特表 2024-513972 ＲＮＡサイレンシング剤および使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-27

(54)【発明の名称】ＲＮＡサイレンシング剤および使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20240319BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240319BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240319BHJP

   C07H 21/00 20060101ALI20240319BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20240319BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

A61K31/7088

A61K48/00

A61P43/00 105

C07H21/00

A61K47/54

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023562698

(86)(22)【出願日】2022-04-13

(85)【翻訳文提出日】2023-11-22

(86)【国際出願番号】 US2022024692

(87)【国際公開番号】W WO2022221457

(87)【国際公開日】2022-10-20

(31)【優先権主張番号】63/174,507

(32)【優先日】2021-04-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523033006

【氏名又は名称】エーダーエックス ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】リー， ジェン

(72)【発明者】

【氏名】ジョウ， ジーチン

【テーマコード（参考）】

4C057

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C057BB02

4C057CC03

4C057DD01

4C057MM01

4C057MM09

4C076AA95

4C076CC41

4C076CC50

4C076DD66

4C076EE59

4C076FF70

4C084AA13

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZB21

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA13

4C086NA14

4C086ZB21

(57)【要約】

本開示の局面は、標的ＲＮＡの発現を減少させるための核酸を提供する。一部の局面において、本開示は、ＲＮＡ干渉のための核酸の設計において有用な、核酸改変および塩基対合構成を提供する。本開示は、ＲＮＡサイレンシング剤の設計において有用であり得る核酸設計戦略を提供し、標的ＲＮＡレベルの有効な減少が、その１４位ヌクレオチドとその標的ＲＮＡとの間にゆらぎ塩基対合を媒介するように構成されたアンチセンス鎖を使用して達成され得るという発見に関連する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的ｍＲＮＡの発現を減少させるための核酸であって、
該標的ｍＲＮＡの連続する配列と少なくとも９０％相補的である配列を有する１５ヌクレオチド長～３１ヌクレオチド長のアンチセンス鎖
を含み、該アンチセンス鎖の配列はその５’末端から１４位に脱塩基部位を含むか、または該アンチセンス鎖の配列は、その５’末端から１４位に、該標的ｍＲＮＡの連続する配列上の対応する位置にある標的ヌクレオチドとは標準的塩基対を形成しないヌクレオチドを含む、核酸。

【請求項2】

前記標的ヌクレオチドがシチジンまたはグアノシンのいずれかを含む、請求項１に記載の核酸。

【請求項3】

前記アンチセンス鎖上の１４位にあるヌクレオチドと前記標的ヌクレオチドとがミスマッチ塩基対を含む、請求項１または２に記載の核酸。

【請求項4】

前記ミスマッチ塩基対がゆらぎ塩基対である、請求項３に記載の核酸。

【請求項5】

前記アンチセンス鎖上の１４位にあるヌクレオチドが前記標的ヌクレオチドとゆらぎ塩基対を形成する、請求項１または２に記載の核酸。

【請求項6】

前記アンチセンス鎖上の１４位にあるヌクレオチドがイノシンまたはウリジンのいずれかを含む、請求項４または５に記載の核酸。

【請求項7】

前記ゆらぎ塩基対がＩ：ＣまたはＵ：Ｇである、請求項４～６のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項8】

前記標的ヌクレオチドがシチジンを含む場合に、前記アンチセンス鎖上の１４位にあるヌクレオチドがイノシンを含むか、または
前記標的ヌクレオチドがグアノシンを含む場合に、前記アンチセンス鎖上の１４位にあるヌクレオチドがウリジンを含む、
請求項４～７のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項9】

前記アンチセンス鎖が少なくとも１個の改変型ヌクレオチドおよび／または少なくとも１個の改変型ヌクレオチド間結合を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項10】

前記アンチセンス鎖が、２’－アミノエチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸から選択される１個または複数個のヌクレオシド改変を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項11】

前記アンチセンス鎖が少なくとも１個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項12】

前記アンチセンス鎖が１５ヌクレオチド長～２５ヌクレオチド長である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項13】

前記アンチセンス鎖が１９ヌクレオチド長～２５ヌクレオチド長である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項14】

前記アンチセンス鎖が２１ヌクレオチド長である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項15】

前記アンチセンス鎖の配列が表１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項16】

１５ヌクレオチド長～４０ヌクレオチド長のセンス鎖をさらに含み、該センス鎖は前記アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項17】

前記二重鎖領域が、前記センス鎖上のヌクレオチドと前記アンチセンス鎖上の１４位にあるヌクレオチドとの間に標準的塩基対合または非標準的塩基対合を含む、請求項１６に記載の核酸。

【請求項18】

前記アンチセンス鎖上の１４位にあるヌクレオチドがイノシンを含む場合に、前記センス鎖上のヌクレオチドがシチジン、アデノシン、もしくはウリジンを含むか、または
前記アンチセンス鎖上の１４位にあるヌクレオチドがウリジンを含む場合に、前記センス鎖上のヌクレオチドがアデノシンを含む、
請求項１７に記載の核酸。

【請求項19】

前記センス鎖が少なくとも１個の改変型ヌクレオチドおよび／または少なくとも１個の改変型ヌクレオチド間結合を含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項20】

前記センス鎖が、２’－アミノエチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸から選択される１個または複数個のヌクレオシド改変を含む、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項21】

前記センス鎖が少なくとも１個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項22】

前記センス鎖が少なくとも１個のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分に結合されている、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項23】

前記アンチセンス鎖の配列が、前記ゆらぎ塩基対を形成するヌクレオチドを除いて、前記標的ｍＲＮＡの連続する配列と１００％相補的である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項24】

標的ｍＲＮＡの発現を減少させるための核酸であって、
式（Ｉ）：
５’－Ｘ^０１Ｘ^０２Ｘ^０３Ｘ^０４Ｘ^０５Ｘ^０６Ｘ^０７Ｘ^０８Ｘ^０９Ｘ^１０Ｘ^１１Ｘ^１２Ｘ^１３Ｘ^１４（Ｘ^Ｙ）_ｂＮ_ａ－３’（Ｉ）
のアンチセンス鎖
を含み、
ＮおよびＸ^Ｙのそれぞれは独立して任意の型のヌクレオチドであり；
ａは、０～２の整数であり；
ｂは、１～１７の整数であり；
Ｘ^０１～Ｘ^１３は各々が独立して任意の型のヌクレオチドであり、ただし、Ｘ^０１～（Ｘ^Ｙ）_ｂは該標的ｍＲＮＡの連続するヌクレオチド配列と少なくとも９０％相補的であり；
Ｘ^１４は脱塩基部位であるか、またはＸ^１４は、該標的ｍＲＮＡの連続するヌクレオチド配列上の対応する位置にある標的ヌクレオチドとは標準的塩基対を形成しないヌクレオチドである、
核酸。

【請求項25】

前記標的ヌクレオチドがシチジンまたはグアノシンのいずれかを含む、請求項２４に記載の核酸。

【請求項26】

Ｘ^１４と前記標的ヌクレオチドとがミスマッチ塩基対を含む、請求項２４または２５に記載の核酸。

【請求項27】

前記ミスマッチ塩基対がゆらぎ塩基対である、請求項２６に記載の核酸。

【請求項28】

Ｘ^１４が、前記標的ヌクレオチドとゆらぎ塩基対を形成するヌクレオチドである、請求項２４または２５に記載の核酸。

【請求項29】

Ｘ^１４がイノシンまたはウリジンのいずれかを含む、請求項２７または２８に記載の核酸。

【請求項30】

前記ゆらぎ塩基対がＩ：ＣまたはＵ：Ｇである、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項31】

前記標的ヌクレオチドがシチジンを含む場合にＸ^１４がイノシンを含むか、または
前記標的ヌクレオチドがグアノシンを含む場合にＸ^１４がウリジンを含む、
請求項２７～３０のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項32】

前記アンチセンス鎖が少なくとも１個の改変型ヌクレオチドおよび／または少なくとも１個の改変型ヌクレオチド間結合を含む、請求項２４～３１のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項33】

前記アンチセンス鎖が、２’－アミノエチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸から選択される１個または複数個のヌクレオシド改変を含む、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項34】

前記アンチセンス鎖が少なくとも１個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項２４～３３のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項35】

ａが０である、請求項２４～３４のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項36】

ｂが、１～１１の整数である、請求項２４～３５のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項37】

ｂが、５～１１の整数である、請求項２４～３６のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項38】

ｂが７である、請求項２４～３７のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項39】

Ｘ^０１～（Ｘ^Ｙ）_ｂの配列が表１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である、請求項２４～３８のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項40】

１５ヌクレオチド長～４０ヌクレオチド長のセンス鎖をさらに含み、該センス鎖は前記アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成する、請求項２４～３９のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項41】

前記二重鎖領域が、前記センス鎖上のヌクレオチドとＸ^１４との間に標準的塩基対合または非標準的塩基対合を含む、請求項４０に記載の核酸

【請求項42】

Ｘ^１４がイノシンを含む場合に前記センス鎖上のヌクレオチドがシチジン、アデノシン、もしくはウリジンを含むか、または
Ｘ^１４がウリジンを含む場合に前記センス鎖上のヌクレオチドがアデノシンを含む、
請求項４１に記載の核酸。

【請求項43】

前記二重鎖領域がどのＮの場合も除く、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項44】

前記センス鎖が少なくとも１個の改変型ヌクレオチドおよび／または少なくとも１個の改変型ヌクレオチド間結合を含む、請求項４０～４３のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項45】

前記センス鎖が、２’－アミノエチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸から選択される１個または複数個のヌクレオシド改変を含む、請求項４０～４４のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項46】

前記センス鎖が少なくとも１個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項47】

前記センス鎖が少なくとも１個のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分に結合されている、請求項４０～４６のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項48】

