(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-28
(54)【発明の名称】抗ウイルス治療のためのＴＫＴＬ１阻害剤
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20240321BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240321BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20240321BHJP
A61K 31/05 20060101ALI20240321BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240321BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240321BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240321BHJP
A61K 31/661 20060101ALI20240321BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240321BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61P31/12
A61P31/14
A61K31/05
A61K31/7088
A61K31/7105
A61K48/00
A61K31/661
A61P43/00 111
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023563119
(86)(22)【出願日】2022-04-07
(85)【翻訳文提出日】2023-10-13
(86)【国際出願番号】 DE2022100262
(87)【国際公開番号】W WO2022218471
(87)【国際公開日】2022-10-20
(31)【優先権主張番号】102021109341.4
(32)【優先日】2021-04-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】DE
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522490136
【氏名又は名称】タヴァールジェニクス ゲー・エム・ベー・ハー
【氏名又は名称原語表記】ＴＡＶＡＲＧＥＮＩＸ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｇｒａｅｆｅｎｈａｅｕｓｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ ２６， ６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ
(74)【代理人】
【識別番号】100114890
【弁理士】
【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト
(74)【代理人】
【識別番号】100098501
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 拓
(74)【代理人】
【識別番号】100116403
【弁理士】
【氏名又は名称】前川 純一
(74)【代理人】
【識別番号】100134315
【弁理士】
【氏名又は名称】永島 秀郎
(74)【代理人】
【識別番号】100162880
【弁理士】
【氏名又は名称】上島 類
(72)【発明者】
【氏名】ヨハネス エフ． コイ
(72)【発明者】
【氏名】ラルフ シーアル
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZB33
4C084ZC20
4C086AA01
4C086AA02
4C086DA38
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB33
4C086ZC20
4C206AA01
4C206AA02
4C206CA20
4C206KA01
4C206MA01
4C206MA04
4C206NA14
4C206ZB33
4C206ZC20
(57)【要約】
トランスケトラーゼＴＫＴＬ１の少なくとも１つの阻害剤が、患者のウイルス感染症、特にＲＮＡウイルス感染症、特にまたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の処置に使用される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ウイルス感染症、特にＲＮＡウイルス感染症、特にまたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の処置に使用するためのトランスケトラーゼＴＫＴＬ１の阻害剤。
【請求項2】
ＴＫＴＬ１遺伝子の転写を特異的に制限または阻止することが可能であり、かつそれに適した物質または物質混合物であることを特徴とする、請求項１記載の阻害剤。
【請求項3】
細胞のＴＫＴＬ１プロモーターに結合し、それによってその活性を制限または阻止することが可能であり、かつそれに適した物質または物質混合物であることを特徴とする、請求項１または２記載の阻害剤。
【請求項4】
前記阻害剤がレスベラトロールであることを特徴とする、請求項３記載の阻害剤。
【請求項5】
前記阻害剤が、ＴＫＴＬ１－ｍＲＮＡの翻訳を特異的に阻害するのに適した物質または物質混合物であることを特徴とする、請求項１記載の阻害剤。
【請求項6】
前記阻害剤が、ＴＫＴＬ１－ｍＲＮＡにそれぞれ特異的なアンチセンス構築物、ｓｉＲＮＡ、リボザイムおよび他の阻害性ＲＮＡを含む群から選択されることを特徴とする、請求項５記載の阻害剤。
【請求項7】
前記阻害剤が、ＴＫＴＬ１および／またはＴＫＴＬ１－ＴＫＴヘテロ二量体複合体の酵素反応を制限または阻止するのに適した物質または物質混合物であることを特徴とする、請求項１記載の阻害剤。
【請求項8】
前記阻害剤が、抗チアミン化合物およびＴＫＴＬ１ポリペプチドの補因子の他のアンタゴニストを含む群から選択されることを特徴とする、請求項７記載の阻害剤。
【請求項9】
前記阻害剤が、阻害性チアミンアナログ、特にオキシチアミン、ベンフォオキシチアミンおよび／またはベンフォオキシチアミンアナログであり、ベンフォオキシチアミンの場合、これは患者の体重１ｋｇ当たりかつ１日当たり７μｇ～４３０μｇ、有利には１４μｇ～２１５μｇ、とりわけ好ましくは１４μｇ～１３０μｇのベンフォオキシチアミンの用量で使用されることを特徴とする、請求項７または８記載の阻害剤。
【請求項10】
前記阻害性チアミンアナログが有効成分ベンフォオキシチアミンであり、患者の体重１ｋｇ当たりかつ１日当たり７μｇ～４３０μｇ、有利には１４μｇ～２１５μｇ、とりわけ好ましくは１４μｇ～１３０μｇのベンフォオキシチアミンの用量で使用されることを特徴とする、請求項８または９記載の阻害剤。
【請求項11】
前記阻害剤が、ＴＫＴＬ１－ＴＫＴヘテロ二量体複合体の形成を制限または阻止することが可能であり、かつそれに適した物質または物質混合物であることを特徴とする、請求項１記載の阻害剤。
【請求項12】
