＺＫ阻害剤）を初代ＲＧＣから除去して細胞死を開始させた。５０％体積のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（ＣＴＧ）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ８４６２）を添加することによって、ＧＮＥ除去後３日目の生存［相対光単位（ＲＬＵ）］について細胞をアッセイした。プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で発光を測定した。これにより、生存細胞の数の計算が可能になった。レンチウイルス構築物の「効力」は、ＣＴＧによって測定された生存効果をもたらしたレンチウイルスの最低力価（ウイルスゲノム（ｖｇ）のレベルとして表される）を決定することによって評価した。構築物の「有効性」は、同じレンチウイルス濃度の異なる構築物の生存を比較することによって評価した。
形質導入後３～５日目に、ＧＮＥ ３５１１（ＤＬＫ／ＬＺＫ阻害剤）を初代ＲＧＣから除去して細胞死を開始させた。５０％体積のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（ＣＴＧ）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ８４６２）を添加することによって、ＧＮＥ除去後３日目の生存［相対光単位（ＲＬＵ）］について細胞をアッセイした。プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で発光を測定した。これにより、生存細胞の数の計算が可能になった。レンチウイルス構築物の「効力」は、ＣＴＧによって測定された生存効果をもたらしたレンチウイルスの最低力価（ウイルスゲノム（ｖｇ）のレベルとして表される）を決定することによって評価した。構築物の「有効性」は、同じレンチウイルス濃度の異なる構築物の生存を比較することによって評価した。
【0084】
５．１．４ レンチウイルスゲノムコピー数を定量するための定量的逆転写酵素ＰＣＲ
２９３－ＨＥＫ細胞を、セクション５．１．１に記載されているように、ＤＮ ＤＬＫ及びＬＺＫを発現するレンチウイルスで形質導入した。細胞を回収し、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＲＮＡ抽出キット（Ｌｕｃｉｇｅｎ番号ＱＥ０９０５０）を使用してＤＮＡを抽出した。ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ １８５５２００）を使用してＰＣＲ分析を実施した。フォワード（ＣＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴ）及びリバース（ＧＣＡＧＡＡＴＣＣＡＧＧＴＧＧＣＡＡＣＡ）プライマーを使用するＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ １７２５２７０）を用いてｑＰＣＲを行い、レンチウイルスｍＲＮＡレベル（すなわち、ゲノムコピー数）を検出した。Ｓｏｘ１１を内部対照として増幅した（Ｓｏｘ１１、フォワードプライマー：ＣＡＣＣＧＡＴＧＡＡＣＧＧＧＡＴＣＴＴＣＴＣＧＣ、リバースプライマー：ＡＡＡＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＣＣＣＧＴＴＣＡＴＣ）。
２９３－ＨＥＫ細胞を、セクション５．１．１に記載されているように、ＤＮ ＤＬＫ及びＬＺＫを発現するレンチウイルスで形質導入した。細胞を回収し、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＲＮＡ抽出キット（Ｌｕｃｉｇｅｎ番号ＱＥ０９０５０）を使用してＤＮＡを抽出した。ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ １８５５２００）を使用してＰＣＲ分析を実施した。フォワード（ＣＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴ）及びリバース（ＧＣＡＧＡＡＴＣＣＡＧＧＴＧＧＣＡＡＣＡ）プライマーを使用するＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ １７２５２７０）を用いてｑＰＣＲを行い、レンチウイルスｍＲＮＡレベル（すなわち、ゲノムコピー数）を検出した。Ｓｏｘ１１を内部対照として増幅した（Ｓｏｘ１１、フォワードプライマー：ＣＡＣＣＧＡＴＧＡＡＣＧＧＧＡＴＣＴＴＣＴＣＧＣ、リバースプライマー：ＡＡＡＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＣＣＣＧＴＴＣＡＴＣ）。
【0085】
５．１．５ ランダム変異誘発スクリーニング
ＤＬＫの約１ｋｂ切片（ヌクレオチド７７２～１８３０）を、全長ＤＬＫｃＤＮＡから増幅した。ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩ Ｅｒｒｏｒ－Ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用し、１変異／ｋｂのおよその変異頻度を維持しながら、エラープローンＰＣＲを用いて、増幅産物をランダムに変異誘発した。次いで、変異誘発したインサート及び骨格をＡａｒＩ及びＢｓｔＸＩで消化し、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）を使用してライゲーションした。初代ＲＧＣへのレンチウイルスＤＮ ＤＬＫライブラリーの形質導入は、０．３の感染多重度で単離したときに行った。形質導入後３～５日目にＧＮＥ ３５１１を除去することにより選択圧を誘発した。ＧＮＥ ３５１１除去後５～７日後の生存細胞を回収し、次世代シーケンシングによって分析した。
ＤＬＫの約１ｋｂ切片（ヌクレオチド７７２～１８３０）を、全長ＤＬＫｃＤＮＡから増幅した。ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩ Ｅｒｒｏｒ－Ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用し、１変異／ｋｂのおよその変異頻度を維持しながら、エラープローンＰＣＲを用いて、増幅産物をランダムに変異誘発した。次いで、変異誘発したインサート及び骨格をＡａｒＩ及びＢｓｔＸＩで消化し、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）を使用してライゲーションした。初代ＲＧＣへのレンチウイルスＤＮ ＤＬＫライブラリーの形質導入は、０．３の感染多重度で単離したときに行った。形質導入後３～５日目にＧＮＥ ３５１１を除去することにより選択圧を誘発した。ＧＮＥ ３５１１除去後５～７日後の生存細胞を回収し、次世代シーケンシングによって分析した。
【0086】
５．２ 神経保護ＤＬＫバリアントの作製
一連の構築物を調製して、特定の位置での野生型ヒトＤＬＫ（配列番号１）の変異の影響を評価し、Ｃ末端でのＤＬＫの切断の影響を試験した。
一連の構築物を調製して、特定の位置での野生型ヒトＤＬＫ（配列番号１）の変異の影響を評価し、Ｃ末端でのＤＬＫの切断の影響を試験した。
【0087】
