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▶ ユニバーシティ・カレッジ・コークーナショナル・ユニバーシティ・オブ・アイルランド，コークの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-28
(54)【発明の名称】脳血管イベントおよび神経障害の治療
(51)【国際特許分類】
A61K 38/17 20060101AFI20240321BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240321BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240321BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240321BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240321BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240321BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20240321BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20240321BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20240321BHJP
【ＦＩ】
A61K38/17
A61P9/10
A61P25/00
A61K47/68
A61K39/395 Y
C07K19/00 ZNA
C07K16/00
C07K14/47
C12N15/62 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023563182
(86)(22)【出願日】2022-04-12
(85)【翻訳文提出日】2023-12-12
(86)【国際出願番号】 EP2022059809
(87)【国際公開番号】W WO2022219008
(87)【国際公開日】2022-10-20
(31)【優先権主張番号】21168469.1
(32)【優先日】2021-04-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500489473
【氏名又は名称】ユニバーシティ・カレッジ・コークーナショナル・ユニバーシティ・オブ・アイルランド，コーク
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ムーア、トム
(72)【発明者】
【氏名】ウェーバー、クリスチャン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076BB13
4C076BB21
4C076CC01
4C076CC11
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF70
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA22
4C084BA41
4C084CA18
4C084MA56
4C084MA65
4C084NA14
4C084ZA01
4C084ZA36
4C085AA21
4C085BB42
4C085GG01
4C085GG02
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、神経障害を治療する、または対象の脳血管イベントもしくは脳外傷によって損傷を受けた組織の生存もしくは回復を刺激する方法に使用するための妊娠特異的糖タンパク質（例えば、ＰＳＧ１）を提供する。ＰＳＧ１は、Ｆｃタグ付きＰＳＧ１であってよい。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトの脳血管イベントによって損傷を受けた組織の生存または回復を刺激する方法に使用するための妊娠特異的糖タンパク質１（ＰＳＧ１）。
【請求項2】
Ｆｃタグ付きＰＳＧ１（ＰＳＧ１－Ｆｃ）である、請求項１の使用のための、請求項１に記載のＰＳＧ１。
【請求項3】
前記脳血管イベントが急性虚血性脳卒中である、請求項１の使用のための、請求項１または２に記載のＰＳＧ１。
【請求項4】
前記脳血管イベントが出血性脳卒中である、請求項１の使用のための、請求項１または２に記載のＰＳＧ１。
【請求項5】
前記脳血管イベントが一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）である、請求項１の使用のための、請求項１または２に記載のＰＳＧ１。
【請求項6】
静脈内投与または髄腔内投与によって前記対象に投与される、請求項１～５のいずれかの使用のための、請求項１または２に記載のＰＳＧ１。
【請求項7】
０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で前記対象に投与される、請求項１～６のいずれかの使用のための、請求項１または２に記載のＰＳＧ１。
【請求項8】
前記脳血管イベントの６時間以内に前記対象に投与される、請求項１～７のいずれかの使用のための、請求項１または２に記載のＰＳＧ１。
【請求項9】
神経細胞死または脱髄をもたらす、ミクログリアの調節の変化を特徴とする、ヒトの神経障害を治療する方法に使用するための妊娠特異的糖タンパク質１（ＰＳＧ１）。
【請求項10】
Ｆｃタグ付きＰＳＧ１（ＰＳＧ１－Ｆｃ）である、請求項９の使用のための、請求項９に記載のＰＳＧ１。
【請求項11】
神経細胞死または脱髄をもたらす、ミクログリアの調節の変化を特徴とする前記神経障害が神経変性疾患である、請求項９の使用のための、請求項９または１０に記載のＰＳＧ１。
【請求項12】
外傷性脳損傷によって損傷を受けた組織の生存または回復を刺激することによって哺乳動物の外傷性脳損傷を治療する方法に使用するための妊娠特異的糖タンパク質１（ＰＳＧ１）。
【請求項13】
Ｆｃタグ付きＰＳＧ１（ＰＳＧ１－Ｆｃ）である、請求項１２の使用のための、請求項１２に記載のＰＳＧ１。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、急性虚血性脳卒中などの脳血管イベント、および神経障害を治療するための胎盤発現タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
妊娠特異的糖タンパク質（ｐｒｅｇｎａｎｃｙ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）（ＰＳＧ）は、母体－胎児境界面（ｍａｔｅｒｎａｌ－ｆｅｔａｌ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）、および妊娠中の母体循環では、免疫応答、血管新生応答および血小板応答の調節に関与すると考えられている。ＰＳＧタンパク質は、それ自体が免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである癌胎児性抗原細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）ファミリーの一部である。ＰＳＧタンパク質は、霊長類、ウマ類および齧歯類の間で構造がかなり異なるが、保存された機能を保持している（Ａｌｅｋｓｉｃ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｈｏｒｓｅ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．２０１６ Ｓｅｐ；１５２（３）：１７１－８４．ｄｏｉ：１０．１５３０／ＲＥＰ－１６－０２３６．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｊｕｎ ８．Ｍｏｏｒｅ Ｔ，Ｄｖｅｋｓｌｅｒ ＧＳ．Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｃｏｍｐｌｅｘ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｎａｌ－ｆｅｔａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．２０１４；５８（２－４）：２７３－８０．ｄｏｉ：１０．１３８７／ｉｊｄｂ．１３０３２９ｇｄ．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰＭＩＤ：２５０２３６９３．）。ヒトおよびマウスには、それぞれ、ＰＳＧタンパク質をコードする１１個および１７個の異なるＰＳＧ遺伝子が存在する。ヒトＰＳＧは、１つのＮ末端免疫グロブリン可変（ＩｇＶ）様ドメイン（Ｎドメイン）、それに続く２つの異なるタイプ（ＡおよびＢと命名される）の一般に２～３つのＩｇ定常（ＩｇＣ）様ドメインから構成されるが、齧歯類ＰＳＧは、２～９つの連続するＮドメイン、それに続く１つのＩｇＣ様ドメインを含有する。７つのウマＣＥＡＣＡＭ由来ＰＳＧ様タンパク質は、単一のＮドメインおよびＡ２ドメインを有する（Ａｌｅｋｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
【0003】
ＰＳＧ１は、１１個の異なるヒトＰＳＧ遺伝子の豊富に発現されるメンバーであり、ある試験では、妊娠の第三期に総ＰＳＧタンパク質濃度が１００μｇ／ｍｌを超えると推定された。妊娠中、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）は、栄養膜浸潤、血管新生および細胞外マトリックス産生を調節する。様々な細胞をＰＳＧ１または他のＰＳＧを用いて処理すると、ＥＬＩＳＡによって決定した場合、上清中の総ＴＧＦ－β１の分泌が増加し、潜在型ＴＧＦ－β１の活性化も増加した［Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ Ａ，Ｍｅｎｔｉｎｋ－Ｋａｎｅ ＭＭ，Ｗａｒｒｅｎ Ｊ，Ｋａｐｌａｎ ＧＧ，Ｄｖｅｋｓｌｅｒ ＧＳ．
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｔｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β１ ａｒｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｂｙ ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ １（ＰＳＧ１）．
Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１５ Ｆｅｂ １３；２９０（７）：４４２２－３１．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１４．５９７５１８．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｄｅｃ ２９．］。
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｔｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β１ ａｒｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｂｙ ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ １（ＰＳＧ１）．
Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１５ Ｆｅｂ １３；２９０（７）：４４２２－３１．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１４．５９７５１８．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｄｅｃ ２９．］。
【0004】
国際公開第２０１７０４９０８２号は、１つの特異的ＰＳＧタンパク質、ＰＳＧ１、および免疫寛容の誘導に供される経路におけるその関与を記載している。ＰＳＧ１は、炎症性Ｔ細胞の抑制に必須であり、移植片対宿主病（ＧｖＤＨ）の予防に重要であることが示されている細胞集団である寛容誘導性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の分化に重要なサイトカインである形質転換増殖因子－β１（ＴＧＦβ１）の活性化に関与している。
【発明の概要】
【0005】
本出願人は、ＰＳＧ１が哺乳動物におけるミクログリア細胞の表現型をＭ１炎症促進性表現型からＭ２抗炎症性表現型に改変することができることを発見した（図１）。ミクログリアは、ＣＮＳの常在免疫細胞であり、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病ならびに多発性硬化症および筋萎縮性側索硬化症などの多様な神経変性疾患の病因に関与している。したがって、本発明は、神経障害の治療におけるＰＳＧ１の使用に関する。本出願人はまた、ＰＳＧ１が、処置後のマウス脳卒中モデルでは行動転帰の改善を提供し（足障害試験）（図２）、したがって、哺乳動物の脳卒中および他の脳血管イベントならびに外傷性脳損傷の処置に適応されることを発見した。
【0006】
第１の態様では、本発明は、脳血管イベントまたは外傷性脳損傷によって損傷を受けた組織の生存または回復を刺激する方法に使用するための妊娠特異的糖タンパク質（例えば、ＰＳＧ１）を提供する。
【0007】
別の態様では、本発明は、対象に対する神経保護剤としての妊娠特異的糖タンパク質（例えば、ＰＳＧ１）の使用に関する。
【0008】
任意の実施形態では、ＰＳＧ１はＦｃタグ付きＰＳＧ１（ＰＳＧ１－Ｆｃ）である。
【0009】
任意の実施形態では、脳血管イベントは急性虚血性脳卒中である。
【0010】
任意の実施形態では、脳血管イベントは出血性脳卒中である。
【0011】
任意の実施形態では、脳血管イベントは一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）である。
【0012】
任意の実施形態では、ＰＳＧ１は、対象に静脈内投与される。
【0013】
任意の実施形態では、ＰＳＧ１は、薬物送達カテーテルを使用して脳損傷部位に局所投与される。
【0014】
任意の実施形態では、ＰＳＧ１は、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２０１３ Ｏｃｔ；３０（１０）：２４２９－４４に記載される薬物送達系を使用して投与される。
【0015】
任意の実施形態では、ＰＳＧ１は、０．０１～１００、典型的には０．０１～０．１、０．１～１．０、１．０～１０、または１０～１００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で対象に投与される。
【0016】
任意の実施形態では、ＰＳＧ１は、脳血管イベントの７２、４８、２４時間以内、好ましくは１８時間以内、さらに好ましくは１２時間以内、さらに好ましくは６時間以内、さらに好ましくは４時間以内、理想的には２時間以内に対象に投与される。
【0017】
任意の実施形態では、方法は、別の薬物、例えば、血栓溶解薬、血液希釈剤または抗血小板剤を投与することを含む。血液希釈剤の例には、アピキサバン（エリキュース）、ダビガトラン（プラダキサ）、エドキサバン（サバイサ（Ｓａｖａｙｓａ））、フォンダパリヌクス（アリクストラ）、ヘパリン（フラグミン、イノヘップおよびラブノックス）、リバーロキサバン（イグザレルト）、ワルファリン（クマジン、ジャントベン（Ｊａｎｔｏｖｅｎ））および抗血小板剤が挙げられる。血栓溶解薬の例には、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、テネクテプラーゼ、アルテプラーゼ、ウロキナーゼ、レテプラーゼおよびストレプトキナーゼが挙げられる。
【0018】
任意の実施形態では、方法は、対象に対して血管内血栓摘出術を行うことを含む。
【0019】
任意の実施形態では、方法は、脳血管イベントまたは脳外傷の１つ以上の症状の改善をもたらす。症状の例には、以下が挙げられる：
歩行困難、
眩暈、
バランスおよび協調の喪失、
話すこと、または話している他者を理解することが困難であること、
顔、脚または腕（身体の片側のみである可能性が最も高い）のしびれまたは麻痺、
ぼやけたまたは暗い視覚、ならびに
特に悪心、嘔吐または眩暈を伴う場合の突然の頭痛。
歩行困難、
眩暈、
バランスおよび協調の喪失、
話すこと、または話している他者を理解することが困難であること、
顔、脚または腕（身体の片側のみである可能性が最も高い）のしびれまたは麻痺、
ぼやけたまたは暗い視覚、ならびに
特に悪心、嘔吐または眩暈を伴う場合の突然の頭痛。
【0020】
さらなる態様では、本発明は、神経学的疾患／障害、例えば、哺乳動物の神経変性、神経細胞死または脱髄を特徴とする疾患または状態を治療する方法に使用するための妊娠特異的糖タンパク質１（ＰＳＧ１）を提供する。例には、神経細胞死または脱髄をもたらす、神経幹細胞、またはミクログリアおよび乏突起膠細胞などのアクセサリー細胞の調節の変化を特徴とする疾患が挙げられる。ＰＳＧ１は、幹細胞を含む神経細胞系統に対する直接的な作用を介して、ミクログリアおよび乏突起膠細胞などのアクセサリー細胞の表現型（サイトカイン産生を含む）を調節することによって、ならびに中枢免疫系および末梢免疫系を調節することによって、ニューロンの修復を促進することができる。ＰＳＧ１によって処理されたＪｕｒｋａｔ細胞およびミクログリア細胞は、疾患進行の遅延と一致する変化したサイトカインプロファイルを示すことが見出されている。一実施形態では、ＰＳＧ１はＦｃタグ付き妊娠特異的糖タンパク質１（ＰＳＧ１－Ｆｃ）である。
【0021】
一実施形態では、神経変性を特徴とする疾患または状態は、神経細胞死を引き起こす。一実施形態では、神経変性疾患は、ＡＬＳ（運動ニューロン疾患またはルー・ゲーリック病としても知られる）、または原発性側索硬化症および脊髄性筋萎縮症を含むその変形例である。他の神経変性疾患には、アルツハイマー病および他の記憶障害、運動失調、ハンチントン病、パーキンソン病、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺が含まれる。
【0022】
一実施形態では、神経変性を特徴とする疾患または状態は脱髄疾患である。一実施形態では、神経変性疾患は、ＭＳ（多発性硬化症としても知られる）またはその変形例である。
【0023】
任意の実施形態では、神経障害は、発作性障害、例えば、てんかんである。
【0024】
一態様では、本発明は、軸索細胞（ａｘｏｎａｌ ｃｅｌｌ）の髄鞘形成の完全性を維持することによる、哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）の脱髄に関連する疾患または状態の原因治療または予防に使用するためのＰＳＧ１、特にＦｃタグ付きＰＳＧ１を提供する。
【0025】
本明細書では、用語「軸索細胞の髄鞘形成の完全性を維持する」は、軸索細胞の再髄鞘形成を行うこと、軸索細胞の脱髄を阻害もしくは予防すること、またはその両方を意味すると理解されるべきである。用語「原因」治療は、疾患の根本的な原因としての脱髄の治療を意味し、疾患の臨床症状に直接対処することを意図した治療（対症療法）を除外すると理解されるべきである。
【0026】
別の態様では、本発明は、軸索細胞の髄鞘形成の完全性を維持することによって哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）の脱髄に関連する疾患または状態を治療または予防する方法であって、臨床的有効量のＰＳＧ１、特にＦｃタグ付きＰＳＧ１をそれを必要とする個体に投与する工程を含む方法に広く関する。
【0027】
別の態様では、本発明は、軸索細胞の髄鞘形成の完全性を維持することによって哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）の脱髄に関連する疾患または状態の再発、特に急性再発を治療する方法であって、疾患または状態の再発時に、臨床的有効量のＰＳＧ１、特にＦｃタグ付きＰＳＧ１を哺乳動物に投与する工程を含む方法に関する。好ましくは、臨床的有効量の活性剤の投与は、疾患または状態の再発期間中継続され、好ましくは、疾患または状態の寛解時に中止される。
