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特表2024-514253ヒトエンドセリン受容体に特異的に結合できる抗体及び糖尿病性腎症及び慢性腎疾患の治療におけるその応用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-29

(54)【発明の名称】ヒトエンドセリン受容体に特異的に結合できる抗体及び糖尿病性腎症及び慢性腎疾患の治療におけるその応用

(51)【国際特許分類】

C12N 15/13 20060101AFI20240322BHJP

C12N 15/63 20060101ALI20240322BHJP

C07K 16/28 20060101ALI20240322BHJP

C12P 21/08 20060101ALI20240322BHJP

C12N 1/15 20060101ALI20240322BHJP

C12N 1/19 20060101ALI20240322BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20240322BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20240322BHJP

A61K 39/395 20060101ALI20240322BHJP

A61P 13/12 20060101ALI20240322BHJP

A61K 35/76 20150101ALI20240322BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20240322BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C12N15/63 Z ZNA

C07K16/28

C12P21/08

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K39/395 N

A61K39/395 D

A61P13/12

A61K35/76

A61P43/00 121

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023560989

(86)(22)【出願日】2022-03-30

(85)【翻訳文提出日】2023-11-27

(86)【国際出願番号】 CN2022084164

(87)【国際公開番号】W WO2022206857

(87)【国際公開日】2022-10-06

(31)【優先権主張番号】202110353110.6

(32)【優先日】2021-03-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523373865

【氏名又は名称】ジーマックスバイオファームエルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田慎介

(74)【代理人】

【識別番号】100119183

【弁理士】

【氏名又は名称】松任谷優子

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田裕

(74)【代理人】

【識別番号】100162503

【弁理士】

【氏名又は名称】今野智介

(74)【代理人】

【識別番号】100144794

【弁理士】

【氏名又は名称】大木信人

(74)【代理人】

【識別番号】100204582

【弁理士】

【氏名又は名称】大栗由美

(72)【発明者】

【氏名】ザン，チェン

(72)【発明者】

【氏名】ジン，シュキアン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG26

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA88X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085CC01

4C085DD62

4C085EE03

4C087AA01

4C087BC83

4C087MA02

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA81

4C087ZC75

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本明細書は、ＥＴ_AＲ抗体及びその薬物組成物を提供し、本明細書は、糖尿病性腎症の一つ又は複数の症状及び慢性腎疾患の一つ又は複数の症状を治療、予防又は改善するためのその方法をさらに提供した。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＥＴ_AＲに特異的に結合できる抗体であって、１、２、３、４、５、又は６個のアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列は、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８、及びＳＥＱＩＤＮＯ：３０、
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８、ＳＥＱＩＤＮＯ：４０、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４、ＳＥＱＩＤＮＯ：４６、及びＳＥＱＩＤＮＯ：４８、
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：５０、ＳＥＱＩＤＮＯ：５２、ＳＥＱＩＤＮＯ：５４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５６、ＳＥＱＩＤＮＯ：５８、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２、ＳＥＱＩＤＮＯ：６４、ＳＥＱＩＤＮＯ：６６、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６８、
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７０、ＳＥＱＩＤＮＯ：７２、ＳＥＱＩＤＮＯ：７４、ＳＥＱＩＤＮＯ：７６、ＳＥＱＩＤＮＯ：７８、ＳＥＱＩＤＮＯ：８０、ＳＥＱＩＤＮＯ：８２、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：８６、ＳＥＱＩＤＮＯ：８８、及びＳＥＱＩＤＮＯ：９０、
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：９２、ＳＥＱＩＤＮＯ：９４、ＳＥＱＩＤＮＯ：９６、ＳＥＱＩＤＮＯ：９８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１００、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１２、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１１４、及び
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３４、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１３６から独立して選択される、ことを特徴とするＥＴ_AＲに特異的に結合できる抗体。

【請求項2】

前記抗体は、一つ又は二つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列は、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８、及びＳＥＱＩＤＮＯ：３０、及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７０、ＳＥＱＩＤＮＯ：７２、ＳＥＱＩＤＮＯ：７４、ＳＥＱＩＤＮＯ：７６、ＳＥＱＩＤＮＯ：７８、ＳＥＱＩＤＮＯ：８０、ＳＥＱＩＤＮＯ：８２、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：８６、ＳＥＱＩＤＮＯ：８８、及びＳＥＱＩＤＮＯ：９０から独立して選択される、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴ_AＲに特異的に結合できる抗体。

【請求項3】

前記抗体は、一つ又は二つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列は、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８、ＳＥＱＩＤＮＯ：４０、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４、ＳＥＱＩＤＮＯ：４６、及びＳＥＱＩＤＮＯ：４８、及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：９２、ＳＥＱＩＤＮＯ：９４、ＳＥＱＩＤＮＯ：９６、ＳＥＱＩＤＮＯ：９８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１００、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１２、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１１４から独立して選択される、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴ_AＲに特異的に結合できる抗体。

【請求項4】

前記抗体は、一つ又は二つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列は、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：５０、ＳＥＱＩＤＮＯ：５２、ＳＥＱＩＤＮＯ：５４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５６、ＳＥＱＩＤＮＯ：５８、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２、ＳＥＱＩＤＮＯ：６４、ＳＥＱＩＤＮＯ：６６、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６８、及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３４、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１３６から独立して選択される、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴ_AＲに特異的に結合できる抗体。

【請求項5】

前記抗体は、一つ又は二つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列は、以下に列挙されるアミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４、ＳＥＱＩＤＮＯ：４６、ＳＥＱＩＤＮＯ：４８、ＳＥＱＩＤＮＯ：５０、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２、ＳＥＱＩＤＮＯ：６４、ＳＥＱＩＤＮＯ：６６、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６８から独立して選択される、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴ_AＲに特異的に結合できる抗体。

【請求項6】

前記抗体は、一つ又は二つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列は、以下に列挙されるアミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７０、ＳＥＱＩＤＮＯ：８２、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：８６、ＳＥＱＩＤＮＯ：８８、ＳＥＱＩＤＮＯ：９０、ＳＥＱＩＤＮＯ：９２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３４、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１３６から独立して選択される、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴ_AＲに特異的に結合できる抗体。

【請求項7】

前記抗体は、以下に列挙される：ＳＥＱＩＤＮＯ：５０とＳＥＱＩＤＮＯ：１１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２とＳＥＱＩＤＮＯ：１２８、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２とＳＥＱＩＤＮＯ：１３０、ＳＥＱＩＤＮＯ：６４とＳＥＱＩＤＮＯ：１３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：６６とＳＥＱＩＤＮＯ：１３４、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６８とＳＥＱＩＤＮＯ：１３６から独立して選択される一つの軽鎖と重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の組み合わせを含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴ_AＲに特異的に結合できる抗体。

【請求項8】

前記抗体は、一つ又は二つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列は、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖可変ドメインアミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１３８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６２、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１６４、及び
ｂ．重鎖可変ドメインアミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１６６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９０、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１９２から独立して選択される、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴ_AＲに特異的に結合できる抗体。

【請求項9】

前記抗体のポリヌクレオチドコード配列は、一つ又は二つのポリヌクレオチド配列を含み、ここで、各ポリヌクレオチド配列は、以下に列挙されるポリヌクレオチド配列：
ａ．軽鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１３７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３９、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４５、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４９、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５５、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５９、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６１、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１６３、及び
ｂ．重鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１６５、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６９、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７５、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７９、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８５、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８９、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１９１から独立して選択される、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴ_AＲに特異的に結合できる抗体。

【請求項10】

前記抗体は、以下に列挙される：ＳＥＱＩＤＮＯ：１３８とＳＥＱＩＤＮＯ：１６６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４０とＳＥＱＩＤＮＯ：１６８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４２とＳＥＱＩＤＮＯ：１７０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４４とＳＥＱＩＤＮＯ：１７２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４６とＳＥＱＩＤＮＯ：１７４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４８とＳＥＱＩＤＮＯ：１７６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５０とＳＥＱＩＤＮＯ：１７８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５２とＳＥＱＩＤＮＯ：１８０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５４とＳＥＱＩＤＮＯ：１８２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５６とＳＥＱＩＤＮＯ：１８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５８とＳＥＱＩＤＮＯ：１８６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６０とＳＥＱＩＤＮＯ：１８８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６２とＳＥＱＩＤＮＯ：１９０、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１６４とＳＥＱＩＤＮＯ：１９２から独立して選択される一つのアミノ酸配列組み合わせを含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴ_AＲに特異的に結合できる抗体。

【請求項11】

前記抗体は、以下に列挙される：ＳＥＱＩＤＮＯ：１３８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６２、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１６４から独立して選択される一つのアミノ酸配列を含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴ_AＲに特異的に結合できる抗体。

【請求項12】

前記抗体は、以下に列挙される：ＳＥＱＩＤＮＯ：１６６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９０、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１９２から独立して選択される一つのアミノ酸配列を含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴ_AＲに特異的に結合できる抗体。

【請求項13】

前記抗体は、以下に列挙される：ＳＥＱＩＤＮＯ：１３８とＳＥＱＩＤＮＯ：１６６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５０とＳＥＱＩＤＮＯ：１７８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５２とＳＥＱＩＤＮＯ：１８０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５４とＳＥＱＩＤＮＯ：１８２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５６とＳＥＱＩＤＮＯ：１８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５８とＳＥＱＩＤＮＯ：１８６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６０とＳＥＱＩＤＮＯ：１８８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６２とＳＥＱＩＤＮＯ：１９０、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１６４とＳＥＱＩＤＮＯ：１９２から独立して選択される一つの軽鎖及び重鎖可変領域アミノ酸配列の組み合わせを含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴ_AＲに特異的に結合できる抗体。

【請求項14】

前記抗体は、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１３８又はＳＥＱＩＤＮＯ：１６６を含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴ_AＲに特異的に結合できる抗体。

【請求項15】

前記抗体は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３８及びＳＥＱＩＤＮＯ：１６６アミノ酸配列の組み合わせを含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴ_AＲ受容体に特異的に結合できる抗体。

【請求項16】

前記抗体は、一つ又は二つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列は、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖定常領域アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１９４及びＳＥＱＩＤＮＯ：１９６、及び
ｂ．重鎖定常領域アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１９８から独立して選択される、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴ_AＲに特異的に結合できる抗体。

【請求項17】

前記抗体は、マウス抗体又はヒト化抗体を含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴ_AＲに特異的に結合できる抗体。

【請求項18】

前記抗体は、モノクローナル抗体を含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴ_AＲに特異的に結合できる抗体。

【請求項19】

前記抗体は、一つのモノクローナル抗体を含み、該モノクローナル抗体は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３８とＳＥＱＩＤＮＯ：１６６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５０とＳＥＱＩＤＮＯ：１７８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５２とＳＥＱＩＤＮＯ：１８０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５４とＳＥＱＩＤＮＯ：１８２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５６とＳＥＱＩＤＮＯ：１８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５８とＳＥＱＩＤＮＯ：１８６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６０とＳＥＱＩＤＮＯ：１８８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６２とＳＥＱＩＤＮＯ：１９０、又はＳＥＱＩＤＮＯ：１６４とＳＥＱＩＤＮＯ：１９２を含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴ_AＲに特異的に結合できる抗体。

【請求項20】

ヒトエンドセリンシグナル伝達を低下させる前記抗体のＩＣ₅₀値は、約１ｎＭ～２００ｎＭ又は１０ｎＭ～１００ｎＭである、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴ_AＲに特異的に結合できる抗体。

【請求項21】

医薬的に許容されるベクターと混合する、請求項１に記載のＥＴ_AＲに特異的に結合できる抗体を含む、医薬組成物。

【請求項22】

請求項１に記載のＥＴ_AＲに特異的に結合できる抗体をコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項23】

請求項２２に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。

【請求項24】

請求項２３に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項25】

ＥＴ_AＲに特異的に結合できる抗体を生産する方法であって、前記抗体の発現が許容される条件下で請求項２４に記載の宿主細胞を培養することを含む、ことを特徴とする方法。

【請求項26】

被験体における糖尿病性腎症の一つ又は複数の症状を治療、予防又は改善するための方法であって、治療有効量の請求項２１に記載の医薬組成物を被験体に投与することを含む、方法。

【請求項27】

被験体における慢性腎疾患の一つ又は複数の症状を治療、予防又は改善するための方法であって、治療有効量の請求項２１に記載の医薬組成物を被験体に投与することを含む、方法。

【請求項28】

被験体におけるタンパク尿を伴う疾患の一つ又は複数の症状を治療、予防又は改善するための方法であって、治療有効量の請求項２１に記載の医薬組成物を被験体に投与することを含む、方法。

【請求項29】

被験体における糸球体濾過率の低下を伴う疾患の一つ又は複数の症状を治療、予防又は改善するための方法であって、治療有効量の請求項２１に記載の医薬組成物を被験体に投与することを含む、方法。

【請求項30】

前記被験体はヒトである、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書は、ＥＴ_AＲ抗体及びその薬物組成物を提供した。本明細書は、糖尿病性腎症の一つ又は複数の症状及び慢性腎疾患の一つ又は複数の症状を治療、予防又は改善するためのその方法をさらに提供した。

【背景技術】

【0002】

エンドセリンは、２１個のアミノ酸からなるポリペプチドであり、分子量が２，４００Ｄａであり、Ｎ末端においては、二つのジスルフィド結合を介して１～１５、３～１１位置のシステインが連結され、Ｃ末端には、いくつかの疎水性アミノ酸の残基がある。Ｎ末端の構造は、それと受容体との親和力を決定し、Ｃ末端の構造は、それと受容体との結合位置を決定する。エンドセリン（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ、ＥＴ）には、三つのサブタイプ、即ちＥＴ－１、ＥＴ－２、及びＥＴ－３がある。エンドセリン受容体（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、ＥＴＲ）は、ＥＴ_AＲ及びＥＴ_BＲの二種類があり、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＧＰＣＲ）に属する。ＥＴ及びその受容体は、心臓血管系、肺、腎臓系、脳、神経組織などを含む人体組織及び器官に広く分布している。腎髄質は、生体において最も高いＥＴ－１レベルを有する（Ｋｉｔａｍｕｒａら，１９８９，ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ１６１：３４８－３５２）。腎臓は、他の器官に比べてＥＴ－１により高い感受性を示している（Ｓｐｅｅｄ及びＰｏｌｌｏｃｋ、２０１３、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ６１：１１４２－１１４５）。ＥＴ及びその受容体は、肥満、高血圧及び糖尿病などによる腎障害に関与する可能性があり、通常、ＥＴ_AＲにより媒介される。

【0003】

世界経済の成長と生活水準の向上に伴い、糖尿病は、発症率と流行率が徐々に高くなり、それにより公衆衛生上の大きな問題となっている。糖尿病性腎症は、糖尿病の最も重要な合併症の一つであり、１５～２５％のＩ型糖尿病患者及び３０～４０％のＩＩ型糖尿病患者に影響を与える（Ｓｃｈｅｒｎｔｈａｎｅｒ及びＳｃｈｅｒｎｔｈａｎｅｒ、２０１３，ＪＮｅｐｈｒｏｌ２６：９７５－９８５）。

【発明の概要】

【0004】

【0005】

本明細書は、ＥＴ_AＲ抗体を提供し、その抗体は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列は、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８、及びＳＥＱＩＤＮＯ：３０、
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８、ＳＥＱＩＤＮＯ：４０、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４、ＳＥＱＩＤＮＯ：４６、及びＳＥＱＩＤＮＯ：４８、
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：５０、ＳＥＱＩＤＮＯ：５２、ＳＥＱＩＤＮＯ：５４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５６、ＳＥＱＩＤＮＯ：５８、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２、ＳＥＱＩＤＮＯ：６４、ＳＥＱＩＤＮＯ：６６、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６８、
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７０、ＳＥＱＩＤＮＯ：７２、ＳＥＱＩＤＮＯ：７４、ＳＥＱＩＤＮＯ：７６、ＳＥＱＩＤＮＯ：７８、ＳＥＱＩＤＮＯ：８０、ＳＥＱＩＤＮＯ：８２、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：８６、ＳＥＱＩＤＮＯ：８８、及びＳＥＱＩＤＮＯ：９０、
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：９２、ＳＥＱＩＤＮＯ：９４、ＳＥＱＩＤＮＯ：９６、ＳＥＱＩＤＮＯ：９８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１００、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１２、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１１４、及び
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３４、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１３６から独立して選択される。

【0006】

一実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：８と、
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３２と、
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：５０と、
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７０と、
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：９２と、
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１１６とを含む。

【0007】

一実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１０と、
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３４と、
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：５２と、
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７２と、
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：９４と、
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１１８とを含む。

【0008】

一実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１２と、
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３６と、
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：５４と、
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７４と、
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：９６と、
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１２０とを含む。

【0009】

一実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１４と、
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３８と、
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：５６と、
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７６と、
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：９８と、
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１２２とを含む。

【0010】

一実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１６と、
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４０と、
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：５８と、
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７８と、
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１００と、
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１２４とを含む。

【0011】

一実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１８と、
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４２と、
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：６０と、
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：８０と、
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１０２と、
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１２６とを含む。

【0012】

一実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２０と、
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４４と、
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：６２と、
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：８２と、
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１０４と、
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１２８とを含む。

【0013】

一実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２２と、
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４４と、
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：６２と、
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：８２と、
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１０６と、
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１２８とを含む。

【0014】

一実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２４と、
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４４と、
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：６２と、
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：８４と、
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１０８と、
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０とを含む。

【0015】

一実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２６と、
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４６と、
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：６４と、
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：８６と、
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１１０と、
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１３２とを含む。

【0016】

一実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２８と、
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４６と、
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：６６と、
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：８８と、
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１１２と、
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１３４とを含む。

【0017】

別の実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３０と、
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４８と、
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：６８と、
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：９０と、
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１１４と、
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１３６とを含む。

【0018】

本明細書は、薬物組成物をさらに提供し、それは本明細書によるＥＴ_AＲ抗体と、一つ又は複数の薬学的に許容されるベクターとの組み合わせを含む。

【0019】

本明細書は、糖尿病性腎症の一つ又は複数の症状を治療、予防又は改善する方法を提供し、それは、治療有効量の本明細書による医薬組成物を被験体に投与することを含む。

【0020】

本明細書は、慢性腎疾患の一つ又は複数の症状を治療、予防又は改善する方法を提供し、それは、治療有効量の本明細書による医薬組成物を被験体に投与することを含む。

【0021】

本明細書は、タンパク尿を伴う疾患の一つ又は複数の症状を治療、予防又は改善する方法を提供し、それは、治療有効量の本明細書による医薬組成物を被験体に投与することを含む。

