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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-27
(54)【発明の名称】哺乳類の樹状細胞の過剰活性化因子
(51)【国際特許分類】
A61K 39/00 20060101AFI20240319BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20240319BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240319BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20240319BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20240319BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240319BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240319BHJP
【ＦＩ】
A61K39/00 G
A61K39/39
A61K35/17
A61K47/34
A61K9/14
A61P37/04
A61P35/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024506588
(86)(22)【出願日】2022-04-11
(85)【翻訳文提出日】2023-12-08
(86)【国際出願番号】 US2022071664
(87)【国際公開番号】W WO2022221827
(87)【国際公開日】2022-10-20
(31)【優先権主張番号】63/173,958
(32)【優先日】2021-04-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/246,740
(32)【優先日】2021-09-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523385846
【氏名又は名称】コーナー セラピューティクス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】フィン， ケルシー ケー．
(72)【発明者】
【氏名】チャウ， ジョナサン
(72)【発明者】
【氏名】ゴセリン， エミリー
(72)【発明者】
【氏名】ジヴァキ， ダニア
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C076AA30
4C076CC07
4C076CC27
4C076DD09F
4C076EE23F
4C076GG05
4C085AA03
4C085AA38
4C085BA01
4C085FF02
4C085FF12
4C085FF14
4C085FF18
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB63
4C087CA04
4C087MA05
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB26
(57)【要約】
本開示は、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）化合物、および哺乳類の樹状細胞、例えばヒト樹状細胞またはイヌ樹状細胞の過剰活性化におけるその使用に関する。本開示はまた、ＬＰＣと、病原体認識受容体アゴニスト、抗原、および哺乳類の樹状細胞のうちの１つまたは複数とを含む組成物、ならびに組成物の製造および使用のための方法にも関する。特に、本開示は、単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と、ＴＬＲ７／８アゴニストとを含み、該アシル鎖がＣ１３～Ｃ２２アシル鎖またはＣ１３～Ｃ２４アシル鎖である組成物を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と、ＴＬＲ７／８アゴニストとを含む組成物であって、前記アシル鎖がＣ１３～Ｃ２４アシル鎖である組成物。
【請求項2】
前記アシル鎖が、Ｃ１８～Ｃ２２アシル鎖またはＣ２１～Ｃ２４アシル鎖である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
抗原をさらに含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
樹状細胞をさらに含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項5】
単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と、抗原とを含む組成物であって、前記アシル鎖がＣ２１～Ｃ２４アシル鎖である組成物。
【請求項6】
樹状細胞をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項7】
ＴＬＲ７／８アゴニストをさらに含む、請求項５または請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と樹状細胞とを含む組成物であって、前記アシル鎖がＣ２１～Ｃ２４アシル鎖である組成物。
【請求項9】
ＴＬＲ７／８アゴニストをさらに含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
抗原をさらに含む、請求項８または請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
前記アシル鎖がＣ２２アシル鎖である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項12】
前記アシル鎖が完全に飽和している、請求項１から１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項13】
前記ＬＰＣが１－ベヘノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン［ＬＰＣ（２２：０）］を含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項14】
前記ＴＬＲ７／８アゴニストが、９００ダルトンまたはそれ未満の分子量を有する小分子である、請求項１から１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項15】
前記ＴＬＲ７／８アゴニストがイミダゾキノリン化合物を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項16】
前記ＴＬＲ７／８アゴニストがレシキモド（Ｒ８４８）を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項17】
前記ＴＬＲ７／８アゴニストが、ＮＬＲファミリーパイリンドメイン含有３（ＮＬＲＰ３）を阻害しない、請求項１４または請求項１５に記載の組成物。
【請求項18】
前記ＬＰＣがＬＰＣ（２２：０）を含み、前記ＴＬＲ７／８アゴニストがレシキモド（Ｒ８４８）を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項19】
前記抗原が、個体から得られた生体試料中に存在する、請求項１から１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項20】
前記生体試料が生検組織を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項21】
前記生体試料が細胞を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項22】
前記生体試料が細胞を含まない、請求項１９に記載の組成物。
【請求項23】
前記生体試料が、膿瘍からの膿を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項24】
前記抗原がタンパク質性抗原を含む、請求項１から２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項25】
前記抗原が腫瘍抗原を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項26】
前記腫瘍抗原が、合成または組換えネオ抗原を含む、請求項２５に記載の化合物。
【請求項27】
前記腫瘍抗原が、腫瘍細胞溶解物を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項28】
前記腫瘍抗原が、微生物抗原を含み、前記微生物抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、原虫抗原、および真菌抗原のうちの１つまたは複数を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項29】
前記微生物抗原が精製または組換え表面タンパク質を含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項30】
前記微生物抗原が不活化されたウイルス全体を含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項31】
前記組成物がリポソームを含まない、請求項１から３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項32】
前記組成物がＬＰＳまたはＭＰＬＡを含まない、請求項１から３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項33】
前記組成物が、ｏｘＰＡＰＣまたはｏｘＰＡＰＣの種を含まない、請求項１から３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項34】
前記組成物が、ＨＯｄｉＡ－ＰＣ、ＫＯｄｉＡ－ＰＣ、ＨＯＯＡ－ＰＣ、ＫＯＯＡ－ＰＣ、および／またはＰＧＰＣを含まない、請求項３３に記載の組成物。
【請求項35】
アジュバントをさらに含み、前記アジュバントが、アルミニウム塩アジュバント、水中スクアレン－エマルジョン、サポニン、またはそれらの組合せを含む、請求項１から３４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項36】
請求項１から３５のいずれか１項に記載の組成物と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む、医薬製剤。
【請求項37】
過剰活性化樹状細胞を産生するための方法であって、前記方法が、過剰活性化樹状細胞の産生のために、単一のＣ１３～Ｃ２４アシル鎖を有する有効量の単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と、ＴＬＲ７／８アゴニストとを含む組成物に前記樹状細胞を接触させることを含み、前記過剰活性化樹状細胞はパイロトーシスを起こさずにＩＬ－１ベータを分泌する、方法。
【請求項38】
前記樹状細胞を、エクスビボで、請求項１から３５のいずれか１項に記載の組成物または請求項３６に記載の製剤と接触させる、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記樹状細胞を、請求項３６に記載の製剤とインビボで接触させる、請求項３７に記載の方法。
【請求項40】
請求項３８に記載の方法によって産生された少なくとも１０３、１０４、１０５個または１０６個の前記過剰活性化樹状細胞と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬製剤。
【請求項41】
抗原に対する免疫応答を刺激する方法であって、有効量の請求項３６に記載の製剤を、投与することを必要とする個体に投与して、前記抗原に対する前記免疫応答を刺激することを含む、方法。
【請求項42】
有効量の請求項３６に記載の製剤を、投与することを必要とする個体に投与して前記がんを処置することを含む、がんを処置する方法。
【請求項43】
異常な細胞増殖を阻害する方法であって、異常な細胞増殖を阻害するために有効量の請求項３６に記載の製剤を、投与することを必要とする個体に投与することを含む方法。
【請求項44】
感染性疾患を処置する方法であって、有効量の請求項３６に記載の製剤を、前記感染性疾患を処置するために、投与することを必要とする個体に投与することを含む方法。
【請求項45】
前記抗原に対する免疫応答を、誘導することを必要とする個体において誘導するための、請求項３６に記載の製剤の使用。
【請求項46】
抗腫瘍免疫応答を、誘導することを必要とする個体において誘導するための請求項３６に記載の製剤の使用であって、前記個体が腫瘍を担持しているか、または腫瘍を担持していた、使用。
【請求項47】
抗微生物免疫応答を誘導することを必要とする個体において誘導するための請求項３６に記載の製剤の使用であって、前記個体が前記微生物に感染しているか、または前記微生物に曝露されていない、使用。
【請求項48】
前記個体が哺乳動物対象である、請求項１９から４７のいずれか１項に記載の組成物、製剤、方法または使用。
【請求項49】
前記個体がヒト対象である、請求項１９から４７のいずれか１項に記載の組成物、製剤、方法または使用。
【請求項50】
免疫原性組成物の調製方法であって、該方法は、ａ）腫瘍から調製した細胞の懸濁液から白血球を枯渇させて、腫瘍細胞富化懸濁液を得るステップと；
ｂ）前記腫瘍細胞富化懸濁液から細胞を溶解し、腫瘍細胞溶解物を得るステップと；
ｃ）前記腫瘍細胞溶解物を、単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）およびｔｏｌｌ様受容体７／８（ＴＬＲ７／８）アゴニストと接触させて、前記免疫原性組成物を得るステップであって、前記アシル鎖がＣ１３～Ｃ２４アシル鎖であるステップと
を含む方法。
【請求項51】
ステップａ）において、抗ＣＤ４５抗体を使用するネガティブ選択によって前記白血球を枯渇させる、請求項５０に記載の方法。
【請求項52】
前記細胞が、ステップｂ）において、１またはそれを超える凍結融解サイクルによって溶解される、請求項５０または請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記アシル鎖が、完全飽和Ｃ１８～Ｃ２２アシル鎖または完全飽和Ｃ１８～Ｃ２４アシル鎖である、請求項５０から５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項54】
前記ＬＰＣが、１－ベヘノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン［ＬＰＣ（２２：０）］を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
前記ＴＬＲ７／８アゴニストが、９００ダルトンまたはそれ未満の分子量を有する小分子である、請求項５０から５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項56】
前記ＴＬＲ７／８アゴニストがイミダゾキノリン化合物を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項57】
前記ＴＬＲ７／８アゴニストがレシキモド（Ｒ８４８）を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
前記ＴＬＲ７／８アゴニストが、ＮＬＲファミリーパイリンドメイン含有３（ＮＬＲＰ３）を阻害しない、請求項５５または請求項５６に記載の方法。
【請求項59】
前記ＬＰＣがＬＰＣ（２２：０）を含み、前記ＴＬＲ７／８アゴニストがレシキモド（Ｒ８４８）を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項60】
ステップａ）の前に、がんを有する哺乳動物対象からの前記腫瘍から試料を得て、前記試料から細胞の前記懸濁液を調製するステップをさらに含む、請求項５０から５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項61】
請求項５０から６０のいずれか１項に記載の方法によって調製された免疫原性組成物。
【請求項62】
抗がん免疫応答を誘発する方法であって、前記方法が、がんを有する哺乳動物対象に、有効量の請求項６１に記載の免疫原性組成物を投与するステップ
を含む、方法。
【請求項63】
前記抗がん免疫応答が細胞性免疫応答を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項64】
前記抗がん免疫応答が、がん抗原誘導性ＩＬ－１ベータ分泌および／またはＣＤ８＋Ｔリンパ球の活性化を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項65】
前記がんが非血液がんである、請求項６２から６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項66】
前記非血液がんが、癌、肉腫または黒色腫である、請求項６５に記載の方法。
【請求項67】
前記がんがリンパ腫である、請求項６２から６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項68】
がんを処置する方法であって、前記方法は、ａ）腫瘍細胞溶解物、単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、およびｔｏｌｌ様受容体７／８（ＴＬＲ７／８）アゴニストを含む免疫原性組成物を調製するステップであって、前記腫瘍細胞溶解物は、がんを有する哺乳動物対象から得た腫瘍の試料であるかまたはそれから調製されており、前記アシル鎖はＣ１３～Ｃ２４アシル鎖であるステップと、
ｂ）前記被験体に有効量の前記免疫原性組成物を投与するステップと
を含む、方法。
【請求項69】
前記アシル鎖が、完全飽和Ｃ１８～Ｃ２２アシル鎖または完全飽和Ｃ１８～Ｃ２４アシル鎖である、請求項６２から６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項70】
前記ＬＰＣが、１－ベヘノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン［ＬＰＣ（２２：０）］を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項71】
前記ＴＬＲ７／８アゴニストが、９００ダルトンまたはそれ未満の分子量を有する小分子である、請求項６２から７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項72】
前記ＴＬＲ７／８アゴニストがイミダゾキノリン化合物を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項73】
前記ＴＬＲ７／８アゴニストがレシキモド（Ｒ８４８）を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項74】
前記ＬＰＣが２２：０ ＬＰＣを含み、前記ＴＬＲ７／８アゴニストがレシキモド（Ｒ８４８）を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項75】
有効量の追加の治療剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項６８から７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項76】
前記追加の治療剤が、免疫チェックポイント阻害剤、抗新生物剤、および放射線治療からなる群のうちの１つまたは複数を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項77】
単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）および病原体認識受容体（ＰＲＲ）アゴニストを含む組成物であって、前記アシル鎖がＣ１３～Ｃ２４アシル鎖である、組成物。
【請求項78】
前記ＰＲＲアゴニストが、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）またはＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）のアゴニストである、請求項７７に記載の組成物。
【請求項79】
前記ＰＲＲアゴニストが、細胞質ＤＮＡセンサー（ＣＤＳ）のアゴニストまたはＩＦＮ遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）である、請求項７７に記載の組成物。
【請求項80】
前記ＰＲＲアゴニストが、Ｒ８４８、ＴＬ８－５０６、ＬＰＳ、Ｐａｍ２ＣＳＫ４およびＯＤＮ２３３６のうちの１つまたは複数を含む、請求項７７に記載の組成物。
【請求項81】
抗原をさらに含む、請求項７７～８０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項82】
樹状細胞をさらに含む、請求項７７から８１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項83】
請求項７７から８２のいずれか１項に記載の組成物と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む、医薬製剤。
【請求項84】
単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬製剤であって、前記アシル鎖がＣ２１～Ｃ２４アシル鎖である、医薬製剤。
【請求項85】
前記アシル鎖が完全飽和Ｃ２２アシル鎖である、請求項８３または請求項８４に記載の医薬製剤。
【請求項86】
前記ＬＰＣが１－ベヘノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン［ＬＰＣ（２２：０）］を含む、請求項８５に記載の医薬製剤。
【請求項87】
単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と、病原体認識受容体（ＰＲＲ）アゴニストとを含む、ヒト樹状細胞を過剰活性化するための組成物であって、前記アシル鎖がＣ２２アシル鎖であり、前記組成物が、前記ＬＰＣの代わりにＰＧＰＣを含む比較対照組成物よりも高いレベルの樹状細胞の過剰活性化を達成するのに有効である組成物。
【請求項88】
前記高いレベルの樹状細胞の過剰活性化が、前記ＬＰＣと前記ＰＲＲアゴニストとを含む前記組成物に接触させた場合に、前記ＰＧＰＣと前記ＰＲＲアゴニストとを含む前記比較対照組成物に接触させた場合よりも少なくとも２、３または４倍高いレベルの、インビトロでの前記ヒト樹状細胞からのＩＬ－１ベータ分泌の誘導を含み、前記ＰＲＲアゴニストがＬＰＳである、請求項８７に記載の組成物。
【請求項89】
前記ＬＰＣの前記濃度および前記ＰＧＰＣの前記濃度が、約１０μＭ～約８０μＭの範囲内の同じ濃度であり、前記ＬＰＳが、前記組成物と前記比較対照組成物の両方で１μｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項８８に記載の組成物。
【請求項90】
前記高いレベルの樹状細胞の過剰活性化が、前記ＬＰＣと前記ＰＲＲアゴニストとを含む前記組成物について、ヒト樹状細胞からのＩＬ－１ベータ分泌に対する脂質活性指数を含み、これは、活性単位において、前記ＬＰＣと前記ＰＲＲアゴニストとを含む前記比較対照組成物の脂質活性指数よりも少なくとも４、５または６倍高い、、請求項８８に記載の組成物。
【請求項91】
前記個体がイヌ対象である、請求項１９から４７のいずれか１項に記載の組成物、製剤、方法または使用。
【請求項92】
前記哺乳動物対象がヒト患者である、請求項６０から９０のいずれか１項に記載の組成物、製剤、方法または使用。
【請求項93】
前記哺乳動物対象が非ヒト患者である、請求項６０から９０のいずれか１項に記載の組成物、製剤、方法または使用。
【請求項94】
前記哺乳動物対象がイヌ患者である、請求項６０から９０のいずれか１項に記載の組成物、製剤、方法または使用。
【請求項95】
前記樹状細胞がヒト樹状細胞である、請求項１から９０または９２のいずれか１項に記載の組成物、製剤、方法または使用。
【請求項96】
前記樹状細胞がイヌ樹状細胞である、請求項１から９１または９４のいずれか１項に記載の組成物、製剤、方法または使用。
【請求項97】
前記樹状細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む組成物中に存在する、請求項９５または請求項９６に記載の組成物、方法または使用。
【請求項98】
前記過剰活性化樹状細胞が、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの一方または両方を分泌する、請求項３７～４９または請求項９１のいずれか１項に記載の組成物、方法または使用。
【請求項99】
界面活性剤を含む、請求項１～９８のいずれか１項に記載の組成物、製剤、方法または使用。
【請求項100】
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤を含む、請求項９９に記載の組成物、製剤、方法または使用。
【請求項101】
前記非イオン性界面活性剤が、エチレンオキシド－プロピレンオキシドコポリマーを含む、請求項１００に記載の組成物、製剤、方法または使用。
【請求項102】
前記非イオン性界面活性剤が、ポロキサマー４０７、ポロキサマー１８８およびＰ１２３のうちの１つまたは複数を含む、請求項１００に記載の組成物、製剤、方法または使用。
【請求項103】
前記非イオン性界面活性剤がポロキサマー４０７を含む、請求項１００に記載の組成物、製剤、方法または使用。
【請求項104】
ｉ）前記ＬＰＣをアルコールに溶解してＬＰＣアルコール溶液を形成し；ｉｉ）前記ＬＰＣアルコール溶液を前記非イオン性界面活性剤と混合して混合物を形成し；ｉｉｉ）前記アルコールを前記混合物から蒸発させて前記ＬＰＣと前記非イオン性界面活性剤を含む粒子を形成する、請求項１００から１０３のいずれか１項に記載の組成物、製剤、方法または使用。
【請求項105】
前記非イオン性界面活性剤が、約２．５％～２５％（ｗ／ｗ）、必要に応じて約５％～２０％（ｗ／ｗ）、必要に応じて約１５％（ｗ／ｗ）の量で存在する、請求項１００から１０４のいずれか１項に記載の組成物、製剤、方法または使用。
【請求項106】
前記ＬＰＣおよび非イオン性界面活性剤が、約１０００から２０００ナノメートルの直径を有し、必要に応じて約１５００ナノメートルの直径を有する粒子中に存在する、請求項１００から１０５のいずれか１項に記載の組成物、製剤、方法または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年９月２１日に出願された米国特許仮出願第６３／２４６，７４０号および２０２１年４月１２日に出願された米国特許仮出願第６３／１７３，９５８号の利益を主張し、これらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年９月２１日に出願された米国特許仮出願第６３／２４６，７４０号および２０２１年４月１２日に出願された米国特許仮出願第６３／１７３，９５８号の利益を主張し、これらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
ＡＳＣＩＩテキストファイルとしての配列表の提出
なし。
なし。
【0003】
分野
本開示は、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）化合物、および哺乳類の樹状細胞、例えばヒト樹状細胞またはイヌ樹状細胞の過剰活性化におけるその使用に関する。本開示はまた、ＬＰＣと、病原体認識受容体アゴニスト、抗原、およびヒトもしくはイヌ樹状細胞のうちの１つまたは複数とを含む組成物、ならびに組成物の製造および使用のための方法にも関する。
本開示は、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）化合物、および哺乳類の樹状細胞、例えばヒト樹状細胞またはイヌ樹状細胞の過剰活性化におけるその使用に関する。本開示はまた、ＬＰＣと、病原体認識受容体アゴニスト、抗原、およびヒトもしくはイヌ樹状細胞のうちの１つまたは複数とを含む組成物、ならびに組成物の製造および使用のための方法にも関する。
【背景技術】
【0004】
背景
通常、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストなどのワクチンアジュバントによる樹状細胞（ＤＣ）の成熟は、ＩＬ－１ベータ分泌につながらない。インフラマソーム活性化などの状況では、ＩＬ－１ベータ分泌が起こるが、その代償として、パイロトーシスと呼ばれる細胞死の溶解プロセスによるＤＣ死が起こる（Ｅｖａｖｏｌｄら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，４３０（２）：２１７－２３７，２０１８）。しかし、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）含有分子であるリポ多糖（ＬＰＳ）およびダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）含有分子、例えばＰＧＰＣ（１－パルミトイル－２－グルタリル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）を使用してＤＣを成熟させると、パイロトーシスを伴わずにＩＬ－１ベータを産生および分泌し、これらの生存可能なＤＣは過剰活性として特徴付けられる（Ｚａｎｏｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５２（６２９０）：１２３２－１２３６，２０１６）。実際、マウスモデルでは、過剰活性化したＤＣは、ＬＰＳのみを使用して活性化した細胞と比較して、免疫応答を誘導する能力が向上していることが示された（Ｚｈｉｖａｋｉら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ，３３（７）：１０８３８１，２０２０）。しかし、ヒトＤＣの過剰活性化に有効な刺激についてはほとんど知られていない。
したがって、ヒトＤＣの過剰活性化に適したＰＡＭＰおよびＤＡＭＰの同定が当技術分野で必要とされている。さらに、哺乳類ＤＣの過剰活性化のためのＬＰＳおよびＰＧＰＣの使用に代わるものの同定が望ましい。特に、ＬＰＳ（エンドトキシン）は強力なＰＡＭＰであるが、敗血症性ショックを引き起こす可能性があるため、ヒトへの使用は禁忌である。
通常、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストなどのワクチンアジュバントによる樹状細胞（ＤＣ）の成熟は、ＩＬ－１ベータ分泌につながらない。インフラマソーム活性化などの状況では、ＩＬ－１ベータ分泌が起こるが、その代償として、パイロトーシスと呼ばれる細胞死の溶解プロセスによるＤＣ死が起こる（Ｅｖａｖｏｌｄら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，４３０（２）：２１７－２３７，２０１８）。しかし、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）含有分子であるリポ多糖（ＬＰＳ）およびダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）含有分子、例えばＰＧＰＣ（１－パルミトイル－２－グルタリル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）を使用してＤＣを成熟させると、パイロトーシスを伴わずにＩＬ－１ベータを産生および分泌し、これらの生存可能なＤＣは過剰活性として特徴付けられる（Ｚａｎｏｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５２（６２９０）：１２３２－１２３６，２０１６）。実際、マウスモデルでは、過剰活性化したＤＣは、ＬＰＳのみを使用して活性化した細胞と比較して、免疫応答を誘導する能力が向上していることが示された（Ｚｈｉｖａｋｉら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ，３３（７）：１０８３８１，２０２０）。しかし、ヒトＤＣの過剰活性化に有効な刺激についてはほとんど知られていない。