ＴＫＴＬ１阻害剤としてのベンフォオキシチアミンの場合、前記ベンフォオキシチアミンが、患者の体重１ｋｇ当たりかつ１日当たり７μｇ～４３０μｇ、有利には１４μｇ～２１５μｇ、とりわけ好ましくは１４μｇ～１３０μｇのベンフォオキシチアミンの用量で使用される、請求項１から１１までのいずれか１項記載の阻害剤。
【請求項13】
患者の体重１ｋｇ当たりかつ１日当たりの前記用量が、ベンフォオキシチアミン１４μｇ～２１５μｇ、有利にはベンフォオキシチアミン１４μｇ～１３０μｇであることを特徴とする、請求項１２記載の阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗ウイルス治療、特にＲＮＡウイルス、特にまたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症およびＣｏｖｉｄ－１９疾患の治療に使用するためのトランスケトラーゼＴＫＴＬ１の阻害剤（以下、略して「ＴＫＴＬ１阻害剤」）に関する。
【0002】
２０１９年、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２という名前の新たなコロナウイルスが中国で報告され、人々に感染し、急速に広がっている。感染者の一部はＣＯＶＩＤ－１９と呼ばれる疾患を発症し、肺に損傷が起こり、これは酸素欠乏および呼吸困難も引き起こす。２０２０年３月、ＷＨＯはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の流行をパンデミックと宣言した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの感染は、インフルエンザウイルスの感染とは異なり、無症候（無症候性）で進行する可能性もあるため、一見健康な人が他の人にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを感染させる可能性がある。このことはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の封じ込めを非常に困難にしている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２にかかった人の中には、無症候性の感染経過の他に、咳、咽頭痛、下痢または発熱などのインフルエンザに似た症候を示す人も多い。また、インフルエンザとは異なり、味覚の喪失などの症候および神経細胞の機能に関連した他の症候または欠損も見られる。例えば認知機能障害、疲労、慢性疲労症候群などのそのような神経学的関連症候は、急性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が消失した後も長期にわたって発現し、感染者の健康上の大きな問題となっている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者のサブグループは、肺炎、時には両側肺炎も発症する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染により、多臓器不全が生じて致命的な結果を伴うこともある。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のそのような重篤な経過では、過剰反応、すなわち免疫系の強すぎる応答が起こることが多く、例えば免疫細胞が肺に移動してその機能を阻害する。例えばデキサメタゾンなどの免疫系の活性を阻害する医薬品は、この病気の経過に良い効果を示す。とはいえ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の重篤な経過をたどる患者の高い割合が死亡する。今のところ、Ｃｏｖｉｄ－１９疾患の重篤な経過の予防または治療に使用することができる十分有効な治療はない。
【0003】
他の多くのウイルス性疾患の場合においても、患者のウイルス感染と闘うために十分効果のある有効成分はまだない。例えば、ウイルスによって引き起こされるデング熱または失明につながる重度の目のヘルペス感染に対する適切な治療法はまだない。
【0004】
当該技術分野で知られているウイルス性疾患の治療制御戦略のほとんどは、ウイルス自体を無害化することを目的としており、例えば、ワクチンによる予防治療または抗ウイルス有効成分の投与による緩和および治癒療法である。これらの戦略に共通しているのは、ウイルス特異的な構造（エピトープ／酵素）を攻撃することである。しかしながら、ウイルスには非常に短時間でゲノムを変化させる能力があるため、ウイルスは、新しい環境条件に非常に迅速に適応することができる。このことは、現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの新しいバリアントによって明確にされており、これらは、より良好に拡散することができたり、身体自身の免疫システムからより良好に防御することができたり、ワクチン接種からより良好に防御することができたり、さらには感染症の致死率を高める結果となることさえある。そのため、ウイルス特異的な構造に基づく治療戦略は、すぐに失敗に終わる可能性がある。なぜなら、天然に存在する数多くのウイルス突然変異体の中には、かかる有効成分またはワクチンに対して反応しないものも発生しているからである。また、どのウイルス突然変異またはどのウイルスが次に新たに出現し、将来人々に脅威をもたらすかを予測することは基本的に不可能である。したがって、ウイルス特異的な治療戦略をタイムリーに開発および計画することは非常に困難であり、ほぼ不可能ですらある。
【0005】
ウイルスのゲノムはＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかで構成される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスはＲＮＡウイルスに属する。
【0006】
ＲＮＡウイルスは、細胞内に感染してウイルスＲＮＡを放出した後、このウイルスＲＮＡの複製（増幅）に基づいて迅速かつ可能な限り大量に発生することになる。この複製には、宿主細胞からのリボース－５－リン酸（Ｒ５Ｐ）が絶対に必要である。
【0007】
ＤＮＡウイルスも宿主細胞内での増殖にＲ５Ｐを必要とする。というのも、ＤＮＡの必須構成要素であるデオキシリボース－５－リン酸はリボース－５－リン酸から作られるからである。このように、ＲＮＡウイルスとＤＮＡウイルスのいずれも宿主細胞のＲ５Ｐ合成に依存している。
【0008】
哺乳動物細胞では、Ｒ５Ｐはペントースリン酸代謝経路（ＰＰＰ）を介して提供される。一般的な学説によれば、これはＰＰＰの酸化部分と非酸化部分との両方を介して行われ得る。
【0009】
トランスケトラーゼ（ＴＫＴ）はＰＰＰの重要な酵素である。それらは二量体を形成し、チアミン二リン酸分子と二価カチオンとの結合によって活性化される。このトランスケトラーゼ酵素活性は、ＴＫＴとトランスケトラーゼ様－１（ＴＫＴＬ１）タンパク質とからのヘテロ二量体の形成によって変化する可能性がある（Li et al., 2019）。
【0010】
Li et al. (2019)は、ＴＫＴＬ１－ＴＫＴヘテロ二量体の形成により、細胞がＲ５Ｐ代謝を再プログラムできることを記載している。より多くのＲ５Ｐが必要な場合、これは主に細胞のＳ期におけるヌクレオチド合成およびＤＮＡ合成の場合に該当するが、ＴＫＴＬ１レベルの上昇は、ＴＫＴＬ１－ＴＫＴヘテロ二量体の形成を増加させる。これらはＲ５Ｐ産生を促進する。換言すれば、簡略化すると、Li et al.は、細胞のＲ５Ｐ基本供給がＴＫＴ－ＴＫＴホモ二量体を介して提供されることを示している。細胞がさらに大量のＲ５Ｐを必要とする場合、ＴＫＴＬ１の発現とその結果生じるＴＫＴ－ＴＫＴＬ１ヘテロ二量体の形成とを介して、細胞分裂ひいては細胞増殖を可能にするためにＲ５Ｐの形成増加を促進するいわば「細胞内ターボプログラム」が開始される。
