特表 2024-514246 ＣＬＤＮ１８．２抗原結合タンパク質およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-29

(54)【発明の名称】ＣＬＤＮ１８．２抗原結合タンパク質およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20240322BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20240322BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240322BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20240322BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240322BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240322BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240322BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240322BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240322BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20240322BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240322BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240322BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240322BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240322BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240322BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20240322BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C07K16/18 ZNA

C07K19/00

C07K14/705

C12N15/13

C12N15/12

C12N5/10

A61K39/395 N

A61K39/395 D

A61P35/00

A61K38/02

A61K31/7088

A61K48/00

A61K35/12

A61K35/17

A61P35/02

A61K47/65

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023560013

(86)(22)【出願日】2022-04-01

(85)【翻訳文提出日】2023-10-27

(86)【国際出願番号】 CN2022084922

(87)【国際公開番号】W WO2022206975

(87)【国際公開日】2022-10-06

(31)【優先権主張番号】202110359711.8

(32)【優先日】2021-04-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202210016145.5

(32)【優先日】2022-01-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520358863

【氏名又は名称】オリセル セラピューティクス カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ヤン シャーシャー

(72)【発明者】

【氏名】フー シャオウェン

(72)【発明者】

【氏名】リー モン

(72)【発明者】

【氏名】ワン フワジン

(72)【発明者】

【氏名】ヤン ファンフォン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AB04

4B065AB06

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

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4C076EE59

4C076FF31

4C076FF34

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4C084AA07

4C084AA13

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4C084NA13

4C084NA14

4C084ZB26

4C084ZB27

4C085AA13

4C085AA14

4C085EE01

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

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4C086MA04

4C086NA13

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZB27

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB65

4C087CA12

4C087CA20

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

【要約】
【課題】ＣＬＤＮ１８．２抗原結合タンパク質およびその使用を提供することを課題とする。
【解決手段】ＣＬＤＮ１８．２に結合できる単離された抗原結合タンパク質を提供する。また、前記単離された抗原結合タンパク質を含むキメラ抗原受容体、ならびに前記抗原結合タンパク質とキメラ抗原受容体の調製方法および使用にも提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ３は、配列番号：６７で示されるアミノ酸配列を含む、単離された抗原結合タンパク質。

【請求項2】

前記ＨＣＤＲ３は、配列番号：４、配列番号：１２および配列番号：１８のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項3】

ＨＣＤＲ２を含み、前記ＨＣＤＲ２は、配列番号：６８または配列番号：１１で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～２のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項4】

前記ＨＣＤＲ２は、配列番号：３または配列番号：１７で示されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項5】

ＨＣＤＲ１を含み、前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：２、配列番号：１０および配列番号：１６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項6】

Ｈ－ＦＲ１を含み、前記Ｈ－ＦＲ１のＣ末端は、前記ＨＣＤＲ１のＮ末端に直接的または間接的に連結され、前記Ｈ－ＦＲ１は配列番号：７２で示されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項7】

前記Ｈ－ＦＲ１は、配列番号：３４、配列番号：４３および配列番号：４９のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項8】

Ｈ－ＦＲ２を含み、前記Ｈ－ＦＲ２は、前記ＨＣＤＲ１と前記ＨＣＤＲ２との間に位置し、配列番号：７３で示されるアミノ酸配列を含む、請求項５～７のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項9】

前記Ｈ－ＦＲ２は、配列番号：３５または配列番号：４４で示されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項10】

Ｈ－ＦＲ３を含み、前記Ｈ－ＦＲ３は、前記ＨＣＤＲ２と前記ＨＣＤＲ３との間に位置し、配列番号：８０または配列番号：４５で示されるアミノ酸配列を含む、請求項３～９のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項11】

前記Ｈ－ＦＲ３は、配列番号：３６または配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項12】

Ｈ－ＦＲ４を含み、前記Ｈ－ＦＲ４のＮ末端は、前記ＨＣＤＲ３のＣ末端に連結され、前記Ｈ－ＦＲ４は配列番号：７４で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項13】

前記Ｈ－ＦＲ４は、配列番号：４６または配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項14】

ＶＨを含み、前記ＶＨは、配列番号：７８で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項15】

前記ＶＨは、配列番号：１、配列番号：９、配列番号：１５および配列番号：１９のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項16】

ＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ３は、配列番号：６９で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項17】

前記ＬＣＤＲ３は、配列番号：８、配列番号：１４、配列番号：２３および配列番号：２５のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項18】

ＬＣＤＲ２を含み、前記ＬＣＤＲ２は、配列番号：７０で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項19】

前記ＬＣＤＲ２は、配列番号：７または配列番号：２２で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項20】

ＬＣＤＲ１を含み、前記ＬＣＤＲ１は、配列番号：７１で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項21】

前記ＬＣＤＲ１は、配列番号：６または配列番号：２１で示されるアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項22】

Ｌ－ＦＲ１を含み、前記Ｌ－ＦＲ１のＣ末端は、前記ＬＣＤＲ１のＮ末端に直接的または間接的に連結され、前記Ｌ－ＦＲ１は配列番号：７５で示されるアミノ酸配列を含む、請求項２０～２１のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項23】

前記Ｌ－ＦＲ１は、配列番号：３８、配列番号：４７、配列番号：５０および配列番号：５３のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項24】

Ｌ－ＦＲ２を含み、前記Ｌ－ＦＲ２は、前記ＬＣＤＲ１と前記ＬＣＤＲ２との間に位置し、配列番号：３９で示されるアミノ酸配列を含む、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項25】

Ｌ－ＦＲ３を含み、前記Ｌ－ＦＲ３は、前記ＬＣＤＲ２と前記ＬＣＤＲ３との間に位置し、配列番号：７６で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１８～２４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項26】

前記Ｌ－ＦＲ３は、配列番号：４０、配列番号：４８および配列番号：５１のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項27】

Ｌ－ＦＲ４を含み、前記Ｌ－ＦＲ４のＮ末端は、前記ＬＣＤＲ３のＣ末端に連結され、前記Ｌ－ＦＲ４は配列番号：７７で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１６～２６のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項28】

前記Ｌ－ＦＲ４は、配列番号：４１、配列番号：５２および配列番号：５４のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項29】

ＶＬを含み、前記ＶＬは、配列番号：７９で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項30】

前記ＶＬは、配列番号：５、配列番号：１３、配列番号：２０および配列番号：２４のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項31】

以下の任意の群から選択されるＶＨおよびＶＬを含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
１）配列番号：１で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号：５で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ
２）配列番号：１５で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号：５で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ
３）配列番号：９で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号：１３で示されるアミノ酸配列を含む前記ＶＬ
４）配列番号：１９で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号：２０で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ、および
５）配列番号：１９で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号：２４で示されるアミノ酸配列を含む前記ＶＬ

【請求項32】

抗体重鎖定常領域を含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項33】

前記抗体重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域に由来する、請求項３２に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項34】

前記抗体重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に由来する、請求項３２～３３のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項35】

抗体軽鎖定常領域を含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項36】

前記抗体軽鎖定常領域は、ヒトＩｇκ定常領域に由来する、請求項３５に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項37】

抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項38】

前記抗原結合断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ）_２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖおよび／またはｄＡｂが含まれる、請求項３７に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項39】

前記抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体から成る群の１種以上から選択される、請求項３７～３８のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項40】

ＦＡＣＳで検証されるように、ＣＬＤＮ１８．２への結合に関して参照抗体と実質的に競合せず、前記参照抗体は重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記参照抗体のＶＨは配列番号５５で示されるアミノ酸配列を含み、前記参照抗体のＶＬは配列番号５６で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項41】

ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合するが、ＣＬＤＮ１８．１には実質的に結合しない、請求項１～４０のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項42】

前記ＣＬＤＮ１８．２は、マウスＣＬＤＮ１８．２、カニクイザルＣＬＤＮ１８．２および／またはヒトＣＬＤＮ１８．２を含む、請求項４０～４１のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項43】

ＣＤＣ活性を有する、請求項１～４２のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項44】

腫瘍の成長および／または腫瘍細胞の増殖を抑制することができる、請求項１～４３のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項45】

請求項１～４４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を含む標的部分を含む、キメラ抗原受容体。

【請求項46】

共刺激ドメインを含み、前記共刺激ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＯＸ４０、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＳＬＡＭ、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、２Ｂ４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＰＤ－１、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＪＡＭＬ、ＣＤ２４４、ＣＤ１００、ＩＣＯＳ、ＣＤ８３のリガンド、ＣＤ４０およびＭｙＤ８８からなる群から選択される１種以上のタンパク質に由来する共刺激ドメインを含む、請求項４５に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項47】

前記共刺激ドメインは、４－１ＢＢ由来の細胞内共刺激シグナル伝達領域である、請求項４５～４６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項48】

前記共刺激ドメインは、配列番号：８５で示されるアミノ酸配列を含む、請求項４６～４７のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項49】

細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃεＲＩγ、ＦｃεＲＩβ、ＦｃγＲＩＩａ、ウシ白血病ウイルスｇｐ３０、エプスタイン・バーウイルス （ＥＢＶ）ＬＭＰ２Ａ、サル免疫不全ウイルスＰＢｊ１４ Ｎｅｆ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＨＳＫＶ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ－１２および少なくとも１つのＩＴＡＭを含むドメインからなる群から選択される１種以上のタンパク質に由来する細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項４５～４８のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項50】

前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインである、請求項４９に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項51】

前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号：８６で示されるアミノ酸配列を含む、請求項４９～５０のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項52】

膜貫通ドメインを含み、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＰＤ－１、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＣＤ５、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４、ＣＤ２４４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＣＤ２、ＮＫＧ２Ｃ、ＬＩＧＨＴ、ＤＡＰ１２、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４およびＳＬＡＭからなる群から選択される１種以上のタンパク質に由来する膜貫通ドメインを含む、請求項４５～５１のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項53】

前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８に由来する膜貫通ドメインである、請求項５２に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項54】

前記膜貫通ドメインは、配列番号：８４で示されるアミノ酸配列を含む、請求項５２～５３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項55】

標的部分と膜貫通ドメインとの間にヒンジ領域を含み、前記ヒンジ領域は、ＣＤ２８、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＣＤ８、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＤＡＰ１０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＣＤ２２６、ＳＬＡＭ、ＣＤ３０およびＬＩＧＨＴからなる群から選択される１種以上のタンパク質に由来するヒンジ領域を含む、請求項４５～５４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項56】

前記ヒンジ領域は、ＣＤ８に由来するヒンジ領域である、請求項５５に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項57】

前記ヒンジ領域は、配列番号：８３で示されるアミノ酸配列を含む、請求項５５～５６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項58】

シグナルペプチドをさらに含む、請求項４５～５７のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項59】

前記シグナルペプチドは、ＣＤ８タンパク質に由来するシグナルペプチドである、請求項５８に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項60】

前記シグナルペプチドは、配列番号：８８で示されるアミノ酸配列を含む、請求項５８～５９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項61】

低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片をさらに含む、請求項４５～６０のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項62】

前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１～１２およびその機能的断片からなる群から選択される１種以上を含む、請求項６１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項63】

前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片は、配列番号：９１で示されるアミノ酸配列を含む、請求項６１～６２のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項64】

請求項１～４４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質または請求項４５～６３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を含む、ポリペプチド分子。

【請求項65】

融合タンパク質を含む、請求項６４に記載のポリペプチド分子。

【請求項66】

請求項１～４６のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質を含む、免疫複合体。

【請求項67】

請求項１～４４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項４５～６３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体または請求項６４～６５のいずれか一項に記載のポリペプチド分子をコードする、単離された１種以上の核酸分子。

【請求項68】

配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２および配列番号：３３のいずれかで示される塩基配列を含む、請求項６７に記載の核酸分子。

【請求項69】

以下の任意の群から選択される塩基配列を含む、請求項６７～６８のいずれか一項に記載の核酸分子。
１）配列番号２６で示される塩基配列、および配列番号２７で示される塩基配列
２）配列番号３０に示される塩基配列、および配列番号２７で示される塩基配列
３）配列番号２８に示される塩基配列、および配列番号２９で示される塩基配列
４）配列番号３１に示される塩基配列、および配列番号３２で示される塩基配列、ならびに
５）配列番号３１に示される塩基配列、および配列番号３３で示される塩基配列

【請求項70】

請求項６７～６９のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。

【請求項71】

請求項１～４４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項４５～６３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項６４～６５のいずれか一項に記載のポリペプチド分子、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項７０に記載のベクターを含む、細胞。

【請求項72】

免疫エフェクター細胞である、請求項７１に記載の細胞。

【請求項73】

Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、単球、樹状細胞、顆粒球、リンパ球、白血球、末梢血単核球、胚性幹細胞、リンパ球前駆細胞および／または多能性幹細胞を含む、請求項７１～７２のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項74】

Ｔ細胞である、請求項７１～７３のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項75】

低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片をさらに含み、および／または発現する、請求項７１～７４のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項76】

前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１～１２およびその機能的断片からなる群から選択される１種以上を含む、請求項７５に記載の細胞。

【請求項77】

前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５および／もしくは６またはその断片である、請求項７５～７６のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項78】

前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片は、配列番号：９１で示されるアミノ酸配列を含む、請求項７５～７７のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項79】

請求項１～４４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項４５～６３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項６４～６５のいずれか一項に記載のポリペプチド分子、請求項６６に記載の免疫複合体、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項７０に記載のベクターおよび／または請求項７１～７８のいずれか一項に記載の細胞、および任意に薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

【請求項80】

前記抗原結合タンパク質が発現される条件下で、請求項７１に記載の細胞を培養することを含む、請求項１～４４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質の調製方法。

【請求項81】

疾患および／または障害を予防、緩和および／または治療するために用いられる医薬品の調製における、請求項１～４４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項４５～６３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項６４～６５のいずれか一項に記載のポリペプチド分子、請求項６６に記載の免疫複合体、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項７０に記載のベクター、請求項７１～７８のいずれか一項に記載の細胞および／または請求項７９に記載の医薬組成物の使用。

【請求項82】

前記疾患および／または障害には、癌が含まれる請求項８１に記載の使用。

【請求項83】

前記癌には、固形腫瘍および／または血液腫瘍（ｈｅｍａｔｏｍａｓ）が含まれる、請求項８１～８２のいずれか一項に記載の使用。

【請求項84】

前記癌には、胃癌および／または結腸癌が含まれる、請求項８２～８３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項85】

請求項１～４４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項４５～６３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項６４～６５のいずれか一項に記載のポリペプチド分子、請求項６６に記載の免疫複合体、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項７０に記載のベクター、請求項７１～７８のいずれか一項に記載の細胞および／または請求項７９に記載の医薬組成物を投与することを含む、サンプル中のＣＬＤＮ１８．２を検出する方法。

【請求項86】

請求項１～４４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項４５～６３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項６４～６５のいずれか一項に記載のポリペプチド分子、請求項６６に記載の免疫複合体、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項７０に記載のベクター、請求項７１～７８のいずれか一項に記載の細胞および／または請求項７９に記載の医薬組成物を含む、サンプル中のＣＬＤＮ１８．２を検出するための試薬またはキット。

【請求項87】

サンプル中のＣＬＤＮ１８．２の存在および／または含有量を検出するために用いられるキットの調製における、請求項１～４４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項４５～６３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項６４～６５のいずれか一項に記載のポリペプチド分子、請求項６６に記載の免疫複合体、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項７０に記載のベクター、請求項７１～７８のいずれか一項に記載の細胞および／または請求項７９に記載の医薬組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、バイオ医薬品の技術分野に関し、特に、ＣＬＤＮ１８．２に結合することができる抗原結合タンパク質に関する。

【背景技術】

【0002】

胃癌は、世界で２番目に致死率が高い悪性腫瘍である。世界保健機関の２０１５年のデータによると世界中で毎年７５．４万人が胃癌で命を落としている。膵臓癌は、最も悪性度の高い腫瘍の１つであり、非特許文献１のデータによると、世界中で毎年２０万以上の人が膵臓癌で命を落としている。進行または再発胃癌の標準的な第一選択治療は、化学療法である。化学療法としてトラスツズマブを追加することで、ＨＥＲ２－陽性腫瘍患者の延命効果がある程度もたらされているが、ＨＥＲ２－陽性胃癌は、全体の１５％のみである。安全で有効な治療法の開発が急務となっている。

【0003】

ＣＬＤＮ１８．２（Ｃｌａｕｄｉｎ １８．２）は、分化胃壁細胞でのみ発現され、正常組織において発現されない。最新の研究では、ＣＬＤＮ１８．２が胃癌患者の７７％以上、膵臓癌患者の８０％以上で過剰発現しており、また肺がん、食道癌、および卵巣癌などの固形腫瘍でも過剰発現していることが示されている。ＣＬＤＮ１８．２は、層状細胞間の分子の流れを制御する密着結合タンパク質ファミリーに属する。しかし腫瘍では、密着結合が破壊され、ＣＬＤＮタンパク質はその主要な役割を失う。ＣＬＤＮ１８．２は、胃腫瘍に大量存在するため、研究者らは進行胃癌患者の半数がＣＬＤＮ１８．２抗体を標的とする新たな治療法の候補者となる可能性があると推定している。なおこのユニークな標的は、胃壁以外の健康な組織に存在しないため、治療の副作用が最小限に抑えられる。これらの特徴は、ＣＬＤＮ１８．２が治療用モノクローナル抗体開発の理想的な標的であることを示している。

【0004】

ＣＬＤＮ１８．２ は、膜タンパク質であるため、従来の抗体スクリーニング方法を使用してネイティブタンパク質に対抗する高品質な抗体を得ることは困難であった。現在、ｉｎ ｖｉｖｏ免疫化方法（例えばＤＮＡ注射方法）が多く用いられているが、動物に対する複数回の免疫化が必要である。ＣＬＤＮ１８には、２つのスプライスバリアント（ＣＬＤＮ１８．１およびＣＬＤＮ１８．２）があり、この２つのバリアントは第１細胞外ループに存在し、Ｎ末端６９番目のアミノ酸配列のみが異なり、残りの配列が同じである。ＣＬＤＮ１８．１は、正常な肺組織で発現しているため、ＣＬＤＮ１８．２に結合するがＣＬＤＮ１８．１には結合しない抗体をスクリーニングする必要がある。一方ＣＬＤＮ１８．２配列は、ヒトとマウス間で極めて高い相同性を持っている。このため、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する抗体を得ることが急務となっている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際出願第ＷＯ ０６／０３０２２０号公報

【特許文献2】国際出願第ＷＯ ０６／００３３８８号公報

【特許文献3】米国特許第６，１５０，５８４号公報

【特許文献4】米国特許第６，４５８，５９２号公報

【特許文献5】米国特許第６，４２０，１４０号公報

【特許文献6】国際出願第ＷＯ２０１５／０３６５８３号公報

【特許文献7】中国特願第ＣＮ１０３５０９１１４Ａ号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】医学誌《ランセット》２０１６

【非特許文献2】Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒら，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，５３（１）：１２１－１２９（２００３）

【非特許文献3】Ｒｏｑｕｅら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ．２０：６３９－６５４（２００４）

【非特許文献4】Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）

【非特許文献5】Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ Ｐ．Ｓｔｉｅｓ，Ａｂｂａ Ｉ． Ｔｅｒｒ ａｎｄ Ｔｒｉｓｔｒａｍ Ｇ． Ｐａｒｓｏｌｗ （ｅｄｓ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．，１９９４，７１頁目および第６章

【非特許文献6】Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６－４４８（１９９３）；Ｓｈｅｒｉｆｆ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３－７３６（１９９６）

【非特許文献7】Ｗａｒｄら（Ｎａｔｕｒｅ，１９８９Ｏｃｔ １２；３４１（６２４２）：５４４－６）

【非特許文献8】Ｈｏｌｔら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００３，２１（１１）：４８４－４９０

【非特許文献9】Ｗ．Ｒ．ＰｅａｒｓｏｎおよびＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎの「生物学的配列比較のための改善されたツール」

【非特許文献10】全米科学アカデミーのジャーナル議事録（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．），８５：２４４４－２４４８，１９８８

【非特許文献11】Ｄ．Ｊ．ＬｉｐｍａｎおよびＷ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎの「高速かつ高感度のタンパク質類似性検索」、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７：１４３５－１４４１，１９８９

【非特許文献12】Ｓ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｗ．Ｇｉｓｈ、Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｅ．Ｗ．ＭｙｅｒｓおよびＤ．Ｌｉｐｍａｎの「基本的なローカルアラインメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）検索ツール」、分子生物学ジャーナル、２１５：４０３－４１０，１９９０

