特表 2024-514425 ポリペプチドの翻訳後修飾をオンラインで検出するためのシステム及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-02

(54)【発明の名称】ポリペプチドの翻訳後修飾をオンラインで検出するためのシステム及び方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20240326BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20240326BHJP

   C07K 14/00 20060101ALI20240326BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240326BHJP

   G01N 21/27 20060101ALI20240326BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20240326BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20240326BHJP

   G01N 30/72 20060101ALI20240326BHJP

   C12Q 1/37 20060101ALN20240326BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68

C12P21/00 C

C07K14/00

A61K45/00

G01N21/27 Z

G01N27/62 V

G01N27/62 X

G01N30/88 J

G01N30/72 C

C12Q1/37

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023557068

(86)(22)【出願日】2022-03-15

(85)【翻訳文提出日】2023-11-06

(86)【国際出願番号】 IB2022052321

(87)【国際公開番号】W WO2022195473

(87)【国際公開日】2022-09-22

(31)【優先権主張番号】63/200,576

(32)【優先日】2021-03-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＺＩＧＢＥＥ

(71)【出願人】

【識別番号】391008951

【氏名又は名称】アストラゼネカ・アクチエボラーグ

【氏名又は名称原語表記】ＡＳＴＲＡＺＥＮＥＣＡ ＡＫＴＩＥＢＯＬＡＧ

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】アーン，ジューミ

(72)【発明者】

【氏名】アルバーグーティ，メタル

【テーマコード（参考）】

2G041

2G045

2G059

4B063

4B064

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G041CA01

2G041EA04

2G041FA12

2G041HA01

2G045AA40

2G045DA36

2G059AA01

2G059BB04

2G059CC16

2G059DD12

2G059EE01

2G059FF04

2G059HH03

2G059JJ01

2G059MM12

4B063QA01

4B063QA13

4B063QA18

4B063QQ67

4B063QQ79

4B063QR16

4B063QS15

4B063QS39

4B064AF22

4B064AF41

4B064AG01

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4C084AA17

4C084NA20

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA40

4H045AA50

4H045BA10

4H045BA41

4H045BA53

4H045DA75

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本明細書では、ポリペプチドの翻訳後修飾及びグリコシル化をモニタリングするための方法及びシステム、特に、細胞培養で生産された組換えタンパク質の翻訳後修飾をリアルタイムでモニタリングするためのオンライン（即ち、自動）方法が提供される。タンパク質の翻訳後修飾を検出及び定量化するための方法及びシステムには、フローインジェクション分析（ＦＩＡ）、アフィニティーカラム、分光測定、消化、及びペプチドマッピングが含まれる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

タンパク質の翻訳後修飾を検出するための方法であって、少なくとも１つのプロセッサによって制御されるフローインジェクション分析器（ＦＩＡ）により行われ、
（ａ）前記タンパク質を含む第１の試料を保持リザーバ内に収容すること；
（ｂ）前記ＦＩＡを介して、第１の体積の結合緩衝液を前記ＦＩＡ内のアフィニティーカラムに送達すること；
（ｃ）前記ＦＩＡを介して、前記第１の試料を前記保持リザーバから前記アフィニティーカラムに移送すること；
（ｄ）前記ＦＩＡを介して、第１の体積の溶出緩衝液を前記アフィニティーカラムに送達し、それにより前記アフィニティーカラムから前記第１の試料中の前記タンパク質を溶出させて第１の溶出液を形成すること；
（ｅ）前記ＦＩＡを介して、前記第１の溶出液をタンパク質濃度検出ユニットに移送すること；
（ｆ）前記少なくとも１つのプロセッサによって前記第１の溶出液中の前記タンパク質の濃度を決定すること；
（ｇ）前記タンパク質を含む第２の試料を前記保持リザーバ内に収容すること；
（ｈ）前記ＦＩＡを介して、第２の体積の前記結合緩衝液を前記アフィニティーカラムに送達すること；
（ｉ）前記ＦＩＡを介して、前記第２の試料を前記保持リザーバから前記アフィニティーカラムに移送すること；
（ｊ）前記ＦＩＡを介して、第２の体積の溶出緩衝液を前記アフィニティーカラムに送達し、それにより前記アフィニティーカラムから前記第２の試料中の前記タンパク質を溶出させて第２の溶出液を形成すること；
（ｋ）前記ＦＩＡを介して、前記第２の溶出液を消化チャンバに移送すること；
（ｌ）前記ＦＩＡを介して、消化試薬を送達し、前記第２の溶出液中の前記タンパク質を消化してペプチド混合物を形成すること；及び
（ｍ）前記ＦＩＡを介して、前記ペプチド混合物をペプチドマッピングユニットに移送し、前記タンパク質の前記翻訳後修飾を検出すること、
を含む、方法。

【請求項2】

前記ＦＩＡが、シーケンシャルインジェクション分析器（ＳＩＡ）又はダイレクトインジェクション分析器（ＤＩＡ）である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第１の試料及び前記第２の試料が、細胞培養物から得られる、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記細胞培養物が、バイオリアクタ内にある、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記バイオリアクタが、バッチバイオリアクタ、流加バイオリアクタ、又は灌流バイオリアクタを含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記アフィニティーカラムが、プロテインＡカラムを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

（ｆ）の前記第１の溶出液中の前記タンパク質の濃度を決定することが、所定の検量線に従って前記少なくとも１つのプロセッサによって実施される、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

（ｄ）の前記第１の溶出液を形成するための前記アフィニティーカラムから溶出した前記第１の試料中の前記タンパク質の溶出時間を、所定の溶出時間に基づいて前記少なくとも１つのプロセッサによって制御することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

（ｊ）の前記第２の溶出液を形成するための前記アフィニティーカラムから溶出した前記第２の試料中の前記タンパク質の溶出時間を、（ｄ）の前記第１の試料と同じ所定の溶出時間に基づいて前記少なくとも１つのプロセッサによって制御することを更に含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記タンパク質濃度検出ユニットが、分光光度計を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記分光光度計が、前記第１の溶出液のＵＶ吸光度を測定し、前記少なくとも１つのプロセッサによって検量線に基づいてタンパク質濃度を算出する、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記第２の溶出液中の前記タンパク質が、（ｌ）で酵素的に消化される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記タンパク質の酵素消化が、前記ＦＩＡを介して、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、サーモライシン、パパイン、プロナーゼ、エンドペプチダーゼＡｒｇ－Ｃ、ペプチジル－Ａｓｐメタロエンドペプチダーゼ（エンドペプチダーゼＡｓｐ－Ｎ）、グルタミルエンドペプチダーゼ（Ｇｌｕ－Ｃエンドペプチダーゼ）、及びリシルエンドペプチダーゼ（Ｌｙｓ－Ｃエンドペプチダーゼ）から選択されるタンパク質分解酵素と前記第２の溶出液を接触させることを含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記タンパク質分解酵素が、トリプシンを含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記タンパク質分解酵素が、熱安定性トリプシンを含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

（ｌ）が、
（ｉ）前記ＦＩＡを介して、消化試薬を導入して消化混合物を形成すること；
（ｉｉ）前記消化混合物を混合すること；及び
（ｉｉｉ）前記消化混合物をインキュベートすること、
を含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記消化緩衝液が、約６．０～約７．５のｐＨの消化緩衝液を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記消化試薬が、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む還元剤を含む、請求項１６又は１７に記載の方法。

【請求項19】

前記消化試薬が、タンパク質分解酵素を含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記第２の溶出液を、（ｇ）で決定された前記第１の溶出液の濃度に基づいて、前記少なくとも１つのプロセッサによって決定される量のタンパク質分解酵素と接触させる、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記タンパク質分解酵素が、トリプシンを含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記第２の溶出液を、約１：１０～約１：１００のトリプシン：タンパク質比でトリプシンと接触させる、請求項２０又は２１に記載の方法。

【請求項23】

前記第２の溶出液を、約１：２０～約１：３０のトリプシン：タンパク質比でトリプシンと接触させる、請求項２０又は２１に記載の方法。

【請求項24】

前記消化混合物をインキュベートすることが、約３６℃～約８５℃の温度で約５分間～約３０分間インキュベートすることを含む、請求項１６～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記消化混合物をインキュベートすることが、約５０℃～約７５℃の温度で約１５分間～約３０分間インキュベートすることを含む、請求項１６～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記消化混合物をインキュベートすることが、約７０℃～約７２℃の温度で約１５分間～約３０分間インキュベートすることを含む、請求項１６～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記タンパク質分解酵素が、熱安定性トリプシンを含み、前記方法が、
（ｉ）前記ＦＩＡを介して、第１の量の消化緩衝液、還元剤、及び熱安定性トリプシンを前記第２の溶出液に導入し、混合して第１の消化混合物を形成すること；
（ｉｉ）前記第１の反応混合物を約７０℃～約７５℃の温度で約１０分間～約２０分間インキュベートして、第１のインキュベート混合物を形成すること；
（ｉｉｉ）前記ＦＩＡを介して、第２の量の熱安定性トリプシンを前記インキュベート混合物に導入し、混合して第２の消化混合物を形成すること；並びに
（ｉｖ）前記第２の消化混合物を約７０℃～約７５℃の温度で約１０分間～約２０分間インキュベートして、ペプチド混合物を形成すること、
を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項28】

第２の量の消化緩衝液が、前記ＦＩＡを介して、（ｉｉｉ）の前記第２の量の熱安定性トリプシンとともに前記第１のインキュベート混合物に添加される、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記ペプチドマッピングユニットが、質量分析計（ＭＳ）を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

翻訳後修飾を検出することが、質量分析（ＭＳ）を使用して実施されるペプチドマッピング分析を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

翻訳後修飾を検出することが、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を使用して実施されるペプチドマッピング分析を含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

液体クロマトグラフィーが、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

オンラインで実施される、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記翻訳後修飾が、グリコシル化、酸化、脱アミド化、異性化、糖化、Ｎ末端リーダー配列、Ｎ末端環化、Ｃ末端リジン保持、アミド形成、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

グリコシル化が、Ｎ－結合型グリコシル化、Ｏ－結合型グリコシル化、又はそれらの組み合わせを含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

組換えタンパク質を生産する方法であって、
（ａ）前記組換えタンパク質が発現される条件下で宿主細胞を培養すること；
（ｂ）請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法に従って前記タンパク質の翻訳後修飾を検出すること；
（ｃ）（ｂ）で検出された前記翻訳後修飾に基づいて１つ以上の細胞培養パラメータを修正すること、
を含む、方法。

【請求項37】

前記宿主細胞が、バッチバイオリアクタ、流加バイオリアクタ、又は灌流バイオリアクタを含むバイオリアクタ内で培養される、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、請求項３６又は３７に記載の方法。

【請求項39】

前記宿主細胞が、ＣＨＯ、ＨＥＫ ２９３、ＣＯＳ、ＮＳ０、ＳＰ２、又はＰＥＲ．Ｃ６宿主細胞である、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

以下の細胞培養パラメータ：ｐＨ；ＣＯ_２レベル；溶存酸素量（ｄＯ_２）；温度；栄養素の量若しくはタイプ；グリカン前駆体の存在及びタイプ；又はそれらの組み合わせのうちの１つ以上が、（ｂ）で検出された前記翻訳後修飾に基づいて修正される、請求項３６～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記タンパク質が、少なくとも約１０００個のアミノ酸残基を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記タンパク質が、組換え生産される、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記タンパク質が、糖タンパク質を含む、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記タンパク質が、治療用タンパク質を含む、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記タンパク質が、治療用抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記タンパク質が、融合タンパク質を含む、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

請求項３５に記載の方法により生産される、組換えタンパク質。

【請求項48】

請求項４６に記載の組換えタンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。

【請求項49】

タンパク質の翻訳後修飾をモニタリングするためのオンライン方法であって、少なくとも１つのプロセッサによって制御されるシリンジポンプ及びマルチポートバルブを含むフローインジェクション分析器（ＦＩＡ）により行われ、
（ａ）前記タンパク質を含む第１の試料を前記ＦＩＡの保持リザーバ内に収容すること；
（ｂ）前記マルチポートバルブの動作によって、第１の体積の結合緩衝液を前記ＦＩＡ内のアフィニティーカラムに導入すること；
（ｃ）シリンジポンプの動作によって、前記第１の試料を前記保持リザーバから前記アフィニティーカラムへと進め、前記第１の試料中の前記タンパク質を前記アフィニティーカラムに結合させること；
（ｄ）前記マルチポートバルブの動作によって、第１の体積の溶出緩衝液を前記アフィニティーカラムに導入し、前記結合したタンパク質を溶出させて第１の溶出液を形成すること；
（ｅ）前記シリンジポンプの動作によって、前記第１の溶出液を前記ＦＩＡ内の分光光度計へと進めること；
（ｆ）前記少なくとも１つのプロセッサによって、測定されたＵＶ吸光度に従って前記第１の溶出液中のタンパク質の濃度を決定すること；
（ｇ）前記タンパク質を含む第２の試料を前記保持リザーバ内に収容すること；
（ｈ）前記マルチポートバルブの動作によって、第２の体積の前記結合緩衝液を前記アフィニティーカラムに導入すること；
（ｉ）前記シリンジポンプの動作によって、前記第２の試料を前記保持リザーバから前記アフィニティーカラムへと進め、前記第２の試料中の前記タンパク質を前記アフィニティーカラムに結合させること；
（ｊ）前記マルチポートバルブの動作によって、第２の体積の溶出緩衝液を前記アフィニティーカラムに導入し、前記結合したタンパク質を溶出させて第２の溶出液を形成すること；
（ｋ）前記シリンジポンプの動作によって、前記第２の溶出液を前記ＦＩＡ内の消化チャンバへと進めること；及び
（ｌ）前記マルチポートバルブの動作によって、前記消化チャンバ内の前記第２の溶出液に消化試薬を導入し、前記タンパク質を消化してペプチド混合物を形成すること；及び
（ｍ）前記シリンジポンプの動作によって、前記ペプチド混合物をペプチドマッピングユニットへと進め、前記タンパク質の翻訳後修飾を検出すること、
を含む、オンライン方法。

【請求項50】

（ｍ）の前記タンパク質を消化することが、
（ｉ）前記マルチポートバルブの動作によって、消化緩衝液、還元剤、及びタンパク質分解酵素を前記消化チャンバ内の前記第２の溶出液に導入して、混合して第１の消化混合物を形成すること；
（ｉｉ）前記消化チャンバ内の前記第１の消化混合物をインキュベートして、第１のインキュベート混合物を形成すること；
（ｉｉｉ）前記マルチポートバルブの動作によって、第２の体積の消化緩衝液及びタンパク質分解酵素を前記インキュベート混合物に導入して、第２の消化混合物を形成すること；並びに
（ｉｖ）前記消化チャンバ内の前記第２の消化混合物をインキュベートして、ペプチド混合物を形成すること、
を含む、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記消化緩衝液が、約６．０～約７．５のｐＨを有する、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記還元剤が、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む、請求項５０又は５１に記載の方法。

【請求項53】

（ｆ）の前記第１の溶出液中の前記タンパク質の濃度が、所定の検量線に従って前記少なくとも１つのプロセッサによって実施される、請求項４９～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

（ｄ）の前記第１の溶出液を形成するための前記アフィニティーカラムから溶出した前記第１の試料中の前記タンパク質の溶出時間を、所定の溶出時間に基づいて前記少なくとも１つのプロセッサによって制御することを更に含む、請求項４９～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

（ｊ）の前記第２の溶出液を形成するための前記アフィニティーカラムから溶出した前記第２の試料中の前記タンパク質の溶出時間を、（ｄ）の前記第１の試料と同じ所定の溶出時間に基づいて前記少なくとも１つのプロセッサによって制御することを更に含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項56】

（ｉ）で導入されるタンパク質分解酵素の量が、（ｇ）で決定された前記第１の溶出液の濃度に基づいて前記少なくとも１つのプロセッサによって決定される、請求項４９～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記タンパク質分解酵素が、トリプシンを含む、請求項４９～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

トリプシンが、熱安定性トリプシンを含む、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記第２の溶出液を、約１：１０～約１：１００のトリプシン：タンパク質比でトリプシンと接触させる、請求項５７又は５８に記載の方法。

【請求項60】

前記第２の溶出液を、約１：２０～約１：３０のトリプシン：タンパク質比でトリプシンと接触させる、請求項５７又は５８に記載の方法。

【請求項61】

（ｉｉ）の前記第１の消化混合物が、約３６℃～約８５℃の温度で約５分間～約３０分間インキュベートされる、請求項５０～６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

（ｉｉ）の前記第１の消化混合物が、約５０℃～約７５℃の温度で約１５分間～約３０分間インキュベートされる、請求項５０～６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

（ｉｉ）の前記第１の消化混合物が、約７０℃～約７２℃の温度で約１５分間～約３０分間インキュベートされる、請求項５０～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

（ｉｖ）の前記第２の消化混合物が、約３６℃～約８５℃の温度で約５分間～約３０分間インキュベートされる、請求項５０～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

（ｉｖ）の前記第２の消化混合物が、約５０℃～約７５℃の温度で約１５分間～約３０分間インキュベートされる、請求項５０～６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

（ｉｖ）の前記第２の消化混合物が、約７０℃～約７２℃の温度で約１５分間～約３０分間インキュベートされる、請求項５０～６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

前記タンパク質分解酵素が、熱安定性トリプシンを含み、前記方法が、
（ｉ）前記マルチポートバルブの動作によって、第１の量の消化緩衝液、還元剤、及び熱安定性トリプシンを前記第２の溶出液に導入し、混合して第１の消化混合物を形成すること；
（ｉｉ）前記消化混合物を約７０℃～約７５℃の温度で約１０分間～約２０分間インキュベートして、第１のインキュベート混合物を形成すること；
（ｉｉｉ）前記マルチポートバルブの動作によって、第２の量の消化緩衝液及び熱安定性トリプシンを前記インキュベート混合物に導入し、混合して第２の消化混合物を形成すること；並びに
（ｉｖ）前記第２の消化混合物を約７０℃～約７５℃の温度で約１０分間～約２０分間インキュベートして、ペプチド混合物を形成すること、
を含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項68】

前記タンパク質が、少なくとも約１０００個のアミノ酸残基を含む、請求項４９～６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

前記ペプチド混合物が、約１００個未満のアミノ酸を含むペプチドを含む、請求項４９～６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

タンパク質の翻訳後修飾をモニタリングするためのオンラインシステムであって、
（ａ）前記タンパク質を含む第１の試料及び第２の試料を収容するように構成された保持リザーバ；
（ｂ）前記第１の試料及び前記第２の試料を前記保持リザーバからフローインジェクション分析器（ＦＩＡ）を通じて進めるように構成された第１のシリンジポンプ；
（ｃ）第１のシリンジポンプと流体連通した第１のマルチポートバルブ；
（ｄ）前記第１のマルチポートバルブと流体連通し、前記保持リザーバからの前記第１の試料及び前記第２の試料を収容するように構成されたアフィニティーカラム；
（ｅ）前記アフィニティーカラムからの第１の溶出液を収容するように構成された分光光度計であって、前記第１の溶出液が、前記第１の試料からのタンパク質を含み、前記分光光度計が、ＵＶ吸光度を決定し且つ所定の検量線に基づいて前記第１の試料のタンパク質濃度を算出するように構成されている、分光光度計；
（ｆ）第２の溶出液を前記アフィニティーカラムから消化チャンバへと進めるように構成された第２のシリンジポンプであって、前記第２の溶出液が、前記第２の試料からのタンパク質を含み、前記第２の溶出液中の前記タンパク質が、（ｅ）で決定された前記第１の試料の前記タンパク質濃度に基づいて消化される、第２のシリンジポンプ；並びに
（ｇ）前記第２のシリンジポンプと流体連通した第２の注入マルチポートバルブ、
を含む、オンラインシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／２００，５７６号明細書の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張するものであり、この仮特許出願は、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、ポリペプチドの翻訳後修飾を検出するための方法、特に、細胞培養で生産された組換えタンパク質の翻訳後修飾をリアルタイムで検出するためのオンライン方法に関する。

【背景技術】

【0003】

融合タンパク質、増殖因子、サイトカイン、酵素、ホルモン、及びモノクローナル抗体（ｍＡｂ）などの治療用タンパク質を含むバイオ医薬品は、製薬業界で最も急速に成長している分野を代表している。典型的には、バイオ医薬品は、遺伝子操作された宿主細胞（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）又はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの微生物系、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）などの真菌系、及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＮＳ０、又はＳｐ２／０などの哺乳動物系の宿主細胞を含む）を使用して、細胞培養で組換え生産される。哺乳動物系が好まれることが多いが、それは、多くのバイオ医薬品は微生物によって作製するには過度に大きく且つ複雑であるため、又はバイオ医薬品には哺乳動物宿主細胞でのみ可能である翻訳後修飾（ＰＴＭ）が必要であるためである。しかしながら、ＰＴＭは、生体分子の物理化学的特徴に影響を及ぼす可能性があり、これにより、活性、タンパク質間相互作用、生物学的機能、有効性、及び安定性が影響を受ける可能性があり、結果として様々なレベルのタンパク質不均一性が生じるおそれがある。したがって、ＰＴＭは、バイオ医薬品のプロセス開発及び製造中に特性評価され、制御され、且つモニタリングされる、重要品質特性（ＣＱＡ）である。

【0004】

一般的なＰＴＭには、グリコシル化、脱アミド化、異性化、及び酸化、不完全なジスルフィド結合形成、糖化、Ｎ末端グルタミン環化、及びＣ末端リジンプロセシングが含まれる。これらの修飾のうち、最も多く見られ且つ自然に発生するものは、リン酸化、アセチル化、グリコシル化（Ｏ－結合型及びＮ－結合型）、脱アミド化、酸化、水酸化、メチル化、ユビキチン化、ピログルタミン酸、硫酸化、並びに切断である。非特許文献１。

【0005】

グリコシル化は、タンパク質上の特定の部位、例えば、アスパラギン残基（Ｎ－結合型グリコシル化）又はセリン（Ｓｅｒ）若しくはトレオニン（Ｔｈｒ）残基（Ｏ－結合型グリコシル化）でのグリカンの付着を伴う一般的なＰＴＭである。Ｎ－結合型グリコシル化は、コンセンサス配列（Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸である）で起こり、小胞体（ＥＲ）で開始され、そこでグリカン鎖（Ｇｌｃ_３Ｍａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２）がコンセンサス配列のＡｓｎ残基に付加される。種々のグリコシドヒドロキシラーゼ酵素によってグリカン鎖がトリミングされた後、糖タンパク質はゴルジ装置に輸送され、そこでグリカンは更なるトリミング及び修飾を受け、様々なＮ－グリカン構造が生じる。Ｏ－結合型グリカンは、通常、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）とＳｅｒ又はＴｈｒ残基のヒドロキシル基（－ＯＨ）との間に形成されるα－Ｏ－グリコシド結合を介して、セリン（Ｓｅｒ）又はトレオニン（Ｔｈｒ）残基に付着する。Ｏ－グリカンの生合成は、ゴルジ体内で、ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃからＳｅｒ又はＴｈｒ残基へのＧａｌＮＡｃの転移により開始される。Ｏ－ＧａｌＮＡｃ前駆体がプロセシングされ、様々なＯ－ＧａｌＮＡｃグリカンが生成される。非特許文献２。