【0011】
ヒト細胞株Ｃａｃｏ－２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞を用いたBojkova et al. (2020)の調査により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞では細胞のＰＰＰが活性化されることが示された。
【0012】
Bojkova et al. (2020)は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製がＴＫＴ阻害剤によって影響を及ぼされ得るかどうかも調べた。ＴＫＴ阻害剤オキシチアミンのプロドラッグであるＴＫＴ阻害剤ベンフォキシチアミン（Benfooxythiamin）（Ｂ－ＯＴ）（チアミンの阻害性アナログである）の使用により、宿主細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの複製が阻害された。しかしながら、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの増殖を阻害するには、Ｂ－ＯＴは、少なくとも５ｍＭのＢ－ＯＴ濃度で必要であった。ヒトに置き換えると、これは体重１ｋｇ当たり少なくとも１ｇのＢ－ＯＴのＢ－ＯＴ投与量に相当し、すなわち体重７０ｋｇのヒトの場合、７０ｇのＢ－ＯＴを投与することになる。この値は、通常または例外的にのみ使用される有効成分の量からも外れており、Ｂ－ＯＴに移行できる、先行技術でヒトに対して知られているオキシチアミンの耐容量をはるかに超えている。したがって、当業者は、Ｂ－ＯＴおよびＴＫＴ阻害剤それ自体は、ウイルス阻害の有効成分に照らして使用可能な選択肢ではないと想定している。
【0013】
本発明は、ウイルス感染症、特にＲＮＡウイルス感染症と闘うための、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと闘うのにも適した薬剤を提供するという課題に基づいている。
【0014】
この課題の解決策は、ウイルス感染症の医学的治療処置（抗ウイルス治療）、特にＲＮＡウイルス感染症の処置（治療）、特にまたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症および例えばＣＯＶＩＤ－１９などの関連疾患の処置（治療）に使用するためのトランスケトラーゼＴＫＴＬ１の少なくとも１つの阻害剤（以下、略して「ＴＫＴＬ１阻害剤」）を提供することにある。
【0015】
換言すれば、この課題の解決策は、抗ウイルス効果、特に静ウイルス性（ウイルス阻害性）効果を有する薬剤の有効成分としての、トランスケトラーゼＴＫＴＬ１の少なくとも１つの阻害剤（略して「ＴＫＴＬ１阻害剤」）の使用の技術的教示にある。
【0016】
用語の定義：
－ 「阻害剤」という用語は、本明細書において、個体または個体の細胞におけるＴＫＴＬ１ポリペプチドの活性の低下を直接的または間接的にもたらす（引き起こす）のに適した薬剤（すなわち、原則として任意の薬剤）、特に（任意の）材料物質、すなわち、医薬組成物を含む物質または物質混合物の文脈で使用される。これらの薬剤または材料物質には、特に次のものが含まれる：
（ａ）ＴＫＴＬ１遺伝子の転写の阻害剤、例えば、ＴＫＴＬ１プロモーターに結合し、それによってその活性を制限または阻止する物質、例えば、用量依存的にＴＫＴＬ１プロモーターを阻害するレスベラトロールなど。
（ｂ）ＴＫＴＬ１－ｍＲＮＡの翻訳の阻害剤、例えば、アンチセンス構築物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈ－ＲＮＡ、リボザイムなどの阻害性ＲＮＡ。
（ｃ）ＴＫＴＬ１および／またはＴＫＴＬ１－ＴＫＴヘテロ二量体複合体の酵素反応の阻害剤、特にこの酵素反応を制限または阻止する有効成分。これらには、特に、例えば抗チアミン化合物などのＴＫＴＬ１ポリペプチドの補因子のアンタゴニストが含まれる。
（ｄ）ＴＫＴＬ１－ＴＫＴヘテロ二量体複合体の形成の阻害剤、特にヘテロ二量体の形成を制限または阻止する有効成分。
－ 「ＲＮＡ」という用語は、本明細書において、リボ核酸と同義である。
－ 「ＤＮＡ」という用語は、本明細書において、デオキシリボ核酸と同義である。
－ 「阻害剤」という用語は、本明細書において、個体または個体の細胞におけるＴＫＴＬ１ポリペプチドの活性の低下を直接的または間接的にもたらす（引き起こす）のに適した薬剤（すなわち、原則として任意の薬剤）、特に（任意の）材料物質、すなわち、医薬組成物を含む物質または物質混合物の文脈で使用される。これらの薬剤または材料物質には、特に次のものが含まれる：
（ａ）ＴＫＴＬ１遺伝子の転写の阻害剤、例えば、ＴＫＴＬ１プロモーターに結合し、それによってその活性を制限または阻止する物質、例えば、用量依存的にＴＫＴＬ１プロモーターを阻害するレスベラトロールなど。
（ｂ）ＴＫＴＬ１－ｍＲＮＡの翻訳の阻害剤、例えば、アンチセンス構築物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈ－ＲＮＡ、リボザイムなどの阻害性ＲＮＡ。
（ｃ）ＴＫＴＬ１および／またはＴＫＴＬ１－ＴＫＴヘテロ二量体複合体の酵素反応の阻害剤、特にこの酵素反応を制限または阻止する有効成分。これらには、特に、例えば抗チアミン化合物などのＴＫＴＬ１ポリペプチドの補因子のアンタゴニストが含まれる。
（ｄ）ＴＫＴＬ１－ＴＫＴヘテロ二量体複合体の形成の阻害剤、特にヘテロ二量体の形成を制限または阻止する有効成分。
－ 「ＲＮＡ」という用語は、本明細書において、リボ核酸と同義である。
－ 「ＤＮＡ」という用語は、本明細書において、デオキシリボ核酸と同義である。
【0017】
本発明は、ヒト細胞における酵素ＴＫＴＬ１の阻害ひいてはＴＫＴＬ１／ＴＫＴヘテロ二量体の酵素活性の阻害が、ウイルスＲＮＡまたはウイルスＤＮＡの増殖（複製）を有意に阻害するが、宿主細胞自体は生存可能なままであり、ヒトの身体は永久的かつ不可逆的な損傷を被らないという驚くべき認識に基づいている。
【0018】
細胞の分裂ひいては増殖はヒトの身体にとって不可欠であるため、ＴＫＴＬ１および／またはＴＫＴＬ１／ＴＫＴヘテロ二量体を、Bojkova et al. (2020)によればウイルス増殖を減速または阻止するのに必要な程度に阻害すると、細胞分裂の阻害ひいては死に至るまでの重篤な副作用がもたらされることが予想されていた。また、トランスケトラーゼ、特にＴＫＴＬ１は、細胞周期および細胞分裂の制御における重要な酵素として、細胞の生存に基本的に関係しているとまさに考えられているため、一般的な学説によれば、重篤な副作用が予想されるため、それらは抗ウイルス治療戦略の可能な標的としては不適切であると思われていた。
【0019】
しかしながら、驚くべきことに、ウイルス感染ヒト宿主細胞におけるＴＫＴＬ１／ＴＫＴヘテロ二量体の酵素活性の阻害により、ウイルス核酸の生合成ひいてはウイルス核酸（ＲＮＡもしくはＤＮＡ）の増殖に必要なリボース－５－リン酸（Ｒ５Ｐ）産生の大量の（強力な）増加が宿主細胞の代謝を介して阻止されるかまたは有利に阻害されるが、他方で宿主細胞の生存に必要なＲ５Ｐの量は維持されることが見出された。
【0020】