【非特許文献13】Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２：１１８０－８

【非特許文献14】ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：８３５－４１

【非特許文献15】Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６８６４－２６８７０

【非特許文献16】Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１６０５－１２

【非特許文献17】Ｋｅｌｌｅｙ ａｎｄ Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ （１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：６８６２－３５

【非特許文献18】Ａｄｉｂ－Ｃｏｎｑｕｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３４１－６ ａｎｄ Ｂｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６：２８３５－４３

【非特許文献19】Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ，ｃｉｔｅｄ ｓｕｐｒａ；Ｃａｏ ａｎｄ Ｓｕｒｅｓｈ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９ （６）， ６３５－６４４ （１９９８）

【非特許文献20】ｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ， ２１ （８），３９１－３９７ （２０００）

【非特許文献21】Ｌｏｔｔａ ｖｏｎ Ｂｏｅｈｍｅｒが発表したＰＲＯＴＯＣＯＬ（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１６．１０２）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本出願は、例えばヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合することができること、ヒトＣＬＤＮ１８．１に本質的に結合しないこと、ＣＤＣ活性および／または抗腫瘍活性を持つ可能性があるなどの１つ以上の所望の機能特性を示し、ＣＬＤＮ１８．２に結合することができる抗原結合タンパク質を提供する。本出願は、単離された抗原結合タンパク質をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、および前記単離された抗原結合タンパク質を調製する方法も提供する。本出願の単離された抗原結合タンパク質は、腫瘍および／または癌などの疾患および／または障害症を予防および／または治療するために用いられることができる。

【課題を解決するための手段】

【0008】

一態様において、本出願は、配列番号：６７で示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を、含む単離された抗原結合タンパク質を提供する。

【0009】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質のＨＣＤＲ３は、配列番号：４、配列番号：１２および配列番号：１８のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む。

【0010】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ２を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号：６８または配列番号：１１で示されるアミノ酸配列を含む。

【0011】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質のＨＣＤＲ２は、配列番号：３または配列番号：１７で示されるアミノ酸配列を含む。

【0012】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１を含み、前記ＨＣＤＲ１は配列番号：２、配列番号：１０および配列番号：１６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む。

【0013】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、Ｈ－ＦＲ１を含み、前記Ｈ－ＦＲ１のＣ末端は前記ＨＣＤＲ１のＮ末端に直接的または間接的に連結され、前記Ｈ－ＦＲ１は配列番号：７２で示されるアミノ酸配列を含む。

【0014】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質のＨ－ＦＲ１は、配列番号：３４、配列番号：４３および配列番号：４９のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む。

【0015】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、Ｈ－ＦＲ２を含み、前記Ｈ－ＦＲ２は前記ＨＣＤＲ１と前記ＨＣＤＲ２との間に位置し、配列番号：７３で示されるアミノ酸配列を含む。

【0016】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質のＨ－ＦＲ２は、配列番号：３５または配列番号：４４で示されるアミノ酸配列を含む。

【0017】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、Ｈ－ＦＲ３を含み、前記Ｈ－ＦＲ３は前記ＨＣＤＲ２と前記ＨＣＤＲ３との間に位置し、配列番号：８０または配列番号：４５で示されるアミノ酸配列を含む。

【0018】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質のＨ－ＦＲ３は、配列番号：３６または配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含む。

【0019】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、Ｈ－ＦＲ４を含み、前記Ｈ－ＦＲ４のＮ末端は前記ＨＣＤＲ３のＣ末端に連結され、前記Ｈ－ＦＲ４は配列番号：７４で示されるアミノ酸配列を含む。

【0020】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質のＨ－ＦＲ４は、配列番号：４６または配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を含む。

【0021】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＶＨを含み、前記ＶＨは配列番号：７８で示されるアミノ酸配列を含む。

【0022】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質のＶＨは、配列番号：１、配列番号：９、配列番号：１５および配列番号：１９のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む。

【0023】

いくつかの実施形態において，前記単離された抗原結合タンパク質は、ＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ３は配列番号：６９で示されるアミノ酸配列を含む。

【0024】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質のＬＣＤＲ３は、配列番号：８、配列番号：１４、配列番号：２３および配列番号：２５のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む。

【0025】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＬＣＤＲ２を含み、前記ＬＣＤＲ２は配列番号：７０で示されるアミノ酸配列を含む。

【0026】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質のＬＣＤＲ２は、配列番号：７または配列番号：２２で示されるアミノ酸配列を含む。

【0027】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＬＣＤＲ１を含み、前記ＬＣＤＲ１は配列番号：７１で示されるアミノ酸配列を含む。

【0028】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質のＬＣＤＲ１は、配列番号：６または配列番号：２１で示されるアミノ酸配列を含む。

【0029】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、Ｌ－ＦＲ１を含み、前記Ｌ－ＦＲ１のＣ末端は前記ＬＣＤＲ１のＮ末端に直接的または間接的に連結され、前記Ｌ－ＦＲ１は配列番号：７５で示されるアミノ酸配列を含む。

【0030】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質のＬ－ＦＲ１は、配列番号：３８、配列番号：４７、配列番号：５０および配列番号：５３のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む。

【0031】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、Ｌ－ＦＲ２を含み、前記Ｌ－ＦＲ２は前記ＬＣＤＲ１と前記ＬＣＤＲ２との間に位置し、配列番号：３９で示されるアミノ酸配列を含む。

【0032】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、Ｌ－ＦＲ３を含み、前記Ｌ－ＦＲ３は前記ＬＣＤＲ２と前記ＬＣＤＲ３との間に位置し、配列番号：７６で示されるアミノ酸配列を含む。

【0033】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質のＬ－ＦＲ３は、配列番号：４０、配列番号：４８および配列番号：５１のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む。

【0034】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、Ｌ－ＦＲ４を含み、前記Ｌ－ＦＲ４のＮ末端は前記ＬＣＤＲ３のＣ末端に連結され、前記Ｌ－ＦＲ４は配列番号：７７で示されるアミノ酸配列を含む。

【0035】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質のＬ－ＦＲ４は、配列番号：４１、配列番号：５２および配列番号：５４のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む。

【0036】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＶＬを含み、前記ＶＬは配列番号：７９で示されるアミノ酸配列を含む。

【0037】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質のＶＬは、配列番号：５、配列番号：１３、配列番号：２０および配列番号：２４のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む。

【0038】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、以下の任意の群から選択されるＶＨおよびＶＬを含み、
１）配列番号：１で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号：５で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
２）配列番号：１５で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号：５で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
３）配列番号：９で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号：１３で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
４）配列番号：１９で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号：２０で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ、および
５）配列番号：１９で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号：２４で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ。

【0039】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、抗体重鎖定常領域を含む。

【0040】

いくつかの実施形態において、前記抗体重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域に由来する。

【0041】

いくつかの実施形態において、前記抗体重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に由来する。

【0042】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、抗体軽鎖定常領域を含む。

【0043】

いくつかの実施形態において、前記抗体軽鎖定常領域は、ヒトＩｇκ定常領域に由来する。

【0044】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含む。

【0045】

いくつかの実施形態において、前記抗原結合断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ）_２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖおよび／またはｄＡｂが含まれる。

【0046】

いくつかの実施形態において、前記抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体から成る群の１種以上から選択される。

【0047】

いくつかの実施形態において、ＦＡＣＳで検証されるように、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ１８．２への結合に関して参照抗体と実質的に競合せず、前記参照抗体は重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記参照抗体のＶＨは配列番号５５で示されるアミノ酸配列を含み、前記参照抗体のＶＬは配列番号５６で示されるアミノ酸配列を含む。

【0048】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合することができるが、ＣＬＤＮ１８．１には実質的に結合しない。

【0049】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質が特異的に結合することができるＣＬＤＮ１８．２は、マウスＣＬＤＮ１８．２、カニクイザルＣＬＤＮ１８．２および／またはヒトＣＬＤＮ１８．２を含む。

【0050】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＣＤＣ活性を有する。

【0051】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、腫瘍の成長および／または腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。

【0052】

別の態様において、本出願は、本出願に記載の抗原結合タンパク質を含む標的部分を、含むキメラ抗原受容体も提供する。

【0053】

いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、共刺激ドメインを含み、前記共刺激ドメインはＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＯＸ４０、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＳＬＡＭ、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、２Ｂ４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＰＤ－１、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＪＡＭＬ、ＣＤ２４４、ＣＤ１００、ＩＣＯＳ、ＣＤ８３のリガンド、ＣＤ４０およびＭｙＤ８８からなる群から選択される１種以上のタンパク質に由来する共刺激ドメインを含む。

【0054】

いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の共刺激ドメインは、４－１ＢＢ由来の細胞内共刺激シグナル伝達領域である。

【0055】

いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の共刺激ドメインは、配列番号：８５で示されるアミノ酸配列を含む。

【0056】

いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃεＲＩγ、ＦｃεＲＩβ、ＦｃγＲＩＩａ、ウシ白血病ウイルスｇｐ３０、エプスタイン・バーウイルス （ＥＢＶ）ＬＭＰ２Ａ、サル免疫不全ウイルスＰＢｊ１４ Ｎｅｆ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＨＳＫＶ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ－１２および少なくとも１つのＩＴＡＭを含むドメインを含む。

【0057】

いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインである。

【0058】

いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号：８６で示されるアミノ酸配列を含む。

【0059】

いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、膜貫通ドメインを含み、前記膜貫通ドメインはＣＤ８、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＰＤ－１、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＣＤ５、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４、ＣＤ２４４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＣＤ２、ＮＫＧ２Ｃ、ＬＩＧＨＴ、ＤＡＰ１２，ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４およびＳＬＡＭからなる群から選択される１種以上のタンパク質に由来する膜貫通ドメインを含む。

【0060】

いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８に由来する膜貫通ドメインである。

【0061】

いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記膜貫通ドメインは、配列番号：８４で示されるアミノ酸配列を含む。

【0062】

いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、標的部分と膜貫通ドメインとの間にヒンジ領域を含み、前記ヒンジ領域はＣＤ２８、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＣＤ８、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＤＡＰ１０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＣＤ２２６、ＳＬＡＭ、ＣＤ３０およびＬＩＧＨＴからなる群から選択される１種以上のタンパク質に由来するヒンジ領域を含む。

【0063】

いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記ヒンジ領域は、ＣＤ８に由来するヒンジ領域である。

【0064】

いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記ヒンジ領域は、配列番号：８３で示されるアミノ酸配列を含む。

【0065】

いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、シグナルペプチドをさらに含む。

【0066】

いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記シグナルペプチドは、ＣＤ８タンパク質に由来するシグナルペプチドである。

【0067】

いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記シグナルペプチドは、配列番号：８８で示されるアミノ酸配列を含む。

【0068】

いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片をさらに含む。

【0069】

いくつかの実施形態において、前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１～１２およびその機能的断片からなる群から選択される１種以上を含む。

【0070】

いくつかの実施形態において、前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片は、配列番号：９１で示されるアミノ酸配列を含む。

【0071】

別の態様において、本出願は、前記単離された抗原結合タンパク質または前記キメラ抗原受容体を含むポリペプチド分子も提供する。

【0072】

いくつかの実施形態において、前記ポリペプチド分子は、融合タンパク質を含む。

【0073】

別の態様において、本出願は、前記単離された抗原結合タンパク質を含む免疫複合体も提供する。

【0074】

別の態様において、本出願は、前記単離された抗原結合タンパク質、前記キメラ抗原受容体または前記ポリペプチド分子をコードする単離された１種以上の核酸分子も提供する。

【0075】

いくつかの実施形態において、前記核酸分子は、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２および配列番号：３３のいずれかで示される塩基配列を含む。

【0076】

いくつかの実施形態において、前記核酸分子は、以下の任意の群から選択される塩基配列を含み、
１）配列番号２６で示される塩基配列、および配列番号２７で示される塩基配列、
２）配列番号３０に示される塩基配列、および配列番号２７で示される塩基配列、
３）配列番号２８に示される塩基配列、および配列番号２９で示される塩基配列、
４）配列番号３１に示される塩基配列、および配列番号３２で示される塩基配列、および
５）配列番号３１に示される塩基配列、および配列番号３３で示される塩基配列。

【0077】

別の態様において、本出願は、前記核酸分子を含むベクターも提供する。

【0078】

別の態様において、本出願は、前記単離された抗原結合タンパク質、前記キメラ抗原受容体、前記ポリペプチド分子、前記核酸分子または前記ベクターを含む細胞も提供する。

【0079】

いくつかの実施形態において、前記細胞は、免疫エフェクター細胞である。

【0080】

いくつかの実施形態において、前記細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、単球、樹状細胞、顆粒球、リンパ球、白血球、末梢血単核球、胚性幹細胞、リンパ球前駆細胞および／または多能性幹細胞を含む。

【0081】

いくつかの実施形態において、前記細胞は、Ｔ細胞である。

【0082】

いくつかの実施形態において、前記細胞は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片をさらに含み、および／または発現する。

【0083】

いくつかの実施形態において、前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１～１２およびその機能的断片からなる群から選択される１種以上を含む。

【0084】

いくつかの実施形態において、前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５および／または６あるいはその断片である。

【0085】

いくつかの実施形態において、前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片は、配列番号：９１で示されるアミノ酸配列を含む。

【0086】

別の態様において、本出願は、前記単離された抗原結合タンパク質、前記キメラ抗原受容体、前記ポリペプチド分子、前記免疫複合体、前記核酸分子、前記ベクターおよび／または前記細胞、および任意で薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。

【0087】

別の態様において、本出願は、前記抗原結合タンパク質が発現される条件下で、前記細胞を培養することを含む前記単離された抗原結合タンパク質の調製方法も提供する。

【0088】

別の態様において、本出願は、疾患および／または障害を予防、緩和および／または治療するための医薬品の調製における前記単離された抗原結合タンパク質、前記キメラ抗原受容体、前記ポリペプチド分子、前記免疫複合体、前記核酸分子、前記ベクター、前記細胞および／または前記医薬組成物の使用も提供する。

【0089】

いくつかの実施形態において、前記疾病および／または障害には、癌が含まれる。

【0090】

いくつかの実施形態において、前記癌には、固形腫瘍および／または血液腫瘍が含まれる。

【0091】

いくつかの実施形態において、前記癌には、胃癌および／または結腸癌が含まれる。

【0092】

別の態様において、本出願は、前記単離された抗原結合タンパク質、前記キメラ抗原受容体、前記ポリペプチド分子、前記免疫複合体、前記核酸分子、前記ベクター、前記細胞および／または前記医薬組成物を投与することを含む、サンプル中のＣＬＤＮ１８．２を検出する方法も提供する。

【0093】

別の態様において、本出願は、前記単離された抗原結合タンパク質、前記キメラ抗原受容体、前記ポリペプチド分子、前記免疫複合体、前記核酸分子、前記ベクター、前記細胞および／または前記医薬組成物を含む、サンプル中のＣＬＤＮ１８．２を検出するための試薬またはキットも提供する。

【0094】

別の態様において、本出願は、サンプル中のＣＬＤＮ１８．２の存在および／または含有量を検出するためのキットの調製における前記単離された抗原結合タンパク質、前記キメラ抗原受容体、前記ポリペプチド分子、前記免疫複合体、前記核酸分子、前記ベクター、前記細胞および／または前記医薬組成物の使用も提供する。

【0095】

当業者は、下記の詳細な説明から本出願の他の態様および利点を容易に理解することができる。下記の詳細な説明では、本出願の例示的な実施形態のみを示して説明する。当業者が理解するように、本出願の内容により、当業者は、本出願に係る発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された具体的実施形態に変更を加えることができる。また、本出願の添付の図面および明細書における説明は、すべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。

【図面の簡単な説明】

【0096】

本出願に係る発明の具体的特徴は、添付の特許請求の範囲に記載されている。下記の詳細に説明する例示的な実施形態および図面を参照して本出願に係る発明の特徴および利点をさらに理解することができる。

【0097】

【図1】本出願の抗原結合タンパク質と高発現ヒトＣＬＤＮ１８．２細胞のフローサイトメトリーによる結合活性アッセイを示すグラフである。

【図2】本出願の抗原結合タンパク質と高発現ヒトＣＬＤＮ１８．１細胞のフローサイトメトリーによる結合活性アッセイを示すグラフである。

【図3】本出願の抗原結合タンパク質と腫瘍細胞系のフローサイトメトリーによる結合活性アッセイを示すグラフである。

【図4】本出願の抗原結合タンパク質の種交差結合活性解析を示すグラフである。

【図5a-5b】本出願の抗原結合タンパク質のＣＤＣ活性アッセイを示すグラフである。

【図6】本出願の抗原結合タンパク質の競合結合活性解析を示すグラフである。

【図7】投与後のマウスの体重変化を示すグラフである。

【図8】投与後のマウスの体重の相対変化（％）を示すグラフである。

【図9】投与後のマウスの腫瘍体積の変化を示すグラフである。

【図10】投与後のマウスの腫瘍抑制率を示すグラフである。

【図11】投与後のマウスの生存曲線を示すグラフである。

【図12A-B】ＣＬＤＮ１８．２一本鎖抗体の抗原結合活性の同定を示すグラフである。

【図13】ＣＬＤＮ１８．２一本鎖抗体と非標的細胞の結合活性の同定を示すグラフである。

【図14】ヒト胃癌のマウスモデルにおける、本出願のＣＬＤＮ１８．２抗原結合タンパク質の抗腫瘍活性を示すグラフである。

【図15A-D】Ｔ細胞におけるＣＬＤＮ１８．２特異的ＣＡＲの発現状況を示すグラフである。

【図16】ＣＡＲ-Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性アッセイを示すグラフである。

【図17A-B】ＣＬＤＮ１８．２特異的ＣＡＲの因子分泌の検出を示すグラフである。

【図18A-D】マウス結腸癌ＣＤＸモデルにおけるＣＬＤＮ１８．２特異的ＣＡＲ-Ｔ細胞の抗腫瘍作用を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0098】

以下、特定の具体的実施例を挙げて本出願の発明の実施形態を説明し、当業者は本明細書に開示された内容から本出願の発明その他の利点および効果を容易に理解することができる。

【0099】

（用語定義）
本出願において、「ＣＬＤＮ１８．２」または「Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２」という用語は、互換的に使用され、一般的に細胞結合クローディンＣｌａｕｄｉｎ１８のアイソフォーム２を指す。この用語には、「完全長」の未プロセシングＣＬＤＮ１８．２、および細胞プロセシングから生じるあらゆる形態のＣＬＤＮ１８．２が含まれる。ＣＬＤＮ１８．２には、完全なＣＬＤＮ１８．２および断片、機能的変異体、アイソフォーム、物種相同体、誘導体、類似体、およびＣＬＤＮ１８．２と共通の少なくとも１つのエピトープを有する類似体が含まれ得る。ＣＬＤＮ１８．２（例えばヒトＣＬＤＮ１８．２）のアミノ酸配列は、当技術分野で既知のものであり得る。例えばヒトＣＬＤＮ１８．２塩基配列は、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１００２０２６．３で示すことができる。例えばマウスＣＬＤＮ１８．２塩基配列は、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１９４９２１．１で示すことができる。例えばカニクイザルＣＬＤＮ１８．２塩基配列は、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００１１１４７０８．４で示すことができる。

【0100】

本出願において、「ＣＬＤＮ１８．１」または「Ｃｌａｕｄｉｎ１８．１」という用語は、互換的に使用され、一般的に細胞結合クローディンＣｌａｕｄｉｎ１８のアイソフォーム１を指す。この用語には、「完全長」の未プロセシングＣＬＤＮ１８．１、および細胞プロセシングから生じるあらゆる形態のＣＬＤＮ１８．２が含まれる。ＣＬＤＮ１８．２には、完全なＣＬＤＮ１８．１および断片、機能的変異体、アイソフォーム、物種相同体、誘導体、類似体、およびＣＬＤＮ１８．１と共通の少なくとも１つのエピトープを有する類似体が含まれ得る。ＣＬＤＮ１８．１（例えばヒトＣＬＤＮ１８．１）のアミノ酸配列は、当技術分野で既知のものであり得る。例えばヒトＣＬＤＮ１８．１塩基配列は、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６３６９．４で示すことができる。例えばマウスＣＬＤＮ１８．１塩基配列は、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１９８１５．３で示すことができる。例えばカニクイザルＣＬＤＮ１８．１塩基配列は、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００５５４５８６３．２で示すことができる。

