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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-27
(54)【発明の名称】ＦＯＬＲ２＋マクロファージおよび抗腫瘍免疫
(51)【国際特許分類】
G01N 33/574 20060101AFI20240319BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240319BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240319BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20240319BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20240319BHJP
C12N 15/88 20060101ALI20240319BHJP
C12Q 1/6874 20180101ALN20240319BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALN20240319BHJP
【ＦＩ】
G01N33/574 A
G01N33/53 Y ZNA
G01N33/50 P
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6876 Z
C12N15/88 Z
C12Q1/6874 Z
C12Q1/6851 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023562578
(86)(22)【出願日】2022-04-12
(85)【翻訳文提出日】2023-12-11
(86)【国際出願番号】 EP2022059792
(87)【国際公開番号】W WO2022218999
(87)【国際公開日】2022-10-20
(31)【優先権主張番号】21305475.2
(32)【優先日】2021-04-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509181699
【氏名又は名称】アンスティテュ・クリー
(71)【出願人】
【識別番号】507002516
【氏名又は名称】アンセルム（アンスティチュート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル）
(71)【出願人】
【識別番号】520053762
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・パリ・シテ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ ＣＩＴＥ
(71)【出願人】
【識別番号】506316557
【氏名又は名称】サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ホドリゴ・ナリオ・ハーモス
(72)【発明者】
【氏名】ピエール・ゲルモンプレ
(72)【発明者】
【氏名】エリアーヌ・ピアッジオ
(72)【発明者】
【氏名】ジュリー・エルフト
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045AA26
2G045CA23
2G045CB02
2G045DA14
2G045DA36
2G045FA37
2G045FB03
2G045FB12
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ03
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
本発明は、がん患者の予後およびモニタリングに有用な好適な転帰および抗腫瘍免疫のバイオマーカーとしての腫瘍関連FOLR2＋マクロファージおよびその遺伝子シグネチャに関する。本発明はまた、がんおよび感染症の予防および治療でT細胞免疫を増強するための治療標的としてのFOLR2＋マクロファージに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
患者のがんの予後およびモニタリングの方法であって、－患者の腫瘍試料におけるFOLR2＋マクロファージのレベルを決定するステップであって、腫瘍関連FOLR2＋マクロファージのレベルが前記患者のがん疾患または治療の転帰と正に相関する、ステップと、
－それから、前記がん疾患または治療の転帰が前記患者において好適であるか不良である可能性が高いかを推定するステップとを含む、方法。
【請求項2】
参照と比較して前記患者の腫瘍試料におけるFOLR2＋マクロファージのレベルが上昇していることが、前記患者において前記がん疾患または治療の転帰が好適である可能性が高いことを示す、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
がん疾患の前記好適な転帰が、生存期間もしくは生存率の増加、再発率の減少、再発までの期間の増加、および／または腫瘍の発生もしくは転移の減少を含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項4】
前記患者の腫瘍試料におけるFOLR2＋細胞の前記密度を決定するステップを含み、好ましくは、抗FOLR2抗体を使用する免疫組織化学的技術によるものであり、好ましくは、前記FOLR2＋細胞がさらにTREM2－またはTREM2低および／またはCADM1－である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記患者の腫瘍試料におけるFOLR2遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、好ましくは、FOLR2タンパク質の前記レベルを決定するステップを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
FOLR2、SEPP1およびSLC40A1遺伝子を含むまたはそれらからなる腫瘍関連FOLR2＋マクロファージの遺伝子シグネチャの発現の前記レベルを決定するステップを含み、好ましくは、前記遺伝子によって発現されるmRNAの前記レベルを決定するステップを含む、請求項5に記載の方法。
【請求項7】
前記FOLR2遺伝子または前記FOLR2、SEPP1およびSLC40A1遺伝子によって発現されるmRNAの前記レベルをRNA－Seqによって決定するステップを含む、請求項5から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記患者の腫瘍試料で決定された腫瘍関連FOLR2＋マクロファージの前記レベルに基づいて、前記患者を予後好適群および予後不良群に分類するステップをさらに含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記FOLR2、SEPP1およびSLC40A1遺伝子を含むまたはそれらからなる、腫瘍関連FOLR2＋マクロファージの遺伝子シグネチャ。
【請求項10】
患者におけるがんの前記予後またはモニタリングのためのバイオマーカーとしての、請求項9に記載の遺伝子シグネチャのインビトロでの使用。
【請求項11】
前記がんが、乳がん、腎臓がん、肺がん、肝臓がん、皮膚がん、子宮がん、脳がん、甲状腺がん、および副腎がんからなる群から選択され、好ましくは乳がんである、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法、または請求項10に記載の使用。
【請求項12】
目的の抗原または発現可能な形態の前記抗原をコードする核酸に関連するFOLR2結合リガンドを含む、標的抗原送達システム。
【請求項13】
前記目的の抗原がワクチン抗原であり、好ましくは腫瘍抗原ならびに病原体由来の抗原、特にウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、および寄生虫抗原から選択される、請求項12に記載の標的抗原送達システム。
【請求項14】
前記FOLR2結合リガンドが、前記抗原結合部位を含む抗FOLR2抗体またはその断片を含む、請求項12または13に記載の標的抗原送達システム。
【請求項15】
前記FOLR2結合リガンドおよびその抗原または核酸が、コンジュゲート、融合タンパク質または粒子において会合していて、好ましくは、前記粒子が、親油性粒子、ナノ粒子、ウイルス様粒子、ウイルスベクター粒子およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、より好ましくは、前記粒子は、前記抗原またはその核酸を組み込み、その表面に前記FOLR2結合リガンドを提示する、請求項12から14のいずれか一項に記載の標的抗原送達システム。
【請求項16】
請求項12から15のいずれか一項に記載の抗原送達システムと、少なくとも1つの薬学的に許容されるビヒクル、アジュバントおよび／または担体とを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫学的バイオマーカーおよび免疫療法の分野に関する。本発明は、がん患者の予後およびモニタリングに有用な好適な転帰および抗腫瘍免疫のバイオマーカーとしての腫瘍関連FOLR2＋マクロファージおよびその遺伝子シグネチャに関する。本発明はまた、がんおよび感染症の予防および治療でT細胞免疫を増強するための治療標的としてのFOLR2＋マクロファージに関する。
【背景技術】
【0002】
マクロファージ浸潤は、固形がんの顕著な特徴であり、全体的なマクロファージ浸潤は、より低い患者生存率および治療に対する抵抗性と相関している。例えば、マクロファージは、ヒト乳房腫瘍微小環境（TME）において最も豊富な免疫細胞集団の1つである（Cassetta and Pollard、2018）。乳房の腫瘍におけるマクロファージ浸潤は、予後不良およびより高い腫瘍グレードと相関する（Zhaoら、2017）（Ruffell and Coussens、2015）（Ramosら、2020）。腫瘍関連マクロファージ（TAM）は、腫瘍に成長因子を与え、腫瘍細胞の運動性および浸潤を増強し、血管新生および転移を促進することによって腫瘍促進の役割を果たす（Lewis and Pollard、2006）（Engblomら、2016）（Cauxら、2016）。さらに、TAMは免疫抑制機能を発揮し、それによってNKおよびTリンパ球による腫瘍細胞破壊を防ぐ。したがって、TAMの動員、生存および機能を標的とすることは、主要な治療目標となっている（Riesら、2014）（Mantovaniら、2017）（Binneiesら、2018）。
【0003】
現在のパラダイムは、ほとんどの場合TAMを腫瘍形成促進性細胞として提示するが、いくつかの研究は、特定の疾患の病期または器官におけるTAMの保護的役割を強調している（Ruffell and Coussens、2015）。したがって、前臨床がんモデルにおけるTAMの標的化は、腫瘍の進行および転移に有害な影響を及ぼし得る（Bonapaceら、2014）（Cassetta and Pollard、2018）（Hannaら、2015）。先に記載されているように（Mantovaniら、2004）、反対であるプロ腫瘍機能および抗腫瘍機能を有するマクロファージの異なる集団が、同じ腫瘍内に共存し得る（Mantovaniら、2002）（Aliら、2016）。腫瘍関連マクロファージは表現型および機能的に不均一である。特定の腫瘍関連マクロファージサブセットは、がんの進行および抗腫瘍免疫の発達に対する拮抗的役割を付与され得る。したがって、マクロファージの区画における不均一性の程度を確立することは、マクロファージ標的化療法の合理的な設計のための必要条件である。
【0004】
マクロファージの不均一性は、i）代替的な活性化状態（Mantovaniら、2017）、ii）マクロファージニッチを定める組織または腫瘍関連キューによるインプリンティング（Cassettaら、2019）（Guilliams and Scott、2017）、iii）異なるTAM細胞起源（成体単球対胚始原細胞）（Franklinら、2014）（Ginhouxら、2010）（Loyherら、2018）（Zhuら、2017）、およびiv）循環性単球の腫瘍誘導性全身修飾（Gallinaら、2006）（Vegliaら、2018）（Cassettaら、2019）（Ramosら、2020）から生じる潜在可能性がある。
【0005】
ヒト乳がんでは、マクロファージ浸潤が、CD14またはCSF1R（Ruffellら、2012）（Cassettaら、2019）およびCD68（Leekら、1996）（Yuanら、2014）などのマーカーで評価されている。しかしながら、CD14およびCSF1Rも未分化単球をマークするが、食細胞間のCD68発現は完全には特徴付けられていない。TAM表現型の不均一性を評価するために、CD163、TIE2、MRC1／CD206またはMARCOなどの他のマーカーが実施されている（Cassetta and Pollard、2018）。パイオニアである単一細胞RNAシーケンシング（scRNAseq）研究は、TAM不均一性を説明する主な機構として代替活性化を無効にした（Aziziら、2018）。要約すると、TAM浸潤ヒト乳がんの表現型および機能的多様性は解明されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
したがって、TAMサブセットの拮抗的役割を反映する腫瘍関連マクロファージ（TAM）の別個のサブセットに特異的な信頼性の高いマーカーは、がんの予後診断および治療には欠けている。
【0007】
本発明は、この必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【0008】
ヒト乳がんにおけるマクロファージ集団の表現型および機能的不均一性を理解するために、本発明者らは、ヒトルミナル乳房腫瘍に浸潤する骨髄細胞の単一細胞アトラスを作成した。それらは、2つの表現型的に異なるTAMサブセット、骨髄によって発現されるトリガー受容体細胞－2（TREM2）、オステオポンチン（SPP1）および細胞接着分子1（CADM1）遺伝子を発現するTREM2＋マクロファージ；および葉酸受容体2（FOLR2）、セレノタンパク質P（SEPP1）、溶質担体ファミリー40メンバー1（SLC40A1）、ヒアルロナン受容体（LYVE－1）およびマンノース受容体C型1（MRC1／CD206）遺伝子を発現するFOLR2＋マクロファージを同定する。
【0009】
ここで、本発明者らは、FOLR2＋マクロファージが、種をまたがって発展的に保存され、がん発症前に健常な乳腺を増殖させる組織常在マクロファージ（TRM）であることを示す。
【0010】
浸潤が以前に最悪の臨床転帰に関連していた（Molgoraら、2020）TREM2＋マクロファージとは完全に対照的に、本発明者らは、FOLR2＋TAMの存在量がより良好な臨床転帰を予測することを示す。FOLR2＋マクロファージを定める特定の遺伝子シグネチャは、乳がんおよび少なくとも6つの他のタイプのがんにわたる患者の生存と正に相関する独立した予後因子である。
【0011】
したがって、FOLR2＋マクロファージは、CD8＋T細胞、NK細胞および樹状細胞（DC）を含む抗腫瘍免疫の主要な細胞プレイヤーのシグネチャと正に相関する。
【0012】
FOLR2＋およびTREM2＋マクロファージが腫瘍微小環境（TME）の中で空間的に隔離されていることがさらに示された。FOLR2＋マクロファージは、血管周囲領域を含む腫瘍周囲の間質領域に特異的に位置する。さらに、FOLR2＋TAMは、乳がんおよび他の10種類のがんにおいてCD8＋T細胞を含有するリンパ系凝集体と共局在する。このFOLR2＋マクロファージ／CD8＋T細胞の共局在化は、この新たに特徴付けられたマクロファージサブセットの抗腫瘍性の役割を示唆する好適な臨床転帰と相関する。
【0013】
さらに、本発明者らは、FOLR2＋マクロファージがTREM2＋（CADM1＋）マクロファージよりもT細胞を活性化する能力が高いことを示した。さらに、モデル抗原にカップリングされた抗FOLR2標的化抗体を使用するワクチン接種は、特異的CD8＋T細胞応答を誘発する。
【0014】
この研究は、腫瘍関連マクロファージサブセットの拮抗的な役割を強調し、マクロファージベースのがん治療におけるサブセット特異的な治療的介入の道を開く。これらの結果に基づいて、本発明者らは、がんの予後およびモニタリングのためのバイオマーカーとしてFOLR2＋腫瘍関連マクロファージを使用し、抗原をFOLR2－発現マクロファージに標的化して、がんおよび感染症を予防または治療するためのT細胞免疫を増強することを提唱する。
【0015】
本発明は、患者のがんの予後診断およびモニタリングの方法であって、
－患者の腫瘍試料におけるFOLR2＋マクロファージのレベルを決定するステップであって、腫瘍関連FOLR2＋マクロファージのレベルが患者のがん疾患または治療の転帰と正に相関する、ステップと、
－そこから、がん疾患または治療の転帰が患者において好適である可能性が高いか、または不利である可能性が高いかどうかを推定するステップと、を含む方法に関する。
－患者の腫瘍試料におけるFOLR2＋マクロファージのレベルを決定するステップであって、腫瘍関連FOLR2＋マクロファージのレベルが患者のがん疾患または治療の転帰と正に相関する、ステップと、
－そこから、がん疾患または治療の転帰が患者において好適である可能性が高いか、または不利である可能性が高いかどうかを推定するステップと、を含む方法に関する。
【0016】
本方法のいくつかの実施形態では、参照と比較して患者の腫瘍試料におけるFOLR2＋マクロファージのレベルが上昇していることが、患者においてがん疾患または治療の転帰が好適である可能性が高いことを示す。
【0017】
方法のいくつかの実施形態では、がん疾患の好適な転帰が、生存期間もしくは生存率の増加、再発率の減少、再発までの期間の増加、および／または腫瘍の発生もしくは転移の減少を含む。
【0018】
いくつかの態様では、方法は、患者の腫瘍試料におけるFOLR2＋細胞の密度を決定するステップを含み、好ましくは、抗FOLR2抗体を使用する免疫組織化学的技術によるものであり、好ましくは、前記FOLR2＋細胞がさらにTREM2－またはTREM2低および／またはCADM1－である。
【0019】
いくつかの他の実施形態では、方法は、患者の腫瘍試料におけるFOLR2遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、好ましくは、FOLR2タンパク質のレベルを決定するステップを含む。
【0020】
いくつかの他の実施形態では、方法は、FOLR2、SEPP1およびSLC40A1遺伝子を含むまたはそれらからなる腫瘍関連FOLR2＋マクロファージの遺伝子シグネチャの発現のレベルを決定するステップを含み、好ましくは、前記遺伝子によって発現されるmRNAのレベルを決定するステップを含む。
【0021】
いくつかの好ましい実施形態では、方法は、FOLR2遺伝子またはFOLR2、SEPP1およびSLC40A1遺伝子によって発現されるmRNAのレベルをRNA－Seqによって決定するステップを含む。
【0022】
いくつかの実施形態では、方法は、患者の腫瘍試料で決定された腫瘍関連FOLR2＋マクロファージのレベルに基づいて、患者を予後好適群および予後不良群に分類するステップをさらに含む。
【0023】
本発明はまた、患者のがんの予後またはモニタリングのためのバイオマーカーとしての、FOLR2、SEPP1およびSLC40A1遺伝子を含むまたはそれらからなる腫瘍関連FOLR2＋マクロファージの遺伝子シグネチャおよびそのインビトロ使用に関する。
【0024】
本発明による上記方法および使用のいくつかの実施形態では、がんが、乳がん、腎臓がん、肺がん、肝臓がん、皮膚がん、子宮がんおよび副腎がん、好ましくは乳がんからなる群から選択される。または、がんは、乳がん、腎臓がん、肺がん、肝臓がん、皮膚がん、子宮がん、脳がん、甲状腺がんおよび副腎がん、好ましくは乳がんからなる群から選択される。
【0025】
本発明はまた、目的の抗原または発現可能な形態の抗原をコードする核酸に関連するFOLR2結合リガンドを含む標的抗原送達システムに関する。
【0026】
標的抗原送達システムのいくつかの実施形態では、目的の抗原がワクチン抗原であり、好ましくは腫瘍抗原ならびに病原体由来の抗原、特にウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、および寄生虫抗原から選択される。
【0027】
標的抗原送達システムのいくつかの態様では、FOLR2結合リガンドが、抗原結合部位を含む抗FOLR2抗体またはその断片を含む。
【0028】
標的抗原送達システムのいくつかの実施形態では、FOLR2結合リガンドおよびその抗原または核酸が、コンジュゲート、融合タンパク質または粒子において会合していて、好ましくは、粒子が、親油性粒子、ナノ粒子、ウイルス様粒子、ウイルスベクター粒子およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、より好ましくは、粒子は、抗原またはその核酸を組み込み、その表面にFOLR2結合リガンドを提示する。
【0029】
本発明はまた、本開示による抗原送達システムと、少なくとも1つの薬学的に許容されるビヒクル、アジュバントおよび／または担体とを含む医薬組成物、ならびに予防および治療またはがんおよび感染症における抗原に特異的なT細胞免疫応答を刺激するためのその使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【0030】
本発明は、がん患者における好適な転帰および抗腫瘍免疫のバイオマーカーとしての腫瘍関連FOLR2＋2陽性（FOLR2＋）マクロファージの存在量を提供する。本発明はさらに、バイオマーカーを測定するのに有用なFOLR2＋マクロファージを定義する遺伝子シグネチャを提供する。本発明は、がんの予後およびモニタリングのためのバイオマーカーおよび遺伝子シグネチャの様々な使用を提供する。本発明はまた、FOLR2＋マクロファージを標的とする抗原送達システム、ならびにがんおよび感染症の予防および治療におけるT細胞免疫応答を刺激するためのそれらの使用を提供する。
【0031】
定義
マクロファージは、単核食細胞である免疫系の白血球の一種である。マクロファージは、自然免疫および適応免疫ならびに組織のホメオスタシスにおいて重要な役割を果たす。マクロファージは、胚性前駆体または循環単球から分化し、腫瘍を含む異なる組織に留まる。健常な組織に存在するマクロファージは、組織常在マクロファージ（TRM）と呼ばれる。マクロファージ浸潤腫瘍は、腫瘍関連マクロファージまたはTAMと呼ばれる。マクロファージは、本実施例に開示されるようなマーカーの様々な組み合わせによって定義され得る。これらには、特に、CD3E－、CD19／20－、CD66－、XCR1－、CD1C－、CCR2－、CD64＋、CD11c＋、HLA－DR＋、CD14＋およびAPOE＋、APOE＋、APOC1＋、C1QA＋およびC1QB＋が含まれる。
マクロファージは、単核食細胞である免疫系の白血球の一種である。マクロファージは、自然免疫および適応免疫ならびに組織のホメオスタシスにおいて重要な役割を果たす。マクロファージは、胚性前駆体または循環単球から分化し、腫瘍を含む異なる組織に留まる。健常な組織に存在するマクロファージは、組織常在マクロファージ（TRM）と呼ばれる。マクロファージ浸潤腫瘍は、腫瘍関連マクロファージまたはTAMと呼ばれる。マクロファージは、本実施例に開示されるようなマーカーの様々な組み合わせによって定義され得る。これらには、特に、CD3E－、CD19／20－、CD66－、XCR1－、CD1C－、CCR2－、CD64＋、CD11c＋、HLA－DR＋、CD14＋およびAPOE＋、APOE＋、APOC1＋、C1QA＋およびC1QB＋が含まれる。
【0032】
FOLR2＋マクロファージは、腫瘍関連マクロファージまたはTAMの別個のサブセットを指す。FOLR2＋マクロファージは、本願の実施例および図に示されるように、特定の遺伝子の差次的発現（遺伝子シグネチャ）によってTREM2＋マクロファージなどのTAMの他のサブセットとは異なる。
【0033】
本明細書で使用される場合、＜＜遺伝子シグネチャ＞、＜＜遺伝子発現シグネチャ＞＞、＜＜分子シグネチャ＞＞は、変化したまたは変化していない生物学的プロセスまたは病原性医学的状態の結果として生じる遺伝子発現の固有の特徴的なパターンを有する細胞の遺伝子の単一のまたは組み合わせた群を指す。
【0034】
本明細書で使用される場合、「バイオマーカー」は、プロセス、事象または状態の特徴的な生物学的または生物学的に由来する指標を指す。バイオマーカーには、特定の遺伝子または遺伝子産物（mRNAまたはタンパク質）を指す「分子マーカー」が含まれる。
【0035】
本明細書で使用される場合、抗腫瘍免疫は、特にCD8＋T細胞、NK細胞、B細胞を含む腫瘍環境に存在する免疫細胞によって媒介される免疫応答を指す。これらの細胞は、三次リンパ系構造と呼ばれる炎症誘発性リンパ系構造で組織化され得る。
【0036】
本明細書で使用される場合、抗原は、免疫系によって、特に抗体および免疫系の細胞（Bリンパ球、CD4＋Tリンパ球、CD8＋Tリンパ球）によって特異的に認識され得る任意の物質を指す。本発明による抗原は、抗体の産生、ならびに／または前記抗原に特異的なTヘルパー応答（CD4＋Tリンパ球の活性化）および／もしくは細胞傷害性T応答（CD8＋Tリンパ球の活性化）の誘導などの特異的免疫応答を誘導することができる免疫原性物質を指す。
【0037】
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、細胞の制御されない分裂およびこれらの細胞が他の組織に浸潤する能力を特徴とする疾患または障害のクラスの任意のメンバーを指し、浸潤による隣接組織への直接的な増殖または転移による遠隔部位への移植性転移のいずれかによるものである。転移は、がん細胞が血流またはリンパ系を介して輸送される段階として定義される。本発明によるがんという用語は、がんの転移およびがんの再発も含む。がんは、腫瘍が類似する細胞の種類、したがって腫瘍の起源であると推定される組織によって分類される。例えば、癌腫は、上皮細胞に由来する悪性腫瘍である。この群は、乳がん、前立腺がん、肺がんおよび結腸がんの一般的な形態を含む最も一般的ながんを表す。リンパ腫および白血病には、血液および骨髄細胞に由来する悪性腫瘍が含まれる。肉腫は、結合組織または間葉細胞に由来する悪性腫瘍である。中皮腫は、腹膜および胸膜を裏打ちする中皮細胞に由来する腫瘍である。神経膠腫は、最も一般的なタイプの脳細胞であるグリアに由来する腫瘍である。胚細胞腫は、生殖細胞に由来する腫瘍であり、通常、精巣および卵巣に見られる。絨毛癌は、胎盤に由来する悪性腫瘍である。本明細書で使用される場合、「がん」は、固形腫瘍および液状腫瘍を含む任意のがん型を指す。
【0038】
本明細書で使用される場合、感染性疾患は、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物などの病原体または微生物によって引き起こされるいずれかの疾患を指す。