換言すれば、ウイルス感染症、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の処置におけるＴＫＴＬ１阻害剤の使用は、宿主細胞の生存を危険にさらすことなく、ひいては人体への損傷の危険もなく、ヒト宿主細胞におけるウイルス核酸の生合成ひいてはウイルス増殖（ウイルス複製）をＴＫＴＬ１阻害剤によって有意に阻害または減少させることができるという驚くべき認識に基づいている。
【0021】
本発明によるＴＫＴＬ１阻害剤の使用は、宿主細胞ひいては人体全体の代謝を妨害し、ウイルス複製に利用可能な十分なリボース－５－リン酸構成要素（Ｒ５Ｐ）をもはや存在させなくし、したがって細胞および人体全体を不可逆的に損傷することなく、ウイルス増殖が減速されるかまたは完全に防止される。このことは、ウイルス自体が（直接）有効成分の標的ではなく、むしろ宿主細胞の代謝であり、したがっていかなるウイルス突然変異も本発明による適用の成功を損なわないという利点を伴う。
【0022】
本発明によるＴＫＴＬ１阻害剤の使用は、ウイルス特異的な構造ではなく、むしろ感染宿主細胞に由来し、ウイルスがその増殖に必要とする因子に対処する治療戦略である。したがって、第一に、広範なウイルスに対して有望に使用することができ、第二に、ウイルスの突然変異（ウイルス突然変異体）に対しても有効な抗ウイルス治療戦略が利用可能である。これはまた、将来出現するであろうウイルスに対する防御を可能にする。本発明は、ウイルスのＲＮＡ配列やＤＮＡ配列を知らなくてもウイルスに対する防御を可能にする。したがって、ワクチン接種と比較して、医薬品の開発にリードタイムを必要としないため、すぐに治療法が実現することになる。これにより、人類および哺乳類全般を、既存および将来のウイルスと、ウイルスに由来しかつ由来するであろう疾患から防御することが可能になる。ウイルス性疾患に対する現存在保護(Daseinsschutz)が初めて実現する。
【0023】
好ましい実施形態において、阻害剤は、ＴＫＴＬ１遺伝子の転写を特異的に制限もしくは阻止することが可能であり、かつそれに適した物質または物質混合物である。これに関して、特に、細胞のＴＫＴＬ１プロモーターに結合することができ、それによってその活性を制限または阻止することが可能であり、かつそれに適した物質が考慮される。実際には、特にレスベラトロールがＴＫＴＬ１プロモーターの適切な阻害剤であることが証明されている（Kumar B, 2018）。
【0024】
同様に好ましい実施形態において、阻害剤は、ＴＫＴＬ１－ｍＲＮＡの翻訳を特異的に阻害するのに適した物質または物質混合物である。これに関して、特に、ＴＫＴＬ１－ｍＲＮＡ特異的アンチセンス構築物、ＴＫＴＬ１－ｍＲＮＡ特異的ｓｉＲＮＡ、ＴＫＴＬ１－ｍＲＮＡ特異的ｓｈ－ＲＮＡ、ＴＫＴＬ１－ｍＲＮＡ特異的リボザイムおよび他のＴＫＴＬ１－ｍＲＮＡ特異的阻害ＲＮＡの群から選択される少なくとも１つの物質が考慮される。
【0025】
更なる好ましい実施形態において、阻害剤は、ＴＫＴＬ１および／またはＴＫＴＬ１－ＴＫＴヘテロ二量体複合体の酵素反応を制限または阻止するのに適した物質または物質混合物である。これに関して、特に、抗チアミン化合物および他のアンタゴニスト、特に酵素ＴＫＴＬ１の補因子の群からのアンタゴニストの群から選択される少なくとも１つの物質が考慮される。
【0026】
実際に試験された一実施形態において、ＴＫＴＬ１阻害剤は、阻害性チアミン類似体である。ＴＫＴＬ１を含むこれまでに知られている全てのトランスケトラーゼ酵素は、補酵素としてチアミン（ビタミンＢ１）に機能的に依存している。例えばオキシチアミンなどのチアミン類似体は、チアミンアンタゴニストとして作用し、トランスケトラーゼを阻害するために使用することができる（欧州特許出願公開第１３５４９６１号明細書を参照されたい）。
【0027】
好ましい阻害性チアミン類似体は、ベンフォオキシチアミン（Ｂ－ＯＴ）の物質である。
【0028】
Ｂ－ＯＴは、オキシチアミンの前駆体（「プロファルマコン」、「プロドラッグ」）であり、経口投与が可能であり、哺乳類生物に吸収された直後にオキシチアミンを放出する。Ｂ－ＯＴは血流を介して身体のあらゆる部分のあらゆる細胞に到達することができる。インビボ薬物動態データは、オキシチアミンが血液脳関門を通過でき、その結果、脳のウイルス感染症にも成功裏に使用できることを示している。
【0029】
ベンフォオキシチアミンの化学構造（構造式）は、例えば欧州特許出願公開第１３５４９６１号明細書から知られている。
【0030】
驚くべきことに、ヒトの身体におけるＴＫＴＬ１／ＴＫＴヘテロ二量体のＴＫＴＬ１の酵素活性を阻害するためには、Bojkova et al. (2020)がヒトＣａｃｏ－２細胞株に対して細胞培養レベルで記載した最低濃度よりも１０００倍を超えて低いＢ－ＯＴ濃度で十分であることが判明した。その調査において、Bojkova et al. (2020)は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染Ｃａｃｏ－２細胞株においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの増殖を阻害するには、少なくとも５ｍＭの濃度のＢ－ＯＴが必要であることを示している。しかしながら、当業者には予想外かつ驚くべきことに、本発明の基礎となる調査の過程で、１日当たりかつ患者の体重７０ｋｇ当たり３５ｍｇ未満のＢ－ＯＴ、すなわち１日当たり体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇ未満、それに応じて体重１ｋｇ当たりかつ１日当たり１ナノモル（１ｎＭ）未満の濃度のＢ－ＯＴを投与すれば、人体でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの増殖を阻害するのに十分であることが示された。
【0031】
したがって、本発明によれば、ＴＫＴＬ１阻害剤としてのベンフォオキシチアミンの場合、Ｂ－ＯＴは、患者の体重１ｋｇ当たりかつ１日当たり７μｇ～４３０μｇ（μｇ＝マイクログラム）、有利には１４μｇ～２１５μｇ、とりわけ好ましくは１４μｇ～１３０μｇのＢ－ＯＴの用量／投与量で適用／投与される。換言すれば、ＴＫＴＬ１阻害剤ベンフォオキシチアミンの患者の体重１ｋｇ当たりかつ１日当たりの用量／投与量は、７μｇ≦μｇ Ｂ－ＯＴ≦４３０μｇ、有利には１４μｇ≦μｇ Ｂ－ＯＴ≦２１５μｇであり、とりわけ好ましくは１４μｇ≦μｇ Ｂ－ＯＴ≦１３０μｇである。
【0032】
一般に、本発明によれば、ＴＫＴＬ１阻害剤としてのベンフォオキシチアミンの場合、ベンフォオキシチアミンは、患者の体重１ｋｇ当たりかつ１日当たり０．５ｍｇ未満、有利には０．３ｍｇ未満の用量で使用される。
【0033】
ヒトおよび動物用薬剤のＥＵ ＧＭＰガイドラインに従ったベンフォオキシチアミン（Ｂ－ＯＴ）の製造は従来技術で確立されており、哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ）、特にヒトでのベンフォオキシチアミンの使用が可能である。
【0034】
更なる好ましい実施形態において、ＴＫＴＬ１阻害剤は、ＴＫＴＬ１－ＴＫＴヘテロ二量体複合体の形成（生成）を制限または阻止するのに適した物質または物質混合物である。
【0035】
以下、本発明を、表および図を用いた実施形態例によりさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】ＴＫＴＬ１特異的ｓｉＲＮＡを用いたＴＫＴＬ１翻訳の阻害後のＳＡＲＳ Ｃｏｖ－２ウイルス量の減少およびＣａｃｏ－２細胞の生存率を示す図である。
