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特表2024-513983第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体を含む液体組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-27
(54)【発明の名称】第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体を含む液体組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 38/37 20060101AFI20240319BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20240319BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20240319BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20240319BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20240319BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20240319BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20240319BHJP
A61P 7/04 20060101ALI20240319BHJP
【ＦＩ】
A61K38/37
A61K9/08
A61K47/10
A61K47/26
A61K47/18
A61K47/02
A61K47/42
A61P7/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023562800
(86)(22)【出願日】2022-04-12
(85)【翻訳文提出日】2023-12-11
(86)【国際出願番号】 EP2022059711
(87)【国際公開番号】W WO2022218962
(87)【国際公開日】2022-10-20
(31)【優先権主張番号】63/174,316
(32)【優先日】2021-04-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515116009
【氏名又は名称】グリフォルス・ワールドワイド・オペレーションズ・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＧＲＩＦＯＬＳ ＷＯＲＬＤＷＩＤＥ ＯＰＥＲＡＴＩＯＮＳ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｇｒａｎｇｅ Ｃａｓｔｌｅ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｐａｒｋ，Ｇｒａｎｇｅ Ｃａｓｔｌｅ，Ｃｌｏｎｄａｌｋｉｎ，Ｄｕｂｌｉｎ ２２，ＩＲＥＬＡＮＤ
(74)【代理人】
【識別番号】110003421
【氏名又は名称】弁理士法人フィールズ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】トシハル、モトクボタ
(72)【発明者】
【氏名】ツォン－チー、ファン
(72)【発明者】
【氏名】エマ、ペレグリ－オデイ
(72)【発明者】
【氏名】スティーブン、ダブリュー．ヘリング
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C076AA11
4C076CC14
4C076DD09F
4C076DD09Q
4C076DD21Q
4C076DD23Q
4C076DD38Q
4C076DD51Q
4C076DD67Q
4C076EE23Q
4C076EE41Q
4C076FF63
4C084AA02
4C084AA03
4C084DC15
4C084MA16
4C084NA03
4C084NA05
4C084ZA53
(57)【要約】
第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体を含む液体組成物であって、グリセロール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、ベタイン、プロリン、アルギニン、ヒスチジン、ＮａＣｌ、カルシウム、界面活性剤、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン、およびアルブミンから選択される１以上の安定剤を含み、プロテアーゼ含有量が３０ｎｇ／１，０００ ＦＶＩＩＩ ＩＵ以下であり、前記液体組成物の浸透圧が３５０～８００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである、液体組成物。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体を含む液体組成物であって、グリセロール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、ベタイン、プロリン、アルギニン、ヒスチジン、ＮａＣｌ、カルシウム、界面活性剤、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン、およびアルブミンから選択される１以上の安定剤を含み、プロテアーゼ含有量が３０ｎｇ／１，０００ ＦＶＩＩＩ ＩＵ以下であり、前記液体組成物の浸透圧が３５０～８００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである、液体組成物。
【請求項2】
グリセロール、ソルビトール、スクロース、トレハロースおよびベタインの濃度が０．１～０．３Ｍである、液体組成物。
【請求項3】
プロリンの濃度が０．１０～０．４５Ｍである、液体組成物。
【請求項4】
アルギニンの濃度が０．００１～０．１０Ｍである、液体組成物。
【請求項5】
ヒスチジンの濃度が０．００３～０．０２５Ｍである、液体組成物。
【請求項6】
ＮａＣｌの濃度が０．１～０．２Ｍである、液体組成物。
【請求項7】
カルシウムの濃度が０．０１～０．０４Ｍである、液体組成物。
【請求項8】
ポリソルベート８０および２０並びにポロキサマー１８８から選択される界面活性剤の濃度が０．０２％である、液体組成物。
【請求項9】
アンチトロンビンＩＩＩおよびヘパリンから選択されるＦＶＩＩＩプロテアーゼ阻害剤の濃度が０．１～５Ｕ／ｍＬである、液体組成物。
【請求項10】
アルブミンの濃度が０．５～５％である、液体組成物。
【請求項11】