【0028】
別の態様では、本発明は、軸索細胞の髄鞘形成の完全性を維持することによって哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）の脱髄に関連する疾患または状態の寛解期間を延長する方法であって、疾患または状態の寛解期間中に臨床的有効量のＰＳＧ１、特にＦｃタグ付きＰＳＧ１を哺乳動物に投与する工程を含む方法に関する。好ましくは、臨床的有効量の活性物質の投与は、疾患または状態の再発期間中継続される。
【0029】
別の態様では、本発明は、哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）の脱髄に関連する疾患または状態、特に多発性硬化症（ＭＳ）、特に原発性進行性ＭＳのための非免疫媒介療法（好ましくは、非免疫媒介原因療法）であって、方法が、哺乳動物の軸索鞘の臨床的に有意な再髄鞘形成、または脱髄の阻害をもたらすのに十分な量で臨床的有効量のＰＳＧ１、特にＦｃタグ付きＰＳＧ１を哺乳動物に投与する工程を含む非免疫媒介療法に関する。用語「非免疫媒介療法」は、哺乳動物の免疫応答の減衰を目的としない療法を意味すると理解されるべきである。
【0030】
さらなる態様では、本発明は、哺乳動物の外傷性脳損傷を治療する方法、例えば、外傷性脳損傷によって損傷を受けた組織の生存または回復を刺激する方法に使用するための妊娠特異的糖タンパク質（例えば、ＰＳＧ１）を提供する。任意の実施形態では、妊娠特異的糖タンパク質は、外傷性脳損傷によって損傷を受けた組織に投与される。
【0031】
さらなる態様では、本発明は、哺乳動物の脊髄損傷を治療する方法、例えば、外傷性脊髄損傷または外傷性脊髄疾患によって損傷を受けた脊髄組織の生存または回復を刺激する方法に使用するための妊娠特異的糖タンパク質（例えば、ＰＳＧ１）を提供する。任意の実施形態では、方法は、外傷性脊髄損傷または外傷性脊髄疾患によって引き起こされる、脊髄のグリア性瘢痕などの脊髄病変を治療する方法である。任意の実施形態では、方法は、損傷を受けた脊髄の脊髄組織を再生する方法である。
【0032】
さらなる態様では、本発明は、Ｆｃタグ付き妊娠特異的糖タンパク質１（ＰＳＧ１－Ｆｃ）と、神経幹細胞および間葉系幹細胞を含む細胞移植片とを含む組成物を提供する。
【0033】
一実施形態では、ＰＳＧ１は、筋肉内、髄腔内、皮下、静脈内もしくは腹腔内送達によって、または患部への注射によって投与される。
【0034】
一実施形態では、ＰＳＧ１は、哺乳動物にＰＳＧ１（またはＰＳＧ１－Ｆｃ）発現ベクターをトランスフェクトすることによって、哺乳動物に投与される。
【0035】
一実施形態では、ＰＳＧ１は、ＰＳＧ１（またはＰＳＧ１－Ｆｃ）発現ベクターによってトランスフェクトされた細胞を哺乳動物に投与することによって、哺乳動物に投与される。一実施形態では、細胞は幹細胞である。一実施形態では、細胞は、脳細胞（例えば、ニューロン、乏突起膠細胞、星状膠細胞またはミクログリア細胞）または間葉系幹細胞である。一実施形態では、ドナー細胞はレシピエントから得られる。一実施形態では、ドナー細胞は、レシピエントとは異なる哺乳動物（例えば、ヒト）から得られる（同種細胞療法）。一実施形態では、細胞は、エクスビボでトランスフェクトされる。
【0036】
上記で提供された本発明の方法は、治療におけるＰＳＧ１、およびＰＳＧ１の改変バージョン、例えば、ＰＳＧ１－Ｆｃを列挙している。ただし、本発明はまた、上記の治療方法におけるＰＳＧ１（およびその改変バージョン）以外のＰＳＧタンパク質の使用に関する。
【0037】
一実施形態では、ＰＳＧ１（またはＰＳＧ）は、官能性部分によって改変される。官能性部分は、改変ＰＳＧ１の血漿半減期を増加させるように構成され得る。官能性部分は、改変ＰＳＧ１の細胞透過官能性を増加させるように構成され得る。官能性部分は、改変ＰＳＧ１の活性を増加させるように構成され得る。官能性部分は、改変ＰＳＧ１の精製を容易にするように構成され得る。ＰＳＧ１ポリペプチドの改変の例は以下に提供され、ＰＳＧ１ポリペプチドの改変の例には、抗体断片、例えば、Ｆｃ部分の付加、ＰＥＧ官能基の付加、Ｌ－異性体による天然アミノ酸の置換が挙げられる。一実施形態では、官能基はＦｃ部分である。一実施形態では、Ｆｃ部分は、天然Ｆｃ部分と比較して増加した血漿半減期を有するように改変される。改変Ｆｃタグは、以下の論文に記載されている：Ａｌｇｉｒｄａｓ Ｇｒｅｖｙｓ，Ｍａｌｉｎ Ｂｅｒｎ，Ｓｔｉａｎ Ｆｏｓｓ，Ｄｉａｎｅ Ｂｒｙａｎｔ，Ｔｅｒｊｅ Ｂｒａｔｌｉｅ，Ａｎｄｅｒｓ Ｍｏｅｎ，Ｋｒｉｓｔｉｎ Ｓｔｏｅｎ Ｇｕｎｎａｒｓｅｎ，Ａｕｄｕｎ Ａａｓｅ，Ｔｅｒｊｅ Ｅｉｎａｒ Ｍｉｃｈａｅｌｓｅｎ，Ｉｎｇｅｒ Ｓａｎｄｌｉｅ ａｎｄ Ｊａｎ Ａｎｄｅｒｓｅｎ．Ｆｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｆｏｒ Ａｌｔｅｒｅｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｆｆｅｃｔｓ Ｆｃ Ｅｆｆｅｃ－ｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｊｕｎｅ １，２０１５，１９４（１１）５４９７－５５０８．Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ＷＦ，Ｋｉｅｎｅｒ ＰＡ，Ｗｕ Ｈ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦｃＲｎ）．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２８１：２３５１４－２３５２４（２００６）．Ａｂｈｉｓｈｅｋ Ｓａｘｅｎａ ａｎｄ Ｄｏｎｇｈｕｉ Ｗｕ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｆｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ－Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＧ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｅｒｕｍ Ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１６；７：５８０．ヒトＦｃタグに対する例示的な改変には、安定性および半減期を増加させるためのＣＨ２ドメイン内の三重置換ＹＴＥ（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）およびＣＨ３ドメイン内の（Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ）が含まれる（配列番号３）。これらの改変は、部位特異的変異誘発を使用して行われ得る。一実施形態では、本発明は、配列番号３によってコードされるＦｃタグとコンジュゲートされたＰＳＧ１タンパク質を提供する。
【0038】
本発明の他の態様および好ましい実施形態は、以下に記載される他の特許請求の範囲において定義および説明される。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図1】５０ｕｇ／ｍｌで５時間にわたる、組換えＰＳＧ１－Ｖ５Ｈｉｓタンパク質によるＣ２０ミクログリア細胞株（Ｇａｒｃｉａ－Ｍｅｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１７）の表現型の調節。
【図2】１００ｕｇの組換えＰＳＧ１－Ｆｃによる処置後のマウス脳卒中モデルにおける行動転帰（足障害試験）の改善。
【発明を実施するための形態】
【0040】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、特許出願および他の参考文献は、あたかも各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示され、その内容が完全に引用されているかのように、あらゆる目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0041】
定義および一般的な選好
本明細書で使用される場合、特に具体的な指示がない限り、以下の用語は、当技術分野で享受され得る任意のさらに広い（またはさらに狭い）意味に加えて、以下の意味を有することが意図される。
本明細書で使用される場合、特に具体的な指示がない限り、以下の用語は、当技術分野で享受され得る任意のさらに広い（またはさらに狭い）意味に加えて、以下の意味を有することが意図される。
【0042】
文脈上特に必要とされない限り、本明細書における単数形の使用は、複数形を含むように読まれるべきであり、その逆も同様である。実体に関して使用される用語「ａ」または「ａｎ」は、その実体のうちの１つ以上を指すように読まれるべきである。したがって、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書では区別なく使用される。
【0043】
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」またはその変形例、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、任意の列挙された整数（例えば、機構、要素、特性、特性、方法／プロセス工程または限定）または整数群（例えば、機構、要素、特性、特性、方法／プロセス工程または限定）を含むが、任意の他の整数または整数群を除外しないことを示すように読まれるべきである。したがって、本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、包括的またはオープンエンドであり、追加の列挙されていない整数または方法／プロセス工程を除外しない。
【0044】
本明細書で使用される場合、用語「疾患」は、生理学的機能を損ない、特定の症状に関連する任意の異常な状態を定義するために使用される。該用語は、病因の性質（または実際に疾患の病因学的基礎が確立されているかどうか）にかかわらず生理学的機能が損なわれている任意の障害、疾病、異常、病態、病気、状態または症候群を包含するために広く使用される。したがって、該用語は、感染、外傷、傷害、手術、放射線学的アブレーション、年齢、中毒または栄養不足から生じる状態を包含する。
【0045】
本明細書で使用される場合、用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患の症状を治癒させる、改善するもしくは軽減する、またはその原因を除去する（またはその原因の影響を軽減する）介入（例えば、対象への薬剤の投与）（例えば、リソソーム酵素の病理学的レベルの蓄積の減少）を指す。この場合、該用語は、用語「療法（ｔｈｅｒａｐｙ）」と同義に使用される。
【0046】
さらに、用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患の発症もしくは進行を予防するもしくは遅延させる、または治療された集団内でのその発生率を低下させる（または根絶する）介入（例えば、対象への薬剤の投与）を指す。この場合、治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）という用語は、用語「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」と同義に使用される。
【0047】
本明細書で使用される場合、薬剤の有効量または治療有効量は、合理的な利益／リスク比に見合った、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を伴わず対象に投与され得るが、所望の効果、例えば、対象の状態の持続的または一時的な改善によって現れる治療または予防を提供するのに十分な量を定義する。量は、個体の年齢および全身状態、投与様式、ならびに他の要因に応じて、対象ごとに変動する。したがって、正確な有効量を特定することは不可能であるが、当業者であれば、常用的な実験、および背景技術の一般知識を使用して、いずれかの個々の場合に適切な「有効」量を決定することができるであろう。これに関連して、治療結果には、症状の根絶または軽減、疼痛または不快感の低減、生存期間の延長、可動性の改善、および臨床的改善の他のマーカーが含まれる。治療結果は、完全な治癒である必要はない。改善は、生物学的／分子的マーカー、臨床的または観察的改善に観察され得る。好ましい実施形態では、本発明の方法は、ヒト、大型競走用動物（ウマ、ラクダ、イヌ）および飼育伴侶動物（ネコおよびイヌ）に適用可能である。
【0048】
上記で定義される治療および有効量に関連して、対象という用語（文脈上許容される場合、「個体」、「動物」、「患者」または「哺乳動物」を含むように読まれるべきである）は、治療が適応される任意の対象、特に哺乳動物対象を定義する。哺乳動物対象には、限定するものではないが、ヒト、飼育動物、家畜、動物園動物、スポーツ動物、ペット動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ラクダ、バイソン、畜牛、乳牛；霊長類、例えば、類人猿、サル、オランウータンおよびチンパンジー；イヌ科動物、例えば、イヌおよびオオカミ；ネコ科動物、例えば、ネコ、ライオン、トラ；ウマ類、例えば、ウマ、ロバおよびシマウマ；食用動物、例えば、乳牛、ブタおよびヒツジ；有蹄動物、例えば、シカおよびキリン；ならびに齧歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットが含まれる。好ましい実施形態では、対象はヒトである。本明細書で使用される場合、用語「ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）」は、ウマ（ｈｏｒｓｅ）、ロバ（ｄｏｎｋｅｙ）、ロバ（ａｓｓ）、チベットノロバおよびシマウマを含むウマ科（Ｅｑｕｉｄａｅ）の哺乳動物を指す。
【0049】
本明細書で使用される場合、用語「脳血管イベント」または「ＣＶＡ」は、神経症状または神経症状群を引き起こす、対象の脳虚血または出血を指す。これは、一般に「脳卒中」とも呼ばれる。主な臨床的特徴は、突然または亜急性の発症および（くも膜下出血を除く）局所神経障害である。患者がいつ見られるかおよび根本的な原因に応じて、障害は、安定であり得るか、進行性であり得るか、または完全に解消され得る。これらの共通の特徴を除いて、脳血管疾患は、病因、位置、および症状の持続期間に従ってさらに分類される極めて多様な障害群である。脳血管疾患は、それぞれ多くの病因を有する虚血性事象および脳出血に細分される。虚血事象は、症状が頸動脈分布または椎骨脳底分布で発生したかどうかに従って、および症状の持続時間によって、さらに分類される。一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）は、数分を超えて続くことはほとんどなく、２４時間を超えて続くことはない。虚血性脳卒中では、神経障害は２４時間を超えて存在しており、進行性、安定性または解消性であり得る。
【0050】
本明細書で使用される場合、ＰＳＧタンパク質という用語は、細胞膜アンカーを欠き、胎盤組織内で主に発現されるＣＥＡＣＡＭ関連タンパク質を指す。そのようなタンパク質は、例えば、霊長類、齧歯類、ウマ類、コウモリを含む哺乳動物のサブセットに見られるが、例えば、有蹄動物およびイヌ科動物には見られない（Ｒｏｂｅｒｔ Ｋａｍｍｅｒｅｒ，Ｗｏｌｆｇａｎｇ Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ．Ｃｏｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｗｉｔｈｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ．ＢＭＣ Ｂｉｏｌ．２０１０；８：１２．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１０ Ｆｅｂ ４．ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４１－７００７－８－１２）。ＰＳＧの遺伝子およびタンパク質配列の例が利用可能である（ＭｃＬｅｌｌａｎ ＡＳ，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｂ，Ｄｖｅｋｓｌｅｒ Ｇ，Ｈｏｒｉ Ｔ，Ｗｙｎｎｅ Ｆ，Ｂａｌｌ Ｍ，Ｏｋｕｍｕｒａ Ｋ，Ｍｏｏｒｅ Ｔ，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ Ｗ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐｓｇ）ｇｅｎｅ ｌｏｃｕｓ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００５ Ｊａｎ １２；６：４．ＰＭＩＤ：１５６４７１１４；Ｋａｍｍｅｒｅｒ＆Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，２０１０；Ａｌｅｋｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。一般に、ＰＳＧ（すなわち、ＰＳＧ１）は組換えタンパク質である。
【0051】
本明細書で使用される場合、用語「妊娠特異的糖タンパク質１」または「ＰＳＧ１」は、シグナル配列（アミノ酸残基１～３４）、成熟ペプチド（残基３５～４１９）を含む、以下の配列番号１によって表される全長タンパク質を指す。該用語には、シグナル配列を有しない成熟ペプチドも含まれる。
【0052】
配列番号１：
【0053】
用語「ＰＳＧ１」はまた、Ｆｃタグ付きＰＳＧ１タンパク質（ＰＳＧ１－Ｆｃ）を含み、その一例は、Ｆｃタグが、ＭＴＳ変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６ＥおよびＨＮ変異Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを導入する部位特異的変異誘発によって改変されている以下の配列番号２に提供される：
【0054】
配列番号２
【0055】
配列番号３は、ＭＴＳ変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６ＥおよびＨＮ変異Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを組み込んだ改変Ｆｃタグに対するオープンリーディングフレームを提供する：
【0056】
配列番号３
改変ヒトＦｃ ＯＲＦ
改変ヒトＦｃ ＯＲＦ
【0057】
用語「ＰＳＧ１」はまた、野生型ＰＳＧ１タンパク質、典型的には、ヒト野生型ＰＳＧ１タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質である変異体を含む。したがって、例えば、該用語は、１つ以上のアミノ酸残基に関して変化したタンパク質またはポリペプチドを含むと解釈されるべきである。好ましくは、そのような変化は、５個以下のアミノ酸、さらに好ましくは４個以下、さらになお好ましくは３個以下、最も好ましくは１個または２個のアミノ酸のみの挿入、付加、欠失および／または置換を伴う。天然アミノ酸および改変アミノ酸による挿入、付加および置換が想定される。変異体は、保存的アミノ酸変化を有してもよく、導入されるアミノ酸は、置換されるアミノ酸と構造的、化学的または機能的に類似している。典型的には、触媒的に重要な残基の置換または欠失によって変化したタンパク質は、用語「変異体」から除外される。このような触媒的に重要な残基の詳細は、タンパク質モデリングの分野の当業者に周知である。一般に、変異体は、野生型タンパク質（上記のシグナルペプチドを除く）と少なくとも７０％のアミノ酸配列相同性、好ましくは少なくとも８０％の配列相同性、さらに好ましくは少なくとも９０％の配列相同性、理想的には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を有する。これに関連して、配列相同性は、配列同一性および配列類似性の両方を含み、すなわち、野生型タンパク質と７０％のアミノ酸相同性を共有するポリペプチド配列は、アライメントした残基の任意の７０％が、野生型タンパク質の対応する残基と同一であるかまたは野生型タンパク質の対応する残基の保存的置換であるものである。ＰＳＧ１に関して、本発明の範囲内に含まれる特定の変異体は、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１７０４９０８２の段落２５～３８で特定される変異体ＰＳＧ１タンパク質である。該用語はまた、ヒトＦｃタグを含むＦｃタグなどのタグによって改変されたＰＳＧ１タンパク質を含む。Ｆｃタグは、血漿半減期および／または安定性の増加を示すように改変され得る。そのようなＦｃタグは、文献から公知であり、本明細書に記載されている。安定性および半減期を増加させるためのＣＨ２ドメイン内の三重置換ＭＳＴ（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）およびＣＨ３ドメイン内の（Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ）を含む、ヒトＦｃタグに対する改変の例。
