特表 2024-514107 抗ＣＤ１９抗体及びＣＡＲ－Ｔ構造体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-28

(54)【発明の名称】抗ＣＤ１９抗体及びＣＡＲ－Ｔ構造体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20240321BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240321BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240321BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240321BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240321BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240321BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240321BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240321BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240321BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240321BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20240321BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240321BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240321BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240321BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240321BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240321BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240321BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240321BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240321BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240321BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240321BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240321BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240321BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C12N15/63 Z

C12P21/08

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C07K16/28

C07K16/46

C07K19/00

C07K14/725

C12N15/12

C12N15/62 Z

A61P43/00 105

A61P35/02

A61P35/00

A61P37/02

A61P29/00 101

A61P19/02

A61P25/00

A61P43/00 121

A61K45/00

A61K35/17

A61K39/395 E

A61K39/395 T

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023561019

(86)(22)【出願日】2022-04-06

(85)【翻訳文提出日】2023-11-08

(86)【国際出願番号】 US2022023723

(87)【国際公開番号】W WO2022216864

(87)【国際公開日】2022-10-13

(31)【優先権主張番号】63/171,520

(32)【優先日】2021-04-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/311,913

(32)【優先日】2022-02-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518452881

【氏名又は名称】テネオバイオ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】トリンクライン，ネイサン

(72)【発明者】

【氏名】ハリス，キャサリン

(72)【発明者】

【氏名】アバンジーノ，ブライアン

(72)【発明者】

【氏名】チャン，カレン

(72)【発明者】

【氏名】デイビソン，ローラ

(72)【発明者】

【氏名】マディソン，ブレア・ビー

(72)【発明者】

【氏名】ルーカス，ジョーセフ・エス

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA88X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA19

4C084NA05

4C084ZA021

4C084ZA961

4C084ZB051

4C084ZB151

4C084ZB211

4C084ZB261

4C084ZB271

4C085AA13

4C085BB11

4C085CC01

4C085CC08

4C085CC21

4C085DD23

4C085DD31

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087BB65

4C087CA05

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZA96

4C087ZB05

4C087ZB15

4C087ZB21

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZC75

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

抗ＣＤ１９抗体（例えば、ＵｎｉＡｂｓ（商標））及びＣＡＲ－Ｔ構造体は、かかる抗体及びＣＡＲ－Ｔ構造体を作製する方法、かかる抗体及びＣＡＲ－Ｔ構造体を含む医薬組成物を含む組成物並びにＣＤ１９の発現によって特徴付けられる障害を処置するためのその使用と共に開示される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）配列番号１において２つ以下の置換を有するＣＤＲ１配列；及び／又は
（ｂ）配列番号２において２つ以下の置換を有するＣＤＲ２配列；及び／又は
（ｃ）配列番号３～４の何れか１つにおいて２つ以下の置換を有するＣＤＲ３配列
を含む重鎖可変領域を含む、ＣＤ１９に結合する抗体。

【請求項2】

前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、ヒトＶＨフレームワーク中に存在する、請求項１に記載の抗体。

【請求項3】

ＣＨ１配列の非存在下で重鎖定常領域配列をさらに含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項4】

（ａ）配列番号１及び３８からなる群から選択されるＣＤＲ１配列；及び／又は
（ｂ）配列番号２及び３９からなる群から選択されるＣＤＲ２配列；及び／又は
（ｃ）配列番号３～４からなる群から選択されるＣＤＲ３配列
を含む、請求項１～３の何れか一項に記載の抗体。

【請求項5】

（ａ）配列番号１又は配列番号３８を含むＣＤＲ１配列；及び
（ｂ）配列番号２又は配列番号３９を含むＣＤＲ２配列；及び
（ｃ）配列番号３又は配列番号４を含むＣＤＲ３配列
を含む、請求項４に記載の抗体。

【請求項6】

（ａ）配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２配列及び配列番号３のＣＤＲ３配列；又は
（ｂ）配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２配列及び配列番号４のＣＤＲ３配列；又は
（ｃ）配列番号３８のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２配列及び配列番号３のＣＤＲ３配列；又は
（ｄ）配列番号３８のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２配列及び配列番号４のＣＤＲ３配列；又は
（ｅ）配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号３９のＣＤＲ２配列及び配列番号３のＣＤＲ３配列；又は
（ｆ）配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号３９のＣＤＲ２配列及び配列番号４のＣＤＲ３配列
を含む、請求項５に記載の抗体。

【請求項7】

配列番号５、６、４０及び４１の配列の何れか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、請求項１～３の何れか一項に記載の抗体。

【請求項8】

配列番号５、６、４０及び４１からなる群から選択される重鎖可変領域配列を含む、請求項７に記載の抗体。

【請求項9】

配列番号５の重鎖可変領域配列を含む、請求項８に記載の抗体。

【請求項10】

配列番号６の重鎖可変領域配列を含む、請求項８に記載の抗体。

【請求項11】

配列番号４０の重鎖可変領域配列を含む、請求項８に記載の抗体。

【請求項12】

配列番号４１の重鎖可変領域配列を含む、請求項８に記載の抗体。

【請求項13】

ヒトＶＨフレームワークにおけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含む、ＣＤ１９に結合する抗体であって、前記ＣＤＲ配列は、配列番号１、２、３、４、３８及び３９からなる群から選択されるＣＤＲ配列において２つ以下の置換を有する配列である、抗体。

【請求項14】

ヒトＶＨフレームワークにおけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含み、前記ＣＤＲ配列は、配列番号１、２、３、４、３８及び３９からなる群から選択される、請求項１３に記載の抗体。

【請求項15】

（ａ）ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２配列及び配列番号３のＣＤＲ３配列；又は
（ｂ）ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２配列及び配列番号４のＣＤＲ３配列；又は
（ｃ）ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号３８のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２配列及び配列番号３のＣＤＲ３配列；又は
（ｄ）ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号３８のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２配列及び配列番号４のＣＤＲ３配列；又は
（ｅ）ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号３９のＣＤＲ２配列及び配列番号３のＣＤＲ３配列；又は
（ｆ）ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号３９のＣＤＲ２配列及び配列番号４のＣＤＲ３配列
を含む重鎖可変領域を含む、ＣＤ１９に結合する抗体。

【請求項16】

多特異性である、請求項１～１５の何れか一項に記載の抗体。

【請求項17】

二特異性である、請求項１６に記載の抗体。

【請求項18】

２つの異なるＣＤ１９タンパク質に結合する、請求項１７に記載の抗体。

【請求項19】

同じＣＤ１９タンパク質上の２つの異なるエピトープに結合する、請求項１７に記載の抗体。

【請求項20】

エフェクター細胞に結合する、請求項１６に記載の抗体。

【請求項21】

Ｔ細胞抗原に結合する、請求項１６に記載の抗体。

【請求項22】

ＣＤ３に結合する、請求項２１に記載の抗体。

【請求項23】

ＣＡＲ－Ｔフォーマットである、請求項１～１５の何れか一項に記載の抗体。

【請求項24】

（ａ）配列番号１又は配列番号３８を含むＣＤＲ１配列；及び
（ｂ）配列番号２又は配列番号３９を含むＣＤＲ２配列；及び
（ｃ）配列番号３又は配列番号４を含むＣＤＲ３配列
を含む重鎖可変領域を含む、ＣＤ１９に結合する細胞外抗原結合ドメインを含むＣＡＲを含むＣＡＲ－Ｔ細胞。

【請求項25】

前記重鎖可変領域は、
（ａ）ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２配列及び配列番号３のＣＤＲ３配列；又は
（ｂ）ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２配列及び配列番号４のＣＤＲ３配列；又は
（ｃ）ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号３８のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２配列及び配列番号３のＣＤＲ３配列；又は
（ｄ）ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号３８のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２配列及び配列番号４のＣＤＲ３配列；又は
（ｅ）ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号３９のＣＤＲ２配列及び配列番号３のＣＤＲ３配列；又は
（ｆ）ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号３９のＣＤＲ２配列及び配列番号４のＣＤＲ３配列
を含む、請求項２４に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。

【請求項26】

ＣＤ１９に結合する前記細胞外抗原結合ドメインは、配列番号５、６、４０及び４１の配列の何れか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、請求項２４又は２５に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。

【請求項27】

ＣＤ１９に結合する前記細胞外抗原結合ドメインは、配列番号５、６、４０及び４１からなる群から選択される重鎖可変領域配列を含む、請求項２６に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。

【請求項28】

ＣＤ１９に結合する前記細胞外抗原結合ドメインは、配列番号５の重鎖可変領域配列を含む、請求項２７に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。

【請求項29】

ＣＤ１９に結合する前記細胞外抗原結合ドメインは、配列番号６の重鎖可変領域配列を含む、請求項２７に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。

【請求項30】

ＣＤ１９に結合する前記細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４０の重鎖可変領域配列を含む、請求項２７に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。

【請求項31】

ＣＤ１９に結合する前記細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４１の重鎖可変領域配列を含む、請求項２７に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。

【請求項32】

請求項１～２３の何れか一項に記載の抗体又は請求項２４～３１の何れか一項に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む医薬組成物。

【請求項33】

ＣＤ１９の発現によって特徴付けられるＢ細胞障害の処置の方法であって、前記障害を有する対象に、請求項１～２３の何れか一項に記載の抗体、請求項２４～３１の何れか一項に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞又は請求項３２に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。

【請求項34】

前記障害は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記障害は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である、請求項３３に記載の方法。

【請求項36】

前記障害は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である、請求項３３に記載の方法。

【請求項37】

前記障害は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である、請求項３３に記載の方法。

【請求項38】

前記障害は、関節リウマチ（ＲＡ）である、請求項３３に記載の方法。

【請求項39】

前記障害は、多発性硬化症（ＭＳ）である、請求項３３に記載の方法。

【請求項40】

請求項１～２３の何れか一項に記載の抗体又は請求項２４～３１の何れか一項に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド。

【請求項41】

請求項４０に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項42】

請求項４１に記載のベクターを含む細胞。

【請求項43】

請求項１～２３の何れか一項に記載の抗体を生成する方法であって、前記抗体の発現を許容する条件下において、請求項４２に記載の細胞を成長させることと、前記細胞及び／又は前記細胞が成長する細胞培養培地から前記抗体を単離することとを含む方法。

【請求項44】

請求項１～２３の何れか一項に記載の抗体を作製する方法であって、ＵｎｉＲａｔ動物をＣＤ１９で免疫することと、ＣＤ１９結合重鎖配列を同定することとを含む方法。

【請求項45】

処置の方法であって、必要とする個体に、有効用量の、請求項１～２３の何れか一項に記載の抗体、請求項２４～３１の何れか一項に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞又は請求項３２に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。

【請求項46】

必要とする個体の疾患又は障害の処置のための薬物の調製における、請求項１～２３の何れか一項に記載の抗体又は請求項２４～３１の何れか一項に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞の使用。

【請求項47】

必要とする個体の治療における使用のための、請求項１～２３の何れか一項に記載の抗体、請求項２４～３１の何れか一項に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞又は請求項３２に記載の医薬組成物。

【請求項48】

必要とする個体の疾患又は障害を処置するためのキットであって、請求項１～２３の何れか一項に記載の抗体、請求項２４～３１の何れか一項に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞又は請求項３２に記載の医薬組成物と使用説明書とを含むキット。

【請求項49】

少なくとも１つの追加の試薬をさらに含む、請求項４８に記載のキット。

【請求項50】

前記少なくとも１つの追加の試薬は、化学療法薬を含む、請求項４９に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０２１年４月６日に出願された米国仮特許出願第６３／１７１，５２０号明細書の出願日の優先権利益を主張するものであり、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本願は、２０２２年２月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／３１１，９１３号明細書の出願日の優先権利益も主張するものであり、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、ＣＤ１９に結合する抗体（例えば、ＵｎｉＡｂｓ（商標））及びＣＡＲ－Ｔ構造体に関する。本発明は、かかる抗体及びＣＡＲ－Ｔ構造体を作製する方法、かかる抗体及びＣＡＲ－Ｔ構造体を含む医薬組成物を含む組成物並びにＣＤ１９の発現によって特徴付けられる障害を処置するためのその使用にさらに関する。

【背景技術】

【0003】

分化クラスター１９（ＣＤ１９）
ＣＤ１９、別名Ｂ－リンパ球表面抗原Ｂ４（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１５３９１）は、あらゆるヒトＢ細胞に発現するが、形質細胞には発現しない細胞表面受容体である。ＣＤ１９は、細胞質シグナル伝達タンパク質を膜に動員する膜貫通タンパク質であり、これは、ＣＤ１９／ＣＤ２１複合体内でＢ細胞受容体シグナル伝達経路の閾値を低下させる役割を果たす。ＣＤ１９は、比較的大型の２４０アミノ酸の細胞質テールを有する。この細胞外Ｉｇ様ドメインは、潜在的にジスルフィド結合型の非Ｉｇ様ドメインと、Ｎ－結合型の糖鎖付加部位とに分けられる。この細胞質テールは、Ｃ末端近傍に少なくとも９個のチロシン残基を有し、そのいくつかは、リン酸化していることが示されている。ＣＤ２０及びＣＤ２２と共に、ＣＤ１９の発現は、Ｂ細胞系統に制限されているため、ＣＤ１９は、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療処置に魅力的な標的となる。ＣＤ１９に特異的なモノクローナル抗体及び抗体－薬物コンジュゲートが多数記載されている（Ｎａｄｄａｆｉ ｅｔ ａｌ．２０１５，ＰＭＣ４６４４５２５）。加えて、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体Ｔ細胞は、白血病の処置に承認されている（Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１７，ＰＭＩＤ：２９２４５００５）。

【0004】

重鎖抗体
従来のＩｇＧ抗体では、重鎖と軽鎖との会合は、一部には、軽鎖定常領域と重鎖のＣＨ１定常ドメインとの間の疎水性相互作用に起因する。重鎖のフレームワーク２（ＦＲ２）及びフレームワーク４（ＦＲ４）の領域には、この重鎖と軽鎖との間の疎水性相互作用にも寄与するさらなる残基が存在する。

【0005】

しかしながら、ラクダ科動物（ラクダ、ヒトコブラクダ及びラマを含むタイロポダ（Ｔｙｌｏｐｏｄａ）亜目）の血清には、対になったＨ鎖のみから構成される主要なタイプの抗体（重鎖抗体又はＵｎｉＡｂ（商標））が含有されることが知られている。ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）（キャメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）、キャメルス・バクトリアヌス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）、ラマ・グラマ（Ｌａｍａ ｇｌａｍａ）、ラマ・グアナコ（Ｌａｍａ ｇｕａｎａｃｏ）、ラマ・アルパカ（Ｌａｍａ ａｌｐａｃａ）及びラマ・ビクーニャ（Ｌａｍａ ｖｉｃｕｇｎａ））のＵｎｉＡｂ（商標）は、単一可変ドメイン（ＶＨＨ）、ヒンジ領域及び古典的な抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインと相同性の高い２つの定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）からなる独特の構造を有する。これらのＵｎｉＡｂ（商標）は、ゲノム中に存在するが、ｍＲＮＡプロセシング中にスプライスアウトされる定常領域の第１のドメイン（ＣＨ１）を欠いている。ＣＨ１ドメインの非存在は、このドメインが軽鎖の定常ドメインのアンカー位置であるため、ＵｎｉＡｂ（商標）における軽鎖の非存在を説明する。このようなＵｎｉＡｂ（商標）は、従来の抗体又はその断片からの３つのＣＤＲによる抗原結合特異性及び高親和性を付与するように自然に進化した（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，２００１；Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７４：２７７－３０２；Ｒｅｖｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ５：１１１－１２４）。サメなどの軟骨魚類も、軽鎖ポリペプチドを欠き、完全に重鎖によって構成される、ＩｇＮＡＲと称される特有のタイプの免疫グロブリンを進化させた。ＩｇＮＡＲ分子は、分子工学によって操作して、単一重鎖ポリペプチドの可変ドメイン（ｖＮＡＲ）を作製し得る（Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，３５４３－３５５４（２００３）；Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５５，１８７－１９７（２００４）；Ｄｏｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０，２５－３３（２００３））。