【0022】

本明細書は、糸球体濾過率の低下を伴う疾患の一つ又は複数の症状を治療、予防又は改善する方法を提供し、それは、治療有効量の本明細書による医薬組成物を被験体に投与することを含む。

【0023】

本明細書は、糖尿病性腎症、慢性腎疾患、タンパク尿又は糸球体濾過率の低下を伴う疾患を治療するためのキットを提供し、それは本明細書による医薬組成物を含む。

【0024】

本明細書は、糖尿病性腎症、慢性腎疾患、タンパク尿又は糸球体濾過率の低下を伴う疾患を治療するための薬物の製造における医薬組成物の用途を提供した。本明細書は、単離された核酸を提供し、それは、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体のポリヌクレオチドコード配列を含む。

【0025】

本明細書は、本明細書による核酸を含む組換え発現ベクターを提供した。

【0026】

本明細書は、本明細書によるベクターを含む宿主細胞を提供した。

【0027】

本明細書は、ＥＴ_AＲ抗体を生産する方法を提供し、それは、本明細書による抗体の発現が許容される条件下で本明細書による宿主細胞を培養することを含む。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】：様々なハイブリドーマ細胞上清とＣＨＯ－ＤＨＦＲ－ＥＴ_AＲ（図中ＣＨＯ－ＥＴ_AＲと標識される）細胞との結合をＥＬＩＳＡ実験によりスクリーニングする結果を示した図である。ここで、１５Ｆ３ハイブリドーマ細胞からＥＴ_AＲ抗体Ａ－１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３８とＳＥＱＩＤＮＯ：１６６とを含む）にクローニングした。

【図2】：組換え発現されたＥＴ_AＲ抗体（Ａ－１、Ａ－２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４０とＳＥＱＩＤＮＯ：１６８とを含む）、Ａ－７（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５０とＳＥＱＩＤＮＯ：１７８とを含む）、及びＡ－１２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６０とＳＥＱＩＤＮＯ：１８８とを含む））とヒトＥＴ_AＲとの特異的結合をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により検出する結果を示した図であるここで、灰色ピーク及び点線ピークは陰性対照であり、点線ピークは、ＥＴ_AＲ抗体とＣＨＯ－ＤＨＦＲ－との結合曲線を示し、実線ピークは、ＥＴ_AＲ抗体とＣＨＯ－ＤＨＦＲ－ＥＴ_AＲとの結合曲線を示す。

【図3】：異なるハイブリドーマ細胞上清による細胞内ヒトＥＴ_AＲ媒介性Ｃａ²⁺変化への抑制をカルシウムフラックス実験によりスクリーニングする結果を示した図である。

【図4】：組換え発現されたＥＴ_AＲ抗体とヒトＥＴ_AＲとの濃度抑制勾配曲線（ＩＣ₅₀ ＝３８ｎＭ、Ｒ² ＝０．９７）（Ａ－１）、（ＩＣ₅₀ ＝８８ｎＭ、Ｒ² ＝０．９７）（Ａ－９（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５４とＳＥＱＩＤＮＯ：１８２とを含む））をカルシウムフラックス実験により検出することを示した図である。

【図5】：抗体Ａ－１とウサギＥＴ_AＲ、ゴールデンハムスターＥＴ_AＲ及びラットＥＴ_AＲとの濃度抑制勾配曲線をカルシウムフラックス実験により検出することを示した図である。

【図6】：抗体Ａ－１のウサギ急性腎障害モデル薬効実験における動物の尿素窒素（ＢＵＮ）変化曲線を示した図である。

【図7】：抗体Ａ－１のウサギ急性腎障害モデル薬効実験における動物の血中クレアチニン（ｓＣｒ）変化曲線を示した図である。

【図8】：抗体Ａ－１のウサギ急性腎障害モデル薬効実験における動物の２４時間尿中アルブミン（Ｕ－Ａｌｂ）排泄量を示した図である。

【図9】：抗体Ａ－１のゴールデンハムスター糖尿病性腎症モデル薬効実験における動物の２４時間総尿中タンパク質（Ｕ－ＴＰ）排泄量を示した図である。

【図10】：抗体Ａ－１のゴールデンハムスター糖尿病性腎症モデル薬効実験における動物の２４時間尿中アルブミン（Ｕ－Ａｌｂ）排泄量を示した図である。

【図11】：抗体Ａ－１のゴールデンハムスター糖尿病性腎症モデル薬効実験における動物の２４時間尿量を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0029】

定義
本明細書において特に定義しない限り、本明細書に関連する科学用語及び技術用語は、当業者に理解されている意味を有する。通常、本明細書に記載の薬物学、生物学、生化学、細胞及び組織培養学、生物学、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学及びタンパク質核酸化学及びハイブリダイゼーションに関連する命名法及び技術は、当分野において周知であり、よく使用されているものである。

【0030】

本明細書は、標準的な１文字又は３文字の略語を使用して、ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示す。特に明記しない限り、ポリペプチド配列は、アミノ末端が左にあるがそれらのカルボキシ末端が右にあり、一本鎖核酸配列及び二本鎖核酸配列の上流鎖の５’末端が左にあるがそれらの３’末端が右にある。ポリペプチドの具体的な部分は、アミ
ノ酸残基番号、例えば、アミノ酸８０～１３０で表されてもよいし、又は該部位の実際の残基、例えば、Ｌｙｓ８０～Ｌｙｓ１３０で表されてもよい。具体的なポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、それらと参照配列との差異を解釈することによって記述され得る。

【0031】

「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語はいずれも、ペプチド結合を介して互いに連結される二つ又は複数のアミノ酸を含む分子を指す。これらの用語は、例えば、天然及び人工タンパク質、タンパク質断片及びタンパク質配列のポリペプチド類似体（例えば、突然変異タンパク質、変異体及び融合タンパク質）及び転写されたか又はそうでなければ共有もしくは非共有的に修飾されたタンパク質を包含する。ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、モノマー又は多量体であってもよい。

【0032】

「ポリペプチド断片」という用語は、対応する完全長タンパク質に比べて、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端が欠失しているポリペプチドを指す。断片長さは、例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、５０、７０、８０、９０、１００、１５０又は２００個のアミノ酸であってもよい。断片長さは、例えば、最大１０００、７５０、５００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１４、１３、１２、１１又は１０個のアミノ酸である。断片は、その片端又は両端に、一つ又は複数の追加のアミノ酸、例えば、様々な天然タンパク質からのアミノ酸配列（例えば、Ｆｃ又はロイシンジッパードメイン）又は人工アミノ酸配列（例えば、人工リンカー配列）がさらに含まれてもよい。

【0033】

本明細書のポリペプチドは、任意の原因及び任意の方法で修飾されたポリペプチドを含み、例えば、それにより、（１）タンパク質の加水分解感受性を低下させ、（２）酸化感受性を低下させ、（３）形成されたタンパク質複合体の親和性を変化させ、（４）結合親和性を変化させ、（４）他の物理化学的又は機能的性質を付与又は修飾する。類似体は、ポリペプチドの突然変異タンパク質を含む。例えば、天然配列（例えば、分子内接触が形成されるドメイン以外のポリペプチド部分）において、単一又は複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を行ってもよい。「保存的アミノ酸置換」は、親配列構造の特性を著しく変化させないものである（例えば、置換アミノ酸は、親配列に現れる螺旋を破壊するか又は親配列特性を付与するかもしくはその機能に必須である他の二次構造タイプを妨害してはいけない）。

【0034】

ポリペプチドの「変異体」は、別のポリペプチド配列に比べて、アミノ酸配列において、一つ又は複数のアミノ酸残基が挿入され、欠失しており、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含む。本明細書の変異体は融合タンパク質を含む。

【0035】

ポリペプチドの「誘導体」は、例えば、他の化学的部分、例えば、ポリエチレングリコール、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）との結合、リン酸化及びグリコシル化によって、化学的に修飾されたポリペプチドである。

【0036】

別段の説明がない限り、「抗体」という用語は、二つの完全長重鎖と二つの完全長軽鎖とを含む抗体以外のその誘導体、変異体、断片及び突然変異タンパク質を含み、その例は以下を参照されたい。

【0037】

「抗体」という用語は、抗原に結合する部分を含むものであり、任意選択的に、抗原結合部分が該抗体と該抗原との結合を促進する配座足場又はフレームワーク部分を用いることを可能にするタンパク質である。抗体の例としては、完全抗体、抗体断片（例えば、抗体の抗原結合部分）、抗体誘導体、及び抗体類似体が挙げられる。該抗体は、例えば、選択可能なタンパク質足場又は移植されたＣＤＲｓもしくはＣＤＲｓ誘導体を有する人工足場を含んでもよい。該足場は、例えば、該抗体を安定化するために導入された三次元構造を含む抗体由来足場と、例えば、生体適合性多量体を含む全合成足場とを含むが、それらに限らない。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒら，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ＦｕｎｃｔｉｏｎａｎｄＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ５３：１２１－１２９、Ｒｏｑｕｅら，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９－６５４を参照されたい。なお、模倣ペプチド抗体（「ＰＡＭｓ」）及び模倣抗体に基づく足場を用いてもよく、それは、足場と同様に、フィブロネクチンを利用する。

【0038】

抗体は、例えば、天然免疫グロブリンの構造を有してもよい。「免疫グロブリン」は四量体分子である。天然の免疫グロブリンにおいて、各四量体は、二つの同じポリペプチド鎖ペアで構成され、各ペアは、一つの「軽」（約２５ｋＤａ）及び一つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端は、約１００～１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変ドメインを含み、主に抗原認識に関連する。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター作用に関連する定常領域を確定した。ヒトの軽鎖は、κ及びλ軽鎖に分けられる。重鎖は、μ、δ、α又はεに分けられ、抗原のアイソタイプを確定し、例えば、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥである。軽鎖及び重鎖において、可変及び定常領域は、約１２又はそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域を介して連結され、重鎖は、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＣｈ．７（Ｐａｕｌ編集，第２版，ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ，１９８９）（その内容は、あらゆる目的のために全体として参照により本明細書に組込まれる）を参照されたい。各軽／重鎖ペアの可変領域には抗体結合部位が形成され、このように一つの完全な免疫グロブリンは二つの結合部位を有する。

【0039】

天然免疫グロブリン鎖は、三つの超可変領域を介して連結される、相対的に保存的な骨格領域（ＦＲ）である同じ基本構造を示しており、相補的決定領域又はＣＤＲｓとも呼ばれる。Ｎ末端からＣ末端へ、軽及び重鎖は、いずれもドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。各ドメインアミノ酸の分配は、ＫａｂａｔらのＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＵＳＤｅｐｔ．ｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．９１－３２４２，１９９１における定義と一致する。

【0040】

特に明記しない限り、「抗体」は、完全な免疫グロブリン、又は特異的結合について完全抗体と競合できる抗原結合部分を指す。組換えＤＮＡ技術、又は完全抗体の酵素的もしくは化学的開裂によって抗原結合部分を生産することができる。抗原結合部分は、特に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）と、相補的決定領
域（ＣＤＲｓ）を含む断片と、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）と、キメラ抗体と、二本鎖抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）と、三本鎖抗体（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）と、四本鎖抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）と、ポリペプチドに特異的抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドとを含む。

【0041】

Ｆａｂ断片は、Ｖ_L、Ｖ_H、Ｃ_L及びＣ_H1ドメインを有する一価断片であり、Ｆ（ａｂ’）₂断片は、ヒンジ領域においてジスルフィド結合を介して連結される二つのＦａｂ断
片を有する二価断片であり、Ｆｄ断片は、Ｖ_H又はＶ_Lドメインを有し、ｄＡｂ断片は、Ｖ_Hドメイン、Ｖ_Lドメイン、又はＶ_HもしくはＶ_Lドメインの抗原結合断片を有する（米国特許第６８４６６３４、６６９６２４５号、米国特許出願公開番号０５／０２０２５１２、０４／０２０２９９５、０４／００３８２９１、０４／０００９５０７、０３／００３９９５８，Ｗａｒｄら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４－５４６．）。

【0042】

一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、それにおけるＶ_L及びＶ_H領域がリンカー（例えば、合成されたアミノ酸残基配列）を介して連結されて、連続したタンパク質を形成する抗体であり、ここで、該リンカーは、該タンパク質鎖が自身に折り返されて、一価抗原結合部位を形成することを可能にするのに十分な長さである（例えば、Ｂｉｒｄら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－２６及びＨｕｓｔｏｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９－８３を参照されたい）。二本鎖抗体は、二つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であり、ここで、各ポリペプチド鎖は、リンカーを介して連結されるＶ_H及びＶ_Lドメインを含み、該リンカーは、二つのドメインの同じ鎖でのペアリングを許容しないほど短いため、各ドメインと別のポリペプチド鎖における互補的ドメインとのペアリングを許容する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４－４８、及びＰｏｌｊａｋら，１９９４，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２：１１２１－２３を参照されたい）。二本鎖抗体の二つのポリペプチド鎖が同じであれば、それらのペアリングにより得られた二本鎖抗体は、同じ抗原結合部位を有する。異なる配列を有するポリペプチド鎖は、異なる抗原結合部位を有する二本鎖抗体を製造することに用いられてもよい。同様に、三本鎖抗体及び四本鎖抗体はそれぞれ、三つ及び四つのポリペプチド鎖を含む抗体であり、かつそれぞれ三つ及び四つの抗原結合部位が形成され、それらは同じであっても異なっていてもよい。

【0043】

Ｋａｂａｔらにより、ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＵＳＤｅｐｔ．ｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．９１－３２４２、１９９１において記述されている方法を用いて、所定の抗体の相補的決定領域（ＣＤＲｓ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を同定することができる。一つ又は複数のＣＤＲｓを、分子に共有又は非共有的に組込むことにより、抗体にしてもよい。抗体は、大きなポリペプチド鎖によってＣＤＲ（ｓ）に組込まれ得る。ＣＤＲ（ｓ）を別のペプチド鎖に共有的に連結してもよく、又はＣＤＲ（ｓ）を非共有的に組込まれてもよい。ＣＤＲｓは、抗体と具体的な関連抗原との特異的結合を可能にする。

【0044】

抗体は、一つ又は複数の結合部位を有してもよい。二つ以上の結合部位が存在する場合、該結合部位は、他方と同じであっても異なっていてもよい。例えば、天然ヒト免疫グロブリンは、通常、二つの同じ結合部位を有するが、「二重特異性」又は「二官能性」抗体は、二つの異なる結合部位を有する。

【0045】

「マウス抗体」という用語は、マウス免疫グロブリン配列に由来する一つ又は複数の可変領域及び定常領域を有する全ての抗体を含む。

【0046】

「ヒト化抗体」という用語は、マウス抗体分子の相補的決定領域配列をヒト抗体可変領域フレームワークに移植して製造された抗体である。

【0047】

「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」又は「抗原結合部位」という用語は、抗原と相互作用するアミノ酸残基（又は他の部分）を含み、抗原に対する抗体の特異性及び親和力に役立つ抗体の部分である。その抗原に特異的に結合する抗体にとっては、これは、少なくとも一部の少なくとも一つのＣＤＲドメインを含む。

【0048】

「エピトープ」という用語は、抗体に（例えば、抗体により）結合する分子部分である。エピトープは、分子の不連続部分を含んでもよい（例えば、ポリペプチドにおいて、ポリペプチドの一次配列中の不連続なアミノ酸残基が、該ポリペプチドの三次及び四次構造において一つの抗体と結合するほど十分に近接している）。

【0049】

二つのポリヌクレオチド又は二つのポリペプチド配列の「同一性パーセント」は、ＧＡＰコンピュータプログラム（ＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅ、ｖｅｒｓｉｏｎ１０．３（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）の一部）を用いて、そのデフォルトパラメータ比較配列によって測定された。

【0050】

「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、全体を通して同義的に使用され得、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）と、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）と、ヌクレオチド類似体（例えば、ペプチド核酸及び非天然ヌクレオチド類似体）を用いて生成されたＤＮＡ又はＲＮＡ類似体及びそのハイブリドソームとを含む。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であってもよい。一実施形態において、本明細書の核酸分子は、コード本明細書による抗体又はその断片、誘導体、突然変異タンパク質又は変異体をコードする、連続したオープンリーディングフレームを含む。

【0051】

それらの配列が逆方向に平行に配列され得る場合、二つの一本鎖ポリヌクレオチドは互いに「互補的」であり、このように一つのポリヌクレオチドにおける各ヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドにおける互補的ヌクレオチドと逆であり、隙間を導入せず、且つ各配列の５’又は３’末端にはペアリングされていないヌクレオチドがない。二つのポリヌ
クレオチドが中程度にストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることができる場合、一つのポリヌクレオチドは別のポリヌクレオチドと「互補的」である。そのため、一つのポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドと互補的であってもよいが、その互補的配列ではない。

【0052】

「ベクター」という用語は、それに連結される別の核酸を細胞に導入することに用いられ得る核酸である。ベクターの一つのタイプは、「プラスミド」であり、追加の核酸セグメントに連結され得る線状又は環状の二本鎖ＤＮＡ分子を指す。ベクターの別のタイプは、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノウイルス随伴ウイルス）であり、ここで、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに導入することができる。いくつかのベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製可能である（例えば、細菌複製始点を含む細菌ベクター及び遊離型哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非遊離型哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入される場合、宿主細胞のゲノムに組込まれ、そのため宿主ゲノムと共に複製される。「発現ベクター」は、選択されたポリヌクレオチドの発現を誘導できるベクタータイプである。

【0053】

調節配列がヌクレオチド配列の発現（例えば、発現レベル、時間又は部位）に影響を与える場合、ヌクレオチド配列は調節配列に「作動可能に連結される」。「調節配列」は、それに作動可能に連結される核酸の発現（例えば、発現レベル、時間又は部位）に影響を与えることができる核酸である。調節遺伝子は、例えば、調節される核酸に直接作用を発揮するか又は一つ又は複数の他の分子（例えば、調節配列及び／又は核酸に結合するポリヌクレオチド）を介して作用する。調節配列の例としては、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメント（例えば、アデニル化シグナル）が挙げられる。調節配列の更なる例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９０，ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ１８５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡａｎｄＢａｒｏｎら，１９９５，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３：３６０５－０６に記述されている。

