特表 2024-514074 Ｅ．ＣＯＬＩ Ｏ１８バイオコンジュゲートの産生

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-28

(54)【発明の名称】Ｅ．ＣＯＬＩ Ｏ１８バイオコンジュゲートの産生

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20240321BHJP

   C12P 1/04 20060101ALI20240321BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20240321BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20240321BHJP

   A61K 39/108 20060101ALI20240321BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20240321BHJP

   C12N 9/10 20060101ALN20240321BHJP

【ＦＩ】

C12N1/21 ZNA

C12P1/04 Z

A61K47/64

A61P31/04

A61K39/108

C12N15/54

C12N9/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2023559726

(86)(22)【出願日】2022-03-31

(85)【翻訳文提出日】2023-09-27

(86)【国際出願番号】 IB2022053013

(87)【国際公開番号】W WO2022208430

(87)【国際公開日】2022-10-06

(31)【優先権主張番号】21166781.1

(32)【優先日】2021-04-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514010601

【氏名又は名称】ヤンセン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100217663

【弁理士】

【氏名又は名称】末広 尚也

(72)【発明者】

【氏名】ワールデンブルグ，エブリン，マーリーン

(72)【発明者】

【氏名】ゲウルトセン，イェルーン

(72)【発明者】

【氏名】バーウト，ピーター ジャン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C085

【Ｆターム（参考）】

4B064AF11

4B064AG01

4B064CA01

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE08

4B064DA01

4B065AA26X

4B065AA26Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065BC26

4B065BD16

4B065CA19

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC06

4C076CC41

4C076EE59

4C085AA03

4C085BA21

4C085CC07

4C085CC21

4C085DD51

4C085DD59

4C085EE01

(57)【要約】

本発明は、担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原多糖のバイオコンジュゲートを産生するための宿主細胞に関する。宿主細胞は、配列番号１の野生型Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼと比較して、１９９位、３７７位及び３９５位のうちの１つ又は２つ以上におけるアミノ酸置換の特定の組み合わせを有する改変Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼを含むことを特徴とし、改変Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼは、宿主細胞によって産生されるＯ１８バイオコンジュゲートの収率及びグリコシル化パターンを改善する。本発明は更に、宿主細胞を使用して、担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原多糖のバイオコンジュゲートを産生する方法、追加のＯ抗原多糖血清型のバイオコンジュゲートを含む多価組成物を含む、これらのバイオコンジュゲートを含む組成物に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）少なくとも１つのグリコシル化コンセンサス配列を含む担体タンパク質と、
（ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１８ ｒｆｂ遺伝子座と、
（ｃ）オリゴサッカリルトランスフェラーゼと、
を含む、グラム陰性細菌宿主細胞であって、
前記細胞が、Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、
ｉ）配列番号１の１９９位に対応する位置のイソロイシン、配列番号１の３７７位に対応する位置のリジン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のアラニン、
ｉｉ）配列番号１の１９９位に対応する位置のトレオニン、配列番号１の３７７位に対応する位置のリジン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のバリン、
ｉｉｉ）配列番号１の１９９位に対応する位置のトレオニン、配列番号１の３７７位に対応する位置のリジン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のアラニン、
ｉｖ）配列番号１の１９９位に対応する位置のイソロイシン、配列番号１の３７７位に対応する位置のリジン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のバリン、又は
ｖ）配列番号１の１９９位に対応する位置のイソロイシン、配列番号１の３７７位に対応する位置のメチオニン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のアラニン
を含む、グラム陰性細菌宿主細胞。

【請求項2】

前記Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むが、前記アミノ酸配列が、
ｉ）配列番号１の１９９位に対応する位置のイソロイシン、配列番号１の３７７位に対応する位置のリジン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のアラニン、
ｉｉ）配列番号１の１９９位に対応する位置のトレオニン、配列番号１の３７７位に対応する位置のリジン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のバリン、
ｉｉｉ）配列番号１の１９９位に対応する位置のトレオニン、配列番号１の３７７位に対応する位置のリジン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のアラニン、
ｉｖ）配列番号１の１９９位に対応する位置のイソロイシン、配列番号１の３７７位に対応する位置のリジン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のバリン、又は
ｖ）配列番号１の１９９位に対応する位置のイソロイシン、配列番号１の３７７位に対応する位置のメチオニン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のアラニン
を含む場合を除く、請求項１に記載の宿主細胞。

【請求項3】

前記Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号１の１９９位に対応する位置のイソロイシン、配列番号１の３７７位に対応する位置のリジン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のアラニンを含む、請求項１又は２に記載の宿主細胞。

【請求項4】

前記Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はベクターが、前記宿主細胞のゲノムに組み込まれている、請求項１～３のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項5】

前記宿主細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ宿主細胞である、請求項１～４のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項6】

前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２株、好ましくはＷ３１１０株である、請求項５に記載の宿主細胞。

【請求項7】

ａ）前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、配列番号６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
ｂ）前記担体タンパク質が配列番号３を含み、
ｃ）前記Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１８ ｒｆｂ遺伝子座が、血清型Ｏ１８Ａを有するＥ．ｃｏｌｉ株のｒｆｂ遺伝子座である、
のうちの少なくとも１つである、請求項１～６のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項8】

前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項9】

前記宿主細胞が、Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有し、請求項１～３のいずれか一項に記載の配列を有するポリペプチドをコードするＷｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を有するＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８ ｒｆｂ遺伝子座を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項10】

担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原多糖のバイオコンジュゲートを産生するための方法であって、請求項１～９のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養して前記バイオコンジュゲートを産生することを含む、方法。

【請求項11】

前記バイオコンジュゲートの回収を更に含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

回収された前記バイオコンジュゲートを医薬組成物に製剤化することを更に含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ－抗原多糖の１つ又は２つ以上の追加のバイオコンジュゲートを前記医薬組成物に添加して、多価バイオコンジュゲート組成物を得ることを更に含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記１つ又は２つ以上の追加のバイオコンジュゲートが、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ２５及びＯ７５からなる群から選択される少なくとも１つのＯ－抗原多糖を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記多価バイオコンジュゲート組成物が、
（ｉ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８Ａ抗原多糖のバイオコンジュゲート、
（ｉｉ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１Ａ抗原多糖のバイオコンジュゲート、
（ｉｉｉ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ２抗原多糖のバイオコンジュゲート、
（ｉｖ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉグルコシル化Ｏ４抗原多糖のバイオコンジュゲート、
（ｖ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ６Ａ抗原多糖のバイオコンジュゲート、
（ｖｉ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１５抗原多糖のバイオコンジュゲート、
（ｖｉｉ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１６抗原多糖のバイオコンジュゲート、
（ｖｉｉｉ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ２５Ｂ抗原多糖のバイオコンジュゲート、及び
（ｉｘ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ７５抗原多糖のバイオコンジュゲート
を含み、
好ましくは、各バイオコンジュゲート中の前記担体タンパク質が配列番号３を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記多価バイオコンジュゲート組成物が、
（ｘ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ８抗原多糖のバイオコンジュゲートを更に含み、
好ましくは、前記担体タンパク質が配列番号３を含む、請求項１５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、医療微生物学、免疫学及びワクチンの分野に関する。特に、本発明は、増加した収率及び増加したグリコシル化度を有するＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原多糖のバイオコンジュゲートを産生するための改善されたＷｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼを含む宿主細胞に関する。本発明は更に、本発明のバイオコンジュゲートを含む組成物、及びＥ．ｃｏｌｉ感染、特に侵襲性腸管外病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（extra-intestinal pathogenic E. coli、ＥｘＰＥＣ）疾患による感染の予防又は治療のためのＥ．ｃｏｌｉに対する免疫応答を誘導するためのそのような組成物の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

腸管外病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥｘＰＥＣ）株は、共生Ｅ．ｃｏｌｉ株と並んで、通常、ヒト胃腸管の無害な居住者である。ＥｘＰＥＣ分離株は、血清型によって共生分離株から容易に区別することができないが、多くのクローン系統は、Ｏ－抗原、莢膜及び鞭毛抗原血清型によって定義されるように、ＥｘＰＥＣによって支配される（Ｏ：Ｋ：Ｈと略される、例えばＯ２５：Ｋ１：Ｈ４）。共生Ｅ．ｃｏｌｉとは対照的に、ＥｘＰＥＣ株は、それらが胃腸管にコロニーを形成することを可能にし、また広範囲の腸管外感染を引き起こすことを可能にする広範な病原性因子を発現し、これは、入院による著しい医療費負担及び死亡に関連する。新生児、高齢者、及び免疫無防備状態の患者は、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患（invasive ExPEC disease、ＩＥＤ）を含むＥｘＰＥＣ感染に特に感受性である。

【0003】

Ｏ－抗原は、Ｅ．ｃｏｌｉを含むグラム陰性細菌における細胞壁リポ多糖（lipopolysaccharide、ＬＰＳ）の免疫優性成分を含む。現在、１８０を超える血清学的に特有なＥ．ｃｏｌｉ Ｏ－抗原が同定されており、ＥｘＰＥＣ分離株の大部分は２０未満のＯ－抗原血清型内に分類されている。完全長Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ－抗原は、典型的には、高度に保存されたＬＰＳコア構造に結合した約１０～２５個の反復糖単位からなり、各成分は、それぞれ主にｒｆｂ及びｒｆａ遺伝子クラスターでコードされる酵素によって別々に合成される。Ｏ－抗原の重合後、Ｏ－抗原多糖骨格は、典型的には、アセチル残基又はグルコース残基の付加を介して改変され得る。これらの改変は、共通の多糖骨格を共有するが、側鎖が異なる、抗原的に異なる血清型を作製することによって、血清型多様性を効果的に増加させる。Ｏ－抗原改変酵素をコードする遺伝子は、典型的に、染色体上のｒｆｂクラスターの外側に存在し、そしていくつかの場合において、これらの遺伝子は、溶原性バクテリオファージ内に見出される。

【0004】

ＥｘＰＥＣ感染を予防するためのワクチンの開発への努力は、Ｏ－抗原多糖コンジュゲートに焦点を当ててきた。１２価のＯ－抗原コンジュゲートワクチンは、Ｏ－抗原多糖の抽出及び精製並びに解毒されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａへの化学的コンジュゲーションを介して合成され、第１相臨床試験において安全性及び免疫原性について試験された（Ｃｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（１９９４）ｖ．１７０，ｐｐ．８３４－４０）。この候補ワクチンは、臨床使用に認可されることはなかった。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるバイオコンジュゲーションシステムが最近開発されており、このシステムでは、抗原多糖及び担体タンパク質の両方がインビボで合成され、続いて、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ酵素であるオリゴサッカリルトランスフェラーゼＰｇｌＢの活性を介してインビボでコンジュゲートされる（Ｗａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００６）ｖ．１０３，ｐｐ．７０８８－９３）。このＮ結合型タンパク質グリコシル化系は、多様な多糖を担体タンパク質に移入させることができ、それが発現される細菌からバイオコンジュゲートを精製する方法を可能にする。バイオコンジュゲーションは、Ｅ．ｃｏｌｉ ４価Ｏ－抗原候補ワクチンのためのコンジュゲート多糖を産生するための使用に成功している（Ｐｏｏｌｍａｎ ａｎｄ Ｗａｃｋｅｒ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（２０１６）ｖ．２１３（１），ｐｐ．６－１３、国際公開第２０１５／１２４７６９号、国際公開第２０１７／０３５１８１号）。

【0005】

１０種のバイオコンジュゲートを含む組成物（Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ及びＯ７５、この組成物はＥｘＰＥＣ１０Ｖと称される）が記載されており、臨床試験中である（例えば、国際公開第２０２０／１９１０８２（Ａ１）号）。

【0006】

Ｏ１８Ａ抗原多糖を有するバイオコンジュゲートについての産物収率は、ＥｘＰＥＣ１０Ｖについて調製された他の９つのバイオコンジュゲートと比較して最も低かったことが観察された（国際公開第２０２０／１９１０８２（Ａ１）号）。更に、そのように産生されたＯ１８Ａバイオコンジュゲートは、「ｓＥＰＡ」と呼ばれる限られた数のＯ１８Ａ抗原多糖反復単位から構成される比較的高い量のグリカンを含有するようであり（すなわち、わずか約１～３反復単位を有する多糖鎖を有するＥＰＡ担体タンパク質であり、これは、Ｏ１８Ａバイオコンジュゲート原薬の産生プロセスにおける周辺質画分中のＯ１８Ａバイオコンジュゲートの２０％超に対応する）、このｓＥＰＡ産物は、Ｏ１８Ａ抗原多糖が少なくとも５反復単位から構成されるグリカンを主に含む好ましいバイオコンジュゲートから容易に分離されない。Ｏ１８血清群に属するＥｘＰＥＣ分離株は、米国及びＥＵ血液分離株の現代のサーベイランス研究において一般的に同定されており、したがって、Ｏ１８コンジュゲートは、ＥｘＰＥＣワクチンの関連成分であると考えられる。したがって、Ｏ１８抗原多糖のコンジュゲートの収率を改善することが所望されるであろう。

【発明の概要】

【0007】

したがって、本発明の目的は、産生中にＯ１８抗原多糖を含むバイオコンジュゲートの産物収率を増加させるための材料及び方法を提供すること、並びに／あるいは以前に記載された産生プロセスを使用して得られたＯ１８バイオコンジュゲートと比較してｓＥＰＡの相対量が減少したＯ１８バイオコンジュゲートを得るための材料及び方法を生成することである。本発明の別の目的は、以前に記載された材料及び方法を使用して得られたＯ１８バイオコンジュゲートと比較して、グリコシル化の程度が増加したＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８Ａ抗原多糖のバイオコンジュゲートを産生するための材料及び方法を提供することである。