【0006】

軽鎖を欠く重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）が抗原に結合する能力は、１９６０年代に確立された（Ｊａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９６８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，４１８５－４１９５）。軽鎖から物理的に分離された重鎖免疫グロブリンは、四量体抗体の８０％の抗原結合活性を保持した。Ｓｉｔｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ，６０，７８１－７９０は、再編成されたマウスμ遺伝子からのＣＨ１ドメインの除去が、哺乳動物細胞培養において、軽鎖を欠く重鎖抗体の産生をもたらすことを示した。産生された抗体は、ＶＨ結合特異性及びエフェクター機能を保持した。

【0007】

高い特異性及び親和性を有する重鎖抗体は、免疫付与を通じて様々な抗原に対して生成され得（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４３１，３７－４６（１９９９））、ＶＨＨ部分を容易にクローニングし、酵母で発現させ得る（Ｆｒｅｎｋｅｎ，Ｌ．Ｇ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７８，１１－２１（２０００））。それらの発現、溶解性及び安定性のレベルは、古典的なＦ（ａｂ）断片又はＦｖ断片より顕著に高い（Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４，５２１－５２６（１９９７））。

【0008】

λ（ラムダ）軽鎖（Ｌ）遺伝子座及び／又はλ及びκ（カッパ）Ｌ鎖遺伝子座が機能的にサイレンシングされたマウス及びそのようなマウスによって産生される抗体は、米国特許第７，５４１，５１３号明細書及び同第８，３６７，８８８号明細書に記載されている。マウス及びラットにおける重鎖抗体の組み換え産生は、例えば、国際公開第２００６００８５４８号パンフレット、米国特許出願公開第２０１００１２２３５８号明細書、Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；１０９（１），９３－１０１；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；２００６，２６（５）：３７７－９０；及びＺｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ；２０４（１３）：３２７１－３２８３において報告されている。ジンクフィンガーヌクレアーゼの胚マイクロインジェクションによるノックアウトラットの作製は、Ｇｅｕｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２５（５９３９）：４３３に記載されている。このような抗体を産生する異種重鎖遺伝子座を含む可溶性重鎖抗体及びトランスジェニック齧歯類は、米国特許第８，８８３，１５０号明細書及び同第９，３６５，６５５号明細書に記載されている。結合（標的化）ドメインとして単一ドメイン抗体を含むＣＡＲ－Ｔ構造は、例えば、Ｉｒｉ－Ｓｏｆｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１７：２６３０－２６４１及びＪａｍｎａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１８４０：３７８－３８６に記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】米国特許第７，５４１，５１３号明細書

【特許文献2】米国特許第８，３６７，８８８号明細書

【特許文献3】国際公開第２００６００８５４８号パンフレット

【特許文献4】米国特許出願公開第２０１００１２２３５８号明細書

【特許文献5】米国特許第８，８８３，１５０号明細書

【特許文献6】米国特許第９，３６５，６５５号明細書

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Ｎａｄｄａｆｉ ｅｔ ａｌ．２０１５，ＰＭＣ４６４４５２５

【非特許文献2】Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１７，ＰＭＩＤ：２９２４５００５

【非特許文献3】Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，２００１；Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７４：２７７－３０２

【非特許文献4】Ｒｅｖｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ５：１１１－１２４

【非特許文献5】Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，３５４３－３５５４（２００３）

【非特許文献6】Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５５，１８７－１９７（２００４）

【非特許文献7】Ｄｏｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０，２５－３３（２００３）

【非特許文献8】Ｊａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９６８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，４１８５－４１９５

【非特許文献9】Ｓｉｔｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ，６０，７８１－７９０

【非特許文献10】ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４３１，３７－４６（１９９９）

【非特許文献11】Ｆｒｅｎｋｅｎ，Ｌ．Ｇ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７８，１１－２１（２０００）

【非特許文献12】Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４，５２１－５２６（１９９７）

【非特許文献13】Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；１０９（１），９３－１０１

【非特許文献14】Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；２００６，２６（５）：３７７－９０

【非特許文献15】Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ；２０４（１３）：３２７１－３２８３

【非特許文献16】Ｇｅｕｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２５（５９３９）：４３３

【非特許文献17】Ｉｒｉ－Ｓｏｆｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１７：２６３０－２６４１

【非特許文献18】Ｊａｍｎａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１８４０：３７８－３８６

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明の態様は、（ａ）配列番号１において２つ以下の置換を有するＣＤＲ１配列；及び／又は（ｂ）配列番号２において２つ以下の置換を有するＣＤＲ２配列；及び／又は（ｃ）配列番号３～４の何れか１つにおいて２つ以下の置換を有するＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含む、ＣＤ１９に結合する抗体を含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、ヒトＶＨフレームワーク中に存在する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＨ１配列の非存在下で重鎖定常領域配列をさらに含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号１及び３８からなる群から選択されるＣＤＲ１配列；及び／又は（ｂ）配列番号２及び３９からなる群から選択されるＣＤＲ２配列；及び／又は（ｃ）配列番号３～４からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号１又は配列番号３８を含むＣＤＲ１配列；及び（ｂ）配列番号２又は配列番号３９を含むＣＤＲ２配列；及び（ｃ）配列番号３又は配列番号４を含むＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２配列及び配列番号３のＣＤＲ３配列；又は（ｂ）配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２配列及び配列番号４のＣＤＲ３配列；又は（ｃ）配列番号３８のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２配列及び配列番号３のＣＤＲ３配列；又は（ｄ）配列番号３８のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２配列及び配列番号４のＣＤＲ３配列；又は（ｅ）配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号３９のＣＤＲ２配列及び配列番号３のＣＤＲ３配列；又は（ｆ）配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号３９のＣＤＲ２配列及び配列番号４のＣＤＲ３配列を含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５、６、４０及び４１の配列の何れか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５、６、４０及び４１からなる群から選択される重鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５の重鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号６の重鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号４０の重鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号４１の重鎖可変領域配列を含む。

【0015】

本発明の態様は、ヒトＶＨフレームワークにおけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含む、ＣＤ１９に結合する抗体を含み、ＣＤＲ配列は、配列番号１、２、３、４、３８及び３９からなる群から選択されるＣＤＲ配列において２つ以下の置換を有する配列である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＶＨフレームワークにおけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲ配列は、配列番号１、２、３、４、３８及び３９からなる群から選択される。

【0016】

本発明の態様は、（ａ）ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２配列及び配列番号３のＣＤＲ３配列；又は（ｂ）ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２配列及び配列番号４のＣＤＲ３配列；又は（ｃ）ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号３８のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２配列及び配列番号３のＣＤＲ３配列；又は（ｄ）ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号３８のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２配列及び配列番号４のＣＤＲ３配列；又は（ｅ）ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号３９のＣＤＲ２配列及び配列番号３のＣＤＲ３配列；又は（ｆ）ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号３９のＣＤＲ２配列及び配列番号４のＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含む、ＣＤ１９に結合する抗体を含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、抗体は、多特異性である。いくつかの実施形態では、抗体は、二特異性である。いくつかの実施形態では、抗体は、２つの異なるＣＤ１９タンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、同じＣＤ１９タンパク質上の２つの異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、エフェクター細胞に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｔ細胞抗原に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤ３に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＡＲ－Ｔフォーマットである。

【0018】

本発明の態様は、（ａ）配列番号１又は配列番号３８を含むＣＤＲ１配列；及び（ｂ）配列番号２又は配列番号３９を含むＣＤＲ２配列；及び（ｃ）配列番号３又は配列番号４を含むＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含む、ＣＤ１９に結合する細胞外抗原結合ドメインを含むＣＡＲを含むＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、（ａ）ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２配列及び配列番号３のＣＤＲ３配列；又は（ｂ）ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２配列及び配列番号４のＣＤＲ３配列；又は（ｃ）ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号３８のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２配列及び配列番号３のＣＤＲ３配列；又は（ｄ）ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号３８のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２配列及び配列番号４のＣＤＲ３配列；又は（ｅ）ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号３９のＣＤＲ２配列及び配列番号３のＣＤＲ３配列；又は（ｆ）ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号３９のＣＤＲ２配列及び配列番号４のＣＤＲ３配列を含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、ＣＤ１９に結合する細胞外抗原結合ドメインは、配列番号５、６、４０及び４１の配列の何れか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９に結合する細胞外抗原結合ドメインは、配列番号５～６からなる群から選択される重鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９に結合する細胞外抗原結合ドメインは、配列番号５、６、４０及び４１の重鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９に結合する細胞外抗原結合ドメインは、配列番号６の重鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９に結合する細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４０の重鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９に結合する細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４１の重鎖可変領域配列を含む。

【0021】

本発明の態様は、本明細書に記載される抗体又はＣＡＲ－Ｔ細胞を含む医薬組成物を含む。

【0022】

本発明の態様は、ＣＤ１９の発現によって特徴付けられるＢ細胞障害を処置する方法であって、前記障害を有する対象に、本明細書に記載される抗体、ＣＡＲ－Ｔ細胞又は医薬組成物を投与することを含む方法を含む。

【0023】

いくつかの実施形態では、障害は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である。いくつかの実施形態では、障害は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である。いくつかの実施形態では、障害は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。いくつかの実施形態では、障害は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。いくつかの実施形態では、障害は、関節リウマチ（ＲＡ）である。いくつかの実施形態では、障害は、多発性硬化症（ＭＳ）である。

【0024】

本発明の態様は、本明細書に記載される抗体又はＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドを含むベクター及びかかるベクターを含む細胞を含む。

【0025】

本発明の態様は、本明細書に記載される抗体を生成する方法であって、抗体の発現を許容する条件下において、本明細書に記載される細胞を成長させることと、細胞及び／又は細胞が成長する細胞培養培地から抗体を単離することとを含む方法を含む。

【0026】

本発明の態様は、本明細書に記載される抗体を作製する方法であって、ＵｎｉＲａｔ動物をＣＤ１９で免疫することと、ＣＤ１９結合重鎖配列を同定することとを含む方法を含む。

【0027】

本発明の態様は、処置の方法であって、必要とする個体に、有効用量の、本明細書に記載される抗体、ＣＡＲ－Ｔ細胞又は医薬組成物を投与することを含む方法を含む。

【0028】

本発明の態様は、必要とする個体の疾患又は障害の処置のための薬物の調製における、本明細書に記載される抗体又はＣＡＲ－Ｔ細胞の使用を含む。

【0029】

本発明の態様は、必要とする個体の疾患又は障害を処置するためのキットであって、本明細書に記載される抗体、ＣＡＲ－Ｔ細胞又は医薬組成物と使用説明書とを含むキットを含む。いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも１つの追加の試薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の試薬は、化学療法薬を含む。

【0030】

これら及びさらなる態様について、実施例を含めた本開示の残りの部分でさらに説明する。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】ＣＤ１９＋ Ｒａｊｉ細胞及び陰性対照細胞に対する指示される抗体コンストラクトについてのＣＤ１９結合データを要約する表である。

【図2】パネルＡ及びＢは、指示される細胞型（Ｒａｊｉ及びＤａｕｄｉ）における、指示される抗体コンストラクトについての抗体濃度の関数としての細胞結合を示すグラフである。

【図3】ＣＤ１９＋ Ｒａｊｉ及びＤａｕｄｉ細胞に対する指示される抗体コンストラクトの細胞結合ＥＣ５０値を要約する表である。

【図4】パネルＡは、抗ＣＤ１９細胞外結合ドメインを含むＣＡＲ－Ｔ構造体の概略図である。パネルＢ及びＣは、指示される細胞株で試験した、抗ＣＤ１９細胞外結合ドメインを含むＣＡＲコンストラクトの抗原特異的結合及び活性化を示すグラフである。

【図5】パネルＡ及びＢは、親ＶＨ－０３４結合体と比較した、Ｔ２９Ｄ ＶＨ結合体又はＳ５５Ｄ ＶＨ結合体の何れかを含むＣＡＲを発現するＴ細胞間の細胞傷害性比較結果を示すグラフである。

【図6】親ＶＨ－０３４結合体と比較した、Ｔ２９Ｄ ＶＨ結合体又はＳ５５Ｄ ＶＨ結合体の何れかを含むＣＡＲを発現するＴ細胞におけるインビトロＴ細胞活性化の向上を要約する表である。

【図7】ＣＡＲフォーマットの濃縮されたＣＤ１９ ＶＨ結合体が親ＶＨ－０３４結合体と比較してＴ細胞でＣＡＲをより高度に発現することを示す表である。

【図8】Ｔ２９Ｄ ＶＨ結合体又はＳ５５Ｄ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現するＴ細胞がインビボでのＴ細胞増大の向上を呈することを示す表である。

【図9】Ｔ２９Ｄ又はＳ５５Ｄ ＣＤ１９ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現するＴ細胞が親ＶＨ－０３４ ＣＤ１９結合体と比較して少ないＴ細胞枯渇を呈したことを示す表である。

【図10】Ｔ２９Ｄ ＶＨ結合体又はＳ５５Ｄ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現するＴ細胞が腫瘍制御を呈したことを示すグラフである。

【図11】図１０に示されるのと同じ結果を図示する、簡約していない個々のマウスモデルデータを示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0032】

本発明の実施は、特に明記しない限り、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技術を使用し、これらは、当技術分野の技術の範囲内である。そのような技術は、文献、例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，１９９４）；“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ｐｅｒｂａｌ Ｂｅｒｎａｒｄ Ｖ．，１９８８）；“Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）；Ｈａｒｌｏｗ，Ｌａｎｅ ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｎｏ．Ｉ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９８）；及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；（１９８８）で十分に説明されている。

【0033】

値の範囲が提供される場合、この範囲の上限と下限との間の各介在値（別途文脈が明確に示す場合を除き、下限の単位の１０分の１まで）及びこの述べられる範囲のあらゆる他の指定の又は介在する値が本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、より小さい範囲に含まれ得、またこの指定された範囲で具体的に排除された何れかの制限を条件として本発明内に包含される。指定された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、含まれているこれらの限界の一方又は両方を除く範囲も本発明中に含まれる。

【0034】

別段の指示がない限り、本明細書中の抗体残基は、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（例えばＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））に従い番号付けされる。

【0035】

以下の説明では、本発明のより詳細な理解を提供するために、多くの具体的な詳細を記載する。しかしながら、本発明は、これらの具体的な詳細の１つ又は複数がなくても実施され得ることが当業者にとって明らかであろう。他の例では、周知の特徴及び当業者にとって周知の手順は、本発明を不明瞭にすることを避けるために説明していない。

【0036】

特許出願及び刊行物を含む、本開示全体を通して引用されている全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0037】

Ｉ．定義
「含む」とは、列挙された要素は、組成物／方法／キットにおいて必要であるが、他の要素は特許請求の範囲内の組成物／方法／キットなどを形成するために含まれ得ることを意味する。

【0038】

「基本的に～からなる」とは、記載された組成物又は方法の範囲を、主題発明の基本的且つ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない特定の材料又は段階に限定することを意味する。

【0039】

「～からなる」とは、特許請求の範囲において特定されていない要素、段階又は成分を、組成物、方法又はキットから排除することを意味する。

【0040】

本明細書中の抗体残基は、Ｋａｂａｔナンバリングシステム及びＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされる。Ｋａｂａｔナンバリングシステムは一般に、可変ドメインの残基（重鎖のおよそ１～１１３の残基）を指す場合に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。「ＥＵナンバリングシステム」又は「ＥＵインデックス」は一般に、免疫グロブリン重鎖定常領域の残基を指す場合に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，前出、において報告されるＥＵインデックス）。「ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基の番号付けを指す。本明細書中で別段の記載がない限り、抗体の可変ドメイン中の残基番号への言及は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによる残基番号付けを意味する。本明細書において別段の記載がない限り、抗体の定常ドメイン中の残基番号への言及は、ＥＵナンバリングシステムによる残基番号付けを意味する。

【0041】

免疫グロブリンとも呼ばれる抗体は従来、少なくとも１本の重鎖及び１本の軽鎖を含み、重鎖及び軽鎖のアミノ末端ドメインの配列は可変であり、従って一般に可変領域ドメイン又は可変重鎖（ＶＨ）若しくは可変軽鎖（ＶＬ）ドメインと呼ばれる。２つのドメインは従来、会合して特異的結合領域を形成するが、本明細書で論じるように、特異的結合は、重鎖のみの可変配列を用いても得ることができ、抗体の様々な非天然構造が知られており、当技術分野で使用されている。