【0054】

「宿主細胞」という用語は、核酸、例えば、本明細書による核酸を発現するための細胞である。宿主細胞は、原核生物、例えば、大腸菌であってもよく、又は真核生物、例えば、単細胞真核生物（例えば、酵母又は他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコ又はトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞又は昆虫細胞）もしくはハイブリドーマであってもよい。通常、宿主細胞は、ポリペプチドコード核酸で形質転換又はトランスフェクトする可能な培養細胞であり、宿主細胞に接着して発現することができる。「組換え宿主細胞」という語句は、発現が期待される核酸で形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を表現することに用いられてもよい。宿主細胞は、該核酸を含むが所望のレベルで発現しない細胞であってもよく、調節配列が該宿主細胞に導入されていない限り、核酸に作動可能に連結されている。宿主細胞という用語は、具体的な被験体細胞だけでなく、該細胞の子孫又は可能な子孫をも指すことが理解されるべきである。例えば、突然変異又は環境の影響によりその後の世代にいくつかの修飾が生じることがあり、該子孫は、実際には母細胞と異なるが、依然として本明細書で使用される用語の範囲に属する。

【0055】

エンドセリン及びエンドセリン受容体

【0056】

エンドセリンは、２１個のアミノ酸からなるポリペプチドであり、分子量が２，４００Ｄａであり、Ｎ末端においては、二つのジスルフィド結合を介して１～１５、３～１１位置のシステインが連結され、Ｃ末端には、いくつかの疎水性アミノ酸の残基がある。Ｎ末端構造は、それと受容体との親和力を決定し、Ｃ末端構造は、それと受容体との結合位置を決定する。エンドセリン（ＥＴ）には、三つのサブタイプ、即ちＥＴ－１、ＥＴ－２、及びＥＴ－３があり、その区別が一部のアミノ酸の残基にある。エンドセリン受容体（ＥＴ_AＲ）は、７－膜貫通受容体ファミリーのＡサブファミリーに属し、異種三量体のグアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）を介して、一つ又は複数の細胞内シグナル伝達経路とカップリングする（Ｊｅｌｉｎｅｋら，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１６１４－１６１６、Ｓｅｇｒｅら，１９９３，ＴｒｅｎｄｓＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．４：３０９－３１４）。本明細書で使用されるように、「エンドセリン受容体」及び「ＥＴ_AＲ」は同義的に使用され得る。

【0057】

一実施形態において、本明細書による抗体は、細胞上に発現される膜結合性エンドセリン受容体に結合し、エンドセリン受容体によってエンドセリンシグナル伝達を抑制又は遮断するように選択され得る。一実施形態において、本明細書による抗体は、ヒトエンドセリン受容体に特異的に結合する。更なる実施形態において、ヒトエンドセリン受容体に結合する抗体は、他の種、例えば、ラットのエンドセリン受容体と結合することもできる。以下の実施例は、ヒト膜結合性エンドセリン受容体に結合するマウス抗体の生成を提供し、更なる実施形態において他の種のエンドセリン受容体と結合する。

【0058】

複数の種のエンドセリン受容体のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は知られている。ＳＥＱＩＤＮＯ：１～ＳＥＱＩＤＮＯ：６は、ヒト、サル及びラットの配列を示している。配列データは、米国国立生物工学情報センターのＧｅｎｅＢａｎｋデータベースから得た。

【0059】

エンドセリン受容体Ａ（ＥＴ_AＲ）は以下のとおりである：

【0060】

ヒト（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）ポリヌクレオチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、登録番号：Ｓ６３９３８。

【0061】

ヒト（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）アミノ酸（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）、登録番号：ＡＡＢ２０２７８。

【0062】

サル（Ｒｈｅｓｕｓｍａｃａｑｕｅ）ポリヌクレオチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、登録番号：ＪＶ６３５７７１。

【0063】

サル（Ｒｈｅｓｕｓｍａｃａｑｕｅ）アミノ酸（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）、登録番号：ＡＦＪ７１１１１。

【0064】

ラット（Ｒａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ポリヌクレオチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）、登録番号：Ｍ６０７８６。

【0065】

ラット（Ｒａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）アミノ酸（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）、登録番号：ＡＡＡ４１１１４。

【0066】

エンドセリン受容体Ａ（ＥＴ_AＲ）抗体

【0067】

一実施形態において、本明細書は、ＥＴ_AＲ抗体（例えば、完全抗体、抗体断片、抗体誘導体、抗体突然変異タンパク質、及び抗体変異体）を提供した。

【0068】

一実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列は、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８、及びＳＥＱＩＤＮＯ：３０、
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８、ＳＥＱＩＤＮＯ：４０、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４、ＳＥＱＩＤＮＯ：４６、及びＳＥＱＩＤＮＯ：４８、
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：５０、ＳＥＱＩＤＮＯ：５２、ＳＥＱＩＤＮＯ：５４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５６、ＳＥＱＩＤＮＯ：５８、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２、ＳＥＱＩＤＮＯ：６４、ＳＥＱＩＤＮＯ：６６、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６８、
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７０、ＳＥＱＩＤＮＯ：７２、ＳＥＱＩＤＮＯ：７４、ＳＥＱＩＤＮＯ：７６、ＳＥＱＩＤＮＯ：７８、ＳＥＱＩＤＮＯ：８０、ＳＥＱＩＤＮＯ：８２、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：８６、ＳＥＱＩＤＮＯ：８８、及びＳＥＱＩＤＮＯ：９０、
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：９２、ＳＥＱＩＤＮＯ：９４、ＳＥＱＩＤＮＯ：９６、ＳＥＱＩＤＮＯ：９８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１００、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１２、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１１４、及び
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３４、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１３６から独立して選択される。

【0069】

表１には、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体の軽鎖ＣＤＲｓのアミノ酸配列、及びその該当するポリヌクレオチドコード配列がリストされている。表２には、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体の重鎖ＣＤＲｓのアミノ酸配列、及びその該当するポリヌクレオチドコード配列がリストされている。

【0070】

【表1-1】

【0071】

【表1-2】

【0072】

【表2-1】

【0073】

【表2-2】

【0074】

一実施形態において、本明細書による抗体は、表１及び表２におけるＣＤＲアミノ酸配列の各々と５、４、３、２、又は１個の単一アミノ酸の付加、置換及び／又は欠失が異なる配列を含む。別の実施形態において、本明細書による抗体は、表１及び表２におけるＣＤＲアミノ酸配列の各々と４、３、２、又は１個の単一アミノ酸の付加、置換及び／又は欠失が異なる配列を含む。別の実施形態において、本明細書による抗体は、表１及び表２におけるＣＤＲアミノ酸配列の各々と３、２、又は１個の単一アミノ酸の付加、置換及び／又は欠失が異なる配列を含む。別の実施形態において、本明細書による抗体は、表１及び表２におけるＣＤＲアミノ酸配列の各々と２又は１個の単一アミノ酸の付加、置換及び／又は欠失が異なる配列を含む。別の実施形態において、本明細書による抗体は、表１及び表２におけるＣＤＲアミノ酸配列の各々と１個の単一アミノ酸の付加、置換及び／又は欠失が異なる配列を含む。

【0075】

別の実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体（ＥＴ_AＲ－１抗体）は、一つ又は二つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列は、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８、及びＳＥＱＩＤＮＯ：３０、及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７０、ＳＥＱＩＤＮＯ：７２、ＳＥＱＩＤＮＯ：７４、ＳＥＱＩＤＮＯ：７６、ＳＥＱＩＤＮＯ：７８、ＳＥＱＩＤＮＯ：８０、ＳＥＱＩＤＮＯ：８２、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：８６、ＳＥＱＩＤＮＯ：８８、及びＳＥＱＩＤＮＯ：９０から独立して選択される。

【0076】

一態様では、ＥＴ_AＲ－１抗体は、一つ又は二つのアミノ酸配列をさらに含み、ここで、各アミノ酸配列は、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８、ＳＥＱＩＤＮＯ：４０、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４、ＳＥＱＩＤＮＯ：４６、及びＳＥＱＩＤＮＯ：４８、及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：９２、ＳＥＱＩＤＮＯ：９４、ＳＥＱＩＤＮＯ：９６、ＳＥＱＩＤＮＯ：９８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１００、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１２、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１１４から独立して選択される。

【0077】

別の態様では、ＥＴ_AＲ－１抗体は、一つ又は二つのアミノ酸配列をさらに含み、ここで、各アミノ酸配列は、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：５０、ＳＥＱＩＤＮＯ：５２、ＳＥＱＩＤＮＯ：５４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５６、ＳＥＱＩＤＮＯ：５８、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２、ＳＥＱＩＤＮＯ：６４、ＳＥＱＩＤＮＯ：６６、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６８、及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３４、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１３６から独立して選択される。

【0078】

別の実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体（ＥＴ_AＲ－２抗体）は、一つ又は二つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列は、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８、ＳＥＱＩＤＮＯ：４０、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４、ＳＥＱＩＤＮＯ：４６、及びＳＥＱＩＤＮＯ：４８、及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：９２、ＳＥＱＩＤＮＯ：９４、ＳＥＱＩＤＮＯ：９６、ＳＥＱＩＤＮＯ：９８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１００、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１２、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１１４から独立して選択される。

【0079】

一態様では、ＥＴ_AＲ－２抗体は、一つ又は二つのアミノ酸配列をさらに含み、ここで、各アミノ酸配列は、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８、及びＳＥＱＩＤＮＯ：３０、及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７０、ＳＥＱＩＤＮＯ：７２、ＳＥＱＩＤＮＯ：７４、ＳＥＱＩＤＮＯ：７６、ＳＥＱＩＤＮＯ：７８、ＳＥＱＩＤＮＯ：８０、ＳＥＱＩＤＮＯ：８２、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：８６、ＳＥＱＩＤＮＯ：８８、及びＳＥＱＩＤＮＯ：９０から独立して選択される。

【0080】

別の態様では、ＥＴ_AＲ－２抗体は、一つ又は二つのアミノ酸配列をさらに含み、ここで、各アミノ酸配列は、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：５０、ＳＥＱＩＤＮＯ：５２、ＳＥＱＩＤＮＯ：５４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５６、ＳＥＱＩＤＮＯ：５８、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２、ＳＥＱＩＤＮＯ：６４、ＳＥＱＩＤＮＯ：６６、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６８、及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３４、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１３６から独立して選択される。

【0081】

別の実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体（ＥＴ_AＲ－３抗体）は、一つ又は二つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列は、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：５０、ＳＥＱＩＤＮＯ：５２、ＳＥＱＩＤＮＯ：５４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５６、ＳＥＱＩＤＮＯ：５８、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２、ＳＥＱＩＤＮＯ：６４、ＳＥＱＩＤＮＯ：６６、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６８、及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３４、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１３６から独立して選択される。

【0082】

一態様では、ＥＴ_AＲ－３抗体は、一つ又は二つのアミノ酸配列をさらに含み、ここで、各アミノ酸配列は、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８、及びＳＥＱＩＤＮＯ：３０、及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７０、ＳＥＱＩＤＮＯ：７２、ＳＥＱＩＤＮＯ：７４、ＳＥＱＩＤＮＯ：７６、ＳＥＱＩＤＮＯ：７８、ＳＥＱＩＤＮＯ：８０、ＳＥＱＩＤＮＯ：８２、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：８６、ＳＥＱＩＤＮＯ：８８、及びＳＥＱＩＤＮＯ：９０から独立して選択される。

【0083】

別の態様では、ＥＴ_AＲ－３抗体は、一つ又は二つのアミノ酸配列をさらに含み、ここで、各アミノ酸配列は、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８、ＳＥＱＩＤＮＯ：４０、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４、ＳＥＱＩＤＮＯ：４６、及びＳＥＱＩＤＮＯ：４８、及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：９２、ＳＥＱＩＤＮＯ：９４、ＳＥＱＩＤＮＯ：９６、ＳＥＱＩＤＮＯ：９８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１００、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１２、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１１４から独立して選択される。

【0084】

一実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、
ａ．以下に列挙される：ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８、及びＳＥＱＩＤＮＯ：３０から独立して選択される一つの軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列と、
ｂ．以下に列挙される：ＳＥＱＩＤＮＯ：３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８、ＳＥＱＩＤＮＯ：４０、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４、ＳＥＱＩＤＮＯ：４６、及びＳＥＱＩＤＮＯ：４８から独立して選択される一つの軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列と、
ｃ．以下に列挙される：ＳＥＱＩＤＮＯ：５０、ＳＥＱＩＤＮＯ：５２、ＳＥＱＩＤＮＯ：５４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５６、ＳＥＱＩＤＮＯ：５８、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２、ＳＥＱＩＤＮＯ：６４、ＳＥＱＩＤＮＯ：６６、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６８から独立して選択される一つの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列と、
ｄ．以下に列挙される：ＳＥＱＩＤＮＯ：７０、ＳＥＱＩＤＮＯ：７２、ＳＥＱＩＤＮＯ：７４、ＳＥＱＩＤＮＯ：７６、ＳＥＱＩＤＮＯ：７８、ＳＥＱＩＤＮＯ：８０、ＳＥＱＩＤＮＯ：８２、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：８６、ＳＥＱＩＤＮＯ：８８、及びＳＥＱＩＤＮＯ：９０から独立して選択される一つの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列と、
ｅ．以下に列挙される：ＳＥＱＩＤＮＯ：９２、ＳＥＱＩＤＮＯ：９４、ＳＥＱＩＤＮＯ：９６、ＳＥＱＩＤＮＯ：９８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１００、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１２、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１１４から独立して選択される一つの重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列と、
ｆ．以下に列挙される：ＳＥＱＩＤＮＯ：１１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３４、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１３６から独立して選択される一つの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む。

【0085】

一実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、以下に列挙される：ＳＥＱＩＤＮＯ：５０、ＳＥＱＩＤＮＯ：５２、ＳＥＱＩＤＮＯ：５４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５６、ＳＥＱＩＤＮＯ：５８、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２、ＳＥＱＩＤＮＯ：６４、ＳＥＱＩＤＮＯ：６６、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６８から独立して選択される一つの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。別の実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、以下に列挙される：ＳＥＱＩＤＮＯ：１１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３４、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１３６から独立して選択される一つの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。別の実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、以下に列挙される：ＳＥＱＩＤＮＯ：５０とＳＥＱＩＤＮＯ：１１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２とＳＥＱＩＤＮＯ：１２８、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２とＳＥＱＩＤＮＯ：１３０、ＳＥＱＩＤＮＯ：６４とＳＥＱＩＤＮＯ：１３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：６６とＳＥＱＩＤＮＯ：１３４、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６８とＳＥＱＩＤＮＯ：１３６から独立して選択される一つの軽鎖と重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の組み合わせを含む。

【0086】

別の実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、一つ又は二つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列は、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖可変ドメインアミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１３８（Ｌ１）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４０（Ｌ２）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４２（Ｌ３）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４４（Ｌ４）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４６（Ｌ５）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４８（Ｌ６）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５０（Ｌ７）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５２（Ｌ８）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５４（Ｌ９）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５６（Ｌ１０）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５８（Ｌ１１）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６０（Ｌ１２）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６２（Ｌ１３）、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１６４（Ｌ１４）、及びそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、及び
ｂ．重鎖可変ドメインアミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１６６（Ｈ１）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６８（Ｈ２）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７０（Ｈ３）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７２（Ｈ４）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７４（Ｈ５）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７６（Ｈ６）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７８（Ｈ７）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８０（Ｈ８）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８２（Ｈ９）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８４（Ｈ１０）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６（Ｈ１１）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８８（Ｈ１２）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９０（Ｈ１３）、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１９２（Ｈ１４）、及びそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列から独立して選択される。

【0087】

別の実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体のポリヌクレオチドコード配列は、一つ又は二つのポリヌクレオチド配列を含み、ここで、各ポリヌクレオチド配列は、以下に列挙されるポリヌクレオチド配列：
ａ．軽鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１３７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３９、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４５、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４９、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５５、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５９、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６１、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１６３、及びそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチド配列、及び
ｂ．重鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１６５、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６９、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７５、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７９、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８５、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８９、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１９１、及びそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチド配列から独立して選択される。

【0088】

別の実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、
ａ．以下に列挙される：ＳＥＱＩＤＮＯ：１３８（Ｌ１）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４０（Ｌ２）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４２（Ｌ３）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４４（Ｌ４）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４６（Ｌ５）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４８（Ｌ６）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５０（Ｌ７）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５２（Ｌ８）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５４（Ｌ９）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５６（Ｌ１０）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５８（Ｌ１１）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６０（Ｌ１２）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６２（Ｌ１３）、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１６４（Ｌ１４）、及びそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列から独立して選択される一つの軽鎖可変ドメインアミノ酸配列と、
ｂ．以下に列挙される：ＳＥＱＩＤＮＯ：１６６（Ｈ１）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６８（Ｈ２）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７０（Ｈ３）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７２（Ｈ４）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７４（Ｈ５）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７６（Ｈ６）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７８（Ｈ７）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８０（Ｈ８）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８２（Ｈ９）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８４（Ｈ１０）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６（Ｈ１１）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８８（Ｈ１２）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９０（Ｈ１３）、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１９２（Ｈ１４）、及びそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列から独立して選択される一つの重鎖可変ドメインアミノ酸配列とを含む。

【0089】

別の実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、
ａ．以下に列挙される：ＳＥＱＩＤＮＯ：１３８（Ｌ１）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４０（Ｌ２）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４２（Ｌ３）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４４（Ｌ４）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４６（Ｌ５）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４８（Ｌ６）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５０（Ｌ７）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５２（Ｌ８）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５４（Ｌ９）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５６（Ｌ１０）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５８（Ｌ１１）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６０（Ｌ１２）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６２（Ｌ１３）、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１６４（Ｌ１４）から独立して選択される一つの軽鎖可変ドメインアミノ酸配列と、
ｂ．以下に列挙される：ＳＥＱＩＤＮＯ：１６６（Ｈ１）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６８（Ｈ２）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７０（Ｈ３）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７２（Ｈ４）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７４（Ｈ５）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７６（Ｈ６）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７８（Ｈ７）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８０（Ｈ８）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８２（Ｈ９）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８４（Ｈ１０）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６（Ｈ１１）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８８（Ｈ１２）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９０（Ｈ１３）、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１９２（Ｈ１４）から独立して選択される一つの重鎖可変ドメインアミノ酸配列とを含む。

