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▶ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-28
(54)【発明の名称】ＩＬ－１３ＲＡ２キメラ抗原受容体および使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240321BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240321BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240321BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240321BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240321BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240321BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20240321BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240321BHJP
C12N 5/0786 20100101ALI20240321BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240321BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240321BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20240321BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20240321BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240321BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240321BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240321BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240321BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240321BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K14/705 ZNA
C07K19/00
C12N15/13
C12N15/12
C12N15/63 Z
C12N15/867 Z
C12N5/0783
C12N5/0786
C12N5/10
C07K16/28
C07K14/725
C07K16/30
C07K16/46
A61P35/00
A61P43/00 121
A61K45/00
A61K35/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023560806
(86)(22)【出願日】2022-04-01
(85)【翻訳文提出日】2023-11-28
(86)【国際出願番号】 US2022023112
(87)【国際公開番号】W WO2022212879
(87)【国際公開日】2022-10-06
(31)【優先権主張番号】63/169,575
(32)【優先日】2021-04-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】324002926
【氏名又は名称】ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】プーリー， ラジ ケー．
(72)【発明者】
【氏名】ジョシ， バラトクマール エイチ．
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA92Y
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA19
4C084MA02
4C084MA17
4C084MA66
4C084NA05
4C084ZB212
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC202
4C084ZC751
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB64
4C087BB65
4C087MA17
4C087MA66
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZC75
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA41
4H045CA42
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
免疫療法、特にＩＬ－１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体およびがんを処置するためのそれらの使用を提供する。ＩＬ－１３Ｒα２に特異的に結合する単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、ＩＬ－１３Ｒα２ ｓｃＦｖを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＣＡＲをコードする核酸、ＣＡＲをコードする核酸を含むベクター、およびＣＡＲを発現する免疫細胞を提供する。ＩＬ－１３Ｒα２ ｓｃＦｖ－ＣＡＲを発現する免疫細胞を単独でまたは他のがん治療と組み合わせて対象に投与することを含む、がんを有する対象を処置する方法も提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
インターロイキン－１３受容体α２（ＩＬ－１３Ｒα２）に特異的に結合する単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）であって、前記ｓｃＦｖが、それぞれ配列番号１のアミノ酸位置３１～３５、５０～６６、および９９～１０７の可変重鎖（ＶＨ）ドメイン相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列、ならびにそれぞれ配列番号１のアミノ酸位置１５７～１６７、１８３～１８９、および２２２～２２９の可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）。
【請求項2】
前記アミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１に記載のｓｃＦｖ。
【請求項3】
前記アミノ酸配列が、配列番号１を含む、請求項１または２に記載のｓｃＦｖ。
【請求項4】
前記ｓｃＦｖが、ＩＬ－１３Ｒα２を発現する細胞に結合する、請求項１～３のいずれか１項に記載のｓｃＦｖ。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項に記載のｓｃＦｖをコードする、核酸分子。
【請求項6】
配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項7】
配列番号２を含む、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項8】
請求項５～７のいずれか１項に記載の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項9】
キメラ抗原受容体であって、（ａ）請求項１～４のいずれか１項に記載のｓｃＦｖを含む抗原結合ドメインと、
（ｂ）ヒンジドメインと、
（ｃ）膜貫通ドメインと、
（ｄ）１つまたはそれを超えるシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインと、
を含む、キメラ抗原受容体。
【請求項10】
シグナルペプチドを更に含む、請求項９に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項11】
前記シグナルペプチドが、ＣＤ８αシグナルペプチドである、請求項１０に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項12】
前記１またはそれを超えるシグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８ドメイン、４－１ＢＢドメイン、ＣＤ３ζドメイン、またはそれらの２もしくはそれより多くの任意の組み合わせを含む、請求項９～１１のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項13】
前記１またはそれを超えるシグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８ドメイン、４－１ＢＢドメインおよびＣＤ３ζドメインを含む、請求項１２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項14】
前記ヒンジドメインが、ＣＤ８αヒンジドメインを含む、請求項９～１３のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項15】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８膜貫通ドメインである、請求項９～１４のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項16】
配列番号３または配列番号３のアミノ酸２２～５３８と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９～１５のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項17】
配列番号３または配列番号３のアミノ酸２２～５３８を含む、請求項９～１６のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項18】
請求項９～１７のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体をコードする、核酸分子。
【請求項19】
配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項20】
配列番号４を含む、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項21】
請求項１８～２０のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項22】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項２１に記載のベクター。
【請求項23】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項２２に記載のベクター。
【請求項24】
請求項９～１７のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体を発現する、免疫細胞。
【請求項25】
請求項１８～２０のいずれか１項に記載の核酸、または請求項２１～２３のいずれか１項に記載のベクターを含む、免疫細胞。
【請求項26】
前記免疫細胞が、末梢血試料から得られる、請求項２４または請求項２５に記載の免疫細胞。
【請求項27】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはマクロファージである、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項28】
ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ細胞を産生する方法であって、免疫細胞の集団を、請求項２１～２３のいずれか１項に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトすることを含む、方法。
【請求項29】
前記免疫細胞の集団が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、またはマクロファージの集団である、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、またはマクロファージが、対象の末梢血試料から得られる、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
がんを有する対象を処置する方法であって、有効量の請求項２４～２７のいずれか１項に記載の免疫細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項32】
前記免疫細胞が、がんを有する前記対象に対して自家である、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記対象が、ＩＬ－１３Ｒα２を発現するがんを有する、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記対象が、固形腫瘍を有する、請求項３１～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
前記対象が、膵臓がん、神経膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、卵巣がん、腎細胞癌、子宮がん、前立腺がん、乳がん、黒色腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、カポジ肉腫、または副腎癌を有する、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項36】
手術、放射線、化学療法、または追加の免疫療法のうちの１またはそれより多くで前記対象を処置することを更に含む、請求項３１～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項37】
ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、細胞周期阻害剤もしくはチェックポイント阻害剤、アドレノメデュリン、ＩＬ－１３－ＰＥ免疫毒素、またはそれらの２もしくはそれより多くの任意の組み合わせを前記対象に投与することを更に含む、請求項３１～３５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
これは、参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年４月１日に出願された米国仮出願第６３／１６９，５７５号の利益を主張する。
これは、参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年４月１日に出願された米国仮出願第６３／１６９，５７５号の利益を主張する。
【0002】
技術分野
本開示は、免疫療法、特にＩＬ－１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体およびがんを処置するためのそれらの使用に関する。
本開示は、免疫療法、特にＩＬ－１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体およびがんを処置するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0003】
背景
ＩＬ－１３Ｒα２は、サイトカインインターロイキン－１３（ＩＬ－１３）および既知の腫瘍抗原に対する高親和性受容体である。がんにおけるＩＬ－１３Ｒα２発現の重要性は完全には理解されていないが、ＩＬ－１３Ｒα２は、悪性神経膠腫、頭頸部がん、カポジ肉腫、腎細胞癌、卵巣癌、乳がんおよび膵臓がんを含む様々なヒトがんにおいて過剰発現していることが示され、このことは、ＩＬ－１３Ｒα２をがん免疫療法の潜在的な標的とする。
ＩＬ－１３Ｒα２は、サイトカインインターロイキン－１３（ＩＬ－１３）および既知の腫瘍抗原に対する高親和性受容体である。がんにおけるＩＬ－１３Ｒα２発現の重要性は完全には理解されていないが、ＩＬ－１３Ｒα２は、悪性神経膠腫、頭頸部がん、カポジ肉腫、腎細胞癌、卵巣癌、乳がんおよび膵臓がんを含む様々なヒトがんにおいて過剰発現していることが示され、このことは、ＩＬ－１３Ｒα２をがん免疫療法の潜在的な標的とする。
【0004】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞療法は、様々な血液がんを処置するための有望な免疫療法戦略となっている。ＣＡＲ－Ｔ細胞は白血病およびリンパ腫等の血液悪性疾患に有効であるが、今日まで、ヒト固形がんでは非常に限られた活性が見られている。固形腫瘍におけるＣＡＲ－Ｔ細胞の標的化の改善は、単独で、または腫瘍間質を標的化する他の薬剤（骨髄由来サプレッサー細胞、腫瘍関連マクロファージおよび線維芽細胞を含む腫瘍微小環境）と組み合わせて、ＣＡＲ－Ｔ免疫療法の分野における大きな進歩を意味するであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
開示の概要
ＩＬ－１３Ｒα２は、いくつかのがんにおいて有意にアップレギュレートされており、したがって、ＩＬ－１３Ｒα２は、様々ながんを処置するための免疫療法の標的である。ＩＬ－１３Ｒα２を発現する細胞を特異的に標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を本明細書中に提供する。これらのＣＡＲは、ＩＬ－１３Ｒα２を発現または過剰発現するがんを標的とする免疫療法に使用することができる。
ＩＬ－１３Ｒα２は、いくつかのがんにおいて有意にアップレギュレートされており、したがって、ＩＬ－１３Ｒα２は、様々ながんを処置するための免疫療法の標的である。ＩＬ－１３Ｒα２を発現する細胞を特異的に標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を本明細書中に提供する。これらのＣＡＲは、ＩＬ－１３Ｒα２を発現または過剰発現するがんを標的とする免疫療法に使用することができる。
【0006】
ＩＬ－１３ Ｒα２に特異的に結合する単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１の可変重鎖（ＶＨ）ドメイン相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列、ならびに配列番号１の可変軽鎖（ＶＬ）ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの例では、ｓｃＦｖは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するか、または配列番号１のアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなる。いくつかの例では、ｓｃＦｖは、ＩＬ－１３Ｒα２を発現する細胞に特異的に結合する。
【0007】
ＩＬ－１３Ｒα２ ｓｃＦｖをコードする核酸および該核酸を含むベクター（ウイルスベクター等）も提供される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３Ｒα２ ｓｃＦｖをコードする核酸は、コドン最適化されている。いくつかの例では、ＩＬ－１３Ｒα２ ｓｃＦｖは、配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列によってコードされる。他の例では、ＩＬ－１３Ｒα２ ｓｃＦｖは、配列番号２の核酸配列を含むかまたはそれからなる核酸によってコードされる。
【0008】
ＩＬ－１３Ｒα２ ｓｃＦｖ、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および１またはそれを超えるシグナル伝達ドメインを有する細胞内ドメインを含むＣＡＲも提供される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲはシグナルペプチドを更に含む。いくつかの例では、シグナルペプチドはＣＤ８αシグナルペプチドである。いくつかの例では、膜貫通ドメインはＣＤ２８膜貫通ドメインである。いくつかの例では、細胞内ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのうちの１またはそれより多く、またはそれらの２もしくはそれより多くの任意の組み合わせを含む。非限定的な一実施形態では、ＩＬ－１３ Ｒα２－ＣＡＲは、ＩＬ－１３Ｒα２ ｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ２８ドメイン、４－１ＢＢドメインおよびＣＤ３ζドメインを含む細胞内ドメインを含む。いくつかの例では、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号３のアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなる。
【0009】
本明細書に開示されるＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲをコードする核酸、および核酸を含むベクター（ウイルスベクター等）も提供される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲをコードする核酸は、特定の細胞型（例えば、細菌、ｙｅｓｔ、昆虫、マウス、ヒト）における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの例では、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲは、配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列によってコードされる。他の例では、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲは、配列番号４の核酸配列を含むかまたはそれからなる核酸によってコードされる。ＩＬ－１３ Ｒα２－ＣＡＲをコードする核酸分子を含むベクターも本明細書に開示される。いくつかの例では、ベクターは、レンチウイルスベクター等のウイルスベクターである。
【0010】
開示されるＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する免疫細胞、例えば、開示されるＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲをコードする核酸または開示されるＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲをコードするベクターを含む免疫細胞も提供される。いくつかの例では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、またはマクロファージである。具体的な非限定的な例では、免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの例では、免疫細胞は末梢血から得られる。ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する細胞を産生する方法が提供される。これらの方法は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはマクロファージ等の細胞を、開示されるＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲをコードするベクターで形質導入またはトランスフェクトすることを含む。
【0011】