したがって、ヒトＤＣの過剰活性化に適したＰＡＭＰおよびＤＡＭＰの同定が当技術分野で必要とされている。さらに、哺乳類ＤＣの過剰活性化のためのＬＰＳおよびＰＧＰＣの使用に代わるものの同定が望ましい。特に、ＬＰＳ（エンドトキシン）は強力なＰＡＭＰであるが、敗血症性ショックを引き起こす可能性があるため、ヒトへの使用は禁忌である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｅｖａｖｏｌｄら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，４３０（２）：２１７－２３７，２０１８
【非特許文献2】Ｚａｎｏｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５２（６２９０）：１２３２－１２３６，２０１６
【非特許文献3】Ｚｈｉｖａｋｉら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ，３３（７）：１０８３８１，２０２０
【発明の概要】
【0006】
簡単な概要
本開示は、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）化合物、および哺乳類の樹状細胞、例えばヒト樹状細胞またはイヌ樹状細胞の過剰活性化におけるその使用に関する。本開示はまた、ＬＰＣと、病原体認識受容体アゴニスト、抗原、およびヒトもしくはイヌ樹状細胞のうちの１つまたは複数とを含む組成物、ならびに組成物の製造および使用のための方法にも関する。
本開示は、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）化合物、および哺乳類の樹状細胞、例えばヒト樹状細胞またはイヌ樹状細胞の過剰活性化におけるその使用に関する。本開示はまた、ＬＰＣと、病原体認識受容体アゴニスト、抗原、およびヒトもしくはイヌ樹状細胞のうちの１つまたは複数とを含む組成物、ならびに組成物の製造および使用のための方法にも関する。
【0007】
特に、本開示は、単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と、ＴＬＲ７／８アゴニストとを含み、該アシル鎖がＣ１３～Ｃ２２アシル鎖またはＣ１３～Ｃ２４アシル鎖である組成物を提供する。いくつかの実施形態では、アシル鎖は、Ｃ１８～Ｃ２２アシル鎖、Ｃ２１～Ｃ２４アシル鎖、またはＣ２２アシル鎖である。いくつかの実施形態では、組成物は、抗原および／または樹状細胞をさらに含む。
【0008】
いくつかの態様では、本開示は、単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と、抗原とを含み、該アシル鎖がＣ２１～Ｃ２４アシル鎖である組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、樹状細胞および／またはＴＬＲ７／８アゴニストをさらに含む。
【0009】
いくつかの態様では、本開示は、単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と、樹状細胞とを含み、該アシル鎖がＣ２１～Ｃ２４アシル鎖である組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、ＴＬＲ７／８アゴニストおよび／または抗原をさらに含む。
【0010】
前述の態様のいくつかの実施形態では、抗原は、個体から得られた生体試料中に存在する。いくつかの実施形態では、生体試料は生検組織を含む。いくつかの実施形態では、生体試料は細胞を含む。他の実施形態では、生体試料は細胞を含まない。いくつかの実施形態では、生体試料は、膿瘍からの膿を含む。いくつかの実施形態では、抗原はタンパク質性抗原を含む。いくつかの実施形態では、抗原は腫瘍抗原を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は合成または組換えネオ抗原を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は腫瘍細胞溶解物を含む。いくつかの実施形態では、抗原は微生物抗原を含み、微生物抗原はウイルス抗原、細菌抗原、原虫抗原、および真菌抗原のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、微生物抗原は、精製または組換え表面タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、微生物抗原は、不活化されたウイルス全体を含む。
【0011】
いくつかの実施形態では、組成物はリポソームを含まない。いくつかの実施形態では、組成物はＬＰＳまたはＭＰＬＡを含まない。いくつかの実施形態では、組成物は、ｏｘＰＡＰＣまたはｏｘＰＡＰＣの種を含まない。いくつかの実施形態では、組成物は、ＨＯｄｉＡ－ＰＣ、ＫＯｄｉＡ－ＰＣ、ＨＯＯＡ－ＰＣ、ＫＯＯＡ－ＰＣ、および／またはＰＧＰＣを含まない。
【0012】
いくつかの実施形態では、組成物は、アジュバントをさらに含み、アジュバントは、アルミニウム塩アジュバント、水中スクアレンエマルジョン、サポニン、またはそれらの組合せを含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、本開示は、前述の態様のいずれかの組成物と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬製剤を提供する。
【0014】
他の態様では、本開示は、過剰活性化樹状細胞を産生するための方法を提供し、この方法は、過剰活性化樹状細胞の産生のために、単一のＣ１３～Ｃ２２アシル鎖またはＣ１３～Ｃ２４アシル鎖を有する有効量の単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と、ＴＬＲ７／８アゴニストとを含む組成物に樹状細胞を接触させることを含み、この過剰活性化樹状細胞はパイロトーシスを起こさずにＩＬ－１ベータを分泌する。いくつかの実施形態では、樹状細胞に、前述の実施形態のいずれか１つの組成物または医薬製剤をエクスビボで接触させる。他の実施形態では、樹状細胞には、前述の実施形態のいずれか１つの組成物を含む医薬製剤をインビボで接触させる。いくつかの態様では、本開示は、前述の実施形態によって産生された複数の過剰活性化樹状細胞と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬製剤を提供する。いくつかの実施形態では、複数は、少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６、１０７個または１０８個の過剰活性化ＤＣを含む。
【0015】
他の態様では、本開示は、単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と、病原体認識受容体（ＰＲＲ）アゴニストとを含み、該アシル鎖がＣ１３～Ｃ２２アシル鎖またはＣ１３～Ｃ２４アシル鎖である組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＲＲアゴニストは、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）またはＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）のアゴニストである。いくつかの実施形態では、ＰＲＲアゴニストは、細胞質ＤＮＡセンサー（ＣＤＳ）のアゴニストまたはＩＦＮ遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）である。いくつかの実施形態では、ＰＲＲアゴニストは、ＴＬＲ７／８アゴニストを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、抗原および／または樹状細胞をさらに含む。
【0016】
前述の態様のいくつかの実施形態では、アシル鎖はＣ２１～Ｃ２４アシル鎖である。いくつかの実施形態では、アシル鎖はＣ２２アシル鎖である。いくつかの実施形態では、アシル鎖は完全に飽和している。いくつかの実施形態では、ＬＰＣは、１－ベヘノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン［ＬＰＣ（２２：０）］を含む。
【0017】
前述の態様のいくつかの実施形態では、ＴＬＲ７／８アゴニストは、９００ダルトンまたはそれ未満の分子量を有する小分子である。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ７／８アゴニストはイミダゾキノリン化合物を含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ７／８アゴニストは、レシキモド（Ｒ８４８）を含む。いくつかの実施形態では、ＬＰＣはＬＰＣ（２２：０）を含み、ＴＬＲ７／８アゴニストはレシキモド（Ｒ８４８）を含む。
【0018】
本開示はさらに、単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）化合物と、病原体認識受容体（ＰＲＲ）アゴニストとを含み、アシル鎖がＣ２２アシル鎖である、ヒト樹状細胞の過剰活性化のための組成物であって、該組成物が、ＬＰＣの代わりにＰＧＰＣを含む比較対照組成物よりも、高いレベルの樹状細胞の過剰活性化を達成するのに有効である、組成物を提供する。いくつかの態様では、過剰活性化はインビトロまたはエクスビボで起こる。他の実施形態では、過剰活性化はインビボで起こる。いくつかの実施形態では、より高いレベルの樹状細胞の過剰活性化は、インビトロでのヒト樹状細胞からのＩＬ－１ベータの分泌を、ＬＰＣとＰＲＲアゴニストとを含む組成物に接触させた場合に、ＰＧＰＣとＰＲＲアゴニストを含む比較対照組成物に接触させた場合よりも少なくとも２、３または４倍高いレベルで誘導することを含み、ここで、ＰＲＲアゴニストはＬＰＳである。いくつかの実施形態では、ＬＰＣの濃度とＰＧＰＣの濃度は同じ濃度であり、必要に応じて約１０μＭ～約８０μＭの範囲であり、ＬＰＳは組成物と比較対照組成物の両方に１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、より高いレベルの樹状細胞の過剰活性化は、ＬＰＣとＰＲＲアゴニストとを含む組成物について、ヒト樹状細胞からのＩＬ－１ベータ分泌に対する脂質活性指数（ｌｉｐｉｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）を含み、これは、活性単位において、ＬＰＣとＰＲＲアゴニストとを含む比較対照組成物の脂質活性指数よりも少なくとも４、５または６倍高い。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【図6A-6C】図６Ａ～図６Ｂは、示された刺激による活性化の２日後のイヌ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるＩＬ－１β分泌を示し、それぞれ、Ｒ８４８単独と比較した総濃度（図６Ａ）およびドナーあたりの倍数変化（図６Ｂ）として示される。結果は、２２：０ ＬＹＳＯ ＰＣをＲ８４８と組み合わせると、イヌＰＢＭＣを刺激して、ＰＧＰＣまたはＬＰＳおよびミョウバンなどのＤＡＭＰと同等またはそれより高いレベルでＩＬ－１βを分泌させることができることを実証している。図６Ｃは、示された刺激による活性化の２日後のイヌＰＢＭＣの相対生存率を示す。結果は、イヌＰＢＭＣが２２：０のＬＹＳＯ ＰＣによる処理後も生存可能なままであることを実証している。
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【0034】
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】
【0039】
【0040】
【0041】
【0042】
【0043】
【0044】
【0045】
【0046】
【0047】
【0048】
【0049】
【0050】
【0051】
【発明を実施するための形態】
【0052】
詳細な説明
本開示は、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）化合物およびヒト樹状細胞の過剰活性化におけるその使用に関する。本開示はまた、ＬＰＣと、病原体認識受容体アゴニスト、抗原、およびヒト樹状細胞のうちの１つまたは複数とを含む組成物、ならびに組成物の製造および使用のための方法にも関する。さらなる実施形態では、樹状細胞は非ヒト樹状細胞であるが、但し、樹状細胞はげっ歯類樹状細胞ではない。
本開示は、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）化合物およびヒト樹状細胞の過剰活性化におけるその使用に関する。本開示はまた、ＬＰＣと、病原体認識受容体アゴニスト、抗原、およびヒト樹状細胞のうちの１つまたは複数とを含む組成物、ならびに組成物の製造および使用のための方法にも関する。さらなる実施形態では、樹状細胞は非ヒト樹状細胞であるが、但し、樹状細胞はげっ歯類樹状細胞ではない。
【0053】
一般的な技術および定義
本開示の実施は、特に明記しない限り、当業者の技術の範囲内にある分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を使用する。
本開示の実施は、特に明記しない限り、当業者の技術の範囲内にある分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を使用する。
【0054】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、特に指示されない限り、複数形の言及を含む。例えば、「１つの」賦形剤は、１またはそれを超える賦形剤を含む。
【0055】
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」というフレーズはオープンエンドであり、そのような実施形態が追加の要素を含み得ることを示している。対照的に、「からなる」というフレーズはクローズドであり、そのような実施形態が追加の要素を含まないこと（微量不純物を除く）を示している。「から本質的になる」というフレーズは部分的にクローズドであり、そのような実施形態の基本的な特性を実質的に変化させない要素をそのような実施形態がさらに含み得ることを示している。
【0056】
値に関して本明細書で使用される「約」という用語は、その値の９０％～１１０％を包含する（例えば、約９００ダルトンの分子量は、９１０ダルトン～９９０ダルトンの分子量を指す）。
【0057】
物質の「有効量」または「十分な量」は、臨床結果をはじめとする、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用されている文脈に依存する。例えば、免疫原性組成物の投与に関連して、有効量は、十分な抗原と、抗原に対する免疫応答（例えば、抗原反応性抗体および／または細胞性免疫応答）を刺激するためのリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）化合物およびＰＲＲアゴニストの一方または両方とを含む。
【0058】
「個体」および「対象」という用語は哺乳動物を指す。「哺乳動物」には、限定されるものではないが、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、農場動物、スポーツ動物、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、およびペット（例えば、イヌおよびネコ）が含まれる。いくつかの実施形態では、対象は、がんおよび／または感染性疾患に罹患しているヒト患者などのヒト患者である。
【0059】
免疫原性組成物に関して本明細書で使用される「用量」という用語は、任意の時点で対象によって摂取された（投与されたまたは受けられた）免疫原性組成物の測定された部分を指す。
【0060】
本明細書で使用される「単離された」および「精製された」という用語は、天然に関連する少なくとも１つの成分から取り出された（例えば、その元の環境から取り出された）材料を指す。一例として、ＬＰＣに関して使用される場合、単離されたＬＰＣは、薄層クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィーによって測定される場合、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％純粋である。さらなる例として、組換えタンパク質に関して使用される場合、単離されたタンパク質は、タンパク質を産生した宿主細胞の培養培地から取り出されたタンパク質を指す。
【0061】
「医薬製剤」および「医薬組成物」という用語は、有効成分の生物活性が効果的であることを可能にするような形態であり、製剤または組成物が投与される個体に対して許容できないほど毒性である追加の成分を含有しない調製物を指す。そのような製剤または組成物は、無菌であることが意図されている。
【0062】
本明細書で使用される「賦形剤」は、用いる投与量および濃度では、それに曝露される細胞または哺乳動物に対して無毒である、薬学的に許容され得る賦形剤、担体、ビヒクルまたは安定剤を含む。多くの場合、生理学的に許容され得る賦形剤は、ｐＨ緩衝水溶液である。
【0063】
「抗原」という用語は、抗体またはＴ細胞抗原受容体によって特異的に認識および結合される物質を指す。抗原は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖類、複合糖質、糖、ガングリオシド、脂質およびリン脂質；それらの一部およびそれらの組合せを含み得る。抗原は、本開示の組成物中に存在する場合、合成されたものであってもよいし、自然から単離されたものであってもよい。本開示の方法における投与に適した抗原には、抗原特異的なＢ細胞またはＴ細胞応答を誘発することができる任意の分子が含まれる。ハプテンは「抗原」の範囲内に含まれる。「ハプテン」は、それ自体は免疫原性ではないが、一般的により大きな免疫原性分子（担体）と結合すると免疫原性になる低分子量化合物である。
【0064】
「ポリペプチド抗原」には、精製された天然ペプチド、合成ペプチド、組換えペプチド、粗ペプチド抽出物、または部分的に精製されたもしくは未精製の活性状態のペプチド（例えば、弱毒化もしくは不活化されたウイルス、微生物もしくは細胞の一部であるペプチド）、またはそのようなペプチドの断片が含まれ得る。ポリペプチド抗原は、好ましくは少なくとも８アミノ酸残基長である。
【0065】
「アゴニスト」という用語は最も広い意味で使用され、受容体を介してシグナル伝達を活性化するあらゆる分子を含む。いくつかの実施形態では、アゴニストは受容体に結合する。例えば、ＴＬＲ８アゴニストは、ＴＬＲ８受容体に結合してＴＬＲ８シグナル伝達経路を活性化する。
【0066】
「アルキル」とは、一価の飽和脂肪族ヒドロカルビル基を指す。Ｃｘアルキルとは、ｘ個の炭素原子を有するアルキル基を指す。Ｃｘ－ＣｙアルキルまたはＣｘ－ｙアルキルとは、ｘ個とｙ個の間（両端を含む）の炭素原子を有するアルキル基を指す。
【0067】
「アルキレン」とは、二価の飽和脂肪族ヒドロカルビル基を指す。
【0068】
「アルケニル」とは、少なくとも１つの二重結合（＞Ｃ＝Ｃ＜）を有する一価のヒドロカルビル基を指す。Ｃｘアルケニルは、ｘ個の炭素原子を有するアルケニル基を指す。Ｃｘ－ＣｙアルケニルまたはＣｘ－ｙアルケニルとは、ｘ個とｙ個の間（両端を含む）の炭素原子を有するアルケニル基を指す。
【0069】
応答またはパラメータの「刺激」には、目的のパラメータを除く他の点で同じ条件と比較した場合、あるいは別の条件と比較した場合（例えば、ＴＬＲアゴニストの非存在下と比較した場合に、ＴＬＲアゴニストの存在下でのＴＬＲシグナル伝達の増加）に、その応答またはパラメータを誘発および／または増強することが含まれる。例えば、免疫応答の「刺激」は、応答の増加を意味する。測定されたパラメータに応じて、この増加は、２倍～２，０００倍、または５倍～５００倍もしくはそれより大きい、または２、５、１０、５０、または１００倍から、５００、１，０００、２，０００、５，０００、または１０，０００倍であり得る。
【0070】
逆に、応答またはパラメータの「阻害」には、目的のパラメータを除く他の点で同じ条件と比較した場合、あるいは別の条件と比較した場合（例えば、プラセボ組成物の投与または無処理と比較した場合に、ＬＰＣ化合物と、病原体認識受容体アゴニスト、抗原、およびヒト樹状細胞のうちの１つまたは複数とを含む組成物の投与後の異常な細胞増殖の減少）に、その応答またはパラメータを低減および／または抑制することが含まれる。例えば、免疫応答の「阻害」は、応答の減少を意味する。測定されたパラメータに応じて、この減少は、２倍～２，０００倍、または５倍～５００倍もしくはそれより大きい、または２、５、１０、５０、または１００倍から、５００、１，０００、２，０００、５，０００、または１０，０００倍であり得る。
【0071】
相対的な用語「より高い」および「より低い」とは、目的のパラメータを除く他の点で同じ条件と比較した場合、あるいは別の条件と比較した場合の応答またはパラメータの測定可能な増加または減少をそれぞれ指す。例えば、「より高いレベルのＤＣ過剰活性化」は、対照条件（例えば、ＬＰＣ、ＰＧＰＣ、ｏｘＰＡＰＣなどを含まず）の結果としてのＤＣ過剰活性化のレベルよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍高い処理条件（本開示のＬＰＣ化合物を含む）の結果としてのＤＣ過剰活性化のレベルを指す。同様に、「より低いレベルのＤＣ過剰活性化」とは、対照条件（例えば、ＬＰＣ、ＰＧＰＣ、ｏｘＰＡＰＣなどを含まず）の結果としてのＤＣ過剰活性化のレベルよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍低い処理条件（本開示のＬＰＣ化合物を含む）の結果としてのＤＣ過剰活性化のレベルを指す。
【0072】
本明細書で使用される場合、「免疫化」という用語は、抗原に対する哺乳動物対象の反応を増加させ、したがって感染に抵抗するか克服する能力および／または疾患に抵抗する能力を改善するプロセスを指す。
【0073】
本明細書で使用される「ワクチン接種」という用語は、哺乳動物対象の体内へのワクチンの導入を指す。
【0074】
「アジュバント」は、抗原を含む組成物に添加されると、曝露の際に哺乳動物レシピエントにおいて抗原に対する免疫応答を増強するかまたは高める物質を指す。
【0075】
疾患を「処置する」または「処置」という用語は、臨床結果を含む個体において有益なまたは所望の結果を得るために、個体（ヒトまたはその他）に１またはそれを超える治療剤を投与することを含み得るプロトコルを実行することを指す。有益なまたは所望の臨床結果としては、限定されるものではないが、疾患の１またはそれを超える徴候または症状の軽減または改善、疾患の程度の縮小、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾患の拡大の防止、疾患の進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的であるか全体的であるかに関わらず）が挙げられる。「処置」はまた、処置を受けていない個体の予想される生存と比較して、生存を延長することを意味し得る。さらに、「処置する」および「処置」は、１または複数の治療剤の１回用量の投与によって行われてもよく、または１または複数の治療剤の一連の用量の投与によって行われてもよい。加えて、「処置する」または「処置」は、徴候または症状の完全な軽減を必要とせず、治癒を必要とせず、具体的には患者に緩和効果のみを与えるプロトコルが含まれる。疾患または障害を「緩和する」とは、予測される未処置の転帰と比較して、疾患または障害の程度および／または望ましくない臨床症状が軽減されること、および／または疾患または障害の進行の時間経過が遅くなることを意味する。
【0076】
Ｉ．リゾホスファチジルコリン化合物
「リゾホスファチジルコリン」（ＬＰＣ）または「リゾホスファチジルコリン分子」とは、グリセロールのヒドロキシル基に１つのホスホコリン基を有し、グリセロールの他の２つのヒドロキシル基のうちの１つに１つのアシル基を有するグリセロール分子を指す。残りのヒドロキシル基は非置換である。
「リゾホスファチジルコリン」（ＬＰＣ）または「リゾホスファチジルコリン分子」とは、グリセロールのヒドロキシル基に１つのホスホコリン基を有し、グリセロールの他の２つのヒドロキシル基のうちの１つに１つのアシル基を有するグリセロール分子を指す。残りのヒドロキシル基は非置換である。
【0077】
いくつかの実施形態では、単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）は、以下の形態：
である。
【化1】
【0078】
いくつかの実施形態では、単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）は、以下の形態：
である。
【化2】
【0079】
アルキル鎖またはアルケニル鎖は、カルボニル炭素と一緒に、アルキル鎖またはアルケニル鎖よりも炭素原子１個分長いアシル鎖を形成する。例えば、（Ｃ２３アルキル）－Ｃ（＝Ｏ）－基は、Ｃ２４アシル鎖を形成する。したがって、基「（アルキルまたはアルキレン）」がＣ１２～Ｃ２３アルキル基（例えばＣ１２～Ｃ１９アルキル基またはＣ２０～Ｃ２３アルキル基）である場合、（Ｃ１２～Ｃ２３アルキル－Ｃ（＝Ｏ）－基はＣ１３～Ｃ２４アシル鎖（例えばＣ１３～Ｃ２０アシル鎖またはＣ２１～Ｃ２４アシル鎖）を形成する。基「（アルキルまたはアルキレン）」がＣ１２～Ｃ２３アルケニル基（例えばＣ１２～Ｃ１９アルケニル基またはＣ２０～Ｃ２３アルケニル基）である場合、（Ｃ１２～Ｃ２３アルケニル－Ｃ（＝Ｏ）－基はＣ１３～Ｃ２４アシル鎖（例えばＣ１３～Ｃ２０アシル鎖またはＣ２１～Ｃ２４アシル鎖）を形成する。アシル鎖は、アルキル含有アシル基とアルケニル含有アシル基とを区別するために、飽和アシルまたは不飽和アシルと呼ぶことができる。標準的なデルタ表記またはオメガ表記を使用して、不飽和アシル鎖中の１またはそれを超える二重結合の位置を示すことができる。
【0080】
本開示のリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）化合物は、アシル鎖がＣ１３～Ｃ２２アシル鎖またはＣ１３～Ｃ２４アシル鎖である単一アシル鎖を有する。いくつかの実施形態では、アシル鎖は、Ｃ１８～Ｃ２２アシル鎖またはＣ２１～Ｃ２４アシル鎖である。いくつかの実施形態では、アシル鎖は、Ｃ２１アシル鎖またはＣ２２アシル鎖である。いくつかの好ましい実施形態では、アシル鎖はＣ２２アシル鎖である。本開示の例示的なＬＰＣ化合物の名称および構造、ならびにそれらのＣｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＣＡＳ）登録番号を、表Ｉに＃３０～４３、必要に応じて＃３０～４２として示す。
【表I-1】
【表I-2】
【表I-3】
【表I-4】
【0081】
ＩＩ．病原体認識受容体アゴニスト
本開示の組成物および方法は、病原体認識受容体（ＰＲＲ）アゴニストをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＲＲアゴニストは、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）またはＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）のアゴニストを含む。他の実施形態では、ＰＲＲアゴニストは、細胞質ＤＮＡセンサー（ＣＤＳ）のアゴニストまたはＩＦＮ遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＲＲアゴニストは、ＴＬＲ７／８アゴニストを含む。
本開示の組成物および方法は、病原体認識受容体（ＰＲＲ）アゴニストをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＲＲアゴニストは、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）またはＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）のアゴニストを含む。他の実施形態では、ＰＲＲアゴニストは、細胞質ＤＮＡセンサー（ＣＤＳ）のアゴニストまたはＩＦＮ遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＲＲアゴニストは、ＴＬＲ７／８アゴニストを含む。
【0082】
Ａ．ＴＬＲ７／８アゴニスト
本明細書で使用される「ＴＬＲ７／８アゴニスト」という用語は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８のアゴニストを指す。一態様では、ＴＬＲ７／８アゴニストは、ＴＬＲ７アゴニストである。別の態様では、ＴＬＲ７／８アゴニストは、ＴＬＲ８アゴニストである。さらなる態様では、ＴＬＲ７／８アゴニストは、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の両方のアゴニストである。本開示のＴＬＲ７／８アゴニストは、ＬＰＣの存在下でヒト樹状細胞を過剰活性化するのに適している。
本明細書で使用される「ＴＬＲ７／８アゴニスト」という用語は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８のアゴニストを指す。一態様では、ＴＬＲ７／８アゴニストは、ＴＬＲ７アゴニストである。別の態様では、ＴＬＲ７／８アゴニストは、ＴＬＲ８アゴニストである。さらなる態様では、ＴＬＲ７／８アゴニストは、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の両方のアゴニストである。本開示のＴＬＲ７／８アゴニストは、ＬＰＣの存在下でヒト樹状細胞を過剰活性化するのに適している。
【0083】
いくつかの態様では、ＴＬＲ７／８アゴニストは小分子である。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ７／８アゴニストは、９００ダルトンまたはそれ未満の分子量を有する小分子、またはその塩である。すなわち、小分子ＴＬＲ７／８アゴニストは、米国ＦＤＡの生物製剤評価研究センターによって規制可能な組換えタンパク質または合成オリゴヌクレオチドのような大きな分子ではない。むしろ、小分子ＴＬＲ７／８アゴニストは、ＦＤＡの医薬品評価研究センターによって規制可能である。いくつかの実施形態では、この小分子の分子量は、約９０～約９００ダルトンである。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ７／８アゴニストはイミダゾキノリン化合物を含む。いくつかの好ましい実施形態では、ＴＬＲ７／８アゴニストは、レシキモド（Ｒ８４８）を含む。
【0084】
Ｂ．他のＰＲＲアゴニスト
いくつかの態様では、病原体認識受容体（ＰＲＲ）アゴニストは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む、ただし、ＴＬＲアゴニストはＴＬＲ７／８アゴニストを含まない。いくつかの実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９およびＴＬＲ１３のうちの１つまたは複数のアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＰＲＲアゴニストは、ＴＬＲ２／６アゴニスト、例えばＰａｍ２ＣＳＫ４である。他の実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）などのＴＬＲ４アゴニストである。しかし、好ましい実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４および／またはＴＬＲ９のアゴニストではない。例えば、好ましい実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストは、ＬＰＳ（エンドトキシン）などのＴＬＲ４リガンドではない。
いくつかの態様では、病原体認識受容体（ＰＲＲ）アゴニストは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む、ただし、ＴＬＲアゴニストはＴＬＲ７／８アゴニストを含まない。いくつかの実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９およびＴＬＲ１３のうちの１つまたは複数のアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＰＲＲアゴニストは、ＴＬＲ２／６アゴニスト、例えばＰａｍ２ＣＳＫ４である。他の実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）などのＴＬＲ４アゴニストである。しかし、好ましい実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４および／またはＴＬＲ９のアゴニストではない。例えば、好ましい実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストは、ＬＰＳ（エンドトキシン）などのＴＬＲ４リガンドではない。