【0039】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物、特に哺乳動物、例えば限定されないが、げっ歯類、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ウマおよび霊長類を指す。「患者」は、疾患に罹患している対象を指す。好ましくは、本発明による対象または患者はヒトである。患者は、好ましくはがん患者である。
【0040】
本明細書で使用される場合、患者の「腫瘍試料」という用語は、前記患者のがん細胞を含む任意の生物学的試料を指す。例えば、腫瘍試料は、原発腫瘍、転移、および／または腫瘍排出リンパ節（TDLN）からの試料であり得る。好ましくは、それは腫瘍生検である。
【0041】
試料には、直接的試料および処理された試料が含まれる。処理された試料は、分析のための生物学的試料を調製するために使用される標準的な方法によって処理されている。特に、処理された試料には、免疫組織学的分析のための組織の調製、または分析のための核酸もしくはタンパク質の単離および精製、例えば実施例に記載されているものに使用される標準的な方法によって処理された試料が含まれる。
【0042】
本明細書で使用される「治療すること」または「治療」という用語は、そのような用語が適用される障害もしくは状態を逆転させる、緩和する、進行を阻害する、もしくは予防すること、またはそのような用語が適用される障害もしくは状態の1つもしくは複数の症状を逆転させる、緩和する、進行を阻害する、もしくは予防することを意味する。本明細書で使用される場合、「治療」または「治療する」という用語は、予防的治療または防ぐ治療、ならびに治癒的または疾患を改善させる治療の両方を指し、疾患に罹患するリスクがあるかまたは疾患に罹患した疑いがある患者、ならびに疾患または病状を患っていると診断された患者の治療を含み、臨床的再発の抑制を含む。治療は、障害または再発性障害の1つ以上の症状を予防、治癒、その発症を遅延、その重症度を軽減、または改善するために、またはそのような治療の非存在下で予想されるよりも患者の生存を延長するために、医学的障害を有するか、または最終的に障害にかかり得る患者に与えられ得る。
【0043】
「がんを治療すること」には、限定されないが、患者におけるがん細胞の数または腫瘍のサイズを減少させること、がんの進行をより攻撃的な形態に対して低減させること（すなわち、治療剤に感受性である形態でがんを維持すること）、がん細胞の増殖を減少させること、または腫瘍の増殖速度を低下させること、がん細胞を死滅させること、がん細胞の転移を減少させること、または対象におけるがんの再発の可能性を低下させることが含まれる。本明細書で使用される対象を治療することは、がんに罹患しているか、がんを発症するリスクがあるか、またはがん再発に直面している対象に利益を与える任意の種類の治療を指す。治療には、対象の状態の改善（例えば、1つまたは複数の症状において）、疾患の進行を遅くすること、症状の発症を遅らせること、症状の進行を遅くすることなどが含まれる。
【0044】
本明細書で使用される場合、「薬物」または「治療剤」は、ヒトまたは動物に投与された場合に所望の生物学的または薬理学的効果をもたらし、特に状態または疾患を治療または予防するために身体に対して意図された治療効果または応答を生じる化合物または薬剤を指す。治療剤には、任意の適切な生物学的に活性な化合物または生物学的に由来する成分が含まれる。
【0045】
本明細書で使用される場合、「治療的応答」または「薬物による治療に対する応答」は、疾患の客観的臨床徴候、患者の自己報告パラメータおよび／または生存率の増加などの客観的パラメータまたは基準によって特徴付けられる陽性医学的応答を指す。薬物治療に対する応答を評価するための客観的基準は、疾患ごとに異なり、臨床スコアを使用することによって当業者によって容易に決定することができる。薬物に対する陽性の医学的応答は、当技術分野で周知の疾患の適切な動物モデルにおいて容易に検証することができる。
【0046】
「a」、「an」、および「the」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、「a」（または「an」）、「1つ以上」または「少なくとも1つ」という用語は、本明細書では互換的に使用することができる。別段の指定がない限り、「または」は「および／または」を意味する。
【0047】
がんの予後およびモニタリング
本発明は、患者におけるがんの疾患および治療の転帰を予測するのに有用なバイオマーカーおよび導出される分子診断試験を提供する。
本発明は、患者におけるがんの疾患および治療の転帰を予測するのに有用なバイオマーカーおよび導出される分子診断試験を提供する。
【0048】
本発明は、腫瘍関連FOLR2＋マクロファージの存在量またはレベルががんの転帰および抗腫瘍免疫と正に相関することを示す。したがって、腫瘍関連FOLR2＋マクロファージのレベルは、がんの治療を受ける前またはがんの治療の過程にある患者のがん疾患の転帰を予測するのに有用ながんの予後のバイオマーカーである。さらに、抗腫瘍免疫は、がんの治療の有効性の予測因子である。したがって、腫瘍関連FOLR2＋マクロファージのレベルはまた、がん患者における治療、特にチェックポイント遮断療法などの免疫療法を含む治療に対する応答を予測するのに有用ながん治療をモニタリングするためのバイオマーカーであると考えられる。
【0049】
本発明は、患者の腫瘍試料のFOLR2＋マクロファージのレベルを測定することを含む、患者のがんの予後診断およびモニタリングの方法を提供し、腫瘍関連FOLR2＋マクロファージのレベルは、患者のがん疾患または治療の転帰と正に相関する。これは、患者の試料の腫瘍関連FOLR2＋マクロファージのレベルが高いほど、がん疾患および治療の転帰が患者においてより好適である可能性が高いことを意味する。したがって、本発明の方法によれば、患者の腫瘍試料におけるFOLR2＋マクロファージのレベル上昇は、がん疾患または治療の転帰が患者において好適である可能性が高いことを示す。
【0050】
いくつかの実施形態では、本発明による方法は、
－患者の腫瘍試料におけるFOLR2＋マクロファージのレベルを決定するステップであって、腫瘍関連FOLR2＋マクロファージのレベルが患者のがん疾患または治療の転帰と正に相関する、ステップと、
－それから、がん疾患または治療の転帰が患者において好適である可能性が高いか否かを推定するステップとを含む。
－患者の腫瘍試料におけるFOLR2＋マクロファージのレベルを決定するステップであって、腫瘍関連FOLR2＋マクロファージのレベルが患者のがん疾患または治療の転帰と正に相関する、ステップと、
－それから、がん疾患または治療の転帰が患者において好適である可能性が高いか否かを推定するステップとを含む。
【0051】
がん疾患の好適な転帰は、生存期間または生存率の増加、再発率の減少、再発までの時間の増加、腫瘍の発生または転移の減少のうちの1つまたは複数を含み得る。がん治療の好適な転帰は、腫瘍の増殖の低減、腫瘍マーカー発現の減少、および当技術分野で周知の他のものなどの客観的パラメータまたは基準によって特徴付けられる陽性医学的応答を意味する。
【0052】
患者の腫瘍試料におけるFOLR2＋マクロファージのレベル（例えば、腫瘍関連FOLR2＋マクロファージのレベル）は、患者の腫瘍試料におけるFOLR2＋2陽性（FOLR2＋）細胞のレベルを測定することによって直接決定され得、または患者の腫瘍試料におけるFOLR2＋2遺伝子の発現レベルを単独でまたはFOLR2＋マクロファージに特異的な他の遺伝子と組み合わせて測定し、腫瘍関連FOLR2＋マクロファージの遺伝子シグネチャを形成することによって間接的に決定され得る。
【0053】
本発明の方法によれば、患者の腫瘍試料にレベルが上昇したFOLR2＋マクロファージが存在していることを、参照との比較によって決定することができる。参照は、既知のレベルのFOLR2＋細胞、FOLR2＋2mRNAまたはタンパク質、シグネチャ遺伝子によって発現されるmRNAまたはタンパク質を含む参照試料であり得る。あるいは、参照は所定の値である。所定の値は、閾値であり得るか、範囲であり得る。参照の値は、代表的な個人のパネルから得られた値の統計分析によって確立された値を指す。参照の値は、例えば、本実施例に開示されるように、好適な予後（例えば、生存率の増加）を有するがん患者のパネル、および好ましくない予後（例えば、生存率の増加なし）を有するがん患者のパネルからの試料において上に開示されているようなFOLR2＋マクロファージレベルを測定することによって、得ることができる。次いで、がんの予後の好適および不良を判別可能なカットオフ値を決定する。がん患者のパネルは、好ましくは、試験された患者と同じタイプのがんである。
【0054】
いくつかの実施形態では、腫瘍関連FOLR2＋マクロファージのレベルは、患者の腫瘍試料におけるFOLR2＋2陽性（FOLR2＋）細胞のレベルを測定することによって直接決定される。患者の腫瘍試料におけるFOLR2＋細胞のレベルは、本実施例に開示されるような周知の方法に従って、抗FOLR2＋2抗体を使用する免疫組織学的技術によって測定され得る。方法は、患者の腫瘍試料におけるFOLR2＋細胞の密度を決定することを含み得、これは腫瘍試料の表面単位当たりのFOLR2＋細胞の数を意味し、単位は平方ミリメートル（mm2）であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、FOLR2陽性（FOLR2＋）細胞は、さらにTREM2陰性または「低」（TREM2－またはTREM2低）および／またはCADM1陰性（CADM1－）である。
【0055】
いくつかの他の実施形態では、腫瘍関連FOLR2＋マクロファージのレベルは、患者の腫瘍試料におけるFOLR2遺伝子の発現レベルを測定することによって間接的に決定される。方法は、FOLR2遺伝子によって発現されるmRNAまたはタンパク質のレベルを測定することを含み得る。好ましくは、方法は、FOLR2タンパク質のレベルを測定することを含む。
【0056】
いくつかの好ましい実施形態では、腫瘍関連FOLR2＋マクロファージのレベルは、FOLR2、SEPP1およびSLC40A1遺伝子を含むまたはそれらからなる腫瘍関連FOLR2＋マクロファージの遺伝子シグネチャの発現レベルを測定することによって間接的に決定される。シグネチャの発現が高いまたは低い患者を層別化するためのカットオフ値は、可能なすべてのカットオフを計算し、最良のp値を有するカットオフを選択することによって決定される。あるいは、カットオフは、同じシグネチャの発現がより低い患者の75％と比較して、シグネチャの発現が最も高いコホート内の患者の25％として決定することができる。実施例（図4A～B）に示すように、この遺伝子シグネチャは、FOLR2＋マクロファージに特異的であり、FOLR2＋マクロファージを他のTAMおよび他の白血球系統から区別することを可能にする。好ましくは、方法は、シグネチャ遺伝子によって発現されるmRNAのレベルを測定することを含む。
【0057】
いくつかの実施形態では、TAM－FOLR2＋マクロファージは、少なくとも葉酸受容体2（FOLR2）、セレノタンパク質P（SEPP1）および溶質担体ファミリー40メンバー1（SLC40A1）遺伝子を発現し、オステオポンチン（SPP1）および細胞接着分子1（CADM1）遺伝子を発現しない、すなわち、TAM－FOLR2＋マクロファージ遺伝子シグネチャは、FOLR2、SEPP1およびSLC40A1を含み、SPP1およびCADM1を含まない。いくつかの実施形態では、TAM－FOLR2＋マクロファージは、ヒアルロナン受容体（LYVE－1）、マンノース受容体C型（MRC1／CD206）、CD163およびMAF遺伝子の1つまたは複数または全部をさらに発現し、すなわち、TAM－FOLR2＋マクロファージ遺伝子シグネチャは、LYVE－1、MRC1／CD206、C163およびMAFの1つまたは複数または全部を含む。いくつかの実施形態では、TAM－FOLR2＋マクロファージは、骨髄細胞2（TREM2）によって発現される低レベルのトリガー受容体をさらに発現する、すなわち、TAM－FOLR2＋マクロファージ遺伝子シグネチャはTREM2－低である。いくつかの実施形態では、FOLR2＋マクロファージは、骨髄細胞－2（TREM2）によって発現されるトリガー受容体をさらに発現しない、すなわち、TAM－FOLR2＋マクロファージ遺伝子シグネチャはTREM2を含まない。いくつかの実施形態では、TAM－FOLR2＋マクロファージはさらに、FN1、FABP5、MSR1、CD9、IFI27、HSPB1およびHSPA1遺伝子の1つまたは複数または全部を発現しない、すなわち、TAM－FOLR2＋マクロファージ遺伝子シグネチャは、FN1、FABP5、MSR1、CD9、IFI27、HSPB1およびHSPA1の1つまたは複数または全部を含まない。いくつかの特定の実施形態では、TAM－FOLR2＋マクロファージ遺伝子シグネチャは、SPP1、C3およびCD9を含まない。
【0058】
本明細書で使用される場合、「遺伝子発現レベル」または「遺伝子の発現レベル」という用語は、転写産物（または転写物）、例えばmRNA、または翻訳産物、例えばタンパク質もしくはポリペプチドの量または濃度を指す。典型的には、mRNA発現のレベルは、細胞当たりの転写物または組織1マイクログラム当たりのナノグラムなどの単位で表現され得る。ポリペプチドのレベルは、例えば、組織1マイクログラム当たりのナノグラムとして表すことができる。あるいは、相対的な単位を使用して遺伝子発現レベルを記載することができる。
【0059】
本明細書で使用される場合、「遺伝子の発現レベルの測定」という表現は、転写産物、好ましくは前記遺伝子の転写を介して得られたmRNAの量を測定するステップ、および／または翻訳産物、好ましくは前記遺伝子の翻訳を介して得られたタンパク質の量を測定するステップを包含する。
【0060】
典型的には、遺伝子発現レベルは、当業者に周知の日常的な技術に従って決定され得る。例えば、測定は、患者の腫瘍試料をプローブ、プライマー、リガンドまたは抗体などの選択的試薬と接触させ、それによって元々試料にあった目的の核酸またはタンパク質の存在を検出することを含み得る。
【0061】
mRNAの量を決定する方法は、当技術分野で周知である。例えば、試料に含まれるmRNAは、最初に、標準的な方法に従って、例えば溶解酵素または化学溶液を用いて抽出されるか、または核酸結合樹脂によって製造業者の指示に従って抽出される。次いで、試料に存在する抽出されたmRNAを、制限なく、分光光度法などの任意の適切な方法、例えばハイブリダイゼーション、例えば、ノーザンブロッティング、マイクロアレイ、in situハイブリダイゼーション、例えば、RNAスコープ；次世代シーケンシング（NGS）、一分子シーケンシングなどのシーケンシング；マイクロおよびナノセンサベースの電気化学的、電気的、機械的または光学的検出および核酸増幅技術によって検出する。核酸増幅法には、等温およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に基づく技術、例えば逆転写PCR（RT－PCR）、定量PCR（Q－PCR）、特にリアルタイムQ－PCR、RT－qPCR、液滴デジタルPCR（ddPCR）、PCR－HM（高分解能DNA融解、蛍光マイクロスフェア（Luminex（登録商標）マイクロスフェア）に基づくリガーゼ検出反応と組み合わせたPCRが含まれる。
【0062】
いくつかの実施形態では、試料に存在するmRNAは、核酸増幅、核酸ハイブリダイゼーションもしくは核酸配列決定アッセイまたはそれらの組み合わせによって検出される。mRNAは、上記のような任意の適切な核酸増幅技術またはそれらの組み合わせを使用して増幅され得る。核酸増幅アッセイは、mRNAに特異的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマー、通常はmRNAに特異的なフォワードプライマー（センスプライマー）とリバースプライマー（アンチセンス）のペア、および好ましくは任意の増幅産物を検出するためのmRNAに特異的なオリゴヌクレオチドプローブも使用する。mRNAは、増幅前にリバースプライマーによる逆転写反応に供される。好ましくは、増幅は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT－PCR）、より好ましくはリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT－qPCR）である。増幅産物またはハイブリダイゼーション産物は、当技術分野で周知であり、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、酵素標識などを含む核酸に適した標識を使用して検出される。
【0063】
全トランスクリプトームショットガンシーケンシング（WTSS）とも呼ばれるRNA－Seq（RNAシーケンシング）は、次世代シーケンシング（NGS）を用いて試料のRNAの量や配列を調べることができる技術である（Wangら、Nat．Rev．Genet．，2009，10，57－63で概説）。それは、RNA内にコードされる遺伝子発現パターンのトランスクリプトームを分析する。RNA－seqは単一細胞分析に適合されており、単一細胞RNAseqはTangらによって最初に報告され（Nat．Methods 2009，6，377～382）、Wang et al．，Nature Reviews Genetics，2009，10，57－63およびSvensson et al．（Nat Protoc．2018 Apr；13（4）：599－604）で概説されている。
【0064】
好ましい実施形態では、mRNA発現レベルはRNA－Seqによって測定される。
【0065】
タンパク質のレベルは、当業者に公知の任意の適切な方法によって決定され得る。通常、これらの方法は、細胞試料、好ましくは細胞溶解物を、試料に存在するタンパク質と選択的に相互作用することができる結合パートナーと接触させることを含む。結合パートナーは、一般に、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。方法は一般に、蛍光、化学発光、放射性、酵素標識または色素分子などの適切な標識、またはタンパク質と抗体との間に形成される複合体またはそれと反応する抗体の量を検出するための他の方法を含む。タンパク質の量は、例えば、半定量的ウエスタンブロット、ELISAなどの酵素標識および媒介イムノアッセイ、ビオチン／アビジン型アッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫電気泳動、質量分析、免疫沈降によって、またはタンパク質もしくは抗体アレイによって測定され得る。
【0066】
葉酸受容体ベータ（FOLR2）遺伝子（BETA－HFR、FBP、FBP／PL－1、FOLR1、FR－BETA、FR－P3、FRベータとしても知られる）は、葉酸およびいくつかの還元された葉酸誘導体に対して高い親和性を有し、細胞の内部への5－メチルテトラヒドロ葉酸の送達を媒介する葉酸受容体（FOLR）ファミリーのメンバーをコードする。この遺伝子は、胎盤および造血細胞において発現される。悪性組織では発現が増加する。ヒトFOLR2は、遺伝子ID：2350に対応する。ヒトFOLR2タンパク質は、アミノ酸配列UniProtKB／Swiss－Protアクセッション番号P14207に対応する。同じタンパク質をコードする4つの転写変異体がこの遺伝子について見出されている（GenBank／NCBIアクセッション番号：NM＿803．5（変異体1）；NM＿1113534．2（変異体2）；NM＿1113535．2（変異体3）；NM＿1113536．2（変異体4）、すべて2021年3月22日にアクセス）。
【0067】
骨髄細胞2（TREM2）遺伝子に発現されるトリガー受容体（PLOSL2、TREM－2、Trem2a、Trem2b、Trem2cとしても知られている）は、TYROタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質と受容体シグナル伝達複合体を形成する膜タンパク質をコードする。コードされたタンパク質は免疫応答において機能し、構成的炎症性サイトカインの産生を引き起こすことによって慢性炎症に関与し得る。選択的スプライシングは、異なるアイソフォームをコードする複数の転写変異体をもたらす。TREM2は、脳、肺および14の他の組織で広く発現される。ヒトTREM2は、遺伝子ID：54209に対応する。ヒトTREM2タンパク質は、アミノ酸配列UniProtKB／Swiss－Protアクセッション番号Q9NZC2に対応する。同じタンパク質をコードする2つの転写変異体がこの遺伝子について見出されている（GenBank／NCBIアクセッション番号：NM＿18965．4（変異体1）；NM＿1271821．2（変異体2）；すべて2021年3月22日にアクセス）。
【0068】
細胞接着分子1（CADM1）遺伝子（BL2；ST17；IGSF4；NECL2；RA175；TSLC1；IGSF4A；Necl－2；SYNCAM；sgIGSF；sTSLC－1；synCAM1としても知られている）は、肺、甲状腺、および23の他の組織で広く発現される細胞接着分子をコードする。ヒトCADM1は、遺伝子ID：23705に対応する。ヒトCADM1タンパク質は、アミノ酸配列UniProtKB／Swiss－Protアクセッション番号Q9BY67に対応する。同じタンパク質をコードする5つの転写変異体がこの遺伝子について見出されている（GenBank／NCBIアクセッション番号：NM＿14333．4（変異体1）；NM＿1098517．2（変異体2）；NM＿1301043．2（変異体3）；NM＿1301044．2（変異体4）；NM＿1301045．2（変異体5）；すべて2021年3月29日にアクセス）。
【0069】
セレノタンパク質P（SEPP1）遺伝子（SeP、SELP、SEPP、SELENOPとしても知られている）は、主に肝臓で発現され、血漿の中に分泌されるセレノタンパク質をコードする。このセレノタンパク質は、ポリペプチドあたり複数のセレノシステイン（Sec）残基を含み（ヒトでは10）、血漿のセレンの大部分を占めるという点で独特である。これは、細胞外抗酸化剤として、およびアポリポタンパク質E受容体－2（apoER2）を介した肝外組織へのセレンの輸送に関与している。ヒトSEPP1遺伝子は、遺伝子ID：6414に対応する。ヒトセレノタンパク質Pは、アミノ酸配列UniProtKB／Swiss－Protアクセッション番号P49908に対応する。同じタンパク質をコードする3つの転写変異体がこの遺伝子について見出されている（GenBank／NCBIアクセッション番号NM＿5410．4（変異体1）；NM＿1085486．3（変異体2）；NM＿1093726．3（変異体3）すべて2021年3月22日にアクセス）。
【0070】
溶質担体ファミリー40メンバー1（SLC40A1）遺伝子（FPN1、HFE4、MTP1、IREG1、MST079、MSTP079、SLC11A3としても知られている）は、十二指腸上皮細胞からの鉄の輸送に関与し得る細胞膜タンパク質をコードする。この遺伝子の欠損は、ヘモクロマトーシス4型（HFE4）の原因である。この遺伝子は、胎盤、腸、筋肉および脾臓で発現される。これは赤血球でも（タンパク質レベルで）検出される。ヒトSLC40A1遺伝子は、遺伝子ID：30061に対応する。ヒトSLC40A1タンパク質は、アミノ酸配列UniProtKB／Swiss－Protアクセッション番号Q9NP59に対応する。転写物は、2021年2月20日にアクセスされたヌクレオチド配列GenBank／NCBIアクセッション番号NM＿14585．6に対応する。
【0071】
特異的にFOLR2、TREM2、CADM1、SEPP1またはSLC40A1タンパク質を対象とした様々な抗体が開示されており、公開されて利用可能である。特に、本実施例において使用される抗体、または、限定されないが、antibodypedia、Antibody Group（ABG）、Antibody Central、The hybridoma Databank、European Collection of Cell Cultures、Monoclonal Antibody Index、SCOP、Validated antibody database（VAD）、Antibody Chemically Defined（ABCD）などの抗体関連のデータベースもしくはポータルに開示される他の抗体を参照されたい。
【0072】
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、以下の組織または器官のいずれか1つに影響を及ぼし得る任意のがんを指す：乳房；肝臓；腎臓；心臓、縦隔、胸膜；口腔底；唇；唾液腺；舌部；歯茎；口腔；口蓋；扁桃腺；喉頭；気管；気管支、肺；咽頭、下咽頭、中咽頭、鼻咽頭；食道；胃、肝内胆管、胆道、膵臓、小腸、結腸などの消化器；直腸；膀胱、胆嚢、尿管などの泌尿器；直腸S状結腸接合部；肛門、肛門管；皮膚；骨；関節、四肢の関節軟骨；眼および付属器；脳；末梢神経、自律神経系；脊髄、脳神経、髄膜；および中枢神経系の様々な部分；結合組織、皮下組織および他の軟組織；後腹膜、腹膜；副腎；甲状腺；内分泌腺および関連構造；卵巣、子宮、子宮頸部などの女性生殖器；子宮体部、膣、外陰部；陰茎、精巣および前立腺などの男性生殖器；造血系および細網内皮系；血液；リンパ節；胸腺。
【0073】