【0042】

「機能的」又は「生物学的に活性である」抗体又は抗原結合分子（本明細書に記載の重鎖抗体及び多特異性（例えば二特異性）３本鎖抗体様分子（ＴＣＡ）を含む）は、構造的、調節的、生化学的又は生物物理学的事象においてその天然の活性の１つ以上を発揮することが可能なものである。例えば、機能的抗体又は他の結合分子、例えばＴＣＡは、抗原に特異的に結合する能力を有し得、結合は次に、シグナル伝達又は酵素活性などの細胞又は分子事象を誘発又は変更し得る。機能的抗体又は他の結合分子、例えばＴＣＡは、受容体のリガンド活性化を遮断し得るか又はアゴニスト若しくはアンタゴニストとしても作用し得る。抗体又は他の結合分子、例えばＴＣＡがその天然の活性の１つ以上を発揮する能力は、ポリペプチド鎖の適切なフォールディング及びアセンブリを含むいくつかの因子に依存する。

【0043】

本明細書中の「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単量体、二量体、多量体、多特異性抗体（例えば二特異性抗体）、重鎖抗体、３本鎖抗体、ＴＣＡ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ナノボディなどを包含し、抗体断片も、それらが所望の生物学的活性を示す限り含まれる（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊｏｕｒ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７０：４８５４－４８６１）。抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体又は他の種由来であり得る。

【0044】

抗体という用語は、完全長重鎖、完全長軽鎖、インタクトな免疫グロブリン分子又はこれらのポリペプチドサブユニットの何れかの免疫学的に活性な部分、即ち関心対象の標的の抗原又はその一部に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含むポリペプチドを指し得、そのような標的としては、癌細胞又は自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生する細胞が挙げられるが限定されない。本明細書中で開示される免疫グロブリンは、何れかのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はエフェクター細胞活性を低減若しくは増強させる改変Ｆｃ部分を有する改変サブクラスを含む免疫グロブリン分子のサブクラスであり得る。本抗体の軽鎖は、カッパ軽鎖（Ｖカッパ）又はラムダ軽鎖（Ｖラムダ）であり得る。免疫グロブリンは、何れかの種に由来し得る。一態様では、免疫グロブリンは主にヒト起源のものである。

【0045】

本明細書中で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、集団を構成する個々の抗体は、僅かに存在し得る可能性のある天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は極めて特異性が高く、単一の抗原部位を対象とする。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。本発明によるモノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５により最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得、組み換えタンパク質作製法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照）によっても作製され得る。

【0046】

「可変」という用語は、抗体に関連して使用される場合、抗体可変ドメインの特定の部分の配列が抗体間で大きく異なり、その特定の部分が各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性において用いられるという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均等に分布しているわけではない。それは軽鎖及び重鎖の可変ドメインにおける何れも超可変領域と呼ばれる三つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保存される部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ大部分がβシート構造をとり、ループ接続を形成し、場合によりβシート構造の一部を形成する、３つの超可変領域によって接続された４つのＦＲを含む。各鎖の超可変領域は、ＦＲによりごく近接して一体に保持され、他方の鎖由来の超可変領域と一緒になって抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）を参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関わらないが、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）における抗体の関与などの種々のエフェクター機能を示す。

【0047】

「超可変領域」という用語は、本明細書中で使用される場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」若しくは「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基（例えば、重鎖可変ドメインの残基３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）及び９５～１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））及び／又は「超可変ループ」に由来するアミノ酸残基（例えば、重鎖可変ドメインの２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）及び９６～１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））を含む。いくつかの実施形態では、「ＣＤＲ」は、Ｌｅｆｒａｎｃ，ＭＰ ｅｔ ａｌ．，ＩＭＧＴ，ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２７：２０９－２１２（１９９９）において定義されているような抗体の相補性決定領域を意味する。「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されるような超可変領域／ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。

【0048】

例示的なＣＤＲの名称を本明細書中で示すが、当業者は、Ｋａｂａｔの定義（“Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ａ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｂａｓｅｄ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ．”Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；４７：６９４－７００を参照）（これは、配列の可変性に基づいており、最も一般的に使用されている）を含む、ＣＤＲのいくつかの定義が一般に使用されていることを理解するであろう。Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、構造ループ領域の位置に基づく（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ．”Ｎａｔｕｒｅ．１９８９；３４２：８７７－８８３）。関心対象の代替的なＣＤＲの定義としては、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，“Ｙｅｔ ａｎｏｔｈｅｒ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌ．”Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００１；３０９：６５７－６７０； Ｏｆｒａｎ ｅｔ ａｌ．“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ （ＣＤＲｓ） ｒｅｖｅａｌｓ ｐｅｃｕｌｉａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ＣＤＲｓ ａｎｄ Ｂ－ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ．”Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；１８１：６２３０－６２３５；Ａｌｍａｇｒｏ“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｚｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ．”Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２００４；１７：１３２－１４３；ａｎｄ Ｐａｄｌａｎｅｔ ａｌ．“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”Ｆａｓｅｂ Ｊ．１９９５；９：１３３－１３９に開示されているものが挙げられるが限定されない（これらの各文献は、参照により本明細書に明確に組み込まれる）。

【0049】

「重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、広義で、抗体又は抗体の１つ以上の部分、例えば従来の抗体の軽鎖を欠く抗体の１つ以上のアームを指す。この用語には、具体的には、ＣＨ１ドメインの非存在下でＶＨ抗原結合ドメインとＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインとを含むホモ二量体抗体；このような抗体の機能的（抗原結合）バリアント、可溶性ＶＨバリアント、１つの可変ドメイン（Ｖ－ＮＡＲ）及び５つのＣ様定常ドメイン（Ｃ－ＮＡＲ）のホモ二量体を含むＩｇ－ＮＡＲ及びその機能的断片；並びに可溶性単一ドメイン抗体（ｓＵｎｉＤａｂｓ（商標））が含まれるが限定されない。一実施形態では、重鎖抗体は、フレームワーク１、ＣＤＲ１、フレームワーク２、ＣＤＲ２、フレームワーク３、ＣＤＲ３及びフレームワーク４から構成される可変領域抗原結合ドメインから構成される。別の実施形態では、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部及びＣＨ２及びＣＨ３ドメインから構成される。別の実施形態では、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部及びＣＨ２ドメインから構成される。さらなる実施形態では、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部及びＣＨ３ドメインから構成される。ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインがトランケートされている重鎖抗体も本明細書中に含まれる。さらなる実施形態では、重鎖は、抗原結合ドメイン及び少なくとも１つのＣＨ（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３又はＣＨ４）ドメインから構成されるが、ヒンジ領域は含まれない。重鎖抗体は、２つの重鎖が互いとジスルフィド結合されているか、又はさもなければ互いに共有結合的若しくは非共有結合的に結合されている、二量体の形態であり得る。重鎖抗体は、ＩｇＧサブクラスに属し得るが、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥサブクラスなどの他のサブクラスに属する抗体も本明細書中に含まれる。特定の実施形態では、重鎖抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ、特にＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブタイプである。一実施形態では、重鎖抗体は、ＩｇＧ４サブタイプであり、ＣＨドメインの１つ以上が抗体のエフェクター機能を変化させるように修飾される。一実施形態では、重鎖抗体は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブタイプであり、ＣＨドメインの１つ以上が抗体のエフェクター機能を変化させるように修飾される。エフェクター機能を変化させるＣＨドメインの修飾は、本明細書中でさらに記載される。重鎖抗体の非限定例は、例えば、国際公開第２０１８／０３９１８０号パンフレットに記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。

【0050】

いくつかの実施形態では、本明細書中の重鎖抗体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の結合（標的化）ドメインとして使用される。この定義には、具体的に、ＵｎｉＡｂ（商標）と呼ばれる、ヒト免疫グロブリントランスジェニックラット（ＵｎｉＲａｔ（商標））によって産生されるヒト重鎖抗体が含まれる。ＵｎｉＡｂ（商標）の可変領域（ＶＨ）は、ＵｎｉＤａｂｓ（商標）と呼ばれ、多特異性、効力の上昇及び半減期の延長を伴う新規治療薬の開発のために、Ｆｃ領域又は血清アルブミンに連結され得る多用途の構成要素である。ホモ二量体ＵｎｉＡｂｓ（商標）は、軽鎖及び従ってＶＬドメインを欠くため、抗原は、１つの単一ドメイン、即ち重鎖抗体の重鎖の可変ドメイン（ＶＨ又はＶＨＨ）によって認識される。

【0051】

本明細書中で使用される場合、「インタクトな抗体鎖」は、完全長可変領域及び完全長定常領域（Ｆｃ）を含む抗体鎖である。インタクトな「従来の」抗体は、分泌されたＩｇＧでは、インタクトな軽鎖及びインタクトな重鎖並びに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。ＩｇＭ又はＩｇＡなどの他のアイソタイプは、異なるＣＨドメインを有し得る。定常ドメインは、ネイティブ配列定常ドメイン（例えば、ヒトネイティブ配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列バリアントであり得る。インタクトな抗体は、抗体のＦｃ定常領域（ネイティブ配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列バリアントＦｃ領域）に起因する生物学的活性を指す１つ以上の「エフェクター機能」を有し得る。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；及び細胞表面受容体の下方制御が挙げられる。定常領域バリアントには、エフェクタープロファイル、Ｆｃ受容体への結合などを変化させるものが含まれる。

【0052】

重鎖のＦｃ（定常ドメイン）のアミノ酸配列に応じて、抗体及び種々の抗原結合タンパク質を様々な「クラス」に割り当て得る。重鎖Ｆｃ領域には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２にさらに分けられ得る。様々なクラスの抗体に対応するＦｃ定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれ得る。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元構造は、周知である。Ｉｇ形態には、ヒンジ修飾又はヒンジレス形態が含まれる（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３－４０９０；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：７２４６－７２５６；米国特許出願公開第２００５／００４８５７２号明細書；米国特許出願公開第２００４／０２２９３１０号明細書）。何れかの脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ（カッパ）及びλ（ラムダ）と呼ばれる２つのタイプの１つに割り当てられ得る。本発明の実施形態による抗体は、カッパ軽鎖配列又はラムダ軽鎖配列を含み得る。

【0053】

「機能的Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。エフェクター機能の非限定例としては、Ｃ１ｑ結合；ＣＤＣ；Ｆｃ受容体結合；ＡＤＣＣ；ＡＤＣＰ；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方制御などが挙げられる。そのようなエフェクター機能は一般に、受容体、例えば、ＦｃγＲＩ；ＦｃγＲＩＩＡ；ＦｃγＲＩＩＢ１；ＦｃγＲＩＩＢ２；ＦｃγＲＩＩＩＡ；ＦｃγＲＩＩＩＢ受容体及び低親和性ＦｃＲｎ受容体と相互作用するためのＦｃ領域を必要とし、当技術分野で公知の様々なアッセイを使用して評価され得る。「死滅した」又は「サイレンシングされた」Ｆｃは、例えば、血清半減期の延長に関して活性を保持するように突然変異されているが、高親和性Ｆｃ受容体を活性化しないか、又はＦｃ受容体に対する親和性が低下しているものである。

【0054】

「ネイティブ配列Ｆｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。ネイティブ配列ヒトＦｃ領域としては、例えば、天然配列ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）、ネイティブ配列ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域、ネイティブ配列ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域及びネイティブ配列ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域並びにそれらの天然のバリアントが挙げられる。

【0055】

「バリアントＦｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸の修飾、好ましくは１つ以上のアミノ酸の置換により、ネイティブ配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、バリアントＦｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、約１～約１０個のアミノ酸置換、好ましくは天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域における約１～約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書におけるバリアントＦｃ領域は、好ましくは、ネイティブ配列Ｆｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、最も好ましくは少なくとも約９０％のそれとの相同性、より好ましくはそれと少なくとも約９５％のそれとの相同性を有する。

【0056】

バリアントＦｃ配列は、ＥＵインデックス位置２３４、２３５及び２３７でＦｃγＲＩ結合を低減するためにＣＨ２領域に３つのアミノ酸置換を含み得る（Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：５６３を参照）。ＥＵインデックス位置３３０及び３３１における補体Ｃ１ｑ結合部位における２つのアミノ酸置換は、補体結合を減少させる（Ｔａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：６６１（１９９３）及びＣａｎｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３（１９９１）を参照）。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ２残基の２３３～２３６位での置換並びにＩｇＧ４残基の３２７、３３０及び３３１位での置換は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを大幅に低下させる（例えば、Ａｒｍｏｕｒ ＫＬ．ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（８）：２６１３－２４；及びＳｈｉｅｌｄｓ ＲＬ．ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１－６０４を参照）。ヒトＩｇＧ４ Ｆｃアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｐ０１８６１）を配列番号７６として本明細書で提供する。サイレンシングされたＩｇＧ１は、例えばＢｏｅｓｃｈ，Ａ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＧ Ｆｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．”ＭＡｂｓ，２０１４．６（４）：ｐ．９１５－２７に記載されており、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0057】

ジスルフィド結合を形成することが可能な領域が欠失されているか、又は特定のアミノ酸残基がネイティブＦｃのＮ末端で除去されているか、又はメチオニン残基が付加されているものを含むが限定されない、他のＦｃバリアントが可能である。従って、いくつかの実施形態では、抗体の１つ以上のＦｃ部分が、ジスルフィド結合を排除するために、ヒンジ領域に１つ以上の変異を含み得る。また別の実施形態では、Ｆｃのヒンジ領域を完全に除去し得る。さらに別の実施形態では、抗体は、Ｆｃバリアントを含み得る。

【0058】

さらに、Ｆｃバリアントは、補体結合又はＦｃ受容体結合をもたらすためにアミノ酸残基を置換（突然変異）、欠失又は付加することにより、エフェクター機能を除去するか又は実質的に低下させるように構築され得る。例えば、限定されないが、欠失は、Ｃ１ｑ結合部位などの補体結合部位において生じ得る。免疫グロブリンＦｃ断片のこのような配列誘導体を調製するための技術は、国際公開第９７／３４６３１号パンフレット及び国際公開第９６／３２４７８号パンフレットで開示されている。さらに、Ｆｃドメインは、リン酸化、硫酸化、アシル化、グリコシル化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化、アミド化などによって修飾され得る。

【0059】

いくつかの実施形態では、抗体は、Ｔ３６６Ｗ突然変異を含むバリアントヒトＩｇＧ４ ＣＨ３ドメイン配列を含み、これは、本明細書中では、任意選択でＩｇＧ４ ＣＨ３ノブ配列と呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｔ３６６Ｓ突然変異、Ｌ３６８Ａ突然変異及びＹ４０７Ｖ突然変異を含むバリアントヒトＩｇＧ４ ＣＨ３ドメイン配列を含み、これは、本明細書中では、任意選択でＩｇＧ４ ＣＨ３ホール配列と呼ばれ得る。本明細書中に記載のＩｇＧ４ ＣＨ３変異は、抗体二量体中の第１の単量体の第１の重鎖定常領域に「ノブ」を置き、抗体二量体中の第２の単量体の第２の重鎖定常領域に「ホール」を置き、それによって抗体中の重鎖ポリペプチドサブユニットの所望の対の適切な対合（ヘテロ二量体化）を促進するために、何れかの好適な方法で利用され得る。

【0060】

いくつかの実施形態では、抗体は、Ｓ２２８Ｐ突然変異、Ｆ２３４Ａ突然変異、Ｌ２３５Ａ突然変異及びＴ３６６Ｗ突然変異（ノブ）を含むバリアントヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む重鎖ポリペプチドサブユニットを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｓ２２８Ｐ突然変異、Ｆ２３４Ａ突然変異、Ｌ２３５Ａ突然変異、Ｔ３６６Ｓ突然変異、Ｌ３６８Ａ突然変異及びＹ４０７Ｖ突然変異（ホール）を含むバリアントヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む重鎖ポリペプチドサブユニットを含む。

【0061】

「Ｆｃ領域含有抗体」という用語は、Ｆｃ領域を含む抗体を指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリングシステムによる残基４４７）は、例えば、抗体の精製中又は抗体をコードする核酸の組み換え操作によって除去され得る。従って、本発明によるＦｃ領域を有する抗体は、Ｋ４４７を有する抗体又はＫ４４７のない抗体を含み得る。