【0085】
他の態様では、ＰＲＲアゴニストは、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）アゴニストを含む。さらなる態様では、ＰＲＲアゴニストは、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）アゴニストを含む。さらなる態様では、ＰＲＲアゴニストは、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）アゴニストを含む。なおさらなる態様では、ＰＲＲアゴニストは、ＣＤＳアゴニストまたはＳＴＩＮＧアゴニストを含む。
【0086】
ＩＩＩ．抗原
本開示の組成物および方法は、抗原をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、抗原はタンパク質性抗原を含む。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、少なくとも８アミノ酸長のペプチド鎖を含むタンパク質性抗原を指すために本明細書で互換的に使用される。いくつかの実施形態では、タンパク質性抗原は、８～１８００アミノ酸、９～１０００アミノ酸、または１０～１００アミノ酸長である。いくつかの態様では、抗原は合成タンパク質または組換えタンパク質を含む。他の実施形態では、抗原は、生体試料から精製されたタンパク質を含む。ポリペプチドは、リン酸化、ヒドロキシル化、スルホン化、パルミトイル化、および／またはグリコシル化などによって翻訳後修飾され得る。
本開示の組成物および方法は、抗原をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、抗原はタンパク質性抗原を含む。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、少なくとも８アミノ酸長のペプチド鎖を含むタンパク質性抗原を指すために本明細書で互換的に使用される。いくつかの実施形態では、タンパク質性抗原は、８～１８００アミノ酸、９～１０００アミノ酸、または１０～１００アミノ酸長である。いくつかの態様では、抗原は合成タンパク質または組換えタンパク質を含む。他の実施形態では、抗原は、生体試料から精製されたタンパク質を含む。ポリペプチドは、リン酸化、ヒドロキシル化、スルホン化、パルミトイル化、および／またはグリコシル化などによって翻訳後修飾され得る。
【0087】
いくつかの実施形態では、抗原は、少なくとも１つの全長タンパク質またはそのフラグメントのアミノ酸配列を含む腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、がんタンパク質由来のアミノ酸配列またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、哺乳類抗原はネオ抗原であるか、または哺乳類対象由来の正常細胞に存在する遺伝子と比較して変異を含む遺伝子によってコードされる。ネオ抗原は、Ｔ細胞ががん細胞と非がん細胞とを区別することができるようにする際に特に有用であると考えられている（例えば、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４８：６９－７４，２０１５を参照）。他の実施形態では、腫瘍抗原は、がんを引き起こすウイルスの抗原などのウイルス抗原を含む。
【0088】
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、２またはそれを超えるポリペプチドを含む融合タンパク質であり、ここで、各ポリペプチドは、異なる腫瘍抗原由来のアミノ酸配列または同じ腫瘍抗原由来の不連続アミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいくつかでは、融合タンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含み、各ポリペプチドは、同じ腫瘍抗原由来の不連続アミノ酸配列を含む。
【0089】
いくつかの実施形態では、抗原は微生物抗原である。いくつかの実施形態では、微生物抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、原虫抗原、真菌抗原、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、微生物抗原は、微生物の表面タンパク質または他の抗原性サブユニットを含む。他の実施形態では、微生物抗原は、不活化または弱毒化微生物を含む。例えば、微生物抗原は、化学的または遺伝的に不活化されたウイルスなどの不活化ウイルスを含み得る。あるいは、微生物抗原は、ウイルス様粒子を含み得る。
【0090】
いくつかの実施形態では、抗原は、ヒト患者などの個体から得られた生体試料中に存在し得る。例えば、抗原はがん細胞を含み得る。別の態様では、抗原は、ウイルス感染細胞などの微生物感染細胞を含み得る。
【0091】
ＩＶ．樹状細胞
本開示の組成物および方法は、哺乳動物の自然免疫系と適応免疫系の橋渡しをすると考えられている抗原提示細胞である樹状細胞（ＤＣ）をさらに含み得る。好ましい実施形態では、ＤＣは、形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）とは対照的に、サブセット１の従来のＤＣ（以前は骨髄ＤＣ１と呼ばれていた、ｃＤＣ１）である。
本開示の組成物および方法は、哺乳動物の自然免疫系と適応免疫系の橋渡しをすると考えられている抗原提示細胞である樹状細胞（ＤＣ）をさらに含み得る。好ましい実施形態では、ＤＣは、形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）とは対照的に、サブセット１の従来のＤＣ（以前は骨髄ＤＣ１と呼ばれていた、ｃＤＣ１）である。
【0092】
いくつかの実施形態では、ＤＣは、高いレベルのＣＤ４０およびＩＬ－１２ｐ７０を発現する過剰活性ＤＣである。本明細書で使用される場合、「過剰活性樹状細胞」という用語は、ＤＣが細胞生存率を維持しながら（例えば、パイロトーシスを受けずに）ＩＬ－１βを分泌することができる細胞状態を指す。このようにして、過剰活性化樹状細胞は堅牢なＴ細胞免疫を刺激することができ（図１）、明らかに活性化樹状細胞とパイロトーシス樹状細胞の利点を兼ね備える（Ｚｈｉｖａｋｉら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，３３（７），２０２０，１０８３８１）。
【0093】
Ｖ．医薬製剤
本開示のいくつかの組成物は、薬学的に許容され得る賦形剤と、ＬＰＣ化合物、ＰＲＲアゴニスト、樹状細胞、抗原、アジュバント、またはそれらの任意の組合せとを含む医薬製剤である。本開示の医薬製剤は、溶液または懸濁液の形態であり得る。あるいは、医薬製剤は、脱水された固体（例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥固体）であってよい。本開示の医薬製剤は、好ましくは無菌であり、好ましくは本質的にエンドトキシンを含まない。「医薬製剤」という用語は、本明細書では「医薬品」および「医薬」という用語と互換的に使用される。いくつかの実施形態では、医薬製剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）は、製剤の意図された目的に基づく様々な成分の特定の比率を含む。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、ＬＰＣ化合物および非イオン性界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポロキサマー－４０７（ＣＡＳ登録番号９７７０５７－９１－２）などのエチレンオキシド－プロピレンオキシドコポリマーを含む。
本開示のいくつかの組成物は、薬学的に許容され得る賦形剤と、ＬＰＣ化合物、ＰＲＲアゴニスト、樹状細胞、抗原、アジュバント、またはそれらの任意の組合せとを含む医薬製剤である。本開示の医薬製剤は、溶液または懸濁液の形態であり得る。あるいは、医薬製剤は、脱水された固体（例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥固体）であってよい。本開示の医薬製剤は、好ましくは無菌であり、好ましくは本質的にエンドトキシンを含まない。「医薬製剤」という用語は、本明細書では「医薬品」および「医薬」という用語と互換的に使用される。いくつかの実施形態では、医薬製剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）は、製剤の意図された目的に基づく様々な成分の特定の比率を含む。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、ＬＰＣ化合物および非イオン性界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポロキサマー－４０７（ＣＡＳ登録番号９７７０５７－９１－２）などのエチレンオキシド－プロピレンオキシドコポリマーを含む。
【0094】
Ａ．賦形剤
本開示の薬学的に許容され得る賦形剤には、例えば、溶媒、緩衝剤、張度調整剤、増量剤および保存剤（例えば、Ｐｒａｍａｎｉｃｋら、Ｐｈａｒｍａ Ｔｉｍｅｓ，４５：６５－７７，２０１３を参照）が含まれる。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、溶媒、緩衝剤、張度調整剤、および増量剤として機能する賦形剤（例えば、食塩水中の塩化ナトリウムは、水性ビヒクルおよび張度調整剤の両方として機能することができる）のうちの１つまたは複数を含んでよい。本開示の薬学的に許容され得る賦形剤には、洗浄剤、湿潤剤、乳化剤、発泡剤および分散剤、ならびに界面活性剤も含まれる。
本開示の薬学的に許容され得る賦形剤には、例えば、溶媒、緩衝剤、張度調整剤、増量剤および保存剤（例えば、Ｐｒａｍａｎｉｃｋら、Ｐｈａｒｍａ Ｔｉｍｅｓ，４５：６５－７７，２０１３を参照）が含まれる。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、溶媒、緩衝剤、張度調整剤、および増量剤として機能する賦形剤（例えば、食塩水中の塩化ナトリウムは、水性ビヒクルおよび張度調整剤の両方として機能することができる）のうちの１つまたは複数を含んでよい。本開示の薬学的に許容され得る賦形剤には、洗浄剤、湿潤剤、乳化剤、発泡剤および分散剤、ならびに界面活性剤も含まれる。
【0095】
本明細書に開示される脂質の多くは、水に難溶性である。界面活性剤を使用して、脂質を水性製剤に可溶化することができる。幅広い種類の界面活性剤が利用可能であり、これらはアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、および双性イオン性界面活性剤として分類することができる。
【0096】
非イオン性界面活性剤のいくつかの例としては、ポロキサマーが挙げられる。ポロキサマーは、一般式：
ＨＯ－［ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－］ａ－［ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－］ｂ－［ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－］ａ－Ｈ
のエチレンオキシドとプロピレンオキシドのトリブロックコポリマーである。一部のポロキサマーは、商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＰＬＵＲＯＮＩＣは、ドイツＬｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎのＢＡＳＦ ＳＥの登録商標である。）で販売されている。ポロキサマーの例は、ポロキサマー４０７（ＫＰ４０７；ａ＝１０１、ｂ＝５６）である。ポロキサマー１８８（ＫＰ１８８；ａ＝８０、ｂ＝２７）；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ８４（Ｐ－８４；ａ＝１９、ｂ＝３９）；およびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１２３（Ｐ－１２３；ａ＝２０、ｂ＝７０）（上記のａおよびｂの値は、若干異なる場合がある）。
ＨＯ－［ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－］ａ－［ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－］ｂ－［ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－］ａ－Ｈ
のエチレンオキシドとプロピレンオキシドのトリブロックコポリマーである。一部のポロキサマーは、商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＰＬＵＲＯＮＩＣは、ドイツＬｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎのＢＡＳＦ ＳＥの登録商標である。）で販売されている。ポロキサマーの例は、ポロキサマー４０７（ＫＰ４０７；ａ＝１０１、ｂ＝５６）である。ポロキサマー１８８（ＫＰ１８８；ａ＝８０、ｂ＝２７）；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ８４（Ｐ－８４；ａ＝１９、ｂ＝３９）；およびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１２３（Ｐ－１２３；ａ＝２０、ｂ＝７０）（上記のａおよびｂの値は、若干異なる場合がある）。
【0097】
他の非イオン性界面活性剤としては、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）シリーズ（ＣＲＥＭＡＰＨＯＲは、ドイツＬｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎのＢＡＳＦ ＳＥの登録商標である）が挙げられる。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）界面活性剤としては、ヒマシ油とエチレンオキシドとを約１：３５のモル比で反応させることにより製造されるポリオキシエチル化トリグリセリドの混合物である、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ（Ｋ ＥＬ）、および、４０モルのエチレンオキシドと１モルの水素化ヒマシ油とを反応させることにより得られる、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＲＨ４０（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）ＲＨ４０としても公知；ＫＯＬＬＩＰＨＯＲは、ＢＡＳＦ社の登録商標である）が挙げられる。
【0098】
いくつかの実施形態では、医薬製剤は、溶媒として水性ビヒクルを含む。適切なビヒクルとしては、例えば、滅菌水、食塩液、リン酸緩衝食塩水、およびリンゲル液が挙げられる。いくつかの実施形態では、組成物は等張性である。
【0099】
医薬製剤は緩衝剤を含み得る。緩衝剤は、処理、貯蔵および必要に応じて再構成中の活性剤の分解を阻害するようにｐＨを制御する。適切なバッファーとしては、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩または硫酸塩を含む塩が挙げられる。他の適切なバッファーとしては、例えば、アルギニン、グリシン、ヒスチジンおよびリジンなどのアミノ酸が挙げられる。緩衝剤は、塩酸または水酸化ナトリウムをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、組成物のｐＨを６～９の範囲内に維持する。いくつかの実施形態では、ｐＨは、（下限）６、７または８より大きい。いくつかの実施形態では、ｐＨは、（上限）９、８または７未満である。すなわち、ｐＨは約６～９の範囲であり、下限は上限よりも小さい。
【0100】
医薬組成物は、張度調整剤を含み得る。適切な張度調整剤としては、例えば、デキストロース、グリセロール、塩化ナトリウム、グリセリンおよびマンニトールが挙げられる。
【0101】
医薬製剤は増量剤を含み得る。増量剤は、医薬組成物を投与前に凍結乾燥する場合に特に有用である。いくつかの実施形態では、増量剤は、凍結または噴霧乾燥中および／または貯蔵中の活性剤の安定化および分解の防止に役立つ保護剤である。適切な増量剤は、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔａｌ）、グルコースおよびラフィノースなどの糖類（単糖類、二糖類および多糖類）である。
【0102】
医薬製剤は、保存剤を含み得る。適切な保存剤としては、例えば、酸化防止剤および抗微生物剤が挙げられる。しかし、好ましい実施形態では、医薬製剤は無菌条件下で調製され、単回使用容器に入っているので、保存剤を含める必要はない。
【0103】
本開示の医薬製剤は、非経口投与に適している。すなわち、本開示の医薬製剤は、経腸投与を意図していない（例えば、経口、胃、または直腸による投与ではない）。
【0104】
Ｂ．アジュバント
本開示の薬学的に許容され得るアジュバントとしては、例えば、アルミニウム塩アジュバント、水中スクアレンエマルジョン、サポニン、またはそれらの組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、アジュバントは、非晶質ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、およびそれらの組合せからなる群から選択されるアルミニウム塩アジュバントである。他の実施形態では、アジュバントは、水中スクアレンエマルジョン、例えばＭＦ５９またはＡＳ０３である。他の実施形態では、アジュバントは、ＡＳ０１またはＡＳ０２と同様に、Ｑｕｉｌ ＡまたはＱＳ－２１などのサポニンである。
本開示の薬学的に許容され得るアジュバントとしては、例えば、アルミニウム塩アジュバント、水中スクアレンエマルジョン、サポニン、またはそれらの組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、アジュバントは、非晶質ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、およびそれらの組合せからなる群から選択されるアルミニウム塩アジュバントである。他の実施形態では、アジュバントは、水中スクアレンエマルジョン、例えばＭＦ５９またはＡＳ０３である。他の実施形態では、アジュバントは、ＡＳ０１またはＡＳ０２と同様に、Ｑｕｉｌ ＡまたはＱＳ－２１などのサポニンである。
【0105】
ＶＩ．製造方法
本開示は、いくつかの態様では、過剰活性化樹状細胞を調製するための方法、および免疫原性組成物を調製するための方法に関する。免疫原性組成物は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボでの樹状細胞の過剰活性化に適している。
本開示は、いくつかの態様では、過剰活性化樹状細胞を調製するための方法、および免疫原性組成物を調製するための方法に関する。免疫原性組成物は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボでの樹状細胞の過剰活性化に適している。
【0106】
一態様では、本開示は、過剰活性化樹状細胞（ＤＣ）を産生するための方法を提供し、この方法は、過剰活性化樹状細胞を産生するために、樹状細胞に、単一アシル鎖を有する有効量の単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）およびＰＲＲアゴニストを接触させることを含み、この過剰活性化樹状細胞はパイロトーシスを起こさずにＩＬ－１ベータを分泌する。いくつかの態様では、ＤＣは単離されており、他の態様では、ＤＣはヒト患者などの哺乳動物対象から得られた生体試料内に存在する。いくつかの態様では、ＤＣは単球由来ＤＣ、好ましくはｃＤＣ１である。
【0107】
別の態様では、本開示は、免疫原性組成物を製造するための方法を提供し、この方法は、免疫原性組成物を製造するために、抗原を、単一アシル鎖を有する有効量の単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、およびＰＲＲアゴニストと組合せるステップを含む。いくつかの態様では、抗原は、哺乳動物対象から得られた生体試料中に存在するかまたはそれから精製されたタンパク質性抗原を含む。いくつかの態様では、タンパク質性抗原は合成または組換えタンパク質である。好ましい実施形態では、抗原は腫瘍抗原である。好ましい実施形態では、抗原は微生物抗原である。
【0108】
特定の実施形態では、本開示は、免疫原性組成物の製造方法を提供し、該方法は、
ａ）腫瘍から調製した細胞の懸濁液から白血球を枯渇させて、腫瘍細胞富化懸濁液を得る工程；
ｂ）腫瘍細胞富化懸濁液から細胞を溶解し、腫瘍細胞溶解物を得る工程；および
ｃ）腫瘍細胞溶解物を、単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）およびＰＲＲアゴニストと接触させて、前記免疫原性組成物を得る工程
を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞富化懸濁液を白血球に特異的な抗体と接触させることによって、腫瘍細胞濃縮細胞懸濁液から白血球を枯渇させる。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞富化懸濁液を抗ＣＤ４５抗体と接触させることによって、白血球を枯渇させる。いくつかの態様では、細胞は、限定されるものではないが、機械的溶解、液体均質化、超音波処理、凍結解凍、または手動粉砕などの物理的破壊に基づく細胞溶解法によって溶解される。いくつかの好ましい実施形態では、細胞は、１回またはそれを超える凍結融解サイクルによって溶解される。
ａ）腫瘍から調製した細胞の懸濁液から白血球を枯渇させて、腫瘍細胞富化懸濁液を得る工程；
ｂ）腫瘍細胞富化懸濁液から細胞を溶解し、腫瘍細胞溶解物を得る工程；および
ｃ）腫瘍細胞溶解物を、単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）およびＰＲＲアゴニストと接触させて、前記免疫原性組成物を得る工程
を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞富化懸濁液を白血球に特異的な抗体と接触させることによって、腫瘍細胞濃縮細胞懸濁液から白血球を枯渇させる。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞富化懸濁液を抗ＣＤ４５抗体と接触させることによって、白血球を枯渇させる。いくつかの態様では、細胞は、限定されるものではないが、機械的溶解、液体均質化、超音波処理、凍結解凍、または手動粉砕などの物理的破壊に基づく細胞溶解法によって溶解される。いくつかの好ましい実施形態では、細胞は、１回またはそれを超える凍結融解サイクルによって溶解される。
【0109】
前述の方法のいくつかの実施形態では、ＬＰＣのアシル鎖は、Ｃ１３～Ｃ２２アシル鎖またはＣ１３～Ｃ２４アシル鎖である。いくつかの実施形態では、ＬＰＣのアシル鎖は、Ｃ１８～Ｃ２２アシル鎖またはＣ１８～Ｃ２４アシル鎖である。いくつかの好ましい実施形態では、アシル鎖は完全に飽和している。いくつかの好ましい実施形態では、ＬＰＣのアシル鎖はＣ２２アシル鎖である。いくつかの好ましい実施形態では、ＬＰＣは、１－ベヘノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン［ＬＰＣ（２２：０）］である。いくつかの実施形態では、ＰＲＲアゴニストは、ＴＬＲ７／８アゴニストである。いくつかの好ましい実施形態では、ＴＬＲ７／８アゴニストはイミダゾキノリン化合物であり、特に好ましい実施形態では、これはレシキモド（Ｒ８４８）である。
【0110】
ＶＩＩ．使用方法
いくつかの態様では、本開示は、ＬＰＣ化合物、ＰＲＲアゴニスト、樹状細胞、抗原、アジュバント、またはそれらの任意の組合せを含む、本明細書に記載の組成物または製剤のいずれか１つの使用方法に関する。使用方法は、免疫応答の刺激を伴う複数の使用に適している。いくつかの実施形態では、使用方法は、がんを処置する方法を含む。いくつかの実施形態では、使用方法は、異常な細胞増殖を阻害する方法を含む。いくつかの実施形態では、使用方法は、感染性疾患を処置する方法を含む。本方法は、特定の結果を達成するために、有効量の本明細書に記載の製剤または組成物を、投与することを必要とする個体に投与することを含む。個体は、ヒト患者などの哺乳動物対象である。他の実施形態では、個体は、非ヒト患者である。いくつかの実施態様では、個体は、イヌ患者である。すなわち、いくつかの実施形態では、使用方法は臨床的使用を含むが、他の実施形態では、使用方法は前臨床および／または獣医学での使用を含む。前臨床使用のために、哺乳動物対象は、非ヒト霊長類（例えば、サルまたは類人猿）またはげっ歯類（例えば、マウスまたはラット）であり得る。獣医学での使用の場合、哺乳動物対象は、農場動物（例えば、ウシ）、スポーツ動物（例えば、ウマ）、またはペット（例えば、イヌまたはネコなどのコンパニオンアニマル）であり得る。
いくつかの態様では、本開示は、ＬＰＣ化合物、ＰＲＲアゴニスト、樹状細胞、抗原、アジュバント、またはそれらの任意の組合せを含む、本明細書に記載の組成物または製剤のいずれか１つの使用方法に関する。使用方法は、免疫応答の刺激を伴う複数の使用に適している。いくつかの実施形態では、使用方法は、がんを処置する方法を含む。いくつかの実施形態では、使用方法は、異常な細胞増殖を阻害する方法を含む。いくつかの実施形態では、使用方法は、感染性疾患を処置する方法を含む。本方法は、特定の結果を達成するために、有効量の本明細書に記載の製剤または組成物を、投与することを必要とする個体に投与することを含む。個体は、ヒト患者などの哺乳動物対象である。他の実施形態では、個体は、非ヒト患者である。いくつかの実施態様では、個体は、イヌ患者である。すなわち、いくつかの実施形態では、使用方法は臨床的使用を含むが、他の実施形態では、使用方法は前臨床および／または獣医学での使用を含む。前臨床使用のために、哺乳動物対象は、非ヒト霊長類（例えば、サルまたは類人猿）またはげっ歯類（例えば、マウスまたはラット）であり得る。獣医学での使用の場合、哺乳動物対象は、農場動物（例えば、ウシ）、スポーツ動物（例えば、ウマ）、またはペット（例えば、イヌまたはネコなどのコンパニオンアニマル）であり得る。
【0111】
Ａ．免疫応答の刺激
手短に言えば、本開示は、個体において免疫応答を刺激するのに十分な量の本明細書に記載の組成物または製剤を個体に投与することを含む、個体において免疫応答を刺激する方法を提供する。免疫応答を「刺激する」（免疫応答を「誘発する」と互換的に使用される）とは、デノボ免疫応答を誘発すること（例えば、初期ワクチン接種レジメンの結果として）または既存の免疫応答を増強すること（例えば、ブースターワクチン接種レジメンの結果として）から生じ得る免疫応答を増加させることを意味する。いくつかの実施形態では、免疫応答を刺激することは、サイトカイン産生を刺激すること；Ｂリンパ球増殖を刺激すること；インターフェロン経路関連遺伝子発現を刺激すること；化学誘引物質関連遺伝子発現を刺激すること；樹状細胞ＤＣの成熟を刺激すること、からなる群の１つまたは複数を含む。免疫応答の刺激を測定するための方法は、当技術分野で公知である。
手短に言えば、本開示は、個体において免疫応答を刺激するのに十分な量の本明細書に記載の組成物または製剤を個体に投与することを含む、個体において免疫応答を刺激する方法を提供する。免疫応答を「刺激する」（免疫応答を「誘発する」と互換的に使用される）とは、デノボ免疫応答を誘発すること（例えば、初期ワクチン接種レジメンの結果として）または既存の免疫応答を増強すること（例えば、ブースターワクチン接種レジメンの結果として）から生じ得る免疫応答を増加させることを意味する。いくつかの実施形態では、免疫応答を刺激することは、サイトカイン産生を刺激すること；Ｂリンパ球増殖を刺激すること；インターフェロン経路関連遺伝子発現を刺激すること；化学誘引物質関連遺伝子発現を刺激すること；樹状細胞ＤＣの成熟を刺激すること、からなる群の１つまたは複数を含む。免疫応答の刺激を測定するための方法は、当技術分野で公知である。
【0112】
例えば、本開示は、個体において抗原特異的免疫応答を誘導するのに十分な量の本明細書に記載の組成物または製剤を個体に投与することによって、個体において抗原特異的免疫応答を誘導する方法を提供する。好ましい実施形態では、組成物または製剤は抗原を含む。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、抗原を含む個体の組織に投与される。免疫応答は、抗原特異的抗体応答および抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の一方または両方を含み得る。抗原特異的抗体応答を「誘導する」とは、抗原特異的抗体の力価を、投与前のベースライン力価または血清防御レベルなどの閾値レベルを超えて増加させることを意味する。抗原特異的ＣＴＬ応答を「誘導する」とは、末梢血中に見出される抗原特異的ＣＴＬの頻度を投与前のベースライン頻度よりも増加させることを意味する。
【0113】
免疫応答の分析（定性的および定量的の両方）は、当技術分野で公知の任意の方法によるものであってよく、それには、限定されるものではないが、抗原特異的抗体産生の測定（特異的抗体サブクラスの測定を含む）、Ｂ細胞およびヘルパーＴ細胞などのリンパ球の特定の集団の活性化、ＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－６、ＩＬ－１２などのサイトカインの産生および／またはヒスタミンの放出が含まれる。抗原特異的抗体応答を測定するための方法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。リンパ球の特定の集団の活性化は、増殖アッセイおよび蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって測定することができる。サイトカインの産生は、ＥＬＩＳＡによっても測定することができる。いくつかの実施形態では、免疫応答を刺激する方法は、単球由来樹状細胞または末梢血単核細胞による、インターロイキン－１ベータ（ＩＬ－１β）分泌、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）分泌、および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）分泌の刺激を含む。いくつかの実施形態では、免疫応答を刺激する方法は、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞による、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１７ａ、ＩＬ－１７ｆ、およびＩＬ－２２のうちの１つまたは複数の分泌の刺激を含む。いくつかの実施形態では、免疫応答を刺激する方法は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１分化を増加させることを含む。いくつかの好ましい実施形態では、本開示の組成物と接触させた細胞の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％が、接触後４０～５６時間（または約４８時間）に生存可能なままである。
【0114】
いくつかの実施形態では、本方法は、抗腫瘍免疫応答を刺激するのに適している。他の実施形態では、本方法は、抗微生物免疫応答を刺激するのに適している。いくつかの実施形態では、抗微生物応答は、抗細菌免疫応答である。いくつかの実施形態では、抗微生物応答は、抗真菌免疫応答である。いくつかの実施形態では、抗微生物応答は、抗ウイルス免疫応答である。いくつかの実施形態では、抗微生物応答は、抗原虫免疫応答である。
【0115】
Ｂ．疾患の処置または予防
本開示はさらに、個体において疾患を処置または予防するのに十分な量の本明細書に記載の組成物または製剤を個体に投与することを含む、個体において疾患を処置または予防する方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患はがんである。いくつかの実施形態では、疾患は異常な細胞増殖である。他の実施形態では、疾患は感染性疾患である。