前記アンチセンス鎖が式（ＩＩ）：
５’－Ｘ^０１Ｘ^０２Ｘ^０３Ｘ^０４Ｘ^０５Ｘ^０６Ｘ^０７Ｘ^０８Ｘ^０９Ｘ^１０Ｘ^１１Ｘ^１２Ｘ^１３Ｘ^１４Ｘ^１５Ｘ^１６Ｘ^１７Ｘ^１８Ｘ^１９Ｘ^２０Ｘ^２１－３’（ＩＩ）、
のアンチセンス鎖であり、
Ｘ^０１～Ｘ^１３およびＸ^１５～Ｘ^２１は各々が独立して任意の型のヌクレオチドであり、ただし、Ｘ^０１～Ｘ^２１は、前記標的ｍＲＮＡの連続するヌクレオチド配列と少なくとも９０％相補的であり；
Ｘ^１４が、イノシンまたはウリジンを含むヌクレオチドである、
請求項２４～４７のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項49】

先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸と対イオンとを含む、組成物。

【請求項50】

先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸と薬学的に受容可能なキャリアとを含む、組成物。

【請求項51】

細胞における標的ｍＲＮＡの発現を減少させる方法であって、
該細胞を請求項１～５０のいずれか一項に記載の核酸または組成物と接触させる工程
を含む、方法。

【請求項52】

前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記細胞がインビボにある、請求項５１または５２に記載の方法。

【請求項54】

前記細胞がインビトロにある、請求項５１または５２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年４月１３日に出願された米国特許仮出願第６３／１７４，５０７号に基づく米国特許法第１１９条（ｅ）の下での優先権を主張する。この米国特許仮出願は、参照によってその全体が本明細書によって援用される。

【0002】

（テキストファイルとして提出された配列表に対する参照）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで提出され参照によってその全体が本明細書によって援用される、配列表を含む。２０２２年４月１２日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、Ａ１２７８７０００７ＷＯ００－ＳＥＱ－ＪＩＢという名前であり、サイズは１０，１９２バイトである。

【背景技術】

【0003】

（背景）
ＲＮＡ干渉 （ＲＮＡｉ）の分野は、近年かなりの関心を受けている。その理由は、ＲＮＡサイレンシング剤が、高い程度の配列特異性を有する特定のタンパク質の発現をノックダウンする能力を提供するからである。ＲＮＡｉは、科学研究において、例えば、遺伝的経路および生化学的経路を研究するため、個々の遺伝子および遺伝子産物の機能を解明するため、および製薬産業における標的確認のための道具として、有用であってきた。さらに、かなりの努力が、治療戦略としてＲＮＡを媒介可能なＲＮＡサイレンシング剤を開発することを目標として行われている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

（要旨）
数ある局面の中で、本開示は、ＲＮＡサイレンシング剤の設計において有用であり得る核酸設計戦略を提供する。一部の局面において、本開示は、標的ＲＮＡレベルの有効な減少が、その１４位ヌクレオチドとその標的ＲＮＡとの間にゆらぎ塩基対合を媒介するように構成されたアンチセンス鎖を使用して達成され得るという、発見に関連する。したがって、一部の局面において、本開示は、その５’末端から１４位に、その標的ｍＲＮＡ上の対応する位置にある標的ヌクレオチドとゆらぎ塩基対を形成するヌクレオチドを有する、アンチセンス鎖を含む核酸を提供する。

【0005】

一部の局面において、本開示は、標的ｍＲＮＡの発現を減少させるための核酸を提供し、その核酸は、その標的ｍＲＮＡの連続する配列と少なくとも９０％相補的である配列を有する１５ヌクレオチド長～３１ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を含み、そのアンチセンス鎖の配列はその５’末端から１４位に脱塩基部位を含むか、またはそのアンチセンス鎖の配列は、その５’末端から１４位に、その標的ｍＲＮＡの連続する配列上の対応する位置にある標的ヌクレオチドとは標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）（例えば、ワトソン－クリック）塩基対を形成しないヌクレオチドを含む。

【0006】

一部の実施形態において、アンチセンス鎖上の１４位にあるヌクレオチドと、標的ｍＲＮＡ上の対応する位置にある標的ヌクレオチドとは、ミスマッチしている（例えば、そのヌクレオチドは、ミスマッチ塩基対（例えば、ゆらぎ塩基対）を形成する）。一部の実施形態において、そのミスマッチ塩基対はゆらぎ塩基対である。例えば、一部の実施形態において、アンチセンス鎖上の１４位にあるヌクレオチドは、標的ヌクレオチドとゆらぎ塩基対を形成する。一部の実施形態において、標的ヌクレオチドはシチジンまたはグアノシンのいずれかを含む。一部の実施形態において、アンチセンス鎖上の１４位にあるヌクレオチドはイノシンまたはウリジンのいずれかを含む。一部の実施形態において、ゆらぎ塩基対はＩ：ＣまたはＵ：Ｇである。一部の実施形態において、標的ヌクレオチドがシチジンを含む場合に、アンチセンス鎖上の１４位にあるヌクレオチドはイノシンを含む。一部の実施形態において、標的ヌクレオチドがグアノシンを含む場合に、アンチセンス鎖上の１４位にあるヌクレオチドはウリジンを含む。

【0007】

一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、少なくとも１個の改変型ヌクレオチドおよび／または少なくとも１個の改変型ヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、２’－アミノエチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（ａｒａｂｉｎｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）から選択される１個または複数個のヌクレオシド改変を含む。ヌクレオシド改変のさらなる例が本明細書中の他の箇所に記載され、ヌクレオシド改変のさらなる例としては、改変型糖（例えば、糖（例えば、リボース）に対する２’－Ｏ置換（２’－Ｏ－メトキシエチル糖が挙げられる）、２’－フルオロ糖改変（２’－フルオロ）、２’－Ｏ－メチル糖（２’－Ｏ－メチル）、２’－Ｏ－エチル糖、２’－Ｃｌ、２’－ＳＨ、およびそれらの置換（例えば、２’－ＳＣＨ_３）、二環式糖部分）、あるいは置換（例えば、低級アルキルもしくはその置換（例えば、－ＣＨ_３、－ＣＦ_３）による２’－Ｏ部分の置換、２’－アミノもしくはその置換による２’－Ｏ部分の置換、２’，３’－セコヌクレオチド模倣物、２’－Ｆ－アラビノヌクレオチド、逆方向（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）ヌクレオチド、逆方向（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－Ｏ－デオキシヌクレオチド、アルケニルによる２’－Ｏ部分の置換、アルキニルによる２’－Ｏ部分の置換、メトキシエチルによる２’－Ｏ部分の置換（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、（ＤＮＡ中のような）－Ｈによる２’－Ｏ部分の置換、または他の置換基による２’－Ｏ部分の置換が挙げられるが、それらに限定はされない。一部の実施形態において、アンチセンス鎖は少なくとも１個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態において、アンチセンス鎖の配列は、ゆらぎ塩基対を形成するヌクレオチドを除いて、標的ｍＲＮＡの連続する配列と１００％相補的である。

【0008】

一部の実施形態において、アンチセンス鎖は１５ヌクレオチド長～２５ヌクレオチド長（例えば、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、または２５ヌクレオチド長）である。一部の実施形態において、アンチセンス鎖は１９ヌクレオチド長～２５ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、アンチセンス鎖は２１ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、アンチセンス鎖の配列は表１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である。一部の実施形態において、アンチセンス鎖の配列は表１のヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一（例えば、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または１００％同一）である。一部の実施形態において、アンチセンス鎖の配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、および５０のいずれか一つと少なくとも８０％同一である。一部の実施形態において、アンチセンス鎖の配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、および５０のいずれか一つと少なくとも８５％同一（例えば、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または１００％同一）である。

【0009】

一部の実施形態において、核酸は、１５ヌクレオチド長～４０ヌクレオチド長（例えば、１５ヌクレオチド長～３５ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長～３０ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長～２５ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長～３０ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長～２５ヌクレオチド長、または２５ヌクレオチド長～３０ヌクレオチド長）のセンス鎖をさらに含む。一部の実施形態において、センス鎖は、アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成する。一部の実施形態において、二重鎖領域は、センス鎖上のヌクレオチドとアンチセンス鎖上の１４位にあるヌクレオチドとの間に標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）塩基対合または非標準的（ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ）塩基対合を含む。一部の実施形態において、アンチセンス鎖上の１４位にあるヌクレオチドがイノシンを含む場合に、センス鎖上のヌクレオチドはシチジン、アデノシン、またはウリジンを含む。一部の実施形態において、アンチセンス鎖上の１４位にあるヌクレオチドがウリジンを含む場合に、センス鎖上のヌクレオチドはアデノシンを含む。一部の実施形態において、センス鎖の配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、および４９のいずれか一つと少なくとも８０％同一である。一部の実施形態において、センス鎖の配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、および４９のいずれか一つと少なくとも８５％同一（例えば、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または１００％同一）である。

【0010】

一部の実施形態において、センス鎖は少なくとも１個の改変型ヌクレオチドおよび／または少なくとも１個の改変型ヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態において、センス鎖は、２’－アミノエチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（ａｒａｂｉｎｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）から選択される１個または複数個のヌクレオシド改変を含む。ヌクレオシド改変および改変型ヌクレオチドのさらなる例が、本明細書中の他の箇所に記載される。一部の実施形態において、センス鎖は少なくとも１個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態において、センス鎖は少なくとも１個のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分に結合されている。

