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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-02
(54)【発明の名称】ＰＤ－１及びＴＩＭ－３を標的化する二重特異性抗体
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20240326BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240326BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240326BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20240326BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240326BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20240326BHJP
C07K 16/46 20060101ALN20240326BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 N ZNA
A61K39/395 D
A61P35/00
A61P37/04
A61P35/04
A61P11/00
C07K16/28
C07K16/46
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023562513
(86)(22)【出願日】2022-04-12
(85)【翻訳文提出日】2023-10-11
(86)【国際出願番号】 US2022024368
(87)【国際公開番号】W WO2022221245
(87)【国際公開日】2022-10-20
(31)【優先権主張番号】63/174,156
(32)【優先日】2021-04-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】504333972
【氏名又は名称】メディミューン，エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】ポリッツィ，クリステン
(72)【発明者】
【氏名】ハモンド，スコット エイ
(72)【発明者】
【氏名】メイザー，ヤリブ
(72)【発明者】
【氏名】ペリー，トリニティ
(72)【発明者】
【氏名】プリッツ，ステイシー
(72)【発明者】
【氏名】ジャイスワル，アシュビン アール
(72)【発明者】
【氏名】オガネシャン，バヘー
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，チュンニン
(72)【発明者】
【氏名】クーレク，ラファエル
(72)【発明者】
【氏名】チャイコフスカヤ，ナタリア
(72)【発明者】
【氏名】フェルテ，シャルル
(72)【発明者】
【氏名】クランシー－トンプソン，エリノア
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB42
4C085CC01
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA30
4H045DA76
4H045EA22
4H045EA28
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、対象において、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有タンパク質３（ＴＩＭ－３）とホスファチジルセリン（ＰＳ）との間のエンゲージメントを変化させる方法を提供する。ＴＩＭ－３結合タンパク質を使用する治療の方法であって、ＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３の免疫グロブリン可変（ＩｇＶ）ドメインのＣ’Ｃ’’及びＤＥループに特異的に結合する、方法も提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象において、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有タンパク質３（ＴＩＭ－３）とホスファチジルセリン（ＰＳ）との間のエンゲージメントを変化させる方法であって、ＴＩＭ－３結合ドメインを含むＴＩＭ－３結合タンパク質を前記対象に投与することを含み、前記ＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３の免疫グロブリン可変（ＩｇＶ）ドメインのＣ’Ｃ’’及びＤＥループに特異的に結合する、方法。
【請求項2】
前記ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、抗体投与なしと比較して、対象における抗腫瘍活性を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、前記ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＰＳ結合クレフト（ＦＧ及びＣＣ’ループ）に結合するＴＩＭ－３結合タンパク質の投与と比較して、対象における抗腫瘍活性を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
対象においてＴ細胞媒介性抗腫瘍活性を増加させる方法であって、ＴＩＭ－３結合ドメインを含むＴＩＭ－３結合タンパク質を前記対象に投与することを含み、前記ＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＣ’Ｃ’’及びＤＥループに特異的に結合する、方法。
【請求項5】
前記対象における前記Ｔ細胞媒介性抗腫瘍活性は、抗体投与なしと比較して増加する、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記対象における前記Ｔ細胞媒介性抗腫瘍活性は、前記ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＰＳ結合クレフト（ＦＧ及びＣＣ’ループ）に結合するＴＩＭ－３結合タンパク質の投与と比較して増加する、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
前記ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、抗体投与なしと比較して、対象におけるアポトーシス腫瘍細胞の樹状細胞食作用を増加させる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、前記ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインの前記ＰＳ結合クレフト（ＦＧ及びＣＣ’ループ）に結合するＴＩＭ－３結合タンパク質の投与と比較して、対象におけるアポトーシス腫瘍細胞の樹状細胞食作用を増加させる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、抗体投与なしと比較して、対象における腫瘍抗原の樹状細胞交差提示を増加させる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、前記ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインの前記ＰＳ結合クレフト（ＦＧ及びＣＣ’ループ）に結合するＴＩＭ－３結合タンパク質の投与と比較して、対象における腫瘍抗原の樹状細胞交差提示を増加させる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
対象において腫瘍細胞の樹状細胞食作用を促進させる方法であって、ＴＩＭ－３結合ドメインを含むＴＩＭ－３結合タンパク質を前記対象に投与することを含み、前記ＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＣ’Ｃ’’及びＤＥループに特異的に結合する、方法。
【請求項12】
対象において腫瘍抗原の樹状細胞交差提示を増加させる方法であって、ＴＩＭ－３結合ドメインを含むＴＩＭ－３結合タンパク質を前記対象に投与することを含み、前記ＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＣ’Ｃ’’及びＤＥループに特異的に結合する、方法。
【請求項13】
樹状細胞交差提示のレベルは、抗体投与なしと比較して増加する、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
樹状細胞交差提示のレベルは、前記ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＰＳ結合クレフト（ＦＧ及びＣＣ’ループ）に結合するＴＩＭ－３結合タンパク質の投与と比較して増加する、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
前記ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、抗体投与なしと比較して、対象におけるＴＩＭ－３陽性Ｔ細胞へのエンゲージ時のＩＬ－２分泌を増加させる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、前記ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインの前記ＰＳ結合クレフト（ＦＧ及びＣＣ’ループ）に結合するＴＩＭ－３結合タンパク質の投与と比較して、対象におけるＴＩＭ－３陽性Ｔ細胞へのエンゲージ時のＩＬ－２分泌を増加させる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、前記対象における腫瘍成長の阻害をもたらす、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
腫瘍は、進行性又は転移性の固形腫瘍である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記対象は、卵巣癌、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、膀胱癌、頭頸部癌、黒色腫、膵臓癌、腎細胞癌、肺癌、食道癌、胃癌、胆道腫瘍、尿路上皮癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群及び急性骨髄性白血病の１つ以上を有する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記対象は、癌免疫療法（ＩＯ）獲得耐性を有する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
ＩＯ獲得耐性を有する対象において癌を治療する方法であって、ＴＩＭ－３結合ドメインを含むＴＩＭ－３結合タンパク質を前記対象に投与することを含み、前記ＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＣ’Ｃ’’及びＤＥループに特異的に結合する、方法。
【請求項22】
前記癌は、卵巣癌、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、膀胱癌、頭頸部癌、黒色腫、膵臓癌、腎細胞癌、肺癌、食道癌、胃癌、胆道腫瘍、尿路上皮癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群及び急性骨髄性白血病の１つ以上である、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記対象は、ヒトである、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記対象は、根治的外科手術若しくは放射線療法が適さないステージＩＩＩ又はステージＩＶの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を実証している、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記ＮＳＣＬＣは、扁平上皮又は非扁平上皮ＮＳＣＬＣである、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記対象は、単剤療法としての又は化学療法との組み合わせにおける、最低でも３～６ヶ月間の抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法による初期治療後、Ｘ線で実証された腫瘍進行又は臨床的悪化を有し、且つ初期の臨床的利益、すなわち疾患の安定化又は退縮の兆候を有していた、請求項１～２５、４５又は４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記ＩＯ獲得耐性は、（ｉ）抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１単剤療法への６ヶ月間未満の曝露で、部分的退縮若しくは完全退縮の初期最良総合効果（ＢＯＲ）を伴い、続いて治療中の疾患進行若しくは抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療を中断してから１２週間以下での疾患進行を伴うこと、又は
（ｉｉ）単独での若しくは化学療法との組み合わせにおける抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法への６ヶ月間以上の曝露で、疾患の安定化、部分的退縮若しくは完全退縮のＢＯＲを伴い、続いて治療中の疾患進行若しくは抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療を中断してから１２週間以下での疾患進行を伴うこと
として定義される、請求項２０～２６、４５又は４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記ＩＯ獲得耐性は、単独での又は化学療法との組み合わせにおける抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法への６ヶ月間以上の曝露；疾患の安定化、部分的退縮又は完全退縮の最良総合効果（ＢＯＲ）、それに続く治療中の疾患進行又は抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療を中断してから１２週間以下での疾患進行として定義される、請求項２０～２６、４５又は４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記対象のＰＤ－Ｌ１腫瘍比率スコア（ＴＰＳ）は、１％以上である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記対象は、ファーストライン設定での以前の全身療法を受けていない、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記以前の全身療法は、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法以外のＩＯ療法である、３０に記載の方法。
【請求項32】
前記対象は、以前のネオ／アジュバント療法を受けているが、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法を最後に投与してから少なくとも１２ヶ月間にわたって進行しなかった、請求項３０に記載の方法。
【請求項33】
前記対象のＰＤ－Ｌ１ ＴＰＳは、５０％以上である、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記ＴＩＭ－３結合タンパク質は、それぞれ配列番号１、２、３、７、８及び９又はそれぞれ配列番号１、２、３、７、８及び１３のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記ＴＩＭ－３結合ドメインは、前記ＴＩＭ－３のＩｇＶドメイン上のエピトープに特異的に結合し、及び前記エピトープは、ＴＩＭ－３のＮ１２、Ｌ４７、Ｒ５２、Ｄ５３、Ｖ５４、Ｎ５５、Ｙ５６、Ｗ５７、Ｗ６２、Ｌ６３、Ｎ６４、Ｇ６５、Ｄ６６、Ｆ６７、Ｒ６８、Ｋ６９、Ｄ７１、Ｔ７５及びＥ７７（配列番号２９）を含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
前記ＴＩＭ－３結合タンパク質は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）結合ドメインを更に含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記ＴＩＭ－３結合ドメインは、それぞれ配列番号１、２、３、７、８及び９又は１、２、３、７、８及び１３のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の第１のセットを含み、及び前記ＰＤ－１結合ドメインは、それぞれ配列番号４、５、６、１０、１１及び１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の第２のセットを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記ＴＩＭ－３結合タンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、配列番号１７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、配列番号１９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖ＶＨ及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖ＶＬを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記ＴＩＭ－３結合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項40】
前記ＴＩＭ－３結合タンパク質は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項41】
前記ＴＩＭ－３結合タンパク質は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項42】
前記ＴＩＭ－３結合タンパク質は、アグリコシル化されたＦｃ領域を含む、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
前記ＴＩＭ－３結合タンパク質は、脱グリコシル化されたＦｃ領域を含む、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
前記ＴＩＭ－３結合タンパク質は、減少したフコシル化を有するか又はアフコシル化されているＦｃ領域を含む、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
進行性又は転移性ＮＳＣＬＣを有する対象においてＮＳＣＬＣを治療する方法であって、ＰＤ－１結合ドメイン及びＴＩＭ－３結合ドメインを含む二重特異性結合タンパク質を前記対象に投与することを含み、前記二重特異性結合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含み、
前記対象は、ＩＯ獲得耐性を有する、方法。
【請求項46】
進行性又は転移性腫瘍を有する対象において非小細胞肺腫瘍の成長を阻害する方法であって、ＰＤ－１結合ドメイン及びＴＩＭ－３結合ドメインを含む二重特異性結合タンパク質を前記対象に投与することを含み、前記二重特異性結合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含み、
前記対象は、ＩＯ獲得耐性を有する、方法。
【請求項47】
前記ＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＣ’Ｃ’’及びＤＥループに特異的に結合する、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項48】
前記ＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメイン上のエピトープに特異的に結合し、及び前記エピトープは、ＴＩＭ－３のＮ１２、Ｌ４７、Ｒ５２、Ｄ５３、Ｖ５４、Ｎ５５、Ｙ５６、Ｗ５７、Ｗ６２、Ｌ６３、Ｎ６４、Ｇ６５、Ｄ６６、Ｆ６７、Ｒ６８、Ｋ６９、Ｄ７１、Ｔ７５及びＥ７７（配列番号２９）を含む、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項49】
前記ＮＳＣＬＣは、扁平上皮又は非扁平上皮ＮＳＣＬＣである、請求項４５～４８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、概して、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有タンパク質３（ＴＩＭ－３）結合タンパク質を使用する治療であって、ＴＩＭ－３結合領域は、ＴＩＭ－３の免疫グロブリン可変（ＩｇＶ）ドメインに特異的に結合する、治療の作用機序及び方法に関する。
【背景技術】
【0002】
癌は、依然として主な世界的健康負担である。癌免疫療法の進歩にも関わらず、特に癌免疫療法（ＩＯ）獲得耐性を有する患者のための効果的な治療法に対する満たされていない医学上の必要性が依然として存在する。
【0003】
いくつかの分子標的は、癌に対するＩＯ療法薬としてのその潜在的な有用性に関して同定されている。癌免疫療法の分野においてその治療薬の可能性について研究されているいくつかの分子標的としては、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４又はＣＤ１５２）、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１又はＢ７－Ｈ１又はＣＤ２７４）、プログラム死－１（ＰＤ－１）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４又はＴＮＦＲＳＦ４）並びにＴ細胞阻害性受容体Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３（ＴＩＭ３）が挙げられる。しかしながら、全ての患者が免疫療法に応答するわけではなく、一部の患者は、時間の経過と共に応答しなくなる。こうしたＩＯ獲得耐性の理由は、研究者によって理解されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
このため、免疫療法、特にＩＯ獲得耐性を克服し、且つ現行の臨床評価された免疫療法戦略を上回って患者の応答を向上させる免疫療法の候補標的を継続して特定する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【0005】