【0006】

ＰＴＭを分析するための従来のプロセスには、細胞培養の終了時に試料を手動で収集すること、試料を検査機関に送り、そこで試料を分析のために濃縮、精製、及び調製することが含まれる。従来のプロセスの所要時間は３～５日となる可能性があり、その結果、開発及び製造の遅延及びコストの増加が生じ得る。分析は典型的にはプロセスの終了時に実施されるため、結果にはプロセスの総合結果が反映される。更に、生産物が必要な規格を満たしていない場合は、細胞培養から開始してプロセス全体を繰り返す必要がある。したがって、製造パラメータを調整して生産物を所望の規格内に保持することができるように、製造過程中に生産物を特性決定するためにリアルタイムで実施することができる分析方法が望まれている。

【0007】

非特許文献３には、抗体グリカンプロファイルをリアルタイムでモニタリングするための、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）システムと連結されたマイクロシーケンシャルインジェクションシステムを試料調製プラットフォームとして使用した、グリコシル化をリアルタイムでモニタリングするための方法について記載されている。グリカン分析のために、グリカンはＰＮＧａｓｅ Ｆ（Ｐ０７０４，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して酵素的に抗体から遊離され、ＵＰＬＣカラムを使用して分離された。

【0008】

組換え生産されたタンパク質の翻訳後修飾（ＰＴＭ）をリアルタイムでモニタリングするための向上したプロセスが依然として必要とされている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｖｉｒａｇ ｅｔ ａｌ．（２０２０）“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ．８３：１－１０（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１０３３７－０１９－０３７９６－９）

【非特許文献2】Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６）“Ｇｌｙｃａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，”ＭＡｂｓ．８（２）：２０５－２１５

【非特許文献3】Ｔｈａｒｍａｌｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ａ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＲＴ－ＧＭ）ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，”Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１２（６）：１１４６－１１５４

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、組換え生産されたタンパク質の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を検出する、同定する、又はモニタリングするための方法及びシステムに関し、特に、細胞培養中の組換え生産されたタンパク質のＰＴＭをリアルタイムでモニタリングするためのオンライン方法又はシステムに関する。

【0011】

一態様では、タンパク質の翻訳後修飾を検出するための方法が提供され、本方法は、少なくとも１つのプロセッサによって制御されるフローインジェクション分析器（ＦＩＡ）により行われる。一態様では、ＦＩＡは、シーケンシャルインジェクション分析器（ＳＩＡ）である。一態様では、ＦＩＡは、ダイレクトインジェクション分析器（ＤＩＡ）である。一態様では、本方法は、
（ａ）タンパク質を含む第１の試料を保持リザーバ内に収容すること；
（ｂ）ＦＩＡを介して、第１の体積の結合緩衝液をＦＩＡ内のアフィニティーカラムに送達すること；
（ｃ）ＦＩＡを介して、第１の試料を保持リザーバからアフィニティーカラムに移送すること；
（ｄ）ＦＩＡを介して、第１の体積の溶出緩衝液をアフィニティーカラムに送達し、それによりアフィニティーカラムから第１の試料中のタンパク質を溶出させて第１の溶出液を形成すること；
（ｅ）ＦＩＡを介して、第１の溶出液をタンパク質濃度検出ユニットに移送すること；
（ｆ）少なくとも１つのプロセッサによって第１の溶出液中のタンパク質の濃度を決定すること；
（ｇ）タンパク質を含む第２の試料を保持リザーバ内に収容すること；
（ｈ）ＦＩＡを介して、第２の体積の結合緩衝液をアフィニティーカラムに送達すること；
（ｉ）ＦＩＡを介して、第２の試料を保持リザーバからアフィニティーカラムに移送すること；
（ｊ）ＦＩＡを介して、第２の体積の溶出緩衝液をアフィニティーカラムに送達し、それによりアフィニティーカラムから第２の試料中のタンパク質を溶出させて第２の溶出液を形成すること；
（ｋ）ＦＩＡを介して、第２の溶出液を消化チャンバに移送すること；
（ｌ）ＦＩＡを介して、消化試薬を送達し、第２の溶出液中のタンパク質を消化してペプチド混合物を形成すること；及び
（ｍ）ＦＩＡを介して、ペプチド混合物をペプチドマッピングユニットに移送し、タンパク質の翻訳後修飾を検出すること、を含む。

【0012】

一態様では、第１の試料及び第２の試料は、細胞培養物から得られる。一態様では、細胞培養物は、バイオリアクタ内にある。一態様では、バイオリアクタは、バッチバイオリアクタ、流加バイオリアクタ、又は灌流バイオリアクタである。

【0013】

一態様では、アフィニティーカラムには、プロテインＡカラムが含まれる。

【0014】

一態様では、（ｆ）の第１の溶出液中のタンパク質の濃度を決定することは、所定の検量線に従って少なくとも１つのプロセッサによって実施される。

【0015】

一態様では、第１の溶出液を形成するためのアフィニティーカラムからの第１の試料中のタンパク質の溶出時間は、所定の溶出時間に基づいて少なくとも１つのプロセッサによって制御される。一態様では、第２の溶出液を形成するためのアフィニティーカラムからの第２の試料中のタンパク質の溶出時間は、所定の溶出時間に基づいて少なくとも１つのプロセッサによって制御される。一態様では、第１の試料及び第２の試料中のタンパク質の所定の溶出時間は、同じである。一態様では、第１の試料及び第２の試料中のタンパク質の所定の溶出時間は、実験的に決定される。一態様では、第１の試料及び第２の試料中のタンパク質の所定の溶出時間は、本明細書に記載のオンライン方法を実施する前に実験的に決定される。

【0016】

一態様では、タンパク質濃度検出ユニットは、分光光度計を含む。一態様では、分光光度計は、第１の溶出液のＵＶ吸光度を測定し、少なくとも１つのプロセッサによって所定の検量線に基づいてタンパク質濃度を算出する。一態様では、検量線は、実験的に決定される。一態様では、検量線は、本明細書に記載のオンライン方法を実施する前に実験的に決定される。一態様では、分光光度計は、第１の溶出液のＵＶ吸光度を２８０ｎｍで測定し、少なくとも１つのプロセッサによって検量線に基づいてタンパク質濃度を算出する。一態様では、分光光度計は、第１の溶出液のＵＶ吸光度を２０５ｎｍで測定し、少なくとも１つのプロセッサによって検量線に基づいてタンパク質濃度を算出する。

【0017】

一態様では、第２の溶出液中のタンパク質は、（ｌ）で酵素的に消化される。一態様では、タンパク質の酵素消化は、ＦＩＡを介して、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、サーモライシン、パパイン、プロナーゼ、エンドペプチダーゼＡｒｇ－Ｃ、ペプチジル－Ａｓｐメタロエンドペプチダーゼ（エンドペプチダーゼＡｓｐ－Ｎ）、グルタミルエンドペプチダーゼ（Ｇｌｕ－Ｃエンドペプチダーゼ）、及びリシルエンドペプチダーゼ（Ｌｙｓ－Ｃエンドペプチダーゼ）から選択されるタンパク質分解酵素と第２の溶出液を接触させることを含む。一態様では、タンパク質分解酵素は、トリプシンを含む。

【0018】

一態様では、タンパク質分解酵素は、熱安定性トリプシンを含む。一態様では、本方法は、
（ｉ）ＦＩＡを介して、消化試薬を第２の溶出液に導入して消化混合物を形成すること；
（ｉｉ）消化混合物を混合すること；及び
（ｉｉｉ）消化混合物をインキュベートすること、を含む。

【0019】

一態様では、消化試薬は、消化緩衝液、還元剤、及びタンパク質分解酵素を含む。一態様では、消化緩衝液は、約６．０～約７．５のｐＨを有する。一態様では、還元剤は、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む。一態様では、第２の溶出液を、第１の溶出液の濃度に基づいて、少なくとも１つのプロセッサによって決定される量のタンパク質分解酵素と接触させる。一態様では、タンパク質分解酵素は、トリプシンを含む。一態様では、タンパク質分解酵素は、熱安定性トリプシンを含む。一態様では、第２の溶出液を、約１：１０～約１：１００の酵素：タンパク質比でタンパク質分解酵素と接触させる。一態様では、第２の溶出液を、約１：２０～約１：３０の酵素：タンパク質比でタンパク質分解酵素と接触させる。一態様では、第２の溶出液を、約１：１０～約１：１００のトリプシン：タンパク質比でトリプシンと接触させる。一態様では、第２の溶出液を、約１：２０～約１：３０のトリプシン：タンパク質比でトリプシンと接触させる。

【0020】

一態様では、消化混合物をインキュベートすることは、約３６℃～約８５℃の温度で約５分間～約３０分間インキュベートすることを含む。一態様では、消化混合物をインキュベートすることは、約５０℃～約７５℃の温度で約１５分間～約３０分間インキュベートすることを含む。一態様では、消化混合物をインキュベートすることは、約７０℃～約７２℃の温度で約１５分間～約３０分間インキュベートすることを含む。

【0021】

一態様では、タンパク質分解酵素は、熱安定性トリプシンを含み、本方法は、
（ｉ）ＦＩＡを介して、消化緩衝液、還元剤、及び熱安定性トリプシンを含む第１の量の消化緩衝液を第２の溶出液に導入し、混合して第１の消化混合物を形成すること；
（ｉｉ）第１の消化混合物を約７０℃～約７５℃の温度で約１０分間～約２０分間インキュベートして、第１のインキュベート混合物を形成すること；
（ｉｉｉ）ＦＩＡを介して、第２の量の熱安定性トリプシンをインキュベート混合物に導入し、混合して第２の消化混合物を形成すること；並びに
（ｉｖ）第２の消化混合物を約７０℃～約７５℃の温度で約１０分間～約２０分間インキュベートして、ペプチド混合物を形成すること、を含む。

【0022】

一態様では、第２の量の消化緩衝液が、ＦＩＡを介して、（ｉｉｉ）の第２の量の熱安定性トリプシンとともに第１のインキュベート混合物に添加される。

【0023】

一態様では、ペプチドマッピングユニットは、質量分析計（ＭＳ）を含む。一態様では、翻訳後修飾を検出することは、質量分析（ＭＳ）を使用して実施されるペプチドマッピング分析を含む。一態様では、翻訳後修飾を検出することは、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を使用して実施されるペプチドマッピング分析を含む。一態様では、液体クロマトグラフィーには、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）が含まれる。

【0024】

一態様では、本方法は、オンラインで実施される。

【0025】

一態様では、翻訳後修飾には、グリコシル化、酸化、脱アミド化、異性化、糖化、Ｎ末端リーダー配列、Ｎ末端環化、Ｃ末端リジン保持、アミド形成、又はそれらの組み合わせが含まれる。一態様では、グリコシル化には、Ｎ－結合型グリコシル化、Ｏ－結合型グリコシル化、又はそれらの組み合わせが含まれる。

【0026】

一態様では、組換えタンパク質を生産する方法が提供される。一態様では、本方法は、
（ａ）組換えタンパク質が発現される条件下で宿主細胞を培養すること；
（ｂ）本明細書に記載の方法に従ってタンパク質の翻訳後修飾を検出すること；
（ｃ）（ｂ）で検出された翻訳後修飾に基づいて１つ以上の細胞培養パラメータを修正すること、を含む。

【0027】

一態様では、宿主細胞は、バッチバイオリアクタ、流加バイオリアクタ、又は灌流バイオリアクタであるバイオリアクタ内で培養される。一態様では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。一態様では、宿主細胞は、ＣＨＯ、ＨＥＫ ２９３、ＣＯＳ、ＮＳ０、ＳＰ２、又はＰＥＲ．Ｃ６宿主細胞である。

【0028】

一態様では、以下の細胞培養パラメータ：ｐＨ；ＣＯ_２レベル；溶存酸素量（ｄＯ_２）；温度；栄養素の量若しくはタイプ；グリカン前駆体の存在及びタイプ；又はそれらの組み合わせのうちの１つ以上が、本明細書に記載の方法を使用して検出された翻訳後修飾に基づいて修正される。

【0029】

一態様では、タンパク質は、少なくとも１０００個のアミノ酸残基を含む。一態様では、タンパク質は、組換え生産される。一態様では、タンパク質は、糖タンパク質を含む。一態様では、タンパク質は、治療用タンパク質を含む。一態様では、タンパク質は、治療用抗体又はその抗原結合断片を含む。一態様では、タンパク質は、融合タンパク質を含む。

【0030】

一態様では、本明細書に記載の方法により生産される組換えタンパク質が提供される。一態様では、本明細書に記載の方法により生産される組換えタンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物が提供される。

【0031】

一態様では、タンパク質の翻訳後修飾をモニタリングするためのオンライン方法が提供される。一態様では、本方法は、フローインジェクション分析器（ＦＩＡ）により行われる。一態様では、ＦＩＡは、シーケンシャルインジェクション分析器（ＳＩＡ）である。一態様では、ＦＩＡは、ダイレクトインジェクション分析器（ＤＩＡ）である。一態様では、ＦＩＡは、少なくとも１つのプロセッサによって制御される双方向ポンプを含む。一態様では、ＦＩＡは、少なくとも１つのプロセッサによって制御されるシリンジポンプ及びマルチポートバルブを含む。一態様では、ＦＩＡは、２つ以上のシリンジポンプ及び２つ以上のマルチポートバルブを含む。一態様では、ＦＩＡは、２つのシリンジポンプ及び２つのマルチポートバルブを含む。

【0032】

一態様では、本方法は、
（ａ）タンパク質を含む第１の試料をＦＩＡの保持リザーバ内に収容すること；
（ｂ）マルチポートバルブの動作によって、第１の体積の結合緩衝液をＦＩＡ内のアフィニティーカラムに導入すること；
（ｃ）シリンジポンプの動作によって、第１の試料を保持リザーバからアフィニティーカラムへと進め、第１の試料中のタンパク質をアフィニティーカラムに結合させること；
（ｄ）マルチポートバルブの動作によって、第１の体積の溶出緩衝液をアフィニティーカラムに導入し、結合したタンパク質を溶出させて第１の溶出液を形成すること；
（ｅ）シリンジポンプの動作によって、第１の溶出液をＦＩＡ内の分光光度計へと進めること；
（ｆ）少なくとも１つのプロセッサによって、測定されたＵＶ吸光度に従って第１の溶出液中のタンパク質の濃度を決定すること；
（ｇ）タンパク質を含む第２の試料を保持リザーバ内に収容すること；
（ｈ）マルチポートバルブの動作によって、第２の体積の結合緩衝液をアフィニティーカラムに導入すること；
（ｉ）シリンジポンプの動作によって、第２の試料を保持リザーバからアフィニティーカラムへと進め、第２の試料中のタンパク質をアフィニティーカラムに結合させること；
（ｊ）マルチポートバルブの動作によって、第２の体積の溶出緩衝液をアフィニティーカラムに導入し、結合したタンパク質を溶出させて第２の溶出液を形成すること；
（ｋ）シリンジポンプの動作によって、第２の溶出液をＦＩＡ内の消化チャンバへと進めること；及び
（ｌ）マルチポートバルブの動作によって、消化チャンバ内の第２の溶出液に消化試薬を導入し、タンパク質を消化してペプチド混合物を形成すること；及び
（ｍ）シリンジポンプの動作によって、ペプチド混合物をペプチドマッピングユニットへと進め、タンパク質の翻訳後修飾を検出すること、を含む。

【0033】

一態様では、タンパク質を消化することは、
（ｉ）マルチポートバルブの動作によって、消化緩衝液、還元剤、及びタンパク質分解酵素を消化チャンバ内の第２の溶出液に導入して、混合して第１の消化混合物を形成すること；
（ｉｉ）消化チャンバ内の第１の消化混合物をインキュベートして、第１のインキュベート混合物を形成すること；
（ｉｉｉ）マルチポートバルブの動作によって、第２の体積の消化緩衝液及びタンパク質分解酵素をインキュベート混合物に導入して、第２の消化混合物を形成すること；並びに
（ｉｖ）消化チャンバ内の第２の消化混合物をインキュベートして、ペプチド混合物を形成すること、を含む。

【0034】

一態様では、（ｆ）の第１の溶出液中のタンパク質の濃度を決定することは、所定の検量線に従って少なくとも１つのプロセッサによって実施される。一態様では、所定の溶出時間に基づいて、第１の試料中のタンパク質がアフィニティーカラムから溶出され、第１の溶出液が形成される。一態様では、所定の溶出時間に基づいて、第２の試料中のタンパク質がアフィニティーカラムから溶出され、第２の溶出液が形成される。

【0035】

一態様では、消化緩衝液は、約６．０～約７．５のｐＨを有する。一態様では、還元剤は、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である。一態様では、消化チャンバに導入されるタンパク質分解酵素の量は、第１の溶出液の濃度（既に決定済み）に基づいて少なくとも１つのプロセッサによって決定される。一態様では、タンパク質分解酵素は、トリプシンを含む。一態様では、トリプシンは、熱安定性トリプシンを含む。一態様では、第２の溶出液を、約１：１０～約１：１００のトリプシン：タンパク質比でトリプシンと接触させる。一態様では、第２の溶出液を、約１：２０～約１：３０のトリプシン：タンパク質比でトリプシンと接触させる。

【0036】

一態様では、第１の消化混合物は、約３６℃～約８５℃の温度で約５分間～約３０分間インキュベートされる。一態様では、第１の消化混合物は、約５０℃～約７５℃の温度で約１５分間～約３０分間インキュベートされる。一態様では、第１の消化混合物は、約７０℃～約７２℃の温度で約１５分間～約３０分間インキュベートされる。

【0037】

一態様では、第２の消化混合物は、約３６℃～約８５℃の温度で約５分間～約３０分間インキュベートされる。一態様では、第２の消化混合物は、約５０℃～約７５℃の温度で約１５分間～約３０分間インキュベートされる。一態様では、第２の消化混合物は、約７０℃～約７２℃の温度で約１５分間～約３０分間インキュベートされる。

【0038】

一態様では、タンパク質分解酵素は、熱安定性トリプシンを含み、本方法は、
（ｉ）マルチポートバルブの動作によって、第１の量の消化緩衝液、還元剤、及び熱安定性トリプシンを第２の溶出液に導入し、混合して第１の消化混合物を形成すること；
（ｉｉ）第１の消化混合物を約７０℃～約７５℃の温度で約１０分間～約２０分間インキュベートして、インキュベート混合物を形成すること；
（ｉｉｉ）マルチポートバルブの動作によって、第２の量の消化緩衝液及び熱安定性トリプシンをインキュベート混合物に導入し、混合して第２の消化混合物を形成すること；並びに
（ｉｖ）第２の消化混合物を約７０℃～約７５℃の温度で約１０分間～約２０分間インキュベートして、ペプチド混合物を形成すること、を含む。

【0039】

一態様では、タンパク質は、少なくとも約１０００個のアミノ酸残基を含む。

【0040】

一態様では、ペプチド混合物は、約１００個未満のアミノ酸を含むペプチドを含む。

【0041】

一態様では、目的タンパク質の翻訳後修飾をモニタリングするためのオンラインシステムが提供される。一態様では、本システムは、
（ａ）目的タンパク質をそれぞれ含む第１の試料及び第２の試料を収容するように構成された保持リザーバ；
（ｂ）第１の試料及び第２の試料を保持リザーバからフローインジェクション分析器（ＦＩＡ）を通じて進めるように構成された第１のシリンジポンプ；
（ｃ）第１のシリンジポンプと流体連通した第１のマルチポートバルブ；
（ｄ）第１のマルチポートバルブと流体連通し、保持リザーバからの第１の試料及び第２の試料を収容するように構成されたアフィニティーカラム；
（ｅ）アフィニティーカラムからの第１の溶出液を収容するように構成されたＦＩＡ内の分光光度計であって、ここで、第１の溶出液が、第１の試料からのタンパク質を含み、分光光度計が、ＵＶ吸光度を決定し且つ所定の検量線に基づいて第１の試料のタンパク質濃度を算出するように構成されている、分光光度計；
（ｆ）第２の溶出液をアフィニティーカラムから消化チャンバへと進めるように構成された第２のシリンジポンプであって、ここで、第２の溶出液が、第２の試料からのタンパク質を含み、第２の溶出液中のタンパク質が、（ｅ）で決定された第１の試料のタンパク質濃度に基づいて消化される、第２のシリンジポンプ；並びに
（ｇ）第２のシリンジポンプと流体連通した第２の注入マルチポートバルブ、を含む。

【図面の簡単な説明】

【0042】

【図1】本明細書に記載の方法と一致する自動方法のプロセス実装を提供するように構成されたシステムの概略図である。

【図2】本明細書に記載の方法と一致する自動方法のプロセス制御を提供するように構成されたコンピュータシステムの概略図である。

【図3】本明細書に記載のオンライン自動方法を実施するための、第１のシリンジポンプ及び第１のバルブシステムの概略図である。

【図4】本明細書に記載のオンライン自動方法を実施するための、第２のシリンジポンプ及び第２のバルブシステムの概略図である。

【図5】本明細書に記載されるオンライン自動方法の概略図示である。

【図6】本明細書に記載される代替方法の概略図示である。

【図7】本明細書に記載されるオンライン自動方法の更なる概略図示である。

【図8】本明細書に記載されるペプチドマッピングプロセスのフローチャートである。

【図9A】プロテインＡ捕捉工程を使用したポリペプチドの検量線及びＵＶ決定を示すグラフである。

【図9B】第１の溶出液の濃度決定を行うために使用されたＵＶプロファイルであって、後にタンパク質消化に使用された第２の溶出液について同量のタンパク質が捕捉されたことを示しているものである。

【図10A】本明細書に記載のオンラインペプチドマッピング法を使用して決定した試料ＩｇＧ１モノクローナル抗体のグリコシル化％と、グリカン遊離（オリゴ２－ＡＢ）法を使用して決定したものとの間の相関関係を示すグラフである。

【図10B】本明細書に記載のオンラインペプチドマッピング法を使用して、細胞培養中に経時的に（７日目、１０日目、及び１４日目）モニタリングしたマンノースの定量化％を示すグラフである。各時点の反復実験により、一定レベルの定量化％が示される。