【0062】

本発明の態様には、１価又は２価構造の重鎖のみの可変領域を含む抗体を含む。本明細書で使用される場合、重鎖のみの可変領域ドメインに関して使用される場合、「１価構造」という用語は、重鎖のみの可変領域ドメインが１つのみ存在し、単一の結合部位を有することを意味する。一方、重鎖のみの可変領域ドメインに関して使用される「２価構造」という用語は、重鎖のみの可変領域ドメインが２つ存在し（それぞれが単一の結合部位を有する）、リンカー配列によって連結されることを意味する。リンカー配列の非限定例は、本明細書中でさらに論じられ、様々な長さのＧＳリンカー配列が含まれるが限定されない。重鎖のみの可変領域が２価構造である場合、重鎖のみの２つの可変領域ドメインのそれぞれは、同じ抗原又は異なる抗原（例えば、同じタンパク質上の異なるエピトープに；２つの異なるタンパク質になど）に結合し得る。しかしながら、特に断らない限り、「２価構造」であると示される重鎖のみの可変領域は、リンカー配列によって連結された２つの同一の重鎖のみの可変領域ドメインを含有すると理解され、２つの同一の重鎖のみの可変領域ドメインの各々は、同じ標的抗原に結合する。

【0063】

本発明の態様は、二特異性、三特異性などを含むが限定されない、多特異性構造を有する抗体を含む。多種多様な方法及びタンパク質構成が知られており、二特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡＢ）、三特異性抗体などにおいて使用されている。

【0064】

２つ以上の抗体の可変ドメインを組み換え融合することにより、多価の人工抗体を作製するための様々な方法が開発されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチド上の第１及び第２の抗原結合ドメインは、ポリペプチドリンカーによって連結されている。このようなポリペプチドリンカーの１つの非限定例は、４つのグリシン残基のアミノ酸配列、続いて１つのセリン残基を有するＧＳリンカーであり、配列はｎ回反復され、ここで、ｎは、１～約１０の範囲の整数、例えば２、３、４、５、６、７、８又は９である。このようなリンカーの非限定例としては、ＧＧＧＧＳ（配列番号３８）（ｎ＝１）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３９）（ｎ＝２）が挙げられる。他の好適なリンカーも使用され得、例えばＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１３ Ｏｃｔｏｂｅｒ １５；６５（１０）：１３５７－６９に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0065】

「３本鎖抗体様分子」又は「ＴＣＡ」という用語は、本明細書では、３つのポリペプチドサブユニットを含むか、基本的にそれらからなるか又はそれらからなり、その２つが、モノクローナル抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖又は抗原結合領域及び少なくとも１つのＣＨドメインを含むそのような抗体鎖の機能的抗原結合断片を含むか、基本的にそれらからなるか又はそれらからなる抗体様分子を指すために使用される。この重鎖／軽鎖対は、第１の抗原に対する結合特異性を有する。第３のポリペプチドサブユニットは、ＣＨ１ドメインの非存在下でＣＨ２、及び／又はＣＨ３、及び／又はＣＨ４ドメインを含むＦｃ部分と、第２の抗原のエピトープ又は第１の抗原の異なるエピトープに結合する１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、２つの抗原結合ドメイン）とを含み、そのような結合ドメインが抗体重鎖又は軽鎖の可変領域に由来するか又はそれと配列同一性を有する重鎖抗体を、含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる。そのような可変領域の一部は、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ遺伝子セグメント、Ｄ及びＪ_Ｈ遺伝子セグメント又はＪ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされ得る。可変領域は、再編成されたＶ_ＨＤＪ_Ｈ、Ｖ_ＬＤＪ_Ｈ、Ｖ_ＨＪ_Ｌ又はＶ_ＬＪ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされ得る。

【0066】

ＴＣＡ結合化合物は、「重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」又は「重鎖－抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」又は「重鎖ポリペプチド」を使用し、本明細書で使用される場合、重鎖定常領域ＣＨ２及び／又はＣＨ３及び／又はＣＨ４を含むが、ＣＨ１ドメインを含まない単鎖抗体を意味する。一実施形態では、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部並びにＣＨ２及びＣＨ３ドメインから構成される。別の実施形態では、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部及びＣＨ２ドメインから構成される。さらなる実施形態では、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部及びＣＨ３ドメインから構成される。ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインがトランケートされている重鎖抗体も本明細書中に含まれる。さらなる実施形態では、重鎖は、抗原結合ドメイン及び少なくとも１つのＣＨ（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３又はＣＨ４）ドメインから構成され、ヒンジ領域は含まれない。重鎖抗体は、２つの重鎖がジスルフィド結合されているか、又は他の方法で互いに共有結合的若しくは非共有結合的に取り付けられている二量体の形態であり得、任意選択で、ＣＨドメインの１つ以上の間において、ポリペプチド鎖間での正しい対合を促す非対称な界面（例えば、ノブインホール（ＫｉＨ）界面）を含み得る。重鎖抗体は、ＩｇＧサブクラスに属し得るが、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥサブクラスなどの他のサブクラスに属する抗体も本明細書中に含まれる。特定の実施形態では、重鎖抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ、特にＩｇＧ１サブタイプ又はＩｇＧ４サブタイプのものである。ＴＣＡ結合化合物の非限定例は、例えば、国際公開第２０１７／２２３１１１号パンフレット及び国際公開第２０１８／０５２５０３号パンフレットに記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。

【0067】

重鎖抗体は、ラクダ科動物、例えばラクダ及びラマによって産生されるＩｇＧ抗体の約４分の１を構成する（Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．３６３，４４６－４４８（１９９３））。これらの抗体は、２つの重鎖によって形成されるが、軽鎖を欠いている。結果として、可変抗原結合部分はＶＨＨドメインと称され、天然に存在する最小のインタクトな抗原結合部位を表し、長さは僅か約１２０アミノ酸である（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２６２８５－２６２９０（２００１））。高い特異性及び親和性を有する重鎖抗体は、免疫化によって様々な抗原に対して生成され得る（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４３１，３７－４６（１９９９））、ＶＨＨ部分を容易にクローニングし、酵母で発現させ得る（Ｆｒｅｎｋｅｎ，Ｌ．Ｇ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７８，１１－２１（２０００））。それらの発現、溶解性及び安定性のレベルは、古典的なＦ（ａｂ）断片又はＦｖ断片より大幅に高い（Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４，５２１－５２６（１９９７））。サメは、その抗体中にＶＮＡＲと呼ばれる単一のＶＨ様ドメインを有することも示されている。（Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，３５４３－３５５４（２００３）；Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５５，１８７－１９７（２００４）；Ｄｏｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０，２５－３３（２００３））。

【0068】

用語「ＣＤ１９」は、本明細書中で使用される場合、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する９５ｋＤａ膜貫通糖タンパク質であって、Ｂリンパ球上のＢ細胞抗原受容体複合体（ＢＣＲ）の共受容体として機能するものを指す。用語「ＣＤ１９」には、任意のヒト及び非ヒト動物種のＣＤ１９タンパク質が含まれ、特に、ヒトＣＤ１９並びに非ヒト哺乳類のＣＤ１９が含まれる。

【0069】

「ヒトＣＤ１９」という用語は、本明細書中で使用される場合、その供給源又は調製方式にかかわらず、ヒトＣＤ１９（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１５３９１）の何れかのバリアント、アイソフォーム及び種相同体を含む。従って、「ヒトＣＤ１９」は、細胞によって天然に発現されるヒトＣＤ１９及びヒトＣＤ１９遺伝子を遺伝子移入した細胞で発現されるＣＤ１９を含む。

【0070】

「抗ＣＤ１９重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」、「ＣＤ１９重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」、「抗ＣＤ１９重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「ＣＤ１９重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、本明細書中、上で定義したとおりのヒトＣＤ１９を含む、ＣＤ１９に免疫特異的に結合する、本明細書中、上で定義したとおりの重鎖抗体を指す。この定義には、ヒト免疫グロブリンを発現するトランスジェニックラット又はトランスジェニックマウス、例えば、上で定義されたようなヒト抗ＣＤ１９ ＵｎｉＡｂ（商標）を産生するＵｎｉＲａｔ（商標）抗体など、トランスジェニック動物によって産生されたヒト重鎖抗体が含まれるが限定されない。

【0071】

参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアラインさせ、必要に応じて、最大の配列同一性％を達成するためにギャップを導入した後の、配列同一性の一部として保存的置換を考慮しない、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、当業者の範囲内である様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な何れかのアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメータを決定し得る。しかしながら、本明細書の目的のためには、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。

【0072】

「単離された」抗体は、その天然環境の成分から同定され、分離され及び／又は回収されたものである。その天然環境の混入成分は、抗体の診断的又は治療的使用を妨害し得る物質であり、酵素、ホルモン及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質が含まれ得る。好ましい実施形態では、抗体は、（１）ローリー法による決定で抗体が９５重量％を超えるまで、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップ配列決定装置の使用によってＮ末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を十分に得られる程度まで、又は（３）クマシーブルー若しくは好ましくは銀染色を用いて、還元条件下又は非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均質になるまで精製される。単離された抗体には、その抗体の天然環境の少なくとも１つの成分は存在しないため、組み換え細胞内にインサイチュで存在する抗体が含まれる。しかし、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製段階によって調製される。

【0073】

本発明の抗体としては、多特異性抗体が挙げられる。多特異性抗体は、複数の結合特異性を有する。「多特異性」という用語には、具体的には、「二特異性」及び「三特異性」並びにより高次のポリエピトープ特異性などのより高次の独立した特異的結合親和性並びに４価抗体及び抗体断片が含まれる。「多特異性抗体」、「多特異性重鎖抗体（ｍｕｌｔｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」、「多特異性重鎖抗体（ｍｕｌｔｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「多特異性ＵｎｉＡｂ（商標）」という用語は、本明細書中では、最も広い意味で使用され、複数の結合特異性を有する全ての抗体を包含する。本発明の多特異性抗重鎖抗ＣＤ１９抗体は、具体的には、ヒトＣＤ１９などのＣＤ１９タンパク質上の２つ以上の非重複エピトープに免疫特異的に結合する抗体を含む（即ち２価及びバイパラトピック）。本発明の多特異性重鎖抗ＣＤ１９抗体は、具体的には、ヒトＣＤ１９などのＣＤ１９タンパク質上のエピトープ及び例えばＣＤ３タンパク質、例えばヒトＣＤ３タンパク質などの異なるタンパク質上のエピトープに免疫特異的に結合する抗体も含む（即ち、二特異性及びバイパラトピック）。本発明の多特異性重鎖抗ＣＤ１９抗体は、具体的には、ヒトＣＤ１９タンパク質などのＣＤ１９タンパク質上の２つ以上の、重複しないか又は部分的に重複するエピトープ及び例えばＣＤ３タンパク質、例えばヒトＣＤ３タンパク質などの異なるタンパク質上のエピトープに免疫特異的に結合する抗体も含む（即ち３価及びバイパラトピック）。

【0074】

本発明の抗体は、１つの結合特異性を有する単一特異性抗体を含む。単一特異性抗体は、具体的には、単一結合特異性を含む抗体並びに同じ結合特異性を有する複数の結合ユニットを含む抗体を含む。「単一特異性抗体」、「単一特異性重鎖抗体（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」、「単一特異性重鎖抗体（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「単一特異性ＵｎｉＡｂ（商標）」という用語は、本明細書では、最も広い意味で使用され、１つの結合特異性を有する全ての抗体を包含する。本発明の単一特異性重鎖抗ＣＤ１９抗体は、具体的には、ヒトＣＤ１９タンパク質などのＣＤ１９タンパク質上の１つのエピトープに免疫特異的に結合する抗体（１価及び単一特異性）を含む。本発明の単一特異性重鎖抗ＣＤ１９抗体は、具体的には、ヒトＣＤ１９などのＣＤ１９タンパク質上のエピトープに免疫特異的に結合する複数の結合ユニットを有する抗体（例えば多価抗体）も含む。例えば、本発明の実施形態による単一特異性抗体は、各抗原結合ドメインがＣＤ１９タンパク質上の同じエピトープに結合する２つの抗原結合ドメインを含む重鎖可変領域を含み得る（即ち２価及び単一特異性）。

【0075】

「エピトープ」は、単一の抗体分子が結合する抗原分子の表面上の部位である。一般に、抗原は、数個又は多くの異なるエピトープを有し、多くの異なる抗体と反応する。この用語には、具体的には、線状エピトープ及び立体構造エピトープが含まれる。

【0076】

「エピトープマッピング」は、抗体の標的抗原上の、抗体の結合部位又はエピトープを同定する過程である。抗体エピトープは、線状エピトープ又は立体構造エピトープであり得る。線状エピトープは、タンパク質中のアミノ酸の連続配列によって形成される。立体構造エピトープは、タンパク質配列中の不連続であるが、タンパク質が三次元構造に折り畳まれると１つにまとまるアミノ酸から形成される。

【0077】

「ポリエピトープ特異性」は、同じ又は異なる標的上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。上記のように、本発明は、特に、ポリエピトープ特異性を有する抗ＣＤ１９重鎖抗体、即ちヒトＣＤ１９などのＣＤ１９タンパク質上の１つ以上の非重複エピトープに結合する抗ＣＤ１９重鎖抗体；及びＣＤ１９タンパク質上の１つ以上のエピトープ及び例えばＣＤ３タンパク質などの異なるタンパク質上のエピトープに結合する抗ＣＤ１９重鎖抗体を含む。抗原の「非重複エピトープ」又は「非競合エピトープ」という用語は、本明細書中では、一対の抗原特異的抗体の一方のメンバーによって認識されるが、他方のメンバーによっては認識されないエピトープを意味すると定義される。非重複エピトープを認識する、多特異性抗体上の同じ抗原を標的とする抗体の対又は抗原結合領域は、その抗原への結合について競合せず、その抗原に同時に結合することが可能である。

【0078】

抗体は、２つの抗体が同一又は立体的に重複するエピトープを認識する場合、参照抗体と「本質的に同じエピトープ」に結合する。２つのエピトープが同一又は立体的に重複するエピトープに結合するか否かを決定するための迅速で最も広く使用されている方法は、標識抗原又は標識抗体の何れかを使用して、あらゆる数の異なる形式で構成され得る競合アッセイである。通常、抗原を９６ウェルプレート上に固定化し、標識抗体の結合を遮断する非標識抗体の能力を、放射性標識又は酵素標識を用いて測定する。

【0079】

本明細書中で使用される場合の「価」という用語は、抗体分子中の結合部位の特定の数を指す。

【0080】

「１価」抗体は、１つの結合部位を有する。従って、１価抗体は単一特異性でもある。

【0081】

「多価」抗体は、２つ以上の結合部位を有する。従って、「２価」、「３価」及び「４価」という用語は、それぞれ２つの結合部位、３つの結合部位及び４つの結合部位が存在することを指す。従って、本発明による二特異性抗体は、少なくとも２価であり、３価、４価又は他の多価であり得る。本発明の実施形態による２価抗体は、同じエピトープ（即ち２価、モノパラトピック）又は２つの異なるエピトープ（即ち２価、バイパラトピック）への２つの結合部位を有し得る。

【0082】

二特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡＢ）、三特異性抗体などを調製するための多種多様な方法及びタンパク質構造が知られており、使用されている。

【0083】

「３本鎖抗体様分子」又は「ＴＣＡ」という用語は、本明細書では、３つのポリペプチドサブユニットを含むか、基本的にそれらからなるか又はそれらからなり、その２つが、モノクローナル抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖又は抗原結合領域及び少なくとも１つのＣＨドメインを含むそのような抗体鎖の機能的抗原結合断片を含むか、基本的にそれらからなるか又はそれらからなる抗体様分子を指すために使用される。この重鎖／軽鎖対は、第１の抗原に対する結合特異性を有する。第３のポリペプチドサブユニットは、ＣＨ１ドメインの非存在下でＣＨ２及び／又はＣＨ３及び／又はＣＨ４ドメインを含むＦｃ部分と、第２の抗原のエピトープ又は第１の抗原の異なるエピトープに結合する抗原結合ドメインとを含み、そのような結合ドメインは、抗体重鎖又は軽鎖の可変領域に由来するか又はそれと配列同一性を有する、重鎖抗体を含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる。そのような可変領域の一部は、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ遺伝子セグメント、Ｄ及びＪ_Ｈ遺伝子セグメント又はＪ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされ得る。可変領域は、再編成されたＶ_ＨＤＪ_Ｈ、Ｖ_ＬＤＪ_Ｈ、Ｖ_ＨＪ_Ｌ又はＶ_ＬＪ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされ得る。ＴＣＡタンパク質は、本明細書中の上で定義した重鎖抗体を利用する。