【0008】

第１の態様において、本発明は、（ａ）少なくとも１つのグリコシル化コンセンサス配列を含む担体タンパク質、（ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１８ ｒｆｂ遺伝子座、及び（ｃ）オリゴサッカリルトランスフェラーゼを含むグラム陰性細菌宿主細胞に関し、細胞は、Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを含み、ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、ｉ）配列番号１の１９９位に対応する位置のイソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、配列番号１の３７７位に対応する位置のリジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のアラニン（Ａｌａ、Ａ）、ｉｉ）配列番号１の１９９位に対応する位置のトレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、配列番号１の３７７位に対応する位置のリジン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のバリン（Ｖａｌ、Ｖ）、ｉｉｉ）配列番号１の１９９位に対応する位置のトレオニン、配列番号１の３７７位に対応する位置のリジン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のアラニン、ｉｖ）配列番号１の１９９位に対応する位置のイソロイシン、配列番号１の３７７位に対応する位置のリジン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のバリン、又はｖ）配列番号１の１９９位に対応する位置のイソロイシン、配列番号１の３７７位に対応する位置のメチオニン（Ｍｅｔ，Ｍ）、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のアラニン、を含む、オリゴサッカリルトランスフェラーゼを含む。

【0009】

一実施形態では、宿主細胞において、Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むが、このアミノ酸配列が、ｉ）１９９位にＩｌｅ、３７７位にＬｙｓ、及び３９５位にＡｌａ、ｉｉ）１９９位にＴｈｒ、３７７位にＬｙｓ及び３９５位にＶａｌ、ｉｉｉ）１９９位にＴｈｒ、３７７位にＬｙｓ及び３９５位にＡｌａ、ｉｖ）１９９位にＩｌｅ、３７７位にＬｙｓ及び３９５位にＶａｌ、又はｖ）１９９位にＩｌｅ、３７７位にＭｅｔ及び３９５位にＡｌａを含むことを除き、ここで、全ての位置は配列番号１における位置に対応する。

【0010】

一実施形態では、宿主細胞において、Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、１９９位にＩｌｅ、３７７位にＬｙｓ、及び３９５位にＡｌａを含み、これらの位置は、配列番号１における位置に対応する。

【0011】

一実施形態において、宿主細胞は、宿主細胞のゲノムに組み込まれたＷｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はベクターを含む。

【0012】

一実施形態では、宿主細胞はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ宿主細胞である。好ましい実施形態において、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２株であり、より好ましくはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２株Ｗ３１１０である。

【0013】

一実施形態では、宿主細胞において、ａ）オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、配列番号６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｂ）担体タンパク質が、配列番号３を含み、ｃ）Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１８ｒｆｂ遺伝子座が、血清型Ｏ１８Ａを有するＥ．ｃｏｌｉ株のｒｆｂ遺伝子座である、のうちの少なくとも１つである。好ましくは、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。

【0014】

一実施形態において、宿主細胞は、本明細書において上で定義されたＷｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＷｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を有するＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８ ｒｆｂ遺伝子座を含む。

【0015】

更なる態様において、本発明は、担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原多糖のバイオコンジュゲートを産生するための方法であって、（ａ）本明細書において上で定義された本発明の宿主細胞を培養して、バイオコンジュゲートを産生することを含む方法に関する。好ましくは、本方法は、バイオコンジュゲートの回収を更に含む。

【0016】

一実施形態では、方法は、回収されたバイオコンジュゲートを医薬組成物に製剤化することを更に含む。

【0017】

一実施形態では、方法は、担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ－抗原多糖の１つ又は２つ以上の追加のバイオコンジュゲートを医薬組成物に添加して、多価バイオコンジュゲート組成物を得ることを更に含む。好ましくは、１つ又は２つ以上の追加のバイオコンジュゲートは、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ２５及びＯ７５からなる群から選択される少なくとも１つのＯ－抗原多糖を含む。好ましい実施形態では、本方法で産生される多価バイオコンジュゲート組成物は、（ｉ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８Ａ抗原多糖のバイオコンジュゲート、（ｉｉ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１Ａ抗原多糖のバイオコンジュゲート、（ｉｉｉ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ２抗原多糖のバイオコンジュゲート、（ｉｖ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉグルコシル化Ｏ４抗原多糖のバイオコンジュゲート、（ｖ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ６Ａ抗原多糖のバイオコンジュゲート、（ｖｉ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１５抗原多糖のバイオコンジュゲート、（ｖｉｉ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１６抗原多糖のバイオコンジュゲート、（ｖｉｉｉ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ２５Ｂ抗原多糖のバイオコンジュゲート、及び（ｉｘ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ７５抗原多糖のバイオコンジュゲートを含み、好ましくは各バイオコンジュゲート中の担体タンパク質は、配列番号３を含む。より好ましい実施形態では、本方法で産生される多価バイオコンジュゲート組成物は、（ｘ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ８抗原多糖のバイオコンジュゲートを更に含み、好ましくは、担体タンパク質は配列番号３を含む。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】配列番号１（レーン１及び３）又はＯ１８Ａ多糖バイオコンジュゲート発現のために誘導されたアミノ酸置換１９９Ｉ、３７７Ｋ、３９５Ａ（レーン２及び４）を有するＷｚｙバリアントを含有するＯ１８Ａバイオコンジュゲートについて、Ｅ．ｃｏｌｉ産生株Ｗ３１１０の振盪フラスコ培養物からの周辺質抽出物をロードしたクーマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥの図である。レーン１及び２にロードされた試料において、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ酵素ＰｇｌＢはサイズ縮小発現プラスミドから発現されたが、レーン３及び４において、ＰｇｌＢ発現プラスミドのベクター骨格は、非コードＤＮＡ及び産物発現に最適であると思われるｌａｃリプレッサー遺伝子ｌａｃＩを含む更なる４５００ｂｐのＤＮＡ配列を含んでいた。Ｏ１８Ａ多糖バイオコンジュゲート物質を示すバンドを矢印で示し、モノグリコシル化ＥＰＡ（Ｍ）、ジグリコシル化ＥＰＡ（Ｄ）及びトリグリコシル化ＥＰＡ（Ｔ）のおよそのサイズを示す。

【発明の説明】

【0019】

別の定義がなされない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で引用されるある特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。本明細書に引用される全ての特許、公開された特許出願及び刊行物は、あたかも本明細書に完全に記載されているように参照により組み込まれる。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意する必要がある。

【0020】

本明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、文脈上必要としない限り、「含む（comprise）」という用語並びに「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」などの変形は、指定の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を含むが、任意のその他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外するものではないことを意味すると、理解されよう。本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」という用語は、「含有する（containing）」又は「含む（including）」という用語に置き換えることができ、又は場合によって本明細書で使用される場合、「有する（having）」という用語に置き換えることもできる。

【0021】

本明細書で使用される場合、「からなる（consisting of）」は、特許請求の範囲の要素において指定されていない任意の要素、工程、又は成分を除外する。本明細書で使用される場合、「から本質的になる（consisting essentially of）」は、特許請求の範囲の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程は除外しない。本発明の態様又は実施形態に関連して本明細書で使用される場合、本開示の範囲を変化させるために、「含む（comprising）」、「含有する（containing）」、「含む（including）」、及び「有する」という上記用語のいずれかを、「からなる（consisting of）」又は「から本質的になる（consisting essentially of）」という用語に置き換えることができる。

【0022】

本明細書で使用される場合、複数の列挙された要素間の「及び／又は」という接続的な用語は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしの第１の要素の適用性を指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本明細書で使用される場合、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれ、したがって、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。

【0023】

「約」又は「およそ」という語は、数値に関連して使用される場合、その値が、所与の値±その値の２０％、好ましくは±その値の１０％、より好ましくは±その値の５％であり得ることを意味する。

【0024】

配列同一性は、本明細書において、配列を比較することによって決定される、２つ又はそれ以上のアミノ酸（ポリペプチド若しくはタンパク質）配列間又は２つ又はそれ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列間の関係として定義される。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存的アミノ酸置換物を、第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。「同一性」及び「類似性」は、公知の方法によって容易に計算することができる。

【0025】

「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つの配列の長さに応じて、グローバル又はローカルアラインメントアルゴリズムを使用して、２つのペプチド又は２つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定することができる。同様の長さの配列は、好ましくは、全長にわたって配列を最適に整列するグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈ）を使用してアライメントされ、一方で、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ）を使用して整列される。次いで、配列は、それらが（例えば、デフォルトパラメーターを使用してプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって最適に整列される場合に）少なくともある特定の最小パーセンテージの配列同一性（以下に定義される）を共有する場合、「実質的に同一」又は「本質的に類似」と称され得る。最も好ましくは、配列アラインメントは、デフォルト設定を使用してＣｌｕｓｔａｌＷ（１．８３）配列アラインメントにおいて行われる。

【0026】

あるいは、類似性又は同一性パーセンテージは、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを使用して、公開データベースを検索することによって決定されてもよい。したがって、本発明の核酸配列及びタンパク質配列は、更に、例えば、他のファミリーメンバー又は関連配列を同定するために、公開データベースに対する検索を実施するための「問い合わせ配列」として使用され得る。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，（１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２１５：４０３－１０）のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いてＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実行して、本発明のｗｚｙ核酸分子に対して相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いてＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施して、本発明のタンパク質分子に対して相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップ付きアラインメントを得るために、ギャップ付きＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２に記載されるように利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）のデフォルトパラメーターを使用してもよい。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのホームページ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照されたい。

【0027】

別途記載のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の全ての要素を指すと理解されるべきである。

【発明の詳細な説明】

【0028】

本出願の発明者らは、驚くべきことに、１つ又は２つ以上の特定の位置で参照配列と異なるＷｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼの使用が、Ｏ１８抗原多糖バイオコンジュゲートの産生収率の有意な改善をもたらすことを見出した。更に、そのようなポリメラーゼの使用は、驚くべきことに、増加したグリカン対タンパク質比及び／又はグリコシル化部位の増加した占有率を有するＯ１８抗原多糖コンジュゲートの産生を容易にすることが見出された。

【0029】

したがって、第１の態様において、本発明は、担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原多糖のバイオコンジュゲートを産生する際に使用するための宿主細胞を提供する。

【0030】

一実施形態では、本発明の宿主細胞は、少なくとも以下を含む：（ａ）少なくとも１つのグリコシル化コンセンサス配列を含む担体タンパク質、（ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１８ ｒｆｂ遺伝子座；ｃ）オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、及び（ｄ）Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有する本発明のポリペプチド。

【0031】

宿主細胞において、Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有する本発明のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更にＯ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドである。本発明のポリペプチドがＯ－抗原ポリメラーゼ活性を有するか否かは、好適な宿主細胞においてＷｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を発現させ、当業者に公知の方法によって、又は例えば、全内容が本明細書に組み込まれている、Ｗｏｏｄｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２０１０，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ｊｕｎ；６（６）：４１８－４２３）に記載されるように、産生された重合Ｏ－抗原の量を決定することによってアッセイすることができる。

【0032】

一実施形態では、本発明の宿主細胞は、Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを含み、このポリペプチドは、配列番号１と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、このアミノ酸配列は、
ｉ）配列番号１の１９９位に対応する位置のイソロイシン、配列番号１の３７７位に対応する位置のリジン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のアラニン、
ｉｉ）配列番号１の１９９位に対応する位置のトレオニン、配列番号１の３７７位に対応する位置のリジン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のバリン、
ｉｉｉ）配列番号１の１９９位に対応する位置のトレオニン、配列番号１の３７７位に対応する位置のリジン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のアラニン、
ｉｖ）配列番号１の１９９位に対応する位置のイソロイシン、配列番号１の３７７位に対応する位置のリジン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のバリン、又は、
ｖ）配列番号１の１９９位に対応する位置のイソロイシン、配列番号１の３７７位に対応する位置のメチオニン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のアラニン、を含む。

【0033】

それぞれ配列番号１のアミノ酸位置１９９、３７７又は３９５のうちの１つに対応するアミノ酸位置は、本明細書において、好ましくはデフォルト設定を使用して、配列番号１と配列番号１以外の配列との配列アラインメントにおいて、好ましくは配列番号１とのＣｌｕｓｔａｌＷ（１．８３）配列アラインメントにおいて、それぞれ配列番号１の位置１９９、３７７又は３９５のうちの１つと整列する配列番号１以外のアミノ酸配列中の位置を指すと理解される。当業者は、本明細書で定義されるアミノ酸配列アラインメントアルゴリズムを使用して、配列番号１以外のＷｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置を同定する方法を知るであろう。

【0034】

好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞は、Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを含み、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むが、アミノ酸配列が、ｉ）配列番号１の１９９位に対応する位置のイソロイシン、配列番号１の３７７位に対応する位置のリジン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のアラニン、ｉｉ）配列番号１の１９９位に対応する位置のトレオニン、配列番号１の３７７位に対応する位置のリジン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のバリン、ｉｉｉ）配列番号１の１９９位に対応する位置のトレオニン、配列番号１の３７７位に対応する位置のリジン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のアラニン、ｉｖ）配列番号１の１９９位に対応する位置のイソロイシン、配列番号１の３７７位に対応する位置のリジン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のバリン、又はｖ）配列番号１の１９９位に対応する位置のイソロイシン、配列番号１の３７７位に対応する位置のメチオニン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のアラニンを含むことを除く。したがって、この実施形態では、本発明の宿主細胞は、Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを含み、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むが、アミノ酸配列が、ｉ）配列番号１の１９９位のイソロイシン、配列番号１の３７７位のリジン、及び配列番号１の３９５位のアラニン、ｉｉ）配列番号１の３７７位のリジン、ｉｉｉ）配列番号１の３７７位のリジン及び配列番号１の３９５位のアラニン、ｉｖ）配列番号１の１９９位のイソロイシン及び配列番号１の３７７位のリジン、又は、ｖ）配列番号１の１９９位のイソロイシン及び配列番号１の３９５位のアラニンを含むことを除く。