５．２．１ Ｓ３０２ ｄｎＤＬＫ
ＤＬＫリン酸化部位である３０２位に置換を有するＤＬＫ変異体を作製した。３０２位（Ｓ３０２Ａ）でアラニンをＳに置換し、上記のようにマウス網膜神経節ニューロンの生存への影響を評価した。いくつかの実験では、保護活性をｄｎＤＬＫのＫ１８５Ａと比較した。Ｋ１８５Ａ変異は、ＤＬＫ自己リン酸化をブロックする。我々は、ＤＮＫのＳ３０２Ａバリアントが神経保護的であることを見出した。実際、Ｓ３０２ ＤＬＫは、ＤＬＫ Ｋ１８５Ａバリアントよりも高い神経保護活性を有していた。図２（Ｋ１８５Ａ対Ｓ３０２Ａ）を参照されたい。特定の機構に拘束されることを意図するものではないが、Ｓ３０２Ａ変異は、ホスホキナーゼＡ（ＰＫＡ）によるＤＬＫ活性化をブロックすると考えられる。
ＤＬＫリン酸化部位である３０２位に置換を有するＤＬＫ変異体を作製した。３０２位（Ｓ３０２Ａ）でアラニンをＳに置換し、上記のようにマウス網膜神経節ニューロンの生存への影響を評価した。いくつかの実験では、保護活性をｄｎＤＬＫのＫ１８５Ａと比較した。Ｋ１８５Ａ変異は、ＤＬＫ自己リン酸化をブロックする。我々は、ＤＮＫのＳ３０２Ａバリアントが神経保護的であることを見出した。実際、Ｓ３０２ ＤＬＫは、ＤＬＫ Ｋ１８５Ａバリアントよりも高い神経保護活性を有していた。図２（Ｋ１８５Ａ対Ｓ３０２Ａ）を参照されたい。特定の機構に拘束されることを意図するものではないが、Ｓ３０２Ａ変異は、ホスホキナーゼＡ（ＰＫＡ）によるＤＬＫ活性化をブロックすると考えられる。
【0088】
図２はまた、より短いヒトＤＬＫアイソフォーム配列番号１３（図２の構築物Ｋ１８５Ａ（ｉｓｏ２））に導入されたＫ１８５Ａ変異も、この実験で評価した他の変異体構築物で得られた神経保護と比較して低いレベルではあるが、神経保護的であったことを示すデータを提供する。
【0089】
５．２．２ Ｃ末端切断（ΔＣ－ｄｎＤＬＫ）
我々は、Ｋ１８５Ａ ＤＬＫのＣ末端アミノ酸５２１～８９２の除去が、Ｋ１８５Ａ ＤＬＫの保護活性を有意に低下させなかったことを見出した。図２（Ｋ１８５Ａ対Ｋ１８５Ａ／ΔＣ）を参照されたい。我々は、Ｃ末端を欠失させることによって、ｄｎＤＬＫ活性を保持しながら、ＤＬＫのサイズを減少させることができると結論付けた。ΔＣ－ｄｎＤＬＫのより小さいサイズは、はるかに短い導入遺伝子を使用して、活性ｄｎＤＬＫを細胞に送達できることを意味する。
我々は、Ｋ１８５Ａ ＤＬＫのＣ末端アミノ酸５２１～８９２の除去が、Ｋ１８５Ａ ＤＬＫの保護活性を有意に低下させなかったことを見出した。図２（Ｋ１８５Ａ対Ｋ１８５Ａ／ΔＣ）を参照されたい。我々は、Ｃ末端を欠失させることによって、ｄｎＤＬＫ活性を保持しながら、ＤＬＫのサイズを減少させることができると結論付けた。ΔＣ－ｄｎＤＬＫのより小さいサイズは、はるかに短い導入遺伝子を使用して、活性ｄｎＤＬＫを細胞に送達できることを意味する。
【0090】
５．２．３ Ｓ３０２／ΔＣ ｄｎＤＬＫ
我々は、Ｓ３０２Ａ置換を残基５２１～８９２のＣ末端欠失と組み合わせたバリアントを調製した。図１Ａに示されるように、Ｓ３０２／ΔＣ ｄｎＤＬＫは、Ｋ１８５Ａバリアントよりも保護性が高かった。導入遺伝子の効力は１０倍増加し、一方で最大有効性は２．５倍増加した。
我々は、Ｓ３０２Ａ置換を残基５２１～８９２のＣ末端欠失と組み合わせたバリアントを調製した。図１Ａに示されるように、Ｓ３０２／ΔＣ ｄｎＤＬＫは、Ｋ１８５Ａバリアントよりも保護性が高かった。導入遺伝子の効力は１０倍増加し、一方で最大有効性は２．５倍増加した。
【0091】
５．２．４ ＬＺＫ ＬＺは神経保護的である
ＤＬＫは、ＤＬＫロイシンジッパーを介してホモ二量体化することが知られている。ＤＬＫロイシンジッパー自体が、おそらくＤＬＫに結合してホモ二量体化を防止する能力によって、ｄｎＤＬＫとして機能し得ることも示されている（Ｎｉｈａｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：７２７３－７２７９，２０００）。
ＤＬＫは、ＤＬＫロイシンジッパーを介してホモ二量体化することが知られている。ＤＬＫロイシンジッパー自体が、おそらくＤＬＫに結合してホモ二量体化を防止する能力によって、ｄｎＤＬＫとして機能し得ることも示されている（Ｎｉｈａｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：７２７３－７２７９，２０００）。
【0092】
ＬＺＫロイシンジッパードメイン（配列番号８）を発現させるための構築物を調製した。驚くべきことに、ＬＺＫロイシンジッパードメイン（図１ＢにおいてＰ２Ａ ＬＺＫ ＬＺとして示される構築物）は、神経保護活性を有していた。この構築物は、効力を１０倍、有効性を約８．５倍増加させた（図１Ｂを参照されたい）。ＤＬＫロイシンジッパードメイン（図２においてＰ２Ａ ＤＬＫ ＬＺとして示される）を発現する構築物は、保護活性を示さなかった。また、ＤＬＫ ＬＺ及びＬＺＫ ＬＺ Ｐ２Ａ融合構築物も作製したが、ＲＧＣの生存には影響を及ぼさなかった（データは示さず）。同様に、ＤＬＫ ＬＺ及びＬＺＫ ＬＺをコードする構築物の同時トランスフェクションは、生存率の改善をもたらさなかった（データは示さず）。特定の機構に拘束されることを意図するものではないが、ＬＺＫ ＬＺポリペプチドは、ＤＬＫ－ＬＺＫヘテロ二量体化を阻害すると考えられる。
【0093】
５．２．５ Ｔ４３Ｅ ｄｎＤＬＫ
本実施例では、一連のリン酸化模倣変異体（Ｔ９Ｅ、Ｓ１１Ｅ、Ｔ４３Ｅ、Ｓ２７２Ｅ及びＳ５３３Ｅ）を作製した。これらのうち、Ｔ４３Ｅバリアントは、神経保護的であった（図２を参照されたい（Ｋ１８５Ａ対Ｋ１８５Ａ／Ｔ４３Ｅ）。
本実施例では、一連のリン酸化模倣変異体（Ｔ９Ｅ、Ｓ１１Ｅ、Ｔ４３Ｅ、Ｓ２７２Ｅ及びＳ５３３Ｅ）を作製した。これらのうち、Ｔ４３Ｅバリアントは、神経保護的であった（図２を参照されたい（Ｋ１８５Ａ対Ｋ１８５Ａ／Ｔ４３Ｅ）。
【0094】
Ｈｕｎｔｗｏｒｋ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ２０２：７４７－７６３，２０１３）は、神経損傷後、ＤＬＫの長さにわたる特定の部位がｃ－ＪｕｎＮ末端キナーゼによるリン酸化を受けたことを実証した。これらのリン酸化事象は、ＤＬＫユビキチン化の低減を介してＤＬＫ存在量の増加をもたらした。我々は、これらの部位にリン酸化模倣変異を導入して、より安定なドミナントネガティブＤＬＫポリペプチドを作製できるという仮説を立てた。部位Ｔ９、Ｓ１１、Ｔ４３、Ｓ２７２、及びＳ５３３を前述のように変異誘発した。リン酸化模倣変異をＫ１８５Ａ変異体のバックグラウンドに導入した。
【0095】
様々なリン酸化模倣ＤＮ ＤＬＫ変異体をコードするレンチウイルスを、セクション５．１．１に記載されているように作製し、等しい力価でＲＧＣに形質導入した。ＤＬＫ／ＬＺＫ阻害剤ＧＮＥ ３５１１は、細胞死を防止するために培地中に存在していた。形質導入後３～５日目に、ＧＮＥ ３５１１を初代ＲＧＣから除去して細胞死を開始させた。細胞を、ＧＮＥ除去後３日目の生存についてアッセイした。発光（相対光単位（ＲＬＵ）を測定して、生存細胞の数を決定した。
【0096】
この分析では、Ｔ４３Ｅ Ｋ１８５Ａのみが、Ｋ１８５Ａと比較して強化された神経保護を示した。全ての構築物の神経保護活性を以下に要約する。