本開示はさらに、個体において疾患を処置または予防するのに十分な量の本明細書に記載の組成物または製剤を個体に投与することを含む、個体において疾患を処置または予防する方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患はがんである。いくつかの実施形態では、疾患は異常な細胞増殖である。他の実施形態では、疾患は感染性疾患である。
【0116】
一態様では、本方法は、ＬＰＣ化合物、ＰＲＲアゴニスト、抗原、アジュバント、またはそれらの任意の組合せを含む組成物を、投与することを必要とする対象に投与することを含み得る。別の態様では、本方法は、養子細胞療法を含み、過剰活性化樹状細胞などの樹状細胞と、ＬＰＣ化合物、ＰＲＲアゴニスト、抗原、アジュバント、またはそれらの任意の組合せとを含む組成物を、投与することを必要とする対象に投与することを含む。
【0117】
いくつかの実施形態では、本方法は、個体においてがんを処置すること、またはそうでなければがんを有する哺乳動物対象を処置することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ａ）腫瘍細胞溶解物、単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、およびｔｏｌｌ様受容体７／８（ＴＬＲ７／８）アゴニストを含む免疫原性組成物を調製する工程であって、腫瘍細胞溶解物は、がんを有する対象から得た腫瘍の試料であるかまたはそれから調製されており、アシル鎖はＣ１３～Ｃ２２アシル鎖またはＣ１３～Ｃ２４アシル鎖である工程；およびｂ）被験体に有効量の免疫原性組成物を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、がんは、血液がん、例えばリンパ腫、白血病、または骨髄腫である。他の実施形態では、がんは、非血液がん、例えば肉腫、癌または黒色腫である。一部の実施形態では、がんは悪性である。
【0118】
いくつかの実施形態では、本方法は、個体において異常な細胞増殖を阻害することを含む。「異常な細胞増殖」とは、良性腫瘍または悪性腫瘍の増殖を指す。悪性腫瘍は転移性腫瘍であり得る。
【0119】
いくつかの実施形態では、本方法は、個体において感染性疾患を処置または予防することを含む。いくつかの実施形態では、感染性疾患はウイルス感染によって引き起こされる。他の実施形態では、感染性疾患は細菌感染によって引き起こされる。さらなる実施形態では、感染性疾患は真菌感染によって引き起こされる。なおさらなる実施形態では、感染性疾患は原虫感染によって引き起こされる。特に重要なのは、ヒトならびに哺乳動物または鳥類などの他の動物に感染する人畜共通感染症病原体によって引き起こされる感染症である。いくつかの実施形態では、人畜共通感染症病原体は、中間種（ベクター）を介してヒトに伝染する。
列挙された実施形態
実施形態１． 単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と、ＴＬＲ７／８アゴニストとを含む組成物であって、前記アシル鎖がＣ１３～Ｃ２２アシル鎖またはＣ１３～Ｃ２４アシル鎖である組成物。
実施形態２． 前記アシル鎖が、Ｃ１８～Ｃ２２アシル鎖またはＣ２１～Ｃ２４アシル鎖である、実施形態１に記載の組成物。
実施形態３． 抗原をさらに含む、実施形態１または実施形態２に記載の組成物。
実施形態４． 樹状細胞をさらに含む、実施形態１から３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５． 単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と、抗原とを含む組成物であって、前記アシル鎖がＣ２１～Ｃ２４アシル鎖である組成物。
実施形態６． 樹状細胞をさらに含む、実施形態５に記載の組成物。
実施形態７． ＴＬＲ７／８アゴニストをさらに含む、実施形態５または実施形態６に記載の組成物。
実施形態８． 単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と樹状細胞とを含む組成物であって、前記アシル鎖がＣ２１～Ｃ２４アシル鎖である組成物。
実施形態９． ＴＬＲ７／８アゴニストをさらに含む、実施形態８に記載の組成物。
実施形態１０． 抗原をさらに含む、実施形態８または実施形態９に記載の組成物。
実施形態１１． 前記アシル鎖がＣ２２アシル鎖である、実施形態１から１０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１２． 前記アシル鎖が完全に飽和している、実施形態１から１１のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１３． 前記ＬＰＣが１－ベヘノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン［ＬＰＣ（２２：０）］を含む、実施形態１から１２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１４． 前記ＴＬＲ７／８アゴニストが、９００ダルトンまたはそれ未満の分子量を有する小分子である、実施形態１から１３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１５． 前記ＴＬＲ７／８アゴニストがイミダゾキノリン化合物を含む、実施形態１４に記載の組成物。
実施形態１６． 前記ＴＬＲ７／８アゴニストがレシキモド（Ｒ８４８）を含む、実施形態１５に記載の組成物。
実施形態１７． 前記ＴＬＲ７／８アゴニストが、ＮＬＲファミリーパイリンドメイン含有３（ＮＬＲＰ３）を阻害しない、実施形態１４または実施形態１５に記載の組成物。
実施形態１８． 前記ＬＰＣがＬＰＣ（２２：０）を含み、前記ＴＬＲ７／８アゴニストがレシキモド（Ｒ８４８）を含む、実施形態１３に記載の組成物。
実施形態１９． 前記抗原が、個体から得られた生体試料中に存在する、実施形態１から１８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２０． 前記生体試料が生検組織を含む、実施形態１９に記載の組成物。
実施形態２１． 前記生体試料が細胞を含む、実施形態１９に記載の組成物。
実施形態２２． 前記生体試料が細胞を含まない、実施形態１９に記載の組成物。
実施形態２３． 前記生体試料が、膿瘍からの膿を含む、実施形態１９に記載の組成物。
実施形態２４． 前記抗原がタンパク質性抗原を含む、実施形態１から２３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２５． 前記抗原が腫瘍抗原を含む、実施形態２４に記載の組成物。
実施形態２６． 前記腫瘍抗原が、合成または組換えネオ抗原を含む、実施形態２５に記載の化合物。
実施形態２７． 前記腫瘍抗原が、腫瘍細胞溶解物を含む、実施形態２６に記載の組成物。
実施形態２８． 前記腫瘍抗原が、微生物抗原を含み、前記微生物抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、原虫抗原、および真菌抗原のうちの１つまたは複数を含む、実施形態２４に記載の組成物。
実施形態２９． 前記微生物抗原が精製または組換え表面タンパク質を含む、実施形態２８に記載の組成物。
実施形態３０． 前記微生物抗原が不活化されたウイルス全体を含む、実施形態２８に記載の組成物。
実施形態３１． 前記組成物がリポソームを含まない、実施形態１から３０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３２． 前記組成物がＬＰＳまたはＭＰＬＡを含まない、実施形態１から３１のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３３． 前記組成物が、ｏｘＰＡＰＣまたはｏｘＰＡＰＣの種を含まない、実施形態１から３２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３４． 前記組成物が、ＨＯｄｉＡ－ＰＣ、ＫＯｄｉＡ－ＰＣ、ＨＯＯＡ－ＰＣ、ＫＯＯＡ－ＰＣ、および／またはＰＧＰＣを含まない、実施形態３３に記載の組成物。
実施形態３５． アジュバントをさらに含み、前記アジュバントが、アルミニウム塩アジュバント、水中スクアレン－エマルジョン、サポニン、またはそれらの組合せを含む、実施形態１から３４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３６． 実施形態１から３５のいずれか１つに記載の組成物と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む、医薬製剤。
実施形態３７． 過剰活性化樹状細胞を産生するための方法であって、前記方法が、過剰活性化樹状細胞の産生のために、単一のＣ１３～Ｃ２２アシル鎖または単一のＣ１３～Ｃ２４アシル鎖を有する有効量の単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と、ＴＬＲ７／８アゴニストとを含む組成物に前記樹状細胞を接触させることを含み、前記過剰活性化樹状細胞はパイロトーシスを起こさずにＩＬ－１ベータを分泌する、方法。
実施形態３８． 前記樹状細胞を、エクスビボで、実施形態１から３５のいずれか１つに記載の組成物または実施形態３６に記載の製剤と接触させる、実施形態３７に記載の方法。
実施形態３９． 前記樹状細胞を、実施形態３６に記載の製剤とインビボで接触させる、実施形態３７に記載の方法。
実施形態４０． 実施形態３８に記載の方法によって産生された少なくとも１０３、１０４、１０５個または１０６個の前記過剰活性化樹状細胞と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬製剤。
実施形態４１． 抗原に対する免疫応答を刺激する方法であって、有効量の実施形態３６に記載の製剤を、投与することを必要とする個体に投与して、前記抗原に対する前記免疫応答を刺激することを含む、方法。
実施形態４２． 有効量の実施形態３６に記載の製剤を、投与することを必要とする個体に投与して前記がんを処置することを含む、がんを処置する方法。
実施形態４３． 異常な細胞増殖を阻害する方法であって、異常な細胞増殖を阻害するために有効量の実施形態３６に記載の製剤を、投与することを必要とする個体に投与することを含む方法。
実施形態４４． 感染性疾患を処置する方法であって、有効量の実施形態３６に記載の製剤を、前記感染性疾患を処置するために、投与することを必要とする個体に投与することを含む方法。
実施形態４５． 前記抗原に対する免疫応答を、誘導することを必要とする個体において誘導するための、実施形態３６に記載の製剤の使用。
実施形態４６． 抗腫瘍免疫応答を、誘導することを必要とする個体において誘導するための実施形態３６に記載の製剤の使用であって、前記個体が腫瘍を担持しているか、または腫瘍を担持していた、使用。
実施形態４７． 抗微生物免疫応答を誘導することを必要とする個体において誘導するための実施形態３６に記載の製剤の使用であって、前記個体が前記微生物に感染しているか、または前記微生物に曝露されていない、使用。
実施形態４８． 前記個体が哺乳動物対象である、実施形態１９から４７のいずれか１つに記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態４９． 前記個体がヒト対象である、実施形態１９から４７のいずれか１つに記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態５０． 免疫原性組成物の調製方法であって、該方法は、
ａ）腫瘍から調製した細胞の懸濁液から白血球を枯渇させて、腫瘍細胞富化懸濁液を得るステップと；
ｂ）前記腫瘍細胞富化懸濁液から細胞を溶解し、腫瘍細胞溶解物を得るステップと；
ｃ）前記腫瘍細胞溶解物を、単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）およびｔｏｌｌ様受容体７／８（ＴＬＲ７／８）アゴニストと接触させて、前記免疫原性組成物を得るステップであって、前記アシル鎖がＣ１３～Ｃ２２アシル鎖またはＣ１３～Ｃ２４アシル鎖であるステップと
を含む方法。
実施形態５１． ステップａ）において、抗ＣＤ４５抗体を使用するネガティブ選択によって前記白血球を枯渇させる、実施形態５０に記載の方法。
実施形態５２． 前記細胞が、ステップｂ）において、１またはそれを超える凍結融解サイクルによって溶解される、実施形態５０または実施形態５１に記載の方法。
実施形態５３． 前記アシル鎖が、完全飽和Ｃ１８～Ｃ２２アシル鎖または完全飽和Ｃ１８～Ｃ２４アシル鎖である、実施形態５０から５２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５４． 前記ＬＰＣが、１－ベヘノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン［ＬＰＣ（２２：０）］を含む、実施形態５３に記載の方法。
実施形態５５． 前記ＴＬＲ７／８アゴニストが、９００ダルトンまたはそれ未満の分子量を有する小分子である、実施形態５０から５４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５６． 前記ＴＬＲ７／８アゴニストがイミダゾキノリン化合物を含む、実施形態５５に記載の方法。
実施形態５７． 前記ＴＬＲ７／８アゴニストがレシキモド（Ｒ８４８）を含む、実施形態５６に記載の方法。
実施形態５８． 前記ＴＬＲ７／８アゴニストが、ＮＬＲファミリーパイリンドメイン含有３（ＮＬＲＰ３）を阻害しない、実施形態５５または実施形態５６に記載の方法。
実施形態５９． 前記ＬＰＣがＬＰＣ（２２：０）を含み、前記ＴＬＲ７／８アゴニストがレシキモド（Ｒ８４８）を含む、実施形態５４に記載の方法。
実施形態６０． ステップａ）の前に、がんを有する哺乳動物対象からの前記腫瘍から試料を得て、前記試料から細胞の前記懸濁液を調製するステップをさらに含む、実施形態５０から５９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６１． 実施形態５０から６０のいずれか１つに記載の方法によって調製された免疫原性組成物。
実施形態６２． 抗がん免疫応答を誘発する方法であって、前記方法が、
がんを有する哺乳動物対象に、有効量の実施形態６１に記載の免疫原性組成物を投与するステップ
を含む、方法。
実施形態６３． 前記抗がん免疫応答が細胞性免疫応答を含む、実施形態６２に記載の方法。
実施形態６４． 前記抗がん免疫応答が、がん抗原誘導性ＩＬ－１ベータ分泌および／またはＣＤ８＋Ｔリンパ球の活性化を含む、実施形態６３に記載の方法。
実施形態６５． 前記がんが非血液がんである、実施形態６２から６４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６６． 前記非血液がんが、癌、肉腫または黒色腫である、実施形態６５に記載の方法。
実施形態６７． 前記がんがリンパ腫である、実施形態６２から６４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６８． がんを処置する方法であって、前記方法は、
ａ）腫瘍細胞溶解物、単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、およびｔｏｌｌ様受容体７／８（ＴＬＲ７／８）アゴニストを含む免疫原性組成物を調製するステップであって、前記腫瘍細胞溶解物は、がんを有する哺乳動物対象から得た腫瘍の試料であるかまたはそれから調製されており、前記アシル鎖はＣ１３～Ｃ２２アシル鎖またはＣ１３～Ｃ２４アシル鎖であるステップと、
ｂ）前記被験体に有効量の前記免疫原性組成物を投与するステップと
を含む、方法。
実施形態６９． 前記アシル鎖が、完全飽和Ｃ１８～Ｃ２２アシル鎖または完全飽和Ｃ１８～Ｃ２４アシル鎖である、実施形態６２から６８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７０． 前記ＬＰＣが、１－ベヘノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン［ＬＰＣ（２２：０）］を含む、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７１． 前記ＴＬＲ７／８アゴニストが、９００ダルトンまたはそれ未満の分子量を有する小分子である、実施形態６２から７０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７２． 前記ＴＬＲ７／８アゴニストがイミダゾキノリン化合物を含む、実施形態７１に記載の方法。
実施形態７３． 前記ＴＬＲ７／８アゴニストがレシキモド（Ｒ８４８）を含む、実施形態７２に記載の方法。
実施形態７４． 前記ＬＰＣが２２：０ ＬＰＣを含み、前記ＴＬＲ７／８アゴニストがレシキモド（Ｒ８４８）を含む、実施形態７０に記載の方法。
実施形態７５． 有効量の追加の治療剤を前記対象に投与することをさらに含む、実施形態６８から７４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７６． 前記追加の治療剤が、免疫チェックポイント阻害剤、抗新生物剤、および放射線治療からなる群のうちの１つまたは複数を含む、実施形態７５に記載の方法。
実施形態７７． 単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）および病原体認識受容体（ＰＲＲ）アゴニストを含む組成物であって、前記アシル鎖がＣ１３～Ｃ２２アシル鎖またはＣ１３～Ｃ２４アシル鎖である、組成物。
実施形態７８． 前記ＰＲＲアゴニストが、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）またはＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）のアゴニストである、実施形態７７に記載の組成物。
実施形態７９． 前記ＰＲＲアゴニストが、細胞質ＤＮＡセンサー（ＣＤＳ）のアゴニストまたはＩＦＮ遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）である、実施形態７７に記載の組成物。
実施形態８０． 前記ＰＲＲアゴニストが、Ｒ８４８、ＴＬ８－５０６、ＬＰＳ、Ｐａｍ２ＣＳＫ４およびＯＤＮ２３３６のうちの１つまたは複数を含む、実施形態７７に記載の組成物。
実施形態８１． 抗原をさらに含む、実施形態７７～８０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態８２． 樹状細胞をさらに含む、実施形態７７から８１のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態８３． 実施形態７７から８２のいずれか１つに記載の組成物と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む、医薬製剤。
実施形態８４． 単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬製剤であって、前記アシル鎖がＣ２１～Ｃ２４アシル鎖である、医薬製剤。
実施形態８５． 前記アシル鎖が完全飽和Ｃ２２アシル鎖である、実施形態８３または実施形態８４に記載の医薬製剤。
実施形態８６． 前記ＬＰＣが１－ベヘノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン［ＬＰＣ（２２：０）］を含む、実施形態８５に記載の医薬製剤。
実施形態８７． 単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と、病原体認識受容体（ＰＲＲ）アゴニストとを含む、ヒト樹状細胞を過剰活性化するための組成物であって、前記アシル鎖がＣ２２アシル鎖であり、前記組成物が、前記ＬＰＣの代わりにＰＧＰＣを含む比較対照組成物よりも高いレベルの樹状細胞の過剰活性化を達成するのに有効である組成物。
実施形態８８． 前記高いレベルの樹状細胞の過剰活性化が、前記ＬＰＣと前記ＰＲＲアゴニストとを含む前記組成物に接触させた場合に、前記ＰＧＰＣと前記ＰＲＲアゴニストとを含む前記比較対照組成物に接触させた場合よりも少なくとも２、３または４倍高いレベルの、インビトロでの前記ヒト樹状細胞からのＩＬ－１ベータ分泌の誘導を含み、前記ＰＲＲアゴニストがＬＰＳである、実施形態８７に記載の組成物。
実施形態８９． 前記ＬＰＣの前記濃度および前記ＰＧＰＣの前記濃度が、約１０μＭ～約８０μＭの範囲内の同じ濃度であり、前記ＬＰＳが、前記組成物と前記比較対照組成物の両方で１μｇ／ｍｌの濃度で存在する、実施形態８８に記載の組成物。
実施形態９０． 前記高いレベルの樹状細胞の過剰活性化が、前記ＬＰＣと前記ＰＲＲアゴニストとを含む前記組成物について、ヒト樹状細胞からのＩＬ－１ベータ分泌に対する脂質活性指数を含み、これは、活性単位において、前記ＬＰＣと前記ＰＲＲアゴニストとを含む前記比較対照組成物の脂質活性指数よりも少なくとも４、５または６倍高い、、実施形態８８に記載の組成物。
実施形態９１． 前記個体がイヌ対象である、実施形態１９から４７のいずれか１つに記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態９２． 前記哺乳動物対象がヒト患者である、実施形態６０から９０のいずれか１つに記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態９３． 前記哺乳動物対象が非ヒト患者である、実施形態６０から９０のいずれか１つに記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態９４． 前記哺乳動物対象がイヌ患者である、実施形態６０から９０のいずれか１つに記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態９５． 前記樹状細胞がヒト樹状細胞である、実施形態１から９０または９２のいずれか１つに記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態９６． 前記樹状細胞がイヌ樹状細胞である、実施形態１から９１または９４のいずれか１つに記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態９７． 前記樹状細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む組成物中に存在する、実施形態９５または実施形態９６に記載の組成物、方法または使用。
実施形態９８． 前記過剰活性化樹状細胞が、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの一方または両方を分泌する、実施形態３７～４９または実施形態９１のいずれか１つに記載の組成物、方法または使用。
実施形態９９． 界面活性剤を含む、実施形態１～９８のいずれか１つに記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態１００． 前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤を含む、実施形態９９に記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態１０１． 前記非イオン性界面活性剤が、エチレンオキシド－プロピレンオキシドコポリマーを含む、実施形態１００に記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態１０２． 前記非イオン性界面活性剤が、ポロキサマー４０７、ポロキサマー１８８およびＰ１２３のうちの１つまたは複数を含む、実施形態１００に記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態１０３． 前記非イオン性界面活性剤がポロキサマー４０７を含む、実施形態１００に記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態１０４． ｉ）前記ＬＰＣをアルコールに溶解してＬＰＣアルコール溶液を形成し；ｉｉ）前記ＬＰＣアルコール溶液を前記非イオン性界面活性剤と混合して混合物を形成し；ｉｉｉ）前記アルコールを前記混合物から蒸発させて前記ＬＰＣと前記非イオン性界面活性剤を含む粒子を形成する、実施形態１００から１０３のいずれか１つに記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態１０５． 前記非イオン性界面活性剤が、約２．５％～２５％（ｗ／ｗ）、必要に応じて約５％～２０％（ｗ／ｗ）、必要に応じて約１５％（ｗ／ｗ）の量で存在する、実施形態１００から１０４のいずれか１つに記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態１０６． 前記ＬＰＣおよび非イオン性界面活性剤が、約１０００から２０００ナノメートルの直径を有し、必要に応じて約１５００ナノメートルの直径を有する粒子中に存在する、実施形態１００から１０５のいずれか１つに記載の組成物、製剤、方法または使用。
列挙された実施形態
実施形態１． 単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と、ＴＬＲ７／８アゴニストとを含む組成物であって、前記アシル鎖がＣ１３～Ｃ２２アシル鎖またはＣ１３～Ｃ２４アシル鎖である組成物。
実施形態２． 前記アシル鎖が、Ｃ１８～Ｃ２２アシル鎖またはＣ２１～Ｃ２４アシル鎖である、実施形態１に記載の組成物。
実施形態３． 抗原をさらに含む、実施形態１または実施形態２に記載の組成物。
実施形態４． 樹状細胞をさらに含む、実施形態１から３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５． 単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と、抗原とを含む組成物であって、前記アシル鎖がＣ２１～Ｃ２４アシル鎖である組成物。
実施形態６． 樹状細胞をさらに含む、実施形態５に記載の組成物。
実施形態７． ＴＬＲ７／８アゴニストをさらに含む、実施形態５または実施形態６に記載の組成物。
実施形態８． 単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と樹状細胞とを含む組成物であって、前記アシル鎖がＣ２１～Ｃ２４アシル鎖である組成物。
実施形態９． ＴＬＲ７／８アゴニストをさらに含む、実施形態８に記載の組成物。
実施形態１０． 抗原をさらに含む、実施形態８または実施形態９に記載の組成物。
実施形態１１． 前記アシル鎖がＣ２２アシル鎖である、実施形態１から１０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１２． 前記アシル鎖が完全に飽和している、実施形態１から１１のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１３． 前記ＬＰＣが１－ベヘノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン［ＬＰＣ（２２：０）］を含む、実施形態１から１２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１４． 前記ＴＬＲ７／８アゴニストが、９００ダルトンまたはそれ未満の分子量を有する小分子である、実施形態１から１３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１５． 前記ＴＬＲ７／８アゴニストがイミダゾキノリン化合物を含む、実施形態１４に記載の組成物。
実施形態１６． 前記ＴＬＲ７／８アゴニストがレシキモド（Ｒ８４８）を含む、実施形態１５に記載の組成物。
実施形態１７． 前記ＴＬＲ７／８アゴニストが、ＮＬＲファミリーパイリンドメイン含有３（ＮＬＲＰ３）を阻害しない、実施形態１４または実施形態１５に記載の組成物。
実施形態１８． 前記ＬＰＣがＬＰＣ（２２：０）を含み、前記ＴＬＲ７／８アゴニストがレシキモド（Ｒ８４８）を含む、実施形態１３に記載の組成物。
実施形態１９． 前記抗原が、個体から得られた生体試料中に存在する、実施形態１から１８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２０． 前記生体試料が生検組織を含む、実施形態１９に記載の組成物。
実施形態２１． 前記生体試料が細胞を含む、実施形態１９に記載の組成物。
実施形態２２． 前記生体試料が細胞を含まない、実施形態１９に記載の組成物。
実施形態２３． 前記生体試料が、膿瘍からの膿を含む、実施形態１９に記載の組成物。
実施形態２４． 前記抗原がタンパク質性抗原を含む、実施形態１から２３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２５． 前記抗原が腫瘍抗原を含む、実施形態２４に記載の組成物。
実施形態２６． 前記腫瘍抗原が、合成または組換えネオ抗原を含む、実施形態２５に記載の化合物。
実施形態２７． 前記腫瘍抗原が、腫瘍細胞溶解物を含む、実施形態２６に記載の組成物。
実施形態２８． 前記腫瘍抗原が、微生物抗原を含み、前記微生物抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、原虫抗原、および真菌抗原のうちの１つまたは複数を含む、実施形態２４に記載の組成物。
実施形態２９． 前記微生物抗原が精製または組換え表面タンパク質を含む、実施形態２８に記載の組成物。
実施形態３０． 前記微生物抗原が不活化されたウイルス全体を含む、実施形態２８に記載の組成物。
実施形態３１． 前記組成物がリポソームを含まない、実施形態１から３０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３２． 前記組成物がＬＰＳまたはＭＰＬＡを含まない、実施形態１から３１のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３３． 前記組成物が、ｏｘＰＡＰＣまたはｏｘＰＡＰＣの種を含まない、実施形態１から３２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３４． 前記組成物が、ＨＯｄｉＡ－ＰＣ、ＫＯｄｉＡ－ＰＣ、ＨＯＯＡ－ＰＣ、ＫＯＯＡ－ＰＣ、および／またはＰＧＰＣを含まない、実施形態３３に記載の組成物。
実施形態３５． アジュバントをさらに含み、前記アジュバントが、アルミニウム塩アジュバント、水中スクアレン－エマルジョン、サポニン、またはそれらの組合せを含む、実施形態１から３４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３６． 実施形態１から３５のいずれか１つに記載の組成物と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む、医薬製剤。
実施形態３７． 過剰活性化樹状細胞を産生するための方法であって、前記方法が、過剰活性化樹状細胞の産生のために、単一のＣ１３～Ｃ２２アシル鎖または単一のＣ１３～Ｃ２４アシル鎖を有する有効量の単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と、ＴＬＲ７／８アゴニストとを含む組成物に前記樹状細胞を接触させることを含み、前記過剰活性化樹状細胞はパイロトーシスを起こさずにＩＬ－１ベータを分泌する、方法。
実施形態３８． 前記樹状細胞を、エクスビボで、実施形態１から３５のいずれか１つに記載の組成物または実施形態３６に記載の製剤と接触させる、実施形態３７に記載の方法。
実施形態３９． 前記樹状細胞を、実施形態３６に記載の製剤とインビボで接触させる、実施形態３７に記載の方法。
実施形態４０． 実施形態３８に記載の方法によって産生された少なくとも１０３、１０４、１０５個または１０６個の前記過剰活性化樹状細胞と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬製剤。
実施形態４１． 抗原に対する免疫応答を刺激する方法であって、有効量の実施形態３６に記載の製剤を、投与することを必要とする個体に投与して、前記抗原に対する前記免疫応答を刺激することを含む、方法。
実施形態４２． 有効量の実施形態３６に記載の製剤を、投与することを必要とする個体に投与して前記がんを処置することを含む、がんを処置する方法。
実施形態４３． 異常な細胞増殖を阻害する方法であって、異常な細胞増殖を阻害するために有効量の実施形態３６に記載の製剤を、投与することを必要とする個体に投与することを含む方法。
実施形態４４． 感染性疾患を処置する方法であって、有効量の実施形態３６に記載の製剤を、前記感染性疾患を処置するために、投与することを必要とする個体に投与することを含む方法。