【図2】ＴＫＴ特異的ｓｉＲＮＡを用いたＴＫＴ翻訳の阻害後のＳＡＲＳ Ｃｏｖ－２ウイルス量の減少およびＣａｃｏ－２細胞の生存率を示す図である。
【図3】ＴＫＴＬ１特異的ｓｉＲＮＡを用いたＴＫＴＬ１翻訳の阻害後のヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ウイルス量の減少およびＣａｃｏ－２細胞の生存率を示す図である。
【図4】ＴＫＴ特異的ｓｉＲＮＡを用いたＴＫＴ翻訳の阻害後のヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ウイルス量の減少およびＣａｃｏ－２細胞の生存率を示す図である。
【図5】異なる投与量のレスベラトロールを用いたＴＫＴＬ１プロモーターの阻害後のＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルス量の用量依存的減少およびＣａｃｏ－２細胞の生存率を示す図である。
【0037】
ウイルス量の減少は、それぞれの場合において、表記されたパーセント値の減少として示されている。
【0038】
実施例１：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染哺乳動物細胞における（ａ）ＴＫＴＬ１のｓｉＲＮＡ阻害と（ｂ）ＴＫＴのｓｉＲＮＡ阻害との比較
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染Ｃａｃｏ－２細胞を、ポリカチオン性脂質と中性脂質とからなるトランスフェクション試薬（ここでは、ミュンヘン在のBiontex Laboratories GmbHのＭＥＴＡＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標））を用いて、（ａ）ヒトＴＫＴＬ１特異的ｓｉＲＮＡおよび（ｂ）ヒトＴＫＴ特異的ｓｉＲＮＡ、ならびに（ｃ）ｓｉＲＮＡネガティブコントロール（ここでは、QiagenのＡｌｌＳｔａｒｓネガティブコントロールｓｉＲＮＡ、メーカーの情報によれば、既知の哺乳類遺伝子と相同性を有しない）でトランスフェクトした（ｓｉＲＮＡまたは低分子干渉ＲＮＡは、タンパク質をコードせず、相補的な一本鎖ＲＮＡ分子と結合し、それによってその正常な機能を妨げる短いＲＮＡ分子である）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染Ｃａｃｏ－２細胞を、ポリカチオン性脂質と中性脂質とからなるトランスフェクション試薬（ここでは、ミュンヘン在のBiontex Laboratories GmbHのＭＥＴＡＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標））を用いて、（ａ）ヒトＴＫＴＬ１特異的ｓｉＲＮＡおよび（ｂ）ヒトＴＫＴ特異的ｓｉＲＮＡ、ならびに（ｃ）ｓｉＲＮＡネガティブコントロール（ここでは、QiagenのＡｌｌＳｔａｒｓネガティブコントロールｓｉＲＮＡ、メーカーの情報によれば、既知の哺乳類遺伝子と相同性を有しない）でトランスフェクトした（ｓｉＲＮＡまたは低分子干渉ＲＮＡは、タンパク質をコードせず、相補的な一本鎖ＲＮＡ分子と結合し、それによってその正常な機能を妨げる短いＲＮＡ分子である）。
【0039】
以下のｓｉＲＮＡ配列を用いた：
（ａ）ＴＫＴＬ１特異的：
１． ５’－ＧＧＡＧＵＵＧＣＡＵＧＵＧＧＡＡＵＧＧ－３’（Diaz-Morelli et al. 2016）
２． ５’－ＵＵＡＵＵＣＡＣＧＡＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＵ－３’（Heller et al. 2018）
３． ５’－ＵＡＡＡＵＡＡＣＣＡＵＡＧＵＵＵＣＵＧＧＵ－３’（Heller et al. 2018）
（ｂ）ＴＫＴ特異的：５’－ＡＡＵＧＡＵＧＧＣＵＧＵＵＧＧＣＵＧＧＴＴ－３’（Lu et al. 2017）。
（ａ）ＴＫＴＬ１特異的：
１． ５’－ＧＧＡＧＵＵＧＣＡＵＧＵＧＧＡＡＵＧＧ－３’（Diaz-Morelli et al. 2016）
２． ５’－ＵＵＡＵＵＣＡＣＧＡＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＵ－３’（Heller et al. 2018）
３． ５’－ＵＡＡＡＵＡＡＣＣＡＵＡＧＵＵＵＣＵＧＧＵ－３’（Heller et al. 2018）
（ｂ）ＴＫＴ特異的：５’－ＡＡＵＧＡＵＧＧＣＵＧＵＵＧＧＣＵＧＧＴＴ－３’（Lu et al. 2017）。
【0040】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＣａｃｏ－２細胞における（ａ）ＴＫＴＬ１および（ｂ）ＴＫＴの効果的なサイレンシング（すなわち、遺伝子サイレンシング、ＲＮＡ干渉による遺伝子発現ノックダウン）を、ＲＴｑＰＣＲ（逆転写酵素定量ＰＣＲ）およびウェスタンブロット分析を用いて実証した。ＴＫＴＬ１／ＴＫＴ－ｍＲＮＡおよびＴＫＴＬ１／ＴＫＴ－タンパク質の測定および定量化のために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＣａｃｏ－２細胞において、トランスフェクションの７２時間後および９６時間後にＲＴｑＰＣＲ（逆転写酵素定量ＰＣＲ）およびウェスタンブロット分析を行った。
【0041】
Ｃａｃｏ－２細胞を異なるｓｉＲＮＡでトランスフェクトした後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの複製能力は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質の免疫染色により決定した。スパイクタンパク質染色を用いて、（ｃ）ｓｉＲＮＡネガティブコントロールでトランスフェクトした細胞と比較して、（ａ）ＴＫＴＬ１または（ｂ）ＴＫＴ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞におけるウイルス阻害のパーセント割合を算出した。
【0042】
異なるｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染Ｃａｃｏ－２細胞の細胞生存率を、メチルチアゾリルジフェニル－テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイにより集計した。
【0043】
【0044】
異なるｓｉＲＮＡ配列に応じて、ＡｌｌＳｔａｒｓネガティブコントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＣａｃｏ－２細胞と比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染Ｃａｃｏ－２細胞のウイルス量の減少および生存率に関して以下の効果が確認された。
【0045】
ＴＫＴＬ１特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞では（非標的コントロール二重鎖でトランスフェクトした細胞と比較して）、ＴＫＴＬ１翻訳の阻害が起こった。ここで、細胞がさらに生存可能なままのレベルでＴＫＴＬ１翻訳を阻害すると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの複製能力が有意に低下した。
【0046】