【0084】

「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」という用語は、本明細書中で、最も広い意味で使用され、所望の結合特異性（例えば、モノクローナル抗体又は他のリガンドの抗原結合領域）を膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに移植する、改変された受容体を指す。典型的には、この受容体を用いて、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に移植して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を作製する。（Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，２０１５；１０８（７）：ｄｖｊ４３９；及びＪａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１６；１３：３７０－３８３）。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、免疫療法での使用のための人工Ｔ細胞受容体を生成させるように遺伝子操作されたＴ細胞である。一実施形態では、「ＣＡＲ－Ｔ細胞」は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び少なくとも１つの細胞質ドメインから最小限構成される１つ以上のキメラ抗原受容体をコードする導入遺伝子を発現する治療用Ｔ細胞を意味する。

【0085】

「ヒト抗体」という用語は、本明細書では、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むために使用される。本明細書中のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基、例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異誘発により導入される突然変異又はインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異を含み得る。「ヒト抗体」という用語には、具体的には、トランスジェニック動物、例えば、トランスジェニックラット又はマウスによって産生される、ヒト重鎖可変領域配列を有する重鎖抗体、特に上で定義されるＵｎｉＲａｔ（商標）によって産生されるＵｎｉＡｂ（商標）が含まれる。

【0086】

「キメラ抗体」又は「キメラ免疫グロブリン」とは、少なくとも２つの異なるＩｇ遺伝子座に由来するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン分子、例えば、ヒトＩｇ遺伝子座によってコードされる部分及びラットＩｇ遺伝子座によってコードされる部分を含むトランスジェニック抗体を意味する。キメラ抗体は、非ヒトＦｃ領域又は人工Ｆｃ領域を有するトランスジェニック抗体及びヒトイディオタイプを含む。そのような免疫グロブリンは、そのようなキメラ抗体を産生するように操作された本発明の動物から単離され得る。

【0087】

本明細書中で使用される場合、「エフェクター細胞」という用語は、免疫応答の認識相及び活性化相とは対照的に、免疫応答のエフェクター相に関与する免疫細胞を指す。いくつかのエフェクター細胞は、特異的Ｆｃ受容体を発現し、特異的免疫機能を実行する。いくつかの実施形態では、ナチュラルキラー細胞などのエフェクター細胞が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することが可能である。例えば、ＦｃＲを発現する単球及びマクロファージは、標的細胞の特異的死滅及び免疫系の他の成分への抗原の提示又は抗原を提示する細胞への結合に関与する。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、標的抗原又は標的細胞を貪食し得る。

【0088】

「ヒトエフェクター細胞」は、Ｔ細胞受容体又はＦｃＲなどの受容体を発現し、エフェクター機能を果たす白血球である。好ましくは、細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣに介在するヒト白血球の例としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球が挙げられ、ＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、その天然供給源、例えば本明細書中に記載されるような血液又はＰＢＭＣから単離され得る。

【0089】

「免疫細胞」という用語は、本明細書中で、最も広い意味で使用され、骨髄又はリンパ起源の細胞、例えば、リンパ球（例えば、Ｂ細胞及び細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、好酸球、多形核細胞、例えば、好中球、顆粒球、肥満細胞及び好塩基球を含むが限定されない。

【0090】

抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（ネイティブ配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列バリアントＦｃ領域）に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体、ＢＣＲ）の下方制御などが挙げられる。

【0091】

「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞介在性反応を指す。ＡＤＣＣに介在するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－９２（１９９１）の４６４頁、表３に要約される。関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、インビトロＡＤＣＣアッセイ、例えば、米国特許第５，５００，３６２号明細書又は同第５，８２１，３３７号明細書に記載されているもの、を実施し得る。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代わりに又はさらに、関心対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価され得る。

【0092】

「補体依存性細胞傷害」又は「ＣＤＣ」は、補体の存在下で分子が標的を溶解する能力を指す。補体活性化経路は、補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）の、同族抗原と複合化した分子（例えば抗体）への結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えばＧａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）に記載されているようなＣＤＣアッセイを実施し得る。

【0093】

「結合親和性」は、分子（例えば抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合性相互作用の合計強度を指す。別段の指示がない限り、本明細書中で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表され得る。親和性は、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定され得る。低親和性抗体は一般に、抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向がある一方、高親和性抗体は一般に、より速く抗原に結合し、結合したままである傾向がある。

【0094】

本明細書中で使用される場合、「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、動力学モードでＯｃｔｅｔ ＱＫ３８４機器（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を使用して、バイオレイヤー干渉法によって決定される解離定数を指す。例えば、抗マウスＦｃセンサーにマウスＦｃ融合抗原を載せ、次いで、抗体含有ウェルに浸漬して、濃度依存性結合速度（ｋｏｎ）を測定する。抗体解離速度（ｋｏｆｆ）を最終段階で測定し、ここで、センサーを緩衝液のみを含有するウェルに浸漬する。Ｋｄは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比である。（さらに詳しくは、Ｃｏｎｃｅｐｃｉｏｎ，Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｂ Ｃｈｅｍ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ，１２（８），７９１－８００，２００９を参照）。

【0095】

「処置」、「処置する」などの用語は、本明細書では、一般に所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを意味するために使用される。効果は、疾患若しくはその症状を完全若しくは部分的に防ぐ点で予防的であり得、且つ／又は疾患及び／又は疾患に起因する有害作用に対する部分的若しくは完全な治癒の点で治療的であり得る。本明細書中で使用される場合、「処置」は、哺乳動物における疾患のあらゆる処置を包含し、（ａ）疾患の素因があり得るが、それを有するとまだ診断されていない対象において疾患が生じるのを防止すること；（ｂ）疾患を阻止すること、即ちその発症を阻止すること；又は（ｃ）疾患を軽減すること、即ち疾患の退縮を引き起こすことを含む。治療薬は、疾患又は傷害の発症前、発症中又は発症後に投与され得る。処置が患者の望ましくない臨床症状を安定化又は軽減する、進行中の疾患の処置は、特に興味深い。そのような処置は、罹患組織における機能の完全な喪失前に実施されることが望ましい。対象の治療は、疾患の症候性段階中、場合により疾患の症候性段階後に投与され得る。

【0096】

「治療的有効量」は、対象に治療的利益を与えるのに必要な活性薬剤の量を意図する。例えば、「治療的有効量」は、疾患に関連する病理学的症状、疾患の進行若しくは生理学的状態の改善を誘導するか、改良するか若しくは引き起こすか、又は障害に対する抵抗性を改善する量である。

【0097】

用語「Ｂ細胞性新生物」又は「成熟Ｂ細胞性新生物」には、本発明に関連して、限定はされないが、あらゆるリンパ性白血病及びリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、前リンパ球性白血病、前駆Ｂリンパ芽球性白血病、有毛細胞白血病、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、多発性骨髄腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞性新生物、例えば、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、モノクローナル免疫グロブリン沈着症、重鎖病、ＭＡＬＴリンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、原発性滲出性リンパ腫及びエイズ関連非ホジキンリンパ腫が含まれる。

【0098】

用語「ＣＤ１９の発現によって特徴付けられる」とは、広義には、疾患又は障害の特徴である１つ以上の病的過程にＣＤ１９発現が付随するか、又はそれが関わる任意の疾患又は障害を指す。かかる障害としては、限定はされないが、Ｂ細胞性新生物が挙げられる。

【0099】

「対象」、「個体」及び「患者」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、処置について評価され及び／又は処置されている哺乳動物を指す。一実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。「対象」、「個体」及び「患者」という用語は、癌を有する個体、自己免疫疾患を有する個体、病原体感染を有する個体などを包含するが限定されない。対象はヒトであり得るが、他の哺乳動物、特にヒト疾患のための実験モデルとして有用な哺乳動物、例えばマウス、ラットなども含む。

【0100】

「医薬製剤」という用語は、有効成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であり、製剤が投与される対象に対して許容できない毒性を有する追加成分を含有しない製剤を指す。このような製剤は無菌である。「薬学的に許容可能な」賦形剤（ビヒクル、添加剤）は、使用される有効成分の有効用量を提供するために対象哺乳動物に合理的に投与され得るものである。

【0101】

「無菌」製剤は、無菌であるか、又は全ての生きている微生物及びそれらの胞子を含まないか若しくは基本的に含まない。「凍結」製剤は、０℃未満の温度のものである。

【0102】

「安定な」製剤は、その中のタンパク質が貯蔵時にその物理的安定性、及び／又は化学的安定性、及び／又は生物学的活性を基本的に保持するものである。好ましくは、製剤は、貯蔵時、その物理的及び化学的安定性並びにその生物学的活性を基本的に保持する。貯蔵期間は、一般に、製剤の意図された有効期間に基づいて選択される。タンパク質安定性を測定するための様々な分析技術が当技術分野で利用可能であり、例えばＰｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７－３０１．Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１） ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ．Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９－９０）（１９９３）で概説されている。安定性は、選択された温度で、選択された期間、測定され得る。安定性は、凝集体形成の評価（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて濁度を測定することにより、且つ／又は目視検査によって）；陽イオン交換クロマトグラフィー、画像キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）又はキャピラリーゾーン電気泳動を用いて電荷不均一性を評価することによって；アミノ末端又はカルボキシ末端配列の分析；質量分光分析；還元されたインタクトな抗体を比較するためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析；ペプチドマップ（例えば、トリプシン又はＬＹＳ－Ｃ）分析；抗体の生物学的活性又は抗原結合機能の評価などを含む様々な異なる方法で定性的及び／又は定量的に評価され得る。不安定性には、以下の何れかの１つ以上が含まれ得る：凝集、脱アミド化（例えばＡｓｎ脱アミド化）、酸化（例えば、Ｍｅｔ酸化）、異性化（例えばＡｓｐ異性化）、クリッピング／加水分解／断片化（例えばヒンジ領域断片化）、スクシンイミド形成、不対システイン、Ｎ末端伸長、Ｃ末端プロセシング、グリコシル化の相違など。

【0103】

ＩＩ．詳細な説明
抗ＣＤ１９抗体
本発明は、ヒトＣＤ１９に結合する近縁抗体のファミリーを提供する。このファミリーの抗体は、本明細書に定義し及び表１に示すとおりの一組のＣＤＲ配列を含み、表２に示される提供される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列及び表３に示される配列番号５及び６の重鎖可変領域（ＶＨ）配列によって例示される。この抗体ファミリーは、１つ又は複数の臨床治療薬としての有用性に寄与するいくつもの利益を提供する。これらの抗体には、様々な結合親和性を有するメンバーが含まれるため、所望の結合親和性を有する具体的な配列を選ぶことが可能である。

【0104】

【表1】

【0105】

【表2】

【0106】

【表3】

【0107】

開発及び治療的又は他の使用、限定なしに、二特異性抗体としての又は例えば図４パネルＢに図示されるとおりのＣＡＲ－Ｔ構造体の一部としての使用を含めた使用のために、好適な抗体を本明細書に提供されるものから選択し得る。

【0108】

候補タンパク質に対する親和性の決定は、Ｂｉａｃｏｒｅ測定などの当技術分野で知られた方法を使用して行い得る。抗体ファミリーの^－メンバーは、約１０^－６～約１０^－１０前後；約１０^－６～１０^－９前後；約１０^－６～約１０^－８前後；約１０^－８～約１０^－１１前後；約１０^－８～約１０^－１０前後；約１０^－８～約１０^－９前後；約１０^－９～約１０^－１１前後；約１０^－９～約１０^－１０前後；又はこれらの範囲内の何れかの値を含むが限定されない、約１０－６～約１０－１１前後のＫｄの、ＣＤ１９に対する親和性を有し得る。親和性選択は、インビトロアッセイ、前臨床モデル及び臨床治験並びに潜在的な毒性の評価を含む、ＣＤ１９の生物学的活性の調整、例えば遮断についての生物学的評価によって確認され得る。

【0109】

本明細書における抗体ファミリーのメンバーは、カニクイザルのＣＤ１９タンパク質と交差反応性を示さないが、必要に応じて、カニクイザルのＣＤ１９タンパク質又は任意の他の動物種のＣＤ１９との交差反応性が付与されるように操作することができる。

【0110】

本明細書中のＣＤ１９特異的抗体のファミリーは、ヒトＶＨフレームワークにおけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含むＶＨドメインを含む。ＣＤＲ配列は、一例として、配列番号５～６で示される、提供される代表的な可変領域配列の、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に対する、アミノ酸残基２６～３３；５１～５８；及び９７～１１６の前後の領域に位置し得る。異なるフレームワーク配列が選択される場合、ＣＤＲ配列は異なる位置にあり得るが、一般に配列の順序は同じままであることが当業者により理解されよう。

【0111】

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１又は３８の何れか１つのＣＤＲ１配列を含む。詳細な実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１のＣＤＲ１配列を含む。詳細な実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号３８のＣＤＲ１配列を含む。

【0112】

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号２又は３９の何れか１つのＣＤＲ２配列を含む。詳細な実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号２のＣＤＲ２配列を含む。詳細な実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号３９のＣＤＲ２配列を含む。

【0113】

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号３～４の何れか１つのＣＤＲ３配列を含む。詳細な実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号３のＣＤＲ３配列を含む。詳細な実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号４のＣＤＲ３配列を含む。

【0114】

さらなる実施形態において、抗ＣＤ１９重鎖抗体は、配列番号１のＣＤＲ１配列；配列番号２のＣＤＲ２配列；及び配列番号３のＣＤＲ３配列を含む。

【0115】

さらなる実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１のＣＤＲ１配列；配列番号２のＣＤＲ２配列；及び配列番号４のＣＤＲ３配列を含む。

【0116】

さらなる実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号３８のＣＤＲ１配列；配列番号２のＣＤＲ２配列；及び配列番号４のＣＤＲ３配列を含む。

【0117】

さらなる実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１のＣＤＲ１配列；配列番号３９のＣＤＲ２配列；及び配列番号４のＣＤＲ３配列を含む。

【0118】

さらなる実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号５～６及び４０～４１（表３）の重鎖可変領域アミノ酸配列の何れかを含む。

【0119】

なおもさらなる実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号５の重鎖可変領域配列を含む。

【0120】

なおもさらなる実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号６の重鎖可変領域配列を含む。

【0121】

なおもさらなる実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号４０の重鎖可変領域配列を含む。

【0122】

なおもさらなる実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号４１の重鎖可変領域配列を含む。

【0123】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ１９抗体におけるＣＤＲ配列は、配列番号１～４、３８及び３９（表１；表２）の何れか１つにあるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３配列又は一組のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列と比べると１つ又は２つのアミノ酸置換を含む。

【0124】

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、好ましくは、ＣＤＲ３配列が、表１又は表２に提供されるＣＤＲ３配列を有する抗体の何れか１つのＣＤＲ３配列に対してアミノ酸レベルで８０％以上、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、ＣＤ１９に結合する。

【0125】

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、好ましくは、全一組のＣＤＲ１、２及び３（の組み合わせ）が、表１又は表２に提供されるＣＤＲ配列を有する抗体のＣＤＲ１、２及び３（の組み合わせ）に対してアミノ酸レベルで８５パーセント（８５％）以上の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、ＣＤ１９に結合する。

【0126】

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号５～６及び４０～４１（表３に示される）の重鎖可変領域配列の何れかに対して少なくとも約８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性又は少なくとも９９％の同一性の重鎖可変領域配列を含み、ＣＤ１９に結合する。