【図11A】オンラインペプチドマッピング法を使用したＧ０Ｆ検出とグリカン遊離（オリゴ２－ＡＢ）法を使用したＧ０Ｆ検出との間の直接的な線形関係を示すグラフである。

【図11B】オンラインペプチドマッピング法を使用したＧ１Ｆ検出とグリカン遊離（オリゴ２－ＡＢ）法を使用したＧ１Ｆ検出との間の直接的な線形関係を示すグラフである。

【図11C】オンラインペプチドマッピング法を使用したＭａｎ５検出とグリカン遊離（オリゴ２－ＡＢ）法を使用したＭａｎ５検出との間の直接的な線形関係を示すグラフである。

【図11D】オンラインペプチドマッピング法を使用したＧ０Ｆ－ＧＮ検出とグリカン放出（オリゴ２－ＡＢ）法を使用したＧ０Ｆ－ＧＮ検出との間の直接的な線形関係を示すグラフである。

【図12A】本明細書に記載のオンラインペプチドマッピング法を使用して決定した、細胞培養中の特定のメチオニン残基における酸化レベルを経時的に示すグラフである。

【図12B】本明細書に記載のオンラインペプチドマッピング法を使用して決定した、細胞培養中のＮ末端環化のレベルを経時的に示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0043】

本発明は、組換え生産されたポリペプチドの翻訳後修飾（ＰＴＭ）を検出する、同定する、又はモニタリングするための方法及びシステムに関し、特に、細胞培養中の組換え生産されたタンパク質のＰＴＭをリアルタイムでモニタリングするためのオンライン方法又はシステムに関する。

【0044】

Ａ．定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者が通常理解する意味を有するものとする。更に、文脈で別段の定めがない限り、単数形の用語には複数形が含まれ、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。例えば、特に明記しない限り、「ａ」又は「ａｎ」には複数形、例えば、「１つ以上」又は「少なくとも１つ」が含まれ、「又は」という用語は「及び／又は」を意味し得る。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」という用語は、限定するものではない。本明細書に提供される任意のタイプの範囲には、記載される特定の範囲内の全ての値及び特定の範囲の端点に関する値が含まれる。

【0045】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、例えば、本発明の説明に用いられる、組成物中の成分の量、濃度、体積、プロセス温度、プロセス時間、収率、流量、圧力、及びそれらの範囲を修飾するために使用される。「約」という用語は、例えば、化合物、組成物、濃縮物、又は製剤の製造に使用される典型的な測定及び取扱いの手順により；これらの手順での偶発的エラーにより；方法を行うために使用される出発材料又は成分の製造、供給源又は純度及び他の類似の要件の差により、起こり得る数値量の変動を指す。「約」という用語は、特定の初期濃度又は初期混合を有する製剤の経時変化に起因して異なる量、及び特定の初期濃度又は初期混合を有する製剤の混合又は処理に起因して異なる量も包含する。「約」という用語により修飾された場合、本明細書に添付された特許請求の範囲は、そのような均等物を含む。

【0046】

一般的には、本明細書中に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、並びにタンパク質及びオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド化学作用、並びにハイブリダイゼーションとの関連で使用される命名法及びそれらの技法は、当該技術分野で周知であり通常使用されるものである。本明細書では、アミノ酸は、一般に知られている３文字記号又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）により推奨されている１文字記号のいずれかにより言及され得る。ヌクレオチドは、同様に、一般に受け入れられている１文字コードにより言及され得る。

【0047】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって互いに接合された２つ以上のアミノ酸残基を含む任意の長さの分子を指す。本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって互いに接合された約２～約５０個のアミノ酸を含むポリペプチドを指す。「タンパク質」という用語は、ペプチド結合によって互いに接合された約１００個を超えるアミノ酸残基、又は約１０００個を超えるアミノ酸残基を含むポリペプチドを指す。ポリペプチド内のアミノ酸の配列は、一次構造と称される。一態様では、タンパク質は、例えば第１のアミノ酸の酸素原子と第２のアミノ酸の窒素原子との間の水素結合形成の結果として二次元のアルファヘリックス又はベータプリーツシートが生じることにより、二次構造を有する。一態様では、タンパク質は、例えば、１つ以上の鎖間ジスルフィド（Ｓ－Ｓ）結合の形成、又はアミノ酸Ｒ基間の他の相互作用（水素結合、イオン結合、共有結合、及び疎水性相互作用を含むがこれらに限定されない）により、三次元の三次構造を有する。一態様では、タンパク質は、例えば２つ以上のポリペプチド鎖、例えば抗体が存在することにより、四次構造を有する。一態様では、ペプチドは二次、三次、又は四次構造を有さない。

【0048】

「タンパク質」という用語は、抗体及び他の非抗体タンパク質（酵素、受容体、リガンド、分泌タンパク質、融合タンパク質、又はそれらの断片を含むがこれらに限定されない）を指し得る。タンパク質は科学的又は商業的な関心対象であり得、タンパク質には治療用タンパク質が含まれ得るがこれに限定されない。「治療用タンパク質」という用語は、障害又は疾患を治療、予防、又は改善するのに有用な１つ以上の生物学的活性を有するタンパク質を指す。

【0049】

本明細書で使用される場合、「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、互換的に使用することができ、抗原の抗原決定基の特徴部に相補的な内表面の形状及び電荷分布を伴う三次元結合空間を有するポリペプチド鎖のフォールディングにより形成されている少なくとも１つの結合ドメインを含むタンパク質又はポリペプチドの群を指す。従来の又は天然に存在する抗体は、典型的には２対のポリペプチド鎖の四量体形態を有し、各対は、１本の「軽」鎖と１本の「重」鎖とを有する。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。各軽鎖は１つの共有結合性のジスルフィド結合により重鎖に連結されるが、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間ではジスルフィド結合の数は異なる。重鎖及び軽鎖の各々はまた、規則的に隔てられた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それにいくつかの定常ドメイン（ＣＨ）が続く。各軽鎖は一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他端に定常ドメイン（ＣＬ）を有しており、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列する。軽鎖は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいてラムダ鎖又はカッパ鎖のいずれかに分類される。抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、サブアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、又はアロタイプ（例えば、Ｇｍ、例えばＧ１ｍ（ｆ、ｚ、ａ、若しくはｘ）、Ｇ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（ｇ、ｂ、若しくはｃ）、Ａｍ、Ｅｍ、及びＫｍ（１、２、若しくは３））の抗体であり得、抗体には、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの異なるエピトープ結合断片から形成された多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ＣＤＲグラフト化されたもの、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、細胞内抗体、及びそれらの望ましい抗原結合断片が含まれるがこれらに限定されず、組換え生産された抗体断片が含まれ得る。

【0050】

「抗原結合断片」又は「免疫学的に活性な断片」という用語は、少なくとも１つの抗原結合部位を含有し且つ抗原に特異的に結合する能力を保持している、抗体の断片を指す。組換え生産され得る抗体断片の例には、可変重鎖ドメイン及び軽鎖ドメインを含む抗体断片、例えば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片が含まれるがこれらに限定されない。抗体断片は、上で列挙された抗体のいずれかのエピトープ結合断片又は誘導体も含み得る。

【0051】

「組換え」という用語は、人間の介入によって（例えば組換えＤＮＡプロセスを使用して）、人為的又は合成的に（即ち非天然に）変更又は生産された生体物質、例えば核酸又はタンパク質を指し、これには例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現されたタンパク質が含まれる。

【0052】

「細胞培養」という用語は、目的生体分子、例えば目的タンパク質を生産することができる宿主細胞の集団を作製及び維持するために使用される方法及び技法、並びに目的生体分子を生産及び収集するための方法を指す。「細胞培養」中、タンパク質は、細胞内に生産され得るか、細胞膜周辺腔に生産され得るか、又は培地中に直接分泌され得る。一態様では、細胞培養物は、哺乳動物宿主細胞を含み得る。哺乳動物細胞に好適な培養条件は、当該技術分野で公知である。例えば、Ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄ．Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）を参照されたい。哺乳動物宿主細胞は、例えば、流動床バイオリアクタ、中空糸バイオリアクタ、ローラーボトル、振盪フラスコ、又は撹拌タンクバイオリアクタ内で、マイクロキャリアの有無を問わず、懸濁液中で、又は固体基材に付着させながら培養することができる。

【0053】

「細胞培養培地」又は「培養培地」とは、細胞培養中の細胞の生存及び増殖に必要な適切なエネルギー源及び栄養素を含む液体又はゲルを指す。典型的な細胞培養培地には、アミノ酸；通常はグルコースなどの炭水化物の形態であるエネルギー源；ビタミン；遊離脂肪酸；緩衝液；塩；及び微量必須元素が含まれる。細胞培養培地には、培養される細胞の要件及び／又は所望の細胞培養パラメータに応じて、追加の成分又は濃度を増加させた成分、例えば、アミノ酸、塩、糖、ビタミン、ホルモン、増殖因子、緩衝液、抗生物質、脂質、又は微量元素も補充され得る。

【0054】

「馴化培地」とは、細胞によって細胞培養培地中に放出又は分泌される目的生体分子を含有する培養培地を指す。

【0055】

「清澄化細胞培養培地」とは、例えば、遠心分離、精密濾過、タンジェンシャルフロー濾過、交互タンジェンシャルフロー濾過、及び／又はデプス濾過により宿主細胞及び／又は細胞デブリが除去された培養培地を指す。一態様では、清澄化細胞培養培地には、細胞培養上清が含まれる。

【0056】

「バイオリアクタ」とは、細胞培養物の増殖を制御するように設計された容器を指す。バイオリアクタという用語は、個々のフラスコ及び振盪フラスコ又はウェーブバッグから、１リットルのバイオリアクタまで、また最大でラージスケールの工業用バイオリアクタに至るまでのあらゆるスケールの細胞培養を指し得る。一態様では、バイオリアクタは、例えば約１２５ｍｌ～約５００ｍｌの容積を有する、スモールスケールのバイオリアクタである。一態様では、バイオリアクタは、例えば約１００リットル～約２０，０００リットル以上の容積を有する、ラージスケールのバイオリアクタである。様々なバイオリアクタが知られており、それらには、撹拌スタンク（ｓｔｉｒｒｅｄ－ｓｔａｎｋ）、固定床、流動床、気泡塔、及びエアリフトバイオリアクタが含まれるがこれらに限定されない。ラージスケール又は商業スケールの細胞培養（例えば、治療用タンパク質の生産のためのもの）は、数日間又は更には数週間維持され得る。この期間、培養物には、細胞培養の過程の間に消費される栄養素及びアミノ酸などの成分を含有する濃縮フィード培地が補充され得る。一態様では、バッチプロセスでの細胞培養プロセス中に、バイオリアクタ内の培地は補充されない。一態様では、流加バイオリアクタでの細胞培養プロセス中に、バイオリアクタ内の培地には追加の成分、例えば栄養素又は細胞培養培地が補充される。一態様では、培地はバイオリアクタに継続的に添加され、使用済み培地及び生産物は、灌流バイオリアクタでの細胞培養プロセス全体を通じて除去される。

【0057】

「宿主細胞」又は「組換え宿主細胞」は、発現ベクターが導入された細胞である。「宿主細胞」という用語は、特定の細胞のみならず、かかる細胞の子孫も指す。変異又は環境の影響のいずれかに起因して後代にある特定の修飾が起こる場合があることから、かかる子孫は、実際には親細胞と同一ではない場合があるが、「宿主細胞」という用語の範囲に依然として含まれる。宿主細胞には、原核細胞及び真核細胞が含まれ得る。一態様では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒト胎児腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）、サル腎細胞（例えば、ＣＯＳ）、マウス骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ０若しくはＳＰ２）、又はヒト初代胎児網膜細胞（ＰＥＲ．Ｃ６）である。

【0058】

「重要品質特性」（ＣＱＡ）は、生産物の安全性及び／又は有効性に影響を及ぼし得る治療用タンパク質の化学的、物理的、又は生物学的特徴である。ＣＱＡには、例えばサイズ及び配列のバリアント、凝集又は断片化によるバリアント、並びに電荷バリアントを含む、生産物特異的バリアントが含まれ得る。他のバリアントには、グリコシル化、酸化、脱アミド化、異性化、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端プロセシングなどの翻訳後修飾（ＰＴＭ）が含まれる。ＣＱＡには、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、浸出物、及び他の原料を含むがこれらに限定されない、プロセスに関連する不純物も含まれる。

【0059】

「翻訳後修飾」（ＰＴＭ）とは、ポリペプチド鎖への官能基の共有結合付加又はポリペプチド鎖内のペプチド結合の切断の結果としてのポリペプチドの変化を指し、これには、グリコシル化、酸化、脱アミド化、異性化、糖化、Ｎ末端リーダー配列、Ｎ末端環化、Ｃ末端リジン保持、アミド形成、又はそれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。一態様では、グリコシル化には、Ｎ－結合型グリコシル化、Ｏ－結合型グリコシル化、又はそれらの組み合わせが含まれる。

【0060】

「糖タンパク質」とは、ポリペプチド鎖の全長に沿って付加された１つ以上の炭水化物又は糖部分を含むタンパク質を指す。「グリコペプチド」とは、ポリペプチド鎖の全長に沿って付加された１つ以上の炭水化物又は糖部分を含むペプチドを指す。

【0061】

「グリコフォーム」とは、グリコシル化プロファイル（即ち、付着したグリカンの数及び／又はタイプ）が異なるタンパク質のアイソフォームを指す。

【0062】

「グリカン」とは、ポリペプチド鎖に付着したオリゴ糖を指し、これにはＮ－結合型及びＯ－結合型グリカンが含まれる。Ｎ－結合型グリカン（Ｎ－グリカンとも呼ばれる）は、Ｎ－グリコシド結合を介してアスパラギン（Ａｓｐ）又はアルギニン（Ａｒｇ）残基のアミド窒素でポリペプチド鎖に付着する。Ｎ－結合型グリコシル化は、コンセンサス配列（Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸である）で起こる。Ｏ－結合型グリカン（又はＯ－グリカン）は、α－Ｏ－グリコシド結合を介してセリン（Ｓｅｒ）又はトレオニン（Ｔｈｒ）残基でポリペプチド鎖に付着する。Ｏ－結合型グリコシル化に関する一般的なコンセンサス配列は存在しない。Ｎ－結合型グリコシル化及びＯ－結合型グリコシル化は両方とも、個々の単糖の段階的な付加及び／又は除去を含む反応経路において、小胞体（ＥＲ）及びゴルジ体内で起こる。様々な末端糖の有無によって分類可能である多くのタイプのグリカンがあり、それらとしては、例えば、末端ガラクトース部分が０個のアガラクトシルグリカン（例えば、Ｇ０、Ｇ０－ＧｌｃＮＡｃ、Ｇ０Ｆ、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮＡｃ）、末端ガラクトース部分が１個のグリカン（例えば、Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ１Ｆ－ＧｌｃＮＡｃ）、及び末端ガラクトース部分が２個のグリカン（例えば、Ｇ２Ｆ、Ｇ２Ｆ＋シアル酸）が挙げられる。タンパク質の機能に有益であり得るグリコシル化パターンもあれば、有害であり得るグリコシル化パターンもある。

【0063】

「プロセス分析技術」（ＰＡＴ）とは、原料及びインプロセス材料並びにプロセスの重要な品質及び性能特性をタイムリーに（例えば、処理中に）測定することを通じて、製造を設計、分析、及び制御するためのシステムを指す。

【0064】

「オンライン」とは、人間の介入なしにプロセス溶液の自動試料採取が行われる分析プロセスを指す。「インライン」とは、流動する材料の流れの中にセンサを配置して分析を行う分析プロセスを指す。「アトライン」とは、試料がプロセスからプロセスに物理的に近接した分析装置に移送され、分析結果が比較的短時間で返される（即ち、数時間）プロセスを指す。「オフライン」とは、試料がプロセスから取り出され別の場所で分析されるプロセスであって、分析結果が比較的短時間以内には返されない（例えば、数日）プロセスを指す。オフライン分析とアトライン分析の両方で、試料をシステムから手動で採取し、続いて試料の調製及び分析を行うという人間の介入が必要である。オンライン分析及びインライン分析は完全に自動化され、人間の介入なしで実施することができる。

【0065】

「リアルタイム」とは、分析プロセスが大幅な時間の遅延なしで、例えば、分析プロセスから得られた情報をプロセス条件の最適化に関する決定に適用することができる十分に短い時間内に実施されることを意味し、例えば、試料を採取した細胞培養が依然進行中である間に、バイオリアクタ内の細胞培養条件を最適化することができる。一態様では、プロテインＡ捕捉工程とタンパク質濃度決定とを含む分析プロセスの結果は、約５時間未満、約４時間未満、又は約３時間未満内に入手可能である。一態様では、分析プロセスの結果は、約２．５時間未満内に入手可能である。対照的に、オフラインプロセスでは、分析プロセスの結果には一般に少なくとも１日、最大で２日を要する。

【0066】

「自動」とは、人間の発明なしに実施されるプロセスを指す。一態様では、自動プロセスは、１つ以上の装置により実施される。一態様では、自動プロセスには、試料調製がオンライン且つ自動であるプロセスが含まれる。一態様では、オンライン自動試料調製プロセスは、流体インジェクション分析器（ＦＩＡ）で実施される。一態様では、流体インジェクション分析器は、シーケンシャルインジェクション分析器（ＳＩＡ）である。一態様では、流体インジェクション分析器は、ダイレクトインジェクション分析器（ＤＩＡ）である。一態様では、自動プロセスには、自動分析装置、例えば自動ペプチドマッピングユニットが含まれる。「自動」という用語には、オフライン自動プロセス、例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ液体ハンドリングシステム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）又はＴＥＣＡＮ液体ハンドリングシステム（ＴＥＣＡＮ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．，Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｚｅｒｌａｎｄ）などの液体ハンドリングシステムを使用したプロセスは含まれない。

【0067】

「所定の」とは、プロセスの開始前、例えば、本明細書に記載の方法の開始前に決定されたものを指す。例えば、タンパク質濃度を決定する際に使用される「所定の検量線」とは、タンパク質濃度が既知の代表的な試料を使用して作成される検量線を指す。例えば、検量線は、濃度が既知の試料を得て、段階希釈、例えば１０倍段階希釈を実施して、既知の濃度の約３～約１０個の試料を得ることによって作成することができる。一態様では、次いで、段階希釈した試料のＵＶ吸光度を、タンパク質を除く全ての試薬を含むブランクのＵＶ吸光度とともに決定する。検量線は、試料の既知のタンパク質濃度に対してＵＶ吸光度をプロットすることによって作成される。一態様では、「所定の溶出時間」は、既知量の代表的試料をカラムにロードし、カラムから試料を溶出するのに必要な時間量を決定することによって決定される。一態様では、溶出時間とは、溶出試薬を既知の速度でアプライした場合に、試料がカラムにロードされた時間と、試料がカラムからそれ以上溶出されなくなる時間との間で経過した時間量を指す。一態様では、溶出時間とは、溶出試薬を既知の速度でアプライした場合に、試料がカラムにロードされた時間と、最大濃度の試料がカラムから溶出される時間との間で経過した時間量を指す。一態様では、溶出時間は、カラムから全ての試料を溶出するのに必要となる既知の流量での溶出試薬の体積を指し得る。「所定の」翻訳後修飾とは、本明細書に記載の方法の前に同定される目的タンパク質の既知の翻訳後修飾を指しており、その方法は、所定の翻訳後修飾を同定及び／又は定量化するために使用される。

【0068】

「同時に」は、本明細書に記載の方法工程に関連して使用される場合、工程が実質的に同時間に実施される方法を指す。「実質的に同時間に」実施される動作は、動作が並行して実施されることを意味し得るが、２つの動作が互いに短い時間内に、例えば互いに約３０分以内、又は互いに約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、若しくは約１分以内に実施される状況も含み得る。一態様では、ある方法工程の少なくとも一部の実行が別の方法工程の一部の実行と時間的に重複する場合、方法工程は「同時に」実施される。「同時に」は、厳密に並行する作用を必要とするわけではない。例えば、全ての方法工程が同時間に開始又は終了する必要はない。一態様では、「同時に」は、反応が同じ反応体積で且つ／又は同じインキュベーション期間中に起こるように、方法工程に必要な全ての試薬が同じ反応混合物中で合わされることを意味し得る。

【0069】

「実質的に同じ」又は「実質的に一致する」とは、量、体積、時間、温度、圧力、濃度、及び流量を含むがこれらに限定されない２つのプロセスパラメータに関して使用される場合、２つのプロセスパラメータの量又は定量化が機能的に同等であること、例えば、２つのプロセスパラメータの差が、約１０％未満、約５％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、又は約０．１％未満であることを意味する。

【0070】

「フローインジェクション分析」（ＦＩＡ）とは、自動試料処理のためにマイクロリットル体積の試料をキャリア流に注入し、キャリア流により移動させる分析技法を指す。フローインジェクション分析は、フローインジェクション分析器（ＦＩＡ）によって実施することができ、これは、本明細書で使用する場合、シーケンシャルインジェクション分析器（ＳＩＡ）又はダイレクトインジェクション分析器（ＤＩＡ）を含み得るか又は包含し得る。一態様では、フローインジェクション分析器は、分析器を通じて試料を移動させるために一定流量のキャリア流を使用する。一態様では、フローインジェクション分析器は、試料と試薬を混合するために、又は試料成分をアッセイするためにキャリア流の流れを逆転又は停止させることができる双方向ポンプ、例えばシリンジポンプを含む。

【0071】

本明細書で使用される場合、「流体連通した」とは、流体、例えば液体が、システム内のあるコンポーネント、機器、又はデバイスから別のコンポーネント、機器、又はデバイスに流れることができることを意味する。流れは、１つ以上の中間コンポーネント、機器、又はデバイスによって実現されてもよく、（例えばバルブによって）選択的に遮断可能であっても、又はそうでなくてもよい。

【0072】

本明細書で使用される場合、「連結された」とは、２つ以上のコンポーネント、機器、又はデバイスが、１つ以上の中間コンポーネント、機器、又はデバイスによって、可動的に又は固定してつなぎ合わされている又は他の方法で取り付けられていることを意味する。

【0073】

本明細書で使用される場合、「上流」及び「下流」とは、システム内のキャリア流の流れ方向に対する相対的位置を指す。「上流」という用語は、別のコンポーネント又は位置と比較して、システムの入力部により近いシステムコンポーネント又は位置を指す。「下流」という用語は、別のコンポーネント又は位置と比較して、システムの出口により近いシステムコンポーネント又は位置を指す。