【0035】

特に好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞は、Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを含み、ポリペプチドは配列番号１の１９９位に対応する位置のイソロイシン、配列番号１の３７７位に対応する位置のリジン、及び配列番号１の３９５位に対応する位置のアラニンを含む。

【0036】

当業者に理解されるように、一実施形態において、Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドの発現のために、本発明の宿主細胞は、好ましくは、本明細書において上で定義された本発明のＷｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、それに作動可能に連結されたプロモーターによって先行され得る。ある特定の実施形態において、プロモーターは、Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼコード配列に対して内因性である。ある特定の好ましい実施形態において、プロモーターは、腸内細菌科の細菌、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌、より好ましくはＥ．ｃｏｌｉ種の細菌においてＷｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼの発現を駆動する内因性プロモーターである。他の実施形態では、プロモーターは、Ｗｚｙコード配列に対して異種であり、例えば、組換え発現系における使用について当業者に公知の強力なプロモーターが使用される。例えば、プロモーターは、ａｒａ、ｐｈｏＡ、ｔａｃ、ｔｅｔ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ＰＢＡＤ、λＰＬ、Ｔ５又はＴ７プロモーターなどの誘導性又は構成的原核生物プロモーターである。

【0037】

ある特定の実施形態において、本発明は、本発明による宿主細胞の構築において使用することができる単離されたポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、組換え、合成、又は人工ポリヌクレオチドであり得る。ポリヌクレオチドは、任意の形態の核酸、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくは、ＤＮＡであり得る。ポリヌクレオチドは、天然に存在するＷｚｙコードポリヌクレオチド、例えば、配列番号２の天然に存在するＷｚｙコードポリヌクレオチド中に存在しない１つ又は２つ以上のヌクレオチドを含み得る。具体的には、本発明における使用のためのポリヌクレオチドは、配列番号１における１９９位、３７７位及び３９５位に対応するコドンのうちの１つ又は２つ以上において、配列番号２などの天然に存在するＷｚｙコードポリヌクレオチドと少なくとも異なる。更に、本発明における使用のためのポリヌクレオチドは、配列番号１における位置１９９、３７７及び３９５のうちの少なくとも１つに対応する位置以外のコドンにおいて、天然に存在するＷｚｙコードポリヌクレオチドと異なり得る。ポリヌクレオチドは、その５’末端及び／又は３’末端に天然に存在するＷｚｙコードポリヌクレオチド中に存在しない１つ又は２つ以上のヌクレオチドを有し得る。当業者は、日常的な技術を使用して、記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行って、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映することができる。したがって別途記載のない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型であるヌクレオチド配列及び同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列全てを含む。

【0038】

当業者によって更に理解されるように、一実施形態では、本明細書において上で定義された本発明のＷｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現構築物又はベクターに含まれ得る。好ましくは、発現構築物において、Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば発現カセットにおいて、本発明の宿主細胞におけるポリペプチドの発現のための発現制御配列に作動可能に連結されている。そのような発現制御配列は、上で特定したプロモーターを含むことができ、Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ配列、転写終結配列などを更に含むことができる。一実施形態では、発現構築物はベクターに含まれる。一実施形態では、ベクターは、エピソーマルベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクター、好ましくはプラスミドである。別の実施形態において、ポリヌクレオチド、ベクター、又は発現構築物は、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。ある特定の実施形態において、ベクター又は発現構築物は、好ましくはＤＮＡの形態である。ある特定の実施形態において、ベクターは、プロモーターに作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含み、これは、ポリヌクレオチドがプロモーターの制御下にあることを意味する。ある特定の実施形態では、本明細書で定義される本発明のＷｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞のゲノム中のｒｆｂ遺伝子座におけるその天然の位置に組み込まれ、例えば、分子生物学の当業者に公知である相同組換えに基づく遺伝子改変技術を使用して、部位特異的突然変異誘発によって作製される。

【0039】

担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原多糖のバイオコンジュゲートを産生する際に使用するための本発明の宿主細胞は、細菌宿主細胞である。一実施形態では、宿主細胞はグラム陰性細菌宿主細胞である。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原を含むバイオコンジュゲートの産生における使用に適した細菌又は原核宿主細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ種、Ｘｈａｎｔｏｍｏｎａｓ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、Ｙｅｒｓｉｎｉａ種、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ宿主細胞、より好ましくはＷ３１１０株などのＥ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２株であり、後者が特に好ましい。

【0040】

一実施形態では、宿主細胞は、天然に存在しない宿主細胞である。したがって、宿主細胞は、本明細書に記載されるＷｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを発現するように改変されており、好ましくは、ｉ）本明細書に定義されるＯ１８ ｒｆｂ遺伝子座、ｉｉ）本明細書に定義される少なくとも１つのグリコシル化コンセンサス配列を含む担体タンパク質（の発現のための核酸構築物）、及びｉｉｉ）本明細書に定義されるオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（の発現のための核酸構築物）のうちの１つ又は２つ以上又は全てを含むように更に改変されている、天然に存在する単離物、例えば臨床単離物に由来し得る。

【0041】

担体タンパク質にコンジュゲートしたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原多糖のバイオコンジュゲートを産生する際に使用するための本発明の宿主細胞は、担体タンパク質上のＮ－グリコシル化部位へのオリゴ糖の移入のためのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（oligosaccharyl transferase、ＯＳＴ）を更に含むことが好ましい。したがって、好ましくは、本明細書において提供される宿主細胞は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＳＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む。本明細書で使用されるオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、脂質結合オリゴ糖を、グリコシル化コンセンサスモチーフを含む新生ポリペプチド鎖の残基、例えば、Ｎ－グリコシル化コンセンサスモチーフを含む新生ポリペプチド鎖のアスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）残基に移入させる酵素であり、このようなＮ－グリコシル化コンセンサスモチーフの例は、配列番号４又はＡｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）である。本出願を通して、Ｎ－グリコシル化モチーフＡｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）について、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸であり得ることが理解されるべきである。好ましくは、そのようなオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、本明細書に記載の担体タンパク質のポリペプチド鎖中の配列番号４のアスパラギン残基にオリゴ糖を移入させる。オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸は、宿主細胞に対してネイティブであり得るか、又は遺伝的アプローチを使用して宿主細胞に導入され得る。好ましい実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、宿主細胞に対して異種である。Ｅ．ｃｏｌｉは、天然にはオリゴサッカリルトランスフェラーゼを含まず、したがって、Ｅ．ｃｏｌｉがバイオコンジュゲートの産生のための宿主細胞として使用される場合、異種オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、例えば遺伝子工学による導入時に、そのような宿主細胞に含まれる。オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、本開示を考慮して当技術分野で公知の任意の供給源に由来し得る。

【0042】

ある特定の好ましい実施形態において、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼである。例えば、一実施形態において、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼである（すなわち、ＰｇｌＢ；例えば、Ｗａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８：１７９０－１７９３を参照されたい；例えば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：３２３１７７５、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｏ８６１５４も参照されたい）。別の実施形態において、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼである（例えば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：７４１０９８６を参照されたい）。

【0043】

具体的な実施形態において、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、国際特許出願公開の国際公開第２０１６／１０７８１８号及び国際公開第２０１６／１０７８１９号に記載されているものなどの、天然（野生型）タンパク質又はその任意のバリアントを含むＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ由来のＰｇｌＢである。ＰｇｌＢは、脂質結合オリゴ糖をコンセンサス配列番号４及びＡｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）中のアスパラギン残基に移入させることができる。特定の実施形態では、ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、本明細書で定義されるオリゴサッカリルトランスフェラーゼを有するポリペプチドであり、このポリペプチドは、配列番号６と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、配列番号６と同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、野生型ＰｇｌＢ中の１つ又は２つ以上の内因性グリコシル化コンセンサス配列が、ＰｇｌＢ自己グリコシル化を回避するように変異されており、例えば変異Ｎ５３４Ｑを含む配列番号６である。本明細書において提供される宿主細胞における使用に適したバリアントＰｇｌＢの例としては、変異Ｎ３１１Ｖを含む配列番号６のＰｇｌＢが挙げられる。

【0044】

担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原多糖のバイオコンジュゲートの産生において使用するための本発明の宿主細胞は、更に好ましくは、グリコシル化コンセンサス配列Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）を含む少なくとも１つのグリコシル化部位、より好ましくは配列番号４を有する少なくとも１つのグリコシル化部位を含む担体タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0045】

いくつかの実施形態では、担体タンパク質は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＰＡ）、Ｅ．ｃｏｌｉフラジェリン（ＦｌｉＣ）、ＣＲＭ１９７、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの解毒溶血素、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシンの解毒バリアント、コレラ毒素Ｂサブユニット（Cholera toxin B subunit、ＣＴＢ）、コレラ毒素、コレラ毒素の解毒バリアント、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓａｔタンパク質、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓａｔタンパク質のパッセンジャードメイン、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅニューモリシン、キーホールリンペットヘモシアニン（Keyhole limpet hemocyanin、ＫＬＨ）、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰｃｒＶ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質（ＯＭＰＣ）、及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤからなる群から選択される。

【0046】

ある特定の実施形態では、担体タンパク質は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの無毒化外毒素Ａ（ＥＰＡ）、又はＣＲＭ１９７であり、好ましくは、担体タンパク質はＥＰＡである。ＥＰＡについては、様々な解毒されたタンパク質変異体が文献に記載されており、担体タンパク質として使用することができる。ある特定の実施形態において、本発明のコンジュゲートにおいて使用されるＥＰＡ担体タンパク質は、タンパク質がより毒性が低く、及び／又はグリコシル化に対してより感受性であるような様式で改変される。例えば、解毒は、Ｌｕｋａｃ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ，５６：３０９５－３０９８、及びＨｏ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ，２：８９－９８に従って、触媒的に必須の残基Ｌ５５２Ｖ及びΔＥ５５３を変異及び欠失させることによって達成することができる。特定の実施形態において、本発明のコンジュゲートの生成において使用される担体タンパク質は、より低い濃度のタンパク質が、例えば、免疫原性組成物において、そのバイオコンジュゲート形態で投与されることを可能にする様式で、担体タンパク質中のグリコシル化部位の数が最適化されるように改変される。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号４を有するグリコシル化コンセンサス配列を含む１～１０個、好ましくは２～４つ、好ましくは４つのグリコシル化部位を含むＥＰＡをコードする。一実施形態では、担体タンパク質は、配列番号３と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、グリコシル化コンセンサス配列Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）を含む、より好ましくは配列番号４を有する１～１０個、好ましくは２～４つ、好ましくは４つのグリコシル化部位を含む。好ましい実施形態では、担体タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＥＰＡを含む。

【0047】

ある特定の好ましい実施形態では、本発明による宿主細胞は、配列番号６を含むオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列及び配列番号３を含む担体タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0048】

担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原多糖のバイオコンジュゲートを産生する際に使用するための本発明の宿主細胞は、更に好ましくは、Ｏ１８抗原多糖構造の合成のためのＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８ ｒｆｂ遺伝子座を含む。

【0049】

Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、Ｏ－抗原生合成に関与する遺伝子産物は、ｒｆｂ遺伝子座によってコードされる。したがって、本明細書において提供される宿主細胞は、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１８ ｒｆｂ遺伝子座、好ましくは血清型Ｏ１８Ａを有するＥ．ｃｏｌｉ株のｒｆｂ遺伝子座のヌクレオチド配列を更に含む。本明細書で使用される場合、「Ｏ１８ ｒｆｂ遺伝子座」及び「Ｏ１８ ｒｆｂ遺伝子クラスター」は、Ｏ１８抗原多糖構造を合成することができる酵素機構を一緒にコードする遺伝子のクラスターを含むグラム陰性細菌ゲノム中の遺伝子座を指す。ｒｆｂ遺伝子座という用語は、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、特にＥ．ｃｏｌｉ由来のゲノム遺伝子座を指す。

【0050】

ある特定の実施形態では、Ｏ１８ｒｆｂ遺伝子座は、宿主細胞に対して異種であり、例えば、宿主細胞の前駆細胞に導入され、好ましくはそのゲノムに組み込まれる。好ましくは、元のｒｆｂ遺伝子クラスターは、それが前駆細胞中に存在する場合、宿主細胞中でＯ１８ｒｆｂ遺伝子クラスターによって置換されて、Ｏ１８のバイオコンジュゲートの産生を可能にする。

【0051】

ある特定の実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原多糖のｒｆｂ遺伝子クラスターは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１８Ａ抗原多糖のｒｆｂ遺伝子クラスターである。したがって、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１８Ａ抗原多糖のｒｆｂ遺伝子クラスターは、配列番号５と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１８Ａ抗原多糖を作製する酵素をコードし、好ましくは、Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書において上で定義した本発明のＷｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。ある特定の実施形態において、ｒｆｂ遺伝子クラスターは、本明細書において上で定義されるような本発明のＷｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であるＷｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼをコードする配列を除いて、配列番号５のヌクレオチド配列を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１８Ａ抗原多糖の反復単位の構造を表１にエントリー（Ｏ１８Ａ）として示す。

【0052】

したがって、ある特定の好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｆｂ遺伝子クラスターを含み、Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書において上で定義された本発明のＷｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。したがって、ある特定の好ましい実施形態では、内因性Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼコード配列は、本明細書において上で定義された本発明のＷｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、本発明のＷｚｙポリメラーゼによって置換されている。内因性Ｗｚｙコード配列の除去及び本発明のＷｚｙポリメラーゼをコードする配列での置換は、当技術分野で一般に知られている遺伝子編集技術を使用することによって達成することができる。