実施形態４５． 前記抗原に対する免疫応答を、誘導することを必要とする個体において誘導するための、実施形態３６に記載の製剤の使用。
実施形態４６． 抗腫瘍免疫応答を、誘導することを必要とする個体において誘導するための実施形態３６に記載の製剤の使用であって、前記個体が腫瘍を担持しているか、または腫瘍を担持していた、使用。
実施形態４７． 抗微生物免疫応答を誘導することを必要とする個体において誘導するための実施形態３６に記載の製剤の使用であって、前記個体が前記微生物に感染しているか、または前記微生物に曝露されていない、使用。
実施形態４８． 前記個体が哺乳動物対象である、実施形態１９から４７のいずれか１つに記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態４９． 前記個体がヒト対象である、実施形態１９から４７のいずれか１つに記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態５０． 免疫原性組成物の調製方法であって、該方法は、
ａ）腫瘍から調製した細胞の懸濁液から白血球を枯渇させて、腫瘍細胞富化懸濁液を得るステップと；
ｂ）前記腫瘍細胞富化懸濁液から細胞を溶解し、腫瘍細胞溶解物を得るステップと；
ｃ）前記腫瘍細胞溶解物を、単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）およびｔｏｌｌ様受容体７／８（ＴＬＲ７／８）アゴニストと接触させて、前記免疫原性組成物を得るステップであって、前記アシル鎖がＣ１３～Ｃ２２アシル鎖またはＣ１３～Ｃ２４アシル鎖であるステップと
を含む方法。
実施形態５１． ステップａ）において、抗ＣＤ４５抗体を使用するネガティブ選択によって前記白血球を枯渇させる、実施形態５０に記載の方法。
実施形態５２． 前記細胞が、ステップｂ）において、１またはそれを超える凍結融解サイクルによって溶解される、実施形態５０または実施形態５１に記載の方法。
実施形態５３． 前記アシル鎖が、完全飽和Ｃ１８～Ｃ２２アシル鎖または完全飽和Ｃ１８～Ｃ２４アシル鎖である、実施形態５０から５２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５４． 前記ＬＰＣが、１－ベヘノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン［ＬＰＣ（２２：０）］を含む、実施形態５３に記載の方法。
実施形態５５． 前記ＴＬＲ７／８アゴニストが、９００ダルトンまたはそれ未満の分子量を有する小分子である、実施形態５０から５４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５６． 前記ＴＬＲ７／８アゴニストがイミダゾキノリン化合物を含む、実施形態５５に記載の方法。
実施形態５７． 前記ＴＬＲ７／８アゴニストがレシキモド（Ｒ８４８）を含む、実施形態５６に記載の方法。
実施形態５８． 前記ＴＬＲ７／８アゴニストが、ＮＬＲファミリーパイリンドメイン含有３（ＮＬＲＰ３）を阻害しない、実施形態５５または実施形態５６に記載の方法。
実施形態５９． 前記ＬＰＣがＬＰＣ（２２：０）を含み、前記ＴＬＲ７／８アゴニストがレシキモド（Ｒ８４８）を含む、実施形態５４に記載の方法。
実施形態６０． ステップａ）の前に、がんを有する哺乳動物対象からの前記腫瘍から試料を得て、前記試料から細胞の前記懸濁液を調製するステップをさらに含む、実施形態５０から５９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６１． 実施形態５０から６０のいずれか１つに記載の方法によって調製された免疫原性組成物。
実施形態６２． 抗がん免疫応答を誘発する方法であって、前記方法が、
がんを有する哺乳動物対象に、有効量の実施形態６１に記載の免疫原性組成物を投与するステップ
を含む、方法。
実施形態６３． 前記抗がん免疫応答が細胞性免疫応答を含む、実施形態６２に記載の方法。
実施形態６４． 前記抗がん免疫応答が、がん抗原誘導性ＩＬ－１ベータ分泌および／またはＣＤ８＋Ｔリンパ球の活性化を含む、実施形態６３に記載の方法。
実施形態６５． 前記がんが非血液がんである、実施形態６２から６４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６６． 前記非血液がんが、癌、肉腫または黒色腫である、実施形態６５に記載の方法。
実施形態６７． 前記がんがリンパ腫である、実施形態６２から６４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６８． がんを処置する方法であって、前記方法は、
ａ）腫瘍細胞溶解物、単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、およびｔｏｌｌ様受容体７／８（ＴＬＲ７／８）アゴニストを含む免疫原性組成物を調製するステップであって、前記腫瘍細胞溶解物は、がんを有する哺乳動物対象から得た腫瘍の試料であるかまたはそれから調製されており、前記アシル鎖はＣ１３～Ｃ２２アシル鎖またはＣ１３～Ｃ２４アシル鎖であるステップと、
ｂ）前記被験体に有効量の前記免疫原性組成物を投与するステップと
を含む、方法。
実施形態６９． 前記アシル鎖が、完全飽和Ｃ１８～Ｃ２２アシル鎖または完全飽和Ｃ１８～Ｃ２４アシル鎖である、実施形態６２から６８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７０． 前記ＬＰＣが、１－ベヘノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン［ＬＰＣ（２２：０）］を含む、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７１． 前記ＴＬＲ７／８アゴニストが、９００ダルトンまたはそれ未満の分子量を有する小分子である、実施形態６２から７０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７２． 前記ＴＬＲ７／８アゴニストがイミダゾキノリン化合物を含む、実施形態７１に記載の方法。
実施形態７３． 前記ＴＬＲ７／８アゴニストがレシキモド（Ｒ８４８）を含む、実施形態７２に記載の方法。
実施形態７４． 前記ＬＰＣが２２：０ ＬＰＣを含み、前記ＴＬＲ７／８アゴニストがレシキモド（Ｒ８４８）を含む、実施形態７０に記載の方法。
実施形態７５． 有効量の追加の治療剤を前記対象に投与することをさらに含む、実施形態６８から７４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７６． 前記追加の治療剤が、免疫チェックポイント阻害剤、抗新生物剤、および放射線治療からなる群のうちの１つまたは複数を含む、実施形態７５に記載の方法。
実施形態７７． 単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）および病原体認識受容体（ＰＲＲ）アゴニストを含む組成物であって、前記アシル鎖がＣ１３～Ｃ２２アシル鎖またはＣ１３～Ｃ２４アシル鎖である、組成物。
実施形態７８． 前記ＰＲＲアゴニストが、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）またはＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）のアゴニストである、実施形態７７に記載の組成物。
実施形態７９． 前記ＰＲＲアゴニストが、細胞質ＤＮＡセンサー（ＣＤＳ）のアゴニストまたはＩＦＮ遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）である、実施形態７７に記載の組成物。
実施形態８０． 前記ＰＲＲアゴニストが、Ｒ８４８、ＴＬ８－５０６、ＬＰＳ、Ｐａｍ２ＣＳＫ４およびＯＤＮ２３３６のうちの１つまたは複数を含む、実施形態７７に記載の組成物。
実施形態８１． 抗原をさらに含む、実施形態７７～８０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態８２． 樹状細胞をさらに含む、実施形態７７から８１のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態８３． 実施形態７７から８２のいずれか１つに記載の組成物と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む、医薬製剤。
実施形態８４． 単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬製剤であって、前記アシル鎖がＣ２１～Ｃ２４アシル鎖である、医薬製剤。
実施形態８５． 前記アシル鎖が完全飽和Ｃ２２アシル鎖である、実施形態８３または実施形態８４に記載の医薬製剤。
実施形態８６． 前記ＬＰＣが１－ベヘノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン［ＬＰＣ（２２：０）］を含む、実施形態８５に記載の医薬製剤。
実施形態８７． 単一アシル鎖を有する単離されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と、病原体認識受容体（ＰＲＲ）アゴニストとを含む、ヒト樹状細胞を過剰活性化するための組成物であって、前記アシル鎖がＣ２２アシル鎖であり、前記組成物が、前記ＬＰＣの代わりにＰＧＰＣを含む比較対照組成物よりも高いレベルの樹状細胞の過剰活性化を達成するのに有効である組成物。
実施形態８８． 前記高いレベルの樹状細胞の過剰活性化が、前記ＬＰＣと前記ＰＲＲアゴニストとを含む前記組成物に接触させた場合に、前記ＰＧＰＣと前記ＰＲＲアゴニストとを含む前記比較対照組成物に接触させた場合よりも少なくとも２、３または４倍高いレベルの、インビトロでの前記ヒト樹状細胞からのＩＬ－１ベータ分泌の誘導を含み、前記ＰＲＲアゴニストがＬＰＳである、実施形態８７に記載の組成物。
実施形態８９． 前記ＬＰＣの前記濃度および前記ＰＧＰＣの前記濃度が、約１０μＭ～約８０μＭの範囲内の同じ濃度であり、前記ＬＰＳが、前記組成物と前記比較対照組成物の両方で１μｇ／ｍｌの濃度で存在する、実施形態８８に記載の組成物。
実施形態９０． 前記高いレベルの樹状細胞の過剰活性化が、前記ＬＰＣと前記ＰＲＲアゴニストとを含む前記組成物について、ヒト樹状細胞からのＩＬ－１ベータ分泌に対する脂質活性指数を含み、これは、活性単位において、前記ＬＰＣと前記ＰＲＲアゴニストとを含む前記比較対照組成物の脂質活性指数よりも少なくとも４、５または６倍高い、、実施形態８８に記載の組成物。
実施形態９１． 前記個体がイヌ対象である、実施形態１９から４７のいずれか１つに記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態９２． 前記哺乳動物対象がヒト患者である、実施形態６０から９０のいずれか１つに記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態９３． 前記哺乳動物対象が非ヒト患者である、実施形態６０から９０のいずれか１つに記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態９４． 前記哺乳動物対象がイヌ患者である、実施形態６０から９０のいずれか１つに記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態９５． 前記樹状細胞がヒト樹状細胞である、実施形態１から９０または９２のいずれか１つに記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態９６． 前記樹状細胞がイヌ樹状細胞である、実施形態１から９１または９４のいずれか１つに記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態９７． 前記樹状細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む組成物中に存在する、実施形態９５または実施形態９６に記載の組成物、方法または使用。
実施形態９８． 前記過剰活性化樹状細胞が、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの一方または両方を分泌する、実施形態３７～４９または実施形態９１のいずれか１つに記載の組成物、方法または使用。
実施形態９９． 界面活性剤を含む、実施形態１～９８のいずれか１つに記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態１００． 前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤を含む、実施形態９９に記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態１０１． 前記非イオン性界面活性剤が、エチレンオキシド－プロピレンオキシドコポリマーを含む、実施形態１００に記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態１０２． 前記非イオン性界面活性剤が、ポロキサマー４０７、ポロキサマー１８８およびＰ１２３のうちの１つまたは複数を含む、実施形態１００に記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態１０３． 前記非イオン性界面活性剤がポロキサマー４０７を含む、実施形態１００に記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態１０４． ｉ）前記ＬＰＣをアルコールに溶解してＬＰＣアルコール溶液を形成し；ｉｉ）前記ＬＰＣアルコール溶液を前記非イオン性界面活性剤と混合して混合物を形成し；ｉｉｉ）前記アルコールを前記混合物から蒸発させて前記ＬＰＣと前記非イオン性界面活性剤を含む粒子を形成する、実施形態１００から１０３のいずれか１つに記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態１０５． 前記非イオン性界面活性剤が、約２．５％～２５％（ｗ／ｗ）、必要に応じて約５％～２０％（ｗ／ｗ）、必要に応じて約１５％（ｗ／ｗ）の量で存在する、実施形態１００から１０４のいずれか１つに記載の組成物、製剤、方法または使用。
実施形態１０６． 前記ＬＰＣおよび非イオン性界面活性剤が、約１０００から２０００ナノメートルの直径を有し、必要に応じて約１５００ナノメートルの直径を有する粒子中に存在する、実施形態１００から１０５のいずれか１つに記載の組成物、製剤、方法または使用。
【実施例】
【0120】
略語：ＢＭ（骨髄）；ＢＭＤＣ（骨髄由来樹状細胞）；ＣＤＳ（細胞質ＤＮＡセンサー）；ＣＬＲ（Ｃ型レクチン受容体）；ＤＡＭＰ（ダメージ関連分子パターン）；ＤＣ（樹状細胞）；ｄＬＮ（排出リンパ節）；ＨＯｄｉＡ－ＰＣ（１－パルミトイル－２－（５－ヒドロキシ－８－オキソ－６－オクテンジオイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン）；ＨＯＯＡ－ＰＣ（１－パルミトイル－２－（５－ヒドロキシ－８－オキソオクタ－６－エノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）；ＩＦＮγ（インターフェロンガンマ）；ＩＬ－１ｂ／ＩＬ１－ベータ／ＩＬ－１β（インターロイキン－１ベータ）；ＫＯｄｉＡ－ＰＣ（１－（パルミトイル）－２－（５－ケト－６－オクテン－ジオイル）ホスファチジルコリン）；ＫＯＯＡ－ＰＣ（１－パルミトイル－（５－ケト－８－オキソ－６－オクテノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）；ＫＰ４０７（ポロキサマー４０７）；ＬＰＣ／Ｌｙｓｏ ＰＣ（リゾホスファチジルコリン）；Ｌｙｓｏ ＰＣ（２２：０）（１－ベヘノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）；ＬＰＳ（リポ多糖）；ＭＦＩ（平均蛍光強度）；ｍｏＤＣ（単球由来樹状細胞）；ＭＰＬＡ（モノホスホリルリピドＡ）；ＮＬＲ（ＮＯＤ様受容体）；ｏｘＰＡＰＣ（酸化１－パルミトイル－２－アラキドニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホリルコリン）；ＰＡＭＰ（病原体関連分子パターン）；ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）；ＰＧＰＣ（１－パルミトイル－２－グルタリル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）；ＰＯＶＰＣ（１－パルミトイル－２－（５’－オキソ－バレロイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）；ＰＲＲ（病原体認識受容体）；ＲＬＲ（ＲＩＧ－Ｉ様受容体）；Ｒ８４８（レシキモド）；ＳＴＩＮＧ（ＩＦＮ遺伝子の刺激因子）；ＴＮＦα（腫瘍壊死因子－アルファ）；ＴＬＲ（ｔｏｌｌ様受容体）；およびＷＴＬ（全腫瘍溶解物）。
【0121】
本開示は、明確さおよび理解のために例示および例としてある程度詳細に記載されているが、特定の変更および修正が実施され得ることは当業者には明らかである。したがって、以下の実施例は、添付の特許請求の範囲によって規定される本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【0122】
実施例１：樹状細胞の過剰活性化のためのＤＡＭＰおよびＰＡＭＰの同定
この実施例は、組み合わせてヒト樹状細胞を過剰活性化することができる脂質ＤＡＭＰおよび小分子ＰＡＭＰの同定について説明する。
この実施例は、組み合わせてヒト樹状細胞を過剰活性化することができる脂質ＤＡＭＰおよび小分子ＰＡＭＰの同定について説明する。
【0123】
材料および方法
ヒト単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）の分化。ヒト単球をＳｔｒａｉｇｈｔＦｒｏｍ Ｌｅｕｋｏｐａｋ ＣＤ１４マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を製造業者の指示に従って使用して、Ｌｅｕｋｏｐａｋｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉより購入）から単離した。次いで、単球を等分し、１０％ジメチルスルホキシドを含有するウシ胎児血清中で凍結させた。ｍｏＤＣ培養物を使用した過剰活性化脂質の研究には、単球を解凍し、１０％ＦＢＳ、５０単位／ｍＬペニシリン、５０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および５０ｍＭベータ－メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ培地（Ｒ１０培地）で培養した。ヒト単球を、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ－４（２５ｎｇ／ｍＬ）を使用して分化させ、Ｒ１０培地に添加した。細胞をＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４と共に６日間培養し、３日目にＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４を含有するＲ１０をさらに細胞に供給した。
ヒト単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）の分化。ヒト単球をＳｔｒａｉｇｈｔＦｒｏｍ Ｌｅｕｋｏｐａｋ ＣＤ１４マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を製造業者の指示に従って使用して、Ｌｅｕｋｏｐａｋｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉより購入）から単離した。次いで、単球を等分し、１０％ジメチルスルホキシドを含有するウシ胎児血清中で凍結させた。ｍｏＤＣ培養物を使用した過剰活性化脂質の研究には、単球を解凍し、１０％ＦＢＳ、５０単位／ｍＬペニシリン、５０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および５０ｍＭベータ－メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ培地（Ｒ１０培地）で培養した。ヒト単球を、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ－４（２５ｎｇ／ｍＬ）を使用して分化させ、Ｒ１０培地に添加した。細胞をＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４と共に６日間培養し、３日目にＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４を含有するＲ１０をさらに細胞に供給した。
【0124】
危険関連分子パターン（ＤＡＭＰ）スクリーニング。ｍｏＤＣへの分化の６日後、細胞を収集し、計数した。細胞を、９６ウェル平底組織培養処理プレート中のＲ１０培地に１００，０００細胞／ウェルでプレーティングした。ＬＰＳ、血清型Ｏ５５：Ｂ５（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、各ウェルにおいて最終濃度１μｇ／ｍＬになるように添加した。ＬＰＳの添加後、脂質を調製し、８２．５μＭまたは４１．３μＭの最終濃度で添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２日間インキュベートした。次いで、細胞培養物をエンドポイント分析に使用した。
【0125】
脂質滴定。ｍｏＤＣへの分化の６日後、細胞を収集し、計数した。細胞を、９６ウェル平底組織培養処理プレート中のＲ１０培地に１００，０００細胞／ウェルで再プレーティングした。ＬＰＳ、血清型Ｏ５５：Ｂ５（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、各ウェルにおいて最終濃度１μｇ／ｍＬになるように添加した。ＬＰＳの添加後、脂質を調製した。試験した最高の脂質濃度（８２．５μＭ）の作業ストックをＲ１０で作製し、その後、試験した最終濃度の１．３μＭまで連続２倍希釈を行った。２日間の培養後、細胞培養物をエンドポイント分析に使用した。
【0126】
病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）スクリーニング。自然免疫シグナル伝達経路アゴニストはＩｎｖｉｖｏｇｅｎから購入した。凍結乾燥ストックを再構成し、製造業者の指示に従って推奨濃度で保存した。ｍｏＤＣへの分化の６日後、細胞を収集し、計数した。細胞を、９６ウェル平底組織培養処理プレート中のＲ１０培地に１００，０００細胞／ウェルで再プレーティングした。自然免疫シグナル伝達アゴニストをＲ１０培地で製造業者の推奨作業濃度に希釈し、その後、細胞に添加した。次いで、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣをＲ１０中の凍結乾燥ストックから再構成し、その後さらに希釈した。脂質を最終濃度２０μＭで細胞に添加した。細胞を２日間インキュベートした後、エンドポイント分析のために培養物を収集した。
【0127】
エンドポイント分析。ｍｏＤＣをＰＡＭＰおよびＤＡＭＰとともに２日間培養した後、上清および細胞試料を分析のために収集した。培養中の細胞を、４００×ｇで５分間遠心分離することにより、ペレット化した。ウェル中の培地体積の半分を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるサイトカイン定量のために収集し、残りの培地および細胞は、代謝活性を評価することによって細胞生存率を定量するために使用した。
【0128】
ＩＬ－１ベータ分泌の定量。ＩＬ－１ベータ分泌は、ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１ベータキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して評価した。ＥＬＩＳＡは、以下の修正を加えて製造業者の指示に従って実施した：ｉ）インキュベーションのための総試料体積を１００ｍＬから５０ｍＬに減少させた（２５ｍＬ／ウェルの試料または標準物質を含む２５ｍＬ／ウェルのアッセイ緩衝液Ｄ）；ｉｉ）上位の標準物質を５００ｐｇ／ｍＬに調製し、７．８ｐｇ／ｍＬに２倍希釈した；ｉｉｉ）試料のインキュベーションをオービタルシェーカーで４℃で一晩で完了させた。吸光度は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉＤ３プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、５７０ｎｍ補正で４５０ｎｍで測定した。上清中のＩＬ－１ベータ濃度を決定するために、試料のＩＬ－１ベータ濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）での４ＰＬ分析による標準曲線を用いて補間した。次に、試料の補間された結果を、上清に行ったあらゆる希釈について調整した。
【0129】
細胞生存率の定量。細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、代謝的に活性な細胞の指標としてＡＴＰの存在を定量することによって評価した。代謝活性は、製造業者の指示に従って評価した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を、細胞ペレットおよび残りの上清と混合し、白色の不透明な９６ウェルプレートに移した。発光は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉＤ３プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、５００ｍｓの積分時間を使用してすべての波長で測定した。生存率を、ＬＰＳで処理したｍｏＤＣの対照条件と比較して計算した。
【0130】
統計解析。各データセットについて、複数のドナーを試験し、試験ごとの数を各試験に対応する表に示した。各試験条件について、各ドナー由来の細胞をプレーティングし、３連で試験した。各ドナーの三重測定値を平均し、ＩＬ－１ベータを定量するかまたは生存率を測定する場合には、その平均を１つのドナー測定値として含めた。グラフ上で、各データポイントはドナーの平均値を表す。試験条件の違いを試験するために、試験結果を各表に示す対照条件と比較した。Ｐ値は、ダネット検定を使用した多重比較の補正を伴う反復測定一元配置分散分析を使用して計算した。
【0131】
結果－定義された構造の脂質は過剰刺激能力を有する
通常、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（ＴＬＲ）などのワクチンアジュバントによる樹状細胞（ＤＣ）の成熟は、ＩＬ－１β分泌をもたらさない。インフラマソームの活性化中、ＩＬ－１β分泌は起こるが、パイロトーシスと呼ばれる溶解性プログラム細胞死プロセスを伴う可能性がある（Ｅｖａｖｏｌｄら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，４３０（２）：２１７～２３７，２０１９）。しかし、ＰＡＭＰ ＬＰＳおよびＤＡＭＰ ＰＧＰＣを使用してＤＣを成熟させると、それらは、パイロトーシスを伴わずにＩＬ－１βを産生および分泌することができ（図１参照）、これらの生存可能なＤＣを過剰活性ＤＣとして特徴付けることができる（Ｚｈｉｖａｋｉら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，３３（７）：１０８３８１，２０２０）。マウスモデルでは、過剰活性化されたＤＣは、ＬＰＳのみを使用して活性化された細胞と比較して、免疫応答を誘導する能力が改善されていることが観察されている（Ｚｈｉｖａｋｉら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，３３（７）：１０８３８１，２０２０）。
通常、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（ＴＬＲ）などのワクチンアジュバントによる樹状細胞（ＤＣ）の成熟は、ＩＬ－１β分泌をもたらさない。インフラマソームの活性化中、ＩＬ－１β分泌は起こるが、パイロトーシスと呼ばれる溶解性プログラム細胞死プロセスを伴う可能性がある（Ｅｖａｖｏｌｄら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，４３０（２）：２１７～２３７，２０１９）。しかし、ＰＡＭＰ ＬＰＳおよびＤＡＭＰ ＰＧＰＣを使用してＤＣを成熟させると、それらは、パイロトーシスを伴わずにＩＬ－１βを産生および分泌することができ（図１参照）、これらの生存可能なＤＣを過剰活性ＤＣとして特徴付けることができる（Ｚｈｉｖａｋｉら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，３３（７）：１０８３８１，２０２０）。マウスモデルでは、過剰活性化されたＤＣは、ＬＰＳのみを使用して活性化された細胞と比較して、免疫応答を誘導する能力が改善されていることが観察されている（Ｚｈｉｖａｋｉら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，３３（７）：１０８３８１，２０２０）。
【0132】
ＤＣを過剰活性化することができるさらなる脂質（例えば、過剰活性化脂質）を同定するために、ホスファチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）（ＰＣ）脂質のライブラリーをスクリーニング用に選択した。ＰＣ脂質のライブラリーには、混合アシルＰＣ脂質、Ｌｙｓｏ ＰＣ脂質、および酸化ＰＣ脂質が含まれていた。３種類のＰＣ脂質はすべて、ホスホコリン頭部基が存在するためにＰＧＰＣと構造的に類似しているが、各種類は、アシル鎖の数および長さ、脂肪酸飽和度、ならびに酸化状態が異なる。脂質スクリーニング戦略を設計する場合、ヒトＤＣは言うまでもなく、ＤＣを過剰活性化させるこれらの脂質の使用は報告されていなかったので、これらの特性の重要性は不明であった。
【0133】
臨床使用に最も関連する脂質種を同定するために、ヒトＤＣを用いてＰＣ脂質をスクリーニングした。ＭｏＤＣはＬＰＳによって活性化され、ＩＬ－１βの前駆体（例えば、未成熟ＩＬ－１β）を産生するが、ＬＰＳのみに応答してＩＬ－１βを分泌しない。ＬＰＳと組み合わせてＰＧＰＣに曝露すると、ｍｏＤＣは切断された活性型のＩＬ－１βを分泌するが、ｍｏＤＣは生存可能なままである。分泌されたＩＬ－１βは、ＤＣ過剰活性化の１日後に細胞培養上清中で検出され得るが、ＩＬ－１β分泌後の長いこと未解決なままの生存率を確実にするために、過剰活性化の２日後に細胞生存率を評価した。パイロトーシスまたは脂質の毒性のために死んだ細胞は他の免疫細胞と相互作用することができず、したがって適応Ｔ細胞応答を刺激することができないので、ｍｏＤＣ生存率は不可欠である。
【0134】
各データセットについて、複数のドナー由来のヒト単球を試験した。簡単に記載すると、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４を使用して、ヒト単球試料をｍｏＤＣに分化させた。細胞をプレーティングした後、ＬＰＳで活性化した。次いで、ライブラリー中の脂質を８２．５μＭで細胞培養物に添加し、細胞を２日間過剰活性化した。多くの脂質種は、主にＬｙｓｏ ＰＣ脂質群でＩＬ－１ベータの産生を誘導した（表１－１）。脂質は細胞生存率にも様々な影響を及ぼし、ＩＬ－１ベータ分泌を誘導する脂質は細胞生存率を低下させることがあった（表１－１）。
【0135】
脂質構造と過剰活性化能との間の関係を識別するために、ＩＬ－１ベータ分泌を刺激する脂質の最大群（Ｌｙｓｏ ＰＣ）をさらに分析した。試験したＬｙｓｏ ＰＣ脂質はすべて、６～２６炭素長に及ぶ単一アシル鎖を有する。試験した全てのドナーについて、ＩＬ－１ベータ分泌は、脂質が１２炭素長よりも長い単一アシル鎖を有する場合に、ＬＰＳ処理対照条件を超えると検出可能であった（図２）。このことは、１２～２２炭素長の単一アシル鎖を有するＰＣ脂質がＩＬ－１ベータ分泌を刺激し得ることを示している。驚くべきことに、１２～２２炭素長の不飽和アシル鎖は、脂質３６および３７を含む試験で見られたように、ＩＬ－１ベータ分泌を誘導しなかった（表１－１および図２）。対照的に、同様に長い飽和アシル鎖を有する脂質（脂質試験３５および３８）は、ＩＬ－１ベータ分泌を誘導することができた（表１－１および図２）。脂質種３６および３７に見られる二重結合は、おそらくそれらの構造の変化のために、これらの脂質を不活性にする。