【0101】

本出願において、「単離された」という用語は通常、人工的手段によって自然状態から得られることを意味する。自然界に「分離された」物質または成分が存在する場合、「分離された」物質または成分が位置する自然環境は変更されたか、自然環境から該物質が分離されたか、あるいはその両方である可能性がある。例えば生きている動物には単離されていないポリヌクレオチドまたはポリペプチドが自然に存在し、この自然状態から単離された高純度の同じポリヌクレオチドあるいはポリペプチドを単離という。用語「単離された」は、人工または合成物質の混合、物質の活性に影響を与えない他の不純物質の存在を排除するものではない。

【0102】

本出願において、「単離された抗原結合タンパク質」という用語は、通常、人工的手段によって自然状態から得られ、抗原結合能を有するタンパク質を意味する。該「単離された抗原結合タンパク質」は、抗原結合部分と、任意選択で抗原への前記抗原結合部分の結合を促進するコンフォメーションを抗原結合部分がとることを可能にする枠組みあるいは枠組み部分とを含み得る。抗原結合タンパク質は、例えば抗体由来タンパク質枠組み領域（ＦＲ）またはＣＤＲあるいはＣＤＲ誘導体が移植された代替タンパク質枠組み領域もしくは人工枠組み領域を含み得る。このような枠組みには、例えば抗原結合タンパク質の三次元構造を安定化するために導入された変異を含む抗体由来の枠組み領域、および例えば生体適合性ポリマーを含む完全に合成された枠組み領域が含まれるが、これらに限定されない。例えば非特許文献２、非特許文献３を参照する。抗原結合タンパク質の例として、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体、一本鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ）_２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、またはＩｇＧ４抗体およびその断片が挙げられる。

【0103】

本出願において、「可変ドメイン」および「可変領域」という用語は、互換的に使用され、一般的に抗体の重鎖および／または軽鎖の一部を指す。重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ「Ｖ_Ｈ」および「“Ｖ_Ｌ」（あるいはそれぞれ「ＶＨ」および「ＶＬ」）と呼ぶことができる。これらのドメインは通常、（同じクラスの他の抗体と比較して）抗体の最も変化しやすい部分であり、抗原結合部位を含む。

【0104】

本出願において、「可変」という用語は、一般的に可変ドメインのある部分が抗体間の配列で非常に異なることを意味する。可変ドメインは、抗原結合を媒介し、特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を決定する。ただし、可変性は可変ドメイン全体に均等に分散されていない。通常、軽鎖および重鎖の両方の可変ドメイン中の超可変領域（ＣＤＲまたはＨＶＲ）と呼ばれる３つの部分に集中している。可変ドメインの中でより高度に保存された部分は、枠組み領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは主としてβ－シート構造を持ち、３つのループ状連結を形成し、場合によりβ－シート構造の部分を形成するＣＤＲにより連結された４つのＦＲ領域を含む。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲ領域により非常にもう一方の鎖のＣＤＲと近接して保持され、抗体の抗原結合部位の形成に一役買う（非特許文献４参照）。

【0105】

本出願において、「抗体」という用語は、一般的にインビトロまたはインビボで産生されたかどうかにかかわらず、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを包含する、免疫グロブリンあるいはその断片もしくは誘導体を指す。この用語には、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異性、多重特異性、非特異性、ヒト化、一本鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、変異および移植の抗体が含まれるが、これらに限定されない。「インタクト抗体」のように、「インタクト」という用語によって特に修飾されない限り、本発明の目的のため、「抗体」という用語は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂなどの抗体断片および抗原結合機能を保持する他の抗体断片（例えばヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する）を含む。このような断片は、抗原結合ドメインを含む。基本的な４鎖抗体ユニットは、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、５つの基本的なヘテロ四量体ユニットとＪ鎖と呼ばれる別のポリペプチドで構成され、１０個の抗原結合部位を含むが、ＩｇＡ抗体には、Ｊ鎖と結合・重合して多価組み合わせを形成する２～５個の基本的な４鎖ユニットを含む。ＩｇＧの場合、４鎖ユニットは一般的に約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は共有ジスルフィド結合によってＨ鎖につながっているが、２つのＨ鎖はＨ鎖のアイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合によって互いにつながっている。各Ｈ鎖およびＬ鎖はまた、規則的に間隔があいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端において、可変ドメイン（ＶＨ）、続いてα鎖およびγ鎖のそれぞれに関する３個の定常ドメイン（ＣＨ）、並びにμアイソタイプおよびεアイソタイプに関する４個のＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）、続いてもう一方の末端に定常ドメインを有する。ＶＬはＶＨとアライメントされ、ＣＬは重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とアライメントされる。特定のアミノ酸残基は軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられている。ＶＨおよびＶＬの対合は、単一の抗原結合部位を共に形成する。様々なクラスの抗体の構造および特性に関して、例えば非特許文献５を参照する。任意の脊椎動物種に由来するＬ鎖を、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κおよびλと呼ばれる２種の明確に異なるタイプのうちの一方に帰属させることができる。重鎖（ＣＨ）の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを様々なクラスまたはアイソタイプに帰属させることができる。５つのクラスの免疫グロブリン：それぞれα、δ、ε、γおよびμと命名された重鎖を有するＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在する。ＣＨ配列と機能の比較的小さな違いに基づいてγおよびαをサブクラスさらに分類し、例えばヒトはＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＫ１のサブクラスを発現する。

【0106】

本出願において、「ＣＤＲ」という用語は、「相補性決定領域」とも呼ばれ、一般的に抗体の可変ドメイン内の領域を指し、その配列は超可変であり、および／または構造ループを形成する。一般的に抗体は、ＶＨにある３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）、ＶＬにある３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）という６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、重鎖のみからなる天然に存在するラクダ科動物抗体は、軽鎖がない場合においてその機能も正常で安定化することができる。例えば非特許文献６を参照する。

【0107】

本出願において、「ＦＲ」という用語は、一般的に抗体可変ドメインの中でより高度に保存された部分を指し、枠組み領域と呼ばれる。通常、天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ４つのＦＲ領域を含み、すなわちＶＨに４つ（Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３、およびＨ－ＦＲ４）、ＶＬに４つ（Ｌ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３およびＬ－ＦＲ４）がある。例えば、本出願の単離された抗原結合タンパク質のＶＬは、枠組み領域Ｌ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３、およびＬ－ＦＲ４を含み得る。本出願の単離された抗原結合タンパク質のＶＨは、枠組み領域Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３、およびＨ－ＦＲ４を含み得る。

【0108】

本出願において、「抗原結合断片」という用語は、一般的に抗原（例えばＣＬＤＮ１８．２）に特異的に結合する能力を有する１つ以上の断片を指す。本出願において、抗原結合断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）_２，ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖおよび／またはｄＡｂが含まれることができる。

【0109】

本出願において、「Ｆａｂ」という用語は、一般的に抗体の抗原結合断片を指す。上記のようにパパインでインタクト抗体を消化できる。抗体は、パパイン消化により、２つの同一の抗原結合断片、すなわち「Ｆａｂ」断片、および残りの「Ｆｃ」断片（すなわち、Ｆｃ領域、同上）を生成する。Ｆａｂ断片は、１本の完全なＬ鎖と重鎖の可変領域およびＨ鎖（ＶＨ）の第１の定常領域（ＣＨ１）からなり得る。

【0110】

本出願において、「Ｆａｂ’断片」という用語は、一般的にＦａｂ断片よりわずかに大きい断片である、ヒトモノクローナル抗体の一価抗原結合断片を指す。例えばＦａｂ’断片は、軽鎖の全て、重鎖の可変ドメインの全て、および重鎖の第１と第２の定常領域の全てまたは一部を含み得る。例えばＦａｂ’断片は、重鎖の２２０～３３０個のアミノ酸残基の一部または全部も含み得る。

【0111】

本出願において、「Ｆ（ａｂ’）２」という用語は、一般的にペプシンでインタクト抗体を消化して生成される抗体断片を指す。Ｆ（ａｂ’）２断片には、ジスルフィド結合した２つのＦａｂ断片とヒンジ領域の一部が含まれる。Ｆ（ａｂ’）２断片は二価の抗原結合活性を持ち、抗原を架橋することができる。

【0112】

本出願において、「Ｆｖ断片」という用語は、一般的に重鎖可変領域および軽鎖可変領域の全部または一部を含み、重鎖定常領域および軽鎖定常領域を欠くヒトモノクローナル抗体の一価の抗原結合断片を指す。重鎖可変領域および軽鎖可変領域には、例えばＣＤＲが含まれる。例えばＦｖ断片は、重鎖および軽鎖の約１１０個のアミノ酸のアミノ末端可変領域の全部または一部を含む。

【0113】

本出願において、「ｓｃＦｖ」という用語は、一般的に軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片と、重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片とを含む融合タンパク質を指し、前記軽鎖および重鎖の可変領域は、（例えば短い柔軟なポリペプチドリンカーなどの合成リンカーを介して）隣接し、且つ単鎖ポリペプチドの形態で発現することができ、前記ｓｃＦｖが由来するインタクト抗体の特異性を保留する。特記しない限り、本出願で使用されるように、ｓｃＦｖは、任意の順序で（例えばポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に対して）前記ＶＬおよびＶＨの可変領域を有し得、ｓｃＦｖはＶＬリンカー-ＶＨあるいはＶＨ－リンカー－ＶＬを含み得る。

【0114】

本出願において、「ｄＡｂ」という用語は、一般的にＶＨドメイン、ＶＬドメインを有するあるいはＶＨドメインまたはＶＬドメインを有する抗原結合断片を指す。例えば非特許文献７、非特許文献８、および例えば特許文献１、特許文献２およびＤｏｍａｎｔｉｓＬｔｄの他の公開特許出願を参照する。

【0115】

本出願において、「モノクローナル抗体」という用語は、一般的に単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体は単一の抗原部位に対する高い特異性を有する。抗原決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む、従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的で、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の抗原決定基を対象とする。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンにより汚染されていないハイブリドーマ培養により合成される点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、いかなる特定の方法による抗体の産生が必要であると解釈されない。例えば本出願で使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞で作製することができ、もしくは組換えＤＮＡ法によって作製することができる。

【0116】

本出願において、「キメラ抗体」という用語は、一般的に可変領域が１つの物種に由来し、定常領域が別の物種に由来する抗体を指す。通常、可変領域は齧歯類などの実験動物の抗体（「親抗体」）に由来し、定常領域はヒト抗体に由来するため、得られるキメラ抗体は親（例：マウス由来）抗体に比べ、ヒト個体において有害な免疫反応を引き起こす可能性が低くなる。

【0117】

本出願において、「ヒト化抗体」という用語は、一般的に非ヒト抗体（例：マウス抗体）のＣＤＲ領域以外のアミノ酸の一部または全部が、ヒト免疫グロブリン由来の対応するアミノ酸で置換されている抗体を指す。ＣＤＲ領域において、アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換もしくは修飾もまた、それらが特定の抗原に結合する抗体の能力を保留している限り許容され得る。ヒト化抗体は、任意選択でヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含む。「ヒト化抗体」は、元の抗体に似ている抗原特異性を保留している。非ヒト（例：マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の配列のキメラ抗体を最低限で含み得る。場合により、ヒト免疫グロブリン（受容体抗体）のＣＤＲ領域残基を、所望の特性、親和性および／または能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）（例：マウス、ラットまたは非ヒト霊長類）ＣＤＲ領域における残基に置き換えることができる。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦＲ領域残基を対応する非ヒト残基で置換し得る。なお、ヒト化抗体は、受容体抗体あるいはドナー抗体に存在しないアミノ酸修飾を含み得る。これらの修飾は、結合親和性などの抗体特性をさらに改良するために行うことができる。

【0118】

「完全ヒト抗体」という用語は、一般的にヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を指す。完全ヒト抗体は、マウス、マウス細胞、あるいはマウス細胞由来のハイブリドーマで産生される場合、マウス糖鎖を含む可能性がある。同様に、「マウス抗体」あるいは「ラット抗体」は、それぞれマウスあるいはラット免疫グロブリン配列のみを含む抗体を指す。ファージディスプレイまたは他の分子生物学的方法により、ヒト、ヒト免疫グロブリン生殖系列配列を有するトランスジェニック動物において完全ヒト抗体を産生することができる。抗体を作製するために使用できる例示的な技術は、特許文献３、特許文献４、特許文献５に記載されている。ライブラリを使用するなどの他の技術は、当技術分野で知られている。

【0119】

本出願において、「直接的に連結された」という用語は、「間接的に連結された」という用語と対比され、一般的に直接的に連結されたことを意味する。例えば直接的に連結されたことは、スペーサーを介さずに物質同士が直接的に連結される場合であり得る。前記スペーサーは、リンカーであってもよい。例えばリンカーは、ペプチドリンカーであり得る。「間接的に連結された」という用語は、一般的に物質同士が直接的に連結されていない場合を意味する。例えば間接的に連結されたことは、スペーサーを介した連結であってもよい。例えば本出願の単離された抗原結合タンパク質において、前記Ｌ－ＦＲ１のＣ末端と前記ＬＣＤＲ１のＮ末端は、直接的または間接的に連結され得る。

【0120】

本出願において、「単離された核酸分子」という用語は、一般的に単離された形態の任意の長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、あるいはそれらの自然環境から単離されたもしくは人工的に合成された類似体を指す。

【0121】

本出願において、「ベクター」という用語は、一般的にタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入し、タンパク質を発現させることができる核酸送達ビヒクルを指す。ベクターは、宿主細胞を形質転換、形質導入、またはトランスフェクトすることで、ベクターによって運ばれる遺伝物質エレメントを宿主細胞で発現させることができる。例えばベクターには、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）あるいはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、λファージまたはＭ１３ファージなどのファージおよび動物ウイルスなどが含まれる。ベクターとして使用される動物ウイルス種類には、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスなど）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポバウイルス（ＳＶ４０など）が含まれる。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント、およびレポーター遺伝子を含む、発現を制御する多種エレメントを含む場合がある。なお、ベクターは複製起点を含んでいてもよい。ベクターには、ウイルス粒子、リポソーム、あるいはカプシドなど、細胞への侵入を促進する成分も含まれる場合があるが、これらだけではない。

【0122】

本出願において、「細胞」という用語は、一般的に本発明に記載の核酸分子または本発明に記載のベクターを含む、被験体のプラスミドあるいはベクターのレシピエントであるもしくはあった単一の細胞、細胞系もしくは細胞培養物を指す。細胞は、単一細胞の子孫を含み得る。自然、偶発的、または意図的な変異により、子孫は元の親細胞と必ずしも（全ＤＮＡ補体の形態またはゲノムで）同一であるとは限らない。細胞は、本出願に記載のベクターを用いてインビトロでトランスフェクトされた細胞を含み得る。細胞は、細菌細胞（例：大腸菌）、酵母細胞、またはＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＬＮＣＡＰ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＮＳ０細胞または幹細胞（例：ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞）あるいは免疫細胞（例：Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ）などの他の真核細胞であり得る。いくつかの実施形態において、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞はＨＥＫ２９３細胞である。

【0123】

本出願において、「医薬組成物」という用語は、一般的に疾患または障害を予防／治療するための組成物を指す。前記医薬組成物は、本出願に記載の単離された抗原結合タンパク質、本出願に記載の核酸分子、本出願に記載の担体および／または本出願に記載の細胞、および任意で薬学的に許容されるアジュバントを含み得る。なお、前記医薬組成物は、１種以上の（薬学的に有効な）担体、安定剤、賦形剤、希釈剤、可溶化剤、界面活性剤、乳化剤および／または保存剤の適切な製剤を含んでもよい。組成物の許容される成分は、好ましくは使用される投与量および濃度でレシピエントに対して無毒である。本発明の医薬組成物には、液体、凍結および凍結乾燥組成物が含まれるが、これらに限定されない。

【0124】

本出願において、「薬学的に許容される担体」という用語は、一般的に使用される投与量および濃度で曝露される細胞あるいは哺乳動物に対して無毒である、薬学的に許容されるベクター、賦形剤もしくは安定剤を含む。生理学的に許容される担体の例としては、緩衝剤、抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、タンパク質、親水性ポリマー、アミノ酸、単糖類、二糖類および他の炭水化物、キレート剤、糖アルコール、塩形成対立イオン（例：ナトリウム）および／または非イオン性界面活性剤が挙げられる。

【0125】

本出願において、「特異的に結合する」または「特異的な」という用語は、一般的に標的と抗体との間の結合など、分子（生体分子を含む）の不均一な集団の存在下で標的の存在を決定できる、測定可能かつ再現可能な相互作用を指す。例えば標的（エピトープであり得る）に特異的に結合する抗体は、他の標的に結合するよりも高い親和性、結合力、容易さ、および／または長い持続時間で該標的に結合する抗体であり得る。いくつかの実施形態において、抗体は、異なる種のタンパク質間で保存されているタンパク質上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、特異的結合は排他的結合を含み得るが、これを必要としない。

【0126】

本出願において、「参照抗体」という用語は、一般的に抗原（例：ＣＬＤＮ１８．２）に結合できる抗体を指す。場合によって本出願に記載の抗原結合タンパク質は、参照抗体と比較して競合結合活性を有さない。場合によって本出願に記載の参照抗体は、ゾルベツキシマブであり得る。

【0127】

本出願において、「実質的に結合しない」という用語は、一般に結合しないこと、または非常に弱い結合活性で結合することを意味する。ここで、非常に弱い結合活性とは、例えばフローサイトメトリーによる結合活性アッセイにおいて、ＣＬＤＮ１８．１に結合することが検出される抗体の平均蛍光強度値は、ＣＬＤＮ１８．１抗体陽性対照より約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９１％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％少なくとも低い。

【0128】

本出願において、「被験体」という用語は、一般的にネコ、イヌ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、またはサルを含むがこれらに限定されない、ヒトあるいはヒト以外の動物を指す。

【0129】

本出願において「腫瘍」という用語は、一般的に異常な細胞増殖によって形成される新生物または充実性病変を指す。本出願において腫瘍は、固形腫瘍または血液腫瘍であり得る。例えば本出願において、腫瘍は、ＣＬＤＮ１８．２陽性腫瘍であり得る。

【0130】

「癌」という用語は、一般的に異常細胞の急速かつ制御不能な増殖を特徴とする疾患を指す。癌細胞は、血流やリンパ系を介して局所的に広がること、または体の他の部分に広がることができる。本出願における癌には、胃癌および／または結腸癌などが含まれるが、これらに限定されない。「腫瘍」および「癌」という用語は、本明細書では互換的に使用され、例えば両方の用語は、固形腫瘍および血液腫瘍、例えば、びまん性腫瘍あるいは循環性腫瘍を包含する。本明細書で使用される場合、用語「癌」または「腫瘍」には、前癌性および悪性の癌および腫瘍が含まれ得る。

【0131】

本出願において、かかるタンパク質、ポリペプチドおよび／またはアミノ酸配列は、該タンパク質またはポリペプチドと同一あるいは類似の機能を有するバリアントまたはホモログを少なくとも含むと理解されるべきである。

【0132】

本出願において、前記バリアントは、例えば前記タンパク質および／または前記ポリペプチド（例えばＣＬＤＮ１８．２タンパク質に特異的に結合する抗体あるいはその断片）のアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が置換、欠失、または付加されたタンパク質またはポリペプチドであり得る。例えば機能的バリアントは、１～３０個、１～２０個あるいは１～１０個などの少なくとも１個、さらに例えば１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸が置換、欠失、または付加されることにより、アミノ酸改変を有するタンパク質またはポリペプチドを含み得る。前記機能的バリアントは、改変（例えば置換、欠失または付加）前の前記タンパク質または前記ポリペプチドの生物学的特性を実質的に維持し得る。例えば機能的バリアントは、改変前の前記タンパク質または前記ポリペプチドの生物学的活性（例えば抗原結合能）の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、あるいは１００％を維持し得る。例えば前記置換は、保存的置換であり得る。

【0133】

本出願において、前記ホモログは、前記タンパク質および／または前記ポリペプチド（例えばＣＬＤＮ１８．２タンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片）のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％（例えば少なくとも約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはこれ以上を有する）の配列相同性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。

【0134】

本出願において、相同性は、一般的に２つ以上の配列間の近似性、類似性あるいは関連性を意味する。次の方法により「配列相同性のパーセンテージ」を計算できる。比較ウィンドウでアラインされる２本の配列を比較し、２本の配列に同じ核酸塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）あるいは同じアミノ酸残基（例えばＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔ）が存在する位置の数を確認して一致する位置の数を得、一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウの大きさ）で割り、その結果に１００を掛けて配列相同性のパーセンテージを求める。配列相同性のパーセンテージを確認するためのアラインメントは、当技術分野で知られている様々な方法で実現でき、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、もしくはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて実現できる。当業者は、配列をアラインメントさせるための適切なパラメータを確認することができ、これには、比較されている配列の全長にわたり、あるいはターゲットする配列の領域にわたり、最大のアラインメントを実現するために必要な任意のアルゴリズムが含まれる。前記相同性は、ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴの方法によっても測定できる。ＦＡＳＴＡアルゴリズムに関する説明は、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１を参照する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムの説明については、非特許文献１２を参照する。