例えば、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する、またはＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲをコードするベクターを含む細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはマクロファージ等）を投与することによって、がんを有する対象を処置するための方法も提供される。いくつかの例では、対象は、ＩＬ－１３Ｒα２を発現または過剰発現するがんを有する。特定の非限定的な例では、対象は、膵臓がん、神経膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、卵巣がん、子宮がん、前立腺がん、乳がん、黒色腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞癌、カポジ肉腫、または副腎癌を有する。いくつかの例では、方法は、手術、放射線、化学療法、または追加の免疫療法のうちの１またはそれより多くで対象を処置することを更に含む。さらなる例では、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、細胞周期および／またはチェックポイント阻害剤、アドレノメデュリン、ＩＬ－１３－ＰＥ免疫毒素、またはそれらの２もしくはそれより多くの任意の組み合わせが、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ免疫細胞と組み合わせて対象に投与される。
【0012】
本開示の上記および他の特徴は、添付の図面を参照して進行する以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】図１は、例示的なｓｃＦｖ－ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲコンストラクトの概略図を示す。コンストラクトは、５’－ＣＤ８αシグナルペプチド、ｓｃＦｖ ＩＬ－１３Ｒα２、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ２８細胞質ドメイン、４－１ＢＢおよびＣＤ３ζに由来するエンドドメインを含む。
【図3A】図３Ａ～図３Ｂは、ＩＬ－１３Ｒα２抗体の重鎖の分析を示す。図３Ａは、ｓｃＦｖ－ＩＬ－１３Ｒα２の重鎖アミノ酸の領域、配列、残基番号および長さを提供する表である。図３Ｂは、アミノ酸残基の位置番号を有する重鎖ＣＤＲのループ構造である。示されている配列は、配列番号３の残基２２～１３９である。
【図3B】図３Ａ～図３Ｂは、ＩＬ－１３Ｒα２抗体の重鎖の分析を示す。図３Ａは、ｓｃＦｖ－ＩＬ－１３Ｒα２の重鎖アミノ酸の領域、配列、残基番号および長さを提供する表である。図３Ｂは、アミノ酸残基の位置番号を有する重鎖ＣＤＲのループ構造である。示されている配列は、配列番号３の残基２２～１３９である。
【図5A】図５Ａ～図５Ｂは、ＩＬ－１３Ｒα２抗体の軽鎖の分析を示す。図５Ａは、ｓｃＦｖ－ＩＬ－１３Ｒα２の軽鎖アミノ酸の領域、配列、残基番号および長さを提供する表である。図５Ｂは、アミノ酸残基の位置番号を有する軽鎖ＣＤＲのループ構造である。示されている配列は、配列番号３の残基１５５～２６０である。
【図5B】図５Ａ～図５Ｂは、ＩＬ－１３Ｒα２抗体の軽鎖の分析を示す。図５Ａは、ｓｃＦｖ－ＩＬ－１３Ｒα２の軽鎖アミノ酸の領域、配列、残基番号および長さを提供する表である。図５Ｂは、アミノ酸残基の位置番号を有する軽鎖ＣＤＲのループ構造である。示されている配列は、配列番号３の残基１５５～２６０である。
【図11】図１１は、ｓｃＦｖ ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲを含むベクターの制限消化物を示す。およそ１．０μｇのプラスミドＤＮＡをＢａｍＨ１およびＮｏｔ１により３７℃で１時間消化し、１％アガロースゲルにおいて電気泳動し、次いで染色した。レーン１は未消化のｓｃＦｖ－ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲコンストラクトプラスミドであり、レーン２はＢａｍＨ１およびＮｏｔ１で消化したプラスミドＤＮＡであり、レーン３はＫＢ参照ラダーである。
【図12】図１２Ａ～図１２Ｂは、形質導入されたＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ２８（細胞質）（図１２Ａ）およびＣＤ３ζ（図１２Ｂ）シグナル伝達ドメインの発現を示す。形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞を透過処理し、抗ＣＤ２８（ＣＤ２８．２）マウスｍＡｂ ＰＥコンジュゲート（カタログ番号２７８２６、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、マサチューセッツ州ダンバーズ）およびＣＤ３ζモノクローナル抗体ＰＥコンジュゲート（カタログ番号１２－２４７９－８２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州カールスバッド）で免疫染色した後、ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞のＦＡＣＳ分析を行った。データを、最頻値に正規化して表す。
【図13】図１３Ａ～図１３Ｂは、間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）分析による、形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞およびＴ細胞におけるｓｃＦｖ ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲ導入遺伝子の同定を示す。形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞およびＴ細胞を、５００ｎｇ／ｍｌのビオチン化組換えヒトＩＬ－１３Ｒα２ Ｆｃキメラタンパク質とインキュベートし、続いてストレプトアビジン－Ａｌｅｘａ ５９４とインキュベートして、ｓｃＦｖ－ＩＬ－１３Ｒα２発現細胞において蛍光を発生させた。２＋以上の蛍光強度を発現する細胞を、ＮＩＫＯＮ落射蛍光顕微鏡で見ることによって２００倍の倍率で計数した。各値は、盲検様式で決定され、陽性細胞％として表される４回の実験の平均±ＳＤである（図１３Ａ）。図１３Ｂは、形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞の代表的なＩＦＡ画像を示す。
【図14】図１４は、７日間にわたる細胞培養におけるｓｃＦｖ ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞およびｓｃＦｖ ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞生存度を示す。生存度をトリパンブルー排除によって決定し、生存細胞の数として表す。
【図15】図１５は、ＭＴＳアッセイによるｉｎ ｖｉｔｒｏでのｓｃＦｖ ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞増殖を示す。形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞およびＴ細胞を、適切な培養培地中で最大７日間、細胞増殖についてモニターした。形質導入された細胞の増殖活性を、特定の時点で４９０ｎｍにおいて、増殖している細胞によって還元されたＭＴＳテトラゾリウムの光学密度を測定することによって評価した。各値は、４つの独立した実験の平均±ＳＤである。
【図17】図１７は、共培養におけるｓｃＦｖ ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲ－Ｔ細胞特異性およびＩＬ－１３Ｒα２＋神経膠腫腫瘍細胞に対する細胞傷害を示す。様々なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で標的細胞として固定数のカルセイン－バイオレット負荷腫瘍細胞（５０００）と６時間共培養した後、蛍光色素の放出を測定してＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞溶解活性を決定した。ＩＬ－１３Ｒα２ノックアウト（ＫＯ）腫瘍細胞を陰性対照として使用した。各値は、４連で行われた３回の独立した実験の平均±ＳＤである。
【図18】図１８は、Ｕ２５１およびＵ８７ＭＧ神経膠腫細胞株におけるＩＬ－１３Ｒα２のｓｉＲＮＡサイレンシングを示す。ＩＬ－１３Ｒα２／β－アクチンの相対蛍光単位をＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって測定した。各値は、独立して３連で行われた４回の実施の平均±ＳＤを示す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
配列表
本明細書または添付の配列表に列挙されている任意の核酸およびアミノ酸配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で定義されているように、ヌクレオチド塩基およびアミノ酸の標準的な文字略語を使用して示されている。少なくともいくつかの場合、各核酸配列の１つの鎖のみが示されているが、相補鎖は、表示された鎖に対する任意の参照によって含まれると理解される。配列表は、参照により本明細書に組み込まれる、２０２２年３月３０日に作成された２４，５７６バイトのＡＳＣＩＩテキストファイル「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔ」として提出される。添付の配列表において：
本明細書または添付の配列表に列挙されている任意の核酸およびアミノ酸配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で定義されているように、ヌクレオチド塩基およびアミノ酸の標準的な文字略語を使用して示されている。少なくともいくつかの場合、各核酸配列の１つの鎖のみが示されているが、相補鎖は、表示された鎖に対する任意の参照によって含まれると理解される。配列表は、参照により本明細書に組み込まれる、２０２２年３月３０日に作成された２４，５７６バイトのＡＳＣＩＩテキストファイル「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔ」として提出される。添付の配列表において：
【0015】
配列番号１は、例示的なＩＬ－１３Ｒα２ ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。
【化1】
【0016】
配列番号２は、配列番号１のＩＬ－１３Ｒα２ ｓｃＦｖをコードする例示的な核酸配列である。
【化2】
【0017】
配列番号３は、例示的なＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲのアミノ酸配列である。
【化3】
【0018】
配列番号４は、配列番号３のＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲコンストラクトをコードする例示的な核酸配列である。
【化4-1】
【化4-2】
【0019】
配列番号５は、例示的なＣＤ８αシグナルペプチドのアミノ酸配列である。
【化5】
【0020】
配列番号６は、例示的なＣＤ８αヒンジドメインのアミノ酸配列である。
【化6】
【0021】
配列番号７は、例示的なＣＤ２８膜貫通ドメイン（ＣＤ２８ＴＭ）のアミノ酸配列である。
【化7】
【0022】
配列番号８は、例示的なＣＤ２８細胞質シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列である。
【化8】
【0023】
配列番号９は、例示的な４－１ＢＢ細胞質シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列である。
【化9】
【0024】
配列番号１０は、例示的なＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列である。
【化10】
【0025】
配列番号１１は、配列番号５のＣＤ８αシグナルペプチドをコードする例示的な核酸配列である。
【化11】
【0026】
配列番号１２は、配列番号６のＣＤ８αヒンジドメインをコードする例示的な核酸配列である。
【化12】
【0027】
配列番号１３は、配列番号７のＣＤ２８膜貫通ドメイン（ＣＤ２８ＴＭ）をコードする例示的な核酸配列である。
【化13】
【0028】
配列番号１４は、配列番号８のＣＤ２８細胞質シグナル伝達ドメインをコードする例示的な核酸配列である。
【化14】
【0029】
配列番号１５は、配列番号９の４－１ＢＢ細胞質シグナル伝達ドメインをコードする例示的な核酸配列である。
【化15】
【0030】
配列番号１６は、配列番号１０のＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインをコードする例示的な核酸配列である。
【化16】
【0031】
配列番号１７は、ＩＬ－１３Ｒα２をサイレンシングするための例示的なｓｉＲＮＡの核酸配列である。
【化17】
【0032】
配列番号１８は、例示的なｓｃＦｖ ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲのアミノ酸配列である
【化18】
【0033】
詳細な説明
Ｉ．用語
特に明記しない限り、技術用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ Ｘ，ｅｄ．Ｋｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００９（ＩＳＢＮ ０７６３７６６３２１）；Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９４（ＩＳＢＮ ０６３２０２１８２９）；Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ ０４７１１８６３４１）；およびＧｅｏｒｇｅ Ｐ．Ｒｅｄｅｉ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉｃ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００８（ＩＳＢＮ：１４０２０６７５３４）、ならびに他の同様の参考文献に見出され得る。
Ｉ．用語
特に明記しない限り、技術用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ Ｘ，ｅｄ．Ｋｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００９（ＩＳＢＮ ０７６３７６６３２１）；Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９４（ＩＳＢＮ ０６３２０２１８２９）；Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ ０４７１１８６３４１）；およびＧｅｏｒｇｅ Ｐ．Ｒｅｄｅｉ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉｃ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００８（ＩＳＢＮ：１４０２０６７５３４）、ならびに他の同様の参考文献に見出され得る。
【0034】
他に説明されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。単数形の用語である「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。「ＡまたはＢを含む」とは、Ａ、またはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。さらに、核酸またはポリペプチドについて与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値は近似値であり、説明のために提供されることを理解されたい。
【0035】
本明細書に記載の方法および材料と類似または同等の方法および材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合には、用語の説明を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
【0036】
本開示の様々な実施形態の検討を容易にするために、特定の用語の以下の説明が提供される。
【0037】
抗体：抗原のエピトープを認識して結合する（例えば、特異的に認識して特異的に結合する）少なくとも１つの可変領域を含むポリペプチドリガンド。哺乳動物免疫グロブリン分子は、重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖から構成され、各々が可変重（ＶＨ）領域および可変軽（ＶＬ）領域とそれぞれ呼ばれる可変領域を有する。合わせて、ＶＨ領域およびＶＬ領域は、抗体によって認識される抗原の結合を担う。哺乳動物免疫グロブリンには、抗体分子の機能活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥがある。
【0038】
抗体可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」として知られる「フレームワーク」領域および超可変領域を含む。ＣＤＲは、主に抗原のエピトープへの結合を担う。抗体のフレームワーク領域は、ＣＤＲを三次元空間に配置し、整列させるのに役立つ。所与のＣＤＲのアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．によって記載されたものを含む、いくつかの周知のナンバリングスキームのいずれかを使用して容易に決定することができる。（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１；「Ｋａｂａｔ」ナンバリングスキーム）、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－９１７，１９８７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７，１９８９；およびＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，（ＪＭＢ ２７３，９２７－９４８，１９９７を参照；「Ｃｈｏｔｈｉａ」ナンバリングスキーム）、およびｔｈｅ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）ｄａｔａｂａｓｅ（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２９：２０７－９，２００１を参照；「ＩＭＧＴ」ナンバリングスキーム）。ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴデータベースは、オンラインで維持される。
【0039】
単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体は、遺伝子融合された単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された１またはそれを超える抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む遺伝子操作された分子である（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３－４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：５８７９－５８８３，１９８８；Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１２，ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１２／９８０２５０；Ｍａｒｂｒｙ，ＩＤｒｕｇｓ，１３：５４３－５４９，２０１０を参照）。ｓｃＦｖにおけるＶＨドメインおよびＶＬドメインの分子内配向は、典型的にはｓｃＦｖにとって決定的ではない。したがって、両方の可能な配置（ＶＨドメイン－リンカードメイン－ＶＬドメイン；ＶＬドメイン－リンカードメイン－ＶＨドメイン）を有するｓｃＦｖを使用することができる。ｄｓＦｖでは、ＶＨおよびＶＬは、ジスルフィド結合を導入して鎖の会合を安定化するように変異している。ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）も含まれ、これは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによってドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、２つの抗原結合部位を作り出す二価二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：６４４４－６４４８，１９９３；Ｐｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２：１１２１－１１２３，１９９４を参照）。
【0040】
抗体には、キメラ抗体（ヒト化マウス抗体等）およびヘテロコンジュゲート抗体（二重特異性抗体等）等の遺伝子操作された形態も含まれる。Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４－１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）；Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７も参照されたい。
【0041】
がん：異常なまたは制御されない細胞の成長を特徴とする疾患。がんに関連することが多い他の特徴としては、転移、隣接細胞の正常な機能への干渉、異常なレベルでのサイトカインまたは他の分泌産物の放出、炎症または免疫学的応答の抑制または悪化、リンパ節等の周囲または遠隔の組織または器官の浸潤等が挙げられる。「転移性疾患」は、元の腫瘍部位を離れ、例えば血流またはリンパ系を介して身体の他の部分に移動したがん細胞を指す。
【0042】
チェックポイント阻害剤：細胞周期チェックポイントならびに免疫チェックポイントの阻害剤を含む。細胞周期チェックポイントは、有糸分裂中に細胞が各細胞周期段階を正しく完了することを確実にする保護機構を指す。チェックポイント阻害剤は、ＤＮＡ損傷を有する細胞にＳおよびＧ２／Ｍ停止を迂回させて有糸分裂に入り、分裂期崩壊（ｍｉｔｏｔｉｃ ｃａｔａｓｔｒｏｐｈｅ）による細胞死を引き起こすことによって、がん細胞をＤＮＡ損傷薬に感作させることができる。細胞周期チェックポイント阻害剤は、Ｖｉｓｃｏｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３５（１）：１５３，２０１６によってより詳細に記載されている。免疫チェックポイントは、自己反応性免疫細胞を防ぐ保護機構を指す。免疫チェックポイントは、免疫細胞（Ｔ細胞等）の阻害性受容体が細胞上の抗原を「自己」抗原として認識すると活性化する。免疫チェックポイントは自己免疫障害を予防するための重要な機構であるが、がん性細胞は免疫チェックポイントを利用して免疫認識を抑制または回避することができる。したがって、チェックポイント阻害剤は、免疫細胞ががん性細胞を認識して排除するのを助けることができる。
【0043】
多くのチェックポイント阻害剤が、当技術分野で公知である。いくつかの非限定的な例としては、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、アテゾリズマブ（Ｔｅｎｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））、セミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ（登録商標））、パルボシクリブ（Ｉｂｒａｎｃｅ（登録商標））、リボシクリブ（Ｋｉｓｑｕａｌｉ（登録商標））、およびアベマシクリブ（Ｖｅｒｚｅｎｉｏ（登録商標））が挙げられる。さらなる例は、Ｑｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１２６（３）：４５０－４６４，２０１８；Ｖｉｓｃｏｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３５（１）：１５３，２０１６；およびＭｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７７（２３）：６４８９－６４９８，２０１７に提供される。