したがって、これらの実験は、細胞の生存率に影響を与えない程度にＴＫＴＬ１を阻害することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの増殖を大幅に阻害できることを示している。
【0047】
ＴＫＴ－ｍＲＮＡ翻訳の阻害剤としてＴＫＴ特異的ｓｉＲＮＡを用いた並行アプローチにより、ＴＫＴ翻訳の阻害がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染Ｃａｃｏ－２細胞におけるウイルス量の大幅な減少にもつながることが示された。しかしながら、細胞の生存率も著しく低下する。このことは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス増殖を阻害するＴＫＴ阻害のヒト治療域が、ヒト細胞の損傷と大きく重なっており、事実上存在しないことを示している。換言すれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス増殖を阻害させるのに必要なＴＫＴの阻害の程度は、ヒト細胞が死滅するほど深刻な損傷を受けるほど大きい。トランスケトラーゼＴＫＴの阻害剤がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス増殖の阻害をもたらす用量で投与された場合、人体への損傷は非常に深刻なものとなるため、人体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス増殖を阻害する目的でＴＫＴ阻害を治療に使用することは除外されなければならない。
【0048】
結論：この結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染Ｃａｃｏ－２細胞にＴＫＴＬ１の阻害剤としてＴＫＴＬ１特異的ｓｉＲＮＡを適用すると、宿主細胞内でのウイルス増殖が阻止され、宿主細胞はその過程で生存することを示している。
【0049】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＭＣＶ）を用いたインビトロでの並行調査（ここでの実施例２を参照されたい）により、ＴＫＴＬ１のｓｉＲＮＡ阻害の手段が、宿主細胞の生存を危険にさらすことなく、宿主細胞内でのウイルス増殖を阻止できることが確認される。
【0050】
実施例２：ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）感染哺乳動物細胞における（ａ）ＴＫＴＬ１のｓｉＲＮＡ阻害と（ｂ）ＴＫＴのｓｉＲＮＡ阻害との比較
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）に感染させたＣａｃｏ－２細胞を用いて、一方ではＴＫＴＬ１、他方ではＴＫＴのｓｉＲＮＡ阻害の効果を調べた。Dal Pozzo et al. (2008)が記載しているように、Ｃａｃｏ－２細胞の感染には、増強黄色蛍光タンパク質ＥＹＦＰ（enhanced yellow fluorescent protein）をコードする組み換えＨＣＭＶ－ＥＹＦＰウイルスを用いた。これにより、蛍光ベースの抗ウイルスアッセイを用いてＨＣＭウイルスの複製能力を決定することができる（例えば、Dal Pozzo et al. (2008)）。
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）に感染させたＣａｃｏ－２細胞を用いて、一方ではＴＫＴＬ１、他方ではＴＫＴのｓｉＲＮＡ阻害の効果を調べた。Dal Pozzo et al. (2008)が記載しているように、Ｃａｃｏ－２細胞の感染には、増強黄色蛍光タンパク質ＥＹＦＰ（enhanced yellow fluorescent protein）をコードする組み換えＨＣＭＶ－ＥＹＦＰウイルスを用いた。これにより、蛍光ベースの抗ウイルスアッセイを用いてＨＣＭウイルスの複製能力を決定することができる（例えば、Dal Pozzo et al. (2008)）。
【0051】
Ｃａｃｏ－２細胞に、実施例１に示したＴＫＴＬ１およびＴＫＴのｓｉＲＮＡ配列をトランスフェクトした。効果的なサイレンシングは、ＲＴｑＰＣＲ（逆転写酵素定量ＰＣＲ）およびウェスタンブロット分析を用いて実証された。これらの分析は、トランスフェクションの７２時間後および９６時間後に行った。ＨＭＣＶ感染細胞の生存率をＭＭＴアッセイにより決定した。
【0052】
Ｃａｃｏ－２細胞を異なるｓｉＲＮＡでトランスフェクトした後のＨＣＭウイルスの複製能力は、蛍光ベースの抗ウイルスアッセイを用いて決定した（Dal Pozzo et al. (2008)）。組み換えウイルスのＥＹＦＰシグナルを用いて、（ｃ）ｓｉＲＮＡネガティブコントロールでトランスフェクトした細胞と比較して、（ａ）ＴＫＴＬ１または（ｂ）ＴＫＴ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞におけるウイルス阻害のパーセント割合を算出した。結果を図３および図４に示す。
【0053】
これらの結果により、ＨＭＣＶ感染細胞についても、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いた実施例１で得られた結果が確認される：阻害剤としてＴＫＴＬ１特異的ｓｉＲＮＡを用いてＴＫＴＬ１を阻害すると、宿主細胞内でのＨＭＣウイルスの増殖が阻止され、宿主細胞はその過程で生存する。対照的に、ＴＫＴ特異的ｓｉＲＮＡを用いたＴＫＴ阻害も、ＨＭＣＶ感染Ｃａｃｏ－２細胞におけるウイルス量の大幅な減少をもたらすが、細胞の生存率は著しく低下する。
【0054】
実施例３：ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）感染哺乳動物細胞におけるＴＫＴＬ１阻害剤としてのＢ－ＯＴの使用
さらに、ヒト哺乳動物細胞におけるＢ－ＯＴに対するＨＣＭＶ複製の感受性を調べた。このために、Dal Pozzo et al. (2008)の論文に記載されているように、Ｂ－ＯＴを用いた実験を行った：ヒト胚性肺線維芽細胞（ＨＥＬ）を、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）をさらにコードする組み換えＨＣＭＶ－ＥＹＦＰウイルスに感染させた（Dal Pozzo et al. (2008)）。ＨＣＭＶ－ＥＹＦＰ感染後のウイルス増殖の指標として、ＥＹＦＰタンパク質の発光を測定した（励起波長：４８５ｎｍ／発光：５３０ｎｍ）。ここで、自動的に測定された一定の低い細胞関連バックグラウンド発光を、蛍光発光値から差し引いた。Ｂ－ＯＴの抗ウイルス効果を調べるために、ＨＣＭＶ－ＥＹＦＰ感染細胞を異なるＢ－ＯＴ濃度（０～２０ｍＭのＢ－ＯＴ）で４８時間インキュベートした。（ウイルス増殖の指標として）蛍光の用量依存的阻害が明らかになった。未処理のコントロール（０ｍＭのＢ－ＯＴ）と比較してＥＹＦＰ発光を半減させるのに必要な物質濃度を、蛍光ベースの抗ウイルスアッセイにおける５０％阻害濃度（ＩＣ５０）と定義した。ここで出されたＩＣ５０は０．５ｍＭのＢ－ＯＴであった。