【0053】

一実施形態では、ｗａａＬ遺伝子は、本発明の宿主細胞のゲノムから欠失しているか、又はそのゲノムにおいて機能的に不活性化されている。「ｗａａＬ」及び「ｗａａＬ遺伝子」という用語は、周辺質に位置する活性部位を有する膜結合酵素をコードするＯ－抗原リガーゼ遺伝子を指す。ｗａａＬ遺伝子がコードする酵素は、ウンデカプレニルリン酸（undecaprenylphosphate、ＵＰＰ）結合Ｏ抗原をリピドＡコアに移入させ、リポ多糖を形成する。内因性ｗａａＬ遺伝子（例えば、ΔｗａａＬ株）の欠失又は破壊は、リピドＡへのＯ－抗原の移入を破壊し、代わりに、本発明の宿主細胞において発現される担体タンパク質などの別の利用可能な生体分子へのＯ－抗原の移入を増強することができる。

【0054】

本発明の宿主細胞の一実施形態において、Ｏ１６ Ｏ－抗原グルコシル化に関与するＥ．ｃｏｌｉ ｇｔｒＡＢＳ遺伝子は、宿主細胞ゲノムから欠失されるか、又は宿主細胞ゲノムにおいて機能的に不活性化される。好ましい実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｔｒＡＢＳ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０宿主細胞のゲノムから欠失されるか、又はそのゲノムにおいて機能的に不活性化される。異なる血清型におけるｇｔｒＡ及びｇｔｒＢ遺伝子は、高度に相同であり、交換可能であるが、ｇｔｒＳ遺伝子は、血清型特異的Ｏ－抗原グリコシルトランスフェラーゼをコードする。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０において、ＧｔｒＳは、グルコース（Ｇｌｃ）残基を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１６ Ｏ－抗原のａ－Ｌ－Ｒｈａ－（１→３）－Ｄ－Ｇ１ｃＮＡｃモチーフのＧｌｃＮＡｃ糖に移入し得る。

【0055】

当業者によって理解されるように、本発明の宿主細胞に含まれる本発明のポリペプチド、例えば担体タンパク質、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチド及びｒｆｂ遺伝子クラスターの他の酵素は、本発明のポリペプチドをコードする核酸の形態で宿主細胞に好都合に提供される。本発明のポリペプチドをコードする核酸は、好ましくは核酸構築物、具体的には本発明のポリペプチドの発現のための１つ又は２つ以上の発現カセットを含む発現構築物であり、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、本発明の宿主細胞におけるポリペプチドの発現のための発現制御配列に作動可能に連結されている。好適な発現制御配列は上で言及されており、通常、少なくともプロモーターを含む。プロモーターは、構成的プロモーターであってもよく、又はその活性が調節され得る、例えば、温度変化若しくは細胞内のある特定の化学物質若しくはタンパク質の存在などのある特定の条件下において抑制若しくは誘導され得るプロモーターであってもよく、これらは全て、当該技術分野において周知である。核酸構築物は、染色体外（例えば、プラスミド又は他のベクター）であり得るか、又は核酸構築物は、本発明の宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。本発明の宿主細胞におけるポリペプチドの発現のための核酸構築物の構築及び／又は合成のための分子生物学的方法は、一般に当技術分野において周知である。

【0056】

任意選択で、Ｏ－抗原の鎖長は、天然のＷｚｚ Ｏ－抗原鎖長調節機構を操作することによって、例えば、Ｗｚｚ Ｏ－抗原鎖長調節因子を過剰発現又は補足することによって、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ｗｚｚＢ遺伝子を、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ及びＳｈｉｇｅｌｌａ内の種、又はＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ対応物、ｆｅｐＥ又は他のｗｚｚホモログ（例えば、米国特許出願公開第２０１８／００９９０３８号、国際公開第２０２０／０３９３５９号を参照されたい）由来のその対応物のうちの１つで置き換えることによって操作することができ、それによって例えば、Ｗｚｙタンパク質の更なる過剰発現の有無にかかわらず、Ｏ－抗原の反復単位の数を増加させることができる。ｗｚｚ様遺伝子の効果は、これらの種について文献に記載されている。しかしながら、これはいずれも、良好な免疫原性を有するバイオコンジュゲートを得るために必要とされず、好ましい実施形態において、本発明によるバイオコンジュゲートは、Ｗｚｚ鎖長調節機構の操作なしに調製される。

【0057】

一実施形態では、Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドと、本明細書において上で定義された示された位置における特定のアミノ酸とを含む本発明の宿主細胞を用いて産生されるＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原バイオコンジュゲートの収率は、配列番号１のアミノ酸配列を有する参照Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼを発現する他の点では同一の宿主細胞を用いて同じ条件を使用した場合に産生される収率の少なくとも１０５％、１１０％、１２０％、１５０％又は２００％である。

【0058】

一実施形態では、Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドと、本明細書において上で定義された示された位置の特定のアミノ酸とを含む本発明の宿主細胞を用いて産生されたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原バイオコンジュゲートのグリコシル化部位の占有率は、配列番号１のアミノ酸配列を有する参照Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼを発現する他の点では同一の宿主細胞を用いて同じ条件を使用した場合に産生されたバイオコンジュゲートのグリコシル化部位の占有率よりも改善される。したがって、一実施形態では、本発明の宿主細胞を用いて産生され、担体タンパク質が４つのグリコシル化部位を含むＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原バイオコンジュゲートを含む組成物において、バイオコンジュゲート分子の少なくとも５０、５５、６０、６５、又は７０％が、ジ－、トリ－、又はテトラ－グリコシル化されている、すなわち、占有されているグリコシル化部位のうちの２～４つを有する。好ましくは、この実施形態において、担体タンパク質は、配列番号３に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％の配列同一性を有し、４つのグリコシル化部位を含み、グリコシル化コンセンサス配列Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）を含み、より好ましくは配列番号４を有するアミノ酸配列を含む。この実施形態において最も好ましくは、担体タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＥＰＡを含む。ある特定の実施形態において、このような組成物は、Ｏ１８バイオコンジュゲートを産生する宿主細胞の周辺質画分である。好ましくは、そのような組成物は、Ｏ１８抗原（「ｓＥＰＡ」）の約１～３反復単位の平均数を有するバイオコンジュゲートを２０％、１５％、１０％以下含む。

【0059】

更なる態様において、本発明は更に、本発明の宿主細胞を使用して、担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原多糖のバイオコンジュゲートを産生する方法に関する。したがって、一実施形態は、担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原多糖のバイオコンジュゲートを産生するための方法に関し、好ましくは、方法は、ａ）本発明の宿主細胞を培養してバイオコンジュゲートを産生する工程を少なくとも含む。一実施形態では、工程ａ）において、本発明の宿主細胞は、バイオコンジュゲートの産生をもたらす条件下で培養される。ある特定の実施形態において、方法は、Ｏ１８Ａバイオコンジュゲートの産生に関する。本発明の宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原多糖に共有結合した担体タンパク質を含むバイオコンジュゲートの発現に適した条件下で培養され、そのような条件は当業者に公知であり、例えば、国際公開第２０１５／１２４７６９号又は国際公開第２０２０／１９１０８２号に以前に記載されているような方法を使用する。

【0060】

一実施形態において、Ｏ１８バイオコンジュゲートを産生するための方法は、ｂ）バイオコンジュゲートを回収する工程を更に含む。Ｏ１８バイオコンジュゲートは本開示を考慮して当技術分野で公知の任意の方法を使用して、組換え宿主細胞又は培養培地から単離、分離、及び／又は精製することができる。例えば、Ｏ１８バイオコンジュゲートは、タンパク質の精製のための当技術分野で公知の任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アニオン交換、親和性及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度、又はタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術によって精製することができる。例えば、Ｓａｒａｓｗａｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．，（ｐ．１－１８）を参照されたく、国際公開第２００９／１０４０７４号に記載されている方法も参照されたい。更に、バイオコンジュゲートは、精製を容易にするために異種ポリペプチド配列に融合され得る。バイオコンジュゲートを精製し、特徴付ける方法は、例えば、上記のＩｈｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０、及び国際公開第２００６／１１９９８７号、国際公開第２００９／１０４０７４号、特に国際公開第２０１５／１２４７６９号及び国際公開第２０１７／０３５１８１号、並びに国際公開第２０２０／１９１０８２（Ａ１）号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0061】

一実施形態において、Ｏ１８バイオコンジュゲートを産生するための方法は、ｃ）回収されたバイオコンジュゲートを医薬組成物に製剤化する工程を更に含む。バイオコンジュゲートの医薬組成物への製剤化は、通常、本発明のバイオコンジュゲートと、本明細書において以下により詳細に記載される少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物を調製することを含む。一実施形態において、Ｏ１８バイオコンジュゲートを産生するための方法は、バイオコンジュゲートを含む医薬組成物へのアジュバントの添加を更に含む。医薬組成物への組み込みに適したアジュバントは、本明細書において以下により詳細に記載される。

【0062】

一実施形態では、Ｏ１８バイオコンジュゲートを産生するための方法は、担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ－抗原多糖の１つ又は２つ以上の追加のコンジュゲート又はバイオコンジュゲートを医薬組成物に添加して、多価組成物、好ましくは多価バイオコンジュゲート組成物を得ることを更に含む。したがって、担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ－抗原多糖の１つ又は２つ以上の追加のコンジュゲートは、好ましくは、Ｏ１８以外、又はより好ましくはＯ１８Ａ以外の血清型のＥ．ｃｏｌｉ Ｏ－抗原多糖のバイオコンジュゲートである。好ましい実施形態において、１つ又は２つ以上の更なるコンジュゲート又はバイオコンジュゲートは、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ２５及びＯ７５からなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つ全てのＯ－抗原多糖を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ－抗原多糖血清型の詳細な説明は、本明細書において以下に提供される（表１も参照されたい）。そのような追加のコンジュゲート又はバイオコンジュゲートは、以前に記載されているように、例えば、国際公開第２０２０／１９１０８２（Ａ１）号に記載されているように得ることができる。

【0063】

したがって、好ましい一実施形態では、Ｏ１８バイオコンジュゲートを産生するための方法は、担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ－抗原多糖の追加のバイオコンジュゲートを医薬組成物に添加して多価組成物を得ることを更に含み、多価バイオコンジュゲート組成物は、（ｉ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８Ａ抗原多糖のバイオコンジュゲート、（ｉｉ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１Ａ抗原多糖のバイオコンジュゲート、（ｉｉｉ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ２抗原多糖のバイオコンジュゲート、（ｉｖ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉグルコシル化Ｏ４抗原多糖のバイオコンジュゲート、（ｖ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ６Ａ抗原多糖のバイオコンジュゲート、（ｖｉ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１５抗原多糖のバイオコンジュゲート、（ｖｉｉ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１６抗原多糖のバイオコンジュゲート、（ｖｉｉｉ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ２５Ｂ抗原多糖のバイオコンジュゲート、及び（ｉｘ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ７５抗原多糖のバイオコンジュゲートを含む。一実施形態では、多価バイオコンジュゲート組成物は、（ｘ）担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ８抗原多糖のバイオコンジュゲートを更に含む。好ましくは、これらの実施形態において、各バイオコンジュゲート（ｉ）～（ｉｘ）中の担体タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。

【0064】

別の態様では、本発明は、Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ活性及び本明細書において上に定義した表示の位置に特定のアミノ酸を有する（すなわち、（ｉ）Ｉ１９９、Ｋ３７７及びＡ３９５、又は（ｉｉ）Ｔ１９９、Ｋ３７７、及びＶ３９５、又は（ｉｉｉ）Ｔ１９９、Ｋ３７７、及びＡ３９５、又は（ｉｖ）Ｉ１９９、Ｋ３７７、及びＶ３９５、又は（ｖ）Ｉ１９９、Ｍ３７７、及びＡ３９５を有し、いずれの場合も、それらの位置は配列番号１の位置に対応する）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原バイオコンジュゲートのグリコシル化部位の占有率を改善するためのポリペプチドを含む本発明の宿主細胞の使用に関する。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原バイオコンジュゲートのグリコシル化部位の占有率の改善は、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有する参照Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼを発現する他の点では同一の宿主細胞を用いた同じ条件を使用した場合に産生されるバイオコンジュゲートのグリコシル化部位の占有率と比較して、短い反復単位を有するバイオコンジュゲートの量の減少（表１のＯ１８構造中のｎはわずか約１～３である）及び／又は好ましくは担体タンパク質中の少なくとも２つ又はそれ以上のＮ－グリコシル化コンセンサス配列にコンジュゲートされたＯ１８抗原多糖を含む担体タンパク質からなるバイオコンジュゲートの量の増加（好ましくは、表１のＯ１８構造中のｎは少なくとも５である）によって観察することができる。

【0065】

別の態様では、本発明は、本明細書で上述した本発明の宿主細胞を使用してバイオコンジュゲートを産生するための本発明の方法において得られるか、又は得ることができる担体タンパク質にコンジュゲートしたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原多糖のバイオコンジュゲートに関する。

【0066】

本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」、「グリココンジュゲート」及び「バイオコンジュゲート」という用語は、担体タンパク質に共有結合したＥ．ｃｏｌｉ Ｏ－抗原を含むコンジュゲート化産物を指す。本発明のコンジュゲートは、好ましくは、宿主細胞において産生されるコンジュゲート化産物であるバイオコンジュゲートであり、ここで、Ｏ－抗原及び担体タンパク質は、宿主細胞の機構によって生合成的に産生され、そしてＯ－抗原はまた、担体タンパク質に酵素的に（例えば、宿主細胞の酵素によるＮ結合を介して）共有結合される。

【0067】

更に別の態様では、本発明は、本明細書で上述した本発明の宿主細胞を使用してバイオコンジュゲートを産生するための本発明の方法において得られる又は得ることができる担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原多糖のバイオコンジュゲートを含む組成物に関する。