【0044】
チェックポイント阻害剤はまた、紡錘体形成チェックポイント阻害剤を含み得る。例えば、紡錘体形成チェックポイント阻害剤には、ＭＫ－１７７５（ＡＺＤ１７７５）、タキサンまたはビンカアルカロイド（Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｇｉａｎｎａｋａｋｏｕ．Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ．５：６５－７１，２００５；ａｎｄ Ｖｉｓｃｏｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３５（１）：１５３，２０１６を参照）が含まれる。
【0045】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）：抗原結合部分（単一ドメイン抗体またはｓｃＦｖ等）およびシグナル伝達ドメイン、例えば、Ｔ細胞受容体由来のシグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）を含むキメラ分子。典型的には、ＣＡＲは、抗原結合部分、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む。細胞内ドメインは、典型的には、ＣＤ３ζまたはＦｃεＲＩγ等の免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を有するシグナル伝達鎖を含む。いくつかの例では、細胞内ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７および／またはＤＡＰ１０等の少なくとも１つの追加の共刺激ドメインの細胞内部分も含む。
【0046】
相補性決定領域（ＣＤＲ）：抗体の結合親和性および特異性を規定する超可変アミノ酸配列の領域。哺乳動物免疫グロブリンの軽鎖および重鎖はそれぞれ、ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２、ＶＬ－ＣＤＲ３およびＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、ＶＨ－ＣＤＲ３とそれぞれ呼ばれる３つのＣＤＲを有する。
【0047】
有効量：対象におけるがん等の疾患または病理的状態の症状および／または根底にある原因を処置、低減および／または改善するのに十分な、開示されるＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＩＬ－１３ Ｒα２－ＣＡＲ－ＮＫ細胞等の作用物質の量。非限定的な例では、有効量は、対象の腫瘍成長を阻害または減少させるのに十分な量である。
【0048】
ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤：いくつかのＨＤＡＣ阻害剤は、細胞成長の停止およびアポトーシスを誘導することが示されており、したがって潜在的な抗がん治療薬である。ＨＤＡＣ阻害剤のいくつかの非限定的な例としては、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）、ＳＰ６００１２５（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＳＲ１１３０２（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびロミデプシン（Ｍａｒｋｓ ａｎｄ Ｊｉａｎｇ，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ２００５，４：５４９－５５１；Ｄｕｖｉｃ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １０９：３１－３９，２００７；およびＦｕｊｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９：３７，２０１１を参照）が挙げられる。
【0049】
ＩＬ－１３－ＰＥ免疫毒素：ＩＬ－１３－ＰＥは、ＩＬ－１３および切断型シュードモナス外毒素からなる組換え免疫毒素である。ＩＬ－１３－ＰＥは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で、高レベルのＩＬ－１３ Ｒα２を発現する腫瘍細胞に対して高度に細胞傷害性であることが示されている（Ｄｅｂｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１：１２５３－１２５８，１９９５；Ｄｅｂｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７０：１６７７５－１６７８０，１９９５；およびＪｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８：１９４８－１９５６，２００２を参照）。
【0050】
インターロイキン－１３受容体α２（ＩＬ－１３ Ｒα２）：ＩＬ－１３Ｒα２は、多面的免疫調節性サイトカインインターロイキン－１３（ＩＬ－１３）および既知の腫瘍抗原に対する高親和性受容体である。がんにおけるＩＬ－１３Ｒα２発現の重要性は知られておらず、アップレギュレーションの機構は依然として不明であるが、ＩＬ－１３Ｒα２は、悪性神経膠腫、頭頸部がん、カポジ肉腫、腎細胞癌、および卵巣癌を含む様々なヒトがんにおいて過剰発現されることが示されている。さらに、最近の研究では、膵臓腫瘍の７１％がＩＬ－１３Ｒα２を過剰発現することが示されている（Ｆｕｊｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９：３７，２０１１）。
【0051】
単離された：「単離された」生物学的成分、例えば核酸、タンパク質（抗体を含む）または細胞は、その成分が存在する環境（細胞等）中の他の生物学的成分、例えば他の染色体ならび染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質および細胞から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質ならびに化学的に合成された核酸を包含する。
【0052】
マクロファージ：人体のほとんどの組織に見られる骨髄前駆体に由来する大きな遊走性単核食細胞。マクロファージは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、Ｃ型レクチン受容体、スカベンジャー受容体、レチノイン酸誘導性遺伝子１（ＲＩＧ１）様ヘリカーゼ受容体（ＲＬＲ）およびＮＯＤ様受容体を含むパターン認識受容体（ＰＲＲ）を発現して、病原体、異物、および死細胞または瀕死の細胞に関連するシグナルを認識する。
【0053】
マクロファージは非常に不均一であり、いくつかのサブクラスを含む。古典的活性化マクロファージ（Ｍ１マクロファージ）は、様々な病原体（例えば、細菌、原虫、およびウイルス）からの宿主の防御を媒介し、抗腫瘍免疫応答も媒介する。あるいは、活性化マクロファージ（Ｍ２マクロファージ）は抗炎症の役割を有し、創傷治癒を調節する。制御性マクロファージは、Ｆｃ受容体－γライゲーションに応答して大量のインターロイキン－１０（ＩＬ－１０）を分泌する。あまり明確に規定されていないマクロファージサブセットには、抗腫瘍免疫を抑制する腫瘍関連マクロファージおよび骨髄由来サプレッサー細胞（Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１：７２３－７３７）が含まれる。
【0054】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞：特定の抗原刺激の非存在下で、ＭＨＣクラスによる制限なしに標的細胞を死滅させる免疫系の細胞。標的細胞は、腫瘍細胞またはウイルスを保有する細胞であり得る。ＮＫ細胞は、ＣＤ５６の存在およびＣＤ３表面マーカーの非存在を特徴とする。ＮＫ細胞は、典型的には、正常な末梢血中の単核細胞画分のおよそ１０～１５％を構成する。歴史的に、ＮＫ細胞は、事前の免疫化も活性化もなしに特定の腫瘍細胞を溶解する能力によって最初に同定された。ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩ提示をダウンレギュレートすることによってＣＴＬ応答から逃れる可能性があるウイルスおよび腫瘍に対する「バックアップ」防御機構を提供すると考えられている。ＮＫ細胞は、直接的な細胞傷害性死滅に関与することに加えて、がんおよび感染を制御するために重要であり得るサイトカイン産生においても役割を果たす。
【0055】
いくつかの例では、「改変ＮＫ細胞」は、異種核酸（例えば、本明細書に開示される核酸またはベクターのうちの１またはそれより多く）で形質導入またはトランスフェクトされた、または１もしくそれを超える異種タンパク質を発現するＮＫ細胞である。「改変ＮＫ細胞」および「形質導入されたＮＫ細胞」という用語は、本明細書のいくつかの例では互換的に使用される。
【0056】
薬学的に許容され得る担体：薬学的投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａｄｅｊａｒｅ（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ，２３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０２１）を参照）。そのような担体または希釈剤の例には、水、食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、平衡塩類溶液、および５％ヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。リポソームおよび固定油等の非水性ビヒクルも使用することができる。補助活性化合物も組成物に組み込むことができる。投与可能な組成物を調製するための実際の方法としては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａｄｅｊａｒｅ（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ，２３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０２１）を参照されたい。
【0057】
精製された：精製されたという用語は、絶対純度を必要とせず、むしろ、相対的な用語として意図されている。したがって、例えば、精製されたタンパク質、核酸または細胞調製物は、タンパク質、核酸または細胞がその初期環境にあるタンパク質、核酸または細胞よりも濃縮されているものである。一実施形態では、調製物は、タンパク質、核酸または細胞が調製物の総含有量の少なくとも５０％を占めるように精製される。実質的に精製されたタンパク質または核酸は、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％純粋である。したがって、具体的で非限定的な１つの例では、実質的に精製されたタンパク質または核酸は、他の成分を９０％含まない。
【0058】
組換え：天然に存在しない配列を有するか、そうでなければ分離された２つの配列セグメント（例えば、「キメラ」配列）の人工的な組み合わせによって作製された配列を有する核酸またはタンパク質。この人工的な組み合わせは、化学合成によって、または例えば遺伝子工学技術による核酸の単離されたセグメントの人工的な操作によって達成することができる。
【0059】
対象：生きている多細胞脊椎動物生物、限定されないが、非ヒト霊長類、げっ歯類等を含むヒトおよび非ヒト哺乳動物を含むカテゴリー。本明細書に開示される特定の例では、対象はヒトである。
【0060】
Ｔ細胞：免疫応答の重要なメディエーターである白血球（リンパ球）。Ｔ細胞には、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞が含まれるが、これらに限定されない。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、「表面抗原分類４」（ＣＤ４）として知られるその表面にマーカーを有する免疫細胞である。ヘルパーＴ細胞としても知られるこれらの細胞は、抗体応答ならびにキラーＴ細胞応答を含む免疫応答を編成するのに役立つ。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、「表面抗原分類８」（ＣＤ８）マーカーを有する。一実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である。別の実施形態では、ＣＤ８＋細胞はサプレッサーＴ細胞である。
【0061】
活性化Ｔ細胞は、細胞増殖および／または１もしくそれを超えるサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γまたはＴＮＦα等）の発現もしくは分泌の増加によって検出することができる。ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、抗原に応答した細胞溶解活性の増加によっても検出することができる。
【0062】
ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞は、適応免疫に特徴的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、自然免疫応答の一部であるＮＫ細胞の表面受容体（例えば、α／β Ｔ細胞受容体と共にＮＫ細胞に通常関連する細胞表面マーカーＮＫ１．１）（Ｔｕｐｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５：４０５－４１７）の両方を発現するＴ細胞のクラスである。
【0063】
いくつかの例では、「改変Ｔ細胞」は、異種核酸（例えば、本明細書に開示される核酸またはベクターのうちの１またはそれより多く）で形質導入またはトランスフェクトされた、または１もしくそれを超える異種タンパク質を発現するＴ細胞である。「改変Ｔ細胞」および「形質導入されたＴ細胞」という用語は、本明細書のいくつかの例では互換的に使用される。同様に、「改変ＮＫＴ細胞」は、異種核酸（例えば、本明細書に開示される核酸またはベクターのうちの１またはそれより多く）で形質導入またはトランスフェクトされた、または１もしくそれを超える異種タンパク質を発現するＮＫＴ細胞である。
【0064】
形質導入されたまたは形質転換された：形質転換された細胞は、分子生物学技術によって核酸分子が導入された細胞である。本明細書で使用される場合、形質導入および形質転換という用語は、ウイルスベクターによる形質導入またはトランスフェクション、プラスミドベクターの使用、ならびにエレクトロポレーション、リポフェクション、および粒子銃加速（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）によるＤＮＡの導入を含む、核酸分子がそのような細胞に導入され得る全ての技術を包含する。
【0065】
疾患の処置または改善：「処置する」とは、腫瘍サイズまたは腫瘍負荷の減少等、疾患または病理的状態が発症し始めた後に疾患または病理的状態の徴候または症状を減少または阻害する治療的介入を指す。「改善する」とは、がん等の疾患の徴候または症状の数または重症度の減少を指す。
【0066】
ベクター：宿主細胞（例えば、トランスフェクションまたは形質導入によって）に導入され、それによって形質転換された宿主細胞を産生することができる核酸分子。組換えＤＮＡベクターは、組換えＤＮＡを有するベクターである。ベクターは、複製起点等の宿主細胞内での複製を可能にする核酸配列を含むことができる。ベクターはまた、１またはそれを超える選択マーカー遺伝子および当技術分野で公知の他の遺伝要素を含むことができる。ウイルスベクターは、１またはそれを超えるウイルスに由来する少なくともいくつかの核酸配列を有する組換え核酸ベクターである。複製欠損ウイルスベクターは、少なくとも１つの複製必須遺伝子機能の欠損に起因して、複製に必要なウイルスゲノムの１またはそれを超える領域の補完を必要とするベクターである。
【0067】
ＩＩ．いくつかの実施形態の概要
ｓｃＦｖを含むインターロイキン－１３受容体α２（ＩＬ－１３Ｒα２）結合剤が本明細書に開示される。ヒンジ領域、膜貫通ドメインおよび１またはそれを超えるシグナル伝達ドメイン（例えば１またはそれを超える共刺激ドメイン）を含む細胞内ドメインに融合されたＩＬ－１３Ｒα２特異的結合剤（本明細書に開示されるＩＬ－１３Ｒα２ ｓｃＦｖ等）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も開示される。いくつかの例では、１またはそれを超えるシグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢおよび／またはＣＤ３ζに由来する。いくつかの例では、ヒンジ領域はＣＤ８αに由来し、膜貫通領域はＣＤ２８に由来する。ＣＡＲはまた、ＣＤ８αシグナルペプチド等のシグナルペプチドをコードし得る。ＩＬ－１３Ｒα２特異的結合剤およびＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲをコードする核酸および該核酸を含むベクターも提供される。
ｓｃＦｖを含むインターロイキン－１３受容体α２（ＩＬ－１３Ｒα２）結合剤が本明細書に開示される。ヒンジ領域、膜貫通ドメインおよび１またはそれを超えるシグナル伝達ドメイン（例えば１またはそれを超える共刺激ドメイン）を含む細胞内ドメインに融合されたＩＬ－１３Ｒα２特異的結合剤（本明細書に開示されるＩＬ－１３Ｒα２ ｓｃＦｖ等）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も開示される。いくつかの例では、１またはそれを超えるシグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢおよび／またはＣＤ３ζに由来する。いくつかの例では、ヒンジ領域はＣＤ８αに由来し、膜貫通領域はＣＤ２８に由来する。ＣＡＲはまた、ＣＤ８αシグナルペプチド等のシグナルペプチドをコードし得る。ＩＬ－１３Ｒα２特異的結合剤およびＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲをコードする核酸および該核酸を含むベクターも提供される。
【0068】
ＩＬ－１３Ｒα２特異的結合剤またはＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲをコードする核酸またはベクターで形質転換された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはマクロファージ）も本明細書で提供される。いくつかの例では、免疫細胞はＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する。細胞は、核酸またはベクターで形質転換する前に、血液試料、例えば対象の末梢血から得ることができる。
【0069】
対象においてＩＬ－１３Ｒα２を発現するがんを処置する方法も提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する有効量の免疫細胞を対象に投与することを含む。いくつかの例では、免疫細胞は対象にとって自家である。他の例では、免疫細胞は同種異系である。いくつかの例では、対象は、手術、放射線、化学療法、追加の免疫療法、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤の投与、細胞周期および／またはチェックポイント阻害剤の投与、アドレノメデュリンの投与、ＩＬ－１３－ＰＥ免疫毒素の投与、またはそれらの２もしくはそれより多くの任意の組み合わせ等の追加の処置を受ける。いくつかの例では、対象は、がん、例えば、膵臓がん、神経膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、卵巣がん、子宮がん、前立腺がん、乳がん、黒色腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞癌、カポジ肉腫、または副腎癌を有する。
【0070】
ＩＩＩ．ＩＬ－１３Ｒα２特異的結合剤
いくつかの例では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の標的化部分として使用されるインターロイキン－１３受容体α２（ＩＬ－１３Ｒα２）結合剤が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３Ｒα２結合剤は、ＩＬ－１３Ｒα２に特異的に結合する単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である。
いくつかの例では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の標的化部分として使用されるインターロイキン－１３受容体α２（ＩＬ－１３Ｒα２）結合剤が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３Ｒα２結合剤は、ＩＬ－１３Ｒα２に特異的に結合する単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である。
【0071】
いくつかの実施形態では、ＩＬ１３－Ｒα２結合剤は、表１に提供されるＣＤＲ配列を含む抗体またはｓｃＦｖである。いくつかの例では、抗体またはｓｃＦｖはＩＬ－１３Ｒα２に特異的に結合し、それぞれ配列番号１の可変重鎖（ＶＨ）ドメイン相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列、ならびに配列番号１の可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。いくつかの例では、抗体またはｓｃＦｖは、本明細書中に開示されるＶＨ配列およびＶＬ配列に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、ＶＨドメインは配列番号１のアミノ酸１～１１８を含み、ＶＬドメインは配列番号１のアミノ酸１３４～２３９を含む。
【0072】
いくつかの実施形態では、結合剤は、表１に提供されるＣＤＲアミノ酸配列を含み、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を有するｓｃＦｖである。他の実施形態では、結合剤はｓｃＦｖであり、配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。
【表1-1】
【表1-2】
【0073】
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ＩＬ－１３Ｒα２を発現する細胞等の標的細胞に結合する。いくつかの例では、細胞は、膵臓がん、神経膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、卵巣がん、子宮がん、前立腺がん、乳がん、黒色腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞癌、カポジ肉腫、または副腎癌細胞等のがん細胞（腫瘍細胞を含む）である。ｓｃＦｖ結合は、ＩＬ－１３Ｒα２発現が標的細胞においてアップレギュレートされた場合に増加または改善され得る。
【0074】
ＩＶ．ＩＬ－１３Ｒα２キメラ抗原受容体
本明細書では、セクションＩＩＩに記載されるＩＬ１３－Ｒα２特異的結合剤を含むＩＬ－１３Ｒα２キメラ抗原受容体（ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ）が提供される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲは、（ａ）ＩＬ－１３Ｒα２特異的ｓｃＦｖ（例えば、配列番号１）を含む抗原結合ドメインと、（ｂ）ヒンジドメインと、（ｃ）膜貫通ドメインと、（ｄ）１またはそれを超えるシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインとを含む。ＣＡＲはまた、シグナルペプチド、リンカー、および／または組換え構築のための配列（制限酵素部位等）を含み得る。