【0127】

いくつかの実施形態では、二特異性又は多特異性抗体が提供され、これは、限定なしに、二特異性３本鎖抗体様分子（ＴＣＡ）を含め、本明細書で考察される構成の何れも有し得る。いくつかの実施形態では、多特異性抗体は、ＣＤ１９に対する結合特異性を有する少なくとも１つの重鎖可変領域と、ＣＤ１９以外のタンパク質に対する結合特異性を有する少なくとも１つの重鎖可変領域とを含むことができる。いくつかの実施形態では、多特異性抗体は、ＣＤ１９に結合する少なくとも１つの重鎖可変領域と、ＣＤ１９以外のタンパク質に結合する少なくとも１つの重鎖可変領域とを含むことができる。いくつかの実施形態では、多特異性抗体は、少なくとも２つの抗原結合ドメインを含む重鎖可変領域を含むことができ、それらの抗原結合ドメインは、各々がＣＤ１９に結合する。いくつかの実施形態では、多特異性抗体は、第１の抗原（例えば、ＣＤ３）に結合する重鎖／軽鎖の対と、重鎖抗体からの重鎖とを含むことができる。特定の実施形態において、重鎖抗体からの重鎖は、ＣＨ１ドメインの非存在下で、ＣＨ２及び／又はＣＨ３及び／又はＣＨ４ドメインを含むＦｃ部分を含む。詳細な一実施形態において、二特異性抗体は、エフェクター細胞上の抗原（例えば、Ｔ細胞上のＣＤ３タンパク質）に結合する重鎖／軽鎖の対と、ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインを含む重鎖抗体からの重鎖とを含む。

【0128】

いくつかの実施形態では、多特異性抗体は、軽鎖可変ドメインと対をなすＣＤ３結合ＶＨドメインを含む。特定の実施形態において、軽鎖は、固定された軽鎖である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ＶＨドメインは、ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号７のＣＤＲ１配列、配列番号８のＣＤＲ２配列及び配列番号９のＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ＶＨドメインは、ヒトＶＨフレームワークにおける配列番号１０のＣＤＲ１配列、配列番号１１のＣＤＲ２配列及び配列番号１２のＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、固定された軽鎖は、ヒトＶＬフレームワークにおける配列番号１３のＣＤＲ１配列、配列番号１４のＣＤＲ２配列及び配列番号１５のＣＤＲ３配列を含む。一緒になって、ＣＤ３結合ＶＨドメインと軽鎖可変ドメインとはＣＤ３に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ＶＨドメインは、配列番号１６の重鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ＶＨドメインは、配列番号１７の重鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ＶＨドメインは、配列番号１６又は１７の重鎖可変領域配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％のパーセント同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、固定された軽鎖は、配列番号１８の軽鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、固定された軽鎖は、配列番号１８の軽鎖可変領域配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％のパーセント同一性を有する配列を含む。

【0129】

上述のＣＤ３結合ＶＨドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む多特異性抗体は、例えば、国際公開第２０１８／０５２５０３号パンフレット（この開示は全体として参照により本明細書に組み込まれる）に記載される有利な特性を有する。本明細書に記載される、ＣＤ１９に対して結合親和性を有する多特異性抗体及び抗原結合ドメインの何れも、本明細書に記載されるＣＤ３結合ドメイン及び固定された軽鎖ドメイン（例えば、表４及び表５を参照）並びに表６及び表７に提供されるものなど、追加の配列と組み合わせて、１つ以上のＣＤ１９エピトープ並びにＣＤ３に対して結合親和性を有する多特異性抗体を作成することができる。

【0130】

【表4】

【0131】

【表5】

【0132】

【表6】

【0133】

【表7】

【0134】

【表8】

【0135】

【表9】

【0136】

【表10】

【0137】

いくつかの実施形態では、二特異性３本鎖抗体様分子（ＴＣＡ）を含むが限定されない本明細書中で論じられる配置の何れかを有し得る二特異性又は多特異性抗体が提供される。いくつかの実施形態では、二特異性抗体は、ＣＤ１９に結合する少なくとも１つの重鎖可変領域及びＣＤ１９以外のタンパク質に結合する少なくとも１つの重鎖可変領域を含み得る。いくつかの実施形態では、二特異性抗体は、第１の抗原に結合する重鎖／軽鎖対と、ＣＨ１ドメインの非存在下でＣＨ２及び／又はＣＨ３及び／又はＣＨ４ドメインを含むＦｃ部分を含む重鎖抗体由来の重鎖と、第２の抗原のエピトープ又は第１の抗原の異なるエピトープに結合する抗原結合ドメインとを含み得る。特定の一実施形態では、二特異性抗体は、エフェクター細胞上の抗原（例えばＴ細胞上のＣＤ３タンパク質）に結合する重鎖／軽鎖対と、ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインを含む重鎖抗体由来の重鎖とを含む。

【0138】

いくつかの実施形態では、本発明の抗体が二特異性抗体である場合、抗体の一方のアーム（１つの結合部分又は１つの結合単位）がヒトＣＤ１９に特異的である一方、他方のアームは、標的細胞、腫瘍関連抗原、ターゲティング抗原、例えばインテグリン等、病原体抗原、チェックポイントタンパク質などに特異的であり得る。標的細胞としては、限定なしに、ＣＤ１９の発現によって特徴付けられる血液学的悪性腫瘍に関連する細胞を含めた癌細胞並びにＣＤ１９の発現によって特徴付けられる自己免疫障害に関連する病原性Ｂ細胞が特に挙げられる。いくつかの実施形態では、抗体の一方のアーム（１つの結合部分又は１つの結合単位）がヒトＣＤ１９に特異的である一方、他方のアームはＣＤ３に特異的である。

【0139】

いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２８又は２９の何れか１つの配列に連結された、一価又は二価構成の、配列番号３０の配列を含む抗ＣＤ３軽鎖ポリペプチド、配列番号１６又は１７の配列を含む抗ＣＤ３重鎖ポリペプチド及び配列番号５又は６の配列を含む抗ＣＤ１９重鎖ポリペプチドを含む。これらの配列を様々な方法で組み合わせて、所望のＩｇＧサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ４、サイレントなＩｇＧ１、サイレントなＩｇＧ４の二特異性抗体を作製することができる。好ましい一実施形態において、抗体は、配列番号３０を含む第１のポリペプチドと、配列番号３１を含む第２のポリペプチドと、配列番号３２、３３、３４、３５、３６又は３７を含む第３のポリペプチドとを含むＴＣＡである。

【0140】

多特異性抗体の様々な形式は本発明の範囲内にあり、例えば、１本鎖ポリペプチド、２本鎖ポリペプチド、３本鎖ポリペプチド、４本鎖ポリペプチド及びそれらの複合を含むが限定されない。本明細書中で多特異性抗体は具体的に、ＣＤ１９及びＣＤ３に結合するＴ細胞多特異性（例えば二特異性）抗体（抗ＣＤ１９ ｘ 抗ＣＤ３抗体）を含む。このような抗体は、強力なＴ細胞介在性のＣＤ１９発現細胞の死滅を誘導する。

【0141】

抗ＣＤ１９抗体の調製
本発明の抗体は、当技術分野で公知の方法によって調製され得る。好ましい実施形態では、本明細書中の抗体は、内因性免疫グロブリン遺伝子がノックアウトされるか又は無効にされているトランスジェニック動物、例えばトランスジェニックマウス及びラット、好ましくはラットによって産生される。好ましい実施形態では、本明細書中の重鎖抗体は、ＵｎｉＲａｔ（商標）において作製される。ＵｎｉＲａｔ（商標）の内因性免疫グロブリン遺伝子をサイレンシングし、ヒト免疫グロブリン重鎖トランス遺伝子座を使用して、完全ヒトＨＣＡｂの多様な天然に最適化されたレパートリーを発現させる。ラットの内因性免疫グロブリン遺伝子座は様々な技術を使用してノックアウト又はサイレンシングし得るが、ＵｎｉＲａｔ（商標）では、ジンクフィンガー（エンド）ヌクレアーゼ（ＺＮＦ）技術を使用して、内因性ラット重鎖Ｊ遺伝子座、軽鎖Ｃκ遺伝子座及び軽鎖Ｃλ遺伝子座を不活性化した。卵母細胞へのマイクロインジェクションのためのＺＮＦコンストラクトは、ＩｇＨ及びＩｇＬノックアウト（ＫＯ）株を産生させ得る。詳しくは、例えば、Ｇｅｕｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２５：４３３を参照。Ｉｇ重鎖ノックアウトラットの特性は、Ｍｅｎｏｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０：２９３２－２９４１により報告されている。ＺＮＦ技術の利点は、数ｋｂまでの欠失によって遺伝子又は遺伝子座をサイレンシングするために連結する非相同末端が、相同組込みのための標的部位を提供することもできることである（Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９：６４－６７）。ＵｎｉＲａｔ（商標）で産生されるヒト重鎖抗体は、ＵｎｉＡｂ（商標）と呼ばれ、従来の抗体で攻撃することができないエピトープに結合し得る。それらの高い特異性、親和性及び小さいサイズのために、それらは、単一特異性及び多特異性用途に理想的である。

【0142】

ＵｎｉＡｂ（商標）に加えて、ラクダ科動物のＶＨＨフレームワーク及び突然変異を欠く重鎖抗体並びにそれらの機能的ＶＨ領域が、本明細書中に具体的に含まれる。このような重鎖抗体は、例えば、国際公開第２００６／００８５４８号パンフレットに記載されているように、完全ヒト重鎖単独遺伝子座を含むトランスジェニックラット又はマウスにおいて産生され得るが、ウサギ、モルモット、ラットなどの他のトランスジェニック哺乳動物も使用され得、ラット及びマウスが好ましい。重鎖抗体（それらのＶＨＨ又はＶＨ機能性断片を含む）は、組み換えＤＮＡ技術、例えば哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は酵母を含む好適な真核又は原核宿主中でのコード核酸の発現によっても産生され得る。

【0143】

重鎖抗体のドメインは、抗体及び低分子薬の利点を兼ね備え、１価又は多価であり得、毒性が低く、製造するための費用効率が高い。それらのサイズが小さいため、これらのドメインは経口又は局所投与を含む投与が容易であり、胃腸における安定性を含む高い安定性を特徴とし、それらの半減期は、所望の使用又は適応に合わせ得るさらに、ＨＣＡｂのＶＨ及びＶＨＨドメインは、費用効率の高い方法で製造され得る。

【0144】

特定の実施形態では、ＵｎｉＡｂ（商標）を含む本発明の重鎖抗体は、ＦＲ４領域の第１の位置（Ｋａｂａｔナンバリングシステムによるアミノ酸位置１０１）に、別のアミノ酸残基によって置換されたネイティブアミノ酸残基を有し、このアミノ酸残基はその位置においてネイティブアミノ酸残基を含むか又は天然アミノ酸残基と結合している表面露出疎水性パッチを破壊することが可能である。このような疎水性パッチは通常、抗体軽鎖定常領域との界面に埋め込まれるが、ＨＣＡｂでは表面露出され、少なくとも部分的に、ＨＣＡｂの望ましくない凝集及び軽鎖結合のためである。置換されたアミノ酸残基は好ましくは荷電しており、より好ましくは正に荷電しており、例えば、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）又はヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、好ましくはアルギニン（Ｒ）である。好ましい実施形態では、トランスジェニック動物由来の重鎖抗体は、１０１位にＴｒｐからＡｒｇへの突然変異を含有する。得られるＨＣＡｂは、好ましくは、高い抗原結合親和性及び凝集なしの生理学的条件下での溶解性を有する。

【0145】

本発明の一部として、ＥＬＩＳＡタンパク質及び細胞結合アッセイにおいて、ヒトＣＤ１９に結合する、ＵｎｉＲａｔ（商標）動物由来の特有の配列を有するヒトＩｇＧ抗ＣＤ１９重鎖抗体（ＵｎｉＡｂ（商標））を同定した。同定された重鎖可変領域（ＶＨ）配列は、ヒトＣＤ１９タンパク質結合に対して及び／又はＣＤ１９＋細胞に対する結合について陽性であり、ＣＤ１９を発現しない細胞への結合について全て陰性である。

【0146】

ＣＤ１９タンパク質上の非重複エピトープに結合する重鎖抗体、例えばＵｎｉＡｂｓ（商標）は、競合結合アッセイ、例えば酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡアッセイ）又はフローサイトメトリー競合結合アッセイなどによって同定され得る。例えば、標的抗原に結合する既知の抗体と関心対象の抗体との間の競合を使用し得る。このアプローチを使用することにより、抗体のセットを、参照抗体と競合するものと競合しないものとに分け得る。非競合抗体は、参照抗体が結合するエピトープと重複しない別個のエピトープへの結合として同定される。多くの場合、１つの抗体を固定化し、抗原を結合させ、第２の標識した（例えばビオチン化した）抗体を、捕捉された抗原に結合する能力についてＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験する。これは、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（ＢｉｏＲａｄ，Ｉｎｃ）、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００及びＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＭＸ９６ ＳＰＲイメージャ（Ｉｂｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｂ．Ｖ．）を含む表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）プラットフォームを使用することにより、且つＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４及びＯｃｔｅｔ ＨＴＸ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｐａｌｌ Ｉｎｃ）などのバイオレイヤー干渉プラットフォーム上でも行われ得る。さらなる詳細については、本明細書中の実施例を参照。

【0147】

典型的には、抗体は、標準的な技術、例えば上記の競合結合アッセイによって決定されるように、標的抗原に対する参照抗体の結合の約１５～１００％の減少を引き起こす場合、参照抗体と「競合する」。種々の実施形態では、相対阻害率は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％以上である。

【0148】

医薬組成物、使用及び処置の方法
本発明の別の態様は、本発明の１つ以上の抗体を好適な薬学的に許容可能な担体と混合して含む医薬組成物を提供することである。本明細書中で使用されるような薬学的に許容可能な担体としては、アジュバント、固体担体、水、緩衝液若しくは治療成分を保持するために当技術分野で使用されている他の担体又はこれらの組み合わせが例示されるが限定されない。

【0149】

一実施形態において、医薬組成物は、ＣＤ１９に結合する重鎖抗体（例えば、ＵｎｉＡｂ（商標））を含む。別の実施形態において、医薬組成物は、ＣＤ１９タンパク質上の２つ以上の重複しないエピトープに対して結合特異性を有する多特異性（二特異性を含む）の重鎖抗体（例えば、ＵｎｉＡｂ（商標））を含む。好ましい実施形態において、医薬組成物は、ＣＤ１９に対する結合特異性を有し、且つエフェクター細胞上の結合標的（例えば、Ｔ細胞上のＣＤ３タンパク質など、例えば、Ｔ細胞上の結合標的）に対する結合特異性を有する多特異性（二特異性及びＴＣＡを含む）の重鎖抗体（例えば、ＵｎｉＡｂ（商標））を含む。好ましい実施形態において、医薬組成物は、ＣＤ１９に結合し、且つエフェクター細胞上の結合標的（例えば、Ｔ細胞上のＣＤ３タンパク質など、例えば、Ｔ細胞上の結合標的）に結合する多特異性（二特異性及びＴＣＡを含む）の重鎖抗体（例えば、ＵｎｉＡｂ（商標））を含む。

【0150】

本開示に従って使用される抗体の医薬組成物は、保管のために、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態などで、所望の純度を有するタンパク質を任意選択の薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と混合することによって調製される（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）を参照）。許容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して毒性がなく、それらには、リン酸、クエン酸及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンなど；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎタンパク質錯体）；及び／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。

【0151】

非経口投与のための医薬組成物は、好ましくは、無菌で且つ実質的に等張であり、適正製造基準（ＧＭＰ）条件下で製造される。医薬組成物は単位剤形（即ち単回投与のための剤形）で提供され得る。製剤は、選択される投与経路に依存する。本明細書中の抗体は、静脈内注射若しくは注入により又は皮下に投与され得る。注射投与のために、本明細書中の抗体は、水溶液中で、好ましくは生理学的に適合性の緩衝液中で製剤化されて、注射部位の不快感を軽減し得る。溶液は、上で論じられるように、担体、賦形剤又は安定剤を含有し得る。代わりに、抗体は、使用前に好適なビヒクル、例えば発熱物質不含の滅菌水、での構成のために、凍結乾燥された形態であり得る。

【0152】

例えば米国特許第９，０３４，３２４号明細書において抗体製剤が開示される。本発明の、ＵｎｉＡｂｓ（商標）を含む、重鎖抗体に対して、同様の製剤が使用され得る。皮下抗体製剤は、例えば、米国特許出願公開第２０１６０３５５５９１号明細書及び米国特許出願公開第２０１６０１６６６８９号明細書に記載されている。

【0153】

使用方法
本明細書に記載される抗ＣＤ１９抗体及び医薬組成物は、限定なしに、本明細書にさらに記載される病態及び疾患を含め、ＣＤ１９の発現によって特徴付けられる疾患及び病態の処置に使用することができる。