【0058】
本発明で使用するためのＰＳＧ１は、化学合成によって、または核酸からの発現（すなわち、組換え）によって、全体的または部分的に生成され得る。例えば、本発明のタンパク質、および本発明で使用するためのタンパク質は、当技術分野で公知の十分に確立された標準的な液相タンパク質合成方法または好ましくは固相タンパク質合成方法に従って容易に調製され得る（例えば、Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９８４），ｉｎ Ｍ．Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ ａｎｄ Ａ．Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ，Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）を参照）。必要に応じて、本発明で使用されるタンパク質のいずれも、それらの安定性を増加させるために化学的に改変され得る。化学的に改変されたタンパク質またはタンパク質類似体には、本発明の実施に関してインビボまたはインビトロでの安定性および／または有効性および／または半減期の増加を特徴とするタンパク質の任意の機能的な化学的同等物が含まれる。タンパク質類似体という用語はまた、本明細書に記載のタンパク質の任意のアミノ酸誘導体を指す。タンパク質類似体は、限定するものではないが、側鎖への改変、タンパク質合成中の非天然アミノ酸および／またはそれらの誘導体の組込み、ならびにタンパク質またはそれらの類似体に配座制約を課す架橋剤および他の方法の使用を含む手順によって生成され得る。側鎖改変の例には、例えば、アルデヒドとの反応、それに続くＮａＢＨ４による還元による還元アルキル化；メチルアセトイミダートによるアミド化；無水酢酸によるアセチル化；シアナートによるアミノ基のカルバミル化；２，４，６，トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸およびテトラヒドロ無水フタル酸によるアミノ基のアルキル化；ならびに５’－リン酸ピリドキサールによるリジンのピリドキシル化、それに続くＮａＢＨによる還元によるアミノ基の改変が挙げられる。アルギニン残基のグアニジノ基は、２，３－ブタンジオン、フェニルグリオキサールおよびグリオキサールなどの試薬との複素環縮合生成物の形成によって改変され得る。カルボキシル基は、ｏ－アシルイソ尿素形成を介したカルボジイミド活性化、続いて、例えば、対応するアミドへのその後の誘導体化によって改変され得る。スルフヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応；４－クロロメルクリ安息香酸、４－クロロメルクリフェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、２－クロロメルクリック－４－ニトロフェノールおよび他の水銀を使用する水銀誘導体の形成；アルカリ性ｐＨでのシアナートによるカルバミル化などの方法によって改変され得る。トリプトファン残基は、例えば、Ｎ－ブロモスクシンイミドによる酸化、または２－ヒドロキシ－５－ニトロベンジルブロミドもしくはハロゲン化スルホニルによるインドール環のアルキル化によって改変され得る。チロシン残基は、３－ニトロチロシン誘導体を形成するためのテトラニトロメタンによるニトロ化によって変化させてもよい。ヒスチジン残基のイミダゾール環の改変は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化、またはジエチルピロカーボナートによるＮ－カルベトキシル化によって達成され得る。タンパク質合成中の非天然アミノ酸および誘導体の組込みの例には、限定するものではないが、ノルロイシン、４－アミノ酪酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ－５－フェニルペンタン酸、６－アミノヘキサン酸、ｔ－ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、４－アミノ－３－ヒドロキシ－６－メチルヘプタン酸、２－チエニルアラニン、および／またはアミノ酸のＤ－異性体の使用が挙げられる。タンパク質構造の改変には、Ｄ－アミノ酸によってコードされる逆配列を含むレトロインベルソタンパク質の生成が含まれる。変化は、タンパク質分解に対する感受性を低下させ、酸化に対する感受性を低下させ、変異体配列の結合親和性を変化させ（典型的には、望ましくは親和性を増加させ）、および／または関連する変異体／類似体タンパク質に対して他の物理化学的もしくは機能的特性を付与もしくは改変するものであり得る。
【0059】
本明細書では、用語「配列同一性」は、配列同一性および配列類似性の両方を含むと理解されるべきであり、すなわち、参照配列と７０％の配列同一性を共有する変異体（またはホモログ）は、その変異体（またはホモログ）のアライメントされた残基の任意の７０％が、配列の全長にわたって、参照配列内の対応する残基と同一であるかまたは参照配列内の対応する残基の保存的置換であるものである。配列同一性は、２つの異なる配列間で正確に一致する文字の量である。これにより、ギャップはカウントされず、測定値は２つの配列のうちの短い方に関係する。「配列相同性」に関して、該用語は、変異体（またはホモログ）のアライメントされた残基のパーセンテージが、参照配列内の対応する残基と同一であるかまたは参照配列内の対応する残基の保存的置換であり、変異体（またはホモログ）が参照配列と同じ機能を共有する場合に、定義されたパーセント類似性またはパーセント同一性を参照配列と共有する変異体（またはホモログ）を意味すると理解されるべきである。このアライメントおよびパーセント相同性またはパーセント配列同一性は、当技術分野で公知のソフトウェアプログラムを使用して決定され得、例えば、１つのアライメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉで見出され得る。
【0060】
用語「ＰＳＧ１」には、官能基による改変によるアミノ酸残基の挿入、欠失または置換以外によって改変されたＰＳＧ１タンパク質（改変タンパク質）も含まれる。
【0061】
医師であれば、治療またはケアされる特定の状態、疾患または障害、ならびに人の年齢、体重および／または健康状態に応じて、患者に最も適した実際の用量を決定するであろう。それは、使用される特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用の長さ、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与様式および投与時間、排泄速度、薬物の組合せ、特定の状態の重症度、ならびに治療を受けている個体を含む様々な要因に依存する。言うまでもなく、さらに高いまたは低い投与量範囲が見合った個々の例が存在する可能性があり、それは本発明の範囲内である。例えば、組成物は、０．０１～５０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、０．０１～１．０ｍｇ／ｋｇ、典型的には０．１～３０ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは０．１～２０ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは０．１～１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１～５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与され得る。例示的な実施形態では、１０～３００ｍｇ／日、またはさらに好ましくは１０～１５０ｍｇ／日の１つ以上の用量が患者に投与される。この量および頻度は、この目的に最も適している。適用または投与の頻度は、各対象の必要性に応じて大きく変動し得、適用または投与の推奨範囲は、月に１回～１日１０回、好ましくは週に１回～１日４回、さらに好ましくは週に３回～１日３回、さらになお好ましくは１日に１回または２回である。本発明の一実施形態では、エマルジョンは、脂質または油を含有する。エマルジョンは、限定するものではないが、水中油型、油中水型、水中油中水型およびシリコーン中水中油型エマルジョンであり得る。エマルジョンは、保湿剤を含有し得る。エマルジョンは、シリコーンなどの消泡剤を含有し得る。エマルジョンは、任意の好適な粘度を有し得る。エマルジョンは、乳化剤および／または消泡剤をさらに含有し得る。エマルジョンを調製する方法は、当業者に公知である。
【0062】
活性剤（ＰＳＧ１）は、所望の効果を達成するための薬学的または治療的に有効な濃度で、組成物の総重量に関して０．０００００００１％（重量基準）～１００％（重量基準）、典型的には０．０００００００１％（重量基準）～４０％（重量基準）、好ましくは０．０００００１％（重量基準）～１５％（重量基準）、さらに好ましくは０．０００１％（重量基準）～１０％（重量基準）、さらになお好ましくは０．０００１％（重量基準）～５％（重量基準）の好ましい形態で、本発明の医薬組成物に使用される。理想的には、組成物の約０．００００１％ｗ／ｗ～約０．５％ｗ／ｗ、さらに好ましくは０．００００５ｗ／ｗ～約０．０５ｗ／ｗ、最も好ましくは約０．０００１ｗ／ｗ～約０．０１ｗ／ｗのＰＳＧ１が好ましくは使用される。理想的には、組成物の約０．０００１％ｗ／ｗ～約０．００４％ｗ／ｗのＰＳＧ１が好ましくは使用される。
【0063】
本発明の組成物は、個別に、または他の薬理学的に活性な薬剤と組み合わせて投与され得る。そのような併用療法は、限定するものではないが、単一剤形または別個の個々の剤形の複数の薬剤を一緒に投与することを含む様々な治療レジメンを包含することが理解される。薬剤が異なる剤形で存在する場合、投与は、同時もしくはほぼ同時であり得るか、または異なる薬剤の投与を包含する任意の所定のレジメンに従い得る。好適な活性剤は、本明細書に記載される通りであり得る。
【0064】
本発明のいくつかの実施形態では、組成物は、リポソーム、混合リポソーム、オレオソーム、ニオソーム、エトソーム、ミリカプセル、カプセル、マクロカプセル、ナノカプセル、ナノ構造脂質担体、スポンジ、シクロデキストリン、小胞、ミセル、界面活性剤の混合ミセル、界面活性剤－リン脂質混合ミセル、ミリスフェア、スフェア、リポスフェア、粒子、ナノスフェア、ナノ粒子、ミリ粒子、固体ナノ粒子、ならびに逆ミセルの内部構造を有する油中水型マイクロエマルジョンを含むマイクロエマルジョン、およびナノエマルジョン、マイクロスフェア、マイクロ粒子のいずれか１つを介して送達され得る。
【0065】
リポソームを調製するための様々な方法が利用可能である。例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）、米国特許第４，１８６，１８３号明細書、米国特許第４，２１７，３４４号明細書、米国特許第４，２３５，８７１号明細書、米国特許第４，２６１，９７５号明細書、米国特許第４，４８５，０５４号明細書、米国特許第４，５０１，７２８号明細書、米国特許第４，７７４，０８５号明細書、米国特許第４，８３７，０２８号明細書、米国特許第４，２３５，８７１号明細書、米国特許第４，２６１，９７５号明細書、米国特許第４，４８５，０５４号明細書、米国特許第４，５０１，７２８号明細書、米国特許第４，７７４，０８５号明細書、米国特許第４，８３７，０２８号明細書、米国特許第４，９４６，７８７号明細書、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１７４２４、Ｄｅａｍｅｒ＆Ｂａｎｇｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ４４３：６２９－６３４（１９７６）；Ｆｒａｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ７６：３３４８－３３５２（１９７９）；Ｈｏｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８１２：５５－６５（１９８５）；Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８５８：１６１－１６８（１９８６）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８５：２４２－２４６（１９８８）；Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（Ｏｓｔｒｏ（ｅｄ．），１９８３，Ｃｈａｐｔｅｒ １）；Ｈｏｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐ．４０：８９（１９８６）；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）およびＬａｓｉｃ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ｆｒｏｍ Ｐｈｙｓｉｃｓ ｔｏ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９３））を参照されたい。好適な方法には、例えば、超音波処理、押出、高圧／ホモジナイゼーション、マイクロフルイダイゼーション、洗剤透析、小型リポソームビヒクルのカルシウム誘導融合、およびエーテル融合法が含まれ、これらはいずれも当技術分野で周知である。
【0066】
これらの送達系は、本発明の化合物および／またはペプチドのさらに大きな浸透を達成するように適合され得る。これにより、薬物動態特性および薬力学特性が改善され得る。送達系は、本発明の化合物またはペプチドが一定期間中に、好ましくは一定期間にわたって一定の放出速度で徐々に放出される持続放出系であり得る。送達系は、当技術分野で公知の方法によって調製される。持続放出系に含有されるペプチドの量は、組成物がどこに送達されるか、および放出の持続時間、ならびに治療またはケアされる状態、疾患および／または障害の種類に依存する。
【0067】
本発明の化合物は、経口投与によって投与され得る。化合物（および所望により他の成分）はまた、硬質もしくは軟質シェルゼラチンカプセルに封入されてもよいか、錠剤に圧縮されてもよいか、または対象の食事に直接組み込まれてもよい。経口治療的投与のために、化合物を賦形剤とともに組み込んでもよく、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハなどの形態で使用してもよい。化合物は、その不活性化を防止するために、何らかの材料を用いてコーティングまたは同時投与され得る。コーティングは、胃を通過する間に活性剤を保護し、回腸内で活性剤を放出するように構成され得る。
【0068】
本発明の方法は、インビボで活性剤（ＰＳＧ１）を発現するように構成された核酸構築物を投与することを伴い得る。本明細書で使用される場合、用語「ＰＳＧ１発現ベクター」は、細胞内のＰＳＧ１（またはＦｃタグ付きタンパク質などのその改変バージョン）の発現に適した染色体ベクター、非染色体ベクターおよび合成核酸ベクター（好適な一連の発現制御エレメントを含む核酸配列）を含む任意の好適なベクターであり得る。そのようなベクターの例には、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡとの組合せに由来するベクター、およびウイルス核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）ベクターが挙げられる。一実施形態では、ＰＳＧ１アミノ酸配列をコードする核酸分子は、例えば、線状発現エレメント（例えば、Ｓｙｋｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １２，３５５－５９（１９９７）に記載されているように）、圧縮核酸ベクター（例えば、米国特許第６，０７７，８３５号明細書および／または国際公開第００／７００８７号に記載されているように）またはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ １９／１８もしくはｐＵＣ １１８／１１９などのプラスミドベクターを含む裸のＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターに含まれる。そのような核酸ベクターおよびその使用法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，５８９，４６６号明細書および米国特許第５，９７３，９７２号明細書を参照）。一実施形態では、ＤＮＡは、発現制御配列を含む。
【0069】
一実施形態では、ベクターは、細菌細胞内のタンパク質の発現に適している。そのようなベクターの例には、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４，５５０３－５５０９）、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）などのような発現ベクターが挙げられる。一実施形態では、発現ベクターは、同じくまたは代替的に、酵母系内での発現に適したベクターであり得る。酵母系内での発現に適した任意のベクターが使用され得る。好適なベクターには、例えば、酵母アルファ因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨなどの構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターが含まれる（Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，１９８７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＧｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５３，５１６－５４４に概説されている）。他の実施形態では、発現ベクターは、バキュロウイルス感染昆虫細胞内での発現に適している。（Ｋｏｓｔ，Ｔ；ａｎｄ Ｃｏｎｄｒｅａｙ，Ｊ Ｐ，１９９９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０（５）：４２８－３３．）
【0070】
発現制御配列は、目的の遺伝子の転写、およびその後の様々な細胞系内のタンパク質の発現を制御および促進するように操作される。プラスミドは、目的の発現可能な遺伝子を、例えば、プロモーター、エンハンサー、選択マーカー、オペレーターなどの望ましいエレメントを含む発現制御配列（すなわち、発現カセット）と組み合わせる。本発明の発現ベクターでは、ＰＳＧ１アミノ酸配列をコードする核酸分子は、任意の好適なプロモーター、エンハンサー、選択マーカー、オペレーター、リプレッサータンパク質、ポリＡ終結配列および他の発現促進エレメントを含み得るか、またはそれらと会合し得る。
【0071】