対象において、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有タンパク質３（ＴＩＭ－３）とホスファチジルセリン（ＰＳ）との間のエンゲージメントを変化させる方法であって、ＴＩＭ－３結合ドメインを含むＴＩＭ－３結合タンパク質を対象に投与することを含み、ＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３の免疫グロブリン可変（ＩｇＶ）ドメインのＣ’Ｃ’’及びＤＥループに特異的に結合する、方法が本明細書で提供される。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、抗体投与なしと比較して、対象における抗腫瘍活性を増加させる。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＰＳ結合クレフト（ＦＧ及びＣＣ’ループ）に結合するＴＩＭ－３結合タンパク質の投与と比較して、対象における抗腫瘍活性を増加させる。
【0006】
対象においてＴ細胞媒介性抗腫瘍活性を増加させる方法であって、ＴＩＭ－３結合ドメインを含むＴＩＭ－３結合タンパク質を対象に投与することを含み、ＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＣ’Ｃ’’及びＤＥループに特異的に結合する、方法も本明細書で提供される。いくつかの態様では、対象におけるＴ細胞媒介性抗腫瘍活性は、抗体投与なしと比較して増加する。いくつかの態様では、対象におけるＴ細胞媒介性抗腫瘍活性は、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＰＳ結合クレフト（ＦＧ及びＣＣ’ループ）に結合するＴＩＭ－３結合タンパク質の投与と比較して増加する。
【0007】
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、抗体投与なしと比較して、対象におけるアポトーシス腫瘍細胞の樹状細胞食作用を増加させる。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＰＳ結合クレフト（ＦＧ及びＣＣ’ループ）に結合するＴＩＭ－３結合タンパク質の投与と比較して、対象におけるアポトーシス腫瘍細胞の樹状細胞食作用を増加させる。
【0008】
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、抗体投与なしと比較して、対象における腫瘍抗原の樹状細胞交差提示を増加させる。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＰＳ結合クレフト（ＦＧ及びＣＣ’ループ）に結合するＴＩＭ－３結合タンパク質の投与と比較して、対象における腫瘍抗原の樹状細胞交差提示を増加させる。
【0009】
対象において腫瘍細胞の樹状細胞食作用を促進させる方法であって、ＴＩＭ－３結合ドメインを含むＴＩＭ－３結合タンパク質を対象に投与することを含み、ＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＣ’Ｃ’’及びＤＥループに特異的に結合する、方法も本明細書で提供される。
【0010】
対象において腫瘍抗原の樹状細胞交差提示を増加させる方法であって、ＴＩＭ－３結合ドメインを含むＴＩＭ－３結合タンパク質を対象に投与することを含み、ＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＣ’Ｃ’’及びＤＥループに特異的に結合する、方法も本明細書で提供される。いくつかの態様では、樹状細胞交差提示のレベルは、抗体投与なしと比較して増加する。いくつかの態様では、樹状細胞交差提示のレベルは、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＰＳ結合クレフト（ＦＧ及びＣＣ’ループ）に結合するＴＩＭ－３結合タンパク質の投与と比較して増加する。
【0011】
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、抗体投与なしと比較して、対象におけるＴＩＭ－３陽性Ｔ細胞へのエンゲージ時のＩＬ－２分泌を増加させる。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＰＳ結合クレフト（ＦＧ及びＣＣ’ループ）に結合するＴＩＭ－３結合タンパク質の投与と比較して、対象におけるＴＩＭ－３陽性Ｔ細胞へのエンゲージ時のＩＬ－２分泌を増加させる。
【0012】
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、対象における腫瘍成長の阻害をもたらす。いくつかの態様では、腫瘍は、進行性又は転移性の固形腫瘍である。いくつかの態様では、対象は、卵巣癌、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、膀胱癌、頭頸部癌、黒色腫、膵臓癌、腎細胞癌、肺癌、食道癌、胃癌、胆道腫瘍、尿路上皮癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群及び急性骨髄性白血病の１つ以上を有する。
【0013】
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、対象は、癌免疫療法（ＩＯ）獲得耐性を有する。
【0014】
ＩＯ獲得耐性を有する対象において癌を治療する方法であって、ＴＩＭ－３結合ドメインを含むＴＩＭ－３結合タンパク質を対象に投与することを含み、ＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＣ’Ｃ’’及びＤＥループに特異的に結合する、方法も本明細書で提供される。いくつかの態様では、癌は、卵巣癌、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、膀胱癌、頭頸部癌、黒色腫、膵臓癌、腎細胞癌、肺癌、食道癌、胃癌、胆道腫瘍、尿路上皮癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群及び急性骨髄性白血病の１つ以上である。いくつかの態様では、対象は、ヒトである。いくつかの態様では、対象は、根治的外科手術若しくは放射線療法が適さないステージＩＩＩ又はステージＩＶの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を実証している。いくつかの態様では、ＮＳＣＬＣは、扁平上皮又は非扁平上皮ＮＳＣＬＣである。いくつかの態様では、対象は、単剤療法としての又は化学療法との組み合わせにおける、最低でも３～６ヶ月間の抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法による初期治療後、Ｘ線で実証された腫瘍進行又は臨床的悪化を有し、且つ初期の臨床的利益、すなわち疾患の安定化又は退縮の兆候を有していた。
【0015】
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、ＩＯ獲得耐性は、以下の通り定義される：（ｉ）抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１単剤療法への６ヶ月間未満の曝露で、部分的退縮若しくは完全退縮の初期最良総合効果（ＢＯＲ）を伴い、続いて治療中の疾患進行若しくは抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療を中断してから１２週間以下での疾患進行を伴うこと、又は（ｉｉ）単独での若しくは化学療法との組み合わせにおける抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法への６ヶ月間以上の曝露で、疾患の安定化、部分的退縮若しくは完全退縮のＢＯＲを伴い、続いて治療中の疾患進行若しくは抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療を中断してから１２週間以下での疾患進行を伴うこと。
【0016】
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、ＩＯ獲得耐性は、単独での又は化学療法との組み合わせにおける抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法への６ヶ月間以上の曝露；疾患の安定化、部分的退縮又は完全退縮の最良総合効果（ＢＯＲ）、それに続く治療中の疾患進行又は抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療を中断してから１２週間以内の疾患進行として定義される。いくつかの態様では、対象のＰＤ－Ｌ１腫瘍比率スコア（ＴＰＳ）は、１％以上である。いくつかの態様では、対象は、ファーストライン設定での以前の全身療法を受けていない。いくつかの態様では、以前の全身療法は、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法以外のＩＯ療法である。いくつかの態様では、対象は、以前のネオ／アジュバント療法を受けているが、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法を最後に投与してから少なくとも１２ヶ月間にわたって進行しなかった。いくつかの態様では、対象のＰＤ－Ｌ１ ＴＰＳは、５０％以上である。
【0017】
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質は、それぞれ配列番号１、２、３、７、８及び９又はそれぞれ配列番号１、２、３、７、８及び１３のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
【0018】
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメイン上のエピトープに特異的に結合し、及びエピトープは、ＴＩＭ－３のＮ１２、Ｌ４７、Ｒ５２、Ｄ５３、Ｖ５４、Ｎ５５、Ｙ５６、Ｗ５７、Ｗ６２、Ｌ６３、Ｎ６４、Ｇ６５、Ｄ６６、Ｆ６７、Ｒ６８、Ｋ６９、Ｄ７１、Ｔ７５及びＥ７７（配列番号２９）を含む。
【0019】
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）結合ドメインを更に含む。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合ドメインは、それぞれ配列番号１、２、３、７、８及び９又は１、２、３、７、８及び１３のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の第１のセットを含み、及びＰＤ－１結合ドメインは、それぞれ配列番号４、５、６、１０、１１及び１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の第２のセットを含む。
【0020】
いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、配列番号１７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、配列番号１９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖ＶＨ及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖ＶＬを含む。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む。
【0021】
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質は、アグリコシル化されたＦｃ領域を含む。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質は、脱グリコシル化されたＦｃ領域を含む。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質は、減少したフコシル化を有するか又はアフコシル化されているＦｃ領域を含む。
【0022】
進行性又は転移性ＮＳＣＬＣを有する対象においてＮＳＣＬＣを治療する方法であって、ＰＤ－１結合ドメイン及びＴＩＭ－３結合ドメインを含む二重特異性結合タンパク質を対象に投与することを含み、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含み、対象は、ＩＯ獲得耐性を有する、方法も本明細書で開示される。
【0023】
進行性又は転移性腫瘍を有する対象において非小細胞肺腫瘍の成長を阻害する方法であって、ＰＤ－１結合ドメイン及びＴＩＭ－３結合ドメインを含む二重特異性結合タンパク質を対象に投与することを含み、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含み、対象は、ＩＯ獲得耐性を有する、方法も本明細書で開示される。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＣ’Ｃ’’及びＤＥループに特異的に結合する。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメイン上のエピトープに特異的に結合し、及びエピトープは、ＴＩＭ－３のＮ１２、Ｌ４７、Ｒ５２、Ｄ５３、Ｖ５４、Ｎ５５、Ｙ５６、Ｗ５７、Ｗ６２、Ｌ６３、Ｎ６４、Ｇ６５、Ｄ６６、Ｆ６７、Ｒ６８、Ｋ６９、Ｄ７１、Ｔ７５及びＥ７７（配列番号２９）を含む。
【0024】
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、ＮＳＣＬＣは、扁平上皮又は非扁平上皮ＮＳＣＬＣである。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1A】Ｏ１３－１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ＡＺＤ７７８９に対する親抗ＴＩＭ－３ｍＡｂ）は、アイソタイプ対照と比較して且つｈ－ＴＩＭ－３とホスファチジルセリン（ＰＳ）との相互作用を低下させる抗ＴＩＭ－３ｍＡｂ（Ｆ９Ｓ）と比較して、ヒト（ｈ－）ＴＩＭ－３のホスファチジルセリンとの結合を増加させることを示す。
【図1B】ＡＺＤ７７８９によるＴＩＭ－３の一価エンゲージメントは、二価ｍＡｂ Ｏ１３－１結合と比較して且つアイソタイプ対照と比較して、ＴＩＭ－３のホスファチジルセリンとの相互作用を増加させるのに十分であることを示す。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図2】Ｏ１３－１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及びＡＺＤ７７８９ｍＡｂは、ｈ－ＴＩＭ－３のアポトーシス細胞との相互作用を低下させる抗ＰＤ－１（ＬＯ１１５）、ＰＳをブロックする抗ＴＩＭ－３ｍＡｂ（Ｆ９Ｓ）、Ｄｕｅｔ ＬＯ１１５／Ｆ９Ｓ及びＥ２Ｅと比較して、ヒトＴＩＭ－３ ＩｇＶとアポトーシス細胞との結合を増加させることを示す。
【図3】ＡＺ抗ＴＩＭ３クローンの６２ＧＬ及びＯ１３は、ＴＩＭ３を発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞からのＩＬ－２産生を強化する同様の効果を媒介することを示す。したがって、６２ＧＬとＯ１３との間の１アミノ酸の差異は、この表現型に影響を与えない。
【図4】抗ＴＩＭ－３ｍＡｂであるＯ１３－１が、Ｔ細胞刺激時にＪｕｒｋａｔ細胞を発現するｈ－ＴＩＭ－３のＩＬ－２産生の増加を駆動する、濃度依存的な効果を示す。評価された全ての他の抗ＴＩＭ－３ｍＡｂは、ＩＬ－２産生の濃度依存的な低下を示した。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図5】刺激及び抗ＴＩＭ－３ｍＡｂ Ｏ１３－１の添加後にＪｕｒｋａｔ細胞を発現するｈ－ＴＩＭ－３由来のＩＬ－２の観察された増加は、ＴＩＭ－３のホスファチジルセリンとの相互作用をブロックする高濃度の抗ＴＩＭ－３ｍＡｂであるＦ９Ｓ中で細胞が培養される場合に除去されることを示す。
【図6】Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞中にＴＩＭ３を導入すると、ＩＬ－２産生が強化されることを示し、これは、ＡＺ抗ＴＩＭ３（クローンＯ１３）によって更に増加し、競争者様抗ＴＩＭ３（Ｆ９Ｓ）によって更に低下する。結合に不可欠な残基の変異（Ｒ１１１Ａ）は、薬物効果及びＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞からのＩＬ－２産生全体を無効化するため、この薬物効果は、ホスファチジルセリンに結合するＴＩＭ３に依存する。
【図7】ＡＺＤ７７８９及びその親抗ＴＩＭ－３ｍＡｂであるＯ１３－１は、刺激された初代ヒトＰＢＭＣのＩＦＮ－γの分泌を強化することを示す。図７Ａは、あるドナーの細胞におけるｍＡｂ投与の結果としての刺激された初代ヒトＰＢＭＣのＩＦＮ－γの分泌を示す。図７Ｂは、別のドナーの細胞におけるｍＡｂ投与の結果としての刺激された初代ヒトＴ細胞のＩＦＮ－γの分泌を示す。試験抗体をキー内に示す。エラーバーは、三重反復ウェルのＳＥＭを表す。
【図8】ＡＺＤ７７８９は、アポトーシス腫瘍細胞の樹状細胞のエフェロサイトーシスを強化し得ることを示す。図８Ａは、試験抗体を投与した後の又は薬物投与なしでの、実時間（時間）でのアポトーシスＪｕｒｋａｔ細胞の樹状細胞のエフェロサイトーシスを示す。図８Ｂは、試験抗体投与後のエフェロサイトーシスの倍数変化を示す。エフェロサイトーシスの倍数変化は、薬物治療なしの群から決定した。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図9】試験抗体の存在下又は不在下でアポトーシス腫瘍細胞と共にプレインキュベートされた樹状細胞と共培養した後の、初代ヒトＴ細胞からのＴ細胞増殖のパーセントを示す。図９Ａは、アポトーシスＭＡＲＴ－１を発現するＪｕｒｋａｔ細胞とプレインキュベートされた樹状細胞と共培養した後の、ＭＡＲＴ－１反応性Ｔ細胞の増殖のパーセントを示す。図９Ｂは、アポトーシスＣＭＶｐｐ６５を発現するＪｕｒｋａｔ細胞とプレインキュベートされた樹状細胞と共培養した後の、ＣＭＶｐｐｐ６５反応性Ｔ細胞の増殖のパーセントを示す。
【図11】ＡＺＤ７７８９による治療の結果、抗ＰＤ－１ ｍＡｂの単体又は二価ｍＡｂとしての若しくは二重特異性フォーマットにおける、ホスファチジルセリンをブロックする抗ＴＩＭ－３分子との組み合わせによる治療と比較して、ヒト化マウスインビボモデルにおける腫瘍成長が低減することを示す。図１１Ａは、第１のドナーに試験抗体を投与した後の腫瘍容積を示す。図１１Ｂは、別のドナーに試験抗体を投与した後の腫瘍容積を示す。水平バーは、群内の相加平均腫瘍容積を表す。
【図12】ＡＺＤ７７８９の投与は、エクスビボで刺激された、抗ＰＤ－１治療が進行したマウスから採取された腫瘍浸潤リンパ球のＩＦＮ－γ分泌を増加させることを示す。図１２Ａは、ヒト化マウスモデルにおける、腫瘍容積に対する抗ＰＤ－１抗体投与の結果及び試験薬物による切除した腫瘍のエクスビボ刺激を示す研究の概略図である。図１２Ｂは、アイソタイプ対照と比較した、抗ＰＤ－１抗体ＬＯ１１５及びＡＺＤ７７８９を添加した後の、エクスビボで刺激された腫瘍浸潤リンパ球のＩＦＮ－γ分泌の倍数変化の集計を示す。図１２Ｃは、アイソタイプ対照と比較した、抗ＰＤ－１抗体ＬＯ１１５及びＡＺＤ７７８９を添加した後の、ある代表的なマウスから採取された、エクスビボで刺激された腫瘍浸潤リンパ球のＩＦＮ－γ分泌の増加を示す。
【図13A】ヒトＰＣ９－ＭＡＲＴ－１腫瘍細胞を皮下移植されたヒト化免疫不全マウスにおける、アイソタイプ対照、ＡＺＤ７７８９、抗ＰＤ－１ ＬＯ１１５抗体単体及びＡＺＤ７７８９の順次治療が後続する抗ＰＤ－１による治療後の腫瘍成長曲線を示すグラフである。
【図13B-13C】抗ＰＤ－１抗体治療に後続するＡＺＤ７７８９による順次治療は、抗ＰＤ－１抗体のみによる継続的治療と比較して、マウスにおける腫瘍成長を遅延させ得ることを示す。図１３Ｂは、アイソタイプ対照による治療、抗ＰＤ－１抗体ＬＯ１１５による継続的治療及び抗ＰＤ－１抗体治療に後続するＡＺＤ７７８９による順次治療後の腫瘍容積の変化を示す。図１３Ｃは、抗ＰＤ－１抗体治療に後続するＡＺＤ７７８９による順次治療と比較した、抗ＰＤ－１抗体ＬＯ１１５による継続的治療後の腫瘍容積の倍数変化を示す。
【図14】ＡＺＤ７７８９の提案される作用機序を示す概略図である。
【図15】図１５Ａは、Ｃａ＋＋と結合したヒトＴＩＭ－３ ＩｇＶドメインのリボンダイアグラムである。図１５Ｂは、Ｃａ＋＋と結合したヒトＴＩＭ－３ ＩｇＶドメインの表面図である。鎖は、大文字で標識され、ループ（ＢＣ、ＣＣ’、Ｃ’Ｃ’’、ＤＥ及びＦＧ）は、イタリックで強調表示されている。ホスファチジルセリンは、ループＣＣ’及びＦＧによって画定されるドメインのクレフト内に結合する。
【発明を実施するための形態】
【0026】
本開示がより容易に理解され得るようにするために、特定の用語が最初に定義される。本願で使用される場合、本明細書中で他に明らかに提供される場合を除き、以下の各用語は、以下で示す意味を有するものとする。本願全体を通して更なる定義が示される。
【0027】
５．１ 用語
「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子であって、この免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１箇所の抗原認識部位を介して、標的（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質又は前述の組み合わせ）を認識して特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書中で用いられる用語「抗体」は、その抗体が所望の生物学的活性を示す限り、インタクトポリクローナル抗体、インタクトモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体を含む融合タンパク質及び他のあらゆる修飾免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ又はそれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）（それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ及びミューと呼ばれる重鎖定常ドメインの同一性に基づく）のいずれかであり得る。免疫グロブリンの異なるクラスは、異なる周知のサブユニット構造及び３次元立体配置を有する。抗体は、裸抗体であり得るか、又は例えば毒素、放射性同位体などの他の分子にコンジュゲートされ得る。
「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子であって、この免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１箇所の抗原認識部位を介して、標的（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質又は前述の組み合わせ）を認識して特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書中で用いられる用語「抗体」は、その抗体が所望の生物学的活性を示す限り、インタクトポリクローナル抗体、インタクトモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体を含む融合タンパク質及び他のあらゆる修飾免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ又はそれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）（それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ及びミューと呼ばれる重鎖定常ドメインの同一性に基づく）のいずれかであり得る。免疫グロブリンの異なるクラスは、異なる周知のサブユニット構造及び３次元立体配置を有する。抗体は、裸抗体であり得るか、又は例えば毒素、放射性同位体などの他の分子にコンジュゲートされ得る。