【0074】

「カラムクロマトグラフィー」とは、液体試料中の成分が、試料の移動相が固定相上を流れる際の試料中の成分の差次的吸着に基づいて分離されるプロセスを指す。

【0075】

「アフィニティークロマトグラフィー」とは、等電点、疎水性、又はサイズなどのタンパク質の一般的特徴ではなく、クロマトグラフィー分離を生じさせる、目的成分とクロマトグラフィーマトリックス上に固定化された化合物との間の特異的で可逆的な結合相互作用（受容体とリガンド間、酵素と基質間、又は抗原と抗体間の相互作用を含むがこれらに限定されない）に基づいて、移動相中の目的生体分子、例えばタンパク質がクロマトグラフィーカラムの固定相によって保持されるクロマトグラフィープロセスを指す。

【0076】

「プロテインＡクロマトグラフィー」とは、抗体のＦｃ部分と固定相に固定化されたプロテインＡのＩｇＧ結合ドメインとの間の親和性に基づいて試料から抗体が精製される、アフィニティークロマトグラフィープロセスを指す。

【0077】

「液体クロマトグラフィー」（ＬＣ）とは、液体試料がカラムを通過する際に、液体試料のうちの１種以上の成分が選択的に保持されるプロセスを指す。試料中の１種以上の成分の保持は、固定相と移動相の間での成分の分布から生じる。液体クロマトグラフィーには、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及び超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）が含まれるがこれらに限定されない。

【0078】

「質量分析」（ＭＳ）とは、化合物がその質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいて検出、同定、及び／又は測定される分析技法を指す。ＭＳには、通常、化合物のイオン化、質量電荷比によるイオン化分子の分離、イオン化分子の検出、及び質量スペクトルの作成が含まれる。タンパク質イオン化の既知の方法は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）である。「質量分析計」とは、化合物をその質量電荷比に基づいて検出、同定、及び／又は定量化することができる分析装置を指す。質量分析計には通常、イオン源、質量分析器、及び検出器という３つの部分が含まれる。

【0079】

本明細書で使用される場合、「液体クロマトグラフィー／質量分析」（ＬＣ／ＭＳ）とは、試料中の成分、例えばペプチド混合物中のペプチドを液体クロマトグラフィーにより分離し、次いでイオン化して、それらの質量電荷比により特性決定する方法を指す。

【0080】

「タンデム質量分析」（ＭＳ／ＭＳ）とは、質量分析の２つ以上の工程を含む多段階プロセスを使用して化合物を検出、同定、及び／又は測定する技法であって、質量分析プロセスの間に断片化が実施されるものを指す。

【0081】

Ｂ．概要
ペプチドマッピングは、細胞培養プロセスの開発中、及び細胞培養プロセスを使用した生体分子の製造中に使用される重要な分析ツールである。一態様では、ペプチドマッピングは、生体分子の配列を確認するために使用され得る。一態様では、ペプチドマッピングは、細胞培養で生産されたペプチドの翻訳後修飾（ＰＴＭ）を同定及び定量化するために使用され得る。一態様では、ペプチドマッピングは、重要品質特性（ＣＱＡ）のマルチ特性モニタリング（ＭＡＭ）のために使用され得る。

【0082】

ＰＴＭを分析するための多くの方法が開発されている。最も広く使用されているアプローチのうちの１つには、ペプチドマッピングが含まれ、これには液体クロマトグラフィー（ＬＣ）／質量分析（ＭＳ）が含まれる。一方法では、グリカンを、例えば２－アミノベンズアミド（２－ＡＢ）又は２－アミノ安息香酸（２－ＡＡ）を使用して化学標識し、糖タンパク質から酵素的又は化学的に切断し、精製して、蛍光検出器を使用して液体クロマトグラフィー（ＬＣ）により分析する。このプロセスは、「蛍光標識グリカン遊離」法と称される。グリカンがタンパク質から除去されるため、グリカンの遊離によって部位特異的情報を得ることができない。別の方法では、ＬＣ／ＭＳ分析の前に、トリプシンなどの酵素を使用して糖タンパク質をペプチドに消化する。グリカンがペプチド上に残るため、ペプチドのＰＴＭ、例えばグリコシル化に関する部位特異的情報を得ることができる。一態様では、質量分析計により同定されたペプチドは、細胞培養培地から得られるインタクトタンパク質の代理標本（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ）として使用される。

【0083】

本明細書では、細胞培養中の生産物品質及びプロセス制御をリアルタイムでモニタリングするための、インプロセス試料を分析するための自動オンラインシステム及び方法が提供される。完了までに２日超、例えば、最大約３日又は約４日を要する場合がある従来のペプチドマッピングアプローチとは対照的に、本明細書に記載のオンラインペプチドマッピング法は、グリコシル化傾向、翻訳後修飾、及び他の部位特異的情報に関する情報を、１日未満、更にはわずか２．５時間未満で提供することができる完全自動プロセスを提供する。一態様では、本明細書に記載のシステムは、試料調製及びペプチドマッピング分析のための完全自動方法を提供する。一態様では、本方法は、タンパク質捕捉、タンパク質濃度決定、及びタンパク質消化のための完全自動システムを提供する。一態様では、本明細書に記載のオンラインペプチドマッピング法は、目的タンパク質に関連する１つ以上の既知の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を検出するために使用される。一態様では、本明細書に記載のオンラインペプチドマッピング法は、目的タンパク質に関連する１つ以上の所定の翻訳後修飾を検出するために使用される。有利なことに、ＰＴＭに関する部位特異的情報は、本明細書に記載の方法を使用して得ることができる。

【0084】

図１～４は、本明細書に記載の自動方法を実行又は実施するように構成されたシステムの概要を提供する。

【0085】

図１は、本明細書に記載の自動方法及びシステムと一致する自動方法のプロセス実装を提供するように構成されたシステムの概略図である。図１は、本明細書に記載の自動処理方法を実施するように構成された自動プロセス制御システム１００を図示する。図１には、ネットワーク環境の一態様が示されている。ネットワーク環境には１つ以上のプロセス制御デバイス２００を含むことができ、これは、１つ以上のネットワーク２０２を介して、バイオリアクタ１４０、フローインジェクション分析器（ＦＩＡ）１５０、１つ以上のデータ保持システム２０１、１つ以上の他のプロセス制御デバイス２００、及び１つ以上の分析装置１６０のうちの１つ以上と通信している。

【0086】

図３及び図４に示されるように、ＦＩＡ１５０は、少なくとも第１のシリンジポンプ３０２、第２のシリンジポンプ４０２、第１のバルブ３０１、及び第２のバルブ４０１を含み得る。更に、ＦＩＡ１５０は、少なくとも１つのアフィニティーカラム３１３、少なくとも１つの分光光度計４１４、及び少なくとも１つの消化チャンバ４１５を含み得る。加えて、ＦＩＡ１５０は、流体を適切な行き先に送るために必要な管材料、Ｔ字形接続部、バルブ、及び他のコンポーネントなどの更なるコンポーネントを含み得る。更に、ＦＩＡ１５０は、試料、試薬、反応物、水、還元剤、酵素、緩衝液などの供給源と、廃棄物を処分するための排水シンクとを含有し得るか、含み得るか、又は他の方法でそれらに接続され得る。ＦＩＡ１５０は、フローインジェクション分析器として、及び／又はシーケンシャルインジェクション分析器（ＳＩＡ）若しくはダイレクトインジェクション分析器（ＤＩＡ）の機能のいずれか若しくは全てを備えて、構成され得る。

【0087】

自動プロセス制御システム１００は、１つ以上のバイオリアクタ１４０を更に含み得る。自動プロセス制御システム１００を介して処理するための試料は、手動で又はＦＩＡ１５０への自動供給プロセスを通じてのいずれかで、１つ以上のバイオリアクタ１４０から取得され得る。本明細書に記載の方法と一致するバイオリアクタ１４０の更なる説明は後述する。

【0088】

自動プロセス制御システム１００の１つ以上の分析装置は、１つ以上の質量分析器を備えたペプチドマッピングシステムを含み得る。

【0089】

自動プロセス制御システム１００によって格納されるデータ及び情報には、以下の情報が含まれ得る。本明細書で使用される場合、「自動プロセス制御システムデータ」とは、自動プロセス制御システム１００に関連付けられたメモリ上又はメモリ内に記録及び格納され得るあらゆる全てのデータを指す。自動プロセス制御システムデータは、任意の好適なデータ形式で格納することができ、生産バッチ、生産日、又は任意の他の好適なパラメータによって並べ替えることができる。本明細書で使用される「プロセス情報」とは、タイミング、温度、添加量、較正係数、流量、及びモデルなどを含むがこれらに限定されない、試料処理方法及び技法の変数及びパラメータに関する情報を指す。本明細書で使用される「生産情報」とは、処理済み試料、過去の試料ランなどに関する情報を指す。上述のデータ及び／又は情報の各々は、本明細書で論じられるプロセス制御デバイス２００によってほぼリアルタイムでアクセスされ得る。自動プロセス制御システム１００に関連付けられたデータ及びプロセス情報は、例えば、後述するデータ保持システム２０１内に、及び／又は１つ以上のプロセス制御デバイス２００のメモリ内に格納され得る。

【0090】

プロセス制御デバイス２００は、サーバ（例えば、１つ以上のサーバブレード、プロセッサなどを有する）、パーソナルコンピュータ（例えば、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータなど）、スマートフォン、タブレットコンピューティングデバイス、ＦＩＡ１５０に統合されたコンピューティングシステム、並びに／又はバイオリアクタ１４０、ＦＩＡ１５０、及び／若しくは質量分析器１６０とインターフェースするようにプログラムされ得る他のデバイスとして構成され得る。一態様では、プロセス制御デバイス２００の機能のいずれか又は全ては、クラウドコンピューティングプラットフォームの一部として実施され得る。プロセス制御デバイス２００について、図２を参照して更に後述する。

【0091】

図１に示すネットワーク環境は、本明細書に記載の自動方法を提供するように構成された自動プロセス制御システム１００及びプロセス制御デバイス２００の例を表している。ネットワーク２０２を介して接続されているように示されているが、任意の好適な一連の個々の接続又はネットワーク接続を用いて、プロセス制御デバイス２００がバイオリアクタ１４０、ＦＩＡ１５０、及び分析装置１６０を制御し、種々のデータ保持システム２０１などの必要なリソースにアクセスできるようにすることができる。

【0092】

ネットワーク２０２は、有線又は無線リンクを介して接続され得る。有線リンクには、デジタル加入者線（ＤＳＬ）、同軸ケーブル回線、イーサネット、又は光ファイバー回線が含まれ得る。無線リンクには、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ Ｌｏｗ Ｅｎｅｒｇｙ（ＢＬＥ）、ＡＮＴ／ＡＮＴ＋、ＺｉｇＢｅｅ、Ｚ－Ｗａｖｅ、Ｔｈｒｅａｄ、Ｗｉ－Ｆｉ（登録商標）、Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｉｎｔｅｒｏｐｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ Ａｃｃｅｓｓ（ＷｉＭＡＸ（登録商標））、モバイルＷｉＭＡＸ（登録商標）、ＷｉＭＡＸ（登録商標）－Ａｄｖａｎｃｅｄ、ＮＦＣ、ＳｉｇＦｏｘ、ＬｏＲａ、Ｒａｎｄｏｍ Ｐｈａｓｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｃｃｅｓｓ（ＲＰＭＡ）、Ｗｅｉｇｈｔｌｅｓｓ－Ｎ／Ｐ／Ｗ、赤外線チャネル、又は衛星帯域が含まれ得る。無線リンクには、２Ｇ、３Ｇ、４Ｇ、又は５Ｇとして認定される規格を含む、モバイルデバイス間で通信するための任意のセルラーネットワーク規格も含まれ得る。無線規格には、種々のチャネルアクセス方法、例えば、ＦＤＭＡ、ＴＤＭＡ、ＣＤＭＡ、又はＳＤＭＡが使用され得る。一態様では、異なるタイプのデータが、異なるリンク及び規格を介して送信され得る。別の態様では、同じタイプのデータが、異なるリンク及び規格を介して送信され得る。ネットワーク通信は、例えば、ｈｔｔｐ、ｔｃｐ／ｉｐ、ｕｄｐ、イーサネット、ＡＴＭなどを含む任意の好適なプロトコルを介して行われ得る。

【0093】

ネットワーク２０２は、任意のタイプ及び／又は形態のネットワークであり得る。ネットワークの地理的範囲は広範に変化してもよく、ネットワーク２０２は、ボディエリアネットワーク（ＢＡＮ）、パーソナルエリアネットワーク（ＰＡＮ）、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、例えば、イントラネット、メトロポリタンエリアネットワーク（ＭＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）、又はインターネットであり得る。ネットワーク２０２のトポロジは、任意の形式であり得、例えば、以下のいずれか：ポイントツーポイント、バス、スター、リング、メッシュ、又はツリーを含み得る。ネットワーク２０２は、本明細書に記載の作動を補助することができる、当業者に公知の任意のそのようなネットワークトポロジのものであり得る。ネットワーク２０２は、例えば、イーサネットプロトコル、インターネットプロトコルスイート（ＴＣＰ／ＩＰ）、ＡＴＭ（非同期転送モード）技法、ＳＯＮＥＴ（同期光ネットワーキング）プロトコル、又はＳＤＨ（同期デジタルハイアラーキ）プロトコルを含む、異なる技法及びプロトコルの層又はスタックを利用することができる。ＴＣＰ／ＩＰインターネットプロトコルスイートは、アプリケーション層、トランスポート層、インターネット層（例えば、ＩＰｖ４及びＩＰｖ４を含む）、又はリンク層を含み得る。ネットワーク２０２は、ある種のブロードキャストネットワーク、電気通信ネットワーク、データ通信ネットワーク、又はコンピュータネットワークであり得る。

【0094】

データ保持システム２０１は、任意のタイプのコンピュータ可読記憶媒体及び／又はコンピュータ可読記憶デバイスを含み得る。そのようなコンピュータ可読記憶媒体又はデバイスは、データを格納し、データへのアクセスを提供するように構成され得る。コンピュータ可読記憶媒体又はデバイスの例としては、電子記憶デバイス、磁気記憶デバイス、光記憶デバイス、電磁記憶デバイス、半導体記憶デバイス、又はそれらの任意の好適な組み合わせ、例えば、コンピュータディスケット、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、消去可能プログラマブル読み取り専用メモリ（ＥＰＲＯＭ又はフラッシュメモリ）、スタティックランダムアクセスメモリ（ＳＲＡＭ）、ポータブルコンパクトディスク読み取り専用メモリ（ＣＤ－ＲＯＭ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、メモリスティックなどを挙げることができるが、これらに限定されない。

【0095】

図２は、本明細書に記載の方法と一致する自動方法のプロセス制御を提供するように構成されたコンピュータシステム又はプロセス制御デバイスの概略図である。プロセス制御デバイス２００は、１つ以上のプロセッサ１１０（本明細書では、便宜上、複数のプロセッサ（ｐｒｏｃｅｓｓｏｒｓ）１１０、プロセッサ（ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（ｓ））１１０、若しくはプロセッサ（ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）１１０とも互換的に称される）、１つ以上の記憶デバイス１２０、及び／又は他のコンポーネントを含む。別の態様では、プロセッサの機能は、ハードウェアによって（例えば、特定用途向け集積回路（「ＡＳＩＣ」）、プログラマブルゲートアレイ（「ＰＧＡ」）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（「ＦＰＧＡ」）などの使用を通じて）、又はハードウェアとソフトウェアの任意の組み合わせによって実施され得る。記憶デバイス１２０は、任意のタイプの非一時的なコンピュータ可読記憶媒体及び／又は非一時的なコンピュータ可読記憶デバイスを含む。このようなコンピュータ可読記憶媒体又はデバイスは、本明細書で説明する１つ以上の手法をプロセッサに実行させるためのコンピュータ可読プログラム命令を格納することができる。コンピュータ可読記憶媒体又はデバイスの例としては、限定されないが、電子記憶デバイス、磁気記憶デバイス、光記憶デバイス、電磁記憶デバイス、半導体記憶デバイス、又はそれらの任意の好適な組み合わせ、例えば、コンピュータディスケット、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、消去可能プログラマブル読み取り専用メモリ（ＥＰＲＯＭ又はフラッシュメモリ）、スタティックランダムアクセスメモリ（ＳＲＡＭ）、ポータブルコンパクトディスク読み取り専用メモリ（ＣＤ－ＲＯＭ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、メモリスティックを挙げることができる（但し、これらの例に限定されない）。

【0096】

プロセッサ１１０は、ソフトウェアプロトコルを表している、記憶デバイス１２０に格納された１つ以上のコンピュータプログラム命令によってプログラムされる。例えば、プロセッサ１１０は、プロセス制御マネージャ２５２、データ収集マネージャ２５４、較正マネージャ２５６、酵素決定マネージャ２５８、及びユーザインターフェースマネージャ２６０によってプログラムされる。本明細書で論じられる種々のマネージャの機能は代表的なものであり、限定的なものではないことが理解されよう。更に、記憶デバイス１２０は、データストレージを提供するデータ保持システム２０１として機能し得る。本明細書で使用される場合、便宜上、種々の「マネージャ」が作動を実施すると説明されるが、それは実際にはマネージャがプロセッサ１１０（したがってプロセス制御デバイス２００）に作動を実施するようにプログラムする場合である。

【0097】

プロセス制御デバイス２００の種々のコンポーネントは、協働して、１つ以上のＦＩＡＳ１５０及び１つ以上の分析装置１６０の制御を提供し、またユーザ又は他のシステムがこれらのシステムとインターフェースするためのインターフェースを提供する。

【0098】

プロセス制御マネージャ２５２は、自動プロセス制御システム１００上で作動するソフトウェアプロトコルである。プロセス制御マネージャ２５２は、１つ以上の制御信号をＦＩＡ１５０及び分析装置１６０に提供するように構成されている。プロセス制御マネージャ２５４によって提供される制御信号は、ＦＩＡ１５０及び分析装置１６０の１つ以上のプロセスパラメータの調整を生じさせるように構成されている。本明細書で使用される場合、前述した「プロセスパラメータ」とは、プロセス制御デバイス２００を通じてユーザが調整することができる生産プロセスの任意のパラメータ又は変数を指す。プロセスパラメータには、経路、流量、温度、インキュベーション期間、試薬の添加、種々のプロセス工程のタイミングなどが含まれるが、これらに限定されない。制御信号の決定は、本明細書で論じられるように、データ収集マネージャ２５４が受信したプロセス情報又は生産情報に基づき得る。

【0099】

プロセス制御マネージャ２５２によって提供される制御信号は、本明細書に記載のＦＩＡ１５０及び分析装置１６０が行うことのできる任意のプロセスを開始、制御、及び／又は更新するために使用され得る。例えば、プロセス制御マネージャ２５２は、ＦＩＡ１５０の種々の駆動手段の自動制御を介して、自動プロセス中のＦＩＡ１５０の全体にわたる、全ての試料、流体、試薬、温度、撹拌、インキュベーション期間などの流れ、経路、及びタイミングを制御するように構成されている。

【0100】

一態様では、プロセス制御マネージャ２５２は、プロセスモニタリング機能を提供する。プロセス制御マネージャ２５２は、プロセス制御デバイス２００によって測定、生成、及び／又は保存されたあらゆる全ての情報にアクセスするように構成され得る。プロセス制御マネージャ２５４は更に、ユーザインターフェースマネージャ２６０を介してそのような情報のいずれかをユーザに提供するように構成され得る。

【0101】

別の態様では、プロセス制御マネージャ２５２は、較正マネージャ２５６及び酵素決定マネージャ２５８と通信する、且つ／又は他の方法で相互作用するように構成され得る。較正マネージャ２５６及び酵素決定マネージャ２５８については、より詳細に後述する。

【0102】

一態様では、プロセス制御マネージャ２５２は、特に本明細書に記載の自動方法に関して更に後述するように、ＦＩＡ１５０及び分析装置１６０の作動を制御するように構成されている。

【0103】

一態様では、プロセス制御マネージャ２５２は、より詳細に後述するように、所定の溶出時間にわたり、アフィニティーカラム３１３を通る試料の流れを制御する。別の態様では、プロセス制御マネージャ２５２は、アフィニティーカラム３１３を通る試料の流れを制御して、所定体積の溶出液を出力として実現する。プロセス制御マネージャ２５２は、所定の溶出時間内に所定体積の溶出液を実現するように試料の流れを制御し得る。プロセス制御マネージャ２５２は更に、後述するように、アフィニティーカラム３１３の出力部から分光光度計４１４への溶出液の流れを制御して、データ収集マネージャ２５４によって溶出液のタンパク質濃度を決定及び／又は測定することができるように構成されている。一態様では、プロセス制御マネージャ２５２は、後述するように、アフィニティーカラム３１３の出力部から消化チャンバへの溶出液の流れを制御して、プロセス制御マネージャ２５２によって決定された量の消化試薬を添加することによりタンパク質を消化することができるように構成されている。一態様では、プロセス制御マネージャ２５２は、消化チャンバ４１５内の試料のインキュベーション時間及び温度を制御するように構成されている。

【0104】

データ収集マネージャ２５４は、プロセス制御デバイス２００上で作動するソフトウェアプロトコルである。データ収集マネージャ２５４は、ＦＩＡ１５０、分析装置１６０、アフィニティーカラム１５５、分光光度計１５６、及び消化チャンバ４１５のうちの１つ以上にアクセスして、本明細書に記載の自動プロセスに関連付けられたデータ及び情報を採集及び／又は収集するように構成されている。自動システムデータには、例えば、ほぼリアルタイムで取得され得る生産情報、アーカイブデータ、及び／又は抽出データに加えて、プロセス情報及びプロセスパラメータ情報、並びにＦＩＡ１５０及び分析装置１６０によって作成又は測定された任意の他の情報又はデータが含まれ得る。データ収集マネージャ２５４は更に、１つ以上のデータ保持システム２０１にアクセスして、データ保持システム２０１に格納された自動処理システムデータを格納及び／又は受信するように構成されている。

【0105】

データ収集マネージャ２５４は、分光光度計１５６とインターフェースして、アフィニティーカラム３１３によって生成又は出力された溶出液に対してタンパク質濃度の測定／決定を実施するように構成されている。

【0106】

較正マネージャ２５６は、プロセス制御デバイス２００上で作動するソフトウェアプロトコルである。較正マネージャ２５６は、分光光度計４１４により行われたＵＶ吸光度測定に基づくタンパク質濃度の決定に関する較正情報を受信及び管理するように構成されている。較正マネージャ２５６は、プロセス制御マネージャ２５２及びデータ収集マネージャ２５４と通信及び協同して、分光光度計４１４から生データを収集するように構成されている。較正マネージャ２５６によって格納及び管理される較正情報を、プロセス制御マネージャ２５２によって、データ収集マネージャ２５４が収集した生データ（例えば、ＵＶ吸光度データ）に適用させて試料溶出液中のタンパク質濃度を決定することができる。