【0011】

一部の局面において、本開示は、標的ｍＲＮＡの発現を減少させるための核酸を提供し、その核酸は、式（Ｉ）：
５’－Ｘ^０１Ｘ^０２Ｘ^０３Ｘ^０４Ｘ^０５Ｘ^０６Ｘ^０７Ｘ^０８Ｘ^０９Ｘ^１０Ｘ^１１Ｘ^１２Ｘ^１３Ｘ^１４（Ｘ^Ｙ）_ｂＮ_ａ－３’（Ｉ）
のアンチセンス鎖を含み、ＮおよびＸ^Ｙのそれぞれは独立して任意の型のヌクレオチドであり；ａは、０～２の整数であり；ｂは、１～１７の整数であり；
Ｘ^０１～Ｘ^１３は各々が独立して任意の型のヌクレオチドであり、ただし、Ｘ^０１～（Ｘ^Ｙ）_ｂは標的ｍＲＮＡの連続するヌクレオチド配列と少なくとも９０％相補的であり；Ｘ^１４は脱塩基部位であるか、またはＸ^１４は、標的ｍＲＮＡの連続するヌクレオチド配列上の対応する位置にある標的ヌクレオチドとは標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）（例えば、ワトソン－クリック）塩基対を形成しないヌクレオチドである。

【0012】

一部の実施形態において、式（Ｉ）の「Ｘ」ヌクレオチドとは、本明細書中の他の箇所に記載される、標的ｍＲＮＡと相補性の領域を形成するヌクレオチドを示す。一部の実施形態において、式（Ｉ）の「Ｎ」ヌクレオチドとは、その相補性の領域の外側にある任意選択ヌクレオチドを示す。一部の実施形態において、核酸が、式（Ｉ）のアンチセンス鎖との二重鎖の状態にあるセンス鎖をさらに含む場合に、「Ｎ」ヌクレオチドとは、本明細書中の他の箇所に記載される、オーバーハングを形成する任意選択ヌクレオチドを示す。

【0013】

一部の実施形態において、ａは、１～２の整数である。一部の実施形態において、ａは０である。一部の実施形態において、ｂは、１～１１の整数である。一部の実施形態において、ｂは、５～１１の整数である。一部の実施形態において、ｂは７である。一部の実施形態において、Ｘ^０１～（Ｘ^Ｙ）_ｂの配列は、表１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である。一部の実施形態において、Ｘ^０１～（Ｘ^Ｙ）_ｂの配列は、表１のヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一（例えば、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または１００％同一）である。

【0014】

一部の実施形態において、Ｘ^０１～（Ｘ^Ｙ）_ｂの配列は、標的ｍＲＮＡの連続するヌクレオチド配列と少なくとも９５％相補的である。一部の実施形態において、Ｘ^０１～（Ｘ^Ｙ）_ｂの配列は、Ｘ^１４を除いて、標的ｍＲＮＡの天然に存在する連続するヌクレオチド配列と１００％相補的であり、（ｉ）Ｘ^１４はイノシンを含み、標的ｍＲＮＡ上の対応する位置にある標的ヌクレオチドはシチジンを含むか；または（ｉｉ）Ｘ^１４はウリジンを含み、標的ヌクレオチドはグアノシンを含む。一部の実施形態において、ｂは７であり、Ｘ^０１～Ｘ^２１の配列は、Ｘ^１４を除いて、標的ｍＲＮＡの天然に存在する連続するヌクレオチド配列と１００％相補的であり、（ｉ）Ｘ^１４はイノシンを含み、標的ヌクレオチドはシチジンを含むか；または（ｉｉ）Ｘ^１４はウリジンを含み、標的ヌクレオチドはグアノシンを含む。一部の実施形態において、Ｘ^０１～（Ｘ^Ｙ）_ｂの配列は、上記のＸ^１４を除きＸ^０１を除いて、標的ｍＲＮＡの天然に存在する連続するヌクレオチド配列と１００％相補的であり、Ｘ^０１と標的ｍＲＮＡ上の対応する位置にあるヌクレオチドとはミスマッチ塩基対を含む。

【0015】

一部の実施形態において、標的ヌクレオチドはシチジンまたはグアノシンのいずれかを含む。一部の実施形態において、Ｘ^１４と標的ヌクレオチドとはミスマッチ塩基対を含む。一部の実施形態において、ミスマッチ塩基対はゆらぎ塩基対である。一部の実施形態において、Ｘ^１４は、標的ヌクレオチドとゆらぎ塩基対を形成するヌクレオチドである。一部の実施形態において、Ｘ^１４は、イノシンまたはウリジンのいずれかを含む。一部の実施形態において、ゆらぎ塩基対はＩ：ＣまたはＵ：Ｇである。一部の実施形態において、標的ヌクレオチドがシチジンを含む場合にＸ^１４はイノシンを含む。一部の実施形態において、標的ヌクレオチドがグアノシンを含む場合にＸ^１４はウリジンを含む。

【0016】

一部の実施形態において、Ｘ^０１と標的ｍＲＮＡ上の対応する位置にあるヌクレオチドとはミスマッチ塩基対を含む。一部の実施形態において、ミスマッチ塩基対はＡ：ＧまたはＵ：Ｃである。一部の実施形態において、Ｘ^０１はアデノシンまたはウリジンのいずれかを含む。一部の実施形態において、標的ｍＲＮＡ上の対応する位置にあるヌクレオチドがグアノシンを含む場合にＸ^０１はアデノシンを含む。一部の実施形態において、標的ｍＲＮＡ上の対応する位置にあるヌクレオチドがシチジンを含む場合にＸ^０１はウリジンを含む。

【0017】

一部の実施形態において、式（Ｉ）のアンチセンス鎖は少なくとも１個の改変型ヌクレオチドおよび／または少なくとも１個の改変型ヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、２’－アミノエチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（ａｒａｂｉｎｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）から選択される１個または複数個のヌクレオシド改変を含む。一部の実施形態において、アンチセンス鎖は少なくとも１個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態において、核酸は、式（Ｉ）のアンチセンス鎖に結合されている少なくとも１個の標的指向性部分（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ））をさらに含む。一部の実施形態において、少なくとも１個の標的指向性部分は、切断可能なリンカーによってアンチセンス鎖に結合されている。

【0018】

一部の実施形態において、核酸は、１５ヌクレオチド長～４０ヌクレオチド長のセンス鎖をさらに含み、そのセンス鎖は、アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成する。一部の実施形態において、二重鎖領域は、センス鎖上のヌクレオチドとＸ^１４との間に標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）塩基対合または非標準的（ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ）塩基対合を含む。一部の実施形態において、Ｘ^１４がイノシンを含む場合に、センス鎖上のヌクレオチドはシチジン、アデノシン、もしくはウリジンを含む。一部の実施形態において、Ｘ^１４がウリジンを含む場合に、センス鎖上のヌクレオチドはアデノシンを含む。一部の実施形態において、二重鎖領域は、どのＮの場合も除く。

【0019】

一部の実施形態において、アンチセンス鎖は式（ＩＩ）：
５’－Ｘ^０１Ｘ^０２Ｘ^０３Ｘ^０４Ｘ^０５Ｘ^０６Ｘ^０７Ｘ^０８Ｘ^０９Ｘ^１０Ｘ^１１Ｘ^１２Ｘ^１３Ｘ^１４Ｘ^１５Ｘ^１６Ｘ^１７Ｘ^１８Ｘ^１９Ｘ^２０Ｘ^２１－３’（ＩＩ）
のアンチセンス鎖であり、Ｘ^０１～Ｘ^１３およびＸ^１５～Ｘ^２１は各々が独立して任意の型のヌクレオチドであり、ただし、Ｘ^０１～Ｘ^２１は、標的ｍＲＮＡの連続するヌクレオチド配列と少なくとも９０％相補的であり；Ｘ^１４は、イノシンまたはウリジンを含むヌクレオチドである。

【0020】

一部の実施形態において、本開示の核酸は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。一部の実施形態において、核酸は短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。

【0021】

一部の局面において、本開示は、本明細書において記載される核酸と対イオンとを含む組成物を提供する。一部の局面において、本開示は、本明細書において記載される核酸と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物を提供する。

【0022】

一部の局面において、本開示は、細胞における標的ｍＲＮＡの発現を減少させる方法を提供する。一部の実施形態において、その方法は、細胞を本開示の核酸または組成物と接触させる工程を含む。一部の実施形態において、細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態において、哺乳動物細胞はヒト細胞または非ヒト霊長類細胞である。一部の実施形態において、細胞は、核酸または組成物とインビボで接触される。一部の実施形態において、細胞は、核酸または組成物とインビトロで接触される。一部の実施形態において、標的ｍＲＮＡは変異タンパク質をコードする。一部の実施形態において、変異タンパク質は、野生型バリアントと比較して１個または複数個の変異を含む。一部の実施形態において、標的ｍＲＮＡは、その細胞において過剰発現されるタンパク質をコードする。一部の実施形態において、そのタンパク質は、参照発現レベルと比較して（例えば、野生型バリアントと比較して、正常健常細胞と比較して）過剰発現される。一部の実施形態において、標的ｍＲＮＡは、アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン型（９ＰＣＳＫ９）、補体Ｂ因子、ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ２）、および微小管結合タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）から選択される遺伝子の転写物である。一部の実施形態において、その遺伝子は、対応する野生型配列と比較して変異タンパク質をコードする。一部の実施形態において、その遺伝子は野生型タンパク質をコードする。

【0023】

一部の局面において、本開示は、対象を処置する方法を提供する。一部の実施形態において、その方法は、対象に本開示の核酸を投与する工程を含む。一部の実施形態において、対象は、その核酸の標的ｍＲＮＡと関連する疾患または状態を有することが既知であるか、あるいはその疾患または状態を有する疑いがある。一部の実施形態において、対象は、その標的ｍＲＮＡを有することが既知であるか、あるいはその標的ｍＲＮＡを有する疑いがある。一部の実施形態において、対象はヒトである。一部の実施形態において、対象は非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、または非ヒト霊長類、例えば、サルもしくはチンパンジー）である。一部の実施形態において、標的ｍＲＮＡは変異タンパク質をコードする。一部の実施形態において、変異タンパク質は、野生型バリアントと比較して１個または複数個の変異を含む。一部の実施形態において、標的ｍＲＮＡは、その細胞において過剰発現されるタンパク質をコードする。一部の実施形態において、そのタンパク質は、参照発現レベルと比較して（例えば、野生型バリアントと比較して、正常健常細胞と比較して）過剰発現される。一部の実施形態において、対象は、アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン型（９ＰＣＳＫ９）、補体Ｂ因子、ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ２）、および微小管結合タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）から選択される遺伝子と関連する疾患または状態を有することが既知であるか、あるいはその疾患または状態を有する疑いがある。一部の実施形態において、標的ｍＲＮＡは、その遺伝子の転写物である。一部の実施形態において、その遺伝子は、対応する野生型配列と比較して変異タンパク質をコードする。一部の実施形態において、その遺伝子は野生型タンパク質をコードする。