第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子の複合体がヒト由来である、液体組成物。
【請求項12】
ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦがヒト血漿由来である、液体組成物。
【請求項13】
第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子の複合体が組換え由来である、液体組成物。
【請求項14】
第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体が少なくとも１００日間安定である、液体組成物。
【請求項15】
第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体を含む液体組成物を得る方法であって、ａ）精製または部分精製されたＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ含有液体バルクを得る工程；
ｂ）前記バルクをアフィニティー樹脂で処理してプロテアーゼを除去する工程；
ｃ）安定剤を添加してより安定なＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ含有溶液を得る工程；
ｄ）工程ｃ）で得られた組成物を５℃～３０℃の温度で保存する工程
を含む、方法。
【請求項16】
アフィニティークロマトグラフィーがヒドロキシアパタイト、シバクロンブルー、プロシオンレッド、ヘパリン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、リジン、ベンズアミジン、またはそれらの組合せから選択されるアフィニティー樹脂で行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
安定剤がグリセロール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、ベタイン、プロリン、アルギニン、ヒスチジン、ＮａＣｌ、カルシウム、界面活性剤、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン、アルブミン、またはそれらの組合せから選択される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項18】
最終組成物が３５０～８００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧を有する、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体が少なくとも１００日間安定である、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
本開示は、医薬製品の分野に関する。特に、本願は、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体を含む治療用濃縮物の新規液体製剤およびその調製のための方法に関する。
本開示は、医薬製品の分野に関する。特に、本願は、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体を含む治療用濃縮物の新規液体製剤およびその調製のための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
背景
フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）は、多量体構造を持つ血漿タンパク質であり、様々な形態の分子量は、各単量体サブユニットの約２３０，０００ダルトン（Ｄａ）から、分子量の大きい多量体では２，０００万ダルトンを超えるまで多様であり、最大の既知の可溶性タンパク質を形成している。その血漿濃度はおよそ５～１０μｇ／ｍｌ前後であり（Siedlecki et al., Blood (1996) v. 88, 8, 2939-2950）、より小さいサイズの血漿形態は二量体に相当するもので、およそ５０００００Ｄａの大きさである。
フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）は、多量体構造を持つ血漿タンパク質であり、様々な形態の分子量は、各単量体サブユニットの約２３０，０００ダルトン（Ｄａ）から、分子量の大きい多量体では２，０００万ダルトンを超えるまで多様であり、最大の既知の可溶性タンパク質を形成している。その血漿濃度はおよそ５～１０μｇ／ｍｌ前後であり（Siedlecki et al., Blood (1996) v. 88, 8, 2939-2950）、より小さいサイズの血漿形態は二量体に相当するもので、およそ５０００００Ｄａの大きさである。
【0003】
ＶＷＦは一次止血に不可欠な役割を有し、損傷した血管表面に血小板を接着して血小板プラグの形成を担い、ここでフィブリン凝固形成のメカニズムが進行する。分子量が大きい多量体ほどより効率的に内皮下への血小板接着機構を支持することが示唆されており、ＶＷＦ濃縮製剤の臨床的有効性は、これらのより高分子量の多量体の濃度と関連付けられている（Metzner et al., Haemophilia (1998) 4, 25-32）。
【0004】
これに加えて、血漿中ではＶＷＦは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）のトランスポーターおよび安定剤の一部でもあり、自然状態のＦＶＩＩＩ因子はＶＷＦの多量体に連結していることが見出されている。第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子（ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ）の複合体は、長さ１１５０ｎｍに達する（Furuya K et al., Vox Sanguinis (2006) 91, 119-125）。これに加えて、より小さな球形態のＶＷＦは約１４９×７７×３．８ｎｍの大きさであり、剪断力に応じてその構造を伸長型または直線型に変化させることができる（Siedlecki et al., Blood (1996) 88, 2939-2950）。ＦＶＩＩＩの血漿濃度は約０．０５～０．１μｇ／ｍｌ前後（ＶＷＦの約５０分の１～１００分の１）である。
【0005】
ＶＷＦの量的または質的欠損は一次止血に変化をもたらし、フォン・ヴィレブランド病として知られ、出血障害として現れる。精製ＶＷＦ濃縮製剤および機能的ＶＷＦ含有量の高いＦＶＩＩＩ濃縮製剤は、フォン・ヴィレブランド病の治療において治療的に使用される。
【0006】