【0028】
明示的に記載されていない場合且つ文脈がそうでないことを示さない限り、用語「抗体」は、単一特異性、二重特異性又は多重特異性抗体及び単鎖抗体を含む。いくつかの態様では、抗体は、二重特異性抗体である。用語「二重特異性抗体」とは、２つの異なるエピトープに結合する抗体を指す。エピトープは、同じ標的抗原上にあり得るか又は異なる標的抗原上にあり得る。
【0029】
用語「抗体フラグメント」は、インタクト抗体の一部分を指す。「抗原結合フラグメント」、「抗原結合ドメイン」又は「抗原結合領域」は、抗原に結合するインタクト抗体の一部分を指す。二重特異性抗体に関連して、抗原結合フラグメントは、２つの抗原に結合する。抗原結合フラグメントは、インタクト抗体の抗原認識部位を含有し得る（例えば、抗原に特異的に結合するのに十分な相補性決定領域（ＣＤＲ））。抗体の抗原結合フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメント、線状抗体並びに単鎖抗体が挙げられるが、これらに限定されない。抗体の抗原結合フラグメントは、げっ歯類（例えば、マウス、ラット又はハムスター）及びヒトなどのあらゆる動物種から得ることもできるし、人工的に生成することもできる。
【0030】
「モノクローナル」抗体又はその抗原結合フラグメントは、単一の抗原決定基又はエピトープの高度に特異的な結合に関与する均質な抗体又は抗原結合フラグメントの集団を指す。これは、様々な抗原決定基に対して向けられる様々な抗体を典型的に含むポリクローナル抗体と対照的である。用語「モノクローナル」抗体又はその抗原結合フラグメントは、インタクトなモノクローナル抗体及び完全長のモノクローナル抗体の双方並びに抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単鎖（ｓｃＦｖ）変異体、抗体部分を含む融合タンパク質及び抗原認識部位を含む他のあらゆる修飾免疫グロブリン分子を包含する。更に、「モノクローナル」抗体又はその抗原結合フラグメントは、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現及びトランスジェニック動物によるものが挙げられるが、これらに限定されない任意の数の方法で製造されるような抗体及びその抗原結合フラグメントを指す。
【0031】
いくつかの態様では、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合フラグメントは、多価分子である。本願中で使用するとき、用語「価」とは、抗体分子中に指定された数の結合部位が存在することを示す。本発明の、例えば天然の抗体又は完全長抗体は、２つの結合部位を有し、これは「二価」である。用語「四価」は、抗原結合タンパク質中に４つの結合部位が存在することを示す。用語「三価」は、抗体分子中に３つの結合部位が存在することを示す。本明細書で使用するとき、用語「二重特異性、四価」は、４つの抗原結合部位を有し、その少なくとも１つが第１の抗原に結合し、少なくとも１つが第２の抗原又は抗原の別のエピトープに結合する、本発明の抗原結合タンパク質を示す。
【0032】
本明細書で使用する用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、互換的に使用され、当技術分野において一般的である。可変領域は、典型的には、抗体の一部分、広義には軽鎖又は重鎖の一部分、典型的には成熟重鎖内のアミノ末端の約１１０～１２０個のアミノ酸又は１１０～１２５個のアミノ酸及び成熟軽鎖内の約９０～１１５個のアミノ酸を指し、これらは抗体間で配列が異なり、そしてその特定の抗原に対する特定の抗体の結合及び特異性において用いられる。配列の可変性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる領域中に集中しており、一方、可変ドメイン中のより高度に保存された領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。いかなる特定の機序にも理論にも縛られることを望むものではないが、軽鎖及び重鎖のＣＤＲは、主に抗体と抗原との相互作用及び特異性を担うものと考えられる。本開示のいくつかの態様では、可変領域はヒト可変領域である。本開示のいくつかの態様では、可変領域は、げっ歯類又はネズミ科のＣＤＲ及びヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。本開示の特定の態様では、可変領域は霊長類（例えば非ヒト霊長類）の可変領域である。本開示のいくつかの態様では、可変領域は、げっ歯類又はネズミ科のＣＤＲ及び霊長類（例えば非ヒト霊長類）のフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。
【0033】
用語「ＶＬ」及び「ＶＬドメイン」は、互換的に用いられ、抗体の軽鎖可変領域を指す。
【0034】
用語「ＶＨ」及び「ＶＨドメイン」は、互換的に用いられ、抗体の重鎖可変領域を指す。
【0035】
用語「Ｋａｂａｔ付番」及び同様の用語は、当技術分野で認識されており、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域又はそれらの抗原結合フラグメントのアミノ酸残基を付番する方式を指す。いくつかの態様では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番方式に従って決定することができる（例えば、Ｋａｂａｔ ＥＡ＆Ｗｕ ＴＴ（１９７１）Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９０：３８２－３９１ ａｎｄ Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２を参照されたい）。Ｋａｂａｔ付番方式を使用すると、抗体重鎖分子内のＣＤＲは、典型的には、アミノ酸３１位～３５位（ＣＤＲ１）（３５位の後に続く１つ又は２つの追加のアミノ酸（Ｋａｂａｔ付番スキームでは３５Ａ及び３５Ｂと称する）を任意選択的に含み得る）、アミノ酸５０位～６５位（ＣＤＲ２）及びアミノ酸９５位～１０２位（ＣＤＲ３）に存在する。Ｋａｂａｔ付番方式を使用すると、抗体軽鎖分子内のＣＤＲは、典型的には、アミノ酸２４位～３４位（ＣＤＲ１）、アミノ酸５０位～５６位（ＣＤＲ２）及びアミノ酸８９位～９７位（ＣＤＲ３）に存在する。本開示のいくつかの態様では、本明細書に記載される抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番スキームに従って決定されている。
【0036】
Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造ループの位置を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））。Ｋａｂａｔ付番規則を使用して付番した場合のＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ１ループの末端は、このループの長さに応じてＨ３２～Ｈ３４で変化する（これは、Ｋａｂａｔ付番スキームがＨ３５Ａ及びＨ３５Ｂに挿入を置くためであり、３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、このループは、３２で終わり、３５Ａのみが存在する場合、このループは、３３で終わり、３５Ａ及び３５Ｂの両方が存在する場合、このループは、３４で終わる）。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループとの間の妥協案を示し、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって用いられる。
【0037】
本明細書で使用するとき、用語「定常領域」及び「定常ドメイン」は、互換的であり、当技術分野における一般的な意味を有する。定常領域は、抗体部分、例えば、抗体の、抗原への結合に直接的には関与しないが、Ｆｃ受容体との相互作用などの種々のエフェクタ機能を示し得る軽鎖及び／又は重鎖のカルボキシル末端部分である。免疫グロブリン分子の定常領域は一般に、免疫グロブリン可変ドメインと比較して、より保存されたアミノ酸配列を有する。
【0038】
本明細書で使用する用語「重鎖」は、抗体に関して使用する場合、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、任意の別個のタイプ、例えば、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）及びミュー（μ）を指すことができ、これによりＩｇＧのサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む抗体のＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭクラスがそれぞれ生じる。重鎖アミノ酸配列は、当技術分野で公知である。本開示のいくつかの態様では、重鎖はヒト重鎖である。
【0039】
本明細書で使用する用語「軽鎖」は、抗体に関して使用する場合、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、任意の別個のタイプ、例えばκ（カッパ）又はλ（ラムダ）を指すことができる。軽鎖アミノ酸配列は、当技術分野で公知である。本開示のいくつかの態様では、軽鎖はヒト軽鎖である。
【0040】
本明細書で使用するとき、用語「プログラム死１」、「プログラム細胞死１」及び「ＰＤ－１」は互換的に用いられる。完全なＰＤ－１配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０１２１１０．１で見ることができる。ヒトＰＤ－１タンパク質のアミノ酸配列は、
である。
【化1】
【0041】
プログラム死－１（「ＰＤ－１」）は、Ｔ細胞調節因子の拡張ＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４ファミリーの約３１ｋＤのＩ型膜タンパク質メンバーである（Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ ＰＤ－１，Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｍｂｅｒ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，Ｕｐｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ，”ＥＭＢＯ Ｊ．１１：３８８７－３８９５を参照されたい）。
【0042】
ＰＤ－１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞及び単球上で発現する（Ａｇａｔａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＰＤ－１ Ａｎｔｉｇｅｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｔ ａｎｄ Ｂ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，”Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８（５）：７６５－７７２；Ｍａｒｔｉｎ－Ｏｒｏｚｃｏ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２００７）“Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉ－Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，”Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．１７（４）：２８８－２９８）。ＰＤ－１は、ＰＤＬ－１又はＰＤＬ－２の結合による活性化に続く免疫系のダウンレギュレーションを担う受容体であり（Ｍａｒｔｉｎ－Ｏｒｏｚｃｏ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２００７）“Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉ－Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，”Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．１７（４）：２８８－２９８）、細胞死誘導物質として機能する（Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）“Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＤ－１，Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，Ｕｐｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ，”ＥＭＢＯ Ｊ．１１：３８８７－３８９５；Ｓｕｂｕｄｈｉ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００５）“Ｔｈｅ Ｂａｌａｎｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ：Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｖｅｒｓｅ Ｃｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｍｅｄ．８３：１９３－２０２））。このプロセスは、ＰＤ－Ｌ１の過剰発現を介して多数の腫瘍において利用され、免疫応答の抑制をもたらす。
【0043】
ＰＤ－１は、腫瘍学における免疫媒介療法のために十分に検証された標的であり、とりわけ黒色腫及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療の臨床試験から有望な結果をもたらしている。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ－１相互作用の拮抗的阻害は、Ｔ細胞活性化を高め、宿主免疫系による腫瘍細胞の認識及び排除を増強する。感染症及び腫瘍を治療し、且つ適応免疫応答を強化するための抗ＰＤ－１抗体の使用が提案されている（例えば、米国特許第７，５２１，０５１号明細書；同第７，５６３，８６９号明細書；同第７，５９５，０４８号明細書を参照されたい）。
【0044】
プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）も、Ｔ細胞活性化の制御に関与する受容体及びリガンドの複合系の一部である。正常な組織において、ＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、間葉幹細胞、骨髄由来マスト細胞並びに様々な非造血性細胞上で発現する。その正常な機能は、その２つの受容体：プログラム死１（別名ＰＤ－１又はＣＤ２７９）及びＣＤ８０（別名Ｂ７－１又はＢ７．１）との相互作用を介してＴ細胞の活性化と寛容性とのバランスを制御することである。ＰＤ－Ｌ１は、腫瘍によっても発現され、複数の部位で作用して、宿主免疫系による検出及び排除を腫瘍が回避することを促進する。ＰＤ－Ｌ１は、高頻度で非常に多種の癌に発現される。一部の癌において、ＰＤ－Ｌ１の発現は、生存率の低減及び不都合な予後に関連している。ＰＤ－Ｌ１とその受容体との相互作用をブロックする抗体は、ＰＤ－Ｌ１依存性免疫抑制効果を軽減し、抗腫瘍Ｔ細胞の細胞傷害性活性をインビトロで増強することができる。デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）は、ＰＤ－１及びＣＤ８０受容体の両方とＰＤ－Ｌ１との結合をブロックすることができる、ヒトＰＤ－Ｌ１に対するヒトモノクローナル抗体である。感染症及び腫瘍を治療し、且つ適応免疫応答を強化するための抗ＰＤ－Ｌ１抗体の使用が提案されている（例えば、米国特許第８，７７９，１０８号明細書及び同第９，４９３，５６５号明細書（参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照されたい）。
【0045】
本明細書で使用するとき、用語「Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有タンパク質３」及び「ＴＩＭ－３」は互換的に使用され、ヒトＴＩＭ－３のバリアント、イソ型、種ホモログを含む。ＴＩＭ－３はタイプＩ細胞表面糖タンパク質であり、Ｎ末端免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、膜付近にＯ－結合グリコシル化及びＮ－結合グリコシル化を有するムチンドメイン、単一の膜貫通ドメイン並びにチロシンリン酸化モチーフを有する細胞質領域を含む。ＴＩＭ－３は、Ｔ細胞／膜貫通、免疫グロブリン及びムチン（ＴＩＭ）遺伝子ファミリーのメンバーである。ヒトＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのアミノ酸配列は、
である。
【化2】
【0046】
シグナルペプチドを含むヒトＴＩＭ－３タンパク質のアミノ酸配列は、
である。
【化3】
【0047】
Ｔ細胞阻害性受容体ＴＩＭ－３（Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３）は、ＩＦＮ－γ産生ＣＤ４＋ヘルパー１（Ｔｈ１）及びＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性１（Ｔｃ１）Ｔ細胞に発現されることから、抗腫瘍免疫の調節においてある役割を果たす。これは、当初、特にＴｈ１及びＴｃ１ Ｔ細胞応答の持続時間及び大きさを制限するために機能する免疫チェックポイント受容体として作用するＴ細胞阻害性受容体として同定された。更なる研究により、ＴＩＭ－３経路がＰＤ－１経路と協同して、癌におけるＣＤ８＋Ｔ細胞中に重度の機能不全表現型の発生を促進し得ることが特定された。これは、特定の癌の調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）でも発現されている。ＴＩＭ－３は、マウス肥満細胞、マクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）の亜集団、ＮＫ及びＮＫＴ細胞、並びにヒト単球を含む自然免疫系の細胞上、並びにマウスの初代気管支上皮細胞株上でも発現される。ＴＩＭ－３は、阻害シグナルを生成してＴｈ１及びＴｃ１細胞のアポトーシスをもたらすことができ、アポトーシス細胞の食作用及び抗原の交差提示を媒介することができる。
【0048】
ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインの結晶構造は、ジスルフィド結合によって結合される２つの逆平行βシートの存在を示す。４つの非カノニカルなシステインによって形成された２つの追加的ジスルフィド結合は、ＩｇＶドメインを安定化させ、ＣＣ’ループをＦＧループに向けて再配向し、それにより、リガンドの結合に関与すると考えられており、他のＩｇＳＦメンバー中には見ることのできない「クレフト」構造を形成する。代わりに、この「クレフト」集合体は、ＴＩＭ－１及びＴＩＭ－４を含む全てのＴＩＭファミリータンパク質中で確認されるシグネチャー構造である。適切なリガンドによるＩｇＶドメインのエンゲージメントは、ＴＩＭ－３の免疫調節の役割に重要であることが判明しており、抗腫瘍免疫の末梢寛容及び抑制の誘導に有益である。ＴＩＭ－３のＣ’Ｃ’’ループは、ベータ鎖Ｃ’の後且つベータ鎖Ｃ’’の前のアミノ酸、例えばアミノ酸５０～５４を伴う。ＤＥループは６４～７３のアミノ酸からなり、ＣＣ’ループ及びＦＧループはアミノ酸３５～４３及び９２～９９をそれぞれ含む。
【0049】
ＴＩＭ－３はいくつかの既知のリガンド、例えばガレクチン－９、ホスファチジルセリン、ＣＥＡＣＡＭ１及びＨＭＧＢ１を有する。ガレクチン－９は、長い可撓性リンカーによって接合された２つの異なる炭水化物認識ドメインを備えるＳ型レクチンであり、より大きいポリ－Ｎ－アセチルラクトサミン含有構造に対して強化された親和性を有する。ガレクチン－９は、シグナル配列を有さず、細胞質中に局在化している。しかしながら、これは、分泌され得、その炭水化物鎖を介して標的細胞の表面上の糖タンパク質に結合することによってその機能を発揮する（Ｆｒｅｅｍａｎ Ｇ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１０ Ｃａｎ；２３５（１）：１７２－８９）。結合の研究、変異誘発性及び共結晶構造に基づき、ヒト及びマウスの両方のＴＩＭ－３がホスファチジルセリンの受容体であることが示されており、またＴＩＭ－３発現細胞がホスファチジルセリンを発現するアポトーシス細胞に結合し、且つ／又はそれを取り込んだことが示されている。結合部位がＩｇＶドメインの両側にあることが判明したため、ＴＩＭ－３とホスファチジルセリンとの相互作用は、ガレクチン－９との相互作用を除外しない。
【0050】
いくつかの癌で免疫抑制されている主要な免疫細胞集団へのＴＩＭ－３経路の関与を考慮すれば、これは、癌免疫療法の魅力的な候補となる。Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｃ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．，（２０１４） ２：３９３－３９８；及びＦｅｒｒｉｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１４）１９３：１５２５－１５３０を参照されたい。
【0051】
用語「キメラ」抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列が２つ以上の種に由来する抗体又はその抗原結合フラグメントを指す。典型的には、軽鎖及び重鎖双方の可変領域は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ等）の一種に由来する、所望される特異性、親和性及び能力を有する抗体又はその抗原結合フラグメントの可変領域に対応する一方で、定常領域は、別の種（通常はヒト）における免疫応答を誘発することを回避するために、その種に由来する抗体又はその抗原結合フラグメント内の配列に相同である。
【0052】