【0068】

一実施形態では、担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原のバイオコンジュゲートを含む組成物は、担体タンパク質が４つのグリコシル化部位を含み、組成物中の担体タンパク質分子の少なくとも５０、５５、６０、６５、又は７０％が、Ｎ－グリコシル化配列の少なくとも２つにおいてＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原反復でグリコシル化されている、すなわち、ジ－、トリ－、又はテトラ－グリコシル化されており、したがって、占有されたグリコシル化部位の２～４つを有するバイオコンジュゲートを含む組成物である。好ましくは、この実施形態において、担体タンパク質は、配列番号３に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％の配列同一性を有し、４つのグリコシル化部位を含み、グリコシル化コンセンサス配列Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）を含み、より好ましくは配列番号４を有するアミノ酸配列を含む。この実施形態において最も好ましくは、担体タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＥＰＡを含む。ある特定の実施形態において、このような組成物は、Ｏ１８バイオコンジュゲートを産生する宿主細胞の周辺質画分である。好ましくは、そのような組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原多糖（「ｓＥＰＡ」）の約１～３反復単位の平均数を有するバイオコンジュゲートを２０％、１５％、１０％以下含む。

【0069】

一実施形態では、担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原のバイオコンジュゲートを含む組成物は、バイオコンジュゲートに加えて、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。本発明の（医薬）組成物は、担体、充填剤、保存剤、可溶化剤、及び／又は希釈剤を含む、任意の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。生理食塩水並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液も、特に注射溶液用の液体担体として採用され得る。好適な賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。好適な医薬担体の更なる例は、当業者に周知であり、教科書に記載されている。

【0070】

本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される担体」という用語は、本発明による組成物の有効性にも本発明による組成物の生物学的活性にも干渉しない非毒性性材料を指す。「薬学的に許容される担体」は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、ミクロスフェア、リポソーム封入体、又は医薬製剤において使用するための当該技術分野において周知である他の材料を含み得る。薬学的に許容される担体の特性は、特定の用途の投与経路によって決まる点は理解されよう。特定の実施形態によれば、本開示を考慮して、ワクチンにおける使用に好適な任意の薬学的に許容される担体を本発明で使用することができる。好適な賦形剤としては、滅菌水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組み合わせ、並びに安定剤、例えば、ヒト血清アルブミン（Human Serum Albumin、ＨＳＡ）又は他の好適なタンパク質及び還元糖が挙げられるが、これらに限定されない。

【0071】

好適な緩衝液としては、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水、リン酸緩衝液、及びスクロースリン酸グルタミン酸緩衝液が挙げられる。例えば、トリス緩衝生理食塩水（Tris-buffered saline、ＴＢＳ）ｐＨ７．４（例えば、トリス、ＮａＣｌ及びＫＣｌを、例えば、それぞれ２５ｍＭ、１３７ｍＭ及び２．７ｍＭで含有する）；ｐＨ約７．０の約１０ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液、約５％（ｗ／ｖ）のソルビトール、約１０ｍＭのメチオニン、及び約０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含むリン酸緩衝液；又はｐＨ約７．０の約１０ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液、約８％（ｗ／ｖ）スクロース、約１ｍＭのＥＤＴＡ、及び約０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含むリン酸緩衝液。

【0072】

好適な塩には、例えば、トリス－塩酸塩、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、リン酸ナトリウム、グルタミン酸一ナトリウム及びアルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、又はそのようなアルミニウム塩の混合物）のうちの１つ又は２つ以上が含まれる。

【0073】

好適な防腐剤としては、防腐剤の０．００１％～０．０１％（ｗ／ｖ）のフェノール、塩化ベンゼトニウム、２－フェノキシエタノール、又はチメロサールが挙げられる。他の実施形態では、防腐剤は含まれない。

【0074】

組成物は、対象への意図された投与経路に適するように製剤化され得る。例えば、組成物は、皮下、非経口、経口、皮内、経皮、結腸直腸、腹腔内、膣内、直腸、静脈内、頬側、鼻腔内、気管内、筋肉内、局所、経皮、又は肺投与、好ましくは筋肉内投与に適するように製剤化することができる。

【0075】

本発明の組成物は、投与の指示書とともに、容器、パック、又はディスペンサに入れることができる。

【0076】

ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、使用前に保管され得、例えば、組成物は、凍結保管（例えば、約－２０℃又は約－７０℃）され得るか、冷蔵条件（例えば、約２～８℃、例えば、約４℃）で保管され得るか、又は室温で保管され得る。

【0077】

医薬組成物は、任意選択で、アジュバントを含んでもよく、又は任意選択で、アジュバントと組み合わせて投与されてもよい。本発明の組成物と組み合わせて投与するためのアジュバントは、免疫原性組成物の投与の前に、それと同時に、又はその後に、投与することができる。他の好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物はアジュバントを含まず、及び／又はアジュバントと組み合わせて投与されない。

【0078】

本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、本発明の組成物とともに又は組成物の一部として投与された場合、担体タンパク質に結合したＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原を含むコンジュゲートに対する免疫応答を増加、増強及び／又は高めるが、アジュバント化合物が単独で投与された場合、コンジュゲートに対する免疫応答を生成しない化合物を指す。アジュバントは、例えば、リンパ球動員、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞の刺激、並びに／あるいは抗原提示細胞の刺激を含むいくつかの機構によって免疫応答を増強することができる。

【0079】

アジュバントの具体例としては、アルミニウム塩（ミョウバン）（アルミニウム水酸化物、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、及び酸化アルミニウムなど、これには、ミョウバン又はナノミョウバン製剤を含むナノ粒子が含まれる）、リン酸カルシウム、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、又は３－ｄｅ－Ｏ－アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ－ＭＰＬ）（例えば、英国特許第２２２０２１１号、欧州特許第０９７１７３９号、欧州特許第１１９４１６６号、米国特許第６４９１９１９号を参照されたい）、ＡＳ０１、ＡＳ０２、ＡＳ０３、及びＡＳ０４（全てＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ；例えば、ＡＳ０４については欧州特許第１１２６８７６号、米国特許第７３５７９３６号、ＡＳ０２については、欧州特許第０６７１９４８号、欧州特許第０７６１２３１号、米国特許第５７５０１１０号を参照されたい）、イミダゾピリジン化合物（国際公開第２００７／１０９８１２号を参照されたい）、イミダゾキノキサリン化合物（国際公開第２００７／１０９８１３号を参照されたい）、デルタ－イヌリン、ＳＴＩＮＧ活性化合成環状ジ－ヌクレオチド（例えば、米国特許出願公開第２０１５／００５６２２４号）、レシチンとカルボマーホモポリマーとの組み合わせ（例えば、米国特許第６６７６９５８号）、及び、任意選択でＱＳ７と組み合わせた、Ｑｕｉｌ Ａ及びＱＳ２１などのサポニン（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、アジュバントは、フロイントアジュバント（完全又は不完全）である。ある特定の実施形態において、アジュバントは、Ｑｕｉｌ－Ａ、例えば、Ｂｒｅｎｎｔａｇ（現Ｃｒｏｄａ）又はＩｎｖｉｖｏｇｅｎから市販されているものなどを含む。ＱｕｉｌＡは、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja saponaria Molina）の木に由来するサポニンの水抽出性画分を含有する。これらのサポニンは、共通のトリテルペノイド骨格構造を有する、トリテルペノイドサポニンの群に属する。サポニンは、Ｔ依存性抗原並びにＴ非依存性抗原に対する強力なアジュバント応答、並びに強力な細胞傷害性ＣＤ８＋リンパ球応答を誘導し、粘膜抗原に対する応答を増強することが公知である。これらはまた、コレステロール及びリン脂質と組み合わされて、免疫刺激性複合体（immunostimulatory complexe、ＩＳＣＯＭ）を形成し得、ＱｕｉｌＡアジュバントは、異なる起源に由来する広範な抗原に対する抗体媒介性免疫応答及び細胞媒介性免疫応答の両方を活性化し得る。ある特定の実施形態では、アジュバントはＡＳ０１、例えばＡＳ０１Ｂである。ＡＳ０１は、ＭＰＬ（３－Ｏ－デスアシル－４’－モノホスホリルリピドＡ）、ＱＳ２１（キラヤ・サポナリア・モリナ、画分２１）、及びリポソームを含む、アジュバント系である。ある特定の実施形態において、ＡＳ０１は、市販されているか（ＧＳＫ）、又は参照により本明細書に組み込まれる国際公開第９６／３３７３９号に記載されるように作製され得る。ある特定のアジュバントは、エマルジョンを含み、これは、２つの非混和性流体、例えば、油及び水の混合物であり、そのうちの一方が、他方の内側に小滴として懸濁され、界面活性剤によって安定化されている。水中油型エマルジョンは、油の小滴を取り囲む連続相を形成する水を有するが、油中水型エマルジョンは、連続相を形成する油を有する。ある特定のエマルジョンは、スクアレン（代謝可能な油）を含む。ある特定のアジュバントは、ブロックコポリマーを含み、これは、２つのモノマーが一緒にクラスター化して繰り返し単位のブロックを形成する場合に形成されるコポリマーである。ブロックコポリマー、スクアレン、及び微粒子安定剤を含む油中水型エマルジョンの例は、ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）であり、これは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手することができる。任意選択で、エマルジョンは、更なる免疫刺激成分、例えば、ＴＬＲ４アゴニストと組み合わせられ得るか、又はそれを含み得る。ある特定のアジュバントは、ＭＦ５９（例えば、欧州特許第０３９９８４３号、米国特許第６２９９８８４号、米国特許第６４５１３２５号を参照されたい）及びＡＳ０３においても使用される水中油型エマルジョン（例えば、スクアレン又はラッカセイ油など）であり、任意選択で、免疫刺激剤、例えば、ＡＳ０２におけるモノホスホリルリピドＡ及び／又はＱＳ２１と組み合わされる（Ｓｔｏｕｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６，８６－９１を参照されたい）。アジュバントの更なる例は、免疫刺激剤、例えば、例えばＡＳ０１Ｅ及びＡＳ０１ＢにおけるＭＰＬ及びＱＳ２１を含有するリポソームである（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２０６７５８号）。アジュバントの他の例は、ＣｐＧ、並びにイミダゾキノリン（例えば、イミキモド及びＲ８４８）である。例えば、Ｒｅｅｄ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ，１９：１５９７－１６０８を参照されたい。ある特定の実施形態では、アジュバントはＴｈ１アジュバントである。

【0080】

ある特定の実施形態において、アジュバントは、サポニン、好ましくは、キラヤ・サポナリアから得られるサポニンの水抽出可能な画分を含む。ある特定の実施形態において、アジュバントは、ＱＳ－２１を含む。

【0081】

ある特定の実施形態において、アジュバントは、ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含有する。ＴＬＲ４アゴニストは、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｉｒｅｔｏｎ ＧＣ ａｎｄ ＳＧ Ｒｅｅｄ，２０１３，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ １２：７９３－８０７を参照されたい。ある特定の実施形態において、アジュバントは、リピドＡ、又はそのアナログ若しくは誘導体を含む、ＴＬＲ４アゴニストである。

【0082】

例えば、ＴＬＲ４アゴニストを含むアジュバントは、様々な手法で、例えば、油中水型（ｗ／ｏ）エマルジョン又は水中油型（ｏ／ｗ）エマルジョン（例は、ＭＦ５９、ＡＳ０３である）などのエマルジョン、安定（ナノ）エマルジョン（stable (nano-) emulsion、ＳＥ）、脂質懸濁液、リポソーム、（ポリマー）ナノ粒子、ビロソーム、吸着ミョウバン（alum adsorbed）、水性製剤（aqueous formulation、ＡＦ）などで製剤化することができ、アジュバント中の免疫調節分子及び／又は免疫原のための様々な送達系を表す。

【0083】

免疫刺激性ＴＬＲ４アゴニストは、任意選択で、他の免疫調節成分、例えば、サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ７、ＱＳ２１、Ｍａｔｒｉｘ Ｍ、Ｉｓｃｏｍｓ、Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘなど）、アルミニウム塩、他のＴＬＲのための活性化因子（例えば、イミダゾキノリン、フラジェリン、ｄｓＲＮＡアナログ、ＴＬＲ９アゴニスト、例えばＣｐＧなど）などと組み合わされ得る（例えば、Ｒｅｅｄ ｅｔ ａｌ，２０１３（上記）を参照されたい）。

【0084】

本明細書で使用される場合、「リピドＡ」という用語は、ＬＰＳ分子の疎水性脂質部分を指し、この部分は、グルコサミンを含み、ケトシド結合により、ＬＰＳ分子の内部コアにおいてケト－デオキシオクツロソン酸塩に連結されており、ＬＰＳ分子がグラム陰性菌の外膜の外葉に固定されている。ＬＰＳ及びリピドＡ構造の合成の概要については、例えば、Ｒａｅｔｚ，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７５：５７４５－５７５３，Ｒａｅｔｚ ＣＲ ａｎｄ Ｃ Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，２００２，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７１：６３５－７００、米国特許第５，５９３，９６９号及び同第５，１９１，０７２号を参照されたい。リピドＡは、本明細書で使用される場合、天然に存在するリピドＡ、その混合物、アナログ、誘導体、及び前駆体を含む。この用語は、単糖、例えば、リピドＸと称されるリピドＡの前駆体、二糖リピドＡ、ヘプタアシルリピドＡ、ヘキサアシルリピドＡ、ペンタアシルリピドＡ、テトラアシルリピドＡ、例えば、リピドＩＶＡと称されるリピドＡのテトラアシル前駆体、脱リン酸化リピドＡ、モノホスホリルリピドＡ、ジホスホリルリピドＡ、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ及びＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のリピドＡを含む。いくつかの免疫活性化リピドＡ構造は、６つのアシル鎖を含む。グルコサミン糖に直接的に結合された４つの一級アシル鎖は、通常、１０～１６炭素長の３－ヒドロキシアシル鎖である。２つの追加のアシル鎖が、多くの場合、一級アシル鎖の３－ヒドロキシ基に結合される。Ｅ．ｃｏｌｉリピドＡは、例として、典型的には、糖に結合した４つのＣ１４ ３－ヒドロキシアシル鎖、並びにそれぞれ、２’位及び３’位において一級アシル鎖の３－ヒドロキシ基に結合した１つのＣ１２及び１つのＣ１４を有する。