本発明による「がん」という用語は、白血病、セミノーマ、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、腺癌、中皮腫（胸膜中皮腫、腹膜中皮腫、心膜中皮腫、および末期中皮腫を含む）、直腸がん、子宮内膜がん、甲状腺がん（乳頭状甲状腺癌、濾胞性甲状腺癌、甲状腺髄様癌、未分化甲状腺癌、多発性内分泌新生物2A型、多発性内分泌新生物2B型、家族性甲状腺髄様癌、褐色細胞腫および傍神経節腫を含む）、皮膚がん（悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、ケラトアカントーマ、ほくろ、異形成母斑、脂肪腫、血管腫および皮膚線維腫を含む）、神経系がん、脳がん（星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、低悪性度神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫（松果体腫）、多形性神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、シュワン細胞腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍、脊髄神経線維腫、神経膠腫または肉腫を含む）、頭蓋骨がん（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫または変形性骨炎を含む）、髄膜がん（髄膜腫、髄膜肉腫または神経膠腫症を含む）、頭頸部がん（頭頸部扁平上皮癌および口腔癌（例えば、口腔癌、口唇癌、舌癌、口腔がんまたは咽頭がんなど）を含む）、リンパ節がん、胃腸がん、肝臓がん（肝細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫および血管腫を含む）、結腸がん、胃がん、食道がん（扁平上皮癌、喉頭、腺癌、平滑筋肉腫またはリンパ腫を含む）、結腸直腸がん、腸がん、小腸または小腸（small bowlまたはsmall intestine）がん（例えば、腺癌リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫または線維腫など）、大腸または大腸（large bowlまたはlarge intestine）がん（例えば、腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫または平滑筋腫など）、膵臓がん（乳管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍またはビポマを含む）、耳、鼻および喉（ENT）がん、乳がん（HER2富化乳がん、ルミナルA乳がん、ルミナルB乳がんおよびトリプルネガティブ乳がんを含む）、子宮のがん（子宮内膜癌、例えば子宮内膜癌、子宮内膜間質肉腫および悪性混合ミュラー管腫瘍、子宮肉腫、平滑筋肉腫および妊娠性栄養膜疾患など）、卵巣がん（未分化胚細胞腫、顆粒膜－卵胞膜細胞腫瘍およびセルトリ・レイディッヒ細胞腫瘍を含む）、子宮頸がん、膣がん（扁平上皮膣癌、膣腺癌、明細胞膣腺癌、膣胚細胞腫瘍、膣肉腫、および膣黒色腫を含む）、外陰がん（扁平上皮外陰癌、疣贅外陰癌、外陰黒色腫、基底細胞外陰癌、バルトリン腺癌、外陰腺癌、およびQueyratの赤血球増殖症を含む）、尿生殖路がん、腎臓がん（明腎細胞癌、色素嫌性腎細胞癌、乳頭状腎細胞癌、腺癌、ウィルムス腫瘍、腎芽細胞腫、リンパ腫または白血病を含む）、副腎がん、膀胱がん、尿道がん（例えば、扁平上皮癌、移行上皮癌または腺癌など）、前立腺癌（例えば、腺癌または肉腫など）および精巣癌（例えば、精上皮腫、奇形腫、胎児性癌腫、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍または脂肪腫など）、肺癌（小細胞肺癌（SCLC）、扁平上皮肺癌を含む非小細胞肺癌（NSCLC）、肺腺癌（LUAD）、および大細胞肺癌、気管支原性癌、肺胞癌、細気管支癌、気管支腺腫、肺肉腫、軟骨腫性過誤腫、胸膜中皮腫を含む）、肉腫（アスキン腫瘍、ボトライド肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性神経鞘腫、骨肉腫、軟部肉腫を含む）、軟部肉腫（肺胞軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢胞肉腫、隆起皮膚線維肉腫、デスモイド腫瘍、線形成性小円形細胞腫瘍、類上皮肉腫、骨格外軟骨肉腫、骨格外骨肉腫、線維肉腫、消化管間質腫瘍（GIST）、血管周皮細胞腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（MPNST）、神経線維肉腫、網状線維組織球性腫瘍、横紋筋肉腫、滑膜肉腫および未分化多形肉腫、心臓癌（例えば、肉腫、例えば血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫または脂肪肉腫、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫、奇形腫）、骨がん（骨原性肉腫、骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫および細網細胞肉腫、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫瘍脊索腫、骨軟骨腫、骨軟骨性外骨腫、良性軟骨腫、軟骨芽腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫および巨細胞腫瘍を含む）、血液がんおよびリンパ系がん、血液がん（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫および骨髄異形成症候群を含む）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫および有毛細胞およびリンパ系疾患、およびその転移を含む。
【0074】
いくつかの実施形態では、がんは、乳がん、腎臓がん、肺がん、肝臓がん、皮膚がん、子宮がんおよび副腎がんからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、がんは、乳がん、腎臓がん、肺がん、肝臓がん、皮膚がん、子宮がん、脳がん、甲状腺がん、および副腎がんからなる群から選択される。腎臓がんには腎細胞癌（KIRC）が含まれる。肺がんには肺腺癌（LUAD）が含まれる。肝がんには、肝細胞癌（LIHC）が含まれる。子宮がんには、子宮頸がん、特に子宮頸部扁平上皮癌および子宮内頸部（CESC）が含まれる。皮膚がんには黒色腫（SKCM）が含まれる。副腎がんとしては、副腎皮質癌（ACC）が含まれる。乳がんには、エストロゲン受容体陽性（ER＋）、プロゲステロン陽性（PR＋）、HER2陽性（HER2＋）およびトリプルネガティブ（ER－、PR－、HER2－）乳がんが含まれる。「トリプルネガティブ乳がん」は、エストロゲン受容体（ER）、プロゲステロン受容体（PR）およびHER2／Neuの遺伝子を過剰発現しない任意の乳がんを指す。このサブタイプの乳がんは、より侵襲性であり、標準的な治療に対して応答性が低いことを臨床的な特徴とし、患者の全生存率が不良であることに関連付けられる。乳がんには、特にルミナルがん（ER／PR＋；HER2－）が含まれる。脳がんには、神経膠腫、例えば、Brain Lower Grade Glioma（LGG）が含まれる。甲状腺がんには、甲状腺癌（THCA）が含まれる。特定の実施形態では、がんが、ルミナル乳がん、腎細胞癌（KIRC）、肺腺癌（LUAD）、肝細胞癌（LIHC）、子宮頸部扁平上皮癌、子宮頸部腺癌（CESC）、黒色腫（SKCM）、神経膠腫、例えば脳低悪性度神経膠腫（LGG）および甲状腺癌（THCA）を含む群から選択される。特に、ルミナル乳癌、腎細胞癌（KIRC）、肺腺癌（LUAD）、肝細胞癌（LIHC）、子宮頸部扁平上皮癌、子宮頸管内腺癌（CESC）および黒色腫（SKCM）を含む群から選択される。いくつかの好ましい実施形態では、がんが乳がん、特にルミナル乳がんである。
【0075】
本発明の方法は、疾患の初期段階でがんの予後を確立し、それによって未治療の患者で決定された初期の予後に応じて、患者のがん治療を適合させるのに有用である。本発明の方法はまた、治療の経過中にがんをモニタリングし、治療された患者について決定された予後に応じてがん治療を調整するのに有用である。
【0076】
本発明の方法はまた、がん療法、特にチェックポイント遮断療法などの免疫療法に対する応答を予測するのに有用である。より高いレベルのFOLR2＋マクロファージを有する患者は、腫瘍または腫瘍環境における免疫細胞浸潤のレベルが上昇しているので、チェックポイント遮断療法などの免疫療法に対する良好なレスポンダである可能性が高い。したがって、より高レベルのFOLR2＋マクロファージを有する患者は、免疫療法、特にチェックポイント遮断療法で治療される。
【0077】
興味深いことに、乳がん患者、特に高FOLR2遺伝子シグネチャを有するER／PR＋患者は、化学療法単独、または化学療法＋内分泌療法と比較して、内分泌療法からの生存率が改善されており、これはFOLR2遺伝子シグネチャが低い患者には当てはまらない。FOLR2高患者は、内分泌療法単独から利益を得るであろうし、化学療法を必要としない。FOLR2低患者は、内分泌療法と化学療法の併用から利益を得ることができる。いくつかの有利な実施形態では、方法は、患者の腫瘍試料で決定された腫瘍関連FOLR2＋マクロファージのレベルに基づいて、患者を予後好適群および予後不良群に分類するステップをさらに含む。
【0078】
本発明の別の態様は、がん患者を治療する方法に使用するための組成物に関し、本発明による予後の方法に従って好適な予後を有すると以前に診断された患者に組成物が投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、免疫療法剤、特に免疫チェックポイント阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、特に乳がん患者を治療するための内分泌療法剤を含む。
【0079】
本発明の別の態様は、がん患者を治療する方法に使用するための組成物に関し、本発明による予後の方法に従って、好ましくない予後を有すると以前に診断された患者に組成物が投与される。
【0080】
組成物は、免疫療法もしくは化学療法またはそれらの組み合わせのための薬剤を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、特に乳がん患者を治療するための、少なくとも内分泌療法と化学療法剤との組み合わせを含む。
【0081】
本発明による予後の方法を使用して良好な予後を有すると診断された患者は、治療タイプおよび治療レジメンの両方に関して、より低侵襲性のがん治療から利益を得ることができる。それによって副作用を低減し、患者の快適さおよび幸福を改善する。反対に、本発明による予後の方法を使用して予後不良と診断された患者は、治療タイプおよび治療レジメンの両方に関して、より積極的ながん治療から利益を得ることができる。それによって治療の有効性を増加させる。
【0082】
本発明はまた、本開示によるがんの予後またはモニタリングの方法に従って患者の腫瘍試料におけるFOLR2＋マクロファージのレベルを決定すること、および患者においてがん疾患または治療の転帰が好適である可能性が高いか否かに応じて、適切な治療を前記患者に与えることを含む、がんを治療する方法に関する。いくつかの態様では、方法は、患者が好適な予後を有すると診断された場合、免疫療法剤、特に免疫チェックポイント阻害剤の投与を含む。いくつかの態様では、方法は、患者が好適な予後を有すると診断された場合、内分泌療法剤の投与を含み、好ましくは、患者は、本明細書に開示される乳がん患者である。いくつかの他の態様では、方法は、患者が好ましくない予後を有すると診断された場合、化学療法剤、または化学療法剤と免疫療法剤の組み合わせの投与を含む。いくつかの他の実施形態では、方法は、患者が好ましくない予後を有すると診断された場合、化学療法剤、または化学療法剤と内分泌療法剤との組み合わせの投与を含み、好ましくは、患者は本明細書に開示される乳がん患者である。
【0083】
本発明のさらに別の態様は、患者のがん疾患および治療の転帰の好適な予後のバイオマーカーとしての、腫瘍関連FOLR2＋マクロファージ、その遺伝子シグネチャ、およびFOLR2遺伝子のインビトロでの使用に関する。FOLR2＋マクロファージのFOLR2遺伝子および遺伝子シグネチャには、遺伝子産物（mRNA、タンパク質）が含まれる。好ましくは、FOLR2＋マクロファージの遺伝子シグネチャは、FOLR2、SEPP1およびSLC40A1遺伝子を含むかまたはこれからなる。バイオマーカーは、患者の腫瘍試料における腫瘍関連FOLR2＋マクロファージのレベルを決定するために使用される。好ましくは、バイオマーカーは、（i）腫瘍関連FOLR2＋細胞、好ましくはFOLR2＋およびTREM2－および／またはCADM1－細胞の密度、（ii）腫瘍試料中のFOLR2 mRNAまたはタンパク質のレベル、好ましくはタンパク質のレベル、好ましくはFOLR2タンパク質のレベル、（iii）FOLR2、SEPP1およびSLC40A1遺伝子を含むまたはそれらからなるFOLR2＋マクロファージの遺伝子シグネチャによって発現されるmRNAまたはタンパク質のレベル、好ましくは、シグネチャ遺伝子によって発現されるmRNAレベルを決定するために使用される。
【0084】
本発明はまた、FOLR2、SEPP1およびSLC40A1遺伝子を含むまたはそれらからなるFOLR2＋マクロファージの遺伝子シグネチャに関する。本発明はまた、がんの予後またはモニタリングのためのバイオマーカーとしてのFOLR2＋マクロファージの遺伝子シグネチャのインビトロでの使用に関する。
【0085】
治療法
本発明はまた、FOLR2＋マクロファージを標的とする抗原送達システム、ならびにがんおよび感染症の予防および治療におけるT細胞免疫応答を刺激するための、それらの使用を提供する。
本発明はまた、FOLR2＋マクロファージを標的とする抗原送達システム、ならびにがんおよび感染症の予防および治療におけるT細胞免疫応答を刺激するための、それらの使用を提供する。
【0086】
本発明の一態様は、抗原または発現可能な形態の抗原をコードする核酸に関連するFOLR2結合リガンドを含む標的抗原送達システムに関する。
【0087】
抗原は、目的の任意の抗原、特にワクチン抗原であり得る。ワクチン抗原は当技術分野で周知であり、腫瘍抗原および病原体由来の抗原、例えばウイルス、細菌、真菌、寄生虫抗原および他の抗原が挙げられる。抗原は、完全な抗原、抗原フラグメントまたは部分、抗原構築物、特にいくつかの抗原に由来するものを含む天然抗原、組換え抗原または合成抗原であり得る。抗原は腫瘍または病原体に特異的である。それは、B細胞、CD4＋T細胞および／またはCD8＋T細胞エピトープを含む1つまたは複数のエピトープを含み得る。任意の既知のワクチン抗原は、本発明のワクチン送達システムへの組み込みに適しており、本発明による送達システムは、任意の既知のワクチン抗原を組み込むことができる。標的抗原送達システムは、抗原に特異的なエフェクターT細胞および細胞傷害性T細胞免疫応答を含む、抗原に特異的なCD4＋および／またはCD8＋T細胞免疫応答を刺激するために使用され得る。
【0088】
抗原をコードする核酸は、個体の標的細胞または組織で発現可能な組換え、合成または半合成核酸からなり得る。核酸は、DNA、RNAであってもよく、混合されていてもよく、さらに修飾され得る。前記核酸構築物は、哺乳動物発現カセット、好ましくはヒト発現カセットであり得、コード配列は、プロモーター、イントロン、エンハンサー、ターミネーターなどの、個体の標的細胞または組織におけるそれらの発現のための適切な調節配列に作動可能に連結されている。核酸は、当技術分野で周知であり、限定するものではないが、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、ワクシニアウイルスなどのポックスウイルス、複製欠損アルファウイルスレプリコンおよびサイトメガロウイルスなどのプラスミドおよびウイルスベクターを含む、個体の標的細胞または組織への遺伝子送達のための適切なベクターに組み込むことができる。
【0089】
FOLR2結合リガンドは、細胞表面FOLR2、特に細胞表面ヒトFOLR2に結合する。これは、標準条件下で安定な複合体を形成するためのFOLR2細胞外ドメインに対する十分な親和性としてのFOLR2結合リガンドを意味する。
【0090】
いくつかの態様では、FOLR2結合リガンドは、抗原結合部位を含む抗FOLR2抗体またはその断片を含むかまたはそれからなる。
【0091】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリンの少なくとも1つの抗原結合領域を含むタンパク質を指す。抗原結合領域は、1つまたは2つの可変ドメイン、例えばVHドメインおよびVLドメインまたは単一のVHHもしくはVNARドメインを含み得る。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプの完全長の免疫グロブリン、少なくとも抗原結合領域を含むその機能的断片およびその誘導体を包含する。抗体の抗原結合フラグメントには、例えば、Fv、scFv、Fab、Fab’、F（ab’）2、Fd、FabcおよびsdAb（VHH、V－NAR）が含まれる。抗体誘導体には、多価抗体または多価の抗体、イントラボディおよびイムノコンジュゲートが含まれるが、これらに限定されない。イントラボディは、同じ細胞で産生された後にそれらの抗原に細胞内で結合する抗体である（総説については、例えば、Marschall AL，Dubel S and Boldicke T“Specific in vivo knockdown of protein function by intrabodies”，MAbs．2015；7（6）：1010－35を参照されたい）。抗体はグリコシル化され得る。抗体は、好ましくは、抗体依存性細胞傷害性および補体媒介性細胞傷害性について非機能性である。抗体は、高親和性Fc－ガンマ受容体への結合を妨げるFcドメインでの変異を含み得る。当技術分野で周知のそのような突然変異体としては、例えばN297Aが挙げられる。抗体は、抗FOLR2モノクローナル抗体由来のFvまたはscFvと、別の抗体由来の定常ドメイン、特にCH2およびCH3とを含むキメラ抗体であり得る。抗体は、ハイブリドーマ技術、選択リンパ球抗体法（SLAM）、トランスジェニック動物、組換え抗体ライブラリーまたは合成産生などの当技術分野で周知の標準的な方法によって調製される。
【0092】
抗体は、FOLR2の細胞外ドメインを対象とする。様々な抗FOLR2抗体が当技術分野で公知であり、公開されて利用可能である。特に、本実施例において使用される抗体、または抗体関連のデータベースもしくはポータルに開示される他の抗体、例えば、限定されないが：antibodypedia、Antibody Group（ABG）、Antibody Central、The hybridoma Databank、European Collection of Cell Cultures、Monoclonal Antibody Index、SCOP、Validated antibody database（VAD）、Antibody Chemically Defined（ABCD）データベースを参照されたい。例えば、抗FOLR2抗体は、米国特許出願公開第2008／0260812号明細書、米国特許出願公開第2014／0010756号明細書、国際公開第2012／033987号パンフレットに開示されている。ジスルフィド安定化Fv抗FOLR2は、Nagai et al．，Arthritis and Rheumatism，2006，54，3126－3134に開示されている。
【0093】
抗原およびFOLR2結合リガンドは、直接的または間接的に会合し得る。直接会合は、特にコンジュゲートおよび融合タンパク質を指す。融合タンパク質は、N－terからC－terまで、つまり抗FOLR2Fv、抗体CHドメイン、例えばCH2およびCH3、ならびに融合タンパク質のC末端に融合した抗原を含み得る。抗原は、ポリエピトープポリペプチドであり得る。
【0094】
間接的な会合は、特に非共有結合性の複合体および粒子を指す。非共有結合複合体は、例えば、ストレプトアビジン／ビオチンなどの結合相互作用パートナーを使用して形成され得る。粒子は、治療剤を細胞に送達することができる任意の粒子を指す。粒子には、脂質ナノ粒子（LNP）などの、リポ粒子、微粒子、ナノ粒子、エキソソーム、ウイルス様粒子、ウイルスベクター粒子およびそれらの組み合わせが含まれる。葉酸修飾リポソーム複合体は、Tieら（Signal transduction and targeted therapy，2020，5，6）に開示されている。いくつかの実施形態では、粒子は、抗原またはその核酸を組み込み、その表面にFOLR2結合リガンド、特にFOLR2抗体またはその断片を提示する。
【0095】
標的抗原送達システムは、活性物質として抗原と、少なくとも1つの薬学的に許容されるビヒクル、アジュバントおよび／または担体とを含む免疫原性またはワクチン組成物の形態で有利に使用される。
【0096】
医薬組成物は、経口、非経口および局所を含むがこれらに限定されないいくつかの経路による投与のために製剤化される。医薬ビヒクルは、計画された投与経路に適したものであり、当技術分野で周知である。
【0097】
医薬組成物は、投与された対象において特異的T細胞免疫応答、特に病原体に対する抗腫瘍応答または防御免疫応答を刺激するのに十分な治療有効量の抗原を含む。
【0098】
薬学的に有効な用量は、使用される組成物、投与経路、処置される哺乳動物（ヒトまたは動物）のタイプ、検討中の特定の哺乳動物の身体的特徴、同時投薬、および医療分野の当業者が認識するであろう他の因子に依存する。
【0099】
本発明の医薬組成物は、一般に、既知の手順に従って、個体において有益な効果を誘導するのに有効な投与量および期間で投与される。投与は、注射または局所投与によるものであり得る。注射は、皮下または筋肉内であり得る。
【0100】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、特に免疫調節剤、抗がん剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤または抗寄生虫剤などの別の活性剤を含む。
【0101】
本発明の医薬組成物は、付加的ながん療法、例えば限定されないが、免疫チェックポイント療法および免疫チェックポイント阻害剤を含む免疫療法、免共刺激抗体、CAR－T細胞療法、抗がんワクチン、化学療法および／または放射線療法と組み合わせて有利に使用される。併用療法は、別個、同時および／または逐次であり得る。
【0102】
いくつかの実施形態では、医薬組成物はヒトの治療に使用される。
【0103】
本発明は、がんおよび感染症の予防および治療においてT細胞免疫応答を刺激するために使用するための標的抗原送達システムおよび医薬組成物を包含する。
【0104】
本発明の実施は、別段の指示がない限り、当業者の技術の範囲内にある従来の技術を使用する。そのような技術は、文献で十分に説明されている。
【0105】
ここで、本発明を、添付の図面を参照して、限定的ではない以下の実施例によって例示する。
【図面の簡単な説明】
【0106】
【図1】APOE発現は、ヒト乳がんにおける腫瘍関連マクロファージを定義する。
【図1A】一致した非転移性リンパ節および転移性リンパ節におけるCD11c＋HLA－DR＋骨髄系細胞の中のCD1c＋CD14－細胞、CD1c＋CD14＋細胞およびCD1c－CD14＋細胞のフローサイトメトリー定量。
【図1B】CD45－EPCAM＋腫瘍細胞頻度による層別化された転移性リンパ節におけるCD14＋細胞のフローサイトメトリー定量化。
【図1C】未治療のルミナル乳がん患者の試料（PBMC、転移性リンパ節および原発腫瘍）の実験のデザイン、およびscRNAseq液滴ベースアッセイ（10×Chromium）のための骨髄細胞のFACS選別のためのゲーティング戦略。
【図1D】血液、転移性リンパ節および原発腫瘍から融合したscRNAseqデータの次元の減少を、6つのクラスタを同定するルーバングラフに基づくクラスタリングを使用して行った。各ドットは個々の細胞を表す（n＝18008）。各クラスタからの代表的な遺伝子を示す。
【図1E】6つの定められたクラスタにわたって上位5つの最も有意な発現遺伝子を示すバブルマップ。円はサイジングし、遺伝子を発現するクラスタ内の細胞のパーセンテージを表し、色は各遺伝子の平均的発現を表す。
【図1F】クラスタ0（CD14＋単球）、クラスタ1（CD1C＋DC）、クラスタ2（マクロファージ）およびクラスタ4（CD16＋単球）における選択された目的の遺伝子の発現分布を示すバイオリンプロット。
【図1G】健常または転移性のリンパ節および乳房におけるCD14＋CCR2＋単球対CD14＋APOE＋マクロファージのフローサイトメトリー定量化。（＊P≦0．05；＊＊P≦0．01；＊＊＊＊P＜0．0001）。
【図2】単一細胞RNAシーケンシングは、APOE＋マクロファージの2つの主要なサブセットを明らかにする。
【図2B】平均遺伝子発現（1200遺伝子）に基づくクラスタ0、1および2の階層的クラスタ化。
【図2C】SCENICパイプラインを使用して定められたクラスタ0、1および2における異なる予測された転写レギュロンのヒートマップおよび階層的クラスタリング。
【図2D】各クラスタ間のD．E．G．を示すボルケーノプロット。上位25の中から選択された遺伝子を示した。
【図2E】APOE＋マクロファージにおけるTREM2およびFOLR2の相互に排他的な発現を示すUMAPプロット。
【図2F】APOE＋マクロファージクラスタにわたるFOLR2、TREM2およびCADM1のバイオリンプロットの発現分布
【図2G】転移性リンパ節および原発腫瘍から単離されたFACS選別されたFOLR2＋およびCADM1＋マクロファージからの代表的なフローサイトメトリー等高線図およびサイトスピン画像。
【図2H】未治療のルミナル乳がん患者の転移性リンパ節および原発腫瘍からFACS選別によって単離されたFOLR2＋TAM、CADM1＋TAMおよびCCR2＋単球のバルクRNAシーケンシングからの100個の最も可変的な遺伝子を使用した階層的クラスタリング。
【図2I】scRNAseqデータセットから選択され、未治療のルミナル乳がん患者の転移性リンパ節および原発性腫瘍からFACS選別によって単離されたFOLR2＋マクロファージ、CADM1＋マクロファージおよびCCR2＋単球のバルクRNAseqに適用されるFOLR2＋（c2）とTREM2高（c1）マクロファージとの間のD．E．G．のヒートマップ。
【図2J】scRNAseqデータセットから選択され、未治療のルミナル乳がん患者の転移性リンパ節および原発性腫瘍からFACS選別によって単離されたFOLR2＋マクロファージ、CADM1＋マクロファージおよびCCR2＋単球のバルクRNAseqに適用されるFOLR2＋（c2）とTREM2高（c1）マクロファージとの間のD．E．G．のヒートマップ。
【図2K】転移性リンパ節からのC14＋CCR2＋単球、CD14＋CCR2－CD68＋LYVE1＋マクロファージおよびCD14＋CCR2－CD68＋CADM1＋マクロファージにおける単球／マクロファージおよび樹状細胞マーカーのタンパク質発現分析（CyTOF）。
【図3】FOLR2＋マクロファージは組織常在マクロファージである。
【図3A】フローサイトメトリーを使用した異なる乳がん患者組織にわたるFOLR2＋APOE＋およびFOLR2－APOE＋マクロファージの代表的な等高線図（上のパネル）および定量化（下のパネル）。
【図3B】TCGAデータベースの乳がん患者由来の腫瘍マイクロアレイにおけるFOLR2およびTREM2mRNA発現（腫瘍：n＝1093；正常な乳房：n＝112；基底サブタイプ、n＝190；Her2サブタイプ、n＝82；およびルミナルサブタイプ、n＝781）。
【図3C】23週齢のMMTV－PyMTマウス（n＝2）の乳房腫瘍から単離したFcgr1＋マクロファージ（n＝4095）のUMAPプロット視覚化。Fcgr1＋マクロファージにわたるCadm1、Folr2およびMrc1の発現分布を示すバイオリンプロット。
【図3D】マウスおよびヒトマクロファージサブセットにわたって同様に発現される遺伝子オルソログを示すヒートマップ。
【図3E】Seurat v3参照標識移入インテグレーションを使用して定義された類似性スコア（Stuartら、2019）。各ヒトマクロファージクラスタに適用した各マウスマクロファージクラスタの予測スコアを示すグラフプロット（図2Aに定義）。各ドットは細胞を表す。予測スコアの平均のヒートマップ。