【0107】

酵素決定マネージャ２５８は、プロセス制御デバイス２００上で作動するソフトウェアプロトコルである。酵素決定マネージャ２５８は、自動処理手順中に試料に添加される酵素の量を決定するように構成されている。以下により詳細に説明するように、自動処理手順中、プロセス制御マネージャ２５２によって制御された所定の溶出時間にわたり第１の試料をアフィニティーカラム３１３を介して溶出させて、試料溶出液を得ることができる。データ収集マネージャ２５４は、タンパク質濃度測定値を得るように作動し、この測定値は、較正情報と組み合わせて、プロセス制御マネージャ２５２が溶出試料中のタンパク質濃度レベルを決定するために使用することができる。酵素決定マネージャ２５８は、決定されたタンパク質濃度レベルを使用して、試料消化工程に添加される消化酵素の適切な量を決定することができる。

【0108】

作動中、酵素決定マネージャ２５８は、プロセス制御マネージャ２５２と通信及び協同して、第１の試料のタンパク質濃度決定により決定された、第２の試料への酵素添加量に関する決定された消化酵素の情報を提供することができる。前述のとおり、プロセス制御マネージャ２５２は、アフィニティーカラム３１３を通る試料の流れのタイミング及び体積を精密に制御するように構成されている。アフィニティーカラム３１３によって処理される第１の試料及び第２の試料に同じ所定のタイミング及び体積の処理パラメータを適用することにより、プロセス制御マネージャ２５２は、実質的に同様の濃度値を有する第１の試料溶出液及び第２の試料溶出液を実現することができる可能性がある。したがって、前述のとおり、第１の試料溶出液に対して実施されるタンパク質濃度の測定値は、第２の試料溶出液に添加される消化酵素の適切な量を決定するために酵素決定マネージャ２５８によって適用され得る。

【0109】

ユーザインターフェースマネージャ２６０は、プロセス制御デバイス２００上で作動するソフトウェアプロトコルである。ユーザインターフェースマネージャ２６０は、プロセス制御デバイス２００とのユーザの対話を可能にするユーザインターフェースを提供するように構成されている。ユーザインターフェースマネージャ２６０は、タッチスクリーン、キーボード、マウス、コントローラ、ジョイスティック、音声制御を含むがこれらに限定されない任意のユーザ入力ソースから入力を受信するように構成されている。ユーザインターフェースマネージャ２６０は、テキストベースのユーザインターフェース、グラフィカルユーザインターフェース、又は任意の他の好適なユーザインターフェースなどのユーザインターフェースを提供するように構成されている。ユーザインターフェースマネージャ２６０は、クライアントデバイスのタイプに応じて異なるユーザインターフェースサービスを提供するように構成され得る。例えば、ラップトップ又はデスクトップコンピュータには、インターフェースオプションの完全な一式を含むユーザインターフェースが設けられ得るが、一方、スマートフォン又はタブレットには、ステータス更新に限定されたユーザインターフェースが設けられ得る。

【0110】

一態様では、ユーザインターフェースマネージャ２６０は、ユーザインターフェースを介して、１人以上のユーザに自動プロセス制御システム１００に関する任意の又は全てのプロセス及び／又は生産情報へのアクセスを提供し得る。ユーザインターフェースマネージャ２６０は、ユーザがバイオリアクタ１４０、ＦＩＡ１５０、及び分析装置１６０上で種々のタスクを実施できるようにし得る。例えば、ユーザインターフェースマネージャ２６０は、ユーザが１つ以上のプロセスパラメータを直接調整又は制御できるようにし得る。

【0111】

図３は、本明細書に記載のオンライン自動方法を実施するための、ＦＩＡ１５０に付随する第１のシリンジポンプ及び第１のバルブシステムの概略図である。作動中、プロセス制御デバイスのプロセス制御マネージャ２５２は、本明細書に記載の自動プロセス方法中に流体を適切に送り且つ混合するために、ＦＩＡ１５０の第１のバルブ３０１及び第１のシリンジポンプ３０２を制御する。以下の表１は、第１のバルブ３０１及び第１のシリンジポンプ３０２への種々の接続の例示的な一覧表を提供する。

【0112】

第１のバルブ３０１は、複数の入力ポート３０４と、出力ポート３０８とを含む。「入力ポート」及び「出力ポート」という用語は、本明細書では第１のバルブ３０１の両端のポートを区別するために使用されており、必ずしもそれらに関連する流れの方向を指すものではない。第１のバルブ３０１は、例えばマルチポートロータリーバルブであり得る。プロセス制御マネージャ２５２は、バルブ３０１を回転させて選択された入力ポート３０４と出力ポート３０８との間の流体連通を提供するように構成された、バルブ自動セレクタ手段（例えば、ステッピングモータ、サーボモータ、又は他のアクチュエータデバイス。図示せず）を制御する。出力ポート３０８は、通信ライン３０９を介して第１のシリンジポンプ３０２に接続されている。第１のシリンジポンプ３０２は、ポート選択デバイス３１１及び駆動シリンジ３０６を含む。ポート選択デバイス３１１は、ポート選択デバイス３１１を操作して、選択された複数のシリンジポンプポート３０５のうちの１つをアクチュエータシリンジ３０６と位置合わせするように構成された、複数のシリンジポンプポート３０５及びシリンジポンプ自動セレクタ手段（例えば、ステッピングモータ、サーボモータ、又は他のアクチュエータデバイス。図示せず）を含む。シリンジポンプ自動セレクタ手段は、特定のシリンジポンプポート３０５を選択してアクチュエータシリンジ３０６と流体連通して配置するように、プロセス制御マネージャ２５２によって制御される。

【0113】

アクチュエータシリンジ３０６は、シリンジポンプ駆動手段（例えば、ステッピングモータ、リニアドライブ、サーボモータ、又は他のアクチュエータデバイス。図示せず）によって駆動されるシリンジであり、選択されたシリンジポンプポート３０５のうちの１つを通じて流体を吸引し、且つ押し出すための双方向圧力を提供する。アクチュエータシリンジ３０６は更に、シリンジポンプ駆動手段によって駆動される際にシリンジプランジャの押し下げ及び後退を介して流体をシリンジチャンバで混合するように構成されている。アクチュエータシリンジ３０６は、ＦＩＡ１５０システムに双方向に圧力を印加して流体を吸引し且つ流体を押し出すように構成された任意のタイプのシリンジであり得る。

【0114】

図３には更に、Ｖ２０８入力ポート３０４によって第１のバルブ３０１に接続されている、アフィニティーカラム３１３が図示されている。

【0115】

作動中、プロセス制御マネージャ２５２は、第１のバルブ３０１を作動させ、選択された入力ポート３０４と出力ポート３０８との間に流体接続を確立し得る。プロセス制御マネージャ２５２は、ポート選択デバイス３１１を作動させ、選択されたシリンジポンプポート３０５とアクチュエータシリンジ３０６との間に流体接続を生じさせ得る。次いで、アクチュエータシリンジ３０６が駆動され、選択されたシリンジポンプポート３０５を介して特定量の流体がアクチュエータシリンジ３０６内へと吸引され得る。次いで、ポート選択デバイス３１１は、プロセス制御マネージャ２５２によって再度作動され、通信ライン３０９とシリンジポンプアクチュエータ３０６との間に流体連通を生じさせ得る。次いで、アクチュエータシリンジ３０６が再度作動され、第１のバルブ３０１からアクチュエータシリンジ３０６内に流体を吸引し得る。次いで、アクチュエータシリンジ３０６及びポート選択デバイス３１１は、追加の流体をアクチュエータシリンジ３０６内へと吸引するために、及び／又はアクチュエータシリンジ内の流体をシリンジポンプポート３０５のうちの１つを通じて外に移動させるために更に作動され得る。

【0116】

プロセス制御マネージャ２５２は、ＦＩＡ１５０のシステムを通じて適量の流体を移送するために、アクチュエータシリンジ３０６の正確且つ精密な制御を提供することができる。

【0117】

図４は、本明細書に記載のオンライン自動方法を実施するための、ＦＩＡ１５０に付随する第２のシリンジポンプ及び第２のバルブシステムの概略図である。作動中、プロセス制御デバイスのプロセス制御マネージャ２５２は、本明細書に記載の自動プロセス方法中に流体を適切に送り且つ混合するために、ＦＩＡ１５０の第２のバルブ４０１及び第２のシリンジポンプ４０２を制御する。以下の表１は、第２のバルブ４０１及び第２のシリンジポンプ４０２への種々の接続の例示的な一覧表を提供する。

【0118】

第２のバルブ４０１は、複数の入力ポート４０４と、出力ポート４０８とを含む。第２のバルブ４０１は、例えばマルチポートロータリーバルブであり得る。「入力ポート」及び「出力ポート」という用語は、本明細書では第１のバルブ３０１の両端のポートを区別するために使用されており、必ずしもそれらに関連する流れの方向を指すものではない。プロセス制御マネージャ２５２は、バルブ４０１を回転させて選択された入力ポート４０４と出力ポート４０８との間の流体連通を提供するように構成された、バルブ自動セレクタ手段（例えば、ステッピングモータ、サーボモータ、又は他のアクチュエータデバイス。図示せず）を制御する。出力ポート４０８は、通信ライン４０９を介して第２のシリンジポンプ４０２に接続されている。第２のシリンジポンプ４０２は、ポート選択デバイス４１１及び駆動シリンジ４０６を含む。ポート選択デバイス４１１は、ポート選択デバイス４１１を操作して、選択された複数のシリンジポンプポート４０５のうちの１つをアクチュエータシリンジ４０６と位置合わせするように構成された、複数のシリンジポンプポート４０５及びシリンジポンプ自動セレクタ手段（例えば、ステッピングモータ、サーボモータ、又は他のアクチュエータデバイス。図示せず）を含む。シリンジポンプ自動セレクタ手段は、特定のシリンジポンプポート３０５を選択して通信ライン３０９を介してバルブ３０１と流体連通して配置するように、プロセス制御マネージャ２５２によって制御される。

【0119】

アクチュエータシリンジ４０６は、シリンジポンプ駆動手段（例えば、ステッピングモータ、リニアドライブ、サーボモータ、又は他のアクチュエータデバイス。図示せず）に接続されるシリンジであり、選択されたシリンジポンプポート４０５のうちの１つを通じて流体を吸引し、且つ押し出すための双方向圧力を提供する。アクチュエータシリンジ４０６は更に、シリンジポンプ駆動手段によって駆動される際にシリンジプランジャの押し下げ及び後退を介して流体をシリンジチャンバで混合するように構成されている。アクチュエータシリンジ４０６は、ＦＩＡ１５０システムに双方向に圧力を印加して流体を吸引し且つ流体を押し出すように構成された任意のタイプのシリンジであり得る。

【0120】

図４には更に、入力端で第１のバルブ３０１に接続され、出力端で多方向接続部４１２に接続されている、アフィニティーカラム３１３が図示されている。多方向接続部４１２は更に、分光光度計４１４に接続されている。図４には更に、シリンジポンプポート４０５を介して第２のシリンジポンプ４０２に接続されたＳ１０５消化チャンバ４１５が図示されている。

【0121】

作動中、第２のバルブ４０１及び第２のシリンジポンプ４０２は、第１のバルブ３０１及び第１のシリンジポンプ３０２と同様に作動する。プロセス制御マネージャ２５２は、バルブ自動セレクタ手段、シリンジポンプ自動セレクタ手段、及びシリンジポンプ駆動手段に制御信号を提供して、ＦＩＡ１５０の接続を制御及び調整し、プロセス及び生産パラメータに従ってＦＩＡ１５０全体に流体の流体流れを発生させる／提供する。

【0122】

以下の表１は、本明細書に記載のシステムと一致するＦＩＡ１５０内における種々の流体接続、流体リザーバ／供給源、流体シンク／出口／ドレインなどの例を提供する。

【0123】

【表1】

【0124】

上述した自動プロセスシステム１００を参照して、オンライン自動方法の概略的全体像を図５に提供する。簡潔に述べると、清澄化細胞培養培地は、タンパク質捕捉ユニットと、タンパク質濃度決定ユニットと、タンパク質消化ユニットと含む試料調製ユニットに送達される。一態様では、タンパク質捕捉ユニットは、クロマトグラフィーカラムを含む。一態様では、タンパク質捕捉ユニットは、アフィニティークロマトグラフィーカラム（本明細書ではアフィニティーカラムとも称される）を含む。一態様では、タンパク質濃度決定ユニットは、分光光度計を含む。一態様では、タンパク質消化ユニットは、消化チャンバを含む。一態様では、タンパク質消化チャンバは、シリンジポンプのバレルである。一態様では、消化チャンバの温度は制御され得る。一態様では、調製された試料は分析装置に移送される。一態様では、分析装置は、ペプチドマッピングユニットを含む。一態様では、ペプチドマッピングユニットは、データ取得ユニット及びデータ処理ユニットを含む。一態様では、データ取得ユニットは、液体クロマトグラフィーカラム（ＬＣ）及び質量分析計（ＭＳ）を含む。

【0125】

図６は、一部の工程が手動又はオフラインで実施される、本明細書に記載の方法の概略図である。一態様では、試料調製のためのタンパク質捕捉工程及び濃度決定工程はオフラインで実施され、タンパク質消化工程、データ取得工程、及びデータ処理工程はオンラインで実施される。一態様では、例えばタンパク質捕捉工程、濃度決定工程、及びタンパク質消化工程を含む試料調製工程は、オフラインで実施され、データ取得工程及びデータ処理工程は、オンラインで実施される。

【0126】

一態様では、タンパク質の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を検出するための方法が提供される。一態様では、本方法は、少なくとも１つのプロセッサによって制御されるフローインジェクション分析器（ＦＩＡ）により行われる。一態様では、フローインジェクション分析器（ＦＩＡ）は、シーケンシャルインジェクション分析器（ＳＩＡ）である。一態様では、フローインジェクション分析器（ＦＩＡ）は、ダイレクトインジェクション分析器（ＤＩＡ）である。上述したように、オンラインの自動フローインジェクション分析のための方法又はシステムの例が図１～４に示されている。

【0127】

一態様では、本方法は、目的タンパク質を含む第１の試料をＦＩＡ、例えば上記のＦＩＡ１５０の保持リザーバ内に収容することを含む。一態様では、第１の試料は、バイオリアクタ、例えば、上記のバイオリアクタ１４０から得られる。一態様では、バイオリアクタ１４０は、ＦＩＡに連結されている。一態様では、ＦＩＡは、バイオリアクタ１４０に連結され、且つバイオリアクタ１４０から細胞培養培地又は清澄化細胞培養培地を得るように構成された、試料採取デバイスを含む。一態様では、バイオリアクタ１４０とＦＩＡとを連結させるために使用される自動システムインターフェース、例えば、Ｍｏｄｕｌａｒ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓａｍｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＭＡＳＴ（商標））試料採取システム（Ｌｏｎｚａ，Ｂｅｎｄ，ＯＲ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）又はＳｅｇ－Ｆｌｏｗ自動試料採取システム（ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｕｒｏｐｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）。一態様では、試料は、バイオリアクタから手動で得られ、例えばＦＩＡの保持リザーバを細胞培養試料を含有する容器に導入することによって、ＦＩＡの保持リザーバに導入される。一態様では、第１の試料は、細胞培養培地を含む。一態様では、第１の試料は、清澄化細胞培養培地を含む。一態様では、第１の試料は、約２０μＬ～約１０００μＬの体積を有する。

【0128】

一態様では、本方法は、第１のタンパク質捕捉工程を含む。一態様では、タンパク質捕捉工程は、アフィニティークロマトグラフィー工程を含む。一態様では、アフィニティークロマトグラフィー工程は、カラム平衡化、試料ローディング、及び試料溶出を含む。一態様では、カラム平衡化工程は、ＦＩＡを介して、第１の体積の結合緩衝液をＦＩＡ内のアフィニティークロマトグラフィーカラムに送達することを含む。一態様では、試料ローディング工程は、ＦＩＡを介して、第１の試料を保持リザーバからアフィニティーカラムに移送することを含む。一態様では、試料溶出工程は、ＦＩＡを介して、第１の体積の溶出緩衝液をアフィニティークロマトグラフィーカラムに送達すること、及びアフィニティークロマトグラフィーカラムから第１の試料中のタンパク質を溶出させて第１の溶出液を形成すること、を含む。一態様では、所定の溶出時間に基づいて、第１の試料中のタンパク質がアフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出され、第１の溶出液が形成される。一態様では、所定の溶出時間は、自動制御システムに関連付けられたプロセス制御デバイスのプロセス制御マネージャによって制御される。一態様では、所定の溶出体積に基づいて、第１の試料中のタンパク質がアフィニティーカラムから溶出され、第１の溶出液が形成される。一態様では、溶出体積は、自動制御システムに関連付けられたプロセス制御デバイスのプロセス制御マネージャによって制御される。

【0129】

一態様では、図６に示されるように、タンパク質捕捉工程は手動で実施される。一態様では、タンパク質捕捉工程はオフラインで実施される。一態様では、タンパク質捕捉工程はアトラインで実施される。一態様では、アフィニティークロマトグラフィー工程は手動で実施される。一態様では、アフィニティークロマトグラフィー工程はオフラインで実施される。一態様では、アフィニティークロマトグラフィー工程はアトラインで実施される。

【0130】

一態様では、第１の溶出液は、プロセス制御マネージャの制御下でＦＩＡを介してタンパク質濃度検出ユニットに移送される。一態様では、カラム平衡化から溶出までのタンパク質捕捉工程は、約１５分～約１時間を要する。一態様では、タンパク質捕捉工程は、約３０分未満を要する。

【0131】

一態様では、本方法は、少なくとも１つのプロセッサによって第１の溶出液中のタンパク質の濃度を決定することを含む。一態様では、第１の溶出液中のタンパク質の濃度を決定することは、所定の検量線に従って少なくとも１つのプロセッサによって実施される。一態様では、第１の溶出液中のタンパク質の濃度は、試料の吸光度を測定し、所定の検量線に基づいてタンパク質濃度を算出することにより決定される。例えば、プロセス制御マネージャは、データ収集マネージャと協同して分光光度計からＵＶ吸光度データを取得することができ、且つ較正マネージャと協同して所定の検量線を取得し、取得したＵＶ吸光度データにそれを適用することができる。一態様では、第１の溶出液中のタンパク質の濃度は、約１９０ｎｍ～約２８０ｎｍ、又は約２０５ｎｍ～約２８０ｎｍで試料のＵＶ吸光度を測定し、所定の検量線に基づいてタンパク質濃度を算出することにより決定される。一態様では、本方法は、タンパク質濃度を決定した後、ＦＩＡの動作を介して第１の溶出液を廃棄物容器Ｔ１０６に移送することを含む。一態様では、濃度決定工程は、約５分～約３０分、又は約１０分未満を要する。

【0132】

一態様では、図６に示されるように、タンパク質濃度決定は手動で実施される。一態様では、タンパク質濃度決定はオフラインで実施される。一態様では、タンパク質濃度決定はアトラインで実施される。

【0133】

第１の溶出液のタンパク質濃度が決定された後、本方法は、タンパク質を含む第２の試料を保持リザーバ内に収容することを含む。一態様では、第２の試料は、バイオリアクタから得られる。一態様では、第２の試料は、細胞培養培地を含む。一態様では、第２の試料は、清澄化細胞培養培地を含む。一態様では、第２の試料は、第１の試料が得られたものと同じ細胞培養物から得られる。一態様では、第１の試料及び第２の試料は、細胞培養物から実質的に同時間に得られる。一態様では、第１の試料及び第２の試料は、細胞培養物から互いに少なくとも約３０分以内、約１５分以内、約１０分以内、約５分以内、約４分以内、約３分以内、約２分以内、又は約１分以内に得られる。一態様では、第２の試料は、約２０μＬ～約１０００μＬの体積を有する。

【0134】

一態様では、本方法は、第２のタンパク質捕捉工程を含む。一態様では、第２のタンパク質捕捉工程は、アフィニティークロマトグラフィー工程を含む。一態様では、第２のアフィニティークロマトグラフィー工程は、カラム平衡化、試料ローディング、及び試料溶出を含む。一態様では、カラム平衡化工程は、ＦＩＡを介して、第２の体積の結合緩衝液をアフィニティーカラムに送達することを含む。一態様では、試料ローディング工程は、ＦＩＡを介して、第２の試料を保持リザーバからアフィニティーカラムに移送することを含む。一態様では、試料溶出工程は、ＦＩＡを介して、第２の体積の溶出緩衝液をアフィニティーカラムに送達すること、及びアフィニティーカラムから第２の試料中のタンパク質を溶出させて第２の溶出液を形成すること、を含む。一態様では、所定の溶出時間に基づいて、第２の試料中のタンパク質がアフィニティーカラムから溶出され、第２の溶出液が形成される。一態様では、溶出時間（及び任意選択的に、溶出緩衝液体積などの他のプロセスパラメータ）は、第１の溶出液の所定の溶出時間に実質的に一致するように、例えばプロセス制御マネージャを介して、少なくとも１つのプロセッサによって制御され、それにより第２の溶出液が得られる。一態様では、第２の溶出液は、第１の溶出液のタンパク質濃度と実質的に同様のタンパク質濃度を有する。一態様では、所定の溶出体積に基づいて、第２の試料中のタンパク質がアフィニティーカラムから溶出され、第２の溶出液が形成される。一態様では、第２の試料の溶出時間は、第１の試料の溶出時間と実質的に一致するようにプロセス制御マネージャによって制御される。一態様では、第２の試料の溶出体積は、第１の試料の溶出体積と実質的に一致するようにプロセス制御マネージャによって制御される。

【0135】

一態様では、図６に示されるように、タンパク質捕捉工程は手動で実施される。一態様では、タンパク質捕捉工程はオフラインで実施される。一態様では、タンパク質捕捉工程はアトラインで実施される。一態様では、アフィニティークロマトグラフィー工程は手動で実施される。一態様では、アフィニティークロマトグラフィー工程はオフラインで実施される。一態様では、アフィニティークロマトグラフィー工程はアトラインで実施される。