用語「ヒト化」抗体又はその抗原結合フラグメントは、最小限の非ヒト（例えばネズミ科）配列を含む特定の免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン又はそのフラグメントである、非ヒト（例えばネズミ科）抗体又は抗原結合フラグメントの形態を指す。典型的には、ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター）のＣＤＲの残基によって相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が置換されている（「ＣＤＲグラフト化」）ヒト免疫グロブリンである（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４－１５３６（１９８８））。場合によっては、ヒト免疫グロブリンの特定のＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種由来の抗体又はフラグメント中の対応する残基で置換される。ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｆｖフレームワーク領域にある、且つ／又は非ヒトＣＤＲ残基内にある追加の残基の置換によって更に修飾されて、抗体又はその抗原結合フラグメントの特異性、親和性及び／又は能力を洗練し最適化することができる。一般に、ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てを含有する可変ドメインを含むことになるが、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含み得る。ヒト化抗体を生成するのに用いられる方法の例は、米国特許第５，２２５，５３９号明細書、Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１（３）：９６９－９７３（１９９４）及びＲｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１０）：８９５－９０４（１９９６）に記載されている。本開示のいくつかの態様では、「ヒト化抗体」は、再表面化抗体である。
【0053】
用語「ヒト」抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト免疫グロブリン遺伝子座から誘導されたアミノ酸配列を有する抗体又はその抗原結合フラグメントを意味し、このような抗体又は抗原結合フラグメントは、当技術分野で既知の任意の技法を用いて作製される。ヒト抗体又はその抗原結合フラグメントのこの定義は、インタクトな抗体又は完全長の抗体及びそれらのフラグメントを含む。
【0054】
「結合親和性」は、一般に、分子（例えば抗体又はその抗原結合フラグメント）の単一の結合部位と、その結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合性の相互作用の合計の強度を指す。特に指定されない限り、本明細書中で用いられる「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントと抗原）間の１：１相互作用を反映する内因性結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（ＫＤ）によって表され得る。親和性は、平衡解離定数（ＫＤ）及び平衡結合定数（ＫＡ）が挙げられるが、これらに限定されない、当技術分野で既知の多くの方法で測定し、且つ／又は表すことができる。ＫＤはｋｏｆｆ／ｋｏｎの商から計算され、一方でＫＡはｋｏｆｆ／ｋｏｎの商から計算される。ｋｏｎは、例えば抗体又はその抗原結合フラグメントの抗原に対する結合速度定数を指し、ｋｏｆｆは、例えば抗体又はその抗原結合フラグメントの抗原からの解離を指す。ｋｏｎ及びｋｏｆｆは、当業者に既知の技法、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）又はＫｉｎＥｘＡによって決定することができる。
【0055】
本明細書中で用いられる「エピトープ」は、当技術分野の用語であり、抗体又はその抗原結合フラグメントが特異的に結合し得る抗原の局所領域を指す。エピトープは、例えば、ポリペプチド（直鎖状であるか又は連続したエピトープ）の連続アミノ酸であり得るか、又はエピトープは、例えば、ポリペプチドの２つ以上の非連続領域から一体となり得る（コンフォメーションエピトープ、非直鎖状エピトープ、不連続エピトープ又は非連続エピトープ）。本開示のいくつかの態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントが特異的に結合するエピトープは、例えば、ＮＭＲ分光法、Ｘ線回折結晶解析研究、ＥＬＩＳＡアッセイ、水素／重水素交換質量分析法（例えば、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析法）、アレイベースのオリゴペプチドスキャニングアッセイ及び／又は変異誘発マッピング（例えば、部位特異的変異誘発マッピング）によって決定することができる。Ｘ線結晶構造解析の場合、結晶化は、当技術分野で既知の方法のいずれかを使用して達成され得る（例えば、Ｇｉｅｇｅ Ｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５０（Ｐｔ ４）：３３９－３５０；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ａ（１９９０）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １８９：１－２３；Ｃｈａｙｅｎ ＮＥ（１９９７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：１２６９－１２７４；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ａ（１９７６） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５１：６３００－６３０３）。抗体／その抗原結合フラグメント：抗原の結晶は、周知のＸ線回折技術を用いて研究することができ、且つコンピューターソフトウェア、例えばＸ－ＰＬＯＲ（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、１９９２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃにより配布される；例えば、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８５）ｖｏｌｕｍｅｓ １１４＆１１５，ｅｄｓ Ｗｙｃｋｏｆｆ ＨＷ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．２００４／００１４１９４）及びＢＵＳＴＥＲ（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ Ｇ（１９９３）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ４９（Ｐｔ １）：３７－６０；Ｂｒｉｃｏｇｎｅ Ｇ（１９９７）Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２７６Ａ：３６１－４２３，ｅｄ Ｃａｒｔｅｒ ＣＷ；Ｒｏｖｅｒｓｉ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５６（Ｐｔ １０）：１３１６－１３２３を参照されたい）を用いて精製することができる。変異誘発マッピング研究は、当業者に既知の任意の方法を用いて達成され得る。例えば、アラニンスキャニング変異誘発技術を含む変異誘発技術の説明については、Ｃｈａｍｐｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：１３８８－１３９４及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＢＣ＆Ｗｅｌｌｓ ＪＡ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１－１０８５を参照されたい。
【0056】
参照抗体と「同じエピトープに結合する」抗体は、参照抗体と同じアミノ酸残基に結合する抗体を指す。抗体の、参照抗体と同一エピトープに結合する能力は、水素／重水素交換アッセイ（Ｃｏａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００９；２３：６３９－６４７を参照されたい）又はＸ線結晶構造解析により決定され得る。
【0057】
抗体は、それが所与のエピトープへの参照抗体の結合をある程度ブロックする限り、そのエピトープ又は重複エピトープに優先的に結合する場合、所与のエピトープに対する参照抗体の結合を「競合的に阻害する」又は「交差競合する」と言われる。競合的阻害は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば競合ＥＬＩＳＡアッセイにより判定され得る。抗体は、所与のエピトープへの参照抗体の結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％又は少なくとも５０％競合的に阻害すると言うことができる。
【0058】
「単離」されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞又は組成物は、天然に見られない形態のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞又は組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞又は組成物として、もはや天然に見出される形態ではない程度まで精製されているものが挙げられる。本開示のいくつかの態様では、単離されている抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞又は組成物は、実質的に純粋である。本明細書で使用する「実質的に純粋」は、少なくとも５０％純粋（すなわち夾雑物を含まない）、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％純粋又は少なくとも９９％純粋な材料を指す。
【0059】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では、あらゆる長さのアミノ酸のポリマーに言及するために互換的に使用される。ポリマーは、直鎖又は分岐鎖であり得、修飾アミノ酸を含み得、非アミノ酸によって中断され得る。この用語は、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば標識成分とのコンジュゲーションにより、天然に又は介在により修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸の１つ又は複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）及び当技術分野で公知の他の修飾を含有するポリペプチドも定義の範囲に含まれる。本開示のポリペプチドは、抗体に基づくため、本開示のいくつかの態様では、ポリペプチドは、単鎖又は結合鎖として存在し得ることが理解される。
【0060】
本明細書で使用するとき、用語「ＡＺＤ７７８９」は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖並びに配列番号２０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む抗ＴＩＭ－３／ＰＤ－１二重特異性抗体を指す。ＡＺＤ７７８９は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第１０，４５７，７３２号明細書に開示されている。本明細書で論じられるモノクローナル抗体Ｏ１３－１及びクローン６２の配列も、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第１０，４５７，７３２号明細書に開示されている。
【0061】
本明細書で使用するとき、用語「医薬配合物」は、活性成分の生物活性が有効となるのを可能にするような形態であり、且つ配合物が投与されることになる対象に対して許容できないほど毒性の高い追加の成分を含有しない製剤を指す。配合物は無菌であり得る。
【0062】
「投与する」、「投与すること」、「投与」などの用語は、本明細書で使用するとき、抗ＴＩＭ－３／ＰＤ－１結合タンパク質（例えば抗体又はその抗原結合フラグメント）などの薬物を所望の生物学的作用部位に送達することを可能にするために使用され得る方法（例えば、静脈内投与）を指す。本明細書に記載される薬剤及び方法と共に用いることのできる投与技法は、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｃｕｒｒｅｎｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ；及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃｕｒｒｅｎｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａに見出される。
【0063】
本明細書で使用される場合、「組み合わせて」又は「組み合わせて投与される」という用語は、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを１つ又は複数の追加の治療薬と共に投与することができることを意味する。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、１つ又は複数の更なる治療剤と共に同時に又は逐次的に投与され得る。いくつかの態様では、本明細書中に記載される抗体又はその抗原結合フラグメントは、同じ組成物又は異なる組成物において１つ又は複数の更なる治療剤と共に投与され得る。
【0064】
本明細書で使用する用語「対象」及び「患者」は、互換的に用いられる。対象は、動物であり得る。本開示のいくつかの態様では、対象は、哺乳動物、例えば非ヒト動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、マウス、サル又は他の霊長類など）である。本開示のいくつかの態様では、対象は、カニクイザルである。本開示のいくつかの態様では、対象は、ヒトである。
【0065】
用語「治療有効量」は、対象の疾患又は障害を治療するのに有効な薬物、例えば抗ＴＩＭ－３／ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントの量を指す。「治療する」、「治療」、「治療すること」、「軽減する」及び「軽減すること」などの用語は、病状又は障害を治癒し、減速させ、その症状を緩和し、且つ／又はその進行を停止させる治療的手段を指す。したがって、治療を必要とする者には、障害を有すると既に診断されたか又は障害を有することが疑われる者が含まれる。
【0066】
本開示及び特許請求の範囲で使用するとき、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、文脈上特に明確に指示されない限り、複数形を含む。
【0067】
本明細書中で本開示の態様が「含む」という語と共に説明されるときは、常に「～からなる」及び／又は「～から本質的になる」という用語で説明される、他の点では類似の態様も提供されることを理解されたい。
【0068】
特に明記されていない限り又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用する場合、「又は」という用語は、包括的であると理解される。「及び／又は」という用語は、本明細書において「Ａ及び／又はＢ」などの語句で使用される場合、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」の両方、「Ａ」及び「Ｂ」を含むものとする。同様に、「及び／又は」という用語は、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」などの語句で使用される場合、以下の態様の各々を包含するものとする：Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）。
【0069】
本明細書で使用するとき、「約」及び「およそ」という用語は、数値又は数範囲を修飾するために用いられる場合、その値又は範囲から５％～１０％上及び５％～１０％下の偏差が、列挙された値又は範囲の意図された意味の内に留まることを示す。
【0070】
本明細書で提供される組成物又は方法のいずれも、本明細書で提供される他の組成物及び方法のいずれかの１つ以上と組み合わせることができる。
【0071】
単位、接頭辞及び記号は、これらの国際単位系（ＳＩ）で認められている形態で表記される。数値範囲には、この範囲を画定する数字が含まれる。本明細書中で提供される見出しは、全体として本明細書を参照することによって得ることのできる本開示の様々な態様を限定するものではない。したがって、直下に定義される用語は、本明細書全体を参照することによってより詳細に定義される。
【0072】
５．２ 本開示の方法
いくつかの態様では、本開示は、ＰＤ－１及びＴＩＭ－３を同時に標的化する、新規な抗癌剤ＡＺＤ７７８９の治療方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ＩＯ獲得耐性を有する患者にＡＺＤ７７８９を用いる方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、ＰＤ－１及びＴＩＭ－３を同時に標的化する、新規な抗癌剤ＡＺＤ７７８９の治療方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ＩＯ獲得耐性を有する患者にＡＺＤ７７８９を用いる方法を提供する。
【0073】
Ｘ線回折結晶解析研究により、ＴＩＭ－３のアームは、ＴＩＭ－３の免疫グロブリン可変（ＩｇＶ）細胞外ドメイン上の固有のエピトープに結合するため、ＡＺＤ７７８９のＴＩＭ－３のアームは、他の臨床的抗ＴＩＭ－３剤（例えばモノクローナル抗体）と異なることが明らかになった。このエピトープは、ホスファチジルセリン結合（ＦＧ－ＣＣ’ループ）クレフトの外部にあり、アミノ酸Ｎ１２（Ｈ結合）、Ｌ４７、Ｒ５２（塩橋）、Ｄ５３（Ｈ結合）、Ｖ５４、Ｎ５５、Ｙ５６、Ｗ５７、Ｗ６２、Ｌ６３）Ｈ結合）、Ｎ６４（Ｈ結合）、Ｇ６５、Ｄ６６（Ｈ結合）、Ｆ６７、Ｒ６８（Ｈ結合、塩橋）、Ｋ６９（Ｈ結合、塩橋）、Ｄ７１、Ｔ７５、Ｅ７７（Ｈ結合）からなる。軽鎖からのパラトープは、ＣＤＲ１の残基２８～３１、ＣＤＲ２の４８～５３及びＣＤＲ３の残基９２を含む。重鎖からのパラトープは、ＣＤＲ１の残基３０～３３、ＣＤＲ２の５２～５７及びＣＤＲ３の１００～１０８を含む。
【0074】
ＡＺＤ７７８９のＴＩＭ－３結合アームは、ホスファチジルセリン結合とは反対側の部位でＩｇＶドメインに結合し、これらのループからの残基との相互作用に直接関与しない。したがって、ＡＺＤ７７８９は、ＴＩＭ－３とホスファチジルセリンとの相互作用をブロックしない。代わりに、ＡＺＤ７７８９は、ＴＩＭ－３とホスファチジルセリンとの間のエンゲージメントを増加させる。この固有の機序は、Ｔ細胞媒介性抗腫瘍反応を、ホスファチジルセリンブロッキング抗ＴＩＭ３ｍＡｂから観察されるものを超えて改善する。したがって、いくつかの態様では、本開示は、対象において、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有タンパク質３（ＴＩＭ－３）とホスファチジルセリン（ＰＳ）との間のエンゲージメントを変化させる方法であって、ＴＩＭ－３結合ドメインを含むＴＩＭ－３結合タンパク質を対象に投与することを含み、ＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＣ’Ｃ’’及びＤＥループに特異的に結合する、方法を提供する。
【0075】
Ａ．ＴＩＭ－３とＰＳとの間のエンゲージメントを変化させる方法
いくつかの態様では、本開示は、対象において、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有タンパク質３（ＴＩＭ－３）とホスファチジルセリン（ＰＳ）との間のエンゲージメントを変化させる方法を提供する。いくつかの態様では、方法は、本明細書に開示されるＴＩＭ－３結合ドメインを含むＴＩＭ－３結合タンパク質を対象に投与することを含む。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３の免疫グロブリン可変（ＩｇＶ）ドメインのＣ’Ｃ’’及びＤＥループに特異的に結合する。
いくつかの態様では、本開示は、対象において、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有タンパク質３（ＴＩＭ－３）とホスファチジルセリン（ＰＳ）との間のエンゲージメントを変化させる方法を提供する。いくつかの態様では、方法は、本明細書に開示されるＴＩＭ－３結合ドメインを含むＴＩＭ－３結合タンパク質を対象に投与することを含む。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３の免疫グロブリン可変（ＩｇＶ）ドメインのＣ’Ｃ’’及びＤＥループに特異的に結合する。
【0076】
本明細書に開示される、対象においてＴＩＭ－３とＰＳとの間のエンゲージメントを変化させる方法のいくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、対象における抗腫瘍活性を増加させる。いくつかの態様では、抗腫瘍活性は、結合タンパク質（例えば、抗体）なしの投与と比較して増加する。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＰＳ結合クレフト（ＦＧ及びＣＣ’ループ）に結合するＴＩＭ－３結合タンパク質の投与と比較して、対象における抗腫瘍活性を増加させる。
【0077】
いくつかの態様では、本開示は、対象においてＴ細胞媒介性抗腫瘍活性を増加させる方法を提供する。いくつかの態様では、対象においてＴ細胞媒介性抗腫瘍活性を増加させる方法は、本明細書に開示されるＴＩＭ－３結合ドメインを含むＴＩＭ－３結合タンパク質を対象に投与することを含む。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＣ’Ｃ’’及びＤＥループに特異的に結合する。
【0078】
本明細書に開示される対象においてＴ細胞媒介性抗腫瘍活性を増加させる方法のいくつかの態様では、前記対象における前記Ｔ細胞媒介性抗腫瘍活性は、結合タンパク質（例えば抗体）なしの投与と比較して増加する。いくつかの態様では、対象におけるＴ細胞媒介性抗腫瘍活性は、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＰＳ結合クレフト（ＦＧ及びＣＣ’ループ）に結合するＴＩＭ－３結合タンパク質の投与と比較して増加する。
【0079】
Ｂ．腫瘍抗原の樹状細胞のエフェロサイトーシス及び交差提示を増加させる方法
いくつかの態様では、本開示は、アポトーシス腫瘍細胞の樹状細胞食作用を増加させる方法を提供する。いくつかの態様では、本明細書に記載のＴＩＭ－３結合タンパク質を投与することにより、アポトーシス腫瘍細胞の樹状細胞エフェロサイトーシスが増加する。いくつかの態様では、アポトーシス腫瘍細胞の樹状細胞エフェロサイトーシスは、結合タンパク質（例えば抗体）なしの投与と比較して、対象において増加する。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＰＳ結合クレフト（ＦＧ及びＣＣ’ループ）に結合するＴＩＭ－３結合タンパク質の投与と比較して、対象におけるアポトーシス腫瘍細胞の樹状細胞エフェロサイトーシスを増加させる。
いくつかの態様では、本開示は、アポトーシス腫瘍細胞の樹状細胞食作用を増加させる方法を提供する。いくつかの態様では、本明細書に記載のＴＩＭ－３結合タンパク質を投与することにより、アポトーシス腫瘍細胞の樹状細胞エフェロサイトーシスが増加する。いくつかの態様では、アポトーシス腫瘍細胞の樹状細胞エフェロサイトーシスは、結合タンパク質（例えば抗体）なしの投与と比較して、対象において増加する。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＰＳ結合クレフト（ＦＧ及びＣＣ’ループ）に結合するＴＩＭ－３結合タンパク質の投与と比較して、対象におけるアポトーシス腫瘍細胞の樹状細胞エフェロサイトーシスを増加させる。