さらに、ヒト哺乳動物細胞におけるＢ－ＯＴに対するＨＣＭＶ複製の感受性を調べた。このために、Dal Pozzo et al. (2008)の論文に記載されているように、Ｂ－ＯＴを用いた実験を行った：ヒト胚性肺線維芽細胞（ＨＥＬ）を、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）をさらにコードする組み換えＨＣＭＶ－ＥＹＦＰウイルスに感染させた（Dal Pozzo et al. (2008)）。ＨＣＭＶ－ＥＹＦＰ感染後のウイルス増殖の指標として、ＥＹＦＰタンパク質の発光を測定した（励起波長：４８５ｎｍ／発光：５３０ｎｍ）。ここで、自動的に測定された一定の低い細胞関連バックグラウンド発光を、蛍光発光値から差し引いた。Ｂ－ＯＴの抗ウイルス効果を調べるために、ＨＣＭＶ－ＥＹＦＰ感染細胞を異なるＢ－ＯＴ濃度（０～２０ｍＭのＢ－ＯＴ）で４８時間インキュベートした。（ウイルス増殖の指標として）蛍光の用量依存的阻害が明らかになった。未処理のコントロール（０ｍＭのＢ－ＯＴ）と比較してＥＹＦＰ発光を半減させるのに必要な物質濃度を、蛍光ベースの抗ウイルスアッセイにおける５０％阻害濃度（ＩＣ５０）と定義した。ここで出されたＩＣ５０は０．５ｍＭのＢ－ＯＴであった。
【0055】
実施例４：人体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス増殖を阻害するためのＴＫＴＬ１阻害剤としてのＢ－ＯＴの使用
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染およびＣｏｖｉｄ－１９疾患を有する患者において、疾患の重症度の評価は、免疫炎症マーカーの臨床値によってなされ得ることが、Zhu et al 2020から知られている。炎症誘発性サイトカインＩＬ－６および／またはＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の高い値は、重篤な疾患および非常に高リスクの疾患経過を示す。炎症誘発性サイトカインＩＬ－６は、その多面発現特性により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者について説明される「サイトカインストーム」において重要な役割を果たしている。その構成的発現は、臓器損傷と激しい痛みとを引き起こす（Zhu et al 2020; Gupta et al. 2020）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染およびＣｏｖｉｄ－１９疾患を有する患者において、疾患の重症度の評価は、免疫炎症マーカーの臨床値によってなされ得ることが、Zhu et al 2020から知られている。炎症誘発性サイトカインＩＬ－６および／またはＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の高い値は、重篤な疾患および非常に高リスクの疾患経過を示す。炎症誘発性サイトカインＩＬ－６は、その多面発現特性により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者について説明される「サイトカインストーム」において重要な役割を果たしている。その構成的発現は、臓器損傷と激しい痛みとを引き起こす（Zhu et al 2020; Gupta et al. 2020）。
【0056】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症およびＣＯＶＩＤ－１９疾患の入院患者における個々の治癒試験の一環として、患者の体重７０ｋｇ当たり２０ｍｇ未満のＢ－ＯＴを１日１回投与した場合、すなわち体重１ｋｇ当たり０．３ｍｇ未満、それに応じて体重１ｋｇ当たり１ナノモル（１ｎＭ）未満の濃度のＢ－ＯＴを１日１回投与した場合、７日間の経過で、ＰＣＲ法で検出されたウイルス量の有意な減少だけでなく、炎症パラメータであるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）およびインターロイキン－６（ＩＬ－６）の大幅な減少も確認された：７日間のＢ－ＯＴ治療で、ＣＲＰ値は平均７７ｐｇ／ｍｌから５ｐｇ／ｍｌに低下し、ＩＬ－６レベルは平均６３ｐｇ／ｍｌから５ｐｇ／ｍｌに低下した。
【0057】
実施例５：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染Ｃａｃｏ－２細胞におけるウイルス増殖を阻害するためのＴＫＴＬ１阻害剤としてのレスベラトロールの使用
ポリフェノールの群の有機化合物レスベラトロール（分子式Ｃ１４Ｈ１２Ｏ３）は、ＴＫＴＬ１プロモーターの阻害剤として当業者に知られている。Kumar B. (2018)には、ＨｅＬａ細胞を５０μＭのレスベラトロールで４８時間処理すると、未処理の細胞と比較してＴＫＴＬ１プロモーター活性が７５％低下したことが記載されている。しかしながら、これはＨｅＬａ細胞の生存率の著しい低下も同時にもたらした。
ポリフェノールの群の有機化合物レスベラトロール（分子式Ｃ１４Ｈ１２Ｏ３）は、ＴＫＴＬ１プロモーターの阻害剤として当業者に知られている。Kumar B. (2018)には、ＨｅＬａ細胞を５０μＭのレスベラトロールで４８時間処理すると、未処理の細胞と比較してＴＫＴＬ１プロモーター活性が７５％低下したことが記載されている。しかしながら、これはＨｅＬａ細胞の生存率の著しい低下も同時にもたらした。
【0058】
この実施例５の枠組みにおける調査では、レスベラトロールを用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染Ｃａｃｏ－２細胞のウイルス複製を阻止した。このために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染Ｃａｃｏ－２細胞を異なるレスベラトロール濃度で２４時間処理した。ＴＫＴＬ１－ｍＲＮＡ産生に対するプロモーター活性低下の影響を確認するために、ＲＴｑＰＣＲを行った。このＲＴｑＰＣＲの結果は、使用したレスベラトロール濃度に依存して、ＴＫＴＬ１－ｍＲＮＡの減少を示す：濃度が高いほど、減少は大きくなる。さらに、本明細書の実施例１に記載したように、Ｃａｃｏ－２細胞の生存率をＭＴＴアッセイにより決定し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの複製能力をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質の免疫染色により決定した。レスベラトロールで処理を行わなかったＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染Ｃａｃｏ－２細胞をコントロールとして用いた。
【0059】
レスベラトロール処理下におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの複製能力は、コントロールと比較してレスベラトロールの投与量が増加するにつれて低下したが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染Ｃａｃｏ－２細胞の生存率は十分なレベルのままであることが明らかになった。したがって、２５μＭのレスベラトロールで４８時間処理すると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの複製能力はコントロールに比べて６８％減少したが、Ｃａｃｏ－２細胞の生存率は９３％であった。結果を図５にグラフで示す。
【0060】
引用された非特許文献：
Bojkova D, Costa R, Bechtel M, Ciesek S, Michaelis M, Cinatl jr. J (2020):
Targeting pentose phosphate pathway for SARS-CoV-2 therapy.