本明細書で使用される「プロモーター」は、適切なシグナルが存在する場合、それが作動可能に連結されている、すなわち、タンパク質コードヌクレオチド配列の転写を可能にするように連結されているＤＮＡ配列の転写を導くのに十分なＤＮＡ配列を示す。タンパク質コードヌクレオチド配列の発現は、当技術分野で公知の任意のプロモーターエレメントまたはエンハンサーエレメントの制御下に置かれ得る。そのようなエレメントの例には、強力な発現プロモーター（例えば、ヒトＣＭＶ ＩＥプロモーター／エンハンサー、またはＣＭＶ主要ＩＥ（ＣＭＶ－ＭＩＥ）プロモーター、ならびにＲＳＶ、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＬ３－３、ＭＭＴＶ、ユビキチン（Ｕｂｉ）、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）およびＨＩＶ ＬＴＲプロモーター）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＣＭＶ－ＩＥ、ＣＭＶ－ＭＩＥ、ＲＳＶ、ＳＬ３－３、ＭＭＴＶ、Ｕｂｉ、ＵｂＣおよびＨＩＶ ＬＴＲからなる群から選択されるプロモーターを含む。
【0072】
本発明の核酸分子はまた、有効なポリ（Ａ）終結配列、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のプラスミド産物のための複製起点、選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子、および／または簡便なクローニング部位（例えば、ポリリンカー）に作動可能に連結され得る。核酸はまた、ＣＭＶ ＩＥなどの構成的プロモーターとは対照的な調節可能な誘導性プロモーター（発達的に調節される誘導性、抑制性）を含み得る（当業者であれば、そのような用語が、特定の条件下での遺伝子発現の程度の実際の記述語であることを認識するであろう）。
【0073】
選択マーカーは、当技術分野で周知のエレメントである。選択条件下では、適切な選択マーカーを発現する細胞のみが生存することができる。一般に、選択マーカー遺伝子は、細胞培養では、様々な抗生物質に対する耐性を付与するタンパク質、通常は酵素を発現する。他の選択条件では、蛍光タンパク質マーカーを発現する細胞が可視化され、したがって、選択可能である。実施形態には、ベータラクタマーゼ（ｂｌａ）（ベータラクタム抗生物質耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子、すなわち、ａｍｐＲ）、ｂｌｓ（ブラストサイジン耐性アセチルトランスフェラーゼ遺伝子）、ｂｓｄ（ブラストサイジン－Ｓデアミナーゼ耐性遺伝子）、ｂｓｒ（ブラストサイジン－Ｓ耐性遺伝子）、Ｓｈ ｂｌｅ（Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）耐性遺伝子）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）（ハイグロマイシン耐性遺伝子）、ｔｅｔＭ（テトラサイクリン耐性遺伝子、すなわち、ｔｅｔＲ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔ）（ネオマイシン耐性遺伝子、すなわち、ｎｅｏＲ）、ｋａｎＲ（カナマイシン耐性遺伝子）およびｐａｃ（ピューロマイシン耐性遺伝子）が含まれる。
【0074】
ある特定の実施形態では、ベクターは、ｂｌａ、ｂｌｓ、ｂｓｄ、ｂｓｒ、Ｓｈ ｂｌｅ、ｈｐｔ、ｔｅｔＲ、ｔｅｔＭ、ｎｐｔ、ｋａｎＲおよびｐａｃからなる群から選択される１つ以上の選択マーカー遺伝子を含む。他の実施形態では、ベクターは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、シアノ蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、増強シアノ蛍光タンパク質（ｅＣＦＰ）または黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）をコードする１つ以上の選択マーカー遺伝子を含む。
【0075】
本発明の目的のために、真核細胞内の遺伝子発現は、オペレーターによって制御される強力なプロモーターを使用して厳密に調節され得、オペレーターは、組換え「調節融合タンパク質」（ＲＦＰ）であり得る調節タンパク質によって調節される。ＲＦＰは、転写阻止ドメインと、その活性を調節するリガンド結合ドメインとから本質的になる。そのような発現系の例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第２００９０１６２９０１号明細書に記載されている。
【0076】
本明細書で使用される場合、「オペレーター」は、遺伝子がオペレーターへのＲＦＰの結合によって調節され得、その結果、目的の遺伝子、すなわち、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチドの転写を防止するかまたは可能にするように、遺伝子内または遺伝子の近くに導入されるＤＮＡ配列を示す。原核細胞およびバクテリオファージでは、いくつかのオペレーターがよく特性評価されている（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，ｅｄ．，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｄ．Ｖｏｌ ２ ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．１９９６）。これらには、限定するものではないが、ＬｅｘＡペプチドに結合する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＬｅｘＡ遺伝子のオペレーター領域、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＬａｄ遺伝子およびｔｒｐＲ遺伝子によってコードされるリプレッサータンパク質に結合するラクトースオペレーターおよびトリプトファンオペレーターが含まれる。これらには、ラムダｃＩおよびＰ２２ ａｒｃによってコードされるリプレッサータンパク質に結合するラムダＰＲ遺伝子およびファージＰ２２ ａｎｔ／ｍｎｔ遺伝子由来のバクテリオファージオペレーターも含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＦＰの転写阻止ドメインがＮｏｔＩなどの制限酵素である場合、オペレーターは、その酵素に対する認識配列である。当業者であれば、プロモーターによる転写を制御することができるように、オペレーターがプロモーターに隣接して、またはプロモーターの３’側に位置しなければならないことを認識するであろう。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９７２，６５０号明細書は、ｔｅｔＯ配列がＴＡＴＡボックスから特定の距離内にあることを指定している。特定の実施形態では、オペレーターは、プロモーターのすぐ下流に配置されることが好ましい。他の実施形態では、オペレーターは、プロモーターの１０塩基対以内に配置される。
【0077】
例示的な細胞発現系では、細胞は、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）を発現するように操作され、目的のタンパク質は、その活性がＴｅｔＲによって調節されるプロモーターの転写制御下に置かれる。２つのタンデムＴｅｔＲオペレーター（ｔｅｔＯ）が、ベクター内のＣＭＶ－ＭＩＥプロモーター／エンハンサーのすぐ下流に配置される。そのようなベクター内のＣＭＶ－ＭＩＥプロモーターによって導かれる、目的のタンパク質をコードする遺伝子の転写は、テトラサイクリンまたは他の何らかの好適な誘導因子（例えば、ドキシサイクリン）の非存在下でＴｅｔＲによって阻止され得る。誘導因子の存在下では、ＴｅｔＲタンパク質はｔｅｔＯに結合することができないため、転写後に目的のタンパク質の翻訳（発現）が起こる。（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，４３５，５５３号明細書を参照）。
【0078】
本発明のベクターはまた、Ｃｒｅ－ｌｏｘ組換えツールを使用して、宿主ゲノムへの目的の遺伝子の組込みを促進し得る。Ｃｒｅ－ｌｏｘ戦略は、少なくとも２つの成分、すなわち、１）Ｃｒｅリコンビナーゼ、２つのｌｏｘＰ部位間の組換えを触媒する酵素；および２）ｌｏｘＰ部位（例えば、組換えが起こる８ｂｐのコア配列と、２つの隣接する１３ｂｐの逆方向反復とからなる、配列ごとの特定の３４塩基対）または変異体ｌｏｘ部位を必要とする。（例えば、いずれも参照により本明細書に組み込まれるＡｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＰＮＡＳ ９２：１６０－４；Ｎａｇｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｇｅｎｅｓｉｓ ２６：９９－１０９；Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０（１９）：ｅ１０３；および米国特許第２０１００２９１６２６号明細書を参照）。別の組換え戦略では、コンセンサス配列ＦＲＴとともに、酵母由来ＦＬＰリコンビナーゼが利用され得る（例えば、Ｄｙｍｅｃｋｉ，Ｓ．Ｍ．，１９９６，ＰＮＡＳ ９３（１２）：６１９１－６１９６も参照）。
【0079】
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」は、組換え核酸配列を発現するのに適した任意の細胞を含む。細胞には、原核生物および真核生物の細胞（単細胞または複数細胞）、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種などの株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、Ｐ．パートリス（Ｐ．ｐａｒｔｏｒｉｓ）、Ｐ．メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）など）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ－９、ＳＦ－２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）など）、非ヒト動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、または細胞融合物、例えば、ハイブリドーマもしくはクアドローマなどが含まれる。ある特定の実施形態では、細胞は、ヒト、ウマ、イヌ、ネコ、スパイン（ｓｕｐｉｎｅ）、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウスの細胞である。他の実施形態では、細胞は、真核細胞であり、以下の細胞、すなわち、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ２１）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ－６０、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ－１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、ＭＭＴ細胞、腫瘍細胞、および前述の細胞に由来する細胞株から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）を含む。いくつかの実施形態では、細胞はＣＨＯ細胞である。他の実施形態では、細胞はＣＨＯ Ｋ１細胞である。一実施形態では、宿主細胞は細菌である。
【0080】
本明細書で使用される場合、用語「形質転換細胞」は、ＰＳＧ１タンパク質の発現をコードするヌクレオチド配列を含む、細胞ゲノムに安定に組み込まれた核酸を含む宿主細胞を指す。別の実施形態では、本発明は、ＰＳＧ１タンパク質の発現をコードする配列を含む、プラスミド、コスミド、ファージミドまたは線状発現エレメントなどの非組込み（すなわち、エピソーム）核酸を含む細胞を提供する。他の実施形態では、本発明は、本発明の発現ベクターを含むプラスミドによって宿主細胞を安定にトランスフェクトすることによって産生された細胞株を提供する。
【0081】
本明細書で使用される場合、細胞に適用される用語「操作された」は、組換えＤＮＡ技術を使用して遺伝子操作されたことを意味し、一般に、好適な発現ベクター（上記を参照）を合成し、次いで、発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトする工程（一般に安定なトランスフェクション）を伴う。
【0082】
本明細書で使用される場合、用語「異種発現」は、核酸を天然に有しない宿主細胞内の核酸の発現を指す。異種宿主への核酸の挿入は、組換えＤＮＡ技術によって行われる。
【0083】
本明細書で使用される場合、用語「神経幹細胞」は、神経系のニューロンおよびグリアを生成する自己複製多能性細胞を指す。それらは以下に記載されている：
Ｃｌａｒｋｅ，Ｄ ｅｔ ａｌ．（２０００）．“Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ａｄｕｌｔ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ”．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８８（５４７１）：１６６０－６３．Ｂｉｂｃｏｄｅ：２０００Ｓｃｉ．．．２８８．１６６０Ｃ．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．２８８．５４７１．１６６０．ＰＭＩＤ １０８３４８４８；
Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ（２０１４）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｔｅｎｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．ｅｄ．）．Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．：Ｓｉｎａｕｅｒ．ＩＳＢＮ ９７８－０８７８９３９７８７；および
Ｔｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）．“Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｄ ＣＮＳ ｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｃｕｌｔｕｒｅ”．Ｎａｔｕｒｅ．３４０（６２３３）：４７１－７３．Ｂｉｂｃｏｄｅ：１９８９ Ｎａｔｕｒ．３４０．．４７１Ｔ．ｄｏｉ：１０．１０３８／３４０４７１ａ０．ＰＭＩＤ ２７５５５１０．
Ｃｌａｒｋｅ，Ｄ ｅｔ ａｌ．（２０００）．“Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ａｄｕｌｔ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ”．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８８（５４７１）：１６６０－６３．Ｂｉｂｃｏｄｅ：２０００Ｓｃｉ．．．２８８．１６６０Ｃ．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．２８８．５４７１．１６６０．ＰＭＩＤ １０８３４８４８；
Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ（２０１４）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｔｅｎｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．ｅｄ．）．Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．：Ｓｉｎａｕｅｒ．ＩＳＢＮ ９７８－０８７８９３９７８７；および
Ｔｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）．“Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｄ ＣＮＳ ｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｃｕｌｔｕｒｅ”．Ｎａｔｕｒｅ．３４０（６２３３）：４７１－７３．Ｂｉｂｃｏｄｅ：１９８９ Ｎａｔｕｒ．３４０．．４７１Ｔ．ｄｏｉ：１０．１０３８／３４０４７１ａ０．ＰＭＩＤ ２７５５５１０．
【0084】
本明細書で使用される場合、神経変性の治療に関連して、用語「投与する」は、静脈内送達、経口送達、筋肉内送達、髄腔内送達および吸入送達を含む、活性剤をＣＮＳまたはＰＮＳに送達することができる任意の形態の送達を含むように解釈されるべきである。これらの送達手段を達成するための方法は、薬物送達の当業者に周知であり、以下を含む：
・ミニ浸透圧ポンプによって髄腔内送達される。（参照：Ｉｇｎａｃｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００５，１０５３：１２１－１３６）。
・シリンジまたはミニ浸透圧ポンプによる筋肉内への直接送達（Ａｚｚｏｕｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００５；１１（４）：４２９－３３）。
・腹腔内－全身投与のために－シリンジまたはミニ浸透圧ポンプによって腹膜に直接投与される（Ｋｉｅｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００４；１０（４）：４０２）。
・皮下－全身投与のために－シリンジによって皮膚の下に直接投与される（Ｒｅｉｎｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．１９９９；１５９（１）：２０４－１６）。
・脳室内－注射による、または浸透圧ポンプに取り付けられた小型カテーテルを使用した、脳室への直接投与（Ｓａｔｈａｓｉｖａｍ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ Ａｐｐ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ；３１（５）：４６７）。
・インプラント－活性物質を放出するインプラント（例えば、小さなシリコンインプラント）で調製され得るインプラントは、筋肉に配置され得るか、または脊髄に直接配置され得る（Ｋｉｅｒａｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｓｍｉｔｈ，２００４ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １２５（２）：４２７－３９）。
・ミニ浸透圧ポンプによって髄腔内送達される。（参照：Ｉｇｎａｃｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００５，１０５３：１２１－１３６）。
・シリンジまたはミニ浸透圧ポンプによる筋肉内への直接送達（Ａｚｚｏｕｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００５；１１（４）：４２９－３３）。
・腹腔内－全身投与のために－シリンジまたはミニ浸透圧ポンプによって腹膜に直接投与される（Ｋｉｅｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００４；１０（４）：４０２）。
・皮下－全身投与のために－シリンジによって皮膚の下に直接投与される（Ｒｅｉｎｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．１９９９；１５９（１）：２０４－１６）。