【図3F】MMTV－PyMTマウスモデルにおける腫瘍発達中のフローサイトメトリーによるFolr2＋およびCadm1＋マクロファージの定量化。上段は、無腫瘍マウスおよび腫瘍担持マウス（20週齢のPyMTマウス）の乳腺におけるマクロファージサブセットの代表的な等高線図を示す。下段は、腫瘍発達中のWTマウスまたはPyMTマウスにおけるマクロファージサブセットの定量化を示す。
【図4】FOLR2＋マクロファージは、乳がん患者の生存率の増加と相関する。
【図4B】乳がん患者から単離されたCD45＋細胞に対して行われた公開されたscRNAseqデータセットにおける腫瘍浸潤免疫細胞集団を識別する特定の遺伝子の平均発現を示すヒートマップ（Aziziら、2018）。
【図4C】METABRICルミナル乳がん（BC）コホート（n＝1309）におけるマクロファージ遺伝子シグネチャ（C1QA／C1QB／C1QC）およびFOLR2＋TAM遺伝子シグネチャ（FOLR2／SEPP1／SLC40A1）について作成したカプラン・マイヤー生存曲線。CPTACルミナル乳がんコホートにおけるFOLR2タンパク質発現について作成されたカプラン・マイヤー生存曲線（n＝49）。患者を、シグネチャ発現の75％分位に基づいて高発現群と低発現群に分けた。
【図4D】Wangらのルミナル乳がんコホート（n＝209患者）においてFOLR2＋マクロファージ遺伝子シグネチャ（FOLR2／SEPP1／SLC40A1）について作成したカプラン・マイヤー生存曲線。患者を、シグネチャ発現の70％分位に基づいて、高発現群と低発現群に分けた。
【図4E】異なる治療群におけるFOLR2シグネチャの予後力を試験するために、受けた治療に従って分類されたルミナルBC患者において単変量解析を実施した。受けた治療によって層別化されたルミナルA／B患者のMETABRICデータセットにおいてFOLR2＋マクロファージ遺伝子シグネチャ（FOLR2／SEPP1／SLC40A1）について作成されたカプラン・マイヤー生存曲線。FOLR2遺伝子シグネチャは、内分泌療法のみを受けている患者において有意な予後値を有する。FOLR2遺伝子シグネチャは、内分泌療法＋化学療法または化学療法単独を受けている患者において有意な予後力を有さなかった。患者を、シグネチャ発現の70％分位に基づいて、高発現群と低発現群に分けた。各群の患者数を示す。
【図4F】腫瘍のマルチスペクトル分析によって計算されたFOLR2＋マクロファージ密度について作成されたカプラン・マイヤー生存曲線（コホート1：n＝122；コホート2：n＝126）。グラフは、腫瘍におけるFOLR2＋マクロファージ密度の定量化を示す。最良p値カットオフ（＊＊P≦0．01）に基づいて、患者を高細胞密度群と低細胞密度群に分けた。
【図5】FOLR2遺伝子シグネチャは、より良好な生存と相関する独立した予後因子である
【図5A】METABRICデータセットからの異なるグレードおよびステージのルミナル（ER／PR）乳房腫瘍におけるFOLR2mRNA発現。
【図5B】連続変数（左）としての、または75％カットオフ、調整された年齢、組織学的グレード、腫瘍サイズ、組織学（参照＋管）および疾患陽性リンパ節の数を用いた、FOLR2シグネチャの予後値の多変量解析。95％信頼区間のハザード比を示す。アスタリスクは、各変数についてのWald検定からのP値を指す。
【図6】FOLR2＋マクロファージは、CD8＋T細胞浸潤腫瘍において富化され、がん全体にわたってリンパ系凝集体と共局在する。
【図6A】相関マップ（A）およびヒートマップ（B）は、METABRICデータセットにおける免疫細胞遺伝子シグネチャに対するFOLR2およびTREM2遺伝子の関連を分析する。
【図6B】相関マップ（A）およびヒートマップ（B）は、METABRICデータセットにおける免疫細胞遺伝子シグネチャに対するFOLR2およびTREM2遺伝子の関連を分析する。
【図6C】組織マイクロアレイの免疫蛍光画像で決定された高または低FOLR2＋細胞密度を有する腫瘍におけるCD8＋T細胞の密度。
【図6D】ライブイメージングによって決定された、FOLR2＋マクロファージと接触しているまたは接触していない内因性CD8＋T細胞の平均速度のグラフ。マン・ホイットニー検定。
【図7】FOLR2マクロファージはT細胞エフェクター分化を促進することができる。
【図7A】健常なMGまたは乳房腫瘍から単離されたFOLR2＋マクロファージ間のDEGを示すボルケーノプロット。
【図7B】SIINFEKL OVAペプチドパルスFOLR2＋またはCADM1＋マクロファージをCTV標識ナイーブOTI CD8＋T細胞と共培養した。T細胞の増殖および活性化を3日後にフローサイトメトリーによって評価した。右側パネルのデータは、1nMのSIINFEKLでパルスした別個のマクロファージ集団との3日間の共培養後のOTI T細胞数およびIFN－γ＋TNF－α＋CD8＋T細胞の％を表す。データは、3つ組のウェルの平均＋／－SDであり、2つの実験の代表である。対応のないt検定。
【図7C】FOLR2マクロファージをマウス乳房腫瘍から精製し、OVAペプチドを負荷した。洗浄後、FOLR2マクロファージを抗OVAナイーブCD8T細胞と3日間共培養した。培養後3日目に、T細胞の活性化および増殖を測定した。FOLR2マクロファージは、CADM1マクロファージまたはOVA単独よりも高いT細胞活性化能を示す。
【図8】モデル抗原にカップリングされた抗FOLR2標的化抗体を使用するワクチン接種は、特異的CD8＋T細胞応答を誘発する
【0107】
SIINFEKLペプチドに連結された抗FOLR2 ScFvのスキーム。WTマウスを、対照として抗FOLR2－SIINFEKLまたは抗hCD 19－SIINFEKLで免疫した。4日後、CFSE標識されたCD45．1 OTIナイーブCD8＋T細胞を免疫化マウスに養子移入し、それらの増殖（CFSE希釈）および活性化（CD44発現およびCD62Lダウンレギュレーション）を免疫化部位を排出するリンパ節において3日後に評価した。
【0108】
実施例
A．材料および方法
1．実験モデルおよび対象の詳細
ヒト腫瘍試料
原発腫瘍、傍腫瘍組織、転移性および非転移性腫瘍排出LNを、施設の倫理ガイドラインに従ってInstitut Curie病院（フランス、パリ）でルミナル乳がん患者から外科的に切除し、インフォームドコンセントを得た（CRI－0804－2015、キュリー研究所倫理委員会承認）。リンパ節転移は、Institut Curieの病理部門によって割り当てられ、フローサイトメトリーによる汎がん／CD45免疫検出を使用することによって、さらに確認された。FOLR2およびTREM2免疫組織化学を、Pathology Unit、ASST Spedali Civili di Bresciaのアーカイブから検索された腫瘍切片に対して行った。
A．材料および方法
1．実験モデルおよび対象の詳細
ヒト腫瘍試料
原発腫瘍、傍腫瘍組織、転移性および非転移性腫瘍排出LNを、施設の倫理ガイドラインに従ってInstitut Curie病院（フランス、パリ）でルミナル乳がん患者から外科的に切除し、インフォームドコンセントを得た（CRI－0804－2015、キュリー研究所倫理委員会承認）。リンパ節転移は、Institut Curieの病理部門によって割り当てられ、フローサイトメトリーによる汎がん／CD45免疫検出を使用することによって、さらに確認された。FOLR2およびTREM2免疫組織化学を、Pathology Unit、ASST Spedali Civili di Bresciaのアーカイブから検索された腫瘍切片に対して行った。
【0109】
マウス
トランスジェニックPyMTマウス（MMTV－PyMT634Mul）（Davieら、2007）をC57Bl／6バックグラウンドで維持し、キュリー研究所のガイドラインに従ってキュリー研究所動物施設で特定病原体なしで飼育および維持した。健康なC57BL／6J雌マウスをCharles River Laboratoriesから入手し、非バリア施設で維持し、実験手順のために8～12週齢で含めた。この研究のための動物の管理および使用は、実験動物の管理および使用のためのヨーロッパ共同体の勧告に従って実施した（2010／63／UE）。実験手順は、国際的なガイドラインに従って、スイス連邦共和国政府により明確に承認された（認可番号2016－06．150）。
トランスジェニックPyMTマウス（MMTV－PyMT634Mul）（Davieら、2007）をC57Bl／6バックグラウンドで維持し、キュリー研究所のガイドラインに従ってキュリー研究所動物施設で特定病原体なしで飼育および維持した。健康なC57BL／6J雌マウスをCharles River Laboratoriesから入手し、非バリア施設で維持し、実験手順のために8～12週齢で含めた。この研究のための動物の管理および使用は、実験動物の管理および使用のためのヨーロッパ共同体の勧告に従って実施した（2010／63／UE）。実験手順は、国際的なガイドラインに従って、スイス連邦共和国政府により明確に承認された（認可番号2016－06．150）。
【0110】
2．方法の詳細
ヒト試料の処理
患者試料を前述のように処理した（Nunuezら、2020）。簡単に記載すると、新たに切除したヒト試料を小さな断片に切断し、CO2非依存性培地（GIBCO）＋0、4g／lのヒトアルブミン（Vialebex）中0．1mg／mlのリベラーゼTL（Roche）および0．1mg／mlのDNase（Roche）で37℃にて30分間消化した。解離した組織の単一細胞懸濁液を40μm細胞のセルストレーナー（BD Biosciences）で濾過し、CO2非依存性培地＋0．4g／lのヒトアルブミンで洗浄し、細胞数の推定のために培地に再懸濁した。
ヒト試料の処理
患者試料を前述のように処理した（Nunuezら、2020）。簡単に記載すると、新たに切除したヒト試料を小さな断片に切断し、CO2非依存性培地（GIBCO）＋0、4g／lのヒトアルブミン（Vialebex）中0．1mg／mlのリベラーゼTL（Roche）および0．1mg／mlのDNase（Roche）で37℃にて30分間消化した。解離した組織の単一細胞懸濁液を40μm細胞のセルストレーナー（BD Biosciences）で濾過し、CO2非依存性培地＋0．4g／lのヒトアルブミンで洗浄し、細胞数の推定のために培地に再懸濁した。
【0111】
フローサイトメトリー分析
組織処理および細胞計数の後、細胞懸濁液を、室温で10分間、1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中のLive／Dead Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit（Life Technologies）で染色した。インキュベーション後、細胞を冷PBS＋0．5％ウシ血清アルブミン（BSA）＋2mMのEDTAで洗浄し、Fc受容体ブロッキング試薬（Miltenyi）の存在下で蛍光抗体（表）で4℃にて30分間染色した。その後、細胞懸濁液を洗浄し、製造業者の指示に従って固定／透過化キット（eBiosciences／Thermo Fischer）を使用して細胞内染色に供した。LSR－Fortessa（BD）を用いてデータ取得を行い、FlowJoソフトウェア（TreeStar）を用いて補償および分析を行った。
組織処理および細胞計数の後、細胞懸濁液を、室温で10分間、1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中のLive／Dead Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit（Life Technologies）で染色した。インキュベーション後、細胞を冷PBS＋0．5％ウシ血清アルブミン（BSA）＋2mMのEDTAで洗浄し、Fc受容体ブロッキング試薬（Miltenyi）の存在下で蛍光抗体（表）で4℃にて30分間染色した。その後、細胞懸濁液を洗浄し、製造業者の指示に従って固定／透過化キット（eBiosciences／Thermo Fischer）を使用して細胞内染色に供した。LSR－Fortessa（BD）を用いてデータ取得を行い、FlowJoソフトウェア（TreeStar）を用いて補償および分析を行った。
【0112】
マス・サイトメトリー染色およびデータ分析
マス・サイトメトリーのために、事前にコンジュゲート化された抗体または精製された抗体を、表に列挙されているように、Invitrogen、Fluidigm（事前にコンジュゲート化された抗体）、Biolegend、eBioscience、Becton DickinsonまたはR＆D Systemsから得た。いくつかのマーカーについては、フルオロフォアコンジュゲート抗体またはビオチンコンジュゲート抗体を一次抗体として使用し、続いて抗フルオロフォア金属結合抗体（例えば、抗FITCクローンFIT22）または金属結合ストレプトアビジンで二次標識させており、先に記載されたように産生させている（Becherら、2014）。簡潔には、患者リンパ節細胞懸濁液（U字形底部96ウェルプレート中約30×106細胞／ウェル；BD Falcon、カタログ番号3077）を200mLのFACS緩衝液（1×PBS中4％のFBS、2mMのEDTA、0．05％のアジド）で1回洗浄し、次いで、氷上で5分間100mLの200mMシスプラチン（SigmaAldrich、カタログ番号479306－1G）で染色して、死細胞を除外した。次いで、細胞をFACS緩衝液で洗浄し、PBSで1回洗浄した後、PBS中の200mLの2％パラホルムアルデヒド（PFA；Electron Microscopy Sciences、カタログ番号15710）で一晩またはそれ以上固定した。固定後、細胞をペレット化し、細胞内標識を可能にするために室温で5分間、200μLの1×透過処理緩衝液（Biolegend、カタログ番号421002）に再懸濁した。ブロモアセトアミドベンジル－EDTA（BABE）結合金属バーコードは、BABE（Dojindo、カタログ番号B437）を100mMのHEPES緩衝液（GIBCO、カタログ番号15630）に最終濃度2mMまで溶解することによって調製した。次いで、同位体精製したPdCl2（Trace Sciences）を2mMのBABE溶液に添加して、最終濃度を0．5mMにした。同様に、DOTA－マレイミド（DM）結合金属バーコードを、DM（Macrocyclics、カタログ番号B－272）をL緩衝液（MAXPAR、カタログ番号PN00008）に1mMの最終濃度に溶解することによって調製した。次いで、RhC3（Sigma）および同位体的に精製したLnCl3を、0．5mMの最終濃度でDM溶液に添加した。6つの金属バーコード、つまりBABE－Pd－102、BABE－Pd－104、BABE－Pd－106、BABE－Pd－108、BABE－Pd－110およびDMLn－113を使用した。すべてのBABEおよびDM金属溶液混合物を液体窒素中で直ちに急速凍結し、80℃で保存した。各組織試料を染色するために、バーコードの固有の二重の組み合わせを選択した。バーコードPd－102を1：4000希釈で使用し、Pd－104を1：2000希釈で使用し、Pd－106およびPd－108を1：1000希釈で使用し、Pd－110およびLn－113を1：500希釈で使用した。細胞をPBS中の100mLバーコードで氷上で30分間インキュベートし、透過処理緩衝液で洗浄し、次いでFACS緩衝液中で氷上で10分間インキュベートした。次いで、細胞をペレット化し、室温で、2％のPFA／PBS（1：2000）中の100mL核酸Ir－インターカレーター（MAXPAR、カタログ番号201192B）に再懸濁した。20分後、細胞をFACS緩衝液で2回および水で2回洗浄した後、水に再懸濁した。各セットにおいて、細胞をすべての組織型からプールし、計数し、0．5×106細胞／mLに希釈した。取得前に、EQ Four Element Calibration Beads（DVS Science、Fluidigm）を1％濃度で添加した。細胞データを取得し、CyTOFマスサイトメーター（Fluidigm）を用いて分析した。CyTOFデータを従来のフローサイトメトリーファイル（．fcs）形式でエクスポートし、前述のソフトウェアを使用して正規化した（Finckら、2013）。0の値を有するイベントは、以前のバージョンのマス・サイトメトリーソフトウェアで使用されたカスタムのRスクリプトを使用して、0～－1の値をランダムに割り当てた（Newellら、2012）。FlowJo内のブールゲーティングアルゴリズムを使用して、各バーコードの細胞をデコンボリューションした。PBMCのCD45＋Lin（CD3／CD19／CD20）－HLA－DR＋集団を、FlowJoを使用してゲーティングし、．fcsファイルとしてエクスポートした。
マス・サイトメトリーのために、事前にコンジュゲート化された抗体または精製された抗体を、表に列挙されているように、Invitrogen、Fluidigm（事前にコンジュゲート化された抗体）、Biolegend、eBioscience、Becton DickinsonまたはR＆D Systemsから得た。いくつかのマーカーについては、フルオロフォアコンジュゲート抗体またはビオチンコンジュゲート抗体を一次抗体として使用し、続いて抗フルオロフォア金属結合抗体（例えば、抗FITCクローンFIT22）または金属結合ストレプトアビジンで二次標識させており、先に記載されたように産生させている（Becherら、2014）。簡潔には、患者リンパ節細胞懸濁液（U字形底部96ウェルプレート中約30×106細胞／ウェル；BD Falcon、カタログ番号3077）を200mLのFACS緩衝液（1×PBS中4％のFBS、2mMのEDTA、0．05％のアジド）で1回洗浄し、次いで、氷上で5分間100mLの200mMシスプラチン（SigmaAldrich、カタログ番号479306－1G）で染色して、死細胞を除外した。次いで、細胞をFACS緩衝液で洗浄し、PBSで1回洗浄した後、PBS中の200mLの2％パラホルムアルデヒド（PFA；Electron Microscopy Sciences、カタログ番号15710）で一晩またはそれ以上固定した。固定後、細胞をペレット化し、細胞内標識を可能にするために室温で5分間、200μLの1×透過処理緩衝液（Biolegend、カタログ番号421002）に再懸濁した。ブロモアセトアミドベンジル－EDTA（BABE）結合金属バーコードは、BABE（Dojindo、カタログ番号B437）を100mMのHEPES緩衝液（GIBCO、カタログ番号15630）に最終濃度2mMまで溶解することによって調製した。次いで、同位体精製したPdCl2（Trace Sciences）を2mMのBABE溶液に添加して、最終濃度を0．5mMにした。同様に、DOTA－マレイミド（DM）結合金属バーコードを、DM（Macrocyclics、カタログ番号B－272）をL緩衝液（MAXPAR、カタログ番号PN00008）に1mMの最終濃度に溶解することによって調製した。次いで、RhC3（Sigma）および同位体的に精製したLnCl3を、0．5mMの最終濃度でDM溶液に添加した。6つの金属バーコード、つまりBABE－Pd－102、BABE－Pd－104、BABE－Pd－106、BABE－Pd－108、BABE－Pd－110およびDMLn－113を使用した。すべてのBABEおよびDM金属溶液混合物を液体窒素中で直ちに急速凍結し、80℃で保存した。各組織試料を染色するために、バーコードの固有の二重の組み合わせを選択した。バーコードPd－102を1：4000希釈で使用し、Pd－104を1：2000希釈で使用し、Pd－106およびPd－108を1：1000希釈で使用し、Pd－110およびLn－113を1：500希釈で使用した。細胞をPBS中の100mLバーコードで氷上で30分間インキュベートし、透過処理緩衝液で洗浄し、次いでFACS緩衝液中で氷上で10分間インキュベートした。次いで、細胞をペレット化し、室温で、2％のPFA／PBS（1：2000）中の100mL核酸Ir－インターカレーター（MAXPAR、カタログ番号201192B）に再懸濁した。20分後、細胞をFACS緩衝液で2回および水で2回洗浄した後、水に再懸濁した。各セットにおいて、細胞をすべての組織型からプールし、計数し、0．5×106細胞／mLに希釈した。取得前に、EQ Four Element Calibration Beads（DVS Science、Fluidigm）を1％濃度で添加した。細胞データを取得し、CyTOFマスサイトメーター（Fluidigm）を用いて分析した。CyTOFデータを従来のフローサイトメトリーファイル（．fcs）形式でエクスポートし、前述のソフトウェアを使用して正規化した（Finckら、2013）。0の値を有するイベントは、以前のバージョンのマス・サイトメトリーソフトウェアで使用されたカスタムのRスクリプトを使用して、0～－1の値をランダムに割り当てた（Newellら、2012）。FlowJo内のブールゲーティングアルゴリズムを使用して、各バーコードの細胞をデコンボリューションした。PBMCのCD45＋Lin（CD3／CD19／CD20）－HLA－DR＋集団を、FlowJoを使用してゲーティングし、．fcsファイルとしてエクスポートした。
【0113】
単一細胞シーケンシングのためのヒトおよびマウス試料処理
PyMTまたは野生型同腹仔対照由来のマウスの腫瘍を小片に切断し、150μg／mLのDNAseおよび75μg／mLのリベラーゼTL（Roche）を含有するCO2非依存性培地（Gibco）中、37℃で1時間消化した。次いで、40μMセルストレーナー（BD）で濾過することによって細胞懸濁液を得た。その後、赤血球を赤血球溶解緩衝液で溶解した。最後に、さらなるアッセイのために、細胞を、2mMのEDTA（Invitrogen）および5％ウシ血清アルブミン（BSA；シグマ）を含有する冷PBSに再懸濁した。
PyMTまたは野生型同腹仔対照由来のマウスの腫瘍を小片に切断し、150μg／mLのDNAseおよび75μg／mLのリベラーゼTL（Roche）を含有するCO2非依存性培地（Gibco）中、37℃で1時間消化した。次いで、40μMセルストレーナー（BD）で濾過することによって細胞懸濁液を得た。その後、赤血球を赤血球溶解緩衝液で溶解した。最後に、さらなるアッセイのために、細胞を、2mMのEDTA（Invitrogen）および5％ウシ血清アルブミン（BSA；シグマ）を含有する冷PBSに再懸濁した。
【0114】
ヒト腫瘍を、以前に公開された方法（Lerusteら、2019）（Bourdelyら、2020）に従って処理した。簡潔には、組織処理、解離および細胞計数の後、細胞懸濁液を氷上で維持し、表に示す抗体およびDAPIでFACS選別用に染色した。細胞を、FACS－ARIA III（BD）セルソーターを使用して単離し、細胞計数のために冷PBS＋0．04％のBSAに回収した。PBMCを、Lymphoprep（Stemcell Technologies）を製造者の説明書に従って使用する密度勾配遠心分離によって新鮮血液試料から得て、次いで洗浄し、FACS選別の前にCO2非依存性培地＋0．4g／lのヒトアルブミンに再懸濁した。細胞計数の前に、血液単球も冷PBS＋0．04％のBSAに収集した。すべての組織を腫瘍切除後1時間以内に処理し、選別した細胞を6時間以内に10×Chromiumチップ機器に入れた。
【0115】
単一細胞RNAシーケンシング
ヒトおよびマウスの細胞懸濁液（3000から8000細胞）を、10×GEMCodeの専有技術に基づく製造業者のプロトコルに従って、10×ChromiumController（10×Genomics）にロードした。単一細胞RNA－Seqライブラリーを、Chromium Single Cell 3’v2またはv3試薬キット（10xGenomics）を製造者のプロトコルに従って使用して調製した。手短に言えば、最初のステップは、エマルジョンを実施することからなり、個々の細胞を、10X細胞バーコード、ユニーク分子識別子（UMI）およびポリ（dT）配列を有するユニークなプライマーでコーティングしたゲルビーズと共に液滴にて単離した。逆転写反応を行ってバーコード化した完全長のcDNAを生成させ、続いて回収剤を使用してエマルジョンを破壊し、DynaBeads MyOne SilaneでcDNAをクリーンアップした。バルクcDNAを、96－Well Gold Sample Block Module（Applied Biosystems）を備えたGeneAmp PCR System 9700を使用して増幅した（98℃で3分間；サイクル11／12×：98℃で15秒間、63℃で20秒間および72℃で1分間；4℃保持）。増幅したcDNA産物をSPRIセレクトReagent Kit（Beckman Coulter）で浄化した。Chromium Single Cell 3’v3 Reagent Kitからの試薬を使用して、以下のステップに従ってインデックス付き配列決定ライブラリーを構築した、（1）断片化、末端修復、およびテーリング、（2）SPRI選択によるサイズ選択、（3）アダプターライゲーション、（4）SPRI選択によるライゲーション後の浄化；（5）試料インデックスPCRおよびSPRI選択ビーズによる浄化。ライブラリーの定量化および質の評価を、高感度DNAチップ（Agilent）を使用したdsDNA HS（高感度）Assay KitおよびBioanalyzer Agilent 2100を用いたQubit蛍光アッセイ（Invitrogen）を使用して行った。インデックス付けしたライブラリーを細胞の数に従ってプールし、ペアエンド28×91bpを使用してNovaSeq 6000（Illumina）で配列決定した。細胞あたり約5万リードの深さが得られた。
ヒトおよびマウスの細胞懸濁液（3000から8000細胞）を、10×GEMCodeの専有技術に基づく製造業者のプロトコルに従って、10×ChromiumController（10×Genomics）にロードした。単一細胞RNA－Seqライブラリーを、Chromium Single Cell 3’v2またはv3試薬キット（10xGenomics）を製造者のプロトコルに従って使用して調製した。手短に言えば、最初のステップは、エマルジョンを実施することからなり、個々の細胞を、10X細胞バーコード、ユニーク分子識別子（UMI）およびポリ（dT）配列を有するユニークなプライマーでコーティングしたゲルビーズと共に液滴にて単離した。逆転写反応を行ってバーコード化した完全長のcDNAを生成させ、続いて回収剤を使用してエマルジョンを破壊し、DynaBeads MyOne SilaneでcDNAをクリーンアップした。バルクcDNAを、96－Well Gold Sample Block Module（Applied Biosystems）を備えたGeneAmp PCR System 9700を使用して増幅した（98℃で3分間；サイクル11／12×：98℃で15秒間、63℃で20秒間および72℃で1分間；4℃保持）。増幅したcDNA産物をSPRIセレクトReagent Kit（Beckman Coulter）で浄化した。Chromium Single Cell 3’v3 Reagent Kitからの試薬を使用して、以下のステップに従ってインデックス付き配列決定ライブラリーを構築した、（1）断片化、末端修復、およびテーリング、（2）SPRI選択によるサイズ選択、（3）アダプターライゲーション、（4）SPRI選択によるライゲーション後の浄化；（5）試料インデックスPCRおよびSPRI選択ビーズによる浄化。ライブラリーの定量化および質の評価を、高感度DNAチップ（Agilent）を使用したdsDNA HS（高感度）Assay KitおよびBioanalyzer Agilent 2100を用いたQubit蛍光アッセイ（Invitrogen）を使用して行った。インデックス付けしたライブラリーを細胞の数に従ってプールし、ペアエンド28×91bpを使用してNovaSeq 6000（Illumina）で配列決定した。細胞あたり約5万リードの深さが得られた。