【0080】
いくつかの態様では、本開示は、対象において腫瘍抗原の樹状細胞交差提示を増加させる方法を提供する。交差提示とは、樹状細胞などの特定の抗原提示細胞が細胞外抗原を取り込み、プロセシングし、ＭＨＣクラスＩ分子と共にＣＤ８＋Ｔ細胞へ提示する能力である。このプロセスの結果であるクロスプライミングは、ナイーブな細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞へと刺激する。このプロセスは、抗原提示細胞に容易に感染しないが、末梢組織細胞に感染する大半の腫瘍及びウイルスに対する免疫に必要である。交差提示は、通常はＭＨＣ ＩＩによって樹状細胞の表面上に提示される外来性抗原の提示を、ＭＨＣ Ｉ経路を介しても提示されるようにするため、特に重要である。
【0081】
いくつかの態様では、本明細書に記載のＴＩＭ－３結合タンパク質を投与することにより、対象における腫瘍抗原の樹状細胞交差提示が増加する。いくつかの態様では、腫瘍抗原の樹状細胞交差提示は、結合タンパク質（例えば抗体）なしの投与と比較して増加する。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＰＳ結合クレフト（ＦＧ及びＣＣ’ループ）に結合するＴＩＭ－３結合タンパク質の投与と比較して、対象における腫瘍抗原の樹状細胞交差提示を増加させる。
【0082】
いくつかの態様では、本開示は、対象において腫瘍細胞の樹状細胞エフェロサイトーシスを促進する方法を提供する。対象において腫瘍細胞の樹状細胞エフェロサイトーシスを促進する方法のいくつかの態様では、方法は、本明細書に記載されるＴＩＭ－３結合ドメインを含むＴＩＭ－３結合タンパク質を対象に投与することを含む。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質は、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＣ’Ｃ’’及びＤＥループに特異的に結合する。
【0083】
いくつかの態様では、本開示は、対象において腫瘍抗原の樹状細胞交差提示を増加させる方法を提供する。いくつかの態様では、対象において腫瘍抗原の樹状細胞交差提示を増加させる方法は、本明細書に記載されるＴＩＭ－３結合ドメインを含むＴＩＭ－３結合タンパク質を対象に投与することを含む。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質は、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＣ’Ｃ’’及びＤＥループに特異的に結合する。いくつかの態様では、樹状細胞交差提示のレベルは、結合タンパク質（例えば抗体）なしの投与と比較して増加する。いくつかの態様では、樹状細胞交差提示のレベルは、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＰＳ結合クレフト（ＦＧ及びＣＣ’ループ）に結合するＴＩＭ－３結合タンパク質の投与と比較して増加する。
【0084】
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、本明細書に記載のＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、対象におけるＴＩＭ－３陽性Ｔ細胞へのエンゲージ時のＩＬ－２分泌を増加させる。いくつかの態様では、ＩＬ－２分泌は、結合タンパク質（例えば、抗体）なしの投与と比較して増加する。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＰＳ結合クレフト（ＦＧ及びＣＣ’ループ）に結合するＴＩＭ－３結合タンパク質の投与と比較して、対象におけるＴＩＭ－３陽性Ｔ細胞へのエンゲージ時のＩＬ－２分泌を増加させる。
【0085】
５．３ 患者集団
本明細書に開示される任意の方法、例えば、二重特異性抗体（例えばＡＺＤ７７８９）又はその抗原結合フラグメントを用いて、ヒト患者における癌（例えば扁平上皮又は非扁平上皮ＮＳＣＬＣ）を治療する方法が本明細書で提供される。いくつかの態様では、患者は、固形腫瘍を有する。いくつかの態様では、患者は、進行性又は転移性の固形腫瘍を有する。
本明細書に開示される任意の方法、例えば、二重特異性抗体（例えばＡＺＤ７７８９）又はその抗原結合フラグメントを用いて、ヒト患者における癌（例えば扁平上皮又は非扁平上皮ＮＳＣＬＣ）を治療する方法が本明細書で提供される。いくつかの態様では、患者は、固形腫瘍を有する。いくつかの態様では、患者は、進行性又は転移性の固形腫瘍を有する。
【0086】
いくつかの態様では、対象は、卵巣癌、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、膀胱癌、頭頸部癌、黒色腫、膵臓癌、腎細胞癌、肺癌、食道癌、胃癌、胆道腫瘍、尿路上皮癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群及び急性骨髄性白血病の１つ以上を有する。
【0087】
癌免疫療法（ＩＯ）獲得耐性を有する対象において癌を治療するための方法も本明細書で提供される。いくつかの態様では、対象は、ヒトである。
【0088】
いくつかの態様では、対象は、根治的外科手術又は放射線療法が適さないステージＩＩＩの癌を実証している。いくつかの態様では、対象はステージＩＶの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する。いくつかの態様では、ＮＳＣＬＣは、扁平上皮又は非扁平上皮ＮＳＣＬＣである。
【0089】
いくつかの態様では、癌免疫療法（ＩＯ）獲得耐性を有する対象は、単剤療法としての又は化学療法との組み合わせにおける、最低でも３～６ヶ月間の抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法による初期治療後、Ｘ線で実証された腫瘍進行又は臨床的悪化を有し、且つ初期の臨床的利益、すなわち疾患の安定化又は退縮の兆候を有していた。
【0090】
いくつかの態様では、抗ＰＤ－１療法は、ニボルマブ（別名ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）、５Ｃ４、ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６及びＯＮＯ－４５３８）、ペムブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ；別名ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、ラムブロリズマブ及びＭＫ－３４７５；国際公開第２００８／１５６７１２号パンフレットを参照されたい）、ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ；国際公開第２０１５／１１２９００号パンフレットを参照されたい）、ＭＥＤＩ－０６８０（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ；別名ＡＭＰ－５１４；国際公開第２０１２／１４５４９３号パンフレットを参照されたい）、セミプリマブ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ；別名ＲＥＧＮ－２８１０；国際公開第２０１５／１１２８００号パンフレットを参照されたい）、ＪＳ００１（ＴＡＩＺＨＯＵ ＪＵＮＳＨＩ ＰＨＡＲＭＡ；Ｓｉ－Ｙａｎｇ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．７０：１３６（２０１７）を参照されたい）、ＢＧＢ－Ａ３１７（Ｂｅｉｇｅｎｅ；国際公開第２０１５／３５６０６号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１５／００７９１０９号明細書を参照されたい）、ＩＮＣＳＨＲ１２１０（Ｊｉａｎｇｓｕ Ｈｅｎｇｒｕｉ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；別名ＳＨＲ－１２１０；国際公開第２０１５／０８５８４７号パンフレット；Ｓｉ－Ｙａｎｇ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．７０：１３６（２０１７）を参照されたい）、ＴＳＲ－０４２（Ｔｅｓａｒｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ；別名ＡＮＢ０１１；国際公開第２０１４／１７９６６４号パンフレットを参照されたい）、ピジリズマブ（Ｍｅｄｉｖａｔｉｏｎ／ＣｕｒｅＴｅｃｈ；米国特許第８，６８６，１１９Ｂ２号明細書又は国際公開第２０１３／０１４６６８Ａ１号パンフレットを参照されたい）；ＧＬＳ－０１０（Ｗｕｘｉ／Ｈａｒｂｉｎ Ｇｌｏｒｉａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；別名ＷＢＰ３０５５；Ｓｉ－Ｙａｎｇ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．７０：１３６（２０１７）を参照されたい）、ＡＭ－０００１（Ａｒｍｏ）、ＳＴＩ－１１１０（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；国際公開第２０１４／１９４３０２号パンフレットを参照されたい）、ＡＧＥＮ２０３４（Ａｇｅｎｕｓ；国際公開第２０１７／０４０７９０号パンフレットを参照されたい）、ＭＧＡ０１２（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ、国際公開第２０１７／１９８４６号パンフレットを参照されたい）及びＩＢＩ３０８（Ｉｎｎｏｖｅｎｔ；国際公開第２０１７／０２４４６５号パンフレット、同第２０１７／０２５０１６号パンフレット、同第２０１７／１３２８２５号パンフレット及び同第２０１７／１３３５４０号パンフレットを参照されたい）から選択される抗体である。いくつかの態様では、抗ＰＤ－１療法は、ＰＤ－１拮抗物質ＡＭＰ－２２４であり、これは、ＰＤ－１リガンドプログラム細胞死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）の細胞外ドメイン及びヒトＩｇＧのＦｃ領域からなる組換え融合タンパク質である。ＡＭＰ－２２４は、米国特許出願公開第第２０１３／００１７１９９号明細書で論じられている。これらの参考文献の各々の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0091】
いくつかの態様では、抗ＰＤ－Ｌ１療法は、ＢＭＳ－９３６５５９（別名１２Ａ４、ＭＤＸ－１１０５；例えば、米国特許第７，９４３，７４３号明細書及び国際公開第２０１３／１７３２２３号パンフレットを参照されたい）、アテゾリズマブ（Ｒｏｃｈｅ；別名ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）；ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６；米国特許第８，２１７，１４９号明細書を参照されたく；Ｈｅｒｂｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３ ｌ（ｓｕｐｐｌ）：３０００も参照されたい）、デュルバルマブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ；別名ＩＭＦＩＮＺＩ（商標）、ＭＥＤＩ－４７３６；国際公開第２０１１／０６６３８９号パンフレットを参照されたい）、アベルマブ（Ｐｆｉｚｅｒ；別名ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標）、ＭＳＢ－００１０７１８Ｃ；国際公開第２０１３／０７９１７４号パンフレットを参照されたい）、ＳＴＩ－１０１４（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ；国際公開第２０１３／１８１６３４号パンフレットを参照されたい）、ＣＸ－０７２（Ｃｙｔｏｍｘ；国際公開第２０１６／１４９２０１号パンフレットを参照されたい）、ＫＮ０３５（３Ｄ Ｍｅｄ／Ａｌｐｈａｍａｂ；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｃｏｖ．７：３（Ｍａｒｃｈ ２０１７）を参照されたい）、ＬＹ３３０００５４（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ Ｃｏ．；例えば国際公開第２０１７／０３４９１６号パンフレットを参照されたい）及びＣＫ－３０１（Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；Ｇｏｒｅｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，ＡＡＣＲ：Ａｂｓｔｒａｃｔ ４６０６（Ａｐｒ ２０１６）を参照されたい）から選択される抗体であり、これらの参考文献の各々の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0092】
本明細書に開示される方法の特定の態様では、ＩＯ獲得耐性は以下の通り定義される：
（ｉ）抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１単剤療法への６ヶ月間未満の曝露で、部分的退縮若しくは完全退縮の初期最良総合効果（ＢＯＲ）を伴い、続いて治療中の疾患進行若しくは抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療を中断してから１２週間以下での疾患進行を伴うこと、又は
（ｉｉ）単独での若しくは化学療法との組み合わせにおける抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法への６ヶ月間以上の曝露で、疾患の安定化、部分的退縮若しくは完全退縮のＢＯＲを伴い、続いて治療中の疾患進行若しくは抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療を中断してから１２週間以下での疾患進行を伴うこと。
（ｉ）抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１単剤療法への６ヶ月間未満の曝露で、部分的退縮若しくは完全退縮の初期最良総合効果（ＢＯＲ）を伴い、続いて治療中の疾患進行若しくは抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療を中断してから１２週間以下での疾患進行を伴うこと、又は
（ｉｉ）単独での若しくは化学療法との組み合わせにおける抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法への６ヶ月間以上の曝露で、疾患の安定化、部分的退縮若しくは完全退縮のＢＯＲを伴い、続いて治療中の疾患進行若しくは抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療を中断してから１２週間以下での疾患進行を伴うこと。
【0093】
本明細書に開示される方法の特定の態様では、ＩＯ獲得耐性は、単独での又は化学療法との組み合わせにおける抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法への６ヶ月間以上の曝露；疾患の安定化、部分的退縮又は完全退縮の最良総合効果（ＢＯＲ）、それに続く治療中の疾患進行又は抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療を中断してから１２週間以下での疾患進行として定義される。
【0094】
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、対象のＰＤ－Ｌ１腫瘍比率スコア（ＴＰＳ）は、１％以上である。いくつかの態様では、対象は、ファーストライン設定での以前の全身療法を受けていない。いくつかの態様では、以前の全身療法は、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法以外のＩＯ療法である。いくつかの態様では、対象は、以前のネオ／アジュバント療法を受けているが、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法を最後に投与してから少なくとも１２ヶ月間にわたって進行しなかった。いくつかの態様では、対象のＰＤ－Ｌ１ ＴＰＳは、５０％以上である。
【0095】
５．４ 結果
本明細書に開示される方法に従って治療された患者は、好ましくは、癌の少なくとも１つの徴候の改善を経験する。一態様では、改善は、測定可能な腫瘍病変の量及び／又はサイズの減少によって測定される。別の態様では、病変は、胸部Ｘ線又はＣＴ若しくはＭＲＩフィルム上で測定され得る。別の態様では、細胞学又は組織学を用いて療法に対する応答性を評価することができる。いくつかの態様では、二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントの投与に対する腫瘍応答は、腫瘍評価の治験責任医師レビューによって決定され、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１ガイドラインによって定義され得る。追加の腫瘍測定は、治験責任医師の裁量で又は施設の慣例に従って行うことができる。
本明細書に開示される方法に従って治療された患者は、好ましくは、癌の少なくとも１つの徴候の改善を経験する。一態様では、改善は、測定可能な腫瘍病変の量及び／又はサイズの減少によって測定される。別の態様では、病変は、胸部Ｘ線又はＣＴ若しくはＭＲＩフィルム上で測定され得る。別の態様では、細胞学又は組織学を用いて療法に対する応答性を評価することができる。いくつかの態様では、二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントの投与に対する腫瘍応答は、腫瘍評価の治験責任医師レビューによって決定され、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１ガイドラインによって定義され得る。追加の腫瘍測定は、治験責任医師の裁量で又は施設の慣例に従って行うことができる。
【0096】
いくつかの態様では、治療された患者は、完全寛解（ＣＲ）、すなわち全ての標的病変の消失を示す。いくつかの態様では、治療された患者は、部分的寛解（ＰＲ）、すなわちベースライン径和を基準とした、標的病変の径和の少なくとも３０％の減少を示す。いくつかの態様では、治療された患者は、進行性疾患（ＰＤ）、すなわち試験中の最小和（これは、ベースライン和が試験中の最小である場合、ベースライン和を含む）を基準とした、標的病変の径和の少なくとも２０％の増大を示す。２０％の相対的増加に加えて、その和は、少なくとも５ｍｍの絶対的増加を示す必要もある。（注：１つ以上の新たな病変の出現は、進行とみなされ得る。）いくつかの態様では、治療される患者は、安定疾患（ＳＤ）、すなわち試験中の最小径和を基準としてＰＲと認定するほど十分に縮小しておらず、ＰＤと認定するほど十分に増大していないことを示す。
【0097】
別の態様では、治療された患者は、腫瘍の縮小及び／又は成長速度の低下、すなわち腫瘍成長の抑制を経験する。いくつかの態様では、望ましくない細胞増殖が低減又は阻害される。いくつかの態様では、以下の１つ又は複数が起こり得る。癌細胞の数が減少され得る；腫瘍サイズが縮小し得る；末梢器官への癌細胞浸潤が阻害、阻止、遅延又は停止され得る；腫瘍転移が遅延又は阻害され得る；腫瘍成長が阻害され得る；腫瘍の再発が防止又は遅延され得る；癌に関連する症状の１つ又は複数がある程度緩和され得る。
【0098】
他の態様では、本明細書で提供される方法のいずれかによる二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントの投与は、腫瘍サイズの縮小、経時的に現れる転移性病変数の減少、完全寛解、部分寛解又は安定疾患からなる群から選択される少なくとも１つの治療効果をもたらす。
【0099】
いくつかの態様では、１つ又は複数の腫瘍生検が、本明細書中に提供される方法のいずれかに従って二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントの投与に対する腫瘍応答を決定するために使用され得る。いくつかの態様では、試料はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である。いくつかの態様では、試料は新鮮な試料である。腫瘍試料（例えば、生検）を使用して、免疫及び腫瘍微小環境に関連する予測的及び／又は薬力学的バイオマーカを同定することができる。そのようなバイオマーカは、ＩＨＣ、腫瘍突然変異分析、ＲＮＡ分析及びプロテオーム分析を含むアッセイから決定することができる。特定の態様では、腫瘍バイオマーカの発現は、ＲＴ－ＰＣＲ、インサイチュハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護、ＲＴ－ＰＣＲベースのアッセイ、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ、インビボ撮像又はフローサイトメトリーによって検出される。
【0100】
５．５ 二重特異性抗体及びその抗原結合フラグメント
本明細書では、ＴＩＭ－３及びＰＤ－１（例えば、ヒトＴＩＭ－３及びＰＤ－１）に特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを対象に投与することを含む、対象（例えばヒト対象）における癌を治療する方法が提供される。いくつかの態様では、本明細書に適用される方法に使用され得るＴＩＭ－３及びＰＤ－１（例えば、ヒトＴＩＭ－３及びＰＤ－１）抗体及びその抗原結合フラグメントとしては、ＴＩＭ－３及びＰＤ－１に特異的に結合し、固有のＴＩＭ－３エピトープを標的化する一価の二重特異性ヒト化免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であるＡＺＤ７７８９が挙げられる。
本明細書では、ＴＩＭ－３及びＰＤ－１（例えば、ヒトＴＩＭ－３及びＰＤ－１）に特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを対象に投与することを含む、対象（例えばヒト対象）における癌を治療する方法が提供される。いくつかの態様では、本明細書に適用される方法に使用され得るＴＩＭ－３及びＰＤ－１（例えば、ヒトＴＩＭ－３及びＰＤ－１）抗体及びその抗原結合フラグメントとしては、ＴＩＭ－３及びＰＤ－１に特異的に結合し、固有のＴＩＭ－３エピトープを標的化する一価の二重特異性ヒト化免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であるＡＺＤ７７８９が挙げられる。
【0101】
ＡＺＤ７７８９は、ＤｕｅｔＭａｂ分子の主鎖上に構築された。ＤｕｅｔＭａｂの設計については、Ｍａｚｏｒ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ．７（２）：３７７－３８９，（２０１５ Ｍａｒ－Ａｐｒ ２０１５）で説明されており、これは、参照によりその全体が本明細書に援用される。「ＤｕｅｔＭａｂ」設計は、２つの異なる重鎖をヘテロ二量体化するためのノブ・イントゥ・ホール（ＫＩＨ）技術を含み、ＣＨ１－ＣＬ界面の１つの天然のジスルフィド結合を改変ジスルフィド結合に置き換えることにより、同族の重鎖と軽鎖とを対合する効率を増大させる。