【0135】

本出願において、「含む」という用語は、一般的に、含む、総括する、含有する、または包含するという意味を指す。場合により、「のため」、「……からなる」を意味することもある。

【0136】

本出願において、「約」という用語は、一般的に、所定値の上下０．５％～１０％の範囲内で変動することを意味し、例えば所定値の上下０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、または１０％の範囲内で変動する。

【0137】

（発明の詳細な説明）
抗体のＣＤＲは、相補性決定領域とも呼ばれ、可変領域の一部である。この領域のアミノ酸残基は、抗原または抗原エピトープと接触することができる。抗体のＣＤＲは、ＣＣＧ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、総合考慮Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａなどの複数種の番号付けシステムによって決定できる。これらの番号付けシステムは、当技術分野で知られ、具体的にはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ＃ｋａｂａｔｎｕｍを参照できる。当業者は、抗体の配列および構造に基づいて、異なる番号付けシステムでＣＤＲ領域を決定できる。異なる番号付けシステムを使用する場合、ＣＤＲ領域に違いが生じる場合がある。本出願において、前記ＣＤＲは、任意のＣＤＲ割り当て方法により割り当てて得られたＣＤＲ配列を包含でき、そのバリアントも包含する。前記バリアントは、１つ以上のアミノ酸が置換、欠失および／または付加された前記ＣＤＲのアミノ酸配列を含む。例えば１～３０個、１～２０個または１～１０個、また例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個あるいは９個のアミノ酸が置換、欠失および／または挿入され、これらのホモログも包含し、前記ホモログは、前記ＣＤＲのアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％（例えば少なくとも約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはこれ以上を有する）の配列相同性を有するアミノ酸配列であり得る

【0138】

一態様において、本出願は、ＨＣＤＲ３を含み得る単離された抗原結合タンパク質を提供する。本出願において、前記ＨＣＤＲ３は、配列番号：６７で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記ＨＣＤＲ３は、配列番号：４で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記ＨＣＤＲ３は、配列番号：１２で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記ＨＣＤＲ３は、配列番号：１８で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0139】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ２を含み得る。本出願において、前記ＨＣＤＲ２は配列番号：６８で示されるアミノ酸配列を含み得る。本出願において、前記ＨＣＤＲ２は、配列番号：１１で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記ＨＣＤＲ２は、配列番号：３で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記ＨＣＤＲ２は、配列番号：１７で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0140】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１を含み得る。本出願において、前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：２で示されるアミノ酸配列を含み得る。本出願において、前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：１０で示されるアミノ酸配列を含み得る。本出願において、前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：１６で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0141】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み得る。本出願において、前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：２、配列番号：１０および配列番号：１６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＨＣＤＲ２は配列番号：６８または配列番号：１１で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＨＣＤＲ３は配列番号：６７で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0142】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質のＨＣＤＲ１は、配列番号：２、配列番号：１０および配列番号：１６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＨＣＤＲ２は配列番号：３、配列番号：１７および配列番号：１１のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＨＣＤＲ３は配列番号：４、配列番号：１２および配列番号：１８のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0143】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質のＨＣＤＲ１，ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は、は、以下の任意の群から選択されるアミノ酸配列を含み得、
１）前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：２で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＨＣＤＲ２は配列番号：３で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＨＣＤＲ３は配列番号：４で示されるアミノ酸配列を含み得、
２）前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：１０で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＨＣＤＲ２は配列番号：１１で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＨＣＤＲ３は配列番号：１２で示されるアミノ酸配列を含み得、
３）前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：１６で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＨＣＤＲ２は配列番号：１７で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＨＣＤＲ３は配列番号：１８で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0144】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、Ｈ－ＦＲ１を含み得、前記Ｈ－ＦＲ１のＣ末端は前記ＨＣＤＲ１のＮ末端に直接的または間接的に連結され、前記Ｈ－ＦＲ１は配列番号：７２で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記Ｈ－ＦＲ１は、配列番号：３４で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記Ｈ－ＦＲ１は、配列番号：４３で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記Ｈ－ＦＲ１は、配列番号：４９で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0145】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、Ｈ－ＦＲ２を含み得、前記Ｈ－ＦＲ２は前記ＨＣＤＲ１と前記ＨＣＤＲ２との間に位置し、配列番号：７３で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記Ｈ－ＦＲ２は、配列番号：３５で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記Ｈ－ＦＲ２は、配列番号：４４で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0146】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、Ｈ－ＦＲ３を含み得、前記Ｈ－ＦＲ３は前記ＨＣＤＲ２と前記ＨＣＤＲ３との間に位置し、配列番号：８０で示されるアミノ酸配列を含み得る。本出願において、前記Ｈ－ＦＲ３は、配列番号：４５で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記Ｈ－ＦＲ３は、配列番号：３６で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記Ｈ－ＦＲ３は、配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0147】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、Ｈ－ＦＲ４を含み得、前記Ｈ－ＦＲ４のＮ末端は前記ＨＣＤＲ３のＣ末端に連結され、前記Ｈ－ＦＲ４は配列番号：７４で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記Ｈ－ＦＲ４は、配列番号：４６で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記Ｈ－ＦＲ４は、配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0148】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３およびＨ－ＦＲ４を含み得る。本出願において、前記Ｈ－ＦＲ１は、配列番号：７２で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｈ－ＦＲ２は配列番号：７３で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｈ－ＦＲ３は配列番号：８０または配列番号：４５で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｈ－ＦＲ４は配列番号：７４で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0149】

本出願において、前記Ｈ－ＦＲ１は、配列番号：３４、配列番号：４３および配列番号：４９のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｈ－ＦＲ２は配列番号：３５または配列番号：４４で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｈ－ＦＲ３は配列番号：３６または配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｈ－ＦＲ４は配列番号：４６または配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0150】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質のＨ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３およびＨ－ＦＲ４は、以下の任意の群から選択されるアミノ酸配列を含み得、
１）前記Ｈ－ＦＲ１は、配列番号：３４で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｈ－ＦＲ２は配列番号：３５で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｈ－ＦＲ３は配列番号：３６で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｈ－ＦＲ４は配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を含み得、
２）前記Ｈ－ＦＲ１は、配列番号：４３で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｈ－ＦＲ２は配列番号：４４で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｈ－ＦＲ３は配列番号：４５で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｈ－ＦＲ４は配列番号：４６で示されるアミノ酸配列を含み得、
３）前記Ｈ－ＦＲ１は、配列番号：３４で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｈ－ＦＲ２は配列番号：３５で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｈ－ＦＲ３は配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｈ－ＦＲ４は配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を含み得、
４）前記Ｈ－ＦＲ１は、配列番号：４９で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｈ－ＦＲ２は配列番号：３５で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｈ－ＦＲ３は配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｈ－ＦＲ４は配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0151】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、Ｈ－ＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３およびＨ－ＦＲ４を含み得る。例えば前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３およびＨ－ＦＲ４は、それぞれ配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６および配列番号：３７で示されるアミノ酸配列、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５および配列番号：４６で示されるアミノ酸配列、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：４２および配列番号：３７で示されるアミノ酸配列、または配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：４９、配列番号：３５、配列番号：４２および配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を順に含んでもよい。

【0152】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＶＨを含み得る。本出願において、前記ＶＨは、配列番号：７８で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記ＶＨは、配列番号：１で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記ＶＨは、配列番号：９で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記ＶＨは、配列番号：１５で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記ＶＨは、配列番号：１９で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0153】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＬＣＤＲ３を含み得る。本出願において、前記ＬＣＤＲ３は、配列番号：６９で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記ＬＣＤＲ３は、配列番号：８で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記ＬＣＤＲ３は、配列番号：１４で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記ＬＣＤＲ３は、配列番号：２３で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記ＬＣＤＲ３は、配列番号：２５で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0154】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＬＣＤＲ２を含み得る。本出願において、前記ＬＣＤＲ２は、配列番号：７０で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記ＬＣＤＲ２は、配列番号：７で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記ＬＣＤＲ２は、配列番号：２２で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0155】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＬＣＤＲ１を含み得る。本出願において、前記ＬＣＤＲ１は、配列番号：７１で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記ＬＣＤＲ１は、配列番号：６で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記ＬＣＤＲ１は、配列番号：２１で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0156】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み得る。例えば前記ＬＣＤＲ１は、配列番号：７１で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ２は配列番号：７０で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ３は配列番号：６９で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0157】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質のＬＣＤＲ１は、配列番号：６または配列番号：２１で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ２は配列番号：７または配列番号：２２で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ３は配列番号：８、配列番号：１４、配列番号：２３および配列番号：２５のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0158】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は、以下の任意の群から選択されるアミノ酸配列を含み得、
１）前記ＬＣＤＲ１は、配列番号：６で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ２は配列番号：７で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ３は配列番号：８で示されるアミノ酸配列を含み得、
２）前記ＬＣＤＲ１は、配列番号：６で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ２は配列番号：７で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ３は配列番号：１４で示されるアミノ酸配列を含み得、
３）前記ＬＣＤＲ１は、配列番号：２１で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ２は配列番号：２２で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ３は配列番号：２３で示されるアミノ酸配列を含み得、
４）前記ＬＣＤＲ１は、配列番号：６で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ２は配列番号：７で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ３は配列番号：２５で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0159】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、Ｌ－ＦＲ１を含み得、前記Ｌ－ＦＲ１のＣ末端は前記ＬＣＤＲ１のＮ末端に直接的または間接的に連結される。本出願において、前記Ｌ－ＦＲ１は、配列番号：７５で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記Ｌ－ＦＲ１は、配列番号：３８で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記Ｌ－ＦＲ１は、配列番号：４７で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記Ｌ－ＦＲ１は、配列番号：５０で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記Ｌ－ＦＲ１は、配列番号：５３で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0160】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、Ｌ－ＦＲ２を含み得、前記Ｌ－ＦＲ２は前記ＬＣＤＲ１と前記ＬＣＤＲ２との間に位置する。本出願において、前記Ｌ－ＦＲ２は、配列番号：３９で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0161】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、Ｌ－ＦＲ３を含み得、前記Ｌ－ＦＲ３は前記ＬＣＤＲ２と前記ＬＣＤＲ３との間に位置する。本出願において、前記Ｌ－ＦＲ３は、配列番号：７６で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記Ｌ－ＦＲ３は、配列番号：４０で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記Ｌ－ＦＲ３は、配列番号：４８で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記Ｌ－ＦＲ３は、配列番号：５１で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0162】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、Ｌ－ＦＲ４を含み得、前記Ｌ－ＦＲ４のＮ末端は前記ＬＣＤＲ３のＣ末端に連結される。本出願において、前記Ｌ－ＦＲ４は、配列番号：７７で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記Ｌ－ＦＲ４は、配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記Ｌ－ＦＲ４は、配列番号：５２で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記Ｌ－ＦＲ４は、配列番号：５４で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0163】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、Ｌ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３およびＬ－ＦＲ４を含み得る。例えば前記Ｌ－ＦＲ１は、配列番号：７５で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｌ－ＦＲ２は配列番号：３９で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｌ－ＦＲ３は配列番号：７６で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｌ－ＦＲ４は配列番号：７７で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0164】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質のＬ－ＦＲ１は、配列番号：３８、配列番号：４７、配列番号：５０および配列番号：５３のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｌ－ＦＲ２は配列番号：３９で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｌ－ＦＲ３は配列番号：４０、配列番号：４８および配列番号：５１のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｌ－ＦＲ４は配列番号：４１、配列番号：５２および配列番号：５４のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0165】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質のＬ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３およびＬ－ＦＲ４は、以下の任意の群のアミノ酸配列を含み得、
１）前記Ｌ－ＦＲ１は、配列番号：３８で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｌ－ＦＲ２は配列番号：３９で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｌ－ＦＲ３は配列番号：４０で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｌ－ＦＲ４は配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含み得、
２）前記Ｌ－ＦＲ１は、配列番号：４７で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｌ－ＦＲ２は配列番号：３９で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｌ－ＦＲ３は配列番号：４８で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｌ－ＦＲ４は配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含み得、
３）前記Ｌ－ＦＲ１は、配列番号：５０で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｌ－ＦＲ２は配列番号：３９で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｌ－ＦＲ３は配列番号：５１で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｌ－ＦＲ４は配列番号：５２で示されるアミノ酸配列を含み得、
４）前記Ｌ－ＦＲ１は、配列番号：５３で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｌ－ＦＲ２は配列番号：３９で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｌ－ＦＲ３は配列番号：４０で示されるアミノ酸配列を含み得、前記Ｌ－ＦＲ４は配列番号：５４で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0166】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、Ｌ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３およびＬ－ＦＲ４を含む。例えば前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、Ｌ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３およびＬ－ＦＲ４は、それぞれ配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０および配列番号：４１で示されるアミノ酸配列、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：１４、配列番号：４７、配列番号：３９、配列番号：４８および配列番号：４１で示されるアミノ酸配列、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：５０、配列番号：３９、配列番号：５１および配列番号：５２で示されるアミノ酸配列、または配列番号：６、配列番号：７、配列番号：２５、配列番号：５３、配列番号：３９、配列番号：４０および配列番号：５４で示されるアミノ酸配列を順に含んでもよい。

【0167】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＶＬを含む。本出願において、前記ＶＬは、配列番号：７９で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記ＶＬは、配列番号：５で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記ＶＬは、配列番号：１３で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記ＶＬは、配列番号：２０で示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば前記ＶＬは、配列番号：２４で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0168】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み得る。本出願において、前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：２、配列番号：１０および配列番号：１６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＨＣＤＲ２は配列番号：６８または配列番号：１１で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＨＣＤＲ３は配列番号：６７で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ１は配列番号：７１で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ２は配列番号：７０で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ３は配列番号：６９で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0169】

本出願において、前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：２、配列番号：１０および配列番号：１６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＨＣＤＲ２は配列番号：３、配列番号：１７および配列番号：１１のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＨＣＤＲ３は配列番号：４、配列番号：１２および配列番号：１８のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ１は配列番号：６または配列番号：２１で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ２は配列番号：７または配列番号：２２で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ３は配列番号：８、配列番号：１４、配列番号：２３および配列番号：２５のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0170】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は、以下の任意の群のアミノ酸配列を含み得、
１）前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：２で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＨＣＤＲ２は配列番号：３で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＨＣＤＲ３は配列番号：４で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ１は配列番号：６で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ２は配列番号：７で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ３は配列番号：８で示されるアミノ酸配列を含み得、
２）前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：１０で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＨＣＤＲ２は配列番号：１１で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＨＣＤＲ３は配列番号：１２で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ１は配列番号：６で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ２は配列番号：７で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ３は配列番号：１４で示されるアミノ酸配列を含み得、
３）前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：１６で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＨＣＤＲ２は配列番号：１７で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＨＣＤＲ３は配列番号：１８で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ１は配列番号：６で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ２は配列番号：７で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ３は配列番号：８で示されるアミノ酸配列を含み得、
４）前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：１６で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＨＣＤＲ２は配列番号：１７で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＨＣＤＲ３は配列番号：１８で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ１は配列番号：２１で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ２は配列番号：２２で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ３は配列番号：２３で示されるアミノ酸配列を含み得、
５）前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：１６で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＨＣＤＲ２は配列番号：１７で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＨＣＤＲ３は配列番号：１８で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ１は配列番号：６で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ２は配列番号：７で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＬＣＤＲ３は配列番号：２５で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0171】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＶＨおよびＶＬを含み得る。本出願において、前記ＶＨは、配列番号：７８で示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＶＬは配列番号：７９で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0172】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質のＶＨは、配列番号：１、配列番号：９、配列番号：１５および配列番号：１９のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み得、前記ＶＬは配列番号：５、配列番号：１３、配列番号：２０および配列番号：２４のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0173】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、以下の群のいずれかから選択されるＶＨおよびＶＬを含み得、
１）配列番号：１で示されるアミノ酸配列を含み得るＶＨ、配列番号：５で示されるアミノ酸配列を含み得るＶＬ、
２）配列番号：１５で示されるアミノ酸配列を含み得るＶＨ、配列番号：５で示されるアミノ酸配列を含み得るＶＬ、
３）配列番号：９で示されるアミノ酸配列を含み得るＶＨ、配列番号：１３で示されるアミノ酸配列を含み得るＶＬ、
４）配列番号：１９で示されるアミノ酸配列を含み得るＶＨ、配列番号：２０で示されるアミノ酸配列を含み得るＶＬ、および
５）配列番号：１９で示されるアミノ酸配列を含み得るＶＨ、配列番号：２４で示されるアミノ酸配列を含み得るＶＬ。

【0174】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、抗体重鎖定常領域を含み得る。前記抗体重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域に由来し得る。いくつかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、抗体重鎖定常領域を含み得、前記抗体重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に由来し得る。

【0175】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、抗体軽鎖定常領域を含み得る。前記抗体軽鎖定常領域は、ヒトＩｇκ定常領域に由来し得る。

【0176】

なお特筆すべきことは、本出願の単離された抗原結合タンパク質は、１つ以上の保存配列修飾を伴う重鏈および／または軽鎖配列を含み得る。いわゆる「保存配列修飾」とは、抗体の結合特性に大きな影響を与えないか、改変させないアミノ酸修飾を意味する。このような保存修飾には、アミノ酸の置換、付加および欠失が含まれる。部位変異およびＰＣＲ媒介変異などの当技術分野で知られている標準的な技術を通じて、修飾を本明細書に記載の単離された抗原結合タンパク質に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、類似した側鎖を有するアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換である。類似した側鎖を有するアミノ酸残基群には、当技術分野で知られている。これらのアミノ酸残基群には、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。いくつかの実施形態において、本出願の単離された抗原結合タンパク質のＣＤＲ領域中の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖群の他のアミノ酸残基で置換することができる。当業者は、いくつかの保存配列修飾が抗原結合性を喪失しないことを知り、具体的には例えば非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８を参照できる。

【0177】

当技術分野で知られている様々なアッセイによって、本出願のＣＬＤＮ１８．２抗原結合タンパク質の物理的／化学的特性および／または生物活性の同定、スクリーニングまたはキャラクタリゼーションを行うことができる。

【0178】

いくつかの実施形態において、例えば酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫ブロッティング（例えばウエスタンブロット）、フローサイトメトリー（例えばＦＡＣＳ）、免疫組織化学、免疫蛍光などの既知の方法で本出願の抗原結合タンパク質または融合タンパク質の抗原結合活性を測定できる。

【0179】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ１８．２抗原に特異的に結合することができる。ＣＬＤＮ１８．２抗原に「特異的に結合する」抗原結合タンパク質は通常、ＣＬＤＮ１８．２に結合するが、ＣＬＤＮ１８．２配列を欠く他のタンパク質には結合しない、または実質的に結合しない。抗原結合タンパク質（例：抗体）が抗原ＣＬＤＮ１８．２に結合するかどうかは、当技術分野で知られている任意のアッセイを使用して確認することができる。例えば蛍光活性化細胞選別技術（ＦＡＣＳ）を使用して前記単離された抗原結合タンパク質のＣＬＤＮ１８．２に対する特異的結合活性を測定することができる。いくつかの実施形態において、前記特異的結合は、濃度依存性の結合であり得る。例えばＦＡＣＳ結合活性実験において、前記ＣＬＤＮ１８．２の平均蛍光強度は、ＣＬＤＮ１８．２抗体濃度の増加とともに増加する。

【0180】

本出願において、前記抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質に結合することができる。場合により本出願の抗原結合タンパク質は、マウス（例えばマウス）および／またはサル（例えばカニクイザル）ＣＬＤＮ１８．２とも交差反応することができ、例えばＦＡＣＳで検出される。本出願において、「交差反応」とは、抗体が他の物種の相同タンパク質と反応する能力を意味する。