【0116】
単一細胞RNAシーケンシングデータの処理および分析
アラインメントおよび生の発現マトリックスの構築。ヒトおよびマウスの生の配列決定データを、参照ゲノムGRCh38／84およびGRCm38／84（ゲノムアセンブリ／ENSEMBL放出）上で、10XソフトウェアCellRanger（バージョン3．0．2）をデフォルトのパラメータで使用してそれぞれ整列させた。個々の細胞の遺伝子発現数を、セルランジャーカウントを使用して生成した。細胞の選択、フィルタリングおよび正規化。ヒトおよびマウスの生のカウントマトリックス両方について、少なくとも200個の遺伝子を発現する細胞を保持した。ミトコンドリア含有量が10％を超える細胞を除去した。この質の管理の後、データを、Seurat 3 Rパイプラインに続く総カウントによって正規化した。ゲーティング戦略の汚染物質として同定された細胞、またはヒートショックタンパク質もしくはリボソームコード遺伝子の含有量が高い細胞を除外した。可変遺伝子の選択および試料の融合試料の融合のために、最も可変的な遺伝子を選択するVST（分散安定化変換）法を適用した。10個のヒト試料に対して最も多い8000個の遺伝子を使用して、Seurat V3インテグレーションパイプラインを実施した。3000個の最も可変的な遺伝子を使用して、2つのマウス試料を融合した。アンカーの選択および統合ステップの両方について、Seurat V3関数のデフォルトのパラメータを使用した。次元の減少および視覚化。データは、変動因子として、総UMI数、発現されたミトコンドリア遺伝子の割合、各細胞の起源試料および組織、ならびに配列決定に使用されるCellRanger化学キットのバージョンを使用して回帰を適用することによって、スケーリングした。ヒートマップは、このスケーリングされた行列のzスコアを示している。UMAP視覚化は、ヒトおよびマウスのPCAの50および30の最も有益な成分をそれぞれ使用して構築した。クラスタリングおよび示差的遺伝子発現分析。クラスタリングは、共有最近傍（SNN）グラフを構築することによって処理された。各細胞の20のネイバーを最初に決定した。得られたKNNグラフを使用して、すべての細胞とその20個の最近傍のネイバーとの間の近傍の重なり（ジャッカード指数）を計算することによって、SNNグラフを構築した。次いで、ルーバングラフに基づくアルゴリズムを使用して、このグラフにクラスタリングを適用した。示差的遺伝子発現分析を各試料対数正規化マトリックスに適用した。Seurat関数FindAllMarkersをロジスティック回帰検定と共に使用し、変動因子として、各細胞の起源試料および組織、ならびに使用したCellRangerシーケンシングキットのバージョンを追加した。クラスタ内の細胞の10％超で発現され、比較群間で少なくとも0．10のlog倍率変化を有する遺伝子のみを試験した。脱落した遺伝子によって生成された低シグナルを検出することができた。ボルケーノプロットについては、第1の条件のみを維持した。最後に、有意に調整されたp値（pv＜0．05、偽発見率（FDR）調整p値）を有する遺伝子のみを保持し、各クラスタを定義するために使用した。
ヒトとマウスの融合およびSeurat標識転移予測スコア。マウスおよびヒトマクロファージを比較するために、両種間で保存されたオルソログ遺伝子を選択した。対応する遺伝子記号表は、Mouse Genome Informaticsデータベースによって提供された。他の種において2つ以上の対応するオルソログを有する遺伝子については、すべてのオルソログの平均発現を採用した。Seurat標識転移スコアリングアルゴリズムをマウス（クエリとして）からヒトデータセット（参照として）に適用した。アンカー探索ステップのために、参照データセットの10000個の最も可変な遺伝子を使用した。Seuratパイプラインの以下のステップをデフォルトパラメータで適用した。
公開されたデータセットの処理。Aziziら、Cell 2018（GSE 114725）のデータセットをダウンロードした。生の計数行列（補足ファイルGSE114725＿rna＿raw．csv．gz）からのSeurat V3（積分補正なし）の単一細胞分析のための古典的なパイプラインを使用した。次に、ルーバングラフに基づくクラスタリングを行った。分解能0．9で、39個のクラスタ、つまりT細胞の14個のクラスタ、B細胞の6個のクラスタ、NK細胞の5個のクラスタ、pDC、DC1、DC2、CD16＋単球、CD14＋単球、好中球または肥満細胞の1個のクラスタ、マクロファージの3個のクラスタ、および汚染細胞の4個のクラスタが得られた。マクロファージクラスタおよび混入しているクラスタを除いて、同じ免疫細胞型のクラスタを融合した。Hanら、Cell 2018（GSE 108097）のデータセットをダウンロードした。バージンの乳腺の2試料および妊娠乳腺の1試料を、生データ（補足ファイルGSE 108097＿RAW．tar）から統合した。一体化ステップを含む上記と同じパイプラインを使用した。
アラインメントおよび生の発現マトリックスの構築。ヒトおよびマウスの生の配列決定データを、参照ゲノムGRCh38／84およびGRCm38／84（ゲノムアセンブリ／ENSEMBL放出）上で、10XソフトウェアCellRanger（バージョン3．0．2）をデフォルトのパラメータで使用してそれぞれ整列させた。個々の細胞の遺伝子発現数を、セルランジャーカウントを使用して生成した。細胞の選択、フィルタリングおよび正規化。ヒトおよびマウスの生のカウントマトリックス両方について、少なくとも200個の遺伝子を発現する細胞を保持した。ミトコンドリア含有量が10％を超える細胞を除去した。この質の管理の後、データを、Seurat 3 Rパイプラインに続く総カウントによって正規化した。ゲーティング戦略の汚染物質として同定された細胞、またはヒートショックタンパク質もしくはリボソームコード遺伝子の含有量が高い細胞を除外した。可変遺伝子の選択および試料の融合試料の融合のために、最も可変的な遺伝子を選択するVST（分散安定化変換）法を適用した。10個のヒト試料に対して最も多い8000個の遺伝子を使用して、Seurat V3インテグレーションパイプラインを実施した。3000個の最も可変的な遺伝子を使用して、2つのマウス試料を融合した。アンカーの選択および統合ステップの両方について、Seurat V3関数のデフォルトのパラメータを使用した。次元の減少および視覚化。データは、変動因子として、総UMI数、発現されたミトコンドリア遺伝子の割合、各細胞の起源試料および組織、ならびに配列決定に使用されるCellRanger化学キットのバージョンを使用して回帰を適用することによって、スケーリングした。ヒートマップは、このスケーリングされた行列のzスコアを示している。UMAP視覚化は、ヒトおよびマウスのPCAの50および30の最も有益な成分をそれぞれ使用して構築した。クラスタリングおよび示差的遺伝子発現分析。クラスタリングは、共有最近傍（SNN）グラフを構築することによって処理された。各細胞の20のネイバーを最初に決定した。得られたKNNグラフを使用して、すべての細胞とその20個の最近傍のネイバーとの間の近傍の重なり（ジャッカード指数）を計算することによって、SNNグラフを構築した。次いで、ルーバングラフに基づくアルゴリズムを使用して、このグラフにクラスタリングを適用した。示差的遺伝子発現分析を各試料対数正規化マトリックスに適用した。Seurat関数FindAllMarkersをロジスティック回帰検定と共に使用し、変動因子として、各細胞の起源試料および組織、ならびに使用したCellRangerシーケンシングキットのバージョンを追加した。クラスタ内の細胞の10％超で発現され、比較群間で少なくとも0．10のlog倍率変化を有する遺伝子のみを試験した。脱落した遺伝子によって生成された低シグナルを検出することができた。ボルケーノプロットについては、第1の条件のみを維持した。最後に、有意に調整されたp値（pv＜0．05、偽発見率（FDR）調整p値）を有する遺伝子のみを保持し、各クラスタを定義するために使用した。
ヒトとマウスの融合およびSeurat標識転移予測スコア。マウスおよびヒトマクロファージを比較するために、両種間で保存されたオルソログ遺伝子を選択した。対応する遺伝子記号表は、Mouse Genome Informaticsデータベースによって提供された。他の種において2つ以上の対応するオルソログを有する遺伝子については、すべてのオルソログの平均発現を採用した。Seurat標識転移スコアリングアルゴリズムをマウス（クエリとして）からヒトデータセット（参照として）に適用した。アンカー探索ステップのために、参照データセットの10000個の最も可変な遺伝子を使用した。Seuratパイプラインの以下のステップをデフォルトパラメータで適用した。
公開されたデータセットの処理。Aziziら、Cell 2018（GSE 114725）のデータセットをダウンロードした。生の計数行列（補足ファイルGSE114725＿rna＿raw．csv．gz）からのSeurat V3（積分補正なし）の単一細胞分析のための古典的なパイプラインを使用した。次に、ルーバングラフに基づくクラスタリングを行った。分解能0．9で、39個のクラスタ、つまりT細胞の14個のクラスタ、B細胞の6個のクラスタ、NK細胞の5個のクラスタ、pDC、DC1、DC2、CD16＋単球、CD14＋単球、好中球または肥満細胞の1個のクラスタ、マクロファージの3個のクラスタ、および汚染細胞の4個のクラスタが得られた。マクロファージクラスタおよび混入しているクラスタを除いて、同じ免疫細胞型のクラスタを融合した。Hanら、Cell 2018（GSE 108097）のデータセットをダウンロードした。バージンの乳腺の2試料および妊娠乳腺の1試料を、生データ（補足ファイルGSE 108097＿RAW．tar）から統合した。一体化ステップを含む上記と同じパイプラインを使用した。
【0117】
バルクRNAシーケンシング
組織処理および細胞計数後、細胞懸濁液を冷PBS＋0．5％のBSA＋2mMのEDTAで洗浄し、Fc受容体遮断（FcRブロッキング試薬；Miltenyi）の存在下で4℃で30分間表面抗体染色（表）に供した。骨髄細胞サブセットを、FACS－ARIA III（BD）細胞選別機を使用して単離し、1％のβ－メルカプトエタノールを含有する溶解TCL緩衝液（QIAGEN）上に直接収集した後、－80℃で保存した。製造業者の説明書に従ってSingle Cell RNA精製キット（Norgen、カタログ番号51800）を使用してRNAを抽出し、単離した。抽出後、Agilent RNA 6000 Pico Kitを用いてAgilent 2100 Bioanalyzer Systemで全RNAを分析した。RNAの質は、RNA Integrity Number（RIN）を用いてキャピラリー電気泳動プロファイルに基づいて推定した。RNA配列決定ライブラリーを、SMARTer Stranded Total RNA－Seq Kit v2－Pico Input Mammalian（Clontech／Takara）を使用して調製した。総RNAの投入量は1ng～22ngであった。このプロトコルは、94℃で独自の断片化混合物を使用したRNA断片化の最初のステップを含む。インキュベーションの時間は、RNAの質に基づいて、製造業者の推奨に従って各試料について設定した。断片化後、インデックス付きcDNA合成を行った。次いで、哺乳動物のrRNAに特異的なプローブを使用して、リボデプリーションステップを行った。最終的には、インデックス付きcDNAライブラリーを増幅するためにPCR増幅を達成し、tRNAの投入量に従って設定されたサイクル数で行った。ライブラリーの定量化および質の評価を、高感度DNAチップ（Perkin Elmer）を使用したdsDNA HS（高感度）Assay KitおよびLabChip GX Touchを用いたQubit蛍光アッセイ（Invitrogen）を使用して行った。次いで、ライブラリーを等モルでプールし、KAPAライブラリー定量キット（Roche）を使用してqPCRによって定量した。配列決定を、試料あたり10M～15Mリードを標的とし、ペアエンド2×100 bpを使用して、NovaSeq 6000（Illumina）で行った。
組織処理および細胞計数後、細胞懸濁液を冷PBS＋0．5％のBSA＋2mMのEDTAで洗浄し、Fc受容体遮断（FcRブロッキング試薬；Miltenyi）の存在下で4℃で30分間表面抗体染色（表）に供した。骨髄細胞サブセットを、FACS－ARIA III（BD）細胞選別機を使用して単離し、1％のβ－メルカプトエタノールを含有する溶解TCL緩衝液（QIAGEN）上に直接収集した後、－80℃で保存した。製造業者の説明書に従ってSingle Cell RNA精製キット（Norgen、カタログ番号51800）を使用してRNAを抽出し、単離した。抽出後、Agilent RNA 6000 Pico Kitを用いてAgilent 2100 Bioanalyzer Systemで全RNAを分析した。RNAの質は、RNA Integrity Number（RIN）を用いてキャピラリー電気泳動プロファイルに基づいて推定した。RNA配列決定ライブラリーを、SMARTer Stranded Total RNA－Seq Kit v2－Pico Input Mammalian（Clontech／Takara）を使用して調製した。総RNAの投入量は1ng～22ngであった。このプロトコルは、94℃で独自の断片化混合物を使用したRNA断片化の最初のステップを含む。インキュベーションの時間は、RNAの質に基づいて、製造業者の推奨に従って各試料について設定した。断片化後、インデックス付きcDNA合成を行った。次いで、哺乳動物のrRNAに特異的なプローブを使用して、リボデプリーションステップを行った。最終的には、インデックス付きcDNAライブラリーを増幅するためにPCR増幅を達成し、tRNAの投入量に従って設定されたサイクル数で行った。ライブラリーの定量化および質の評価を、高感度DNAチップ（Perkin Elmer）を使用したdsDNA HS（高感度）Assay KitおよびLabChip GX Touchを用いたQubit蛍光アッセイ（Invitrogen）を使用して行った。次いで、ライブラリーを等モルでプールし、KAPAライブラリー定量キット（Roche）を使用してqPCRによって定量した。配列決定を、試料あたり10M～15Mリードを標的とし、ペアエンド2×100 bpを使用して、NovaSeq 6000（Illumina）で行った。
【0118】
バルクRNAシーケンシングデータの処理および分析
生の配列決定データを、STARアライナ（v2．5．3a）を使用して、最初にヒト参照ゲノムhg19にアラインメントした（Dobinら、2013）。生リードカウントマトリックスは（パラメータ－－quantMode GeneCountsを使用して）STARでも作成。FastQファイルの質の管理をFastQC（アダプタおよび低い質のベースの除去）で適用した。未発現遺伝子（2未満のすべての試料におけるカウントの合計）および低発現遺伝子（バックグラウンド；2未満の全試料における生カウントの平均のlog2）を生のリードカウントマトリックスから除去した。示差発現分析のために、RパッケージDESeq2（バージョン1．24．0）（Loveら、2014）をp値の補正により使用した。DESeqマトリックスを、患者および細胞タイプの情報を使用して設計した（式設計＝凡そバッチ＋条件、に従う）。比率のメジアン法（Anders and Huber、2010）を正規化に使用し、DESeq 2チュートリアル（Loveら、2014）で提案されている視覚化およびクラスタリングのためのrlog変換を使用した。
生の配列決定データを、STARアライナ（v2．5．3a）を使用して、最初にヒト参照ゲノムhg19にアラインメントした（Dobinら、2013）。生リードカウントマトリックスは（パラメータ－－quantMode GeneCountsを使用して）STARでも作成。FastQファイルの質の管理をFastQC（アダプタおよび低い質のベースの除去）で適用した。未発現遺伝子（2未満のすべての試料におけるカウントの合計）および低発現遺伝子（バックグラウンド；2未満の全試料における生カウントの平均のlog2）を生のリードカウントマトリックスから除去した。示差発現分析のために、RパッケージDESeq2（バージョン1．24．0）（Loveら、2014）をp値の補正により使用した。DESeqマトリックスを、患者および細胞タイプの情報を使用して設計した（式設計＝凡そバッチ＋条件、に従う）。比率のメジアン法（Anders and Huber、2010）を正規化に使用し、DESeq 2チュートリアル（Loveら、2014）で提案されている視覚化およびクラスタリングのためのrlog変換を使用した。
【0119】
免疫組織化学
パラフィン包埋組織ブロックをミクロトームで3ミクロンの微細スライバーに切断した。免疫組織化学を、Bond Polymer改良検出キット（Leica、DS 9800）を用いてBond RX自動化（Leica）で処理した。抗原の検索を、BOND Epitope Retrieval Solution 1（Leica、AR 9961）において行った。一次抗体APOE（Abcam；ab52607）を室温で30分間インキュベートした。スライドをヘマトキシリンで対比染色した後、樹脂でマウントした。画像は、Digital Pathologyスライドスキャナー（Ultra Fast Scanner 1．8、Philips）を用いて取得した。免疫組織化学を使用することによってヒトの組織でFOLR2発現を試験した。試料には、病理学ユニット、ASST Spedali Civili di Bresciaのアーカイブから検索された異なる原発部位（乳房、膀胱、胃腸、肺、腎臓および皮膚）からの反応性リンパ節（n＝7）、原発性癌腫（n＝47）、転移性腫瘍排出リンパ節（n＝7）ならびに肺（n＝8）および肝臓（n＝11）への遠隔転移が含まれた。簡潔には、抗FOLR2（クローンOTI4G6、1：100、ThermoFisher SCIENTIFIC）および抗TREM2（クローンD814C、1：100、Cell Signaling Technology）の抗体を、Novolink Polymer（Leica）、続いてDABを使用して明らかにした。二重染色のために、FOLR2を抗CD3（クローンLN10、1：70、Leica Biosystem）、抗CD20（クローンL26、1：200、Leica Biosystem）、抗CD31（クローンPECAM－1、1：50、Leica）および抗TREM2と組み合わせた。簡潔には、第1の免疫反応を完了した後、第2の免疫反応を、Mach 4 MR－AP（Biocare Medical）、続いてFerangi Blueを使用して可視化した。三次リンパ系構造（TLS）内のFOLR2＋細胞の局在化を、B細胞マーカーCD20およびT細胞マーカーCD3について二重で確認した。
パラフィン包埋組織ブロックをミクロトームで3ミクロンの微細スライバーに切断した。免疫組織化学を、Bond Polymer改良検出キット（Leica、DS 9800）を用いてBond RX自動化（Leica）で処理した。抗原の検索を、BOND Epitope Retrieval Solution 1（Leica、AR 9961）において行った。一次抗体APOE（Abcam；ab52607）を室温で30分間インキュベートした。スライドをヘマトキシリンで対比染色した後、樹脂でマウントした。画像は、Digital Pathologyスライドスキャナー（Ultra Fast Scanner 1．8、Philips）を用いて取得した。免疫組織化学を使用することによってヒトの組織でFOLR2発現を試験した。試料には、病理学ユニット、ASST Spedali Civili di Bresciaのアーカイブから検索された異なる原発部位（乳房、膀胱、胃腸、肺、腎臓および皮膚）からの反応性リンパ節（n＝7）、原発性癌腫（n＝47）、転移性腫瘍排出リンパ節（n＝7）ならびに肺（n＝8）および肝臓（n＝11）への遠隔転移が含まれた。簡潔には、抗FOLR2（クローンOTI4G6、1：100、ThermoFisher SCIENTIFIC）および抗TREM2（クローンD814C、1：100、Cell Signaling Technology）の抗体を、Novolink Polymer（Leica）、続いてDABを使用して明らかにした。二重染色のために、FOLR2を抗CD3（クローンLN10、1：70、Leica Biosystem）、抗CD20（クローンL26、1：200、Leica Biosystem）、抗CD31（クローンPECAM－1、1：50、Leica）および抗TREM2と組み合わせた。簡潔には、第1の免疫反応を完了した後、第2の免疫反応を、Mach 4 MR－AP（Biocare Medical）、続いてFerangi Blueを使用して可視化した。三次リンパ系構造（TLS）内のFOLR2＋細胞の局在化を、B細胞マーカーCD20およびT細胞マーカーCD3について二重で確認した。
【0120】
固定された腫瘍切片に対する免疫蛍光
生検物を過ヨウ素酸塩－リジン－パラホルムアルデヒド溶液（0．1MのL－リジン［pH7．4］、2mg／mlのNaIO4および10mg／mlのパラホルムアルデヒドを含む0．05Mのリン酸緩衝液）中、4℃で一晩固定した。次いで、固定腫瘍を5％低ゲル化温度アガロース（VII－A型、Sigma－Aldrich）に包埋し、前述のように（Peranzoniら、2018）400μm厚のスライス片に切断した。腫瘍切片を表に示す抗体で37℃で15分間染色した。10μg／mlで使用した抗FOLR2およびCD31抗体を除いて、すべての抗体をPBSで希釈し、5μg／mlの濃度で使用した。5×5の視野のZスタック画像を、倒立型スピニングディスク共焦点顕微鏡（IXplore、オリンパス）の10×水浸対物レンズ（10x／0．3N．A．）を用いて撮影した。仮想スライスを再構成し、ImageJソフトウェアで分析した。
生検物を過ヨウ素酸塩－リジン－パラホルムアルデヒド溶液（0．1MのL－リジン［pH7．4］、2mg／mlのNaIO4および10mg／mlのパラホルムアルデヒドを含む0．05Mのリン酸緩衝液）中、4℃で一晩固定した。次いで、固定腫瘍を5％低ゲル化温度アガロース（VII－A型、Sigma－Aldrich）に包埋し、前述のように（Peranzoniら、2018）400μm厚のスライス片に切断した。腫瘍切片を表に示す抗体で37℃で15分間染色した。10μg／mlで使用した抗FOLR2およびCD31抗体を除いて、すべての抗体をPBSで希釈し、5μg／mlの濃度で使用した。5×5の視野のZスタック画像を、倒立型スピニングディスク共焦点顕微鏡（IXplore、オリンパス）の10×水浸対物レンズ（10x／0．3N．A．）を用いて撮影した。仮想スライスを再構成し、ImageJソフトウェアで分析した。
【0121】
パラフィン包埋組織でのマルチスペクトル免疫蛍光
パラフィン包埋組織ブロックをミクロトームで5ミクロンの微細スライバーに切断した。免疫染色は、表に示す抗体を使用して、Opal（商標）7－Color IHCキット（Akoya Biosciences、NEL821001KT）を用いてBond RX自動化（Leica）で、製造者の説明書に従って処理した。組織切片をProong（商標）Diamond Antifade Mountant（ThermoFisher）でカバーガラスをかぶせ、4℃で保存した。続いて、スライドを、Vectra（登録商標）3自動定量的病理イメージングシステム（Vectra 3．0．5；Akoya Bioscience）を使用してスキャンした。マルチスペクトル画像を混合せず、inForm Advanced Image Analysis Software（inForm 2．4．6；Akoya Bioscience）を使用して分析した。
パラフィン包埋組織ブロックをミクロトームで5ミクロンの微細スライバーに切断した。免疫染色は、表に示す抗体を使用して、Opal（商標）7－Color IHCキット（Akoya Biosciences、NEL821001KT）を用いてBond RX自動化（Leica）で、製造者の説明書に従って処理した。組織切片をProong（商標）Diamond Antifade Mountant（ThermoFisher）でカバーガラスをかぶせ、4℃で保存した。続いて、スライドを、Vectra（登録商標）3自動定量的病理イメージングシステム（Vectra 3．0．5；Akoya Bioscience）を使用してスキャンした。マルチスペクトル画像を混合せず、inForm Advanced Image Analysis Software（inForm 2．4．6；Akoya Bioscience）を使用して分析した。
【0122】
組織マイクロアレイ（TMA）マルチスペクトル免疫蛍光
乳がん患者のパラフィン包埋組織マイクロアレイ（n＝122スポット）を商業的に入手した（AMSBIO、英国）。免疫染色は、Opal（商標）7－Color IHCキット（Akoya Biosciences、NEL821001KT）を用いてBond RX自動化（Leica）で、製造者の説明書に従って処理した（表）。免疫染色後、スライドをDAPI染色に供し、洗浄し、Proong（商標）Diamond Antifade Mountant（ThermoFisher）でカバーガラスを覆った。続いて、スライドを、Vectra（登録商標）3自動定量的病理イメージングシステム（Vectra 3．0．5；Akoya Bioscience）を使用してスキャンした。マルチスペクトル画像を、inForm Advanced Image Analysis Software（inForm 2．4．6；Akoya Bioscience）を使用して混合せず、免疫サブセット定量化のためにHALOソフトウェアにより分析した。
乳がん患者のパラフィン包埋組織マイクロアレイ（n＝122スポット）を商業的に入手した（AMSBIO、英国）。免疫染色は、Opal（商標）7－Color IHCキット（Akoya Biosciences、NEL821001KT）を用いてBond RX自動化（Leica）で、製造者の説明書に従って処理した（表）。免疫染色後、スライドをDAPI染色に供し、洗浄し、Proong（商標）Diamond Antifade Mountant（ThermoFisher）でカバーガラスを覆った。続いて、スライドを、Vectra（登録商標）3自動定量的病理イメージングシステム（Vectra 3．0．5；Akoya Bioscience）を使用してスキャンした。マルチスペクトル画像を、inForm Advanced Image Analysis Software（inForm 2．4．6；Akoya Bioscience）を使用して混合せず、免疫サブセット定量化のためにHALOソフトウェアにより分析した。
