特表 2024-514327 哺乳類細胞の灌流培養方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-01

(54)【発明の名称】哺乳類細胞の灌流培養方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20240325BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240325BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20240325BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240325BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20240325BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240325BHJP

【ＦＩ】

C12N5/071

C12P21/02 C

C12Q1/06

C12P21/08

A61K38/02

A61P43/00 111

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023562946

(86)(22)【出願日】2022-04-14

(85)【翻訳文提出日】2023-11-22

(86)【国際出願番号】 US2022024781

(87)【国際公開番号】W WO2022221511

(87)【国際公開日】2022-10-20

(31)【優先権主張番号】63/174,900

(32)【優先日】2021-04-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500034653

【氏名又は名称】ジェンザイム・コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】シャウン・エル・バレット

(72)【発明者】

【氏名】チャールズ・ブッデ

(72)【発明者】

【氏名】ダリル・パワーズ

【テーマコード（参考）】

4B063

4B064

4B065

4C084

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QQ08

4B063QQ13

4B063QX01

4B064AG01

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC06

4B064CC07

4B064CC10

4B064CC22

4B064CC24

4B064CD16

4B064DA01

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BC20

4B065BC25

4B065BD27

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA44

4C084CA53

4C084DB52

4C084DC01

4C084NA20

4C084ZC02

(57)【要約】

本明細書では、哺乳類細胞の灌流培養方法であって：約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する第１の液体培地中に配置された哺乳類細胞を含む容器を用意することと；約３２℃から約３９℃で哺乳類細胞をある期間インキュベートすることと；その期間の間、連続的または定期的に、第１の液体培地の第１の体積を除去し、第１の液体培地に第２の液体培地の第２の体積を添加することであって、第１および第２の体積はほぼ等しく、容器内の第１および第２の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇにその期間にわたって維持されることとを含む、方法が提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

哺乳類細胞の灌流培養方法であって：
約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する第１の液体培地中に配置された哺乳類細胞を含む容器を用意することと；
約３２℃から約３９℃で哺乳類細胞をある期間インキュベートすることと；
その期間の間、連続的または定期的に、第１の液体培地の第１の体積を除去し、第１の液体培地に第２の液体培地の第２の体積を添加することであって、第１および第２の体積はほぼ等しく、容器内の第１および第２の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇにその期間にわたって維持されることとを含む、方法。

【請求項2】

第１の液体培地は、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

第２の液体培地は、８ｇ／Ｌ超のポロキサマーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

第２の液体培地は、１０ｇ／Ｌ超のポロキサマーを含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

第２の液体培地は、１２ｇ／Ｌ超のポロキサマーを含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

ポロキサマーは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８である、請求項３～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

第２の液体培地は、約６．８から約７．１のｐＨを有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

第２の液体培地は塩化ナトリウムを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

第２の液体培地は、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，５００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

第２の液体培地は、約１，２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，８００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

添加する第２の液体培地の第２の体積を、その期間にわたって増加させる、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

添加する第２の液体培地の第２の体積を、生細胞密度に基づいてその期間にわたって増加させる、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

容器内の第１および第２の液体培地の浸透圧を維持することは、第２の液体培地の流量をその期間の間のある時点で調整することを含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

調整する工程は、第２の液体培地の流量をその期間の間のある時点で増加させることを含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

容器内の第１および第２の液体培地のｐＨおよびｐＣＯ_２の一方または両方を、その期間の間のある時点で調整することを更に含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

調整する工程は、第２の液体培地の流量をその期間の間のある時点で減少させることを含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

その期間にわたって、容器内の第１および第２の液体培地のｐＣＯ_２を増加させ、ｐＨを増加させることを更に含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

容器内の第１および第２の液体培地のｐＣＯ_２およびｐＨを、生細胞密度に基づいてその期間にわたって増加させる、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

第１および第２の液体培地における６０×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度は、その期間の間に達成される、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

第１および第２の液体培地における１００×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度は、その期間の間に達成される、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

第１および第２の液体培地における１２０×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度は、その期間の間に達成される、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

容器内の第１および第２の液体培地の浸透圧をその期間の間モニタリングすることを更に含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

その期間の間、第１の液体培地の第１の体積の除去、および第２の液体培地の第２の体積の添加は同時に行われる、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

その期間の間、第１の液体培地の第１の体積の除去、および第２の液体培地の第２の体積の添加は連続的に行われる、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

その期間にわたって、第１の液体培地の第１の体積の除去、および第２の液体培地の第２の体積の添加は定期的に行われる、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

その期間の間、定期的に、容器内の第１および第２の液体培地に水溶液の第３の体積を添加することであって、第１の体積と、第２および第３の体積の合計とはほぼ等しく、容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇにその期間にわたって維持されることを更に含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

水溶液は塩溶液である、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

塩溶液は塩化ナトリウム溶液または塩化カリウム溶液である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

その期間の間、第１の液体培地の第１の体積の除去、第２の液体培地の第２の体積の添加、および第３の体積の添加は同時に行われる、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

その期間の間、第１の液体培地の第１の体積の除去、第２の液体培地の第２の体積の添加および第３の体積の添加は連続的に行われる、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

その期間にわたって、第１の液体培地の第１の体積の除去、第２の液体培地の第２の体積の添加、および第３の体積の添加は定期的に行われる、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項32】

連続的または定期的に、第１の液体培地に第３の液体培地の第３の体積を添加することであって、第１の体積と、第２および第３の体積の合計とはほぼ等しく、容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｍｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇにその期間にわたって維持されることを更に含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

第３の液体培地は、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇである浸透圧を有する、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧を維持することは、第２の液体培地の流量をその期間の間調整することを含む、請求項３２または３３に記載の方法。

【請求項35】

調整する工程は、第２の液体培地の流量をその期間の間のある時点で増加させることを含む、請求項３２～３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

調整する工程は、第２の液体培地の流量をその期間の間のある時点で減少させることを含む、請求項３２～３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

第３の液体培地は、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する、請求項３２に記載の方法。

【請求項38】

第３の液体培地は、約５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧を維持することは、第３の液体培地の流量をその期間の間調整することを含む、請求項３７または３８に記載の方法。

【請求項40】

調整する工程は、第３の液体培地の流量をその期間の間のある時点で増加させることを含む、請求項３７～３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

調整する工程は、第３の液体培地の流量をその期間の間のある時点で減少させることを含む、請求項３７～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

容器内の第１、第２、および第３の液体培地のｐＨおよびｐＣＯ_２の一方または両方を、その期間の間のある時点で調整することを更に含む、請求項３２～４１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

その期間にわたって、容器内の第１、第２、および第３の液体培地のｐＣＯ_２を増加させ、ｐＨを増加させることを含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

容器内の第１、第２、および第３の液体培地のｐＣＯ_２およびｐＨを、生細胞密度に基づいてその期間にわたって増加させる、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

第１、第２、および第３の液体培地における６０×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度は、その期間の間に達成される、請求項３２～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

第１、第２、および第３の液体培地における１００×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度は、その期間の間に達成される、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

第１、第２、および第３の液体培地における１２０×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度は、その期間の間に達成される、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧をその期間の間モニタリングすることを更に含む、請求項３２～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

その期間の間、第１の液体培地の第１の体積の除去、第２の液体培地の第２の体積の添加、および第３の体積の添加は同時に行われる、請求項３２～４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

その期間の間、第１の液体培地の第１の体積の除去、第２の液体培地の第２の体積の添加、および第３の体積の添加は連続的に行われる、請求項３２～４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

その期間にわたって、第１の液体培地の第１の体積の除去、第２の液体培地の第２の体積の添加、および第３の体積の添加は定期的に行われる、請求項３２～４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項52】

哺乳類細胞は、ＣＨＯ細胞である、請求項１～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

容器はバイオリアクターである、請求項１～５２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項54】

バイオリアクターは灌流バイオリアクターである、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

組換えタンパク質の産生方法であって：
約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する第１の液体培地中に配置された、組換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞を含む容器を用意することと；
約３２℃から約３９℃で哺乳類細胞をある期間インキュベートすることと；
その期間の間、連続的または定期的に、第１の液体培地の第１の体積を除去し、第１の液体培地に第２の液体培地の第２の体積を添加することであって、第１および第２の体積はほぼ等しく、容器内の第１および第２の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇにその期間にわたって維持されることと；
組換えタンパク質を、哺乳類細胞から、または第１の液体培地および／もしくは第２の液体培地から回収することとを含む、方法。

【請求項56】

第１の液体培地は、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

第２の液体培地は、８ｇ／Ｌ超のポロキサマーを含む、請求項５５に記載の方法。

【請求項58】

第２の液体培地は、１０ｇ／Ｌ超のポロキサマーを含む、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

第２の液体培地は、１２ｇ／Ｌ超のポロキサマーを含む、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

ポロキサマーは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８である、請求項５７～５９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項61】

第２の液体培地は、約６．８から約７．１のｐＨを有する、請求項５５～６０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項62】

第２の液体培地は塩化ナトリウムを含む、請求項５５～６１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項63】

第２の液体培地は、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，５００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する、請求項５５～６２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項64】

第２の液体培地は、約１，２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，８００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

添加する第２の液体培地の第２の体積を、その期間にわたって増加させる、請求項５５～６４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項66】

添加する第２の液体培地の第２の体積を、生細胞密度に基づいてその期間にわたって増加させる、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

容器内の第１および第２の液体培地の浸透圧を維持することは、第２の液体培地の流量をその期間の間のある時点で調整することを含む、請求項５５～６６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項68】

調整する工程は、第２の液体培地の流量をその期間の間のある時点で増加させることを含む、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

容器内の第１および第２の液体培地のｐＨおよびｐＣＯ_２の一方または両方を、その期間の間のある時点で調整することを更に含む、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

調整する工程は、第２の液体培地の流量をその期間の間のある時点で減少させることを含む、請求項６７に記載の方法。

【請求項71】

その期間にわたって、容器内の第１および第２の液体培地のｐＣＯ_２を増加させ、ｐＨを増加させることを更に含む、請求項５５～７０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項72】

容器内の第１および第２の液体培地のｐＣＯ_２およびｐＨを、生細胞密度に基づいてその期間にわたって増加させる、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

第１および第２の液体培地における６０×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度は、その期間の間に達成される、請求項５５～７２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項74】

第１および第２の液体培地における１００×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度は、その期間の間に達成される、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

第１および第２の液体培地における１２０×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度は、その期間の間に達成される、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

容器内の第１および第２の液体培地の浸透圧をその期間の間モニタリングすることを更に含む、請求項５５～７５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項77】

その期間の間、第１の液体培地の第１の体積の除去、および第２の液体培地の第２の体積の添加は同時に行われる、請求項５５～７６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項78】

その期間の間、第１の液体培地の第１の体積の除去、および第２の液体培地の第２の体積の添加は連続的に行われる、請求項５５～７７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項79】

その期間にわたって、第１の液体培地の第１の体積の除去、および第２の液体培地の第２の体積の添加は定期的に行われる、請求項５５～７７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項80】

組換えタンパク質は第１および／または第２の液体培地中に分泌される、請求項５５～７９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項81】

組換えタンパク質は、第１および／または第２の液体培地から回収される、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

その期間の間、連続的または定期的に、容器内の第１および第２の液体培地に水溶液の第３の体積を添加することであって、第１の体積と、第２および第３の体積の合計とはほぼ等しく、容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇにその期間にわたって維持されることを更に含む、請求項５５～８１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項83】

水溶液は塩溶液である、請求項８２に記載の方法。

【請求項84】

塩溶液は塩化ナトリウム溶液または塩化カリウム溶液である、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

その期間の間、第１の液体培地の第１の体積の除去、第２の液体培地の第２の体積の添加、および第３の体積の添加は同時に行われる、請求項８２～８４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項86】

その期間の間、第１の液体培地の第１の体積の除去、第２の液体培地の第２の体積の添加、および第３の体積の添加は連続的に行われる、請求項８２～８４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項87】

その期間にわたって、第１の液体培地の第１の体積の除去、第２の液体培地の第２の体積の添加、および第３の体積の添加は定期的に行われる、請求項８２～８４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項88】

連続的または定期的に、第１の液体培地に第３の液体培地の第３の体積を添加することであって、第１の体積と、第２および第３の体積の合計とはほぼ等しく、容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇにその期間にわたって維持されることを更に含む、請求項５５～８１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項89】

第３の液体培地は、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇである浸透圧を有する、請求項８８に記載の方法。

【請求項90】

容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧を維持することは、第２の液体培地の流量をその期間の間調整することを含む、請求項８８または８９に記載の方法。

【請求項91】

調整する工程は、第２の液体培地の流量をその期間の間のある時点で増加させることを含む、請求項８８～９０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項92】

調整する工程は、第２の液体培地の流量をその期間の間のある時点で減少させることを含む、請求項８８～９０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項93】

第３の液体培地は、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する、請求項８８に記載の方法。

【請求項94】

第３の液体培地は、約５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する、請求項９３に記載の方法。

【請求項95】

容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧を維持することは、第３の液体培地の流量をその期間の間調整することを含む、請求項９３または９４に記載の方法。

【請求項96】

調整する工程は、第３の液体培地の流量をその期間の間のある時点で増加させることを含む、請求項９３～９５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項97】

調整する工程は、第３の液体培地の流量をその期間の間のある時点で減少させることを含む、請求項９３～９６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項98】

容器内の第１、第２、および第３の液体培地のｐＨおよびｐＣＯ_２の一方または両方を、その期間の間のある時点で調整することを更に含む、請求項８８～９７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項99】

その期間にわたって、容器内の第１、第２、および第３の液体培地のｐＣＯ_２を増加させ、ｐＨを増加させることを含む、請求項９８に記載の方法。

【請求項100】

容器内の第１、第２、および第３の液体培地のｐＣＯ_２およびｐＨを、生細胞密度に基づいてその期間にわたって増加させる、請求項９９に記載の方法。

【請求項101】

第１、第２、および第３の液体培地における６０×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度は、その期間の間に達成される、請求項８８～１００のいずれか１項に記載の方法。

【請求項102】

第１、第２、および第３の液体培地における１００×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度は、その期間の間に達成される、請求項１０１に記載の方法。

【請求項103】

第１、第２、および第３の液体培地における１２０×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度は、その期間の間に達成される、請求項１０２に記載の方法。

【請求項104】

容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧をその期間の間モニタリングすることを更に含む、請求項８８～１０３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項105】

その期間の間、第１の液体培地の第１の体積の除去、第２の液体培地の第２の体積の添加、および第３の体積の添加は同時に行われる、請求項８８～１０４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項106】

その期間の間、第１の液体培地の第１の体積の除去、第２の液体培地の第２の体積の添加、および第３の体積の添加は連続的に行われる、請求項８８～１０４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項107】

その期間にわたって、第１の液体培地の第１の体積の除去、第２の液体培地の第２の体積の添加、および第３の体積の添加は定期的に行われる、請求項８８～１０４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項108】

組換えタンパク質は第１、第２、および／または第３の液体培地中に分泌される、請求項８８～１０７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項109】

組換えタンパク質は、第１、第２、および／または第３の液体培地から回収される、請求項１０８に記載の方法。

【請求項110】

哺乳類細胞は、ＣＨＯ細胞である、請求項５５～１０９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項111】

容器はバイオリアクターである、請求項５５～１１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項112】