【0085】

本明細書で使用される場合、「リピドＡアナログ又は誘導体」という用語は、リピドＡに構造及び免疫学的活性が類似しているが、必ずしも天然に存在するわけではない分子を指す。リピドＡアナログ又は誘導体は、例えば、短縮若しくは縮合されるように、及び／又は別のアミン糖残基、例えば、ガラクトサミン残基で置換されたグルコサミン残基を有するように、還元末端にグルコサミン－１－リン酸の代わりに２－デオキシ－２－アミノグルコン酸を含有するように、４’位にリン酸の代わりにガラクツロン酸部分を有するように、改変されていてもよい。リピドＡアナログ又は誘導体は、細菌から単離されたリピドＡから、例えば、化学的誘導によって調製されてもよく、又は例えば、最初に好ましいリピドＡの構造を決定し、そのアナログ若しくは誘導体を合成することによって化学的に合成されてもよい。リピドＡアナログ又は誘導体もまた、ＴＬＲ４アゴニストアジュバントとして有用である（例えば、Ｇｒｅｇｇ ＫＡ ｅｔ ａｌ，２０１７，ＭＢｉｏ ８，ｅＤＤ４９２－１７，ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＢｉｏ．００４９２－１７を参照されたい）。

【0086】

例えば、リピドＡアナログ又は誘導体は、例えば、アルカリ処理によって、野生型リピドＡ分子の脱アシル化によって、得ることができる。リピドＡアナログ又は誘導体は、例えば、細菌から単離されたリピドＡから調製することができる。そのような分子はまた、化学的に合成することもできる。リピドＡアナログ又は誘導体の別の例は、リピドＡ生合成及び／又はリピドＡ改変に関与する酵素の変異、又はその欠失若しくは挿入を有する細菌細胞から単離されたリピドＡ分子である。

【0087】

ＭＰＬ及び３Ｄ－ＭＰＬは、リピドＡの毒性を弱めるように改変されたリピドＡアナログ又は誘導体である。リピドＡ、ＭＰＬ、及び３Ｄ－ＭＰＬは、長鎖脂肪酸が結合した糖骨格を有し、この骨格は、グリコシド連結した２つの６炭糖、及び４位のホスホリル部分を含む。典型的には、５～８つの長鎖脂肪酸（通常、１２～１４個の炭素原子）が糖骨格に結合している。天然源の誘導に起因して、ＭＰＬ又は３Ｄ－ＭＰＬは、様々な脂肪酸長を有するいくつかの脂肪酸置換パターン、例えば、ヘプタアシル、ヘキサアシル、ペンタアシルなどの複合体又は混合物として存在し得る。これはまた、本明細書に記載される他のリピドＡアナログ又は誘導体のいくつかについても当てはまるが、合成リピドＡバリアントもまた規定され得、そして均質であり得る。ＭＰＬ及びその製造は、例えば、米国特許第４，４３６，７２７号に記載されている。３Ｄ－ＭＰＬは、例えば、米国特許第４，９１２，０９４（Ｂ１）号に記載されており、３位の還元末端グルコサミンにエステル結合している３－ヒドロキシミリスチン酸アシル残基の選択的除去によってＭＰＬとは異なる（例えば、米国特許第４，９１２，０９４号（Ｂ１）号の第１欄のＭＰＬの構造と第６欄の３Ｄ－ＭＰＬとを比較されたい）。当該技術分野では、３Ｄ－ＭＰＬが使用されることが多いが、ＭＰＬと呼ばれることもある（例えば、Ｉｒｅｔｏｎ ＧＣ ａｎｄ ＳＧ Ｒｅｅｄ，２０１３（上記）の表１の最初の構造は、この構造をＭＰＬ（登録商標）と称しているが、実際には、３Ｄ－ＭＰＬの構造を示している）。

【0088】

リピドＡ（アナログ、誘導体）の例としては、ＭＰＬ、３Ｄ－ＭＰＬ、ＲＣ５２９（例えば、欧州特許第１３８５５４１号）、ＰＥＴ－リピドＡ、ＧＬＡ（グリコピラノシル脂質アジュバント、合成二糖脂質；例えば、米国特許出願公開第２０１０／０３１０６０２号、米国特許第８７２２０６４号）、ＳＬＡ（例えば、Ｃａｒｔｅｒ Ｄ ｅｔ ａｌ，２０１６，Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：ｅ１０８（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｔｉ．２０１６．６３）、ヒトワクチンのためにＴＬＲ４リガンドを最適化するための構造機能アプローチが記載されている）、ＰＨＡＤ（リン酸化ヘキサアシル二糖；その構造は、ＧＬＡの構造と同じである）、３Ｄ－ＰＨＡＤ、３Ｄ－（６－アシル）－ＰＨＡＤ（３Ｄ（６Ａ）－ＰＨＡＤ）（ＰＨＡＤ、３Ｄ－ＰＨＡＤ、及び３Ｄ（６Ａ）ＰＨＡＤは、合成リピドＡバリアントであり、例えば、ａｖａｎｔｉｌｉｐｉｄｓ．ｃｏｍ／ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ／ａｄｊｕｖａｎｔｓを参照されたく、これは、これらの分子の構造も提供する）、Ｅ６０２０（ＣＡＳ番号２８７１８０－６３－６）、ＯＮＯ４００７、ＯＭ－１７４などが挙げられる。３Ｄ－ＭＰＬ、ＲＣ５２９、ＰＥＴ－リピドＡ、ＧＬＡ／ＰＨＡＤ、Ｅ６０２０、ＯＮＯ４００７、及びＯＭ－１７４の例示的な化学構造については、例えば、Ｉｒｅｔｏｎ ＧＣ ａｎｄ ＳＧ Ｒｅｅｄ，２０１３（上記）の表１を参照されたい。ＳＬＡの構造については、例えば、Ｒｅｅｄ ＳＧ ｅｔ ａｌ，２０１６，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４１：８５－９０の図１を参照されたい。ある特定の好ましい実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストアジュバントは、３Ｄ－ＭＰＬ、ＧＬＡ、又はＳＬＡから選択されるリピドＡアナログ又は誘導体を含む。ある特定の実施形態では、リピドＡアナログ又は誘導体はリポソーム中に製剤化される。

【0089】

リピドＡアナログ又は誘導体を含む例示的なアジュバントとしては、ＧＬＡ－ＬＳＱ（合成ＭＰＬ［ＧＬＡ］、ＱＳ２１、リポソームとして製剤化された脂質）、ＳＬＡ－ＬＳＱ（合成ＭＰＬ［ＳＬＡ］、ＱＳ２１、リポソームとして製剤化された脂質）、ＧＬＡ－ＳＥ（合成ＭＰＬ［ＧＬＡ］、スクアレン油／水エマルジョン）、ＳＬＡ－ＳＥ（合成ＭＰＬ［ＳＬＡ］、スクアレン油／水エマルジョン）、ＳＬＡ－ナノミョウバン（合成ＭＰＬ［ＳＬＡ］、アルミニウム塩）、ＧＬＡ－ナノミョウバン（合成ＭＰＬ［ＧＬＡ］、アルミニウム塩）、ＳＬＡ－ＡＦ（合成ＭＰＬ［ＳＬＡ］、水性懸濁液）、ＧＬＡ－ＡＦ（合成ＭＰＬ［ＧＬＡ］、水性懸濁液）、ＳＬＡ－ミョウバン（合成ＭＰＬ［ＳＬＡ］、アルミニウム塩）、ＧＬＡ－ミョウバン（合成ＭＰＬ［ＧＬＡ］、アルミニウム塩）、並びにＡＳ０１（ＭＰＬ、ＱＳ２１、リポソーム）、ＡＳ０２（ＭＰＬ、ＱＳ２１、油／水エマルジョン）、ＡＳ２５（ＭＰＬ、油／水エマルジョン）、ＡＳ０４（ＭＰＬ、アルミニウム塩）、及びＡＳ１５（ＭＰＬ、ＱＳ２１、ＣｐＧ、リポソーム）を含むＧＳＫ ＡＳｘｘシリーズのアジュバントのうちのいくつかが挙げられる。例えば、国際公開第２０１３／１１９８５６号、国際公開第２００６／１１６４２３号、米国特許第４，９８７，２３７号、米国特許第４，４３６，７２７号、米国特許第４，８７７，６１１号、米国特許第４，８６６，０３４号、米国特許第４，９１２，０９４号、米国特許第４，９８７，２３７号、米国特許第５１９１０７２号、米国特許第５５９３９６９号、米国特許第６，７５９，２４１号、米国特許第９，０１７，６９８号、米国特許第９，１４９，５２１号、米国特許第９，１４９，５２２号、米国特許第９，４１５，０９７号、米国特許第９，４１５，１０１号、米国特許第９，５０４，７４３号、Ｒｅｅｄ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１３、上記を参照されたい。

【0090】

非糖脂質分子、例えば、ネオセプチン－３などの合成分子又はＬｅＩＦなどの天然分子もまた、ＴＬＲ４アゴニストアジュバントとして使用することができ、例えば、Ｒｅｅｄ ＳＧ ｅｔ ａｌ，２０１６（上記）を参照されたい。

【0091】

一実施形態では、担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原のバイオコンジュゲートを含む本発明の組成物は、担体タンパク質に共有結合したＥ．ｃｏｌｉ Ｏ－抗原多糖を含む少なくとも１つの追加のコンジュゲートを更に含む。担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ－抗原多糖の１つ又は２つ以上の追加のバイオコンジュゲートは、好ましくは、Ｏ１８以外、又はより好ましくはＯ１８Ａ以外の血清型のＥ．ｃｏｌｉ Ｏ－抗原多糖のバイオコンジュゲートである。好ましい実施形態において、１つ又は２つ以上の更なるコンジュゲート又はバイオコンジュゲートは、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ２５及びＯ７５からなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つ全てのＯ－抗原多糖を含む。

【0092】

好ましい実施形態では、追加のコンジュゲート中の１つ又は２つ以上の追加のＥ．ｃｏｌｉ Ｏ－抗原は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１抗原多糖（例えば、Ｏ１Ａ抗原多糖）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ２抗原多糖、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ４抗原多糖（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉグルコシル化Ｏ４抗原多糖）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ６抗原多糖（例えば、Ｏ６Ａ抗原多糖）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ８抗原多糖、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５抗原多糖、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１６抗原多糖、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ２５抗原多糖（例えば、Ｏ２５Ａ又はＯ２５Ｂ抗原多糖、好ましくはＯ２５Ｂ抗原多糖）、及びＥ．ｃｏｌｉ Ｏ７５抗原多糖からなる群から選択される。好ましくは、更なるＯ－抗原多糖の各々は、担体タンパク質に共有結合される。ある特定の実施形態では、担体タンパク質の各々、すなわち各コンジュゲートの担体タンパク質は、ＥＰＡ担体タンパク質である。好ましくは、追加のコンジュゲートのうちの１つ又は２つ以上、好ましくは全てがバイオコンジュゲートである。

【0093】

本明細書で使用される場合、「Ｏ１８」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ１８抗原（Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１８）を指し、Ｏ１８Ａ、Ｏ１８Ｂ、Ｏ１８Ａ１、又はＯ１８Ｂ１抗原（Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１８の４つのサブ血清型の各々）のいずれかであり得、好ましい実施形態において、Ｏ１８は、Ｏ１８Ａを指す。Ｏ１８Ａ抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ１８Ａ）の構造を含んでもよく、式中、ｎは、１～１００、例えば３～５０、好ましくは５～４０、例えば７～２５、例えば１０～２０の整数である。「Ｏ１Ａ」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ１Ａ抗原（Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１のサブ血清型）を指す。「Ｏ２」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ２抗原（Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２）を指す。「Ｏ４」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ４抗原（Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ４）を指し、これはグルコース側鎖を含んでも含まなくてもよい（それぞれグルコシル化Ｏ４抗原多糖（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）及び非グルコシル化Ｏ４抗原多糖（Ｏ４－Ｇｌｃ－）と呼ばれ、好ましい実施形態において、Ｏ４はＯ４－Ｇｌｃ＋である）。「Ｏ６Ａ」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ６Ａ抗原（Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ６のサブ血清型）を指す。「Ｏ８」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ８抗原（Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ８）を指す。「Ｏ１５」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ１５抗原（Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１５）を指す。「Ｏ１６」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ１６抗原（Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１６）を指す。「Ｏ２５Ｂ」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＯ２５Ｂ抗原（Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２５のサブ血清型）を指す。「Ｏ７５」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ７５抗原（Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ７５）を指す。

【0094】

本出願を通して言及されるＥ．ｃｏｌｉ Ｏ－抗原多糖の構造を以下の表１に示す。各Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ－抗原多糖についての単一の繰り返し単位を示す。

【0095】

【表1-1】

【0096】

【表1-2】

^１各ｎは独立して、１～１００の整数、例えば１～５０、１～４０、１～３０、１～２０及び１～１０、３～５０、３～４０、例えば少なくとも５、例えば５～４０、例えば７～３０、例えば７～２５、例えば１０～２０である。