・脳室内－注射による、または浸透圧ポンプに取り付けられた小型カテーテルを使用した、脳室への直接投与（Ｓａｔｈａｓｉｖａｍ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ Ａｐｐ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ；３１（５）：４６７）。
・インプラント－活性物質を放出するインプラント（例えば、小さなシリコンインプラント）で調製され得るインプラントは、筋肉に配置され得るか、または脊髄に直接配置され得る（Ｋｉｅｒａｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｓｍｉｔｈ，２００４ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １２５（２）：４２７－３９）。
【0085】
改変タンパク質
一実施形態では、ＰＳＧ１タンパク質（タンパク質断片および変異体を含む）は、改変タンパク質であり得る。用語「改変タンパク質」は、用語「タンパク質の誘導体」と区別なく使用される。一実施形態では、用語「改変タンパク質」は、未改変タンパク質と比較して、以下の特性のうちの１つ以上を示すように改変されたタンパク質を意味する：血漿半減期を増加させる；タンパク質の親油性を増加させる；改変タンパク質の腎クリアランスを減少させる；改変タンパク質の活性を増加させ、タンパク質分解に対する改変タンパク質の耐性を増加させる（すなわち、哺乳動物および特にヒトの消化管プロテアーゼによる）。これらの特性を示すように本発明のタンパク質を改変する様々な方法が本明細書に開示され、それには、タンパク質を結合パートナー（例えば、アルブミン結合小分子、大型ポリマー、長寿命血漿タンパク質（ｌｏｎｇ ｌｉｆｅ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ）、または抗体もしくは抗体断片）とコンジュゲートすること、環化、Ｎ末端もしくはＣ末端または側鎖の付加、保護基、１つ以上のＬ－アミノ酸をＤ－異性体によって置換すること、アミノ酸改変、血漿タンパク質結合の増加、アルブミン結合の増加が含まれる。改変タンパク質には、限定するものではないが、本明細書で定義される１つ以上の基によって置換された、または結合パートナーとコンジュゲートされた、または環化されたタンパク質が含まれる。一般に、タンパク質は、動物ではインビボで半減期を増加させるように改変される。様々な改変方法が以下に提供される。
一実施形態では、ＰＳＧ１タンパク質（タンパク質断片および変異体を含む）は、改変タンパク質であり得る。用語「改変タンパク質」は、用語「タンパク質の誘導体」と区別なく使用される。一実施形態では、用語「改変タンパク質」は、未改変タンパク質と比較して、以下の特性のうちの１つ以上を示すように改変されたタンパク質を意味する：血漿半減期を増加させる；タンパク質の親油性を増加させる；改変タンパク質の腎クリアランスを減少させる；改変タンパク質の活性を増加させ、タンパク質分解に対する改変タンパク質の耐性を増加させる（すなわち、哺乳動物および特にヒトの消化管プロテアーゼによる）。これらの特性を示すように本発明のタンパク質を改変する様々な方法が本明細書に開示され、それには、タンパク質を結合パートナー（例えば、アルブミン結合小分子、大型ポリマー、長寿命血漿タンパク質（ｌｏｎｇ ｌｉｆｅ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ）、または抗体もしくは抗体断片）とコンジュゲートすること、環化、Ｎ末端もしくはＣ末端または側鎖の付加、保護基、１つ以上のＬ－アミノ酸をＤ－異性体によって置換すること、アミノ酸改変、血漿タンパク質結合の増加、アルブミン結合の増加が含まれる。改変タンパク質には、限定するものではないが、本明細書で定義される１つ以上の基によって置換された、または結合パートナーとコンジュゲートされた、または環化されたタンパク質が含まれる。一般に、タンパク質は、動物ではインビボで半減期を増加させるように改変される。様々な改変方法が以下に提供される。
【0086】
一実施形態では、改変は、細胞を透過する能力が増加した、本発明のタンパク質および／または組成物を提供する任意の改変であり得る。一実施形態では、改変は、本発明の組成物またはタンパク質の半減期を増加させる任意の改変であり得る。一実施形態では、改変は、組成物またはタンパク質の活性を増加させる任意の改変であり得る。一実施形態では、改変は、組成物またはタンパク質の選択性を増加させる任意の改変であり得る。
【0087】
一実施形態では、基は保護基である。保護基は、Ｎ末端保護基、Ｃ末端保護基または側鎖保護基であってよい。タンパク質は、これらの保護基のうちの１つ以上を有し得る。
【0088】
当業者であれば、アミノ酸をこれらの保護基と反応させるための好適な技術を認識している。これらの基は、当技術分野で公知の調製方法、例えば、米国特許第２０１４１２０１４１号明細書の段落［０１０４］～［０１０７］に概説されている方法によって付加され得る。基は、タンパク質上に残っていてもよいか、または除去されてもよい。保護基は、合成中に付加されてもよい。
【0089】
本発明の一実施形態では、タンパク質は、１つ以上の直鎖もしくは分岐鎖、長鎖もしくは短鎖、飽和もしくは不飽和から選択される基によって置換されていてもよいか、ヒドロキシル基、アミノ基、アミノアシル基、スルファート基もしくはスルフィド基によって置換されていてもよいか、または１～２９個の炭素原子を有する非置換であってよい。Ｎ－アシル誘導体は、酢酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、オクタン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、リノール酸、リノレン酸、リポ酸、オレイン酸、イソステアリン酸、エライジン酸、２－エチルヘキサン酸、ヤシ油脂肪酸、獣脂脂肪酸、硬化獣脂脂肪酸、パーム核脂肪酸、ラノリン脂肪酸または類似の酸に由来するアシル基を含む。これらは、置換されていてもよいか、または非置換であってもよい。置換される場合、それらは、ヒドロキシル基、または硫黄含有基、例えば、限定するものではないが、ＳＯ３Ｈ、ＳＨもしくはＳ－Ｓによって置換されることが好ましい。
【0090】
本発明の一実施形態では、タンパク質はＲ１－Ｘ－Ｒ２である。
【0091】
Ｒ１および／またはＲ２基は、タンパク質配列のアミノ末端（Ｎ末端）およびカルボキシル末端（Ｃ末端）にそれぞれ結合する。
【0092】
一実施形態では、タンパク質はＲ１－Ｘである。あるいは、タンパク質はＸ－Ｒ２である。
【0093】
好ましくは、Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１～４アルキル、アセチル、ベンゾイルまたはトリフルオロアセチルであり、
Ｘは、本発明のタンパク質であり、
Ｒ２は、ＯＨまたはＮＨ２である。
Ｘは、本発明のタンパク質であり、
Ｒ２は、ＯＨまたはＮＨ２である。
【0094】
一実施形態では、Ｒ１は、Ｈ、非環状の置換または非置換の脂肪族基、置換または非置換のアリシクリル（ａｌｉｃｙｃｌｙｌ）、置換または非置換のヘテロシクリル、置換または非置換のヘテロアリールアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のアラルキル、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、およびＲ５－ＣＯ－によって形成される群から選択され、式中、Ｒ５は、Ｈ、非環状の置換または非置換の脂肪族基、置換または非置換のアリシクリル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のアラルキル、置換または非置換のヘテロシクリル、および置換または非置換のヘテロアリールアルキルによって形成される群から選択され、
Ｒ２は、－ＮＲ３Ｒ４、－ＯＲ３および－ＳＲ３によって形成される群から選択され、式中、Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、非環状の置換または非置換の脂肪族基、置換または非置換のアリシクリル、置換または非置換のヘテロシクリル、置換または非置換のヘテロアリールアルキル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のアラルキルによって形成される群から独立して選択され、ただし、Ｒ１およびＲ２は、α－アミノ酸ではないことを条件とする。
Ｒ２は、－ＮＲ３Ｒ４、－ＯＲ３および－ＳＲ３によって形成される群から選択され、式中、Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、非環状の置換または非置換の脂肪族基、置換または非置換のアリシクリル、置換または非置換のヘテロシクリル、置換または非置換のヘテロアリールアルキル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のアラルキルによって形成される群から独立して選択され、ただし、Ｒ１およびＲ２は、α－アミノ酸ではないことを条件とする。
【0095】
別の好ましい実施形態によれば、Ｒ２は、－ＮＲ３Ｒ４、－ＯＲ３または－ＳＲ３であり、式中、Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、置換または非置換のＣ１～Ｃ２４アルキル、置換または非置換のＣ２～Ｃ２４アルケニル、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、置換または非置換のＣ２～Ｃ２４アルキニル、置換または非置換のＣ３～Ｃ２４シクロアルキル、置換または非置換のＣ５～Ｃ２４シクロアルケニル、置換または非置換のＣ８～Ｃ２４シクロアルキニル、置換または非置換のＣ６～Ｃ３０アリール、置換または非置換のＣ７～Ｃ２４アラルキル、３～１０員の置換または非置換のヘテロシクリル環、ならびに２～２４個の炭素原子および炭素以外の１～３個の原子の置換または非置換のヘテロアリールアルキルによって形成される群から独立して選択され、アルキル鎖は、１～６個の炭素原子のものである。場合により、Ｒ３およびＲ４は、飽和または不飽和の炭素－炭素結合によって結合され、窒素原子との環を形成することができる。さらに好ましくは、Ｒ２は、－ＮＲ３Ｒ４または－ＯＲ３であり、式中、Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、置換または非置換のＣ１～Ｃ２４アルキル、置換または非置換のＣ２～Ｃ２４アルケニル、置換または非置換のＣ２～Ｃ２４アルキニル、置換または非置換のＣ３～Ｃ１０シクロアルキル、置換または非置換のＣ６～Ｃ１５アリール、ならびに３～１０員の置換または非置換のヘテロシクリル、３～１０員の環および１～６個の炭素原子のアルキル鎖を有する置換または非置換のヘテロアリールアルキルによって形成される群から独立して選択される。さらに好ましくは、Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、メチル、エチル、ヘキシル、ドデシルまたはヘキサデシルによって形成される群から選択される。さらになお好ましくは、Ｒ３はＨであり、Ｒ４は、Ｈ、メチル、エチル、ヘキシル、ドデシルまたはヘキサデシルによって形成される群から選択される。さらになお好ましい実施形態によれば、Ｒ２は、－ＯＨおよび－ＮＨ２から選択される。
【0096】
本発明の別の実施形態によれば、Ｒ１は、Ｈ、アセチル、ラウロイル、ミリストイルまたはパルミトイルによって形成される群から選択され、Ｒ２は、－ＮＲ３Ｒ ４または－ＯＲ３であり、式中、Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、メチル、エチル、ヘキシル、ドデシルおよびヘキサデシルから独立して選択され、好ましくは、Ｒ２は、－ＯＨまたは－ＮＨ２である。さらに好ましくは、Ｒ１はアセチルまたはパルミトイルであり、Ｒ２は－ＮＨ２である。
【0097】
好ましい実施形態では、アシル（またはアセチル）基は、タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸のＮ末端に結合している。
【0098】
本発明の一実施形態では、タンパク質は、側鎖保護基を含むように改変される。側鎖保護基は、ベンジル基またはベンジル系基、ｔ－ブチル系基、ベンジルオキシ－カルボニル（Ｚ）基およびアリルオキシカルボニル（ａｌｌｏｃ）保護基を含む基のうちの１つ以上であり得る。側鎖保護基は、アキラルグリシンなどのアキラルアミノ酸に由来し得る。アキラルアミノ酸の使用は、得られたタンパク質を安定化するほか、本発明の合成経路を促進するのに役立つ。好ましくは、タンパク質は、改変されたＣ末端、好ましくはアミド化されたＣ末端をさらに含む。アキラル残基は、アルファ－アミノイソ酪酸（メチルアラニン）であり得る。使用される特定の側鎖保護基は、タンパク質の配列、および使用されるＮ末端保護基のタイプに依存することが理解される。
【0099】
本発明の一実施形態では、タンパク質は、１つ以上のポリエチレングリコールポリマーまたは他の化合物、例えば、分子量増加化合物にコンジュゲート、連結または融合される。分子量増加化合物は、得られたコンジュゲートの分子量を典型的には１０％～９０％、または２０％～５０％増加させる任意の化合物であり、２００～２０，０００、好ましくは５００～１０，０００の分子量を有し得る。分子量増加化合物は、ＰＥＧ、任意の水溶性（両親媒性または親水性）ポリマー部分、ＰＥＧのホモまたはコポリマー、ＰＥＧ（ｍＰＥＧ）およびポリオキシエチレングリセロール（ＰＯＧ）のモノメチル置換ポリマー、ポリアミノ酸、例えば、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、特にＬ配座のもの、薬理学的に不活性なタンパク質、例えば、アルブミン、ゼラチン、脂肪酸、多糖、脂質アミノ酸ならびにデキストランであり得る。ポリマー部分は、直鎖または分岐であってよく、５００～４００００ダルトン（ＤＡ）、５０００～１００００Ｄａ、１００００～５０００Ｄａの分子量を有してもよい。化合物は、任意の好適な細胞透過性化合物、例えば、ｔａｔタンパク質、ペネトラチン、ｐｅｐ－１であってよい。化合物は抗体分子であり得る。化合物は、親油性部分またはポリマー部分であり得る。
【0100】
親油性置換基およびポリマー置換基は、当技術分野で公知である。親油性置換基は、エステル、スルホニルエステル、チオエステル、アミドまたはスルホンアミドの一部を形成するアシル基、スルホニル基、Ｎ原子、Ｏ原子またはＳ原子を含む。親油性部分は、４～３０個のＣ原子、好ましくは８～１２個のＣ原子を有する炭化水素鎖を含み得る。親油性部分は、直鎖または分岐、飽和または不飽和であり得る。炭化水素鎖は、さらに置換されていてもよい。炭化水素鎖は、シクロアルカンまたはヘテロシクロアルカンであり得る。
【0101】
タンパク質は、Ｎ末端、Ｃ末端またはその両方で改変され得る。ポリマーまたは化合物は、アミノ基、カルボキシル基またはチオール基に好ましくは連結され、任意のアミノ酸残基の側鎖のＮ末端またはＣ末端によって連結されてもよい。ポリマーまたは化合物は、任意の好適な残基の側鎖にコンジュゲートされてもよい。
【0102】
ポリマーまたは化合物は、スペーサーを介してコンジュゲートされてもよい。スペーサーは、天然または非天然アミノ酸、コハク酸、リシル、グルタミル、アスパラギル、グリシル、ベータ－アラニル、ガンマ－アミノブタノイルであり得る。
【0103】
ポリマーまたは化合物は、エステル、スルホニルエステル、チオエステル、アミド、カルバマート、尿素、スルホンアミドを介してコンジュゲートされてもよい。
【0104】
当業者であれば、記載されたコンジュゲートを調製するための好適な手段を認識している。
【0105】
タンパク質は、例えば、それらの循環半減期を増加させるために、ポリマーへの共有結合コンジュゲーションによって化学的に改変され得る。そのようなポリマーをタンパク質に結合させる例示的なポリマーおよび方法は、例えば、米国特許第４，７６６，１０６号明細書、米国特許第４，１７９，３３７号明細書、米国特許第４，４９５，２８５号明細書および米国特許第４，６０９，５４６号明細書に例示されている。追加の例示的なポリマーには、ポリオキシエチル化ポリオール部分およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分が含まれる。
【0106】
本発明のタンパク質は、貯蔵安定性、薬物動態、ならびに／またはタンパク質の生物活性の任意の態様、例えば、効力、選択性および薬物相互作用などを操作するための１つ以上の改変に供され得る。タンパク質が供され得る化学的改変には、限定するものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ－ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ－（Ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール、コロミン酸または他の炭水化物系ポリマー、アミノ酸のポリマー、ならびにビオチン誘導体のうちの１つ以上のタンパク質へのコンジュゲーションが含まれる。Ｃｙｓ残基でのタンパク質のＰＥＧコンジュゲーションは、例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．＆Ｋａｔｒｅ，Ｎ．Ｖ．（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８，３４３およびＫｏｇａｎ，Ｔ．Ｐ．（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍ．２２，２４１７に開示されている。
【0107】
改変タンパク質はまた、１つ以上の残基が改変された配列（すなわち、リン酸化、硫酸化、アシル化、アミド化、ＰＥＧ化などによって）、および親配列に対して１つ以上の改変残基を含む変異体を含み得る。アミノ酸配列はまた、限定するものではないが、放射性同位体標識、蛍光標識および酵素標識を含む、検出可能なシグナルを直接的または間接的に提供することができる標識によって改変され得る。蛍光標識には、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ、ＢＯＤＩＰＹ、フルオレセイン（例えば、ＦｌｕｏｒＸ、ＤＴＡＦおよびＦＩＴＣ）、ローダミン（例えば、ＴＲＩＴＣ）、オーラミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＡＭＣＡブルーおよびＬｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗが含まれる。好ましい同位体標識には、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉおよび２８６Ｒｅが含まれる。好ましい酵素標識には、ペルオキシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、β－Ｄ－グルコシダーゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼが含まれる（例えば、米国特許第３，６５４，０９０号明細書、米国特許第３，８５０，７５２号明細書および米国特許第４，０１６，０４３号明細書を参照）。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアナート、グルタルアルデヒドなどのような架橋分子との反応によってコンジュゲートされ得る。酵素標識は、視覚的に検出され得るか、または熱量測定技術、分光光度技術、蛍光分光光度技術、電流測定技術もしくは気体定量技術によって測定され得る。アビジン／ビオチン、Ｔｙｒａｍｉｄｅ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＳＡ（商標））などの他の標識系は、当技術分野で公知であり、市販されている（例えば、ＡＢＣ ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆ．；ＮＥＮ（登録商標）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．を参照）。
【0108】