バイオリアクターは灌流バイオリアクターである、請求項１１１に記載の方法。

【請求項113】

組換えタンパク質は、免疫グロブリン、酵素、増殖因子、タンパク質断片、または操作されたタンパク質である、請求項５５～１１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項114】

組換えタンパク質は、哺乳類細胞から回収される、請求項５５～１１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項115】

組換えタンパク質を単離することを更に含む、請求項５５～１１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項116】

単離された組換えタンパク質を製剤化することを更に含む、請求項１１５に記載の方法。

【請求項117】

請求項５５～１１４のいずれか１項に記載の方法によって産生される、組換えタンパク質。

【請求項118】

請求項１１７に記載の組換えタンパク質を含む、医薬組成物。

【請求項119】

請求項１１８に記載の医薬組成物を含む、キット。

【請求項120】

請求項１１８に記載の医薬組成物の治療上有効な量をそれを必要とする対象に投与することを含む、対象の治療方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／１７４，９００号の優先権を主張する；本出願の全内容は参照によって本明細書に組み入れる。

【0002】

本発明は、バイオテクノロジーの方法および組換えタンパク質の製造に関する。

【背景技術】

【0003】

組換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞は、治療上または商業上重要なタンパク質を産生するのによく使用される。バイオテクノロジー企業は、製品パイプラインが多様である現在の状況においては、高柔軟性かつ高対費用効果の治療用タンパク質原薬製造のための革新的な解決策を開発する必要に迫られている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、以下の発見に少なくとも部分的に基づいている：哺乳類細胞の灌流培養方法であって：約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する第１の液体培地中に配置された哺乳類細胞を含む容器を用意することと；約３２℃から約３９℃で哺乳類細胞をある期間インキュベートすることと；その期間の間、連続的または定期的に、第１の液体培地の第１の体積を除去し、第１の液体培地に第２の液体培地の第２の体積を添加することであって、第１および第２の体積はほぼ等しく、容器内の第１の液体培地の浸透圧および第２の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇにその期間にわたって維持されることとを含む、方法は、浸透圧が約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇにその期間にわたって維持されない他の灌流細胞培養方法と比較して、培養の増殖および健全性の改善を達成する。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本明細書では、哺乳類細胞の灌流培養方法であって：約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ（例えば、その中のいずれかの部分範囲）の浸透圧を有する第１の液体培地中に配置された哺乳類細胞を含む容器を用意することと；約３２℃から約３９℃（例えば、その中のいずれかの部分範囲）で哺乳類細胞をある期間インキュベートすることと；その期間の間、連続的または定期的に、第１の液体培地の第１の体積を除去し、第１の液体培地に第２の液体培地の第２の体積を添加することであって、第１および第２の体積はほぼ等しく、容器内の第１および第２の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ（例えば、その中のいずれかの部分範囲）にその期間にわたって維持されることとを含む、方法が提供される。

【0006】

いくつかの実施形態では、第１の液体培地は、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する。いくつかの実施形態では、第２の液体培地は、８ｇ／Ｌ超のポロキサマーを含む。いくつかの実施形態では、第２の液体培地は、１０ｇ／Ｌ超のポロキサマーを含む。いくつかの実施形態では、第２の液体培地は、１２ｇ／Ｌ超のポロキサマーを含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ポロキサマーは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８である。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、第２の液体培地は、約６．８から約７．１のｐＨを有する。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、第２の液体培地は、塩化ナトリウムを含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、第２の液体培地は、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，５００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、第２の液体培地は、約１，２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，８００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、添加する第２の液体培地の第２の体積を、その期間にわたって増加させる。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、添加する第２の液体培地の第２の体積を、生細胞密度に基づいてその期間にわたって増加させる。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、容器内の第１および第２の液体培地の浸透圧を維持することは、第２の液体培地の流量をその期間の間のある時点で調整することを含む。

【0007】

いくつかの実施形態では、調整する工程は、第２の液体培地の流量をその期間の間のある時点で増加させることを含む。

【0008】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、容器内の第１および第２の液体培地のｐＨおよびｐＣＯ_２の一方または両方を、その期間の間のある時点で調整することを含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、調整する工程は、第２の液体培地の流量をその期間の間のある時点で減少させることを含む。

【0010】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、その期間にわたって、容器内の第１および第２の液体培地のｐＣＯ_２を増加させ、ｐＨを増加させることを更に含む。

【0011】

いくつかの実施形態では、容器内の第１および第２の液体培地のｐＣＯ_２およびｐＨを、生細胞密度に基づいてその期間にわたって増加させる。

【0012】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、第１および第２の液体培地における６０×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度は、その期間の間に達成される。いくつかの実施形態では、第１および第２の液体培地における１００×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度は、その期間の間に達成される。いくつかの実施形態では、第１および第２の液体培地における１２０×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度は、その期間の間に達成される。

【0013】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、容器内の第１および第２の液体培地の浸透圧をその期間の間モニタリングすることを更に含む。

【0014】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、その期間の間、第１の液体培地の第１の体積の除去、および第２の液体培地の第２の体積の添加は同時に行われる。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、その期間の間、第１の液体培地の第１の体積の除去、および第２の液体培地の第２の体積の添加は連続的に行われる。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、その期間にわたって、第１の液体培地の第１の体積の除去、および第２の液体培地の第２の体積の添加は定期的に行われる。

【0015】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、その期間の間、定期的に、容器内の第１および第２の液体培地に水溶液の第３の体積を添加することであって、第１の体積と、第２および第３の体積の合計とはほぼ等しく、容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇにその期間にわたって維持されることを更に含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、水溶液は塩溶液である。いくつかの実施形態では、塩溶液は塩化ナトリウム溶液または塩化カリウム溶液である。

【0017】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、その期間の間、第１の液体培地の第１の体積の除去、第２の液体培地の第２の体積の添加、および第３の体積の添加は同時に行われる。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、その期間の間、第１の液体培地の第１の体積の除去、第２の液体培地の第２の体積の添加、および第３の体積の添加は連続的に行われる。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、その期間にわたって、第１の液体培地の第１の体積の除去、第２の液体培地の第２の体積の添加、および第３の体積の添加は定期的に行われる。

【0018】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、連続的または定期的に、第１の液体培地に第３の液体培地の第３の体積を添加することであって、第１の体積と、第２および第３の体積の合計とはほぼ等しく、容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｍｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇにその期間にわたって維持されることを更に含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、第３の液体培地は、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇである浸透圧を有する。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧を維持することは、第２の液体培地の流量をその期間の間調整することを含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、調整する工程は、第２の液体培地の流量をその期間の間のある時点で増加させることを含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、調整する工程は、第２の液体培地の流量をその期間の間のある時点で減少させることを含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、第３の液体培地は、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する。いくつかの実施形態では、第３の液体培地は、約５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する。

【0021】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧を維持することは、第３の液体培地の流量をその期間の間調整することを含む。

【0022】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、調整する工程は、第３の液体培地の流量をその期間の間のある時点で増加させることを含む。

【0023】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、調整する工程は、第３の液体培地の流量をその期間の間のある時点で減少させることを含む。

【0024】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、容器内の第１、第２、および第３の液体培地のｐＨおよびｐＣＯ_２の一方または両方を、その期間の間のある時点で調整することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、その期間にわたって、容器内の第１、第２、および第３の液体培地のｐＣＯ_２を増加させ、ｐＨを増加させることを含む。いくつかの実施形態では、容器内の第１、第２、および第３の液体培地のｐＣＯ_２およびｐＨを、生細胞密度に基づいてその期間にわたって増加させる。

【0025】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、第１、第２、および第３の液体培地における６０×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度は、その期間の間に達成される。いくつかの実施形態では、第１、第２、および第３の液体培地における１００×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度は、その期間の間に達成される。いくつかの実施形態では、第１、第２、および第３の液体培地における１２０×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度は、その期間の間に達成される。

【0026】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧をその期間の間モニタリングすることを更に含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、その期間の間、第１の液体培地の第１の体積の除去、第２の液体培地の第２の体積の添加、および第３の体積の添加は同時に行われる。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、その期間の間、第１の液体培地の第１の体積の除去、第２の液体培地の第２の体積の添加、および第３の体積の添加は連続的に行われる。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、その期間にわたって、第１の液体培地の第１の体積の除去、第２の液体培地の第２の体積の添加、および第３の体積の添加は定期的に行われる。

【0027】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、哺乳類細胞はＣＨＯ細胞である。

【0028】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、容器はバイオリアクターである。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは灌流バイオリアクターである。

【0029】

本明細書ではまた、組換えタンパク質の産生方法であって：約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ（例えば、その中のいずれかの部分範囲）の浸透圧を有する第１の液体培地中に配置された、組換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞を含む容器を用意することと；約３２℃から約３９℃（例えば、その中のいずれかの部分範囲）で哺乳類細胞をある期間インキュベートすることと；その期間の間、連続的または定期的に、第１の液体培地の第１の体積を除去し、第１の液体培地に第２の液体培地の第２の体積を添加することであって、第１および第２の体積はほぼ等しく、容器内の第１および第２の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ（例えば、その中のいずれかの部分範囲）にその期間にわたって維持されることと；組換えタンパク質を、哺乳類細胞から、または第１の液体培地および／もしくは第２の液体培地から回収することとを含む、方法も提供される。

【0030】

いくつかの実施形態では、第１の液体培地は、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する。いくつかの実施形態では、第２の液体培地は、８ｇ／Ｌ超のポロキサマーを含む。いくつかの実施形態では、第２の液体培地は、１０ｇ／Ｌ超のポロキサマーを含む。いくつかの実施形態では、第２の液体培地は、１２ｇ／Ｌ超のポロキサマーを含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ポロキサマーは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８である。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、第２の液体培地は、約６．８から約７．１のｐＨを有する。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、第２の液体培地は、塩化ナトリウムを含む。

【0031】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、第２の液体培地は、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，５００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する。いくつかの実施形態では、第２の液体培地は、約１，２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，８００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、添加する第２の液体培地の第２の体積を、その期間にわたって増加させる。いくつかの実施形態では、添加する第２の液体培地の第２の体積を、生細胞密度に基づいてその期間にわたって増加させる。

【0032】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、容器内の第１および第２の液体培地の浸透圧を維持することは、第２の液体培地の流量をその期間の間のある時点で調整することを含む。いくつかの実施形態では、調整する工程は、第２の液体培地の流量をその期間の間のある時点で増加させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、容器内の第１および第２の液体培地のｐＨおよびｐＣＯ_２の一方または両方を、その期間の間のある時点で調整することを更に含む。いくつかの実施形態では、調整する工程は、第２の液体培地の流量をその期間の間のある時点で減少させることを含む。

【0033】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、その期間にわたって、容器内の第１および第２の液体培地のｐＣＯ_２を増加させ、ｐＨを増加させることを更に含む。いくつかの実施形態では、容器内の第１および第２の液体培地のｐＣＯ_２およびｐＨを、生細胞密度に基づいてその期間にわたって増加させる。

【0034】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、第１および第２の液体培地における６０×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度は、その期間の間に達成される。いくつかの実施形態では、第１および第２の液体培地における１００×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度は、その期間の間に達成される。いくつかの実施形態では、第１および第２の液体培地における１２０×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度は、その期間の間に達成される。

【0035】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、容器内の第１および第２の液体培地の浸透圧をその期間の間モニタリングすることを更に含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、その期間の間、第１の液体培地の第１の体積の除去、および第２の液体培地の第２の体積の添加は同時に行われる。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、その期間の間、第１の液体培地の第１の体積の除去、および第２の液体培地の第２の体積の添加は連続的に行われる。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、その期間にわたって、第１の液体培地の第１の体積の除去、および第２の液体培地の第２の体積の添加は定期的に行われる。

【0036】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、組換えタンパク質は第１および／または第２の液体培地中に分泌される。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、第１および／または第２の液体培地から回収される。

【0037】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、その期間の間、連続的または定期的に、容器内の第１および第２の液体培地に水溶液の第３の体積を添加することであって、第１の体積と、第２および第３の体積の合計とはほぼ等しく、容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇにその期間にわたって維持されることを更に含む。いくつかの実施形態では、水溶液は塩溶液である。いくつかの実施形態では、塩溶液は塩化ナトリウム溶液または塩化カリウム溶液である。

【0038】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、その期間の間、第１の液体培地の第１の体積の除去、第２の液体培地の第２の体積の添加、および第３の体積の添加は同時に行われる。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、その期間の間、第１の液体培地の第１の体積の除去、第２の液体培地の第２の体積の添加、および第３の体積の添加は連続的に行われる。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、その期間にわたって、第１の液体培地の第１の体積の除去、第２の液体培地の第２の体積の添加、および第３の体積の添加は定期的に行われる。

【0039】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、連続的または定期的に、第１の液体培地に第３の液体培地の第３の体積を添加することであって、第１の体積と、第２および第３の体積の合計とはほぼ等しく、容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇにその期間にわたって維持されることを更に含む。

【0040】

いくつかの実施形態では、第３の液体培地は、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇである浸透圧を有する。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧を維持することは、第２の液体培地の流量をその期間の間調整することを含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、調整する工程は、第２の液体培地の流量をその期間の間のある時点で増加させることを含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、調整する工程は、第２の液体培地の流量をその期間の間のある時点で減少させることを含む。いくつかの実施形態では、第３の液体培地は、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する。いくつかの実施形態では、第３の液体培地は、約５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧を維持することは、第３の液体培地の流量をその期間の間調整することを含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、調整する工程は、第３の液体培地の流量をその期間の間のある時点で増加させることを含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、調整する工程は、第３の液体培地の流量をその期間の間のある時点で減少させることを含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、容器内の第１、第２、および第３の液体培地のｐＨおよびｐＣＯ_２の一方または両方を、その期間の間のある時点で調整することを更に含む。

【0041】

いくつかの実施形態では、方法は、その期間にわたって、容器内の第１、第２、および第３の液体培地のｐＣＯ_２を増加させ、ｐＨを増加させることを含む。いくつかの実施形態では、容器内の第１、第２、および第３の液体培地のｐＣＯ_２およびｐＨを、生細胞密度に基づいてその期間にわたって増加させる。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、第１、第２、および第３の液体培地における６０×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度は、その期間の間に達成される。いくつかの実施形態では、第１、第２、および第３の液体培地における１００×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度は、その期間の間に達成される。いくつかの実施形態では、第１、第２、および第３の液体培地における１２０×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度は、その期間の間に達成される。

【0042】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧をその期間の間モニタリングすることを更に含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、その期間の間、第１の液体培地の第１の体積の除去、第２の液体培地の第２の体積の添加、および第３の体積の添加は同時に行われる。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、その期間の間、第１の液体培地の第１の体積の除去、第２の液体培地の第２の体積の添加、および第３の体積の添加は連続的に行われる。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、その期間にわたって、第１の液体培地の第１の体積の除去、第２の液体培地の第２の体積の添加、および第３の体積の添加は定期的に行われる。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、組換えタンパク質は第１、第２、および／または第３の液体培地中に分泌される。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、第１、第２、および／または第３の液体培地から回収される。

【0043】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、哺乳類細胞はＣＨＯ細胞である。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、容器はバイオリアクターである。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは灌流バイオリアクターである。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、免疫グロブリン、酵素、増殖因子、タンパク質断片、または操作されたタンパク質である。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、哺乳類細胞から回収される。

【0044】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、組換えタンパク質を単離することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、単離された組換えタンパク質を製剤化することを更に含む。