【0136】
さらに、脂質試験３８および３９（表１－１および図２）によって示されるように、単一アシル鎖の位置は重要ではないようである。代わりに、アシル鎖の数がより大きな役割を果たすと思われる。混合アシルＰＣサブセット内の脂質は、様々な長さの２つのアシル鎖を有する。１２～２２炭素長の範囲内のアシル鎖を有するにもかかわらず、これらの脂質はほとんど不活性であった。
【表1-1-1】
【表1-1-2】
【表1-1-3】
【0137】
結果－２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣは強力な過剰刺激能力を有する
過剰活性化脂質の最初のスクリーニングは、５人のヒトドナーから得たｍｏＤＣを用いて８２．５μＭの脂質濃度を用いて行った。しかし、異なる脂質種は、様々な濃度にわたって過剰活性化作用を有し得る。具体的には、８２．５μＭで試験した脂質のいくつかは、細胞生存率の低下を引き起こし、ＩＬ－１β分泌を促進しながら細胞生存率を維持するには、より低い脂質濃度が最適であり得ることを示している。３人のヒトドナーから得られたｍｏＤＣを使用して、脂質ライブラリーを４１．３μＭで再スクリーニングした。結果を表１－２に示す。
過剰活性化脂質の最初のスクリーニングは、５人のヒトドナーから得たｍｏＤＣを用いて８２．５μＭの脂質濃度を用いて行った。しかし、異なる脂質種は、様々な濃度にわたって過剰活性化作用を有し得る。具体的には、８２．５μＭで試験した脂質のいくつかは、細胞生存率の低下を引き起こし、ＩＬ－１β分泌を促進しながら細胞生存率を維持するには、より低い脂質濃度が最適であり得ることを示している。３人のヒトドナーから得られたｍｏＤＣを使用して、脂質ライブラリーを４１．３μＭで再スクリーニングした。結果を表１－２に示す。
【表1-2-1】
【表1-2-2】
【表1-2-3】
【0138】
４１．３μＭで、ＩＬ－１β分泌を誘導した脂質は、８２．５μＭで観察された結果をほぼ確認した（表１－２、表１と比較）。仮定されるように、ＩＬ－１β分泌を誘導した脂質で処理したｍｏＤＣの生存率は、８２．５μＭと比較して４１．３μＭで改善された（表１－２）。
【0139】
次に、追加の研究で使用するために、いくつかの脂質を選択した（表１－３および図３）。ＬＹＳＯ ＰＣサブセットから、２２：０ ＬＹＳＯ ＰＣおよび１９：０ ＬＹＳＯ ＰＣを、ＩＬ－１β分泌のロバストな誘導に基づいて、追加の研究のために選択した。さらに、ＩＬ－１β分泌を刺激するための最小アシル鎖脂質であったために、１２：０ ＬＹＳＯ ＰＣを選択した。アシル鎖長がＩＬ－１β分泌活性の範囲外であったため、１０：０ ＬＹＳＯ ＰＣおよび２４：０ Ｌｙｓｏ ＰＣを陰性対照脂質として選択した。酸化脂質群から、ＰＧＰＣ、ＰＯＶＰＣおよびｏｘＰＡＰＣは、スクリーニングがこれらの脂質を含む研究に基づいていたため、さらなる研究のために保管された。ＰＡｚｅＰＣは、ＩＬ－１β分泌を促進し、他の酸化脂質と構造的に類似しており、活性を保持しながら試験した中で最長の第２アシル鎖を有していたため、さらなる研究のために選択された。これらの活性および不活性脂質種で観察される違いをより明確に実証するために、選択した脂質の結果を表１～３および図３に示す。
【表1-3】
【0140】
過剰活性化脂質の効力をさらに理解するために、より広い範囲の脂質濃度でＩＬ－１β分泌および細胞生存率を研究した。４人のヒトドナーから得たｍｏＤＣをＬＰＳで活性化させた。目的の脂質を８２．５μＭで細胞に添加し、濃度を１．３μＭの最終試験濃度まで２倍希釈した。ＬＰＳで処理した細胞よりも２倍高いレベルでＩＬ－１β分泌を誘導した最低濃度の逆数に、任意の濃度で観察された最大ＩＬ－１βシグナルを乗算することによって脂質活性指数を計算し、各脂質の効力を比較した。選択した脂質の結果を表１ー４および図４に示す。要約すると、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣがこれまでで最も強力な活性を有し、１９：０ Ｌｙｓｏ ＰＣがそれに続く。ＰＧＰＣおよびＰＡｚｅＰＣは同様の活性指数を有していた。
【表1-4】
【0141】
脂質の滴定により、選択された脂質の活性に関する本発明者らの知識も広がった。１０．３μＭでは、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣはＩＬ－１ベータ分泌を誘導する能力を保持していたが、試験した他のすべての脂質は誘導できなかった（表１－５）。１０．３μＭでは、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣで処理したｍｏＤＣは高い生存率を保持し（表１－５）、したがって、過剰活性化樹状細胞の両方の特性を示した。２０．６μＭでは、２２：０のＬｙｓｏ ＰＣはＩＬ－１ベータ分泌を増加させたのに対し、試験した他の脂質は増加させなかった（表１－６）が、これは細胞生存率を若干低下させた。
【表1-5】
【表1-6】
【0142】
１０．３μＭでは、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣは、８２．５μＭのＰＧＰＣに匹敵する濃度でＩＬ－１ベータ分泌を刺激する（表１－５および表１－１）。したがって、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣは、ＰＧＰＣよりもほぼ８倍低い濃度で使用することができ、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣはこれまでに確認された最も強力な過剰活性化脂質になる。
【0143】
結果－自然免疫シグナル伝達経路アゴニストは樹状細胞を過剰活性化することができる
以前の実験から、樹状細胞を過剰活性化するために２つのシグナルが必要であることが示された、すなわち、未熟型のＩＬ－１βを産生する自然免疫アゴニスト（例えば、ＬＰＳなどのＰＡＭＰ）と、ＩＬ－１β分泌を可能にする脂質（例えば、ＰＧＰＣなどのＤＡＭＰ）である。上記のＤＡＭＰスクリーニングは自然免疫アゴニストとしてＬＰＳを使用したが、毒性の懸念のためにＬＰＳは臨床アゴニストとして使用されていない。したがって、臨床的に関連する自然免疫シグナル伝達経路アゴニストの選択を、ヒトｍｏＤＣを過剰活性化する能力について２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣと組み合わせて試験した。
以前の実験から、樹状細胞を過剰活性化するために２つのシグナルが必要であることが示された、すなわち、未熟型のＩＬ－１βを産生する自然免疫アゴニスト（例えば、ＬＰＳなどのＰＡＭＰ）と、ＩＬ－１β分泌を可能にする脂質（例えば、ＰＧＰＣなどのＤＡＭＰ）である。上記のＤＡＭＰスクリーニングは自然免疫アゴニストとしてＬＰＳを使用したが、毒性の懸念のためにＬＰＳは臨床アゴニストとして使用されていない。したがって、臨床的に関連する自然免疫シグナル伝達経路アゴニストの選択を、ヒトｍｏＤＣを過剰活性化する能力について２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣと組み合わせて試験した。
【0144】
試験したＰＲＲアゴニストは、主にＴＬＲシグナル伝達経路アゴニストに焦点を当てたが、いくつかのｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路アゴニストおよびＣ型レクチンファミリー受容体アゴニストも試験した。１０人の異なるヒトドナー由来のｍｏＤＣを使用して、アゴニストを最初に試験した（表１－７）。１０人のヒトドナーのうちの５人からのｍｏＤＣも、より低濃度でアゴニストを試験するために使用した（表１－８）。分化後のｍｏＤＣ培養物に、ＤＡＭＰ、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣとともにＰＡＭＰを添加した。細胞を２日間刺激した後、細胞生存率およびＩＬ－１β分泌を測定した。
【表1-7-1】
【表1-7-2】
【0145】
表７および図５は、４つのアゴニスト：Ｒ８４８、ＴＬ８－５０６、Ｐａｍ２ＣＳＫ４およびＯＤＮ２３３６がＩＬ－１β分泌を可能にしたことを示す。これらのアゴニストは、細胞生存率にほとんどまたは全く影響を及ぼさなかった（表７）。表８は、低用量ＰＡＭＰ処理の結果を示す。
【表1-8-1】
【表1-8-2】
【表1-8-3】
【0146】
表１－７および図５に示すように、４つのアゴニスト（Ｒ８４８、ＴＬ８－５０６、Ｐａｍ２ＣＳＫ４、およびＯＤＮ２３３６）は、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣの存在下でヒトＤＣによるＩＬ－１β分泌を誘導した。これらのＰＲＲアゴニストは、細胞生存率にほとんどまたは全く影響を及ぼさなかった（表１－７）。試験した低アゴニスト濃度では、ＩＬ－１β分泌は、Ｒ８４８またはＰａｍ２ＣＳＫ４を２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣと組み合わせて使用した場合にのみ観察された（表１－８）。Ｒ８４８もＰａｍ２ＣＳＫ４も、試験したより低濃度では細胞生存率に影響を及ぼさなかった（表１－８）。臨床的に関連する自然免疫シグナル伝達経路アゴニストのこの小さなスクリーニングから、ほんの一握りが、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣと組み合わせた場合にヒトｍｏＤＣを過剰活性化することができることが見出された。ＩＬ－１β分泌に基づくと、Ｒ８４８は、ヒトＤＣの過剰活性化を促進する（例えば、ＩＬ－１βを分泌し、細胞生存率を維持する）アゴニストとして最も強力な臨床的に関連する候補である。
【0147】
実施例２：単一アシル鎖およびＴＬＲ７／８アゴニストを有するリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と哺乳動物末梢血単核細胞の過剰活性化の組合せ
この実施例は、小分子ＰＡＭＰと組み合わせた脂質ＤＡＭＰによるイヌおよびヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の過剰活性化について説明する。
この実施例は、小分子ＰＡＭＰと組み合わせた脂質ＤＡＭＰによるイヌおよびヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の過剰活性化について説明する。
【0148】
材料および方法
全血からのＰＢＭＣの単離。Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（Ｃｙｔｉｖｉａ）を用いた密度勾配遠心分離を使用して、全血からＰＢＭＣを単離した。全血をＰＢＳで１：１に希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳの上に重層し、室温で３０分間、１０００×ｇで遠心分離した。ＰＢＭＣを収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、Ａｃｋ溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ）とともにインキュベートして、残っている赤血球を除去した。
全血からのＰＢＭＣの単離。Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（Ｃｙｔｉｖｉａ）を用いた密度勾配遠心分離を使用して、全血からＰＢＭＣを単離した。全血をＰＢＳで１：１に希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳの上に重層し、室温で３０分間、１０００×ｇで遠心分離した。ＰＢＭＣを収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、Ａｃｋ溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ）とともにインキュベートして、残っている赤血球を除去した。
【0149】
細胞培養および刺激。単離直後に、１０％ＦＢＳ、５０単位／ｍＬペニシリン、５０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび５０ｍＭベータ－メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ培地（Ｒ１０培地）に、ＰＢＭＣをプレーティングした。細胞を、９６ウェル平底組織培養プレートに１ウェルあたり１×１０５（イヌ細胞）または１×１０６（ヒト細胞）でプレーティングした。凍結乾燥Ｖａｃｃｉｇｒａｄｅ Ｒ８４８（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を再構成し、製造業者の推奨に従って希釈し、１μｇ／ｍＬの最終濃度で細胞に添加した。直後に、２２：０ ＬＹＳＯ ＰＣを８２．５μＭの最終濃度で細胞に添加した。追加の自然アゴニストを製造業者の推奨に従ってＲ１０培地に希釈し、以下のように細胞に添加した：ヒトＧＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で添加した；２’３’ｃＧＡＭＰ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を１５μｇ／ｍＬの最終濃度で添加した；ＬＰＳ、血清型Ｏ５５：Ｂ５（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１μｇ／ｍＬの最終濃度で添加した；水酸化ミョウバン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を３０μｇ／ｍＬの最終濃度で添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２日間インキュベートした。次いで、細胞培養物をエンドポイント分析に使用した。
【0150】
エンドポイント分析。ＰＢＭＣをＰＡＭＰおよびＤＡＭＰとともに２日間培養した後、上清および細胞試料を分析のために収集した。培養中の細胞を４００ｘｇで５分間の遠心分離によってペレット化した。ウェル中の培地体積の半分を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはＬｕｍｉｔ（商標）生物発光アッセイによるサイトカイン定量のために収集し、残りの培地および細胞を使用して、代謝活性を評価することによって細胞生存率を定量した。
【0151】
サイトカイン分泌の定量。ヒトＰＢＭＣからのＩＬ－１β分泌を、以下のキット：ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１βキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１βキット、またはＬｕｍｉｔ（商標）Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１β Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のうちの１つを使用して評価した。ヒトＰＢＭＣからのＩＦＮγ分泌は、ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔ Ｈｕｍａｎ ＩＦＮγ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して評価し、ヒトＰＢＭＣからのＴＮＦα分泌は、Ｈｕｍａｎ ＴＮＦα Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して評価した。ＥＬＩＳＡを以下の修正を加えて製造業者の指示に従って実施した：ｉ）インキュベーションのための総試料＋緩衝液体積を１００μＬから５０μＬに減少させた；ｉｉ）上位の標準物質を５００ｐｇ／ｍＬに調製し、７．８ｐｇ／ｍＬに２倍希釈した；ｉｉｉ）試料のインキュベーションをオービタルシェーカーで４℃で一晩で完了させた。Ｌｕｍｉｔ（商標）アッセイを製造業者の指示に従って実施した。イヌＰＢＭＣからのＩＬ－１β分泌を、以下の修正を加えたイヌＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｆ２ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ）を製造業者の指示に従って使用して評価した：ｉ）インキュベーションのための総試料＋緩衝液体積を１００μＬから５０μＬに減少させた；ｉｉ）試料のインキュベーションをオービタルシェーカーで４℃で一晩で完了させた。全てのＥＬＩＳＡについて、吸光度は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５ｅプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、５７０ｎｍ補正で４５０ｎｍで測定した。Ｌｕｍｉｔ（商標）アッセイでは、発光は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５ｅプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、５００ｍｓの積分時間を使用してすべての波長で測定した。上清中のサイトカイン濃度を決定するために、試料濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）での４ＰＬ分析による標準曲線を使用して補間した。次に、試料の補間された結果を、上清に行ったあらゆる希釈について調整した。
【0152】
細胞生存率の定量。細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、代謝的に活性な細胞の指標としてＡＴＰの存在を定量することによって評価した。代謝活性は、製造業者の指示に従って評価した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を、細胞ペレットおよび新鮮な培地と混合し、次いで白色の不透明な９６ウェルプレートに移した。発光は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５ｅプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、５００ｍｓの積分時間を使用してすべての波長で測定した。生存率を、Ｒ８４８で処理したＰＢＭＣの対照条件と比較して計算した。
【0153】
統計解析。各条件について、各ドナー由来の細胞を試験のために３連でプレーティングした。サイトカイン定量のために、３連の値を補間に使用し、データをＲ８４８単独の対照条件と比較したドナーごとの総濃度（ｐｇ／ｍＬ）または倍数変化としてプロットした。生存率の定量のために、各ドナーの３連の値を平均し、平均値を１つのドナー測定値として使用した。複数のドナーが試験され、棒グラフの各データポイントはドナーの値を表す。試験条件の違いを試験するために、試験結果をＲ８４８単独の対照条件と比較した。Ｐ値は、ダネット検定を使用した多重比較の補正を伴う混合効果一元配置分散分析を使用して計算した。
【0154】
結果－２２：０ ＬＹＳＯ ＰＣおよびＲ８４８過剰活性化イヌＰＢＭＣによる処理
実施例１に記載されるように、２２：０ ＬＹＳＯ ＰＣ（ＤＡＭＰ）とＴＬＲ７／８アゴニストＲ８４８（ＰＡＭＰ）との組合せは、ヒトｍｏＤＣにおいて強力な過剰刺激活性を有することが見出された。この過剰刺激活性が他の臨床的に関連する種にもあてはまるかどうかを評価するために、２２：０ ＬＹＳＯ ＰＣ＋Ｒ８４８がイヌ全血から単離したＰＢＭＣを過剰活性化する能力を評価した。各データセットについて、本物の（ｂｏｎｅ ｆｉｄｅ）イヌｍｏＤＣを誘導するために利用可能なイヌ特異的試薬がないため、複数のドナー由来のＰＢＭＣをｍｏＤＣの代わりに使用した。簡単に記載すると、密度勾配遠心分離を使用して全血からＰＢＭＣを単離し、次に、目的の過剰活性化刺激とともに２日間培養した。
実施例１に記載されるように、２２：０ ＬＹＳＯ ＰＣ（ＤＡＭＰ）とＴＬＲ７／８アゴニストＲ８４８（ＰＡＭＰ）との組合せは、ヒトｍｏＤＣにおいて強力な過剰刺激活性を有することが見出された。この過剰刺激活性が他の臨床的に関連する種にもあてはまるかどうかを評価するために、２２：０ ＬＹＳＯ ＰＣ＋Ｒ８４８がイヌ全血から単離したＰＢＭＣを過剰活性化する能力を評価した。各データセットについて、本物の（ｂｏｎｅ ｆｉｄｅ）イヌｍｏＤＣを誘導するために利用可能なイヌ特異的試薬がないため、複数のドナー由来のＰＢＭＣをｍｏＤＣの代わりに使用した。簡単に記載すると、密度勾配遠心分離を使用して全血からＰＢＭＣを単離し、次に、目的の過剰活性化刺激とともに２日間培養した。
【0155】
培養２日後、細胞培養上清中のＩＬ－１βの定量および細胞生存率の測定によって、過剰活性化を評価した。２２：０ ＬＹＳＯ ＰＣおよびＲ８４８を一緒に用いて処理した場合、イヌＰＢＭＣは、試験した他のすべての刺激と比較して、ｍＬあたりの濃度、ならびにＲ８４８単独と比較したドナーあたりの倍数変化の両方で、同等またはより高いレベルのＩＬ－１βを分泌した（図６Ａ～６Ｂ）。ＰＢＭＣの５～１０％を構成する単球が、Ｒ８４８による活性化に応答してＩＬ－１βを放出することができることを示す以前の研究と一致して、イヌＰＢＭＣは、未処理細胞と比較して、Ｒ８４８単独でＩＬ－１β分泌のレベルが上昇した。ＬＰＳ＋ミョウバンのパイロトーシスの組合せは、予想通り高いレベルのＩＬ－１βを惹起した。特に、ＰＧＰＣ＋Ｒ８４８は、Ｒ８４８単独と比較して同様のレベルのＩＬ－１βを惹起したが、ＧＭ－ＣＳＦも２’３’ｃＧＡＭＰも未処理細胞と比較してイヌＰＢＭＣからの有意なＩＬ－１β分泌を誘導しなかった。
【0156】
ＩＬ－１βは、細胞培養上清中のイヌＰＢＭＣの過剰活性化の１日後に検出され得るが、ＩＬ－１β分泌後の長いこと未解決なままの生存率を確実にするために、過剰活性化の２日後に細胞生存率を評価した。２２：０ ＬＹＳＯ＋Ｒ８４８は、相対細胞生存率を有意に低下させなかった（図６Ｃ）。興味深いことに、Ｒ８４８と組み合わせたＰＧＰＣは、イヌＰＢＭＣに対していくらか毒性であることが証明されたが、ヒトｍｏＤＣ（実施例１）またはヒトＰＢＭＣ（図７Ｃ）に対して毒性であることは観察されなかった。まとめると、これらのデータは、２２：０ ＬＹＳＯ＋Ｒ８４８がイヌＰＢＭＣから高いレベルのＩＬ－１β分泌を惹起することを実証しており、これは過剰活性化を示している。
【0157】
結果－２２：０ ＬＹＳＯ ＰＣおよびＲ８４８過剰活性化ヒトＰＢＭＣによる処理
２２：０ ＬＹＳＯ ＰＣおよびＲ８４８が強力な過剰活性化の潜在性を有するものとして特定された最初のスクリーニングは、実施例１に記載されるようにヒトｍｏＤＣを用いて実施された。イヌＰＢＭＣおよびヒトｍｏＤＣを用いて行われた観察がヒトＰＢＭＣにおいて再現され得ることを確認するために、ヒトドナーから得られた全血から単離されたＰＢＭＣを用いて過剰活性化実験も行った。簡単に記載すると、複数のヒトドナーからの密度勾配遠心分離によってＰＢＭＣを全血から単離し、目的の過剰活性化刺激と共に２日間培養した。
２２：０ ＬＹＳＯ ＰＣおよびＲ８４８が強力な過剰活性化の潜在性を有するものとして特定された最初のスクリーニングは、実施例１に記載されるようにヒトｍｏＤＣを用いて実施された。イヌＰＢＭＣおよびヒトｍｏＤＣを用いて行われた観察がヒトＰＢＭＣにおいて再現され得ることを確認するために、ヒトドナーから得られた全血から単離されたＰＢＭＣを用いて過剰活性化実験も行った。簡単に記載すると、複数のヒトドナーからの密度勾配遠心分離によってＰＢＭＣを全血から単離し、目的の過剰活性化刺激と共に２日間培養した。
【0158】
ヒトＰＢＭＣは、ヒトｍｏＤＣおよびイヌＰＢＭＣと同様に、試験した全ての他の刺激よりも高いかまたは同等のレベルでＩＬ－１βを分泌した（図７Ａ～７Ｂ）。イヌＰＢＭＣと同様に、ヒトＰＢＭＣは、単球活性化により、Ｒ８４８単独に応答してＩＬ－１βを分泌し、これは２２：０ ＬＹＳＯ ＰＣの添加によって上昇した。ＬＰＳ＋ミョウバンのパイロトーシスの組合せは、予想通り高いレベルのＩＬ－１βを惹起した。イヌＰＢＭＣにおける観察結果と一致して、ＰＧＰＣ＋Ｒ８４８は、Ｒ８４８単独よりも実質的に高いレベルのＩＬ－１βを誘導しなかった。ＧＭ－ＣＳＦは、未処理細胞によって産生されるバックグラウンドレベルを大幅に上回るヒトＰＢＭＣからのＩＬ－１β分泌レベルを誘導しなかった。
【0159】
ＩＬ－１β分泌後のヒトＰＢＭＣの長いこと未解決なままの生存率を確実にするために、過剰活性化の２日後にヒトＰＢＭＣの生存率も評価した。いずれの刺激による処理の後も、ヒトＰＢＭＣ生存率の有意な低下は観察されなかった（図７Ｃ）。まとめると、これらのデータは、ヒトおよびイヌの両方のＰＢＭＣが２２：０ ＬＹＳＯ ＰＣ＋Ｒ８４８によって過剰活性化されることを実証している。興味深いことに、イヌＰＢＭＣは、ＰＧＰＣ＋Ｒ８４８よりも２２：０ ＬＹＳＯ ＰＣ＋Ｒ８４８によってより高度に過剰活性化される。
【0160】
活性化ヒトＰＢＭＣはＩＬ－１βに加えて他のサイトカインを分泌することができるので、細胞培養上清中の炎症促進性サイトカインＩＦＮγおよびＴＮＦαの分泌は、過剰活性化の２日後に測定した。２２：０ ＬＹＳＯ ＰＣ＋Ｒ８４８の組合せは、試験した全ての他の刺激と比較して、Ｒ８４８単独と比較して、ＩＦＮγ分泌およびＴＮＦα分泌の両方においてドナーあたりの最大倍数変化を誘導した（図８Ａ～８Ｂ）。特に、ＬＰＳ＋ミョウバンはヒトＰＢＭＣからの高いレベルのＩＬ－１β分泌を誘導したが（図７Ｂ）、この刺激の組合せはＩＦＮγまたはＴＮＦα分泌の倍数増加を誘導しなかった。さらに、ＧＭ－ＣＳＦも２’３’ｃＧＡＭＰも、Ｒ８４８単独よりもＩＦＮγ分泌の実質的な倍数変化を惹起しなかった。これらのデータは、２２：０ ＬＹＳＯ ＰＣ＋Ｒ８４８の組合せが、ヒトＰＢＭＣからの炎症促進性サイトカインＩＦＮγおよびＴＮＦαの分泌の誘導において優れていることを示している。
【0161】
実施例３：２２：０ ＬＹＳＯ ＰＣは非ヒト霊長類樹状細胞および末梢血単核細胞を過剰活性化する
この実施例は、小分子ＰＡＭＰ（Ｒ８４８）と組み合わせた脂質ＤＡＭＰによる非ヒト霊長類ｍｏＤＣおよび末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の過剰活性化について説明する。
この実施例は、小分子ＰＡＭＰ（Ｒ８４８）と組み合わせた脂質ＤＡＭＰによる非ヒト霊長類ｍｏＤＣおよび末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の過剰活性化について説明する。
【0162】
材料および方法
非ヒト霊長類ｍｏＤＣの分化および過剰活性化。アカゲザル由来の全血を等体積のＰＢＳで希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ溶液に重層した。細胞を、室温で１０００ｒｃｆで３０分間、中断せずに回転させた。バフィーコート層を収集し、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、計数した。ＰＢＭＣから単球を単離するために、ＭｉｌｔｅｎｙｉのヒトＣＤ１４マイクロビーズを製造業者の推奨に従って使用した。次いで、単離された単球を、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）および組換えヒトＩＬ－４（２５ｎｇ／ｍＬ）を使用して６日間にわたってｍｏＤＣに分化させた。細胞を、ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ－グルタミン、ピルビン酸ナトリウムおよびベータ－メルカプトエタノールからなるＲ１０培地中で成長させた。
非ヒト霊長類ｍｏＤＣの分化および過剰活性化。アカゲザル由来の全血を等体積のＰＢＳで希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ溶液に重層した。細胞を、室温で１０００ｒｃｆで３０分間、中断せずに回転させた。バフィーコート層を収集し、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、計数した。ＰＢＭＣから単球を単離するために、ＭｉｌｔｅｎｙｉのヒトＣＤ１４マイクロビーズを製造業者の推奨に従って使用した。次いで、単離された単球を、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）および組換えヒトＩＬ－４（２５ｎｇ／ｍＬ）を使用して６日間にわたってｍｏＤＣに分化させた。細胞を、ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ－グルタミン、ピルビン酸ナトリウムおよびベータ－メルカプトエタノールからなるＲ１０培地中で成長させた。
【0163】
分化したｍｏＤＣを収集し、計数し、９６ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルでプレーティングした。細胞を過剰活性化刺激ありまたはなしで処理した。過剰活性化培養物を２日間インキュベートした後、細胞生存率およびＩＬ－１ベータ分泌を評価した。Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏを製造業者の指示に従って使用して、細胞生存率の尺度としてＡＴＰを定量した。非ヒト霊長類ＩＬ－１ベータに特異的なＥＬＩＳＡキットをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、製造業者の指示に従ってアッセイを完了した。
【0164】
非ヒト霊長類ＰＢＭＣの過剰活性化。カニクイザル由来の全血を等体積のＰＢＳで希釈した。９０％Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳおよび１０％ＲＰＭＩの溶液を作製し、希釈した全血を、希釈Ｆｉｃｏｌｌの上に重層した。細胞を、室温で１０００ｒｃｆで３０分間、中断せずに遠心分離した。バフィーコート層を収集し、ＰＢＳで２回洗浄した。赤血球汚染が存在する場合、細胞をＡＣＫ溶解緩衝液中で２分間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄して溶解赤血球を除去した。
【0165】
単離したＰＢＭＣを１×１０６細胞／ウェルでプレーティングし、過剰活性化刺激ありまたはなしで培養した。２日間のインキュベーションの後、細胞を生存率について評価し、細胞培養上清を使用してサイトカイン産生量を測定した。Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＬｅｇｅｎｄＰｌｅｘキットなどの市販のキットを製造業者のプロトコルによって指示されるように使用して、目的のサイトカインを定量した。
【0166】
統計解析。アカゲザルｍｏＤＣを４匹の動物から作製した。各活性化条件は３連で試験され、報告されたデータ点は動物ドナー試料の３連の平均である。細胞数が限られているため、Ｒ８４８＋４１．３ｕＭ ＰＧＰＣを使用した過剰活性化は、２つの試料のみで試験されたことに留意されたい。データは、通常の一元配置分散分析を使用して統計学的有意性について試験された。
【0167】
ＰＢＭＣを１３匹のカニクイザルから得た。各活性化条件は３連で試験され、動物試料の３連の平均値がグラフ化されている。反復測定一元配置分散分析を使用して統計的有意性を試験し、続いてダネットの多重比較試験を行った。
【0168】
結果
過剰活性化が自然免疫系の重要な生物学的機能である場合、それが複数の種にわたって進化的に保存されていることが分かると予想される。さらに，治療薬としての２２：０ ＬＰＣのさらなる開発には，関連する疾患動物モデルでの試験が必要になる可能性があるであろう。本発明者らは、非ヒト霊長類などの近縁種も２２：０ ＬＰＣ媒介性の過剰活性化に応答すると仮定した。
過剰活性化が自然免疫系の重要な生物学的機能である場合、それが複数の種にわたって進化的に保存されていることが分かると予想される。さらに，治療薬としての２２：０ ＬＰＣのさらなる開発には，関連する疾患動物モデルでの試験が必要になる可能性があるであろう。本発明者らは、非ヒト霊長類などの近縁種も２２：０ ＬＰＣ媒介性の過剰活性化に応答すると仮定した。
【0169】
本発明者らの仮説を試験するために、本発明者らはアカゲザル全血から単球を単離した。ヒト細胞と同じ分化プロトコルを使用して、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４を使用して単球をｍｏＤＣに分化させた。細胞をプレーティングし、Ｒ８４８を含めてまたは含めずに、および過剰活性化脂質を含めてまたは含めずに刺激した。２日間のインキュベーションの後、ＩＬ－１ベータが細胞培養上清中に検出された。興味深いことに、２２：０ ＬＰＣは、８２．５ｕＭおよび４１．３ｕＭで検出可能なＩＬ－１ベータを誘導したが、ＩＬ－１ベータは、ＰＧＰＣを使用して８２．５ｕＭでのみ検出可能であった（図９Ｂ）。これらの結果は、ヒトｍｏＤＣを使用して生成されたデータと一致し、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣがＰＧＰＣよりも強力であることを実証している。さらに、細胞は、試験した条件にわたって生存し続けた（図９Ａ）。