【0024】

本発明の特定の実施形態の詳細が、下記のとおり詳細な説明において示される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、実施例、図面、および特許請求の範囲から明らかとなる。

【0025】

（図面の簡単な説明）
本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明のいくつかの非限定的実施形態を示し、本記載とともに、本発明の原理を説明するのに役立つ。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】図1は、アンチセンス鎖がセンス鎖または標的ＲＮＡ鎖との二重鎖の状態にある、例示的な核酸構造を示す。

【0027】

【図2】図２は、センス鎖（５’から３’へ示される）とアンチセンス鎖（３’から５’へ示される）とを有する核酸についての例示的な式を示す。

【0028】

【図3A-3B】図３Ａ～図３Ｂは、カニクイザルにおけるｓｉＲＮＡ（ＲＤ１３５４）のインビボ試験からの結果を示す。個々のサルについての結果を図３Ａに示し、群についての平均した結果を図３Ｂに示す。

【発明を実施するための形態】

【0029】

（詳細な説明）
本開示の局面は、標的ＲＮＡレベルの有効な減少が、その１４位ヌクレオチドとその標的ＲＮＡとの間に非標準的（ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ）相互作用（例えば、ミスマッチ相互作用、例えば、ゆらぎ塩基対合）を媒介するように構成されたアンチセンス鎖を使用して達成され得るという、発見に関連する。一部の局面において、本開示は、有効なアンチセンス分子の設計のための新しい戦略を提供して、これまでよりも多数で多くの種類の可能性のある標的ｍＲＮＡ部位を効率を犠牲にすることなく可能にするように従来の指針を補う。

【0030】

低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子の効率は、種々の要因に依存し、その種々の要因としては、標的の利用性、ｍＲＮＡの二次構造、ｓｉＲＮＡとｍＲＮＡとのマッチングの位置ならびにｓｉＲＮＡおよびｍＲＮＡの固有の特徴が挙げられる。ｓｉＲＮＡの正確な設計は、その配列内にあるヌクレオチドのほんの少数の変化がその機能を変更し得るという事実に起因する重要な工程である。

【0031】

本発明者らは、従来のｓｉＲＮＡ設計戦略が、可能性のあるＲＮＡ標的部位の数および種類を限定し得る特定の規則にしたがうことを認識し理解した。一部の局面において、本開示は、その５’末端から１４位に、脱塩基部位を有するか、または標的ＲＮＡの対応する位置にある標的ヌクレオチドとは標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）塩基対を形成しないヌクレオチドを有する、アンチセンス鎖を含む核酸を提供することによって、これらの限界の一部を克服する。一部の実施形態において、非標準的（ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ）相互作用（例えば、ゆらぎ塩基対）が、１４位ヌクレオチドと標的ＲＮＡ上のＧヌクレオチドまたはＣヌクレオチドとの間に形成される。したがって、一部の実施形態において、本開示のゆらぎ塩基対および他の非標準的（ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ）相互作用は、標的分子上のこの位置にあるＡヌクレオチドまたはＵヌクレオチドへの従来の選好性に代わる代替的設計戦略を提供する。一部の局面において、本開示は、標的ＲＮＡとそのようなゆらぎ塩基対を形成する核酸が標的ＲＮＡレベルの非常に有効な減少をもたらしたという、驚くべき発見に関連する。

【0032】

図１は、アンチセンス鎖（点々が付された形）がセンス鎖または標的鎖（無地の形）との二重鎖の状態にある、例示的な核酸構造を示す。一部の実施形態において、センス鎖との二重鎖の状態にあるアンチセンス鎖を含む核酸は、一般的に本明細書においてＲＮＡサイレンシング剤と呼ばれ得る。ＲＮＡサイレンシング剤の例が本明細書中の他の箇所で提供され、ＲＮＡサイレンシング剤の例としては、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡが挙げられるが、それらに限定はされない。

【0033】

ＲＮＡサイレンシング剤１００が、センス鎖（無地の形）との二重鎖の状態にあるアンチセンス鎖（点々が付された形）を有して示されている。本明細書において使用される場合、一部の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤のアンチセンス鎖とは、標的鎖（例えば、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）と相補性の領域を有する鎖を指す。一部の実施形態において、その相補性の領域は、標的特異的サイレンシングを導くのに十分にその望ましい標的鎖と相補的（例えば、ＲＮＡｉ機構もしくはＲＮＡｉプロセス（ＲＮＡｉ干渉）によって望ましい標的鎖の破壊を誘発するのに十分な相補性、または望ましい標的ｍＲＮＡの翻訳抑制を誘発するのに十分な相補性）であるヌクレオチド配列を有する。

【0034】

示されるとおり、ＲＮＡサイレンシング剤１００は、アンチセンス鎖上の１４位ヌクレオチドにあるイノシンを含む。本明細書において使用される場合、一部の実施形態において、１４位ヌクレオチドとは、標的鎖上の対応する位置にあるＧヌクレオチドまたはＣヌクレオチドと非標準的（ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ）相互作用（例えば、ゆらぎ塩基対）を形成可能である、アンチセンス鎖上のヌクレオチドを指す。一部の実施形態において、アンチセンス鎖上の１４位ヌクレオチドはその５’末端と比較して番号付けされ、アンチセンス鎖上の最も５’側のヌクレオチドが１位ヌクレオチドと名付けられ得る。一部の実施形態において、アンチセンス鎖上の１４位ヌクレオチドはその標的鎖と相補性の領域と比較して番号付けされ、その相補性の領域の最も５’側のヌクレオチドが１位ヌクレオチドと名付けられ得る。例えば、一部の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤は、センス鎖と比較した５’オーバーハング領域において１個または複数個のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む。この状況において、１４位ヌクレオチドは、このオーバーハング領域には存在しない最も５’側のヌクレオチドと比較して番号付けされ、この後者である最も５’側のヌクレオチドが１位ヌクレオチドと名付けられ得る。

【0035】

一般的に示されるとおり、ＲＮＡサイレンシング剤１００のアンチセンス鎖上の１４位ヌクレオチドにあるイノシンは、センス鎖上の対応する位置にあるシチジンとゆらぎ塩基対を形成する。例として、ＲＮＡサイレンシング剤１００は、センス鎖上の対応する位置にあるシチジンを示すが、他のヌクレオシドがこの位置で利用され得る。例えば、イノシンはシチジン、アデノシン、またはウリジンとゆらぎ塩基対を形成し得るので、センス鎖上の対応する位置にあるヌクレオチドは、これらのヌクレオシドのいずれか一つを含み得る。しかし、本明細書において記載されるとおり、１４位ヌクレオチドは、標的ＲＮＡ上の対応する位置と非標準的（ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ）相互作用（例えば、ゆらぎ塩基対）を有利に形成し得る。したがって、ＲＮＡサイレンシング剤１００の文脈において、アンチセンス鎖上の１４位ヌクレオチドは、センス鎖上の対応する位置にあるヌクレオチドとゆらぎ塩基対を形成する必要はないことが、理解されるべきである。例えば、一部の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤のセンス鎖上の対応する位置にあるヌクレオチドは、１４位ヌクレオチドのイノシンとは塩基対合しないヌクレオシドを含む。したがって、一部の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤１００のセンス鎖上の対応する位置は、１４位ヌクレオチドのイノシンと塩基対合してもしなくても良い、あらゆるヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジン、イノシン、またはそれらのアナログ）を含み得る。

【0036】

標的二重鎖１０２は、標的鎖（無地の形）との二重鎖の状態にあるＲＮＡサイレンシング剤１００のアンチセンス鎖（点々が付された形）を示す。一部の実施形態において、標的鎖は標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。一般的に示されるとおり、アンチセンス鎖上の１４位ヌクレオチドにあるイノシンは、標的鎖上の対応する位置にあるシチジンとゆらぎ塩基対を形成する。本開示にしたがって、Ｉ：Ｃのゆらぎ塩基対は、この位置における別の不都合なＧ：Ｃ塩基対に代わる有利な代替案を提供する。本明細書において記載されるとおり、一部の実施形態において、アンチセンス鎖は相補性の領域を含み、この相補性の領域とは、標的鎖のヌクレオチドと塩基対を形成する、アンチセンス鎖のヌクレオチドを指す。

【0037】

一部の実施形態において、アンチセンス鎖上の１４位は脱塩基部位を含むか、またはアンチセンス鎖上の１４位は、標的鎖上の対応する位置にある標的ヌクレオチドとは標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）塩基対を形成しないヌクレオチドを含み得る。標的二重鎖１０２は、センス鎖上の１４位にあるイノシンが、標的鎖上の対応する位置にあるシチジンとゆらぎ塩基対を形成する例を示す。一部の実施形態において、ゆらぎ塩基対は、本開示にしたがうミスマッチ塩基対の一例であることが、理解されるべきである。したがって、一部の実施形態において、標的ヌクレオチドがシチジンを含む場合に、１４位ヌクレオチドはグアノシン以外のヌクレオシドを含む。例えば、一部の実施形態において、標的ヌクレオチドはシチジンを含み、１４位ヌクレオチドはアデノシン、ウリジン、またはシチジンを含む。しかし、一部の実施形態において、アンチセンス鎖上の１４位は、核酸塩基がこの位置に存在しないように脱塩基部位を含む。