【0045】

本明細書では、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生される組換えタンパク質が提供される。本明細書ではまた、本明細書に記載の組換えタンパク質のいずれかを含む医薬組成物、および本明細書に記載の医薬組成物のいずれかを含むキットも提供される。

【0046】

本明細書ではまた、本明細書に記載の医薬組成物のいずれかの治療上有効な量をそれを必要とする対象に投与することを含む、対象の治療方法も提供される。

【0047】

本明細書で使用する場合、名詞の前の単語「ａ」は、特定の名詞の１つまたはそれ以上を表す。例えば、「哺乳類細胞」という句は、「１つまたはそれ以上の哺乳類細胞」を表す。

【0048】

用語「哺乳類細胞」は、任意の哺乳類（例えば、ヒト、ハムスター、マウス、ミドリザル、ラット、ブタ、ウシ、またはウサギ）からの任意の細胞またはそれに由来する任意の細胞を意味する。例えば、哺乳類細胞は不死化細胞であり得る。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、分化または未分化細胞である。哺乳類細胞の非限定的な例が、本明細書に記載される。哺乳類細胞の追加の例は、当技術分野で知られている。

【0049】

用語「培養」または「細胞培養」は、制御された一連の物理的条件下での哺乳類細胞の維持または増殖を意味する。

【0050】

用語「哺乳類細胞の培養物」、「培養物」、または「細胞培養物」は、制御された一連の物理的条件下で維持または増殖させる複数の哺乳類細胞を含む液体培地を意味する。

【0051】

用語「液体培地」または「液体培地」は、細胞（例えば、哺乳類細胞）がインビトロで成長または増殖できるのに十分な栄養素を含む液体を意味する。例えば、液体培地は、以下の１つまたはそれ以上を含み得る：アミノ酸（例えば、２０アミノ酸）、プリン（ヒポキサンチン）、ピリミジン（例えば、チミジン）、コリン、イノシトール、チアミン、葉酸、ビオチン、カルシウム、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チミジン、シアノコバラミン、ピルビン酸塩、リポ酸、マグネシウム、グルコース、ナトリウム、カリウム、鉄、銅、亜鉛、および重炭酸ナトリウム。いくつかの実施形態では、液体培地は、哺乳類からの血清を含み得る。いくつかの実施形態では、液体培地は、哺乳類からの血清または別の抽出物を含まない（定義された液体培地）。いくつかの実施形態では、液体培地は、微量金属、哺乳類成長ホルモン、および／または哺乳類増殖因子を含み得る。液体培地の別の例は、最少培地（例えば、無機塩、炭素源、および水のみを含む培地）である。液体培地の非限定的な例が本明細書に記載される。液体培地の追加の例は、当技術分野で知られており、市販されている。液体培地は、任意の密度の哺乳類細胞を含み得る。例えば、本明細書で使用する場合、バイオリアクターから除去される一定量の液体培地は、哺乳類細胞を実質的に含まない場合がある。

【0052】

用語「無動物由来成分液体培地」は、哺乳類に由来する成分（例えば、タンパク質または血清）を含まない液体培地を意味する。

【0053】

用語「無血清液体培地」は、哺乳類血清を含まない液体培地を意味する。

【0054】

用語「血清含有液体培地」は、哺乳類血清を含む液体培地を意味する。

【0055】

用語「化学的に定義された液体培地」は、専門用語であり、全ての化学成分が既知である液体培地を意味する。例えば、化学的に定義された液体培地では、ウシ胎仔血清、ウシ血清アルブミン、またはヒト血清アルブミンは、これらの調製物が通常アルブミンおよび脂質の複雑な混合物を含むために含まれない。

【0056】

用語「無タンパク質液体培地」は、タンパク質（例えば、任意の検出可能なタンパク質）を含まない液体培地を意味する。

【0057】

用語「清澄化液体培地」は、細菌または酵母細胞を実質的に含まない（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、または９９％含まない）細菌または酵母細胞培養から得られる液体培地を意味する。

【0058】

用語「撹拌」は、バイオリアクター内の液体培地の一部をかき混ぜるか、または他の方法で移動させることを意味する。これは、例えば、バイオリアクター内の液体培地の溶存Ｏ_２濃度を増加させるために行われる。撹拌は、当技術分野で知られている任意の方法、例えば、装置またはプロペラを使用して行い得る。バイオリアクター内の液体培地の一部を撹拌するのに使用できる例示的な器具および方法は、当技術分野で知られている。

【0059】

用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリンタンパク質（例えば、可変ドメイン配列、フレームワーク配列、または定常ドメイン配列）の少なくとも１５アミノ酸のアミノ酸配列（例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００アミノ酸）を含むポリペプチドを意味する。免疫グロブリンは、例えば、軽鎖免疫グロブリンの少なくとも１５アミノ酸を含み得、例えば、重鎖免疫グロブリンの少なくとも１５アミノ酸を含み得る。免疫グロブリンは、単離された抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ）であってもよい。免疫グロブリンは、抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、またはｓｃＦｖ断片であってもよい。免疫グロブリンはまた、二重特異性抗体もしくは三重特異性抗体、または２量体、３量体、多量体抗体、またはダイアボディ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）、もしくはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）であってもよい。免疫グロブリンはまた、少なくとも１つの免疫グロブリンドメイン（例えば、融合タンパク質）を含む操作されたタンパク質であってもよい。免疫グロブリンの非限定的な例は本明細書に記載され、免疫グロブリンの追加の例は当技術分野で知られている。組換え免疫グロブリンは、本明細書に記載の方法のいずれかを使用して産生される。

【0060】

用語「操作されたタンパク質」は、生物（例えば、哺乳類）内に存在する内因性核酸では天然にはコードされていないポリペプチドを意味する。操作されたタンパク質の例としては、酵素（例えば、操作された酵素の安定性および／または触媒活性の増加をもたらす、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入、または付加を有する）、融合タンパク質、抗体（例えば、二価抗体、三価抗体、またはダイアボディ）、ならびに少なくとも１つの組換え足場配列を含む抗原結合タンパク質が挙げられる。

【0061】

用語「分泌されるタンパク質」または「分泌される組換えタンパク質」は、哺乳類細胞内で翻訳されるときに、少なくとも１つの分泌シグナル配列を元々含んでいたタンパク質（例えば、組換えタンパク質）を意味し、該タンパク質は、少なくとも部分的に、哺乳類細胞内で分泌シグナル配列が酵素的に切断されることを通して、細胞外空間（例えば、液体培地）に少なくとも部分的に分泌される。当業者は、「分泌される」タンパク質が分泌されるタンパク質とみなされるために細胞から完全に分離する必要はないことを理解するであろう。

【0062】

用語「灌流バイオリアクター」は、第１の液体培地内の複数の細胞（例えば、哺乳類細胞）を含むバイオリアクターを意味し、バイオリアクター内に存在する細胞を培養することは、第１の液体培地を定期的または連続的に除去すること、ならびに同時に、またはその直後に、実質的に同じ体積の第２の液体培地をバイオリアクターに添加することを含む。いくつかの例では、培養期間の間、第１の液体培地の体積を漸増的な期間（例えば、約２４時間の期間、約１分間と約２４時間との間の期間、または２４時間超の期間）にわたって除去および添加して漸進的に変化（例えば、増加または減少）させる（例えば、１日当たりの液体培地の再供給量）。１日に除去および置換される培地の割合は、培養する特定の細胞、初期播種密度、および特定の時点での細胞密度に応じて異なり得る。「ＲＶ」または「リアクター体積」は、培養処理の開始時に存在する液体培地の体積（例えば、播種後に存在する液体培地の合計体積）を意味する。

【0063】

「比生産性」または「ＳＰ」は、専門用語であり、本明細書で使用する場合、１哺乳類細胞毎に１日当たり産生される組換え治療用タンパク質の質量または酵素活性を指す。組換え治療用抗体のＳＰは、通常、質量／細胞／日として測定する。組換え治療用酵素のＳＰは、通常、単位／細胞／日または（単位／質量）／細胞／日として測定する。

【0064】

「体積生産性」または「ＶＰ」は、専門用語であり、本明細書で使用する場合、培養の体積毎（例えば、バイオリアクター、容器、またはチューブの体積の１Ｌ毎）に１日当たり産生される組換え治療用タンパク質の質量または酵素活性を指す。組換え治療用抗体のＶＰは、通常、質量／Ｌ／日として測定する。組換え治療用酵素のＶＰは、通常、単位／Ｌ／日または質量／Ｌ／日として測定する。

【0065】

「ある濃度のポロキサマー」および「ポロキサマー濃度」という句は、本明細書では互換的に使用される。「Ｘｇ／Ｌまたはそれ以上のポロキサマー」および「Ｘｇ／ＬまたはＸｇ／Ｌ以上の濃度のポロキサマー」という句は、本明細書では互換的に使用される。

【0066】

他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書では、本発明で使用するための方法および材料が記載されるが；他の適切な当技術分野で知られている方法および材料を使用することもできる。材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、限定することを意図するものではない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、および他の参考文献は、その全体を参照によって組み入れる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先する。

【0067】

本発明の他の機能および利点は、以下の詳細な説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0068】

【図1A】振とうフラスコで異なる浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ）で行うバッチ細胞培養実行（ｎ＝２）における経時的な生細胞密度（ＶＣＤ）（１００万細胞／ｍＬ）のグラフである。０、４、および７日目の平均浸透圧をｍＯｓｍで示す。

【図1B】Ａｍｂｒ１５マイクロバイオリアクターで異なる浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ）で行うバッチ細胞培養実行（ｎ＝２）における経時的な生細胞密度（ＶＣＤ）（１００万細胞／ｍＬ）のグラフである。０、２、５、７、および９日目の平均浸透圧をｍＯｓｍで示す。

【図2A】振とうフラスコでの４日目の浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ）に対する平均細胞直径（μｍ）のグラフである。

【図2B】Ａｍｂｒ１５マイクロバイオリアクターでの５日目の浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ）に対する平均細胞直径（μｍ）のグラフである。

【図3A】バイオリアクターで行った灌流細胞培養の実行における経時的な浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ）のグラフである。実行Ｖ２２（「Ｖ２２」）は、バイオリアクターでの高い浸透圧をもたらす水供給に対する濃縮細胞培地供給の比を有した。

【図3B】バイオリアクターで行った灌流細胞培養の実行における経時的な生細胞密度（ＶＣＤ）（１００万細胞／ｍＬ）（実線）および生細胞平均直径（μｍ）（破線）のグラフである。実行Ｖ２２（「Ｖ２２」）は、高い浸透圧を経験したことで、増殖速度が低下し、また、生存率が減少した。

【図3C】バイオリアクターで行った灌流細胞培養の実行における経時的な回収体積生産性（ＶＰ）（ｇ／Ｌ／日）（実線）および回収力価（ｇ／Ｌ）（破線）のグラフである。実行Ｖ２２（「Ｖ２２」）は、高い浸透圧を有し、生産性が減少した。

【図3D】バイオリアクターで行った灌流細胞培養の実行における経時的な生存率（％）（実線）および乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）産生量（Ｕ／Ｌ／ｄａｙ）（破線）のグラフである。実行Ｖ２２（「Ｖ２２」）は、高い浸透圧を有し、培養の健全性が悪いことを示すＬＤＨ産生量が高くなった。

【図3E】バイオリアクターで行った灌流細胞培養の実行における経時的なグルコース濃度（ｇ／Ｌ）（実線）および乳酸濃度（ｇ／Ｌ）（破線）のグラフである。実行Ｖ２２（「Ｖ２２」）は、高い浸透圧を有し、乳酸産生の上昇につながった。

【図4A】Ｐｒｏｔｅｉｎ ３バイオリアクターで行った灌流細胞培養の実行における経時的な生細胞密度（ＶＣＤ）（１００万細胞／ｍＬ）（実線）および生存率（％）（破線）のグラフである。高い浸透圧のために、ＶＣＤおよび培養生存率が減少した。

【図4B】バイオリアクターで行った灌流細胞培養の実行における経時的な乳酸濃度（ｇ／Ｌ）（実線）および乳酸浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ）（破線）のグラフである。高い浸透圧は乳酸産生の上昇につながった。

【図5A】１セットの灌流細胞培養バイオリアクターでの経時的な浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ）のグラフであり、異なる浸透圧プロファイルを示すグラフである。

【図5B】バイオリアクターで行った灌流細胞培養の実行における経時的な生細胞密度（ＶＣＤ）（１００万細胞／ｍＬ）（実線）および生細胞平均直径（μｍ）（破線）のグラフである。ＶＣＤプロファイルの違いは、培養浸透圧の違いに対応する。

【図6A】バイオリアクターで行った灌流細胞培養の実行における導電率（ｍＳ／ｃｍ）に対する浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ）のグラフであり、全てのデータを使用したグラフである。

【図6B】バイオリアクターで行った灌流細胞培養の実行における導電率（ｍＳ／ｃｍ）に対する浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ）のグラフであり、リアクタースケールおよび培養の相（低または高バイオマス）によって特徴付けられるデータを使用したグラフである。

【図7】自動化導電率フィードバック制御を有するバイオリアクターで行った灌流細胞培養の実行における経時的な導電率（ｍＳ／ｃｍ）（実線）および浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ）のグラフ（個々のデータ点）である。

【図8A】自動化導電率フィードバック制御を有する１０Ｌバイオリアクターで行った灌流細胞培養の実行における経時的な浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ）のグラフである。

【図8B】１０Ｌバイオリアクターで行った灌流細胞培養の実行における経時的な生細胞密度（ＶＣＤ）（１００万細胞／ｍＬ）（実線）および生細胞平均直径（μｍ）（破線）のグラフであり、一貫したＶＣＤプロファイルを示すグラフである。

【図9】異なるプローブの種類を用いて測定した浸透圧標準物質の浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ）に対する導電率（ｍＳ／ｃｍ）のグラフである。

【図10】１００Ｌバイオリアクターで行った灌流細胞培養の実行における経時的な浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ）のグラフであり、ラマン分光法測定から予測される浸透圧を用いたグラフである。

【図11】１０Ｌバイオリアクターでの、６０日間の灌流細胞培養処理の３０日目の浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ）に対する生細胞密度（ＶＣＤ）（１００万細胞／ｍＬ）のグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0069】

本明細書では、哺乳類細胞の灌流培養方法であって：約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する第１の液体培地中に配置された哺乳類細胞を含む容器を用意することと；約３２℃から約３９℃で哺乳類細胞をある期間インキュベートすることと；その期間の間、連続的または定期的に、第１の液体培地の第１の体積を除去し、第１の液体培地に第２の液体培地の第２の体積を添加することであって、第１および第２の体積はほぼ等しく、容器内の第１および第２の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇにその期間にわたって維持されることとを含む、方法が提供される。これらの方法のいくつかの実施形態は、その期間の間、連続的または定期的に、容器内の第１および第２の液体培地に水溶液の第３の体積を添加することであって、第１の体積と、第２および第３の体積の合計とはほぼ等しく、容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇにその期間にわたって維持されることを更に含む。これらの方法のいくつかの実施形態は、連続的または定期的に、第１の液体培地に第３の液体培地の第３の体積を添加することであって、第１の体積と、第２および第３の体積の合計とはほぼ等しく、容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇにその期間にわたって維持されることを更に含む。いくつかの例では、第３の液体培地は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）または塩化カリウム（ＫＣｌ）を含む。いくつかの例では、容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧を維持することは、第３の液体培地の流量をその期間の間調整することを含む。他の例では、浸透圧は、第３の液体培地の流量によって制御する。他の例では、第３の液体培地は、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有し得る。例えば、第２の液体培地が３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ超の浸透圧を有する場合、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する第３の液体培地を使用できる。いくつかの例では、容器内の第１、第２、および第３の液体培地における浸透圧を維持することは、第３の液体培地の流量をその期間の間調整することを含む。