【0097】

本明細書に記載される全ての単糖は、当該分野で公知のそれらの一般的な意味を有する。単糖は、Ｄ又はＬ配置を有し得る。Ｄ又はＬが特定されていない場合、糖はＤ配置を有すると理解される。単糖は、典型的には、当技術分野で一般に知られており、使用されている略語によって呼ばれる。例えば、Ｇｌｃはグルコースを指し、Ｄ－ＧｌｃはＤ－グルコースを指し、Ｌ－ＧｌｃはＬ－グルコースを指す。単糖の他の一般的な略語には、Ｒｈａ、ラムノース；ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ－アセチルグルコサミン；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ－アセチルガラクトサミン；Ｆｕｃ、フコース；Ｍａｎ、マンノース；Ｍａｎ３Ｍｅ、３－Ｏ－メチル－マンノース；Ｇａｌ、ガラクトース；ＦｕｃＮＡｃ、Ｎ－アセチルフコシルアミン；及びＲｉｂ、リボースが含まれる。接尾辞「ｆ」はフラノースを意味し、接尾辞「ｐ」はピラノースを意味する。

【0098】

本発明によるＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原多糖に共有結合した担体タンパク質のバイオコンジュゲートを含む組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ－抗原多糖に共有結合した担体タンパク質の少なくとも１つの追加のコンジュゲートを更に含むことができ、ある特定の実施形態では、少なくとも１つの追加のコンジュゲートは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１Ａ抗原多糖、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ２抗原多糖、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ４抗原多糖、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ６Ａ抗原多糖、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ８抗原多糖、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５抗原多糖、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１６抗原多糖、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ２５Ｂ抗原多糖、及びＥ．ｃｏｌｉ Ｏ７５抗原多糖からなる群から選択されるＥ．ｃｏｌｉ Ｏ－抗原多糖を含む。このような組成物は、コンジュゲートを一緒に添加して多価コンジュゲート組成物を得ることによって調製することができる。好ましくは、追加のコンジュゲートの１つ又は２つ以上、好ましくは全てもバイオコンジュゲートである。

【0099】

ある特定の実施形態では、Ｏ１Ａ抗原多糖（例えば、単離された形態で、又はグリココンジュゲート、好ましくはバイオコンジュゲートの一部として）は、本明細書で提供される（医薬）組成物（例えば、本明細書に記載される方法によって得られるＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８バイオコンジュゲートを含む組成物）中に存在する。Ｏ１Ａ抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ１Ａ）の構造を含んでもよく、式中、ｎは、１～１００、例えば３～５０、好ましくは５～４０、例えば７～２５、例えば１０～２０の整数である。好ましくは、Ｏ１Ａ抗原多糖は、コンジュゲート、より好ましくはバイオコンジュゲートの一部であり、担体タンパク質、例えばＥＰＡに共有結合している。

【0100】

ある特定の実施形態では、Ｏ２抗原多糖（例えば、単離された形態で、又はグリココンジュゲート、好ましくはバイオコンジュゲートの一部として）は、本明細書で提供される（医薬）組成物（例えば、本明細書に記載の方法によって得られるＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８バイオコンジュゲートを含む組成物）中に存在する。Ｏ２抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ２）の構造を含んでもよく、式中、ｎは、１～１００、例えば３～５０、好ましくは５～４０、例えば７～２５、例えば１０～２０の整数である。好ましくは、Ｏ２抗原多糖は、コンジュゲート、より好ましくはバイオコンジュゲートの一部であり、担体タンパク質、例えば、ＥＰＡに共有結合している。

【0101】

ある特定の実施形態では、Ｏ４抗原多糖（例えば、単離された形態で、又はグリココンジュゲート、好ましくはバイオコンジュゲートの一部として）は、本明細書で提供される（医薬）組成物（例えば、本明細書に記載される方法によって得られるＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８バイオコンジュゲートを含む組成物）中に存在する。Ｏ－抗原の構造的改変は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ４血清型内に存在することが知られている。特に、いくつかのＯ４血清型は、分枝グルコース単位を有する改変Ｏ－抗原を発現する。本明細書で使用される場合、「グルコシル化Ｏ４抗原」、「グルコシル化Ｏ４抗原多糖」、「グルコース分岐Ｏ４」、「Ｏ４－Ｇｌｃ＋抗原多糖」、「Ｇｌｃ＋Ｏ４」、及び「Ｏ４－Ｇｌｃ＋抗原」は、グルコース分岐を有するＯ４抗原を指す。いくつかのＯ４血清型は、このような分枝グルコース単位を有さないＯ４抗原を有し、これは、本明細書において「非グルコシル化Ｏ４抗原」、「非グルコシル化Ｏ４抗原多糖」、「Ｏ４－Ｇｌｃ－抗原」、又は「Ｏ４－Ｇｌｃ－」と呼ばれる。本明細書において「Ｏ４抗原」を指す場合、これはＯ４－Ｇｌｃ＋抗原又はＯ４－Ｇｌｃ－抗原のいずれかであり得る。好ましい実施形態において、Ｏ４は、Ｏ４－Ｇｌｃ＋抗原を指す。Ｅ．ｃｏｌｉ非グルコシル化Ｏ４抗原及びＥ．ｃｏｌｉグルコシル化Ｏ４抗原の構造は、それぞれ表１の式（Ｏ４－Ｇｌｃ－）及び（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）に示されており、式中、ｎは１～１００、例えば３～５０、好ましくは５～４０、例えば７～２５、例えば１０～２０の整数である。Ｏ４－Ｇｌｃ＋バイオコンジュゲートを特異的に産生する方法は、国際公開第２０２０／１９１０８２（Ａ１）号に記載されており、その全体が本明細書に組み込まれる。好ましくは、Ｏ４抗原多糖は、コンジュゲート、より好ましくはバイオコンジュゲートの一部であり、担体タンパク質、例えば、ＥＰＡに共有結合している。

【0102】

ある特定の実施形態では、Ｏ６Ａ抗原多糖（例えば、単離された形態で、又はグリココンジュゲート、好ましくはバイオコンジュゲートの一部として）は、本明細書で提供される（医薬）組成物（例えば、本明細書に記載される方法によって得られるＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８バイオコンジュゲートを含む組成物）中に存在する。Ｏ６Ａ抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ６Ａ）の構造を含んでもよく、式中、ｎは、１～１００、例えば３～５０、好ましくは５～４０、例えば７～２５、例えば１０～２０の整数である。好ましくは、Ｏ６Ａ抗原多糖は、コンジュゲート、より好ましくはバイオコンジュゲートの一部であり、担体タンパク質、例えばＥＰＡに共有結合している。

【0103】

ある特定の実施形態では、Ｏ８抗原多糖（例えば、単離された形態で、又はグリココンジュゲート、好ましくはバイオコンジュゲートの一部として）は、本明細書で提供される（医薬）組成物（例えば、本明細書に記載される方法によって得られるＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８バイオコンジュゲートを含む組成物）中に存在する。Ｏ８抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ８）の構造を含んでもよく、式中、ｎは、１～１００、例えば３～５０、好ましくは５～４０、例えば７～２５、例えば１０～２０の整数である。好ましくは、Ｏ８抗原多糖は、コンジュゲート、より好ましくはバイオコンジュゲートの一部であり、担体タンパク質、例えば、ＥＰＡに共有結合している。

【0104】

ある特定の実施形態では、Ｏ１５抗原多糖（例えば、単離された形態で、又はグリココンジュゲート、好ましくはバイオコンジュゲートの一部として）は、本明細書で提供される（医薬）組成物（例えば、本明細書に記載される方法によって得られるＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８バイオコンジュゲートを含む組成物）中に存在する。Ｏ１５抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ１５）の構造を含んでもよく、式中、ｎは、１～１００、例えば３～５０、好ましくは５～４０、例えば７～２５、例えば１０～２０の整数である。好ましくは、Ｏ１５抗原多糖は、コンジュゲート、より好ましくはバイオコンジュゲートの一部であり、担体タンパク質、例えばＥＰＡに共有結合している。

【0105】

ある特定の実施形態では、Ｏ１６抗原多糖（例えば、単離された形態で、又はグリココンジュゲート、好ましくはバイオコンジュゲートの一部として）は、本明細書で提供される（医薬）組成物（例えば、本明細書に記載される方法によって得られるＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８バイオコンジュゲートを含む組成物）中に存在する。Ｏ１６抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ１６）の構造を含んでもよく、式中、ｎは、１～１００、例えば３～５０、好ましくは５～４０、例えば７～２５、例えば１０～２０の整数である。好ましくは、Ｏ１６抗原多糖は、コンジュゲート、より好ましくはバイオコンジュゲートの一部であり、担体タンパク質、例えばＥＰＡに共有結合している。担体タンパク質に共有結合したＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１６抗原多糖のコンジュゲートは、Ｌ－Ｒｈａ糖の２位にある程度のアセチル化を有し得る。コンジュゲート中のＯ１６抗原多糖のこのＯ－アセチル化の程度は、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、例えば少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％である。

【0106】

ある特定の実施形態では、Ｏ２５Ｂ抗原多糖（例えば、単離された形態で、又はグリココンジュゲート、好ましくはバイオコンジュゲートの一部として）は、本明細書で提供される（医薬）組成物（例えば、本明細書に記載の方法によって得られるＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８バイオコンジュゲートを含む組成物）中に存在する。Ｏ２５Ｂ抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ２５Ｂ）の構造を含んでもよく、式中、ｎは、１～１００、例えば３～５０、好ましくは５～４０、例えば７～２５、例えば１０～２０の整数である。好ましくは、Ｏ２５Ｂ抗原多糖は、コンジュゲート、より好ましくはバイオコンジュゲートの一部であり、担体タンパク質、例えば、ＥＰＡに共有結合している。上記のＯ１６抗原多糖と同様に、担体タンパク質に共有結合したＥ．ｃｏｌｉ Ｏ２５Ｂ抗原多糖のコンジュゲートは、Ｌ－Ｒｈａ糖の２位にある程度のアセチル化を有することができる。コンジュゲート中のＥ．ｃｏｌｉ Ｏ２５Ｂ抗原多糖のこのＯ－アセチル化の程度は、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、例えば少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％である。

【0107】

ある特定の実施形態において、Ｏ７５抗原多糖（例えば、単離された形態で、又はグリココンジュゲート、好ましくはバイオコンジュゲートの一部として）は、本明細書で提供される（医薬）組成物（例えば、本明細書に記載される方法によって得られるＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８バイオコンジュゲートを含む組成物）中に存在する。Ｏ７５抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ７５）の構造を含み得、式中、ｎは、１～１００、例えば３～５０、好ましくは５～４０、例えば７～２５、例えば１０～２０の整数である。好ましくは、Ｏ７５抗原多糖は、コンジュゲート、より好ましくはバイオコンジュゲートの一部であり、担体タンパク質、例えばＥＰＡに共有結合している。

【0108】

ある特定の実施形態では、本発明による組成物は、本発明によるＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１８抗原多糖に共有結合した担体タンパク質を含むバイオコンジュゲートを含み、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ－抗原多糖に共有結合した担体タンパク質を含む１つ又は２つ以上の追加のコンジュゲート、好ましくは４～２５個のそのような追加のコンジュゲートを更に含む。好ましくは、更なるコンジュゲートは、上記のようなＥ．ｃｏｌｉ Ｏ－抗原多糖のうちの１つ又は２つ以上、最も好ましくは、少なくともＯ２５Ｂ、Ｏ１Ａ、Ｏ２、及びＯ６を含む。特に好ましいのは、少なくとも７つ、好ましくは少なくとも８つの追加のコンジュゲートを含む組成物であり、これらの追加のコンジュゲートの好ましくはいくつか、最も好ましくは全てがバイオコンジュゲートである。

【0109】

好ましい実施形態では、本発明による組成物は、少なくともＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４（好ましくはグルコシル化Ｏ４）、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８（好ましくはＯ１８Ａ）、Ｏ２５Ｂ及びＯ７５抗原多糖、好ましくは、それぞれ独立して担体タンパク質、例えばＥＰＡに共有結合したＯ１Ａ、Ｏ２、グルコシル化Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ及びＯ７５抗原多糖のコンジュゲートを含む（すなわち、少なくとも９価の組成物）。ある特定の実施形態では、そのような組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ８抗原多糖を、好ましくはコンジュゲート、好ましくはバイオコンジュゲートの形態で更に含む。ある特定の実施形態において、このような組成物（Ｏ８抗原多糖を含むか又は含まない）は、他の血清型由来の更なるＥ．ｃｏｌｉ Ｏ－抗原多糖、好ましくは担体タンパク質にコンジュゲート化されたもの、好ましくはバイオコンジュゲート、例えば、２～１０の更なる血清型由来のものを含む。ある特定の実施形態では、少なくとも９つのバイオコンジュゲートを含む医薬組成物が提供され、各バイオコンジュゲートは、異なる血清型由来のＥ．ｃｏｌｉ Ｏ－抗原多糖に共有結合した担体タンパク質を含み、血清型は、Ｏ１８Ａ（及びＯ１８Ａバイオコンジュゲートは、本発明による方法を使用して調製された本発明によるバイオコンジュゲートである）、Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４－Ｇｌｃ＋、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ２５Ｂ、及びＯ７５を含む。ある特定の実施形態では、担体タンパク質はＥＰＡ、例えば配列番号３のアミノ酸配列を有するＥＰＡである。

【0110】

本発明による組成物は、任意選択で、免疫応答が望まれる更なるタンパク質、炭水化物及びリポ多糖を含むか、それらと組み合わせられるか、又はそれらと一緒に投与されてもよい。

【0111】

別の態様では、本発明は、医薬品として使用するための本発明の医薬組成物に関する。

【0112】

更なる態様において、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉに対する免疫応答を誘導するための医薬品としての、本明細書に記載の医薬組成物の使用に関する。

【0113】

本明細書で使用される場合、「免疫原」又は「免疫原性」又は「抗原」という用語は、単独で、アジュバントと組み合わせて、又はディスプレイビヒクル上に提示されるかのいずれかで、レシピエントへの投与の際に、それ自体に対する免疫学的応答を生成することができる分子を記載するために、互換可能に使用される。