考慮しなければならないもう一つの側面は、ＶＷＦがＦＶＩＩＩの天然の安定剤であることから、ＶＷＦ含有量の高いＦＶＩＩＩ濃縮製剤は、血友病Ａの治療に使用した場合、多くの利点を有する可能性があり、多数の著者が指摘しているように、例えば、輸注したＦＶＩＩＩの生体内での平均寿命が長いこと、ＦＶＩＩＩ阻害抗体に対して保護効果があること（Gensana M. et al., Haemophilia, (2001) v.7, 369 374] [Bjorkman S. et al., Clin Pharmacokinet, (2001) v.40, 815-832） （Behrmann K. et al., Thromb Haemost, (2002) v.88, 221-229）およびＦＶＩＩＩ活性阻害抗体の発現頻度が低い可能性があること（Goudemand J. et al., Blood (2006) 107, 46-51）が挙げられる。
【0007】
現在、第ＶＩＩＩ因子製剤は、保存中にＦＶＩＩＩとフォン・ヴィレブランド因子の生物学的活性を維持するために凍結乾燥されている。凍結乾燥製剤は、患者に注射する前に再構成してシリンジに移さなければならず、患者にとって面倒で時間のかかるものである。しかし、液体ですぐに使用できるＦＶＩＩＩ製剤またはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦは再構成の必要がなく、現在の凍結乾燥製剤よりもはるかに患者に優しい。また、液体ＦＶＩＩＩ製剤はシリンジ充填がしやすい。しかしながら、現在のＦＶＩＩＩ製剤は液体状態では数時間またはせいぜい数日しか安定でない（初期力価の８０％超を保持していない）。
【0008】
ＰＣＴ出願ＷＯ２０１４０２６９５４Ａ１では、ＣａＣｌ２と糖類／ポリオールを含むＦＶＩＩＩ液体製剤が従前に記載されているが、浸透圧が８００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇを超える高い安定剤濃度であった。
【0009】
ＰＣＴ出願ＷＯ２００９１３３２００Ａ１では、非常に低濃度のＣａＣｌ２を含む液体製剤が、いくつかのタンパク質複合体を安定化する可能性があることが示唆されている。それらのＦＶＩＩＩとの併用は記載されていない。
【0010】
スペイン特許出願ＥＳ２２８０９２４Ｔ３では、リガンドとしてヘパリン、プロテアーゼ阻害剤としてアンチトロンビン、およびＥＤＴＡのような金属キレーターを含むＦＶＩＩＩ製剤が従前に記載されている。しかしながら、本明細書に記載される本発明は、アフィニティー処理と相加的であり、これは自明ではなく、はるかに長い安定化時間を提供する。
【0011】
欧州特許出願ＥＰ３４８３１７３Ａは、第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを得るための賦形剤を開示している。しかしながら、ＥＰ３４８３１７３出願はＡＴＩＩＩの使用は開示していない。ＡＴＩＩＩの添加は重要であり、達成された安定化レベルはＡＴＩＩＩの存在によるものであり、その結果、他の製品と比較してはるかに安定な液体製剤が得られる。さらに、ＥＰ３４８３１７３出願に記載されている疎水性クロマトグラフィーは、本発明によって開発されたアフィニティークロマトグラフィーとは全く異なる。特に、アフィニティークロマトグラフィーによってプロテアーゼが除去されたという記述はない。
【0012】
液体ＦＶＩＩＩ組成物からプロテアーゼを除去してその安定性を改善するためのアフィニティーリガンドの使用は、一般論としてすでに知られている。例えば、欧州特許出願ＥＰ２１２６１０６には、ＦＶＩＩＩを安定化させるためにデキストラン硫酸を哺乳動物細胞培養培地に添加することが開示されている。これは培地中のプロテアーゼ活性を阻害または中和するが、プロテアーゼを除去するわけではかった。また、欧州特許出願ＥＰ０６０７３９２にはデキストラン硫酸アフィニティーカラムを用いたチモーゲン（第ＩＩ因子と第Ｘ因子）の分離および精製が記載されている。デキストラン硫酸はＦＩＸおよびＦＸに親和性があるので、ＦＩＸおよびＦＸをデキストラン硫酸カラムに吸着することにより他の因子から分離する。
【0013】
全てのＦＶＩＩＩ製剤およびＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体製剤は、液状では不安定であるため、現在凍結乾燥状態で包装されている。
【0014】
米国特許２００５００７４８６６には、血漿由来ＦＶＩＩＩの液体製剤用の安定化製剤が記載されており、これは２５℃で保存した場合、８週間にわたり初期ＦＶＩＩＩ力価の６７．６％を保持する。本発明者らは、この製剤を使用することで、２５℃で１２週間または５℃で１２か月間、開始時の第ＶＩＩＩ因子：Ｃ（第ＶＩＩＩ因子凝固活性）の５０％を保持できると推定した。これらの限界を超えて液体状態でより多量のＦＶＩＩＩ：Ｃを保存する他の方法論または医薬製剤は記載されていない。
【0015】
ＦＶＩＩＩの液体製剤の回収と安定性は、米国特許２００５００７４８６６に記載されているものを超えており、製剤の中には、５℃で少なくとも４か月間、開始時の第ＶＩＩＩ因子：Ｃ（１００～２００単位／ｍＬ）の９０％以上の保持、または少なくとも６か月間、開始時の第ＶＩＩＩ因子：Ｃの８０％を超える保持を示すものがある。観察された６か月の安定性は予期されず、研究がまだ進行中であるため、実際の安定性は６か月を超える可能性がある。
【0016】
本発明者らは、意外にも、ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体を含む液体組成物の安定性を高め、液体状体で調製し、患者が使用するために製造、貯蔵、および流通を可能とするに十分な期間、貯蔵されるようにするための新規製剤を開発した。さらに、本発明者らは、ＦＶＩＩＩ不活性化タンパク質の除去を含む独特な製造方法を特定した。
【発明の概要】
【0017】
概要
第１の側面において、本発明は、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体を含む液体組成物であって、グリセロール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、ベタイン、プロリン、アルギニン、ヒスチジン、ＮａＣｌ、カルシウム、界面活性剤、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン、およびアルブミンから選択される１以上の安定剤を含み、プロテアーゼ含有量が３０ｎｇ／１，０００ ＦＶＩＩＩ ＩＵ以下であり、前記液体組成物の浸透圧が３５０～８００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである液体組成物に関する。