【0090】

別の実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、以下に列挙される：ＳＥＱＩＤＮＯ：１３８とＳＥＱＩＤＮＯ：１６６（Ｌ１Ｈ１）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４０とＳＥＱＩＤＮＯ：１６８（Ｌ２Ｈ２）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４２とＳＥＱＩＤＮＯ：１７０（Ｌ３Ｈ３）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４４とＳＥＱＩＤＮＯ：１７２（Ｌ４Ｈ４）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４６とＳＥＱＩＤＮＯ：１７４（Ｌ５Ｈ５）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４８とＳＥＱＩＤＮＯ：１７６（Ｌ６Ｈ６）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５０とＳＥＱＩＤＮＯ：１７８（Ｌ７Ｈ７）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５２とＳＥＱＩＤＮＯ：１８０（Ｌ８Ｈ８）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５４とＳＥＱＩＤＮＯ：１８２（Ｌ９Ｈ９）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５６とＳＥＱＩＤＮＯ：１８４（Ｌ１０Ｈ１０）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５８とＳＥＱＩＤＮＯ：１８６（Ｌ１１Ｈ１１）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６０とＳＥＱＩＤＮＯ：１８８（Ｌ１２Ｈ１２）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６２とＳＥＱＩＤＮＯ：１９０（Ｌ１３Ｈ１３）、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１６４とＳＥＱＩＤＮＯ：１９２（Ｌ１４Ｈ１４）から独立して選択される一つの軽鎖及び重鎖可変ドメインアミノ酸配列の組み合わせを含む。

【0091】

本明細書では、記号「ＬｘＨｙ」で本明細書によるＥＴ_AＲ抗体を表してもよく、ここで、「ｘ」は軽鎖可変領域に対応し、且つ「ｙ」は重鎖可変領域に対応する。例えば、Ｌ２Ｈ１は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４０（Ｌ２）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１６６（Ｈ１）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する抗体を指す。

【0092】

別の実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、Ｌ１～Ｌ１４から選択される軽鎖可変領域又はＨ１～Ｈ１４から選択される重鎖可変領域及びその断片、誘導体、突然変異タンパク質、又は変異体を含む抗体を指す。

【0093】

別の実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、以下に列挙される：ＳＥＱＩＤＮＯ：１３８とＳＥＱＩＤＮＯ：１６６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５０とＳＥＱＩＤＮＯ：１７８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５２とＳＥＱＩＤＮＯ：１８０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５４とＳＥＱＩＤＮＯ：１８２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５６とＳＥＱＩＤＮＯ：１８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５８とＳＥＱＩＤＮＯ：１８６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６０とＳＥＱＩＤＮＯ：１８８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６２とＳＥＱＩＤＮＯ：１９０、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１６４とＳＥＱＩＤＮＯ：１９２から独立して選択される一つの軽鎖と重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の組み合わせを含む。

【0094】

一実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３８軽鎖可変ドメインアミノ酸配列又はＳＥＱＩＤＮＯ：１６６重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３８軽鎖可変ドメインアミノ酸配列とＳＥＱＩＤＮＯ：１６６の重鎖可変ドメインアミノ酸配列との組み合わせを含む。

【0095】

別の実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、定常領域アミノ酸配列をさらに含み、ここで、各定常領域アミノ酸配列は、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖定常領域アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１９４及びＳＥＱＩＤＮＯ：１９６、及び
ｂ．重鎖定常領域アミノ酸配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１９８から独立して選択される。

【0096】

別の実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、定常領域アミノ酸配列をさらに含み、ここで、各定常領域アミノ酸配列は、以下に列挙される軽鎖及び重鎖定常領域アミノ酸配列の組み合わせ：
ａ．軽鎖定常領域アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１９４と重鎖定常領域アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１９８との組み合わせ、
ｂ．軽鎖定常領域アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１９６と重鎖定常領域アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１９８との組み合わせから独立して選択される。

【0097】

一実施形態において、本明細書による抗体は、本明細書に列挙される軽鎖及び重鎖ＣＤＲｓ及びＦＲｓ（フレームワーク）のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、該抗体は、本明細書に列挙される軽鎖ＣＤＲ１配列を含む。別の実施形態において、該抗体は、本明細書に列挙される軽鎖ＣＤＲ２配列を含む。別の実施形態において、該抗体は、本明細書に列挙される軽鎖ＣＤＲ３配列を含む。別の実施形態において、該抗体は、本明細書に列挙される重鎖ＣＤＲ１配列を含む。別の実施形態において、該抗体は、本明細書に列挙される重鎖ＣＤＲ２配列を含む。別の実施形態において、該抗体は、本明細書に列挙される重鎖ＣＤＲ３配列を含む。別の実施形態において、該抗体は、本明細書に列挙される軽鎖ＦＲ１配列を含む。別の実施形態において、該抗体は、本明細書に列挙される軽鎖ＦＲ２配列を含む。別の実施形態において、該抗体は、本明細書に列挙される軽鎖のＦＲ３配列を含む。別の実施形態において、該抗体は、本明細書に列挙される軽鎖ＦＲ４配列を含む。別の実施形態において、該抗体は、本明細書に列挙される重鎖ＦＲ１配列を含む。別の実施形態において、該抗体は、本明細書に列挙される重鎖のＦＲ２配列を含む。別の実施形態において、該抗体は、本明細書に列挙される重鎖ＦＲ３配列を含む。別の実施形態において、該抗体は、本明細書に列挙される重鎖ＦＲ４配列を含む。

【0098】

一実施形態において、該抗体のＣＤＲ３配列は、本明細書に列挙される軽重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：５０及びＳＥＱＩＤＮＯ：１１６の組み合わせと最大６、５、４、３、２、又は１個の単一アミノ酸の付加、置換及び／又は欠失が異なる。別の実施形態において、該抗体の軽鎖ＣＤＲ３配列は、本明細書に列挙される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：５０と６、５、４、３、２、又は１個以下の単一アミノ酸の付加、置換及び／又は欠失が異なる。別の実施形態において、該抗体の軽鎖ＣＤＲ３配列は、本明細書に列挙される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：５０と６、５、４、３、２、又は１個以下の単一アミノ酸の付加、置換及び／又は欠失が異なり、且つ該抗体の重鎖ＣＤＲ３配列は、本明細書に列挙される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１１６又はＳＥＱＩＤＮＯ：１１８と最大６、５、４、３、２、又は１個の単一アミノ酸の付加、置換及び／又は欠失が異なる。別の実施形態において、該抗体は、本明細書に列挙される１、２、３、４、５、又は６個の軽重鎖ＣＤＲ軽重鎖配列の組み合わせをさらに含む。別の実施形態において、該抗体は、１、２、３、４、５、又は６個のＣＤＲ軽重鎖配列組み合わせをさらに含み、各配列は独立して、本明細書に列挙される軽重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：５０及びＳＥＱＩＤＮＯ：１１６の組み合わせと最大６、５、４、３、２、又は１個の単一アミノ酸が異なる。別の実施形態において、該抗体は、本明細書に列挙される軽鎖可変領域ＣＤＲｓ及び重鎖可変領域のＣＤＲｓを含む。別の実施形態において、該抗体は、本明細書に列挙される１、２、３、４、５、及び／又は６個のＣＤＲ軽重鎖配列組み合わせを含む。

【0099】

一実施形態において、該抗体（例えば、抗体又は抗体断片）は、本明細書に列挙されるＬ１軽鎖可変ドメイン配列を含む。一実施形態において、該軽鎖可変ドメインは、Ｌ１の軽鎖可変ドメイン配列と１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸差異があるアミノ酸配列を含み、ここで、各該配列の差異は、独立して一つのアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換である。別の実施形態において、該軽鎖可変ドメインは、Ｌ１の軽鎖可変ドメイン配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、該軽鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、Ｌ１ポリヌクレオチドコード配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一であるヌクレオチドコード配列を含む。別の実施形態において、該軽鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、中程度な条件下で、Ｌ１の軽鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列の互補的配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、該軽鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、ストリンジェントな条件下で、Ｌ１の軽鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列の互補的配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。

【0100】

一実施形態において、該抗体（例えば、抗体又は抗体断片）は、本明細書に列挙されるＨ１重鎖可変ドメイン配列を含む。別の実施形態において、該可変ドメインは、Ｈ１の重鎖可変ドメイン配列と１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸差異があるアミノ酸配列を含み、ここで、各該配列の差異は、独立して一つのアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換である。別の実施形態において、該重鎖可変ドメインは、Ｈ１の重鎖可変ドメイン配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、該重鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、Ｈ１ポリヌクレオチドコード配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一であるヌクレオチドコード配列を含む。別の実施形態において、該重鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、中程度にストリンジェントな条件下で、Ｈ１の重鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列の互補的配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、該重鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、ストリンジェントな条件下で、Ｈ１の重鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列の互補的配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。

【0101】

一実施形態において、本明細書による抗体は、組み合わせＬ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３、又はＬ１４Ｈ１４を含む抗体、もしくはその所望の表現型（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＥ及びＩｇＤ）、又はそのＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）₂断片を含む。

【0102】

一実施形態において、本明細書による抗体は、組み合わせＬ１Ｈ１を含む抗体、もしくはそのクラス変換抗体（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＥ及びＩｇＤ）、又はそのＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）₂断片を含む。

【0103】

本明細書による抗体（例えば、抗体、抗体断片、及び抗体誘導体）は、当分野に既知の定常領域のうちのいずれか一つを含んでもよい。軽鎖定常領域は、例えば、κ又はλ型軽鎖定常領域、例えば、マウスκ又はλ型軽鎖定常領域であってもよい。重鎖定常領域は、例えば、α、δ、ε、γ、又はμ型重鎖定常領域、例えば、マウスα、δ、ε、γ、又はμ型重鎖定常領域であってもよい。一実施形態において、該軽鎖又は重鎖定常領域は、天然定常領域の断片、誘導体、変異体、又は突然変異タンパク質である。

【0104】

一実施形態において、本明細書による抗体は、定常軽鎖κ又はλドメイン又はそれらの断片をさらに含む。軽鎖定常領域配列及びそれらのポリヌクレオチドコード配列は以下のように提供される：
ポリヌクレオチド（κ）、（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９３）、アミノ酸（κ）、（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９４）、
ポリヌクレオチド（λ）、（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９５）、アミノ酸（λ）、（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９６）。

【0105】

別の実施形態において、本明細書による抗体は、重鎖定常ドメイン又はその断片をさらに含む。重鎖定常領域配列及びそのポリヌクレオチドコード配列は以下のように提供される：
ポリヌクレオチド（ＩｇＧ１）、（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９７）、アミノ酸（ＩｇＧ１）、（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９８）。

【0106】

一実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、マウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、抗原結合抗体断片、一本鎖抗体、二本鎖抗体、三本鎖抗体、四本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_x断片、ド
メイン抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧｌ抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、及びＩｇＧ４抗体から選択される。別の実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、ＥＴ_AＲモノクローナル抗体である。別の実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、マウス由来のＥＴ_AＲ抗体である。本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、ヒト化ＥＴ_AＲ抗体である。

【0107】

一実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、モノクローナル抗体Ａ－１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３８とＳＥＱＩＤＮＯ：１６６とを含む）、Ａ－７（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５０とＳＥＱＩＤＮＯ：１７８とを含む）、Ａ－８（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５２とＳＥＱＩＤＮＯ：１８０とを含む）、Ａ－９（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５４とＳＥＱＩＤＮＯ：１８２とを含む）、Ａ－１０（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５６とＳＥＱＩＤＮＯ：１８４とを含む）、Ａ－１１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５８とＳＥＱＩＤＮＯ：１８６とを含む）、Ａ－１２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６０とＳＥＱＩＤＮＯ：１８８とを含む）、Ａ－１３（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６２とＳＥＱＩＤＮＯ：１９０とを含む）、又はＡ－１４（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６４とＳＥＱＩＤＮＯ：１９２とを含む）である。

【0108】

抗体及び抗体断片
一実施形態において、本明細書による抗体は、完全抗体（完全長重及び／又は軽鎖を有するポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含む）である。別の実施形態において、本明細書による抗体は、抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａ
ｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆｃ、又はＦｄ断片であり、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、マキ
シ抗体（ｍａｘｉｂｏｄｉｅｓ）、ミニ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、細胞内抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、二本鎖抗体、三本鎖抗体、四本鎖抗体、ｖ－ＮＡＲ及びｂｉｓ－ｓｃＦｖに組込んでもよい（例えば、ＨｏｌｌｉｎｇｅｒａｎｄＨｕｄｓｏｎ，２００５，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２３：１１２６－１１３６を参照されたい）。別の実施形態において、本明細書による抗体は、抗体ポリペプチドをも含み、例えば、米国特許第６７０３１９９に開示される、フィブロネクチンポリペプチド単一抗体を含むものである。別の実施形態において、本明細書による抗体は、他の抗体ポリペプチドをも含み、米国特許出版物２００５／０２３８６４６に開示され、一本鎖ポリペプチドである。

【0109】

一実施形態において、ヌクレオチドプライマーを用いて、ハイブリドーマにおいて関連するモノクローナル抗体を発現する遺伝子の可変領域を増幅させる。これらのプライマーは、当業者により合成されるか又は商業的供給源から購入可能であり（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを参照されたい）、これらのメーカーは、Ｖ_Ha、Ｖ_Hb、Ｖ_Hc、Ｖ_Hd、Ｃ_H1、Ｖ_L及びＣ_L領域を含むマウス及びヒト可変領域プライマーを販売している。これらのプライマーは、重鎖又は軽鎖可変領域を増幅させ、そしてそれらをそれぞれベクター、例えば、ＩＭＭＵＮＯＺＡＰ^TMＨ又はＩＬＬＬＦＦＬＵＮＯＺＡＰ^TMＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に挿入することに用いられてもよい。そして、これらのベクターを大腸菌、酵母又は哺乳動物ベースの発現系に導入する。これらの方法により、Ｖ_H及びＶ_Lドメイン融合を大量に含む一本鎖タンパク質を生産することができる（Ｂｉｒｄら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－４２６を参照されたい）。

【0110】

上記任意の免疫及び他の技術を用いて、本明細書に従って抗体を生産する細胞を得ると、本明細書に記載の標準的な方法に基づいて、ＤＮＡ又はｍＲＮＡを単離し、そこから増幅させることによって特異的抗体遺伝子をクローニングしてもよい。それから生産された抗体を配列決定しＣＤＲｓを同定すれば、以上に記載のように、ＣＤＲｓをコードするＤＮＡを操作して本明細書による他の抗体を生成することができる。

【0111】

本明細書による抗体は、好ましくは、本明細書に記述されている細胞ベースのアッセイ及び／又は本明細書に記述されているインビボアッセイにおいて、エンドセリンシグナル伝達を調節し、及び／又は本出願に記載の抗体のうちの一つの結合を交差遮断し、及び／又は本出願に記載の抗体のうちの一つを経由してＥＴ_AＲへの結合により交差遮断される。そのため、本明細書に記載のアッセイを用いて、このような結合剤を同定することができる。

【0112】

いくつかの実施形態において、まず本明細書に記述されている細胞ベースの及び／又はインビボアッセイにおいてＥＴ_AＲ過剰発現細胞と結合し、及び／又は本出願に記述されている抗体を中和及び／又は交差遮断し、及び／又は本出願に記述されている抗体のうちの一つを経由してＥＴ_AＲへの結合に交差遮断される抗体を同定することによって、抗体を生成する。

【0113】

当業者であれば、いくつかのタンパク質、例えば、抗体が様々な転写後修飾を行うことができることを理解するであろう。これらの修飾のタイプ及び程度は、該タンパク質を発現するための宿主細胞株及び培養条件に依存する。このような修飾は、グリコシル化作用、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性体化及びアスパラギン脱アミド作用の変化を含む。カルボキシペプチダーゼ作用の頻繁な修飾により、カルボキシペプチダーゼ（例えば、リジン又はアルギニン）が失われる（Ｈａｒｒｉｓ，１９９５，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ７０５：１２９－１３４に記載されているとおりである）。

【0114】

マウスモノクローナル抗体の選択可能な生産方法は、ハイブリドーマ細胞を同系遺伝子マウス、例えば、モノクローナル抗体を含む腹水の形成を促進する処理（例えば、プリスタン初回免疫）を施したマウスの腹膜腔に注入することである。モノクローナル抗体は、確立された複数の技術によって単離され精製され得る。このような単離技術は、タンパク質Ａ－アガロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、分子排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを含み、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎらページ２．７．１－２．７．１２及びページ２．９．１－２．９．３、Ｂａｉｎｅｓら，「ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧ（ＩｇＧ），」ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第１０巻，ページ７９－１０４（ＴｈｅＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９２）を参照されたい。モノクローナル抗体は、抗体の特異的性質（例えば、重鎖又は軽鎖アイソタイプ、結合特異性など）に基づいてスクリーニングされた適切なリガンドを用いて、アフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。固体ベクターに固定化された適切なリガンドの例としては、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、抗定常領域（軽鎖又は重鎖）抗体、抗イディオタイプ抗体及びＴＧＦ－ｐ結合タンパク質又はその断片もしくは変異体が挙げられる。

【0115】

親和性が増加した抗体、例えば、ｃ－ｅｒｂＢ－２への親和性が増加した抗体は、Ｓｃｈｉｅｒら，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１－５６７に記載しているように、抗体結合部位中央の相補的決定領域（ＣＤＲｓ）の分子進化を用いて単離され得る。そのため、このような技術は、ヒトエンドセリン受容体の抗体を製造することに用いられ得る。