【0070】

本明細書ではまた、組換えタンパク質の産生方法であって：約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する第１の液体培地中に配置された、組換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞を含む容器を用意することと；約３２℃から約３９℃で哺乳類細胞をある期間インキュベートすることと；その期間の間、連続的または定期的に、第１の液体培地の第１の体積を除去し、第１の液体培地に第２の液体培地の第２の体積を添加することであって、第１および第２の体積はほぼ等しく、容器内の第１および第２の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇにその期間にわたって維持されることと；組換えタンパク質を、哺乳類細胞から、または第１の液体培地および／もしくは第２の液体培地から回収することとを含む、方法も提供される。これらの方法のいくつかの実施形態は、その期間の間、連続的または定期的に、容器内の第１および第２の液体培地に水溶液の第３の体積を添加することであって、第１の体積と、第２および第３の体積の合計とはほぼ等しく、容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇにその期間にわたって維持されることを更に含む。これらの方法のいくつかの実施形態は、連続的または定期的に、第１の液体培地に第３の液体培地の第３の体積を添加することであって、第１の体積と、第２および第３の体積の合計とはほぼ等しく、容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇにその期間にわたって維持されることを更に含む。いくつかの例では、第３の液体培地は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）または塩化カリウム（ＫＣｌ）を含む。いくつかの例では、容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧を維持することは、第３の液体培地の流量をその期間の間調整することを含む。他の例では、第３の液体培地は、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有し得る。例えば、第２の液体培地が３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ超の浸透圧を有する場合、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する第３の液体培地を使用できる。いくつかの例では、容器内の第１、第２、および第３の液体培地における浸透圧を維持することは、第３の液体培地の流量をその期間の間調整することを含む。

【0071】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、第１および第２の液体培地における、または第１、第２、および第３の液体培地における６０×１０^６細胞／ｍＬ超の生細胞密度を有する細胞培養を、その期間の間に達成し得る。細胞培養の生細胞密度を決めるための方法は、当技術分野でよく知られている。

【0072】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、少なくとも５日間（例えば、少なくとも１０日間、少なくとも１５日間、少なくとも２０日間、少なくとも２５日間、少なくとも３０日間、少なくとも３５日間、少なくとも４０日間、少なくとも４５日間、少なくとも５０日間、少なくとも５５日間、少なくとも６０日間、少なくとも６５日間、または少なくとも７０日間）の培養期間にわたって７５％超（例えば、８０％超、８５％超、または９０％超）である細胞生存率パーセンテージを有する細胞培養を提供する。

【0073】

培養体積（１０Ｌ～１０，０００Ｌ流加バッチ、５０～５００Ｌ～２０００Ｌ、５０Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、２０００Ｌ）
任意の本明細書に記載の方法は、インキュベートすることを含み得、約１０Ｌと約１０，０００Ｌとの間（例えば、約１０Ｌと約８，０００Ｌとの間、約１０Ｌと約７，０００Ｌとの間、約１０Ｌと約６，０００Ｌとの間、約１０Ｌと約５，０００Ｌとの間、約１０Ｌと約４，０００Ｌとの間、約１０Ｌと約３，０００Ｌとの間、約１０Ｌと約２，５００Ｌとの間、約１０Ｌと約２，０００Ｌとの間、約１０Ｌと約１，５００Ｌとの間、約１０Ｌと約１，０００Ｌとの間、約１０Ｌと約５００Ｌとの間、約１０Ｌと約２００Ｌとの間、約１０Ｌと約１００Ｌとの間、約２０Ｌと約１０，０００Ｌとの間、約２０Ｌと約８，０００Ｌとの間、約２０Ｌと約７，０００Ｌとの間、約２０Ｌと約６，０００Ｌとの間、約２０Ｌと約５，０００Ｌとの間、約２０Ｌと約４，０００Ｌとの間、約２０Ｌと約３，０００Ｌとの間、約２０Ｌと約２，５００Ｌとの間、約２０Ｌと約２，０００Ｌとの間、約２０Ｌと約１，５００Ｌとの間、約２０Ｌと約１，０００Ｌとの間、約２０Ｌと約５００Ｌとの間、約２０Ｌと約２００Ｌとの間、約２０Ｌと約１００Ｌとの間、約１００Ｌと約１０，０００Ｌとの間、約１００Ｌと約８，０００Ｌとの間、約１００Ｌと約７，０００Ｌとの間、約１００Ｌと約６，０００Ｌとの間、約１００Ｌと約５，０００Ｌとの間、約１００Ｌと約４，０００Ｌとの間、約１００Ｌと約３，０００Ｌとの間、約１００Ｌと約２，０００Ｌとの間、約１００Ｌと約１，５００Ｌとの間、約１００Ｌと約１，０００Ｌとの間、約１００Ｌと約８００Ｌとの間、約１００Ｌと約７００Ｌとの間、約１００Ｌと約６００Ｌとの間、約１００Ｌと約５００Ｌとの間、約１００Ｌと約４００Ｌとの間、約１００Ｌと約３００Ｌとの間、約１００Ｌと約２００Ｌとの間、約５００Ｌと約１０，０００Ｌとの間、約５００Ｌと約８，０００Ｌとの間、約５００Ｌと約７，０００Ｌとの間、約５００Ｌと約６，０００Ｌとの間、約５００Ｌと約５，０００Ｌとの間、約５００Ｌと約４，０００Ｌとの間、約５００Ｌと約３，０００Ｌとの間、約５００Ｌと約２，０００Ｌとの間、約５００Ｌと約１，５００Ｌとの間、約５００Ｌと約１，０００Ｌとの間、約５００Ｌと約７５０Ｌとの間、約１，０００Ｌと約１０，０００Ｌとの間、約１，０００Ｌと約８，０００Ｌとの間、約１，０００Ｌと約７，０００Ｌとの間、約１，０００Ｌと約６，０００Ｌとの間、約１，０００Ｌと約５，０００Ｌとの間、約１，０００Ｌと約４，０００Ｌとの間、約１，０００Ｌと約３，０００Ｌとの間、約１，０００Ｌと約２，０００Ｌとの間、約１，０００Ｌと約１，５００Ｌとの間、約２，０００Ｌと約１０，０００Ｌとの間、約２，０００Ｌと約８，０００Ｌとの間、約２，０００Ｌと約７，０００Ｌとの間、約２，０００Ｌと約６，０００Ｌとの間、約２，０００Ｌと約５，０００Ｌとの間、約２，０００Ｌと約４，０００Ｌとの間、約２，０００Ｌと約３，０００Ｌとの間、約３，０００Ｌと約１０，０００Ｌとの間、約３，０００Ｌと約８，０００Ｌとの間、約３，０００Ｌと約７，０００Ｌとの間、約３，０００Ｌと約６，０００Ｌとの間、約３，０００Ｌと約５，０００Ｌとの間、約３，０００Ｌと約４，０００Ｌとの間、約４，０００Ｌと約１０，０００Ｌとの間、約４，０００Ｌと約８，０００Ｌとの間、約４，０００Ｌと約７，０００Ｌとの間、約４，０００Ｌと約６，０００Ｌとの間、約４，０００Ｌと約５，０００Ｌとの間、約５，０００Ｌと約１０，０００Ｌとの間、約５，０００Ｌと約８，０００Ｌとの間、約５，０００Ｌと約７，０００Ｌとの間、約５，０００Ｌと約６，０００Ｌとの間、約６，０００Ｌと約１０，０００Ｌとの間、約６，０００Ｌと約８，０００Ｌとの間、約６，０００Ｌと約７，０００Ｌとの間、約７，０００Ｌと約１０，０００Ｌとの間、約７，０００Ｌと約８，０００Ｌとの間、または約８，０００Ｌと約１０，０００Ｌとの間、あるいは、１０Ｌ、２０Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、５００Ｌ、１，０００Ｌ、または２，０００Ｌ）の体積（その期間の開始時）を有する第１の液体培地内の哺乳類細胞（例えば、本明細書に記載の哺乳類細胞のいずれか）を含む容器（例えば、本明細書に記載の容器のいずれか）を提供する。哺乳類細胞をインキュベートする工程は、細胞の維持および増殖を可能とする条件下で行う。

【0074】

第１の液体培地は、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ（例えば、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３０５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２９５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２８５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇから約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇから約３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇから約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇから約３０５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇから約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇから約２９５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇから約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇから約２８５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇから約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３０５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２９５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２８５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８５ｍＯｓｍ／ｋｇから約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８５ｍＯｓｍ／ｋｇから約３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８５ｍＯｓｍ／ｋｇから約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８５ｍＯｓｍ／ｋｇから約３０５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８５ｍＯｓｍ／ｋｇから約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８５ｍＯｓｍ／ｋｇから約２９５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８５ｍＯｓｍ／ｋｇから約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３０５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２９５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２９５ｍＯｓｍ／ｋｇから約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２９５ｍＯｓｍ／ｋｇから約３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２９５ｍＯｓｍ／ｋｇから約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２９５ｍＯｓｍ／ｋｇから約３０５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２９５ｍＯｓｍ／ｋｇから約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約３０５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３０５ｍＯｓｍ／ｋｇから約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３０５ｍＯｓｍ／ｋｇから約３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３０５ｍＯｓｍ／ｋｇから約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ、または約３１５ｍＯｓｍ／ｋｇから約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ）の浸透圧を有し得る。第１の液体培地の非限定的な態様および例が本明細書に記載される。

【0075】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、第１の液体培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第１の液体培地のいずれか）に添加する第２の液体培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の液体培地のいずれか）の第２の体積（および場合により第３の液体培地）を、その期間の間のより早い時点で添加する第２の液体培地の第２の体積と比較して、その期間の間、少なくとも１０％（例えば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも２００少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％、あるいは約１０％から約５００％、約１０％から約４００％、約１０％から約３００％、約１０％から約２００％、約１０％から約１００％、約１０％から約５０％、約１０％から約２０％、約２０％から約５００、約２０％から約４００％、約２０％から約３００％、約２０％から約２００％、約２０％から約１００％、約２０％から約５０％、約２０％から約４０％、約２０％から約３０％、約３０％から約５００％、約３０％から約４００％、約３０％から約３００％、約３０％から約２００％、約３０％から約１００％、約３０％から約５０％、約３０％から約４０％、約４０％から約５００約４０％から約４００％、約４０％から約３００％、約４０％から約２００％、約４０％から約１００％、約４０％から約５０％、約５０％から約５００％、約５０％から約４００％、約５０％から約３００％、約５０％から約２００％、約５０％から約１００％、約５０％から約６０％、約６０％から約５００％、約６０％から約４００％、約６０％から約３００％、約６０％から約２００％、約６０％から約１００％、約６０％から約８０％、約６０％から約７０％、約７０％から約５００％、約７０％から約４００％、約７０％から約３００％、約７０％から約２００％、約７０％から約１００％、約７０％から約８０％、約８０％から約５００％、約８０％から約４００％、約８０％から約３００％、約８０％から約２００％、約８０％から約１００％、約８０％から約９０％、約９０％から約５００％、約９０％から約４００％、約９０％から約３００％、約９０％から約２００％、約９０％から約１００％、約１００％から約５００％、約１００％から約４００％、約１００％から約３００％、約１００％から約２００％、約１００％から約１５０％、約２００％から約５００％、約２００％から約４００％、約２００％から約３００％、約２００％から約２５０％、約３００％から約５００％、約３００％から約４００％、約４００％から約５００％、または約４５０％から約５００％）増加させる。

【0076】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、第１の液体培地（例えば、本明細書に記載の第１の液体培地のいずれか）に添加する第２の液体培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の液体培地のいずれか）の第２の体積（および場合により第３の液体培地に対して）を、その期間の間のより早い時点で添加する第２の液体培地の第２の体積と比較して、生細胞密度に基づいてその期間にわたって、少なくとも１０％（例えば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１２０％、少なくとも１４０％、少なくとも１６０％、少なくとも１８０％、少なくとも２００％、少なくとも２２０％、少なくとも２４０％、少なくとも２６０％、少なくとも２８０％、少なくとも３００％、少なくとも３２０％、少なくとも３４０％、少なくとも３６０％、少なくとも３８０％、少なくとも４００％、少なくとも４２０％、少なくとも４４０％、少なくとも４６０％、少なくとも４８０％、または少なくとも５００％、あるいは約１０％から約５００％（または例えば、本明細書に記載のこの範囲のいずれかの部分範囲）増加させる。

【0077】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、第１の液体培地に添加する第２の液体培地（および場合により第３の液体培地）の流量を、その期間の間のより早い時点での第２の液体培地の流量と比較して、その期間の間、少なくとも１０％（例えば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１２０％、少なくとも１４０％、少なくとも１６０％、少なくとも１８０％、少なくとも２００％、少なくとも２２０％、少なくとも２４０％、少なくとも２６０％、少なくとも２８０％、または少なくとも３００％、あるいは約１０％から約３００％、約１０％から約２５０％、約１０％から約２００％、約１０％から約１５０％、約１０％から約１００％、約１０％から約９０％、約１０％から約８０％、約１０％から約７０％、約１０％から約６０％、約１０％から約５０％、約１０％から約４０％、約１０％から約３０％、約１０％から約２０％、約２０％から約３００％、約２０％から約２５０％、約２０％から約２００％、約２０％から約１５０％、約２０％から約１００％、約２０％から約９０％、約２０％から約８０％、約２０％から約７０％、約２０％から約６０％、約２０％から約５０％、約２０％から約４０％、約２０％から約３０％、約３０％から約３００％、約３０％から約２５０％、約３０％から約２００％、約３０％から約１５０％、約３０％から約１００％、約３０％から約９０％、約３０％から約８０％、約３０％から約７０％、約３０％から約６０％、約３０％から約５０％、約３０％から約４０％、約４０％から約３００％、約４０％から約２５０％、約４０％から約２００％、約４０％から約１５０％、約４０％から約１００％、約４０％から約９０％、約４０％から約８０％、約４０％から約７０％、約４０％から約６０％、約４０％から約５０％、約５０％から約３００％、約５０％から約２５０％、約５０％から約２００％、約５０％から約１５０％、約５０％から約１００％、約５０％から約９０％、約５０％から約８０％、約５０％から約７０％、約５０％から約６０％、約６０％から約３００％、約６０％から約２５０％、約６０％から約２００％、約６０％から約１５０％、約６０％から約１００％、約６０％から約９０％、約６０％から約８０％、約６０％から約７０％、約７０％から約３００％、約７０％から約２５０％、約７０％から約２００％、約７０％から約１５０％、約７０％から約１００％、約７０％から約９０％、約７０％から約８０％、約８０％から約３００％、約８０％から約２５０％、約８０％から約２００％、約８０％から約１５０％、約８０％から約１００％、約８０％から約９０％、約９０％から約３００％、約９０％から約２５０％、約９０％から約２００％、約９０％から約１５０％、約９０％から約１００％、約１００％から約３００％、約１００％から約２５０％、約１００％から約２００％、約１００％から約１５０％、約１５０％から約３００％、約１５０％から約２５０％、約１５０％から約２００％、約２００％から約３００％、約２００％から約２５０％、または約２５０％から約３００％）増加させる。