【0038】

ＲＮＡサイレンシング剤１１０が、センス鎖（無地の形）との二重鎖の状態にあるアンチセンス鎖（点々が付された形）を有して示され、１４位ヌクレオチドはウリジンを含む。この例において、ＲＮＡサイレンシング剤１１０のセンス鎖は、１４位ヌクレオチドのウリジンに対応する位置にあるアデノシンを含む。ＲＮＡサイレンシング剤１００に関して記載されたとおり、この位置でのヌクレオチド相補性はＲＮＡサイレンシング剤１１０にとっての必要条件ではない。その理由は、本明細書において記載される利点は、標的二重鎖の状況においてこの位置で形成される非標準的（ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ）相互作用（例えば、ゆらぎ塩基対）に関連するからである。したがって、一部の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤１１０のセンス鎖上の対応する位置は、１４位ヌクレオチドのウリジンと塩基対合してもしなくても良い、あらゆるヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジン、イノシン、またはそれらのアナログ）を含み得る。

【0039】

標的二重鎖１１２は、標的鎖（無地の形）との二重鎖の状態にあるＲＮＡサイレンシング剤１１０のアンチセンス鎖（点々が付された形）を示す。一部の実施形態において、標的鎖は標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。一般的に示されるとおり、アンチセンス鎖上の１４位ヌクレオチドにあるウリジンは、標的鎖上の対応する位置にあるグアノシンとゆらぎ塩基対を形成する。本開示にしたがって、Ｕ：Ｇのゆらぎ塩基対は、この位置における別の不都合なＣ：Ｇ塩基対に代わる有利な代替案を提供する。

【0040】

標的二重鎖１１２は、センス鎖上の１４位にあるウリジンが、標的鎖上の対応する位置にあるグアノシンとゆらぎ塩基対を形成する例を示す。一部の実施形態において、ゆらぎ塩基対は、本開示にしたがうミスマッチ塩基対の一例であることが、理解されるべきである。したがって、一部の実施形態において、標的ヌクレオチドがグアノシンを含む場合に、１４位ヌクレオチドは、シチジン以外のヌクレオシドを含む。例えば、一部の実施形態において、標的ヌクレオチドはグアノシンを含み、１４位ヌクレオチドはアデノシン、グアノシン、またはウリジンを含む。しかし、一部の実施形態において、アンチセンス鎖上の１４位は、核酸塩基がこの位置に存在しないように脱塩基部位を含む。

【0041】

図１の核酸構造は一般的に示されており、図１の核酸構造は本開示に対する限定として解釈されるべきではない。例えば、ＲＮＡサイレンシング剤１００および１１０は、センス鎖と完全に相補的である２１ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を有するとして各々示されている。同様に、標的二重鎖１０２および１１２は、標的鎖と完全に相補的である２１ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を有するとして各々示されている。これらの例は例示目的のために提供されていること、および本明細書中の他の箇所に記載されるとおり、アンチセンス鎖またはセンス鎖は２１ヌクレオチド長よりも長くても短くても良く、ＲＮＡサイレンシング剤または標的二重鎖の相補性の程度は１００％未満であり得ることが、理解されるべきである。

【0042】

図２は、センス鎖（５’から３’へ示される）とアンチセンス鎖（３’から５’へ示される）とを有するＲＮＡサイレンシング剤についての例示的な式を示す。Ｎ、Ｘ、およびＺという変数は個々のヌクレオチドを示し、ａおよびｂという変数は本明細書において定義されている。一部の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤は、（Ｚ^Ｙ）_ｂ～Ｚ^１４におけるセンス鎖と（Ｘ^Ｙ）_ｂ～Ｘ^０１におけるアンチセンス鎖との間に塩基対相互作用によって形成される二重鎖領域を含む。一部の実施形態において、ｂは、１～１７の整数である。例として、２１ヌクレオチド長の二重鎖領域（例えば、ＲＮＡサイレンシング剤１００および１１０について示される二重鎖領域）について、ｂは７である。

【0043】

一部の実施形態において、（Ｘ^Ｙ）_ｂおよびＸ^１３～Ｘ^０１は各々が独立して任意の型のヌクレオチドであり、ただし、（Ｘ^Ｙ）_ｂ～Ｘ^０１は（Ｚ^Ｙ）_ｂ～Ｚ^１４と少なくとも８０％相補的である。したがって、一部の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤の二重鎖領域とは、少なくとも８０％相補的（例えば、少なくとも８５％相補的、少なくとも９０％相補的、少なくとも９５％相補的、または１００％相補的）である、センス鎖の配列およびアンチセンス鎖の配列を指す。

【0044】

一部の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤は、図２においてＮ_ａによって示される少なくとも１個のオーバーハング領域を含む。一部の実施形態において、ａは、独立して０～２の整数であり、ＲＮＡサイレンシング剤は、２ヌクレオチドまでの少なくとも１個のオーバーハングを必要に応じて含み得るようになる。本明細書において使用される場合、一部の実施形態において、オーバーハングとは、ある１本の鎖または領域から生じ、その１本の鎖または領域が二重鎖を形成する相補鎖の末端を越えて延びる、末端の非塩基対合ヌクレオチドを指す。一部の実施形態において、オーバーハングは、ＲＮＡサイレンシング剤の５’末端または３’末端にある二重鎖領域から延びる、１個もしくは複数個の不対クレオチドを含む。一部の実施形態において、オーバーハングは、ＲＮＡサイレンシング剤のアンチセンス鎖またはセンス鎖上の、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングである。一部の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤は、センス鎖上の５’オーバーハングおよび３’オーバーハングを含む。一部の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤は、センス鎖上の３’オーバーハングおよびアンチセンス鎖上の３’オーバーハングを含む。一部の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤は、センス鎖上の３’オーバーハングおよびアンチセンス鎖上の３’オーバーハングを含み、センス鎖上の５’オーバーハングもアンチセンス鎖上の５’オーバーハングもいずれも含まない。示されてはいないが、一部の実施形態において、アンチセンス鎖上の３’オーバーハングを有するＲＮＡサイレンシング剤は、その３’オーバーハングがそのＲＮＡサイレンシング剤から除去可能（例えば、切断可能）であるように構成され得ることが、理解されるべきである。

【0045】

一部の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤は、少なくとも１個のステムループを含む。一部の実施形態において、ａは、独立して０～３０の整数であり、ＲＮＡサイレンシング剤は、３０ヌクレオチドまでの少なくとも１個のステムループを必要に応じて含み得るようになる。したがって、一部の実施形態において、「Ｎ」ヌクレオチドとは、その核酸のいずれかの末端または両方の末端にある、ステムループを形成する任意選択ヌクレオチドを示す。例えば、一部の実施形態において、一方の鎖の５’末端にあるＮヌクレオチドともう一方の鎖の３’末端にあるＮヌクレオチドとは、ステム領域とループ領域とを有するステムループを介して共有結合される。一部の実施形態において、ステム領域は、約１塩基長～約２６塩基長までの間の二重鎖を含む。一部の実施形態において、ループ領域は、約４ヌクレオチド長～１０ヌクレオチド長までの間の一本鎖部分を含む。

【0046】

一部の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤は、図２においてＸ^１４によって示される脱塩基部位を含むか、またはＲＮＡサイレンシング剤は、図２においてＸ^１４によって示される、標的鎖（例えば、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の対応する位置にある標的ヌクレオチドとは標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）塩基対を形成しないヌクレオチドを含む。示されるとおり、Ｚ^０１は、アンチセンス鎖上のＸ^１４に対応する位置にあるセンス鎖上のヌクレオチドである。一部の実施形態において、Ｘ^１４は脱塩基部位である。一部の実施形態において、Ｘ^１４はアデノシン、イノシン、またはウリジンである。一部の実施形態において、Ｚ^０１は任意の型のヌクレオチドである。一部の実施形態において、Ｚ^０１はグアノシン、シチジン、アデノシン、またはウリジンである。一部の実施形態において、Ｘ^１４はイノシンであり、Ｚ^０１はシチジン、アデノシン、またはウリジンである。一部の実施形態において、Ｘ^１４はウリジンであり、Ｚ^０１はアデノシンまたはグアノシンである。

【0047】

一部の実施形態において、図２におけるＲＮＡサイレンシング剤のアンチセンス鎖は、本明細書中の他の箇所に記載される式（Ｉ）のアンチセンス鎖である。

【0048】

本明細書において記載される場合、一部の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤とは、ＲＮＡ媒介性サイレンシング機構（例えば、ＲＮＡｉ）を媒介するのに十分な標的鎖（例えば、標的ＲＮＡ配列）との相補性を有するアンチセンス鎖を含む核酸を指す。一部の実施形態において、その核酸は、センス鎖と相補的アンチセンス鎖（またはその部分）とを含む二重鎖分子（または二重鎖様構造を有する分子）である。一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、その５’末端から１４位に、標的鎖上の対応する位置にあるヌクレオチドとゆらぎ塩基対を形成するヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、１４位ヌクレオチドは、イノシンおよびウリジンから選択されるヌクレオシドを含む。