【0116】

例えば、エンドセリン受容体が存在するか否かを検出するインビトロ又はインビボアッセイにおいて、ヒトエンドセリン受容体に対する抗体を用いる。

【0117】

抗体はまた、任意の従来技術によって製造され得る。例えば、これらの抗体は、天然に発現される細胞から精製（例えば、抗体を生産するハイブリドーマからそれらを精製）されてもよく、又は当分野で公知の任意の技術を用いて組換え発現系で生産されてもよい。例えば、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：ＡＮｅｗＤｉｍｅｎｓｉｏｎｉｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔら編集、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ（１９８０）、及びＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｄ編集，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８８）を参照されたい。これは、以下の核酸の項で論じられる。

【0118】

抗体は、公知の任意の技術によって製造され、所望の性質をスクリーニングすることができる。いくつかの技術は、関連する抗体（例えば、抗エンドセリン受容体抗体）のポリペプチド鎖（又はその一部）をコードする核酸を単離し、組換えＤＮＡ技術によって核酸を操作することに関する。該核酸は、別の関連する核酸と融合するか、又は修飾されて（例えば、突然変異誘発又は他の従来の技術により）一つ又は複数のアミノ酸残基を付加、欠失又は置換することができる。

【0119】

本明細書による、一つ又は複数の上記ＣＤＲｓを含む抗体の親和性を向上させる必要がある場合、ＣＤＲｓ維持（Ｙａｎｇら，１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２－４０３）、鎖置換（Ｍａｒｋｓら，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９－７８３）、大腸菌を用いた突然変異株（Ｌｏｗら，１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５０：３５０－３６８）ＤＮＡ再配列（Ｐａｔｔｅｎら，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４－７３３）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５６：７－８８）及び他のＰＣＲ技術（Ｃｒａｍｅｒｉら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ３９１：２８８－２９１）を含めて、複数の親和性成熟スキームを用いてもよい。全てのこれらの親和力成熟方法は、Ｖａｕｇｈａｎら，１９９８，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１６：５３５－５３９で論じられている。

【0120】

一実施形態において、本明細書による抗体は、抗エンドセリン受容体断片である。該断片は、完全に抗体由来配列からなるか又は追加の配列を含んでもよい。抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体、二本鎖抗体、三本鎖抗体、四本鎖抗体
及びドメイン抗体が挙げられ、他の例は、Ｌｕｎｄｅら、２００２、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：５００－０６に提供されている。

【0121】

アミノ酸ブリッジ（ショートペプチドリンカー）を介して重鎖及び軽鎖可変ドメイン（Ｆｖ領域）を連結して一本鎖抗体を形成することによって、単一ポリペプチド鎖を得ることができる。該一本鎖ＦＶｓ（ｓｃＦｖｓ）は、二つの可変ドメインポリペプチド（Ｖ_L及びＶ_H）をコードするＤＮＡｓの間に、ペプチドリンカーをコードするＤＮＡを融合させることによって製造された。得られたポリペプチドは、自身に折り返されて抗原結合モノマーを形成するか、又は多量体（例えば、二量体、三量体又は四量体）を形成することができ、これは二つの可変ドメインの間の可撓性リンカーの長さに依存する（Ｋｏｒｔｔら、１９９７、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：４２３、Ｋｏｒｔｔら２００１、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：９５－１０８）。ポリペプチドを含む様々なＶ_L及びＶ_Hを組み合わせすることによって、様々な表現型に結合する多量体ｓｃＦｖｓを形成することができる（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍら、２００１、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：３１－４０）。一本鎖抗体を生産するために開発された技術は、米国特許第４９４６７７８号、Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３、Ｈｕｓｔｏｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３、Ｗａｒｄら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ３３４：５４４－５４６、ｄｅＧｒａａｆら，２００２，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ．１７８：３７９－８７に記述されているものを含む。本明細書による抗体に由来する一本鎖抗体は、可変ドメイン組み合わせＬ１Ｈ１を含むｓｃＦｖｓを含むが、それに限らず、いずれも本明細書に包含されている。

【0122】

また、抗体のタンパク質加水分解作用、例えば、従来の方法に従ったペプシン又はパパインによる完全な抗体の消化によって、抗体に由来する抗原結合断片を得ることができる。例えば、抗体断片は、ペプシン酵素開裂抗体を用いてＦ（ａｂ’）２と呼ばれるＳＳ断
片を提供することによって生産され得る。メルカプト還元剤を用いてこの断片をさらに開裂して、３．５ＳＦａｂ’一価断片を産生することができる。選択可能なスキームとし
て、メルカプト保護基を用いて該開裂反応を行い、ジスルフィド結合の開裂を得て、また、パパインの酵素開裂を用いて二つの一価Ｆａｂ断片及び一つのＦｃ断片を直接産生してもよい。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４，３３１，６４７、Ｎｉｓｏｎｏｆｆら，１９６０，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０、Ｐｏｒｔｅｒ，１９５９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９、Ｅｄｅｌｍａｎら，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙｌ：４２２（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９６７）、及びＡｎｄｒｅｗｓ及びＴｉｔｕｓ，Ｊ．Ａ．ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎら編集、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，２００３）、ページ２．８，１－２．８．１０及びページ２．１０Ａ．１－２．１０Ａ．５に記述されている。抗体を開裂する他の方法は、例えば、重鎖を製造して一価重、軽鎖断片（Ｆｄ）を形成し、断片をさらに開裂してもよく、又は他の酵素的、化学的又は遺伝子的技術を用いてもよく、断片が、該完全抗体により認識される抗原と結合できればよい。

【0123】

別の形態の抗体断片は、一つ又は複数の抗体の相補的決定領域（ＣＤＲｓ）を含むペプチドである。ＣＤＲｓは、関連するＣＤＲをコードするポリペプチドを構築することによって得られる。このようなポリペプチドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応用抗体を用いて細胞のｍＲＮＡをテンプレートとして生成して可変領域を合成することによって製造され得、例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＡＣｏｍｐａｎｉｏｎｔｏＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２：１０６、Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ－Ｌｕｃｋ，「ＧｅｎｅｔｉｃＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，」ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒら編集，ページ１６６（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，１９９５）、及びＷａｒｄら，「ＧｅｎｅｔｉｃＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，」ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈら編集，ページ１３７（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９５）を参照されたい。該抗体断片は、本明細書に記載の抗体の少なくとも一つの可変ドメインをさらに含んでもよい。そのため、例えば、Ｖ領域ドメインは、モノマーであってもよく、且つＶ_H又はＶ_Lドメインであり、それは、以下に記載されている少なくとも１ｘ１０^-7Ｍ又はそれ以下の親和性で、エンドセリン受容体に独立して結合することができる。

【0124】

該可変領域ドメインは、任意の天然可変ドメイン又はその遺伝子工学的形態であってもよい。遺伝子工学的形態は、組換えＤＮＡ工学技術を用いて生産された可変領域ドメインを指す。該遺伝子工学的形態は、例えば、特異的抗体のアミノ酸配列への挿入、欠失又は変化によって特異的抗体の可変領域から産生されたものを含む。具体的な例としては、一つのＣＤＲのみを含み、任意に一つの抗体に由来する一つ又は複数のフレームワークアミノ酸及び別の抗体に由来する可変領域ドメインの残りの部分を含み、遺伝子工学によって組織化された可変領域ドメインが挙げられる。

【0125】

可変領域ドメインは、Ｃ末端アミノ酸において、少なくとも一つの抗体ドメイン又はその断片に共有的に連結され得る。そのため、例えば、可変領域ドメインに存在するＶ_Hドメインは、免疫グロブリンＣＨ１ドメイン又はその断片に連結され得る。同様に、Ｖ_Lドメインは、Ｃ_Kドメイン又はその断片に連結され得る。このようにして、例えば、該抗体はＦａｂ断片であってもよく、ここで、抗原結合ドメインは、Ｃ末端がそれぞれＣＨ１及びＣ_Kドメインに共有的に連結される結合Ｖ_H及びＶ_Lドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、例えば、ヒンジ領域もしくはＦａｂ’断片における一部のヒンジドメインを提供する
か又は他のドメイン、例えば、抗体ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを提供するために、他のアミノ酸を用いて延長され得る。

【0126】

抗体の誘導体及び変異体
例えば、アミノ酸配列Ａ－１に対応するヌクレオチド配列Ｌ１及びＨ１をコードして、突然変異されていないポリヌクレオチドに比べて、一つ又は複数の具体的なヌクレオチドの置換、欠失又は挿入を含む変化を産生するポリヌクレオチドは、ランダム突然変異誘発又は部位特異的突然変異誘発（例えば、オリゴヌクレオチドにより誘導された部位特異的突然変異誘発）によって変化させ得る。このような変化を産生するための技術の例は、Ｗａｌｄｅｒら，１９８６，Ｇｅｎｅ４２：１３３、Ｂａｕｅｒら，１９８５，Ｇｅｎｅ３７：７３、Ｃｒａｉｋ，１９８５，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３：１２－１９、Ｓｍｉｔｈら，１９８１，ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ、及び米国特許第４５１８５８４及び４７３７４６２に記述されている。これら及び他の方法は、例えば、誘導体化されていない抗体に比べて、所望の性質、例えば、親和性、親和力又はエンドセリン受容体に対する特異性増強、インビボもしくはインビトロ活性又は安定性の増強もしくはインビボ副作用の低下を有する抗エンドセリン受容体抗体の誘導体を産生することに用いられ得る。

【0127】

本明細書の分野の他の抗エンドセリン受容体抗体の誘導体は、例えば、抗エンドセリン受容体抗体ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端と融合する異種ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質を発現することにより、抗エンドセリン受容体抗体又はその断片と他のタンパク質又はポリペプチドとの共有又は凝集結合体を含む。例えば、該結合ペプチドは、異種シグナル（又はガイド）ポリペプチド、例えば、酵母α因子リーダーペプチド又は例えば、エピトープタグのペプチドであってもよい。融合タンパク質を含む抗体は、抗体の精製又は同定を補助するために付加されたペプチド（例えば、ポリヒスチジン）を含んでもよい。抗体は、Ｈｏｐｐら，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：１２０４及び米国特許５０１１９１２に記載されているように、ＦＬＡＧペプチドに連結され得る。ＦＬＡＧペプチドは、高い抗原性を有し、特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に可逆的に結合するエピトープを提供し、発現した組換えタンパク質の迅速な検出及び簡便な精製を可能にする。それにおけるＦＬＡＧペプチドが所定のポリペプチドと融合する融合タンパク質を製造するための試薬は商業的に購入可能であり（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、別の実施形態において、一つ又は複数の抗体を含むオリゴマーを、エンドセリン受容体アンタゴニストとして用いられてもよく、又はより高次のオリゴマーを用いてもよい。オリゴマーは、共有的に連結されるか又は非共有的に連結される二量体、三量体又はより高次のオリゴマー形態であってもよい。二つ又はそれ以上の抗体を含むオリゴマーを用いてもよく、ここで、一つの例はホモ二量体である。他のオリゴマーは、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体などを含む。

【0128】

一実施形態は、複数の抗体を含むオリゴマーを対象とし、それらは、抗体と融合するペプチド部分の間の共有又は非共有的相互作用を介して連結される。このようなペプチドは、ペプチドリンカー（ｓｐａｃｅｒｓ）又はオリゴマー化作用を促進する性質を有するペプチドであってもよい。ロイシンジッパー及び抗体に由来するいくつかのポリペプチドは、以下で詳細に記述されているように、抗体オリゴマー化を促進できるペプチドである。

【0129】

具体的な実施形態において、オリゴマーは、２～４個の抗体を含む。オリゴマーの抗体は、以上に記載の任意の形態、例えば、変異体又は断片のような任意の形態であってもよい。好ましくは、該オリゴマーは、エンドセリン受容体結合活性を有する抗体を含む。

【0130】

一実施形態において、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを用いてオリゴマーを製造する。抗体由来ポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の異なる部位と融合するいくつかの異種ポリペプチドの製造は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら，１９９１，ＰＮＡＳＵＳＡ８８：１０５３５、Ｂｙｒｎら，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ３４４：６７７、及びＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈら，ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＦｕｓｉｏｎＰｒｏｔｅｉｎｓ，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ページ１０．１９．１－１０．１９．１１に記述されている。本明細書の一実施形態は、抗エンドセリン受容体抗体のエンドセリン結合断片と抗体のＦｃ領域を融合させることによって産生された二つの融合タンパク質を含む二量体を対象とする。二量体は以下の方式によって製造され得る：例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子を適切な発現ベクターに挿入して融合させ、組換え発現ベクターにより形質転換された宿主細胞に該融合遺伝子を発現し、発現されている融合タンパク質を抗体分子のように組織化することを可能にし、ここで、Ｆｃ部分の間の鎖間ジスルフィド結合により二量体が形成される。

【0131】

本明細書で使用されるように、「Ｆｃポリペプチド」という用語は、抗体Ｆｃ領域に由来する天然及び突然変異タンパク質形態のポリペプチドを含む。また、二量体化を促進するヒンジ領域を含むこのようなポリペプチドの短縮型を含む。Ｆｃ部分（及びそれにより形成されたオリゴマー）を含む融合タンパク質は、タンパク質Ａ又はタンパク質Ｇカラム上でアフィニティークロマトグラフィーを行って精製を容易にする優位性を提供した。

【0132】

ＰＣＴ出願Ｗ０９３／１０１５１（参照により本明細書に組込まれる）における適切なＦｃポリペプチドは、Ｎ末端ヒンジ領域からヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域の天然Ｃ末端に延伸する一本鎖ポリペプチドである。もう一つの利用可能なＦｃポリペプチドは、米国特許５４５７０３５及びＢａｕｍら，１９９４，ＥＭＢＯＪ．１３：３９９２－４００１に記述されているＦｃ突然変異タンパク質である。該突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がロイシンからアラニンに変え、アミノ酸２０がロイシンからグルタミンに変え、アミノ酸２２がグリシンからアラニンに変えることを除いて、Ｗ０９３／１０１５１に示す天然Ｆｃ配列のアミノ酸配列と同じである。該突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対する親和力の低下を示している。他の実施形態において、抗エンドセリン受容体抗体の重鎖及び／又は軽鎖は、抗体重鎖及び／又は軽鎖の可変部分に置換されていてもよい。又は、該オリゴマーは、複数の抗体を含む融合タンパク質であり、リンカーペプチド（ｓｐａｃｅｒｐｅｐｔｉｄｅｓ）を含むか含まない。これらの適切なリンカーペプチドは、米国特許４７５１１８０及び４９３５２３３に記述されている。

【0133】

オリゴマー抗体を製造する別の方法は、ロイシンジッパーの使用に関する。ロイシンジッパードメインは、それらが存在するタンパク質のオリゴマー化作用を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、複数のＤＮＡ結合タンパク質に存在することが最初に発見され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１７５９）、その後に様々な異なるタンパク質中に存在することが発見された。既知のロイシンジッパーにおいて、二量体化又は三量体化可能な天然ペプチド又はその誘導体である。溶解性オリゴマータンパク質の生産に適したロイシンジッパードメインの例は、ＰＣＴ出願Ｗ０９４／１０３０８に記述されており、肺胞界面活性タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーは、Ｈｏｐｐｅら，１９９４，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ３４４：１９１に記述されており、参照により本明細書に組込まれる。それと融合する異種タンパク質の安定的な三量体化を可能にする、修飾されたロイシンジッパーの使用は、Ｆａｎｓｌｏｗら，１９９４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７－７８に記述されている。一方法において、ロイシンジッパーペプチドと融合する抗エンドセリン受容体抗体断片又は誘導体を含む組換え融合タンパク質を適切な宿主細胞中で発現し、溶解性オリゴマー抗エンドセリン受容体抗体断片又はその誘導体を培養物上清から収集する。

【0134】

別の実施形態において、該抗体誘導体は、本明細書に開示されたＣＤＲｓのうちの少なくとも一つを含んでもよい。例えば、一つ又は複数のＣＤＲは、その半減期を増強するために、既知の抗体骨格領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）に組込まれ得るか、又は適切なベクターに結合してもよい。適切なベクターは、Ｆｃ、アルブミン、トランスフェリン及び類似物質を含むが、それらに限らない。これら及び他のベクターは当分野に既知のものである。該結合ＣＤＲペプチドは、モノマー、二量体、四量体又は他の形態であってもよい。一実施形態において、一つ又は複数の水溶性多量体は、結合剤の一つ又は複数の特異的部位、例えば、アミノ末端で結合する。一つの例において、抗体誘導体は、一つ又は複数の水溶性多量体付着物を含み、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール又はポリプロピレングリコールを含むが、それらに限らない。例えば、米国特許第４６４０８３５、４４９６６８９、４３０１１４４、４６７０４１７、４７９１１９２及び４１７９３３７号を参照されたく、いくつかの実施形態において、誘導体は、一つ又は複数のモノメトキシ．ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース又は炭水化物ベースの他のポリマーと、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）．ポリエチレングリコール、ポリオキシエチルポリオール（例えば、グリセロール）及びポリビニルアルコールと、このようなポリマーの混合物とを含む。いくつかの実施形態において、一つ又は複数の水溶性ポリマーは、一つ又は複数の側鎖にランダムに結合する。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、結合剤、例えば、抗体の治療作用を向上させることができる。いくつかのこのような方法は、例えば、米国特許第６１３３４２６号に記述されており、それらはあらゆる目的のために参照により本明細書に組込まれる。

【0135】

理解すべきこととして、本明細書による抗体は、結合特異性を保持している限り、少なくとも一つのアミノ酸置換を有してもよい。そのため、抗体構造の修飾は本明細書の範囲に含まれている。これらは、抗体エンドセリン受容体の結合能力を破壊しないアミノ酸置換を含んでもよく、それは保存的又は非保存的であってもよい。保存的アミノ酸置換は、非天然アミノ酸残基を含んでもよく、それは、通常、生物系合成のではなく、化学ペプチド合成によって組込まれる。これらは、ペプチド模倣体と、逆方向又は逆位形態の他のアミノ酸部分とを含む。保存的アミノ酸置換はまた、非天然残基で天然アミノ酸残基を置換することに関し、このようにして、該部位アミノ酸残基の極性又は電荷に対する作用が小さいか又は全く作用しない。非保存的置換は、あるクラスのアミノ酸又はアミノ酸類似体の一つのメンバーと、異なる物理的性質（例えば、体積、極性、疎水性、電荷）を有する別のクラスのアミノ酸のメンバーとの交換に関してもよい。