－Ｔ９Ｅ Ｓ１１Ｅ Ｋ１８５Ａ：Ｋ１８５Ａ変異単独と比較して有意差なし
－Ｓ５３３Ｅ Ｋ１８５Ａ：Ｋ１８５Ａ変異単独と比較して有意差なし
－Ｔ９Ｅ Ｓ１１Ｅ Ｓ２７２Ｅ Ｓ５３３Ｅ Ｋ１８５Ａ：Ｋ１８５Ａ変異単独と比較して有意差なし
－Ｔ４３Ｅ Ｓ２７２Ｅ Ｓ５３３Ｅ Ｋ１８５Ａ：陰性対照（ＧＮＥ除去）と比較して生存率の改善なし
－Ｔ４３Ｅ Ｋ１８５Ａ：Ｋ１８５Ａ単独と比較して約３倍の生存率改善
－Ｔ９Ｅ Ｓ１１Ｅ Ｋ１８５Ａ：Ｋ１８５Ａ変異単独と比較して有意差なし
－Ｓ５３３Ｅ Ｋ１８５Ａ：Ｋ１８５Ａ変異単独と比較して有意差なし
－Ｔ９Ｅ Ｓ１１Ｅ Ｓ２７２Ｅ Ｓ５３３Ｅ Ｋ１８５Ａ：Ｋ１８５Ａ変異単独と比較して有意差なし
－Ｔ４３Ｅ Ｓ２７２Ｅ Ｓ５３３Ｅ Ｋ１８５Ａ：陰性対照（ＧＮＥ除去）と比較して生存率の改善なし
－Ｔ４３Ｅ Ｋ１８５Ａ：Ｋ１８５Ａ単独と比較して約３倍の生存率改善
【0097】
５．２．６ Ｇ５１６ ｄｎＤＬＫ
ｄｎＤＬＫ変異を発見するための代替的なアプローチとして、ヒトＤＬＫをランダムに変異誘発し、ＲＧＣを形質導入し、生存細胞に残存する配列を回収した（すなわち、指向性進化）。
ｄｎＤＬＫ変異を発見するための代替的なアプローチとして、ヒトＤＬＫをランダムに変異誘発し、ＲＧＣを形質導入し、生存細胞に残存する配列を回収した（すなわち、指向性進化）。
【0098】
ＤＬＫをランダムに変異誘発したレンチウイルスライブラリーを作製した。ＲＧＣは、各細胞が平均して１つのウイルスを受け取るように、１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。ＬＫ／ＬＺＫ阻害剤ＧＮＥ ３５１１は、当初、細胞死を防止するために培地中に存在していた。次いで、生存細胞のみが活性ＤＬＫドミナントネガティブを含むように、ＧＮ ３５１１を除去することにより選択圧を適用した。選択圧を適用する前に、次世代シーケンシングによって変異のベースライン分布を示した。選択圧後、生存細胞の次世代シーケンシングにより、Ｇ５１６Ｖがベースライン分布を超えて最も濃縮されていることが確認された。このようにして、本スクリーニングにより、ｄｎＤＬＫも生成する新しい変異体Ｇ５１６Ｖが同定された。
【0099】
５．３ ｄｎＤＬＫのインビボ投与
５．３．１ 緑内障のラットモデル
Ｓ３０２Ａ置換を残基５２１～８９２のＣ末端欠失と組み合わせたｄｎＤＬＫバリアント（配列番号６）をコードするＡＡＶの投与の効果を、緑内障のラットモデルにおいて評価した。
５．３．１ 緑内障のラットモデル
Ｓ３０２Ａ置換を残基５２１～８９２のＣ末端欠失と組み合わせたｄｎＤＬＫバリアント（配列番号６）をコードするＡＡＶの投与の効果を、緑内障のラットモデルにおいて評価した。
【0100】
動物（１群当たり８匹）をイソフルランで麻酔し、ｄｎＤＬＫを発現するＡＡＶ、又は対照としてＧＦＰを発現するＡＡＶを、５×１０９ウイルスゲノムの用量で１回硝子体内注射した。
【0101】
４週間後、動物をケタミン／キシラジンカクテルで麻酔し、プロパラカイン点眼薬で眼に局所麻酔した。麻酔後、低温の焼灼ペン（７００～１０００Ｆ）で、眼の辺縁神経叢の周囲を穏やかにタッピングした。適切な焼灼は、結膜のわずかな褐変及び上強膜血管の白化によって確認した。次いで、感染及び角膜の乾燥を防止するために、眼を抗生物質軟膏でコーティングした。損傷の６週間後、動物を麻酔し、次いで４％のＰＦＡで灌流し、網膜をＲＢＰＭＳ及びＳＮＣＧで免疫蛍光標識した。
【0102】
緑内障モデルにおけるＲＧＣ生存率を定量するために、中心領域及び末梢領域が等しく表示されるように、網膜当たりのＲＢＰＭＳ標識したＲＧＣの合計１６枚の画像を１０倍の倍率で撮影した。ＲＧＣの数は、画像ごとに自動画像解析ソフトウェアを使用して定量し、次いで網膜ごとに平均化した。
【0103】
軸索変性を評価するために、ＳＮＣＧを標識した視神経乳頭を１０倍の倍率で撮像し、モンタージュして軸索の健康を評価した。モンタージュした画像は、１から５までスコア化した（５は健康な軸索、１は完全に変性した状態）治癒レベルについて治験責任医師のパネルによって評価された。健康を評価するための基準には、軸索束の厚さ、軸索形状の均一性又は直線性、及び軸索喪失を伴う網膜のパーセンテージが含まれた。
【0104】
図３は、左パネルに、ｄｎＤＬＫを投与した動物と対照を投与した動物における軸索の平均軸索健康スコアを示し、右パネルに、軸索変性を評価することによって評価した視神経乳頭変性の平均パーセンテージを示す。ｄｎＤＬＫを発現するＡＡＶを注射した眼からの網膜は、平均スコア４（５点満点中）で緑内障から保護されたのに対し、ＧＦＰを発現するＡＡＶを注射した眼からの網膜は、平均スコア２で変性軸索を有していた。更に、緑内障損傷は、ＧＦＰ網膜において平均６５％の軸索変性を引き起こしたが、ｄｎＤＬＫを含む網膜では軸索完全性の損失はわずか２０％であった。緑内障後のＲＧＣ生存率は、ｄｎＤＬＫによって改善され、損傷のないｄｎＤＬＫを含む網膜と比較するとＲＧＣにおける損失は平均８％であった。ＧＦＰを含む網膜は、損傷のないＧＦＰ網膜と比較して、損傷がある場合のＲＧＣ損失は平均３７．５％であった。
【0105】
したがって、この結果は、ｄｎＤＬＫがインビボラットモデルにおいて緑内障損傷からＲＧＣを保護したことを実証するものである。
＊＊＊
＊＊＊
【0106】
本明細書に記載される実施例及び実施形態は、例示的な目的のためだけのものであり、それを考慮して様々な修正又は変更が当業者に提案され、本出願の趣旨及び範囲並びに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。
【0107】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それらが明示的に引用される資料に関して参照により本明細書に組み込まれる。
【表3】
【0108】
配列番号１ ヒトＤＬＫキナーゼドメインポリペプチド配列、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１２８５２－２；ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１２８５２－１の４６位にあるヒスチジンの代わりに、アミノ酸配列ＱＣＶＬＲＤＶＶＰＬＧＧＱＧＧＧＧＰＳＰＳＰＧＧＥＰＰＰＥＰＦＡＮＳを含む；配列番号１３を参照のこと）。実施例で言及されるＣ末端欠失配列を下線で示す。
配列番号２ ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１２８５２に定義される触媒（キナーゼ）ドメインアミノ酸配列
配列番号３ ヒトＤＬＫロイシンジッパードメイン配列
配列番号４ ヒトＤＬＫのロイシンジッパー１配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１２８５２に定義されるとおり）
ＶＫＬＨＦＥＫＩＫＳＥＧＴＣＬＨＲＬＥＥＥＬ
配列番号５ ヒトＤＬＫのロイシンジッパー２配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１２８５２に定義されるとおり）
ＬＮＡＬＭＬＱＬＥＬＫＥＲＥＬＬＲＲＥＱＡＬ
配列番号６ ３０２に変異を有するＣ末端欠失ｄｎＤＬＫ
配列番号７ ３０２及び４３に変異を有するＣ末端欠失ｄｎＤＬＫ