【0181】

本出願において、前記抗原結合タンパク質は、ＣＤＣ効果を誘発することができる。例えば本出願のＣＬＤＮ１８．２抗原結合タンパク質は、ＳＰ２／０－ヒトＣＬＤＮ１８．２細胞に対して強力なＣＤＣ効果を誘導することができる。例えば本出願のＣＬＤＮ１８．２抗原結合タンパク質は、ＭＣ３８－ヒトＣＬＤＮ１８．２細胞に対して強力なＣＤＣ効果を誘導することができる。例えば誘導方法は、用量依存的な様式であり得る。

【0182】

本出願において、ＦＡＣＳで検証されるように前記単離された抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ１８．２への結合に関して参照抗体と実質的に競合しない。前記参照抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み得、前記参照抗体のＶＨは配列番号５５で示されるアミノ酸配列を含み得、前記参照抗体のＶＬは配列番号５６で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0183】

本出願において、前記抗原結合タンパク質は、腫瘍の成長および／または腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。前記腫瘍は、ＣＬＤＮ１８．２発現腫瘍（例：結腸癌）であり得る。前記結腸癌の細胞は、ＭＣ３８－ヒトＣＬＤＮ１８．２細胞であってもよい。

【0184】

キメラ抗原受容体
別の態様において、本出願は、ＣＬＤＮ１８．２タンパク質に結合する標的部分を含み得るキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も提供し、例えばＣＬＤＮ１８．２タンパク質に結合する標的部分は本出願の抗原結合タンパク質であり得る。例えば前記標的部分は、ｓｃＦｖの形式で存在し得る。例えば前記ｓｃＦｖは、本出願の単離された抗原結合タンパク質のＣＤＲ、ＶＨおよび／またはＶＬを含み得る。例えば前記ｓｃＦｖのＶＨとＶＬは、配列番号８９により連結され得る。例えば前記ｓｃＦｖは、配列番号９０で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0185】

本出願において，前記ＣＡＲは、ＣＬＤＮ１８．２タンパク質に結合する細胞外標的部分以外に、他のドメインも含み得る。

【0186】

本出願において、前記ＣＡＲは、刺激シグナルを提供できる共刺激シグナル領域を含むことができる。例えば前記共刺激シグナル領域は、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＯＸ４０、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＳＬＡＭ、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、２Ｂ４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＰＤ－１、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＪＡＭＬ、ＣＤ２４４、ＣＤ１００、ＩＣＯＳ、ＣＤ８３のリガンド、ＣＤ４０およびＭｙＤ８８からなる群から選択される１種以上のタンパク質に由来する細胞内共刺激シグナル伝達領域を含み得る。

【0187】

例えば前記共刺激シグナル領域は、４－１ＢＢ由来する細胞内共刺激シグナル伝達領域であってもよい。例えば前記共刺激シグナル領域は、配列番号：８５で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0188】

場合によっては、前記ＣＡＲは、少なくとも１つのＩＴＡＭモチーフを有するドメインを含み得る細胞内シグナル伝達領域を含んでもよい。前記細胞内シグナル伝達ドメインは、活性化シグナルを細胞の内部に伝達することができる。例えば前記細胞内シグナル伝達領域は、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃεＲＩγ、ＦｃεＲＩβ、ＦｃγＲＩＩａ、ウシ白血病ウイルスｇｐ３０、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ＬＭＰ２Ａ、サル免疫不全ウイルスＰＢｊ１４ Ｎｅｆ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＨＳＫＶ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ－１２および他の少なくとも１つのＩＴＡＭを含むドメインからなる群から選択される１種以上のタンパク質に由来する細胞内シグナル伝達領域を含み得る。

【0189】

例えば前記細胞内シグナル伝達領域は、ＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインであってもよい。例えば前記細胞内シグナル伝達領域は、配列番号：８６で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0190】

場合によっては、前記ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含み得、前記膜貫通ドメインは細胞膜を貫通する細胞表面タンパク質内の配列であり、疎水性αヘリックスを含み得る。前記膜貫通ドメインは、任意のＩ型膜貫通タンパク質に由来することができる。膜貫通ドメインは、疎水性ヘリックスを形成すると予測される合成配列であり得る。例えば前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＰＤ－１、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＣＤ５、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４、ＣＤ２４４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＣＤ２、ＮＫＧ２Ｃ、ＬＩＧＨＴ、ＤＡＰ１２，ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４およびＳＬＡＭからなる群から選択される１種以上のタンパク質に由来する膜貫通ドメインであり得る。

【0191】

例えば前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８に由来する膜貫通ドメインであってもよい。例えば前記膜貫通ドメインは、配列番号：８４で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0192】

場合によっては、前記ＣＡＲは、細胞外標的部分と膜貫通ドメインとの間に位置し得るヒンジ領域を含み得る。例えば前記ヒンジ領域は、ＣＤ２８、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＣＤ８、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＤＡＰ１０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＣＤ２２６、ＳＬＡＭ、ＣＤ３０およびＬＩＧＨＴからなる群から選択される１種以上のタンパク質に由来するヒンジ領域であり得る。

【0193】

例えば前記ヒンジ領域は、ＣＤ８に由来するヒンジ領域であってもよい。例えば前記ヒンジ領域は、配列番号：８３で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0194】

本出願において、前記ＣＡＲは、前記結合ＣＬＤＮ１８．２タンパク質に結合する標的部分のＮ末端にはシグナルペプチドをさらに含み得る。例えば前記シグナルペプチドは、ＣＤ８タンパク質に由来するシグナルペプチドであってもよい。例えば前記シグナルペプチドは、配列番号：８８で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0195】

本出願において、前記ＣＡＲは、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片も含み得る。例えば前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片は、前記ＣＡＲのＣ端に位置し得る。例えば前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１～１２およびその機能的断片を含み得る。例えば前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５および／または６あるいはその断片であってもよい。例えば前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片は、配列番号：９１で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0196】

本出願において、前記ＣＡＲ内の前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片の配列は、自己切断ペプチド（例えばＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａなどの２Ａペプチド）を介してＣＡＲのＣ端配列に連結することができる。例えば前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片は、Ｔ２Ａを介して細胞内シグナル伝達領域のＣ端に連結することができる。例えば前記切断ペプチドは、配列番号：８７で示されるアミノ酸配列を含み得る。

【0197】

本出願において、前記ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端に向けてＣＬＤＮ１８．２タンパク質に結合する標的部分（例えば抗原結合タンパク質）、前記ヒンジ領域、前記膜貫通ドメイン、前記共刺激シグナル伝達領域および前記細胞内シグナル伝達領域を順に含み得る。例えば前記ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端に向けて前記ｓｃＦｖ、ＣＤ８に由来するヒンジ領域、ＣＤ８に由来する膜貫通ドメイン、４－１ＢＢに由来する共刺激シグナル領域、およびＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル伝達領域を順に含んでもよい。

【0198】

本出願において、前記ＣＡＲまたは免疫エフェクター細胞を発現することができるベクターも含み、前記ベクターにおいて、ＣＬＤＮ１８．２タンパク質に結合する標的部分（例えば前記抗原結合タンパク質）をコードする核酸分子、前記ヒンジ領域をコードする核酸分子、前記膜貫通ドメインをコードする核酸分子、前記共刺激シグナル領域をコードする核酸分子、前記細胞内シグナル伝達領域をコードする核酸分子および前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片をコードする核酸分子を順に含み得る。

【0199】

本出願において、前記ＣＡＲまたは免疫エフェクター細胞を発現することができるベクターも含み、前記ベクターにおいて、ＣＬＤＮ１８．２タンパク質に結合する標的部分（例えば前記抗原結合タンパク質）をコードする核酸分子、前記ヒンジ領域をコードする核酸分子、前記膜貫通ドメインをコードする核酸分子、前記共刺激シグナル領域をコードする核酸分子、前記細胞内シグナル伝達領域をコードする核酸分子、前記切断ペプチドをコードする核酸分子および前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片をコードする核酸分子を順に含み得る。

【0200】

ポリペプチド分子、免疫複合体、核酸分子、ベクター、細胞および医薬組成物
別の態様において、本出願は、本出願の単離された抗原結合タンパク質または本出願のキメラ抗原受容体を含み得るポリペプチド分子を提供する。

【0201】

本出願において、前記ポリペプチド分子は、融合タンパク質を含み得る。例えば本出願の単離された抗原結合タンパク質は、他の機能分子（例えば抗体または受容体リガンド）と融合して、二重特異性分子または多重特異性分子を形成することができる。前記二重特異性分子または多重特異性分子は、少なくとも２つの異なる結合部位あるいは標的分子に特異的に結合することができる。前記二重特異性分子または多重特異性分子は、遺伝子改変、体細胞ハイブリダイゼーション、もしくは化学的方法により調製することができる。詳細については、例えば非特許文献１９および非特許文献２０を参照されたい。

【0202】

別の態様において、本出願は、本出願の単離された抗原結合タンパク質を含み得る免疫複合体も提供する。

【0203】

本出願において、本出願の単離された抗原結合タンパク質またはその断片を化学療法剤、毒素、免疫療法剤、イメージングプローブ、分光プローブなどの別の試薬に連結することができる。該連結は、１つ以上の共有結合または非共有結合性相互作用によるものであり得、キレート作用を含み得る。複数種のリンカー（リンカーは、当技術分野で知られている）を使用して免疫複合体を形成することができる。なお、免疫複合体は、免疫複合体をコードするポリヌクレオチドから発現させることができる融合タンパク質の形態で提供することができる。前記免疫複合体は、例えば抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）を含んでもよい。ＡＤＣにおいて、ペプチドリンカー、ジスルフィドリンカー、あるいはヒドラゾンリンカーなどの切断可能なリンカーを介して抗体および治療薬を架橋することができる。

【0204】

別の態様において、本出願は、本出願の単離された抗原結合タンパク質または本出願のキメラ抗原受容体をコードし得る１種以上の核酸分子を提供する。例えば核酸分子は、（ｉ）インビトロでの増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により産生されること、（ｉｉ）組換えクローニングにより産生されること、（ｉｉｉ）例えば酵素的切断およびゲル電気泳動分画によって精製されること、あるいは（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されることといった方法で産生もしくは合成されることができる。

【0205】

本出願において、前記核酸分子は、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２および配列番号：３３のいずれかで示される塩基配列を含み得る。

【0206】

本出願において、前記核酸分子は、以下の任意の群から選択される塩基配列を含み得、
１）配列番号２６で示される塩基配列、および配列番号２７で示される塩基配列、
２）配列番号３０に示される塩基配列、および配列番号２７で示される塩基配列、
３）配列番号２８に示される塩基配列、および配列番号２９で示される塩基配列、
４）配列番号３１に示される塩基配列、および配列番号３２で示される塩基配列、
５）配列番号３１に示される塩基配列、および配列番号３３で示される塩基配列。

【0207】

別の態様において、本出願は、本出願の核酸分子を含み得るベクターを提供する。なお、前記ベクターには適切な宿主細胞および適切な条件下での該ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子などの他の遺伝子を含めることもできる。また、前記ベクターは、適切な宿主におけるコード領域の適切な発現を可能にする発現制御エレメントも含み得る。このような制御エレメントは当業者にはよく知られ、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、および遺伝子転写またはｍＲＮＡ翻訳などを調節する他の制御エレメントも含み得る。ベクターは、宿主細胞を形質転換、形質導入、またはトランスフェクトすることで、ベクターによって運ばれる遺伝物質エレメントを宿主細胞で発現させることができる。前記ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス、ファージ、あるいは遺伝子工学で一般的に使用される他のベクターが挙げられる。例えばベクターは発現ベクターである。なお、前記ベクターは、例えばウイルス粒子、リポソーム、あるいはカプシドなどであるがこれらに限定されない、細胞への侵入を促進する成分を含んでもよい。

【0208】

別の態様において、本出願は、本出願の単離された抗原結合タンパク質、本出願のキメラ抗原受容体、本出願のポリペプチド分子、本出願の核酸分子または本出願のベクターを含み得る細胞を提供する。いくつかの実施形態において、各種または各々宿主細胞は、１つまたは１種の本出願の核酸分子あるいはベクターを含み得る。いくつかの実施形態において、各種または各々宿主細胞は、複数（例えば２つ以上）あるいは複数種（例えば２種以上）の本出願の核酸分子もしくはベクターを含み得る。例えば本出願のベクターを前記宿主細胞（植物由来の細胞、真菌あるいは酵母細胞などの真核細胞）に導入することができる。いくつかの実施形態において、前記細胞は、細菌細胞（例えば大腸菌）、酵母細胞あるいはその他の真核細胞であり得る。当技術分野で知られている方法により、本出願のベクターを前記宿主細胞に導入することができる。

【0209】

いくつかの実施形態において、前記細胞は、免疫エフェクター細胞であり得る。いくつかの実施形態において、前記細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、単球、樹状細胞、顆粒球、リンパ球、白血球、末梢血単核球、胚性幹細胞、リンパ球前駆細胞および／または多能性幹細胞であり得る。

【0210】

いくつかの実施形態において、前記細胞は、Ｔ細胞であり得る。

【0211】

本出願において、前記細胞は、前記ＣＡＲを含み、かつ／または発現し得る。本出願において、前記細胞は、前記ＣＡＲおよび前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片を含み得、かつ／または発現し得る。

【0212】

別の態様において、本出願は、本出願の単離された抗原結合タンパク質、本出願のキメラ抗原受容体、本出願のポリペプチド分子、本出願の免疫複合体、本出願の核酸分子、本出願のベクターおよび／または本出願の細胞、および任意で薬学的に許容される担体を含み得る医薬組成物も提供する。

【0213】

いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、１種以上（薬学的に有効な）アジュバント、安定剤、賦形剤、希釈剤、可溶化剤、界面活性剤、乳化剤および／または防腐剤の適切な製剤を含み得る。組成物の許容される成分は、好ましくは使用される投与量および濃度でレシピエントに対して無毒である。本発明の医薬組成物には、液体、凍結および凍結乾燥の組成物が含まれるが、これらに限定されない。

【0214】

いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、１種以上の活性化合物、例えば一般的に互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する活性化合物を含み得る。このような薬物のタイプおよび有効量は、例えば製剤中に存在するアンタゴニストの量およびタイプ、ならびに被験体の臨床パラメータに決め得る。

【0215】

いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容される担体は、薬物投与に適合するあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、等張化剤および吸収遅延剤を含み得、一般的に安全で無毒である。

【0216】

いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、非経口、経皮、腔内、動脈内、くも膜下腔内および／または鼻腔内投与、あるいは組織への直接注射を含み得る。例えば前記薬学的組成物は、注入または注射を介して患者あるいは被験体に投与することができる。いくつかの実施形態において、前記医薬組成物の投与は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所あるいは皮内投与などの異なる手段を介して行うことができる。いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、中断することなく投与することができる。特許文献６に記載されているように、患者の体内へ流入する治療薬を測定するために患者が装着する小さなポンプシステムによって、中断のない（または連続的な）投与を実現することができる。

【0217】

調製方法
別の態様において、本出願は、前記抗原結合タンパク質の調製方法を提供する。前記方法は、前記単離された抗原結合タンパク質が発現される条件下で、本出願に記載の細胞を培養することを含む。例えば適切な培地の使用、適切な温度および培養時間などを通じて実施でき、これらの方法は当業者には理解されている。

【0218】

モノクローナル抗体を産生するのに適した任意の方法は、本出願の抗原結合タンパク質を産生することができる。例えば結合したまたは天然に存在するＣＬＤＮ１８．２タンパク質またはその断片で動物を免疫することができる。アジュバント、免疫刺激剤、反復ブースター免疫を含む適切な免疫接種方法を使用することができ、１種以上の経路を使用することができる。

【0219】

任意の適切な形態のＣＬＤＮ１８．２は、免疫原（抗原）としてＣＬＤＮ１８．２に特異的な非ヒト抗体を産生し、前記抗体の生物学的活性をスクリーニングするために使用することができる。プライミング免疫原は、天然のホモ二量体を含む完全長の成熟ヒトＣＬＤＮ１８．２、あるいは単一／複数のエピトープ含有ペプチドであり得る。免疫原は、単独で、もしくは当技術分野で知られている１種以上の免疫増強剤と組み合わせて使用することができる。

【0220】

キメラヒト抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む免疫グロブリンの任意の種類から選択されることができる。本出願において、抗体はＩｇＧ抗体であってもよく、ＩｇＧ１サブタイプが使用されてもよい。以下の実施例に記載の生物学的アッセイを使用して抗体をスクリーニングすることによって、必要な定常ドメイン配列の最適化を実現して所望の生物学的活性を産生することができる。同様に、いずれのタイプの軽鎖も、本出願の化合物および方法で使用することができる。例えば本出願の化合物および方法において、κ鎖またはそのバリアントを使用することができる。

【0221】

方法および使用
別の態様において、本出願は、疾患および／または障害を予防、緩和および／または治療するための医薬品の調製における前記単離された抗原結合タンパク質、前記キメラ抗原受容体、前記ポリペプチド分子、前記免疫複合体、前記核酸分子、前記ベクター、前記細胞および／または前記医薬組成物の使用も提供する。

【0222】

別の態様において、本出願は、疾患および／または障害を予防、緩和および／または治療するための方法も提供し、前記方法は本出願の前記単離された抗原結合タンパク質、前記キメラ抗原受容体、前記ポリペプチド分子、前記免疫複合体、前記核酸分子、前記ベクター、前記細胞および／または前記医薬組成物を必要な被験体に投与することを含み得る。本出願において、前記投与は、静脈内、腫瘍内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内の投与などの異なる手段により実施され得る。

【0223】

別の態様において、本出願の前記単離された抗原結合タンパク質、前記キメラ抗原受容体、前記ポリペプチド分子、前記免疫複合体、前記核酸分子、前記ベクター、前記細胞および／または前記医薬組成物は、疾患および／または障害を予防、緩和および／または治療するために用いることができる。

【0224】

本出願において、前記疾病および／または障害には、癌が含まれ得る。

【0225】

本出願において、前記癌には、固形腫瘍および／または血液腫瘍が含まれ得る。

【0226】

本出願において、前記癌には、ＣＬＤＮ１８．２陽性腫瘍が含まれ得る。

【0227】

本出願において、前記癌には、胃癌および／または結腸癌が含まれ得る。

【0228】

本出願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、被験体における腫瘍の成長を効果的に抑制するため、１種以上の他の抗体と一緒に投与され得る。前記単離された抗原結合タンパク質は、化学療法剤とともに投与することもできる。

【0229】

別の態様において、本出願は、サンプル中のＣＬＤＮ１８．２を検出する方法も提供する。前記方法は、本出願の前記単離された抗原結合タンパク質、前記キメラ抗原受容体、前記ポリペプチド分子、前記免疫複合体、前記核酸分子、前記ベクター、前記細胞および／または前記医薬組成物を投与することを含む。前記方法は、エクスビボ法および／またはインビトロ法であり得る。

【0230】

別の態様において、本出願は、前記単離された抗原結合タンパク質、前記キメラ抗原受容体、前記ポリペプチド分子、前記免疫複合体、前記核酸分子、前記ベクター、前記細胞および／または前記医薬組成物を含み得る、サンプル中のＣＬＤＮ１８．２を検出するための試薬またはキットも提供する。

【0231】

別の態様において、本出願は、前記ＣＬＤＮ１８．２を検出するための試薬またはキットの調製における前記単離された抗原結合タンパク質、前記キメラ抗原受容体、前記ポリペプチド分子、前記免疫複合体、前記核酸分子、前記ベクター、前記細胞および／または前記医薬組成物の使用も提供する。

【0232】

本出願において、前記試薬またはキットは、サンプル中のＣＬＤＮ１８．２の存在および／または含有量を検出するために用いられることができる。

【0233】

いかなる理論にも拘束されることなく、以下の実施例は本出願の抗原結合タンパク質、調製方法及び使用などを説明するためのものであって、本出願の発明の範囲を限定することを意図するものではない。

【実施例】

【0234】

（実施例１ ＣＬＤＮ１８．１およびＣＬＤＮ１８．２陽性対照抗体の調製）
ＣＬＤＮ１８．１陽性対照抗体は、市販の抗ＣＬＤＮ１８ウサギモノクローナル抗体（ａｂｃａｍ，Ｃａｔ＃ａｂ２０３５６３）を選択し、該抗体はＣＬＤＮ１８．１およびＣＬＤＮ１８．２を同時に識別でき、抗原結合部位は細胞内にある。本出願において、この抗体をＣＬＤＮ１８．１陽性対照抗体とし、抗ＣＬＤＮ１８抗体（Ａｎｔｉ－Ｃｌａｕｄｉｎ１８ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と名付けた。