第１の側面において、本発明は、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体を含む液体組成物であって、グリセロール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、ベタイン、プロリン、アルギニン、ヒスチジン、ＮａＣｌ、カルシウム、界面活性剤、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン、およびアルブミンから選択される１以上の安定剤を含み、プロテアーゼ含有量が３０ｎｇ／１，０００ ＦＶＩＩＩ ＩＵ以下であり、前記液体組成物の浸透圧が３５０～８００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである液体組成物に関する。
【0018】
一態様では、グリセロール、ソルビトール、スクロース、トレハロースおよびベタインの濃度は、０．１～０．３Ｍである。
【0019】
一態様では、プロリンの濃度は、０．１０～０．４５Ｍである。
【0020】
一態様では、アルギニンの濃度は、０．００１～０．１０Ｍである。
【0021】
一態様では、ヒスチジンの濃度は、０．００３～０．０２５Ｍである。
【0022】
一態様では、ＮａＣｌの濃度は、０．１～０．２Ｍである。
【0023】
一態様では、カルシウムの濃度は、０．０１～０．０４Ｍである。
【0024】
一態様では、ポリソルベート８０および２０並びにポロキサマー１８８から選択される界面活性剤の濃度は、０．０２％である。
【0025】
一態様では、アンチトロンビンＩＩＩおよびヘパリンから選択されるＦＶＩＩＩプロテアーゼ阻害剤の濃度は、０．１～５Ｕ／ｍＬの間である。
【0026】
一態様では、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子の複合体は、ヒト由来である。一態様では、前記ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦは、ヒト血漿由来である。
【0027】
一態様では、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子の複合体は、組換え由来である。
【0028】
一態様では、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子の複合体は、少なくとも１００日間安定である。
【0029】
一態様では、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子の複合体は、少なくとも２７０日間安定である。
【0030】
さらなる側面において、本発明は、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体を含む液体組成物を得る方法であって、
ａ）精製または部分精製されたＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ含有液体バルクを得る工程；
ｂ）前記バルクをアフィニティー樹脂で処理してプロテアーゼを除去する工程；
ｃ）安定剤を添加してより安定なＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ含有溶液を得る工程；
ｄ）工程ｃ）で得られた組成物を５℃～３０℃の温度で保存する工程
を含む方法に関する。
ａ）精製または部分精製されたＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ含有液体バルクを得る工程；
ｂ）前記バルクをアフィニティー樹脂で処理してプロテアーゼを除去する工程；
ｃ）安定剤を添加してより安定なＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ含有溶液を得る工程；
ｄ）工程ｃ）で得られた組成物を５℃～３０℃の温度で保存する工程
を含む方法に関する。
【0031】
本発明の方法は、従来技術と比較して、溶液中のＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体の安定化を高めるための種々のアプローチ：１）標準的な製造工程への新規の精製工程としてアフィニティークロマトグラフィーの追加、２）製剤中へのＦＶＩＩＩ不活化酵素阻害剤の包含、３）ＦＶＩＩＩタンパク質の変性および／または凝集を防ぐための、製剤への安定剤の包含を組み合わせたものである。
【0032】
新規精製工程は、プロテアーゼを除去するための置換クロマトグラフィーモードでのアフィニティー樹脂の使用を含む。
【0033】
一態様では、アフィニティークロマトグラフィーは、ヒドロキシアパタイト、シバクロンブルー、プロシオンレッド、ヘパリン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、リジン、ベンズアミジン、またはそれらの組合せから選択されるアフィニティー樹脂を用いて行われる。
【0034】
一態様では、本発明の方法の工程ｃ）の安定剤は、グリセロール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、ベタイン、プロリン、アルギニン、ヒスチジン、ＮａＣｌ、カルシウム、界面活性剤、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン、アルブミン、およびそれらの組合せから選択することができる。
【0035】
一態様では、グリセロール、ソルビトール、スクロース、トレハロースおよびベタインの濃度は、０．１～０．３Ｍである。
【0036】
一態様では、プロリンの濃度は、０．１０～０．４５Ｍである。
【0037】
一態様では、アルギニンの濃度は、０．００１～０．１０Ｍである。
【0038】
一態様では、ヒスチジンの濃度は、０．００３～０．０２５Ｍである。
【0039】
一態様では、ＮａＣｌの濃度は、０．１～０．２Ｍである。
【0040】
一態様では、カルシウムの濃度は、０．０１～０．０４Ｍである。
【0041】
一態様では、ポリソルベート８０および２０並びにポロキサマー１８８から選択される界面活性剤の濃度は、０．０２％である。
【0042】
一態様では、アンチトロンビンＩＩＩおよびヘパリンから選択されるＦＶＩＩＩプロテアーゼ阻害剤の濃度は、０．１～５Ｕ／ｍＬである。
【0043】
一態様では、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体は、ヒト由来である。一態様では、前記ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦは、ヒト血漿由来である。
【0044】
一態様では、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体は、組換え由来である。
【0045】
一態様では、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体は、少なくとも１００日間安定である。