本明細書では、セクションＩＩＩに記載されるＩＬ１３－Ｒα２特異的結合剤を含むＩＬ－１３Ｒα２キメラ抗原受容体（ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ）が提供される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲは、（ａ）ＩＬ－１３Ｒα２特異的ｓｃＦｖ（例えば、配列番号１）を含む抗原結合ドメインと、（ｂ）ヒンジドメインと、（ｃ）膜貫通ドメインと、（ｄ）１またはそれを超えるシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインとを含む。ＣＡＲはまた、シグナルペプチド、リンカー、および／または組換え構築のための配列（制限酵素部位等）を含み得る。
【0075】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインはＩＬ－１３Ｒα２特異的ｓｃＦｖであり、例えば、セクションＩＩに記載されているもの等である。いくつかの例では、ＣＡＲは、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号１のアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなるＩＬ－１３Ｒα２ ｓｃＦｖを含む。
【0076】
いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、例えば配列番号６のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなるＣＤ８αヒンジドメインである。他の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤ）由来のヒンジ領域、またはＣＤ２８もしくはＣＤ４０由来のヒンジ領域等、他のヒンジドメインを使用することができる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ２８膜貫通ドメインであり、例えば、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、配列番号７のアミノ酸配列からなる。膜貫通ドメインはまた、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３ζ、ＣＤ４０、ＯＸ４０－Ｌ、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、ＩＣＡＭ－１、ＣＤ５６、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＮＫＰ３０、ＮＫＰ４４、ＮＫＰ４０、ＮＫＰ４６、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－２，およびＣＤ７０等の他のＴ細胞タンパク質に由来し得る。
【0077】
いくつかの実施形態では、１またはそれを超えるシグナル伝達ドメインは、１またはそれを超えるＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ８、ＣＤ４０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０－Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、ＣＤ５６、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤＫ、ＴＩＭ－３、ＮＫＰ３０、ＮＫＰ４４、ＮＫＰ４０、ＮＫＰ４６、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－２、ＣＤ７０、ＣＤ３ζ、およびＦｃεＲＩγドメインのうちの１つまたはそれより多く、あるいはそれらの２もしくはそれより多くの任意の組み合わせを含む。具体的な非限定的な例において、１またはそれを超えるシグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインであり、例えば、それぞれ配列番号８、９および１０のアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、ｓｃＦｖのＮ末端に位置するシグナルペプチドを更に含む。いくつかの例では、シグナルペプチドは、例えば配列番号５のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなるＣＤ８αシグナルペプチドである。他のシグナルペプチドには、ＩｇＧシグナル配列またはＧＭ－ＣＳＦシグナル配列が含まれる。
【0078】
特定の例では、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲは、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。他の例では、ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲはシグナルペプチドを含まず、例えば、配列番号３のアミノ酸１～２１を含まない。
【0079】
他の実施形態では、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲは、ＣＡＲを発現する免疫細胞の生存または持続を増加させるドメインを更に含む。いくつかの例では、ドメインは、サイトカイン受容体由来の細胞内ドメイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ）－１５受容体、ＩＬ－１２受容体またはＩＬ－１８受容体由来の細胞内ドメインである。他の例では、ドメインは、成長因子受容体由来の細胞内ドメイン、例えばＣＤ４０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＰ４０またはＮＫＰ４６由来の細胞内ドメインである。いくつかの例では、ドメインは、ＣＡＲのＣＤ３ζドメインのＣ末端に位置する。追加の実施形態では、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲは、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ発現細胞を排除するために使用することができる誘導性遺伝子（カスパーゼ９等）を更に含む（例えば、「自殺」遺伝子）。誘導性遺伝子は、サイトカイン放出症候群（「サイトカインストーム」）等のオフターゲット副作用（またはオンターゲット／オフ腫瘍効果）の場合に活性化され得る。
【0080】
ＣＡＲの生物学的活性を保持し、そのＣＡＲの生物学的活性が改変体であるか、または特定のドメインの生物学的活性を保持する、本明細書に記載のＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲまたはそのドメインの機能的改変体も提供される。機能的改変体は、親のＣＡＲまたはドメインとアミノ酸配列において少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれを超えて同一であり得る。置換は、例えば、細胞外標的化ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインのうちの１つまたはそれより多くにおいて行うことができる。
【0081】
いくつかの例では、機能的改変体は、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換（例えば最大１０個の保存的アミノ酸置換、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の保存的置換）を有する親のＣＡＲまたはドメインのアミノ酸配列を含む。他の例では、機能的改変体は、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換（例えば最大１０個の非保存的アミノ酸置換、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の非保存的置換）を有する親のＣＡＲまたはドメインのアミノ酸配列を含む。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能的改変体の生物学的活性を妨害も阻害もしない。非保存的アミノ酸置換は、機能的改変体の生物学的活性が親のＣＡＲまたはドメインと比較して増加するように、機能的改変体の生物学的活性を増強し得る。
【0082】
ＣＡＲまたはそのドメインは、いくつかの例では、１またはそれを超える天然に存在するアミノ酸の代わりに１またはそれを超える合成アミノ酸を含み得る。そのような合成アミノ酸としては、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、ａ－アミノｎ－デカン酸、ホモセリン、Ｓ－アセチルアミノメチル－システイン、トランス－３－およびトランス－４－ヒドロキシプロリン、４－アミノフェニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、４－カルボキシフェニルアラニン、β－フェニルセリンβ－ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α－ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン－２－カルボン酸、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’－ベンジル－Ｎ’－メチル－リジン、Ν’，Ν’－ジベンジル－リジン、６－ヒドロキシリジン、オルニチン、α－アミノシクロペンタンカルボン酸、α－アミノシクロヘキサンカルボン酸、ｏｃ－アミノシクロヘプタンカルボン酸、－（２－アミノ－２－ノルボルナン）－カルボン酸、γ－ジアミノ酪酸、α，β－ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、およびα－ｔｅｒｔ－ブチルグリシンが挙げられる。ＣＡＲは、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ－アシル化、例えばジスルフィド架橋を介した環化、または酸付加塩への変換、および／または必要に応じて二量体化もしくは重合もしくはコンジュゲート化され得る。
【0083】
Ｖ．核酸およびベクター
本明細書に開示されるＩＬ１３－Ｒα２結合剤またはＩＬ－１３Ｒα２キメラ抗原受容体（ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ）をコードする核酸も提供される。
本明細書に開示されるＩＬ１３－Ｒα２結合剤またはＩＬ－１３Ｒα２キメラ抗原受容体（ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ）をコードする核酸も提供される。
【0084】
いくつかの実施形態では、核酸は、ＩＬ１３－Ｒα２結合剤をコードする。いくつかの例では、核酸は、表１に提供されるＣＤＲ配列の各々をコードし、例えば、核酸は、配列番号１のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３をコードし、配列番号１のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３をそれぞれコードする。いくつかの例では、核酸は、表１に提供されるＣＤＲ配列の各々を含むアミノ酸配列をコードし、配列番号１と少なくとも９０％の同一性（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を有する。いくつかの例では、核酸は、配列番号１を含むかまたはそれからなるアミノ酸配列をコードする。さらなる例では、核酸は、表１に提供されるＣＤＲ配列の各々をコードし、配列番号２と少なくとも９０％の同一性（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を有する。いくつかの例では、ＩＬ１３－Ｒα２結合剤をコードする核酸は、配列番号２を含むか、または配列番号２からなる。
【0085】
いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に開示されるＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲをコードする。いくつかの例では、核酸分子は、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列をコードする。いくつかの例では、核酸分子は、表１に提供されるＣＤＲ配列（核酸は、配列番号１のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３をコードする）の各々を含み、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列をコードする。いくつかの例では、核酸分子は、配列番号３を含むかまたはそれからなるアミノ酸配列をコードする。さらなる例では、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲをコードする核酸分子は、配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を有する核酸配列を含む。いくつかの例では、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲをコードする核酸分子は、表１に提供されるＣＤＲ配列の各々をコードする核酸配列を含み、核酸は配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を有する。他の例では、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲをコードする核酸分子は、配列番号４を含むかまたはこれからなる。
【0086】
本明細書に開示される核酸（例えば、ＩＬ－１３Ｒα２特異的結合剤またはＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲをコードする核酸）をコードするベクター（例えば、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、人工染色体）も提供される。特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、「発現ベクター」と呼ばれることがある。いくつかの実施形態では、開示されるＩＬ－１３Ｒα２ ｓｃＦｖまたはＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲをコードする核酸分子は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはマクロファージ）等の宿主細胞における発現のためのベクター（ウイルスベクター等）に含まれる。
【0087】
ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術等によって、追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列がウイルスにパッケージングするためにベクター中に存在する（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）。複製欠損ウイルスベクターは、少なくとも１つの複製必須遺伝子機能の欠損に起因して、複製に必要なウイルスゲノムの１またはそれを超える領域の補完を必要とするベクターである。
【0088】
いくつかの実施形態では、ベクターは、レトロウイルス（例えば、ＭｏＭＬＶまたはレンチウイルス）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター等のウイルスベクターである。他の適切なウイルスベクターには、ポリオーマ、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、ＨＳＶおよびＥＢＶを含むヘルペスウイルス、シンドビスウイルス、鳥類、ネズミおよびヒト起源のアルファウイルスおよびレトロウイルス、バキュロウイルス（オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体ウイルス；ＡｃＭＮＰＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、ポリオベクター、オルソポックスベクター、アビポックスベクター、鶏痘ベクター、カプリポックスベクター、水痘ベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターおよびポリオウイルスベクターが含まれる。使用される具体的な例示的なポックスウイルスとしては、オルソポックス、水痘、アビポックスウイルスおよびカプリポックスのウイルスが挙げられる。オルトポックスには、ワクシニア、エクトロメリア、およびアライグマポックスが含まれる。使用のオルソボックスの一例はワクシニアである。アビポックスには、鶏痘、カナリア痘および鳩痘（ｐｉｇｅｏｎ ｐｏｘ）が含まれる。カプリポックスには、山羊痘および羊痘が含まれる。一例では、水痘は豚痘である。具体的な非限定的な例では、ベクターはｐＣＤＨ－ＭＳＣＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１ａ－ＧＦＰ－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏレンチウイルスベクター（例えば、カタログ番号ＣＤ７１３Ｂ－１、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州パロアルト９４３０３）である。
【0089】
ベクターは、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され得る、発現される核酸配列に作動可能に連結された１またはそれを超える調節エレメント（例えば、プロモーター（ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ１α、β－アクチン、ｈＰＧＫ、またはＲＰＢＳＡ等）；転写開始部位（ＴＳＳ）；エンハンサー；インシュレーター；Ａ／Ｔリッチ領域；転写因子（ＴＦ）結合部位；転写および／または翻訳ターミネーター；開始配列、または他の調節エレメント）を含み得る。「作動可能に連結される」は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列（例えば、ベクターが宿主細胞に導入される場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において、または宿主細胞において）の発現を可能にする様式で調節エレメントに連結されていることを意味する。ベクター発現は、構成的（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、およびＣＡＧＧ）、誘導性（例えば、ＩＰＴＧ）、または細胞／組織特異的（例えば、Ｔ細胞特異的、例えばｄＬｃｋまたはＣＤ３δ）であり得る。いくつかの例では、プロモーターは、ＣＡＲ Ｔ細胞またはＴＣＲ活性化時に誘導可能な合成プロモーターである（例えば、「ｉＳｙｎＰｒｏ」プロモーター、国際公開第２０１８／２１３３３２号を参照）。ベクターを宿主細胞に導入して、本明細書に記載の核酸によってコードされる産物（例えば、ＩＬ１３－Ｒα２結合剤またはＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ）を発現させることができる。ベクターはまた、抗生物質（例えば、ピューロマイシン、ハイグロマイシン）または検出可能なマーカー（例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ルシフェラーゼ、Ｘ－ｇａｌ）等の１またはそれを超える選択マーカー遺伝子を含むことができる。いくつかの例では、選択マーカーまたはレポーターはベクターに含まれない。
【0090】
ベクターは、誘導可能なアポトーシス促進性分子（例えば、Ｆａｓ関連デスドメイン含有タンパク質（ＦＡＤＤ）、Ｂｃｌ－２関連デスプロモーター（ＢＡＤ）または誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９））または誘導性活性化系（例えば、Ｍｙ８８／ＣＤ４０（ｉＭＣ））等の安全スイッチシステム（ｓａｆｅｔｙ ｓｗｉｔｃｈ ｓｙｓｔｅｍ）を含み得る。安全スイッチシステムに関するさらなる情報は、例えば、Ｇａｒｇｅｔｔ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ（２０１４）Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：２３５ ａｎｄ Ｇｅｒｋｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．７（１１）：１３０６－１３１９に見出すことができる。いくつかの例では、安全スイッチをコードするベクターは、本明細書に開示されるＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲまたはＩＬ１３－Ｒα２結合剤をコードするベクターとは異なるベクターである。いくつかの例では、安全スイッチをコードするベクターは、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲまたはＩＬ１３－Ｒα２結合剤もコードする。
【0091】
いくつかの例では、安全スイッチは、二量体化の化学誘導因子（ＣＩＤ）（例えば、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＡＰ２１９６７）に結合するＦＫＢＰ（ＦＫ ５０６結合タンパク質）改変体と融合したアポトーシス促進性分子である。いくつかの例では、アポトーシス促進性分子は、成長を制御するために、あるいは、本明細書中に開示されるＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲまたはＩＬ１３－Ｒα２結合剤をコードするベクター等のベクターにより形質導入または形質転換される細胞を排除するために活性化される。いくつかの例では、誘導可能なアポトーシス促進性分子の活性化は、例えば、形質導入または形質転換された細胞の少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％を排除することによって、形質導入または形質転換された細胞を排除する。いくつかの例では、アポトーシス促進性分子は、形質導入または形質転換された細胞をＣＩＤと接触させることによって活性化される。
【0092】
いくつかの例では、安全スイッチは誘導性活性化システム（例えば、Ｍｙ８８／ＣＤ４０（ｉＭＣ））である。いくつかの例では、誘導性活性化システムは、ベクター（例えば、本明細書に開示されるＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲまたはＩＬ１３－Ｒα２結合剤をコードするベクター）により形質導入または形質転換される細胞の活性を増大させるために活性化される。いくつかの例では、誘導性活性化システムの活性化は、例えば、増殖、サイトカイン産生または腫瘍標的化を少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも４００％またはそれを超えて増加させることによって、形質転換された細胞の活性を増加させる。いくつかの例では、誘導性活性化システムは、形質転換された細胞をＣＩＤ（例えば、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＡＰ２１９６７）と接触させることによって活性化される。
【0093】
ＶＩ．ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲを発現する細胞