【0235】

特許文献７により提供される１７５Ｄ１０クローン（ＩＭＡＢ３６２）抗体重鎖・軽鎖の全長アミノ酸配列（例えば配列番号：８１および配列番号：８２で示されるアミノ酸配列）に従い蘇州金唯智生物科技有限公司に従来の遺伝子合成を依頼し、当社が提供する真核生物用発現ベクターｐＣＭＶ－ｋ、ｐＣＭＶ－ＩｇＧ１（ＮＤＬ）にクローニングし、ｐＣＭＶ－ＩＭＡＢ３６２－ＶＬおよびｐＣＭＶ－ＩＭＡＢ３６２－ＶＨを含むプラスミドを構築し、以上の２つのベクタープラスミドを、一過性発現のため３：２（ＶＬ：ＶＨ）の比率でＥｘｐｉ２９３細胞に同時トランスフェクトし、５日後、細胞培養上清を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーで精製し、ＢＣＡを定量してＣＬＤＮ１８．２陽性対照抗体を得、ゾルベツキシマブと名付けた。

【0236】

（実施例２ ＣＬＤＮ１８．１およびＣＬＤＮ１８．２を安定かつ高発現する細胞株の構築）
表１に示すヒトＣＬＤＮ１８．１、ヒトＣＬＤＮ１８．２、マウスＣＬＤＮ１８．１、マウスＣＬＤＮ１８．２、カニクイザルＣＬＤＮ１８．１、カニクイザルＣＬＤＮ１８．２の塩基配列に従い、蘇州金唯智生物科技有限公司に従来の遺伝子合成を依頼し、当社が提供するレンチウイルス発現ベクターｐＨＡＧＥ－ｆｕｌｌ ＥＦ１ａ－ＩｚｓＧｒｅｅｎにクローニングし、得られたプラスミドを含む穿刺細菌を活性化した後、プラスミド抽出を行った後、当社のレンチウイルスパッケージングおよび感染システムを用いて、２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ、ＳＰ２／０細胞にレンチウイルスを感染させ、感染後に得られた細胞をＦＡＣＳで感染効率を検出した後、勾配希釈法で細胞を勾配希釈法でモノクローナル化し、ＦＡＣＳ選別により検証して、ＣＬＤＮ１８．１およびＣＬＤＮ１８．２を安定かつ高発現するモノクローナル細胞株を得た。

【0237】

【表1】

【0238】

ＣＬＤＮ１８．２を安定かつ高発現する細胞株のＦＡＣＳ検証のため、３０，０００個のトランスフェクト細胞をＶ字型９６ウェルプレートに播種し、陽性抗体ゾルベツキシマブを添加し、ＰＢＳ陰性対照ウェルを設け、４℃で１時間インキュベートした後、９６ウェルプレートをＦＡＣＳバッファーで １回洗浄し、二次抗体（ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６５０）（ａｂｃａｍ，Ｃａｔ＃ａｂ９８５９３））を加え、４℃で３０分間インキュベートした後、９６ウェルプレートをＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、その後、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒフローサイトメーター（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ社から購入）で細胞の蛍光強度をモニタリングし、増殖のために最も高いＭＦＩ値を持つモノクローナル細胞を選択しまし、培養を拡大して凍結保存した。

【0239】

ＣＬＤＮ１８．１を安定かつ高発現する細胞株のＦＡＣＳ検証のため、細胞を２つの処理方法に分け、１つは、細胞を計数した後、ＦＡＣＳバッファーで直接再懸濁してウェルプレートにプレーティングする方法で、一次抗体は実施例１で提供されるＣＬＤＮ１８．２陽性抗体ゾルベツキシマブである。もう一つの方法は、細胞計数後に固定化および膜破壊処理（固定液ＦＸＰ００８および膜破壊剤ＦＸＰ００９、四正柏生物社製）を行うことで、抗体が細胞内にある抗原部位に結合できるようにする。一次抗体は実施例１で提供される市販のＣＬＤＮ１８抗体であり、同時に機器にセットして測定し、市販のＣＬＤＮ１８抗体に強く結合するがゾルベツキシマブには結合しないモノクローナル細胞を選択して培養を拡大して凍結保存した。

【0240】

構築されたＣＬＤＮ１８を安定かつ高発現する細胞株は、それぞれ２９３Ｔ－ヒトＣＬＤＮ１８．１（２９３Ｔ－ｈｕｍａｎ ＣＬＤＮ１８．１）、２９３Ｔ－ヒトＣＬＤＮ１８．２（２９３Ｔ－ｈｕｍａｎ ＣＬＤＮ１８．２）、ＣＨＯ－ヒトＣＬＤＮ１８．１（ＣＨＯ－ｈｕｍａｎ ＣＬＤＮ１８．１）、ＣＨＯ－ヒトＣＬＤＮ１８．２（ＣＨＯ－ｈｕｍａｎ ＣＬＤＮ１８．２）、ＳＰ２／０－ヒトＣＬＤＮ１８．１（ＳＰ２／０－ｈｕｍａｎ ＣＬＤＮ１８．１）、ＳＰ２／０－ヒトＣＬＤＮ１８．２（ＳＰ２／０－ｈｕｍａｎ ＣＬＤＮ１８．２）、２９３Ｔ－マウスＣＬＤＮ１８．１（２９３Ｔ－ｍｏｕｓｅＣＬＤＮ１８．１）、２９３Ｔ－マウスＣＬＤＮ１８．２（２９３Ｔ－ｍｏｕｓｅＣＬＤＮ１８．２）、２９３Ｔ－カニクイザルＣＬＤＮ１８．１（２９３Ｔ－ｍａｃａｃａＣＬＤＮ１８．１）、２９３Ｔ－カニクイザルＣＬＤＮ１８．２（２９３Ｔ－ｍａｃａｃａＣＬＤＮ１８．２）として標識され、どちらもモノクローナル安定細胞株である。

【0241】

（実施例３ ＣＬＤＮ１８．２マウス抗原結合タンパク質の生成）
１．マウス免疫
ヒトＣＬＤＮ１８．２の第一細胞外セグメントの全長塩基配列を用いて、蘇州金唯智生物科技有限公司に従来の遺伝子合成を依頼し、当社が提供する真核生物用発現ベクターにクローニングし、構築されたプラスミドはｐＣＭＶ－ＣＬＤＮ１８．２－Ｄ１であり、得られた穿刺細菌液からプラスミド抽出を行ってＤＮＡ免疫原を得た。細胞免疫原は、実施例２で構築したＳＰ２／０－ヒトＣＬＤＮ１８．２細胞であった。この実験では、合計９匹のＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化し、うち６匹のマウスは細胞抗原とＤＮＡ抗原の組み合わせで免疫化され、他の３匹のマウスは全細胞免疫化で免疫化され、古典的なマウスの免疫化スケジュールを用い、２回の免疫後、マウス血清を回収し、２９３ＴヒトＣＬＤＮ１８．２細胞を使用してＦＡＣＳによる血清力価を測定し、力価要件を満たすマウスを最後の追加免疫に選択した。力価が要件を満たさない場合、血清力価が要件を満たすまで免疫を１～２回増やす必要があり、最後の免疫から３日後に、滅菌条件下でマウスの脾臓組織を収集して脾臓細胞を粉砕して懸濁液にし、脾臓細胞の赤血球溶血処理を施して、脾細胞を溶解し、その後小分けして－８０℃の冷蔵庫で冷凍して用意しておく。

【0242】

２．ハイブリドーマ細胞融合
マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０を予め蘇生させ、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養、継代した。融合当日、ＰＥＧ １４５０溶液（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃２５３２２－６８－３）と高グルコースＤＭＥＭ培地を予め３７℃の水浴で予熱した。ＳＰ２／０細胞の状態を顕微鏡で観察し、細胞は対数増殖期にあるのが最適であり、４００ｇで５分間遠心分離してＳＰ２／０細胞を回収し、適量の予熱したＤＭＥＭ培地に再懸濁してトリパンブルーで計数し、細胞生存率が９０％以上である必要があり、その後３７℃の水浴に入れて用意しておく。マウス脾細胞を３７℃の水浴中で蘇生させ、予熱したＤＭＥＭ ２０ｍｌで洗浄し、４００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨て、予熱したＤＭＥＭ ２５ｍｌを加えて細胞を再懸濁し、一定の比率に希釈し、血球計数器で計数する。 細胞数比（脾臓細胞：ＳＰ２／０＝４：１）に従い混合し、４００ｇ、５分間で遠心分離し、上清を捨てた。予熱したＰＥＧ１４５０溶液１ｍＬをゆっくりと加えて細胞融合を実施した。総量１×１０^７個の脾臓細胞を各９６ウェルプレートにプレーティングし、培地には１０％ＦＢＳ、１％二重抗体、２％ＨＡＴサプリメント（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）および１０％ＣｌｏｎａＣｅｌｌ^ＴＭ－ＨＹ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ，ＣＡＴ＃：０３８０３）の高グルコースＤＭＥＭ培地であった。測定前日に培地交換を行い、交換後の培地は１０％ＦＢＳ、１％二重抗体、１％ＨＴサプリメント（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を含む高グルコースＤＭＥＭ培地で、２４時間後の９６ウェルプレートの細胞培養上清をとってフローサイトメトリー検出を実施した。

【0243】

３．ハイブリドーマ細胞のフローサイトメトリースクリーニング
実施例２で構築した２９３Ｔ－ヒトＣＬＤＮ１８．２細胞およびＣＨＯ－ヒトＣＬＤＮ１８．２細胞を選択して融合後に得られた母クローンハイブリドーマ細胞の第１ラウンドのフローサイトメトリー初期スクリーニングを実施し、すなわち、細胞を別々に消化や計数し、フローサイトメトリー染色バッファー（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）に再懸濁し、１×１０^６／ｍｌの細胞密度に調整し、９６ウェルＶ底プレートに３０μｌ／ウェルを添加し、ハイブリドーマ細胞培養上清５０μｌ／ウェルを、細胞抗原をプレーティングした９６ウェルＶ底プレートに加え、同時に陽性対照（５μｇ／ｍｌのゾルベツキシマブ抗体、３０μｌ／ウェル）および陰性対照（３０μｌ／ウェルのＰＢＳバッファー）を設け、４℃で１時間共インキュベートし、フローサイトメトリー染色バッファーで１回洗浄し、対応する二次抗体を３０μｌ／ウェルで添加し、４℃で３０分間共インキュベートし、フローサイトメトリー染色バッファーを加えて２回洗浄し、細胞を振盪して分散させ、各ウェルに２５μｌのＦＡＣＳバッファーを加え、機器にセットして検出を行った（ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒフローサイトメーター、ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ社製）。初期スクリーニングでＣＬＤＮ１８．２陽性を示す母クローンを選択し、２４ウェル細胞培養プレートへ培養を拡大し、３日後に細胞上清を採取し、ＦＡＣＳ再スクリーニングを行ってＣＨＯ－ヒトＣＬＤＮ１８．２、ＣＨＯ－ヒト ＣＬＤＮ１８．１および２９３Ｔ－ヒトＣＬＤＮ１８．２、２９３Ｔ－ヒトＣＬＤＮ１８．１の４種類の細胞を選択して別々にプレーティングし、その中からＣＬＤＮ１８．２陽性およびＣＬＤＮ１８．１陰性のハイブリドーマ母クローンをスクリーニングした。陽性ハイブリドーマ母クローンを勾配希釈法でモノクローニングし、２～３ラウンドのサブクローニングとＦＡＣＳ選別を経て、ＣＬＤＮ１８．２特異的抗体を分泌するハイブリドーマモノクローナル細胞が得られ、２９３Ｔ－ヒトＣＬＤＮ１８．２細胞およびＣＨＯ－ヒトＣＬＤＮ１８．２細胞とは陽性結合を生成できるが、２９３Ｔ－ヒトＣＬＤＮ１８．１、ＣＨＯ－ヒトＣＬＤＮ１８．１細胞とは陰性結合を生成する。

【0244】

結果を表２に示す。ハイブリドーマ細胞培養上清中のＣＬＤＮ１８．２への結合について陽性であったサブクローンには、３Ａ６、７Ｅ３、５Ｅ６、１４Ｅ１２および１７Ｂ１０、合計５株のモノクローナル細胞が含まれる。

【0245】

【表2】

【0246】

（実施例４ ＣＬＤＮ１８．２マウス抗原結合タンパク質の可変領域のシーケンシング）
縮重プライマー増幅法を用いてシーケンシングしてＣＬＤＮ１８．２マウス抗原結合タンパク質の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列を得た。使用したプライマーは非特許文献２１を参照し、蘇州金唯智会社にプライマー合成を依頼した。具体的には、実施例３の５個のＣＬＤＮ１８．２陽性ハイブリドーマモノクローナル細胞を回収し、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して全細胞ＲＮＡを抽出し、１％アガロースゲル電気泳動によりＲＮＡの完全性を検出し、ＮａｎｏＤｒｏｐ核酸定量分析装置でＲＮＡ濃度を測定した。ＲＮＡ逆転写キットで１ｕｇのＲＮＡを ｃＤＮＡに逆転写し、－２０℃で保存して用意しておく。５μｌのｃＤＮＡをテンプレートとして使用し、ＰＣＲ高忠実度酵素（北京泉石金社製、ＡＰ２３１）の操作説明に従いＰＣＲ反応系を構成し、ＰＣＲ手順を設定し、アニーリング温度は勾配降下法を用い、直接第１ラウンドＰＣＲ産物１ｕｌをテンプレートとして第２ラウンドＰＣＲを行い、ＰＣＲの反応系および手順は上記と同じである。第２ラウンドＰＣＲ産物はすべて１％アガロースゲル電気泳動用にサンプルをロードし、適切なサイズの特定の目的に適したバンドを切り出し、ゲル回収を実施し、平滑末端クローニングベクター（北京全式金社製、ＣＢ５０１）を連結し、Ｔｒａｎｓ１－Ｔ１コンピテントセルを形質転換し、２ＹＴプレートに塗布し、３７℃のインキュベーターで逆さにして１２～１６時間インキュベートし、超クリーンの作業台でピペットチップを使用してシングルクローンコロニーを選択し、コロニーが活性化された後、蘇州金唯智会社にシーケンシングを依頼した。シーケンシング後、表３に示すように、５株のハイブリドーマクローンのＶＨおよびＶＬ遺伝子配列が得られた。

【0247】

【表3】

【0248】

（実施例５ ＣＬＤＮ１８．２抗原結合タンパク質の調製）
実施例４でシーケンシングして得られた５つの重鎖・軽鎖可変領域配列をテンプレートとしてプライマーをそれぞれ設計し、蘇州金唯智生物科技有限公司にプライマー合成を依頼し、高忠実度酵素を使用してＰＣＲ増幅、アガロースゲル電気泳動およびゲル回収を行い、回収して得られたプラスミドＤＮＡを、ヒトＩｇＧ１定常領域を含み酵素で切断した真核生物発現ベクター（ｐＣＭＶ－ＩｇＧ１ＮＤＬおよびｐＣＭＶ－κ）に相同組換え（Ｖａｚｙｍｅ、Ｃ１１２）し、蘇州金唯智生物科技有限公司に正しいポジティブ組換えベクターをシーケンシングして同定するよう依頼した。シーケンシングが正しい後、プラスミドを抽出し、重鎖と軽鎖がＥｘｐｉ２９３細胞に同時トランスフェクトされ、５日後遠心分離して細胞培養上清を回収して、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーで精製し、完全なヒトおよびマウスＩｇＧ１、Ｉｇκ抗原結合タンパク質が得られた。 これらの５つの抗原結合タンパク質は、それぞれｃ５Ｅ６、ｃ７Ｅ３、ｃ３Ａ６、ｃ１４Ｅ１２、ｃ１７Ｂ１０と名付けられた。

【0249】

（実施例６ ＣＬＤＮ１８．２抗原結合タンパク質およびＣＬＤＮ１８．２の特異的結合活性の測定）
蛍光活性化細胞選別技術（ＦＡＣＳ）により、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒフローサイトメーター（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ社から購入）を使用し、バッファーとして０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて上記キメラ抗体の標的細胞に対する特異的結合活性を検出し、ヒトＣＬＤＮ１８．２発現の安定な形質転換細胞株、ヒトＣＬＤＮ１８．１発現の安定な形質転換細胞株、および腫瘍細胞系の３つの標的細胞を選択して、結合活性をそれぞれ測定した。

【0250】

１．実施例５の抗原結合タンパク質と高発現ヒトＣＬＤＮ１８．２細胞のフローサイトメトリーによる結合活性検出
細胞は、実施例２で構築した２９３Ｔ－ヒトＣＬＤＮ１８．２、ＣＨＯ－ヒトＣＬＤＮ１８．２、およびＳＰ２／０－ヒトＣＬＤＮ１８．２細胞であった。細胞を消化して計数し、細胞をフローサイトメトリー染色バッファーに再懸濁し、１×１０^６／ｍｌの細胞密度に調整し、９６ウェルＶ底プレートに３０μｌ／ウェルを添加した。一次抗体を３０μｌ／ウェルで添加し、抗体を開始濃度３０μｇ／ｍｌからフローサイトメトリー染色バッファーで２倍または３倍の勾配で希釈して７つの濃度勾配を形成し、各抗体について、ＰＢＳ陰性対照を設け、陽性対照抗体は実施例１で精製して得られたゾルベツキシマブであり、４℃で１時間インキュベートし、フローサイトメトリー染色バッファーで１回洗浄し、二次抗体（ａｂｃａｍ，Ｃａｔ＃ａｂ９８５９３）を３０μｌ／ウェル加え、４℃で３０分間インキュベートし、フローサイトメトリー染色バッファーで２回洗浄し、細胞を振盪して分散させ、各ウェルに２５μｌのフローサイトメトリー染色バッファーを加え、機器にセットするまで待機した。元のデータをＧｒａｐｈＰａｄ８．０ソフトウェアに代入してグラフ化および計算した結果を図１に示す。

【0251】

２．実施例５の抗原結合タンパク質と高発現ヒトＣＬＤＮ１８．１細胞のフローサイトメトリーによる結合活性検出
陽性対照抗体は、市販の抗ＣＬＤＮ１８抗体（Ａｎｔｉ－Ｃｌａｕｄｉｎ１８ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（ａｂｃａｍ，Ｃａｔ＃ａｂ２０３５６３）であり、抗原結合部位はＣＬＤＮ１８．２ ４回膜貫通タンパク質の細胞内部分に位置し、フローサイトメトリーによる細胞内染色分析が必要である。具体的には、細胞は、実施例１で構築した２９３Ｔ－ヒトＣＬＤＮ１８．１細胞およびＳＰ２／０－ヒトＣＬＤＮ１８．１細胞であった。細胞消化や計数後、細胞を固定化し、膜破壊処理を施し、処理後の細胞をフローサイトメトリー染色バッファーに１×１０^６／ｍｌになるように再懸濁し、９６ウェルＶ底プレートに３０μｌ／ウェルを添加した。一次抗体を３０μｌ／ウェルで添加し、抗体を開始濃度３０μｇ／ｍｌからフローサイトメトリー染色バッファーで３倍の勾配で希釈して７つの濃度勾配を形成し、各抗体について、ＰＢＳ陰性対照を設け、陽性対照抗体の希釈条件は上記と同じである。４℃で１時間インキュベートし、フローサイトメトリー染色バッファーで１回洗浄し、二次抗体（ａｂｃａｍ，Ｃａｔ＃ａｂ９８５９３およびＣａｔ＃ａｂ１５００７９）を３０μｌ／ウェル加え、４℃で３０分間インキュベートし、フローサイトメトリー染色バッファーで２回洗浄し、細胞を振盪して分散させ、各ウェルに２５μｌのフローサイトメトリー染色バッファーを加え、機器にセットするまで待機した。元のデータをＧｒａｐｈＰａｄ８．０ソフトウェアに代入してグラフ化および計算した結果を図２に示す。

【0252】

３．実施例５における抗原結合タンパク質および腫瘍細胞系のフローサイトメトリーによる結合活性検出
実施例２に示した方法に従い構築したヒトＣＬＤＮ１８．２を安定かつ高発現するＭＣ３８－ヒトＣＬＤＮ１８．２腫瘍細胞を標的細胞として選択し、細胞を消化して計数し、フローサイトメトリー染色バッファーに再懸濁し、１×１０^６／ｍｌに調整し、９６ウェルＶ底プレートに３０μｌ／ウェルを添加した。一次抗体を３０μｌ／ウェルで添加し、抗体を開始濃度３０μｇ／ｍｌからフローサイトメトリー染色バッファーで３倍の勾配で希釈して７つの濃度勾配を形成し、各抗体について、ＰＢＳ陰性対照を設け、陽性対照抗体は実施例１で精製したゾルベツキシマブであり、希釈条件は上記と同じである。４℃で１時間インキュベートし、フローサイトメトリー染色バッファーで１回洗浄し、二次抗体（ａｂｃａｍ，Ｃａｔ＃ａｂ９８５９３）を３０μｌ／ウェル加え、４℃で３０分間インキュベートし、フローサイトメトリー染色バッファーで２回洗浄し、細胞を振盪して分散させ、各ウェルに２５μｌフローサイトメトリー染色バッファーを加え、機器にセットするまで待機した。元のデータをＧｒａｐｈＰａｄ８．０ソフトウェアに代入してグラフ化および計算した結果を図３に示す。