【0046】
一態様では、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体は、少なくとも２７０日間安定である。
【0047】
アンチトロンビン（本明細書ではＡＴまたはＡＴ－ＩＩＩと呼称）およびヘパリンは、本発明の他の要素と組み合わせると、有効な安定剤となることが判明した。ＡＴおよびヘパリンの安定化効果は、米国特許２００５００７４８６６で示された結果に基づいて予想することができた。しかしながら、溶液中で長期間８０％を超える第ＶＩＩＩ因子：Ｃを維持するために、ＡＴ／ヘパリンと追加工程および新規安定剤を組み合わせることは明白でなかった。
【0048】
開発中、いくつかの潜在的なタンパク質安定剤が、液体第ＶＩＩＩ因子製剤に対する安定化効果について、様々な濃度で個々に評価された。単一の安定化剤、単一の阻害剤、および単一の追加精製工程だけでは、望ましい長期安定化結果は得られなかった。しかしながら、安定化剤の種々の組合せが、ＦＶＩＩＩ：Ｃを安定化するために相乗的に作用することが見出された。本発明者らは、長期（６か月以上）安定性（初期活性の８０％超を維持）を有する液体第ＶＩＩＩ因子製剤を製造することができる安定剤、阻害剤および精製工程のいくつかの組合せを見出した。安定剤、阻害剤および精製工程の最も適切な組合せの決定は直感的なものではなく、経験的に解決された。
【0049】
本発明で検討した製剤用賦形剤／安定剤は、生理学的浸透圧より高い浸透圧の高濃度で最大の安定化効果を示すことが判明した。
【0050】
一態様では、本発明は、３５０～８００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇであると見積もられる浸透圧で有効な賦形剤／安定剤の組合せを記載する。
【0051】
本発明をより良く理解するために、例として提示された添付の図面を参照し、本発明の限定ではない例示的な実施例を参照して、以下により詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0052】
【図1】図１は、ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦを得るための現在の工程と本発明の工程を比較した図を示す。米国特許５２８８８５３（製法）および５３９９６７０（製剤）に記載されているように現在製造されている製品に、本発明に記載される製剤および追加の精製を当てはめた。他の製造方法により製造された他の第ＶＩＩＩ因子製剤も同様に本発明により利益を得る可能性がある。
【図2】図２は、３０℃でのセルファイン（商標）サルフェイト処理の後のＦＶＩＩＩの安定性に関するグラフを示す。種々の濃度のセルファイン（商標）サルフェイトを試験した：３０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌおよび１５０ｍｇ／ｍｌ。
【図3】図３は、５℃でのアフィニティー樹脂処理および安定剤条件後のＦＶＩＩＩの安定性に関するグラフを示す。種々の安定剤を試験した：１）１Ｕ／ｍＬのＡＴＩＩＩと１Ｕ／ｍＬのヘパリンの組合せ；２）３０％のソルビトール、０．６ＭのプロリンおよびＡＴＩＩＩ／ヘパリン；３）セルファイン（商標）サルフェイト、ソルビトール、プロリンおよびＡＴＩＩＩ／ヘパリン；４）ブルーセファロース（商標）、ソルビトール、プロリンおよびＡＴＩＩＩ／ヘパリン；５）ブルーセファロース（商標）、ヘパリンアクチゲル（登録商標）、ソルビトール、プロリンおよびＡＴＩＩＩ／ヘパリン；６）ヘパリンアクチゲル（登録商標）、セルファイン（商標）サルフェイト、およびＡＴＩＩＩ／ヘパリン；７）ヘパリンアクチゲル（登録商標）、セルファイン（商標）サルフェイト、ソルビトール、プロリンおよびＡＴＩＩＩ／ヘパリン。
【図4】図４は、５℃でのアフィニティー樹脂処理および安定剤条件後のＦＶＩＩＩの安定性に関するグラフを示す。種々の安定剤を試験した：１）５％のアルブミンおよびＡＴＩＩＩ／ヘパリン；２）５％のアルブミン、３０ｍＭ ＣａＣｌ２およびＡＴＩＩＩ／ヘパリン；３）０．３Ｍソルビトール、０．１５Ｍプロリン、２０ｍＭ ＣａＣｌ２およびＡＴＩＩＩ／ヘパリン；４）０．３Ｍソルビトール、０．１５Ｍプロリン、０．０２％ポリソルベート８０（ＰＳ８０）およびＡＴＩＩＩ／ヘパリン；５）５０ｍＭアルギニンおよび１２．５ ヒスチジンおよびＡＴＩＩＩ／ヘパリン；６）明澄化バルク。
【図5】図５は、５℃でのアフィニティー樹脂処理および安定剤条件後のＦＶＩＩＩの安定性に関するグラフを示す。種々の安定剤を試験した：１）セルファイン（商標）サルフェイトおよび５％のアルブミンおよび４０ｍＭ ＣａＣｌ２；２）セルファイン（商標）サルフェイトおよび５％ソルビトール、０．２Ｍプロリン、５％アルブミンおよび１０ｍＭ ＣａＣｌ２；３）セルファイン（商標）サルフェイトおよび０．１５Ｍプロリン、５％アルブミン、４０ｍＭ ＣａＣｌ２および１ｍＭ ＥＤＴＡ；４）ＨＡウルトロゲル（登録商標）ヒドロキシアパタイトおよび５％ソルビトール、０．２Ｍプロリン、５％アルブミンおよび１０ｍＭ ＣａＣｌ２；５）セルファイン（商標）ＭＡＸ ＤｅｘＳ－ＶｉｒＳおよび０．１５Ｍプロリン、５％のアルブミン、４０ｍＭ ＣａＣｌ２および１ｍＭ ＥＤＴＡ。ＡＴＩＩＩおよびヘパリンは上記製剤の全てに添加した。
【発明を実施するための形態】
【0053】
詳細な説明
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、記載される方法および組成物に関連する分野における熟練者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語および語句は、別段の明示がない限り、それらに付与された意味を有する。
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、記載される方法および組成物に関連する分野における熟練者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語および語句は、別段の明示がない限り、それらに付与された意味を有する。
【0054】
用語「１つの(a)」、「１つの(an)」および「その(the)」は、文脈が別段のことを明示しない限り、複数形の参照語を含む。
【0055】
本明細書において、文脈が別段のことを要求しない限り、「含む(comprise)」という語、または「含む(comprises）」もしくは「含む(comprising)」などの変形は、記載された要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を含むことを意味するが、他の要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を除外するものではないと理解される。