【0078】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、第１の液体培地に添加する第２の液体培地（および場合により第３の液体培地）の流量を、その期間の間のより早い時点での第２の液体培地の流量と比較して、その期間の間、少なくとも１０％（例えば、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１８％、少なくとも２０％、少なくとも２２％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２８％、少なくとも３０％、少なくとも３２％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３８％、少なくとも４０％、少なくとも４２％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４８％、少なくとも５０％、少なくとも５２％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６２％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６８％、少なくとも７０％、少なくとも７２％、少なくとも７４％、少なくとも７６％、少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、あるいは約１％から約１００％、約１％から約９０％、約１％から約８０％、約１％から約７０％、約１％から約６０％、約１％から約５０％、約１％から約４５％、約１％から約４０％、約１％から約３５％、約１％から約３０％、約１％から約２５％、約１％から約２０％、約１％から約１５％、約１％から約１０％、約１％から約５％、約５％から約１００％、約５％から約９０％、約５％から約８０％、約５％から約７０％、約５％から約６０％、約５％から約５０％、約５％から約４５％、約５％から約４０％、約５％から約３５％、約５％から約３０％、約５％から約２５％、約５％から約２０％、約５％から約１５％、約５％から約１０％、約１０％から約１００％、約１０％から約９０％、約１０％から約８０％、約１０％から約７０％、約１０％から約６０％、約１０％から約５０％、約１０％から約４５％、約１０％から約４０％、約１０％から約３５％、約１０％から約３０％、約１０％から約２５％、約１０％から約２０％、約１０％から約１５％、約１５％から約１００％、約１５％から約９０％、約１５％から約８０％、約１５％から約７０％、約１５％から約６０％、約１５％から約５０％、約１５％から約４５％、約１５％から約４０％、約１５％から約３５％、約１５％から約３０％、約１５％から約２５％、約１５％から約２０％、約２０％から約１００％、約２０％から約９０％、約２０％から約８０％、約２０％から約７０％、約２０％から約６０％、約２０％から約５０％、約２０％から約４５％、約２０％から約４０％、約２０％から約３５％、約２０％から約３０％、約２０％から約２５％、約２５％から約１００％、約２５％から約９０％、約２５％から約８０％、約２５％から約７０％、約２５％から約６０％、約２５％から約５０％、約２５％から約４５％、約２５％から約４０％、約２５％から約３５％、約２５％から約３０％、約３０％から約１００％、約３０％から約９０％、約３０％から約８０％、約３０％から約７０％、約３０％から約６０％、約３０％から約５０％、約３０％から約４５％、約３０％から約４０％、約３０％から約３５％、約３５％から約１００％、約３５％から約９０％、約３５％から約８０％、約３５％から約７０％、約３５％から約６０％、約３５％から約５０％、約３５％から約４５％、約３５％から約４０％、約４０％から約１００％、約４０％から約９０％、約４０％から約８０％、約４０％から約７０％、約４０％から約６０％、約４０％から約５０％、約４０％から約４５％、約４５％から約１００％、約４５％から約９０％、約４５％から約８０％、約４５％から約７０％、約４５％から約６０％、約４５％から約５０％、約５０％から約１００％、約５０％から約９０％、約５０％から約８０％、約５０％から約７０％、約５０％から約６０％、約６０％から約１００％、約６０％から約９０％、約６０％から約８０％、約６０％から約７０％、約７０％から約１００％、約７０％から約９０％、約７０％から約８０％、約８０％から約１００％、約８０％から約９０％、または約９０％から約１００％）減少させる。第２の液体培地の非限定的な態様および例が本明細書に記載される。

【0079】

期間（３０～６０日間；７～９０日間、４５日間、６０日間）
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例では、その期間は、約５日間から約１００日間の間（例えば、約５日間と約９５日間との間、約５日間と約９０日間との間、約５日間と約８５日間との間、約５日間と約８０日間との間、約５日間と約７５日間との間、約５日間と約７０日間との間、約５日間と約６５日間との間、約５日間と約６０日間との間、約５日間と約５５日間との間、約５日間と約５０日間との間、約５日間と約４５日間との間、約５日間と約４０日間との間、約５日間と約３５日間との間、約５日間と約３０日間との間、約５日間と約２５日間との間、約５日間と約２０日間との間、約５日間と約１５日間との間、約５日間と約１０日間との間、約５日間と約７日間との間、約７日間と約９５日間との間、約７日間と約９０日間との間、約７日間と約８５日間との間、約７日間と約８０日間との間、約７日間と約７５日間との間、約７日間と約７０日間との間、約７日間と約６５日間との間、約７日間と約６０日間との間、約７日間と約５５日間との間、約７日間と約５０日間との間、約７日間と約４５日間との間、約７日間と約４０日間との間、約７日間と約３５日間との間、約７日間と約３０日間との間、約７日間と約２５日間との間、約７日間と約２０日間との間、約７日間と約１５日間との間、約７日間と約１０日間との間、約１０日間と約１００日間との間、約１０日間と約９５日間との間、約１０日間と約９０日間との間、約１０日間と約８５日間との間、約１０日間と約８０日間との間、約１０日間と約７５日間との間、約１０日間と約７０日間との間、約１０日間と約６５日間との間、約１０日間と約６０日間との間、約１０日間と約５５日間との間、約１０日間と約５０日間との間、約１０日間と約４５日間との間、約１０日間と約４０日間との間、約１０日間と約３５日間との間、約１０日間と約３０日間との間、約１０日間と約２５日間との間、約１０日間と約２０日間との間、約１０日間と約１５日間との間、約１５日間と約１００日間との間、約１５日間と約９５日間との間、約１５日間と約９０日間との間、約１５日間と約８５日間との間、約１５日間と約８０日間との間、約１５日間と約７５日間との間、約１５日間と約７０日間との間、約１５日間と約６５日間との間、約１５日間と約６０日間との間、約１５日間と約５５日間との間、約１５日間と約５０日間との間、約１５日間と約４５日間との間、約１５日間と約４０日間との間、約１５日間と約３５日間との間、約１５日間と約３０日間との間、約１５日間と約２５日間との間、約１５日間と約２０日間との間、約３０日間と約１００日間との間、約３０日間と約９０日間との間、約３０日間と約８０日間との間、約３０日間と約７０日間との間、約３０日間と約６０日間との間、約３０日間と約５０日間との間、約３０日間と約４０日間との間、約４０日間と約１００日間との間、約４０日間と約９０日間との間、約４０日間と約８０日間との間、約４０日間と約７０日間との間、約４０日間と約６０日間との間、約４０日間と約５０日間との間、約５０日間と約１００日間との間、約５０日間と約９０日間との間、約５０日間と約８０日間との間、約５０日間と約７０日間との間、約５０日間と約６０日間との間、約６０日間と約１００日間との間、約６０日間と約９０日間との間、約６０日間と約８０日間との間、約６０日間と約７０日間との間、約７０日間と約１００日間との間、約７０日間と約９０日間との間、約７０日間と約８０日間との間、約８０日間と約１００日間との間、約８０日間と約９０日間との間、または約９０日間と約１００日間との間、あるいは７日間、２１日間、２８日間、３０日間、３１日間、４５日間、６０日間、または９０日間）である。

【0080】

哺乳類細胞
本明細書で提供される方法で培養した（例えば、灌流培養した）哺乳類細胞は、浮遊状態で増殖する細胞または付着細胞であり得る。本明細書に記載の方法のいずれかで培養できる哺乳類細胞の非限定的な例としては以下が挙げられる：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞またはＣＨＯ－Ｋ１ｓ細胞）、Ｓｐ２．０、骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ／０）、Ｂ細胞、ハイブリドーマ細胞、Ｔ細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（例えば、ＨＥＫ ２９３ＥおよびＨＥＫ ２９３Ｆ）、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞（ベロ）細胞、ＮＳＯ細胞、仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ベロ細胞、ＨＴ－１０８０細胞、ならびにメイディン・ダービー・イヌ（コッカースパニエル）腎臓上皮細胞（ＭＤＣＫ）細胞。付着細胞が培養されるいくつかの例では、培養はまた、複数のマイクロキャリア（例えば、１つまたはそれ以上の細孔を含むマイクロキャリア）も含み得る。本明細書に記載の方法のいずれかで培養できる追加の哺乳類細胞は、当技術分野で知られている。

【0081】

哺乳類細胞は、組換えタンパク質（例えば、本明細書に記載の例示的な組換えタンパク質のいずれか）をコードする組換え核酸（例えば、哺乳類細胞のゲノムに安定に組み込まれた核酸）を含み得る。例示的な組換えタンパク質をコードする組換え核酸の非限定的な例は、本明細書に記載の方法を使用して産生できる組換えタンパク質と同様に、以下に記載される。いくつかの例では、バイオリアクター（例えば、本明細書に記載のバイオリアクターのいずれか）内で培養する哺乳類細胞は、より大規模な培養に由来する。

【0082】

組換えタンパク質をコードする核酸は、分子生物学および分子遺伝学で知られている多様な方法を使用して哺乳類細胞に導入できる。非限定的な例としては、トランスフェクション（例えば、リポフェクション）、形質導入（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、またはレトロウイルス感染）、およびエレクトロポレーションが挙げられる。いくつかの例では、組換えタンパク質をコードする核酸は、哺乳類細胞の染色体に安定に組み込まれない（一過性トランスフェクション）が、他の例では、核酸は組み込まれる。あるいはまたは更に、組換えタンパク質をコードする核酸は、プラスミド中に、および／または哺乳類人工染色体（例えば、ヒト人工染色体）中に存在してもよい。あるいはまたは更に、核酸は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルスベクター）を使用して細胞に導入できる。核酸は、プロモーター配列（例えば、強力なプロモーター、例えば、β－アクチンプロモーターおよびＣＭＶプロモーター、または誘導性プロモーター）に作動可能に連結される。核酸を含むベクターはまた、所望により、選択可能なマーカー（例えば、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、またはネオマイシン耐性を哺乳類細胞に与える遺伝子）も含み得る。

【0083】

いくつかの例では、組換えタンパク質は、分泌されるタンパク質であり、哺乳類細胞によって、細胞外培地（例えば、灌流培養における第１および／または第２の液体培地、あるいは流加培養における第１の液体培地および／または供給液体培地）中に放出される。例えば、可溶性組換えタンパク質をコードする核酸配列は、哺乳類細胞中に存在する酵素によって切断され、続いて細胞外培地（例えば、第１および／または第２の液体培地）中に放出される、組換えタンパク質のＮまたはＣ末端にある分泌シグナルペプチドをコードする配列を含み得る。

【0084】

容器（１０Ｌ～１０，０００Ｌ流加バッチ、５０Ｌ～５００Ｌ～２，０００Ｌ、５０Ｌ、５００Ｌ、１，０００Ｌ、２，０００Ｌ）
任意の本明細書に記載の方法における培養工程は、容器、例えば、バイオリアクター（例えば、灌流バイオリアクター）を使用して行うことができる。バイオリアクター（例えば、灌流バイオリアクター）は、約１０Ｌと約１０，０００Ｌとの間（例えば、約１０Ｌと約８，０００Ｌとの間、約１０Ｌと約７，０００Ｌとの間、約１０Ｌと約６，０００Ｌとの間、約１０Ｌと約５，０００Ｌとの間、約１０Ｌと約４，０００Ｌとの間、約１０Ｌと約３，０００Ｌとの間、約１０Ｌと約２，５００Ｌとの間、約１０Ｌと約２，０００Ｌとの間、約１０Ｌと約１，５００Ｌとの間、約１０Ｌと約１，０００Ｌとの間、約１０Ｌと約５００Ｌとの間、約１０Ｌと約２００Ｌとの間、約１０Ｌと約１００Ｌとの間、約２０Ｌと約１０，０００Ｌとの間、約２０Ｌと約８，０００Ｌとの間、約２０Ｌと約７，０００Ｌとの間、約２０Ｌと約６，０００Ｌとの間、約２０Ｌと約５，０００Ｌとの間、約２０Ｌと約４，０００Ｌとの間、約２０Ｌと約３，０００Ｌとの間、約２０Ｌと約２，５００Ｌとの間、約２０Ｌと約２，０００Ｌとの間、約２０Ｌと約１，５００Ｌとの間、約２０Ｌと約１，０００Ｌとの間、約２０Ｌと約５００Ｌとの間、約２０Ｌと約２００Ｌとの間、約２０Ｌと約１００Ｌとの間、約１００Ｌと約１０，０００Ｌとの間、約１００Ｌと約８，０００Ｌとの間、約１００Ｌと約７，０００Ｌとの間、約１００Ｌと約６，０００Ｌとの間、約１００Ｌと約５，０００Ｌとの間、約１００Ｌと約４，０００Ｌとの間、約１００Ｌと約３，０００Ｌとの間、約１００Ｌと約２，０００Ｌとの間、約１００Ｌと約１，５００Ｌとの間、約１００Ｌと約１，０００Ｌとの間、約１００Ｌと約８００Ｌとの間、約１００Ｌと約７００Ｌとの間、約１００Ｌと約６００Ｌとの間、約１００Ｌと約５００Ｌとの間、約１００Ｌと約４００Ｌとの間、約１００Ｌと約３００Ｌとの間、約１００Ｌと約２００Ｌとの間、約５００Ｌと約１０，０００Ｌとの間、約５００Ｌと約８，０００Ｌとの間、約５００Ｌと約７，０００Ｌとの間、約５００Ｌと約６，０００Ｌとの間、約５００Ｌと約５，０００Ｌとの間、約５００Ｌと約４，０００Ｌとの間、約５００Ｌと約３，０００Ｌとの間、約５００Ｌと約２，０００Ｌとの間、約５００Ｌと約１，５００Ｌとの間、約５００Ｌと約１，０００Ｌとの間、約５００Ｌと約７５０Ｌとの間、約１，０００Ｌと約１０，０００Ｌとの間、約１，０００Ｌと約８，０００Ｌとの間、約１，０００Ｌと約７，０００Ｌとの間、約１，０００Ｌと約６，０００Ｌとの間、約１，０００Ｌと約５，０００Ｌとの間、約１，０００Ｌと約４，０００Ｌとの間、約１，０００Ｌと約３，０００Ｌとの間、約１，０００Ｌと約２，０００Ｌとの間、約１，０００Ｌと約１，５００Ｌとの間、約２，０００Ｌと約１０，０００Ｌとの間、約２，０００Ｌと約８，０００Ｌとの間、約２，０００Ｌと約７，０００Ｌとの間、約２，０００Ｌと約６，０００Ｌとの間、約２，０００Ｌと約５，０００Ｌとの間、約２，０００Ｌと約４，０００Ｌとの間、約２，０００Ｌと約３，０００Ｌとの間、約３，０００Ｌと約１０，０００Ｌとの間、約３，０００Ｌと約８，０００Ｌとの間、約３，０００Ｌと約７，０００Ｌとの間、約３，０００Ｌと約６，０００Ｌとの間、約３，０００Ｌと約５，０００Ｌとの間、約３，０００Ｌと約４，０００Ｌとの間、約４，０００Ｌと約１０，０００Ｌとの間、約４，０００Ｌと約８，０００Ｌとの間、約４，０００Ｌと約７，０００Ｌとの間、約４，０００Ｌと約６，０００Ｌとの間、約４，０００Ｌと約５，０００Ｌとの間、約５，０００Ｌと約１０，０００Ｌとの間、約５，０００Ｌと約８，０００Ｌとの間、約５，０００Ｌと約７，０００Ｌとの間、約５，０００Ｌと約６，０００Ｌとの間、約６，０００Ｌと約１０，０００Ｌとの間、約６，０００Ｌと約８，０００Ｌとの間、約６，０００Ｌと約７，０００Ｌとの間、約７，０００Ｌと約１０，０００Ｌとの間、約７，０００Ｌと約８，０００Ｌとの間、または約８，０００Ｌと約１０，０００Ｌとの間、あるいは約１０Ｌ、約２０Ｌ、約５０Ｌ、約１００Ｌ、約５００Ｌ、約１，０００Ｌ、または約２，０００Ｌ）の内部体積（容量）を有し得る。