また、本明細書中には、開示のＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する細胞（例えば、免疫細胞）、例えば、本明細書に開示される核酸（例えば、本明細書に開示されるＩＬ１３－Ｒα２結合剤またはＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲをコードする核酸）またはその核酸をコードするベクターを含む細胞も提供される。例示的な免疫細胞には、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞および／またはマクロファージが含まれる。いくつかの例では、細胞はＴ細胞である。いくつかの例では、細胞は、配列番号３または配列番号３のアミノ酸２２～５３８と少なくとも９０％の同一性を有するＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する。いくつかの例では、細胞は、配列番号３または配列番号３のアミノ酸２２～５３８を含むかまたはそれからなるＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する。いくつかの例では、細胞は、配列番号３を含むかまたはそれからなるアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸２２～５３８をコードする核酸配列で形質導入またはトランスフェクトされる。さらなる例では、細胞に、配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を形質導入またはトランスフェクトする。いくつかの例では、核酸配列は、配列番号４を含むかまたはそれからなる。
また、本明細書中には、開示のＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する細胞（例えば、免疫細胞）、例えば、本明細書に開示される核酸（例えば、本明細書に開示されるＩＬ１３－Ｒα２結合剤またはＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲをコードする核酸）またはその核酸をコードするベクターを含む細胞も提供される。例示的な免疫細胞には、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞および／またはマクロファージが含まれる。いくつかの例では、細胞はＴ細胞である。いくつかの例では、細胞は、配列番号３または配列番号３のアミノ酸２２～５３８と少なくとも９０％の同一性を有するＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する。いくつかの例では、細胞は、配列番号３または配列番号３のアミノ酸２２～５３８を含むかまたはそれからなるＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する。いくつかの例では、細胞は、配列番号３を含むかまたはそれからなるアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸２２～５３８をコードする核酸配列で形質導入またはトランスフェクトされる。さらなる例では、細胞に、配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を形質導入またはトランスフェクトする。いくつかの例では、核酸配列は、配列番号４を含むかまたはそれからなる。
【0094】
いくつかの実施形態では、細胞は、単離された免疫細胞、例えば単離されたＴ細胞（初代Ｔ細胞または対象から得られたＴ細胞等）、単離されたＮＫ細胞（初代ＮＫ細胞または対象から得られたＮＫ細胞等）、単離されたＮＫＴ細胞、または単離されたマクロファージである。細胞型は、発現マーカーの有無に基づいて同定することができ、例えば、ＮＫ細胞はＣＤ５６陽性かつＣＤ３陰性であり、Ｔ細胞はＣＤ４またはＣＤ８陽性であり得、ＮＫＴ細胞はＮＫ１．１陽性かつα／β Ｔ細胞受容体陽性であり、マクロファージは、ＰＲＲ、ＴＬＲ、Ｃ型レクチン受容体、スカベンジャー受容体、ＲＬＲおよびＮＯＤ様受容体を含むいくつかの受容体を発現する。いくつかの例では、細胞は単離されたＴ細胞である。さらなる例では、細胞は単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの例では、細胞は単離されたナイーブＴ細胞である。ナイーブＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、およびＣＤ１３２表面マーカーを発現し、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ６９、ＣＤ４５ＲＯ、またはＨＬＡ－ＤＲマーカーを欠く。いくつかの例では、免疫細胞は、対象の末梢血、リンパ節、胸腺、骨髄、腫瘍組織、脂肪組織、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、または臍帯血から得られる。非限定的な例では、細胞は、対象の末梢血から単離されたＴ細胞である。さらなる例では、対象から得られた免疫細胞は、例えば、本明細書に開示されるベクターまたは核酸による形質転換または形質導入の前および／または後に、濃縮、精製および／または拡大培養される。いくつかの例では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはマクロファージ）は、がんを有する対象から採取および拡大培養される。いくつかの例では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはマクロファージ）は、がんを有していない対象から採取および拡大培養される。
【0095】
いくつかの実施形態では、細胞は、タンパク質発現および／またはウイルスの産生（例えば、レトロウイルスの産生）に適した細胞型である。例示的な細胞型としては、微生物（例えば、細菌または酵母）、古細菌、昆虫、真菌、植物または哺乳動物の細胞が挙げられる。特定の細胞株の非限定的な例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ならび不死化哺乳動物骨髄系およびリンパ系細胞株が挙げられる。一般的に使用される哺乳動物宿主細胞株の非限定的な例には、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＷＩ３８、ＢＨＫ、およびＣＯＳ細胞株が含まれるが、より高い発現、または望ましい翻訳後修飾（例えば、グリコシル化パターン）、または他の特徴を提供するように設計された細胞等の他の細胞株を使用してもよい。いくつかの例では、本明細書に開示される核酸またはベクター（例えば、本明細書に開示されるＩＬ１３－Ｒα２結合剤、またはＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲをコードする核酸もしくベクター）は、特定の生物、例えば細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、真菌（例えば、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、植物（例えば、タバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＮＴ－１））、または動物（例えば、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＴ細胞）における発現のためにコドン最適化されている。ベクター（例えば、発現ベクター）の適切な例を上に提供する。
【0096】
いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に開示されるＩＬ１３－Ｒα２結合剤もしくはＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲをコードする核酸、または核酸をコードするベクターで形質導入または形質転換（トランスフェクトを含む）される。細胞（例えば、免疫細胞）を形質転換する例示的な方法には、化学形質転換（リン酸カルシウム）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ヒートショック、リポフェクションおよび粒子衝突が含まれる。いくつかの例では、核酸またはベクターは、細胞を核酸またはベクターを含むナノ粒子と接触させることによって導入される。形質転換は、安定発現または一過性発現に使用することができる。形質転換または形質導入の後、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する細胞を、例えば、ＩＬ－１３Ｒα２に結合する標識抗体を使用するフローサイトメトリーによって検出および／または濃縮することができる。いくつかの例では、形質導入されたまたは形質転換された細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはマクロファージ）は、例えば、形質転換または形質導入後のある期間にわたって細胞培養によって拡大培養される。いくつかの例では、形質導入または形質転換された免疫細胞の一部または全部を、後の使用のために凍結保存する。
【0097】
ＶＩＩ．免疫療法の方法
開示されるＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する有効量の細胞（例えば、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する免疫細胞、例えば、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－ＮＫＴ細胞またはＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－マクロファージ細胞）を投与することを含む、がんを有する対象を処置する方法も本明細書に開示される。具体的な非限定的な例では、有効量のＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞が、対象に投与される。開示されるＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する細胞は、試料、例えば対象の末梢血試料から単離された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはマクロファージ）から作製され得、その後、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲで形質転換または形質導入され得る。いくつかの例では、細胞は、対象に対して自家（対象由来）である。他の例では、細胞は同種異系（ドナー由来）である。いくつかの例では、試料は、がんを有する対象に由来する。いくつかの例では、細胞は、試料からの単離後および／またはＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲによる形質転換もしくはトランスフェクション後に、濃縮、精製および／または拡大培養される。
開示されるＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する有効量の細胞（例えば、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する免疫細胞、例えば、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－ＮＫＴ細胞またはＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－マクロファージ細胞）を投与することを含む、がんを有する対象を処置する方法も本明細書に開示される。具体的な非限定的な例では、有効量のＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞が、対象に投与される。開示されるＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する細胞は、試料、例えば対象の末梢血試料から単離された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはマクロファージ）から作製され得、その後、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲで形質転換または形質導入され得る。いくつかの例では、細胞は、対象に対して自家（対象由来）である。他の例では、細胞は同種異系（ドナー由来）である。いくつかの例では、試料は、がんを有する対象に由来する。いくつかの例では、細胞は、試料からの単離後および／またはＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲによる形質転換もしくはトランスフェクション後に、濃縮、精製および／または拡大培養される。
【0098】
いくつかの実施形態では、方法は、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する細胞および薬学的に許容され得る担体を含む組成物を対象に投与することを含む。いくつかの例では、細胞は、安全スイッチシステムをコードするベクターを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲをコードするベクターおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの例では、ベクターは安全スイッチシステムをコードする。
【0099】
「薬学的に許容され得る担体」は、薬学的投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａｄｅｊａｒｅ（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ，２３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０２１）を参照）。そのような担体または希釈剤の例には、水、食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、平衡塩類溶液、および５％ヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。リポソームおよび固定油等の非水性ビヒクルも使用することができる。補助活性化合物も組成物に組み込むことができる。投与可能な組成物を調製するための実際の方法としては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａｄｅｊａｒｅ（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ，２３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０２１）を参照されたい。
【0100】
いくつかの例では、組成物は、約１０４～１０１２個のＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ細胞（例えば、約１０４～１０８個の細胞、約１０６～１０８個の細胞、または約１０６～１０１２個の細胞）を含む。いくつかの例では、組成物は、少なくとも約１０４、１０５、１０６または１０７個のＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ細胞を含む。他の例では、組成物は、約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９または１０１０個以下のＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ細胞を含む。いくつかの例では、組成物は、約１０４～１０１０個のＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ細胞／ｋｇ（例えば、約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０細胞／ｋｇ）が対象に投与されるように調製され得る。適切な用量は、臨床試験を通して決定することができる。
【0101】
ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ細胞の集団は、典型的には、非経口的に、例えば、静脈内投与されるが、腫瘍または腫瘍の近く（例えば、局所投与）への注射もしくは注入、または腹膜腔への投与も使用することができる。適切な投与経路は、対象、処置されている状態、および他の要因等の要因に基づいて、熟練した臨床医によって決定することができる。
【0102】
ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ細胞の集団の複数回用量を対象に投与することができる。例えば、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ細胞を、毎日、１日おきに、１週間に２回、毎週、１週間おきに、３週間毎に、毎月、またはそれ未満の頻度で投与することができる。熟練した臨床医は、対象、処置されている状態、以前の治療歴、および他の要因に基づいて投与スケジュールを選択することができる。
【0103】
いくつかの例では、開示されるＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する細胞の有効量は、対象におけるがんの１またはそれを超える徴候または症状を予防するため、処置するため、低減するためおよび／または改善するために十分な量である。他の例では、有効量は、ＩＬ－１３Ｒα２を発現する腫瘍細胞を標的化し、排除するのに十分な量である。いくつかの例では、有効量は、対象におけるがんの成長または転移を阻害または遅延させるのに十分な量である。別の例では、有効量は、対象における腫瘍量または腫瘍密度を低下させるのに十分な量である。
【0104】
いくつかの実施形態では、対象には、例えば、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ細胞の生存および／または成長を支援するために、１またはそれを超えるサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１および／またはＩＬ－１２のうちの１つまたはそれより多く）が更に投与される。サイトカイン（複数可）は、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ細胞の前、後、または実質的に同時に投与することができる。いくつかの例では、約１～約５のサイトカインが対象に投与され、例えば、約１～約４、約１～約３、約１～約２、約２～約５、約２～約４、約２～約３、約３～約５、約３～約４または約４～約５のサイトカインが、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ細胞の前、後または実質的に同時に投与される。いくつかの例では、ＩＬ－２、ＩＬ－７またはＩＬ－１５のうちの少なくとも１つが、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ細胞の前、後または実質的に同時に対象に投与される。いくつかの例では、少なくとも１つのサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７および／またはＩＬ－１５）が、例えば、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ細胞と共に同時に投与される。
【0105】
いくつかの例では、開示のＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する細胞（例えば、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－ＮＫＴ細胞またはＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－マクロファージ細胞）を、安全スイッチシステムをコードするベクターで形質転換またはトランスフェクトする。いくつかの例では、治療有効量のＣＩＤ（例えば、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＡＰ２１９６７）を対象に投与して安全スイッチシステムを活性化させる。安全スイッチシステムは、任意の所望の時間、例えば処置の終了時に活性化させることができる。いくつかの例では、ＣＩＤは、成長を制御するために、または対象における形質転換された細胞もしくはトランスフェクトされた細胞の活性を増加させるために投与される。いくつかの例では、安全スイッチは誘導可能なアポトーシス促進性分子であり、誘導可能なアポトーシス促進性分子は、治療有効量のＣＩＤを対象に投与することによって活性化される。いくつかの例では、ＣＩＤを投与することは、例えば、対象における形質転換またはトランスフェクトされた細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を排除することによって、対象において形質転換またはトランスフェクトされた細胞を排除する。他の例では、安全スイッチは誘導性活性化システムであり、誘導性活性化システムは、有効量のＣＩＤを対象に投与することによって活性化される。いくつかの例では、ＣＩＤを投与することは、適切な対照と比較して、対象における形質転換またはトランスフェクト細胞の活性を増加させる。例えば、対象における形質転換された細胞またはトランスフェクト細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも４００％またはそれを超える増殖、サイトカイン産生または腫瘍標的化を増加させることによる。安全スイッチシステムに関するさらなる情報は、例えば、Ｇａｒｇｅｔｔ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ（２０１４）Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：２３５ ａｎｄ Ｇｅｒｋｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．７（１１）：１３０６－１３１９に見出すことができる。
【0106】
いくつかの例では、対象は、ＩＬ－１３Ｒα２を発現するがんを有する。例示的ながんには、肉腫、癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性悪性疾患、膵臓がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、子宮がん、前立腺がん、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、副腎癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭状癌、褐色細胞腫、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌、黒色腫、およびＣＮＳ腫瘍（神経膠腫（脳幹神経膠腫および混合神経膠腫等）、神経膠芽腫（多形性神経膠芽腫としても知られる）星細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、シュワン細胞腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、頭頸部がん、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫および脳転移が含まれる。がんには、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（緩徐進行型または高悪性度型）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病または骨髄異形成等の白血病等の血液学的（または血行性）がんも含まれる。
【0107】