【0049】

一部の実施形態において、ヌクレオシドという用語は、リボース糖またはデオキシリボース糖に共有結合された、プリン塩基またはピリミジン塩基を有する分子を指す。ヌクレオシドは、核酸塩基（例えば、窒素塩基（例えば、核酸塩基））と五炭糖（例えば、リボース）とからなる。その五炭糖は、リボースまたはデオキシリボースのいずれかであり得る。ヌクレオシドはヌクレオチドの生化学的前駆体であり、ヌクレオチドはＲＮＡおよびＤＮＡの構成成分である。用語「ヌクレオチド」とは、本明細書において使用され得る場合、核酸塩基および五炭糖（すなわち、ヌクレオシド）ならびに１個または複数個のリン酸基を指す。ヌクレオシドにおいて、そのアノマー炭素は、プリンのＮ９またはピリミジンのＮ１にグリコシド結合を介して結合されている。ヌクレオシドおよび核酸塩基の例としては、シチジン（Ｃ）、ウリジン （Ｕ）、アデノシン（Ａ）、グアノシン （Ｇ）、チミジン（Ｔ）、およびイノシン（Ｉ）が挙げられるが、それらに限定はされないが、ヌクレオシドが核酸塩基および五炭糖を含むので、その用語は（このような用語が本明細書において定義されるとおり）改変から生じるヌクレオシドを記載することもまた、理解されるべきである。例えば、ヌクレオシドとしては、天然ヌクレオシド（例えば、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシドアナログ（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ５ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニルウリジン、Ｃ５－プロピニルシチジン、Ｃ５－メチルシチジン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、４－アセチルシチジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、ジヒドロウリジン、メチルシュードウリジン、１－メチルアデノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、および２－チオシチジン）、化学改変型塩基、生化学改変型塩基（例えば、メチル化塩基）、インターカレート化（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ）塩基、改変型糖（例えば、２’フルオロリボース、リボース、２’デオキシリボース、２’－Ｏ－メチルシチジン、アラビノース、および六炭糖）、または改変型リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合）、キサンチン、ヒポキサンチン、ネブラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアノシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、３－デアザアデノシン、７－デアザアデノシン、７－メチルアデノシン、８－アジドアデノシン、８－メチルアデノシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－メチルシチジン、ピロロシチジン、７－アミノメチル－７－デアザグアノシン、７－デアザグアノシン、７－メチルグアノシン、８－アザ－７－デアザグアノシン、チエノグアノシン、イノシン、４－チオ－ウリジン、５－メトキシウリジン、ジヒドロウリジン、ならびにシュードウリジンが挙げられる。一部の実施形態において、ヌクレオチドという用語は、その糖部分にエステル結合で結合された１個または複数個のリン酸基を有するヌクレオシドを指す。ヌクレオチドの例としては、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、およびヌクレオシド三リン酸が挙げられる。一部の実施形態において、核酸という用語は、５’炭素原子と３’炭素原子との間でホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合によって一緒に結合された、ヌクレオチドのポリマーを指す。本明細書において使用される場合、一部の実施形態において、核酸とは一本鎖分子を指し得、または核酸とは二本鎖分子（例えば、アンチセンス鎖との二重鎖の状態にあるセンス鎖）を指し得る。

【0050】

一部の実施形態において、本開示の核酸は、少なくとも１９ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を含む。例えば、一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、１９ヌクレオチド長～３１ヌクレオチド長（例えば、１９ヌクレオチド長～２５ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長～２１ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長～３１ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長～２５ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、または２５ヌクレオチド長）である。一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、標的鎖（例えば、標的ｍＲＮＡ）と相補性の領域を含む。一部の実施形態において、その相補性の領域とは、標的ｍＲＮＡの連続する配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％）相補的である、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態において、その相補性の領域は、１９ヌクレオチド長～３１ヌクレオチド長（例えば、１９ヌクレオチド長～２５ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長～２１ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長～３１ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長～２５ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、または２５ヌクレオチド長）である。

【0051】

一部の実施形態において、本開示の核酸は、アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成するセンス鎖を含む。一部の実施形態において、センス鎖は少なくとも１９ヌクレオチド長である。例えば、一部の実施形態において、センス鎖は１９ヌクレオチド長～４０ヌクレオチド長（例えば、１９ヌクレオチド長～３５ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長～３０ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長～２５ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長～２１ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長～３０ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長～３０ヌクレオチド長、または３０ヌクレオチド長～４０ヌクレオチド長）である。一部の実施形態において、二重鎖領域とは、２本の逆平行ヌクレオチド配列の相補的塩基対合を介して形成される構造を指す。一部の実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖領域は少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％）相補的である。

【0052】

一部の実施形態において、二重鎖領域は、その二重鎖の少なくとも１個のミスマッチ塩基対（例えば、従来のワトソン－クリック塩基対合規則にしたがって塩基対合しないヌクレオチド）を含む。一部の実施形態において、その少なくとも１個のミスマッチ塩基対のミスマッチは、本明細書において記載されるとおり、アンチセンス鎖上の１４位ヌクレオチドを含む。例えば、一部の実施形態において、アンチセンス鎖上の１４位ヌクレオチドは、（例えば、二重鎖領域にある）アンチセンス鎖上の対応するヌクレオチドおよび／または標的鎖上の対応する位置にある標的ヌクレオチドと、ミスマッチ塩基対を形成し得る。一部の実施形態において、二重鎖領域は、１個よりも多いミスマッチを含む。一部の実施形態において、二重鎖領域は、３０個よりも少ないミスマッチを含む。一部の実施形態において、二重鎖領域は、１個よりも多いが３０個よりも少ないミスマッチを含む。一部の実施形態において、二重鎖領域は、少なくとも１個だが１１個よりも少ないミスマッチを含む。一部の実施形態において、二重鎖領域は、少なくとも１個だが６個よりも少ないミスマッチを含む。一部の実施形態において、二重鎖領域は、少なくとも１個だが４個よりも少ないミスマッチを含む。一部の実施形態において、二重鎖領域が１個よりも多いミスマッチを含む場合、そのミスマッチはその核酸において連続する（例えば、隣接する）。一部の実施形態において、二重鎖領域が１個よりも多いミスマッチを含む場合、そのミスマッチはその核酸において連続しない（例えば、隣接しない）。一部の実施形態において、二重鎖領域が２個よりも多いミスマッチを含む場合、互いと隣接する２個以上のミスマッチからなる少なくとも１個のグループが存在する。一部の実施形態において、二重鎖領域が２個よりも多いミスマッチを含む場合、互いと隣接する２個以上のミスマッチは存在しない。一部の実施形態において、二重鎖領域はミスマッチを含まない。一部の実施形態において、二重鎖領域のミスマッチはゆらぎ塩基対を含む。

【0053】

一部の実施形態において、二重鎖領域は１個または複数個のゆらぎ塩基対を含む。一部の実施形態において、その１個または複数個のゆらぎ塩基対のゆらぎ塩基対は、本明細書において記載されるとおり、アンチセンス鎖上の１４位ヌクレオドを含む。例えば、一部の実施形態において、アンチセンス鎖上の１４位ヌクレオチドは、（例えば、二重鎖領域にある）アンチセンス鎖上の対応するヌクレオチドおよび／または標的鎖上の対応する位置にある標的ヌクレオチドと、ゆらぎ塩基対を形成し得る。一部の実施形態において、ゆらぎ塩基対とは、特定のヌクレオチドの塩基対合（例えば、ゆらぎ塩基対）を指すことが当該分野において一般的に公知である用語であり、それらの特定のヌクレオチドはワトソン－クリック塩基対ではない（例えば、ミスマッチ塩基対またはミスマッチ塩基対の部分集合の形態である）という点で非標準的（ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ）である。詳細には、ゆらぎという用語は、ヒポキサンチンの塩基対合（イノシン（Ｉ））およびウラシル（Ｕ）（Ｉ：Ｕ塩基対）；グアニン（Ｇ）およびＵ（Ｇ：Ｕ塩基対）；Ｉおよびアデニン（Ａ）（Ｉ：Ａ塩基対）；ならびにＩおよびシトシン（Ｃ）（Ｉ：Ｃ塩基対）を記載するための用語として使用される。

【0054】

一部の実施形態において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は少なくとも１個の改変型ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、改変型ヌクレオチドは、１個または複数個の化学改変をその糖、核酸塩基および／またはリン酸基において有する。一部の実施形態において、改変型ヌクレオチドは、対応する参照ヌクレオチドに結合された１個または複数個の化学的部分を有する。典型的には、改変型ヌクレオチドは、１個または複数個の望ましい特性を、その改変型ヌクレオチドが存在する核酸に付与する。例えば、改変型ヌクレオチドは、熱安定性、分解に対する抵抗性、ヌクレアーゼ抵抗性、溶解度、バイオアベイラビリティ、生理活性、免疫原性の減少などを改善し得る。改変型ヌクレオチドの例としては、２－アミノ－グアノシン、２－アミノ－アデノシン、２，６－ジアミノ－グアノシン、および２，６－ジアミノ－アデノシンが挙げられるが、それらに限定はされない。誘導体化され得るヌクレオチドの位置の例としては、５位、例えば、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ブロモウリジン、５－プロピンウリジン（ｐｒｏｐｙｎｅ ｕｒｉｄｉｎｅ）、５－プロペニルウリジンなど；６位、例えば、６－（２－アミノ）プロピルウリジン；アデノシンおよび／またはグアノシンの８位、例えば、８－ブロモグアノシン、８－クロログアノシン、８－フルオログアノシンなどが挙げられる。ヌクレオチドアナログとしてはまた、デアザヌクレオチド、例えば、７－デアザ－アデノシン；Ｏ改変型およびＮ改変型（例えば、アルキル化、例えば、Ｎ６－メチルアデノシン、または当該分野において別に知られているような)ヌクレオチド；および当該分野において公知である他の複素環改変型ヌクレオチドアナログが挙げられる。一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、２’－アミノエチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（ａｒａｂｉｎｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）から選択される１個または複数個のヌクレオシド改変を含む。

【0055】

本開示にしたがう改変型ヌクレオチドのさらなる例としては、改変型プリン核酸塩基または改変型ピリミジン核酸塩基を有する、ヌクレオチドが挙げられる。プリン核酸塩基および／またはピリミジン核酸塩基は、例えば、その複素環式のアミド化または脱アミノ化によって改変され得る。さらに、改変型糖（例えば、糖（例えば、リボース）に対する２’－Ｏ置換（２’－Ｏ－メトキシエチル糖が挙げられるが、それに限定はされない）、２’－フルオロ糖改変（２’－フルオロ）、２’－Ｏ－メチル糖（２’－Ｏ－メチル）、２’－Ｏ－エチル糖、２’－Ｃｌ、２’－ＳＨ、およびそれらの置換（例えば、２’－ＳＣＨ_３）、二環式糖部分）、あるいは置換（例えば、低級アルキルもしくはその置換（例えば、－ＣＨ_３、－ＣＦ_３）による２’－Ｏ部分の置換、２’－アミノもしくはその置換による２’－Ｏ部分の置換、２’，３’－セコヌクレオチド模倣物、２’－Ｆ－アラビノヌクレオチド、逆方向（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）ヌクレオチド、逆方向（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－Ｏ－デオキシヌクレオチド、アルケニルによる２’－Ｏ部分の置換、アルキニルによる２’－Ｏ部分の置換、メトキシエチルによる２’－Ｏ部分の置換（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、（ＤＮＡ中のような）－Ｈによる２’－Ｏ部分の置換、または他の置換基による２’－Ｏ部分の置換）が、導入され得る。リボース模倣物もまた企図され、例えば、モルホリノ、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ＵＮＡ、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）であるが、それらに限定はされない。