【0253】

上記の手順により、５種類のヒトおよびマウスの抗原結合タンパク質を発現・精製し、フローサイトメトリーで抗原結合活性を検証した。図１に示すように、５種類の抗原結合タンパク質はいずれもヒトＣＬＤＮ１８．２に対して濃度依存的な結合活性を示し、大部分がゾルベツキシマブ陽性抗体よりも強力であり、３種類の細胞の検出結果は一致した。図２に示すように５種類の抗原結合タンパク質は、いずれもヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合できるが、ヒトＣＬＤＮ１８．１に結合しなかった。図３に示すように５種類の抗原結合タンパク質は、いずれもヒトＣＬＤＮ１８．２を安定かつ高発現するマウス結腸癌ＭＣ３８細胞に強く結合し、結合活性の強さは濃度依存性を示し、一部はゾルベツキシマブ陽性抗体よりも強力であった。

【0254】

（実施例７ ＣＬＤＮ１８．２抗原結合タンパク質の種交差結合活性の解析）
蛍光活性化細胞選別技術（ＦＡＣＳ）により、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社から購入）を使用し、バッファーとして０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳを使用して、上記抗原結合タンパク質とマウス（ｍｏｕｓｅＣＬＤＮ１８．２）、カニクイザル（ｍａｃａｃａＣＬＤＮ１８．２）の種交差結合活性を検出した。具体的には、２９３ＴマウスＣＬＤＮ１８．２細胞および２９３ＴカニクイザルＣＬＤＮ１８．２細胞は、実施例２で構築された安定な形質転換細胞株であり、細胞を消化して計数し、１×１０^６／ｍｌの細胞密度までフローサイトメトリー染色バッファーに再懸濁し、９６ウェルＶ底プレートに３０μｌ／ウェルを添加した。一次抗体を開始濃度１０μｇ／ｍｌからフローサイトメトリー染色バッファーで３倍に勾配希釈し、６つの濃度勾配を形成した。各抗体についてＰＢＳ陰性対照を設け、陽性対照はゾルベツキシマブであり、希釈条件は上記と同じである。４℃で１時間インキュベートし、フローサイトメトリー染色バッファーで１回洗浄し、二次抗体（ａｂｃａｍ，Ｃａｔ＃ａｂ９８５９３）を３０μｌ／ウェル加え、４℃で３０分間インキュベートし、フローサイトメトリー染色バッファーで２回洗浄し、細胞を振盪して分散させ、各ウェルに３０μｌフローサイトメトリー染色バッファーを加え、機器にセットして測定した。元のデータをＧｒａｐｈＰａｄ８．０ソフトウェアに代入してグラフ化および計算した結果を図４に示す。５種類のＣＬＤＮ１８．２キメラ抗原結合タンパク質と陽性対照抗体ゾルベツキシマブは、どちらもマウス（ｍｏｕｓｅＣＬＤＮ１８．２）およびカニクイザル（ｍａｃａｃａＣＬＤＮ１８．２）に結合し、結合活性は勾配依存性を示す。これは、これら５種類のキメラ抗原結合タンパク質およびゾルベツキシマブがヒトはヒトＣＬＤＮ１８．２（ｈｕｍａｎＣＬＤＮ１８．２）に特異的に結合するだけでなく、ヒト、マウス、およびカニクイザルにおいて種交差の結合活性も有することを示している。

【0255】

（実施例８ ＣＬＤＮ１８．２抗原結合タンパク質のＣＤＣ活性）
使用細胞毒性検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ＃Ｇ１７８０）でＳＰ２／０－ヒトＣＬＤＮ１８．２細胞に対するＣＤＣ効果を誘導するＣＬＤＮ１８．２抗原結合タンパク質の能力を検出し、具体的なプロセスは次の通りであり、
（１）培地を調製（Ａ：ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％二重抗体、Ｂ：ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％二重抗体＋１０％ウサギ補体）し、
（２）標的細胞ＳＰ２／０－ヒトＣＬＤＮ１８．２を４００ｇで５分間遠心分離し、次いで、標的細胞密度が４×１０^５細胞／ｍｌとなるように細胞を上記培地Ａに再懸濁し、９６ウェル細胞培養プレートに１００μｌ／ウェルを添加し、
（３）抗体を上記培地Ｂで１０ｕｇ／ｍｌ、２ｕｇ／ｍｌ、および０．４ｕｇ／ｍｌの３つの濃度に希釈し、１００μｌ／ウェルを検出ウェルに添加し、各濃度点で２つの重複ウェルを設け、ゾルベツキシマブを陽性対照抗体、ヒトＩｇＧ－Ｆｃを陰性対照とし、
（４）補体は、ＰｅｌＦｒｅｅｚ Ｂｉｏ社から購入したＲａｂｂｉｔ Ｃｏｍｐｌｅｎｔ ３～４週（Ｃａｔ＃３１０６１－３）で、実験で使用した補体の最終濃度は５％であり、
（５）キットの要件に従いコントロールウェルを設け、得られた混合物を３７℃のインキュベーターで４時間共インキュベートした後、マイクロプレートリーダーで４９０ｎＭの吸光度値を記録し、キットから与えられる計算式で標的細胞の溶解率を計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ ８でデータを分析・処理した。

【0256】

結果は図５ａに示され、ＳＰ２／０－ヒトＣＬＤＮ１８．２細胞を殺傷標的細胞とした場合、検出した全ての抗原結合タンパク質は、用量依存的に強力なＣＤＣ効果を誘導でき、すなわち、有意なＣＤＣ活性を有し、特にｃ５Ｅ６、ｃ７Ｅ３、およびｃ１７Ｂ１０はゾルベツキシマブよりも高いＣＤＣ活性を示した。

【0257】

ヒトＣＬＤＮ１８．２を安定かつ過剰発現するＣＨＯ細胞に対してＣＤＣ効果を誘導するｃ５Ｅ６抗原結合タンパク質の能力についてさらに検出した。簡単に言えば、ＣＨＯ－ヒトＣＬＤＮ１８．２ 細胞は実施例１に示したように当社のレンチウイルストランスフェクションシステムにより構築されて得られ、操作方法は上記と同じ、ウェルあたり１．２×１０^４個の細胞密度でプレーティングし、ウサギ補体の最終濃度は５％、抗原結合タンパク質を５倍の勾配、すなわち１０ｕｇ／ｍｌ、２ｕｇ／ｍｌ、０．４ｕｇ／ｍｌ、０．０８ｕｇ／ｍｌ、０．０１６ｕｇ／ｍｌ、０．００３２ｕｇ／ｍｌ、０．６４ｎｇ／ｍｌで希釈し、各濃度に２つの重複ウェルを設け、ゾルベツキシマブを陽性対照抗体、ヒトＩｇＧ－Ｆｃをアイソタイプコントロール抗体とし、４時間の共インキュベーション後の吸光度値をマイクロプレートリーダーで測定し、標的細胞の溶解率を計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ ８でデータを分析・処理した。

【0258】

結果は図５ｂに示され、ｃ５Ｅ６抗原結合タンパク質はＣＨＯ－ヒトＣＬＤＮ１８．２細胞に対して用量依存的に強力なＣＤＣ効果を誘導することができ、ゾルベツキシマブよりも高いＣＤＣ活性を示している。

【0259】

（実施例９ ＣＬＤＮ１８．２抗原結合タンパク質の競合結合活性解析）
ビオチン（ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ，Ｔｈｅｒｍｏ，Ａ３９２５７）でｃ５Ｅ６およびゾルベツキシマブを標識し、各々５００ｕｇ標識し、ビオチン化抗原結合タンパク質分子は、分子相互作用分析装置ＯｃｔｅｔＲＥＤ３８４（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で標識効果を測定し、抗体を固化させるため、ＳＡセンサーを選択し、抗体濃度は１００ｎＭ、標識時間は１８０秒で、標識されたビオチン化抗原結合タンパク質は、ビオチン化－ｃ５Ｅ６（Ｂｉｏｔｉｎｙｒａｔｅｄ－ｃ５Ｅ６）、ビオチン化－ｃ７Ｅ３（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ－ｃ７Ｅ３）、ビオチン化－ｃ１７Ｂ１０（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ－ｃ１７Ｂ１０）、ビオチン化－ゾルベツキシマブ（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ－ゾルベツキシマブ）と名付けられた。

【0260】

蛍光活性化細胞選別技術（ＦＡＣＳ）により、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒフローサイトメーター（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ社から購入）を使用し、バッファーとして０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで上記抗原結合タンパク質およびＣＨＯ－ヒトＣＬＤＮ１８．２細胞（実施例２で得られた）のエピトープ競合結合活性を検出し、具体的なプロセスは以下の通りであり、
（１）バッファーを使用してＣＨＯ－ヒトＣＬＤＮ１８．２細胞を１×１０^６ 細胞／ｍｌの濃度で調製し、９６ウェルＶ底プレート（ｃｏｒｎｉｎｇ ３８９４）の各ウェルに３０μｌを加え、
（２）ビオチン化－ｃ５Ｅ６（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ－ｃ５Ｅ６）抗原結合タンパク質の最終濃度が０．５μｇ／ｍｌとなるように、試験対象となる抗原結合タンパク質をそれぞれバッファーで調製し、３０μｌ／ウェルを９６ウェルＶ底プレートに加え、ビオチン化－ゾルベツキシマブ（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ－ｚｏｌｂｅｔｕｘｉｍａｂ）抗原結合タンパク質の最終濃度は５μｇ／ｍｌで、３０μｌ／ウェルを９６ウェルＶ底プレートに添加し、
（３）バッファーで競合抗原結合タンパク質（ｃ５Ｅ６、ｃ７Ｅ３、ｃ１７Ｂ１０ およびゾルベツキシマブ）を調製し、抗体の最終濃度は３３３ｕｇ／ｍｌから始まり、抗体を４倍の勾配で希釈して１０つの濃度勾配を形成し、ＰＢＳを陰性対照ウェルとして設け、調製した異なる濃度の抗体を、標的細胞と試験対象となる抗体をプレーティングした９６ウェルＶ底プレートに３０μｌ／ウェルで添加し、よく混合し、
（４）４℃の冷蔵庫で１時間インキュベートし、
（５）各ウェルに１１０μｌのバッファーを加え、５００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を振盪して分散させ、
（６）工程（５）を繰り返し、
（７）バッファーで蛍光二次抗体（ＢＤ ｐｈａｍｉｎｇｅｎ ＡＰＣ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、Ｃａｔ＃５５４０６７）を１：５００の配合比で調製し、ウェルあたり３０μｌを細胞に加え、よく混合し、４℃の冷蔵庫で３０分間インキュベートし、
（８）各ウェルに１７０μｌのバッファーを加え、５００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を振盪して分散させ、
（９）工程（８）を繰り返し、
（１０）２５μｌのバッファーを各ウェルに加え、よく混合した後、フローサイトメーターで検出した。

【0261】

フローサイトメトリーエピトープ競合結合活性検出の解析結果を図６に示す。本出願の単離された抗原結合タンパク質ｃ１７Ｂ１０／ｃ７Ｅ３とビオチン化－ｃ５Ｅ６（Ｂｉｏｔｉｎｙｒａｔｅｄ－ｃ５Ｅ６）はどちらも競合があり、ｃ１７Ｂ１０／ｃ７Ｅ３抗原結合タンパク質は、高濃度（３３３ｕｇ／ｍｌ）でビオチン化－ｃ５Ｅ６（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ－ｃ５Ｅ６）と細胞抗原の結合について完全に競合し、これらは同じ抗原結合エピトープであると推測された。対照的に、ゾルベツキシマブとビオチン化－ｃ５Ｅ６（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ－ｃ５Ｅ６）との間には弱い競合があり、ゾルベツキシマブ抗体濃度が増加するとともに、シグナル中央値は減少し、一定の濃度依存性を示すが、ゾルベツキシマブ抗体濃度を３３３ｕｇ／ｍｌに引き上げても競合活性と強度は他の抗原結合タンパク質に比べてはるかに弱く、ビオチン化－ｃ５Ｅ６（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ－ｃ５Ｅ６）抗原結合タンパク質と完全に競合することはできず、ゾルベツキシマブとｃ５Ｅ６の抗原結合エピトープは完全に同一ではなく、交差または包含（ゾルベツキシマブ抗体のエピトープはｃ５Ｅ６に含まれている）関係を示していると推測された。

【0262】

（実施例１０ ＣＬＤＮ１８．２抗原結合タンパク質のインビボ抗腫瘍活性）
実施例５の抗原結合タンパク質（ｃ５Ｅ６、ｃ７Ｅ３、ｃ１７Ｂ１０）、陽性対照抗体ゾルベツキシマブ、およびアイソタイプコントロール抗体ヒトＩｇＧ－Ｆｃを選択して、マウス結腸癌細胞を接種したＣ５７ＢＬ／６マウスのインビボ抗腫瘍活性を測定した。当社のＥｘｐｉ２９３一過性トランスフェクションシステムを用いて精製して上記６種類の抗原結合タンパク質が得られ、抗原結合タンパク質のエンドトキシンは４ＥＵ／ｍｇ以下に制御された。具体的な実施スキームは以下の通りである。

【0263】

１１５匹の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右腹部にＭＣ３８ヒトＣＬＤＮ１８．２細胞を皮下接種し、接種細胞量は１．１×１０^６で、接種７日後に腫瘍サイズは３１．３３～１１６．３１ｍｍ^３（平均腫瘍サイズは７１．５９ｍｍ^３）の８０匹のマウスを選択して腫瘍体積に応じて各群８匹ずつ１０群に分け、マウスをランダムに群分けした日をＤａｙ０と定義した。群分け後、マウスの尾静脈に週１回、４週間連続投与し、用量を３０ｍｇ／ｋｇと７．５ｍｇ／ｋｇの２群に分け、マウスの群分けと投与計画を表４に示す。投与期間中、週に体重および腫瘍サイズを３回測定し、下式で腫瘍体積を計算し、腫瘍サイズで腫瘍成長抑制率（ＴＧＩ）およびＴ／Ｃを計算した。腫瘍体積が２０００ｍｍ^３に達したとき、実験を中止し、マウスを安楽死させた。

【0264】

［数１］
ＴＶ＝（長さ×幅^２）／２

【0265】

【表4】

【0266】

皮下ＭＣ３８－ヒトＣＬＤＮ１８．２マウス結腸癌モデルを介して尾静脈経路から投与されたゾルベツキシマブ、ｃ１７Ｂ１０、ｃ５Ｅ６、およびｃ７Ｅ３の抗腫瘍効果を雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの中で評価した。結果は、ＭＣ３８－ヒトＣＬＤＮ１８．２荷瘤Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、すべての投与されたマウスは忍容性が良好で、体重は副作用なく安定したままであることを示した。マウスの体重の変化と相対変化（％）をそれぞれ図７および図８に示す。１７日目以前の腫瘍体積変化曲線および腫瘍成長抑制曲線を解析したところ、ＰＢＳ対照群と比較して、ｃ５Ｅ６およびゾルベツキシマブ高用量投与群はより良好な抗腫瘍効果を示し、抗腫瘍効果には有意差が示され（＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１）、図９および図１０に示す。４０日目以前のカプランマイヤー生存曲線を解析したところ、ＰＢＳ対照群と比較して、ｃ５Ｅ６低用量投与群、ｃ５Ｅ６高用量投与群、およびゾルベツキシマブ高用量投与群はいずれもマウス生存率が高く、有意差（＊、Ｐ＜０．０５）を示し、その中でｃ５Ｅ６抗原結合タンパク質が最も強い抗腫瘍活性を持ち、結果を図１１に示す。

【0267】

（実施例１１ ＣＬＤＮ１８．２一本鎖抗体の産生および抗原結合活性の同定）
本実施例は、レンチウイルス感染および蛍光活性化セルソーティングを用いてヒトＣＬＤＮ１８．２を安定に発現する細胞、すなわちＳＰ２／０－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を得た。Ｂａｌｂ／ｃマウスで細胞性免疫を実施し、免疫原はＳＰ２／０－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞であり、マウスハイブリドーマ技術、フローサイトメトリースクリーニングとサブクローニングを使用してＣＬＤＮ１８．２陽性モノクローナル細胞を得、インビトロ培養でＩｇＧ種類のＣＬＤＮ１８．２マウスモノクローナル抗体を得た。縮重プライマー増幅法によりシーケンシングして重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）および軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）の配列を得、合成リンカーペプチド（Ｌｉｎｋｅｒ）遺伝子を介して抗体の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）と軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を組換え遺伝子に結合し、該組換え遺伝子により発現される抗体がＣＬＤＮ１８．２一本鎖抗体、すなわち５Ｅ６-ｓｃＦｖ（配列番号：９０）である。レンチウイルス感染と蛍光活性化セルソーティングを同時に行い、ヒトＣＬＤＮ１８．１を安定に発現するＳＰ２／０－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞を得た。

【0268】

フローサイトメトリー方法による５Ｅ６－ｓｃＦｖ一本鎖抗体および標準抗体（ＶＨは配列番号：９２で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号：９３で示されるアミノ酸配列を含む）の特異的結合活性の同定：ＳＰ２／０－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を計数し、細胞をフローサイトメトリー染色バッファーに再懸濁して、１×１０^６／ｍｌに調整し、３０μｌ／ウェルを９６ウェルＶ底プレートに添加した。一次抗体を３０μｌ／ウェルで添加し、一次抗体を使用濃度８０μｇ／ｍｌからフローサイトメトリー染色バッファーを使用して４倍の勾配で希釈して７つの濃度勾配を形成し、各抗体について、ＰＢＳ陰性対照を設けた。４℃で１時間インキュベートし、フローサイトメトリー染色バッファーで１回洗浄し、二次抗体：ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６５０）（ａｂｃａｍ，Ｃａｔ＃ａｂ９８５９３）を３０μｌ／ウェルで添加し、４℃で３０分間インキュベートし、フローサイトメトリー染色バッファーで２回洗浄し、細胞を振盪して分散させ、フローサイトメトリー染色バッファーを２５μｌ／ウェルで添加し、機械にセットするのを待つ。同時に、ＳＰ２／０－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞を計数してプレーティングし、一次抗体を使用濃度１０ｕｇ／ｍｌから３倍の勾配で希釈して５つの濃度勾配を形成し、二次抗体はヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ＤｙＬｉｇｈｔ(登録商標) ６５０）（ａｂｃａｍ，Ｃａｔ＃ａｂ９８５９３）であり、元のデータをＧｒａｐｈＰａｄ８．０ソフトウェアに代入してグラフ化および計算し、標準抗体と同様に、５Ｅ６－ｓｃＦｖ一本鎖抗体はヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合できるという結果を図１２に示す。

【0269】

（実施例１２ ＣＬＤＮ１８．２一本鎖抗体の非標的細胞に対する結合活性の同定）
本実施例は、蛍光活性化細胞選別技術（ＦＡＣＳ）で５Ｅ６－ｓｃＦｖ一本鎖抗体のヒト組織内の様々な非標的細胞に対する結合活性を同定した。細胞は、それぞれヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）、ヒト不死化表皮角化細胞（ＨａＣａＴ）、ヒト正常肝細胞（ＬＯ２）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、正常ヒト表皮角化細胞（ＫＥＲＡ）、ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞（Ａ５４９）、ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ－７）、ヒト皮膚線維芽細胞（ＢＪ）であった。抗体を使用濃度３０ｕｇ／ｍｌから３倍の勾配で希釈して７つの濃度勾配を形成し、二次抗体はヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６５０）（ａｂｃａｍ、Ｃａｔ＃ａｂ９８５９３）であり、インキュベーション後に遠心分離し、フローサイトメトリー染色バッファーに再懸濁して機器にセットし、結果をＧｒａｐｈＰａｄ８．０ソフトウェアに代入してグラフ化した。５Ｅ６－ｓｃＦｖ一本鎖抗体はヒト組織内の様々な非標的細胞に対して非特異的結合を示さず、標準抗体と同様に腫瘍標的に対する特異性が初期検証され、すなわち「オフターゲット効果」現象はないという結果を図１３に示す。