いくつかの例では、対象は、例えば、同じタイプの非がん性細胞と比較して、ＩＬ－１３Ｒα２を過剰発現するがんを有する。いくつかの例では、対象は固形腫瘍を有する。更なる例では、対象は、膵臓がん、神経膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、卵巣がん、子宮がん、前立腺がん、乳がん、黒色腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞癌、カポジ肉腫、または副腎癌を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３Ｒα２を発現または過剰発現するがんを有する対象が、処置のために選択される。
【0108】
いくつかの実施形態では、対象は、手術、放射線、化学療法、追加の免疫療法または他の治療のうちの１つまたはそれより多く等のさらなる処置を受ける。例示的な化学療法剤としては（限定されるものではないが）、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタードまたはクロラムブシル等）、アルキルスルホネート（ブスルファン等）、ニトロソ尿素（カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、またはダカルバジン等）；葉酸類似体（メトトレキサート等）、ピリミジン類似体（５－ＦＵまたはシタラビン等）、およびプリン類似体（メルカプトプリンまたはチオグアニン等）等の代謝拮抗物質；または天然産物、例えばビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビンデシン等）、エピポドフィロトキシン（エトポシドまたはテニポシド等）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、またはマイトマイシンＣ）、および酵素（Ｌ－アスパラギナーゼ等）が挙げられる。追加の薬剤としては、白金配位錯体（シスプラチンとしても知られているシス－ジアミン－ジクロロ白金ＩＩ等）、置換尿素（ヒドロキシ尿素等）、メチルヒドラジン誘導体（プロカルバジン等）、および副腎皮質抑制剤（ミトタンおよびアミノグルテチミド等）；副腎皮質ステロイド（プレドニゾン等）、プロゲスチン（カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲストロール等）、エストロゲン（ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール等）、抗エストロゲン（タモキシフェン等）、およびアンドロゲン（プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン等）等のホルモンおよび拮抗薬が挙げられる。最も一般的に使用される化学療法薬の例としては、アドリアマイシン、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））Ａｒａ－Ｃ（シタラビン）、カルムスチン、ブスルファン、ロムスチン、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、ダウノルビシン、ダカルバジン、５－フルオロウラシル、フルダラビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、パクリタキセル（または他のタキサン、例えばドセタキセル）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ＶＰ－１６が挙げられるが、より新しい薬物としては、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、ロイスタチン、ナベルビン、リツキシマブ（リツキサン（登録商標））イマチニブ（ＳＴＩ－５７１）、トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ（登録商標））、カペシタビン、イブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））およびカルシトリオールが挙げられる。熟練した臨床医は、対象、処置されているがん、処置歴、および他の要因等の要因に応じて、対象のための適切な追加の治療法（本明細書に列挙されているものまたは他の現在の治療法から）を選択することができる。
【0109】
いくつかの例では、対象には、追加の治療薬、例えば、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ１または抗ＰＤＬ１）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、細胞周期チェックポイント阻害剤、アドレノメデュリン、ＩＬ－１３－ＰＥ免疫毒素、またはそれらの２もしくはそれより多くの任意の組み合わせが投与される。追加の治療薬の投与は、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する細胞の投与の前、後、または実質的に同時に行われ得る。
【0110】
いくつかの例では、追加の治療薬は、腫瘍細胞上のＩＬ－１３Ｒα２の発現を増加させる。例えば、ＨＤＡＣ阻害剤による処置は、ＩＬ－１３Ｒα２をほとんどまたは全く発現しない膵臓がん細胞株においてＩＬ－１３Ｒα２を劇的にアップレギュレートすることが報告されている。これらの阻害剤はまた、より高いレベルのＩＬ－１３Ｒα２を発現する細胞においてＩＬ－１３Ｒα２を適度にアップレギュレートした。ＩＬ－１３Ｒα２のアップレギュレーションは、膵臓腫瘍細胞を、ＩＬ－１３Ｒα２を発現する細胞を標的とする免疫毒素であるＩＬ－１３－ＰＥに対して感作させ、相乗的な抗腫瘍効果をもたらすことが見出された（Ｆｕｊｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９：３７，２０１１を参照）。したがって、いくつかの例では、対象に、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）、ＳＰ６００１２５（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＳＲ１１３０２（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、またはロミデプシンのうちの１つまたはそれより多く等のＨＤＡＣ阻害剤を投与する。さらなる例では、対象には、ＩＬ－１３Ｒα２発現を増加させることも示されているアドレノメデュリンが投与される（Ｊｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８：９３１１－９３１７，２００８）。いくつかの例では、ＨＤＡＣ阻害剤またはアドレノメデュリンは、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する細胞と実質的に同時に投与される。他の例では、ＨＤＡＣ阻害剤またはアドレノメデュリンは、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する細胞を投与する前に、例えば、少なくとも１日前、少なくとも２日前、少なくとも３日前、少なくとも４日前、少なくとも５日前、少なくとも６日前、少なくとも７日前、少なくとも８日前、少なくとも９日前、少なくとも１２日間、少なくとも１４日間、少なくとも３週間前、少なくとも４週間前、少なくとも１ヶ月前またはそれより前に投与される。複数回用量のＨＤＡＣ阻害剤またはアドレノメデュリンを対象に投与することができ、例えば、１日２回、１日１回、１日おきに、週に２回、毎週、隔週に、３週ごとに、毎月、またはより少ない頻度で投与することができる。熟練した臨床医は、対象、処置されている状態、以前の処置歴、腫瘍量および種類、疾患の臨床病期およびグレード、対象の全身健康状態、ならびに他の要因に基づいて投与スケジュールを選択することができる。
【0111】
いくつかの例では、対象にはチェックポイント阻害剤が投与される。いくつかの例では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＣＤＫ４、および／またはＣＤＫ６を標的とする。例示的な阻害剤には、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、セミプリマブ、パルボシクリブ、リボシクリブ、およびアベマシクリブが含まれる。チェックポイント阻害剤は、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する細胞と実質的に同時に投与され得る。いくつかの例では、チェックポイント阻害剤は、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する細胞を投与する前に、例えば、少なくとも１日前、少なくとも２日前、少なくとも３日前、少なくとも４日前、少なくとも５日前、少なくとも６日前、少なくとも７日前、少なくとも８日前、少なくとも９日前、少なくとも１２日間、少なくとも１４日間、少なくとも３週間前、少なくとも４週間前、少なくとも１ヶ月前またはそれより前に投与される。複数回用量のチェックポイント阻害剤を対象に投与することができ、例えば、１日２回、１日１回、１日おきに、週に２回、毎週、隔週に、３週ごとに、毎月、またはより少ない頻度で投与することができる。熟練した臨床医は、対象、処置されている状態、以前の治療歴、腫瘍量および種類、疾患の臨床病期およびグレードおよび対象の全身健康状態、ならびに他の要因に基づいて投与スケジュールを選択することができる。
【0112】
いくつかの実施形態では、対象に、切断型シュードモナス外毒素（例えば、Ｋｉｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．７（６）：１５７９－１５８７，２００８を参照）にコンジュゲートされたＩＬ－１３を含む組換えタンパク質等のＩＬ－１３ＰＥ免疫毒素を投与する。ＩＬ－１３ＰＥ免疫毒素は、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する細胞と実質的に同時に投与され得る。いくつかの例では、ＩＬ－１３ＰＥ免疫毒素は、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲを発現する細胞を投与する前に、例えば、少なくとも１日前、少なくとも２日前、少なくとも３日前、少なくとも４日前、少なくとも５日前、少なくとも６日前、少なくとも７日前、少なくとも８日前、少なくとも９日前、少なくとも１２日間、少なくとも１４日間、少なくとも３週間前、少なくとも４週間前、少なくとも１ヶ月前またはそれより前に投与される。複数回用量のＩＬ－１３ＰＥ免疫毒素を対象に投与することができ、例えば、１日２回、１日１回、１日おきに、週に２回、毎週、隔週に、３週ごとに、毎月、またはより少ない頻度で投与することができる。熟練した臨床医は、対象、処置されている状態、以前の治療歴、腫瘍量および種類、疾患の臨床病期およびグレードおよび対象の全身健康状態、ならびに他の要因に基づいて投与スケジュールを選択することができる。いかなる特定の理論にも拘束されないが、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ細胞の投与前にＩＬ－１３－ＰＥを投与することにより、腫瘍間質細胞の密度が低下し、それにより、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ細胞が腫瘍に浸潤するための空間が腫瘍微小環境に作り出されると考えられる。
【実施例】
【0113】
以下の実施例は、特定の特徴および／または実施形態を説明するために提供される。これらの例は、本開示を記載された特定の特徴または実施形態に限定すると解釈されるべきではない。
【0114】
実施例１
材料および方法
細胞株：
ヒトＪｕｒｋａｔ－Ｔ細胞、Ａ１７２、Ｕ８７ＭＧおよびＴ９８Ｇ神経膠腫細胞株をＡＴＣＣから入手し、供給業者の指示に従って増殖させた。Ｕ２５１神経膠腫細胞株をＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ完全培地で維持した。Ｔ９８ＧおよびＵ８７ＭＧ神経膠腫細胞株を、１０％ＦＢＳを補充したＥＭＥＭ完全培地において維持した。これらの細胞株は、ｍＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲおよびタンパク質発現の免疫細胞化学（ＩＣＣ）分析によってＩＬ－１３Ｒα２発現について以前に特徴づけられた（Ｊｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：１１６８－１１７２）。２つのＩＬ－１３Ｒα２陽性神経膠腫細胞株、Ｕ２５１およびＵ８７ＭＧを、ＳｕｒｅＳｉｌｅｎｃｉｎｇ（登録商標）ｓｈＲＮＡプラスミド（Ｑｉａｇｅｎ（メリーランド州ゲーサーズバーグ））を製造業者の説明書に従って使用して、ｓｉＲＮＡ技術によるＩＬ－１３Ｒα２遺伝子サイレンシングのために使用した。これらの細胞株は、いくつかの生物学的アッセイにおいて陰性対照として役立った。
材料および方法
細胞株：
ヒトＪｕｒｋａｔ－Ｔ細胞、Ａ１７２、Ｕ８７ＭＧおよびＴ９８Ｇ神経膠腫細胞株をＡＴＣＣから入手し、供給業者の指示に従って増殖させた。Ｕ２５１神経膠腫細胞株をＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ完全培地で維持した。Ｔ９８ＧおよびＵ８７ＭＧ神経膠腫細胞株を、１０％ＦＢＳを補充したＥＭＥＭ完全培地において維持した。これらの細胞株は、ｍＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲおよびタンパク質発現の免疫細胞化学（ＩＣＣ）分析によってＩＬ－１３Ｒα２発現について以前に特徴づけられた（Ｊｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：１１６８－１１７２）。２つのＩＬ－１３Ｒα２陽性神経膠腫細胞株、Ｕ２５１およびＵ８７ＭＧを、ＳｕｒｅＳｉｌｅｎｃｉｎｇ（登録商標）ｓｈＲＮＡプラスミド（Ｑｉａｇｅｎ（メリーランド州ゲーサーズバーグ））を製造業者の説明書に従って使用して、ｓｉＲＮＡ技術によるＩＬ－１３Ｒα２遺伝子サイレンシングのために使用した。これらの細胞株は、いくつかの生物学的アッセイにおいて陰性対照として役立った。
【0115】
ｓｃＦｖ－ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターの設計：
ＩＬ－１３Ｒα２に対する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体配列（外部ドメインとして）、ＣＤ３ζならびにＣＤ２８および４－１ＢＢエンドドメイン配列と共にＣＤ２８膜貫通ドメインからなる第３世代ＣＡＲコンストラクトを設計し、コドン最適化し、ｐＵＣ５７単純サブクローニングベクター内でＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ニュージャージー州）によって合成した。新規ｓｃＦｖは、Ｇｒｉｆｆｉｎ．１ライブラリー（合成ｖ遺伝子セグメントから作製されたｓｃＦｖライブラリー）を使用して以前にクローニングされ、ＶＨおよびＶＬヒト合成Ｆａｂ ＬｏｘライブラリーベクターをファージミドベクターｐＨＥＮ２に以前に記載（Ｋｉｏｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．７：１５７９－１５８７）されたように再クローニングすることによって誘導された。ｈｕＩＬ－１３Ｒα２ Ｆｃキメラタンパク質に対する結合親和性を改善するためにセグメントを再パンニング（ｒｅｐａｎｎｉｎｇ）するための新規アプローチを使用した。ＣＡＲ－Ｔコンストラクトをコドン最適化し、Ｂａｍ ＨＩおよびＮｏｔＩ部位に隣接させ、ｐＣＤＨ－ＭＳＣＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－ｃｏｐＧＦＰ－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏレンチウイルスベクター（システムバイオサイエンス、マサチューセッツ州）に入れた。この移入プラスミドを、３つのヘルパープラスミド（ｐＣＤ／ＮＬ－ＢＨΔ１、ｐＣＥＦ－ＶＳＶ－ＧおよびｐＣＭＶ－Ｒｅｖ）との同時トランスフェクションによって２９３Ｔ細胞にパッケージングして、ＣＡＲ－ＩＬ１３ Ｒα２－ＣＡＲ擬似レンチベクターを発現する自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクターを作製し、これを超遠心分離によって更に精製した。
ＩＬ－１３Ｒα２に対する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体配列（外部ドメインとして）、ＣＤ３ζならびにＣＤ２８および４－１ＢＢエンドドメイン配列と共にＣＤ２８膜貫通ドメインからなる第３世代ＣＡＲコンストラクトを設計し、コドン最適化し、ｐＵＣ５７単純サブクローニングベクター内でＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ニュージャージー州）によって合成した。新規ｓｃＦｖは、Ｇｒｉｆｆｉｎ．１ライブラリー（合成ｖ遺伝子セグメントから作製されたｓｃＦｖライブラリー）を使用して以前にクローニングされ、ＶＨおよびＶＬヒト合成Ｆａｂ ＬｏｘライブラリーベクターをファージミドベクターｐＨＥＮ２に以前に記載（Ｋｉｏｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．７：１５７９－１５８７）されたように再クローニングすることによって誘導された。ｈｕＩＬ－１３Ｒα２ Ｆｃキメラタンパク質に対する結合親和性を改善するためにセグメントを再パンニング（ｒｅｐａｎｎｉｎｇ）するための新規アプローチを使用した。ＣＡＲ－Ｔコンストラクトをコドン最適化し、Ｂａｍ ＨＩおよびＮｏｔＩ部位に隣接させ、ｐＣＤＨ－ＭＳＣＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－ｃｏｐＧＦＰ－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏレンチウイルスベクター（システムバイオサイエンス、マサチューセッツ州）に入れた。この移入プラスミドを、３つのヘルパープラスミド（ｐＣＤ／ＮＬ－ＢＨΔ１、ｐＣＥＦ－ＶＳＶ－ＧおよびｐＣＭＶ－Ｒｅｖ）との同時トランスフェクションによって２９３Ｔ細胞にパッケージングして、ＣＡＲ－ＩＬ１３ Ｒα２－ＣＡＲ擬似レンチベクターを発現する自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクターを作製し、これを超遠心分離によって更に精製した。
【0116】
ｓｃＦｖ ＩＬ－１３Ｒα２における抗原結合残基および相補性決定領域（ＣＤＲ）の分析：
標準化されたナンバリング方法を使用して、抗体のその標的抗原に対する相互作用および／または親和性に影響を及ぼす軽鎖および重鎖からのＣＤＲ、フレームワークおよび残基を規定した。Ｋａｂａｔナンバリングスキーム（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ）を使用してアミノ酸組成の統計的変動性を研究するために、抗体可変ドメインの一般的なナンバリングスキームを使用してアミノ酸配列を分析した。重鎖および軽鎖の両方の残基分布の分析、ならびにそれらの長さを含むＣＤＲ配列の分析を行った。
標準化されたナンバリング方法を使用して、抗体のその標的抗原に対する相互作用および／または親和性に影響を及ぼす軽鎖および重鎖からのＣＤＲ、フレームワークおよび残基を規定した。Ｋａｂａｔナンバリングスキーム（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ）を使用してアミノ酸組成の統計的変動性を研究するために、抗体可変ドメインの一般的なナンバリングスキームを使用してアミノ酸配列を分析した。重鎖および軽鎖の両方の残基分布の分析、ならびにそれらの長さを含むＣＤＲ配列の分析を行った。
【0117】
これらのデータを、ＣＤＲを形成し、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームに従ってＣＤＲＬ１およびＣＤＲＨ１内の点の位置番号を補正した抗体可変領域についての構造ベースのナンバリングスキーム、重鎖および軽鎖のフレームワーク領域内の挿入点の補正に使用されたＭａｒｔｉｎナンバリングスキーム、ならびに抗体軽鎖および重鎖ならびにＴ細胞受容体鎖由来の可変ドメインを含む免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質配列を強調するＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（登録商標）（ＩＭＧＴ（登録商標）、Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（登録商標）ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ、フランス国モンペリエ）ナンバリングスキーム（ｉｍｇｔ．ｏｒｇ；ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｏｘｐｉｇ／ＡＮＡＲＣＩ，ａｃａｄｅｍｉｃ．ｏｕｐ．ｃｏｍ／ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ａｒｔｉｃｌｅ／３２／２／２９８／１７４３８９４；ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ／ａｂｙｓｉｓ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｉｎｐｕｔ／ ｋｅｙ＿ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ｋｅｙ＿ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．ｃｇｉ；ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ／ｃｇｉ／Ｃｏｌｌｉｅｒ－ｄｅ－Ｐｅｒｌｅｓ．ｃｇｉ；ａｎｄ ｃｈｅｍｏｇｅｎｏｍｉｘ．ｃｏｍ）により更に分析し、比較した。
【0118】
ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造：
ヒトＰＢＭＣを、ＮＩＨの輸血医学部門に血液を提供した正常な健康な血液ドナーのバフィーコートから単離した。ＳｔｒａｉｇｈｔＦｒｏｍ（登録商標）Ｂｕｆｆｙ Ｃｏａｔキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて、正常ヒト血液ドナーバフィーコートから単離したＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ細胞からＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞活性化のために、細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体でコーティングされた磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）により３：１の比（Ｔ細胞対ビーズ）で活性化し、レンチウイルスベクターにより異なる感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）で形質導入した。Ｔ細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２ならびに１０ｎｇ／ｍｌの各ＩＬ－７およびＩＬ－１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を補充したＴ細胞培養培地（ＴＣＭ）中、０．６～１×１０６細胞／ｍＬで培養物中で維持した。これらのＰＢＭＣ由来ＣＡＲ－Ｔ細胞は、原稿全体を通してＣＡＲ－Ｔと称される。