【0056】

他の例としては、２’－４’糖架橋バリアント、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）、および２’－Ｏ、４’－Ｃ－エチレン架橋型核酸（ＥＮＡ）が挙げられる。ロックド核酸とは、そのリボース糖が、２’酸素と４’炭素とを結合する架橋（２’酸素と４’炭素との間のメチレン架橋としてしばしば観察される）によって改変されている、改変型ＲＮＡヌクレオチドである。この架橋は、３’－ｅｎｄｏ立体構造でそのリボースを作動可能に「ロックする」。ロックドリボース糖の立体構造は、塩基スタッキングおよび骨格の事前組織化を増強し得、このことはそのハイブリダイゼーション特性（例えば、熱安定性およびハイブリダイゼーション特異性）に影響を与え（例えば、増加し）得る。ロックド核酸は、ＲＮＡオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡオリゴヌクレオチドの両方に挿入されて、典型的なワトソン－クリック塩基対合規則（すなわち、相補性）にしたがってＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズし得る。

【0057】

他の化学反応および改変が、本開示にしたがって容易に使用され得るオリゴヌクレオチドの分野において公知であり、核酸改変の定義内に含まれる。例えば、改変という用語は、天然のヌクレオシド以外のあらゆるヌクレオシドの形成をもたらすあらゆる変化、変更、または操作をさらに含む。

【0058】

一部の実施形態において、核酸は、１個よりも多いヌクレオシド改変を含む。一部の実施形態において、核酸は、２個よりも多いヌクレオシド改変を含む。一部の実施形態において、核酸中のヌクレオシドのうちの２５％よりも多いが１００％またはそれ以下は、ヌクレオシド改変を含む。一部の実施形態において、核酸中のヌクレオシドのうちの５０％よりも多くは、ヌクレオシド改変を含む。一部の実施形態において、核酸中のヌクレオシドのうちの７５％よりも多いが１００％またはそれ以下は、ヌクレオシド改変を含む。一部の実施形態において、核酸中のヌクレオシドのうちの少なくとも７５％（例えば、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも多く）は、ヌクレオシド改変を含む。一部の実施形態において、核酸中のヌクレオシドのうちの少なくとも９５％だが１００％またはそれ以下は、ヌクレオシド改変を含む。

【0059】

一部の実施形態において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、少なくとも１個の改変型ヌクレオチド間結合を含む。本明細書において使用される場合、一部の実施形態において、改変型ヌクレオチド間結合とは、ホスホジエステル結合を含む参照ヌクレオチド間結合と比較して１個または複数個の化学的改変を有する、ヌクレオチド間結合を指す。一部の実施形態において、改変型ヌクレオチド間結合は、天然には存在しない結合である。典型的には、改変型ヌクレオチド間結合は、１個または複数個の望ましい特性を、その改変型ヌクレオチド間結合が存在する核酸に付与する。例えば、改変型ヌクレオチドは、熱安定性、分解に対する抵抗性、ヌクレアーゼ抵抗性、溶解度、バイオアベイラビリティ、生理活性、免疫原性の減少などなどを改善し得る。一部の実施形態において、アンチセンス鎖は少なくとも１個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。その結合に対するさらなる改変としては、アミド化およびペプチドリンカーが挙げられる。他の例としては、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロ（ジ）チオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミダートリンカー、ホスホネート、３’－メチレンホスホネート、５’－メチレンホスホネート、ボラノリン酸などが挙げられる。さらに、異性体のキラリティーが改変され得る（例えば、ＲｐおよびＳｐ）。

【0060】

一部の実施形態において、核酸は、２個よりも多い改変型ヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態において、核酸は、３個よりも多い改変型ヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態において、核酸のヌクレオチド間結合のうちの２５％よりも多くは、改変を含む。一部の実施形態において、核酸のヌクレオチド間結合のうちの５０％よりも多くは、改変を含む。一部の実施形態において、核酸のヌクレオチド間結合のうちの７５％よりも多くは、改変を含む。一部の実施形態において、核酸のヌクレオチド間結合のうちの少なくとも７５％（例えば、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも多く）は、改変を含む。一部の実施形態において、核酸のヌクレオチド間結合のうちの少なくとも９５％は、改変を含む。

【0061】

一部の実施形態において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖が少なくとも１個のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分に結合されている。

【0062】

一部の実施形態において、本開示は、標的ｍＲＮＡの発現を減少させるための核酸を提供する。一部の実施形態において、標的ｍＲＮＡの発現を減少させることは、標的特異的サイレンシングを導くことによって（例えば、ＲＮＡｉ機構もしくはＲＮＡｉプロセス（ＲＮＡｉ干渉）により標的ｍＲＮＡの破壊を誘発することによって、および／または望ましい標的ｍＲＮＡの翻訳抑制を誘発することによって）達成され得る。

【実施例】

【0063】

（実施例１．ｓｉＲＮＡノックダウンについてのＡＧＴ遺伝子発現アッセイ）
トランスフェクション前日に、ＨｅｐＧ２細胞を、９６ウェルプレートにおいて抗生物質を含まない培地に１０，０００細胞／ウェルで播種した。ＡＧＴ ｓｉＲＮＡを、１０ｍＭのストック溶液から１ｍＭおよび０．１０ｍＭの作業ストックへと希釈した。混合物を、下記に示すとおり（三連について示す量）に別個に調製し、穏やかに混合し、室温にて５分間インキュベートした。

【表3】

【0064】

それらの混合物を組み合わせて室温にて２０分間インキュベートした。このインキュベーション中に、９６ウェルプレート中の培地を、８０μＬの抗生物質を含まない培地で置換した。容積２０μＬのその混合物を各ウェルに添加し、プレートを穏やかに軽く叩いて、そのウェルの中身を混合した。細胞を５％ ＣＯ_２中で３７℃にて２４時間（ｍＲＮＡ分析のために）インキュベートした。

【0065】

２４時間後、溶解溶液（Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を、１反応当たり４９．５μＬのＲＴ溶解溶液（Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）と１反応当たり０．５μＬのＤＮａｓｅＩとを組み合わせることによって調製し、総反応数の分だけ増やした。その細胞培養培地を吸引し、５０μＬの冷たいＰＢＳでリンスした。１ウェル当たり容積５０μＬの溶解溶液（Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を添加し、ピペット操作によって混合し、その後、室温にて５分間インキュベーションした。容積５μＬの停止溶液（Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（室温）を添加し、ピペット操作によって混合し、その後、室温にて２分間インキュベーションした。マスターミックス（Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）を、下記に示すとおり氷上で調製した。

【表4】

【0066】

氷上で、容積１８μＬのマスターミックス（Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）を、光学９６ウェルＰＣＲプレートの各ウェルに添加した。容積２μＬの溶解物（またはＮＴＣ用の水）を各ウェルに添加した。そのプレートを光学接着カバーで密封し、５秒間～１０秒間ボルテックス処理し、短時間遠心分離して気泡を除去した。反応を、下記に示すとおりＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３ ｑＰＣＲ機器において実行するように設定した。

【表5】

【0067】

プレートをｑＰＣＲ機器に取り付け、反応を実行した。その実行が完了した後、結果をダウンロードし、（Ｃｔと同様に）そのＣｑ値を使用して、以下にしたがってデータを分析した：（ｉ）各サンプルについてＡＧＴおよびＧＡＰＤＨについてのＣｔ値を記録する；（ｉｉ）ΔΔＣｔ＝ＡＧＴ Ｃｔ値－ＧＡＰＤＨ Ｃｔ値；（ｉｉｉ）ΔΔＣｔＲＱ＝ΔΔＣｔ試験サンプル－ΔΔＣｔトランスフェクトしていない試験サンプル；（ｉｖ）ＲＱ（発現の倍数変化）＝２^{－ΔΔＣｔ}；（ｖ）残存ＡＧＴ％＝２^{－ΔΔＣｔ}×１００；（ｖｉ）ＡＧＴノックダウン％＝１００－残存ＡＧＴ％。

【0068】

これらの実験において評価したｓｉＲＮＡについての配列情報を、以下に表１に提供する。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0069】

ｓｉＲＮＡ分子を用いたＡＧＴノックダウン実験からのインビトロでの結果を、以下に表２に示す。

【表2】

【0070】

この実施例において使用する物質のリストは、以下のとおりである：ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＨＢ－８０６５）；ＡＧＴ ｓｉＲＮＡ ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎカタログ番号Ｌ－０１０９８８－００－０００５）；Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ ４（Ｄｈａｒｍａｃｏｎカタログ番号Ｔ－２００４－０１）；Cells－Ｔｏ－ＣＴ １Ｓｔｅｐ ＴａｑＭａｎキット（Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号 Ａ２５６０３）；ＡＧＴ ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ２５０ｒｘｎｓ－Ｈｓ０１５８６２１３＿ｍ１（Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号４３３１１８２）；ＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ２５０ｒｘｎｓ－Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇ１（Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号４３３１１８２）；ヌクレアーゼを含まない水；ＭｉｃｒｏＡｍｐ光学９６ウェルプレート、０．２ｍＬ（１０プレート）（Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号Ｎ８０１０５６０）；ＭｉｃｒｏＡｍｐ光学接着カバー（１００枚）（Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号４３１１９７１）。