一実施形態では、タンパク質、変異体および／または組成物は、薬物性能能力を増加させるように改変される。一実施形態では、タンパク質、変異体および／または組成物は、安定性、透過性を増加させ、効力を維持し、毒性を回避し、および／または半減期を増加させるように改変される。改変は、上記の通りであり得る。例えば、改変は、Ｎ末端およびＣ末端を保護するためのものであり得、改変アミノ酸、環化、アミノ酸の置換、および／または巨大分子もしくは大型ポリマーもしくは長寿命血漿タンパク質へのコンジュゲーションであり得る。半減期を延長する戦略は、Ｓｔｒｏｈｌ，ｅｔ ａｌ（ＢｉｏＤｒｕｇｓ，２０１５）、Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ，ｅｔ ａｌ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２０１３）、Ｐｏｄｕｓｔ，ＶＮ，ｅｔ ａｌ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２０１３）、Ｚｈａｎｇ，Ｌ ｅｔ ａｌ（Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１２）、Ｇａｂｅｒｃ－Ｐｏｒｅｋａｒ，Ｖ，ｅｔ ａｌ（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ．２００８）によって記載されている通りであり得る。例には、ＰＥＧ化、脂質化（タンパク質側鎖への脂肪酸の共有結合）、Ｆｃドメインおよびヒト血清アルブミンへの融合、親水性アミノ酸ポリマー、例えば、ＸＴＥＮもしくはＰＡＳとの融合、ならびに／または半減期延長タンパク質との融合の使用が挙げられる。
【0109】
単数または複数のタンパク質は、タンパク質分解性が強化された環境内、例えば、血液中または消化管内にある際にタンパク質分解切断を受けやすい弱い部位をそれらの配列内に含む可能性がある。一実施形態では、タンパク質、変異体および／または組成物は、単数または複数の未改変タンパク質と比較して、タンパク質、変異体および／もしくは組成物がタンパク質分解破壊／切断を受けないか、またはタンパク質、変異体および／もしくは組成物のタンパク質分解破壊／切断の量が減少するように、１つ以上の弱い部位の改変を含む。したがって、タンパク質は、哺乳動物消化管プロテアーゼに対するタンパク質分解に対する改変タンパク質の耐性を増加させるように改変され得る。好適な改変は、Ｄｉａｏ ｅｔ ａｌ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ５２．１０（２０１３）：８５５－８６８）に記載されている。
【0110】
タンパク質のインビボ半減期を延長するためのタンパク質の改変は、文献、例えば、以下に記載されている：
Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐｌａｓｍａ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｔｉｍｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇｓ．Ｗｅｒｌｅ Ｍ，Ｂｅｒｎｋｏｐ－Ｓｃｈｎｕｒｃｈ Ａ．Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ．２００６ Ｊｕｎ；３０（４）：３５１－６７．
Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐｌａｓｍａ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｔｉｍｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇｓ．Ｗｅｒｌｅ Ｍ，Ｂｅｒｎｋｏｐ－Ｓｃｈｎｕｒｃｈ Ａ．Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ．２００６ Ｊｕｎ；３０（４）：３５１－６７．
【0111】
長時間作用性のタンパク質およびタンパク質薬物の明白な利点のために、そのような化合物の血漿半減期時間を延長するための戦略は、極めて需要に応じたものである。短い血漿半減期時間は、一般に、急速な腎クリアランスと、全身循環中に起こる酵素分解とに起因する。タンパク質／タンパク質の改変は、血漿半減期時間の延長をもたらし得る。ソマトスタチンの全アミノ酸量を減少させ、Ｌ：－類似体アミノ酸をＤ：－アミノ酸によって置換することにより、誘導体オクトレオチドの血漿半減期時間は、ソマトスタチンのわずか数分と比較して１．５時間であった。ＩＮＦ－アルファ－２ｂのＰＥＧ（２．４０Ｋ）コンジュゲートは、天然タンパク質と比較して３３０倍長い血漿半減期時間を示した。この概説の目的は、Ｎ末端およびＣ末端の改変、またはＰＥＧ化などの血漿半減期時間を延長するための可能な戦略の概要、ならびに薬物改変の有効性を評価する方法を提供することであった。さらに、全身循環中のタンパク質およびタンパク質薬物の酵素的切断を予測するために、ヒトの血液、肝臓および腎臓の最も重要なタンパク質分解酵素、ならびにそれらの切断特異性および阻害剤に関する基本データが提供される。
【0112】
Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡＤＭＥ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｌｉ Ｄｉ ＡＡＰＳ Ｊ．２０１５ Ｊａｎ；１７（１）：１３４－１４３．
【0113】
タンパク質分解からタンパク質を安定化するための戦略
構造改変を介してタンパク質の安定性を増強するために、多くの手法が利用可能である。いくつかの手法は、安定性を改善するだけでなく、他のＡＤＭＥ特性も増強し、例えば、環化は、安定性および透過性を増加させることができ、巨大分子とのコンジュゲーションは、安定性を改善することができ、腎クリアランスを減少させることができる。タンパク質の安定性およびＡＤＭＥ特性を改善しながら、効力を維持し、毒性を回避することが重要である。
構造改変を介してタンパク質の安定性を増強するために、多くの手法が利用可能である。いくつかの手法は、安定性を改善するだけでなく、他のＡＤＭＥ特性も増強し、例えば、環化は、安定性および透過性を増加させることができ、巨大分子とのコンジュゲーションは、安定性を改善することができ、腎クリアランスを減少させることができる。タンパク質の安定性およびＡＤＭＥ特性を改善しながら、効力を維持し、毒性を回避することが重要である。
【0114】
・Ｎ末端およびＣ末端の保護
血液／血漿中、肝臓または腎臓内のいくつかのタンパク質分解酵素には、エキソペプチダーゼ、アミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼがあり、それらは、Ｎ末端およびＣ末端からタンパク質配列を分解する。Ｎ末端または／およびＣ末端の改変は、多くの場合、タンパク質安定性を改善することができる。多くの例では、Ｎ－アセチル化およびＣ－アミド化が、タンパク質分解に対する耐性を増加させることが報告されている。
血液／血漿中、肝臓または腎臓内のいくつかのタンパク質分解酵素には、エキソペプチダーゼ、アミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼがあり、それらは、Ｎ末端およびＣ末端からタンパク質配列を分解する。Ｎ末端または／およびＣ末端の改変は、多くの場合、タンパク質安定性を改善することができる。多くの例では、Ｎ－アセチル化およびＣ－アミド化が、タンパク質分解に対する耐性を増加させることが報告されている。
【0115】
・Ｄ－アミノ酸によるＬ－アミノ酸の置換
天然Ｌ－アミノ酸を非天然Ｄ－アミノ酸によって置換すると、タンパク質分解酵素の基質認識および結合親和性が低下し、安定性が増加する。一例にはバソプレシンがあり、バソプレシンは、Ｌ－Ａｒｇを含有し、ヒトでは１０～３５分の半減期を有する。Ｄ－Ａｒｇ類似体、デスモプレシンは、健康なヒトボランティアでは３．７時間の半減期を有する。癌関連プロテアーゼウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）の二環式タンパク質阻害剤の試験では、特定のグリシンをＤ－セリンによって置換すると、マウス血漿中の効力が１．８倍改善するだけでなく、安定性も４倍増加する。
天然Ｌ－アミノ酸を非天然Ｄ－アミノ酸によって置換すると、タンパク質分解酵素の基質認識および結合親和性が低下し、安定性が増加する。一例にはバソプレシンがあり、バソプレシンは、Ｌ－Ａｒｇを含有し、ヒトでは１０～３５分の半減期を有する。Ｄ－Ａｒｇ類似体、デスモプレシンは、健康なヒトボランティアでは３．７時間の半減期を有する。癌関連プロテアーゼウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）の二環式タンパク質阻害剤の試験では、特定のグリシンをＤ－セリンによって置換すると、マウス血漿中の効力が１．８倍改善するだけでなく、安定性も４倍増加する。
【0116】
・アミノ酸の改変
天然アミノ酸の改変は、立体障害の導入、または酵素認識の妨害によって、タンパク質の安定性を改善することができる。例えば、ゴナドトロピン放出ホルモンは非常に短い半減期（分）を有するが、一方のＧｌｙがｔ－ブチル－Ｄ－Ｓｅｒによって置換され、他方のＧｌｙがエチルアミドによって置換されているブセレリンは、ヒトでは、はるかに長い半減期を有する。
天然アミノ酸の改変は、立体障害の導入、または酵素認識の妨害によって、タンパク質の安定性を改善することができる。例えば、ゴナドトロピン放出ホルモンは非常に短い半減期（分）を有するが、一方のＧｌｙがｔ－ブチル－Ｄ－Ｓｅｒによって置換され、他方のＧｌｙがエチルアミドによって置換されているブセレリンは、ヒトでは、はるかに長い半減期を有する。
【0117】
・環化
環化は、配座制約を導入し、タンパク質の柔軟性を低下させ、安定性および透過性を増加させる。官能基に応じて、タンパク質は、頭部から尾部、頭部／尾部から側鎖、または側鎖から側鎖に環化され得る。環化は、一般に、ラクタム化、ラクトン化およびスルフィド系架橋によって達成される。ジスルフィド架橋は、効力、選択性および安定性を改善することができるフォールディングおよび配座制約をもたらす。いくつかのジスルフィド結合に富むタンパク質、例えば、リナクロチド、レピルジンおよびジコノチドが市販されているか、または前臨床開発中もしくは臨床開発中である。
環化は、配座制約を導入し、タンパク質の柔軟性を低下させ、安定性および透過性を増加させる。官能基に応じて、タンパク質は、頭部から尾部、頭部／尾部から側鎖、または側鎖から側鎖に環化され得る。環化は、一般に、ラクタム化、ラクトン化およびスルフィド系架橋によって達成される。ジスルフィド架橋は、効力、選択性および安定性を改善することができるフォールディングおよび配座制約をもたらす。いくつかのジスルフィド結合に富むタンパク質、例えば、リナクロチド、レピルジンおよびジコノチドが市販されているか、または前臨床開発中もしくは臨床開発中である。
【0118】
・巨大分子へのコンジュゲーション
巨大分子（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン）へのコンジュゲーションは、タンパク質の安定性を改善し、腎クリアランスを減少させるための有効な戦略である。
巨大分子（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン）へのコンジュゲーションは、タンパク質の安定性を改善し、腎クリアランスを減少させるための有効な戦略である。
【0119】
腎クリアランス
多くのタンパク質は、有望なインビトロ薬理活性を示すが、非常に短いインビボ半減期（分）のためにインビボでの有効性を示すことができない。タンパク質の急速なクリアランスおよび短い半減期は、それらを良好な薬物に開発することを妨げる。全身循環からのタンパク質の急速なクリアランスの主な原因は、酵素的タンパク質分解または／および腎クリアランスである。糸球体は約８ｎｍの孔径を有し、ＭＷ＜２～２５ｋＤａの親水性タンパク質は、腎臓の糸球体を通る急速な濾過を受けやすい。タンパク質は尿細管を介して容易に再吸収されないため、高い腎クリアランスおよび短い半減期を有することが多い。タンパク質クリアランスの他の小規模な経路には、エンドサイトーシス、ならびにプロテアソームおよび肝臓による分解がある。動物モデルにおける全身クリアランスと腎クリアランスとの比較は、腎クリアランスが主要な排出経路である可能性が高いかどうかに関して有用な情報を提供する。
多くのタンパク質は、有望なインビトロ薬理活性を示すが、非常に短いインビボ半減期（分）のためにインビボでの有効性を示すことができない。タンパク質の急速なクリアランスおよび短い半減期は、それらを良好な薬物に開発することを妨げる。全身循環からのタンパク質の急速なクリアランスの主な原因は、酵素的タンパク質分解または／および腎クリアランスである。糸球体は約８ｎｍの孔径を有し、ＭＷ＜２～２５ｋＤａの親水性タンパク質は、腎臓の糸球体を通る急速な濾過を受けやすい。タンパク質は尿細管を介して容易に再吸収されないため、高い腎クリアランスおよび短い半減期を有することが多い。タンパク質クリアランスの他の小規模な経路には、エンドサイトーシス、ならびにプロテアソームおよび肝臓による分解がある。動物モデルにおける全身クリアランスと腎クリアランスとの比較は、腎クリアランスが主要な排出経路である可能性が高いかどうかに関して有用な情報を提供する。
【0120】
腎機能障害患者の場合、腎機能障害患者に対する不適切な投与は毒性を引き起こすかまたは治療を無効にする可能性があるため、タンパク質薬物の蓄積および薬物曝露の増大を回避するために用量調整が必要となる場合がある。タンパク質腎クリアランスを減少させ、半減期を延長するためのいくつかの戦略が開発されている。これらについては、次に概説する。
【0121】
・血漿タンパク質結合の増加
タンパク質の腎クリアランスは、それらが膜タンパク質または血清タンパク質に結合すると減少する。一例には、環状タンパク質薬物であるオクトレオチドがあり、オクトレオチドは、内分泌腫瘍の治療薬であり、リポタンパク質への結合に起因して、ヒトでは約１００分の半減期を有する（非結合画分０．６５）。
タンパク質の腎クリアランスは、それらが膜タンパク質または血清タンパク質に結合すると減少する。一例には、環状タンパク質薬物であるオクトレオチドがあり、オクトレオチドは、内分泌腫瘍の治療薬であり、リポタンパク質への結合に起因して、ヒトでは約１００分の半減期を有する（非結合画分０．６５）。
【0122】
・アルブミン結合小分子への共有結合
アルブミン結合小分子をタンパク質に共有結合させると、高度に結合した小分子を介してアルブミンと間接的に相互作用することによって、糸球体濾過を減少させ、タンパク質分解安定性を改善し、半減期を延長することができる。
アルブミン結合小分子をタンパク質に共有結合させると、高度に結合した小分子を介してアルブミンと間接的に相互作用することによって、糸球体濾過を減少させ、タンパク質分解安定性を改善し、半減期を延長することができる。
【0123】
・大型ポリマーへのコンジュゲーション
大型の合成または天然のポリマーまたは炭水化物へのタンパク質のコンジュゲーションは、それらの分子量および流体力学的体積を増加させ、したがって、それらの腎クリアランスを減少させることができる。タンパク質コンジュゲーションに使用される一般的なポリマーは、ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）およびヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である。
大型の合成または天然のポリマーまたは炭水化物へのタンパク質のコンジュゲーションは、それらの分子量および流体力学的体積を増加させ、したがって、それらの腎クリアランスを減少させることができる。タンパク質コンジュゲーションに使用される一般的なポリマーは、ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）およびヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である。
【0124】
・長寿命血漿タンパク質への融合
アルブミンおよび免疫グロブリン（ＩｇＧ）断片などの血漿タンパク質は、ヒトでは１９～２１日という長い半減期を有する。高いＭＷ（６７～１５０ｋＤａ）のために、これらのタンパク質では腎クリアランスが低く、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのそれらの結合は、血管上皮による飲作用を介した排出を減少させる。アルブミンまたはＩｇＧ断片へのタンパク質の共有結合は、腎クリアランスを減少させ、半減期を延長することができる。
アルブミンおよび免疫グロブリン（ＩｇＧ）断片などの血漿タンパク質は、ヒトでは１９～２１日という長い半減期を有する。高いＭＷ（６７～１５０ｋＤａ）のために、これらのタンパク質では腎クリアランスが低く、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのそれらの結合は、血管上皮による飲作用を介した排出を減少させる。アルブミンまたはＩｇＧ断片へのタンパク質の共有結合は、腎クリアランスを減少させ、半減期を延長することができる。
【0125】
Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｈａｌｆ－Ｌｉｆｅ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ａｓ ａ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ Ｍａｋｅ Ｂｉｏｂｅｔｔｅｒｓ Ｗｉｌｌｉａｍ Ｒ．Ｓｔｒｏｈｌ ＢｉｏＤｒｕｇｓ．２０１５；２９（４）：２１５－２３９．
【0126】
Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ，Ｍ，Ｂｉｎｄｅｒ，Ｕ，Ｂｏｒｇｅｒ，Ｃ ｅｔ ａｌ．ＰＡＳＹｌａｔｉｏｎ：ａ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２０１３；２６（８）：４８９－５０１．
【0127】
Ｐｏｄｕｓｔ，ＶＮ，Ｓｉｍ，ＢＣ，Ｋｏｔｈａｒｉ，Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｖｉｖｏ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｖｉａ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｔｏ ＸＴＥＮ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２０１３；２６（１１）：７４３－５３．
【0128】
Ｚｈａｎｇ，Ｌ，Ｂｕｌａｊ，Ｇ．Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｔｏ Ｄｒｕｇ Ｌｅａｄｓ ｂｙ Ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１２；１９（１１）：１６０２－１８．
【0129】
Ｇａｂｅｒｃ－Ｐｏｒｅｋａｒ，Ｖ，Ｚｏｒｅ，Ｉ，Ｐｏｄｏｂｎｉｋ，Ｂ ｅｔ ａｌ．Ｏｂｓｔａｃｌｅｓ ａｎｄ ｐｉｔｆａｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ．２００８；１１（２）：２４２－５０．
【0130】
Ｄｒ Ｒｏｎａｌｄ Ｖ．Ｓｗａｎｓｏｎ－Ｌｏｎｇ ｌｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｆｒｏｍ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｌｄ ｏｎ ｌｉｎｅ．
Ｓｐｒｉｎｇ ２０１４
Ｓｐｒｉｎｇ ２０１４
【0131】
ＰＥＧ化