【0136】

そして、当業者は、各所望のアミノ酸残基上でアミノ酸置換を含む、試験される変異体を生成することができる。このような変異体は、当業者に既知の活性アッセイを用いてスクリーニングされ得る。このような変異体は、適切な変異体に関する情報を収集することに用いられ得る。例えば、あるアミノ酸残基が、活性の破壊、望ましくない低下又は不適切な活性を引き起こす可能性があると判明した場合、このような変化を有する変異体を回避することができる。換言すれば、これらの従来の試験から収集された情報に基づいて、当業者は、さらなる置換（単独又は他の突然変異との組み合わせ）を回避すべきアミノ酸を容易に確定することができる。

【0137】

当業者は、既知の技術を用いて、本明細書に列挙されるようなポリペプチドの適切な変異体を確定することができる。いくつかの実施形態において、当業者は、活性に重要でない領域を標的化することによって、変化した後に活性を破壊しない分子の適切な領域を同定することができる。いくつかの実施形態において、似ているポリペプチドにおいて保存的である残基又は分子部分を同定することができる。いくつかの実施形態において、生物活性を破壊しないか又はポリペプチド構造に悪影響を及ぼさずに、生物活性又は構造にとって重要な領域を保存的に置換することさえも可能である。なお、当業者は構造を考察することができる．機能的研究は、活性又は構造にとって重要である、似ているポリペプチドにおける残基を同定する。この比較に鑑みて、似ているタンパク質において活性又は構造にとって重要であるアミノ酸残基に対するタンパク質におけるアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、重要であると予測されたこれらのアミノ酸残基のために化学的に似ているアミノ酸置換を選択することができる。

【0138】

当業者はまた、似ているポリペプチドの構造に関連する三次元構造及びアミノ酸配列を分析することができる。このような情報に鑑みて、当業者は、三次元構造にとっての抗体のアミノ酸残基アライメントを予測することができる。いくつかの実施形態において、当業者は、タンパク質表面にあると予測されるアミノ酸残基が、他の分子との重要な相互作用に関与する可能性があるため、著しく変化させないことを選択してもよい。多くの科学出版物は二次構造の予測に力を入れている。Ｍｏｕｌｔ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４２２－４２７、Ｃｈｏｕら，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１３：２２２－２４５、Ｃｈｏｕら，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１１３：２１１－２２２、Ｃｈｏｕら，１９７８，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．ＡｒｅａｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５－１４８、Ｃｈｏｕら，１９７９，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１－２７６及びＣｈｏｕら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７－３８４を参照されたい。なお、現在、コンピュータプログラムを用いて二次構造の予測を補助することができる。例えば、配列同一性が３０％超であるか又は類似性が４０％超である二つのポリペプチド又はタンパク質は、通常、似ている高次構造を有する。最近のタンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の増加は、二次構造の予測可能性を増強し、ポリペプチド又はタンパク質構造における潜在的な折り畳みの数を含む。Ｈｏｌｍら，１９９９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２７：２４４－２４７を参照されたい。（Ｂｒｅｎｎｅｒら，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９－３７６）所定のポリペプチド又はタンパク質には限られた数の折り畳みが存在し、且つ臨界数の構造が確定されると、構造の予測が大幅に正確になることが示されている。

【0139】

二次構造を予測する他の方法は、「テープスレディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７：３７７－８７、Ｓｉｐｐｌら，１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ４：１５－１９と、「プロファイル解析（ｐｒｏｆｉｌｅａｎａｌｙｓｉｓ）」（Ｂｏｗｉｅら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５３：１６４－１７０、Ｇｒｉｂｓｋｏｖら，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８３：１４６－１５９、Ｇｒｉｂｓｋｏｖら，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：４３５５－４３５８と「進化リンケージ（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍ，ｓｕｐｒａ（１９９９），ａｎｄＢｒｅｎｎｅｒ，ｓｕｐｒａ（１９９７）を参照されたい）とを含む。いくつかの実施形態において、抗体変異体は、グリコシル化変異体を含み、ここで、母ポリペプチドのアミノ酸配列に比べて、グリコシル化部位の数及び／又はタイプが変えられた。いくつかの実施形態において、変異体は、天然タンパク質に比べて、より多いか又はより少ないＮ連結グリコシル化部位を有する。又は、該配列の置換を除去することにより、既存のＮ連結糖鎖を除去することができる。また、Ｎ連結糖鎖の再配列も提供し、ここで、一つ又は複数のＮ連結糖鎖部位（通常、天然に存在するものである）を除去し、一つ又は複数の新たなＮ連結部位を作った。他の好適な抗体変異体は、システイン変異体を含み、母アミノ酸配列に比べて、それにおいて一つ又は複数のシステイン残基は、欠失しているか又は別のアミノ酸（例えば、セリン）により置換された。システイン変異体は、抗体が生物活性配座に折り畳まれなければならない場合（例えば、溶解性封入体を単離した後）に用いられ得る。システイン変異体は、通常、天然タンパク質に比べて、少ないシステイン残基を有し、通常、ペアリングされていないシステインによる相互作用を最小化するために、偶数個のシステインを有する。

【0140】

当業者は、このような置換が必要である場合に、所望のアミノ酸置換（保存的又は非保存的）を確定することができる。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ヒトエンドセリン受容体抗体の重要な残基を同定するか、又は本明細書に記載のヒトエンドセリン受容体抗体の親和力を向上もしくは低下させるためのものであってもよい。

【0141】

いくつかの実施形態によれば、好適なアミノ酸置換は以下のとおりである：（１）タンパク質の加水分解感受性を低下させ、（２）酸化感受性を低下させ、（３）タンパク質複合体を形成する結合親和力を変化させ、（４）結合親和力を変化させ、及び／又は（４）このようなポリペプチドにおける他の物理化学的又は機能的性質を付与又は修飾する。いくつかの実施形態によれば、天然に存在する配列（いくつかの実施形態において、分子間接触が形成されたドメイン以外のポリペプチド部分）において、単一又は複数のアミノ酸置換（いくつかの実施形態において、保存的アミノ酸置換）を行ってもよい。いくつかの実施形態において、保存的アミノ酸置換は、通常、親配列の構造特性を実質的に変化させない（例えば、置換アミノ酸は、親配列に存在する螺旋を破壊するか又は親配列を特徴づける他のタイプの二次構造を妨害してはいけない）。当分野に承認されるポリペプチド二次及び三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編集，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ（１９８４）、ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏＰｒｏｔｅｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＢｒａｎｄｅｎａｎｄＴｏｏｚｅ編集，ＧａｒｌａｎｄＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９１）、及びＴｈｏｒｎｔｏｎら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ３５４：１０５に記述されており、参照により本明細書に組込まれる。

【0142】

いくつかの実施形態において、本明細書による抗体は、多量体、脂質又は他の部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）と化学的に結合することができる。

【0143】

抗原結合試薬は、本明細書に記述されている少なくとも一つのＣＤＲｓを含んでもよく、それは生体適合性骨格構造に組み込まれる。一つの例において、該生体適合性骨格構造は、配座安定化構造支持体又は骨格又は足場を形成するのに十分なポリペプチド又はその一部を含み、それは、抗原に結合できる一つ又は複数のアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲｓ、可変領域など）を限定された表面領域にディスプレイすることができる。このような構造は、天然に存在するポリペプチドもしくはポリペプチド「折り畳み」（構造モチーフ）であってもよいか、又は天然ポリペプチド又は折り畳みに対して、一つ又は複数の修飾、例えば、アミノ酸付加、欠失又は置換を有してもよい。これらの足場は、任意の種（又は複数の種）のポリペプチドに由来してもよく、例えば、ヒト、他の哺乳動物、他の脊椎動物、無脊椎動物、細菌又はウイルスである。

【0144】

生体溶解性骨格構造は、通常、免疫グロブリンドメインではなく、タンパク質足場又は骨格に基づいている。例えば、フィブロネクチン、アンカータンパク質、リポカリン（ｌｉｐｏｃａｌｉｎ）、新抑癌タンパク質、シトクロムｂ、ＣＰ１ジンクフィンガータンパク質、ＰＳＴ１、コイルドコイル、ＬＡＣＩ－Ｄ１、Ｚドメイン及びテンダミスタットドメインに基づくものを用いてもよい（例えば、Ｎｙｇｒｅｎ及びＵｈｌｅｎ，１９９７，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＢｉｏｌｏｇｙ７：４６３－４６９を参照されたい）。

【0145】

なお、当業者であれば、適切な結合剤が、本明細書に具体的に開示されたように、これらの抗体の一部、例えば、一つ又は複数の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むことを認識するであろう。少なくとも一つの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、該抗体が非置換ＣＤＲの結合特異性を保持する限り、少なくとも一つのアミノ酸置換を有する。該抗体の非ＣＤＲ部分は、非タンパク質分子であってもよく、ここで、該結合剤は、本明細書に開示された抗体とヒトＥＴ_AＲとの結合を交差遮断し、及び／又は該受容体を介したエンドセリンシグナル伝達を抑制する。該抗体の非ＣＤＲ部分は、非タンパク質分子であってもよく、ここで、該抗体は、競合結合アッセイにおいて、少なくとも抗体Ａ－１／Ａ－２のうちの一つに示されるものと似ている、ヒトＥＴ_AＲペプチドとの結合タイプを示し、及び／又はエンドセリンの活性を中和する。抗体の非ＣＤＲ部分は、アミノ酸で構成されてもよく、ここで、該抗体は、組換え結合タンパク質又は合成ペプチドであり、且つ該組換え結合タンパク質は、本明細書に開示された抗体とヒトＥＴ_AＲとの結合を交差遮断し、及び／又はインビボ又はインビトロエンドセリン活性を中和する。抗体の非ＣＤＲ部分は、アミノ酸で構成されてもよく、ここで、該抗体は組換え抗体であり、且つ該組換え抗体は、競合結合アッセイにおいて、少なくとも抗体Ａ－１／Ａ－２のうちの一つに示されるものと似ている、ヒトＥＴ_AＲペプチドとの結合タイプを示し、及び／又はエンドセリンシグナル伝達を中和する。

【0146】

核酸

【0147】

一態様では、本明細書は、単離された核酸分子を提供する。該核酸分子は、例えば、抗体の全て又は一部をコードするポリヌクレオチドを含み、例えば、本明細書の抗体の一本の鎖もしくは二本の鎖、又はその断片、誘導体、突然変異タンパク質もしくは変異体、ハイブリダイゼーションプローブとして用いるのに十分なポリヌクレオチド、ＰＣＲプライマー又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定、分析、突然変異又は増幅させるための配列決定プライマー、ポリヌクレオチドの発現を抑制するためのアンチセンス核酸及びその互補的配列である。該核酸は、任意の長さであってもよい。例えば、それらの長さは５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１０００、１５００、３０００、５０００又はそれ以上のヌクレオチドであってもよく、及び／又は一つ又は複数の追加の配列、例えば、調節配列を含み、及び／又は大きな核酸、例えば、ベクターの一部である。該核酸は、一本鎖又は二本鎖であってもよく、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡヌクレオチド及びその人工変異体（例えば、ペプチド核酸）を含む。

【0148】

ＥＴ_AＲ抗原免疫されたマウスＢ細胞から、抗体ポリペプチド（例えば、重鎖又は軽鎖、可変ドメインのみ又は完全長）をコードする核酸を単離することができる。該核酸は、従来の方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離され得る。

【0149】

重鎖及び軽鎖可変領域をコードする核酸配列は以上に示すとおりである。熟練した当業者は、遺伝暗号の縮退性のため、本明細書に開示された各ポリペプチド配列がより多くの他の核酸配列によりコードされ得ることを理解するであろう。本明細書は、本明細書による抗体をコードする各縮退ヌクレオチド配列を提供する。

【0150】

本明細書は、具体的なハイブリダイゼーション条件下で他の核酸（例えば、任意のＡ－１／Ａ－２のヌクレオチド配列を含む核酸）とハイブリダイズする核酸をさらに提供する。核酸をハイブリダイズする方法は当業者によく知られている。例えば、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ（１９８９），６．３．１－６．３．６を参照されたい。本明細書で定義されるように、例えば、中程度にストリンジェントな条件では、５Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）を含む予洗浄溶液、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、約５０％カルボキサミドのハイブリダイゼーション緩衝液、６ＸＳＳＣ及び５５℃のハイブリダイゼーション温度（又は似ている他のハイブリダイゼーション溶液、例えば、約５０％カルボキサミドを含み、４２℃でハイブリダイズする）を用い、且つ溶出条件が６０℃であり、０．５ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では、６ＸＳＳＣにおいて４５℃でハイブリダイズし、そして６８℃で０．１ＸＳＳＣ、０．２％ＳＤＳにおいて一回又は複数回洗浄する。なお、当業者は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を制御してハイブリダイゼーションストリンジェント度を増加又は低下させることができ、このように、互いに少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８又は９９％相同であるヌクレオチド配列を含む核酸は、通常、依然として互いにハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を与える基本的なパラメータ及び適切な条件の設計のガイドは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ，１９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，第９及び１１章、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌら編集，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，セクション２．１０及び６．３－６．４にリストされ、）当業者により、例えば、ＤＮＡの長さ及び／又は塩基構成に基づいて容易に確定され得る。突然変異によって核酸に変化を導入し、これにより、それにコードされたポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質）のアミノ酸配列の変化を引き起こすことができる。当分野に既知の任意の技術を用いて突然変異を導入してもよい。一実施形態において、例えば、部位特異的突然変異誘発スキームを用いて、一つ又は複数の具体的なアミノ酸残基を変化させる。別の実施形態において、例えば、ランダム突然変異誘発スキームを用いて、ランダムに選択された一つ又は複数の残基を変化させる。それは、以下に生成されるかにかかわらず、突然変異ポリペプチドを発現し、所望の性質をスクリーニングすることができる。

【0151】

それにコードされたポリペプチドの生物学的活性を著しく変化させることなく、突然変異を核酸に導入することができる。例えば、必須ではないアミノ酸残基位置のアミノ酸置換を引き起こすヌクレオチド置換を行ってもよい。一実施形態において、本明細書においてＬ－１～Ｌ－２及びＨ－１～Ｈ－２によるヌクレオチド配列又はその断片、変異体もしくは誘導体を突然変異させ、このようにそれは、本明細書に示すＬ－１～Ｌ－２及びＨ－１～Ｈ－２を含むアミノ酸残基の一つ又は複数の欠失又は置換をコードし、配列が異なる二つ又はそれ以上の残基になる。別の実施形態において、突然変異誘発作用により、本明細書に示すＬ－１～Ｌ－２及びＨ－１～Ｈ－２の一つ又は複数のアミノ酸残基の近傍に一つのアミノ酸を挿入して、配列が異なる二つ又はそれ以上の残基になる。又は、一つ又は複数の突然変異を核酸に導入して、それによりコードされたポリペプチドの生物学的活性（例えば、ＥＴ_AＲへの結合）を選択的に変化させることができる。例えば、該突然変異は、生物学的活性を数量的又は性質的に変化させることができる。量的変化の例としては、該活性の増加、低下又は除去が挙げられる。質的変化の例としては、抗体の抗原特異性を変化させることが挙げられる。

【0152】

別の態様では、本明細書は、プライマー又は本明細書の核酸配列を検出するハイブリダイゼーションプローブとして用いられることに適した核酸分子を提供する。本明細書の核酸分子は、本明細書の完全長ポリペプチドをコードする核酸配列の一部のみを含んでもよく、例えば、プローブ又はプライマー又は本明細書のポリペプチド活性部分をコードする断片（例えば、ＥＴ_AＲ結合部分）として用いられ得る断片である。

【0153】

本明細書の核酸配列に基づくプローブは、該核酸又は似ている核酸、例えば、本明細書のポリペプチドをコードする転写物を検出することに用いられてもよい。該プローブは、標識基、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素又は酵素補因子を含んでもよい。このようなプローブは、該ポリペプチドを発現する細胞を同定することに用いられてもよい。

【0154】

別の態様では、本明細書は、本明細書のポリペプチド又はその一部をコードする核酸を含むベクターを提供する。ベクターの例は、プラスミド、ウイルスベクター、非遊離遺伝子哺乳動物ベクター及び発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターを含むが、それらに限らない。

【0155】

本明細書の組換え発現ベクターは、該核酸の宿主細胞での発現に適した形態の本明細書の核酸を含んでもよい。該組換え発現ベクターは、一つ又は複数の調節配列を含み、発現するための宿主細胞に基づいてスクリーニングし、それは、該予め発現された核酸配列に作動可能に連結される。調節配列は、ヌクレオチド配列の複数種類の宿主細胞における構成型発現をガイドするもの（例えば、ＳＶ４０早期遺伝子増強剤、ラウス肉腫ウイルスプロモーター及びサイトメガロウイルスプロモーター）と、いくつかの宿主細胞のみにおけるヌクレオチド配列の発現をガイドするもの（例えば、組織特異的調節配列、Ｖｏｓｓら，１９８６，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：２８７，Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６：１２３７を参照されたく、その内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる）と、ヌクレオチド配列の、具体的な処理又は条件に応答する誘導型発現をガイドするもの（例えば、哺乳動物細胞における金属チオニンプロモーター及び原核及び真核系の両方におけるテトラサイクリン反応（ｔｅｔ－ｓｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）プロモーター及び／又はストレプトマイシン反応プロモーター（上記））とを含む。当業者は、発現ベクターの設計が、例えば、形質転換するための宿主細胞の選択、必要なタンパク質発現レベルなどの要素に依存することを理解するであろう。本明細書の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、これにより本明細書に記載の核酸によりコードされるタンパク質又はペプチドを生産することができ、融合タンパク質又はペプチドを含む。