【0102】
ＡＺＤ７７８９は、ＴＩＭ－３に結合する可変領域を含む重鎖中のノブ変異及びＰＤ－１に結合する可変領域を含む重鎖中のホール変異を含む。
【0103】
本開示のいくつかの態様では、本明細書に記載される方法に使用するための二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＴＩＭ－３及びヒトＰＤ－１に特異的に結合し、表１及び２に示されるＡＺＤ７７８９抗体のＣＤＲを含む。
【0104】
【表1】
【0105】
【表2】
【0106】
本開示のいくつかの態様では、本明細書に記載される方法に使用するための二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント、ＴＩＭ－３結合タンパク質は、それぞれ配列番号１、２、３、７、８及び９のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。本開示のいくつかの態様では、本明細書に記載される方法に使用するための二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント、ＴＩＭ－３結合タンパク質は、それぞれ配列番号１、２、３、７、８及び１３のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
【0107】
本開示のいくつかの態様では、本明細書に記載される方法に使用するための二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントのＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメイン上の固有のエピトープに特異的に結合する。ＴＩＭ－３のＩｇＶドメイン上のエピトープは、ＴＩＭ－３のＮ１２、Ｌ４７、Ｒ５２、Ｄ５３、Ｖ５４、Ｎ５５、Ｙ５６、Ｗ５７、Ｗ６２、Ｌ６３、Ｎ６４、Ｇ６５、Ｄ６６、Ｆ６７、Ｒ６８、Ｋ６９、Ｄ７１、Ｔ７５及びＥ７７（配列番号２９）を含む。
【0108】
本開示のいくつかの態様では、本明細書に記載される方法に使用するための二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント、ＴＩＭ－３結合タンパク質は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）結合ドメインを更に含む。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合ドメインは、それぞれ配列番号１、２、３、７、８及び９のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の第１のセットを含み、及びＰＤ－１結合ドメインは、それぞれ配列番号４、５、６、１０、１１及び１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の第２のセットを含む。
【0109】
本開示のいくつかの態様では、本明細書に記載される方法に使用するための二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント、ＴＩＭ－３結合タンパク質は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）結合ドメインを更に含む。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合ドメインは、それぞれ配列番号１、２、３、７、８及び１３のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の第１のセットを含み、及びＰＤ－１結合ドメインは、それぞれ配列番号４、５、６、１０、１１及び１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の第２のセットを含む。
【0110】
本開示のいくつかの態様では、本明細書に記載される方法に使用するための二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＴＩＭ－３及びＰＤ－１に特異的に結合し、表３に列挙されるＡＺＤ７７８９抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【0111】
【表3】
【0112】
本開示のいくつかの態様では、本明細書に記載される方法に使用するための二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント、ＴＩＭ－３結合タンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、配列番号１７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、配列番号１９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖ＶＨ及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖ＶＬを含む。
【0113】
本開示のいくつかの態様では、本明細書に記載される方法に使用するための二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＴＩＭ－３及びＰＤ－１に特異的に結合し、表４に列挙されるＡＺＤ７７８９抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を含む。
【0114】
【表4】
【0115】
本開示のいくつかの態様では、本明細書に記載される方法に使用するための二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント、ＴＩＭ－３結合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む。
【0116】
本開示のいくつかの態様では、本明細書に記載される方法に使用するための二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント、ＴＩＭ－３結合タンパク質は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む。
【0117】
本開示のいくつかの態様では、本明細書に記載される方法に使用するための二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント、ＴＩＭ－３結合タンパク質は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む。
【0118】
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法に使用するための二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントのＴＩＭ－３結合タンパク質は、アグリコシル化されたＦｃ領域を含む。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質は、脱グリコシル化されたＦｃ領域を含む。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質は、減少したフコシル化を有するか又はアフコシル化されているＦｃ領域を含む。
【0119】
５．６ 治療方法
いくつかの態様では、本開示は、対象における非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を治療する方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、進行性又は転移性ＮＳＣＬＣを有する対象においてＮＳＣＬＣを治療する方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、対象における非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を治療する方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、進行性又は転移性ＮＳＣＬＣを有する対象においてＮＳＣＬＣを治療する方法を提供する。
【0120】
いくつかの態様では、進行性又は転移性ＮＳＣＬＣを有する対象においてＮＳＣＬＣを治療する方法は、ＰＤ－１結合ドメイン及びＴＩＭ－３結合ドメインを含む二重特異性結合タンパク質を対象に投与することを含み、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含み、対象は、ＩＯ獲得耐性を有する。いくつかの態様では、本開示のＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＣ’Ｃ’’及びＤＥループに特異的に結合する。
【0121】
いくつかの態様では、本開示は、進行性又は転移性腫瘍を有する対象において非小細胞肺腫瘍の成長を阻害する方法を提供する。進行性又は転移性腫瘍を有する対象において非小細胞肺腫瘍の成長を阻害する方法のいくつかの態様では、方法は、ＰＤ－１結合ドメイン及びＴＩＭ－３結合ドメインを含む二重特異性結合タンパク質を対象に投与することを含み、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含み、対象は、ＩＯ獲得耐性を有する。いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＣ’Ｃ’’及びＤＥループに特異的に結合する。
【0122】
いくつかの態様では、本明細書に記載されるＰＤ－１結合ドメイン及びＴＩＭ－３結合ドメインを含む二重特異性結合タンパク質のＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメイン上のエピトープに特異的に結合し、及びエピトープは、ＴＩＭ－３のＮ１２、Ｌ４７、Ｒ５２、Ｄ５３、Ｖ５４、Ｎ５５、Ｙ５６、Ｗ５７、Ｗ６２、Ｌ６３、Ｎ６４、Ｇ６５、Ｄ６６、Ｆ６７、Ｒ６８、Ｋ６９、Ｄ７１、Ｔ７５及びＥ７７（配列番号２９）を含む。
【0123】
いくつかの態様では、ＮＳＣＬＣは、扁平上皮又は非扁平上皮ＮＳＣＬＣである。
【0124】
いくつかの態様では、本開示は、ＩＯ獲得耐性を有する対象において癌を治療する方法を提供する。いくつかの態様では、ＩＯ獲得耐性を有する対象において癌を治療する方法は、ＴＩＭ－３結合ドメインを含むＴＩＭ－３結合タンパク質を対象に投与することを含み、ＴＩＭ－３結合ドメインは、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのＣ’Ｃ’’及びＤＥループに特異的に結合する。いくつかの態様では、癌は、卵巣癌、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、膀胱癌、頭頸部癌、黒色腫、膵臓癌、腎細胞癌、肺癌、食道癌、胃癌、胆道腫瘍、尿路上皮癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群及び急性骨髄性白血病の１つ以上である。いくつかの態様では、対象は、ヒトである。いくつかの態様では、対象は、根治的外科手術若しくは放射線療法が適さないステージＩＩＩ又はステージＩＶの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を実証している。
【0125】
いくつかの態様では、ＴＩＭ－３結合タンパク質の投与は、対象における腫瘍成長の阻害をもたらす。
【0126】
以下の実施例は、限定としてではなく、例示として提供される。
【実施例】
【0127】
本節（すなわち第６節）の実施例は、限定ではなく例示として提供される。
【0128】
６．１ 実施例１：ＴＩＭ－３ ＩｇＶドメインの特性評価
抗ＴＩＭ３＃６２モノクローナル抗体（「＃６２」又は「クローン６２」）の抗原結合フラグメントとのＴＩＭ－３ ＩｇＶドメインの相互作用を調査した。クローン６２は、クローン６２の親和性成熟バリアントである、抗ＴＩＭ－３抗体Ｏ１３－１の親である。ｍＡｂ Ｏ１３－１及びクローン６２の配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第１０，４５７，７３２号明細書に開示されている。
抗ＴＩＭ３＃６２モノクローナル抗体（「＃６２」又は「クローン６２」）の抗原結合フラグメントとのＴＩＭ－３ ＩｇＶドメインの相互作用を調査した。クローン６２は、クローン６２の親和性成熟バリアントである、抗ＴＩＭ－３抗体Ｏ１３－１の親である。ｍＡｂ Ｏ１３－１及びクローン６２の配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第１０，４５７，７３２号明細書に開示されている。
【0129】
結晶化、データ収集及び構造決定
抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）を有するＴＩＭ－３ ＩｇＶドメインの共結晶構造を得るために、全てのタンパク質を哺乳動物細胞中で発現させ、均質になるまで精製した。精製したＴＩＭ－３ ＩｇＶドメイン及びＦａｂ（一度に）を、僅かにＩｇＶドメイン過剰でインキュベートし、続いて複合体をサイズ排除精製した。複合体の結晶化を室温で実施した。Ｘ線回折データを、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｌｉｇｈｔｓｏｕｒｃｅ（ＳＳＲＬ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）で収集した。複合体の構造を分子置換によって解決した。
抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）を有するＴＩＭ－３ ＩｇＶドメインの共結晶構造を得るために、全てのタンパク質を哺乳動物細胞中で発現させ、均質になるまで精製した。精製したＴＩＭ－３ ＩｇＶドメイン及びＦａｂ（一度に）を、僅かにＩｇＶドメイン過剰でインキュベートし、続いて複合体をサイズ排除精製した。複合体の結晶化を室温で実施した。Ｘ線回折データを、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｌｉｇｈｔｓｏｕｒｃｅ（ＳＳＲＬ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）で収集した。複合体の構造を分子置換によって解決した。
【0130】
ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインに結合した抗ＴＩＭ３抗体＃６２のＦａｂの結晶構造を、２．２Åの分解能で決定した。Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の両方が抗原と相互作用した。Ｆａｂの２つの鎖が、８１５Å２の界面面積を生成し、うち軽鎖が３６５Å２に寄与し、重鎖が４５０Å２に寄与した。Ｆａｂの両方の鎖から相互作用に関与するアミノ酸が合計で２７個存在し、１９個のアミノ酸がＴＩＭ－３のＩｇＶドメインに由来する。ＴＩＭ－３アミノ酸の一部は、Ｆａｂの両方の鎖と相互作用した。
【0131】
ＩｇＶドメインの以下のアミノ酸は、抗ＴＩＭ３抗体＃６２：Ｆａｂの重鎖との界面に属し、且つ／又はこれとの相互作用に関与する：Ｎ１２、Ｌ４７、Ｄ５３、Ｖ５４、Ｎ５５、Ｙ５６、Ｗ５７、Ｗ６２、Ｌ６３、Ｎ６４、Ｇ６５、Ｄ６６、Ｆ６７、Ｔ７５及びＥ７７。このうち、アミノ酸Ｎ１２、Ｌ６３（主鎖）及びＥ７７は、重鎖のＣＤＲ２及び３との水素結合を確立する。
【0132】
【表5】
【0133】
抗ＴＩＭ３抗体＃６２の重鎖のＦａｂでは、以下のアミノ酸は、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインとの界面に属し、且つ／又はそれとの相互作用に関与する：Ｓ３０、Ｓ３１、Ｙ３２及びＡ３３（全て重鎖のＣＤＲ１に属する）、Ｓ５２、Ｇ５３、Ｓ５４、Ｇ５６、Ｓ５７（全て重鎖のＣＤＲ２に属する）、Ｓ１００、Ｙ１０１、Ｇ１０２、Ｔ１０３、Ｙ１０４、Ｙ１０５、Ｎ１０７及びＹ１０８（全て重鎖のＣＤＲ３に属する）。
【0134】
ＩｇＶドメインの以下のアミノ酸は、抗ＴＩＭ３抗体の軽鎖中のＦａｂとの界面に属し、且つ／又はそれとの相互作用に関与する：Ｒ５２、Ｄ５３、Ｌ６３、Ｎ６４、Ｇ６５、Ｄ６６、Ｆ６７、Ｒ６８、Ｋ６９、Ｄ７１。
【0135】
【表6】
【0136】
【表7】
【0137】
抗ＴＩＭ３抗体＃６２の軽鎖のＦａｂでは、以下のアミノ酸は、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインとの界面に属し、且つ／又はそれとの相互作用に関与する：Ｇ２８、Ｇ２９、Ｋ３０及びＳ３１（全て軽鎖のＣＤＲ１に属する）、Ｙ４８、Ｙ４９、Ｄ５０、Ｓ５１、Ｄ５２、Ｒ５３（全て軽鎖のＣＤＲ２に属する）並びにＲ９２（軽鎖のＣＤＲ３に属する）。
【0138】
これは、抗ＴＩＭ３抗体＃６２の抗原結合フラグメントは、ホスファチジルセリン結合の反対側からＩｇＶドメインに結合することを実証する。この結合は、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインの折りたたみ又は構造に変化を導入しない。この構造由来のＩｇＶドメインのモデルは、結合したホスファチジルセリンを有するものを０．７Åの平均二乗偏差でアラインさせる。抗ＴＩＭ３抗体＃６２とＴＩＭ－３のＩｇＶドメインとの相互作用界面は、７８位にグリコシル化アスパラギンを含むこともなく、炭水化物自体に結合することもない。
【0139】
６．２ 実施例２：ＴＩＭ－３とホスファチジルセリンとの結合
ホスファチジルセリンを、３０μｇ／ｍＬでマルチアレイ９６ウェルプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）上に播種してから終夜蒸発させた。プレートを、１％のウシ血清アルブミンでブロッキングした。薬物を、１０μｇ／ｍＬから開始する５倍段階希釈を用いた７点曲線によって滴定した。続いて、ＳＵＬＦＯタグ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）とコンジュゲートした５μｇ／ｍＬのＴＩＭ－３ ＩｇＶを、薬物と共に１５分間プレインキュベートしてからプレートに添加した。１．５時間のインキュベーション期間後、プレートを洗浄し、ＭＥＳＯ ＳＥＣＴＯＲ Ｓ６００計器（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）上で電気化学発光シグナルを検出した（図１Ａ）。
ホスファチジルセリンを、３０μｇ／ｍＬでマルチアレイ９６ウェルプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）上に播種してから終夜蒸発させた。プレートを、１％のウシ血清アルブミンでブロッキングした。薬物を、１０μｇ／ｍＬから開始する５倍段階希釈を用いた７点曲線によって滴定した。続いて、ＳＵＬＦＯタグ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）とコンジュゲートした５μｇ／ｍＬのＴＩＭ－３ ＩｇＶを、薬物と共に１５分間プレインキュベートしてからプレートに添加した。１．５時間のインキュベーション期間後、プレートを洗浄し、ＭＥＳＯ ＳＥＣＴＯＲ Ｓ６００計器（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）上で電気化学発光シグナルを検出した（図１Ａ）。
【0140】
図１Ａに示されるデータは、ＡＺＤ７７８９に対する親抗ＴＩＭ－３ｍＡｂ（すなわちｍＡｂ Ｏ１３－１）が、アイソタイプ対照と比較して、ＴＩＭ－３とホスファチジルセリンとの結合を増加させることを実証する。逆に、抗ＴＩＭ－３ｍＡｂであるＦ９Ｓの滴定は、ＴＩＭ－３とホスファチジルセリンとの相互作用をブロックする。全体的に、このデータは、ＴＩＭ－３の異なるエピトープに結合する抗体は、ＴＩＭ－３とホスファチジルセリンとの相互作用を異なった方法で調節し得ること示す。
【0141】
次に、ホスファチジルセリンを、３０μｇ／ｍＬでマルチアレイ９６ウェルプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）上に播種してから終夜蒸発させた。プレートを、１％のウシ血清アルブミンでブロッキングした。薬物を、１５０μｇ／ｍＬから開始する４倍段階希釈を用いた７点曲線によって滴定した。続いて、薬物を添加した直後に、ＳＵＬＦＯタグ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）とコンジュゲートした１．６７μｇ／ｍＬのＴＩＭ－３ ＩｇＶを各ウェルに添加した。２時間のインキュベーション期間後、プレートを洗浄し、ＭＥＳＯ ＳＥＣＴＯＲ Ｓ６００計器（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）上で電気化学発光シグナルを検出した。１治療あたり２つのウェルを評価した。（図１Ｂ）。
【0142】
このデータは、ＡＺＤ７７８９対抗ＴＩＭ－３であるＯ１３－１の結合によって確認される通り、ＴＩＭ－３のＣ’ＣＣ’’／ＤＥエピトープにおける一価エンゲージメントは、アイソタイプ対照と比較して、ＴＩＭ－３のホスファチジルセリンとの相互作用を増加させるのに十分であることを実証する。反対に、ＴＩＭ－３のＣＣ’／ＦＧと結合する２つの独立して誘導された抗ＴＩＭ－３抗体（ｍＡｂ Ｆ９Ｓ及びｍＡｂ‘Ｎ’）は、ＴＩＭ－３とホスファチジルセリンとの相互作用をブロッキングした。全体的に、このデータは、ＴＩＭ－３の異なるエピトープに結合する抗体が、ＴＩＭ－３とホスファチジルセリンとの相互作用を異なった方法で調節することができ、この効果が、一価及び二価のエンゲージメントにわたって観察され得ること示す。
【0143】
６．３ 実施例３：死滅されたＡ３７５黒色腫細胞株に対するＴＩＭ３ ＩｇＶの結合
Ａ３７５黒色腫細胞を１μＭ／ｍＬのスタウロスポリンで２４時間かけて殺傷した。翌日、細胞を洗浄し、１ウェルあたり２０万個の細胞を播種した。薬物を５倍段階希釈によって滴定し、１０μｇ／ｍＬのＴＩＭ－３ ＩｇＶと共に４５分間共インキュベートした。薬物／ＴＩＭ３ ＩｇＶ混合物を、続いてアポトーシスＡ３７５細胞と共にインキュベートした。４５分後、細胞を冷緩衝液で洗浄し、４％ＰＦＡで２０分間固定した。データを、ＢＤ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ａ２上で取得し、ｆｌｏｗｊｏによって解析した。グラフを、ＰＲＩＳＭを用いて生成した。１治療あたり２つのウェルを評価した。（図２）。
Ａ３７５黒色腫細胞を１μＭ／ｍＬのスタウロスポリンで２４時間かけて殺傷した。翌日、細胞を洗浄し、１ウェルあたり２０万個の細胞を播種した。薬物を５倍段階希釈によって滴定し、１０μｇ／ｍＬのＴＩＭ－３ ＩｇＶと共に４５分間共インキュベートした。薬物／ＴＩＭ３ ＩｇＶ混合物を、続いてアポトーシスＡ３７５細胞と共にインキュベートした。４５分後、細胞を冷緩衝液で洗浄し、４％ＰＦＡで２０分間固定した。データを、ＢＤ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ａ２上で取得し、ｆｌｏｗｊｏによって解析した。グラフを、ＰＲＩＳＭを用いて生成した。１治療あたり２つのウェルを評価した。（図２）。
【0144】