配列番号８ ヒトＭＡＰ３Ｋ１３（ロイシンジッパーキナーゼ）ロイシンジッパードメインアミノ酸配列
ＬＡＴＰＱＥＴＹＦＫＳＱＡＥＷＲＥＥＶＫＫＨＦＥＫＩＫＳＥＧＴＣＩＨＲＬＤＥＥＬＩＲＲＲＲＥＥＬＲＨＡＬＤＩＲＥＨＹＥＲＫＬＥＲＡＮＮＬＹＭＥＬＳＡＩＭＬＱＬＥＭＲＥＫＥＬＩＫＲＥＱＡＶＥＫＫＹＰＧＴＹＫＲＨＰＶＲＰＩＩＨＰＮＡＭＥ
配列番号９ 配列番号１をコードするＤＬＫ全長ｃＤＮＡ配列
ＡＴＧＧＣＴＴＧＣＣＴＣＣＡＴＧＡＧＡＣＣＣＧＡＡＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＴＴＧＧＧＧＧＣＴＴＴＧＴＧＴＣＴＡＣＣＣＴＡＡＧＴＧＡＧＧＣＡＴＣＣＡＴＧＣＧＣＡＡＧＣＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＴＴＣＴＧＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＣＣＴＧＡＣＧＣＣＴＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＡＣＴＴＣＧＡＧＡＴＧＴＧＧＴＡＣＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＴＴＴＧＣＣＡＡＣＡＧＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＣＴＡＣＡＴＧＡＧＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧＧＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＡＣＣＴＧＡＧＡＧＴＣＧＧＧＣＡＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＧＡＧＣＴＧＡＣＧＡＧＧＴＧＣＧＡＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＣＴＴＣＣＴＴＧＡＧＧＧＣＣＴＣＴＴＴＧＧＣＴＧＣＣＴＧＣＧＣＣＣＴＧＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＧＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＣＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＴＴＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＣＴＴＴＧＡＧＧＡＡＡＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＧＧＴＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧＧＴＧＣＴＧＴＣＴＴＣＣＴＧＧＧＧＣＧＣＴＴＣＣＡＣＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＣＧＡＧＡＣＣＴＣＡＡＡＧＡＡｗＡＣＣＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＣＴＴＧＣＧＡＡＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＣＣＣＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＣＴＴＴＣＡＡＧＧＧＴＧＴＧＴＧＣＡＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＴＡＣＴＧＣＡＴＣＣＴＣＡＴＧＧＡＧＴＴＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＴＡＣＴＧＣＧＧＧＣＴＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＴＣＡＣＣＣＣＣＴＣＣＴＴＡＣＴＧＧＴＴＧＡＣＴＧＧＴＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＣＧＣＴＧＧＴＧＧＣＡＴＧＡＡＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＡＧＡＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＡＣＡＴＧＣＴＡＡＴＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＡＴＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＧＡＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＴＣＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＡＧＴＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＧＡＴＧＴＣＣＴＴＴＧＣＡＧＧＧＡＣＡＧＴＡＧＣＣＴＧＧＡＴＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＧＣＡＡＴＧＡＡＣＣＴＧＴＧＴＣＴＧＡＧＡＡＧＧＴＣＧＡＣＡＴＣＴＧＧＴＣＣＴＴＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＣＴＡＴＧＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＡＴＣＣＣＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＴＡＧＡＴＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＴＴＡＴＣＴＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＡＡＧＣＡＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＴＴＧＣＣＣＡＧＡＴＧＧＴＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＴＣＧＣＣＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＡＧＣＡＡＡＣＣＡＣＧＡＡＡＴＣＧＣＣＣＡＴＣＡＴＴＣＣＧＡＣＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＣＣＴＣＡＧＣＴＧＡＴＧＴＡＣＴＣＴＣＣＡＣＡＣＣＣＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＡＣＴＴＴＡＡＧＴＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＧＴＧＧＣＧＧＧＡＡＧＡＡＧＴＡＡＡＡＣＴＧＣＡＣＴＴＴＧＡＡＡＡＧＡＴＴＡＡＧＴＣＡＧＡＡＧＧＧＡＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＣＴＧＧＴＧＡＴＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＴＣＡＧＧＧＡＧＣＡＣＴＡＴＧＡＡＡＧＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＣＣＡＡＣＡＡＣＣＴＧＴＡＴＡＴＧＧＡＡＣＴＴＡＡＴＧＣＣＣＴＣＡＴＧＴＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣＡＧＧＣＧＡＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＴＡＧＡＧＣＧＧＡＧＧＴＧＣＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＴＴＣＣＣＧＧＧＧＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＡＣＡＣＡＡＴＧＧＡＧＡＡＧＣＴＴＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＴＧＴＧＣＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＧＴＣＡＣＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＡＴＡＴＣＣＴＣＡＡＧＡＣＧＧＡＧＴＣＴＴＴＧＣＴＣＣＣＴＡＡＡＣＴＡＧＡＴＧＣＡＧＣＣＣＴＧＡＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＧＴＧＴＣＣＴＡＡＧＧＧＣＣＣＣＣＣＣＴＣＡＣＣＡＧＧＡＣＧＧＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＧＣＡＡＧＡＣＣＣＧＴＣＡＣＣＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＧＣＴＧＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣＧＴＡＣＡＧＣＴＧＴＧＣＣＡＣＣＣＣＡＴＧＡＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧＧＧＣＣＴＡＧＧＡＧＧＧＧＧＡＣＣＣＴＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＣＣＴＣＣＣＧＣＣＣＴＣＣＧＴＧＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＴＧＡＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＡＡＡＡＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＧＴＣＣＣＣＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＡＧＧＧＴＣＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＧＧＡＧＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＧＧＣＣＣＧＧＧＧＴＧＡＣＡＣＣＣＣＡＣＣＡＡＧＴＧＡＧＧＧＣＴＣＡＧＣＣＣＣＴＧＧＣＴＣＣＡＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＴＴＣＡＣＣＴＧＧＧＧＧＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＧＡＡＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＡＧＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＴＧＧＧＧＣＴＴＣＴＧＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＣＴＣＡＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＧＧＧＣＴＧＧＧＴＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＧＡＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＡＣＴＧＣＴＧＴＡＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＧＴＣＡＣＣＣＧＡＡＧＴＣＡＧＡＡＡＣＧＴＧＧＣＡＴＣＴＣＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＴＡＧＡＣＡＧＴＧＡＡＧＴＡＧＡＧＣＴＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＣＴＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＡＣＡＴＧＣＧＣＣＡＧＴＣＡＣＴＡＴＣＴＡＣＣＴＴＣＡＧＣＴＣＡＧＡＧＡＡＴＣＣＡＴＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＡＧＴＧＡＡＣＣＴＴＣＣＣＣＣＡＧＴＧＧＣＡＣＡＣＣＴＧＡＡＧＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＡＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣＧＧＣＣＡＧＡＴＧＡＧＣＧＧＴＣＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＴＧＣＴＣＣＣＡＧＧＧＣＴＣＡＧＡＡＡＴＣＣＣＡＣＴＧＧＡＣＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＧＴＣＡＴＣＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＡＣＣＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＣＡＣＡＣＣＡＧＧＡＡＣＴＴＣＴＣＡＧＡＧＡＧＣＧＧＧＧＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＡＧＡＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣＡＣＴＧＡＡＴＴＧＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡＡＣＡＧＣＧＴＴＧＡＴＧＣＣＴＴＧＣＧＧＣＣＣＣＣＡＧＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＡＴＧＡ
配列番号１０ ｄｎＤＬＫ Ｓ３０２Ａ ΔＣ末端含有ＷＰＲＥポリヌクレオチド配列