【0123】
METABRICデータ解析
METABRIC（METABRIC Groupら、2012）遺伝子発現データ、ならびに臨床レベルおよび試料レベルのメタデータを、cBioPortalからダウンロードした。患者の乳がんのサブタイプは、TNBCを陰性ERおよびHER2状態を有するものとして定義することによって注釈付けされた。HER2陽性患者を、HER2陽性状態変数を有するいずれかの患者と定義した。ER／PR陽性患者を、HER2陰性であるがERまたはPR状態のいずれかが陽性であると定義した。PR IHC陽性ステータスのTNBCを除去した。疾患に関連しない他の原因で死亡した患者、ならびに乳房肉腫を有する患者を除去した。TNBC発現データを、TNBCコホートからさらに6人の患者を除外したTNBC型（Chenら、2012）アルゴリズムに供した（MB－3297、MB－7269、MB－5008、MB－6052、MB－0179、MB－2993。最終的なコホートは、1339個の試料（168のTNBC、204のHER2、および967のER／PR）からなった。目的の遺伝子シグネチャについて個々の試料をスコア化するために、遺伝子発現データをZスコア正規化し、次いで、シグネチャ遺伝子にわたる発現の平均レベルを計算した。MCPcounter（1．2．0）を使用して、各試料の免疫および間質細胞集団の存在量を推測した。遺伝子シグネチャスコアに従って患者を層別化するために、75％のカットオフを使用し、したがって患者の25％を「高」スコアと定義した。生存分析は、Rの生存（3．1～12）およびサーブマイナー（0．4．6）パッケージを使用して実行した。ペアワイズスピアマン相関を目的のシグネチャ間で計算し、corrplot Rパッケージ（0．84）を使用して相関ヒートマップとしてプロットした。統計学的に有意でない（p＜0．05）相関をダッシュ（－）でマークした。MCPは、免疫細胞存在量を逆推定した。特定のシグネチャによって高群と低群に層別化された患者間のMCP対向細胞型を比較するために、Benjamini－Hochberg法を使用してP値を調整したウィルコクソン検定を使用した。データをプロットするために、ggplot2（3．3．0）、pheatmap（1．0．12）およびcorrplot（0．84）パッケージを使用した。
METABRIC（METABRIC Groupら、2012）遺伝子発現データ、ならびに臨床レベルおよび試料レベルのメタデータを、cBioPortalからダウンロードした。患者の乳がんのサブタイプは、TNBCを陰性ERおよびHER2状態を有するものとして定義することによって注釈付けされた。HER2陽性患者を、HER2陽性状態変数を有するいずれかの患者と定義した。ER／PR陽性患者を、HER2陰性であるがERまたはPR状態のいずれかが陽性であると定義した。PR IHC陽性ステータスのTNBCを除去した。疾患に関連しない他の原因で死亡した患者、ならびに乳房肉腫を有する患者を除去した。TNBC発現データを、TNBCコホートからさらに6人の患者を除外したTNBC型（Chenら、2012）アルゴリズムに供した（MB－3297、MB－7269、MB－5008、MB－6052、MB－0179、MB－2993。最終的なコホートは、1339個の試料（168のTNBC、204のHER2、および967のER／PR）からなった。目的の遺伝子シグネチャについて個々の試料をスコア化するために、遺伝子発現データをZスコア正規化し、次いで、シグネチャ遺伝子にわたる発現の平均レベルを計算した。MCPcounter（1．2．0）を使用して、各試料の免疫および間質細胞集団の存在量を推測した。遺伝子シグネチャスコアに従って患者を層別化するために、75％のカットオフを使用し、したがって患者の25％を「高」スコアと定義した。生存分析は、Rの生存（3．1～12）およびサーブマイナー（0．4．6）パッケージを使用して実行した。ペアワイズスピアマン相関を目的のシグネチャ間で計算し、corrplot Rパッケージ（0．84）を使用して相関ヒートマップとしてプロットした。統計学的に有意でない（p＜0．05）相関をダッシュ（－）でマークした。MCPは、免疫細胞存在量を逆推定した。特定のシグネチャによって高群と低群に層別化された患者間のMCP対向細胞型を比較するために、Benjamini－Hochberg法を使用してP値を調整したウィルコクソン検定を使用した。データをプロットするために、ggplot2（3．3．0）、pheatmap（1．0．12）およびcorrplot（0．84）パッケージを使用した。
【0124】
CPTACデータ分析
この刊行で使用されたデータは、Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium（NCI／NIH）によって生成された。CPTAC BRCA研究からの臨床情報およびRNA配列決定データを含む対数比正規化プロテオミクスデータをダウンロードした（http：／／linkedomics．org／data＿download／TCGA－BRCA／）。ER陽性またはPR陽性およびHER2陰性のいずれかとして注釈付けされたBRCA患者の試料を、下流分析のために選択した。次いで、患者をFOLR2タンパク質発現による25％カットオフに従って層別化し、単変量Cox回帰分析を行った。ログランク検定スコアをKaplan－Meierプロットにプロットした。
この刊行で使用されたデータは、Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium（NCI／NIH）によって生成された。CPTAC BRCA研究からの臨床情報およびRNA配列決定データを含む対数比正規化プロテオミクスデータをダウンロードした（http：／／linkedomics．org／data＿download／TCGA－BRCA／）。ER陽性またはPR陽性およびHER2陰性のいずれかとして注釈付けされたBRCA患者の試料を、下流分析のために選択した。次いで、患者をFOLR2タンパク質発現による25％カットオフに従って層別化し、単変量Cox回帰分析を行った。ログランク検定スコアをKaplan－Meierプロットにプロットした。
【0125】
GTExとTCGAの比較
非疾患健常組織、腫瘍近接正常組織および腫瘍組織の間のTREM2およびFOLR2 mRNA発現を比較するために、GTExおよびTCGAコンソーシアムからのデータセットを利用した。乳房、結腸および肺の研究のために、Github（https：／／github．com／mskcc／RNAseqDB／tree／master／data／normalized）からの正規化されたトランスクリプトームデータをダウンロードした。ノンパラメトリック、ウィルコクソンT検定を使用して、組織型間のTREM2およびFOLR2の発現を比較した。遺伝子型－組織発現（GTEx）プロジェクトは、国立衛生研究所長室の共通基金、ならびにNCI、NHGRI、NHLBI、NIDA、NIMH、およびNINDSによって支援された。
非疾患健常組織、腫瘍近接正常組織および腫瘍組織の間のTREM2およびFOLR2 mRNA発現を比較するために、GTExおよびTCGAコンソーシアムからのデータセットを利用した。乳房、結腸および肺の研究のために、Github（https：／／github．com／mskcc／RNAseqDB／tree／master／data／normalized）からの正規化されたトランスクリプトームデータをダウンロードした。ノンパラメトリック、ウィルコクソンT検定を使用して、組織型間のTREM2およびFOLR2の発現を比較した。遺伝子型－組織発現（GTEx）プロジェクトは、国立衛生研究所長室の共通基金、ならびにNCI、NHGRI、NHLBI、NIDA、NIMH、およびNINDSによって支援された。
【0126】
FOLR2＋マクロファージの密度
乳がん患者のパラフィン包埋組織マイクロアレイ（n＝122スポット）を商業的に入手した（AMSBIO、英国）。免疫染色は、Opal（商標）7－Color IHCキット（Akoya Biosciences、NEL821001KT）を用いてBond RX自動化（Leica）で、製造者の説明書に従って処理した。免疫染色後、スライドをDAPI染色に供し、洗浄し、Proong（商標）Diamond Antifade Mountant（ThermoFisher）でカバーガラスを覆った。続いて、スライドを、Vectra（登録商標）3自動定量的病理イメージングシステム（Vectra 3．0．5；Akoya Bioscience）を使用してスキャンした。マルチスペクトル画像を、inForm Advanced Image Analysis Software（inForm 2．4．6；Akoya Bioscience）を使用して混合せず、免疫サブセット定量化のためにHALOソフトウェアにより分析した。
乳がん患者のパラフィン包埋組織マイクロアレイ（n＝122スポット）を商業的に入手した（AMSBIO、英国）。免疫染色は、Opal（商標）7－Color IHCキット（Akoya Biosciences、NEL821001KT）を用いてBond RX自動化（Leica）で、製造者の説明書に従って処理した。免疫染色後、スライドをDAPI染色に供し、洗浄し、Proong（商標）Diamond Antifade Mountant（ThermoFisher）でカバーガラスを覆った。続いて、スライドを、Vectra（登録商標）3自動定量的病理イメージングシステム（Vectra 3．0．5；Akoya Bioscience）を使用してスキャンした。マルチスペクトル画像を、inForm Advanced Image Analysis Software（inForm 2．4．6；Akoya Bioscience）を使用して混合せず、免疫サブセット定量化のためにHALOソフトウェアにより分析した。
【0127】
ポリエピトープに連結された組換え抗FOLR2 IgG構築物
オボアルブミン（OVA）由来のよく特徴付けられたCD8＋T細胞エピトープSIINFEKL（配列番号1）を含むポリエピトープに連結された組換えマウスIgG2a抗マウスFOLR2構築物は、Nagaiら（Arthritis and Rheumatism，2006，54，3126－3134）に開示されている抗FolR2 scFvから誘導された。ポリエピトープに連結されたscFvを、高親和性Fc－ガンマ受容体に結合しないように、IgG2a Fc変異（N297A）に融合した。ポリヌクレオチド構築物（配列番号2；1812nt）は、以下の要素を含む：
－コザックコンセンサス：1から6位
－シグナルペプチド：7から63位
－XhoI部位：64から69位
－抗マウスFOLR2 VL：70から408位
－（G4S）4リンカー：409から468位
－抗マウスFOLR2 VH：469から831位
－G4S（A）3リンカー：832から855位
－NotI－Bgl II部位：856から870位
－FcIgG2A＊N297A：871から1569位
－srfI部位：1570から1578位
－ポリエピトープ：1579から1770位
－AscI部位：1771から1779位
－FlagTAG：1780から1803位
－終止コドン：1804から1806位置
－NheI部位：1807から1812位。
オボアルブミン（OVA）由来のよく特徴付けられたCD8＋T細胞エピトープSIINFEKL（配列番号1）を含むポリエピトープに連結された組換えマウスIgG2a抗マウスFOLR2構築物は、Nagaiら（Arthritis and Rheumatism，2006，54，3126－3134）に開示されている抗FolR2 scFvから誘導された。ポリエピトープに連結されたscFvを、高親和性Fc－ガンマ受容体に結合しないように、IgG2a Fc変異（N297A）に融合した。ポリヌクレオチド構築物（配列番号2；1812nt）は、以下の要素を含む：
－コザックコンセンサス：1から6位
－シグナルペプチド：7から63位
－XhoI部位：64から69位
－抗マウスFOLR2 VL：70から408位
－（G4S）4リンカー：409から468位
－抗マウスFOLR2 VH：469から831位
－G4S（A）3リンカー：832から855位
－NotI－Bgl II部位：856から870位
－FcIgG2A＊N297A：871から1569位
－srfI部位：1570から1578位
－ポリエピトープ：1579から1770位
－AscI部位：1771から1779位
－FlagTAG：1780から1803位
－終止コドン：1804から1806位置
－NheI部位：1807から1812位。
【0128】
組換え抗FOLR2 IgGタンパク質構築物は、配列番号3に対応する。
【0129】
統計分析
統計分析に使用される検定は、関連する各図の凡例に記載されており、GraphPad Prism v8またはR v3．4を使用して実施された。有意性の記号：ns、非有意；＊、＜0．05，＊＊、＜0．01；＊＊＊、＜0．001；＊＊＊＊、＜0．0001。各実験群について、nは各群内の対象の数を表す。
統計分析に使用される検定は、関連する各図の凡例に記載されており、GraphPad Prism v8またはR v3．4を使用して実施された。有意性の記号：ns、非有意；＊、＜0．05，＊＊、＜0．01；＊＊＊、＜0．001；＊＊＊＊、＜0．0001。各実験群について、nは各群内の対象の数を表す。
【0130】
B．結果
本発明者らは、転移性LNおよび原発性乳房腫瘍から単離された腫瘍関連CD14＋HLA－DR＋細胞のscRNAseqを実施して、CD14＋区画内の細胞不均一性を評価した。それらは、2つの表現型的に異なるマクロファージ集団、骨髄によって発現されるトリガー受容体細胞－2（TREM2）、オステオポンチン（SPP1）および細胞接着分子1（CADM1）遺伝子を発現するTREM2＋マクロファージ；葉酸受容体2（FOLR2）、セレノタンパク質P（SEPP1）、溶質担体ファミリー40メンバー1（SLC40A1）、ヒアルロナン受容体（LYVE－1）およびマンノース受容体C型1（MRC1／CD206）遺伝子を発現するFOLR2＋マクロファージを同定する。この研究は、腫瘍関連TREM2＋およびFOLR2＋マクロファージがヒト乳がんとマウス乳がんとの間で発展的に保存されていることを示す。TREM2＋マクロファージは、健常な乳房組織では不良に表されるが、腫瘍の発達と共に増加する。対照的に、研究は、FOLR2＋マクロファージが、がん発達の発症前に健康な乳腺に増殖する組織常在マクロファージ（TRM）であることを示す。FOLR2＋マクロファージを定める特定の遺伝子シグネチャは、乳がん患者におけるより良好な無再発生存と相関する。したがって、FOLR2＋マクロファージは、CD8＋T細胞、NK細胞および樹状細胞（DC）を含む抗腫瘍免疫の主要な細胞プレイヤーのシグネチャと正に相関する。この研究は、腫瘍切除試料において、FOLR2＋マクロファージが血管の近くに位置し、CD8＋T細胞凝集物とクラスタを形成することをさらに示す。このFOLR2＋マクロファージ／CD8＋T細胞の共局在化は、この新たに特徴付けられたマクロファージサブセットの抗腫瘍性の役割を示唆する好適な臨床転帰と相関する。
本発明者らは、転移性LNおよび原発性乳房腫瘍から単離された腫瘍関連CD14＋HLA－DR＋細胞のscRNAseqを実施して、CD14＋区画内の細胞不均一性を評価した。それらは、2つの表現型的に異なるマクロファージ集団、骨髄によって発現されるトリガー受容体細胞－2（TREM2）、オステオポンチン（SPP1）および細胞接着分子1（CADM1）遺伝子を発現するTREM2＋マクロファージ；葉酸受容体2（FOLR2）、セレノタンパク質P（SEPP1）、溶質担体ファミリー40メンバー1（SLC40A1）、ヒアルロナン受容体（LYVE－1）およびマンノース受容体C型1（MRC1／CD206）遺伝子を発現するFOLR2＋マクロファージを同定する。この研究は、腫瘍関連TREM2＋およびFOLR2＋マクロファージがヒト乳がんとマウス乳がんとの間で発展的に保存されていることを示す。TREM2＋マクロファージは、健常な乳房組織では不良に表されるが、腫瘍の発達と共に増加する。対照的に、研究は、FOLR2＋マクロファージが、がん発達の発症前に健康な乳腺に増殖する組織常在マクロファージ（TRM）であることを示す。FOLR2＋マクロファージを定める特定の遺伝子シグネチャは、乳がん患者におけるより良好な無再発生存と相関する。したがって、FOLR2＋マクロファージは、CD8＋T細胞、NK細胞および樹状細胞（DC）を含む抗腫瘍免疫の主要な細胞プレイヤーのシグネチャと正に相関する。この研究は、腫瘍切除試料において、FOLR2＋マクロファージが血管の近くに位置し、CD8＋T細胞凝集物とクラスタを形成することをさらに示す。このFOLR2＋マクロファージ／CD8＋T細胞の共局在化は、この新たに特徴付けられたマクロファージサブセットの抗腫瘍性の役割を示唆する好適な臨床転帰と相関する。
【0131】
1．APOE発現はヒトの乳がんにおける腫瘍関連マクロファージを定義する
乳房腫瘍内のマクロファージを明確に同定するという考えに動機付けられて、乳がんマクロファージ集団と浸潤CD14＋CD1c－単球、CD14＋CD1c＋炎症性DC／DC3またはCD14－CD1c＋cDC2（Villaniら、2017）との間の区別を可能にする共通の特徴を定義しようとした（Bourdelyら、2020）（Duttertreら、2019）。
乳房腫瘍内のマクロファージを明確に同定するという考えに動機付けられて、乳がんマクロファージ集団と浸潤CD14＋CD1c－単球、CD14＋CD1c＋炎症性DC／DC3またはCD14－CD1c＋cDC2（Villaniら、2017）との間の区別を可能にする共通の特徴を定義しようとした（Bourdelyら、2020）（Duttertreら、2019）。
【0132】
第1のアプローチでは、13人の治療ナイーブのルミナル乳がん患者のコホートから、一致した原発腫瘍、非転移性および転移性リンパ節（LN）の単核食細胞を定量化した。CD1c－CD14＋単球／マクロファージ集団は、対応する非転移性LNと比較して、転移性LNにおいて最も有意に増加したことが見出された（図1A）。CD14＋細胞浸潤と腫瘍浸潤との間のこの正の相関は、患者の第2のコホートで確認された。CD14＋細胞浸潤は、LNにおける腫瘍浸潤の程度と相関していた（図1B）。
【0133】
次に、偏りのない方法で腫瘍浸潤CD14＋細胞全体内での不均一性を特徴付けることを試みた。この目的のために、未処置のルミナル乳がん患者の転移性LN、原発腫瘍および血液を分析した（図1C）。CD11c＋HLA－DR＋細胞画分をFACSソートし、液滴ベースのアプローチを使用してscRNA－Seqを行うことによって、すべての単核食細胞を単離した。SEURATパイプラインを使用してデータを処理した（図1D）。汚染リンパ球（B／T／NK細胞）、XCR1＋DCおよびCCR7＋LAMP3＋DC（Zhangら、2019）を分析から除外した。次いで、全患者由来の約18000個の残存骨髄細胞を融合した（図1D）。ルーバングラフに基づくクラスタ化により、単核食細胞の4つのクラスタならびにサイクリング細胞（例えば、mKI67、TOP2A、CDC20）および「ストレス負荷された」細胞（例えば、HSPA1A、HSPB1）の集団が同定された。クラスタ0は、CD14＋CD16－単球（Villaniら、2017）を定めるマーカー（S100A8、S100A9、S100A12、VCAN）の選択的かつ高発現を特徴とした（図1D、E）。クラスタ1は、CD1c＋DCを定義する遺伝子（DC2およびDC3サブセットを含む）によって特徴付けられ、一方、クラスタ4は、CD14－CD16＋単球として同定された（Villaniら、2017）（Duttertreら、2019）（Bourdelyら、2020）。単球クラスタ（c0およびc4）は両方とも、血液、腫瘍および転移性LNに見られた。残りのクラスタ2は、高レベルのTAMシグネチャ（図1F）を選択的に発現したため、TAMとして識別された（Aziziら、2018）。クラスタ2は、高レベルのAPOE、APOC1、C1QA、C1QCを発現し、単球との区別を可能にした（図1E）。APOEの均一な発現は、CD14＋単球およびCD1c＋DCの両方からTAMを選択的に区別することが示されている（図1F）。他の一般的に使用されるマーカー（CSF1R、CD68、CD14）は、この識別を達成しなかった。CD68は、CD14＋単球、CD16＋単球およびCD1c DCにおいて発現される。CD14は、単球およびCD1c＋DCのサブセットによって発現される。CSF1Rは無差別である（図1F）。
【0134】
次に、CD1c－CD14＋細胞内の単球からマクロファージ／TAMを区別するタンパク質発現を検証することが望まれていた。細胞内タンパク質S100A8およびS100A9－CD14＋単球クラスタ0で高度かつ特異的に発現されることが見出された－は、このscRNAseqデータセットでは検出されなかった細胞表面CCR2のタンパク質発現パターンに従った。APOEおよびCCR2で染色することによって、最良の単球／マクロファージ識別が得られた（図1G）。次いで、ルミナル乳房腫瘍病変（原発腫瘍または高度に浸潤した転移性LN）内のCD14＋細胞区画に対するCCR2＋単球対APOE＋マクロファージの寄与を、腫瘍を含まない組織（血液、健常な乳房組織、腫瘍のない低侵襲性の転移性LNまたは傍腫瘍）に対して分析した。APOE＋マクロファージの頻度は腫瘍の負荷量と共に増加し、CCR2＋単球の頻度は減少したことが分かった（図1G）。最後に、APOE＋細胞が転移性LNおよび原発腫瘍の腫瘍病変の近くおよび内部に位置することが見出された。まとめると、これらの結果は、原発性および転移性のルミナル乳がんにおけるマクロファージを同定するための特異的マーカーとしてAPOEを確立する。
【0135】
2．単一細胞RNAシーケンシングは、APOE＋マクロファージの2つの主要なサブセットを明らかにする
次に、APOE＋TAM（クラスタ2）の不均一性を調査した。ルーバングラフに基づくクラスタリングは、TAMの3つのクラスタを同定した（図2A）。階層的クラスタリングは、クラスタ0および1がクラスタ2と比較して互いに近いことを示した（図2B）。APOE＋マクロファージ内に見られる転写不均一性をさらに調査するために、単一細胞調節ネットワーク推論およびクラスタリング（SCENIC）を実施して、各マクロファージクラスタの遺伝子調節ネットワーク（GRN）を研究した。GRN分析およびそれらの活性に基づく階層的クラスタリングにより、クラスタ0および1は、CEBPBおよびBHLHE41を含むそれらの転写レギュロンの半分程度を共有し、クラスタ2は、NR1H3およびMAFのようなほとんど独特の転写レギュロンを提示したことが明らかになった（図2C）。示差的に発現した遺伝子の分析により、FOLR2、SEPP1、SLC40A1、MRC1、LYVE1が、クラスタ0およびクラスタ1の両方からクラスタ2を識別したことが明らかになった（図2D）。逆に、TREM2、SPP1、ISG15は、クラスタ0およびクラスタ1の両方をクラスタ2と識別した（図2D）。まとめると、FOLR2はクラスタ2を定めるマーカーであり、TREM2はクラスタ0および1を定めることが示されている（図2E）。APOE＋TAMは、2つの異なる集団：TREM2＋マクロファージおよびFOLR2＋マクロファージを含むと結論付けられる。
次に、APOE＋TAM（クラスタ2）の不均一性を調査した。ルーバングラフに基づくクラスタリングは、TAMの3つのクラスタを同定した（図2A）。階層的クラスタリングは、クラスタ0および1がクラスタ2と比較して互いに近いことを示した（図2B）。APOE＋マクロファージ内に見られる転写不均一性をさらに調査するために、単一細胞調節ネットワーク推論およびクラスタリング（SCENIC）を実施して、各マクロファージクラスタの遺伝子調節ネットワーク（GRN）を研究した。GRN分析およびそれらの活性に基づく階層的クラスタリングにより、クラスタ0および1は、CEBPBおよびBHLHE41を含むそれらの転写レギュロンの半分程度を共有し、クラスタ2は、NR1H3およびMAFのようなほとんど独特の転写レギュロンを提示したことが明らかになった（図2C）。示差的に発現した遺伝子の分析により、FOLR2、SEPP1、SLC40A1、MRC1、LYVE1が、クラスタ0およびクラスタ1の両方からクラスタ2を識別したことが明らかになった（図2D）。逆に、TREM2、SPP1、ISG15は、クラスタ0およびクラスタ1の両方をクラスタ2と識別した（図2D）。まとめると、FOLR2はクラスタ2を定めるマーカーであり、TREM2はクラスタ0および1を定めることが示されている（図2E）。APOE＋TAMは、2つの異なる集団：TREM2＋マクロファージおよびFOLR2＋マクロファージを含むと結論付けられる。
【0136】
次に、バルクトランスクリプトーム分析のためにこれらの集団を前向きに単離することによって、この知見を検証することが求められた。この目的のために、2つの集団間で差次的に発現される表面タンパク質を検索し、したがってフローサイトメトリーによるそれらの単離を可能にした。TREM2は、組織解離後にTAMの細胞表面で検出されなかった。あるいは、クラスタ1（TREM2高 TAM）が特異的に発現し、CADM1について陽性に染色されることが見出された（図2F、G）。
【0137】
FOLR2およびCADM1発現のフローサイトメトリー分析により、相互に排他的な発現パターンが明らかになった（図2G）。FOLR2＋CADM1＋およびFOLR2低CADM1＋TAMを、FAC選別によって原発性腫瘍および転移性LNの両方から単離した。FOLR2＋CADM1－TAMは典型的なマクロファージの形状を示し、液胞で満たされていた。対照的に、FOLR2低CADM1＋TAMはサイズが小さく、形態が単球に近かった（図2G）。
【0138】
次に、バルクRNAseqを、FOLR2＋CADM1－TAM、FOLR2低CADM1＋TAMおよびCD14＋CCR2＋単球に対して行った（図2H）。階層的クラスタ化は、原発腫瘍と浸潤されたLNクラスタ両方からのFOLR2＋CADM1－マクロファージが、FOLR2低CADM1＋マクロファージまたはCD14＋CCR2＋単球から一緒に離れることを示した（図2H）。scRNAseq結果が確認されFOLR2＋マクロファージが、FOLR2低CADM1＋TAMおよびCD14＋CCR2＋単球と比較して、より高いレベルのFOLR2、SEPP1、SLC40A1およびLYVE1（図2I）を発現したことを示した。全体として、原発腫瘍由来のFOLR2低CADM1＋マクロファージは、CD14＋CCR2＋単球と一緒にクラスタを形成した（図2H）。しかしながら、FOLR2低CADM1＋マクロファージはTREM2を特異的に発現し、遺伝子はscRNAseq分析のクラスタ1（C3、FN1、SPP1）で過剰発現されていることが分かった（図2J）。
【0139】