【0156】

別の態様では、本明細書は、本明細書の発現ベクターを導入できる宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の原核又は真核細胞であってもよい。原核宿主細胞は、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば、大腸菌又はバシラスを含む。より高次の真核細胞は、昆虫細胞、酵母細胞及び哺乳動物由来の確立された細胞株を含む。適切な哺乳動物宿主細胞株の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はそれらの誘導体、例えば、ＶｅｇｇｉｅＣＨＯ及び無血清培地中で増殖する関連細胞株（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２８：３１）又はＣＨＯ株ＤＸＢ－１１が挙げられ、それはＤＨＦＲが欠失している（Ｕｒｌａｕｂら，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６－２０を参照されたい）。他のＣＨＯ細胞株は、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－６１）と、ＥＭ９（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１８６１）と、ＵＶ２０（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１８６２）とを含み、他の宿主細胞は、ザル腎臓細胞のＣＯＳ－７株（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら，１９８１，Ｃｅｌｌ２３：１７５を参照されたい）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ－１６３）、ＡＭ－１／Ｄ細胞（米国特許配列番号６２１０９２４に記述されている）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣＣＲＬ－１０）細胞株、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ１に由来するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株（ＡＴＣＣＣＣＬ－７０）（ＭｃＭａｈａｎら，１９９１，ＥＭＢＯＪ．１０：２８２１を参照されたい）、ヒト胚腎細胞、例えば、２９３、２９３ＥＢＮＡ又はＭＳＲ２９３、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣ０１０２０５細胞、形質転換された他の霊長類動物細胞株、正常な二倍体細胞、初期組織インビトロ培養物に由来する細胞株、初期移植体、ＨＬ－６０、Ｕ９３７、ＨａＫ又はＪｕｒｋａｔ細胞を含む。細菌、真菌、酵母及び哺乳細胞宿主に用いられる適切なクローニング及び発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓら（ＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５）に記述されている。

【0157】

ベクターＤＮＡは、従来の形質転換又はトランスフェクト技術によって原核又は真核細胞に導入され得る。安定的な哺乳動物トランスフェクトの場合、用いられる発現ベクター及びトランスフェクト技術に依存し、ごく一部の細胞のみが外因性ＤＮＡをそれらのゲノムに取り込むことができることが知られている。これらのインテグロンを同定しスクリーニングするために、通常、スクリーニングマーカー（例えば、抗生素抗性）をコードする遺伝子を、目的遺伝子とともに宿主細胞に導入する。好適なスクリーニングマーカーは、薬物（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン及びメトトレキサート）に抗性を付与できるものを含む。他の方法において、薬物スクリーニングによって、核酸に導入された安定的なトランスフェクト細胞を含むことを同定することができる（例えば、スクリーニング遺伝子が組込まれた細胞は生存し、他の細胞は死滅する）。

【0158】

ポリペプチド発現を向上させる条件下で、形質転換された細胞を培養してもよく、ポリペプチドは、従来のタンパク質精製方法によって回収され得る。該精製方法の一つは以下の実施例に記述されている。本明細書において予め用いられたポリペプチドは、実質的に相同な組換え哺乳動物抗エンドセリン受容体抗体ポリペプチドを含み、それには内因性物質の混在が実質的にない。

【0159】

抗体の活性

【0160】

一実施形態において、本明細書による抗体は、エンドセリン受容体に特異的に結合し、シグナル伝達を抑制する。別の実施形態において、本明細書は、ヒトエンドセリン受容体に特異的に結合できるマウス抗体又はヒト化抗体を提供した。このような抗体は、エンドセリンシグナル伝達を減少させるか又は中和することができる拮抗又は中和抗体を含む。

【0161】

一実施形態において、本明細書による抗体がヒトエンドセリン受容体ＥＴ_AＲに結合する時のＫ_dは、約０．０１ｎＭ～１０００ｎＭ、０．１ｎＭ～５００ｎＭ、０．５ｎＭ～２００ｎＭ、１ｎＭ～２００ｎＭ、又は１０ｎＭ～１００ｎＭである。別の実施形態において、本明細書による抗体がヒトエンドセリン受容体ＥＴ_AＲに結合する時のＫ_dは、約１ｎＭ～２００ｎＭである。別の実施形態において、本明細書による抗体がヒトエンドセリン受容体ＥＴ_AＲに結合する時のＫ_dは、約１０ｎＭ～１００ｎＭである。別の実施形態において、本明細書による抗体がヒトエンドセリン受容体ＥＴ_AＲに結合する時のＫ_dは、約１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、又は１００ｎＭである。

【0162】

一実施形態において、本明細書による抗体がヒトエンドセリンシグナル伝達を低下させるＩＣ₅₀値は、約０．０１ｎＭ～５００ｎＭ、０．１ｎＭ～２００ｎＭ、０．５ｎＭ～２００ｎＭ、１ｎＭ～２００ｎＭ、又は１０ｎＭ～１００ｎＭである。別の実施形態において、本明細書による抗体がヒトエンドセリンシグナル伝達を低下させるＩＣ₅₀値は、約１ｎＭ～２００ｎＭである。別の実施形態において、本明細書による抗体がヒトエンドセリンシグナル伝達を低下させるＩＣ₅₀値は、約１０ｎＭ～１００ｎＭである。別の実施形態において、本明細書による抗体がヒトエンドセリンシグナル伝達を低下させるＩＣ₅₀値は、約１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、又は１００ｎＭである。

【0163】

一実施形態において、本明細書によるＥＴ_AＲ抗体は、ヒトエンドセリン受容体ＥＴ_AＲに結合する場合、以下に列挙される一つ又は複数の性質を有する：
ａ．前記参照抗体と同じＫ_dでヒトエンドセリン受容体ＥＴ_AＲに結合し、
ｂ．前記参照抗体と同じＩＣ₅₀でヒトエンドセリン受容体ＥＴ_AＲのエンドセリン活性化を抑制し、
ｃ．ヒトエンドセリン受容体ＥＴ_AＲにおいて、前記参照抗体と結合について交差競合する。

【0164】

一態様では、前記参照抗体は、軽鎖可変ドメインアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１３８と重鎖可変ドメインアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１６６との組み合わせを含む。別の態様では、前記参照抗体は、モノクローナル抗体Ａ－１、Ａ－２、Ａ－７、Ａ－９、又はＡ－１２である。

【0165】

本明細書において、「実質的に似ている」という用語は、参照抗体のＩＣ₅₀又はＫ_dと比較可能であるか、又は参照抗体のＩＣ₅₀又はＫ_b値の約２００％、１８０％、１６０％、１５０％、１４０％、１２０％、１１０％、１００％、９９％、９８％、９７％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、又は５０％であることを指す。一実施形態において、参照抗体は、例えば、重鎖と軽鎖との組み合わせＬ１Ｈ１又はＬ２Ｈ２を有する抗体を含む。別の実施形態において、参照抗体は、ＥＴ_AＲ抗体Ａ－１を含む。

【0166】

適応症

【0167】

一実施形態において、ＥＴ_AＲ抗体の生物学的活性の変化は、カルシウムフラックス検出の方法によって、ＥＴ_AＲをインビトロ抑制するＥＴ_AＲ抗体の機能を検出することである。

【0168】

一実施形態において、ＥＴ_AＲ抗体のインビボ生物学的活性は、急性腎障害モデル及び糖尿病性腎症動物モデルによって、ＥＴ_AＲ抗体の腎臓疾患に対する治療効果を検出することである。

【0169】

本発明は、ヒトエンドセリン受容体に特異的に結合することができ、ＥＴ－１及びＥＴ_AＲのシグナルの伝達を遮断することによって、糖尿病性腎症、慢性腎疾患及びタンパク尿又は糸球体濾過率の低下を伴う疾患の治療を達成する作用を提供する。

【0170】

治療方法

【0171】

本明細書において、「被験体」という用語は、ヒトを含む哺乳動物を指し、「患者」という用語と同義的に使用される。「治療」という用語は、少なくとも一つの症状又は障害の他の態様を軽減又は予防するか、又は疾患の重症度を軽減することなどを含む。本明細書による抗体は、完全な治癒効果をもたらすか、又は疾患の全ての症状もしくは発現を根絶しなくても、有効な治療剤を構成することができる。関連分野で一般的に認められているように、治療剤としての薬物は、所定の疾患状態の重症度を低下させることができるが、疾患の全ての発現を除去しなくても有効な治療剤であると認められる。同様に、予防投与治療は、症状の出現を予防するのに完全に有効でなくても、有効な予防剤を構成することができる。疾患の影響を（例えば、その症状の数又は重症度を低減するか、又は別の治療効果を向上させるか、又は別の有効な作用を生じさせることにより）低減するか、又は被験体における疾患の発生もしくは重症化の可能性を低減するだけで十分である。本明細書の一実施形態は、特定の障害の重症度を示す指示剤のベースラインレベルより高い、持続的改善を誘導するのに十分な量及び時間で抗体を患者に投与することを含む方法に関する。

【0172】

薬物組成物は、非経口、局所又は吸入投与を含むがそれらに限らない任意の適切な技術を用いることができる。注射の場合には、例えば、関節内、静脈内、筋肉内、損傷領域内、腹膜内又は皮下経路を介して、迅速な注射又は連続的な注入により、医薬組成物を投与することができる。例えば、経皮投与及び包埋剤持続放出投与のような、疾患又は損傷部位への局所的投与が企図され得る。吸入投与は、例えば、鼻腔又は口腔内吸入、スプレーを用いた、エアゾールの形態での抗体への吸入などを含む。他の選択としては、錠剤、シロップ剤又はトローチ剤を含む口腔用製剤が挙げられる。

【0173】

本明細書による抗体は、一つ又はそれ以上の他の成分、例えば、生理学的に許容されるベクター、補助原料又は希釈剤の組成物の形態で投与されることが有利である。組成物は、任意に、以下に記載の一つ又はそれ以上の生理学的活性剤を追加的に含んでもよい。複数の具体的な実施形態において、組成物は、一つ又は複数の本明細書による抗体（例えば、マウス抗体又はヒト化抗体）に加えて、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つの生理学的活性剤を含む。

【0174】

投与用量及び頻度は以下の要因によって変化することがある：投与経路、使用する具体的な抗体、治療する疾患の性質及び重症度、症状が急性か慢性か及び患者の体積及び全体的な症状。適切な用量は、当分野において周知の方法によって確定され得、例えば、臨床試験において用量拡大研究を含む。

【0175】

本明細書による抗体は、例えば、一定の期間にわたって、一定の間隔で一回又は複数回規律的に投与され得る。具体的な実施形態において、マウス抗体又はヒト化抗体を、少なくとも一ヶ月以上、例えば一ヶ月、二ヶ月又は三ヶ月、又はさらに不定の期間に一回投与する。慢性症状の治療には、長期治療が最も効果的であることが多い。しかし、急性症状の治療には、例えば、１週間から６週間の短期投与が十分である。通常、選択された徴候又は指示剤がベースラインレベルよりも高い医学的に関連する改善度が患者に現れるまでヒト抗体を投与する。

【0176】

抗体、例えば、ヒト抗体を用いた治療の前、治療中及び／又は治療後に、患者の症状の任意の変化を監視することができる。いくつかの障害の場合、タンパク尿、糸球体濾過率の変化は、例えば、疾患の進行などの要素によって変化することがある。

【0177】

本明細書の方法及び組成物の具体的な実施形態は、例えば、抗体及び一つ又は複数のエンドセリンアンタゴニスト、二つ又はそれ以上の本明細書による抗体、又は本発明の抗体及び一つ又はそれ以上の他のエンドセリンアンタゴニストの使用に関する。更なる実施形態において、抗体は、単独で又は患者を苦しめる症状を治療するための他の薬剤と組み合わせて投与される。これらの薬剤の例としては、タンパク質及び非タンパク質薬物が挙げられる。複数の薬物を併用投与する場合、その用量は、当分野で周知のように、それに応じて調整されるべきである。「併用投与」の併用療法は、同時投与に限定されず、少なくとも一つの他の治療剤を患者に投与することに関する治療コースにおいて、抗原及びタンパク質を少なくとも一回投与する治療スキームをさらに含む。

【0178】

本明細書は、ヒトエンドセリン受容体に特異的に結合できる抗体に関連する組成物、キット及び方法を提供する。また、核酸分子及びその誘導体及び断片を提供し、それは、エンドセリン受容体に結合するポリペプチドの全て又は一部をコードするポリヌクレオチド、例えば、抗エンドセリン受容体抗体、抗体断片又は抗体誘導体の全て又は一部をコードする核酸を含む。本明細書は、このような核酸を含むベクター及びプラスミド、及びこのような核酸及び／又はベクター及びプラスミドを含む細胞及び細胞株をさらに提供する。提供される方法は、例えば、ヒトＥＴ_AＲに結合する抗体、例えば、抗ＥＴ_AＲ抗体を製造、同定又は単離する方法、該抗体がＥＴ_AＲに結合するか否かを測定する方法を含む。

【0179】

以下、具体的な実施例を通じて、本明細書の技術案についてさらに具体的に説明する。

【0180】

具体的な実施例：

【0181】

本明細書において、特に言及しない限り、使用される原料及び機器などは、いずれも市販されているか、又は当分野で一般的に使用されている。下記実施例における方法、特に断らない限り、いずれも当分野の従来の方法である。

【0182】

１．安定型免疫用抗原細胞株の構築

【0183】

ＣＨＯ－ＤＨＦＲ－細胞を６ウェルプレートに接種し、２４時間培養した後、ｈＥＴ_AＲ遺伝子（ヌクレオチド配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１に示すとおりであり、アミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すとおりである）がクローニングされているｐＩＲＥＳプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を６ウェルプレート中の細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社が推薦したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００のトランスフェクト条件に従って行われた。４８時間後、培養液を、１０ｎＭＭＴＸ（メトトレキサート）含有の完全培地に交換し、３日毎に交換した。二週間ほど培養すると、安定的に増殖したクローニングが現れた。細胞コロニーを消化し分散させ、細胞を継代し、細胞を培養し続けた。継代細胞が５０％の治癒度まで増殖した場合、ＭＴＸの濃度を、１０ μＭになるまで、徐々に向上させて個別加圧スクリーニングを行った。ポリクローナルＥＴ_AＲ抗体（Ａｂｃａｍ）を利用して、構築された安定型細胞株に対して夫々ＦＡＣＳ検出を行い、ＦＡＣＳ検出結果に応じて加圧後の細胞集団を同定した。スクリーニング後のＣＨＯ－ＤＨＦＲ－ｈＥＴ_AＲ細胞膜には、大量のｈＥＴ_AＲが発現していた。最後に、サブクローニング及び更なる同定によると、６株のＥＴ_AＲ細胞は、高発現の安定型細胞株であった。

【0184】

２．抗体の製造

【0185】

フロイントアジュバント中で乳化したＣＨＯ－ＤＨＦＲ－ｈＥＴ_AＲ全細胞を、２×１０⁶細胞／匹の用量でＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）に皮下注射した。２週間後、不完全フロイントアジュバントで免疫原を乳化し、免疫マウスを強化し、その後に週に一回強化した。合計６回の免疫を経た後、尾を切ることで採血した。血清を遠心単離し、ＦＡＣＳで血清力価を検出した。適切な抗体力価に達した場合、マウスを断首により屠殺し、無菌状態で脾臓細胞を取った。また、増殖状態が対数増殖期にあるＳＰ２／０細胞を収集し、２０００ｒｐｍで、細胞を３ｍｉｎ遠心分離し、沈殿した細胞を無血清で再懸濁まで培養し、もう一度遠心分離し－再懸濁させ、計数した。ＳＰ２／０：脾臓細胞≧１：１であるように脾臓細胞とＳＰ２／０細胞を混合し、混合後にさらに３回「洗浄－遠心分離」した。－最後の遠心分離後の細胞沈殿を散らし、１ｍＬの予め温めたＰＥＧ－１３５０を滴下して加え（３０ｓ内に滴下を完了する）、上下に１分間ブロー吸引し、３０ｍＬの予熱した無血清培地をゆっくりと加えて、ＰＥＧの融合作用を終了した。次に１５００ｒｐｍで、５ｍｉｎ遠心分離し、細胞沈殿を散らし、融合培地を加え、１ウェル当たり２００００個の脾臓細胞及び５０００個のフィーダー細胞を、１ウェル当たり１００μＬの培地で９６ウェルプレートに敷いた。融合後のハイブリドーマ細胞をフィーダー細胞とともに９６ウェルプレート中で培養し、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、メトトレキサート及びチミジン）スクリーニングを行って、非融合細胞を除去した。１０日後、培養プレートにおけるハイブリドーマ細胞上清を採取し、ＥＬＩＳＡ検出を行った。

【0186】

３．全細胞ＥＬＩＳＡスクリーニング

【0187】

ＣＨＯ－ＤＨＦＲ－ｈＥＴ_AＲを過剰発現するｈＥＴ_AＲ細胞、及びｈＥＴ_AＲを発現しないＣＨＯ－ＤＨＦＲ－細胞をそれぞれ９６ウェルプレートに接種した。細胞が９０％の治癒度まで増殖した場合、細胞培養上清を除去し、二回ＰＢＳ洗浄し、１００ μＬ１００％メタノールを加え、４℃で１０ｍｉｎ固定した。次に１００ μＬの新鮮に調合した０．６％Ｈ₂Ｏ₂－ＰＢＳを加え、室温で２０ｍｉｎ処理し、２回ＰＢＳ洗浄した。ＰＢＳ－１％ＢＳＡブロックを経た後、ハイブリドーマ細胞上清を加え、４℃で９０ｍｉｎインキュベートした。複数回洗浄した後、１ウェル当たり１００ μＬの希釈されたＧｘＭ－ＨＲＰ－Ｆｃ二次抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、３７℃で０．５ｈｒインキュベートした。５回洗浄した後、１ウェル当たり１００ μＬのＴＭＢ発色基質を加え、３７℃で１５ｍｉｎ反応させ、２ＭＨ₂ＳＯ₄を加えて発色を終止させ、ＯＤ₄₅₀値を読み取った。陽性対照は免疫マウスの血清であり、陰性対照は細胞培地上清である。ＥＬＩＳＡによる初期検出により、抗ｈＥＴ_AＲ抗体を分泌する複数の陽性ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングした。抗ｈＥＴ_AＲ抗体を分泌するこれらのハイブリドーマ株を選択し、抗ｈＥＴ_AＲ抗体を安定的に分泌できる細胞株を得るためにクローニングを行った。最後にハイブリドーマ細胞により分泌された抗体上清を選択してＦＡＣＳ検証を行った。