ＡＴＧＧＣＴＴＧＣＣＴＣＣＡＴＧＡＧＡＣＣＣＧＡＡＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＴＴＧＧＧＧＧＣＴＴＴＧＴＧＴＣＴＡＣＣＣＴＡＡＧＴＧＡＧＧＣＡＴＣＣＡＴＧＣＧＣＡＡＧＣＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＴＴＣＴＧＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＣＣＴＧＡＣＧＣＣＴＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＡＣＴＴＣＧＡＧＡＴＧＴＧＧＴＡＣＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＴＴＴＧＣＣＡＡＣＡＧＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＣＴＡＣＡＴＧＡＧＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧＧＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＡＣＣＴＧＡＧＡＧＴＣＧＧＧＣＡＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＧＡＧＣＴＧＡＣＧＡＧＧＴＧＣＧＡＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＣＴＴＣＣＴＴＧＡＧＧＧＣＣＴＣＴＴＴＧＧＣＴＧＣＣＴＧＣＧＣＣＣＴＧＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＧＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＣＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＴＴＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＣＴＴＴＧＡＧＧＡＡＡＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＧＧＴＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧＧＴＧＣＴＧＴＣＴＴＣＣＴＧＧＧＧＣＧＣＴＴＣＣＡＣＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＣＧＡＧＡＣＣＴＣＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＣＴＴＧＣＧＡＡＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＣＣＣＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＣＴＴＴＣＡＡＧＧＧＴＧＴＧＴＧＣＡＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＴＡＣＴＧＣＡＴＣＣＴＣＡＴＧＧＡＧＴＴＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＴＡＣＴＧＣＧＧＧＣＴＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＴＣＡＣＣＣＣＣＴＣＣＴＴＡＣＴＧＧＴＴＧＡＣＴＧＧＴＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＣＧＣＴＧＧＴＧＧＣＡＴＧＡＡＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＡＧＡＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＡＣＡＴＧＣＴＡＡＴＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＡＴＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＧＡＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＴＣＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＡＧＴＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＧＣＡＧＧＧＡＣＡＧＴＡＧＣＣＴＧＧＡＴＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＧＣＡＡＴＧＡＡＣＣＴＧＴＧＴＣＴＧＡＧＡＡＧＧＴＣＧＡＣＡＴＣＴＧＧＴＣＣＴＴＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＣＴＡＴＧＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＡＴＣＣＣＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＴＡＧＡＴＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＴＴＡＴＣＴＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＡＡＧＣＡＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＴＴＧＣＣＣＡＧＡＴＧＧＴＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＴＣＧＣＣＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＡＧＣＡＡＡＣＣＡＣＧＡＡＡＴＣＧＣＣＣＡＴＣＡＴＴＣＣＧＡＣＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＣＣＴＣＡＧＣＴＧＡＴＧＴＡＣＴＣＴＣＣＡＣＡＣＣＣＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＡＣＴＴＴＡＡＧＴＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＧＴＧＧＣＧＧＧＡＡＧＡＡＧＴＡＡＡＡＣＴＧＣＡＣＴＴＴＧＡＡＡＡＧＡＴＴＡＡＧＴＣＡＧＡＡＧＧＧＡＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＣＴＧＧＴＧＡＴＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＴＣＡＧＧＧＡＧＣＡＣＴＡＴＧＡＡＡＧＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＣＣＡＡＣＡＡＣＣＴＧＴＡＴＡＴＧＧＡＡＣＴＴＡＡＴＧＣＣＣＴＣＡＴＧＴＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣＡＧＧＣＧＡＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＴＡＧＡＧＣＧＧＡＧＧＴＧＣＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＴＴＣＣＣＧＧＧＧＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＡＣＡＣＡＡＴＧＧＡＧＴＡＧ
配列番号１１ ｄｎＤＬＫ Ｔ４３Ｅ Ｓ３０２Ａ ΔＣ末端含有ＷＰＲＥポリヌクレオチド配列