【0170】
ヒトおよびイヌのＰＢＭＣを使用した研究は、集団内の細胞が過剰活性化に応答することを実証した。非ヒト霊長類のｍｏＤＣは過剰活性化される可能性があるため、本発明者らは、ＮＨＰ由来ＰＢＭＣも過剰活性化され得るかどうかを試験しようとした。カニクイザル由来の全血を処理してＰＢＭＣを単離した。細胞を１×１０６細胞／ウェルでプレーティングし、８２．５および４１．３μＭの濃度の２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣまたはＰＧＰＣで過剰活性化した。過剰活性化の陰性対照として、ＰＢＭＣを未処理のままにするか、または１μｇ／ｍＬのＲ８４８でのみ刺激した。細胞生存率は、全ての試験条件で維持された。イヌおよびヒトのＰＢＭＣと同様に、Ｒ８４８刺激はＩＬ－１ベータ分泌を誘導した。過剰活性化を誘導するために８２．５ｕＭの２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣまたはＰＧＰＣのいずれかを添加すると、ＩＬ－１ベータ産生が増加した（図１０Ａ）。この効果は、Ｒ８４８刺激単独と比較して、過剰活性化状態のＩＬ－１ベータ出力の倍数変化を定量した場合に特に明白であった（図１０Ｂ）。
【0171】
ヒトＰＢＭＣと同様に、カニクイザルＰＢＭＣも、８２．５ｕＭ ２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣまたはＰＧＰＣで２日間過剰活性化すると、ＩＦＮ－ガンマ産生が有意に増加した。これらの観察を拡張し、過剰活性化によって増加する可能性がある他のサイトカインを同定するために、多重ビーズに基づくアッセイを使用して炎症性サイトカインを定量した。ＢｉｏｌｅｇｅｎｄのＬｅｇｅｎｄＰｌｅｘキットはＥＬＩＳＡと同様に機能するが、一次抗体はプレート表面ではなくビーズに結合している。異なるビーズ集団により、１つの反応内で複数のサイトカインを同時に定量することが可能になる。ビーズアッセイを使用して、複数のサイトカインが過剰活性化と共に増加することを特定した。ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－１７ａ、ＩＬ－２３、ＩＦＮ－ベータおよびＩＬ－８は、Ｒ８４８単独による処理と比較して、８２．５ｕＭ ２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣまたはＰＧＰＣを用いてＰＢＭＣを過剰活性化した場合に増加した（図１１Ａ～１５Ａ）。これらの増加は、過剰活性化とＲ８４８活性化とを比較するために各動物試料について倍数変化を計算した場合に特に明白であった（図１１Ｂ～１５Ｂ）。サイトカインレベルの増加は、使用した脂質の量に依存していた。４１．３ｕＭで２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣまたはＰＧＰＣを使用した場合、倍数変化はそれほど顕著に増加せず、この濃度では、サイトカイン分泌の増加は必ずしも統計学的に有意ではなかった。興味深いことに、すべてのサイトカインが過剰活性化の影響を受けたわけではなかった。例えば、ＩＬ－６分泌は、過剰活性化脂質の添加で比較的変化しないままであった（図１６Ａ）。倍数変化としてグラフ化されたデータは、過剰活性化依存性サイトカインで観察された傾向とは非常に異なっているように見える（図１６Ｂ）。
【0172】
まとめると、これらのデータは、２２：０のＬｙｓｏ ＰＣがアカゲザルとカニクイザルの両方において過剰活性化脂質であることを示している。さらに、非ヒト霊長類細胞は、他の種で観察されたものと同様に、過剰活性化され得る。これらのデータは、ＩＦＮ－ガンマおよびＩＬ－１７ａなどのサイトカインが、食細胞によって産生される可能性が低く、この食細胞は、使用する過剰活性化刺激に対する主な反応細胞であると本発明者らが考えるものであるため、特に興味深い。これが本当であれば、過剰活性化細胞は、ＩＦＮ－ガンマおよびＩＬ－１７ａを発現することができるＴ細胞などの隣接細胞に対する二次的な影響を誘導している可能性がある。
【0173】
実施例４：過剰活性化樹状細胞は強力なＣＤ４＋Ｔｈ１細胞応答を刺激する
この実施例は、ヒトメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞に対する過剰活性化ヒトｍｏＤＣの効果について説明する。
この実施例は、ヒトメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞に対する過剰活性化ヒトｍｏＤＣの効果について説明する。
【0174】
材料および方法
ヒトｍｏＤＣとメモリーＣＤ４Ｔ細胞の共培養。ヒト単球は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＳｔｒａｉｇｈｔＦｒｏｍ ＬｅｕｋｏＰａｋ ＣＤ１４マイクロビーズを製造業者の指示に従って使用して、白血球除去産物から単離した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ製のカスタムＰＢＭＣ単離マイクロビーズキットを使用して、同じ血液産物から赤血球を、顆粒球からＰＢＭＣを分離した。ＰＢＭＣ精製後、ＭｉｌｔｅｎｙｉヒトメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットを使用してＣＤ４５ＲＯ＋画分を負に選択した。実験で使用する準備ができるまで、細胞を冷凍保存した。
ヒトｍｏＤＣとメモリーＣＤ４Ｔ細胞の共培養。ヒト単球は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＳｔｒａｉｇｈｔＦｒｏｍ ＬｅｕｋｏＰａｋ ＣＤ１４マイクロビーズを製造業者の指示に従って使用して、白血球除去産物から単離した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ製のカスタムＰＢＭＣ単離マイクロビーズキットを使用して、同じ血液産物から赤血球を、顆粒球からＰＢＭＣを分離した。ＰＢＭＣ精製後、ＭｉｌｔｅｎｙｉヒトメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットを使用してＣＤ４５ＲＯ＋画分を負に選択した。実験で使用する準備ができるまで、細胞を冷凍保存した。
【0175】
ヒト単球を、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４を前述のように６日間使用して、樹状細胞に分化させた。過剰活性化のために、ｍｏＤＣをＲ１０培地中で５Ｅ４細胞／ウェルで９６ウェルＵ底マイクロプレートにプレーティングした。Ｒ８４８および脂質を細胞培養物に添加し、過剰活性化を一晩インキュベートした。Ｔ細胞刺激抗ＣＤ３抗体を、Ｔ細胞を添加する前に培養物に添加した（抗ＩＬ－１ベータ抗体は遮断してもしなくてもよい）。自己凍結メモリーＣＤ４ Ｔ細胞を解凍し、Ｒ１０培地に再懸濁し、２．５×１０５細胞／ウェルで添加した（比率は１：５、ＤＣ：Ｔ細胞）。２日間のインキュベーションの後、細胞培養上清を収集し、サイトカイン分泌を測定するために使用した。Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＬｅｇｅｎｄＰｌｅｘキットなどの市販のキットを製造業者のプロトコルによって指示されるように使用して、目的のサイトカインを定量した。
【0176】
４人のドナーを試験し、各実験条件を３連で試験した。各データポイントは、ドナー３連の平均値を表す。データを、二元配置分散分析、続いてテューキーの多重比較検定を用いて統計学的有意性について試験した。
【0177】
混合リンパ球反応。ヒト単球は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＳｔｒａｉｇｈｔＦｒｏｍ ＬｅｕｋｏＰａｋ ＣＤ１４マイクロビーズを製造業者の指示に従って使用して、白血球除去産物から単離した。ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を単離するために、全血を等体積のＰＢＳで希釈した。希釈した血液を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ溶液の上に重層し、室温で２０分間、１０００ｒｃｆで中断せずに回転させた。バフィーコート層を収集し、洗浄し、計数した。ＭｉｌｔｅｎｙｉヒトナイーブＣＤ４ Ｔ細胞マイクロビーズ単離キットを使用して、製造業者の指示に従ってＰＢＭＣから目的の細胞を単離した。回収した細胞を９０％ＦＢＳおよび１０％ＤＭＳＯ中で凍結保存した。
【0178】
単球はｍｏＤＣに分化した。ｍｏＤＣを計数し、Ｕ底プレートに２×１０４細胞／ウェルでプレーティングし、過剰活性化刺激または対照条件で処理した。培養の１日後、異なる（同種）ヒトドナー由来の１×１０５細胞／ウェルのナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を解凍し、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む培養物に添加した。細胞を５日間共培養し、共培養の３日目にＩＬ－２を与えた。５日後、細胞を、ＢＤ ＧｏｌｇｉＰｌｕｇを含む白血球活性化カクテル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して４時間再活性化した。細胞を染色して、フローサイトメトリーによって得られた活性化Ｔ細胞の極性形成を決定した。細胞内染色標的は、細胞内染色工程の前に細胞を固定および透過処理するためにＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｕｆｆｅｒセットの使用を必要とした。
【0179】
１０のｍｏＤＣドナー試料をＭＬＲアッセイで試験した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して染色結果を分析し、一貫したゲーティング戦略をすべての試料に適用した。活性化細胞の頻度を、各試料中のＣＤ４ Ｔ細胞のパーセンテージとしてグラフ化した。対応のあるｔ検定を使用して、統計学的有意性を決定した。
【0180】
結果－過剰活性樹状細胞はＴｈ１メモリーＣＤ４ Ｔ細胞を強力に再活性化する
過剰活性樹状細胞の１つの重要な特徴は、それらが生存可能なまま成熟ＩＬ－１ベータを分泌することである。対照的に、非過剰活性細胞は、ＩＬ－１ｂを分泌するとパイロトーシスを受ける。継続的に細胞が生存することにより、樹状細胞がＴ細胞などの他の細胞と相互作用する機会を得ることができるため、これらの２つの特徴は特に興味深い。これらの細胞間相互作用は、ＤＣが抗原を提示し、共刺激シグナルおよび炎症シグナルをＴ細胞に提供する機会をもたらす。他の例で上述したように、ＰＢＭＣの過剰活性化は、他の細胞型を潜在的に活性化し得る。興味深いことに、プレート結合抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８アゴニスト抗体を使用するなどの非細胞ベースの方法と比較して、ＤＣはメモリーＣＤ４ Ｔ細胞をより強力に再活性化することが報告されている（Ｊａｉｎら、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，９（１）：３１８５，２０１８）。発表された研究におけるＴ細胞再活性化の増強の機構は、ＤＣからＴ細胞へのＩＬ－１ベータシグナル伝達に依存していた。しかし、Ｔ細胞応答に対する異なるＤＣ活性化状態の影響は調査されなかった。過剰活性化ＤＣがＩＬ－１ベータを強力に産生し、それらの生存能力が継続的な細胞間相互作用を可能にすることを考え、本発明者らは、過剰活性化がメモリーＣＤ４ Ｔ細胞を再活性化する樹状細胞の最も強力な細胞状態であると仮定した。
過剰活性樹状細胞の１つの重要な特徴は、それらが生存可能なまま成熟ＩＬ－１ベータを分泌することである。対照的に、非過剰活性細胞は、ＩＬ－１ｂを分泌するとパイロトーシスを受ける。継続的に細胞が生存することにより、樹状細胞がＴ細胞などの他の細胞と相互作用する機会を得ることができるため、これらの２つの特徴は特に興味深い。これらの細胞間相互作用は、ＤＣが抗原を提示し、共刺激シグナルおよび炎症シグナルをＴ細胞に提供する機会をもたらす。他の例で上述したように、ＰＢＭＣの過剰活性化は、他の細胞型を潜在的に活性化し得る。興味深いことに、プレート結合抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８アゴニスト抗体を使用するなどの非細胞ベースの方法と比較して、ＤＣはメモリーＣＤ４ Ｔ細胞をより強力に再活性化することが報告されている（Ｊａｉｎら、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，９（１）：３１８５，２０１８）。発表された研究におけるＴ細胞再活性化の増強の機構は、ＤＣからＴ細胞へのＩＬ－１ベータシグナル伝達に依存していた。しかし、Ｔ細胞応答に対する異なるＤＣ活性化状態の影響は調査されなかった。過剰活性化ＤＣがＩＬ－１ベータを強力に産生し、それらの生存能力が継続的な細胞間相互作用を可能にすることを考え、本発明者らは、過剰活性化がメモリーＣＤ４ Ｔ細胞を再活性化する樹状細胞の最も強力な細胞状態であると仮定した。
【0181】
本発明者らの仮説を試験するために、ヒト単球をｍｏＤＣに分化させた。ｍｏＤＣは、刺激せずに放置するか、またはＲ８４８で活性化するか、またはＲ８４８および２２：０ ＬＰＣで過剰活性化するか、または非過剰活性化脂質（Ｒ８４８および１０：０ ＬＰＣ）で偽処理した。１日のインキュベーションの後、自己Ｔ細胞を培養物に添加した。ペプチド－ＭＨＣ認識をシミュレートするために、ＴＣＲ刺激抗ＣＤ３抗体を極めて限定的な濃度（Ｊａｉｎら、上掲、２０１８で使用されたものより３００倍低く、非常に希薄な濃度であることが既に指摘されている）で添加した。Ｔ細胞応答がＩＬ－１ｂによって媒介されるかどうかを試験するために、ＩＬ－１ベータシグナル伝達を阻害するために抗ＩＬ－１ベータ遮断抗体を培養物に添加するさらなる実験条件を設定した。追加の対照として、測定されたサイトカイン応答がｍｏＤＣから直接来たものではないことを確実にするために、一部のｍｏＤＣ刺激物にはＴ細胞を添加しなかった。刺激物は、空のウェルにもプレーティングされ、その後にＴ細胞を加えて、刺激物がｍｏＤＣを必要とせずにＴ細胞に直接影響を及ぼさないことを確かめた。
【0182】
Ｔ細胞応答サイトカインを、Ｔ細胞の添加の２日後に培養上清から測定した。ＩＦＮ－ガンマは、ｍｏＤＣまたはＴ細胞を単独で培養した場合には最小限にしか検出されなかった。共培養すると、ＩＦＮ－ガンマが産生され、Ｔ細胞からのＴｈ１応答を示した。抗ＣＤ３抗体によるＴＣＲ刺激が限られているとすると、Ｒ８４８処理ｍｏＤＣは、非刺激ｍｏＤＣと比較して有意に強いＴｈ１応答を生成しなかった。しかし、Ｒ８４８を過剰活性化脂質２２：０ ＬＰＣと組み合わせると、有意により強いＴｈ１応答が生じた（図１７）。１０：０ ＬＰＣなどの非過剰活性化脂質を使用すると、これらのＩＦＮ－ガンマレベルの上昇は検出されなかった。さらに、抗ＩＬ－１ベータを共培養物に添加すると、過剰活性化共培養物はＩＦＮ－ガンマ産生が有意に減少し、Ｔｈ１応答の増強がＩＬ－１ベータシグナル伝達に依存することが示唆された。
【0183】
対照的に、Ｔｈ２サイトカインＩＬ－４およびＩＬ－１３は、ｍｏＤＣ過剰活性化によって増強されなかった。様々な刺激物で処理したｍｏＤＣは、共培養したＴ細胞から同様のＩＬ－４およびＩＬ－１３応答をもたらしたが、統計学的に有意ではなかった（図１８Ａ～１８Ｂ）。Ｔｈ１７サイトカインＩＬ－１７ａ、ＩＬ－１７ｆおよびＩＬ－２２も測定した。Ｔｈ１７サイトカインは、ＩＦＮ－ガンマで観察されたものと同様の傾向をたどった（図１９Ａ～図１９Ｃ）。過剰活性化ｍｏＤＣはＴｈ１７サイトカイン産生の統計学的に有意な増加を誘導したが、非過剰活性化ｍｏＤＣは誘導しなかった。抗ＩＬ－１ベータ抗体はサイトカインレベルを有意に低下させたため、Ｔｈ１７サイトカイン産生の増強はＩＬ－１ベータシグナル伝達に依存していた。これらの結果は、過剰活性化されたｍｏＤＣがＴｈ１およびＴｈ１７応答を優先的に増強する一方で、Ｔｈ２応答は影響を受けないままであることを示唆した。抗腫瘍応答の文脈では、過剰活性化ＤＣは、抗原提示中に適切な状況でＩＬ－１ベータを提供することができるので、腫瘍応答性メモリーＣＤ４ Ｔ細胞を再活性化するのにより適していると考えられる。本発明者らの実験系で使用した抗ＣＤ３刺激が低いことを考えると、過剰活性ＤＣは、がんに見られるようなペプチド－ＭＨＣとのＴＣＲ相互作用が弱いにもかかわらず、再活性化を刺激する能力に優れていると考えられる。
【0184】
結果－過剰活性ｍｏＤＣはナイーブＣＤ４ Ｔ細胞をＴｈ１応答に偏向させる
過剰活性化は、Ｔｈ１およびＴｈ１７メモリーＣＤ４ Ｔ細胞応答を再活性化するｍｏＤＣの能力を改善する。いくつかの疾患状況では、ＣＤ４ Ｔ細胞は以前に活性化されていない可能性があり、したがってナイーブであり得る。ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞に対する過剰活性化ｍｏＤＣの効果を調べるために、広く使用されている免疫学的アッセイである、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を用いた。ｍｏＤＣを、Ｒ８４８で活性化するか、またはＲ８４８および２２：０ ＬＰＣで過剰活性化した。１日のインキュベーションの後、同種ドナー由来のナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を培養物に添加した。ＴＣＲとペプチド－ＭＨＣとの間のミスマッチは、一部のＴ細胞にＴＣＲ刺激を与える。ＩＬ－２を添加して、基底Ｔ細胞成長シグナルを提供する。細胞を５日間共培養した後、染色およびフローサイトメトリー分析を行った。フローサイトメトリーが選択されたのは、この技術が単一細胞レベルで特異性をもつデータを収集するためである。ＣＤ４ Ｔ細胞の分極を決定するために、活性化細胞をエフェクターサイトカインおよび関連する分極転写因子について染色した。
過剰活性化は、Ｔｈ１およびＴｈ１７メモリーＣＤ４ Ｔ細胞応答を再活性化するｍｏＤＣの能力を改善する。いくつかの疾患状況では、ＣＤ４ Ｔ細胞は以前に活性化されていない可能性があり、したがってナイーブであり得る。ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞に対する過剰活性化ｍｏＤＣの効果を調べるために、広く使用されている免疫学的アッセイである、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を用いた。ｍｏＤＣを、Ｒ８４８で活性化するか、またはＲ８４８および２２：０ ＬＰＣで過剰活性化した。１日のインキュベーションの後、同種ドナー由来のナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を培養物に添加した。ＴＣＲとペプチド－ＭＨＣとの間のミスマッチは、一部のＴ細胞にＴＣＲ刺激を与える。ＩＬ－２を添加して、基底Ｔ細胞成長シグナルを提供する。細胞を５日間共培養した後、染色およびフローサイトメトリー分析を行った。フローサイトメトリーが選択されたのは、この技術が単一細胞レベルで特異性をもつデータを収集するためである。ＣＤ４ Ｔ細胞の分極を決定するために、活性化細胞をエフェクターサイトカインおよび関連する分極転写因子について染色した。
【0185】
Ｔｈ１分極を分析するために、細胞を転写因子ＴｂｅｔならびにサイトカインＩＦＮ－ガンマおよびＴＮＦ－アルファについて染色した。Ｒ８４８活性化と比較して、２２：０ ＬＰＣを用いた過剰活性化はＴｈ１細胞の頻度を増加させた（図２０）。さらに、多機能性Ｔｈ１分極細胞（ＩＦＮ－ガンマおよびＴＮＦ－アルファのそれらの二重発現によって示される通り）は、過剰活性化ｍｏＤＣ（図２０）と共に培養した場合に頻度が増加した。Ｔｈ２分極をＧａｔａ３およびＩＬ－４について染色することによって研究した。Ｔｈ１応答と比較して、最小のＴｈ２分極が生じた（図２０）。興味深いことに、細胞は、ＲＯＲｇおよびＩＬ－１７についても染色されたが、これらの細胞は検出されなかった。ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞からのＴｈ１７細胞分化の欠如は、メモリーＣＤ４ Ｔ細胞をｍｏＤＣと共培養した場合に観察された結果と対照的である。まとめると、これらの研究の結果は、２２：０ ＬＰＣを使用した過剰活性化が、活性化の際にＴｈ１応答へのナイーブＣＤ４ Ｔ細胞の分極を増強することを示している。
【0186】
実施例５：２２：０ ＬＹＳＯ ＰＣのミセルへの配合
この実施例は、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣの界面活性剤含有製剤の調製および試験について説明する。
この実施例は、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣの界面活性剤含有製剤の調製および試験について説明する。
【0187】
材料および方法
ポロキサマーを用いた２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣの製剤化。以下の界面活性剤を１％、２％、または５．５％で水に溶解した：ポロキサマー４０７（ＫＰ４０７）、ポロキサマー１８８（ＫＰ１８８）、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（Ｋ ＥＬ）、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＲＨ４０（Ｋ ＲＨ）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ８４（Ｐ－８４）およびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１２３（Ｐ－１２３）。２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣを界面活性剤溶液に再懸濁し、４℃で１時間撹拌した。次いで、溶液を室温にしてミセルを形成した。１０倍濃縮ＰＢＳを使用して、塩を溶液に添加して分子相互作用を安定化させ、生理学的に適切な容量オスモル濃度を得た。脂質溶液は、濾過せずに放置するか、または０．４５ｕｍの孔径で濾過して不溶性の脂質フレークを除去した。脂質をさらに希釈し、１ｕｇ／ｍＬのＲ８４８とともにヒトｍｏＤＣ細胞培養物に添加した。目標脂質濃度は、脂質が濾過前に完全に生物学的に利用可能であるというシナリオに基づいている。しかし、不溶性脂質の濾過は、生物学的に利用可能な脂質の供給を減少させる。したがって、過剰活性の尺度としてのＩＬ－１ベータは、ミセルへの、したがって溶液への２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ取り込みの指標として使用することができる。過剰活性化の１日後、細胞培養上清を収集してサイトカイン分泌を測定し、細胞を使用してＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏによる生存率を測定する。
ポロキサマーを用いた２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣの製剤化。以下の界面活性剤を１％、２％、または５．５％で水に溶解した：ポロキサマー４０７（ＫＰ４０７）、ポロキサマー１８８（ＫＰ１８８）、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（Ｋ ＥＬ）、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＲＨ４０（Ｋ ＲＨ）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ８４（Ｐ－８４）およびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１２３（Ｐ－１２３）。２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣを界面活性剤溶液に再懸濁し、４℃で１時間撹拌した。次いで、溶液を室温にしてミセルを形成した。１０倍濃縮ＰＢＳを使用して、塩を溶液に添加して分子相互作用を安定化させ、生理学的に適切な容量オスモル濃度を得た。脂質溶液は、濾過せずに放置するか、または０．４５ｕｍの孔径で濾過して不溶性の脂質フレークを除去した。脂質をさらに希釈し、１ｕｇ／ｍＬのＲ８４８とともにヒトｍｏＤＣ細胞培養物に添加した。目標脂質濃度は、脂質が濾過前に完全に生物学的に利用可能であるというシナリオに基づいている。しかし、不溶性脂質の濾過は、生物学的に利用可能な脂質の供給を減少させる。したがって、過剰活性の尺度としてのＩＬ－１ベータは、ミセルへの、したがって溶液への２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ取り込みの指標として使用することができる。過剰活性化の１日後、細胞培養上清を収集してサイトカイン分泌を測定し、細胞を使用してＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏによる生存率を測定する。
【0188】
溶媒蒸発法は、ＫＰ４０７と混合する前にメタノールまたはエタノールを利用して、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣを完全に溶解する。溶解した脂質溶液を室温で９０分間撹拌しながら５．５％ＫＰ４０７と混合してアルコール溶媒を蒸発させ、ポロキサマーおよび脂質で粒子形成を誘導する。塩を溶液に添加して分子相互作用を安定化し、溶液を生理学的に適切な容量オスモル濃度にする。次いで、溶液を濾過せずに放置するか、または０．４５ｕｍの孔径で濾過して不溶性脂質フレークまたは粒子凝集体を除去する。次いで、脂質を１ｕｇ／ｍＬのＲ８４８とともにヒトｍｏＤＣ培養物に添加する。過剰活性化の１日後、細胞培養上清を収集してサイトカイン分泌を測定し、細胞を使用して細胞生存率を測定した。
【0189】
粒子サイズは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって定量した。粒子サイズは、ＫＰ４０７への再懸濁または溶媒蒸発粒子合成を使用して作製されたミセルの０．４５ｕｍ濾過後の溶液中の粒子について評価された。
【0190】
ポロキサマー製剤におけるこれらの研究からのデータは、１つのヒトｍｏＤＣドナー試料から示されている。個々のデータポイントは、三連の平均を表す。
【0191】
結果－２２：０ ＬＹＳＯ ＰＣのミセルへの組み込み
２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣは、水溶液にほとんど不溶性の脂質である。細胞培養物に２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣを添加する本発明者らの最初の方法は、培養培地に脂質を単に再懸濁することであった。しかし、脂質材料は、溶液中でフレークとしてはっきりと視認可能であった。一貫した用量を投与するためには、脂質を可溶化させることが理想的であろう。これは、動物研究において、またヒト使用のための開発された治療としても最も重要であろう。過剰活性化分子が脂質であることを考えて、本発明者らは、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣがミセルに組み込まれる可能性があると仮定した。
２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣは、水溶液にほとんど不溶性の脂質である。細胞培養物に２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣを添加する本発明者らの最初の方法は、培養培地に脂質を単に再懸濁することであった。しかし、脂質材料は、溶液中でフレークとしてはっきりと視認可能であった。一貫した用量を投与するためには、脂質を可溶化させることが理想的であろう。これは、動物研究において、またヒト使用のための開発された治療としても最も重要であろう。過剰活性化分子が脂質であることを考えて、本発明者らは、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣがミセルに組み込まれる可能性があると仮定した。
【0192】
本発明者らの仮定を試験するために、本発明者らは、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣのミセル化を助けることができる界面活性剤のセットをスクリーニングした。凍結乾燥脂質を、１または２％の界面活性剤を含有する水溶液と混合した。混合中に溶液を冷蔵して、界面活性剤をモノマー化し、脂質と相互作用させた。次いで、溶液を室温に加温してミセル化させた。１０倍濃縮ＰＢＳを使用して、塩を溶液に添加して分子相互作用を安定化させ、溶液を生理学的に適切な容量オスモル濃度にした。次いで、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣミセルを濾過せずに放置するか、または０．４５ｕｍフィルターに通して不溶性脂質を除去した。次いで、これらの脂質ストックをさらに希釈し、ヒトｍｏＤＣ培養物に添加して細胞を過剰活性化した。Ｋ ＥＬ、Ｋ ＲＨおよびＰ－８４などのいくつかの界面活性剤は、細胞生存率の低下を引き起こし、使用には理想的ではなかった（図２１）。比較すると、ＫＰ４０７、ＫＰ１８８、およびＰ－１２３は、細胞生存率を損なわなかった。次いで、本発明者らは、細胞生存率が維持されたこれらの様々な刺激条件からＩＬ－１ベータ分泌を定量した。脂質を濾過せずに放置すると、２２：０のＬｙｓｏ ＰＣをＰＢＳに再懸濁して細胞に添加する本発明者らの標準的な方法と同様に、高いＩＬ－１ベータ分泌が観察された（図２２）。脂質の濾過は、ｍｏＤＣによって分泌されたＩＬ－１ベータを有意に減少させ、不溶性脂質も過剰活性化に寄与することを示唆した（図２２）。２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣをＫＰ４０７またはＰ－１２３と共に製剤化して濾過すると、ＰＢＳ中の濾過２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣと比較して、ＩＬ－１ベータ分泌が改善された（図２２）。これらのデータは、ミセルとして可溶化された２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣがＤＣ過剰活性化を誘導する能力を維持し、溶解度の改善がＤＣ過剰活性化を増加させることを実証している。この最初の研究は、ポロキサマーおよびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）を使用して脂質をミセルに組み込むことによって、２２：０のＬｙｓｏ ＰＣの一貫した溶液を達成できることを実証した。
【0193】
さらなる研究および最適化のために、ＫＰ４０７をポロキサマーとして選択した。２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣは水溶液にほとんど不溶性であるため、本発明者らは、完全に可溶化された脂質はＫＰ４０７とより容易に会合すると仮定した。２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣはエタノールまたはメタノールに可溶性であり、これらのアルコールは両方とも水と混和性である。２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣの粒子への組み込みを最適化するために、脂質を最初にメタノールまたはエタノールに溶解した。溶解した脂質溶液を撹拌しながら５．５％ＫＰ４０７と混合し、室温で９０分間１５０ｒｐｍで撹拌してアルコール溶媒を蒸発させ、ポロキサマーおよび脂質で粒子形成を誘導した。蒸発後に水を添加して、ＫＰ４０７濃度を５．５％に戻した。１０倍濃縮ＰＢＳを使用して、粒子形成を安定化させ、生理学的に適切な容量オスモル濃度に達するように塩を添加し、ＰＢＳ中のＫＰ４０７の最終濃度を５％にした。０．４５ｕｍの孔径で濾過した後、脂質溶液を希釈し、８２．５ｕＭの理論目標濃度で細胞を過剰活性化するために使用した。ＫＰ４０７ミセルに組み込まれていない２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣは、材料の大部分が濾別されたため、最小量のＩＬ－１ベータを誘導した（図２３Ａ）。しかし、ＫＰ４０７を混合すると、ＩＬ－１ベータ分泌が増加した（図２３Ａ）。最初に脂質を可溶化するためにメタノールまたはエタノールを使用すると、ＩＬ－１ベータ分泌はさらに増加し、この溶媒蒸発戦略を使用してより多くの脂質が粒子に組み込まれたことが示唆された。細胞の大部分はそれぞれの条件で生存可能なままであったが、溶媒蒸発法では細胞生存率は約２５％低下した（図２３Ｂ）。興味深いことに、ビヒクル溶媒蒸発法を使用して処理した試料の生存率は、それほど低下しなかった。このことは、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣのバイオアベイラビリティを増加させることにより、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣをより低用量で使用できることを示唆している。