これらの表現型の違いのいくつかは、浸潤したLN由来のCD14＋CCR2－マクロファージのCyTOFプロファイリングによって確認された。LYVE1、MRC1／CD206およびCD163の共発現は、CADM1＋発現マクロファージとは異なるマクロファージ集団で見られた（図2K）。
【0140】
まとめると、これらの結果は、乳房TAMが、TREM2／CADM1およびFOLR2の相互排他的発現によって分離可能な2つの集団を含むことを示している。
【0141】
3．FOLR2＋マクロファージは組織常在マクロファージである
最近の研究では、TREM2＋マクロファージの浸潤が、がんの発症に関連する事象として特定されている（Molgoraら、2020）。これらのデータは、乳房腫瘍におけるCD14＋CCR2＋単球に対するそれらの転写近接性を確立する（図2H）。これらの結果は、TREM2＋CADM1＋TAMが腫瘍進行中の循環単球の浸潤から生じることを示唆する。
最近の研究では、TREM2＋マクロファージの浸潤が、がんの発症に関連する事象として特定されている（Molgoraら、2020）。これらのデータは、乳房腫瘍におけるCD14＋CCR2＋単球に対するそれらの転写近接性を確立する（図2H）。これらの結果は、TREM2＋CADM1＋TAMが腫瘍進行中の循環単球の浸潤から生じることを示唆する。
【0142】
FOLR2＋マクロファージの起源は知られていない。FOLR2＋マクロファージが、乳腺TRM（すなわち、健常な乳房に存在する）またはTREM2＋TAMのような腫瘍動員単球由来マクロファージに対応するかどうかが疑問であった。この問題に対処するために、健常組織（健常な乳房、腫瘍病変に隣接する乳腺組織－傍腫瘍－、腫瘍非存在または低浸潤転移性LN）対ルミナル乳房腫瘍病変（原発腫瘍および高度に浸潤した転移性LN）におけるFOLR2＋マクロファージをフローサイトメトリーによって定量化した。APOE＋マクロファージの中で、FOLR2＋マクロファージが健常組織および傍腫瘍組織において富化されていることが見出された（図3A）。対照的に、FOLR2－TAMの割合（TREM2＋TAMを含む）は、健常組織と比較して原発性および転移性腫瘍病変の両方で劇的に増加した（図3A）。
【0143】
隣接する正常組織対腫瘍病変におけるFOLR2＋マクロファージの富化はまた、Cancer Genome Atlas（TCGA）データベースからの乳がん試料を分析することによって転写レベルで確認された（図3B）。FOLR2転写物は、異なるサブタイプの乳がん腫瘍病変と比較して、正常な隣接組織で富化されていた（Her2＋、TNBC、ルミナル）。FOLR2転写物はまた、乳がんの腫瘍と比較して、非疾患の健常な組織でも富化されていたが、対照的に、TREM2 転写物は、腫瘍に隣接する正常組織および非疾患の健常な組織と比較して、乳房腫瘍病変で富化されていた（図3B）。重要なことに、免疫組織化学（IHC）分析は、FOLR2＋マクロファージが乳がんのすべてのサブタイプにおいて腫瘍周囲領域に存在することを明らかにした。FOLR2＋マクロファージのバルクRNAseq（図2J）およびCyTOF（図2K）分析は、FOLR2＋マクロファージが血管周囲マクロファージの両方のマーカーであるヒアルロナン受容体LYVE1およびマンノース受容体（MRC1／CD206）を特異的に発現することを示す（（Linら、2006）Limら、2018）（Chakarovら、2019）。したがって、FOLR2＋マクロファージが血管の近くに位置するかどうかが疑問であった。腫瘍外科切除標本の共焦点イメージングは、腫瘍および隣接組織の両方においてCD31＋血管の近くに位置するFOLR2＋CD206＋マクロファージを示した。全体として、これらの結果は、FOLR2＋マクロファージが健常な乳腺およびLNに関連する血管周囲TRMであることを示している。
【0144】
次に、定常状態および腫瘍進行中の免疫集団の長期分析を実施することを可能にするマウスモデルにおいて、乳腺マクロファージを分析した。最初に、健常な乳腺（Hanら、2018）由来の造血細胞に対して行われた、公開されたscRNAseqデータセットを分析した。ヒトFOLR2＋マクロファージのようなFolr2、Mrc1およびLyve1を共発現するTRMのサブセットを同定した。これらの細胞は、以前に記載されたMRC1＋LYVE1＋TRMにアライメントする（Franklinら、2014）（Jappinenら、2019）（Wangら、2020）。次に、MMTV－PyMT自家ルミナル様乳房腫瘍モデル（Franklinら、2014）から単離したCD45＋CD3－CD19－B220－NKP46－細胞に対してscRNAseqを行った（Davieら、2007）（図3C）。これらの細胞を分析から除外した。汚染リンパ球（図示せず）、Ly6c2＋単球（c3）、Ly6c2－Nr4a1高単球（c6）、サイクリング細胞（c4）およびリボソーム遺伝子の含有量が高い細胞（c1）。残りのFcgr1＋細胞の中で、TAMの3つのクラスタが23週齢のPyMTマウス腫瘍で同定された（図3C）。これらの中で、2つがCadm1を発現した（Cx3cr1intクラスタ0およびCx3cr1高クラスタ1、図3C）。さらに、Folr2＋Mrc1＋マクロファージの別個の集団が同定された（クラスタ2、図3C）。マウスおよびヒトのFOLR2＋TAMは、FOLR2、MRC1、SLC40A1およびMAFの発現を共有する（図3D）。一方、Cadm1＋Cx3cr1＋マウスマクロファージ（クラスタ0および1）は、ヒトCADM1＋TREM2高TAMに類似し（クラスタ1、図2A）、CADM1、HAVCR2、IFI44の発現を共有する（図3D）。注目すべきことに、Trem2の発現パターンは、ヒトのマクロファージと比較してマウスにおいてより顕著である。ヒトとマウスのFOLR2＋マクロファージ間の類似性を調べるために、各細胞のレベルで全トランスクリプトームにわたって類似性分析を行った（図3E）。このバイアスのない分析により、マウスFolr2＋マクロファージとヒトFOLR2＋マクロファージのマーカーベースのアラインメントが確認された。逆に、Cadm1＋Cx3cr1＋マウスマクロファージ（クラスタ0および1）は、CADM1＋TREM2＋ヒトマクロファージと高い類似性を示した。したがって、FOLR2＋マクロファージは、マウスとヒトのルミナル乳房腫瘍の間で、発展的に保存されていると結論付けられた。
【0145】
次に、マウスの乳がんが進展している間のFOLR2＋（およびCADM1＋）マクロファージの動態を縦断的に分析した。この目的のために、乳腺マクロファージを健常な同腹子（WT）、病変前PyMTマウス（8週齢）、新生物病変（12週齢マウス）、早期癌（14週齢マウス）および進行癌（20週齢マウス）で分析した。健常な乳腺（WT）では、FOLR2＋マクロファージが全マクロファージ（CD45＋Lin－Ly6C－F4／80＋CD64＋）の約90％を構成することが分かった。FOLR2＋マクロファージの頻度は、20週齢のPyMTマウスの進行癌病変では、癌進行時に徐々に減少して最低10～20％に達した（図3F）。対照的に、癌腫の発生は、20週齢のPyMTマウスにおいて総マクロファージの最大80％を占めるCADM1＋マクロファージのデノボ増殖を伴った（図3F）。全体として、FOLR2＋マクロファージは、進行癌において持続する発展的に保存されたTRMサブセットを表すと結論付けられる。
【0146】
4．FOLR2＋マクロファージは、乳がん患者および少なくとも6つの他のがん型の患者における生存率の増加と相関する
TAMは、一般に、腫瘍の増殖を促し、抗腫瘍免疫を阻害すると考えられている。これは、マクロファージが過剰な腫瘍促進機能を示すマウスモデルにおいて特に十分に確立されている（Linら、2006）（Qianら、2011）（Franklinら、2014）（Lindeら、2018）。ヒトでは、TAMは一般に予後不良およびより高い腫瘍グレードと相関する。しかしながら、臨床研究は、単球およびマクロファージによって共有されることが多いマーカー（CSF1R、MRC1／CD206、CD163など）、またはpDCのような他の免疫細胞型（CD68など）と共有されるマーカーを使用することによって、TAMと患者の生存との関連を探査している（Colonnaら、2004）。したがって、FOLR2＋マクロファージが乳がん患者のより低い生存率と同様な関連性があるかどうかが疑問であった。
TAMは、一般に、腫瘍の増殖を促し、抗腫瘍免疫を阻害すると考えられている。これは、マクロファージが過剰な腫瘍促進機能を示すマウスモデルにおいて特に十分に確立されている（Linら、2006）（Qianら、2011）（Franklinら、2014）（Lindeら、2018）。ヒトでは、TAMは一般に予後不良およびより高い腫瘍グレードと相関する。しかしながら、臨床研究は、単球およびマクロファージによって共有されることが多いマーカー（CSF1R、MRC1／CD206、CD163など）、またはpDCのような他の免疫細胞型（CD68など）と共有されるマーカーを使用することによって、TAMと患者の生存との関連を探査している（Colonnaら、2004）。したがって、FOLR2＋マクロファージが乳がん患者のより低い生存率と同様な関連性があるかどうかが疑問であった。
【0147】
この目的のために、バルク腫瘍RNAシーケンシング内の総マクロファージまたはFOLR2＋マクロファージサブセットの存在量を推測することを可能にする遺伝子シグネチャを定めた。3つの遺伝子（C1QA、C1QB、C1QC）は、この試験で同定された3つのマクロファージのクラスタによって共有されるコアマクロファージシグネチャを定め（図2A、図4A）、マクロファージを他の白血球系統と区別するのに十分である（図4A、B）。3つの遺伝子（FOLR2、SEPP1、SLC40A1）は、FOLR2＋マクロファージを他のTAMおよび他の白血球系統（図4A、B）から独特に区別する（Aziziら、2018）。LYVE1は、その内皮発現のためにシグネチャ解析のために考慮されなかった。
【0148】
これらのシグネチャの表示を、ルミナル乳がんのバルクトランスクリプトームの中で分析した（1339人の患者、METABRICコホート）（METABRIC Groupら、2012）。生存確率を、残りの患者（図4C）に対して最も高いシグネチャ・エクスプレッサー（上位25％）の中で計算した。以前の報告（Ruffell and Coussens、2015）によれば、マクロファージ浸潤の最高レベルがより不良な全生存期間と相関することが見出された（p＝0．036）。完全に対照的に、最高レベルのFOLR2シグネチャは、全生存期間の増加と相関した（p＝0．0013）（図4C）。FOLR2遺伝子シグネチャと患者の臨床転帰との間の関連性は、同じカットオフを使用して独立したBC患者コホートで確認された（Wangら、2005a）（図4D）。FOLR2タンパク質と患者の予後との関連も、CPTACデータセットから49人のER＋／HER2－患者の中で分析した。FOLR2タンパク質の存在量は、より良好な生存期間と正の相関があることが見出された（図4C）。FOLR2高シグネチャ乳がん患者は、再発までの時間が長い。FOLR2シグネチャは、ER＋患者におけるCD8の状態とは無関係の予後因子である。
【0149】
内分泌療法で治療された患者は、FOLR2遺伝子シグネチャによって強力に層別化されたが、これは、化学療法を含む他の治療レジメン、または化学療法も内分泌療法も含まない他の治療レジメンで治療された患者には当てはまらなかった。興味深いことに、高FOLR2遺伝子シグネチャを有するER／PR＋患者は、化学療法単独、または化学療法＋内分泌療法と比較して、内分泌療法からの生存率が改善されており、これはFOLR2遺伝子シグネチャが低い患者には当てはまらなかった（図4E）。したがって、FOLR2高患者は、内分泌療法単独から利益を得るであろうし、化学療法を必要としない。FOLR2低患者は、内分泌療法と化学療法の併用から利益を得ることができる。
【0150】
TCGAデータベースでは、連続変数としてのFOLR2シグネチャは、少なくとも6つの他のがん型、KIRC：腎細胞癌、LUAD：肺腺癌、LIHC：肝細胞癌、CESC：子宮頸部扁平上皮癌および子宮内頸部、MSKCM：黒色腫、およびACC：副腎皮質癌におけるより良好な転帰と正に相関する。
【0151】
FOLR2＋マクロファージは健常な乳腺における組織常在集団であるので、FOLR2mRNA存在量は、より小さく、より低侵襲性の腫瘍に関連し得る。これが単変量生存分析における交絡因子であり得るかどうかを検証するために、FOLR2 mRNAの発現レベルを異なる病期およびグレードの乳房腫瘍について分析した。グレード間のFOLR2発現の有意差は認められず、後期の病期の腫瘍のわずかな増加が認められた（図5A）。さらに、年齢、組織学的グレード、腫瘍のサイズ、疾患の陽性LNの組織学および数について調整したFOLR2遺伝子シグネチャの予後の値の多変量解析は、FOLR2遺伝子シグネチャがルミナル乳がん患者のより良好な生存と相関する独立した予後因子であることを示した（図5B）。
【0152】
次に、FOLR2＋マクロファージの密度が好適な臨床転帰と関連しているかどうかを直接評価することが望まれた。この目的のために、マルチスペクトルイメージングを使用して、122人の乳がん患者の後ろ向きのコホートからの腫瘍を含む組織マイクロアレイを分析した。腫瘍をFOLR2、サイトケラチンおよびDAPIについて染色し、FOLR2＋マクロファージの細胞密度を計算した。カットオフとして最高のパフォーマンスの閾値を使用して、FOLR2＋マクロファージ密度が患者の生存と正に相関することが分かった（図4F）。この結果は、126人の乳がん患者を含む第2の独立コホートで確認された（図4F）。全体として、これらの結果は、FOLR2＋マクロファージの存在量が乳がん患者のより良好な予後と関連することを示している。さらに、低いCD8＋T細胞浸潤を有する患者では、FOLR2＋細胞高密度もより良好な生存確率と相関する。これは、CD8＋T細胞密度とは無関係に予後の値としてFOLR2＋細胞の密度を同定する。
【0153】
5．FOLR2＋マクロファージは、がん全体にわたってTREM2＋マクロファージから空間的に分離されている。
TREM2＋TAMは、がんを越えて腫瘍巣に浸潤することが示されている（Molgoraら、2020）。FOLR2＋マクロファージが乳腺TRMであることが示された。さらに、FOLR2を発現するマクロファージが健常なヒト組織に見られることを他者が最近示した（Samaniegoら、2014）（Sharmaら、2020）（Thomasら、2021）。したがって、FOLR2＋マクロファージががん型にわたって検出され得るかどうかが疑問であった。この問題に対応するために、FOLR2の発現を、異なるがん（口腔、肝臓、膀胱、脳、腎臓、皮膚、結腸、肺、卵巣、胃、乳房）にわたる原発性および転移性腫瘍の80の組織学的切片において分析し、FOLR2＋マクロファージは、これらの癌すべてにわたって見出された。FOLR2およびTREM2の共染色により、異なる細胞の2つのマーカーの相互に排他的な発現が確認された。様々ながん型の連続切片に対するFOLR2およびTREM2の染色は、FOLR2＋およびTREM2＋マクロファージが空間的に隔離されていることを示した。Molgoraらによって記載されているように、TREM2＋マクロファージは腫瘍巣に浸潤した。対照的に、FOLR2＋マクロファージは、腫瘍周囲間質領域内に一貫して見られた。この空間的な分離は、黒色腫、肺癌、肝細胞癌、口腔扁平上皮癌、および膵癌を含む様々ながん型で見られた。まとめると、これらの結果は、FOLR2＋およびTREM2＋マクロファージが様々ながん型におけるTME内の特定の位置に関連することを示している。
TREM2＋TAMは、がんを越えて腫瘍巣に浸潤することが示されている（Molgoraら、2020）。FOLR2＋マクロファージが乳腺TRMであることが示された。さらに、FOLR2を発現するマクロファージが健常なヒト組織に見られることを他者が最近示した（Samaniegoら、2014）（Sharmaら、2020）（Thomasら、2021）。したがって、FOLR2＋マクロファージががん型にわたって検出され得るかどうかが疑問であった。この問題に対応するために、FOLR2の発現を、異なるがん（口腔、肝臓、膀胱、脳、腎臓、皮膚、結腸、肺、卵巣、胃、乳房）にわたる原発性および転移性腫瘍の80の組織学的切片において分析し、FOLR2＋マクロファージは、これらの癌すべてにわたって見出された。FOLR2およびTREM2の共染色により、異なる細胞の2つのマーカーの相互に排他的な発現が確認された。様々ながん型の連続切片に対するFOLR2およびTREM2の染色は、FOLR2＋およびTREM2＋マクロファージが空間的に隔離されていることを示した。Molgoraらによって記載されているように、TREM2＋マクロファージは腫瘍巣に浸潤した。対照的に、FOLR2＋マクロファージは、腫瘍周囲間質領域内に一貫して見られた。この空間的な分離は、黒色腫、肺癌、肝細胞癌、口腔扁平上皮癌、および膵癌を含む様々ながん型で見られた。まとめると、これらの結果は、FOLR2＋およびTREM2＋マクロファージが様々ながん型におけるTME内の特定の位置に関連することを示している。
【0154】
FOLR2遺伝子単独またはFOLR2遺伝子シグネチャmRNAレベルの予後の値を、TCGA全腫瘍トランスクリプトームデータセットにおいて検証した。高いFOLR2の発現（またはFOLR2遺伝子シグネチャ発現）は、以下を含む複数のがん型におけるより良好な生存と関連することが見出された：
－甲状腺癌（THCA）（HR＝0．527；logRank p＝0．005）
－脳低悪性度神経膠腫（LGG）（HR＝0．7；logRank p＝2．7×10－7）
－副腎皮質癌（ACC）（HR＝0．776；logRank p＝0．005）
－子宮頸部扁平上皮癌および子宮内頸部（CESC）（HR＝0．849；logRank p＝0．025）
－肺腺癌（LUAD）（HR＝0．9；logRank p＝0．031）
－皮膚メラノーマ（MSKCM）（HR＝0．912；logRank p＝0．043）。
さらに、FOLR2遺伝子シグネチャ（ただし、FOLR2発現単独ではない）は、以下においてより良好な生存と関連する。
－KIRC：腎明細胞癌
－LIHC：肝肝細胞癌。
－甲状腺癌（THCA）（HR＝0．527；logRank p＝0．005）
－脳低悪性度神経膠腫（LGG）（HR＝0．7；logRank p＝2．7×10－7）
－副腎皮質癌（ACC）（HR＝0．776；logRank p＝0．005）
－子宮頸部扁平上皮癌および子宮内頸部（CESC）（HR＝0．849；logRank p＝0．025）
－肺腺癌（LUAD）（HR＝0．9；logRank p＝0．031）
－皮膚メラノーマ（MSKCM）（HR＝0．912；logRank p＝0．043）。
さらに、FOLR2遺伝子シグネチャ（ただし、FOLR2発現単独ではない）は、以下においてより良好な生存と関連する。
－KIRC：腎明細胞癌
－LIHC：肝肝細胞癌。
【0155】
6．FOLR2＋マクロファージは、CD8＋T細胞浸潤腫瘍において富化され、がん全体にわたってリンパ系凝集体と共局在する。
さらなる機能的洞察を得るために、以前に定められたFOLR2遺伝子シグネチャ（FOLR2／SLC40A1／SEPP1）またはFOLR2発現を次に単独で使用して、FOLR2＋マクロファージの存在量をTMEにおける他の免疫細胞型および間質細胞型と相関させた（図6A）。FOLR2遺伝子シグネチャ（またはFOLR2発現のみ）は、CD8＋T細胞、DC、B細胞および三次リンパ系構造のような抗腫瘍免疫の既知のプレイヤーと正に相関することが見出された（図6A）。対照的に、CADM1＋TREM2遺伝子シグネチャ（TREM2／SPP1）またはTREM2発現単独は、T細胞、CD8＋T細胞、NKまたはB細胞と有意に相関しなかった（図6A）。さらに、バルク腫瘍トランスクリプトームにおけるFOLR2発現の最高レベルは、同じ腫瘍において、複数のリンパ球系統の協調的浸潤および三次リンパ系構造の遺伝子シグネチャと一致する（図6B）。対照的に、患者をTREM2転写物のレベルに従って層別化した場合、相関は見られなかった（図6B）。全腫瘍トランスクリプトームにおけるFOLR2（またはTREM2）発現と正に相関するすべての遺伝子に表される遺伝子経路を分析した。本発明者らの以前の知見を支持して、腫瘍におけるFOLR2発現と、TCRシグナル伝達、抗原プロセシングおよびPD－1シグナル伝達を含む様々な免疫経路との間の強い相関が見出された。CADM1＋TREM2＋TAMと比較してFOLR2＋TAMが富化された遺伝子経路も、このバルクRNAseqデータセットで分析した。FOLR2＋TAMで富化された遺伝子経路が、免疫応答調節の走化性および機能モジュールに関与することが見出された。全体として、これらの結果は、FOLR2＋マクロファージが抗腫瘍免疫の発症の根底にある免疫状況の一部であることを示唆している。
さらなる機能的洞察を得るために、以前に定められたFOLR2遺伝子シグネチャ（FOLR2／SLC40A1／SEPP1）またはFOLR2発現を次に単独で使用して、FOLR2＋マクロファージの存在量をTMEにおける他の免疫細胞型および間質細胞型と相関させた（図6A）。FOLR2遺伝子シグネチャ（またはFOLR2発現のみ）は、CD8＋T細胞、DC、B細胞および三次リンパ系構造のような抗腫瘍免疫の既知のプレイヤーと正に相関することが見出された（図6A）。対照的に、CADM1＋TREM2遺伝子シグネチャ（TREM2／SPP1）またはTREM2発現単独は、T細胞、CD8＋T細胞、NKまたはB細胞と有意に相関しなかった（図6A）。さらに、バルク腫瘍トランスクリプトームにおけるFOLR2発現の最高レベルは、同じ腫瘍において、複数のリンパ球系統の協調的浸潤および三次リンパ系構造の遺伝子シグネチャと一致する（図6B）。対照的に、患者をTREM2転写物のレベルに従って層別化した場合、相関は見られなかった（図6B）。全腫瘍トランスクリプトームにおけるFOLR2（またはTREM2）発現と正に相関するすべての遺伝子に表される遺伝子経路を分析した。本発明者らの以前の知見を支持して、腫瘍におけるFOLR2発現と、TCRシグナル伝達、抗原プロセシングおよびPD－1シグナル伝達を含む様々な免疫経路との間の強い相関が見出された。CADM1＋TREM2＋TAMと比較してFOLR2＋TAMが富化された遺伝子経路も、このバルクRNAseqデータセットで分析した。FOLR2＋TAMで富化された遺伝子経路が、免疫応答調節の走化性および機能モジュールに関与することが見出された。全体として、これらの結果は、FOLR2＋マクロファージが抗腫瘍免疫の発症の根底にある免疫状況の一部であることを示唆している。
【0156】
CD8＋T細胞は、乳がんを含む様々ながん型においてより良好な生存に関連することが示されているので（DeNardoら、2011）（Aliら、2014）（Pagesら、2018）、FOLR2＋マクロファージが腫瘍浸潤CD8＋T細胞と相互作用することを見出すことができるかどうかを調べた。腫瘍切除試料に対し共焦点顕微鏡法を使用して、CD31＋血管の近くに位置するFOLR2＋マクロファージがCD8＋T細胞凝集体と密接に関連していることが見出された。FOLR2＋マクロファージとCD8＋T細胞との間の空間的関連を確認するために、以前の組織マイクロアレイ患者コホートを、CD8とFOLR2の両方で染色し、それぞれの細胞密度を計算した。FOLR2マクロファージ高腫瘍病変は、FOLR2マクロファージ低病変よりも、有意に高いCD8＋T細胞密度を有していた（図6C）。重要なことに、腫瘍周囲間質内に見られるFOLR2＋マクロファージは、様々ながん型にわたってリンパ系凝集体が繰り返し富化されており、三次リンパ系構造の中でも検出することができた。まとめると、これらの結果は、間質関連FOLR2＋マクロファージががん全体にわたって保存されており、腫瘍巣付近のリンパ系構造の構造的構成要素であることを示している。これらのリンパ系構造は、進行中の免疫応答に関連する可能性が高い。
【0157】
FOLR2＋マクロファージがCD8＋T細胞と生産的に係合するかどうかをさらに調べるために、新鮮なヒトBC病変に対して共焦点ライブイメージングを実施した。腫瘍病変からの内因性CD8＋T細胞、FOLR2＋マクロファージおよびEPCAM＋腫瘍細胞を、CD8、FOLR2およびEPCAMに対する蛍光結合抗体で染色し、その後、細胞動態をタイムラプス顕微鏡法によって画像化した（図6D）。FOLR2＋マクロファージが腫瘍間質内に局在し、活性な膜ラッフルを有する固着細胞のネットワークを形成することが観察された。CD8＋T細胞の移動速度の定量化は、多かれ少なかれ運動性細胞を伴う不均一な挙動を示した。重要なことに、CD8＋T細胞はそれらの速度を低下させ、FOLR2＋マクロファージとの長期持続接触を確立したことが再現可能に見出された。これは、FOLR2欠乏腫瘍領域におけるCD8＋T細胞のより高い運動性とは対照的であった。CD8＋T細胞は、T細胞活性化を促進する可能性が高い挙動である、FOLR2＋マクロファージとの長期の相互作用を確立すると、結論付けられた。この結果と一致して、全腫瘍トランスクリプトームにおけるFOLR2の発現は、T細胞における細胞傷害機能を制御する遺伝子（GZMA、GZMB、GZMK、GFR1、KLRB1、KLRD1）と正の相関を示したが、LAG3のようなT細胞機能不全の遺伝子とは相関しなかった。TREM2発現は、CD8＋T細胞の細胞傷害機能を制御する遺伝子との有意な相関を示さなかった。
【0158】
肺の腫瘍間質または胸膜腔および腹膜腔のTAMは、T細胞が腫瘍に到達するのを隔離し、抗腫瘍免疫に悪影響を及ぼし得ることが以前に提唱されている（Peranzoniら、2018）（Chowら、Cancer Cell、2021、39、973～988）。他の研究では、抗原提示細胞とT細胞との間の長期持続性相互作用がT細胞活性化に先行し、したがってT細胞免疫を促進し得る（Huguesら、Nat．Immunol，2004，5，1235－1242）（Mempelら、Nature、2004、427、154～159）。CD8＋T細胞／マクロファージの相互作用がBCにおける好適な臨床転帰につながるかどうかを評価するために、CD8＋T細胞とマクロファージのサブセットとの間の細胞の相互作用の定量的空間分析を、T細胞浸潤腫瘍において行った。この目的のために、CD8＋T細胞の密度が50CD8＋T細胞／mm2よりも優れている約60人のBC患者由来の腫瘍の多重イメージングを行った。FOLR2＋マクロファージまたはTREM2＋マクロファージのいずれかと近接している（＜30μm）CD8＋T細胞の割合を定量化し、これらの2つのマクロファージサブセットと密接に接触しているCD8＋T細胞の割合「高」または「低」に従って、患者を層別化した。FOLR2＋マクロファージと密接に接触しているCD8＋T細胞の高い割合は、BC患者のより良好な転帰と関連しているが、これは、TREM2＋マクロファージと相互作用するCD8＋T細胞には当てはまらないことが見出された。したがって、腫瘍浸潤CD8＋T細胞はFOLR2＋マクロファージと能動的に係合し、この相互作用はCD8＋T細胞の活性化および患者の生存と正に相関すると結論付けられた。したがって、FOLR2＋マクロファージは、抗腫瘍免疫応答の発症に関連する定められたマクロファージ集団を表すと結論付けられた。
【0159】