【0154】

ＣＤ１９は、あらゆるヒトＢ細胞に発現するが、形質細胞には見られない細胞表面受容体である。これは、比較的大型の２４０アミノ酸の細胞質テールを有する。この細胞外Ｉｇ様ドメインは、潜在的にジスルフィド結合型の非Ｉｇ様ドメインと、Ｎ－結合型の糖鎖付加部位とに分けられる。この細胞質テールは、Ｃ末端近傍に少なくとも９個のチロシン残基を有し、そのいくつかは、リン酸化していることが示されている。ＣＤ２０及びＣＤ２２と共に、ＣＤ１９の発現はＢ細胞系統に制限されているため、ＣＤ１９はＢ細胞悪性腫瘍の治療的処置に魅力的な標的となる。ＣＤ１９は、いくつもの血液学的悪性腫瘍でその発現が観察されるため、抗体ベースの治療薬の有望な標的である。

【0155】

一態様において、本明細書の抗ＣＤ１９抗体（例えば、ＵｎｉＡｂｓ（商標））及び医薬組成物は、限定なしに、本明細書にさらに記載される疾患及び障害を含め、ＣＤ１９の発現によって特徴付けられる障害の処置に使用することができる。

【0156】

本発明の抗ＣＤ１９重鎖抗体（ＵｎｉＡｂｓ）は、限定なしに、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及びＢ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を含めた、ＣＤ１９の発現によって特徴付けられる血液学的悪性腫瘍の処置用治療薬の開発に使用することができる。

【0157】

びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ又はＤＬＢＬ）は、成人に最も多く見られる形態の非ホジキンリンパ腫であり（Ｂｌｏｏｄ １９９７ ８９（１１）：３９０９－１８）、米国及び英国での推定年間発生率は毎年１０万人に７～８例である。これは、事実上身体のあらゆる部位に発生し得る高悪性度の癌として特徴付けられる。ＤＬＢＣＬの原因は十分に解明されておらず、これは正常なＢ細胞からも、他の種類のリンパ腫又は白血病細胞の悪性形質転換からも生じ得る。処置手法は、概して化学療法及び放射線照射を伴い、成人の５年全生存率の平均は約５８％となっている。一部のモノクローナル抗体がＤＬＢＣＬの処置に有望であるとされているが、一貫した臨床的有効性は未だ決定的には実証されていない。従って、ＤＬＢＣＬに対する免疫療法を含めた新規の治療法が大いに必要とされている。

【0158】

別の態様において、本明細書におけるＣＤ１９重鎖抗体（例えば、ＵｎｉＡｂｓ（商標））及び医薬組成物は、限定なしに、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）及び多発性硬化症（ＭＳ）を含めた、ＣＤ１９を発現する病原性Ｂ細胞を特徴とする自己免疫障害の処置に使用することができる。

【0159】

一実施形態において、本明細書における抗体は、重鎖のみの抗ＣＤ１９抗体－ＣＡＲ構造体、即ち、重鎖のみの抗ＣＤ１９抗体－ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞構造体の形態であり得る。

【0160】

疾患の処置のための本発明の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか又は動物であるか、他の薬剤の投与及び処置が予防的であるか又は治療的であるかを含む多くの異なる因子に依存して変動する。通常、患者はヒトであるが、非ヒト哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマなどのコンパニオン動物、ウサギ、マウス、ラットなどの実験用哺乳動物も処置され得る。処置投与量は、安全性及び有効性を最適化するために用量設定され得る。

【0161】

投与量レベルは通常の技術を有する臨床医によって容易に決定され得、必要に応じて、例えば、治療に対する対象の応答を変更するために必要に応じて変更し得る。単一の剤形を生成させるために担体材料と組み合わせられ得る有効成分の量は、処置される宿主及び特定の投与方式に応じて変動する。単位剤形は、一般に、約１ｍｇ～約５００ｍｇの有効成分を含有する。

【0162】

いくつかの実施形態では、薬剤の治療投与量は宿主体重の約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には０．０１～５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例えば、投与量は、１ｍｇ／ｋｇ体重若しくは１０ｍｇ／ｋｇ体重又は１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。例示的な処置レジメンは、２週間ごと又は１カ月に１回若しくは３～６カ月ごとの投与を伴う。本発明の治療物質は、通常、複数回投与される。単回投与間の間隔は、毎週、毎月又は毎年であり得る。間隔は、患者における治療物質の血中レベルを測定することによって示されるように不規則でもあり得る。代わりに、本発明の治療物質は、徐放性製剤として投与され得、その場合、投与頻度をより少なくする必要がある。投与量及び頻度は、患者におけるポリペプチドの半減期に応じて変動する。

【0163】

典型的には、組成物は溶液又は懸濁液の何れかとしての注射剤として調製され、注射前の液体ビヒクル中の溶液又は懸濁液に適した固体形態を調製することもできる。本明細書中の医薬組成物は、直接の又は固体（例えば凍結乾燥）組成物の再構成後の静脈内又は皮下投与に好適である。調製物は、上述のように、アジュバント効果を高めるために、ポリラクチド、ポリグリコリド又はコポリマーなどのリポソーム又は微粒子中に乳化又はカプセル化することもできる。Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７，１９９０及びＨａｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２８：９７－１１９，１９９７。本発明の薬剤は、有効成分の持続放出又はパルス放出を可能にするような方式で製剤化され得るデポ注射又はインプラント製剤の形態で投与され得る。本医薬組成物は、一般に、無菌であり、実質的に等張であり、米国食品医薬品局の全ての適正製造基準（ＧＭＰ）規則を完全に遵守して製剤化される。

【0164】

本明細書中に記載の抗体及び抗体構造体の毒性は、細胞培養又は実験動物における標準的な医薬的手順により、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）又はＬＤ１００（集団の１００％に致死的な用量）を決定することにより決定され得る。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数である。これらの細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータを、ヒトでの使用に対して毒性ではない投与量範囲を処方する際に使用し得る。本明細書中に記載の抗体の投与量は、毒性が殆どないか又は全くない有効用量を含む循環濃度の範囲内であることが好ましい。投与量は、使用される剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。正確な処方、投与経路及び投与量は、個々の医師により、患者の状態を考慮して選択され得る。

【0165】

投与のための組成物は一般に、薬学的に許容可能な担体、好ましくは水性担体中で溶解された抗体又は他のアブラティブ剤を含む。様々な水性担体、例えば、緩衝生理食塩水などを使用し得る。これらの溶液は無菌であり、一般に望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌され得る。本組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤などの生理学的条件に近似するために必要とされる薬学的に許容可能な補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有し得る。これらの製剤中の活性薬剤の濃度は広く変動し得、選択された特定の投与方式及び患者の必要性に従い、主に流体体積、粘度、体重などに基づいて選択される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１５ｔｈ ｅｄ．，１９８０）及びＧｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｌｍａｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９６））。

【0166】

本発明の活性物質及びその処方物及び使用説明書を含むキットも本発明の範囲内にある。本キットは、少なくとも１つのさらなる薬剤、例えば化学療法薬などをさらに含有し得る。キットは、典型的には、キットの内容物の意図される使用を示すラベルを含む。「ラベル」という用語は、本明細書中で使用される場合、キット上で又はキットと共に供給されるか、又はそうでなければキットに添付される、何らかの書面又は記録素材を含む。

【0167】

ここで、本発明を十分に説明するが、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、様々な変更形態及び修正形態がなされ得ることは、当業者にとって明らかであろう。

【実施例】

【0168】

ＩＩＩ．実施例
実施例１：ＣＤ１９＋ Ｒａｊｉ細胞への結合
ＣＤ１９陽性Ｒａｊｉ細胞への結合をフローサイトメトリーにより評価した。簡潔に言えば、５０，０００個の標的細胞を、精製したＵｎｉＡｂｓ（商標）の希釈系列によって４℃で３０分間染色した。インキュベーション後、細胞をフローサイトメトリー緩衝液（１×ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ_３）で２回洗浄し、Ｒ－フィコエリトリン（ＰＥ）にコンジュゲートしたヤギＦ（ａｂ’）_２抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０４２－０９）で染色することにより、細胞に結合した抗体を検出した。４℃で２０分間のインキュベーション後、細胞をフローサイトメトリー緩衝液で２回洗浄し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーにより測定した。二次抗体単独で染色した細胞のＭＦＩを使用してバックグラウンドシグナルを決定し、各抗体の結合をバックグラウンドに対する倍数に変換した。

【0169】

結果は図１に提供し、図１は、指示される抗ＣＤ１９抗体の標的結合活性を要約している。列１は、ＨＣＡｂのクローンＩＤを示す。列２は、バックグラウンドＭＦＩシグナルに対する倍数として測定したＲａｊｉ細胞への結合を示す。列３は、バックグラウンドＭＦＩシグナルに対する倍数として測定したＣＤ１９タンパク質を発現しないＣＨＯ細胞（陰性対照）への結合を示す。

【0170】

実施例２：ＣＤ１９＋ Ｒａｊｉ及びＤａｕｄｉ細胞への結合
２つの細胞株：Ｒａｊｉ（Ａ）及びＤａｕｄｉ（Ｂ）に関して、実施例１に記載されるとおり、細胞結合用量曲線を実施した。抗体は、２００ｎＭの出発濃度と、続く８点用量曲線の３倍系列希釈で試験した。ＰＥ平均蛍光強度をバックグラウンド（二次検出抗体のみとインキュベートした細胞）に対する倍数としてプロットした。

【0171】

結果は図２、パネルＡ（Ｒａｊｉ細胞）及びパネルＢ（Ｄａｕｄｉ細胞）に提供する。

【0172】

実施例３：ＣＤ１９＋細胞株に対する細胞結合ＥＣ５０値
細胞結合ＥＣ５０値を決定するため、実施例２に記載されるとおり、ＣＤ１９発現細胞株Ｒａｊｉ及びＤａｕｄｉに関して細胞結合用量曲線を実施した。抗体は、２００ｎＭの出発用量と、続く８点用量曲線の３倍系列希釈で試験した。変換したデータを非線形回帰曲線当てはめ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．４．３で利用可能）を用いてｘｙグラフとしてプロットすることにより、ＥＣ５０（ｎＭ）を求めた。

【0173】

結果は図３に提供する。

【0174】

実施例４：ヒト腫瘍細胞株によるＣＡＲ－Ｔ媒介性Ｔ細胞活性化
Ｊｕｒｋａｔ Ｔリンパ球細胞を抗ＣＤ１９ ＣＡＲ及び６×ＮＦＡＴ ＴＫナノルシフェラーゼレポーターとコトランスフェクトすることにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞活性を測定した。トランスフェクトしたＪｕｒｋａｔをＣＤ１９＋ Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ及びＳＵ－ＤＨＬ－１０又はＣＤ１９陰性Ｋ５６２細胞と共に２４時間共培養した。Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎａｎｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（カタログ番号Ｎ１１１０）を使用してルシフェラーゼ活性を測定し、データは、ＣＡＲをトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ及びＣＤ１９陰性Ｋ５６２細胞株を含む共培養物で正規化した。統計的有意性は、対応のない両側ｔ検定を用いて決定した。

【0175】

結果は、図４、パネルＢ及びＣに提供する。

【0176】

図４、パネルＡは、本発明の態様に従う抗体配列を含む抗ＣＤ１９細胞外結合ドメインを含むＣＡＲ－Ｔ構造体の概略図である。パネルＢは、抗ＣＤ１９ ３７００３４ ＣＡＲをトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔの、Ｒａｊｉ（^＊＊ｐ＝ ０．００５５）、Ｒａｍｏｓ（^＊＊ｐ＝０．００５８）及びＳＵ－ＤＨＬ－１０（^＊＊＊ｐ＝０．０００２５）でのＴ細胞活性を描く。パネルＣは、抗ＣＤ１９ ３７００８３ ＣＡＲをトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔの、Ｒａｊｉ（^＊＊＊＊ｐ＝０．０００００９）、Ｒａｍｏｓ（^＊＊ｐ＝０．００４）及びＳＵ－ＤＨＬ－１０（^＊ｐ＝０．０１６）でのＴ細胞活性を描く。

【0177】

実施例５：部位飽和突然変異誘発による生物学的特性の亢進を呈するＣＤ１９ ＶＨ結合体の作成
この例では、部位飽和突然変異誘発を用いて、野生型アミノ酸コード配列を他の１９個のアミノ酸コード配列の１つに系統的に置き換えたユニークなＣＤ１９ ＶＨ結合配列のプールを作成することにより突然変異体のプールを作成した。これをスクリーニングすることにより、親ＶＨ結合体と比較してインビトロ及び／又はインビボ特性が向上したＣＤ１９ ＶＨ結合体を同定し得る。

【0178】

ＣＤ１９ ＶＨ結合体ＶＨ－０３４は、３つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）：ＣＤＲ１（８アミノ酸；配列番号１）、ＣＤＲ２（８アミノ酸；配列番号２）及びＣＤＲ３（１０アミノ酸；配列番号４）を含む。部位飽和突然変異誘発を利用して、２６個の組み合わせのＣＤＲアミノ酸の各々を他の１９個の残りの非野生型アミノ酸残基の１つに系統的に置き換え、３つ全てのＣＤＲ配列にわたる範囲で単一のＣＤＲアミノ酸置換を含む５１３個のユニークなＣＤ１９ ＶＨ結合体配列のライブラリを作成した。

【0179】

簡潔に言えば、ＶＨ－０３４をコードするヌクレオチド配列が部位飽和突然変異誘発のＤＮＡ鋳型としての役割を果たした（例えば、Ｃｈｒｏｎｏｐｏｕｌｏｕ ａｎｄ Ｌａｂｒｏｕ（２０１１）Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ Ｃｈａｐｔｅｒ ２６ ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４０８６４．ｐｓ２６０６ｓ６３）。ＰＣＲ及びプライマーとして変性合成オリゴヌクレオチドを使用することにより、同じ反応内で１つのコドンを２０個全てのアミノ酸コドンと置き換え、次にそれを２６個のＣＤＲコドンの各々に系統的に適用した。結果として得られた、各々が単一アミノ酸置換をコードする５１３個のメンバーの核酸プール及び親の野生型配列をナノプラスミドベクターにクローニングし、このプラスミドプール中の５１３個のユニークなＶＨ結合体配列の各々の頻度を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）により決定した。

【0180】

ナノプラスミドベクターｎＰＢｖ２－ＥＦ１ａ－ｉＣ９－ＣＤ１９．ＶＨ０３４－ＤＨＦＲ．は、５’から３’方向に以下を含む：右端ＩＴＲ－５’ＵＴＲ－インスレーター－ＥＦ１ａプロモーター－誘導性ｉＣａｓｐａｓｅ９遺伝子－Ｔ２Ａ－ＣＤ８ａリーダーペプチド－ＶＨ０３４結合体の部位－ＣＤ１９ＢＢＺ ＣＡＲカセット－Ｔ２Ａ－ＤＨＦＲ選択可能マーカー－ＳＶ４０ポリＡ－インスレーター－３’－ＵＴＲ及び左端ＩＴＲ。各ユニークな結合体配列をＣＤ１９ＢＢＺ ＣＡＲカセットにインフレームでクローニングして、ＥＦ１ａプロモーターの制御下にある完全長ＣＡＲ（ＣＤ１９ ＶＨ結合体－ＣＤ２８ヒンジ－４１－ＢＢ膜貫通ドメイン及びＣＤ３ゼータドメイン）を作成した。

【0181】

実施例６：突然変異体ＣＤ１９ ＶＨ結合体を含むＣＡＲ発現Ｔ細胞プールの作成
この例では、５１３個のＣＤ１９ ＶＨ結合体配列の１つを含むＣＡＲを発現する個別のＴ細胞のＴ細胞プールを作成した。

【0182】

ＳｕｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードするｍＲＮＡ及び低ＤＮＡコピー数のＤＮＡナノプラスミドプールのアリコートをＴ細胞にエレクトロポレートすることにより、エレクトロポレートしたＴ細胞が５１３個のナノプラスミドの１つについての単一のコピーを含むことが確実となるようにして、実施例５で作成した５１３個のＣＤ１９ ＶＨ結合体ナノプラスミドのライブラリを含むＴ細胞プールを調製した。エレクトロポレートしたＴ細胞の集団を２５０ｎＭメトトレキサート中でインキュベートして、ＣＡＲ発現トランスポゾンの組み込まれたゲノムコピーを含む転移したＴ細胞を選択した。Ｔ細胞プール中における５１３個のユニークな結合体配列の各々の頻度をＮＧＳにより決定した。