bioRxiv preprint https://doi.org/10.1101/2020.08.19.257022
Dal Pozzo F, Andrei G, Daelemans D, Winkler M, Piette J, De Clercq E, Snoeck R, (2008): Fluorescence-based antiviral assay for the evaluation of compounds against vaccinia virus, varicella zoster virus and human cytomegalovirus. Journal of Virological Methods 151 66-73.
doi: 10.1016/j.jviromet.2008.03.025
Diaz-Moralli S, Aguilar E, Marin S, Coy JF, Dewerchin M, Antoniewicz MR, Meca-Cortes O, Notebaert L, Ghesquiere B, Eelen G, Thomson TM, Carmeliet P, Cascante M. (2016):
A key role for transketolase-like 1 in tumor metabolic reprogramming.
Oncotarget 7(32):51875-51897; doi: 10.18632/oncotarget.10429; PMID: 27391434.
Gupta K. K., Khan M. A, Singh S. K (2020): Constitutive Inflammatory Cytokine Storm:
A Major Threat to Human Health.
Journal of Interferon & Cytokine Research. Jan 2020.19-23.
http://doi.org/10.1089/jir.2019.0085
Heller S, Maurer GD, Wanka C, Hofmann U, Luger AL, Bruns I, Steinbach JP, Rieger J. (2018): Gene Suppression of Transketolase-Like Protein 1 (TKTL1) Sensitizes Glioma Cells to hypoxia and Ionizing Radiation.
Int J Mol Sci. 2018 Jul 25;19(8):2168.
Kumar B (2018): Resveratrol inhibits expression of cancer-specific pentose phosphate pathway enzyme TKTL1. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research 11:332.
DOI: 10.22159/ajpcr.2018.v11i6.25021
Li Y, Yao CF, Xu FJ, Qu YY., Li JT, Lin Y, Cao ZL, Lin PC, Xu W, Zhao SM, & Zhao JY (2019): APC /CCDH1 synchronizes ribose-5-phosphate levels and DNA synthesis to cell cycle progression.
Nature Communications (2019) 10:2502; https://doi.org/10.1038/s41467-019-10375-x
Lu H, Zhu H. (2017): Effect of siRNA-mediated gene silencing of transketolase on A549 lung cancer cells. Oncol Lett. 2017; 14(5): 5906-5912. DOI: 10.3892/ol.2017.6916.
Zhu Z, Cai T, Fan L, Lou K, Hua X, Huang Z, Gao G. (2010): Clinical value of immune-inflammatory parameters to assess the severity of coronavirus disease 2019.
Int J Infect Dis. 2020 Jun; 95: 332-339. http://doi: 10.1016/j.ijid.2020.04.041
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Int J Infect Dis. 2020 Jun; 95: 332-339. http://doi: 10.1016/j.ijid.2020.04.041
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【手続補正書】
【提出日】2023-10-13
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ウイルス感染症、特にＲＮＡウイルス感染症、特にまたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の処置に使用するためのトランスケトラーゼＴＫＴＬ１の阻害剤。
【請求項2】
ＴＫＴＬ１遺伝子の転写を特異的に制限または阻止することが可能であり、かつそれに適した物質または物質混合物であることを特徴とする、請求項１記載の阻害剤。
【請求項3】
細胞のＴＫＴＬ１プロモーターに結合し、それによってその活性を制限または阻止することが可能であり、かつそれに適した物質または物質混合物であることを特徴とする、請求項１または２記載の阻害剤。
【請求項4】
前記阻害剤がレスベラトロールであることを特徴とする、請求項３記載の阻害剤。
【請求項5】
前記阻害剤が、ＴＫＴＬ１－ｍＲＮＡの翻訳を特異的に阻害するのに適した物質または物質混合物であることを特徴とする、請求項１記載の阻害剤。
【請求項6】
前記阻害剤が、ＴＫＴＬ１－ｍＲＮＡにそれぞれ特異的なアンチセンス構築物、ｓｉＲＮＡ、リボザイムおよび他の阻害性ＲＮＡを含む群から選択されることを特徴とする、請求項５記載の阻害剤。
【請求項7】
前記阻害剤が、ＴＫＴＬ１および／またはＴＫＴＬ１－ＴＫＴヘテロ二量体複合体の酵素反応を制限または阻止するのに適した物質または物質混合物であることを特徴とする、請求項１記載の阻害剤。
【請求項8】
前記阻害剤が、抗チアミン化合物およびＴＫＴＬ１ポリペプチドの補因子の他のアンタゴニストを含む群から選択されることを特徴とする、請求項７記載の阻害剤。
【請求項9】
前記阻害剤が、阻害性チアミンアナログ、特にオキシチアミン、ベンフォオキシチアミンおよび／またはベンフォオキシチアミンアナログであり、ベンフォオキシチアミンの場合、これは患者の体重１ｋｇ当たりかつ１日当たり７μｇ～４３０μｇ、有利には１４μｇ～２１５μｇ、とりわけ好ましくは１４μｇ～１３０μｇのベンフォオキシチアミンの用量で使用されることを特徴とする、請求項７または８記載の阻害剤。
【請求項10】
前記阻害性チアミンアナログが有効成分ベンフォオキシチアミンであり、患者の体重１ｋｇ当たりかつ１日当たり７μｇ～４３０μｇ、有利には１４μｇ～２１５μｇ、とりわけ好ましくは１４μｇ～１３０μｇのベンフォオキシチアミンの用量で使用されることを特徴とする、請求項９記載の阻害剤。
【請求項11】
前記阻害剤が、ＴＫＴＬ１－ＴＫＴヘテロ二量体複合体の形成を制限または阻止することが可能であり、かつそれに適した物質または物質混合物であることを特徴とする、請求項１記載の阻害剤。
【請求項12】
ＴＫＴＬ１阻害剤としてのベンフォオキシチアミンの場合、前記ベンフォオキシチアミンが、患者の体重１ｋｇ当たりかつ１日当たり７μｇ～４３０μｇ、有利には１４μｇ～２１５μｇ、とりわけ好ましくは１４μｇ～１３０μｇのベンフォオキシチアミンの用量で使用される、請求項１記載の阻害剤。
【請求項13】
患者の体重１ｋｇ当たりかつ１日当たりの前記用量が、ベンフォオキシチアミン１４μｇ～２１５μｇ、有利にはベンフォオキシチアミン１４μｇ～１３０μｇであることを特徴とする、請求項１２記載の阻害剤。
【国際調査報告】