ヒトＰＢＭＣを、ＮＩＨの輸血医学部門に血液を提供した正常な健康な血液ドナーのバフィーコートから単離した。ＳｔｒａｉｇｈｔＦｒｏｍ（登録商標）Ｂｕｆｆｙ Ｃｏａｔキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて、正常ヒト血液ドナーバフィーコートから単離したＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ細胞からＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞活性化のために、細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体でコーティングされた磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）により３：１の比（Ｔ細胞対ビーズ）で活性化し、レンチウイルスベクターにより異なる感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）で形質導入した。Ｔ細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２ならびに１０ｎｇ／ｍｌの各ＩＬ－７およびＩＬ－１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を補充したＴ細胞培養培地（ＴＣＭ）中、０．６～１×１０６細胞／ｍＬで培養物中で維持した。これらのＰＢＭＣ由来ＣＡＲ－Ｔ細胞は、原稿全体を通してＣＡＲ－Ｔと称される。
【0119】
ヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔと呼ばれる）における導入遺伝子およびシグナル伝達ドメインの同一性を確認するために、並行したセットの実験を形質導入および拡大培養に使用した。
【0120】
形質導入されたＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞における導入遺伝子についての間接免疫蛍光アッセイ：
形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞またはＴ細胞上のｓｃＦｖ－ＩＬ－１３Ｒα２発現の検出のため、ポリ－Ｌ－リシン被覆４ウェルチャンバースライドにＪｕｒｋａｔ－ＣＡＲ細胞またはＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれかを７５，０００個播種することによって新規な間接免疫蛍光アッセイを使用した。簡潔には、ビオチン化組換えヒトＩＬ－１３Ｒα２ Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）マイクロスルホ－ＮＨＳ－ビオチン化キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して生産した。次いで、形質導入されたＪｕｒｋａｔおよびＴ細胞を、５００ｎｇ／ｍｌの精製ビオチン化組換えヒトＩＬ－１３Ｒα２ Ｆｃキメラタンパク質とインキュベートし、続いてストレプトアビジン－Ａｌｅｘａ ５９４（登録商標）（０．５μｇ／ｍｌ）とインキュベートして、ｓｃＦｖ－ＩＬ－１３Ｒα２発現細胞において赤色蛍光を発生させた。２＋以上の蛍光強度を発現する細胞を、Ｎｉｋｏｎ（登録商標）落射蛍光顕微鏡を使用して２００倍の倍率で計数した。各値は、盲検様式で決定され、陽性細胞％として表される４回の実験の平均±ＳＤである。
形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞またはＴ細胞上のｓｃＦｖ－ＩＬ－１３Ｒα２発現の検出のため、ポリ－Ｌ－リシン被覆４ウェルチャンバースライドにＪｕｒｋａｔ－ＣＡＲ細胞またはＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれかを７５，０００個播種することによって新規な間接免疫蛍光アッセイを使用した。簡潔には、ビオチン化組換えヒトＩＬ－１３Ｒα２ Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）マイクロスルホ－ＮＨＳ－ビオチン化キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して生産した。次いで、形質導入されたＪｕｒｋａｔおよびＴ細胞を、５００ｎｇ／ｍｌの精製ビオチン化組換えヒトＩＬ－１３Ｒα２ Ｆｃキメラタンパク質とインキュベートし、続いてストレプトアビジン－Ａｌｅｘａ ５９４（登録商標）（０．５μｇ／ｍｌ）とインキュベートして、ｓｃＦｖ－ＩＬ－１３Ｒα２発現細胞において赤色蛍光を発生させた。２＋以上の蛍光強度を発現する細胞を、Ｎｉｋｏｎ（登録商標）落射蛍光顕微鏡を使用して２００倍の倍率で計数した。各値は、盲検様式で決定され、陽性細胞％として表される４回の実験の平均±ＳＤである。
【0121】
フローサイトメトリー分析：
ＢＤ（登録商標）ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）またはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州サンノゼ）機器を使用して免疫蛍光データを取得し、これを最終データ分析およびグラフ表示のためにＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ｖ．７（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ、オレゴン州アシュランド）ソフトウェアで分析した。アイソタイプ対照は免疫グロブリンＩｇＧ１－ＰＥ（ＩｇＧ１－ＰＥ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、マサチューセッツ州デンバー（Ｄｅｎｖｅｒ））であった。ＣＤ２８細胞質およびＣＤ３ζエンドドメインを、抗ＣＤ２８．２マウスｍＡｂ ＰＥコンジュゲートまたはＣＤ３ζモノクローナル抗体ＰＥコンジュゲート（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州カールスバッド）で免疫染色した。透過処理したＣＡＲ－ＪｕｒｋａｔまたはＣＡＲ－Ｔ細胞を抗ＣＤ２８およびＣＤ３ζ抗体で免疫染色した。データを、最頻値に正規化して表した。
ＢＤ（登録商標）ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）またはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州サンノゼ）機器を使用して免疫蛍光データを取得し、これを最終データ分析およびグラフ表示のためにＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ｖ．７（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ、オレゴン州アシュランド）ソフトウェアで分析した。アイソタイプ対照は免疫グロブリンＩｇＧ１－ＰＥ（ＩｇＧ１－ＰＥ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、マサチューセッツ州デンバー（Ｄｅｎｖｅｒ））であった。ＣＤ２８細胞質およびＣＤ３ζエンドドメインを、抗ＣＤ２８．２マウスｍＡｂ ＰＥコンジュゲートまたはＣＤ３ζモノクローナル抗体ＰＥコンジュゲート（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州カールスバッド）で免疫染色した。透過処理したＣＡＲ－ＪｕｒｋａｔまたはＣＡＲ－Ｔ細胞を抗ＣＤ２８およびＣＤ３ζ抗体で免疫染色した。データを、最頻値に正規化して表した。
【0122】
ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴ細胞活性化マーカー発現の評価：
ＣＡＲ－Ｔ細胞のＴ細胞活性化を、間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ、ａｂＣＡＭ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）によって、細胞をブレフェルジンＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）で処理した後のＴ細胞活性化マーカーとしてのＣＤ４４、ＣＤ２５、ＣＤ６９およびインターフェロン－γの細胞内発現によって評価した。各値は、２＋以上の免疫蛍光強度を発現する陽性細胞％について盲検様式でスコア化された４つの独立した読み取り値の平均±ＳＤとして表される。
ＣＡＲ－Ｔ細胞のＴ細胞活性化を、間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ、ａｂＣＡＭ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）によって、細胞をブレフェルジンＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）で処理した後のＴ細胞活性化マーカーとしてのＣＤ４４、ＣＤ２５、ＣＤ６９およびインターフェロン－γの細胞内発現によって評価した。各値は、２＋以上の免疫蛍光強度を発現する陽性細胞％について盲検様式でスコア化された４つの独立した読み取り値の平均±ＳＤとして表される。
【0123】
ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞生存度および増殖分析：
トリパンブルー排除技術によって細胞増殖中にＣＡＲ－Ｔ細胞培養物の細胞生存度を調べた。ＣＡＲ－Ｔ細胞の健康を更に評価するために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６Ｒ（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ ｏｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）によって細胞増殖を評価した。Ｆｉｓｈｅｒ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）。既知数のＣＡＲ－Ｔ細胞（２，５００細胞／ウェル）を９６ウェル培養プレートの４連ウェルに播種し、ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で維持した。３、５、および７日目に、２０マイクロリットルのＭＴＳ試薬を各ウェルに添加した。４９０ｎｍでの吸光度を測定することによって還元型ＭＴＳテトラゾリウムの光学密度を測定することによって、各ウェル中の増殖している細胞の数を決定した。実験を４連で行い、結果を平均±ＳＤとして表した。
トリパンブルー排除技術によって細胞増殖中にＣＡＲ－Ｔ細胞培養物の細胞生存度を調べた。ＣＡＲ－Ｔ細胞の健康を更に評価するために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６Ｒ（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ ｏｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）によって細胞増殖を評価した。Ｆｉｓｈｅｒ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）。既知数のＣＡＲ－Ｔ細胞（２，５００細胞／ウェル）を９６ウェル培養プレートの４連ウェルに播種し、ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で維持した。３、５、および７日目に、２０マイクロリットルのＭＴＳ試薬を各ウェルに添加した。４９０ｎｍでの吸光度を測定することによって還元型ＭＴＳテトラゾリウムの光学密度を測定することによって、各ウェル中の増殖している細胞の数を決定した。実験を４連で行い、結果を平均±ＳＤとして表した。
【0124】
ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞遊走能および浸潤能の解析
ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞遊走能および浸潤能を、５μｍの孔径を有する２４ウェルＣｈｅｍｏＴｘ（登録商標）プレート（ａｂＣａｍ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）において評価した（走化性アッセイ）。下部チャンバーに、１０、５０および１０００ｎｇ／ｍｌのｈＵ－ＩＬ－１３Ｒα２ Ｆｃを含む６００μＬの非馴化ダルベッコ改変イーグル培地（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１％ウシ胎仔血清を含むＵ２５１またはＴ９８Ｇ腫瘍細胞培養馴化ダルベッコ改変イーグル培地、あるいは対照培地を添加した。上部チャンバーに５００，０００個のＣＡＲ－Ｔ細胞／２００μｌをロードした。３７℃で６時間後および２０時間後、残留細胞をポリカーボネートフィルターから掻き取り、プレートを４００×ｇで２分間遠心分離した。フィルターを除去し、下部チャンバー中の細胞をトリパンブルー排除技術によって計数した。遊走パーセンテージは、下部チャンバー中の細胞の数をウェルあたりの播種された細胞の総数で割ったものとして計算した。各値は、４つの独立した実験の平均±ＳＤとして表される。
ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞遊走能および浸潤能を、５μｍの孔径を有する２４ウェルＣｈｅｍｏＴｘ（登録商標）プレート（ａｂＣａｍ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）において評価した（走化性アッセイ）。下部チャンバーに、１０、５０および１０００ｎｇ／ｍｌのｈＵ－ＩＬ－１３Ｒα２ Ｆｃを含む６００μＬの非馴化ダルベッコ改変イーグル培地（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１％ウシ胎仔血清を含むＵ２５１またはＴ９８Ｇ腫瘍細胞培養馴化ダルベッコ改変イーグル培地、あるいは対照培地を添加した。上部チャンバーに５００，０００個のＣＡＲ－Ｔ細胞／２００μｌをロードした。３７℃で６時間後および２０時間後、残留細胞をポリカーボネートフィルターから掻き取り、プレートを４００×ｇで２分間遠心分離した。フィルターを除去し、下部チャンバー中の細胞をトリパンブルー排除技術によって計数した。遊走パーセンテージは、下部チャンバー中の細胞の数をウェルあたりの播種された細胞の総数で割ったものとして計算した。各値は、４つの独立した実験の平均±ＳＤとして表される。
【0125】
細胞傷害活性：
ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞死滅活性を決定するために、ロバストな均一蛍光ベースの非同位体細胞傷害アッセイを行った。ＩＬ－１３Ｒα２発現について陽性であるＵ２５１およびＵ８７ＭＧ神経膠腫細胞株を試験した。さらに、製造業者のプロトコルに従ってＵ２５１およびＵ８７ ＭＧ細胞株のトランスフェクションのため、以下のｓｉＲＮＡ配列ＧＣＴＡＣＣＡＴＴＴＧＧＴＴＴＣＡＴＣＴＴ（配列番号１７）を使用してＳｕｒｅＳｉｌｅｎｃｉｎｇ（商標）ｓｈＲＮＡプラスミド技術によってＩＬ－１３Ｒα２遺伝子をサイレンシングした（カタログ番号３３６３１３ ＫＨ００５９７Ｎ、ＱＩＡＧＥＮ、メリーランド州ジャーマンタウン）。ＩＬ－１３Ｒα２陽性腫瘍細胞およびＩＬ－１３Ｒα２サイレンシング腫瘍細胞を、細胞内カルセインバイオレット－アセトキシメチルエステル（Ｌｉｃｈｔｅｎｆｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １７２：２２７－２３９；Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８：１１３１－１１３５）によって標識した。１：１０、１：２０、１：３０、１：４０および１：５０の比の標的：エフェクター細胞の６時間の共培養の終わりに回収された上清中のカルセインバイオレットの放出を、蛍光プレートリーダーで定量的に測定した。データは、標的ＣＡＲ－Ｔ細胞とエフェクターＣＡＲ－Ｔ細胞との共培養を含む４連で行われた４回の独立した実験の平均±ＳＤとして示されている。
ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞死滅活性を決定するために、ロバストな均一蛍光ベースの非同位体細胞傷害アッセイを行った。ＩＬ－１３Ｒα２発現について陽性であるＵ２５１およびＵ８７ＭＧ神経膠腫細胞株を試験した。さらに、製造業者のプロトコルに従ってＵ２５１およびＵ８７ ＭＧ細胞株のトランスフェクションのため、以下のｓｉＲＮＡ配列ＧＣＴＡＣＣＡＴＴＴＧＧＴＴＴＣＡＴＣＴＴ（配列番号１７）を使用してＳｕｒｅＳｉｌｅｎｃｉｎｇ（商標）ｓｈＲＮＡプラスミド技術によってＩＬ－１３Ｒα２遺伝子をサイレンシングした（カタログ番号３３６３１３ ＫＨ００５９７Ｎ、ＱＩＡＧＥＮ、メリーランド州ジャーマンタウン）。ＩＬ－１３Ｒα２陽性腫瘍細胞およびＩＬ－１３Ｒα２サイレンシング腫瘍細胞を、細胞内カルセインバイオレット－アセトキシメチルエステル（Ｌｉｃｈｔｅｎｆｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １７２：２２７－２３９；Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８：１１３１－１１３５）によって標識した。１：１０、１：２０、１：３０、１：４０および１：５０の比の標的：エフェクター細胞の６時間の共培養の終わりに回収された上清中のカルセインバイオレットの放出を、蛍光プレートリーダーで定量的に測定した。データは、標的ＣＡＲ－Ｔ細胞とエフェクターＣＡＲ－Ｔ細胞との共培養を含む４連で行われた４回の独立した実験の平均±ＳＤとして示されている。
【0126】
ＩＦＮ－γ放出：
ＩＬ１３ Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞（１００，０００）を、９６ウェル丸底プレートにおいて２０時間、ＩＬ－１３Ｒα２陽性、ＩＬ－１３Ｒα２陰性またはＩＬ－１３Ｒα２ ＫＯ腫瘍細胞と等しい部で共培養した。インキュベーション期間の終わりに、培養物を３，５００×ｇで１０分間遠心分離し、ＥＬＩＳＡアッセイ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によるＩＦＮ－γ分泌の定量的測定のために上清を回収した。
ＩＬ１３ Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞（１００，０００）を、９６ウェル丸底プレートにおいて２０時間、ＩＬ－１３Ｒα２陽性、ＩＬ－１３Ｒα２陰性またはＩＬ－１３Ｒα２ ＫＯ腫瘍細胞と等しい部で共培養した。インキュベーション期間の終わりに、培養物を３，５００×ｇで１０分間遠心分離し、ＥＬＩＳＡアッセイ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によるＩＦＮ－γ分泌の定量的測定のために上清を回収した。
【0127】
統計分析：
対応のないスチューデントｔ検定分析を使用してデータを比較した。Ｐ値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）を使用して計算した。０．０５未満のＰ値を有意差とみなした。二元配置分散分析を使用して、標識条件を比較し（ｎ＝４）、ウィルコクソン検定を使用して、細胞の生存または増殖についての両側グローバルＰ値を得た（ｎ＝４）。
対応のないスチューデントｔ検定分析を使用してデータを比較した。Ｐ値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）を使用して計算した。０．０５未満のＰ値を有意差とみなした。二元配置分散分析を使用して、標識条件を比較し（ｎ＝４）、ウィルコクソン検定を使用して、細胞の生存または増殖についての両側グローバルＰ値を得た（ｎ＝４）。
【0128】
実施例２
ｓｃＦｖ－ＩＬ－１３Ｒα２の同定および特徴づけ
ＩＬ－１３Ｒα２のｓｃＦｖに対する遺伝子を、合成ｖ遺伝子セグメントのｓｃＦｖフェーズディスプレイライブラリー、ならびにヒト合成Ｆａｂ Ｌｏｘライブラリーからの超可変アミノ酸構造組成を示すＶＨおよびＶＬの改良バージョンを用いて同定した。４つの異なるスキームによるアミノ酸残基分析に基づいて最適な抗原結合を提供する新規な保存されたｓｃＦｖフラグメントを選択した。分析により、構造ベースのｓｃＦｖ可変領域、ＣＤＲを形成する規定されたループ構造、および超可変アミノ酸組成を示すＣＤＲ内部の挿入点が明らかになった。クローン由来タンパク質は、先にクローン化されたｓｃＦｖ ＥＣＤ－ＩＬ－１３Ｒα２と比較して、組換えＩＬ－１３Ｒα２ Ｆｃタンパク質に対して４倍を上回る高い結合親和性を示した（Ｋｉｏｉ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ，７（６）：１５７９－８７，２００８）。
ｓｃＦｖ－ＩＬ－１３Ｒα２の同定および特徴づけ
ＩＬ－１３Ｒα２のｓｃＦｖに対する遺伝子を、合成ｖ遺伝子セグメントのｓｃＦｖフェーズディスプレイライブラリー、ならびにヒト合成Ｆａｂ Ｌｏｘライブラリーからの超可変アミノ酸構造組成を示すＶＨおよびＶＬの改良バージョンを用いて同定した。４つの異なるスキームによるアミノ酸残基分析に基づいて最適な抗原結合を提供する新規な保存されたｓｃＦｖフラグメントを選択した。分析により、構造ベースのｓｃＦｖ可変領域、ＣＤＲを形成する規定されたループ構造、および超可変アミノ酸組成を示すＣＤＲ内部の挿入点が明らかになった。クローン由来タンパク質は、先にクローン化されたｓｃＦｖ ＥＣＤ－ＩＬ－１３Ｒα２と比較して、組換えＩＬ－１３Ｒα２ Ｆｃタンパク質に対して４倍を上回る高い結合親和性を示した（Ｋｉｏｉ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ，７（６）：１５７９－８７，２００８）。
【0129】
改良されたｓｃＦｖ－ＩＬ－１３Ｒα２は、より高い結合親和性に関して配列特異的であり、ヒト細胞におけるより良好な発現のためにコドン最適化されている。さらに、改善されたｓｃＦｖ－ＩＬ－１３Ｒα２は、合成Ｖ遺伝子セグメントから作製されたライブラリーから生成されたため、ＩＬ－１３Ｒα２に対するその結合スペクトルは、単一モノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖと比較してより特異的であると予想される（例えば、Ｂａｌｙａｓｎｉｋｏｖａ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２８７（３６）：３０２１５－３０２２７，２０１２）。
【0130】
ＩＬ－１３Ｒα２の可変ドメインを、結合親和性および特異性に影響を及ぼし得るＣＤＲ、フレームワーク、ならび軽鎖および重鎖からのアミノ酸残基を規定するための残基ナンバリングスキームによって分析した。分析により、重鎖について様々な数の残基および長さを有する８つの異なる領域が明らかになった（図２および図３Ａ）。分析された配列は、挿入が正確な位置にのみ含まれ得る可変長のギャップを示した。重鎖中の残基の分布を図３Ａに示す。データ分析により、上行ループＢ（ＣＤＲ１）中のアミノ酸残基２７～３８、上行Ｃループ中のアミノ酸残基５５～５９、下行ＣループＣ（ＣＤＲ２）中のアミノ酸残基６２～６５、上行ループＦ中のアミノ酸残基１０５～１１０および下行ループＦ中のアミノ酸残基１１３～１１７（ＣＤＲ３）が重鎖の構造成分であることが更に明らかになった（図３Ｂ）。
【0131】
軽鎖の分析は、２７５アミノ酸のテール領域を含む９つの異なる領域を示した（図５Ａ）。アミノ酸残基の重鎖構造分析と同様に、上行Ｂループ中の軽鎖アミノ酸２４～２９および下行Ｃループ中のアミノ酸３６～３９はＣＤＲ１－軽に属し、上行Ｃループのアミノ酸５６～５７および下行Ｃループ中のアミノ酸６５～６９はＣＤＲ２－軽に属し、上行Ｆループ中のアミノ酸１０５～１０８および下行Ｇループ中のアミノ酸１１４～１１７はＣＤＲ３－軽に属し、保存されている（図５Ｂ）。Ｋａｂａｔナンバリングスキームによる分析後の重鎖および軽鎖におけるアミノ酸の分布を、それぞれ図６および図７に示す。
【0132】
また、ｓｃＦｖ残基配列のＫａｂａｔナンバリングを、抗体可変領域、ＣＤＲを形成するループ構造、抗体重鎖（図８）および軽鎖（図９）由来の可変ドメインを含むＣＤＲ－Ｈ（重）およびＣＤＲ－Ｌ（軽）鎖内の挿入点の位置番号、ならびに生殖系列Ｖのアミノ酸配列アラインメントのためのＩＭＧＴ、ＣｈｏｔｈｉａおよびＭａｒｔｉｎナンバリングスキームを用いた比較アラインメント分析のために分析した。これらの分析により、抗原結合に関与し、超可変アミノ酸組成を示すアミノ酸の構造的位置が明らかになった。