【0085】

培養システム
本明細書に記載の方法のいくつかは、容器、および容器（例えば、本明細書に記載の培地のいずれか）内に配置された第１の液体培地を含むシステム（例えば、灌流培養システム）を使用する。容器は、約１０Ｌから約２５，０００Ｌの間（または、例えば、本明細書に記載のこの範囲のいずれかの部分範囲）の内部体積（容量）を有し得る。容器は、金属（例えば、ステンレス鋼）、プラスチック、もしくはガラス、またはその任意の組み合わせから作製できる。

【0086】

システムは、容器内に配置された液体培地を撹拌するための器具（例えば、羽根車および羽根車を回転させるモーター）を含み得る。容器は、容器内に配置された液体培地への物質（例えば、液体培地、ポロキサマー－１８８、（随時、ｐＨを調整するために）塩基または酸）の添加、および／または液体培地（例えば、清澄化液体培地または細胞培養の試料）の除去を可能とする、１つまたはそれ以上のポート（および場合によりポンプ）を含み得る。

【0087】

培養システムはまた、液体培地におけるｐＨ、ｄＯ_２、温度、およびｐＣＯ_２を培養期間の間モニタリングするための１つまたはそれ以上のセンサーも含むことができる。いくつかの実施形態では、培養システムは、静電容量センサー、導電率センサー、および／またはラマンセンサーをはじめとする１つまたはそれ以上のセンサーを含み得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、静電容量センサー、導電率センサー、および／またはラマンセンサーをはじめとする１つまたはそれ以上のセンサーを含み得る。いくつかの実施形態では、フィルター透過は、静電容量センサー、導電率センサー、および／またはラマンセンサーをはじめとする１つまたはそれ以上のセンサーを含み得る。培養システムは、一定量の細胞培養物を処理して、細胞を実質的に含まない清澄化液体培地を提供するろ過器具（例えば、交互接線ろ過または接線流ろ過を行う器具）を含み得る。培養システムは、容器内に配置された液体培地の温度の調整を可能とする加熱／冷却器具を含み得る。細胞培養システムの追加の構成は、当技術分野でよく知られている。

【0088】

灌流培養
いくつかの例では、灌流培養は、ある期間の間、容器（例えば、バイオリアクター）からの第１の液体培地の第１の体積を除去し、バイオリアクターへの第２の液体培地の第２の体積を添加することであって、第１の体積および第２の体積がほぼ等しいことを含む。

【0089】

他の例では、灌流培養は、容器（例えば、バイオリアクター）からの第１の液体培地の第１の体積の除去、ならびに容器への第２の液体培地の第２の体積および第３の液体培地の第３の体積を添加することであって、第１の体積と、第２および第３の体積の合計とがほぼ等しいことを含む。

【0090】

哺乳類細胞は、何らかの細胞保持器具によって、または沈降コーンでの細胞沈降などの手法によって、バイオリアクター内に保持する。

【0091】

灌流培養における培地の除去および添加は、同時にまたは逐次、あるいはその２つのある組み合わせで行うことができる。更に、除去および添加は、連続的に、例えば、０．１％から４００％の間、約２５％から４００％の間、約２５％から約３００％の間、約２５％から約２００％の間、約２５％から約１００％の間、約２５％から約５０％の間、約５０％から約４００％の間、約５０％から約１００％の間、約５０％から約２００％の間、約５０％から約３００％の間、約５０％から約４００％の間、約１００％から約４００％の間、約１００％から約３００％の間、約１００％から約２００％の間の体積、あるいはバイオリアクターの体積の約２５％、約５０％、約７５％、約１００％、約１５０％、約２００％、約２５０％、約３００％、約３５０％または約４００％を除去および置換する割合で行うことができる。

【0092】

除去する第１の液体培地の第１の体積、ならびに添加する第２の液体培地の第２の体積（および場合により、添加する第３の液体培地）は、いくつかの例では、それぞれ２４時間の期間にわたって、ほぼ同じに保持される。当技術分野で知られているように、第１の液体培地の第１の体積を除去する割合（体積／単位時間）、ならびに第２の液体培地の第２の体積を添加する割合（体積／単位時間）（および場合により、第３の液体培地の第３の体積を添加する割合（体積／単位時間））は、変化させることができ、特定の細胞培養システムの条件に依存する。

【0093】

第１の液体培地の第１の体積を除去する割合（体積／単位時間）、ならびに第２の液体培地の第２の体積を添加する割合（体積／単位時間）（および場合により、第３の液体培地の第３の体積を添加する割合（体積／単位時間））は、ほぼ同じであってもよいし、異なっていてもよい。

【0094】

あるいは、除去および添加する体積は、それぞれ２４時間の期間にわたって徐々に増加させることによって変化させ得る。例えば、それぞれ２４時間の期間内に除去する第１の液体培地の体積、ならびに添加する第２の液体培地の体積（および場合により、添加する第３の液体培地の体積）は、培養期間にわたって増加し得る。体積は、バイオリアクター体積の０．５％から約２０％の間である体積から、培養期間にわたって増加できる。体積は、バイオリアクター容量または培養期間開始時の細胞培養体積の約２５％から約１５０％まで、培養期間にわたって増加できる。

【0095】

本明細書に記載の方法のいくつかの例では、培養期間の最初の４８から９６時間後に、それぞれ２４時間の期間（培養期間内）において、除去する第１の液体培地の第１の体積、ならびに添加する第２の液体培地の第２の体積（および場合により、添加する第３の液体培地の第３の体積も）は、培養期間開始時の細胞培養体積の約１０％から約９５％、約１０％から約２０％、約２０％から約３０％、約３０％から約４０％、約４０％から約５０％、約５０％から約６０％、約６０％から約７０％、約７０％から約８０％、約８０％から約９０％、約８５％から約９５％、約６０％から約８０％、または約７０％である。

【0096】

当業者は、第１の液体培地と第２の液体培地とが、同じ種類の培地であってもよいことを理解するであろう。他の例では、第１の液体培地と第２の液体培地とが、違う種類の液体培地または違う濃度の液体培地であってもよい。第２の液体培地は、１つまたはそれ以上の培地成分に関して、第１の液体培地および第３の液体培地と比較してより濃縮されていてもよい。

【0097】

第１の液体培地の第１の体積は、任意の自動化システムを使用することによって除去できる。例えば、交互接線流ろ過を使用できる。あるいは、第１の液体培地の第１の体積は、哺乳類細胞を排除する分子量カットオフを有する滅菌膜を通した第１の液体培地の第１の体積の滲出または重力による流れによって除去できる。あるいは、第１の液体培地の第１の体積は、少なくとも１分間、少なくとも２分間、３分間、４分間、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、４０分間、５０分間、または１時間の期間の撹拌を停止しまたは速度を顕著に低下させ、バイオリアクターの上部から第１の液体培地の第１の体積を除去または吸引することによって除去できる。

【0098】

第２の液体培地の第２の体積（および場合により、第３の液体培地の第３の体積）は、ポンプによって第１の液体培地に添加できる。第２の液体培地（および場合により、第３の液体培地）は、第１の液体培地に第２の液体培地の第２の体積（および場合により、第３の液体培地の第３の体積）を、第１の液体培地に直接ピペッティングもしくは注入することで、または自動化された様式で添加できる。

【0099】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態は、約３２℃から約３９℃の間の温度で容器を撹拌しながら少なくとも約７日間の期間インキュベートすることと；その期間の間、連続的または定期的に、第１の液体培地の第１の体積を除去し、第１の液体培地に第２の液体培地の第２の体積を添加することであって、第１および第２の体積はほぼ等しく、容器内の第１および第２の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇにその期間にわたって維持されることとを含む。

【0100】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態は、約３２℃から約３９℃の間の温度で容器を撹拌しながら少なくとも約７日間の期間インキュベートすることと；その期間の間、連続的または定期的に、第１の液体培地の第１の体積の除去、ならびに第１の液体培地に第２の液体培地の第２の体積および第３の液体培地の第３の体積を添加することであって、第１の体積と、第２および第３の体積の合計とはほぼ等しく、容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇにその期間にわたって維持されることとを含む。

【0101】

灌流培養のいくつかの例は、約３２℃から約３９℃の間の温度で第１の液体培地を含む培養システムを撹拌しながら少なくとも約７日間の培養期間インキュベートすることと；連続的または定期的に、第１の液体培地の第１の体積を除去し、第１の液体培地に第２の液体培地の第２の体積を添加することであって、第１および第２の体積はほぼ等しく、容器内の第１および第２の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇにその期間にわたって維持されることとを含む。

【0102】

灌流培養のいくつかの例は、約３２℃から約３９℃の間の温度で第１の液体培地を含む培養システムを撹拌しながら少なくとも約７日間の培養期間インキュベートすることと；連続的または定期的に、第１の液体培地の第１の体積の除去、ならびに第１の液体培地に第２の液体培地の第２の体積および第３の液体培地の第３の体積を添加することであって、第１の体積と、第２および第３の体積の合計とはほぼ等しく、容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇにその期間にわたって維持されることとを含む。

【0103】

いくつかの実施形態では、第１の液体培地は、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ（例えば、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３３０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３３０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３３０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３３０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３３０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３９０ｍＯｓｍ／ｋｇ、または約３９０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ）の浸透圧を有し得る。

【0104】

いくつかの実施形態では、第１の液体培地は、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３９０ｍＯｓｍ／ｋｇ、または約４００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有し得る。

【0105】

いくつかの実施形態では、第２の液体培地は、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ（例えば、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約７００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約７００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約７００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約７００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約７００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２，２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２，２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、または約２，４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ）の浸透圧を有し得る。

【0106】

いくつかの実施形態では、第２の液体培地は、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約７００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約７２ｍＯｓｍ／ｋｇ、約７４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約７５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約７６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約７８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約９００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約９２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約９４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約９５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約９６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約９８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，１００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，７００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，９００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２，１００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２，２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２，３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２，４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、または約２，５００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する。

【0107】

液体培地の浸透圧を決めるための方法は、当技術分野でよく知られている。浸透圧は、オフライン試料採取を使用して凝固点降下により測定する。市販の浸透圧計、例えば、ＯｓｍｏＴＥＣＨ（登録商標）ｐｒｏ ｍｕｌｔｉ－ｓａｍｐｌｅ ｍｉｃｒｏ－ｏｓｍｏｍｅｔｅｒもまた当技術分野でよく知られている。浸透圧の連続モニタリングは、ラマン分光法によって行うことができる。例えば、Ｍｏｒｅｔｔｏら、Ａｍ Ｐｈａｒｍａ Ｒｅｖ．、１４（３）、２０１１、およびＷｈｅｌａｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、２８（５）：１３５５～１３６２、２０１２年９月～１０月を参照されたい。

【0108】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態は、その期間の間、容器内の第１および第２の液体培地に水溶液の第３の体積を添加することであって、第１の体積と、第２および第３の体積の合計とはほぼ等しく、容器内の第１および第２の液体培地、ならびに水溶液の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ（または、例えば、本明細書に記載のこの範囲のいずれかの部分範囲）にその期間にわたって維持されることを更に含む。例えば、水溶液は、塩溶液、例えば、塩化ナトリウム溶液および塩化カリウム溶液であり得る。いくつかの実施形態では、第１の液体培地は、本明細書に記載の第１の液体培地のいずれかであり得、第２の液体培地は、本明細書に記載の第２の液体培地のいずれかであり得る。

【0109】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態は、連続的または定期的に、第１の液体培地に第３の液体培地の第３の体積を添加することであって、第１の体積と、第２および第３の体積の合計とはほぼ等しく、容器内の第１、第２、および第３の液体培地の浸透圧は約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ（または、例えば、この範囲のいずれかの部分範囲）にその期間にわたって維持されることを更に含む。これらの方法のいくつかの実施形態では、第１の液体培地は、本明細書に記載の例示的な第１の液体培地のいずれかであり得、第２の液体培地は、本明細書に記載の例示的な第２の液体培地のいずれかであり得る。これらの方法のいくつかの実施形態では、容器内の第１、第２、および第３の液体培地における浸透圧を維持することは、第２の液体培地の流量をその期間の間調整することを含む。いくつかの実施形態では、調整する工程は、第２の液体培地の流量をその期間の間のある時点で増加させることを含む。いくつかの例では、調整する工程は、第２の液体培地の流量をその期間の間のある時点で減少させることを含む。

【0110】

いくつかの例では、第３の液体培地は、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ（例えば、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約１００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１ｍＯｓｍ／ｋｇから約５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約１００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、
約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６０ｍＯｓｍ／ｋｇから約８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、
約８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇから約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇから約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇから約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇから約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇから約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇから約８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇから約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇから約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇから約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇから約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、
約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇから約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇから約８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約５，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約７，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約８，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約９，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１０，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、または約１１，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから約１２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇ）の浸透圧を有し得る。いくつかの実施形態では、第３の液体培地は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）または塩化カリウム（ＫＣｌ）を含む。

【0111】

いくつかの実施形態は、容器内の第１、第２、および第３の液体培地のｐＨおよびｐＣＯ_２の一方または両方を、その期間の間のある時点で調整することを更に含む。いくつかの例では、方法は、その期間にわたって、容器内の第１、第２、および第３の液体培地のｐＣＯ_２を増加させ、ｐＨを増加させることを含む。いくつかの例では、第１、第２、および第３の液体培地のｐＣＯ_２およびｐＨは、容器においてその期間にわたって測定する。

【0112】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、第１および／または第２の液体培地の浸透圧は、以下の１つまたはそれ以上によって制御する：第１および／または第２の液体培地と、水溶液（例えば、水）との比、第１および／または第２の液体培地と、濃度オスモライト（例えば、塩化ナトリウム）との比、容器（例えば、本明細書に記載の容器（例えば、バイオリアクター）のいずれか）における生細胞密度、第１および／または第２の液体培地のｐＨ、容器（例えば、本明細書に記載の容器（例えば、バイオリアクター）のいずれか）における溶存ＣＯ_２（ｄＣＯ_２）のレベル、容器（例えば、本明細書に記載の容器（例えば、バイオリアクター）のいずれか）への炭素（例えば、グルコース）投与量。

【0113】

Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８（ポロキサマー－１８８）
ポロキサマー－１８８は、当技術分野で知られている分子である。ポロキサマー－１８８は、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドの非イオン性合成ブロックコポリマーである。ポロキサマー－１８８は、７６８０から約９５１０の間の平均分子量を有し、その組成の約８１．８重量％（１．９重量％）がオキシエチレンに相当する。例えば、ポロキサマー－１８８は、以下の式Ｉ（式中、ａは８０であり、ｂは２７である）に示す構造を有する。ポロキサマー－１８８は、ＣＡＳ番号９００３－１１－６を有する。