【0136】

一態様では、本方法は、第２の溶出液中のタンパク質を消化してペプチド混合物を形成することを含む。一態様では、第２の溶出液中のタンパク質は、酵素的に消化される。一態様では、第２の溶出液中のタンパク質を消化することは、ＦＩＡを介して、消化試薬を第２の溶出液に導入して消化混合物を形成することを含む。一態様では、第２の溶出液中のタンパク質を消化することは、ＦＩＡを介して、消化緩衝液、還元剤、及びタンパク質分解酵素を含む消化試薬を第２の溶出液に導入して消化混合物を形成することを含む。一態様では、第２の溶出液を、第１の溶出液の濃度に基づいて、少なくとも１つのプロセッサ、例えば酵素決定マネージャによって決定される量のタンパク質分解酵素と接触させる。一態様では、本方法は、例えばプロセス制御マネージャによって制御されるＦＩＡのシリンジポンプを介して、消化混合物を混合することを含む。一態様では、本方法は、例えばプロセス制御マネージャの制御下で、消化混合物をインキュベートすることを含む。

【0137】

一態様では、タンパク質分解酵素は、熱安定性トリプシンを含む。一態様では、本方法は、ＦＩＡを介して、第１の量の消化緩衝液、還元剤、及び熱安定性トリプシンを第２の溶出液に導入し、混合して第１の消化混合物を形成することを含む。一態様では、第１の消化混合物を約６５℃～約８５℃の温度で約５分間～約３０分間インキュベートして、インキュベート混合物を形成する。一態様では、消化混合物を約７０℃～約７５℃の温度で約１０分間～約２０分間インキュベートして、インキュベート混合物を形成する。一態様では、消化混合物を約７０℃～約７５℃の温度で約１０分間～約２０分間インキュベートして、インキュベート混合物を形成する。上記のインキュベーションプロセスの態様は、プロセス制御マネージャを介して制御され得る。

【0138】

一態様では、本方法は、ＦＩＡを介して、第２の量の熱安定性トリプシンをインキュベート混合物に導入し、混合して第２の消化混合物を形成することを含む。一態様では、第２の消化混合物を約６５℃～約８５℃の温度で約５分間～約３０分間インキュベートして、ペプチド混合物を形成する。一態様では、第２の消化混合物を約７０℃～約７５℃の温度で約１０分間～約２０分間インキュベートして、ペプチド混合物を形成する。一態様では、第２の消化混合物を約７０℃～約７５℃の温度で約１０分間～約２０分間インキュベートして、ペプチド混合物を形成する。上記のインキュベーションプロセスの態様は、プロセス制御マネージャを介して制御され得る。

【0139】

一態様では、図６に示されるように、タンパク質消化工程は手動で実施される。一態様では、タンパク質消化工程はオフラインで実施される。一態様では、タンパク質消化工程はアトラインで実施される。

【0140】

一態様では、本方法は、ＦＩＡを介して、分析装置、例えばペプチドマッピングユニット（例えば質量分析器を含み得る）にペプチド混合物を移送すること、及びタンパク質の所定の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を検出すること、を含む。

【0141】

一態様では、タンパク質の翻訳後修飾をモニタリングするためのオンライン方法が提供される。一態様では、本方法は、少なくとも１つのプロセッサを含むプロセス制御デバイスによって制御されるフローインジェクション分析器（ＦＩＡ）により行われる。一態様では、フローインジェクション分析器は、少なくとも１つの双方向ポンプを含む。一態様では、ＦＩＡは、少なくとも１つのプロセッサによって制御される少なくとも１つのシリンジポンプを含む。一態様では、ＦＩＡは、少なくとも１つのプロセッサによって制御される少なくとも１つのマルチポートバルブを含む。一態様では、ＦＩＡは、２つのシリンジポンプを含む。一態様では、ＦＩＡは、２つのマルチポートバルブを含む。一態様では、マルチポートバルブは、１０ポートバルブである。

【0142】

一態様では、本方法は、タンパク質を含む第１の試料をＦＩＡの保持リザーバ内に収容することを含む。一態様では、試料は、少なくとも１つのプロセッサによって制御される１つ以上のシリンジポンプの動作によって、ＦＩＡを通じて進められる。一態様では、試料は、約１０μＬ／秒～約２００μＬ／秒の流量でＦＩＡを通じて進められる。

【0143】

一態様では、第１の体積の結合緩衝液は、マルチポートバルブの動作によって、マルチポートバルブを介してＦＩＡ内のアフィニティーカラムに導入される。

【0144】

一態様では、試料は、シリンジポンプの動作によって、ＦＩＡシステムを通じてアフィニティーカラムへと進められる。一態様では、本方法は、シリンジポンプの動作によって、第１の試料を保持リザーバからアフィニティーカラムに移送することを含む。一態様では、第１の試料中のタンパク質は、アフィニティーカラムに結合する。一態様では、本方法は、マルチポートバルブの動作によって、第１の体積の溶出緩衝液をアフィニティーカラムに導入し、結合したタンパク質を溶出させて第１の溶出液を形成することを含む。一態様では、所定の溶出時間に基づいて、第１の試料中のタンパク質がアフィニティーカラムから溶出され、第１の溶出液が形成される。一態様では、所定の溶出体積に基づいて、第１の試料中のタンパク質がアフィニティーカラムから溶出され、第１の溶出液が形成される。いくつかの態様では、シリンジポンプの動作は、プロセス制御マネージャによって制御され得る。

【0145】

一態様では、本方法は、シリンジポンプの動作によって、第１の溶出液をタンパク質濃度検出ユニットに移送することを含む。一態様では、本方法は、シリンジポンプの動作によって、第１の溶出液を分光光度計へと進めることを含む。一態様では、本方法は、少なくとも１つのプロセッサによって、測定されたＵＶ吸光度に従って第１の溶出液中のタンパク質の濃度を決定することを含む。一態様では、第１の溶出液は、タンパク質濃度が決定された後に廃棄物容器に移送される。一態様では、第１の溶出液中のタンパク質の濃度は、所定の検量線に従って少なくとも１つのプロセッサにより決定される。

【0146】

一態様では、本方法は、第２の試料をＦＩＡの保持リザーバ内に収容することを含む。一態様では、本方法は、シリンジポンプの動作によって試料をＦＩＡを通じて進めることを含む。一態様では、本方法は、マルチポートバルブを介して、第２の体積の結合緩衝液をアフィニティーカラムに送達することを含む。一態様では、本方法は、シリンジポンプの動作によって、第２の試料を保持リザーバからアフィニティーカラムに移送することを含む。一態様では、第２の試料中のタンパク質は、アフィニティーカラムに結合する。一態様では、本方法は、マルチポートバルブの動作によって、第２の体積の溶出緩衝液をアフィニティーカラムに導入し、結合したタンパク質を溶出させて第２の溶出液を形成することを含む。一態様では、所定の溶出時間に基づいて、第２の試料中のタンパク質がアフィニティーカラムから溶出され、第２の溶出液が形成される。一態様では、所定の溶出体積に基づいて、第２の試料中のタンパク質がアフィニティーカラムから溶出され、第２の溶出液が形成される。一態様では、第１及び第２の溶出液は、実質的に同じ溶出体積を有する。いくつかの態様では、シリンジポンプ及びマルチポートバルブの動作は、プロセス制御マネージャによって制御され得る。

【0147】

一態様では、本方法は、シリンジポンプの動作によって、第２の溶出液をＦＩＡ内の消化チャンバへと進めることを含む。一態様では、本方法は、マルチポートバルブの動作によって、第２の溶出液に消化試薬を導入し、第２の溶出液中のタンパク質を消化してペプチド混合物を形成することを含む。一態様では、タンパク質を消化することは、マルチポートバルブの動作によって、消化緩衝液、還元剤、タンパク質分解酵素、又はそれらの組み合わせを消化チャンバ内の第２の溶出液に導入して、第１の消化混合物を形成することを含む。一態様では、本方法は、第１の消化混合物を混合することを含む。一態様では、消化チャンバは、アクチュエータシリンジ、例えばアクチュエータシリンジの内部バレルであり、シリンジのプランジャを押し下げて後退させることにより第１の消化混合物が混合される。一態様では、第１の消化混合物を消化チャンバ内でインキュベートして、インキュベート混合物を形成する。一態様では、本方法は、マルチポートバルブの動作によって、第２の体積のタンパク質分解酵素を第１のインキュベート混合物に導入して、第２の消化混合物を形成することを含む。一態様では、第２の体積の消化緩衝液が、第１のインキュベート混合物に導入される。一態様では、第２の消化混合物をインキュベートして、ペプチド混合物を形成する。一態様では、本方法は、第２の消化混合物を混合することを含む。一態様では、シリンジのプランジャを押し下げて後退させることにより第２の消化混合物が混合される。一態様では、第２の消化混合物に導入されるタンパク質分解酵素の量は、第１の溶出液の濃度に基づいて少なくとも１つのプロセッサによって決定される。一態様では、シリンジポンプ及びマルチポートバルブの動作は、プロセス制御マネージャによって制御され得る。

【0148】

一態様では、タンパク質分解酵素は、熱安定性トリプシンを含む。一態様では、本方法は、マルチポートバルブの動作によって、第１の量の消化緩衝液、還元剤、及び熱安定性トリプシンを第２の溶出液に導入し、混合して第１の消化混合物を形成することを含む。一態様では、本方法は、第１の消化混合物を約７０℃～約７５℃の温度で約１０分間～約２０分間インキュベートすることを含む。一態様では、本方法は、マルチポートバルブの動作によって、第２の量の消化緩衝液及び熱安定性トリプシンを第１の消化混合物に導入し、混合して第２の消化混合物を形成することを含む。一態様では、本方法は、第２の消化混合物を約７０℃～約７５℃の温度で約１０分間～約２０分間インキュベートして、ペプチド混合物を形成することを含む。

【0149】

一態様では、本方法は、シリンジポンプの動作によって、ペプチド混合物をペプチドマッピングユニットへと進め、タンパク質の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を検出することを含む。一態様では、本方法は、シリンジポンプの動作によって、ペプチド混合物をペプチドマッピングユニットへと進め、タンパク質の所定のＰＴＭを検出することを含む。

【0150】

Ｃ．細胞培養
一態様では、本方法は、試料中のタンパク質の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を検出するために使用される。一態様では、タンパク質は、組換えタンパク質である。一態様では、タンパク質は、治療用タンパク質である。一態様では、タンパク質は、組換え生産された治療用タンパク質である。一態様では、試料は細胞培養物から得られる。

【0151】

細胞培養物中で組換えタンパク質を発現させるための方法は公知である。一般に、タンパク質をコードするコード配列を含む発現ベクターが調製される。一態様では、コード配列は、１つ以上の調節配列と作動的に連結される。調節配列は公知であり、これには、プロモーター、エンハンサー、及びコード配列の転写又は翻訳を制御する他の発現制御エレメントが含まれるがこれらに限定されない。「作動的に連結された」又は「作動可能に連結された」とは、コード配列の発現をもたらすために、調節配列がコード配列に対して適切な位置に配置されていることを意味する。一態様では、調節配列は、コード配列と隣接している。一態様では、調節配列は、トランスで又は遠隔で作用してコード配列の発現を制御する。一態様では、組換え発現ベクターは、１つ以上の追加の配列、例えば複製起点及び／又は選択マーカーを含む。

【0152】

一態様では、組換えタンパク質は、２つ以上のポリペプチド鎖を含む。一態様では、組換えタンパク質は、抗体である。２つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質の場合、個々のポリペプチド鎖のコード配列を同じ又は別々の発現ベクターに挿入することができる。遺伝子を発現ベクターに挿入するための方法は公知である。一態様では、組換え発現ベクターは、宿主細胞からのタンパク質の分泌を容易にするシグナルペプチドをコードする。

【0153】

タンパク質を組換え発現させるには、そのタンパク質をコードする組換え発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトする。トランスフェクション方法は公知である。

【0154】

宿主細胞には、原核生物、酵母、又は高等真核生物の細胞が含まれ得る。一態様では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。好適な哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２細胞、ＣＯＳ－７細胞、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ ２９３細胞）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、ヒト肝癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳癌細胞（ＭＭＴ）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、及びＦＳ４細胞が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＨＥＫ ２９３、ＣＯＳ、ＮＳ０、ＳＰ２、又はＰＥＲ．Ｃ６宿主細胞である。

【0155】

細胞培養中、形質転換された宿主細胞は、組換えタンパク質の発現のための好適な培養条件（例えば、温度、ｐＨ、撹拌、及び溶存酸素レベル）の下で、好適な細胞培養培地中で培養される。市販の細胞培養培地としては、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（商標）（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（商標）（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（商標）（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、イスコフ改変ダルベッコ培地、及び最小必須培地－アルファ（ＭＥＭ－アルファ）が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、細胞培養培地には、ホルモン及び／又は他の増殖因子、塩、緩衝液、ヌクレオチド、抗生物質、微量元素、並びにグルコース又は他のエネルギー源が補充される。

【0156】

一態様では、宿主細胞は、スモールスケールのバイオリアクタ内で培養される。一態様では、宿主細胞は、個々のフラスコ、振盪フラスコ、又はウェーブバッグ内で培養される。一態様では、宿主細胞は、約１２５ｍｌ～約５００ｍｌの容積を有するバイオリアクタ内で培養される。一態様では、宿主細胞は、ラージスケールのバイオリアクタ内で培養される。一態様では、宿主細胞は、約１００リットル～約２０，０００リットル、又はそれを超える容積を有するバイオリアクタ内で培養される。一態様では、宿主細胞は、撹拌スタンク、固定床、流動床、気泡塔、又はエアリフトバイオリアクタ内で培養される。

【0157】

一態様では、細胞培養物には、細胞培養の過程中に、栄養素及びアミノ酸などの成分を含有する濃縮フィード培地が補充される。一態様では、バッチプロセスでの細胞培養プロセス中に、バイオリアクタ内の培地は補充されない。一態様では、流加バイオリアクタでの細胞培養プロセス中に、バイオリアクタ内の培地には追加の成分、例えば栄養素又は細胞培養培地が補充される。一態様では、培地はバイオリアクタに継続的に添加され、使用済み培地及び生産物は、灌流バイオリアクタでの細胞培養プロセス全体を通じて除去される。

【0158】

一態様では、本方法は、細胞培養物から第１の試料及び第２の試料を得ることを含む。一態様では、第１の試料及び第２の試料は、同じ細胞培養物から得られる。一態様では、第１の試料及び第２の試料は、細胞培養物から実質的に同時間に得られる。本明細書で使用される場合、「実質的に同時間に」実施される２つの動作は、２つの動作が並行して実施されることを意味し得るが、２つの動作が互いに短い時間内に実施される状況も含む。一態様では、第１の及び試料は、互いに約３０分以内に得られる。一態様では、第１の及び試料は、互いに約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、又は約１分以内に得られる。

【0159】

Ｄ．組換えタンパク質
一態様では、本方法は、試料中の目的タンパク質の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を検出するために使用される。一態様では、タンパク質は、組換え生産される。一態様では、組換え生産されたタンパク質は、少なくとも約１０００個のアミノ酸残基を含む。一態様では、組換え生産されたタンパク質は、少なくとも約１０ｋＤａ、又は少なくとも約２０ｋＤａ、又は少なくとも約３０ｋＤａの分子量を有する。

【0160】

一態様では、タンパク質は、糖タンパク質である。一態様では、タンパク質は、治療用抗体又はその抗原結合断片である。一態様では、タンパク質は、受容体又は受容体リガンドである。一態様では、タンパク質は、融合タンパク質である。

【0161】

組換えタンパク質は、細胞内に生産されるか、細胞膜周辺腔に生産されるか、又は細胞培養培地中に直接分泌され得る。ポリペプチドタンパク質が細胞内で生産される場合、精製プロセスの第１の工程には通常、例えば機械的せん断、浸透圧ショック、又は酵素処理などによる細胞の溶解が含まれ、これにより、細胞の内容物全体がホモジネートに放出され、分画遠心分離又は濾過により除去され得る細胞デブリが生じる。

【0162】

一態様では、タンパク質は、治療用タンパク質である。本明細書で使用される場合、「治療用タンパク質」は、疾患又は疾患の少なくとも１つの症状を治療、予防、又は改善するのに有用な１つ以上の生物学的活性を有するタンパク質である。

【0163】

Ｅ．翻訳後修飾
「翻訳後修飾」（ＰＴＭ）とは、タンパク質合成中又は合成後にポリペプチドに対して行われる１つ以上の共有結合修飾を指す。一態様では、ＰＴＭは、酵素又は酵素経路によって導入される。ＰＴＭは、様々なレベルのタンパク質不均一性をもたらす可能性があり、この不均一性は、組換え生産されたタンパク質の生物学的活性、結合活性、薬物動態（ＰＫ）、薬力学（ＰＤ）、及び免疫原性が含まれるがこれらに限定されないタンパク質の構造及び機能に重大な影響を及ぼし得る。治療用タンパク質の物理化学的特徴に有益であり得るＰＴＭもある一方で、有害であり得るＰＴＭもある。ＰＴＭの量及びタイプは、細胞培養条件の影響を受ける可能性があり、組換え生産された治療用タンパク質の製造中にモニタリングする必要がある重要品質特性（ＣＱＡ）と見なされる。

【0164】

一態様では、タンパク質のＰＴＭを検出するための方法が提供される。一態様では、組換え生産されたタンパク質のＰＴＭを検出するための方法が提供される。一態様では、治療用タンパク質のＰＴＭを検出するための方法が提供される。

【0165】

一態様では、ＰＴＭにはグリコシル化が含まれる。一態様では、グリコシル化には、Ｎ－結合型グリコシル化、Ｏ－結合型グリコシル化、又はそれらの組み合わせが含まれる。一態様では、ＰＴＭには、酸化、脱アミド化、異性化、糖化、又はそれらの組み合わせが含まれる。一態様では、ＰＴＭには、リジン保持、グリシン喪失、アミド形成、又はそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないＣ末端修飾が含まれる。一態様では、ＰＴＭには、リーダー配列保持、Ｎ末端環化、又はそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないＮ末端修飾が含まれる。

【0166】

一態様では、ＰＴＭには、Ｎ－結合型グリカンが含まれる。一態様では、ＰＴＭには、Ｏ－結合型グリカンが含まれる。一態様では、ＰＴＭには、末端ガラクトース部分が０個のアガラクトシルグリカン、例えば、Ｇ０、Ｇ０－ＧｌｃＮＡｃ、Ｇ０Ｆ、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮＡｃ、又はそれらの組み合わせが含まれる。一態様では、ＰＴＭには、末端ガラクトース部分が１個のグリカン、例えば、Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ１Ｆ－ＧｌｃＮＡｃ、又はそれらの組み合わせが含まれる。一態様では、ＰＴＭには、末端ガラクトース部分が２個のグリカン、例えば、Ｇ２Ｆ、Ｇ２Ｆ＋シアル酸、又はそれらの組み合わせが含まれる。

【0167】

一態様では、ＰＴＭには高マンノースグリカンが含まれる。本明細書で使用される場合、「高マンノースグリカン」とは、約３、約４、約５、約６、約７、約８、又は約９個のマンノース残基を含有するＮ－グリカン構造を指し、それぞれＭａｎ４、Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８、又はＭａｎ９グリカンとも称され得る。

【0168】

Ｆ．試料調製
本明細書では、ポリペプチド内の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を検出するための自動オンラインシステム又は方法が提供される。一態様では、組換え生産されたポリペプチド内のＰＴＭを検出するための方法又はシステムが提供される。一態様では、タンパク質内のＰＴＭを検出するための方法又はシステムが提供される。一態様では、組換え生産されたタンパク質内のＰＴＭを検出するための方法又はシステムが提供される。一態様では、治療用タンパク質内のＰＴＭを検出するための方法又はシステムが提供される。一態様では、組換え生産された治療用タンパク質内のＰＴＭを検出するための方法又はシステムが提供される。

【0169】

一態様では、自動オンライン試料調製システム又は方法が提供される。一態様では、自動オンライン試料調製システム又は方法は、タンパク質捕捉工程、濃度決定工程、及びタンパク質消化工程のうちの１つ以上を含む。一態様では、試料中のタンパク質が分析プロセス、例えば質量分析用に調製される、自動オンライン試料調製システム又は方法が提供される。一態様では、試料中のタンパク質が、（例えば１つ以上のＰＴＭを検出するための）分析プロセス用に調製される、自動オンライン試料調製システム又は方法が提供される。一態様では、自動オンライン試料調製システム又は方法は、質量分析（ＭＳ）用に試料中のタンパク質を調製する。一態様では、自動オンライン試料調製システム又は方法は、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）用に試料中のタンパク質を調製する。一態様では、自動オンライン試料調製システム又は方法は、自動ＬＣ／ＭＳシステム用に試料中のタンパク質を調製する。一態様では、自動オンライン試料調製システム又は方法は、統合ＬＣ／ＭＳシステム用に試料中のタンパク質を調製する。

【0170】

オンライン自動方法の概略的全体像を図５に提供する。簡潔に述べると、清澄化細胞培養培地は、タンパク質捕捉ユニットと、タンパク質濃度決定ユニットと、タンパク質消化ユニットと含む試料調製ユニットに送達される。次いで、調製された試料は、分析装置、例えばデータ取得ユニットとデータ処理ユニットとを含むペプチドマッピングユニットに移送される。一態様では、データ取得ユニットは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）及び質量分析（ＭＳ）を含む。

【0171】

図６に示すように、方法工程の一部は手動又はオフラインで実施され得る。一態様では、試料調製のためのタンパク質捕捉工程及び濃度決定工程はオフラインで実施され、タンパク質消化工程、データ取得工程、及びデータ処理工程はオンラインで実施される。一態様では、例えばタンパク質捕捉工程、濃度決定工程、及びタンパク質消化工程を含む試料調製工程は、オフラインで実施され、データ取得工程及びデータ処理工程は、オンラインで実施される。

【0172】

１．フローインジェクション分析
一態様では、自動試料調製は、図１及び２に関して論じたように、１つ以上のプロセス制御デバイスを含む自動プロセス制御システム内に任意選択的に含まれるフローインジェクション分析器（ＦＩＡ）を使用して実施される。フローインジェクション分析器は、例えば、ＦＩＡｌａｂ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）から市販されている。一態様では、ＦＩＡは、シーケンシャルインジェクション分析器（ＳＩＡ）である。一態様では、ＦＩＡは、ダイレクトインジェクション分析器（ＤＩＡ）である。一態様では、ＦＩＡは、双方向ポンプ及びバルブを含む。一態様では、ＦＩＡは、２つ以上のポンプ及び２つ以上のバルブを含む。一態様では、ＦＩＡは、２つのポンプ及び２つのバルブを含む。一態様では、双方向ポンプは、シリンジポンプである。一態様では、バルブは、ロータリーバルブである。一態様では、バルブは、マルチポートバルブである。一態様では、バルブは、１０ポートロータリーバルブである。一態様では、フローインジェクション分析器は、ＰｒｏＳＩＡデュアルポンプインジェクション分析器（ＦＩＡｌａｂ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）である。