ＡＴＧＧＣＴＴＧＣＣＴＣＣＡＴＧＡＧＡＣＣＣＧＡＡＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＴＴＧＧＧＧＧＣＴＴＴＧＴＧＴＣＴＡＣＣＣＴＡＡＧＴＧＡＧＧＣＡＴＣＣＡＴＧＣＧＣＡＡＧＣＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＴＴＣＴＧＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＣＣＴＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＡＣＴＴＣＧＡＧＡＴＧＴＧＧＴＡＣＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＴＴＴＧＣＣＡＡＣＡＧＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＣＴＡＣＡＴＧＡＧＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧＧＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＡＣＣＴＧＡＧＡＧＴＣＧＧＧＣＡＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＧＡＧＣＴＧＡＣＧＡＧＧＴＧＣＧＡＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＣＴＴＣＣＴＴＧＡＧＧＧＣＣＴＣＴＴＴＧＧＣＴＧＣＣＴＧＣＧＣＣＣＴＧＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＧＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＣＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＴＴＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＣＴＴＴＧＡＧＧＡＡＡＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＧＧＴＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧＧＴＧＣＴＧＴＣＴＴＣＣＴＧＧＧＧＣＧＣＴＴＣＣＡＣＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＣＧＡＧＡＣＣＴＣＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＣＴＴＧＣＧＡＡＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＣＣＣＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＣＴＴＴＣＡＡＧＧＧＴＧＴＧＴＧＣＡＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＴＡＣＴＧＣＡＴＣＣＴＣＡＴＧＧＡＧＴＴＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＴＡＣＴＧＣＧＧＧＣＴＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＴＣＡＣＣＣＣＣＴＣＣＴＴＡＣＴＧＧＴＴＧＡＣＴＧＧＴＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＣＧＣＴＧＧＴＧＧＣＡＴＧＡＡＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＡＧＡＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＡＣＡＴＧＣＴＡＡＴＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＡＴＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＧＡＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＴＣＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＡＧＴＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＧＣＡＧＧＧＡＣＡＧＴＡＧＣＣＴＧＧＡＴＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＧＣＡＡＴＧＡＡＣＣＴＧＴＧＴＣＴＧＡＧＡＡＧＧＴＣＧＡＣＡＴＣＴＧＧＴＣＣＴＴＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＣＴＡＴＧＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＡＴＣＣＣＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＴＡＧＡＴＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＴＴＡＴＣＴＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＡＡＧＣＡＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＴＴＧＣＣＣＡＧＡＴＧＧＴＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＴＣＧＣＣＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＡＧＣＡＡＡＣＣＡＣＧＡＡＡＴＣＧＣＣＣＡＴＣＡＴＴＣＣＧＡＣＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＣＣＴＣＡＧＣＴＧＡＴＧＴＡＣＴＣＴＣＣＡＣＡＣＣＣＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＡＣＴＴＴＡＡＧＴＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＧＴＧＧＣＧＧＧＡＡＧＡＡＧＴＡＡＡＡＣＴＧＣＡＣＴＴＴＧＡＡＡＡＧＡＴＴＡＡＧＴＣＡＧＡＡＧＧＧＡＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＣＴＧＧＴＧＡＴＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＴＣＡＧＧＧＡＧＣＡＣＴＡＴＧＡＡＡＧＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＣＣＡＡＣＡＡＣＣＴＧＴＡＴＡＴＧＧＡＡＣＴＴＡＡＴＧＣＣＣＴＣＡＴＧＴＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣＡＧＧＣＧＡＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＴＡＧＡＧＣＧＧＡＧＧＴＧＣＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＴＴＣＣＣＧＧＧＧＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＡＣＡＣＡＡＴＧＧＡＧＴＡＧ