7．FOLR2＋マクロファージはT細胞エフェクター分化を促進する
新生腫瘍は、TRMとの細胞クロストークに関与することが示されており、TRMはひいては腫瘍の成長、運動性および侵襲性を促進する（Cassetta and Pollard、2018）。PyMT BCマウスモデルを使用して、FOLR2＋マクロファージの機能的特徴を調査した。まず、健常な乳腺のFOLR2＋マクロファージが発達している腫瘍に応答するかどうかを問うた。この目的のために、バルクRNAseqを使用して、健常対小腫瘍または中腫瘍のマウスの乳腺から単離されたFOLR2＋マクロファージをプロファイリングした。1万個の最も可変的な遺伝子を使用した主成分（PC）分析は、乳房腫瘍から単離されたFOLR2＋マクロファージが、PC2軸の変動によって見られるように腫瘍のサイズに依存してそれらのトランスクリプトームプロファイルを変化させたことを示した。同じ腫瘍から単離されたFOLR2＋マクロファージとCADM1＋マクロファージとの間に6，139個のDEGが見出された。FOLR2＋マクロファージは、発達している腫瘍に応答するが、CADM1＋マクロファージから分離可能な細胞実体のままであると結論付けられた。乳房腫瘍FOLR2＋マクロファージと健常な乳腺FOLR2＋マクロファージとの間に1，356DEGが見られた（図7A）。これらのDEGの中でも、乳房腫瘍FOLR2＋マクロファージは、BおよびT細胞化学誘引物質（Ccl6から9、Ccl12、Cxcl2、Cxcl13、Cxcl14、Cxcl16）を含む免疫系プロセスの正の調節、接着分子（Icam1、Vcam1、Fn1）、およびリソソームタンパク質（Ctse、Rab32）に関与する遺伝子を発現した。対照的に、健常な乳腺から単離されたFOLR2＋マクロファージは、代謝過程を調節する遺伝子が豊富であった（Igf1、Srebf2、Abcd2）。したがって、これらのデータは、FOLR2＋TRMが腫瘍の発達に応答することを示している。
新生腫瘍は、TRMとの細胞クロストークに関与することが示されており、TRMはひいては腫瘍の成長、運動性および侵襲性を促進する（Cassetta and Pollard、2018）。PyMT BCマウスモデルを使用して、FOLR2＋マクロファージの機能的特徴を調査した。まず、健常な乳腺のFOLR2＋マクロファージが発達している腫瘍に応答するかどうかを問うた。この目的のために、バルクRNAseqを使用して、健常対小腫瘍または中腫瘍のマウスの乳腺から単離されたFOLR2＋マクロファージをプロファイリングした。1万個の最も可変的な遺伝子を使用した主成分（PC）分析は、乳房腫瘍から単離されたFOLR2＋マクロファージが、PC2軸の変動によって見られるように腫瘍のサイズに依存してそれらのトランスクリプトームプロファイルを変化させたことを示した。同じ腫瘍から単離されたFOLR2＋マクロファージとCADM1＋マクロファージとの間に6，139個のDEGが見出された。FOLR2＋マクロファージは、発達している腫瘍に応答するが、CADM1＋マクロファージから分離可能な細胞実体のままであると結論付けられた。乳房腫瘍FOLR2＋マクロファージと健常な乳腺FOLR2＋マクロファージとの間に1，356DEGが見られた（図7A）。これらのDEGの中でも、乳房腫瘍FOLR2＋マクロファージは、BおよびT細胞化学誘引物質（Ccl6から9、Ccl12、Cxcl2、Cxcl13、Cxcl14、Cxcl16）を含む免疫系プロセスの正の調節、接着分子（Icam1、Vcam1、Fn1）、およびリソソームタンパク質（Ctse、Rab32）に関与する遺伝子を発現した。対照的に、健常な乳腺から単離されたFOLR2＋マクロファージは、代謝過程を調節する遺伝子が豊富であった（Igf1、Srebf2、Abcd2）。したがって、これらのデータは、FOLR2＋TRMが腫瘍の発達に応答することを示している。
【0160】
腫瘍におけるマクロファージ活性化は、しばしば「炎症促進性／M1」対「抗炎症性／M2」と呼ばれる（Mantovaniら、2002）（Murrayら、Immunity、2014、41、14～20）。乳房腫瘍FOLR2＋およびCADM1＋マクロファージサブセットがそのような機能的特殊化を有するかどうかを検証するために、M1またはM2遺伝子シグネチャを定める遺伝子の発現を2つのマクロファージサブセットにおいて分析した（Aziziら、2018）。乳房腫瘍FOLR2＋およびCADM1＋マクロファージの両方が個々のM1およびM2遺伝子を同時に発現することが見出された。例えば、FOLR2＋マクロファージは、Cd80、Cd40およびIl6「M1遺伝子」およびCd163、Mrc1、Il10「M2遺伝子」を発現した。CADM1＋マクロファージは、Cd86、Cxcl9、Il12b「M1遺伝子」およびVegfa、Cd276、Tgfb3「M2遺伝子」を発現した。これは、腫瘍微小環境におけるマクロファージ活性化がインビトロM1／M2分極モデルと適合しないことを示し、腫瘍微小環境におけるマクロファージ活性化の複雑さを明らかにする。興味深いことに、乳房腫瘍FOLR2＋およびCADM1＋マクロファージサブセットは、T細胞活性化に関連し得る機能遺伝子の異なるセットを発現した。したがって、マクロファージサブセットのT細胞活性化能を直接検証するために、同じ腫瘍から単離し、CD8＋T細胞と共培養したFOLR2＋およびCADM1＋マクロファージを使用して、2つのアッセイを設定した。最初に、精製TAMをポリクローナル活性化CD8＋T細胞と共培養するT細胞抑制アッセイを設定した。ここで、FOLR2＋マクロファージは抑制活性を示さなかった。代わりに、FOLR2＋マクロファージは、CD8＋T細胞の増殖および分化を改善した（CD62Lの喪失ならびにCD44およびCD25の上方制御）。CADM1＋マクロファージもCD8＋T細胞活性化を抑制しなかったが、エフェクターT細胞分化を促進するそれらの能力はFOLR2＋マクロファージよりも弱かった。先行研究（Ruffell et al．，Cancer Cell，2014，26，623－627）（Katzenelenbogen et al．，Cell，2020，182，872－885）では、免疫抑制活性はMHCIINEG腫瘍関連骨髄細胞に制限されていた。代わりに、MHCII＋TAMはT細胞阻害を発揮しなかった。ここでは、CADM1＋およびFOLR2＋TAMの両方が、免疫抑制活性の欠如と一致して高レベルのMHCIIを発現することが示されている。どちらのFOLR2＋およびCADM1＋マクロファージもT細胞拡大を強く抑制しなかったので、抗原特異的T細胞プライミングアッセイを設定した。精製されたFOLR2＋およびCADM1＋マクロファージにOTI特異的SIINFEKLペプチドを負荷し、洗浄し、続いてナイーブOTI CD8＋T細胞と共培養した。同じ腫瘍から単離されたCADM1＋マクロファージと比較して、FOLR2＋マクロファージは、ナイーブT細胞の活性化、それらの増殖、それらの多機能性（IL－2、IFN－γ、TNF－α）および細胞傷害機能（グランザイムBの発現）を誘導するより高い能力を示した（図7B）。さらに、健常な乳腺から単離されたFOLR2＋マクロファージはOTI CD8＋T細胞を効率的に活性化しないが、乳房腫瘍から単離されたFOLR2＋マクロファージは、T細胞の拡大および分化を誘導できることが見出された（図7B）。これらの結果は、FOLR2＋マクロファージが腫瘍の発達中に活性化され、CD8＋T細胞をプライミングする能力を獲得することを確認する。要するに、これらの結果は、FOLR2＋マクロファージが免疫抑制細胞のようには挙動しないという証拠を提供する。代わりに、腫瘍関連FOLR2＋マクロファージは、CD8＋T細胞活性化を引き起こす機能的能力を示す強力な抗原提示細胞である。
【0161】
FOLR2マクロファージをマウス乳房腫瘍から精製し、OVAペプチドを負荷した。洗浄後、FOLR2マクロファージを抗OVAナイーブCD8T細胞と3日間共培養した。培養後3日目に、T細胞の活性化および増殖を測定した。FOLR2マクロファージは、CADM1マクロファージまたはOVA単独よりも高いT細胞活性化能を示す（図7C）。
【0162】
8．モデル抗原にカップリングされた抗FOLR2標的化抗体を使用するワクチン接種は、特異的CD8＋T細胞応答を誘発する
腫瘍抗原をFOLR2＋マクロファージに送達するために、CD8＋T細胞特異的OVAペプチド（SIINFEKL）に連結された抗FOLR2抗体を作製した（図8）。予備的データは、抗FOLR2－SIINFEKLによる免疫化が、養子移入されたOVA特異的OTI CD8＋T細胞の活性化を誘導することを示し、このアプローチの実現可能性を検証する（図8）。
腫瘍抗原をFOLR2＋マクロファージに送達するために、CD8＋T細胞特異的OVAペプチド（SIINFEKL）に連結された抗FOLR2抗体を作製した（図8）。予備的データは、抗FOLR2－SIINFEKLによる免疫化が、養子移入されたOVA特異的OTI CD8＋T細胞の活性化を誘導することを示し、このアプローチの実現可能性を検証する（図8）。
【0163】
考察
ヒト乳がんにおけるマクロファージ集団の表現型および機能的不均一性を理解するために、ヒトルミナル乳房腫瘍に浸潤する骨髄細胞の単一細胞アトラスを作成した。2つの表現型が異なるTAMサブセット、TREM2＋CADM1＋マクロファージおよびFOLR2＋マクロファージが同定された。浸潤が以前に最悪の臨床転帰に関連していた（Molgoraら、2020）TREM2＋マクロファージとは全く対照的に、FOLR2＋TAMの存在量はより良好な臨床転帰を予測することが示されている。さらに、FOLR2＋TAMは、がんにわたるTME内のリンパ球浸潤部位と空間的に関連していることが確立されている。
ヒト乳がんにおけるマクロファージ集団の表現型および機能的不均一性を理解するために、ヒトルミナル乳房腫瘍に浸潤する骨髄細胞の単一細胞アトラスを作成した。2つの表現型が異なるTAMサブセット、TREM2＋CADM1＋マクロファージおよびFOLR2＋マクロファージが同定された。浸潤が以前に最悪の臨床転帰に関連していた（Molgoraら、2020）TREM2＋マクロファージとは全く対照的に、FOLR2＋TAMの存在量はより良好な臨床転帰を予測することが示されている。さらに、FOLR2＋TAMは、がんにわたるTME内のリンパ球浸潤部位と空間的に関連していることが確立されている。
【0164】
FOLR2＋マクロファージ：好適な臨床転帰に関連するTRMのサブセット。
この研究では、ヒトおよびマウスの健常な乳腺の両方に存在する発展的に保存された組織常在性FOLR2＋マクロファージ集団が同定された。マウスでは、乳房TRMは出生後の乳腺の発達およびリモデリングを調節する（Gouon－Evansら、2002）（Van Nguyen and Pollard、2002）。ヒトFOLR2＋マクロファージは、MRC1およびLYVE1を発現し、健常な未経産マウスの成体乳腺で報告されているマウスMRC1＋TRMにアライメントする（Jappinenら、2019）（Wangら、2020）。MRC1＋TRMは、それぞれファートマッパーCsf1rMer－iCre－MerマウスまたはCx3cr1Cre－ERT2マウスにおけるE8．5またはE13．5での遺伝子標識によって実証されるように、胎児前駆体から生じる（Jappinenら、2019）。さらに、MRC1＋TRMは自己再生能力を示す（Wangら、2020）。MRC1＋TRMは乳腺の発達において重複しない機能を有する：Plvap－／－マウスにおけるMRC1＋TRM発達の阻害は、思春期の間の管形態形成を有意に損なう（Jappinenら、2019）。マウスでは、MRC1＋TRMは、管内局在化を備えたCX3CR1高MRC1－TRMの少量画分と共存する（Dawsonら、2020）。管内CX3CR1高MRC1－マクロファージは、成体単球から発達し、乳汁分泌によって課される組織リモデリング中に拡大する（Dawsonら、2020）。興味深いことに、ほとんどの乳房腫瘍浸潤マウスTAMは、恒常性管内CX3CR1高MRC1－TRMに転写的に整列する（Dawsonら、2020）。要するに、これらの知見は、乳腺TRMサブセット内の個体遺伝学的および機能的多様性を強調している（Ginhoux and Guilliams、2016）。
この研究では、ヒトおよびマウスの健常な乳腺の両方に存在する発展的に保存された組織常在性FOLR2＋マクロファージ集団が同定された。マウスでは、乳房TRMは出生後の乳腺の発達およびリモデリングを調節する（Gouon－Evansら、2002）（Van Nguyen and Pollard、2002）。ヒトFOLR2＋マクロファージは、MRC1およびLYVE1を発現し、健常な未経産マウスの成体乳腺で報告されているマウスMRC1＋TRMにアライメントする（Jappinenら、2019）（Wangら、2020）。MRC1＋TRMは、それぞれファートマッパーCsf1rMer－iCre－MerマウスまたはCx3cr1Cre－ERT2マウスにおけるE8．5またはE13．5での遺伝子標識によって実証されるように、胎児前駆体から生じる（Jappinenら、2019）。さらに、MRC1＋TRMは自己再生能力を示す（Wangら、2020）。MRC1＋TRMは乳腺の発達において重複しない機能を有する：Plvap－／－マウスにおけるMRC1＋TRM発達の阻害は、思春期の間の管形態形成を有意に損なう（Jappinenら、2019）。マウスでは、MRC1＋TRMは、管内局在化を備えたCX3CR1高MRC1－TRMの少量画分と共存する（Dawsonら、2020）。管内CX3CR1高MRC1－マクロファージは、成体単球から発達し、乳汁分泌によって課される組織リモデリング中に拡大する（Dawsonら、2020）。興味深いことに、ほとんどの乳房腫瘍浸潤マウスTAMは、恒常性管内CX3CR1高MRC1－TRMに転写的に整列する（Dawsonら、2020）。要するに、これらの知見は、乳腺TRMサブセット内の個体遺伝学的および機能的多様性を強調している（Ginhoux and Guilliams、2016）。
【0165】
ここで、FOLR2＋マクロファージは、マウスMRC1＋乳房TRMのヒトオルソログとして同定された。ヒトFOLR2＋マクロファージは、健常な乳房組織における主要なマクロファージ集団を表すことが見出された。これは、FOLR2＋マクロファージを真正乳腺常在マクロファージと定める。対照的に、CADM1＋TREM2＋マクロファージは健常な組織では少なく、転移性LNおよび原発性腫瘍が増加することが示されている。ヒトCADM1＋TREM2＋マクロファージがマウスCX3CR1高MRC1－TAMとアライメントすることが示されている。これらの知見は、複数のがん型においてTREM2＋マクロファージを同定した最近の研究と一致している（Molgoraら、2020）。CADM1＋TREM2＋マクロファージの浸潤は、腫瘍病変に局所的に引き付けられる循環性の単球の流入に依存する可能性が高い。この見解を支持して、ヒトCADM1＋TREM2＋マクロファージのこのバルクRNAseq分析は、CCR2＋単球に対する転写の近さを実証する。
【0166】
TRMは発癌時に特定の機能を有するか？最近の研究では、マウスTRMの腫瘍形成促進活性が報告されている。例えば、胚由来線維化促進性TRMの枯渇は、膵管腺癌マウスモデルにおける腫瘍病変の進行を遅延させる（Zhuら、2017）。しかしながら、このことが全生存に影響を及ぼすかどうかは知られていない。また、卵巣がんにおけるCD163＋TRMの枯渇は、上皮から間葉への移行および全体的な腫瘍の増殖を減少させる（Etzerodtら、2020）。マウスPyMT乳がんでは、Franklinらは、健常な乳腺に存在するMRC1＋TRMが、入ってくる単球由来TAMによる希釈にもかかわらず、マウス乳腺腺癌の発症において持続することを示した（Franklinら、2014）。膵臓がんおよび卵巣がんに見られるTRMの腫瘍形成促進機能は、MRC1＋TRMが単球由来NOTCH依存性TAMよりも免疫抑制性が低い乳がんには適用されないようである（Franklinら、2014）（Kitamuraら、2018）。発癌前のMRC1＋TRM枯渇は、初期のがん細胞播種に対する効果にもかかわらず、自己のMMTV－PyMTまたはMMTV－Her2マウスモデルにおいて腫瘍の増殖に影響を及ぼさなかった（Franklinら、2014）（Lindeら、2018）（Lindeら、2018）。
【0167】
ヒトでは、単球由来TAMとTRMとを区別する特異的マーカーの欠如は、これまでのところ、それらの機能の評価を妨げている。この知識のギャップに対処するために、腫瘍内のマクロファージサブセットの慎重な同定を可能にする特定の遺伝子シグネチャおよび表面マーカーが定められている。乳がんにおけるFOLR2＋マクロファージと臨床転帰との関連を調べるために、乳がんバルクトランスクリプトームにおけるFOLR2＋マクロファージ存在量を推測することを可能にする遺伝子シグネチャを設計した。FOLR2＋マクロファージの存在量は、より良好な予後と関連するが、CADM1＋TREM2＋マクロファージの存在量は関連しないことが見出された。FOLR2シグネチャは、少なくとも6つの他のがんにおけるより良好な生存を予測する。122人の乳がん患者の後ろ向きコホートにおけるFOLR2＋マクロファージの密度が生存率の増加と相関することを示すこのin silico所見の検証が得られた。まとめると、これらの結果は、好適な転帰のバイオマーカーとしてのFOLR2＋マクロファージを確立する。
【0168】
血管周囲マクロファージの機能的多様性。
FOLR2＋マクロファージは、定常状態の血管周囲（PV）マクロファージの転写シグネチャを示すことが観察された（LYVE1、MRC1、TIMD4、MAF）。したがって、いくつかのFOLR2＋マクロファージがCD31＋の血管に近接して位置することが見出された。マウスでは、様々な研究により、肺および皮膚（Chakarovら、2019）、脳（Goldmannら、2016）（Sgら、2020）、動脈壁（Limら、2018）、乳腺（Jappinenら、2019）および脾臓（MebiusおよびKraal、2005）を含む臓器にわたるPVマクロファージが同定されている。しかしながら、ヒトPVマクロファージの表現型についてはあまり知られていない（Lapennaら、2018）。
FOLR2＋マクロファージは、定常状態の血管周囲（PV）マクロファージの転写シグネチャを示すことが観察された（LYVE1、MRC1、TIMD4、MAF）。したがって、いくつかのFOLR2＋マクロファージがCD31＋の血管に近接して位置することが見出された。マウスでは、様々な研究により、肺および皮膚（Chakarovら、2019）、脳（Goldmannら、2016）（Sgら、2020）、動脈壁（Limら、2018）、乳腺（Jappinenら、2019）および脾臓（MebiusおよびKraal、2005）を含む臓器にわたるPVマクロファージが同定されている。しかしながら、ヒトPVマクロファージの表現型についてはあまり知られていない（Lapennaら、2018）。
【0169】
マウスモデルにおいて、アンジオポエチン受容体TIE2を発現するPVマクロファージの腫瘍形成促進性サブセットは、血管形成および腫瘍拡大に関与している（Lewisら、2016）（De Palmaら、2005）（Pucciら、2009）。機構的には、TIE2＋PVマクロファージは、血管壁の透過化を促進する腫瘍血管の密着した結合を減少させることによって腫瘍細胞の血管内侵入および転移を促進するVEGFAを放出する（Harneyら、2015）。TIE2＋P Vマクロファージは、TIE2受容体に係合する内皮由来アンジオポエチン2（ANG2）に応答し、それによってPV位置決めおよび血管新生促進機能を支援する（Mazzieriら、2011）。この研究に記載されているFOLR2＋PVマクロファージがTIE2＋PVマクロファージとアライメントするかどうかは不明である。この仮説は2つの理由で支持されなかった。第1に、FOLR2＋マクロファージの単一細胞およびバルクRNAseq分析におけるTIE2の発現を実証することは不可能であった。第2に、TIE2＋PVマクロファージの個体発生は、血管新生促進性TIE2＋単球の特殊化されたサブセットの進行性浸潤に依存する（De Palmaら、2005）（Pucciら、2009）（Coffeltら、2010）（Arwertら、2018）。これは、FOLR2＋マクロファージがTRMであることを証明するこれらのデータとは対照的である。したがって、PVマクロファージの不均一性を解きほぐすためのさらなる実験的努力が必要である。
【0170】
リンパ球浸潤および抗腫瘍免疫の促進におけるFOLR2＋マクロファージの役割
最近の研究では、ヒト肝細胞癌に関連し、胎児肝マクロファージに似ているFOLR2＋TRMのサブセットが同定されている（Sharmaら、2020）。肝臓のFOLR2＋マクロファージにおけるCD86発現は、それらがCTLA4＋調節性T細胞と相互作用している可能性があることを示唆している。乳がんにおけるFOLR2＋マクロファージの機能を調べるために、この遺伝子シグネチャを使用して、バルク腫瘍マイクロアレイにおけるFOLR2＋マクロファージ存在量を推測し、それを他の免疫細胞の浸潤と相関させた。FOLR2＋マクロファージの浸潤は、TREM2＋マクロファージ浸潤とは対照的に、CD8＋T細胞、B細胞およびDCを含む腫瘍浸潤リンパ球と正に相関することが見出された。さらに、共焦点イメージングによって、FOLR2＋マクロファージが内皮細胞の近傍でCD8＋T細胞凝集体と共局在することが見出された。FOLR2とCD8＋T細胞存在量との間の相関をマルチスペクトルイメージングによって検証した。FOLR2＋マクロファージが高度に浸潤した腫瘍の病変は、有意に高いCD8＋T細胞密度を有していた。CD8＋T細胞浸潤は、乳がんを含む多くのがんにおけるより良好な生存確率と相関するので（DeNardoら、2011）（Aliら、2014）、これらの結果は、FOLR2＋マクロファージが抗腫瘍免疫の発症に関与することを示唆する。FOLR2＋マクロファージは、胎児の肝臓、胎盤、結腸を含むヒトの組織で報告されている（Samaniegoら、2014）（Sharmaら、2020）（Thomasら、2021）。ここで、これらの観察結果は、健常な乳腺および乳がんならびに複数の他のがん型において拡張された。重要なことに、FOLR2＋マクロファージと腫瘍周囲間質リンパ系凝集体との会合は、複数のがん型で見られる。いくつかの例では、B細胞およびT細胞を含む組織化された三次リンパ系構造に浸潤するFOLR2＋マクロファージが本明細書にて報告される。マウスPVマクロファージは、炎症の間のリンパ球浸潤（Natsuakiら、2014）および自己免疫（Mohanら、2017）の、可能性のある調節因子として、記載されている。FOLR2＋マクロファージは、T細胞を引き付けるケモカインを直接送達することによって（Dangajら、2019）、または炎症性サイトカインを内皮細胞に送達するかまたは増殖因子を周皮細胞に送達することによって間接的に（Minuttiら、2019）、様々な機序によって、CD8＋T細胞の浸潤を調節することができると仮定することができる。FOLR2＋マクロファージが腫瘍におけるリンパ球浸潤を調節する機構、効率的な抗腫瘍免疫応答の開発のための重要な事象を同定するために、さらなる研究が必要である。この研究は、腫瘍関連マクロファージサブセットの拮抗的な役割を強調し、マクロファージベースのがん治療におけるサブセット特異的な治療的介入の道を開く。
最近の研究では、ヒト肝細胞癌に関連し、胎児肝マクロファージに似ているFOLR2＋TRMのサブセットが同定されている（Sharmaら、2020）。肝臓のFOLR2＋マクロファージにおけるCD86発現は、それらがCTLA4＋調節性T細胞と相互作用している可能性があることを示唆している。乳がんにおけるFOLR2＋マクロファージの機能を調べるために、この遺伝子シグネチャを使用して、バルク腫瘍マイクロアレイにおけるFOLR2＋マクロファージ存在量を推測し、それを他の免疫細胞の浸潤と相関させた。FOLR2＋マクロファージの浸潤は、TREM2＋マクロファージ浸潤とは対照的に、CD8＋T細胞、B細胞およびDCを含む腫瘍浸潤リンパ球と正に相関することが見出された。さらに、共焦点イメージングによって、FOLR2＋マクロファージが内皮細胞の近傍でCD8＋T細胞凝集体と共局在することが見出された。FOLR2とCD8＋T細胞存在量との間の相関をマルチスペクトルイメージングによって検証した。FOLR2＋マクロファージが高度に浸潤した腫瘍の病変は、有意に高いCD8＋T細胞密度を有していた。CD8＋T細胞浸潤は、乳がんを含む多くのがんにおけるより良好な生存確率と相関するので（DeNardoら、2011）（Aliら、2014）、これらの結果は、FOLR2＋マクロファージが抗腫瘍免疫の発症に関与することを示唆する。FOLR2＋マクロファージは、胎児の肝臓、胎盤、結腸を含むヒトの組織で報告されている（Samaniegoら、2014）（Sharmaら、2020）（Thomasら、2021）。ここで、これらの観察結果は、健常な乳腺および乳がんならびに複数の他のがん型において拡張された。重要なことに、FOLR2＋マクロファージと腫瘍周囲間質リンパ系凝集体との会合は、複数のがん型で見られる。いくつかの例では、B細胞およびT細胞を含む組織化された三次リンパ系構造に浸潤するFOLR2＋マクロファージが本明細書にて報告される。マウスPVマクロファージは、炎症の間のリンパ球浸潤（Natsuakiら、2014）および自己免疫（Mohanら、2017）の、可能性のある調節因子として、記載されている。FOLR2＋マクロファージは、T細胞を引き付けるケモカインを直接送達することによって（Dangajら、2019）、または炎症性サイトカインを内皮細胞に送達するかまたは増殖因子を周皮細胞に送達することによって間接的に（Minuttiら、2019）、様々な機序によって、CD8＋T細胞の浸潤を調節することができると仮定することができる。FOLR2＋マクロファージが腫瘍におけるリンパ球浸潤を調節する機構、効率的な抗腫瘍免疫応答の開発のための重要な事象を同定するために、さらなる研究が必要である。この研究は、腫瘍関連マクロファージサブセットの拮抗的な役割を強調し、マクロファージベースのがん治療におけるサブセット特異的な治療的介入の道を開く。
【0171】
【表1】
【0172】
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【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【図2-5】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
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【図3-5】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図4-4】
【図4-5】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7-1】
【図7-2】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】