【0173】

少なくとも１つのプロセス制御デバイス２００、少なくとも１つのバイオリアクタ１４０、少なくとも１つのＦＩＡ１５０、及び少なくとも１つの分析装置１６０を含む自動プロセス制御システム１００によって実装される自動プロセスに関する以下の考察は、図１～４及び表１を参照して理解され得る。ＦＩＡ１５０の第１のバルブ３０１及び第２のバルブ４０１の種々の入力及び出力ポートに関するリザーバ、入力、出力、シンク、ドレイン、及び設備の配置は、単なる例にすぎない。本明細書に記載の方法及びシステムから逸脱することなく、他の配置及び構成を用いることができる。例えば、第１のバルブ３０１と第２のバルブ４０１、第１のシリンジポンプ３０２と第２のシリンジポンプ４０２の役割を入れ替えることができる。別の例では、代替又は追加のポート及び／又は接続を使用することができる。以下の考察では、図２を参照して前述したように、第１のバルブ３０１、第２のバルブ４０１、第１のシリンジポンプ３０２、第２のシリンジポンプ４０２、及びシステムの任意の他の自動態様がプロセス制御デバイス２００によって制御されることが理解される。

【0174】

一態様では、試料は、ＦＩＡの保持リザーバに導入される。試料は、手動及び自動方法を含む任意の適切な手段によって導入され得る。一態様では、バイオリアクタ１４０は、ＦＩＡに連結されている。一態様では、ＦＩＡは、バイオリアクタ１４０に連結され、且つバイオリアクタ１４０から細胞培養培地又は清澄化細胞培養培地を得るように構成された、試料採取デバイスを含む。一態様では、バイオリアクタ１４０とＦＩＡとを連結させるために使用される自動システムインターフェース、例えば、Ｍｏｄｕｌａｒ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓａｍｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＭＡＳＴ（商標））試料採取システム（Ｌｏｎｚａ，Ｂｅｎｄ，ＯＲ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）又はＳｅｇ－Ｆｌｏｗ自動試料採取システム（ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｕｒｏｐｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）。一態様では、試料は、バイオリアクタから手動で得られ、例えばＦＩＡの保持リザーバを細胞培養試料を含有する容器に導入することによって、ＦＩＡの保持リザーバに導入される。一態様では、約２０μＬ～約１０００μＬの体積を有する試料は、ＦＩＡの保持リザーバに導入される。一態様では、試料は細胞培養物から得られる。一態様では、試料は、細胞培養培地を含む。一態様では、試料は、清澄化細胞培養培地を含む。一態様では、細胞培養培地は、遠心分離又は濾過によって清澄化される。一態様では、濾過には、精密濾過又はデプス濾過が含まれる。一態様では、試料は、ポリペプチドを含む。一態様では、細胞培養物中の宿主細胞は、バイオリアクタから除去される。一態様では、細胞培養物中の宿主細胞は、（例えば灌流バイオリアクタでの）細胞培養中に除去される。一態様では、試料は、組換え生産されたポリペプチドを含む。一態様では、試料は、タンパク質を含む。一態様では、試料は、組換え生産されたタンパク質を含む。一態様では、試料は、組換え生産された治療用タンパク質を含む。

【0175】

２．タンパク質捕捉
一態様では、本方法は、試料中の目的タンパク質を、例えば試料中に存在する宿主細胞タンパク質又は他の生産物関連不純物などの不純物から目的タンパク質を分離するために精製する、タンパク質捕捉工程を含む。一態様では、試料は、細胞及び他の細胞デブリが除去された清澄化細胞培養培地を含む。一態様では、タンパク質捕捉工程は、アフィニティークロマトグラフィーを含む。

【0176】

「アフィニティークロマトグラフィー」とは、移動相中の目的生体分子、例えばタンパク質が、目的成分とクロマトグラフィーマトリックス上に固定化された化合物との間の特異的で可逆的な結合相互作用に基づいて、クロマトグラフィーカラムの固定相によって保持されるクロマトグラフィープロセスを指す。一態様では、アフィニティークロマトグラフィーは、カラム平衡化工程、試料ローディング工程、及び試料溶出工程を含む。一態様では、クロマトグラフィーカラムは、約５０μＬ～約３００μＬ、又は約５０μＬ～約２００μＬの体積を有する。一態様では、アフィニティークロマトグラフィーには、低圧アフィニティークロマトグラフィーが含まれる。一態様では、アフィニティークロマトグラフィーは、約１０μＬ／秒～約１００μＬ／秒の流量で行われる。

【0177】

一態様では、本方法は、カラム平衡化工程、ローディング工程、洗浄工程、及び溶出工程を含む。一態様では、カラム平衡化工程、ローディング工程、及び洗浄工程のうちの１つ以上で同じ緩衝液が使用される。一態様では、平衡化工程、ローディング工程、及び洗浄工程のうちの１つ以上で異なる緩衝液が使用される。一態様では、「結合緩衝液」という用語は、平衡化緩衝液、ローディング緩衝液、及び／又は洗浄緩衝液として使用される緩衝液を指すために使用される。

【0178】

一態様では、タンパク質捕捉工程は、約１５分～約２時間を要する。一態様では、タンパク質捕捉工程は、約１５分～約１時間を要する。一態様では、タンパク質捕捉工程は、約３０分未満を要する。

【0179】

一態様では、カラムは、試料をロードする前にカラム上に平衡化緩衝液を通過させることによって平衡化される。一態様では、平衡緩衝液は、結合緩衝液と称される場合がある。一態様では、カラムは、約５～約１０カラム体積（ＣＶ）の平衡化緩衝液で平衡化される。一態様では、カラムは、約１０μＬ／秒～約２００μＬ／秒の流量で平衡化緩衝液を用いて平衡化される。結合緩衝液（又は平衡化緩衝液）は、Ｓ２０１入力ポートを介してＦＩＡ１５０によってアクセスされ、ＦＩＡ１５０を通じてアフィニティーカラムＴ１０５に送られ得る。

【0180】

一態様では、試料は、平衡化したカラム上にロードされる。一態様では、試料は、平衡緩衝液と同じ組成を有するローディング緩衝液にロードされる。一態様では、「結合緩衝液」という用語は、平衡化緩衝液及びローディング緩衝液の両方として使用される緩衝液を指す。一態様では、約２０μＬ～約１０００μＬの試料がローディング緩衝液中でカラムにロードされる。一態様では、試料は、約１０μＬ／秒～約２００μＬ／秒の流量でアフィニティーカラムにロードされる。試料は、Ｖ２０９入力ポート３０４でＦＩＡ１０５によってアクセスされ、第１のシリンジポンプ３０２によって、Ｖ２０８入力ポート３０４を介してアフィニティーカラム３１３に送られ得る。

【0181】

一態様では、本方法は、例えばアフィニティークロマトグラフィー樹脂と弱く又は非特異的に相互作用するタンパク質を除去するための、カラム洗浄工程を含む。一態様では、洗浄緩衝液は、平衡化緩衝液及び／又はローディング緩衝液と同じ組成を有する。一態様では、「結合緩衝液」という用語は、平衡化緩衝液、ローディング緩衝液、及び洗浄緩衝液として使用される緩衝液を指す。一態様では、洗浄緩衝液は、平衡化緩衝液及び／又はローディング緩衝液と異なる組成を有する。一態様では、ロードされたカラムは、約５～約１０カラム体積（ＣＶ）の洗浄緩衝液で洗浄される。一態様では、ロードされたカラムは、約１０μＬ／秒～約２００μＬ／秒の流量で洗浄緩衝液を用いて洗浄される。一態様では、洗浄緩衝液は、Ｓ２０２シリンジポンプポート３０５でＦＩＡ１０５によってアクセスされ、第２のシリンジポンプ４０２によって、Ｓ１０８シリンジポンプポート４０５を介してアフィニティーカラム３１３に送られる。

【0182】

一態様では、目的タンパク質は、溶出工程においてカラムから溶出される。一態様では、目的タンパク質は、試料が固定化されているカラム上に溶出緩衝液を通過させることによってカラムから溶出される。一態様では、目的タンパク質は、ローディング緩衝液とは異なるｐＨ又は塩濃度を有する溶出緩衝液を使用してカラムから溶出される。一態様では、溶出は、例えば溶出緩衝液の組成が経時的に線形変化する、勾配溶出である。一態様では、溶出は、段階溶出であって、例えば溶出緩衝液の組成が各段階で一定であるものである。一態様では、試料の溶出時間は予め定められている。本明細書で使用される場合、「溶出時間」とは、試料がカラムにロードされた時間と、試料がカラムから溶出される時間との間で経過した時間量を指す。一態様では、溶出時間は、試料がカラムにロードされた時間と、溶出液の最大濃度との間で経過した時間量である。一態様では、溶出緩衝液を約１０μＬ／秒～約２００μＬ／秒の流量でカラムにアプライして、目的タンパク質をカラムから溶出させる。一態様では、目的タンパク質を含有するカラムから溶出される溶液は、溶出液と称される。溶出緩衝液は、Ｖ２０３入力ポート３０５でＦＩＡ１０５によってアクセスされ、第１のシリンジポンプ３０２によって、Ｖ２０８入力ポート３０４を介してアフィニティーカラム３１３に送られ得る。

【0183】

一態様では、タンパク質は、抗体、抗体断片、又はＦｃ領域を含む他のタンパク質、例えばＦｃ融合タンパク質である。一態様では、アフィニティーカラムは、免疫グロブリン結合タンパク質を含む。一態様では、アフィニティーカラムは、免疫グロブリン結合細菌タンパク質を含む。一態様では、アフィニティーカラムは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、又はプロテインＬなどの免疫グロブリン結合細菌タンパク質を含む。一態様では、アフィニティーカラムは、プロテインＡカラムである。一態様では、アフィニティーカラムは、プロテインＧカラムである。一態様では、アフィニティーカラムは、プロテインＡ／Ｇカラムである。一態様では、アフィニティーカラムは、プロテインＬカラムである。一態様では、カラムは、プロテインＭカラムである。

【0184】

「プロテインＡクロマトグラフィー」とは、免疫グロブリン分子のＦｃ部分とプロテインＡのＩｇＧ結合ドメインとの間の特異的で可逆的な相互作用を伴うクロマトグラフィーを指す。一態様では、プロテインＡクロマトグラフィーは、スタフィロコッカス・アウレアス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅａｓ）から得られたタンパク質を用いたカラムを含む。一態様では、プロテインＡクロマトグラフィーは、組換え法又は合成法によって生産されたタンパク質を用いたカラムを含む。一態様では、プロテインＡクロマトグラフィーは、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する能力を保持するプロテインＡバリアントを用いたカラムを含む。

【0185】

一態様では、目的タンパク質は、タンパク質精製を容易にするためのＮ末端タグ又はＣ末端タグを含み、これには、ストレプトアビジン、ビオチン、ポリ－ヒスチジン（Ｈｉｓ）、又はグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含むタグが含まれるがこれらに限定されない。

【0186】

一態様では、アフィニティーカラムマトリックスは、組換え生産されたタンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を含む。

【0187】

図７に示されるように、タンパク質捕捉工程から得られた溶出液は、ＦＩＡ１５０の動作を介して、タンパク質濃度検出ユニット又はタンパク質消化工程に移送され得る。一態様では、第１の試料はアフィニティークロマトグラフィーにより精製され、第１の溶出液はタンパク質濃度決定ユニットに移送される。第１の溶出液は、第２のシリンジポンプ４０２によりアフィニティーカラム３１３から吸い出され、多方向接続部４１２を介してタンパク質濃度決定ユニット（例えば、分光光度計４１４）に移送され得る。一態様では、第２の試料は、アフィニティーカラム３１３を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより精製され、第２の溶出液が得られる。第２の溶出液は、タンパク質消化工程に移送される。第２の溶出液は、第２のシリンジポンプ４０２によってアフィニティーカラム３１３から吸い出され、第２のバルブ４０１のＶ１０４入力ポート４０４を介してＳ１０５消化チャンバ４１５に移送され得る。

【0188】

３．濃度決定
一態様では、アフィニティークロマトグラフィー工程からの溶出液は、タンパク質検出ユニットに移送される。一態様では、タンパク質検出ユニットは、分光光度計４１４を使用して試料タンパク質の濃度を測定する。一態様では、アフィニティーカラム３１３から分光光度計４１４への溶出液の移送は、Ｓ１０８シリンジポンプポート４０５を介して多方向バルブ４１２を通じてアフィニティーカラム３１３から溶出液を吸引し、多方向バルブ４１２を通じて分光光度計４１４に溶出液を押し戻す、第２のシリンジポンプ４０２の動作を通じて可能になり得る。一態様では、試料中のタンパク質の濃度は、ＵＶ吸光度を測定することにより決定される。一態様では、試料中のタンパク質の濃度は、約１９０ｎｍ～約２８０ｎｍのＵＶ吸光度を測定することにより決定される。一態様では、試料中のタンパク質の濃度は、アミノ酸であるチロシン及びトリプトファンの存在に起因するＵＶ吸光度を測定して決定される。一態様では、試料中のタンパク質の濃度は、約１７５ｎｍ～約２８０ｎｍのＵＶ吸光度を測定して決定される。一態様では、試料中のタンパク質の濃度は、約２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することにより決定される。一態様では、試料中のタンパク質の濃度は、ペプチド骨格に起因するＵＶ吸光度を測定することにより決定される。一態様では、試料中のタンパク質の濃度は、約１９０ｎｍ～約２２０ｎｍのＵＶ吸光度を測定することにより決定される。一態様では、試料中のタンパク質の濃度は、約２０５ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することにより決定される。一態様では、試料中のタンパク質の濃度は、例えばブラッドフォード法又はローリー法を使用する、比色アッセイにより決定される。

【0189】

一態様では、第１の溶出液のＵＶ吸光度は分光光度法により決定され、タンパク質濃度は所定の検量線に基づいて算出される。一態様では、濃度決定工程は、約５分～約３０分、又は約１０分未満を要する。ＵＶ吸光度データは、データ収集マネージャ２５４によって測定することができ、プロセス制御マネージャ２５２及び較正マネージャ２５６と連携させて、タンパク質濃度を前述したように決定することができる。

【0190】

４．溶液中での自動タンパク質消化
一態様では、タンパク質捕捉工程から得られた溶出液は、消化チャンバに移送される。一態様では、タンパク質捕捉工程から得られた第２の溶出液は、消化チャンバに移送される。一態様では、アフィニティークロマトグラフィー工程から得られた第２の溶出液は、消化チャンバに移送される。第２の溶出液は、第２のシリンジポンプ４０２によってアフィニティーカラム３１３から吸い出され、消化チャンバ４１５に、Ｔ１０１多方向バルブ４１２、Ｓ１０８シリンジポンプポートを介してＳ１０５消化チャンバ４１５に移送され得る。

【0191】

一態様では、アフィニティークロマトグラフィーカラムから得られる溶出液中のタンパク質は、消化されて、分析プロセス、例えばペプチドマッピングで使用するためのペプチド混合物を形成する。一態様では、アフィニティークロマトグラフィーカラムから得られる溶出液中のタンパク質は、平均サイズが約３０００Ｄａ未満、約２５００Ｄａ未満、約２０００Ｄａ未満、又は約１５００Ｄａ未満のペプチドに消化される。一態様では、アフィニティークロマトグラフィーカラムからの溶出液中のタンパク質は、平均サイズが約５００Ｄａ～約５０００Ｄａのペプチドに消化される。一態様では、アフィニティーカラムからの溶出液中のタンパク質は、平均サイズが約１０００Ｄａ～約５０００Ｄａのペプチドに消化される。一態様では、アフィニティークロマトグラフィーカラムからの溶出液中のタンパク質は、平均サイズが約５００Ｄａ、約７５０Ｄａ、又は約１０００Ｄａから、最大約１５００Ｄａ、２０００Ｄａ、２５００Ｄａ、又は約３０００Ｄａまでのペプチドに消化される。一態様では、アフィニティークロマトグラフィーカラムから得られる溶出液中のタンパク質は、消化されて、約２～約１００アミノ酸長、少なくとも約５若しくは約１０アミノ酸長、及び最大約１５、約２５、約５０、若しくは約１００アミノ酸長、又は約５～約５０、若しくは約１０～約２５、若しくは約１０～約１５アミノ酸長のペプチドを含むペプチド混合物を形成する。

【0192】

従来の酵素によるタンパク質消化方法は、典型的には、変性工程、還元工程、アルキル化工程、緩衝液交換及び消化工程を含む。変性は、温度を上昇させることにより、又は化学変性剤、例えば、塩酸グアニジン及び尿素を含むがこれらに限定されない、カオトロピック剤、塩、若しくは界面活性剤を使用することにより達成することができる。タンパク質が変性すると、還元剤、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、グルタチオン、ｂ－メルカプトエタノール（ｂ－ＭＥ）、又はトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を添加することにより、ジスルフィド結合が還元される。ジスルフィド結合の再形成を防止するために、アルキル化剤、例えば、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、アクリルアミド、又はクロロアセトアミドが添加される。

【0193】

従来のタンパク質消化方法で使用される試薬、例えば化学変性剤又はアルキル化剤はタンパク質分解酵素を分解する可能性があることから、試薬は典型的には、タンパク質分解酵素の添加前に、例えば緩衝液交換を使用して除去される。化学変性剤及びアルキル化剤が除去されたら、タンパク質分解酵素を添加してタンパク質を消化することができる。従来のタンパク質消化プロセスは、典型的には中性ｐＨにて３７℃で実施され、約１２～約２４時間、一般的にはおよそ１８時間を要する。

【0194】

従来、タンパク質分解消化は、酸又は他の化学薬品、例えば、ギ酸（ＦＡ）、塩酸（ＨＣｌ）、若しくは酢酸（ＨＡｃ）；若しくはＬ臭化シアン（ＣＮＢｒ）、２－ニトロ－５－チオシアノ安息香酸（ＮＴＣＢ）、若しくはヒドロキシルアミンを添加することにより停止される。

【0195】

本明細書では、時間効率の良い合理化されたタンパク質消化方法が提供される。一態様では、タンパク質消化方法は、自動且つオンラインである。従来のタンパク質消化プロセスが最大４時間を要し得るのに対し、一態様では、自動オンラインタンパク質消化方法は、約５分～最大約１時間を要する。一態様では、タンパク質消化は、約５分～約３０分を要する。一態様では、タンパク質消化は、約１５分～約３０分を要する。一態様では、タンパク質消化は、約３０分未満を要する。一態様では、オンラインタンパク質消化方法は、アルキル化又は緩衝液交換工程を含まない。

【0196】

一態様では、タンパク質の変性、還元、及び消化は、同じ反応混合物中で実施される。一態様では、タンパク質の変性、還元、及び消化は、同じ消化チャンバ内で実施される。一態様では、タンパク質の変性、還元、及び消化は、同時に実施される。一態様では、還元剤は、Ｓ１０３シリンジポンプポートを介して消化チャンバ４１５に導入される。一態様では、約５μＬ～約２０μＬの還元剤が、Ｓ１０３シリンジポンプポートを介して消化チャンバ４１５に導入される。一態様では、タンパク質分解酵素、例えばトリプシンが、Ｓ１０２シリンジポンプポートを介して消化チャンバ４１５に導入される。一態様では、約５μＬ～約２０μＬのタンパク質分解酵素が、Ｓ１０２シリンジポンプポートを介して消化チャンバ４１５に導入される。一態様では、約５μＬ～約２０μＬのトリプシンが、Ｓ１０２シリンジポンプポートを介して消化チャンバ４１５に導入される。一態様では、消化緩衝液は、第２のバルブ４０１のＶ１０４入力ポート４０４を介して消化チャンバ４１５に導入される。一態様では、消化緩衝液は、Ｖ１１１バルブ出力ポート４０８、Ｓ１０９シリンジポンプポート、及びＳ１０５シリンジポンプポートを介して消化チャンバ４１５に導入される。一態様では、約１００μＬ～約４００μＬの消化緩衝液が、消化チャンバ４１５に導入される。一態様では、試薬は、４０２シリンジ４０６を使用して、消化チャンバ内で第２の溶出液と合わされる。一態様では、第２の溶出液中のタンパク質は、消化チャンバ４１５内で変性される。

【0197】

一態様では、タンパク質消化は、高温で実施される。一態様では、タンパク質は、高温変性を使用して変性される。一態様では、タンパク質消化は、耐熱性タンパク質分解酵素を使用して実施される。一態様では、タンパク質消化は、高温で、例えば約３５℃～約８５℃の温度で実施される。一態様では、タンパク質消化は、少なくとも約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約６０℃、又は約７０℃、及び最大約７５℃、約８０℃、又は約８５℃の温度で実施される。一態様では、タンパク質消化は、少なくとも約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、又は約４０℃、及び最大約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃の温度で実施される。一態様では、タンパク質消化は、約５０℃～約８５℃の温度で実施される。一態様では、タンパク質消化は、約６５℃～約８０℃の温度で実施される。一態様では、タンパク質消化は、約７０℃～約７５℃の温度で実施される。一態様では、タンパク質消化は、約７０℃～約７２℃の温度で実施される。

【0198】

一態様では、タンパク質消化は、タンパク質溶液を消化試薬と接触させて、消化混合物を形成することを含む。一態様では、消化試薬は、消化緩衝液、還元剤、及びタンパク質分解酵素を含む。一態様では、アフィニティーカラムからの溶出液を消化試薬と接触させて、消化混合物を形成する。一態様では、アフィニティーカラムからの溶出液を、消化緩衝液、還元剤、及びタンパク質分解酵素を含む消化試薬と接触させて、消化混合物を形成する。一態様では、アフィニティーカラムからの第２の溶出液を、消化緩衝液、還元剤、及びタンパク質分解酵素と接触させて、消化混合物を形成する。

【0199】

一態様では、消化緩衝液は、約６．０～約８．０、又は約６．５～約７．５のｐＨを有する。一態様では、消化緩衝液は、約６．５からのｐＨを有する。一態様では、消化緩衝液は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＭＡＲＴ消化キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）からのものである。

【0200】

一態様では、還元剤は、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む。

【0201】

一態様では、タンパク質分解酵素は、例えば、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、サーモライシン、パパイン、プロナーゼ、エンドペプチダーゼＡｒｇ－Ｃ、ペプチジル－Ａｓｐメタロエンドペプチダーゼ（エンドペプチダーゼＡｓｐ－Ｎ）、グルタミルエンドペプチダーゼ（Ｇｌｕ－Ｃエンドペプチダーゼ）、及びリシルエンドペプチダーゼ（Ｌｙｓ－Ｃエンドペプチダーゼ）を含む。一態様では、タンパク質分解酵素は、トリプシンを含む。一態様では、タンパク質分解酵素は、熱安定性トリプシンを含む。一態様では、タンパク質分解酵素は、ＳＭＡＲＴトリプシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を含む。