【0056】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における熟練者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。例示的な方法および材料を以下に記載するが、本明細書に記載したものと類似または同等の方法および材料を使用することもでき、これらは当業者には明らかであろう。本明細書で言及される全ての刊行物および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾がある場合には、定義を含む本明細書が優先する。材料、方法、および実施例は例示に過ぎず、限定を意図するものではない。
【0057】
本明細書における各態様は、別段の明示がない限り、他の全ての態様に必要な修正を加えて適用される。
【0058】
以下の用語は、別段の指示がない限り、以下の意味を有するものと理解すべきである。
本明細書で使用する場合、「組換え体」という用語は、（１）天然に存在する環境から取り出された、（２）遺伝子が天然に見られるポリヌクレオチドの全部または一部と会合されていない、（３）天然には連結されていないポリヌクレオチドと作動可能に結合されている、または（４）天然には存在しない、生体分子、例えば、遺伝子またはタンパク質を指す。用語「組換え体」は、クローン化されたＤＮＡ単離物、化学的に合成されたポリヌクレオチド類似体、または異種系によって生物学的に合成されたポリヌクレオチド類似体、ならびにこのような核酸によってコードされるタンパク質および／またはｍＲＮＡに関して使用され得る。いくつかの態様において、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体は組換え体である。
本明細書で使用する場合、「組換え体」という用語は、（１）天然に存在する環境から取り出された、（２）遺伝子が天然に見られるポリヌクレオチドの全部または一部と会合されていない、（３）天然には連結されていないポリヌクレオチドと作動可能に結合されている、または（４）天然には存在しない、生体分子、例えば、遺伝子またはタンパク質を指す。用語「組換え体」は、クローン化されたＤＮＡ単離物、化学的に合成されたポリヌクレオチド類似体、または異種系によって生物学的に合成されたポリヌクレオチド類似体、ならびにこのような核酸によってコードされるタンパク質および／またはｍＲＮＡに関して使用され得る。いくつかの態様において、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体は組換え体である。
【0059】
本明細書で使用する場合、「ヒト血漿由来」という用語は、ドナーからプールされたヒト血漿の標準品から得られる生体分子、例えば、遺伝子またはタンパク質を指す。いくつかの態様では、ヒト血漿由来という用語は、ヒト血漿由来の第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体を指して使用される。
【0060】
本明細書で使用する場合、「血漿由来製品」という用語は、血漿または凝固タンパク質が分離または取り出され、凝固因子濃縮物（特定の凝固タンパク質、液体または粉末として凍結乾燥される）または新鮮凍結血漿が製造される提供ヒト血液から作られた製品を指す。従来の血漿分画法の一例としてコーン法がある。
【0061】
本明細書で使用する場合、「プロテアーゼ」という用語は、タンパク質またはポリペプチドのより小さなアミノ酸ポリマーへの加水分解を触媒する酵素群のいずれをも指す。
【0062】
本明細書で使用する場合、「安定剤」という用語は、分解を防ぐために使用される化学物質を指す。いくつかの態様では、安定剤は、ソルビトール、プロリン、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン、塩化カルシウムおよびアルブミンである。
【0063】
本明細書で使用する場合、「リガンド」および「アフィニティー樹脂」という用語は、プロテアーゼを除去するために使用される化学物質を指す。いくつかの態様では、リガンドまたはアフィニティー樹脂は、ヒドロキシアパタイト、シバクロンブルー、プロシオンレッド、ヘパリン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、リジン、およびベンズアミジンである。
【0064】
本明細書で使用する場合、「ＦＶＩＩＩ力価」という用語は、当業者に周知の欧州薬局方発色アッセイを用いて決定される第ＶＩＩＩ因子：Ｃ力価（ＩＵ）を指す。
【0065】
本明細書で使用する場合、「ＶＷＦ力価」という用語は、当業者に周知の欧州薬局方に記載されているようなリストセチン補因子アッセイを用いて決定されるフォン・ヴィレブランド因子力価（ＩＵ／ｍＬ）を指す。
【0066】
Ｉ．ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ
本発明は、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体を含み、ソルビトール、プロリン、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン、塩化カルシウム、アルブミンおよびそれらの組合せを含む液体組成物に関する。
本発明は、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体を含み、ソルビトール、プロリン、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン、塩化カルシウム、アルブミンおよびそれらの組合せを含む液体組成物に関する。
【0067】
第ＶＩＩＩ因子は血液凝固に関与し、第ＩＸａ因子の補因子であり、Ｃａ２＋およびリン脂質の存在下で、第Ｘ因子を活性化合物形態Ｘａに変換する複合体を形成する。第ＶＩＩＩ因子遺伝子は、２つの選択的にスプライシングされる転写産物を生成する。転写変異体１は、血漿中を循環し、フォン・ヴィレブランド因子と非共有結合複合体として会合する大きな糖タンパク質であるアイソフォームａをコードする。このタンパク質は、複数の切断事象を受ける。転写変異体２は、主として第ＶＩＩＩ因子ｃのリン脂質結合ドメインからなる小さな推定タンパク質であるアイソフォームｂをコードする。この結合ドメインは、凝固活性に不可欠である。
【0068】