【0071】

（実施例２．ＲＤ１３５４ ｓｉＲＮＡのインビボ試験）
ｓｉＲＮＡ「ＲＤ１３５４」をカニクイザルにおいて評価した。この研究の前に、それらのサルを隔離した状態で維持し、その間に、それらの動物を健康全般について毎日観察した。２匹のカニクイザルに、研究１日目に、３ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドを単回皮下投与で注入した。この研究期間中、これらのサルを病気または苦痛の徴候について毎日観察した。動物を、－６日目ならびに１日目（投与前）、４日目、８日目、１５日目、２２日目、２９日目、３６日目、および４３日目に血清分析のために採血した。循環ＡＧＴレベルを、ヒトアンジオテンシノーゲン特異的（およびカニクイザルと交差反応性）であるＥＬＩＳＡを製造業者のプロトコル（ＩＢＬ Ａｍｅｒｉｃａ番号２７４１２）にしたがって使用して、定量化した。データをベースライン値（投与前の１日目）のパーセントとして表し、平均±標準偏差として示した。個々のサルについての結果を図３Ａに示し、群についての平均した結果を図３Ｂに示す。

【0072】

（等価物および範囲）
特許請求の範囲において、「ある（１つの）（ａ）」、「ある（１つの）（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」などの冠詞は、反対に示されておらず文脈からそうではないことが明らかでもない限りは、１つまたは１つよりも多くを意味し得る。１つの群のうちの１つまたは複数の要素の間に「または」を含む請求項または記載は、反対に示されておらず文脈からそうではないことが明らかでもない限りは、その群の要素のうちの１つ、１つよりも多く、またはすべてが所定の生成物またはプロセスにおいて存在するか、使用されるか、または他の様式で関連する場合に、満足されると考えられる。本発明は、その群の要素のうちの正確に１つの要素が、所定の生成物またはプロセスにおいて存在するか、使用されるか、または他の様式で関連する、実施形態を含む。本発明は、その群の要素のうちの１よりも多くまたはすべてが、所定の生成物またはプロセスにおいて存在するか、使用されるか、または他の様式で関連する、実施形態を含む。

【0073】

さらに、本発明は、列挙された請求項のうちの１つまたは複数に由来する１つまたは複数の限定、要素、節、および記述用語が別の請求項中に導入される、すべての変化形、組合せ、および置換を含む。例えば、別の請求項に従属するどの請求項も、同じ基本請求項に従属する他のなんらかの請求項において見出される１つまたは複数の限定を含むように改変され得る。要素が例えばマーカッシュ群形式で列挙として示される場合は、その要素の各部分群もまた開示されており、任意の要素がその群から除去され得る。一般に、本発明または本発明の局面が特定の要素および／または特徴を含むと言われる場合には、本発明または本発明の局面の特定の実施形態はそのような要素および／または特徴からなるか、あるいはそのような要素および／または特徴から本質的になることが、理解されるべきである。簡潔さを目的として、それらの実施形態は、本明細書においてこのとおりの言葉では具体的には示されていない。

【0074】

本明細書および特許請求の範囲において本出願で使用される句「および／または（および／もしくは）」は、そのように結合されている要素（すなわち、一部の場合では接続的に存在し別の場合では離接的に存在する要素）のうちの「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」を用いて列挙される複数の要素は、同じ様式（すなわち、そのように結合された要素のうちの「１つまたは複数」）で解釈されるべきである。「および／または」節によって具体的に同定されている要素以外の他の要素が、具体的に同定されている要素と関連があろうと関連がなかろうと、必要に応じて存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／または（および／もしくは）Ｂ」への言及は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの非限定型（ｏｐｅｎ－ｅｎｄｅｄ）の語と組み合わせて使用される場合には、ある実施形態では、Ａのみ（Ｂ以外の要素を必要に応じて含む）を指し得；別の実施形態では、Ｂのみ（Ａ以外の要素を必要に応じて含む）を指し得；さらなる別の実施形態では、ＡおよびＢの両方（他の要素を必要に応じて含む）を指し得る；などである。

【0075】

明細書および特許請求の範囲において本出願で使用される場合、「または（もしくは）（あるいは）（ｏｒ）」は、上記で定義された「および／または（および／もしくは）」と同じ意味を有すると理解されるべきできある。例えば、列挙における項目を区切る場合、「または（もしくは）（あるいは）（ｏｒ）」または「および／または（および／もしくは）」は、包括的である（すなわち、多くの要素または列挙された要素のうちの少なくとも１つを含むが、１つよりも多くもまた含み、列挙されていないさらなる項目もまた必要に応じて含む）と解釈される。反対に明示される用語（例えば、「の１つのみ」もしくは「の正確に１つ」））、または特許請求の範囲において使用される場合の「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」のみは、多くの要素または列挙された要素のうちの正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書において使用される用語「または（もしくは）（あるいは）（ｏｒ）」は、排他的な用語（例えば、「いずれか」、「の一方」、「の１つのみ」、または「の正確に１つ」が続く場合に、排他的な選択肢（すなわち、「一方またはもう一方であるが、両方ではない」）を示すとのみ解釈される。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、特許請求の範囲において使用される場合に、特許法の分野において使用されるその通常の意味を有する。

【0076】

明細書および特許請求の範囲において本出願で使用される場合、１つまたは複数の要素の列挙に関する句「少なくとも１つ」は、その要素の列挙中にある要素のうちの任意の１つまたは複数から選択される少なくとも１つの要素が、その要素の列挙内で具体的に列挙されているどの要素も皆少なくとも１つを含む必要は必ずしもなく、その要素の列挙中の要素のいかなる組合せも排除しないことを意味すると、理解されるべきである。この定義はまた、句「少なくとも１つ」が指す要素の列挙内で具体的に同定されている要素以外の要素が、具体的に同定されている要素と関連があろうと関連がなかろうと、必要に応じて存在し得ることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（あるいは、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、あるいは、同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、少なくとも１つのＡ（１つよりも多くのＡを必要に応じて含む）でありＢは存在しない（Ｂ以外の要素を必要に応じて含む）ことを指し得；別の実施形態では、少なくとも１つのＢ（（１つよりも多くのＢを必要に応じて含む）でありＡは存在しない（Ａ以外の要素を必要に応じて含む）ことを指し得；さらに別の実施形態では、少なくとも１つのＡ（１つよりも多くのＡを必要に応じて含む）および少なくとも１つのＢ（１つよりも多くのＢを必要に応じて含む）（他の要素を必要に応じて含む）を指し得る；などである。

【0077】

反対に明示されない限りは、１つよりも多い工程または動作を含む本出願において特許請求されるあらゆる方法において、その方法の工程または動作の順序は、その方法の工程または動作が記載されている順序に必ずしも限定されないこともまた、理解されるべきである。

【0078】

特許請求の範囲および上記の明細書において、すべての移行句、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「保有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「有する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」などは、非限定型（ｏｐｅｎ－ｅｎｄｅｄ）である、すなわち、含むがそれらに限定はされないことを意味すると、理解されるべきである。移行句「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」のみは、アメリカ合衆国特許審査便覧（ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）セクション２１１１．０３において示されるとおり、それぞれ限定型（ｃｌｏｓｅｄ）または半限定型（ｓｅｍｉ－ｃｌｏｓｅｄ）の移行句である。非限定型（ｏｐｅｎ－ｅｎｄｅｄ）の移行句（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」）を使用して本明細書において記載されている実施形態は、別の実施形態では、その非限定型の移行句によって記載されている特徴「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」としてもまた企図されることが、理解されるべきである。例えば、本出願が「ＡおよびＢを含む組成物」を記載している場合、本出願はまた、別の実施形態である「ＡおよびＢからなる組成物」ならびに「ＡおよびＢから本質的になる組成物」も企図する。

【0079】

範囲が与えられる場合、終点は含まれる。さらに、そうではないと示されることもなく、文脈および当業者の理解からそうではないことが明らかでもない限りは、範囲として表されている値は、文脈がそうではないと明示しない限りは、本発明の種々の実施形態において、記載されている範囲内にある任意の特定の値または部分範囲をその範囲の下限の単位の１０分の１までとり得る。

【0080】

本出願は、種々の登録特許、公開特許出願、雑誌論文、および他の公開物を参照し、それらはすべて、参照により本明細書において援用される。援用された参照物のいずれかと本明細書との間に矛盾が存在する場合は、本明細書が統制する。さらに、本発明のうちの先行技術の範囲内にあるいかなる特定の実施形態も、その請求項のうちのいずれか１つまたは複数から明示的に排除され得る。そのような実施形態は当業者に公知であると考えられるので、本明細書において排除が明示されていない場合でさえ、そのような実施形態は排除され得る。本発明のいかなる特定の実施形態も、先行技術の存在に関連があろうと関連がなかろうと、なんらかの理由で、いずれかの請求項から排除され得る。

【0081】

当業者は、本明細書において記載されている具体的な実施形態の多くの等価物を、認識するか、または慣用的実験のみを使用して確認可能である。本明細書において記載されているその実施形態の範囲は、上記の説明に限定されることは意図されず、むしろ、添付の特許請求の範囲において示されているとおりである。当業者は、本記載に対する種々の変更および改変が、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の趣旨からも範囲からも逸脱することなくなされ得ることを、理解する。

【0082】

本明細書における変数のなんらかの定義における化学基の列挙の記載は、その変数の定義を、列挙された基のうちのいずれか一つの基または組合せとして含む。本明細書における変数についての実施形態の記載は、その実施形態を、いずれか一つの実施形態または他の任意の実施形態もしくはその一部との組合せとして含む。本明細書における実施形態の記載は、その実施形態を、いずれか一つの実施形態または他の任意の実施形態もしくはその一部との組合せとして含む。

【図1】

【図2】

【図3A-3B】

【配列表】

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【国際調査報告】