【0202】

一態様では、タンパク質消化に使用される試薬は、質量分析（ＭＳ）に干渉しない。例えば、ＭＳにおけるイオン化は、塩及び／又は界面活性剤、特に高濃度の塩及び／又は界面活性剤を含むがこれらに限定されない試料中の夾雑物の存在によって妨げられる場合がある。一態様では、タンパク質消化に使用される試薬は、ＭＳにおけるイオン化プロセスに干渉しない。一態様では、タンパク質消化方法は、緩衝液交換工程を含まない。

【0203】

代わりに、タンパク質消化方法は、緩衝液交換工程を含む。一態様では、タンパク質消化方法は、ＭＳにおけるイオン化に干渉する可能性がある１種以上の試薬を含み、それらとしては、緩衝液交換工程を使用して除去される、化学変性試薬、例えば、塩酸グアニジン及び尿素などのカオトロピック剤；ジチオスレイトール（ＤＴＴ）グルタチオン、若しくはｂ－メルカプトエタノール（ｂ－ＭＥ）などの還元剤；又はヨード酢酸、ヨードアセトアミド、アクリルアミド、若しくはクロロアセトアミドなどのアルキル化剤が含まれるがこれらに限定されない。一態様では、緩衝液交換試薬は、マルチポートバルブを介して消化チャンバに送達される。一態様では、消化方法は室温で実施されるが、室温ではプロセスにより長い時間を要することになる。

【0204】

一態様では、第２の溶出液の消化混合物に使用されるタンパク質分解酵素の量は、第１の溶出液のタンパク質濃度に基づいて決定される。一態様では、第２の溶出液を、約１：１０～約１：１００のトリプシン：タンパク質比でトリプシンと接触させる。一態様では、第２の溶出液を、約１：２０～約１：３０のトリプシン：タンパク質比でトリプシンと接触させる。一態様では、トリプシン：タンパク質の比は、少なくとも約１：１０及び最大約１：１００、又は少なくとも約１：１０若しくは１：２０及び最大約１：３０、約１：４０、約１：５０、若しくは約１：１００、又は約１：１０～約１：１００、約１：１０～約１：５０、約１：１０～約１：４０、約１：１０～約１：３０、約１：１０～約１：２０、約１：２０～約１：１００、約１：２０～約１：５０、約１：２０～約１：４０、若しくは約１：２０～約１：３０である。

【0205】

一態様では、第２の溶出液を消化緩衝液、還元剤、及びタンパク質分解酵素と同時に接触させる。本明細書で使用される場合、「同時に」は、本明細書に記載の方法工程と関連して使用される場合、工程が実質的に同時間に実施される（即ち、ある方法工程の少なくとも一部の実行が別の方法工程の一部の実行と時間的に重複する）方法を指す。「同時に」は、厳密に並行する作用を必要とするわけではない。即ち、全ての方法工程が同時間に開始又は終了する必要はない。一態様では、「同時に」は、反応が同じ反応体積で且つ同じインキュベーション期間中に起こるように、方法工程に必要な全ての試薬が同じ反応混合物中で合わされることを意味し得る。一態様では、消化混合物は、消化緩衝液、還元剤、タンパク質分解酵素、及び第２の溶出液を含む。一態様では、消化混合物は、第２の溶出液及び他の試薬をシリンジのチャンバに導入することにより調製され、消化混合物は、シリンジのプランジャを押し下げて後退させることにより混合される。一態様では、消化チャンバは、インキュベーションチャンバとして使用される。例えば、第２の溶出液は、前述したようにアフィニティーカラム３１３から駆動シリンジ４０６のチャンバに移送され得る。駆動シリンジ４０６は更に、Ｓ１０２シリンジポンプポート４０５を介してタンパク質分解酵素にアクセスすることができる。次いで、第２の溶出液及びタンパク質分解酵素、並びに任意の他の好適な試薬を、駆動シリンジ４０６のチャンバ内で混合することができる。

【0206】

一態様では、第２の溶出液を消化緩衝液、還元剤、及びタンパク質分解酵素と逐次的に接触させる。本明細書で使用される場合、「逐次的に」は、本明細書に記載の方法工程と関連して使用される場合、工程が異なる時点で実施される方法、例えば、方法の実践において別々の事象が発生する方法を指す。一態様では、逐次的工程は、別々のインキュベーション期間中に実施される。一態様では、逐次的工程は、異なる反応混合物中で実施される。一態様では、逐次的方法工程は、異なる時間に、但し同じ反応チャンバ内で実施される。

【0207】

一態様では、インキュベーションチャンバの温度は、例えば消化混合物を約３５℃～約８５℃の温度でインキュベートするために、上昇させることができる。一態様では、消化混合物は、少なくとも約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約６０℃、又は約７０℃、及び最大約７５℃、約８０℃、又は約８５℃の温度でインキュベートされる。一態様では、消化混合物は、少なくとも約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、又は約４０℃、及び最大約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、又は約７５℃の温度でインキュベートされる。一態様では、消化混合物は、約５０℃～約８５℃の温度でインキュベートされる。一態様では、消化混合物は、約６５℃～約８０℃の温度でインキュベートされる。一態様では、消化混合物は、約７０℃～約５５℃の温度でインキュベートされる。一態様では、消化混合物は、約７０℃～約７２℃の温度でインキュベートされる。消化チャンバの温度は、例えばプロセス制御デバイスを介して、プロセスパラメータとして制御され得る。

【0208】

一態様では、消化混合物をインキュベートすることは、約３６℃～約８５℃の温度で約５分間～約３０分間インキュベートすることを含む。一態様では、消化混合物をインキュベートすることは、約５０℃～約７５℃の温度で約１５分間～約３０分間インキュベートすることを含む。一態様では、消化混合物をインキュベートすることは、約７０℃～約７２℃の温度で約１５分間～約３０分間インキュベートすることを含む。

【0209】

一態様では、消化方法は、２つの工程を含む：一態様では、第１の消化混合物は、約３６℃～約８５℃の温度で約５分間～約３０分間インキュベートされる。一態様では、第１の消化混合物は、約５０℃～約７５℃の温度で約１５分間～約３０分間インキュベートされる。一態様では、第１の消化混合物は、約７０℃～約７２℃の温度で約１５分間～約３０分間インキュベートされる。一態様では、追加のタンパク質分解酵素及び／又は消化緩衝液が第１の消化混合物に添加され、第２の消化混合物が形成される。一態様では、第２の消化混合物は、約３６℃～約８５℃の温度で約５分間～約３０分間インキュベートされる。一態様では、第２の消化混合物は、約５０℃～約７５℃の温度で約１５分間～約３０分間インキュベートされる。一態様では、第２の消化混合物は、約７０℃～約７２℃の温度で約１５分間～約３０分間インキュベートされる。

【0210】

Ｇ．ペプチドマッピング分析
一態様では、ペプチド混合物は、分析装置に移送される。一態様では、分析装置は、ペプチドマッピングユニットを含む。一態様では、図８に概略的に示されているように、ペプチドマッピングユニットは、ペプチド分離コンポーネント、検出又はデータ取得ユニット；及びデータ処理ユニットという３つのコンポーネントを含む。一態様では、データ取得ユニットは、イオン源及び質量分析器を含む。例えば、ペプチド混合物は、Ｖ１０８入力バルブ４０４を介して、第２のシリンジポンプ４０２の動作によって消化チャンバ４１５から分析装置、例えばペプチドマッピングユニットへと吸引され得る。

【0211】

一態様では、自動ペプチドマッピングシステムが使用される。自動ペプチドマッピングシステムは市販されており、それには例えば、ＢｉｏＡｃｃｏｒｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）が含まれる。

【0212】

一態様では、ペプチドマッピングは、約３０分～約２時間、又は１時間未満を要する。

【0213】

一態様では、ペプチドマッピングユニットは、ペプチド分離コンポーネントを含む。一態様では、ペプチド分離コンポーネントは、クロマトグラフィーカラムを含む。一態様では、ペプチド混合物中のペプチドは、カラムクロマトグラフィーにより分離される。一態様では、カラムクロマトグラフィーには、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）が含まれる。液体クロマトグラフィーには、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が含まれるがこれらに限定されない。一態様では、ペプチド混合物中のペプチドは、ＵＰＬＣにより分離される。一態様では、ペプチド混合物中のペプチドは、ＨＰＬＣにより分離される。

【0214】

一態様では、ペプチドマッピングユニットは、データ取得ユニットを含む。一態様では、データ取得ユニットは、質量分析計（ＭＳ）を含む。一態様では、データ取得ユニットは、イオン源及び質量分析器を含む。一態様では、データ取得ユニットは、ペプチド分離装置、イオン源、及び質量分析器を含む。図８を参照されたい。

【0215】

一態様では、イオン源は、ペプチド混合物中のペプチドをイオン化する。ペプチドをイオン化するための方法は公知であり、それにはエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）が含まれるがこれに限定されない。

【0216】

一態様では、質量分析器は、質量電荷比（ｍ／ｚ）によって気相イオンを分離する。一態様では、質量分析器は、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を含み、これは、質量分析プロセスの間に断片化が実施される質量分析の２つ以上の工程を含む。

【0217】

一態様では、ペプチドマッピングユニットは、データ処理ユニットを含む。一態様では、データ処理ユニットは、データ取得ユニットからのデータを処理して、タンパク質の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を同定及び／又は定量化するプロセッサを含む。一態様では、質量分析計により同定されたペプチドは、細胞培養培地から得られるインタクトタンパク質の代理標本として使用される。一態様では、データ処理は、タンパク質のアミノ酸配列、並びに／又は１つ以上のＰＴＭの存在、位置、及び／若しくは量に関する情報を提供する。一態様では、データ処理ユニットは、所定のＰＴＭに関する情報を提供する。一態様では、データ処理は、約５分～約３０分、又は約１０分未満を要する。態様では、ペプチドマッピングユニットのデータ処理ユニットは、プロセス制御デバイス２００とインターフェースし、且つ／又は他の方法でそれと通信することができる。いくつかの態様では、ペプチドマッピングユニットのデータ処理ユニットの機能は、データ処理ユニットを必要とせずにプロセス制御デバイス２００上で作動するソフトウェアによって行われ得る。

【0218】

Ｈ．翻訳後修飾のモジュレーション／細胞培養条件に対する修正
一態様では、組換えタンパク質を生産する方法が提供される。一態様では、本方法は、組換えタンパク質が発現される条件下で宿主細胞を培養すること；本明細書に記載の方法に従ってタンパク質の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を検出すること；及び検出された翻訳後修飾に基づいて１つ以上の細胞培養パラメータを修正すること、を含む。一態様では、本明細書に記載の方法により生産される組換えタンパク質が提供される。一態様では、本明細書に記載の方法により生産される組換えタンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物が提供される。

【0219】

一態様では、以下の細胞培養パラメータ：ｐＨ；ＣＯ_２レベル；溶存酸素量（ｄＯ_２）；温度；栄養素の量若しくはタイプ；グリカン前駆体の存在及びタイプ；又はそれらの組み合わせのうちの１つ以上が、本明細書に記載の方法により検出されたＰＴＭに基づいて修正される。一態様では、１つ以上の細胞培養パラメータは、本明細書に記載の方法により検出されたＰＴＭに基づいて「リアルタイム」で調整される。一態様では、１つ以上の細胞培養パラメータは、試料が採取された細胞培養物又はバイオリアクタ内で調整される。一態様では、１つ以上の細胞培養パラメータは、細胞培養物又はバイオリアクタ内で、試料が細胞培養物又はバイオリアクタから採取された後の約１日未満以内、約１２時間未満以内、約６時間未満以内、約５時間未満以内、約４時間未満以内、約３時間未満以内、又は約２．５時間未満以内に調整される。

【0220】

Ｉ．参照による組み込み
本明細書で引用される全ての参照文献（特許、特許出願、論文、教科書などを含む）、及びこれらに引用されている参照文献は、これらが既に引用されていない範囲内で、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0221】

実施例１．自動試料調製
試料ＩｇＧ１モノクローナル抗体（ＩｇＧ１ ｍＡｂ）を発現する組換え細胞を、灌流バイオリアクタ内で培養した。細胞培養培地（ＣＭ）を灌流バイオリアクタ内で処理し、細胞及び細胞デブリを除去して、清澄化細胞培養培地（ＣＣＭ）を得た。これをＰｒｏＳＩＡデュアルポンプインジェクション分析器（ＦＩＡｌａｂ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）の保持リザーバに導入した。システムコンポーネントの制御並びにデータの収集及び分析には、独自のＳＩＡｓｏｆｔ（登録商標）ソフトウェア（ＦＩＡｌａｂ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用した。２つのシリンジポンプ（シリンジポンプ１及びシリンジポンプ２）並びにそれらに付随する１０ポートバルブ（それぞれバルブ１及びバルブ２）を介して、試料及び試薬を導入した。

【0222】

ＣＣＭの第１の試料０．３ｍＬを保持リザーバから得て、ＦＩＡのバルブ１を介して、平衡化緩衝液で前処理したプロテインＡアフィニティーカラムに注入した。第１の試料のＩｇＧ１ ｍＡｂを、プロテインＡカラムから次のように溶出させた：結合緩衝液５００μＬを５０μＬ／秒～１００μＬ／秒でアフィニティーカラムに注入した。ＣＭ ３００μＬを５０μＬ／秒～１００μＬ／秒で注入した。結合緩衝液１ｍＬを５０μＬ／秒～１００μＬ／秒で洗浄用に注入した。溶出緩衝液１００～３００μＬを２０μＬ／秒で注入した。

【0223】

溶出液を収集し、ＦＩＡを介してＵＶ分光計に移送し、そこで２８０ｎｍでの吸光度を測定して、第１の試料中のＩｇＧ１ ｍＡｂの濃度を決定した。

【0224】

ＣＣＭの第２の試料３００μＬ（又はＣＣＭの第１の試料と同体積）を保持リザーバから得て、ＦＩＡのバルブ１を介して、平衡化緩衝液で前処理したプロテインＡアフィニティーカラムに注入した。第２の試料のＩｇＧ１ ｍＡｂを、上述した勾配溶出を使用してプロテインＡカラムから溶出させた。溶出液を収集し、ＦＩＡを介してシリンジポンプ２のバレルに移送した。

【0225】

トリス（２－カルボキシエチル（ｃａｒｂｏｘｙｅｈｔｙｌ））ホスフィン）（ＴＣＥＰ）０．０１ｍＬ（濃度５００ｍＭ）、消化緩衝液０．３ｍＬ、及びトリプシンを、ＦＩＡのバルブ２を介してシリンジポンプ２のバレルに注入した。添加したトリプシンの量を、第１の試料に対して決定したタンパク質濃度に基づいて算出した。次いで、シリンジのプランジャを押し下げて後退させることによって消化試薬を混合させ、混合物を７０℃で１５分間インキュベートして、トリプシン消化ペプチド（「トリプシンペプチド）を含有する試料を得た。

【0226】

実施例２．オンラインペプチドマッピング
実施例１のＦＩＡ試料調製物からのトリプシンペプチドのペプチドマッピングを、Ｗａｔｅｒｓ ＢｉｏＡｃｃｏｒｄ（商標）統合ペプチドマッピングシステム（ＡＣＱＵＩＴＹ ＲＤａ（商標）質量分析計にインラインで連結された紫外線（ＴＵＶ）検出器を備えた、ＡＣＱＵＩＴＹ（商標）ＵＰＬＣ（商標）Ｉ－Ｃｌａｓｓ ＰＬＵＳシステムを含む）を使用して、ＵＶ検出及び質量分析と連結された液体クロマトグラフィーにより分析した。

【0227】

クロマトグラフ条件は以下のとおりであった：温度６５℃；移動相Ａ：０．１％ギ酸水溶液；移動相Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル溶液；勾配溶出（１００％～４０％）；及び流量：０．２ｍｌ／分。移動相Ａの分析時間は４０分であった。２２０ｎｍでのＵＶ検出。

【0228】

質量分析については、ＭＳ及びタンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）検出を使用して５０～２０００ｍ／ｚの質量範囲でペプチドを検出した。

【0229】

実施例３．タンパク質濃度の決定
プロテインＡ溶出液のタンパク質濃度の決定に関する実行可能性を評価した。

【0230】

既知の濃度の参照標準物質（ＲＳ）を既知の体積でアフィニティーカラムに注入することにより、検量線を作成した。ブランク、較正物質１（ＲＳ ０．１ｍｇ／ｍＬ）、較正物質２（ＲＳ ０．５ｍｇ／ｍＬ）、較正物質３（ＲＳ １．０ｍｇ／ｍＬ）、及び較正物質４（ＲＳ ２．０ｍｇ／ｍＬ）を、アフィニティーカラムに別々に注入した。ＵＶ応答の読取値を内蔵の較正物質表に記録した。算出した傾き及び係数を用いて検量線を作成した。較正データを較正ファイルとして保存した。

【0231】

消化プロセスを実施する前に、ＦＩＡソフトウェア内で較正ファイルを開いた。次いで、濃度が未知の細胞培養培地試料をアフィニティーカラムに注入した。ＵＶ応答を得て、それを較正ファイルに入力し、タンパク質濃度を算出した。消化方法の実行中に、力価情報のライブフィードバックを取り込み、それを酵素計算値に適合させた。

【0232】

試料検量線を図９Ａに示しており、ｘ軸が濃度、ｙ軸が対応するＵＶ応答である。左側の検量線の各較正点は、ＩｇＧ試料の既知濃度の参照標準物質（ＲＳ）の１つのＵＶ測定値を表している。アフィニティーカラムのＵＶプロファイルを右パネルに示す。検量線は、４つの異なる濃度の参照標準物質（ＲＳ）を使用して作成した。１次の多項式適合モデルを使用して、検量線の傾きを算出した。

【0233】

図９Ｂは、第１の溶出液の濃度決定を行うために使用されたＵＶプロファイルであって、後にタンパク質消化に使用された第２の溶出液について同量のタンパク質が捕捉されたことを示しているものである。

【0234】

実施例４．グリカンプロファイリング：グリカン遊離と比較したオンライン方法
オンラインペプチドマッピング法を使用して決定したグリカンの傾向を、従来のグリカン遊離法（２－アミノベンズアミド（オリゴ２－ＡＢ）グリカン検出）を使用したグリカンの傾向の結果と比較した。簡潔に述べると、試料モノクローナルＩｇＧ１のグリコシル化プロファイルを、実施例１に記載のオンラインペプチドマッピング法及びＰｒｏＺｙｍｅ ２ＡＢ標識キット（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を製造業者の指示に従って使用して決定した。

【0235】

簡潔に述べると、ＩｇＧ１含有試料をＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素で処理して、タンパク質骨格からグリカンを切断した。遊離させたグリカンを固相抽出調製キットを使用して精製及び収集した。２ＡＢ標識試薬を調製した後、それらをグリカンと合わせ、６５℃で３時間インキュベートした。次いで、標識したグリカンを洗浄し、アクセス試薬を除去して乾燥させた。

【0236】

１０種のグリカン（Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮＡｃ、Ｇ０－ＧｌｃＮＡｃ、Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ、Ｇ２ｆ＋ＳＡ、Ｍａｎ５、及びＭａｎ６）のグリコシル化を、実施例１に記載のオンラインペプチドマッピング法及びＯｌｉｇｏ２－ＡＢグリカン遊離法を使用して決定した。図１０Ａに示すように、オンライン方法を使用して決定したグリコシル化プロファイルは、オリゴ－２ＡＢ手順を使用して決定したグリコシル化プロファイルと同様の傾向を示した。図１０Ｂは、細胞培養期間中にモニタリングしたグリカン種のうちの１つ（マンノース）の定量化％を示す。各時点の反復実験により、一定レベルの定量化％が示される。

【0237】

実施例５．グリカンプロファイリング：グリカン遊離と比較したオンライン方法
実施例４に記載の手順に従って、オンラインペプチドマッピング法及びオリゴ２－ＡＢグリカン遊離法を使用して、３つの時点で４つの異なるバイオリアクタ（合計１２時点）から得た試料ＩｇＧ１ ｍＡｂについてグリカンの傾向を決定した。この２つの方法には直接的な線形関係があり、試験したグリコシル化のタイプについて結果が同等であったことが示される。

【0238】

図１１Ａ～Ｅは、５種のグリカンについて、２つの方法間の相関関係を示している：Ｇ０Ｆ（ＣＣ＝０．９３２２）；Ｇ１Ｆ（ＣＣ＝０．９２２９）；Ｍａｎ ５（ＣＣ＝０．９９７９）；Ｃ０Ｆ－ＧＮ（ＣＣ＝０．９９３８）；及びＧ２Ｆ＋ＳＡ（ＣＣ＝０．８４８８、アッセイ変動性及び定量限界（ＬＯＱ）の範囲内）。

【0239】

実施例６．翻訳後修飾の検出
酸化は、モノクローナル抗体内の種々のメチオニン部位で見られる一般的な翻訳後修飾である。メチオニンの酸化は、細胞培養プロセス中にモニタリングされる重要な生産物品質特性である。図１２Ａは、参照標準物質（ＲＳ）と比較して、細胞培養の７、９、及び１１日目に測定した場合、特定のメチオニン残基での酸化レベルが２％未満に維持されていたことを示す。

【0240】

Ｎ末端環化は、抗体の重鎖及び軽鎖のＮ末端配列に見られる一般的な翻訳後修飾である。図１２Ｂは、細胞培養の７日目、１０日目、及び１４日目に測定した場合、Ｎ末端環化のレベルが９５％超で維持されていたことを示す。各時点の反復実験により、重鎖及び軽鎖における一定レベルの修飾が示される。

【0241】

実施例７．部位特異的グリコシル化
実施例２に記載の従来のオリゴ２－ＡＢグリカン遊離法とは異なり、実施例１に記載のオンラインペプチドマッピング法は、部位特異的グリコシル化の情報を得るために使用することができる。

【0242】

分子が２つ以上のグリコシル化部位を有する場合、ペプチドマッピング分析により部位特異的グリコシル化の情報を得ることができる。例えば、グリコシル化が発生したアミノ酸をペプチドレベルで決定し、インタクトタンパク質の部位特異的グリコシル化に関する情報を得ることができる。対照的に、グリカン遊離法では、分析のためにグリカンがタンパク質から切断される際に、グリコシル化に関する全ての部位特異的情報が失われる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【図12】

【国際調査報告】