【0194】
粒子サイズを特徴付けるために、動的光散乱が用いられた。ＰＢＳ中の２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣおよび５％ ＫＰ４０７中の２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣで行われた読み取りは、粒子サイズが一貫していないため、試料の読み取りに大きなばらつきがあり、低品質のサイジングデータをもたらした。対照的に、溶媒蒸発を使用して生成された粒子は一貫して直径が約１５００ｎｍであった（図２４）が、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣを欠くミセルの調製物はこのサイズの粒子がなかった。したがって、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣとＫＰ４０７との間の相互作用により、直径約１５００ｎｍの安定な粒子の形成が可能になった。これらの粒子は固体ではなく、測定された粒子サイズを考慮すると、変形する可能性があり、より小さいフィルター孔を通過することが可能となる。
【0195】
実施例６：インビトロおよびインビボでのマウス樹状細胞の過剰活性化
この実施例は、インビトロおよびインビボのマウス腫瘍モデルにおけるマウス細胞に対する２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣおよび／またはＲ８４８のＫＰ４０７含有製剤の試験について説明する。
この実施例は、インビトロおよびインビボのマウス腫瘍モデルにおけるマウス細胞に対する２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣおよび／またはＲ８４８のＫＰ４０７含有製剤の試験について説明する。
【0196】
材料および方法
マウスＦＬＴ３Ｌ分化骨髄由来ＤＣ（ＢＭＤＣ）の生成。脚大腿骨および脛骨をマウスから取り出し、ハサミで切断し、滅菌チューブに流した。骨髄懸濁液をＡＣＫで１分間処理した後、４０ｕｍのセルストレーナーに通した。細胞を計数し、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシン、ならびにＬ－グルタミンおよびピルビン酸ナトリウム（Ｉ１０）のサプリメントを含有する完全ＩＭＤＭからなる培地に再懸濁した。次いで、細胞をウェルあたり５Ｅ６骨髄細胞でＰ１２プレートにプレーティングした。組換えマウスＦＬＴ３Ｌ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を２００ｎｇ／ｍＬで培養物に添加した。分化した細胞を９日目のその後のアッセイに使用した。分化の効率は、ＢＤ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ａ３を使用するフローサイトメトリーによってモニターされ、ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋細胞は、生細胞の８０％を常に上回っていた。各実験について、５匹のマウスを使用してＢＭを収集し、ＤＣを作製した。
マウスＦＬＴ３Ｌ分化骨髄由来ＤＣ（ＢＭＤＣ）の生成。脚大腿骨および脛骨をマウスから取り出し、ハサミで切断し、滅菌チューブに流した。骨髄懸濁液をＡＣＫで１分間処理した後、４０ｕｍのセルストレーナーに通した。細胞を計数し、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシン、ならびにＬ－グルタミンおよびピルビン酸ナトリウム（Ｉ１０）のサプリメントを含有する完全ＩＭＤＭからなる培地に再懸濁した。次いで、細胞をウェルあたり５Ｅ６骨髄細胞でＰ１２プレートにプレーティングした。組換えマウスＦＬＴ３Ｌ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を２００ｎｇ／ｍＬで培養物に添加した。分化した細胞を９日目のその後のアッセイに使用した。分化の効率は、ＢＤ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ａ３を使用するフローサイトメトリーによってモニターされ、ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋細胞は、生細胞の８０％を常に上回っていた。各実験について、５匹のマウスを使用してＢＭを収集し、ＤＣを作製した。
【0197】
マウスＦＬＴ３Ｌ分化ＢＭＤＣ（ＦＬＴ３Ｌ－ＢＭＤＣ）過剰活性化。ＢＭＤＣをＰＢＳで洗浄し、１．５×１０５細胞／ウェルの濃度でＦＬＴ３Ｌ含有Ｉ１０に再プレーティングした。最終体積２００μＬ／ウェルとなるように、指示濃度で刺激物を培養物に添加した。刺激の２４時間後、細胞培養上清を遠心分離後に収集し、サイトカイン分泌を測定するために－２０℃で保存した。ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ４０およびＴＮＦ－アルファＥＬＩＳＡは、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅａｄｙ－ＳＥＴ－Ｇｏ！（現在はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）ＥＬＩＳＡキットを製造業者のプロトコルに従って使用して実施された。細胞生存率は、ＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬キットを用いて測定した。
【0198】
フローサイトメトリー。ＦｃＲ遮断後、処理したＦＬＴ３Ｌ－ＢＭＤＣを洗浄し、Ｌｉｖｅ Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてＰＢＳ中で４℃で２０分間染色した。次いで、細胞を再び洗浄し、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した以下の蛍光コンジュゲート抗体：抗ＣＤ１１ｃ、抗Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ、抗Ｈ－２Ｋｂ、抗ＳＩＲＰａ、抗ＣＤ２４、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ４５Ｒ、抗ＣＸＣＬ１６および抗ＣＣＲ７を含有するＭＡＣＳ緩衝液（１％ＦＣＳおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）中で４℃で２０分間染色した。データは、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）で取得した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用してデータを解析した。実験条件は３連で試験され、条件は２つまたは３つの独立した実験で試験された。
【0199】
皮膚ｄＬＮにおけるＤＣ浸潤。皮膚排出リンパ節（ｄＬＮ）におけるＤＣの浸潤を評価するために、マウスに、１０％または１５％または２０％でＫＰ４０７に再懸濁した２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣと組み合わせたＲ８４８を皮下注射した。注射の２４時間後、皮膚排出リンパ節（ｄＬＮ）を切り離した。単一細胞懸濁液を調製し、Ｌｉｖｅ Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてＰＢＳ中で４℃で２０分間、細胞を染色した。次いで、細胞を再度洗浄し、以下の蛍光コンジュゲート抗体：抗ＣＤ１１ｃおよび抗Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ（ＭＨＣ－ＩＩ）、を含有するＭＡＣＳ緩衝液（１％ＦＣＳおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）中、４℃で２０分間染色した。生細胞中のＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ－ＩＩｈｉｇｈの絶対数を決定するために、製造業者のプロトコルに従って、ｃｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ計数ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用した。データは、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）で取得した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用してデータを解析した。各実験群に５匹のマウスを使用した。
【0200】
抗原取り込みおよび提示アッセイ。ＢＭＤＣの抗原取り込みおよびエンドサイトーシス能力を調べるために、ｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｒｅｄデキストラン１０，０００ＭＷを使用した（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。手短に言えば、事前に培地のみで培養したか、またはＲ８４８単独でもしくは２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣと組み合わせて２４時間処理したＦＬＴ３Ｌ由来ＢＭＤＣを、ｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｒｅｄデキストラン（４０ｕｇ／ｍｌ）とともに３７℃または（抗原の表面結合の対照として）４℃で４５分間インキュベートした。次いで、ＢＭＤＣを洗浄し、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色して、生細胞と死細胞を区別した。次いで、細胞をＢＤ固定液で固定し、ＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。生細胞の赤色（ＡＰＣ）蛍光をフローサイトメトリーによって測定した。３７℃でインキュベートしたＢＭＤＣの蛍光値を、４℃でインキュベートしたｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｒｅｄデキストラン関連細胞のＭＦＩに対して正規化した、ｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｒｅｄデキストラン関連細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）として報告した。ＭＨＣ－Ｉ上のＯＶＡペプチド提示の効率を測定するために、ＦＬＴ３Ｌ－ＢＭＤＣを上記のように処理し、Ｅｎｄｏｆｉｔ－ＯＶＡタンパク質（０．５ｍｇ／ｍｌ）とともに３７℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞をＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＨ－２Ｋｂ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＯＶＡペプチド「ＳＩＩＮＦＥＫＬ」に結合したＨ－２Ｋｂに結合するＰＥコンジュゲート抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で４℃で２０～３０分間染色した。非ＯＶＡ処理ＤＣは陰性対照として機能し、アイソタイプ対照は染色対照として使用された。ＭＨＣ－Ｉ上のＯＶＡペプチドに関連する細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって計算した。Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ａ３フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）でデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）で解析した。実験条件は３連で試験された。
【0201】
エクスビボ全腫瘍溶解物の調製。同系の全腫瘍溶解物（ＷＴＬ）は、免疫されていない腫瘍担持マウスの腫瘍外植片から調製した。手短に言えば、１０～１２ｍｍのサイズの腫瘍を有する未免疫マウス由来の腫瘍を、穏やかなＭＡＣＳ解離剤（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して機械的に脱凝集させ、腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して製造業者のプロトコルに従って酵素的に消化した。消化後、腫瘍細胞懸濁液をＰＢＳで洗浄し、７０ｕｍ、次いで３０ｕｍフィルターに通した。抗ＣＤ４５ ＴＩＬマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、単一細胞懸濁液からＣＤ４５＋細胞を除去した。次いで、腫瘍細胞を計数し、１×１０７細胞／ｍｌで再懸濁した後、３～４サイクルの凍結融解によって溶解した。溶解した細胞を、１８Ｇ、次いで２１Ｇ、最後に２５Ｇの針に材料を繰り返し通すことによってさらに破壊した。溶解物を７０ｕｍおよび３０ｕｍのセルストレーナーで再び濾過し、使用するまで一定分量で－８０℃で保存した。ＷＴＬは、マウスあたり５．７５Ｅ５個の腫瘍細胞に相当する濃度で、免疫療法に使用された。
【0202】
免疫療法による免疫化および腫瘍チャレンジ。免疫療法アプローチとの関連での免疫化のために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊを５×１０４個のＢ１６Ｆ１０細胞を左側腹部に注射した。腫瘍が触知可能であった場合、マウスを未免疫のままにしておくか、ＷＴＬ単独で免疫するか、Ｒ８４８とＷＴＬを組み合わせて免疫するか、またはＰＢＳもしくはＫＰ４０７中で調製した、Ｒ８４８および２２：０ ＬＰＣとＷＴＬを組み合わせて免疫するかのいずれかにした。マウスは、７日間隔で２回のブースト注射を受けた。
【0203】
定量および統計解析。インビボ研究では、ｎは、１つまたは２つの独立した実験からの条件ごとの動物の数を指す。統計的差異は、対応のない両側スチューデントｔ検定、またはテューキー事後検定を用いた一元配置分散分析を用いて計算した。従属試料は、対応のあるｔ検定で分析した。２つを超える群を用いた実験の統計的有意性は、テューキー多重比較検定補正を用いた二元配置分散分析で検定した。すべての実験は、Ｐｒｉｓｍ ７（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して解析した。グラフデータは平均値として示され、エラーバーはＳＤまたはＳＥＭを示した。＜０．０５（＊）、＜０．０１（＊＊）または＜０．００１（＊＊＊）、％０．０００１（＊＊＊＊）のＰ値は群間の有意差を示した。
【0204】
結果
マウスは、特にがん治療を試験するための重要な実験モデルである。マウス腫瘍担持モデルにおける２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣの治療効果を評価するために、本発明者らはまず、２２：０ ＬＰＣがマウス樹状細胞を過剰活性化するかどうかを判定しようとした。樹状細胞を、マウスＦＬＴ３Ｌ組換えタンパク質を使用してマウス骨髄から分化させた。マウスＤＣを過剰活性化するために、２つの方法を用いて２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣを調製した。２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣをＰＢＳに再懸濁して細胞に添加するか、または脂質を５％Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ４０７（ＫＰ４０７）に再懸濁した。Ｒ８４８（１ｕｇ／ｍＬ）と組み合わせた場合、ＰＢＳに再懸濁したさまざまな濃度の２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣは、ＩＬ－１ベータ分泌を誘導することができなかった。対照的に、ＫＰ４０７に製剤化された２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣは用量依存的にＩＬ－１ベータ分泌を誘導し、マウス細胞が２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣによって過剰活性化され得ることを実証した（図２５Ａ）。予想通り、未処理のＤＣ、またはＲ８４８単独、またはＲ８４８を含まない２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣで処理したＤＣは、ＩＬ－１ベータ分泌を誘導することができなかった。試験した脂質濃度のうち、ＫＰ４０７に製剤化された４１ｕＭ ２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣは、細胞生存率を維持しながらＩＬ－１ベータ分泌を支援することにおいて優れていた（図２５Ｂ）。これらのデータは、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣをミセルに組み込むことにより、マウス樹状細胞が脂質を生物学的に利用できるようになることを示唆している。高活性ＤＣは、生存可能なままＩＬ－１ベータを放出する能力を獲得するが、ＰＡＭＰ単独で処理した活性ＤＣと同様の特性を共有するはずである。Ｒ８４８および２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣで処理した過剰活性ＤＣがそれらの古典的なＤＣ機能（炎症促進性サイトカイン分泌、抗原取り込み、抗原提示、共刺激分子発現およびケモカイン受容体）を保持しているかどうかを試験するために、ＤＣを培地またはＲ８４８単独で上記のように処理するか、またはＲ８４８と４１ｕＭ ２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣの組合せでＤＣを２４時間処理した。予想されるように、Ｒ８４８刺激は、培地のみで処理したナイーブＤＣと比較して、ＴＮＦ－アルファ分泌またはＩＬ－６などの炎症促進性サイトカインの分泌を高いレベルで誘導した。同様に、ＰＢＳまたはＫＰ４０７中で再懸濁された２２：０ ＬＰＣとＲ８４８を組み合わせて処理した過剰活性ＤＣは、高いＴＮＦ－アルファおよびＩＬ－６分泌を誘導し、ＫＰ４０７中のＲ８４８および２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣによるＤＣ刺激後のＴＮＦ－アルファ分泌がわずかに増加した（図２６Ａ～２６Ｂ）。特に、Ｔｈ１応答の重要な推進因子であるＩＬ－１２ｐ４０サイトカインは、２２：０ ＬＰＣの存在下または非存在下でＲ８４８刺激によって誘導された（図２６Ｃ）。全体として、これらのデータは、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣがＤＣにおけるＮＦ－ｋＢ媒介性応答を妨げないことを強調している。結果として、過剰活性ＤＣは、ＰＡＭＰ Ｒ８４８単独で処理した活性ＤＣと同様の特性を共有するが、そのサイトカイン分泌レパートリーにＩＬ－１ベータを追加する。
マウスは、特にがん治療を試験するための重要な実験モデルである。マウス腫瘍担持モデルにおける２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣの治療効果を評価するために、本発明者らはまず、２２：０ ＬＰＣがマウス樹状細胞を過剰活性化するかどうかを判定しようとした。樹状細胞を、マウスＦＬＴ３Ｌ組換えタンパク質を使用してマウス骨髄から分化させた。マウスＤＣを過剰活性化するために、２つの方法を用いて２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣを調製した。２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣをＰＢＳに再懸濁して細胞に添加するか、または脂質を５％Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ４０７（ＫＰ４０７）に再懸濁した。Ｒ８４８（１ｕｇ／ｍＬ）と組み合わせた場合、ＰＢＳに再懸濁したさまざまな濃度の２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣは、ＩＬ－１ベータ分泌を誘導することができなかった。対照的に、ＫＰ４０７に製剤化された２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣは用量依存的にＩＬ－１ベータ分泌を誘導し、マウス細胞が２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣによって過剰活性化され得ることを実証した（図２５Ａ）。予想通り、未処理のＤＣ、またはＲ８４８単独、またはＲ８４８を含まない２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣで処理したＤＣは、ＩＬ－１ベータ分泌を誘導することができなかった。試験した脂質濃度のうち、ＫＰ４０７に製剤化された４１ｕＭ ２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣは、細胞生存率を維持しながらＩＬ－１ベータ分泌を支援することにおいて優れていた（図２５Ｂ）。これらのデータは、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣをミセルに組み込むことにより、マウス樹状細胞が脂質を生物学的に利用できるようになることを示唆している。高活性ＤＣは、生存可能なままＩＬ－１ベータを放出する能力を獲得するが、ＰＡＭＰ単独で処理した活性ＤＣと同様の特性を共有するはずである。Ｒ８４８および２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣで処理した過剰活性ＤＣがそれらの古典的なＤＣ機能（炎症促進性サイトカイン分泌、抗原取り込み、抗原提示、共刺激分子発現およびケモカイン受容体）を保持しているかどうかを試験するために、ＤＣを培地またはＲ８４８単独で上記のように処理するか、またはＲ８４８と４１ｕＭ ２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣの組合せでＤＣを２４時間処理した。予想されるように、Ｒ８４８刺激は、培地のみで処理したナイーブＤＣと比較して、ＴＮＦ－アルファ分泌またはＩＬ－６などの炎症促進性サイトカインの分泌を高いレベルで誘導した。同様に、ＰＢＳまたはＫＰ４０７中で再懸濁された２２：０ ＬＰＣとＲ８４８を組み合わせて処理した過剰活性ＤＣは、高いＴＮＦ－アルファおよびＩＬ－６分泌を誘導し、ＫＰ４０７中のＲ８４８および２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣによるＤＣ刺激後のＴＮＦ－アルファ分泌がわずかに増加した（図２６Ａ～２６Ｂ）。特に、Ｔｈ１応答の重要な推進因子であるＩＬ－１２ｐ４０サイトカインは、２２：０ ＬＰＣの存在下または非存在下でＲ８４８刺激によって誘導された（図２６Ｃ）。全体として、これらのデータは、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣがＤＣにおけるＮＦ－ｋＢ媒介性応答を妨げないことを強調している。結果として、過剰活性ＤＣは、ＰＡＭＰ Ｒ８４８単独で処理した活性ＤＣと同様の特性を共有するが、そのサイトカイン分泌レパートリーにＩＬ－１ベータを追加する。
【0205】
ＦＬＴ３Ｌ－ＤＣは、２つの主要なサブセット：ｃＤＣ１およびｃＤＣ２に分けられる。これらのサブセットのうち、ｃＤＣ１は特有の抗原交差提示が可能であり、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞だけでなくＣＤ４＋Ｔ細胞も刺激することができる。対照的に、ｃＤＣ２はＴｈ２およびＴｈ１７免疫を活性化する。ｃＤＣ１およびｃＤＣ２サブセットにおける２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣの挙動を決定するために、本発明者らは、フローサイトメトリーによってＦＬＴ３Ｌ分化ＤＣのｃＤＣ１およびｃＤＣ２を分析した。ｃＤＣ１およびｃＤＣ２を同定するために、ＦＬＴ３Ｌ ＤＣをＣＤ１１ｃ、ＳＩＲＰａ、ＣＤ２４、ＭＨＣ－ＩＩおよびＣＤ４５Ｒで染色した。ｃＤＣ１はＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ４５Ｒ－ＣＤ２４＋ＳＩＲＰａ－として定義され、ｃＤＣ２はＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ４５Ｒ－ＣＤ２４ｌｏｗＳＩＲＰａ＋として定義される。本発明者らは、ＤＣとＴ細胞の相互作用に重要なＣＤ４０などの共刺激分子の発現を分析した。予想通り、刺激の２４時間後、Ｒ８４８は、ナイーブｃＤＣ１およびｃＤＣ２細胞と比較して、ＣＤ４０発現の上方調節を誘導した。興味深いことに、本発明者らは、５％ＫＰ４０７に再懸濁した４１ｕＭの２２：０ ＬＰＣと組み合わせたＲ８４８で処理した過剰活性ｃＤＣ１およびｃＤＣ２においてＣＤ４０発現が強く増強されることを見出した（図２７）。
【0206】
ＤＣ遊走は、適応免疫応答を活性化する重要なステップである。ＣＣＲ７は、リンパ節へのＤＣ遊走に必要なケモカイン受容体である。ＫＰ４０７製剤中の２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣを使用して細胞を過剰活性化した場合、ｃＤＣ１細胞は、Ｒ８４８単独と比較してＣＣＲ７発現を有意に増加させた（図２８Ａ）。同様の傾向が、腫瘍微小環境における抗腫瘍Ｔ細胞とＤＣの相互作用に重要な役割を果たすＴ細胞の化学誘引物質であるＣＸＣＬ１６についても観察された（図２８Ｂ）。さらに、過剰活性化は、Ｒ８４８刺激単独と比較して、ｃＤＣ１サブセットとｃＤＣ２サブセットの両方でＭＨＣクラスＩ発現を増強した（図２９）。
【0207】
ＤＣ上のＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）発現は、ＣＤ８＋Ｔ細胞への抗原交差提示に重要である。したがって、本発明者らは、抗原特異的Ｔ細胞の刺激に必要なＤＣの機能であるＭＨＣ－Ｉ上の抗原を取り込み、交差提示するＤＣの能力を分析した。最初にＤＣのエンドサイトーシス能力を試験するために、ＦＬＴ３Ｌ－ＤＣを上記のように２４時間刺激し、次いでＲｅｄ ｐＨｒｏｄｏデキストランとともにインキュベートした。デキストランがエンドサイトーシスされると、フローサイトメトリーによって赤色蛍光を検出することができる。デキストランを投与しなかったＤＣを陰性対照とした。本発明者らは、ＤＣを２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣの存在下または非存在下でＲ８４８で処理すると、ＤＣが同様に抗原を取り込み、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣがＤＣの抗原取り込み能力を損なわないことを示すことを見出した（図３０Ａ）。抗原プロセシングおよび抗原交差提示を試験するために、ＤＣを上記のように２４時間刺激し、次いでオボアルブミン全タンパク質で４℃または３７℃で４５分間処理した。次に、本発明者らは、ＳＩＩＮＦＥＫＬに結合したＨ－２Ｋｂに特異的な抗体を使用することによって、ＭＨＣ－Ｉ分子上のオボアルブミンペプチドの発現を測定した。本発明者らは、Ｒ８４８で処理したＤＣがＯＶＡ抗原をプロセシングし交差提示する能力を強く増強することを見出した。特に、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣは、過剰活性ＤＣが依然として抗原をプロセシングし、ＭＨＣ－Ｉ分子上のＯＶＡペプチドを交差提示することができたため、これらの機能を妨げなかった（図３０Ｂ）。まとめると、これらのデータは、過剰活性ＤＣが適応Ｔ細胞免疫応答の誘導に強力であることを示している。
【0208】
本発明者らは、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣとＲ８４８と組合せることで、内因性ＤＣを利用して抗腫瘍免疫応答を開始することができると想定している。インビトロで観察されるように、ＫＰ４０７を使用した２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣのミセル化は、ＤＣを過剰活性化するために必要である。マウスのインビボワクチン接種に必要なＫＰ４０７の量を最適化するために、様々な割合を皮下注射に使用した。マウスを、１０％、１５％または２０％でＫＰ４０７に再懸濁した２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣと組み合わせたＲ８４８で皮下免疫した。１５％のＫＰ４０７を使用した場合、本発明者らは、ｄＬＮ中のＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣｈｉｇｈとして定義されるＤＣの最も多い流入を観察し、１５％のＫＰ４０７がリンパ節へのＤＣ輸送を誘導するための最適濃度であることを示した（図３１）。この最初の概念実証研究は、その後の研究のためにワクチン接種プロトコルを最適化するのに役立った。
【0209】
次いで、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣを治療用腫瘍ワクチンとして試験した。マウスに、マウス黒色腫腫瘍細胞株であるＢ１６－Ｆ１０を左側腹部の皮下に接種した。ワクチン抗原の供給源として、Ｂ１６－Ｆ１０細胞由来の全腫瘍溶解物（ＷＴＬ）を３～４回の凍結／解凍サイクルの後に使用して、腫瘍細胞から抗原を放出させた。腫瘍担持マウスを処置するために、腫瘍注射の７日後に、８０ｕｇのＷＴＬと、マウスあたり１００ｕｇのＲ８４８および６５ｕｇのＫＰ４０７中２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ（１５％）と組み合わせて、マウスを右側腹部で免疫した。その後、マウスは７日ごとに２回のブーストを受けた。未免疫マウスは、腫瘍接種の３週間以内に腫瘍成長により死亡した。ＰＢＳ中のＲ８４８と組み合わせた腫瘍溶解物、またはＲ８４８および２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣと組み合わせた腫瘍溶解物をマウスにワクチン接種した場合、有意な利益は観察されなかった。対照的に、１５％ＫＰ４０７を配合した２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣと組み合わせたＷＴＬおよびＲ８４８で免疫したマウスは、より長く生存し（図３２）、腫瘍成長動態が遅延した（図３３）。この最初の研究は、２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣがマウスＤＣに対して過剰活性化作用を有し、腫瘍チャレンジに対する防御免疫応答を開始することができることを示している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A-6C】
【図7A-7C】
【図8A-8B】
【図9A-9B】
【図10A-10B】
【図11A-11B】
【図12A-12B】
【図13A-13B】
【図14A-14B】
【図15A-15B】
【図16A-16B】
【図17】
【図18A-18B】
【図19A-19C】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23A-23B】
【図24】
【図25A-25B】
【図26A-26C】
【図27】
【図28A-28B】
【図29】
【図30A-30B】
【図31】
【図32】
【図33】
【国際調査報告】