図２に提示するデータは、ＡＺＤ７７８９及びクローンＯ１３－１が、アポトーシス黒色腫細胞に対する可溶性ＴＩＭ－３ ＩｇＶの結合を強化するが、抗ＰＤ－１であるＬＯ１１５はこれを強化しないことを示す。抗ＴＩＭ－３であるＥ２Ｅ及びｄｕｅｔ ＬＯ１１５／Ｆ９Ｓ抗体は、ＴＩＭ－３とアポトーシス細胞とのエンゲージメントを低下させる。
【0145】
６．４ 実施例４：ヒトＴＩＭ－３を発現するように改変されたＪｕｒｋａｔ細胞株
Ｊｕｒｋａｔ細胞株を、ヒトＴＩＭ－３を発現するように改変した（ｈ－ＴＩＭ－３ Ｊｕｒｋａｔ細胞）。１ウェルあたり２０万個の細胞を播種した。薬物を、１０μｇ／ｍＬから開始する９点４倍段階希釈によって滴定した。薬物を添加した直後、細胞を可溶性抗ＣＤ３（２．５μｇ／ｍＬ）及び抗ＣＤ２８（０．５μｇ／ｍＬ）で刺激した。２４時間後に上清を回収し、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙのｈｕｍａｎ ＩＬ－２ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｋｉｔを用いた電気化学発光検出によってＩＬ－２を評価した。１治療あたり２つのウェルを評価した。
Ｊｕｒｋａｔ細胞株を、ヒトＴＩＭ－３を発現するように改変した（ｈ－ＴＩＭ－３ Ｊｕｒｋａｔ細胞）。１ウェルあたり２０万個の細胞を播種した。薬物を、１０μｇ／ｍＬから開始する９点４倍段階希釈によって滴定した。薬物を添加した直後、細胞を可溶性抗ＣＤ３（２．５μｇ／ｍＬ）及び抗ＣＤ２８（０．５μｇ／ｍＬ）で刺激した。２４時間後に上清を回収し、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙのｈｕｍａｎ ＩＬ－２ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｋｉｔを用いた電気化学発光検出によってＩＬ－２を評価した。１治療あたり２つのウェルを評価した。
【0146】
図３に示すように、ＡＺＤ７７８９に対する非リード最適化及びリード最適化親抗ＴＩＭ－３ｍＡｂ（それぞれ抗ＴＩＭ－３抗体＃６２及びＯ１３）は、Ｔ細胞で刺激した際に、アイソタイプ対照と比較して、ｈ－ＴＩＭ－３ Ｊｕｒｋａｔ細胞のＩＬ－２産生を増加させる（エラーバーは、ＳＥＭを表す）。反対に、抗ＴＩＭ－３ｍＡｂ４１又はＦ９Ｓは、同じ刺激条件下でＩＬ－２産生を減少させる。全体的に、このデータは、ＴＩＭ－３の異なるエピトープに結合する抗体が、ヒトＴＩＭ３ Ｊｕｒｋａｔ刺激アッセイにおいて異なる転帰を誘発し得ることを示す。非リード最適化クローン６２とリード最適化クローン１３との間の１つのアミノ酸変化は、このＪｕｒｋａｔ刺激アッセイにおける機能的転帰を変化させない。
【0147】
別の研究では、１ウェルあたり２０万個のｈ－ＴＩＭ－３Ｊｕｒｋａｔ細胞を播種した。薬物を、１０ｍｇ／ｍＬから開始する９点３倍段階希釈によって滴定した。薬物を添加した直後に、細胞を抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）／抗ＣＤ２８（０．５μｇ／ｍＬ）で刺激した。２４時間後に上清を回収し、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙのｈｕｍａｎ ＩＬ－２ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｋｉｔを用いた電気化学発光検出によってＩＬ－２を評価した。（図４）。１治療あたり２つのウェルを評価した。エラーバーは、ＳＥＭを表す。比較器の抗ＴＩＭ－３抗体「Ｎ」、「Ｊ」及び「Ｌ」は、特許配列に由来した。抗ＴＩＭ－３抗体２Ｅ２は市販されている（Ｌｅａｆ精製抗ヒトＣＤ３６６，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。
【0148】
図４に示すように、親抗ＴＩＭ－３ｍＡｂであるＯ１３－１の滴定により、Ｔ細胞で刺激した際のｈ－ＴＩＭ－３ Ｊｕｒｋａｔ細胞のＩＬ－２産生は増加する。反対に、本アッセイで評価された全ての他の抗ＴＩＭ－３ ｍＡｂの滴定により、同じ刺激条件下でのＩＬ－２産生は低下する。全体的に、このデータは、ＴＩＭ－３の異なるエピトープに結合する抗体が、ヒトＴＩＭ－３ Ｊｕｒｋａｔ刺激アッセイにおいて異なる転帰を誘発し得ることを示す。
【0149】
ｈ－ＴＩＭ－３ Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いた別の研究では、３０μｇ／ｍＬで開始する１１点３倍段階希釈によって薬物を滴定した。「抗ＴＩＭ－３ Ｏ１３－１（滴定）＋抗ＴＩＭ－３ Ｆ９Ｓ（定常）」治療群では、細胞を定濃度の抗ＴＩＭ－３ｍＡｂ Ｆ９Ｓ（１０μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした後、抗ＴＩＭ－３ｍＡｂ Ｏ１３－１を滴定する。薬物を添加した後、細胞を、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）／抗ＣＤ２８（０．５μｇ／ｍＬ）で刺激した。２４時間後に上清を回収し、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙのｈｕｍａｎ ＩＬ－２ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｋｉｔを用いた電気化学発光検出によってＩＬ－２を評価した（図５）。
【0150】
図５に示すように、抗ＴＩＭ－３ｍＡｂ Ｏ１３－１添加後の刺激されたｈ－ＴＩＭ－３ Ｊｕｒｋａｔ細胞からのＩＬ－２の観察された増加は、ＴＩＭ－３のホスファチジルセリンとの相互作用をブロックする高濃度の抗ＴＩＭ－３ｍＡｂであるＦ９Ｓ中で細胞が培養される場合に除去されることを示す。このデータは、抗ＴＩＭ－３ｍＡｂ Ｏ１３－１によって誘発されたＩＬ－２産生が、ＴＩＭ－３とホスファチジルセリンとの相互作用に依存し、この相互作用を無効化することで、ＩＬ－２分泌の強化が妨げられることを示唆する。
【0151】
次に、親Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、ヒトＴＩＭ－３の野生型及び変異体（Ｒ１１１Ａ）バージョンを発現するように遺伝子改変された２つのＪｕｒｋａｔ細胞株と比較した。Ｒ１１１は、ＴＩＭ－３がホスファチジルセリンに結合するのに不可欠な残基である。ＴＩＭ－３中のＲ１１１Ａ変異は、ホスファチジルセリンのＴＩＭ－３への結合を無効化する（Ｇａｎｄｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１８；８：１７５１２；Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００９）。薬物を添加した後、細胞を抗ＣＤ３（２．５μｇ／ｍＬ）／抗ＣＤ２８（０．５μｇ／ｍＬ）で刺激した。２４時間後に上清を回収し、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙのｈｕｍａｎ ＩＬ－２ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｋｉｔを用いた電気化学発光検出によってＩＬ－２を評価した（図６）。データを、５０ｎＭで処理した３回の個別の実験からコンパイルした。エラーバーは、ＳＥＭを表す。＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【0152】
図６に提示するデータは、ＴＩＭ－３の発現が、ホスファチジルセリンとのエンゲージメントと共に、刺激後にＴＩＭ－３を発現するＪｕｒｋａｔ細胞からのＩＬ－２産生を抗ＴＩＭ－３ｍＡｂ Ｏ１３－１が媒介して増加させるのに必要であることを示す。
【0153】
６．５ 実施例５：初代ヒトＴ細胞におけるＩＦＮ－γ分泌
２体の健康なドナーに由来する新鮮な末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、４０，０００細胞／ウェルで播種した。薬物を、１００ｎＭから開始する４点１０倍段階希釈によって滴定した。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を、細胞表面上にヒト抗ＣＤ３ ＯＫＴ３単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を発現するように改変した。ＣＨＯ－ＯＫＴ３細胞に放射線（１０Ｇｙ）を照射してアポトーシスを誘導し、１ウェルあたり５，０００で播種した。細胞を３日間共培養した。続いて上清を回収し、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙのｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｋｉｔを用いた電気化学発光検出によってＩＦＮ－γを評価した（図７Ａ及び７Ｂ）。エラーバーは、三重反復ウェルのＳＥＭを表す。＊＊、ｐ＜０．０１；＊、ｐ＜０．０５。
２体の健康なドナーに由来する新鮮な末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、４０，０００細胞／ウェルで播種した。薬物を、１００ｎＭから開始する４点１０倍段階希釈によって滴定した。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を、細胞表面上にヒト抗ＣＤ３ ＯＫＴ３単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を発現するように改変した。ＣＨＯ－ＯＫＴ３細胞に放射線（１０Ｇｙ）を照射してアポトーシスを誘導し、１ウェルあたり５，０００で播種した。細胞を３日間共培養した。続いて上清を回収し、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙのｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｋｉｔを用いた電気化学発光検出によってＩＦＮ－γを評価した（図７Ａ及び７Ｂ）。エラーバーは、三重反復ウェルのＳＥＭを表す。＊＊、ｐ＜０．０１；＊、ｐ＜０．０５。
【0154】
図７Ａ及び７Ｂに示すデータは、ＡＺＤ７７８９及びその親二価抗ＴＩＭ－３ｍＡｂであるＯ１３－１が、細胞アポトーシスとの関係で刺激された初代ヒトＴ細胞のＩＦＮ－γ分泌を強化することを示唆する。これは、抗体又は二重特異性フォーマットにおける抗ＴＩＭ－３分子をブロックするホスファチジルセリンには当てはまらない。
【0155】
６．６ 実施例６：アポトーシス腫瘍細胞の樹状細胞エフェロサイトーシスに対するＡＺＤ７７８９の効果
ヒト樹状細胞（ＤＣ）を、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４及び１００ｎｇ／ｍＬの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）の存在下で６日間培養した、単離したばかりの単球から生成した。アポトーシスを誘発するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞株を、１００ｍＭのスタウロスポリンで２４時間治療した。アポトーシスＪｕｒｋａｔ細胞を、続いて１ｎｇ／ｍＬのＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ染料で標識した。アポトーシス細胞を、試験薬物の存在下で、単球由来ＤＣと４：１の比で共培養した。プレートを、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｓ３ Ｌｉｖｅ－Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍの内部に入れた。画像を、２４時間の期間にわたって１５分間毎に取得した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｓ３ ２０１８Ｂソフトウェアを用いて、赤色蛍光を測定及び分析した。データの視覚的描写を、Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８．０４．０２（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて実施した。図８Ａは、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｓ２ ２０１８Ｂソフトウェアを用いて生成した１実験からの代表的データの例を示す。図８Ｂは、１０回以上の個別の実験からコンパイルされたデータの視覚的表現を示す。図８Ｂのエフェロサイトーシスの倍数変化は、薬物治療なしの群から決定した。＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊、ｐ＜０．０５。
ヒト樹状細胞（ＤＣ）を、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４及び１００ｎｇ／ｍＬの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）の存在下で６日間培養した、単離したばかりの単球から生成した。アポトーシスを誘発するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞株を、１００ｍＭのスタウロスポリンで２４時間治療した。アポトーシスＪｕｒｋａｔ細胞を、続いて１ｎｇ／ｍＬのＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ染料で標識した。アポトーシス細胞を、試験薬物の存在下で、単球由来ＤＣと４：１の比で共培養した。プレートを、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｓ３ Ｌｉｖｅ－Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍの内部に入れた。画像を、２４時間の期間にわたって１５分間毎に取得した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｓ３ ２０１８Ｂソフトウェアを用いて、赤色蛍光を測定及び分析した。データの視覚的描写を、Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８．０４．０２（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて実施した。図８Ａは、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｓ２ ２０１８Ｂソフトウェアを用いて生成した１実験からの代表的データの例を示す。図８Ｂは、１０回以上の個別の実験からコンパイルされたデータの視覚的表現を示す。図８Ｂのエフェロサイトーシスの倍数変化は、薬物治療なしの群から決定した。＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊、ｐ＜０．０５。
【0156】
図８Ａ及び８Ｂに示すデータは、ＡＺＤ７７８９が、アポトーシス腫瘍細胞の樹状細胞のエフェロサイトーシスを強化し得ることを実証する。対照的に、ＴＩＭ－３のホスファチジルセリン結合クレフトを標的化する抗体（ｍＡｂ Ｆ９Ｓ）は、対照群と比較して低減した効果を示した。
【0157】
６．７ 実施例７：腫瘍抗原のＤＣ交差提示に対するＡＺＤ７７８９の効果
２つのＪｕｒｋａｔ細胞株を、ヒトＭＡＲＴ－１又はＣＭＶｐｐ６５抗原のいずれかをそれぞれ発現するように改変した。これらの細胞株は、アッセイ中で腫瘍細胞としての役割を果たした。アポトーシスを誘発するために、ＭＡＲＴ－１及びＣＭＶｐｐ６５ Ｊｕｒｋａｔ細胞株を、１００ｍＭのスタウロスポリンで２４時間治療した。ヒト樹状細胞（ＤＣ）を、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４及び１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦの存在下で６日間培養した、単離したばかりの単球から生成した。ＨＬＡ－Ａ＊０２陽性の健康なドナーの血液から単球を単離した。樹状細胞を、被験物質の存在下で、アポトーシスＭＡＲＴ－１又はＣＭＶｐｐ６５ Ｊｕｒｋａｔ細胞と共培養し（比率１：４）、２４時間インキュベートして、エフェロサイトーシス及び抗原プロセシングを可能にした。ドナー適合した抗原特異性Ｔ細胞を、抗原ペプチドＭＡＲＴ－１（Ｌｅｕ２６）－ＨＬＡ－Ａ＊０２０１（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）又は抗原ペプチドＣＭＶｐｐ６５－ＨＬＡ－Ａ＊０２０１（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）のいずれかを用いて７日間刺激した冷凍ＰＢＭＣ及びペプチドから生成した。２４時間のＭＡＲＴ－１又はＣＭＶｐｐ６５ Ｊｕｒｋａｔ細胞のＤＣエフェロサイトーシス後、ウェルを培地で２回洗浄することにより、残ったアポトーシスＪｕｒｋａｔ細胞を除去した。抗原特異性Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ増殖染料で標識し、ＤＣと１：４の比（ＤＣ：Ｔ細胞）で７日間共培養した。７日後、デキストラマー：ＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ－抗原：ｐｐ６５又はデキストラマー：ＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＥＬＡＧＩＧＬＴＶ－抗原ＭＡＲＴ－１を用いて、Ｔ細胞をＣＤ３、ＣＤ８及び抗原特異性に関して染色した抗原特異性Ｔ細胞の増殖を、フローサイトメトリーによって決定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて解析した。（図９Ａ及び９Ｂ）。棒グラフは、ＭＡＲＴ－１Ｊｕｒｋａｔ細胞実験の二重ウェル及びＣＭＶｐｐ６５ Ｊｕｒｋａｔ細胞実験の三重ウェルを示し、エラーバーは、ＳＥＭを表す；＊、ｐ＜０．０５。
２つのＪｕｒｋａｔ細胞株を、ヒトＭＡＲＴ－１又はＣＭＶｐｐ６５抗原のいずれかをそれぞれ発現するように改変した。これらの細胞株は、アッセイ中で腫瘍細胞としての役割を果たした。アポトーシスを誘発するために、ＭＡＲＴ－１及びＣＭＶｐｐ６５ Ｊｕｒｋａｔ細胞株を、１００ｍＭのスタウロスポリンで２４時間治療した。ヒト樹状細胞（ＤＣ）を、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４及び１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦの存在下で６日間培養した、単離したばかりの単球から生成した。ＨＬＡ－Ａ＊０２陽性の健康なドナーの血液から単球を単離した。樹状細胞を、被験物質の存在下で、アポトーシスＭＡＲＴ－１又はＣＭＶｐｐ６５ Ｊｕｒｋａｔ細胞と共培養し（比率１：４）、２４時間インキュベートして、エフェロサイトーシス及び抗原プロセシングを可能にした。ドナー適合した抗原特異性Ｔ細胞を、抗原ペプチドＭＡＲＴ－１（Ｌｅｕ２６）－ＨＬＡ－Ａ＊０２０１（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）又は抗原ペプチドＣＭＶｐｐ６５－ＨＬＡ－Ａ＊０２０１（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）のいずれかを用いて７日間刺激した冷凍ＰＢＭＣ及びペプチドから生成した。２４時間のＭＡＲＴ－１又はＣＭＶｐｐ６５ Ｊｕｒｋａｔ細胞のＤＣエフェロサイトーシス後、ウェルを培地で２回洗浄することにより、残ったアポトーシスＪｕｒｋａｔ細胞を除去した。抗原特異性Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ増殖染料で標識し、ＤＣと１：４の比（ＤＣ：Ｔ細胞）で７日間共培養した。７日後、デキストラマー：ＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ－抗原：ｐｐ６５又はデキストラマー：ＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＥＬＡＧＩＧＬＴＶ－抗原ＭＡＲＴ－１を用いて、Ｔ細胞をＣＤ３、ＣＤ８及び抗原特異性に関して染色した抗原特異性Ｔ細胞の増殖を、フローサイトメトリーによって決定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて解析した。（図９Ａ及び９Ｂ）。棒グラフは、ＭＡＲＴ－１Ｊｕｒｋａｔ細胞実験の二重ウェル及びＣＭＶｐｐ６５ Ｊｕｒｋａｔ細胞実験の三重ウェルを示し、エラーバーは、ＳＥＭを表す；＊、ｐ＜０．０５。
【0158】
図９Ａ及び９Ｂに提示されるデータは、ＡＺＤ７７８９がＴ細胞に対する腫瘍抗原のＤＣ交差提示を強化し得ることを示す。この効果は、ＴＩＭ－３上のホスファチジルセリン結合部位をブロックする類似のモダリティーと異なる（Ｄｕｅｔ ＬＯ１１５／Ｆ９Ｓ）。この実施例は、抗原特異性Ｔ細胞に対するＤＣ交差提示を強化することにより、ＡＺＤ７７８９が抗腫瘍反応を改善し得ることを実証する。
【0159】
６．８ 実施例８：抗ＰＤ－１対ＡＺＤ７７８９の腫瘍成長阻害及び生存の比較
研究０日目に、免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに、２ｘ１０６個のＯＥ２１－１０ｘＧＳＶ３細胞（目的のウイルスペプチドを発現するように改変されたヒト食道扁平上皮細胞癌）を皮下移植した。７日後、健康なドナーのＰＢＭＣに由来するウイルスペプチド反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を静脈内投与した（１×１０６／マウス）。研究１０日目から、抗ＰＤ－１ ｍＡｂ ＬＯ１１５又は抗ＰＤ－１／抗ＴＩＭ３ ｍＡｂ ＡＺＤ７７８９を腹腔内投与し、マウスに合計で４回の用量（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与し、投与の間に２～３日の間隔を空けた。腫瘍容積を連続的に監視した。腫瘍サイズが２０００ｍｍ３に達した時点でマウスを犠牲にした。腫瘍容積のグラフ（図１０Ａ）は、アイソタイプ対照、ＡＺＤ７７８９及び抗ＰＤ－１ ｍＡｂ ＬＯ１１５の間の治療の比較を示す。ｎ＝８マウス／治療であり、全ての治療は１０ｍｇ／ｋｇで投与した。治療群間のマウスの生存を図１０Ｂに示す。
研究０日目に、免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに、２ｘ１０６個のＯＥ２１－１０ｘＧＳＶ３細胞（目的のウイルスペプチドを発現するように改変されたヒト食道扁平上皮細胞癌）を皮下移植した。７日後、健康なドナーのＰＢＭＣに由来するウイルスペプチド反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を静脈内投与した（１×１０６／マウス）。研究１０日目から、抗ＰＤ－１ ｍＡｂ ＬＯ１１５又は抗ＰＤ－１／抗ＴＩＭ３ ｍＡｂ ＡＺＤ７７８９を腹腔内投与し、マウスに合計で４回の用量（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与し、投与の間に２～３日の間隔を空けた。腫瘍容積を連続的に監視した。腫瘍サイズが２０００ｍｍ３に達した時点でマウスを犠牲にした。腫瘍容積のグラフ（図１０Ａ）は、アイソタイプ対照、ＡＺＤ７７８９及び抗ＰＤ－１ ｍＡｂ ＬＯ１１５の間の治療の比較を示す。ｎ＝８マウス／治療であり、全ての治療は１０ｍｇ／ｋｇで投与した。治療群間のマウスの生存を図１０Ｂに示す。
【0160】
図１０Ａ～Ｂのこれらの結果は、抗原特異性ヒト化マウス腫瘍モデルにおいて、ＡＺＤ７７８９の治療は、抗ＰＤ－１又はアイソタイプ対照で連続的に治療されたマウスと比較して、腫瘍成長を遅延させ、生存を強化することを実証する。これは、ＡＺＤ７７８９による治療が、抗ＰＤ－１療法よりも高い程度で患者に利益をもたらし得ることを示唆する。
【0161】
６．９ 実施例９：腫瘍成長に対するＡＺＤ７７８９の投与の効果
１日目に、４８匹の免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ ｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇ ｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに、２ｘ１０６個のＯＥ２１－１０ｘＧＳＶ３細胞（目的のウイルスペプチドを発現するように改変されたヒト食道扁平上皮細胞癌）を皮下移植した。７日目に、２体の健康なドナー（Ｄ２０３５１７及びＤ８９６）のＰＢＭＣに由来する腫瘍抗原特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞を静脈内投与した（１×１０６／マウス）。８日目に、腫瘍容積に基づいてマウスを６つの異なる治療群に無作為化し、１群あたり８匹のマウスとした。９日目から、被験物質及び対照物質を腹腔内投与し、マウスに合計で４回の用量（各１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。図１１Ａ及び１１Ｂは、異なるＴ細胞ドナー（Ｄ２０３５１７及びＤ８９６）を有する２つの個別の研究の、１３日目の腫瘍容積を示す。アイソタイプ対照と他の全ての薬物治療との腫瘍容積の比較を行い、一元ＡＮＯＶＡ、テューキーの多重比較検定によって群間差異の統計的有意性を分析した。各記号は、ベースラインから被験物質又は対照物質の３回目の用量の日（１３日目）までの腫瘍容積の倍数変化を表す。水平バーは、群内の相加平均腫瘍容積を表す。＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊、ｐ＜０．０５。
１日目に、４８匹の免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ ｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇ ｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに、２ｘ１０６個のＯＥ２１－１０ｘＧＳＶ３細胞（目的のウイルスペプチドを発現するように改変されたヒト食道扁平上皮細胞癌）を皮下移植した。７日目に、２体の健康なドナー（Ｄ２０３５１７及びＤ８９６）のＰＢＭＣに由来する腫瘍抗原特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞を静脈内投与した（１×１０６／マウス）。８日目に、腫瘍容積に基づいてマウスを６つの異なる治療群に無作為化し、１群あたり８匹のマウスとした。９日目から、被験物質及び対照物質を腹腔内投与し、マウスに合計で４回の用量（各１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。図１１Ａ及び１１Ｂは、異なるＴ細胞ドナー（Ｄ２０３５１７及びＤ８９６）を有する２つの個別の研究の、１３日目の腫瘍容積を示す。アイソタイプ対照と他の全ての薬物治療との腫瘍容積の比較を行い、一元ＡＮＯＶＡ、テューキーの多重比較検定によって群間差異の統計的有意性を分析した。各記号は、ベースラインから被験物質又は対照物質の３回目の用量の日（１３日目）までの腫瘍容積の倍数変化を表す。水平バーは、群内の相加平均腫瘍容積を表す。＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊、ｐ＜０．０５。
【0162】
図１１Ａ及び１１Ｂに示されるデータは、ＡＺＤ７７８９による治療が、抗ＰＤ－１抗体のみによる治療又は抗ＰＤ－１抗体及びホスファチジルセリンをブロックする抗ＴＩＭ－３分子の組み合わせによる治療と比較して、腫瘍成長の低下をもたらすことを実証する。この傾向は、２つのドナーにわたって観察された。
【0163】
６．１０ 実施例１０：ヒト化マウス腫瘍モデルにおいて過去に抗ＰＤ－１療法を受けた、エクスビボ刺激された腫瘍浸潤リンパ球のＩＦＮ－γ分泌に対するＡＺＤ７７８９の効果
研究０日目に、免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに、２ｘ１０６個のＯＥ２１－１０ｘＧＳＶ３細胞（目的のウイルスペプチドを発現するように改変されたヒト食道扁平上皮細胞癌）を皮下移植した。７日後、健康なドナーのＰＢＭＣに由来するウイルスペプチド反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を静脈内投与した（１×１０６／マウス）。研究１０日目から、抗ＰＤ－１ ｍＡｂ ＬＯ１１５を腹腔内投与し、マウスに合計で４回の用量（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与し、投与の間に２～３日の間隔を空けた。腫瘍容積を連続的に監視した。腫瘍サイズが２０００ｍｍ３に達した時点でマウスを犠牲にした。単一の細胞懸濁液中へと腫瘍を引き離した。生存細胞を保持するように細胞をフィコール勾配で遠心分離にかけ、１ウェルあたり０．１×１０６個で播種した。被験物質及び対照物質（１０ｎＭ）、組換えヒトＩＬ－２（２０ＩＵ／ｍＬ）並びに１．５ｍｇ／ｍＬのＧＩＬＧＦＶＦＴＬペプチドでパルスした０．０２×１０６のＴ２細胞を、それぞれのウェルに添加した。７２時間後に上清を回収し、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙのｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｋｉｔを用いた電気化学発光検出によってＩＦＮ－γを評価した。説明された実験のインビボ及びエクスビボ要素の概略を図１２Ａに示す。ＩＦＮ－γの倍数変化を、アイソタイプ対照群へのエクスビボでの薬物添加からの測定値を比較することによって決定した。６つの抗ＰＤ－１で治療されたマウスから採取された腫瘍を評価した。（図１２Ｂ）。エクスビボの薬物治療で刺激された１つの抗ＰＤ－１に予め曝露された腫瘍からの代表的ＩＦＮ－γプロットを図１２Ｃに示す。＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊、ｐ＜０．０１；＊、ｐ＜０．０５。
研究０日目に、免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに、２ｘ１０６個のＯＥ２１－１０ｘＧＳＶ３細胞（目的のウイルスペプチドを発現するように改変されたヒト食道扁平上皮細胞癌）を皮下移植した。７日後、健康なドナーのＰＢＭＣに由来するウイルスペプチド反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を静脈内投与した（１×１０６／マウス）。研究１０日目から、抗ＰＤ－１ ｍＡｂ ＬＯ１１５を腹腔内投与し、マウスに合計で４回の用量（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与し、投与の間に２～３日の間隔を空けた。腫瘍容積を連続的に監視した。腫瘍サイズが２０００ｍｍ３に達した時点でマウスを犠牲にした。単一の細胞懸濁液中へと腫瘍を引き離した。生存細胞を保持するように細胞をフィコール勾配で遠心分離にかけ、１ウェルあたり０．１×１０６個で播種した。被験物質及び対照物質（１０ｎＭ）、組換えヒトＩＬ－２（２０ＩＵ／ｍＬ）並びに１．５ｍｇ／ｍＬのＧＩＬＧＦＶＦＴＬペプチドでパルスした０．０２×１０６のＴ２細胞を、それぞれのウェルに添加した。７２時間後に上清を回収し、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙのｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｋｉｔを用いた電気化学発光検出によってＩＦＮ－γを評価した。説明された実験のインビボ及びエクスビボ要素の概略を図１２Ａに示す。ＩＦＮ－γの倍数変化を、アイソタイプ対照群へのエクスビボでの薬物添加からの測定値を比較することによって決定した。６つの抗ＰＤ－１で治療されたマウスから採取された腫瘍を評価した。（図１２Ｂ）。エクスビボの薬物治療で刺激された１つの抗ＰＤ－１に予め曝露された腫瘍からの代表的ＩＦＮ－γプロットを図１２Ｃに示す。＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊、ｐ＜０．０１；＊、ｐ＜０．０５。
【0164】
図１２Ａ～１２Ｃに示されるデータは、ＡＺＤ７７８９が、抗ＰＤ－１治療中に進行した、マウスから採取されたエクスビボで刺激されたＴＩＬのＩＦＮ－γ分泌を増加させ得ることを示唆する。この実施例は、ＡＺＤ７７８９が、抗ＰＤ－１療法に応答しなくなった細胞の抗腫瘍反応を改善させ得ることを実証する。
【0165】
６．１１ 実施例１１：ヒト化マウス腫瘍モデルにおける腫瘍成長に対する、抗ＰＤ－１治療に後続するＡＺＤ７７８９の順次治療
３２匹の免疫不全ＮＳＧマウスに、３×１０６個のＰＣ９－ＭＡＲＴ－１細胞（黒色腫腫瘍抗原、ＭＡＲＴ－１を発現するように改変されたヒト腺癌細胞株）を皮下移植した。１４日目に、健康なドナーのＰＢＭＣに由来するＭＡＲＴ－１反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を静脈内投与した（５×１０６細胞／マウス）。１５、１７、２０日目並びに続いて２３、２７及び３０日目にマウスを腫瘍容積に基づいて無作為化し、被験物質及び対照物質を１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。抗ＰＤ－１で治療したマウスを、２１日目の３回目の用量から２４時間後、ベースラインからの腫瘍容積の倍数変化に基づいて再び無作為化し、抗ＰＤ－１の治療を継続した１０匹のマウス及びＡＺＤ７７８９の治療に切り替えた１０匹のマウスの２つのコホートに分割した。腫瘍容積のグラフ（図１３Ａ）は、アイソタイプ対照、ＡＺＤ７７８９、抗ＰＤ－１ ｍＡｂ ＬＯ１１５のみ及びＡＺＤ７７８９の順次治療が後続する抗ＰＤ－１（３用量の抗ＰＤ－１、それに続いて３用量のＡＺＤ７７８９）の間の治療の比較を示す。ｎ＝８マウス／治療であり、全ての処置は１０ｍｇ／ｋｇで投与した。統計は、テューキーの多重比較検定を用いた二元ＡＮＯＶＡによって評価した。グラフ内の時点５（２８日目）及び６（３１日目）で示される統計は、抗ＰＤ－１治療群と抗ＰＤ－１→ＡＺＤ７７８９治療群と比較する。＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。他の全ての統計は、最終治療から５日後の３５日目の時点での群を比較する。＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；＊＊＊、ｐ＜０．００１＊＊、ｐ＜０．０１；＊、ｐ＜０．０５。
３２匹の免疫不全ＮＳＧマウスに、３×１０６個のＰＣ９－ＭＡＲＴ－１細胞（黒色腫腫瘍抗原、ＭＡＲＴ－１を発現するように改変されたヒト腺癌細胞株）を皮下移植した。１４日目に、健康なドナーのＰＢＭＣに由来するＭＡＲＴ－１反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を静脈内投与した（５×１０６細胞／マウス）。１５、１７、２０日目並びに続いて２３、２７及び３０日目にマウスを腫瘍容積に基づいて無作為化し、被験物質及び対照物質を１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。抗ＰＤ－１で治療したマウスを、２１日目の３回目の用量から２４時間後、ベースラインからの腫瘍容積の倍数変化に基づいて再び無作為化し、抗ＰＤ－１の治療を継続した１０匹のマウス及びＡＺＤ７７８９の治療に切り替えた１０匹のマウスの２つのコホートに分割した。腫瘍容積のグラフ（図１３Ａ）は、アイソタイプ対照、ＡＺＤ７７８９、抗ＰＤ－１ ｍＡｂ ＬＯ１１５のみ及びＡＺＤ７７８９の順次治療が後続する抗ＰＤ－１（３用量の抗ＰＤ－１、それに続いて３用量のＡＺＤ７７８９）の間の治療の比較を示す。ｎ＝８マウス／治療であり、全ての処置は１０ｍｇ／ｋｇで投与した。統計は、テューキーの多重比較検定を用いた二元ＡＮＯＶＡによって評価した。グラフ内の時点５（２８日目）及び６（３１日目）で示される統計は、抗ＰＤ－１治療群と抗ＰＤ－１→ＡＺＤ７７８９治療群と比較する。＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。他の全ての統計は、最終治療から５日後の３５日目の時点での群を比較する。＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；＊＊＊、ｐ＜０．００１＊＊、ｐ＜０．０１；＊、ｐ＜０．０５。
【0166】
これらの結果は、抗原特異性ヒト化マウス腫瘍モデルにおいて、抗ＰＤ－１治療に後続するＡＺＤ７７８９の順次治療が、抗ＰＤ－１で連続的に治療されたマウスと比較して腫瘍成長を遅延させ得ることを実証する。これは、ＡＺＤ７７８９による処置が、抗ＰＤ－１療法に応答しなくなった患者に利益をもたらし得ることを示唆する。
【0167】
６．１２ 実施例１２：ヒト化マウス腫瘍モデルにおける腫瘍成長に対する、抗ＰＤ－１治療に後続するＡＺＤ７７８９の順次治療の効果
研究１日目に、免疫不全ＮＳＧマウスに、２×１０６個のＯＥ２１－１０ｘＧＳＶ３細胞（目的のウイルスペプチドを発現するように改変されたヒト食道扁平上皮細胞癌）を皮下移植した。７日後、健康なドナーから単離されたヒトＰＢＭＣに由来するウイルス反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を静脈内投与した（１×１０６細胞／マウス）。８日目に、腫瘍容積に基づいてマウスを割り当て治療群に無作為化した。９日目から、１０ｍｇ／ｋｇの被験物質及び対照物質を腹腔内投与した。図１３Ｂでは、９日目及び１１日目に、マウスにアイソタイプ対照又は抗ＰＤ－１を２用量投与し、その後、抗ＰＤ－１で治療したマウスを、ベースラインからの腫瘍容積の倍数変化を基準にして３つの個別の治療群に無作為化し、続いて、１４日目及び１７日目に、抗ＰＤ－１（αＰＤ－１連続）、アイソタイプ対照（αＰＤ→Ｉｓｏ対照）又はＡＺＤ７７８９（αＰＤ１→ＡＺＤ７７８９）のいずれかを２用量投与した。図１３Ｂのグラフは、２用量の順次治療から２４時間後の１８日目における治療群間の腫瘍容積の差を示す。一元ＡＮＯＶＡ、テューキーの多重比較検定によって群間差異の統計的有意性を分析した。図１３Ｃでは、９、１３及び１６日目に３用量の抗ＰＤ－１でマウスを治療し、その後、１６日目に後続の治療群に無作為化した。研究は、３体の健康なドナー由来のヒトＰＢＭＣを用いた（Ｄ８９６、Ｄ１０５１、Ｄ１０６３）。各記号は、再無作為化時点からの腫瘍容積の倍数変化を表す（３用量の抗ＰＤ－１後；１６日目から２０日目の第１の順次投与の２４時間後まで）。対応のないｔ検定により、治療群にわたる腫瘍容積の倍数変化間の比較の統計的有意性を分析した。水平バーは、群内の相加平均倍数変化を表す。＊＊、ｐ＜０．０１；＊、ｐ＜０．０５。ｎ＝１治療群あたり１０匹のマウス。全ての治療は、１０ｍｇ／ｋｇで投与された。
研究１日目に、免疫不全ＮＳＧマウスに、２×１０６個のＯＥ２１－１０ｘＧＳＶ３細胞（目的のウイルスペプチドを発現するように改変されたヒト食道扁平上皮細胞癌）を皮下移植した。７日後、健康なドナーから単離されたヒトＰＢＭＣに由来するウイルス反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を静脈内投与した（１×１０６細胞／マウス）。８日目に、腫瘍容積に基づいてマウスを割り当て治療群に無作為化した。９日目から、１０ｍｇ／ｋｇの被験物質及び対照物質を腹腔内投与した。図１３Ｂでは、９日目及び１１日目に、マウスにアイソタイプ対照又は抗ＰＤ－１を２用量投与し、その後、抗ＰＤ－１で治療したマウスを、ベースラインからの腫瘍容積の倍数変化を基準にして３つの個別の治療群に無作為化し、続いて、１４日目及び１７日目に、抗ＰＤ－１（αＰＤ－１連続）、アイソタイプ対照（αＰＤ→Ｉｓｏ対照）又はＡＺＤ７７８９（αＰＤ１→ＡＺＤ７７８９）のいずれかを２用量投与した。図１３Ｂのグラフは、２用量の順次治療から２４時間後の１８日目における治療群間の腫瘍容積の差を示す。一元ＡＮＯＶＡ、テューキーの多重比較検定によって群間差異の統計的有意性を分析した。図１３Ｃでは、９、１３及び１６日目に３用量の抗ＰＤ－１でマウスを治療し、その後、１６日目に後続の治療群に無作為化した。研究は、３体の健康なドナー由来のヒトＰＢＭＣを用いた（Ｄ８９６、Ｄ１０５１、Ｄ１０６３）。各記号は、再無作為化時点からの腫瘍容積の倍数変化を表す（３用量の抗ＰＤ－１後；１６日目から２０日目の第１の順次投与の２４時間後まで）。対応のないｔ検定により、治療群にわたる腫瘍容積の倍数変化間の比較の統計的有意性を分析した。水平バーは、群内の相加平均倍数変化を表す。＊＊、ｐ＜０．０１；＊、ｐ＜０．０５。ｎ＝１治療群あたり１０匹のマウス。全ての治療は、１０ｍｇ／ｋｇで投与された。
【0168】
この実施例は、第２の抗原特異性ヒト化マウス腫瘍モデルにおいて、抗ＰＤ－１治療に後続するＡＺＤ７７８９の順次治療が、抗ＰＤ－１抗体で連続的に治療されたマウスと比較して腫瘍成長を遅延させ得ることを実証する。この結果は、ＡＺＤ７７８９による処置が、抗ＰＤ－１療法に応答しなくなった患者に利益をもたらし得ることを示唆する。
【0169】
全体的に、これらの実施例は、ＡＺＤ７７８９が、異なる細胞のサブセットを調節して抗腫瘍応答を促進することを実証する（図１４）。
【0170】
６．１３ 実施例１３：結合エピトープの比較的特性評価
親抗体クローンＯ１３－１（ＡＺＤ７７８９に対する親クローン）及びＦ９Ｓの推定上の結合エピトープを、様々な方法で特性評価し、既知の抗ＴＩＭ－３抗体と比較した。下記の表５に示すように、Ｘ線結晶解析研究及び競合結合アッセイは、ｍＡｂ Ｏ１３－１がＴＩＭ－３ ＩｇＶドメインのＣ’Ｃ’’及びＤＥループに結合することを立証した。対照的に、試験されたその他の抗ＴＩＭ－３抗体の大部分が、主にＣＣ’及びＦＧループに結合した（図１５Ａ及びＢ；Ｇａｎｄｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１８；８：１７５１２を参照されたい）。１つの試験されたｍＡｂはＢＣ及びＣＣ’ループに結合し（国際公開第２０１５／１１７００２号パンフレット）、１つのｍＡｂはＤＥループに結合した（国際公開第２０１６／１１１９４７号パンフレット）。
親抗体クローンＯ１３－１（ＡＺＤ７７８９に対する親クローン）及びＦ９Ｓの推定上の結合エピトープを、様々な方法で特性評価し、既知の抗ＴＩＭ－３抗体と比較した。下記の表５に示すように、Ｘ線結晶解析研究及び競合結合アッセイは、ｍＡｂ Ｏ１３－１がＴＩＭ－３ ＩｇＶドメインのＣ’Ｃ’’及びＤＥループに結合することを立証した。対照的に、試験されたその他の抗ＴＩＭ－３抗体の大部分が、主にＣＣ’及びＦＧループに結合した（図１５Ａ及びＢ；Ｇａｎｄｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１８；８：１７５１２を参照されたい）。１つの試験されたｍＡｂはＢＣ及びＣＣ’ループに結合し（国際公開第２０１５／１１７００２号パンフレット）、１つのｍＡｂはＤＥループに結合した（国際公開第２０１６／１１１９４７号パンフレット）。
【0171】
【表8】
【0172】
表５に示すように、表で定義される方法を用いて、抗ＴＩＭ－３抗体によって結合されたヒトＴＩＭ－３免疫グロブリン可変（ＩｇＶ）ドメインのループへの結合を特性評価した。参照抗体のそれぞれが、列挙された結合ループに強固に結合したが、以下の２つの例外を除く：国際公開第２０１５／１１７００２号パンフレットに開示される様々な抗体は、ＢＣループに弱く結合し、国際公開第２０１６／１１１９４７Ａ２号パンフレットに開示されるｍＡｂ１５は、ＤＥループに弱く結合した。ＣＣ’及びＦＧドメインに結合し、ホスファチジルセリンをブロッキングした抗体（又は誘導体）は、Ｃ’Ｃ’’及びＤＥループに結合した抗体と比較して最も強い機能活性が報告され（国際公開第２０１６／１１１９４７Ａ２号パンフレット、米国特許出願公開第２０１８／００１６３３６Ａ１号明細書）；Ｃ’Ｃ’’及びＤＥループに結合した抗体（国際公開第２０１６／０７１４４８号パンフレット）は、最も特性評価された後続のＰＤ１／ＴＩＭ３二重特異性抗体に選択されなかった（国際公開第２０１７／０５５４０４号パンフレット）。
【0173】
更に、図１６Ａ及び図１６Ｂに示すように、２つの社内開発抗体であるクローン６２（ＡＺＤ７７８９のＴＩＭ－３アーム）及びＦ９Ｓは、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインに非競合的に結合する。Ｆ９Ｓ（図１６Ｂの明灰色のリボンで示される）は、ホスファチジルセリン及びＣａ＋＋イオン結合部位に近接するＣＣ’及びＦＧループ付近のＩｇＶドメイン（図１６Ａ）に結合する。クローン６２（黒い略画で示される）は、ＩｇＶベータサンドイッチの反対側に結合する。クローン６２エピトープは、ループＢＣ、Ｃ’Ｃ’’、ＤＥ及び短鎖Ｄを含む。
【0174】
この実施例は、ＡＺＤ７７８９が、ホスファチジルセリン結合の反対側でＴＩＭ－３ ＩｇＶドメイン上の固有のエピトープに結合することを立証する（図１５Ａ及び１５Ｂ（Ｇａｎｄｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１８；８：１７５１２））。この結合は、ＴＩＭ－３のＩｇＶドメインの折りたたみ又は構造に変化を導入せず、ＴＩＭ－３とホスファチジルセリンとの相互作用をブロッキングしない（図２）。代わりに、ＡＺＤ７７８９は、ＴＩＭ－３とホスファチジルセリンとの間のエンゲージメントを増加させる（図２）。この固有の機序は、Ｔ細胞媒介性抗腫瘍反応を、既知のホスファチジルセリンブロッキング抗ＴＩＭ３抗体から観察されるものを超えて改善する（図１１～１３）。
【0175】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によってその範囲を限定されるべきではない。実際、記載されたものだけでなく、本発明の様々な変更形態が前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような変更形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【0176】
本明細書で引用される全ての参考文献（例えば、公報又は特許若しくは特許出願）は、それぞれの個々の参考文献（例えば、公報又は特許若しくは特許出願）が、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれると具体的且つ個別に示されるのと同じ程度に、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0177】
配列表
【0178】
【表9】
【0179】
【表10】
【0180】
【表11】
【0181】
【表12】
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B-13C】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【配列表】
【国際調査報告】