【0188】

４．抗体遺伝子のクローニング及びサブクローニング

【0189】

抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を収集し、ＱＩＡＧＥＮのｍＲＮＡ抽出キットの操作規程に従い、ハイブリドーマ細胞のｍＲＮＡを抽出した。そして、抽出されたｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、逆転写プライマーはマウス軽、重鎖定常領域の特異的プライマーであり、重鎖逆転写プライマーは（５’－ＴＴＴＧＧＲＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣ
－３’）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９９）であり、軽鎖逆転写プライマーは（５’－
ＴＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡ－３’）（ＳＥＱＩＤＮＯ：２００
）及び（５’－ＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡ－３’）（ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：２０１）である。ＲＴ－ＰＣＲの反応条件は、２５℃ ５ｍｉｎ、５０℃ ６０ｍｉｎ、７０℃ １５ｍｉｎである。逆転写されたｃＤＮＡを０．１ｍＭのＴＥで５００ μＬに希釈し、限外濾過遠心管（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－０．５）に加え、２０００ｇを１０ｍｉｎ遠心分離し、濾液を捨て、５００ μＬの０．１ｍＭのＴＥを加え、２０００ｇを１０ｍｉｎ遠心分離し、濾液を捨て、調製管を新な遠心管中で逆さにし、２０００ｇを１０ｍｉｎ遠心分離し、精製されたｃＤＮＡを得て、１０ μＬの精製されたｃＤＮＡをテンプレートとして、４ μＬの５ｘｔａｉｌｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、４ μＬのｄＡＴＰ（１ｍＭ）及び１０Ｕの末端トランスフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、市販）を加えた後に均一に混合し、３７℃で５ｍｉｎインキュベートした後に６５℃で５ｍｉｎインキュベートし、そして、ＰｏｌｙＡテールが添加されたｃＤＮＡをテンプレートとし、抗体の軽、重鎖可変領域遺伝子をＰＣＲ増幅させた。上流プライマーはいずれもＯｌｉｇｏｄＴであり、重鎖下流プライマーは（５’－ＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣ－３’）（ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：２０２）及び（５’－ＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＴＣＣＡＴＡＧＴＴＣＣ－３’
）（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０３）であり、軽鎖下流プライマーは（５’－ＡＣＴＣ
ＧＴＣＣＴＴＧＧＴＣＡＡＣＧＴＧ－３’）（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０４）である。
ＰＣＲ反応条件は、９５℃ ５ｍｉｎ、９５℃ ３０ｓ、５６℃ ３０ｓ、７２℃ １ｍｉｎ４０ｃｙｃｌｅｓ、７２℃ ７ｍｉｎであり、ＰＣＲ生成物をＰＭＤ１８－Ｔベクター（ＴａｋａｒａＢｉｏ）に連結した後に配列決定を行った。クローニングの抗体配列は表２に示すとおりである。

【0190】

配列決定して得られた抗体のＤＮＡ配列に基づいてＰＣＲプライマーを設計することによって、完全な軽鎖、重鎖シグナルペプチド及び可変ドメイン及びマウスＩｇＧ１定常領域を発現ベクターｐＴＭ５に連結した。

【0191】

５．抗体のヒト化及び最適化

【0192】

まず、スクリーニングされたマウス抗体の軽、重鎖可変領域配列を得て、ＮＣＢＩのオンライン抗体可変領域配列アライメントツールＩｇＢｌａｓｔを用いて、入力された抗体可変領域配列と相同なヒト抗体生殖細胞株遺伝子配列（ＩｇＧｅｒｍｌｉｎｅＧｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）を検索し、ＣＤＲ配列を除いて、相同性の最も高いヒト遺伝子配列をテンプレート配列としてＣＤＲ移植を行い、ヒト化抗体可変領域配列を得た。アウトソーシングによってヒト化抗体軽、重鎖の遺伝子を合成した。配列に基づいてＰＣＲプライマーを設計し、合成配列の５’末端及び３’末端に適切な制限エンドヌクレアーゼ部
位を導入し、ＰＣＲ増幅後にそれをヒトＩｇＧ２又はＩｇＧ４定常領域配列とつなぎ合わせることによって完全な組換えヒト化抗体配列を得た。組換え抗体は、ステップ７に従って発現し、ステップ９におけるＦＡＣＳ技術によってＥＴ_AＲに対する親和力を検証した。ＥＴ_AＲに対する親和力が保持されたヒト化抗体集団において、最も優れた親和力を示す抗体を選んで、部位特異的突然変異によって、その可変領域配列をさらに改造し、ＥＴ_AＲに対するその親和力をさらに向上させた。

【0193】

６．ＥＴ_AＲヒト化抗体の遺伝子クローニング及びサブクローニング

【0194】

最適化されたヒト化抗体重鎖及び軽鎖可変領域配列は金斯瑞生物科技有限公司により合成され、合成時に、重鎖可変領域の５’末端にＮｈｅ１酵素切断部位を持ち込み、３’末
端にＳａｌ１酵素切断部位を持ち込むことによって、完全な重鎖可変領域配列を、既に重鎖定常領域に入れた発現ベクターｐＴＭ５に連結し、同様に、合成時に軽鎖可変領域の５’末端にＮｈｅ１酵素切断部位を持ち込み、３’末端にＢｓｉｗ１酵素切断部位を持ち込
むことによって、完全な軽鎖可変領域配列を、既に軽鎖定常領域に入れた発現ベクターｐＴＭ５に連結した。

【0195】

７．抗体の瞬時的発現

【0196】

５×１０⁵／ｍＬの懸濁ＨＥＫ２９３又はＣＨＯ発現細胞株をスピナーフラスコに接種し、３７℃で、５％ＣＯ₂により２４時間回転培養した後、密度が１×１０⁶／ｍＬに達してトランスフェクトに用いた。トランスフェクト過程に、ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ（ＰＥＩ）をトランスフェクト媒体として用い、それをＤＮＡ（ＤＮＡ用量が１×１０⁶個の細胞当たり０．５ μｇであり、ここで、抗体の軽鎖と重鎖との比が３：２である）と混合し、ＰＥＩとＤＮＡとの好適な質量混合配合比率は３：１である。両方の混合物は、１５分間静置しインキュベートした後に細胞培養に加えられた。ＰＥＩとＤＮＡとの混合物を受けて、細胞を３７℃で、５％ＣＯ₂により２４時間回転培養し続けた後、０．５％のトリプトンを発現に必要な添加物として細胞培養液に加え、最後に発現が完了した後（９６時間以上）、細胞上清を収集し抗体の精製及び単離に用いた。

【0197】

８．抗体の精製及び単離

【0198】

収集された細胞上清を、高速（８０００ｒｐｍ、１５分間）遠心分離によって細胞及び細胞破片を除去した後、０．４５ｕｍの濾過膜で濾過して清澄化した。清澄化された上清は精製に用いられた。精製過程は、クロマトグラフィー装置により完成された。上清はまずタンパク質Ｇアフィニティークロマトグラフィー用カラムを流れ、上清に含まれる抗体はこの間にタンパク質Ｇアフィニティークロマトグラフィー用カラムのリガンドと結合した後にカラム内に保持され、そして、ｐＨ値の低い（３．０以下）溶出緩衝液でクロマトグラフィーを灌注し、クロマトグラフィーに結合した抗体を解離した。収集された抗体溶出液の低いｐＨ値を１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌで迅速に中和して、抗体を変性及び不活性化から保護した。得られた抗体溶出液は、１６時間透析された後にＰＢＳ緩衝系に置換された。

【0199】

９．フローサイトメトリー分析による機能性抗体（ＦＡＣＳ）の検証

【0200】

１０⁵個のＣＨＯ－ＤＨＦＲ－ｈＥＴ_AＲ細胞を、１０ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳで消化し収集し、それぞれ１．５ｍＬＥＰ管に入れ、遠心分離した後に上清を捨て、陰性対照サンプルをフローサンプリング緩衝液（ＰＢＳ、２％ＦＢＳ）で再懸濁させた。陽性処理群の細胞に対して、１管当たり２００ μＬ抗体上清を加え、室温でインキュベートし、インキュベートが完了した後に１５００ｒｐｍで遠心分離し、上清を捨て、フローサンプリング緩衝液で細胞沈殿を一回洗浄し、さらに遠心分離し、細胞を再懸濁させ、１：５０希釈された、ＦＩＴＣ標識されたヒツジ抗マウス蛍光二次抗体（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、２００ μＬ／ウェルで細胞再懸濁液に加え、室温で遮光して３０ｍｉｎインキュベートし、遠心分離し、上清を捨て、次にフローサンプリング緩衝液で一回洗浄し、遠心分離し、最後にフローサンプリング緩衝液で細胞沈殿を再懸濁させ、オンマシンで検出した。組換え抗ＥＴ_AＲ機能性抗体が発現されている上清と、ＥＴ_AＲが発現されているＣＨＯ－ＤＨＦＲ－ＥＴ_AＲ細胞とは特異的に結合した。灰色ピーク及び点線ピークは陰性対照であり、ハイブリドーマ細胞上清に対応する実線ピークは明らかに右に移動した。

【0201】

１０．カルシウムフラックス実験による機能性抗体の検証

【0202】

ｈＥＴ_AＲ－Ａｅｑｕｏｒｉｎを共発現するＣＨＯ－ＤＨＦＲ－細胞を黒色の９６ウェル細胞培養プレートにウェル当たり２５０００個で接種し、３７℃で一晩培養した。翌日、細胞上清を除去し、５０ μＬの基質ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅｈ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、遮光して２ｈｒｓインキュベートし、次に５０ μＬのハイブリドーマ細胞上清又は精製された抗体を加え、３０分間インキュベートし続けた。ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓのＳｐｅｃｔｒａＭａｘＬマイクロプレートリーダーにおいてオートサンプラーでＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－１を灌注し、灌注後の４０ｓ以内に瞬時的カルシウムフラックス変化を検出し、ピーク時間及びピーク値を記録した。異なるハイブリドーマ上清は、細胞内ヒトＥＴ_AＲ媒介性Ｃａ²⁺変化抑制の異なる結果を示し、Ａ－１抗体はＥＴ_AＲ媒介性Ｃａ²⁺変化を著しく抑制した。組換え抗ＥＴ_AＲ機能性抗体濃度の上昇に伴い、抗体による細胞内ヒトＥＴ_AＲ媒介性Ｃａ²⁺変化に対する抑制効果は顕著に増強されている。

【0203】

１１．抗体Ａ－１による異なる種属ＥＴ_AＲの生物学的活性に対するインビトロ拮抗のカルシウムフラックス実験での検出

【0204】

イクオリンＡｅｑｕｏｒｉｎ及びウサギＥＴ_AＲ、ゴールデンハムスターＥＴ_AＲ又はラットＥＴ_AＲを共発現するＣＨＯ－Ａ１細胞を、２ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳで消化し収集し、計数結果に応じて、各細胞を３．５×１０⁴個の細胞／ウェル又は４×１０⁴個の細胞／ウェルで無菌９６ウェル細胞培養プレートにそれぞれ接種し、１００μＬ／ウェルであり、周辺ウェルをＰＢＳによって１００μＬ／ウェルで補った。３７℃で培養箱において一晩培養した。－２０℃で一管のＣｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ－ｈを取り出し、完全に融解した後に遠心分離し、液体をＥＰ管の底部に凝集させ、５ｍＬの遠心管内に３．２ｍＬのフェノールスルホンフタレインなしＤＭＥＭ／Ｆ１２を加え、１００μＬＣｏｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ－ｈをその中に加え、反転して均一に混合した後に１ウェル当たり３２０μＬでサンプリングプレート内に分けて待機した。細胞培養プレートを取り出し、元の培地を吸引し、５０ μＬ／ウェルのＣｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ－ｈ（遮光操作）をピペットで加え、９６ウェルの細胞培養プレートを遮光条件下に置き、室温で２～２．５時間インキュベートした。抗体Ａ－１を勾配希釈し、遮光して投与し、５０μＬ／ウェルの薬物を５０μＬ／ウェルのセレンテラジンに加え、各濃度で２組のウェルを作った。抗体Ａ－１を加えられなかったフェノールスルホンフタレインなしＤＭＥＭ／Ｆ１２をブランク対照とした。投与が完了し、９６ウェルの細胞培養プレートを遮光条件に置き、室温で３０分間インキュベートした。インキュベートが終了した後、マイクロプレートリーダー上で各ウェル蛍光強度を読み取り、各ウェルを１００μＬ１０ｎＭＥＴ－１で灌注した。ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて作図し、ソフトウェアによって薬物のＩＣ５０値及びカーブフィッティング相関係数Ｒ²を自動的に計算した。図５に示すように、抗体Ａ－１は、ＥＴ－１誘導性ウサギＥＴ_AＲ、ゴールデンハムスターＥＴ_AＲの活性化に有効に拮抗することができ、ＥＴ－１誘導性ラットＥＴ_AＲの活性化に拮抗することができなかった。

【0205】

１２．抗体Ａ－１のカニクイザルにおける薬物動態学的研究

【0206】

カニクイザル１８匹（９雌：９雄）を３つの群にランダム分け、各群に３匹の雌及び３匹の雄カニクイザルがある。各群の動物に抗体Ａ－１をそれぞれ５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内注射し、投与前、投与直後（±１ｍｉｎ）、投与後０．５ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１日、２日、３日、４日、７日、１４日、２１日及び２８日に採血し、遠心分離し血清を抽出し、ＥＬＩＳＡ方法で血清における薬物濃度を検出し、ソフトウェアによって分析してＡ－１のカニクイザルにおける半減期を確定した。表１に示すように、カニクイザルに５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内注射された抗体Ａ－１の半減期は、それぞれ２４４．７４ｈ、１７３．１５ｈ及び１７３．４１ｈである。

【0207】

【表3】

【0208】

１３．抗体Ａ－１のインビボ薬効を評価するためのシスプラチン誘導性ウサギ急性腎障害モデルの確立

【0209】

５ｍｇ／ｋｇの用量でシスプラチンを単回耳介静脈注射してウサギ急性腎障害モデルの確立を誘導し、週に二回静脈注射された抗体Ａ－１の薬効を該モデルにおいて評価した。２４匹の動物をランダムに選択し、シスプラチン注射前又は抗体Ａ－１投与前、ウサギ体重を秤量し、ウサギの２４時間尿液及び血清を収集して、総尿中タンパク質（Ｕ－ＴＰ）、尿中アルブミン（Ｕ－Ａｌｂ）、尿素窒素（ＢＵＮ）及び血中クレアチニン（ｓＣｒ）含有量を検出した。２４匹の動物を体重に応じてランダムにグループ分け、１群に８匹であり、合計３群であり、第２群の動物初回投与時間はシスプラチン注射後２４ｈ（Ｄ１）であり、２回目の投与時間はシスプラチン注射後の４日目である（Ｄ４）。第３群の動物の初回投与時間はシスプラチン注射前２ｈ（－２ｈ）であり、２回目の投与時間はシスプラチン注射後の３日目である（Ｄ３）。シスプラチン注射後１、２、３及び５日目に、血清を再び収集してＢＵＮ及びｓＣｒを検出した。実験の終わりに、Ｕ－ＴＰ及びＵ－Ａｌｂを検出するために、２４時間の尿液を収集した。図６、図７、表２及び表３に示すように、－２ｈ及びＤ３で抗体Ａ－１を投与して治療することは、シスプラチン誘導性ＢＵＮ及びｓＣｒの上昇を著しく低下させるか又は遮断した。図８及び表４に示すように、－２ｈ及びＤ３で抗体Ａ－１を投与して治療することは、シスプラチン誘導性Ｕ－ＴＰ及びＵ－Ａｌｂの上昇を著しく低下させるか又は遮断した。以上のデータにより、抗体Ａ－１（－２ｈ及びＤ３）が、シスプラチン誘導性ウサギ急性腎障害モデルおいて優れた腎臓保護作用を有することが示されている。

【0210】

【表4】

【0211】

【表5】

【0212】

【表6】

【0213】

【表7】

【0214】

１４、抗体Ａ－１のインビボ薬効を評価するためのゴールデンハムスターの糖尿病性腎症モデルの確立

【0215】

３０ｍｇ／ｋｇの用量でストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を３日間連続して腹腔注射し、高脂肪高コレステロール飼料と併用して、ゴールデンハムスターの糖尿病性腎症モデルの確立を誘導し、該モデルにおいて、抗体Ａ－１を週に二回腹腔注射した薬効を評価した。ゴールデンハムスター５０匹をランダムに選んで、尿液を収集し尿中クレアチニン（Ｕ－Ｃｒ）、Ｕ－ＴＰ及びＵ－Ａｌｂを検出し、血清を収集し空腹時血糖、ＢＵＮ及びｓＣｒを検出し、体重に応じてランダムにグループ分けを行い、ブランク群が１０匹であり、残りの動物に３０ｍｇ／ｋｇの用量でＳＴＺを腹腔注射し、３日間連続して注射した後、４日目にグループ分けを行い、各群１０匹にした。グループ分け後に、それぞれ溶媒（ブランク群及びモデル群）、６ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ又は５４ｍｇ／ｋｇ抗体Ａ－１を投与し、投与当日をＤ０に定義し、一般飼料で１０日間飼育し、１１日目に飼料を高脂肪高コレステロール飼料に変更し実験終了まで飼育した。投与二週間後、尿液を収集し、Ｕ－Ｃｒ、Ｕ－ＴＰ及びＵ－Ａｌｂを検出した。図９～図１１、表５に示すように、ブランク群に比べて、ＳＴＺ注射後に、モデル群動物の２４時間尿量、総尿中タンパク質及び尿中アルブミンは上昇し、早期糖尿病性腎症モデルのモデリングに成功したことを示唆しており、モデル群に比べて、抗体Ａ－１は、糖尿病性腎症動物の２４時間尿量及び総尿中タンパク質を著しく低下させ、それとともに、抗体Ａ－１治療後に、糖尿病性腎症動物の２４時間尿中アルブミンも約３０％低下し、良好な腎臓保護作用を示した。

【0216】

以上の実施例は、特許請求される実施形態がどのように製造され使用されるかを当業者に十分に開示及び説明するために提供され、本明細書に開示された範囲を限定することを意図しない。当業者にとって明白な修飾は、全て本明細書の特許請求の範囲内である。本明細書に引用される全ての出版物、特許及び特許出願は、各出版物、特許又は特許出願がいずれも具体的に又は単独で参照により本明細書に組込まれるように、いずれも参照により本明細書に組込まれる。

【図1】