目的の分子への親水性ポリマーポリエチレングリコールの長鎖の結合、ＰＥＧ化は、元々、免疫系による外来タンパク質の認識を防止し、それによって、治療薬としてのそれらの有用性を可能にするための改変として着想された。未改変薬物に対する抗体は、形成されると、タンパク質薬物を迅速に中和し、除去する可能性がある。予想外にも、ＰＥＧ化は、抗薬物抗体の非存在下であっても、タンパク質の薬物動態を改善した１。単純に薬物分子をさらに大きくすることによって、ＰＥＧ化は、腎臓によってさらにゆっくりと濾過される薬物をもたらした。サイズまたは流体力学的半径の増加が腎クリアランスの減少および半減期の増加をもたらしたという経験的観察は、タンパク質およびタンパク質薬物のＰＥＧ化に関する主要な理論的根拠となった。ＰＥＧ化は、タンパク質またはタンパク質をさらに水溶性にし、タンパク質分解酵素による分解からそれらを保護することを含む、分子に対する様々な効果を有することができる。ＰＥＧ化はまた、同族細胞受容体への治療用タンパク質の結合に影響を及ぼし、通常、親和性を低下させ得る。ＰＥＧポリマーのサイズ、構造および結合様式の変化は、結合した薬物の生物学的活性に影響を及ぼし得る。
目的の分子への親水性ポリマーポリエチレングリコールの長鎖の結合、ＰＥＧ化は、元々、免疫系による外来タンパク質の認識を防止し、それによって、治療薬としてのそれらの有用性を可能にするための改変として着想された。未改変薬物に対する抗体は、形成されると、タンパク質薬物を迅速に中和し、除去する可能性がある。予想外にも、ＰＥＧ化は、抗薬物抗体の非存在下であっても、タンパク質の薬物動態を改善した１。単純に薬物分子をさらに大きくすることによって、ＰＥＧ化は、腎臓によってさらにゆっくりと濾過される薬物をもたらした。サイズまたは流体力学的半径の増加が腎クリアランスの減少および半減期の増加をもたらしたという経験的観察は、タンパク質およびタンパク質薬物のＰＥＧ化に関する主要な理論的根拠となった。ＰＥＧ化は、タンパク質またはタンパク質をさらに水溶性にし、タンパク質分解酵素による分解からそれらを保護することを含む、分子に対する様々な効果を有することができる。ＰＥＧ化はまた、同族細胞受容体への治療用タンパク質の結合に影響を及ぼし、通常、親和性を低下させ得る。ＰＥＧポリマーのサイズ、構造および結合様式の変化は、結合した薬物の生物学的活性に影響を及ぼし得る。
【0132】
第１世代のＰＥＧ化方法には、課題が満載であった。しかし、ＰＥＧ化の化学的性質は極めて単純である。このプロセスは、タンパク質またはタンパク質の反応性側鎖へのポリエチレングリコール鎖の共有結合を伴う。例えば、ＰＥＧは、タンパク質またはタンパク質の表面上のリジンの－アミノ基に容易に結合する２。反応はｐＨ依存性である。高いｐＨ（８．０以上）では、リジン側鎖アミノ基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドを介してＰＥＧに共有結合している。この方法は、典型的には、単一の別個の生成物ではなく、タンパク質上の様々な部位に結合した様々な数のＰＥＧ鎖を含有する生成物のファミリーをもたらす３。最初に承認されたＰＥＧ化医薬品は、重症複合免疫不全のための酵素補充療法としてのＰｅｇａｄｅｍａｓｅ ｂｏｖｉｎｅ（ＰＥＧ化ウシアデノシンデアミダーゼ）、および急性リンパ芽球性白血病の治療のためのＰｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ（ＰＥＧ化アスパラギナーゼ）であった１。これらの薬物は、様々なＰＥＧ化種の複雑な混合物であったが、血清半減期の増加、およびタンパク質の免疫原性の低下を含め、天然酵素よりも治療のための改善された特性を有する。ＰＥＧの固有の多分散性のために、品質およびバッチ間再現性は困難であった。この制約にもかかわらず、多数のモノ－ＰＥＧ化位置異性体の異種集団である２つのＰＥＧ化インターフェロン（ペグインターフェロンアルファ－２ｂおよびペグインターフェロンアルファ－２ａ）が、Ｃ型肝炎の治療のためにＦＤＡによって承認されている。これらの薬物は、それぞれ２００１年および２００２年に上市された。
【0133】
基本的なＰＥＧ化技術に対して様々な改良および改変が施されている。第２世代のＰＥＧ化プロセスは、ＰＥＧ結合のための分岐構造および代替化学の使用を導入した。特に、マレイミドまたはヨードアセトアミドなどのシステイン反応性基を有するＰＥＧは、タンパク質またはタンパク質内の単一の残基へのＰＥＧ化の標的化を可能にし、最終生成物の不均一性を低下させるが、ＰＥＧ自体の多分散性に起因して最終生成物の不均一性を排除しない。
【0134】
ＰＥＧ化の元々の理論的根拠は免疫原性を低下させることであったが、それにもかかわらず、免疫原性ＰＥＧ化タンパク質のいくつかの例が存在している。一例には、痛風患者の血漿尿酸レベルを低下させる酵素であるＰＥＧ化尿酸オキシダーゼがある。臨床試験では、比較的高い割合の痛風患者が治療に応答せず、ＰＥＧに特異的であるがウリカーゼタンパク質には特異的でない抗体を発現した２。一般に非免疫原性であるとも考えられるＰＥＧ化リポソームは、いくつかの試験では、免疫原性であることが見出されている。ＰＥＧ化リポソームは、強力な抗ＰＥＧ免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）応答を誘発する。さらに、ＰＥＧ－グルクロニダーゼの複数回の注射は、特異的抗ＰＥＧ ＩｇＭ抗体の生成を誘発し、したがって、身体からのＰＥＧ改変タンパク質のクリアランスを加速することが示された。
【0135】
ＰＥＧを改変因子として使用することの主な潜在的欠点は、ＰＥＧが非生分解性であることである。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、注射用、局所用、直腸用および経鼻用製剤を含む医薬品に対するビヒクルとしてのＰＥＧの使用を承認している。ＰＥＧは、毒性をほとんど示さず、腎臓によって（ＰＥＧ＜３０ｋＤａの場合）、または糞便中に（ＰＥＧ＞２０ｋＤａの場合）体内から無傷で排除される１。動物にいくつかのＰＥＧ化タンパク質を反復投与すると、腎尿細管細胞空胞化が観察された。近年、大型（≧４０ｋＤａ）ＰＥＧとコンジュゲートしたタンパク質を用いた毒性試験では、脈絡叢上皮細胞の空胞化も見られている。脈絡叢上皮細胞は、脳脊髄液を産生し、血液ＣＳＦバリアを形成する。細胞空胞化の長期的な負の結果は不明であるが、いくつかの潜在的な治療法にとって望ましくない結果を表す。１つの可能な代替案は、ＰＥＧに代えた生分解性ポリマーの置換であろう。ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）などのポリマーが可能な代替物である。ＨＥＳは、非毒性かつ生分解性であり、血液増量剤として使用される。ＨＥＳ化のプロセスは、タンパク質の流体力学的半径を増加させることによって腎クリアランスを減少させるＰＥＧ化と同様に機能するが、生分解性に起因して、蓄積する傾向が低くなる可能性がある。しかし、ＨＥＳおよび他の提案されている生分解性ポリマーＰＥＧ代替物は、ＰＥＧのように多分散性であり、最終生成物および代謝産物の特性評価を困難にする。両方の懸念を軽減する１つの新たな解決策は、ポリマー成分として定義されたポリタンパク質を使用することである。この手法については、本論説で後述する。
【0136】
脂質化
タンパク質半減期を増加させるための第２の主要な化学的改変方法は、タンパク質側鎖への脂肪酸の共有結合を伴う脂質化である４。インスリンの半減期を延長するための方法として最初に考えられ開発された脂質化は、ＰＥＧ化と同じ、共通の半減期延長の基本的機構、すなわち、流体力学的半径を増加させて腎濾過を減少させることを共有する。しかし、脂質部分自体は比較的小さく、その効果は、循環アルブミンへの脂質部分の非共有結合を介して間接的に媒介される。ヒト血清（３５～５０ｇ／Ｌ）中の大型（６７ｋＤａ）で非常に豊富なタンパク質であるアルブミンは、脂質を含む分子を全身に輸送するように天然に機能する。血漿タンパク質への結合はまた、やはりＰＥＧ化で見られるものと同様に、立体障害を介してペプチダーゼによる攻撃からタンパク質を保護することができる。脂質化の１つの結果は、それがタンパク質の水溶性を低下させるが、タンパク質と脂肪酸との間のリンカーの操作により、例えば、リンカー内のグルタマートまたはミニＰＥＧの使用によってこれを調節することができることである。リンカーの操作、および脂質部分の変化は自己凝集に影響を及ぼし得、自己凝集は、アルブミンとは無関係に、体内分布を遅くすることによって半減期の増加に寄与し得る５。
タンパク質半減期を増加させるための第２の主要な化学的改変方法は、タンパク質側鎖への脂肪酸の共有結合を伴う脂質化である４。インスリンの半減期を延長するための方法として最初に考えられ開発された脂質化は、ＰＥＧ化と同じ、共通の半減期延長の基本的機構、すなわち、流体力学的半径を増加させて腎濾過を減少させることを共有する。しかし、脂質部分自体は比較的小さく、その効果は、循環アルブミンへの脂質部分の非共有結合を介して間接的に媒介される。ヒト血清（３５～５０ｇ／Ｌ）中の大型（６７ｋＤａ）で非常に豊富なタンパク質であるアルブミンは、脂質を含む分子を全身に輸送するように天然に機能する。血漿タンパク質への結合はまた、やはりＰＥＧ化で見られるものと同様に、立体障害を介してペプチダーゼによる攻撃からタンパク質を保護することができる。脂質化の１つの結果は、それがタンパク質の水溶性を低下させるが、タンパク質と脂肪酸との間のリンカーの操作により、例えば、リンカー内のグルタマートまたはミニＰＥＧの使用によってこれを調節することができることである。リンカーの操作、および脂質部分の変化は自己凝集に影響を及ぼし得、自己凝集は、アルブミンとは無関係に、体内分布を遅くすることによって半減期の増加に寄与し得る５。
【0137】
インスリンを用いた先駆的研究に続いて６、様々なタンパク質、特に、糖尿病領域では、とりわけヒトグルカゴン様タンパク質－１（ＧＬＰ－１）類似体、グルコース依存性インスリン分泌性ポリタンパク質およびＧＬＰ－１Ｒ／グルカゴン受容体コアゴニストを含むタンパク質の脂質化が研究されてきた。２つの脂質化タンパク質薬物が、現在、ヒトに対する使用についてＦＤＡによって承認されている。これらはいずれも持続型抗糖尿病薬、ＧＬＰ－１類似体リラグルチドおよびインスリンデテミルである。
【0138】
ＰＥＧ化と脂質化との間の潜在的に薬理学的に重要な差は、治療活性タンパク質がはるかに大きなＰＥＧに共有結合しているのに対して、それよりも小さな脂肪アシル－タンパク質コンジュゲートが、平衡状態で存在するさらに大きな結合形態および非結合形態のアルブミンと非共有結合していることである。これにより、異なる薬理をもたらし得る体内分布の差がもたらされ得、これは、異なる組織に局在する受容体へのアクセスが異なる効果を誘発し得るためである。場合によっては、さらに制限された体内分布が望ましい場合があるが、他の場合では、さらに大きな組織浸透が重要であり得る。予測可能な切断速度を有する放出可能なＰＥＧコンジュゲートが利用される、この問題に対処するＰＥＧ手法の興味深い変形例が、Ｓａｎｔｉ ｅｔ ａｌによって開発されている７。
【0139】
ＰＥＧ化および脂質化はいずれも、立体障害を介して遮蔽することによってプロテアーゼおよびペプチダーゼに対する保護を付与し、直接的または間接的に、流体力学的半径の増加を介して循環半減期を延長する。両方法は、化学的コンジュゲーションを利用し、生物学的または合成的に生成されるかどうかにかかわらず、改変しているタンパク質を生成するために使用される手段に依存しないという点で柔軟である。合成タンパク質を使用する利点は、既知のタンパク質分解性切断の欠点による不安定性を含むいくつかの特定の問題に対処するように設計された非天然アミノ酸を組み込むことができることである。それらはまた、活性または効力が遊離末端、またはＣ末端アミドなどの改変残基に高度に依存する場合に重要な結合部位の選択に関してさらに柔軟であり得る。
【0140】
従来の遺伝子融合：ＦｃおよびＨＳＡ
長寿命血清タンパク質への従来の遺伝子融合は、ＰＥＧまたは脂質への化学的コンジュゲーションとは異なる半減期延長の代替方法を提供する。２つの主要なタンパク質、すなわち、抗体Ｆｃドメイン（特にヒトＩｇＧ１ ＦｃタグおよびウマＩｇＧ１ Ｆｃタグ）、およびヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）が、融合パートナーとして従来使用されてきた。Ｆｃ融合は、抗体のＦｃ部分へのタンパク質、タンパク質または受容体細胞外ドメインの融合を伴う。Ｆｃ融合およびアルブミン融合はともに、タンパク質薬物のサイズを増加させることによって半減期を延長するだけでなく、身体の天然のリサイクル機構、すなわち、新生児型Ｆｃ受容体、ＦｃＲｎを利用する。ＦｃＲｎへのこれらのタンパク質のｐＨ依存的結合は、エンドソーム内で融合タンパク質の分解を防止する。これらのタンパク質に基づく融合物は、典型的なＰＥＧ化タンパク質または脂質化タンパク質よりもはるかに長い３～１６日間の範囲の半減期を有することができる。抗体Ｆｃへの融合は、タンパク質またはタンパク質薬物の溶解度および安定性を改善することができる。タンパク質Ｆｃ融合物の例には、現在後期臨床試験中のＧＬＰ－１受容体アゴニストであるデュラグルチドがある。ヒト血清アルブミンは、脂肪アシル化タンパク質によって利用されるのと同じタンパク質であり、他の一般的な融合パートナーである。アルビグルチドは、このプラットフォームに基づくＧＬＰ－１受容体アゴニストである。Ｆｃとアルブミンとの間の主な差は、融合パートナーの選択に応じて二量体または単量体として融合タンパク質の提示をもたらす、ＨＡＳの単量体構造と対比したＦｃの二量体性である。タンパク質Ｆｃ融合物の二量体性は、標的受容体が互いに十分に近接して離隔されているか、またはそれ自体が二量体である場合、結合活性効果をもたらし得る。これは、標的に応じて望ましい場合もあれば、そうでない場合もある。一実施形態では、Ｆｃドメインは、変異を含むように操作される。Ｆｃドメインへの変異を操作する方法は、Ｒａｔｈ ｅｔ ａｌ（２０１３；ｄｏｉ＝１０．３１０９／０７３８８５５１．２０１３．８３４２９３）に記載されている。
長寿命血清タンパク質への従来の遺伝子融合は、ＰＥＧまたは脂質への化学的コンジュゲーションとは異なる半減期延長の代替方法を提供する。２つの主要なタンパク質、すなわち、抗体Ｆｃドメイン（特にヒトＩｇＧ１ ＦｃタグおよびウマＩｇＧ１ Ｆｃタグ）、およびヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）が、融合パートナーとして従来使用されてきた。Ｆｃ融合は、抗体のＦｃ部分へのタンパク質、タンパク質または受容体細胞外ドメインの融合を伴う。Ｆｃ融合およびアルブミン融合はともに、タンパク質薬物のサイズを増加させることによって半減期を延長するだけでなく、身体の天然のリサイクル機構、すなわち、新生児型Ｆｃ受容体、ＦｃＲｎを利用する。ＦｃＲｎへのこれらのタンパク質のｐＨ依存的結合は、エンドソーム内で融合タンパク質の分解を防止する。これらのタンパク質に基づく融合物は、典型的なＰＥＧ化タンパク質または脂質化タンパク質よりもはるかに長い３～１６日間の範囲の半減期を有することができる。抗体Ｆｃへの融合は、タンパク質またはタンパク質薬物の溶解度および安定性を改善することができる。タンパク質Ｆｃ融合物の例には、現在後期臨床試験中のＧＬＰ－１受容体アゴニストであるデュラグルチドがある。ヒト血清アルブミンは、脂肪アシル化タンパク質によって利用されるのと同じタンパク質であり、他の一般的な融合パートナーである。アルビグルチドは、このプラットフォームに基づくＧＬＰ－１受容体アゴニストである。Ｆｃとアルブミンとの間の主な差は、融合パートナーの選択に応じて二量体または単量体として融合タンパク質の提示をもたらす、ＨＡＳの単量体構造と対比したＦｃの二量体性である。タンパク質Ｆｃ融合物の二量体性は、標的受容体が互いに十分に近接して離隔されているか、またはそれ自体が二量体である場合、結合活性効果をもたらし得る。これは、標的に応じて望ましい場合もあれば、そうでない場合もある。一実施形態では、Ｆｃドメインは、変異を含むように操作される。Ｆｃドメインへの変異を操作する方法は、Ｒａｔｈ ｅｔ ａｌ（２０１３；ｄｏｉ＝１０．３１０９／０７３８８５５１．２０１３．８３４２９３）に記載されている。
【0141】
設計されたポリタンパク質融合物：ＸＴＥＮおよびＰＡＳ
組換え融合概念の興味深い変形例は、融合パートナーとしての設計された低複雑性配列、基本的には、ＰＥＧの機能的類似体である非構造化親水性アミノ酸ポリマーの開発であった。ポリタンパク質プラットフォームの固有の生分解性は、それをＰＥＧの潜在的にさらに良性の代替物として魅力的にする。別の利点は、ＰＥＧの多分散性とは対照的に、組換え分子の正確な分子構造である。融合パートナーの三次元フォールディングが維持される必要があるＨＳＡタンパク質融合およびＦｃタンパク質融合とは異なり、非構造化パートナーへの組換え融合は、多くの場合、さらに高温、またはＨＰＬＣ精製などの過酷な条件に供され得る。
組換え融合概念の興味深い変形例は、融合パートナーとしての設計された低複雑性配列、基本的には、ＰＥＧの機能的類似体である非構造化親水性アミノ酸ポリマーの開発であった。ポリタンパク質プラットフォームの固有の生分解性は、それをＰＥＧの潜在的にさらに良性の代替物として魅力的にする。別の利点は、ＰＥＧの多分散性とは対照的に、組換え分子の正確な分子構造である。融合パートナーの三次元フォールディングが維持される必要があるＨＳＡタンパク質融合およびＦｃタンパク質融合とは異なり、非構造化パートナーへの組換え融合は、多くの場合、さらに高温、またはＨＰＬＣ精製などの過酷な条件に供され得る。
【0142】
このクラスのポリタンパク質の最も進歩したものは、ＸＴＥＮ（Ａｍｕｎｉｘ）と呼ばれ、８６４アミノ酸長であり、６アミノ酸（Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｐ、ＳおよびＴ）から構成される。これは、ポリマーの生分解性によって可能になることであるが、典型的に使用される４０ＫＤａのＰＥＧよりもはるかに大きく、付随してさらに長い半減期延長を付与する。タンパク質薬物へのＸＴＥＮの融合は、天然分子の６０～１３０倍の半減期延長をもたらす。２つの完全に組換え生産されたＸＴＥＮ化（ＸＴＥＮｙｌａｔｅｄ）生成物、すなわち、ＶＲＳ－８５９（Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ－ＸＴＥＮ）およびＶＲＳ－３１７（ヒト成長ホルモン－ＸＴＥＮ）が臨床試験に入っている。第Ｉａ相試験では、ＶＲＳ－８５９は、２型糖尿病患者では忍容性が高く有効であることが分かった。ＶＲＳ－３１７については、以前に試験されたｒｈＧＨ生成物と比較して優れた薬物動態特性および薬力学特性が報告され、月１回投与の可能性を有する。
【0143】
同様の概念的考察に基づく第２のポリマーは、ＰＡＳ（ＸＬ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ＧｍｂＨ）９である。ランダムコイルポリマーは、３つの小さい非荷電アミノ酸、プロリン、アラニンおよびセリンのみのさらに制限されたセットから構成される。ＰＡＳと高度に負に荷電したＸＴＥＮとの生物物理学的特性の差が生体内分布および／またはインビボ活性の差に寄与し得るかどうかは未だ不明であるが、これらのポリタンパク質がさらに多くの治療薬に組み込まれ、融合物の挙動が特性評価されるにつれて明らかにされるであろう。
【0144】
タンパク質－タンパク質融合物はいずれも、パートナーがＦｃ、ＨＳＡ、ＸＴＥＮまたはＰＡＳであるかどうかにかかわらず、遺伝的にコードされており、その結果、同様の制約を被る。１つの制限は、非天然アミノ酸を組み込む合成タンパク質の使用を可能にする化学的コンジュゲーションを使用する方法とは異なり、天然に存在するアミノ酸のみが組み込まれることである。遺伝暗号を拡張することによってこれを克服する方法が、ＡｍｂｒｘまたはＳｕｔｒｏなどの企業によって開発されているが、未だ広く使用されていない。第２の制限は、タンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかがパートナーに融合される必要があることである。多くの場合、タンパク質末端は受容体相互作用に関与し、一方または両方の末端への遺伝子融合は活性を大きく損なう可能性がある。ＰＥＧコンジュゲーションまたは脂質コンジュゲーションの部位はタンパク質上のいずれの場所でもあり得るため、得られる治療薬の生物学的活性を最大化するように最適化することができる。
【0145】