【0114】

本明細書で使用される場合、抗原又は組成物に対する「免疫学的応答」又は「免疫応答」は、対象における、抗原又は組成物中に存在する抗原に対する体液性及び／又は細胞性免疫応答の発生を指す。

【0115】

ある特定の実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ感染によって引き起こされる疾患の予防又は治療における使用のためのものである。好ましい実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ感染によって引き起こされる疾患は、侵襲性腸管外病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥｘＰＥＣ）疾患（ＩＥＤ）である。

【0116】

本明細書で使用される場合、「腸管外病原性Ｅ．ｃｏｌｉ」又は「ＥｘＰＥＣ」という用語は、一般に、胃腸管の外側の身体部位に侵入し、コロニー形成し、疾患を誘導する遺伝的に関連する病原性Ｅ．ｃｏｌｉ株を指す。ＥｘＰＥＣ細菌には、尿路疾患性（ＵＰＥＣ）Ｅ．ｃｏｌｉ、新生髄膜炎菌（ＮＭＥＣ）Ｅ．ｃｏｌｉ、敗血症関連（ＳｅＰＥＣ）Ｅ．ｃｏｌｉ、接着性侵襲的（ＡＩＥＣ）Ｅ．ｃｏｌｉ、及び鳥類病原性（ＡＰＥＣ）Ｅ．ｃｏｌｉが含まれる。ＥｘＰＥＣ又はＥｘＰＥＣ感染に関連する疾患には、尿路感染（urinary tract infection、ＵＴＩ）、手術部位感染、菌血症、腹部又は骨盤内感染、例えば腹腔内感染（intra-abdominal infection、ＩＡＩ）、肺炎、院内肺炎、骨髄炎、蜂巣炎、腎盂腎炎、創傷感染、髄膜炎、新生児髄膜炎、腹膜炎、胆管炎、軟部組織感染、化膿性筋炎、敗血症性関節炎及び敗血症が含まれるが、これらに限定されない。

【0117】

更なる態様において、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉ感染によって引き起こされる疾患、特に侵襲性腸管外病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥｘＰＥＣ）疾患（ＩＥＤ）を、必要とする対象において予防又は治療する方法に関し、その方法は、有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む。

【0118】

本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、対象において所望される生物学的又は医薬的応答を誘起する活性成分又は構成成分の量を指す。有効量は、記載される目的に対して経験的及び日常的な方法で決定することができる。例えば、任意選択でインビトロアッセイを用いて、最適な用量範囲の特定に役立てることができる。

【0119】

本明細書で使用される場合、「対象」又は「患者」とは、本発明の実施形態による方法又は組成物によってワクチン接種される、又はワクチン接種された、任意の動物、好ましくは、哺乳動物、最も好ましくは、ヒトを意味する。本明細書で使用される場合、「哺乳動物」という用語は、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなど、最も好ましくは、ヒトが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、対象は、ヒト成人である。本明細書で使用される場合、「ヒト成人」という用語は、１８歳以上のヒトを指す。ある特定の実施形態では、対象は、（ｉ）約１６～約５０歳の間、例えば、約１６～約３５歳の間のヒト女性、
（ｉｉ）５０歳超、又は５５歳超、又は６０歳超、又は６５歳超のヒト成人、
（ｉｉｉ）再発ＵＴＩに罹患しているヒト対象、
（ｉｖ）Ｅ．ｃｏｌｉ菌血症若しくは敗血症を有するか、又はそれらになるリスクがあるヒト対象、
（ｖ）カテーテル使用を必要とする状態を有するヒト対象、
（ｖｉ）事前にスケジュールされた手術を受けるヒト対象、
（ｖｉｉ）ヒト閉経後女性、又は
（ｖｉｉｉ）糖尿病を有するヒト対象、のうちの１つ又は２つ以上である。

【0120】

更に別の態様では、本発明はまた、Ｅ．ｃｏｌｉ感染によって引き起こされる疾患、特に侵襲性腸管外病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥｘＰＥＣ）疾患（ＩＥＤ）を予防又は治療するためのワクチン又は医薬品の製造のための、本明細書に記載の医薬組成物の使用に関する。

【0121】

「背景技術」において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載し、これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。

【0122】

配列の説明：

【0123】

【表2-1】

【0124】

【表2-2】

【0125】

【表2-3】

【0126】

【表2-4】

【0127】

【表2-5】

【0128】

【表2-6】

【実施例】

【0129】

以下の本発明の実施例は、本発明の本質を更に説明するためのものである。以下の実施例は本発明を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の請求項によって定められる点を理解されたい。

【0130】

Ｅ．ｃｏｌｉにおけるバイオコンジュゲーションシステムが最近開発されており、このシステムでは、抗原多糖及び担体タンパク質の両方がインビボで合成され、続いて、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ酵素であるオリゴサッカリルトランスフェラーゼＰｇｌＢの活性を介してインビボでコンジュゲートされる（Ｗａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００６）ｖ．１０３，ｐｐ．７０８８－９３）。このＮ結合型タンパク質グリコシル化系は、多様な多糖を担体タンパク質に移入させることができ、それが発現される細菌からバイオコンジュゲートを精製する方法を可能にする。バイオコンジュゲーションは、Ｅ．ｃｏｌｉ ４価Ｏ－抗原候補ワクチンのためのコンジュゲート多糖を産生するための使用に成功している（Ｐｏｏｌｍａｎ ａｎｄ Ｗａｃｋｅｒ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（２０１６）ｖ．２１３（１），ｐｐ．６－１３、国際公開第２０１５／１２４７６９号、国際公開第２０１７／０３５１８１号）。１０種のバイオコンジュゲート（Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ及びＯ７５、ＥｘＰＥＣ１０Ｖと称される組成物）を含む組成物が記載されており、臨床試験中である（例えば、国際公開第２０２０／１９１０８２（Ａ１）号）。バイオコンジュゲートの各々は、Ｏ血清型依存性収率変動を示す別個の産生株によって産生される。いくつかのＯ－血清型のＯ－抗原産生株について、基質特異性が改変されたＣ．ｊｅｊｕｎｉグリコシルトランスフェラーゼＰｇｌＢのバリアントを発現させることによって、収率の改善を得ることができた（例えば、国際公開第２０１６／１０７８１８号、国際公開第２０１６／１０７８１９号を参照されたい）。しかしながら、ＥｘＰＥＣ１０Ｖ組成物のためにバイオコンジュゲートが作製された１０の血清型の中で最も低いバイオコンジュゲート産生収率を示したＯ１８ Ｏ－血清型については、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＰｇｌＢタンパク質のバリアントの使用及び代替ＰｇｌＢホモログの使用は、収率の改善をもたらさなかった。更に、Ｏ１８バイオコンジュゲーション収率を増加させることを目的とした更なるプラットフォーム改変は、この目標を達成するのに成功しなかった。これらの改変の中には、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）－１－ホスファートのウンデカプレニルホスファート（Ｕｎｄ－Ｐ）への移入を触媒してＵｎｄ－Ｐ－Ｐ－ＧｌｃＮＡｃを形成することによってＯ単位生合成を開始するタンパク質であるＷｅｃＡの過剰発現があった。加えて、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２バイオコンジュゲーションプラットフォーム株に存在する天然Ｗｚｚ Ｏ－抗原鎖長調節因子を他のグラム陰性細菌種のＯ－抗原鎖長調節因子に置き換えて、Ｏ１８Ａ Ｏ－抗原鎖長の増加をもたらしたが、産物収率の有意な増加はもたらされなかった。

【0131】

実施例１：収率が改善されたＯ１８バイオコンジュゲート産生株
しかしながら、本発明者らは、Ｏ１８バイオコンジュゲート産物収率が増加した株を得、これらの株におけるＷｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼが、既存のＯ１８バイオコンジュゲート産生株（配列番号１を有するＷｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼを有していた）におけるＷｚｙと比較してアミノ酸変異を有していたことを見出した。これに基づいて、本発明者らは、以前に記載された（国際公開第２０２０／１９１０８２号を参照されたい）Ｏ１８バイオコンジュゲート産生株と比較して、そのＷｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼにおける３つのアミノ酸変異を除いて他の点では同一である、Ｏ１８バイオコンジュゲートの新規産生株を作製した。特に、以前に記載された株におけるＷｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼは、アミノ酸トレオニン（Ｔ）、メチオニン（Ｍ）、及びバリン（Ｖ）を、それぞれ、１９９位、３７７位、及び３９５位に有した（すなわち、以前に記載された株のＷｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼは、配列番号１に示される）が、新しい産生株は、アミノ酸イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、及びアラニン（Ａ）を、これらのそれぞれの位置に有した。

【0132】

浸透圧ショック後（すなわち、収率の妥当な定量化が可能であるプロセスの初期の時点）に実施した２００Ｌバイオリアクターの濾過した周辺質画分中のＯ１８バイオコンジュゲートの収率は、以前に記載された株に対して新しい株については約２．４倍高かった。

【0133】

４つのＮ－グリコシル化コンセンサス配列を有するＥＰＡ担体タンパク質のグリコシル化部位の占有率は、以前に記載された株に対して新しい株において増加し、すなわち、新しい株は、より多くのジ－、トリ－、及びテトラ－グリコシル化ＥＰＡ担体タンパク質を誘導した（例えば、図１）。

【0134】

実施例２：改変Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼの構築
次に、本発明者らは、Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼアミノ酸配列の突然変異誘発研究を行い、Ｏ１８バイオコンジュゲートの収率及びグリコシル化パターンに影響を及ぼす、配列番号１のＷｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼ配列中のこれら３つの位置におけるアミノ酸置換の特定の組み合わせを同定した。

【0135】

Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼの配列番号１のアミノ酸配列における１９９位、３７７位及び３９５位のうちの１つ又は２つ以上におけるアミノ酸置換の種々の組み合わせを、標準的な手順を用いる部位特異的変異誘発を用いて作製した。生成された様々な組み合わせを表３に示す。

【0136】

実施例３：改変Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼを用いたＯ－抗原多糖の産生
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２バイオコンジュゲート産生株Ｗ３１１０の染色体に挿入されたＥ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１８Ａ（配列番号５として提供される例）由来のｒｆｂクラスターに存在するｗｚｙ遺伝子を、相同組換えに基づく遺伝子改変技術によって、表３に示す変異を有する配列番号１を有する改変Ｗｚｙ Ｏ－抗原ポリメラーゼをコードする遺伝子バリアントで置き換えた。Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１８Ａ由来のｒｆｂクラスターに加えて、Ｅ．ｃｏｌｉバイオコンジュゲート産生株Ｗ３１１０は、ＥＰＡ担体タンパク質をコードする核酸（配列番号３を有する）、及びオリゴサッカリルトランスフェラーゼＰｇｌＢをコードする核酸（配列番号６を有する）を更に含んでいた。Ｏ１８Ａ多糖バイオコンジュゲートを、例えば国際公開第２０２０／１９１０８２号に以前に記載されているように、振盪フラスコ培養物において産生し、浸透圧ショックを使用して抽出した。

【0137】

実施例４：Ｏ１８－バイオコンジュゲートの特性評価
Ｏ１８Ａ多糖バイオコンジュゲート発現のために誘導されたＷｚｙバリアント（表３に示される変異を有する）を含有するＥ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２バイオコンジュゲート産生株Ｗ３１１０の振盪フラスコ培養物からの周辺質抽出物を、バイオコンジュゲートの免疫検出のためにＯ１８Ａ特異的モノクローナル抗体を使用するキャピラリー電気泳動イムノアッセイに供した。総産物シグナルに対するＭＷによって決定されるｓＥＰＡ、モノグリコシル化ＥＰＡ及びより高次の形態のグリコシル化ＥＰＡ（ジ－／トリ－／テトラグリコシル化ＥＰＡ）に対応するピークのシグナル強度に基づいて、各試料について相対定量を行った（表３）。

【0138】

表３．野生型及び示されるように配列番号１の１９９、３７７及び３９５の位置のうちの１つ又は２つ以上にアミノ酸置換を有する変異型Ｗｚｙ Ｏ抗原ポリメラーゼ、並びにＯ１８バイオコンジュゲートのグリコシル化パターンに対するそれらの効果。改善されたグリコシル化パターンをもたらすバリアントを太字で示す。

【0139】

【表3】

【0140】

実施例５：新しい産生株によるＯ１８バイオコンジュゲート、並びに免疫原性活性を有するＥｘＰＥＣ９Ｖ及びＥｘＰＥＣ１０Ｖ多価産物の産生
Ｏ１８Ａバイオコンジュゲートを産生するための新しい株を使用してＯ１８Ａバイオコンジュゲートを産生し、浸透圧ショック後に周辺質からＯ１８Ａバイオコンジュゲートを抽出し、クロマトグラフィーに供して宿主細胞タンパク質を除去し、抽出したバイオコンジュゲートを使用して、本質的に国際公開第２０２０／１９１０８２号（その中の実施例８）に記載されているように、このＯ１８Ａバイオコンジュゲートを原薬として含む医薬組成物を調製した。

【0141】

新規Ｏ１８Ａ原薬を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ－抗原Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４（ｇｌｃ＋）、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ２５Ｂ、及びＯ７５の、場合によってはＯ８も含む他のバイオコンジュゲートの原薬とも混合して、多価（９価、それぞれ１０価）製剤を得た。これらの製剤は、ウサギに投与すると、Ｏ－抗原が組成物中に存在するＥ．ｃｏｌｉ血清型に対する抗体を誘導した。したがって、本発明（の方法）に従って（得られた）バイオコンジュゲート及び組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに対する免疫応答を誘導するのに好適であることが実証された。

【図1】

【配列表】

2024514074000001.app

【国際調査報告】