第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子の複合体は、強固に結合した複合体（ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ）として血漿中を循環する異なるが関連のある２つの糖タンパク質である。それらの欠損または構造的欠陥は、最も一般的な遺伝性出血性疾患、すなわち血友病Ａ（ＨＡ）とフォン・ヴィレブランド病（ＶＷＤ）の原因である。ＶＷＦは止血において二重の役割を担い、第一に、それは血栓形成時に血小板の血栓形成表面への接着ならびに血小板同士の凝集を促進し、第二に、血漿中のＦＶＩＩＩの担体である。ＦＶＩＩＩは凝固カスケードにおいて活性化第ＩＸ因子による第Ｘ因子の活性化を促進する補因子として働く。
【0069】
いくつかの態様では、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体は、ヒト由来または組換え由来である。
【0070】
いくつかの態様では、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体は、少なくとも１００日間安定である。いくつかの態様では、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体は、少なくとも２７０日間安定である。
【0071】
ＩＩ．第ＶＩＩＩ因子を得る方法
本発明は、液体第ＶＩＩＩ因子組成物を得るための方法に関する。
本発明は、液体第ＶＩＩＩ因子組成物を得るための方法に関する。
【0072】
本発明の方法において、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体の濃縮物を得る方法は、
ａ）精製または部分精製されたＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ含有液体バルクを得ること；
ｂ）前記バルクをアフィニティー樹脂で処理してプロテアーゼを除去すること；
ｃ）安定剤を添加してより安定なＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ含有溶液を得ること；
ｄ）工程ｃ）で得られた組成物を５℃～３０℃の温度で保存すること
を特徴とする。
ａ）精製または部分精製されたＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ含有液体バルクを得ること；
ｂ）前記バルクをアフィニティー樹脂で処理してプロテアーゼを除去すること；
ｃ）安定剤を添加してより安定なＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ含有溶液を得ること；
ｄ）工程ｃ）で得られた組成物を５℃～３０℃の温度で保存すること
を特徴とする。
【0073】
工程ｂ）では、ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦを含有するバルクを撹拌し、次いで、濾過または遠心分離して、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦタンパク質を吸収することなく樹脂を除去する。この方法は、工業的規模の生産において大きな利点がある。この方法は、ごく少量のアフィニティー樹脂しか必要とせず、生成物の代わりに不純物を結合するため、カラムを使用しない。アフィニティー樹脂の添加量は、ＦＶＩＩＩ活性１，０００単位あたりアフィニティー樹脂約１ｍＬである。ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦの吸収工程が不要であるため、複雑なクロマトグラフィー操作が不要である。
【0074】
いくつかの態様では、アフィニティークロマトグラフィーは、ヒドロキシアパタイト、シバクロンブルー、プロシオンレッド、ヘパリン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、リジン、およびベンズアミジンまたはそれらの組合せから選択されるアフィニティー樹脂を用いて行われる。いくつかの好ましい態様では、アフィニティークロマトグラフィーは、セルファイン（商標）サルフェイト（ＪＮＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、日本）、ＨＡウルトロゲル（登録商標）ヒドロキシアパタイト（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）、セルファイン（商標）ＭＡＸ ＤｅｘＳ－ＶｉｒＳ（ＪＮＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、日本）、ブルーセファロース（商標）（Ｃｙｔｉｖａ、ＵＳＡ）、ヘパリンアクチゲル（登録商標）（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、ＵＳＡ）を用いて行われる。
【0075】
一態様では、本発明の方法の工程ｃ）の安定剤は、グリセロール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、ベタイン、プロリン、アルギニン、ヒスチジン、ＮａＣｌ、カルシウム、界面活性剤、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン、アルブミンおよびそれらの組合せから選択することができる。
【0076】
いくつかの態様では、安定剤は、３５０～８００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧を有する。
【0077】
いくつかの態様では、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体は、少なくとも１００日間安定である。
【0078】
第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体の方法、組成物、および使用は、以下の限定されない例によりさらに説明される。
【実施例】
【0079】
実施例１：本発明によるアフィニティークロマトグラフィー後のＦＶＩＩＩの安定性
アルファネート（登録商標）（Ｇｒｉｆｏｌｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＬＬＣ、ＵＳＡ）を実験の出発材料として使用した。製剤の数本のバイアルを注射水で再構成し、それらの内容物をプールし、その後、追加の精製工程を行い、これらの工程によって第ＶＩＩＩ因子不安定化化合物が除去され得るかどうか、および製剤の安定性が改善され得るかどうかを検討した。
アルファネート（登録商標）（Ｇｒｉｆｏｌｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＬＬＣ、ＵＳＡ）を実験の出発材料として使用した。製剤の数本のバイアルを注射水で再構成し、それらの内容物をプールし、その後、追加の精製工程を行い、これらの工程によって第ＶＩＩＩ因子不安定化化合物が除去され得るかどうか、および製剤の安定性が改善され得るかどうかを検討した。
【0080】