【0133】
実施例３
ｓｃＦｖ－ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲコンストラクトの開発
最適化されたＣＡＲ－Ｔコンストラクトを、ｐＣＤＨ－ＭＳＣＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－ｃｏｐＧＦＰ－Ｔ２ Ａ－Ｐｕｒｏレンチウイルスベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州）に入れた。配列決定データにより、ＣＡＲコンストラクトが１６３１ｂｐ長であり、６０．３５％のＧＣを含有し、ＣＤ８シグナルペプチド、ｓｃＦｖ－ＩＬ－１３Ｒα２導入遺伝子、ＣＤ８ヒンジ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞質ドメイン、４－１ＢＢおよびＣＤ３ζドメインからなることが確認された。図１０は、５’ＢａｍＨ１制限部位を有するＣＡＲ－Ｔコンストラクトの対応するアミノ酸配列、ならびに各特徴またはドメインの位置および配列を示す。ＣＡＲ－ＴプラスミドＤＮＡの制限消化により、１６４０ｂｐのバンドインサートおよび切断されたベクターの第２のバンドが明らかにされた（図１１）。
ｓｃＦｖ－ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲコンストラクトの開発
最適化されたＣＡＲ－Ｔコンストラクトを、ｐＣＤＨ－ＭＳＣＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－ｃｏｐＧＦＰ－Ｔ２ Ａ－Ｐｕｒｏレンチウイルスベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州）に入れた。配列決定データにより、ＣＡＲコンストラクトが１６３１ｂｐ長であり、６０．３５％のＧＣを含有し、ＣＤ８シグナルペプチド、ｓｃＦｖ－ＩＬ－１３Ｒα２導入遺伝子、ＣＤ８ヒンジ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞質ドメイン、４－１ＢＢおよびＣＤ３ζドメインからなることが確認された。図１０は、５’ＢａｍＨ１制限部位を有するＣＡＲ－Ｔコンストラクトの対応するアミノ酸配列、ならびに各特徴またはドメインの位置および配列を示す。ＣＡＲ－ＴプラスミドＤＮＡの制限消化により、１６４０ｂｐのバンドインサートおよび切断されたベクターの第２のバンドが明らかにされた（図１１）。
【0134】
組換えレンチウイルスベクターを３つのヘルパープラスミド（ｐＣＤ／ＮＬ－ＢＨΔ１、ｐＣＥＦ－ＶＳＶ－ＧおよびｐＣＭＶ－Ｒｅｖ）と共にパッケージングして、ＨＥＫ２９３Ｔ産生細胞株において最終的なｓｃＦｖ－ＣＡＲ－レンチウイルスを産生した。
【0135】
実施例４
ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製および特徴
ｓｃＦｖ－ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲコンストラクトをＪｕｒｋａｔ細胞（不死化Ｔ細胞株）に形質導入して、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞を産生した。同様に、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞を、活性化され、ベクターにより形質導入され、培養において拡大培養されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から作製した。
ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製および特徴
ｓｃＦｖ－ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲコンストラクトをＪｕｒｋａｔ細胞（不死化Ｔ細胞株）に形質導入して、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞を産生した。同様に、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞を、活性化され、ベクターにより形質導入され、培養において拡大培養されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から作製した。
【0136】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析により、形質導入されたＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ２８およびＣＤ３ζの発現を確認した（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞を透過処理し、抗ＣＤ２８（ＣＤ２８．２）マウスｍＡｂ ＰＥコンジュゲート（カタログ番号２７８２６、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、マサチューセッツ州ダンバーズ）およびＣＤ３ζモノクローナル抗体ＰＥコンジュゲート（カタログ番号１２－２４７９－８２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州カールスバッド）で免疫染色した後、ＦＡＣＳ分析を行った。データを、最頻値に正規化して表した。ＣＤ２８細胞質およびＣＤ ３ζシグナル伝達ドメインの両方が検出された。
【0137】
ｓｃＦｖ－ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ導入遺伝子の発現を、間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によって確認した（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。ＩＦＡアッセイを、形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞およびＴ細胞に対して行った。２＋以上の蛍光強度を発現する細胞を、Ｎｉｋｏｎ（登録商標）落射蛍光顕微鏡で見ることによって２００倍の倍率で計数した。２＋超の免疫染色強度を有する陽性細胞のパーセントは、ＣＡＲ－Ｔ細胞よりもＪｕｒｋａｔ細胞においてわずかに高かった。形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞の代表的なＩＦＡ画像を図１３Ｂに示す。各値は、盲検様式で決定され、陽性細胞％として表される４回の実験の平均±ＳＤである。
【0138】
細胞培養物中のＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－ＪｕｒｋａｔおよびＣＡＲ－Ｔ細胞の生存度を、トリパンブルー排除技術によって７日間の過程にわたって評価した。図１４に示されるように、ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞の両方が７日間にわたって成長し続け、細胞生存度を維持した。同様に、ＣＡＲ－ＪｕｒｋａｔおよびＣＡＲ－Ｔの両方が、ＭＴＳアッセイによって求められるように７日間にわたって代謝活性および増殖活性を維持した（図１５）。
【0139】
ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞表現型および機能を、細胞表面マーカーおよび細胞内マーカーのＦＡＣＳ分析によって評価し、休止Ｔ細胞と比較した。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｔ細胞活性化を示すＣＤ２５、ＣＤ４４およびＣＤ６９細胞表面マーカーを発現し、３つ全てのマーカーの発現は、７日目に測定されるように、ＣＡＲ－Ｔ細胞培養物の増殖期の間保存された（図１６）。同様に、ＣＡＲ－Ｔ細胞は細胞内インターフェロン－γを発現したが、休止Ｔ細胞はＩＦＮ－γの発現を何ら示さなかった（図１６）。
【0140】
実施例５
ＣＡＲ－Ｔ細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＬ－１３Ｒα２＋神経膠腫腫瘍細胞に対して細胞傷害性である
ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性を、高レベルのＩＬ－１３Ｒα２を発現することが知られている２つのＩＬ－１３Ｒα２陽性悪性神経膠腫腫瘍細胞株（Ｕ２５１およびＵ８７ＭＧ）に対する細胞傷害を測定することによって調べた。ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、エフェクター細胞の数に依存した様式でＩＬ－１３ Ｒα２発現腫瘍細胞（ＩＬ－１３Ｒα２＋）を特異的に死滅させことが見出された（図１７）。標的腫瘍細胞上のＩＬ－１３Ｒα２の遺伝子サイレンシングがＣＡＲ－Ｔ細胞の全ての細胞傷害活性をほぼ排除したことから、腫瘍細胞の死滅は、標的腫瘍細胞上のＩＬ－１３Ｒα２発現に高度に特異的であった。
ＣＡＲ－Ｔ細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＬ－１３Ｒα２＋神経膠腫腫瘍細胞に対して細胞傷害性である
ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性を、高レベルのＩＬ－１３Ｒα２を発現することが知られている２つのＩＬ－１３Ｒα２陽性悪性神経膠腫腫瘍細胞株（Ｕ２５１およびＵ８７ＭＧ）に対する細胞傷害を測定することによって調べた。ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、エフェクター細胞の数に依存した様式でＩＬ－１３ Ｒα２発現腫瘍細胞（ＩＬ－１３Ｒα２＋）を特異的に死滅させことが見出された（図１７）。標的腫瘍細胞上のＩＬ－１３Ｒα２の遺伝子サイレンシングがＣＡＲ－Ｔ細胞の全ての細胞傷害活性をほぼ排除したことから、腫瘍細胞の死滅は、標的腫瘍細胞上のＩＬ－１３Ｒα２発現に高度に特異的であった。
【0141】
ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性および特異性も、ＩＬ－１３Ｒα２発現腫瘍細胞への曝露時のＩＦＮ－γの放出に基づいて評価した。図１９に示されるように、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、３つのＩＬ－１３Ｒα２陽性神経膠腫細胞株（Ｕ２５１、Ａ１７２、およびＵ８７ＭＧ）と共培養されたとき、上清において、大量かつほぼ等しい量のＩＦＮ－γを産生した。対照的に、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＩＬ－１３Ｒα２陰性またはＩＬ－１３Ｒα２ ＫＯ腫瘍細胞株と共培養した場合、基底量のＩＦＮ－γのみを分泌し、ＩＬ－１３Ｒα２陽性腫瘍細胞に対する特異的応答を示した。
【0142】
最後に、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の遊走および浸潤を、ボイデンチャンバーアッセイを使用して調べた。ＣＡＲ－Ｔ細胞を、３つの異なる濃度の組換えＩＬ－１３Ｒα２Ｆｃキメラタンパク質、またはＩＬ－１３Ｒα２陽性およびＩＬ－１３Ｒα２陰性遺伝子サイレンシングヒト神経膠腫細胞株から得られる馴化培地に曝露した。図２０に示されるように、拡大期の８日目からのＣＡＲ－Ｔ細胞培養物が、６時間の時点および２０時間の時点で、濃度依存的様式で浸潤し、ヒトＩＬ－１３Ｒα２Ｆｃに遊走した。同様に、ＣＡＲ－Ｔ細胞は浸潤し、ＩＬ－１３Ｒα２陽性神経膠腫細胞からの馴化培地に遊走したが、ＩＬ－１３Ｒα２陰性神経膠腫細胞からの馴化培地には遊走しなかった。
【0143】
実施例６
ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性の試験
この実施例は、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ細胞の有効性をｉｎ ｖｉｖｏで試験するために使用され得る方法を記載する。特定の方法が提供されるが、当業者は、１またはそれを超えるステップの追加または省略を含む、これらの特定の方法から逸脱する方法も使用できることを認識するであろう。
ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性の試験
この実施例は、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ細胞の有効性をｉｎ ｖｉｖｏで試験するために使用され得る方法を記載する。特定の方法が提供されるが、当業者は、１またはそれを超えるステップの追加または省略を含む、これらの特定の方法から逸脱する方法も使用できることを認識するであろう。
【0144】
マウス固形がんモデルを使用して、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性を評価することができる。このモデルでは、免疫不全マウスに、脳がん、膵臓がん、前立腺がん、または他の腫瘍に由来するヒト腫瘍細胞を皮下移植または同所移植する。
【0145】
一例では、無胸腺ヌードマウスにヒト脳腫瘍細胞（Ｕ２５１およびＵ８７ＭＧ神経膠腫）を移植する。別の例では、ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＯＧ）マウスに腫瘍細胞を移植する。ＮＯＧマウスは、ＮＯＤ（非肥満性糖尿病）バックグラウンドおよびＳＣＩＤ変異のために、成熟Ｔ細胞、Ｂ細胞および単核細胞を欠いている。免疫不全に加えて、ＮＯＧマウスにおけるインターロイキン－２受容体ガンマ欠損は、生着したヒトＴ細胞がその後に分化することを可能にする。
【0146】
一例では、ヒト化ＰＢＭＣ再構成ＮＯＧマウスを使用する。ヒトＰＢＭＣで再構成されたＮＯＧマウスは、末梢血および脾臓において成熟ヒト免疫細胞を発生させるＢｒａｄｙ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９：３（１２））。これらのマウスに、Ｕ２５１およびＵ８７神経膠腫腫瘍細胞、またはＨＳ７６６、ＭｉａＰａｃａ２、ＢＸＰＣ－３、Ｐａｎｃ－１、ＨＰＡＦ－ＩＩもしくＡＳＰＣ－１膵臓腫瘍細胞等の腫瘍細胞を皮下移植または同所移植する。次いで、マウスにＩＬ－１３－Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与する。用量滴定研究（ｄｏｓｅ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ）を使用して、各腫瘍モデルの最適な細胞用量を決定する。腫瘍標的としてのＩＬ－１３Ｒα２の役割を描写するためにＩＬ－１３Ｒα２遺伝子ノックアウト（ＫＯ）腫瘍細胞を注射されるＮＯＧマウスの追加の群を含んでもよい。
【0147】
動物を、ＣＡＲ－Ｔ細胞処置動物と一緒に、対照の確立された腫瘍の退縮、転移および生存について追跡する。動物の免疫応答は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞、制御性細胞（制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、抗体レベル、および血清サイトカインレベル等のいくつかのパラメータを測定することによって評価される。各動物の全身健康状態は、体重を測定することによって、および屠殺時の重要な器官の組織学的研究を通して、様々な時点で評価される。
【0148】
ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の有効性はまた、様々な腫瘍前処置と組み合わせて評価される。方法は、腫瘍を有する動物をＣＡＲ－Ｔ細胞投与の前にＨＤＡＣ阻害剤（例えば、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）、ＳＰ６００１２５、ＳＲ１１３０２、もしくスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ））、アドレノメデュリン（ＡＭ）、またはＩＬ－１３－ＰＥで前処置し、適切な対照処置（例えば、ＣＡＲ－Ｔ療法を受けていない動物、併用療法を受けていない動物、および／またはＩＬ－１３Ｒα２ノックダウン腫瘍細胞を有する動物）と比較することを除いて、同様である。
【0149】
実施例７
ＨＤＡＣ阻害剤処置と組み合わせたＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性の試験
この実施例は、ＨＤＡＣ阻害剤との組み合わせたＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ細胞の有効性をｉｎ ｖｉｖｏで試験するために使用され得る方法を記載する。特定の方法が提供されるが、当業者は、１またはそれを超えるステップの追加または省略を含む、これらの特定の方法から逸脱する方法も使用できることを認識するであろう。
ＨＤＡＣ阻害剤処置と組み合わせたＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性の試験
この実施例は、ＨＤＡＣ阻害剤との組み合わせたＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ細胞の有効性をｉｎ ｖｉｖｏで試験するために使用され得る方法を記載する。特定の方法が提供されるが、当業者は、１またはそれを超えるステップの追加または省略を含む、これらの特定の方法から逸脱する方法も使用できることを認識するであろう。
【0150】
ＨＤＡＣ阻害剤と組み合わせたＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の有効性は、免疫不全マウスにおける皮下および同所性腫瘍移植を用いたがんモデルにおいて評価することができる。この実施例では、膵臓がん細胞株（Ｐａｎｃ－１またはＡＳＰＣ－１等）を使用して、雌性無胸腺ヌードマウスまたはＮＯＧマウスの側腹部に皮下腫瘍インプラントを発生させる。腫瘍移植の約４～６日後、ＴＳＡまたはＳＡＨＡを投与する。ＴＳＡまたはＳＡＨＡ投与開始から約５日後に、ＩＬ１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞または対照も投与する。
【0151】
マウスの体重および腫瘍サイズをモニターし、定期的に測定する。ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＴｒｅｇ細胞数、ならびに血液中のサイトカインプロファイルも定期的に測定する。測定は、腫瘍サイズが直径２０ｍｍ２に達するまで継続する。有害な毒性作用について実験全体の過程中に動物をモニターする。ＩＬ－１３Ｒα２ノックダウン腫瘍細胞を移植し、ＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞療法で処置した動物の追加の群も対照として含めることができる。
【0152】
実施例８
アドレノメデュリンと組み合わせたＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞療法のｉｎ ｖｉｖｏ有効性の試験
この実施例は、アドレノメデュリン処置と組み合わせたＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ細胞の有効性をｉｎ ｖｉｖｏで試験するために使用され得る方法を記載する。特定の方法が提供されるが、当業者は、１またはそれを超えるステップの追加または省略を含む、これらの特定の方法から逸脱する方法も使用できることを認識するであろう。
アドレノメデュリンと組み合わせたＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞療法のｉｎ ｖｉｖｏ有効性の試験
この実施例は、アドレノメデュリン処置と組み合わせたＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ細胞の有効性をｉｎ ｖｉｖｏで試験するために使用され得る方法を記載する。特定の方法が提供されるが、当業者は、１またはそれを超えるステップの追加または省略を含む、これらの特定の方法から逸脱する方法も使用できることを認識するであろう。
【0153】
一例では、ＡＭでトランスフェクトした、または模擬トランスフェクトしたＰＣ－３前立腺がん細胞、またはトランスフェクトされていない対照を、免疫不全マウス、例えば雄性無胸腺ヌードマウスの皮下に注射する。腫瘍サイズがおよそ２０ｍｍ２（およそ１週間）に達したら、マウスにＣＡＲ－Ｔ細胞を投与し、その後、処置に対する応答についてモニターする。
【0154】
別の例では、マウスにＰＣ－３腫瘍細胞を注射し、腫瘍サイズがおよそ２０ｍｍ２に達すると、ＡＭペプチド（または対照）を腫瘍内に定期的に注射する。最後のＡＭ処置の約４８時間後に、ＣＡＲ－Ｔ細胞に対するＰＣ－３腫瘍の感受性を調べる。ＰＣ－３細胞を注射した動物を追加の対照として含めることができる。
【0155】
マウスを数週間にわたって追跡して、ＣＡＲ－Ｔ治療の有効性、例えば、腫瘍の縮小、動物の全般的な健康状態、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｔ ｒｅｇおよび血中サイトカインレベルを評価する。
【0156】
実施例９
ＩＬ－１３－ＰＥと組み合わせたＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞療法のｉｎ ｖｉｖｏ有効性の試験
この実施例は、ＩＬ－１３ＰＥ処置との組み合わせたＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ細胞の有効性をｉｎ ｖｉｖｏで試験するために使用され得る方法を記載する。特定の方法が提供されるが、当業者は、１またはそれを超えるステップの追加または省略を含む、これらの特定の方法から逸脱する方法も使用できることを認識するであろう。
ＩＬ－１３－ＰＥと組み合わせたＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞療法のｉｎ ｖｉｖｏ有効性の試験
この実施例は、ＩＬ－１３ＰＥ処置との組み合わせたＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ細胞の有効性をｉｎ ｖｉｖｏで試験するために使用され得る方法を記載する。特定の方法が提供されるが、当業者は、１またはそれを超えるステップの追加または省略を含む、これらの特定の方法から逸脱する方法も使用できることを認識するであろう。
【0157】
この実施例では、マウスを口腔上皮においてＴＧＦβＲＩおよびＰＴＥＮで処置し、頭頸部の自然発生扁平上皮癌を発生させる。次いで、マウスをＩＬ－１３－ＰＥで処置する。約１週間後、マウスをＩＬ－１３Ｒα２－ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置する。
【0158】
マウスを、処置に応答した抗腫瘍活性および免疫学的変化について調べる。一部の動物を、脾細胞に対するＦＡＣＳ分析を行うために、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の最後の用量の約３日後に屠殺する。ＭＤＳＣを、単球／マクロファージマーカーＣＤ１１ｂ＋および顆粒球抗原Ｇｒ－１＋を使用するＦＡＣＳ分析によって分析する。
【0159】
本開示の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮して、例示された実施形態は単なる例であり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことが認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって規定される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲および趣旨の範囲内に入る全てを本発明者らの発明として主張する。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】
【国際調査報告】