半減期延長タンパク質と合成タンパク質を統合するハイブリッド法
遺伝子融合は、さらに長い半減期延長の可能性を従来提供してきたが、結合部位、およびタンパク質骨格への非天然アミノ酸または改変の組込みの柔軟性に関して、化学的コンジュゲーション、ＰＥＧ化および脂質化を利用する方法によって提供される利点を欠いている。半減期延長のために遺伝子融合の利点を化学的コンジュゲーションと統合する最初の試みの１つは、Ｌａ ＪｏｌｌａのＳｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの研究者によって、後にバイオテクノロジー企業ＣｏｖＸの基礎を形成した技術を用いて行われた。これらの研究者らは、触媒性アルドラーゼ抗体を使用して、抗体の活性部位リジンがタンパク質または小分子に組み込まれたベータ－ジケトンと可逆的共有結合性エナミン結合を形成するプラットフォームを開発した。得られた複合体は、ＣｏｖＸＢｏｄｙ（商標）と呼ばれる。この手法は、遺伝子融合によるのではなく、むしろ化学結合によって、タンパク質薬物または小分子の機能的性質を抗体の長い血清半減期と組み合わせる。この技術の初期の実証に続いて、研究者らは、インテグリンを標的とするペプチド模倣ファーマコフォアに基づき、ＣｏｖＸ－Ｂｏｄｙ（商標）プロトタイプの使用を拡大した。この構造に基づく少なくとも３つの分子、すなわち、Ｇｌｐ－１ＲアゴニストであるＣＶＸ－０９６；アンジオポエチン－２結合タンパク質であるＣＶＸ－０６０；およびトロンボスポンジン模倣体であるＣＶＸ－０４５が臨床開発に入っている。
遺伝子融合は、さらに長い半減期延長の可能性を従来提供してきたが、結合部位、およびタンパク質骨格への非天然アミノ酸または改変の組込みの柔軟性に関して、化学的コンジュゲーション、ＰＥＧ化および脂質化を利用する方法によって提供される利点を欠いている。半減期延長のために遺伝子融合の利点を化学的コンジュゲーションと統合する最初の試みの１つは、Ｌａ ＪｏｌｌａのＳｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの研究者によって、後にバイオテクノロジー企業ＣｏｖＸの基礎を形成した技術を用いて行われた。これらの研究者らは、触媒性アルドラーゼ抗体を使用して、抗体の活性部位リジンがタンパク質または小分子に組み込まれたベータ－ジケトンと可逆的共有結合性エナミン結合を形成するプラットフォームを開発した。得られた複合体は、ＣｏｖＸＢｏｄｙ（商標）と呼ばれる。この手法は、遺伝子融合によるのではなく、むしろ化学結合によって、タンパク質薬物または小分子の機能的性質を抗体の長い血清半減期と組み合わせる。この技術の初期の実証に続いて、研究者らは、インテグリンを標的とするペプチド模倣ファーマコフォアに基づき、ＣｏｖＸ－Ｂｏｄｙ（商標）プロトタイプの使用を拡大した。この構造に基づく少なくとも３つの分子、すなわち、Ｇｌｐ－１ＲアゴニストであるＣＶＸ－０９６；アンジオポエチン－２結合タンパク質であるＣＶＸ－０６０；およびトロンボスポンジン模倣体であるＣＶＸ－０４５が臨床開発に入っている。
【0146】
近年、ＸＴＥＮポリタンパク質はまた、それをＰＥＧにさらになお直接的に類似させる化学的コンジュゲーション様式１２で使用されている。この方法を使用して作製されたＸＴＥＮ化タンパク質の第１の例は、タンパク質がマレイミド－チオール化学を使用してＸＴＥＮタンパク質ポリマーに化学的にコンジュゲートされているＧＬＰ２－２Ｇ－ＸＴＥＮである。化学的にコンジュゲートされたＧＬＰ２－２ＧＸＴＥＮ分子は、ラットでは、組換え融合ＧＬＰ２－２Ｇ－ＸＴＥＮに匹敵する同等のインビトロ活性、インビトロ血漿安定性および薬物動態を示した。
【0147】
ＸＴＥＮポリタンパク質またはＰＡＳポリタンパク質の完全に設計された配列内のリジン側鎖またはシステイン側鎖などの反応性基の数および間隔は、それらが構成される制限されたアミノ酸セットによる部位特異的変化によって正確に制御され得る。これは、その配列が多くの反応性基を天然に含有するＦｃまたはアルブミンを利用し得る方法を上回る付加的な柔軟性を提供し、高度に特殊化された活性部位内の反応性残基に依存するＣｏｖＸ技術とは対照的である。さらに、ＸＴＥＮまたはＰＡＳの三次構造の欠如は、カップリングとコンジュゲートの精製とに使用される条件および化学的性質よりも高い柔軟性を提供するはずである。
【0148】
要約すると、利点を組み合わせ、化学的コンジュゲーションおよび遺伝子融合法の個々の制限を克服するハイブリッドタンパク質半減期延長法が出現している。これらの方法は、さらに長い半減期を付与するが、天然のＬ－アミノ酸のみから構成されるか、またはＮ末端もしくはＣ末端のいずれかで融合された直鎖の一方向性ポリタンパク質としてのみ構成されるという制限から治療用タンパク質部分を解放する、組換えポリタンパク質系パートナーに基づく分子の作製を可能にするため、幅広いさらに長時間作用性のタンパク質系薬物への扉を開く。
【0149】
例示的な投与量および投与戦略
上記のように、本発明の組成物は、本発明のタンパク質の「治療有効量」または「予防有効量」（または本発明のタンパク質と第２の成分とを含む組合せ組成物の場合、第１および第２の量；本発明の２つのタンパク質と本発明の二次作用物質もしくはタンパク質と２つの二次作用物質とを含む組合せ組成物の場合、第１、第２および第３の量など）を含み得る。特定の態様をさらによく例示するために、投与量原理の詳細な説明をここでさらに提供する。
上記のように、本発明の組成物は、本発明のタンパク質の「治療有効量」または「予防有効量」（または本発明のタンパク質と第２の成分とを含む組合せ組成物の場合、第１および第２の量；本発明の２つのタンパク質と本発明の二次作用物質もしくはタンパク質と２つの二次作用物質とを含む組合せ組成物の場合、第１、第２および第３の量など）を含み得る。特定の態様をさらによく例示するために、投与量原理の詳細な説明をここでさらに提供する。
【0150】
本発明を実施する際に、使用されるタンパク質の量もしくは投与量範囲は、典型的には、（創傷治療に関連して）創傷の上皮化を効果的に誘導、促進もしくは増強するものであるか、または使用されるタンパク質の量もしくは投与量範囲は、典型的には、神経変性状態の進行を遅らせるように神経系の細胞の遺伝子発現プロファイルを効果的に改変するものであるか、または使用されるタンパク質の量もしくは投与量範囲は、典型的には、ウマ哺乳動物の組織変性状態の治療に関連して、細胞の遺伝子発現プロファイルを改変するものである。
【0151】
さらに別の態様では、体重１キログラム当たり約０．０１～１００ミリグラムの活性成分（例えば、本発明のタンパク質）の１日投与量が患者に提供される。通常、１日に約１～約６回の分割用量で、または持続放出形態で与えられる１日当たり約１～約５、または約１～約１０ミリグラムが、所望の結果を得るために有効であり得る。一実施形態では、投与量は、１０～１００、３０～７０、４０～６０、理想的には約５０μｇ／ｍｌである。
【0152】
非限定的な例として、ヒトまたは動物の疾患の治療は、約２４、１２、８、６、４もしくは２時間ごとの単回用量もしくは分割用量、またはそれらの任意の組合せを使用して、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日もしくは４０日のうちの少なくとも１つ、もしくは代替的には、１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１２週、１３週、１４週、１５週、１６週、１７週、１８週、１９週もしくは２０週のうちの少なくとも１つ、またはそれらの任意の組合せに、約０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｇ／ｋｇの量での本発明のタンパク質の１日投与量の投与によって提供され得る。
【0153】
例示
以下、具体的な例を参照して本発明を説明する。これらは単なる例示であり、例示のみを目的とするものであり、特許請求される独占権の範囲、または記載される発明を限定することを決して意図するものではない。これらの例は、本発明を実施するために現在企図されている最良の形態を構成する。
以下、具体的な例を参照して本発明を説明する。これらは単なる例示であり、例示のみを目的とするものであり、特許請求される独占権の範囲、または記載される発明を限定することを決して意図するものではない。これらの例は、本発明を実施するために現在企図されている最良の形態を構成する。
【0154】
例１
ｐＴＴ３発現ベクターの構築
ベクターはいずれも、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５－Ｖ５－Ｈｉｓベクターから得られたカルボキシ末端Ｖ５－ＨｉｓタグとインフレームでｐＴＴ３発現ベクターにサブクローニングされた関連するＰＳＧ１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。全長ＰＳＧ１を発現するベクターは以前に記載された。（Ｓｈａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｈｏｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
ｐＴＴ３発現ベクターの構築
ベクターはいずれも、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５－Ｖ５－Ｈｉｓベクターから得られたカルボキシ末端Ｖ５－ＨｉｓタグとインフレームでｐＴＴ３発現ベクターにサブクローニングされた関連するＰＳＧ１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。全長ＰＳＧ１を発現するベクターは以前に記載された。（Ｓｈａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｈｏｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
【0155】
Ｆｃタグクローニング
エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ球ｃＤＮＡの試料から、ヒトＦｃタグをＰＣＲ増幅した。ヒトＦｃタグを、プライマーテールになるように操作したＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用してｐＴＴ３ベクターにサブクローニングし、ＰＳＧ１のＯＲＦの３’末端にインフレーム挿入した。Ｆｃタグを挿入した後、ＦｃタグによるＰＳＧ１ ＯＲＦのインフレーム転写を可能にするために、部位特異的変異誘発を使用して内部ＨｉｎｄＩＩＩ部位を除去した。
エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ球ｃＤＮＡの試料から、ヒトＦｃタグをＰＣＲ増幅した。ヒトＦｃタグを、プライマーテールになるように操作したＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用してｐＴＴ３ベクターにサブクローニングし、ＰＳＧ１のＯＲＦの３’末端にインフレーム挿入した。Ｆｃタグを挿入した後、ＦｃタグによるＰＳＧ１ ＯＲＦのインフレーム転写を可能にするために、部位特異的変異誘発を使用して内部ＨｉｎｄＩＩＩ部位を除去した。
【0156】
部位特異的変異誘発を使用して、安定性および半減期を増加させるためのＣＨ２ドメイン内のヒトＦｃタグ（三重置換ＹＴＥ（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）およびＣＨ３ドメイン内の（Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ）への改変を行った（Ｒａｔｈ ｅｔ ａｌ，２０１５を参照、Ｆｃ改変については、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３１０９／０７３８８５５１．２０１３．８３４２９３）。部位特異的変異誘発を使用して（Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ヒトＦｃタグへの改変を行った。
【0157】
例２
ヒト細胞株内の遺伝子発現に対するＰＳＧ１の効果
ＰＳＧ１を用いてＣ２０、ヒトミクログリア細胞株細胞をインビトロで処理し、Ｑｉａｇｅｎ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ｑＲＴ－ＰＣＲアレイを使用して遺伝子発現変化を分析した。細胞を５０ｕｇ／ｍｌの組換えＰＳＧ１－Ｖ５Ｈｉｓとともに１×１０５細胞／ｍｌの密度で６ウェルプレートに５時間かけて播種し、ｃＤＮＡを調製し、処理後５または２４時間の時点で分析した。結果を図１に示す。
ヒト細胞株内の遺伝子発現に対するＰＳＧ１の効果
ＰＳＧ１を用いてＣ２０、ヒトミクログリア細胞株細胞をインビトロで処理し、Ｑｉａｇｅｎ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ｑＲＴ－ＰＣＲアレイを使用して遺伝子発現変化を分析した。細胞を５０ｕｇ／ｍｌの組換えＰＳＧ１－Ｖ５Ｈｉｓとともに１×１０５細胞／ｍｌの密度で６ウェルプレートに５時間かけて播種し、ｃＤＮＡを調製し、処理後５または２４時間の時点で分析した。結果を図１に示す。
【0158】
例３
マウス脳卒中モデルにおける行動転帰（足障害試験）に対するＰＳＧ１の効果
恒久的な中大脳動脈凝固
手順は無菌条件下で行った。イソフルラン（誘導では３～４％、維持では１～３％）を用いてマウスを麻酔した。手技中、ペダル引っ込め反射および自発運動を最低５分間隔でモニタリングした。誘導後、フェイスマスクを使用して、１～２％イソフルランを用いて麻酔を維持した。恒温ブランケットシステムを用いて、直腸温度を３７°Ｃに維持した。切開前に右耳と眼との間の皮膚に０．５％ブピバカイン（０．１ｍｌ）を浸潤させ、側頭筋を後退させ、側頭骨および頭頂骨を露出させた。動脈分岐部にわたって小さな開頭術を行い、髄膜を切断し、頭頂枝および前頭枝を有する中大脳動脈（ＭＣＡ）を露出させた。小型血管焼灼器を使用して、ＭＣＡの遠位部分を結合した。切開部をモノフィラメント縫合糸を用いて縫合し、断続的な閉鎖を使用して閉鎖した。麻酔を中止し、温乳酸リンゲル液をｉ．ｐ．投与し（０．５ｍｌ）、再灌流まで小型のＴｈｅｒｍｏＣａｒｅ（登録商標）Ｗａｔｅｒ Ｊａｃｋｅｔｅｄ Ｗａｒｍｅｒ内で動物を回復させた。麻酔からの回復中、動物が歩行するまで１５分間隔で、呼吸数、動き、および胸骨横臥を維持する能力をモニタリングした。
マウス脳卒中モデルにおける行動転帰（足障害試験）に対するＰＳＧ１の効果
恒久的な中大脳動脈凝固
手順は無菌条件下で行った。イソフルラン（誘導では３～４％、維持では１～３％）を用いてマウスを麻酔した。手技中、ペダル引っ込め反射および自発運動を最低５分間隔でモニタリングした。誘導後、フェイスマスクを使用して、１～２％イソフルランを用いて麻酔を維持した。恒温ブランケットシステムを用いて、直腸温度を３７°Ｃに維持した。切開前に右耳と眼との間の皮膚に０．５％ブピバカイン（０．１ｍｌ）を浸潤させ、側頭筋を後退させ、側頭骨および頭頂骨を露出させた。動脈分岐部にわたって小さな開頭術を行い、髄膜を切断し、頭頂枝および前頭枝を有する中大脳動脈（ＭＣＡ）を露出させた。小型血管焼灼器を使用して、ＭＣＡの遠位部分を結合した。切開部をモノフィラメント縫合糸を用いて縫合し、断続的な閉鎖を使用して閉鎖した。麻酔を中止し、温乳酸リンゲル液をｉ．ｐ．投与し（０．５ｍｌ）、再灌流まで小型のＴｈｅｒｍｏＣａｒｅ（登録商標）Ｗａｔｅｒ Ｊａｃｋｅｔｅｄ Ｗａｒｍｅｒ内で動物を回復させた。麻酔からの回復中、動物が歩行するまで１５分間隔で、呼吸数、動き、および胸骨横臥を維持する能力をモニタリングした。
【0159】
ビヒクル（ＰＢＳ）またはＰＳＧ１－Ｆｃの皮下注射
滅菌２５～２７ゲージ針およびシリンジを使用して、無菌手順を使用して、室温で、５０～１００μｌ容量の滅菌溶液：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞から精製した１００マイクログラムのＰＳＧ１－Ｆｃタンパク質のＰＢＳ溶液をマウスに注射した。
滅菌２５～２７ゲージ針およびシリンジを使用して、無菌手順を使用して、室温で、５０～１００μｌ容量の滅菌溶液：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞から精製した１００マイクログラムのＰＳＧ１－Ｆｃタンパク質のＰＢＳ溶液をマウスに注射した。
【0160】
尾切断（ｔａｉｌ ｓｎｉｐ）による採血
意識のあるマウスを穏やかに手動で拘束した。７０％アルコールプレップパッド（ｐｒｅｐ ｐａｄ）を用いて尾部を洗浄した。滅菌メスを用いて先端の１ｍｍ未満の尾片を除去することによって、尾切断を行った。尾部を穏やかにマッサージし、ヘパリン処理した毛細管に０．１ｍｌの血液を採取した。採取中、動物をケージ内で自由に運動させた。採取完了後、創傷を穏やかに圧縮して出血を止め、動物をホームケージに戻した。この手順は、比較的ストレスがないことが実証されている。（ＬＡＳＴコースハンドブックから入手したガイドライン（１６４ページ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ＆Ｗｅｌｆａｒｅ；Ｗｏｌｆｅｎｓｏｈｎ＆Ｌｌｏｙｄ））。
意識のあるマウスを穏やかに手動で拘束した。７０％アルコールプレップパッド（ｐｒｅｐ ｐａｄ）を用いて尾部を洗浄した。滅菌メスを用いて先端の１ｍｍ未満の尾片を除去することによって、尾切断を行った。尾部を穏やかにマッサージし、ヘパリン処理した毛細管に０．１ｍｌの血液を採取した。採取中、動物をケージ内で自由に運動させた。採取完了後、創傷を穏やかに圧縮して出血を止め、動物をホームケージに戻した。この手順は、比較的ストレスがないことが実証されている。（ＬＡＳＴコースハンドブックから入手したガイドライン（１６４ページ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ＆Ｗｅｌｆａｒｅ；Ｗｏｌｆｅｎｓｏｈｎ＆Ｌｌｏｙｄ））。
【0161】
グリッド歩行
マウスをワイヤグリッド上に置き、５分間自由に探索させた。マウスをビデオ録画し、後日、処置群に対して盲検化された実験者が、左右の前足による最初の１００歩のうちの足の滑りの割合を採点した。足が横木を完全に逃し、したがって、肢が横木の間に落ちた場合、または足が横木に正しく置かれているが、体重負荷中に滑り落ちた場合に、足の滑りを採点する。動物は事前訓練を必要としないが、慣れるため、およびベースラインスコアを得るために、手術の前に動物をグリッド上に１回置く。
マウスをワイヤグリッド上に置き、５分間自由に探索させた。マウスをビデオ録画し、後日、処置群に対して盲検化された実験者が、左右の前足による最初の１００歩のうちの足の滑りの割合を採点した。足が横木を完全に逃し、したがって、肢が横木の間に落ちた場合、または足が横木に正しく置かれているが、体重負荷中に滑り落ちた場合に、足の滑りを採点する。動物は事前訓練を必要としないが、慣れるため、およびベースラインスコアを得るために、手術の前に動物をグリッド上に１回置く。
【0162】
実験の時系列
７日目：マウスの受領、および７日間の順化
Ｄ０：恒久的なＭＣＡ凝固
Ｄ０＋１時間：ＰＳＧ１－Ｆｃ（マウス２１匹）またはビヒクル（マウス２１匹）の皮下投与
Ｄ２：採血
Ｄ３：グリッド歩行
Ｄ５：グリッド歩行、それに続く安楽死
７日目：マウスの受領、および７日間の順化
Ｄ０：恒久的なＭＣＡ凝固
Ｄ０＋１時間：ＰＳＧ１－Ｆｃ（マウス２１匹）またはビヒクル（マウス２１匹）の皮下投与
Ｄ２：採血
Ｄ３：グリッド歩行
Ｄ５：グリッド歩行、それに続く安楽死
【0163】
均等物
上記の説明は、本発明の目下好ましい実施形態を詳述している。これらの説明を考慮した当業者は、その実施において多くの修正および変形例を想起すると予測される。これらの修正および変形例は、添付の特許請求の範囲内に包含されることが意図されている。
上記の説明は、本発明の目下好ましい実施形態を詳述している。これらの説明を考慮した当業者は、その実施において多くの修正および変形例を想起すると予測される。これらの修正および変形例は、添付の特許請求の範囲内に包含されることが意図されている。
【配列表フリーテキスト】
【0164】
配列表３ ＜２２３＞改変ヒトＦｃ ＯＲＦ
【図1】
【図2】
【配列表】
【国際調査報告】