配列番号１２ ＷＰＲＥを含有するドミナントネガティブＬＺＫロイシンジッパードメインポリヌクレオチド配列
ＡＴＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＡＧＡＡＡＣＴＴＡＣＴＴＣＡＡＧＴＣＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＡＧＡＴＣＡＡＡＡＧＴＧＡＡＧＧＡＡＣＴＴＧＴＡＴＡＣＡＣＣＧＧＴＴＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＴＧＡＴＴＣＧＡＡＧＧＣＧＣＡＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＣＡＧＧＣＡＴＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＴＴＣＧＴＧＡＡＣＡＣＴＡＴＧＡＧＣＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＧＣＧＧＧＣＧＡＡＴＡＡＴＴＴＡＴＡＣＡＴＧＧＡＡＴＴＧＡＧＴＧＣＣＡＴＣＡＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＧＣＧＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＣＴＣＡＴＴＡＡＧＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＧＴＡＴＣＣＴＧＧＧＡＣＣＴＡＣＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＴＴＣＧＴＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＧＴＧＡ
配列番号１３ ヒトＤＬＫポリペプチド配列、アイソフォーム１、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１２８５２－１
配列番号１４ ＷＰＲＥ核酸配列
ＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＧＡＴＴＧＡＣＴＧＡＴＡＴＴＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＡＣＧＣＴＧＴＧＴＧＧＡＴＡＴＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＴＧＣＣＴＣＴＧＴＡＴＣＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＣＣＣＧＴＡＣＧＧＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＡＴＡＡＡＴＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴＴＴＡＴＧＡＧＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＣＧＴＴＧＴＣＣＧＴＣＡＡＣＧＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＴＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＴＴＴＣＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣＧＡＴＣＧＣＣＡＣＧＧＣＡＧＡＡＣＴＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣＴＡＧＧＴＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＴＧＡＴＡＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＴＧＴＧＴＴＧＣＣＡＡＣＴＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＣＧＧＧＡＣＧＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＡＣＧＴＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＣＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＣＧＡＧＧＣＣＴＴＣＴＧＣＣＧＧＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＴＣＣＣＧＣＧＴＣＴＴＣＧＣＴＴＴＣＧＧＣＣＴＣＣＧＡＣＧＡＧＴＣＧＧＡＴＣＴＣＣＣＴＴＴＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＧＣＣＴＧ
【表4】
【表5】
【表6】
ＶＫＬＨＦＥＫＩＫＳＥＧＴＣＬＨＲＬＥＥＥＬ
配列番号５ ヒトＤＬＫのロイシンジッパー２配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１２８５２に定義されるとおり）
ＬＮＡＬＭＬＱＬＥＬＫＥＲＥＬＬＲＲＥＱＡＬ
配列番号６ ３０２に変異を有するＣ末端欠失ｄｎＤＬＫ
【表7】
【表8】
ＬＡＴＰＱＥＴＹＦＫＳＱＡＥＷＲＥＥＶＫＫＨＦＥＫＩＫＳＥＧＴＣＩＨＲＬＤＥＥＬＩＲＲＲＲＥＥＬＲＨＡＬＤＩＲＥＨＹＥＲＫＬＥＲＡＮＮＬＹＭＥＬＳＡＩＭＬＱＬＥＭＲＥＫＥＬＩＫＲＥＱＡＶＥＫＫＹＰＧＴＹＫＲＨＰＶＲＰＩＩＨＰＮＡＭＥ
配列番号９ 配列番号１をコードするＤＬＫ全長ｃＤＮＡ配列
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配列番号１０ ｄｎＤＬＫ Ｓ３０２Ａ ΔＣ末端含有ＷＰＲＥポリヌクレオチド配列
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配列番号１１ ｄｎＤＬＫ Ｔ４３Ｅ Ｓ３０２Ａ ΔＣ末端含有ＷＰＲＥポリヌクレオチド配列
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配列番号１２ ＷＰＲＥを含有するドミナントネガティブＬＺＫロイシンジッパードメインポリヌクレオチド配列
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配列番号１３ ヒトＤＬＫポリペプチド配列、アイソフォーム１、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１２８５２－１
【表9】
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【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【配列表】
【国際調査報告】