【0183】

実施例７：ＣＤ１９刺激の繰り返しによる結合の向上を呈するＣＤ１９ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現するＴ細胞の濃縮
この例は、特定の抗原への繰り返しの曝露及び抗原刺激に起因して数が優先的に増大したＴ－クローンの選択により、Ｔ細胞集団内で選択のＴ細胞クローンを濃縮し得ることを示す。

【0184】

一つの実験では、Ｇｒｅｘ－６Ｍウェルプレートにて、実施例６で作成したＴ細胞プールからの約２０×１０ｅ６ Ｔ細胞／ウェルのＴ細胞を各ウェルにデュプリケートセットで加えた。一方のセットには、２×１０ｅ６個のＲＡＪＩ細胞（ＣＤ１９＋）を加え、他方のセットには、不活性なＣＤ１９遺伝子を有する２×１０ｅ６個の対照ＲＡＪＩ細胞（ＲＡＪＩ ＫＯ）を加えて、ＣＤ１９－ＣＡＲ発現Ｔ細胞の活性化を刺激した。３、６、９日目に、それぞれ、２×１０ｅ６個のＲＡＪＩ細胞又はＲＡＪＩ ＫＯでＴ細胞を再チャレンジした。１２日後、ＲＡＪＩ細胞によって刺激されたＴ細胞プールの分類されない増大は約２０倍であった一方、ＲＡＪＩ ＫＯ細胞の使用では、増大はほとんど乃至全く認められなかった。

【0185】

ＣＤ１９＋細胞をＮＧＳにより分析して、増大したＣＤ１９＋ Ｔ細胞集団内での５１３個の突然変異体結合体配列の各々の頻度を決定し、各メンバーのこの頻度を元のプラスミド及びＴ細胞プール集団と比較して分析した。

【0186】

第２の実験では、実施例６で作成したＴ細胞プールをウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体で処置してＣＡＲ陽性細胞を捕捉し、ＦＡＣＳ分析によりＣＡＲ細胞を選別して分析した。次に選別したＣＡＲ陽性Ｔ細胞プールをＲＡＪＩ ＣＤ１９＋細胞又はＲＡＪＩ－ＫＯによる再刺激に供し、１５日後（Ｒａｊｉ細胞による６回の刺激後）、Ｔ細胞の約４０倍の増大が観察された。ＣＡＲ＋ Ｔ細胞をＮＧＳにより分析して、増大したＣＡＲ＋ Ｔ細胞集団内での５１３個の突然変異体結合体配列の各々の頻度を決定し、各メンバーのこの頻度を元のプラスミド及びＴ細胞プール集団と比較して分析した。

【0187】

元のプラスミド集団内、Ｔ細胞プール内及び２つの濃縮条件の各々における各ＶＨ結合体の相対頻度を比較することにより、各ＶＨ結合体配列の頻度の相対的な変化を決定し得る。５１３個のＶＨ結合体配列の大多数はＲＡＪＩ処置Ｔ細胞プールから枯渇したことから、それらの突然変異がＣＤ１９結合の点で有害であったことが示唆される一方、ＶＨ結合体配列の集団の頻度はＣＤ１９刺激によっても比較的変化しないままであったことから、導入された突然変異がＣＤ１９結合にほとんど効果を及ぼさなかった可能性があることが示唆される。ある種のＴ細胞クローンはＣＤ１９刺激によって濃縮され、これらの２つの濃縮アッセイにより、両方のアッセイで濃縮されるように見えるＴ細胞クローンの重複のあるリストが生み出されている。

【0188】

両方の濃縮アッセイで観察された上位１２個のＶＨ結合体をさらに分析した。２つの特別なＴ細胞クローンが、ＲＡＪＩ細胞を使用した刺激の繰り返し後にＴ細胞集団内で高度に濃縮された。第１のＴ細胞クローンは、ＣＤＲ１にＴ２９Ｄ突然変異を含む（配列番号３８）ＣＤ１９ ＶＨ結合体を発現するＣＡＲを含み、及び第２のＴ細胞クローンは、ＣＤＲ２にＳ５５Ｄ突然変異を含む（配列番号３９）ＣＤ１９ ＶＨ結合体を発現するＣＡＲを含んだ。

【0189】

これらの２つの濃縮されたＣＤ１９ ＶＨ結合体Ｔ２９Ｄ及びＳ５５Ｄをインビトロ及びインビボアッセイでさらに特徴付けた。

【0190】

実施例８：Ｔ２９Ｄ又はＳ５５Ｄ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現するＴ細胞はインビトロ細胞傷害性の亢進を呈する
この例では、Ｔ２９Ｄ ＶＨ結合体又はＳ５５Ｄ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現するＴ細胞が、親のＶＨ０３４結合体と比較すると、ＣＤ１９発現細胞に対して高度なインビトロ細胞傷害性を呈することを示す。図５、パネルＡ及びＢは、親ＶＨ－０３４結合体と比較した、Ｔ２９Ｄ ＶＨ結合体又はＳ５５Ｄ ＶＨ結合体の何れかを含むＣＡＲを発現するＴ細胞間のインビトロ細胞傷害性比較結果を示すグラフである。より具体的には、これらの結果は、親ＶＨ－０３４結合体と比較した、Ｎａｌｍ６（図５、パネルＡを参照）又はＲＡＪＩ（図５、パネルＢを参照）細胞を使用したＣＤ１９刺激時のインビトロ細胞傷害性を示している。

【0191】

９６ウェルプレートにて、親ＶＨ－０３４結合体、Ｔ２９Ｄ ＶＨ結合体又はＳ５５Ｄ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現する約２０，０００ Ｔ細胞／ウェルのＴ細胞を各ウェルにデュプリケートセットで加えた。一方のセットには、１０，０００個のＲＡＪＩ－ＧＦＰ細胞を加え、他方のセットには、１０，０００個のＮａｌｍ６－ＧＦＰ細胞を加えて、ＣＤ１９－ＣＡＲ発現細胞の活性化を刺激した。４８時間、１１６時間及び１７２時間の時点で、それぞれ３０，０００個のＲＡＪＩ－ＧＦＰ又はＮａｌｍ６－ＧＦＰでＴ細胞を再チャレンジした。インビトロ細胞傷害性は、２５２時間（Ｎａｌｍ６－ＧＦＰについて）又は１８８時間（ＲＡＪＩ－ＧＦＰについて）にわたってＩｎｃｕｃｙｔｅによりリアルタイムで測定した。

【0192】

実施例９：Ｔ２９Ｄ又はＳ５５Ｄ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現するＴ細胞はインビトロＴ細胞活性化の向上を呈する
この例は、ＣＤ１９刺激によって濃縮されたＣＤ１９ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現するＴ細胞が親のＶＨ０３４結合体と比較して高度なインビトロＴ細胞活性化を呈することを示す。

【0193】

図６は、親ＶＨ－０３４結合体と比較したＴ２９Ｄ ＶＨ結合体又はＳ５５Ｄ ＶＨ結合体の何れかを含むＣＡＲを発現するＴ細胞におけるインビトロＴ細胞活性化の向上を要約する表である。親ＶＨ－０３４結合体、Ｔ２９Ｄ ＶＨ結合体又はＳ５５Ｄ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現する約０．２×１０ｅ６個のＴ細胞を０．１×１０ｅ６個のＮａｌｍ６又はＲＡＪＩ細胞を加えることによって活性化し、これらの培養物を、１０％ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ １６４０培地において３７℃で１６時間インキュベートした。次にＴ細胞をＦＡＣＳ分析により分析して、Ｔ細胞活性化のマーカーであるＣＤ２５発現を定量化した。図６に図示する表中に、各ＶＨ結合体について活性化Ｔ細胞のＣＤ２５の幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）を示す。

【0194】

図６に図示する表から明らかなとおり、Ｔ２９Ｄ及びＳ５５Ｄ ＣＤ１９ ＶＨ結合体は、親ＣＤ１９ ＶＨ－０３４結合体と比較してＴ細胞活性化の向上を呈し、これらの置換によってＣＤ１９発現細胞によるＴ細胞活性化が向上することを実証した。

【0195】

実施例１０：Ｔ２９Ｄ ＶＨ結合体又はＳ５５Ｄ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現するＴ細胞はインビボでＣＡＲをより高度に発現する
この例は、ＣＡＲフォーマットの濃縮されたＣＤ１９ ＶＨ結合体が親ＶＨ－０３４結合体と比較してＴ細胞でＣＡＲをより高度に発現することを示す。

【0196】

図７は、ＣＡＲフォーマットの濃縮されたＣＤ１９ ＶＨ結合体が親ＶＨ－０３４結合体と比較してＴ細胞でＣＡＲをより高度に発現することを示す表である。親ＶＨ－０３４結合体、Ｔ２９Ｄ ＶＨ結合体又はＳ５５Ｄ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現する約１０×１０ｅ６個のＴ細胞をマウス（ｎ＝５）に投与した。１４日後、処置した動物から血液試料を採取し、血液をＡＣＫ緩衝液によって溶解させて赤血球を除去した。次に循環Ｔ細胞をＦＡＣＳ分析によりＣＤ１９＋細胞でゲーティングして分析し、試料毎にＣＡＲ発現細胞の数を決定した。結果は、図７に図示する表に示す。

【0197】

図７に図示する表から明らかなとおり、平均ＣＤ１９ ＣＡＲ＋循環Ｔ細胞数は、親ＶＨ－０３４結合体と比較すると、Ｔ２９Ｄ及びＳ５５Ｄ ＶＨ結合体についてそれぞれ約３５％及び６５％多かった。

【0198】

実施例１１：Ｔ２９Ｄ ＶＨ結合体又はＳ５５Ｄ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現するＴ細胞はインビボＴ細胞増大の向上を実証する
この例は、Ｔ２９Ｄ ＶＨ結合体又はＳ５５Ｄ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現するＴ細胞が、親ＶＨ－０３４を含むＣＡＲを発現するＴ細胞と比較してインビボでのＴ細胞増大の向上を呈することを示す。

【0199】

図８は、Ｔ２９Ｄ ＶＨ結合体又はＳ５５Ｄ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現するＴ細胞がインビボでのＴ細胞増大の向上を呈することを示す表である。ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／Ｓｚｊ（ｎ＝５／群）に、野生型ＶＨ－０３４結合体、Ｔ２９Ｄ ＶＨ結合体又はＳ５５Ｄ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現する１０×１０ｅ６個のＴ細胞を投与した。３、７及び１４日目に、処置したマウスから血液試料を採取し、血液１マイクロリットル当たりの循環Ｔ細胞数を決定した。結果は、図８に図示する表に示す。

【0200】

図８に図示する表から明らかなとおり、Ｔ細胞増大の動態及び大きさは、親ＶＨ－０３４結合体又は２つの突然変異体ＶＨ結合体の何れかを発現するＴ細胞間で異なる。例えば、Ｓ５５Ｄ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現するＴ細胞は、Ｔ２９Ｄ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現するＴ細胞と比べると、Ｓ５５Ｄ Ｔ細胞の増大ピークが３日であるのに対し、Ｔ２９Ｄ Ｔ細胞の増大ピークが１４日である点で異なる動態を呈する。その上、これらの２つの突然変異体ＶＨ結合体は、各々が、親ＶＨ－０３４ Ｔ細胞と比較したとき動態の向上を実証した。

【0201】

実施例１２：Ｔ２９Ｄ ＶＨ結合体又はＳ５５Ｄ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現するＴ細胞はインビボＴ細胞枯渇の低下を実証する
この例は、ＣＤ１９結合に関して濃縮されたＣＤ１９ ＶＨ結合体の１つを含むＣＡＲを発現するＴ細胞が、親ＶＨ－０３４結合体と比較してインビボＴ細胞枯渇の低下を呈することを示す。

【0202】

親ＶＨ－０３４、Ｔ２９Ｄ ＶＨ結合体又はＳ５５Ｄ ＶＨ結合体を発現する約１０×１０ｅ６個のＴ細胞を成体ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／Ｓｚｊマウス（ｎ＝５／群）に投与した。２１日後、処置した動物から約１００μｌの血液試料を採取し、各試料からＡＣＫ溶解緩衝液によって赤血球を除去した。各試料のＴ細胞枯渇の程度をＦＡＣＳ分析により、Ｔ細胞枯渇の公知のマーカーであるＰＤ－１又はＴＩＧＩＴ－１を発現する細胞に関してゲーティングすることによって決定した。図９は、Ｔ２９Ｄ又はＳ５５Ｄ ＣＤ１９ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現するＴ細胞が親ＶＨ－０３４ ＣＤ１９結合体と比較して少ないＴ細胞枯渇を呈したことを示す表である。

【0203】

図９の表から明らかなとおり、Ｔ２９Ｄ又はＳ５５Ｄ ＣＤ１９ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現するＴ細胞は、２１日目に、ＰＤ－１又はＴＩＧＩＴを発現するＴ細胞の数の減少からも明らかなとおり、より少ないＴ細胞枯渇を呈し、親ＶＨ－０３４ ＣＤ１９結合体と比較して、より高い割合のこれらの細胞が非枯渇状態のままであることが実証された。

【0204】

実施例１３：Ｔ２９Ｄ ＶＨ結合体又はＳ５５Ｄ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現するＴ細胞はインビボ有効性の向上を呈する
この例は、Ｔ２９Ｄ ＶＨ結合体又はＳ５５Ｄ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現するＴ細胞が、親ＶＨ－０３４結合体を含むＣＡＲを発現するＴ細胞と比較してインビボ有効性の向上を呈することを示す。

【0205】

０日目、６～７週齢の成体雌ＮＧＳ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄｌｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／Ｓｚｉ）マウス（ｎ＝５／群）に、ルシフェラーゼを発現するように遺伝子操作した０．５×１０ｅ６個のＲＡＪＩ細胞を静脈内投与した。５日目、マウスに、親ＶＨ－０３４結合体、Ｔ２９Ｄ ＶＨ結合体又はＳ５５Ｄ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現する１０×１０ｅ６個のＴ細胞を投与した。５５日の期間にわたってマウスをモニタした。

【0206】

この試験の経過中、１週間間隔で麻酔下のマウスに全身生体発光イメージング（「ＢＬＩ」）を実施して腫瘍進行をモニタし、８、１２、１８、２５、３２、３９及び５５日目に、処置した動物から全血を採取した。５５日目、マウスを安楽死させ、続いてさらなる分析のため、その血液、脾臓及び大腿骨骨髄を採取した。

【0207】

図１０は、Ｔ２９Ｄ ＶＨ結合体又はＳ５５Ｄ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現するＴ細胞が腫瘍制御を呈したことを示す簡約データによるグラフである。図１１は、図１０に示されるのと同じ結果を図示する簡約していない個々のマウスモデルデータを示すグラフである。図示されるとおり、親ＶＨ－０３４を含むＣＡＲを発現するＴ細胞がこの試験の経過中に腫瘍成長の制御に及ぼす効果は、それほど大きくなかった。対照的に、Ｔ２９Ｄ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現するＴ細胞を投与したマウスは、５匹中５匹が５５日目まで腫瘍の完全な制御及び退縮を呈した。同様に、Ｓ５５Ｄ ＶＨ結合体を含むＣＡＲを発現するＴ細胞を投与した５匹中３匹が、少なくとも３０日目まで腫瘍の完全な制御及び退縮を呈した。これらの結果から、Ｔ２９Ｄ及びＳ５５Ｄ突然変異を含む濃縮されたＣＤ１９ ＶＨ結合体が、ＲＡＪＩモデルにおいて観察されるインビボ有効性の向上に寄与することが指摘される。

【0208】

本発明の好ましい実施形態を本明細書中に示し、記載してきたが、このような実施形態が単なる例として提供されることは、当業者にとって明らかであろう。ここで、当業者は、本発明から逸脱することなく、多くの様々な変化形態及び置換形態を認識するであろう。本明細書中に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替形態が本発明の実施において使用され得ることを理解すべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造並びにその均等物がそれにより包含されるものとする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

2024514107000001.app

【国際調査報告】