【0114】

【化1】

【0115】

ポロキサマー－１８８は、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）、ＭＡＳＴ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）、ＢＡＳＦ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、およびＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＬＬＣ（Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）を含む多くの異なる販売会社から市販されている。

【0116】

いくつかの実施形態では、第２の液体培地は、約８ｇ／Ｌ超の濃度（例えば、約９．０ｇ／Ｌの濃度もしくは９．０ｇ／Ｌ超の濃度、約１０．０ｇ／Ｌの濃度もしくは１０．０ｇ／Ｌ超の濃度、約１２．０ｇ／Ｌの濃度もしくは１２．０ｇ／Ｌ超の濃度、約１４．０ｇ／Ｌの濃度もしくは１４．０ｇ／Ｌ超の濃度、または約１６．０ｇ／Ｌの濃度もしくは１６．０ｇ／Ｌ超の濃度）を含み得る。

【0117】

いくつかの実施形態では、第２の液体培地は、ポロキサマー－１８８を、約８ｇ／Ｌと約１６ｇ／Ｌとの間（例えば、約８．０ｇ／Ｌと約１４．０ｇ／Ｌとの間、約８．０ｇ／Ｌと約１２．０ｇ／Ｌとの間、約８．０ｇ／Ｌと約１０．０ｇ／Ｌとの間、約１０．０ｇ／Ｌと約１６．０ｇ／Ｌとの間、約１０．０ｇ／Ｌと約１２．０ｇ／Ｌとの間、約１２．０ｇ／Ｌと約１６．０ｇ／Ｌとの間、約１２．０ｇ／Ｌと約１４．０ｇ／Ｌとの間、約１４．０ｇ／Ｌと約１６．０ｇ／Ｌとの間、または約１５．０ｇ／Ｌと約１６．０ｇ／Ｌとの間）の濃度で含むことができる。

【0118】

いくつかの実施形態では、第３の液体培地は、ポロキサマー－１８８を、約０ｇ／Ｌと約８ｇ／Ｌとの間（例えば、約０ｇ／Ｌと約６ｇ／Ｌとの間、約０ｇ／Ｌから約４ｇ／Ｌ、約０ｇ／Ｌから約２ｇ／Ｌ、約０ｇ／Ｌから約１ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌと約８ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約６．０ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約４．０ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約２．０ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約８ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約６．０ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約４．０ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約８ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約６．０ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約４．０ｇ／Ｌとの間、約５．０ｇ／Ｌと約８ｇ／Ｌとの間、約５．０ｇ／Ｌと約６．０ｇ／Ｌとの間、約６．０ｇ／Ｌと約８ｇ／Ｌとの間、または約７．０ｇ／Ｌと約８ｇ／Ｌとの間）の濃度で含むことができる。

【0119】

本明細書で提供される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、培養におけるポロキサマー－１８８濃度を経時的に増加させることを含む。いくつかの実施形態では、培地は、以下の群から選択される１つまたはそれ以上の要因に基づいて選択されるポロキサマー－１８８濃度を含む：培地における気体流量および生細胞密度。これらの方法では、選択された培地中のポロキサマー－１８８濃度は、培養工程の前に培地にポロキサマー－１８８を添加すること、および／または培養工程の間に培地にポロキサマー－１８８を添加することによって達成できる。選択されたポロキサマー－１８８濃度は、本明細書に記載のポロキサマー－１８８の例示的な濃度または範囲のいずれかであり得る。

【0120】

培地
液体培地は当技術分野で知られている。液体培地（例えば、第１、第２、および／または第３の液体培地）は、哺乳類血清（例えば、ウシ胎児血清およびウシ血清）、ならびに／または成長ホルモンもしくは増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、および上皮増殖因子）を添加できる。あるいはまたは更に、液体培地（例えば、第１、第２、および／または第３の液体培地）は、化学的に定義された液体培地、無動物由来成分液体培地、無血清液体培地、または血清含有液体培地であり得る。化学的に定義された液体培地、無動物由来成分液体培地、無血清液体培地、および血清含有液体培地の非限定的な例は、市販されている。

【0121】

液体培地は、通常、エネルギー源（例えば、グルコースなどの炭水化物）、必須アミノ酸（例えば、２０種類のアミノ酸の基本セットおよびシステイン）、低濃度の必要とされるビタミンおよび／もしくは他の有機化合物、遊離脂肪酸、ならびに／または微量元素を含む。液体培地（例えば、第１、第２、および／または第３の液体培地）は、所望により、例えば、哺乳類のホルモンもしくは増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、もしくは上皮増殖因子）、塩および緩衝剤（例えば、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、ヌクレオシドおよび塩基（例えば、アデノシン、チミジン、およびヒポキサンチン）、タンパク質および組織加水分解物、ならびに／またはこれらの添加物の任意の組み合わせを添加できる。

【0122】

本明細書に記載の方法のいずれかで細胞（例えば、哺乳類細胞）を培養するのに使用できる多種多様な液体培地が当技術分野で知られている。本処理においても有用であり得る培地成分としては、ＣＤ（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ）加水分解物、例えば、ＣＤペプトン、ＣＤポリペプチド（２種類以上のアミノ酸）、およびＣＤ増殖因子が挙げられるが、しかし、これらに限定されない。液体培地および培地成分の追加の例は、当技術分野で知られている。

【0123】

当業者は、本明細書に記載の第１の液体培地と第２の液体培地と第３の液体培地とが同じ種類の培地であっても異なる培地であってもよいことを理解するであろう。

【0124】

細胞培養から得られる液体培地は、ろ過または清澄化して、細胞および／またはウイルスを実質的に含まない液体培地を得ることができる。細胞を除去するために液体培地をろ過または清澄化するための方法は、当技術分野で知られている（例えば、０．２μｍろ過、および交互接線流（ＡＴＦＴＭ）システムを使用するろ過）。哺乳類細胞はまた、遠心分離を使用することと、細胞を実質的に含まない液体培地である上清を取ることとによって、あるいは細胞を、液体培地を含む容器またはバイオリアクターの重力上の底に沈降させることと、沈降した組換え細胞から離れた液体培地（細胞を実質的に含まない液体培地）を取ることとによって、液体培地から除去することもできる。

【0125】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、第１、第２、および／または第３の液体培地は、約６．０から約６．８（例えば、その中のいずれかの部分範囲）のｐＨを有する。

【0126】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、第１、第２および／または第３の液体培地は、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、第１、第２および／または第３の液体培地は、以下の１つまたはそれ以上を更に含む：Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－ヒスチジン、ヒドロキシ－Ｌ－プロリン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－バリン、コリン、イノシトール、ビオチン、カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２、リポ酸、グルタチオン、リノール酸、ピルビン酸塩、ＨＥＰＥＳ、第一鉄、クエン酸、亜鉛、銅、亜セレン酸塩、エタノールアミン、プトレッシン、スペルミン、カリウム、リン酸塩、マグネシウム、アルミニウム、バナジン酸塩、モリブデン酸塩、マンガン、ニッケル、ケイ酸塩、およびスズ。

【0127】

ｐＨ（６～８、６．５～７．５）
本明細書に記載の方法は、約６．８から約７．１のｐＨで行う。

【0128】

第１、第２、および／または第３の液体培地は、約６．８から約７．１（例えば、約６．８から約７．０、約６．８から約６．９、約６．９から約７．１、約６．９から約７．０、または約７．０から約７．２）のｐＨを有し得る。

【0129】

いくつかの実施形態では、第１、第２、および／または第３の液体培地は、約６．８、約６．９、約７．０、または約７．１のｐＨを有し得る。

【0130】

温度（３０^ｏＣ～４０^ｏＣ；３７^ｏＣ）
哺乳類細胞をインキュベートする工程は、約３２℃から約３９℃（例えば、約３２℃から約３８℃、約３２℃から約３６℃、約３２℃から約３５℃、約３２℃から約３４℃、約３４℃から約３９℃、約３４℃から約３８℃、約３４℃から約３６℃、約３５℃から約３９℃、約３５℃から約３８℃、約３５℃から約３７℃、約３６℃から約３９℃、約３６℃から約３８℃、または約３７℃から約３９℃）の温度で行うことができる。

【0131】

いくつかの実施形態では、哺乳類細胞をインキュベートする工程は、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、または約３９℃の温度で行う。

【0132】

当業者は、温度を培養工程の間の特定の時点で、例えば、１時間毎にまたは１日毎に変更できることを理解するであろう。例えば、温度は、細胞（例えば、哺乳類細胞）をバイオリアクターに最初に播種してから約１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１４日後、１５日後、１６日後、１７日後、１８日後、１９日後、または約２０日以上後に変化またはシフト（例えば、増加または減少）することができる。例えば、温度は上方にシフトすることができる（例えば、最大または約セ氏０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５度、あるいは最大セ氏約１０度の変化）。例えば、温度は下方にシフトすることができる（例えば、最大または約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９℃、あるいは最大または約２０℃の変化）。

【0133】

ＣＯ_２（溶存ＣＯ２を２０～２００ｍｍＨｇ；８０～１４０ｍｍＨｇの範囲の分圧に制御する）
インキュベートする工程は、バイオリアクター内の液体培地を、多くともまたは約１５％のＣＯ_２（例えば、多くともまたは約１４％のＣＯ_２、１２％のＣＯ_２、１０％のＣＯ_２、８％のＣＯ_２、６％のＣＯ_２、５％のＣＯ_２、４％のＣＯ_２、３％のＣＯ_２、２％のＣＯ_２、あるいは多くともまたは約１％のＣＯ_２）を含む雰囲気に曝露することを含むことができる。

【0134】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、その期間の間のある時点で、容器（例えば、本明細書に記載の容器のいずれか（例えば、バイオリアクター））内の第１および第２の液体培地のｐＣＯ_２を少なくとも１０％（例えば、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１８％、少なくとも２０％、少なくとも２２％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２８％、少なくとも３０％、少なくとも３２％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３８％、少なくとも４０％、少なくとも４２％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４８％、少なくとも５０％、少なくとも５２％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６２％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６８％、少なくとも７０％、少なくとも７２％、少なくとも７４％、少なくとも７６％、少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）増加させることと、容器（例えば、本明細書に記載の容器のいずれか（例えば、バイオリアクター））内の第１および第２の液体培地のｐＨを少なくとも８％（例えば、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１８％、少なくとも２０％、少なくとも２２％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２８％、少なくとも３０％、少なくとも３２％）増加させることとを更に含む。

【0135】

本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、容器（例えば、本明細書に記載の容器のいずれか（例えば、バイオリアクター））内の第１、第２、および／または第３の液体培地のｐＣＯ_２およびｐＨを、生細胞密度に基づいてその期間にわたって、（例えば、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１８％、少なくとも２０％、少なくとも２２％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２８％、少なくとも３０％、少なくとも３２％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３８％、少なくとも４０％、少なくとも４２％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４８％、少なくとも５０％、少なくとも５２％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６２％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６８％、少なくとも７０％、少なくとも７２％、少なくとも７４％、少なくとも７６％、少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）増加させる。

【0136】

組換えタンパク質
本明細書で提供される方法によって産生できる組換えタンパク質の非限定的な例としては、免疫グロブリン（軽鎖および重鎖免疫グロブリン、抗体、または抗体断片（例えば、本明細書に記載の抗体断片のいずれか）を含む）、酵素（例えば、ガラクトシダーゼ（例えば、α－ガラクトシダーゼ）、Ｍｙｏｚｙｍｅ、またはＣｅｒｅｚｙｍｅ）、タンパク質（例えば、ヒトエリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、またはインターフェロンαもしくはβ）、あるいは免疫原性タンパク質もしくは抗原タンパク質またはタンパク質断片（例えば、ワクチンで使用するためのタンパク質）が挙げられる。組換えタンパク質は、少なくとも１つの多機能組換えタンパク質足場を含む操作された抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｇｅｂａｕｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３：２４５～２５５、２００９；および米国特許出願公開第２０１２／０１６４０６６号（その全体を参照によって本明細書に組み入れる）に記載される組換え抗原結合タンパク質を参照）であり得る。

【0137】

抗体である組換えタンパク質の非限定的な例としては：パニツムマブ、オマリズマブ、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ（ａｌａｃｉｚｕｍａｂ）、アラシズマブ（ａｌａｃｉｚｕｍａｂ）、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アチヌマブ、トシリズマブ、バシリジマブ（ｂａｓｉｌｉｚｉｍａｂ）、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ベシレソマブ、ベズロトクスマブ、ビシロマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブ、セツキシマブ、シクスツムマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、デンスマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ（ｅｆｕｎｇｕｍａｂ）、エプラツズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ（ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、フィギツムマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、イゴボマブ（ｉｇｏｖｏｍａｂ）、イムガツズマブ（ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）、インフリキシマブ、イノリモマブ、イノツズマブ、ラベツズマブ、レブリキズマブ、モキセツモマブ、ナタリズマブ、オビヌツズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ、ツコツズマブ、トラスツズマブ、ベルツズマブ、ザルツムマブ、およびザツキシマブ（ｚａｔｕｘｉｍａｂ）が挙げられる。

【0138】

本明細書に記載の方法によって産生できる組換え抗体の追加の例は、当技術分野で知られている。本発明の方法によって産生できる組換えタンパク質の追加の非限定的な例としては：アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、アバタセプト、ガルスルファーゼ、ルトロピンアルファ、抗血友病因子、アガルシダーゼベータ、インターフェロンβ－１ａ、ダルベポエチンアルファ、テネクテプラーゼ、エタネルセプト、凝固因子ＩＸ、卵胞刺激ホルモン、インターフェロンβ－１ａ、イミグルセラーゼ、ドルナーゼアルファ、エポエチンアルファ、インスリンまたはインスリン類似体、メカセルミン、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、抗トロンビンＩＩＩ、プロテインＣ、ヒトアルブミン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン－１１、ラロニダーゼ、イズルスファーゼ（ｉｄｕｒｓｕｐｈａｓｅ）、ガルスルファーゼ、α－１－プロテアーゼ阻害剤、ラクターゼ、アデノシンデアミナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、サイロトロピンα（例えば、Ｔｈｙｒｏｇｅｎ（登録商標））およびアルテプラーゼが挙げられる。本発明の方法によって産生できる組換えタンパク質の追加の例としては、酸性α－グルコシダーゼ、アルグルコシダーゼアルファ（例えば、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標））、α－Ｌ－イズロニダーゼ（例えば、Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ（登録商標））、イズロン酸スルファターゼ、ヘパランＮ－スルファターゼ、ガラクトース－６－スルファターゼ、酸性β－ガラクトシダーゼ、β－グルコロニダーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－ホスホトランスフェラーゼ、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、リソソームの酸性セラミダーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、β－グルコシダーゼ（例えば、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）およびＣｅｒｅｄａｓｅ（登録商標））、ガラクトシルセラミダーゼ、α－ガラクトシダーゼ－Ａ（例えば、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標））、酸性β－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ノイラミニダーゼ、ヘキソサミニダーゼＡ、ならびにヘキソサミニダーゼＢが挙げられる。