例えば、再構成製品を硫酸化セルロースアフィニティークロマトグラフィー樹脂（セルファイン（商標）サルフェイト、ＪＮＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、図２参照）で処理した場合、再構成製品が３０℃の加速保存条件下で溶液中にとどまり、初期活性の８０％以上を維持する期間は、１日（処理無し）から１０日（処理有り）に延長された。他のアフィニティークロマトグラフィー樹脂による処理も、同様に製品の安定性を延長することが認められた。例えば、シブリコンブルーアガロース（ブルーセファロース（商標）、Ｃｙｔｉｖａ）またはヘパリンアガロース（ヘパリンアクチゲル（登録商標）、Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）で再構成製品を処理すると、液体ＦＶＩＩＩが３０℃で初期活性の８０％以上を維持できる期間が６～９日に延長され（結果は示されていない）、リジンアガロース樹脂で処理すると、３０℃で保存した場合は１日未満から５日に、５℃で保存した場合は５日から２０日に製品の安定性が増加した。デキストラン硫酸、ヒドロキシアパタイト、プロキオンレッド、リジン、ベンズアミジンなどの他のアフィニティー樹脂も同様の結果を示した。
【0081】
実施例２：本発明の安定剤の添加によるＦＶＩＩＩの安定性
本実施例では、アルファネート（登録商標）を上述の樹脂の１以上で処理した後、アルギニンおよびヒスチジンならびに以下の安定剤：アンチトロンビン、ヘパリン、アルブミン、プロリン、ソルビトール、グリセロール、ε－アミノ－カプロン酸（ＥＡＣＡ）、トレハロース、ベタイン、セリン、グリシン、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー１８８、ＣａＣｌ２、スクロースおよびＮａＣｌのうち１以上を配合した。様々な組合せと濃度のほとんど全ての安定化剤が、追加の精製工程と組み合わされた場合に、ＦＶＩＩＩの安定性をアルギニンおよびヒスチジン単独で見られた安定性よりも延長することができた。
本実施例では、アルファネート（登録商標）を上述の樹脂の１以上で処理した後、アルギニンおよびヒスチジンならびに以下の安定剤：アンチトロンビン、ヘパリン、アルブミン、プロリン、ソルビトール、グリセロール、ε－アミノ－カプロン酸（ＥＡＣＡ）、トレハロース、ベタイン、セリン、グリシン、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー１８８、ＣａＣｌ２、スクロースおよびＮａＣｌのうち１以上を配合した。様々な組合せと濃度のほとんど全ての安定化剤が、追加の精製工程と組み合わされた場合に、ＦＶＩＩＩの安定性をアルギニンおよびヒスチジン単独で見られた安定性よりも延長することができた。
【0082】
これらの樹脂処理と安定剤の組合せのいくつかによる影響を図３に示す。アルファネート（登録商標）を再構成し、ＡＴＩＩＩおよびヘパリン（各１単位／ｍＬ）を配合した場合、ＦＶＩＩＩ活性は１００日間安定であった（－●－）。ＡＴＩＩＩとヘパリンに加えて）３０％ソルビトールと０．６Ｍプロリンを添加した場合、ＦＶＩＩＩ活性は約１５０日間安定であった（－Ｘ－）。再構成液を製剤前に親和性樹脂であるセルファイン（商標）サルフェイト（－■－）またはブルーセファロース（商標）（－▲－）で処理した場合、ＦＶＩＩＩ活性の安定性は１８０日～２７０日以上に延長した。再構成液をヘパリンアクチゲル（登録商標）とブルーセファロース（商標）（－◆－）またはヘパリンアクチゲル（登録商標）とセルファイン（商標）サルフェイト（－□－）の２種類の樹脂で処理した場合、ＦＶＩＩＩ活性は少なくとも２７０日間安定であった。
【0083】
上記製剤の浸透圧（約２５００ｍＯｓｍ／ｋｇ）は、高濃度の賦形剤／安定剤を使用しているために、生理学的浸透圧よりもはるかに高い。これは、予備研究のために最大限の安定化効果を確保するための意図的なものである。さらに高い浸透圧を持つ同じ賦形剤または異なる賦形剤の他の組合せも試験し、さらに大きな安定化効果が得られることが判明した。しかしながら、高浸透圧製品は静脈内薬物送達には望ましくない性質があるため、低濃度および低浸透圧の安定化剤の組合せで同じ安定化効果が得られるかどうかを判定するためにさらなる研究を行った。
【0084】
そこで、浸透圧が生理学的浸透圧付近のいくつかの安定化製剤について、アルファネート（登録商標）プレバルク材料をセルファイン（商標）サルフェイトで処理した後、溶液中のＦＶＩＩＩ活性に対する安定化効果を評価した。図４は、評価されたいくつかの安定化製剤の安定化効果を示す。これらの試験製剤のＦＶＩＩＩ濃度は１８５単位／ｍＬで、浸透圧は３５５～８１９ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲であった。比較のため、アルファネート（登録商標）製剤の浸透圧は１５０ＦＶＩＩＩ単位／ｍＬで３６９±４０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２００ＦＶＩＩＩ単位／ｍＬで４３１±３４ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである。各配合製剤の推定浸透圧を図４に示す。
【0085】
製剤の浸透圧は以下の通り。
【0086】
【表1】
【0087】
現在製剤化されているアルファネート（登録商標）（図４の明澄化バルク、製剤６を参照）は、溶液中で数日間しか安定でない。このバルクは１００ｍＭアルギニン、２５ｍＭヒスチジンおよび０．５％アルブミンが配合されている。
【0088】
しかしながら、中間バルクを図１に示すように樹脂で処理し、その後、同量のアルギニン、ヒスチジンおよびアルブミンとＡＴＩＩＩおよびヘパリン（各２単位／ｍＬ）とを配合した場合、５℃におけるＦＶＩＩＩ：Ｃの溶液安定性は１５０日まで延長した（図４、製剤５）。
【0089】
中間バルクを樹脂で処理し、その後、通常量の半分のアルギニンおよびヒスチジン（浸透圧を下げるため）と、ＡＴＩＩＩおよびヘパリン（各２単位／ｍＬ）および５％アルブミンＦＶＩＩＩ：Ｃを配合した場合、溶液中の安定性は２００日まで延長した（図４、製剤１）。この製剤にＣａＣｌ２を加えると、溶液の安定性は２００日をはるかに超えた（図４、製剤２）。
【0090】
中間バルクを樹脂で処理し、その後、通常量の半分のアルギニンおよびヒスチジンと、ＡＴＩＩＩおよびヘパリン（各２単位／ｍＬ）、ソルビトールおよびプロリン（アルブミンは含まない）、ならびにＣａＣｌ２またはポリソルベート８０を配合した場合にも、溶液中の安定性は２００日を十分に超えて増加した（図４、製剤３、４）。
【0091】
【0092】
製剤の浸透圧は以下の通り。
【0093】
【表2】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【国際調査報告】