【0270】

（実施例１３ ヒト胃癌マウスモデルにおけるＣＬＤＮ１８．２抗原結合タンパク質の抗腫瘍活性）
実施例１０のように、ヒトＣＬＤＮ１８．２抗原結合タンパク質（ｃ５Ｅ６）、陽性対照抗体ゾルベツキシマブおよびアイソタイプコントロール抗体ヒトＩｇＧ－Ｆｃを選択して、ヒト胃がん細胞（ＮＵＧＣ－４）を接種された雌ヌードマウスのインビボ抗腫瘍活性を測定する。具体的な実施スキームは次の通りである。

【0271】

２８匹の雌ヌードマウスにＮＵＧＣ－４細胞を皮下接種し、接種細胞量は３×１０^６で、接種７日後に腫瘍サイズは８０ｍｍ^３の２０匹のマウスを選択して腫瘍体積に応じて各群５匹ずつ４群に分け、マウスをランダムに群分けした日をＤａｙ０と定義した。群分け後、マウスの腹腔内に週２回、３週間連続投与し、マウスの群分けと投与計画を表５に示す。投与期間中、週に体重および腫瘍サイズを３回測定し、下式で腫瘍体積を計算した。腫瘍体積が２０００ｍｍ^３に達したとき、実験を中止し、マウスを安楽死させた。

【0272】

［数２］
ＴＶ＝（長さ×幅^２）／２

【0273】

【表5】

【0274】

皮下ＮＵＧＣ－４ヒト胃癌腫瘍モデルを用いて、ヌードマウスにゾルベツキシマブとｃ５Ｅ６抗体を腹腔内投与した場合の抗腫瘍効果を評価し、実験は投与後の２５日間まで観察し、結果はＮＵＧＣ－４荷瘤の雌ヌードマウスにおいて投与されたすべてのマウスは忍容性が良好で体重は副作用もなく安定したままであることを示し、マウスの体重の変化を図１４Ａに示す。観察期間中、マウスの腫瘍体積の変化曲線を図１４Ｂに示す。Ｇ３：ゾルベツキシマブ、１０ｍｇ／ｋｇ群およびＧ４：ｃ５Ｅ６，１０ｍｇ／ｋｇ群のマウスは、Ｇ２アイソタイプ対照群と比較して一定の抗腫瘍活性を示し、統計的に有意な差（ｐ＜０．０５）がある。Ｇ３とＧ４との間の抗腫瘍活性に有意差がなく、近似の抗腫瘍レベルを有する。

【0275】

（実施例１４ Ｔ細胞でのＣＬＤＮ１８．２特異的ＣＡＲの安定発現）
図１５Ａに示すように、本実施例におけるＣＬＤＮ１８．２特異的ＣＡＲ構造は、ヒトＣＤ８シグナルペプチド（配列番号：８８）、抗ヒトＣＬＤＮ１８．２一本鎖抗体（配列番号：９０）、ヒトＣＤ８ヒンジ領域（配列番号：８３）、ヒトＣＤ８膜貫通ドメイン（配列番号：８４）、ヒト４－１ＢＢ細胞内共刺激ドメイン（配列番号：８５）、ヒトＣＤ３ζ細胞内活性化ドメイン（配列番号：８６）および追加されたＯｒｉ新要素（配列番号：９１）からなる。まず、本実施例はヒトＴ細胞におけるＣＬＤＮ１８．２特異的ＣＡＲの発現状況および従来のインビトロ培養条件下でのＣＡＲＴ細胞の増幅倍率を探究する。具体的な方法は、次の通りである。

【0276】

１）液体窒素で凍結させたヒトＰＢＭＣ細胞を３７℃の水浴で蘇生し、１１ｍｌ ＰＢＳ＋１ｍｌ ＰＢＭＣ の系で遠心分離・再懸濁・リンス（５００ｇ、５分、４００ｇ、５分、３００ｇ、５分）を３回行い、リンス後のヒトＰＢＭＣ細胞をＣＤ３ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ、ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製、１３０－０５０－１０１）と混合し、磁気スタンドを使用してＣＤ３陽性選択を実施（すなわちＣＤ３^＋Ｔ細胞を分離および保持する）した。ＣＤ３^＋Ｔ細胞を（４％ＦＢＳ＋Ｘ－ＶＩＶＯ（Ｌｏｎｚａ社製）＋２０ｎｇ／ｍｌ第１因子＋１０ｎｇ／ｍｌ第２因子）を含む培地に細胞密度が１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように再懸濁し、１：３の比率（細胞：磁気ビーズ）でＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製４０２０３Ｄで、磁気ビーズは培地で２回洗浄し、磁気スタンドで吸引し、１分間静置する）を添加し、Ｔ細胞を活性化した。Ｔ細胞を磁気ビーズに加え、よく混ぜ、１２ウェルプレートの各ウェルに培地を７００μｌまで加え、細胞数は７×１０^５／ウェル、密度は１×１０^６細胞／ｍｌであり、ソーティングの日を０日目とした。

【0277】

２）活性化されたＴ細胞を３７℃のＣＯ_２インキュベーター内に静置して２０時間培養した後、ウイルス感染多重度（ＭＯＩ）が４の比率で対応するウイルス上清を加え、ｐｏｌｙｂｒｅｎｅを最終濃度１０ｕｇ／ｍｌになるように加え、ピペッティングでよく混ぜた後、水平遠心分離機を用いて１２００ｒｐｍで１時間遠心分離し、ウェルプレートを３７℃ ＣＯ_２インキュベーターに戻して２４時間インキュベートし、感染当日を１日目とした。

【0278】

３）２４時間後、１２ウェルプレートの各ウェル細胞を繰り返しピペッティングでよく混ぜ、１．５ｍｌＥＰ チューブに移し、４００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞密度が７×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるまで細胞を１ｍｌの新鮮なＸ－ＶＩＶＯ完全培地に再懸濁し、３７℃ ＣＯ_２インキュベーターに入れて培養し、培地が黄色くなったら培地を補充し、２日ごとに細胞を計数し、新鮮なＸ－ＶＩＶＯ完全培地を補充て細胞密度を７×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに戻し、統計的計数結果を記録し、ＧｒａｐｈＰａｄ８．０ソフトウェアを使用してグラフ化し、従来の培養下でのＣＡＲＴ細胞の増幅倍率を計算した。

【0279】

４）９～１４日間培養したＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞陽性率の検出：細胞を感染するためのウイルスにはＭｙｃタグが付いているため、ウイルスが細胞を感染した後、フローサイトメメーターでＭｙｃ陽性率を検出して、ＣＡＲ発現陽性率が得られ、使用する直接標識・検出抗体は、Ｍｙｃ－Ｔａｇ（９Ｂ１１）Ｍｏｕｓｅ ｍＡｂ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２２７９Ｓ）であった。

【0280】

ＭＯＩ＝４に従い、５Ｅ６配列および標準配列ウイルスを含むヒトＣＬＤＮ１８．２配列ウイルスにそれぞれ感染させた。結果を図１５Ｂに示す。インビトロでのＣＡＲＴ細胞培養の１２日目にフローサイトメトリーによりＣＡＲの陽性率を検出し、５Ｅ６-ＣＡＲＴの陽性率は７２．６％であり、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ＣＡＲ－Ｔの陽性率は６５．４％であった。本実施例では、計６つの異なるＰＢＭＣ ｄｏｎａｒを使用してＣＡＲ陽性率を検証した。図１５Ｃは、６つの異なるＰＢＭＣ ｄｏｎａｒにおける５Ｅ６－ＣＡＲＴの陽性率が６０％程度に留まり、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ＣＡＲ－Ｔと同じであることを示している。図１５Ｄは、通常インビトロで１２日間培養した５Ｅ６－ＣＡＲＴ細胞の累積増幅倍率が約２４０倍であり、Ｓｔａｎｄａｒｄ－ＣＡＲＴの増幅倍率といくらも変わらないことを示す。

【0281】

（実施例１５ ＣＬＤＮ１８．２特異的ＣＡＲはインビトロで標的細胞を特異的に殺傷できる）
本実施例では、まずレンチウイルス感染および蛍光活性化セルソーティングを介してヒトＣＬＤＮ１８．２を安定かつ高発現するＣＨＯ－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞およびヒトＣＬＤＮ１８．１を安定かつ高発現するＣＨＯ－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞が得られた。本実施例ではさらに、細胞毒性検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ＃Ｇ１７８０）を使用し、ＬＤＨ法によりインビトロでのＣＡＲ－Ｔ細胞の特異的殺傷能力を評価し、手順は次の通りである。

【0282】

上記実施例１４で通常９日間培養したＣＡＲ－Ｔ細胞およびＭｏｃｋＴ細胞をそれぞれ遠心分離した後、ブランクＸ－ＶＩＶＯ培地に再懸濁して細胞密度を１×１０^５／ｍｌにさせる。標的細胞はＣＨＯ、ＣＨＯ－ｈＣＬＤＮ１８．２およびＣＨＯ－ｈＣＬＤＮ１８．１の３種類で、３種類の標的細胞をそれぞれ消化した後で計数し、続いてブランクＸ－ＶＩＶＯ培地に再懸濁して細胞密度を５××１０^５／ｍｌにし、その後、ウェル当たり標的細胞懸濁液１００μｌ＋ＣＡＲ－Ｔ／ＭｏｃｋＴ細胞懸濁液１００μｌの体積系を混合し、滅菌９６ウェルＶ底プレートに加えた。キットの要件に従い対照ウェルを設け、得られた混合物を３７℃のインキュベーターで２４時間共インキュベートした後、マイクロプレートリーダーで４９０ｎＭの吸光度値を記録し、キットから与えられる計算式でターゲット細胞の溶解率を計算し、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ ８でデータを分析・処理した。結果を図１６に示し、５Ｅ６－ＣＡＲＴは、インビトロでＣＬＤＮ１８．２陽性標的細胞の溶解を特異的に誘導するが、陰性およびＣＬＤＮ１８．１陽性細胞には溶解作用を持たず、Ｓｔａｎｄａｒｄ－ＣＡＲＴと同様に、５Ｅ６－ＣＡＲＴ細胞はインビトロでヒトＣＬＤＮ１８．２の高度に特異的な標的細胞殺傷活性を有することが示唆されている。

【0283】

（実施例１６ ＣＬＤＮ１８．２特異的ＣＡＲの因子分泌状況）
本実施例は、Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ，ＤＹ２８５Ｂ）およびＨｕｍａｎ ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ，ＤＹ２０２）を使用して標的細胞を殺傷させる過程中のＩＦＮ－γおよびＩＬ－２に対するＣＡＲ－Ｔの分泌量を分析した。具体的には、１ウェルあたり１×１０^４個の細胞量に基づいてＣＬＤＮ１８．２を高発現する標的細胞（ＣＨＯ－ｈＣＬＤＮ１８．２）、ＣＬＤＮ１８．１を高発現する対照細胞（ＣＨＯ－ｈＣＬＤＮ１８．１）および陰性細胞ＣＨＯを滅菌９６ウェルプレートにそれぞれ播種し、標的細胞にエフェクター細胞（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ）：標的細胞（Ｔａｒｇｅｔ）＝５：１の比率でＣＡＲ－Ｔ細胞（５Ｅ６－ＣＡＲＴおよびＰｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ＣＡＲ－Ｔ）および未修飾のＴ細胞（Ｍｏｃｋ Ｔ ｃｅｌｌ）などのエフェクター細胞を加えた。２４時間インキュベートした後、キットの説明書に従い操作し、上清を採取して酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）でＩＬ－２およびＩＦＮ－γ含有量を検出した。結果を図１７Ａおよび図１７Ｂに示す。５Ｅ６－ＣＡＲＴは、ＣＬＤＮ１８．２陽性細胞と共インキュベートした場合、より高いレベルの因子を分泌したが、陰性細胞およびＣＬＤＮ１８．１陽性細胞と共インキュベートした場合、有意な因子の分泌はなく、Ｓｔａｎｄａｒｄ－ＣＡＲＴと同じであった。したがって、５Ｅ６－ＣＡＲＴ細胞は、ＣＬＤＮ１８．２を高発現する腫瘍細胞に対して特異的なサイトカイン誘導効果を持っている。

【0284】

（実施例１７ マウス結腸癌ＣＤＸモデルにおけるＣＬＤＮ１８．２特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍作用）
本実施例は、まずヒトＣＬＤＮ１８．２遺伝子を、レンチウイルスを介してＭＣ３８細胞に導入し、次にフローサイトメメーターでヒトＣＬＤＮ１８．２を高発現するマウス結腸癌細胞、すなわちＭＣ３８－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を選別した。雌Ｂ－ＮＤＧ高度免疫マウスの皮下注射経路を介してマウス結腸癌腫瘍モデルを構築し、マウス体内におけるＣＬＤＮ１８．２特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍作用を検証した。ＭＣ３８－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を１．５×１０^６／マウスの用量で接種し、マウスに腫瘍を接種してから８日後に、腫瘍サイズ４１．６８～１２０．６ｍｍ^３（平均腫瘍サイズ８０．０１ｍｍ^３）のマウスを選択して各群８匹を３群にランダムに分け、１０日間培養したＣＡＲ－Ｔ（またはＭｏｃｋ Ｔ）細胞を尾静脈に再注入し、５Ｅ６－ＣＡＲＴ群および Ｓｔａｎｄａｒｄ－ＣＡＲＴ群のＣＡＲ－Ｔ再注入量は３×１０^６細胞／マウス、ブランク対照Ｍｏｃｋ Ｔ細胞群の再注入量は１×１０^７細胞／マウスであった。図１８Ａに示すように、マウスの腫瘍サイズおよび体重を週に３回測定し、４週間観察した。 ＣＡＲ－Ｔ（またはＭｏｃｋ Ｔ）細胞をマウスの尾静脈に再注入した後、５Ｅ６－ＣＡＲＴ群のマウスは１３日目に体重の１０％以上減少し、１５ 日目の１匹のマウスの体重の相対変化は－３４．５１％で、１３日目に１匹目のマウスは死亡した。Ｓｔａｎｄａｒｄ－ＣＡＲＴ群のマウスは、１６日目に体重の１０％以上減少し、１６日目における１匹のマウスの体重の相対変化は－３６．９３％であり、１８日目に１匹目のマウスは死亡し、マウスの体重減少が激しいため、ＰＧ－Ｄ２２に実験を終了し、図１８Ｂおよび図１８Ｃに示すように実験の終了時に明らかな抗腫瘍作用が観察されなかった。マウスを安楽死させて解剖した後、図１８Ｄに示すように、５Ｅ６－ＣＡＲＴ群およびＳｔａｎｄａｒｄ－ＣＡＲＴ群のマウスの両方に異常な胃損傷・出血現象があることが判明した。要するに、５Ｅ６－ＣＡＲＴ群のマウスは、この腫瘍モデルにおいて低い忍容性と明らかな副作用を現れ、特に体重減少、後ろ髪が逆立つ、丸まる、胃出血として現れ、Ｍｏｃｋ Ｔ群のマウスは忍容性に優れ、体重は正常であった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

2024514246000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-11-29

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＨＣＤＲ３、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ１を含み、前記ＨＣＤＲ３は、配列番号：６７で示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は、配列番号：６８または配列番号：１１で示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：２、配列番号：１０および配列番号：１６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、単離された抗原結合タンパク質。

【請求項2】

前記ＨＣＤＲ３は、配列番号：４、配列番号：１２および配列番号：１８のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は、配列番号：３または配列番号：１７で示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：２、配列番号：１０および配列番号：１６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項3】

ＶＨを含み、前記ＶＨは、配列番号：７８で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項4】

前記ＶＨは、配列番号：１、配列番号：９、配列番号：１５および配列番号：１９のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項5】

ＬＣＤＲ３、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ１を含み、前記ＬＣＤＲ３は、配列番号：６９で示されるアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２は、配列番号：７０で示されるアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１は、配列番号：７１で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項6】

前記ＬＣＤＲ３は、配列番号：８、配列番号：１４、配列番号：２３および配列番号：２５のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２は、配列番号：７または配列番号：２２で示されるアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１は、配列番号：６または配列番号：２１で示されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項7】

ＶＬを含み、前記ＶＬは、配列番号：７９で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項8】

前記ＶＬは、配列番号：５、配列番号：１３、配列番号：２０および配列番号：２４のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項9】

以下の任意の群から選択されるＶＨおよびＶＬを含む、請求項１に記載の単離された抗原結合タンパク質。
１）配列番号：１で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号：５で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ
２）配列番号：１５で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号：５で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ
３）配列番号：９で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号：１３で示されるアミノ酸配列を含む前記ＶＬ
４）配列番号：１９で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号：２０で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ、および
５）配列番号：１９で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号：２４で示されるアミノ酸配列を含む前記ＶＬ

【請求項10】

抗体重鎖定常領域を含む、請求項１に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項11】

前記抗体重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に由来する、請求項１０に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項12】

抗体軽鎖定常領域を含む、請求項１に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項13】

前記抗体軽鎖定常領域は、ヒトＩｇκ定常領域に由来する、請求項１２に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項14】

請求項１に記載の抗原結合タンパク質を含む標的部分を含む、キメラ抗原受容体。

【請求項15】

共刺激ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、標的部分と膜貫通ドメインとの間のヒンジ領域、およびシグナルペプチドを含み、
前記共刺激ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＯＸ４０、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＳＬＡＭ、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、２Ｂ４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＰＤ－１、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＪＡＭＬ、ＣＤ２４４、ＣＤ１００、ＩＣＯＳ、ＣＤ８３のリガンド、ＣＤ４０およびＭｙＤ８８からなる群から選択される１種以上のタンパク質に由来する共刺激ドメインを含み、
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃεＲＩγ、ＦｃεＲＩβ、ＦｃγＲＩＩａ、ウシ白血病ウイルスｇｐ３０、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ＬＭＰ２Ａ、サル免疫不全ウイルスＰＢｊ１４ Ｎｅｆ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＨＳＫＶ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ－１２および少なくとも１つのＩＴＡＭを含むドメインからなる群から選択される１種以上のタンパク質に由来する細胞内シグナル伝達領域を含み、
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＰＤ－１、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＣＤ５、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４、ＣＤ２４４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＣＤ２、ＮＫＧ２Ｃ、ＬＩＧＨＴ、ＤＡＰ１２、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４およびＳＬＡＭからなる群から選択される１種以上のタンパク質に由来する膜貫通ドメインを含み、
前記ヒンジ領域は、ＣＤ２８、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＣＤ８、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＤＡＰ１０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＣＤ２２６、ＳＬＡＭ、ＣＤ３０およびＬＩＧＨＴからなる群から選択される１種以上のタンパク質に由来するヒンジ領域を含む、請求項１４に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項16】

前記共刺激ドメインは、配列番号：８５で示されるアミノ酸配列を含む４－１ＢＢ由来の細胞内共刺激シグナル伝達領域であり、
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号：８６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインであり、
前記膜貫通ドメインは、配列番号：８４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤ８に由来する膜貫通ドメインであり、
前記ヒンジ領域は、配列番号：８３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤ８に由来するヒンジ領域であり、
前記シグナルペプチドは、配列番号：８８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤ８タンパク質に由来するシグナルペプチドである、
請求項１５に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項17】

低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片をさらに含む、請求項１４に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項18】

前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１～１２およびその機能的断片からなる群から選択される１種以上を含む、請求項１７に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項19】

前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはその断片は、配列番号：９１で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項20】

請求項１～１３のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質または請求項１４～１９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を含む、ポリペプチド分子。

【請求項21】

請求項１～１３のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質を含む、免疫複合体。

【請求項22】

請求項１～１３のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項１４～１９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体または請求項２０に記載のポリペプチド分子をコードする、単離された１種以上の核酸分子。

【請求項23】

請求項１～１３のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項１４～１９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項２０に記載のポリペプチド分子または請求項２２に記載の核酸分子を含む、細胞。

【請求項24】

請求項１～１３のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項１４～１９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項２０に記載のポリペプチド分子、請求項２１に記載の免疫複合体、請求項２２に記載の核酸分子および／または請求項２３に記載の細胞、および任意に薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

【請求項25】

疾患および／または障害を予防、緩和および／または治療するために用いられる、請求項２４に記載の医薬組成物、
ここで、前記疾患および／または障害には、癌が含まれる。

【請求項26】

前記癌には、胃癌および／または結腸癌が含まれる、請求項２５に記載の医薬組成物。

【国際調査報告】