【0139】

分泌される可溶性組換えタンパク質は、液体培地（例えば、第１、第２、および第３の液体培地の１つまたはそれ以上）から、液体培地を細胞（例えば、哺乳類細胞）から除去するかさもなければ物理的に分離することによって回収し得る。液体培地を細胞（例えば、哺乳類細胞）から除去するための様々な異なる方法は、当技術分野で知られており、例えば、遠心分離、ろ過、ピペッティング、および／または吸引が挙げられる。次いで、分泌される組換えタンパク質は、様々な生化学的手法を使用して液体培地からの回収および更なる精製を行うことができるが、該手法としては、様々な種類のクロマトグラフィー（例えば、親和性クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、もしくは陰イオン交換クロマトグラフィー）および／またはろ過（例えば、分子量カットオフろ過）が挙げられる。

【0140】

組換えタンパク質の回収
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態は、組換えタンパク質（例えば、本明細書に記載の組換えタンパク質のいずれか）を哺乳類細胞ならびに／または第１、第２、および第３の液体培地の１つもしくはそれ以上から回収することを更に含む。いくつかの例では、回収することは、哺乳類細胞を溶解することを含む。他の例では、回収することは、組換えタンパク質を、培地（例えば、第１、第２、および第３の液体培地の１つまたはそれ以上）から集めることを含み得る。

【0141】

集めることは、例えば、約６０×１０^６細胞／ｍＬ超、６２×１０^６細胞／ｍＬ、６４×１０^６細胞／ｍＬ、６６×１０^６細胞／ｍＬ、６８×１０^６細胞／ｍＬ、７０×１０^６細胞／ｍＬ、７２×１０^６細胞／ｍＬ、７４×１０^６細胞／ｍＬ、７６×１０^６細胞／ｍＬ、７８×１０^６細胞／ｍＬ、８０×１０^６細胞／ｍＬ、約８２×１０^６細胞／ｍＬ超、約８４×１０^６細胞／ｍＬ超、約８６×１０^６細胞／ｍＬ超、約８８×１０^６細胞／ｍＬ超、約９０×１０^６細胞／ｍＬ超、約９２×１０^６細胞／ｍＬ超、約９４×１０^６細胞／ｍＬ超、約９６×１０^６細胞／ｍＬ超、約９８×１０^６細胞／ｍＬ超、約１００×１０^６細胞／ｍＬ超、約１０２×１０^６細胞／ｍＬ超、約１０４×１０^６細胞／ｍＬ超、約１０６×１０^６細胞／ｍＬ超、約１０８×１０^６細胞／ｍＬ超、約１１０×１０^６細胞／ｍＬ超、約１１２×１０^６細胞／ｍＬ超、約１１４×１０^６細胞／ｍＬ超、約１１６×１０^６細胞／ｍＬ超、約１１８×１０^６細胞／ｍＬ超、約１２０×１０^６細胞／ｍＬ超、約１２２×１０^６細胞／ｍＬ超、約１２４×１０^６細胞／ｍＬ超、約１２６×１０^６細胞／ｍＬ超、約１２８×１０^６細胞／ｍＬ超、約１３０×１０^６細胞／ｍＬ超、約１３２×１０^６細胞／ｍＬ超、約１３４×１０^６細胞／ｍＬ超、約１３６×１０^６細胞／ｍＬ超、約１３８×１０^６細胞／ｍＬ超、約１４０×１０^６細胞／ｍＬ超、約１４２×１０^６細胞／ｍＬ超、約１４４×１０^６細胞／ｍＬ超、約１４６×１０^６細胞／ｍＬ超、約１４８×１０^６細胞／ｍＬ超、約１５０×１０^６細胞／ｍＬ超、約１５２×１０^６細胞／ｍＬ超、約１５４×１０^６細胞／ｍＬ超、約１５６×１０^６細胞／ｍＬ超、約１５８×１０^６細胞／ｍＬ超、約１６０×１０^６細胞／ｍＬ超、約１６２×１０^６細胞／ｍＬ超、約１６４×１０^６細胞／ｍＬ超、約１６６×１０^６細胞／ｍＬ超、約１６８×１０^６細胞／ｍＬ超、約１７０×１０^６細胞／ｍＬ超、約１７２×１０^６細胞／ｍＬ超、約１７４×１０^６細胞／ｍＬ超、約１７６×１０^６細胞／ｍＬ超、約１７８×１０^６細胞／ｍＬ超、約１８０×１０^６細胞／ｍＬ超、約１８２×１０^６細胞／ｍＬ超、約１８４×１０^６細胞／ｍＬ超、約１８６×１０^６細胞／ｍＬ超、約１８８×１０^６細胞／ｍＬ超、約１９０×１０^６細胞／ｍＬ超、約１９２×１０^６細胞／ｍＬ超、約１９４×１０^６細胞／ｍＬ超、約１９６×１０^６細胞／ｍＬ超、約１９８×１０^６細胞／ｍＬ超、または約２００×１０^６細胞／ｍＬ超）の生細胞密度を達成する培養の後に行うことができる。

【0142】

組換えタンパク質の製剤化
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態は、組換えタンパク質（例えば、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生される組換えタンパク質、例えば、回収された組換えタンパク質または回収および精製された組換えタンパク質）を医薬組成物へと製剤化する工程を更に含む。例えば、製剤化することは、薬学的に許容される賦形剤を、組換えタンパク質（例えば、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生される組換えタンパク質、例えば、回収された組換えタンパク質または回収および精製された組換えタンパク質）に添加することを含み得る。製剤化することは、薬学的に許容される賦形剤を、組換えタンパク質（例えば、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生される組換えタンパク質、例えば、回収された組換えタンパク質または回収および精製された組換えタンパク質）と混合することを含み得る。薬学的に許容される賦形剤（例えば、非天然の薬学的に許容される賦形剤）の例は当技術分野でよく知られている。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質（例えば、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生される組換えタンパク質、例えば、回収された組換えタンパク質または回収および精製された組換えタンパク質）は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内投与のために製剤化する。

【0143】

医薬組成物およびキット
本明細書ではまた、（例えば、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生される）本明細書に記載の組換えタンパク質のいずれかの少なくとも１つを含む医薬組成物も提供される。医薬組成物は、当技術分野で知られている任意の様式で製剤化できる。医薬組成物は、意図された投与経路（例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内投与に適合するように製剤化する。

【0144】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体（例えば、リン酸緩衝食塩水）を含み得る。製剤の単回または複数回の投与は、例えば、対象によって必要とされ、許容される投薬量および頻度に応じて行うことができる。

【0145】

本明細書ではまた、医薬組成物（例えば、本明細書に記載の医薬組成物のいずれか）を含むキットも提供される。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法のいずれかを行うための説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の医薬組成物のいずれかの少なくとも１つの用量（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）の用量を含み得る。

【0146】

治療方法
本明細書では、以下を含む、それを必要とする対象の治療が提供される：（本明細書に記載の方法のいずれかによって産生される）本明細書に記載の組換えタンパク質のいずれかの少なくとも１つを含む本明細書に記載の医薬組成物のいずれかの治療上有効な量を対象に投与すること。

【0147】

投与することは、例えば、１週間に少なくとも１回（例えば、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、または少なくとも１２回）行うことができる。

【0148】

本発明は、以下の実施例で更に説明されるが、特許請求の範囲に記載された発明の範囲を限定するものではない。
実施例

【実施例1】

【0149】

浸透圧制御方法
灌流培養を含む方法は、多くの液体培地を使用し、各バッチの調製に多大な費用が必要とされる。液体培地のほとんどは水である。しかし、単一の液体培地は、細胞密度が高いときに栄養素の消費により浸透圧が顕著に低下するために、高細胞密度灌流処理全体には使用できない。例えば、１２ｇ／Ｌのグルコース消費により、６７ｍＯｓｍ／ｋｇ減少する。

【0150】

典型的な浸透圧（２９０ｍＯｓｍ／ｋｇから３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ）を有する単一の液体培地を使用すると、細胞密度が高いときに浸透圧が低くなる。低浸透圧条件では、細胞の健康状態が悪くなり、生産性が低下する。しかし、細胞培養（例えば、灌流細胞培養）の開始時から単一の高浸透圧液体培地を使用すると、乳酸産生の急上昇および細胞培養の低下がもたらされる可能性がある。

【0151】

本明細書に記載の第２の液体培地（４×液体培地配合物）（第１の液体培地に添加）は、比較的高い浸透圧（流加培養のための供給液体培地と比較して）を有し得、沈殿を防ぐために７未満のｐＨを有し得る。この第２の液体培地は、ｐＨ６からｐＨ７であっても室温で１週間未満安定であり得る。少なくとも２つの代替手段を第２の液体培地の安定性を増加させるのに使用できる：１）システインおよびチロシンを除去すること、または２）システインおよびチロシンの代替形態（例えば、それぞれピルビン酸塩／システインおよびグリシン－チロシン）を使用すること。

【0152】

灌流細胞培養における浸透圧を制御するために、濃縮された第２の液体培地を使用でき、様々な量の第３の低浸透圧液体（例えば、水）を用いて希釈できる。濃塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液もまた、浸透圧の上昇が必要な場合には、随意に添加することもできる。更に、培養の溶存ＣＯ_２濃度およびｐＨは、浸透圧を調整するために変化させることができる。

【実施例2】

【0153】

細胞培養能力に対する浸透圧の影響
細胞培養能力（例えば、生細胞密度）に対する浸透圧の影響を決めるために、哺乳類細胞は、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇと約４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間の浸透圧を有する液体培地で増殖させた。図１Ａおよび１Ｂは、それぞれタンパク質１およびタンパク質２を発現する哺乳類細胞における経時的な生細胞密度を示す。図１Ａおよび１Ｂのデータにより示されるのは、哺乳類細胞は、３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ超の浸透圧を有する液体培地において哺乳類細胞を増殖する場合、増殖の遅延が観察されたことである。

【0154】

それぞれ４日目および５日目での試験した浸透圧における平均細胞直径が示された（図２Ａおよび２Ｂ）。図２Ａおよび２Ｂのデータは、浸透圧が高いほど細胞の大きさの平均が大きくなることを示し、浸透圧が細胞形態に影響することを示している。

【0155】

図３Ａおよび３Ｂは、濃縮細胞培地（１３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧）および水をそれぞれ供給した２つのバイオリアクターの浸透圧および細胞培養増殖を示している。水供給に対する濃縮培地供給の比は、培養の増殖相で変化させた。容器２２（「Ｖ２２」）は、培地に対する水の比が容器２７（「Ｖ２７」）よりも低く、その結果、１０日目から培養物の浸透圧が高くなった（図３Ａ）。この結果、Ｖ２２は、Ｖ２７と比較して増殖速度が低下した（図３Ｂ）。浸透圧が高いとまた、生産性が減少し（図３Ｃ）、培養の健全性の低下を示す乳酸脱水素酵素産生量が高くなった（図３Ｄ）。高い浸透圧に対する反応の１つは、Ｖ２２での乳酸産生の上昇であり（図３Ｅ）、次いで、これは乳酸を更に高くし続ける（「乳酸産生の急上昇」）。

【0156】

図４Ａおよび４Ｂでは、培養物は、乳酸産生量が高く、その結果、浸透圧が上昇することが示される。浸透圧が４００ｍＯｓｍ／ｋｇ超に達すると、乳酸産生量は増加し、細胞増殖および生存率が低下した。

【実施例3】

【0157】

浸透圧制御の選択肢
安全な操作用の灌流培養のための浸透圧閾値は、上限で３６０～４２０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲であった。浸透圧は、例えば、以下のような様々な手段によって制御できる：１）フィードバック制御と連動して、濃縮細胞培地を供給すること、および水希釈率を調整することによる手段、２）基礎となる添加方法に影響を与える処理パラメーター（例えば、浸透圧が高い場合に高いｐＨおよびｐＣＯ_２が必要とされる）を変化させる手段、３）バイオリアクターキャンペーン内で、少なくとも２つの異なる液体培地、例えば、低い浸透圧を有する増殖液体培地、および高い浸透圧を有する産生液体培地を使用する手段、４）浸透圧を上昇させるために、フィードバック制御を用いて高い細胞密度で、塩、例えば、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌを添加する手段。浸透圧を制御するための処理変更は、無細胞培養透過液のオフライン浸透圧測定に基づいて手動で行うことができる。あるいは、自動化フィードバック制御は、オンライン浸透圧予測に基づいて行うことができる。オンライン浸透圧は、適切なモデルと共に、オンライン静電容量測定、オンライン導電率測定、またはラマン分光法測定から予測できる。

【0158】

図５Ａおよび５Ｂは、増殖相から産生相に至る供給培地の浸透圧の段階的変化を示した。各バイオリアクターに対して、ＮａＣｌ添加は所定の時点で手動でオンとし、次いで、ＮａＣｌ流は実験期間の間一定に保った。図５Ａおよび５Ｂのデータは、同じ静電容量設定点にも関わらず、異なる浸透圧で異なるＶＣＤプロファイルを示した。これは、浸透圧を制御するために一定のＮａＣｌ供給速度を使用することの限界を示している。

【0159】

図６Ａおよび６Ｂは、浸透圧と導電率との相間が、浸透圧制御が必要な回収相の間、高い細胞密度で良好であることを示した。

【0160】

導電率はＡＢＥＲプローブで測定し、２つの測定の平均を図７にプロットした。設定点を維持するために、５ＭのＮａＣｌを、導電率フィードバック制御に基づいてバイオリアクターに供給した。図７に示すように、制御は５日目に開始し、塩添加は培養期間の初期には必要なかった。ＮａＣｌ添加は、１０日目頃から開始した。導電率フィードバック制御に基づくＮａＣｌ添加により、培養の回収相を通じて一貫した導電率および浸透圧が得られた。更に、導電率フィードバック制御に基づくＮａＣｌ添加は、一定のＮａＣｌ添加を使用する処理と比較して、処理の不調の間の浸透圧の逸脱を低下させるのに役立つ。

【0161】

図８Ａおよび８Ｂのデータは、自動化導電率制御により同様の浸透圧の傾向がもたらされた４つの実験実行全てについて同じ静電容量設定点で同様な生細胞密度プロファイルを示した。

【0162】

図９は、導電率と浸透圧との間の相間が、２つの異なるプローブの種類を用いた場合で良好であることを示した。

【0163】

図１０により、浸透圧はラマン分光法を用いて正確に予測できること、およびラマンプローブはバイオリアクターにおいてまたは無細胞灌流回収において配置できることが示された。

【0164】

図１１に示されるように、灌流細胞培養処理における生細胞密度が処理の中頃で最低点に達する傾向が観察された。これは、バイオリアクターにおいて静電容量センサーを用いて測定したときに、バイオマス濃度を一定の静電容量値を維持するように制御した場合に、細胞の大きさが増加するために生じた。これらの培養の後半では、細胞の大きさが減少し、生細胞密度が上昇した。

【0165】

複数バッチからのデータを集計したところ、浸透圧と培養で到達した最低生細胞密度との間には相間があり、より高い浸透圧とより低い細胞密度とが相関することが判明した。この発見は図に示されており、６０日間の処理の３０日目のＶＣＤが３０日目の培養浸透圧に対してプロットされている。浸透圧を所望のレベルに制御できることで、処理の間のＶＣＤの変化を最小限にでき、処理内の一貫性が向上した。

【0166】

他の実施形態
本発明をその詳細な説明と共に説明してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図するもので、限定することを意図しないことを理解されたい。他の態様、利点、および変更は、以下の特許請求の範囲に含まれる。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】

【図11】

【国際調査報告】