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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-02
(54)【発明の名称】免疫療法における使用のための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20240326BHJP
A61K 31/506 20060101ALI20240326BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240326BHJP
A61K 31/7084 20060101ALI20240326BHJP
A61K 47/69 20170101ALI20240326BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240326BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20240326BHJP
A61K 35/768 20150101ALI20240326BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240326BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240326BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240326BHJP
C12N 15/861 20060101ALN20240326BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20240326BHJP
C12N 7/00 20060101ALN20240326BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 N
A61K31/506
A61K45/00
A61K31/7084
A61K47/69
A61K35/12
A61K35/761
A61K35/768
A61P35/00
A61P43/00 121
C12N15/12 ZNA
C12N15/861 Z
C07K16/28
C12N7/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023565145
(86)(22)【出願日】2022-04-20
(85)【翻訳文提出日】2023-12-06
(86)【国際出願番号】 EP2022060422
(87)【国際公開番号】W WO2022223619
(87)【国際公開日】2022-10-27
(31)【優先権主張番号】21305522.1
(32)【優先日】2021-04-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509181699
【氏名又は名称】アンスティテュ・クリー
(71)【出願人】
【識別番号】507002516
【氏名又は名称】アンセルム（アンスティチュート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル）
(71)【出願人】
【識別番号】523397366
【氏名又は名称】スティミュニティ
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ニコラス・マネル
(72)【発明者】
【氏名】バッコス・ネイド
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C085
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065AC20
4B065CA44
4C076AA09
4C076AA19
4C076AA95
4C076BB01
4C076BB11
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB16
4C076CC27
4C076EE41
4C076FF21
4C084AA19
4C084MA02
4C084MA52
4C084MA66
4C084NA05
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC75
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB36
4C085CC23
4C085EE03
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4C085GG06
4C085GG08
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC50
4C086EA16
4C086GA07
4C086GA08
4C086GA10
4C086GA12
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA52
4C086MA66
4C086NA05
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB63
4C087BB65
4C087CA12
4C087MA02
4C087MA52
4C087MA66
4C087NA05
4C087ZB26
4C087ZC75
4H045AA11
4H045AA30
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、i)インターフェロン遺伝子刺激因子(STING)アクチベーターとii)抗制御性T細胞(Treg)剤とを含む医薬組合せに、及びその使用、特に、がんの又はSTING媒介疾患若しくは障害の処置のためのその使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
i)インターフェロン遺伝子刺激因子(STING)アクチベーターを含むベクターとii)イマニチブ又はその誘導体若しくは塩;ダサチニブ又はその誘導体若しくは塩;IgG2定常領域又は変異したIgG1定常領域を有する抗CTLA-4抗体;抗LAG3抗体;抗TIM-3抗体;抗ICOS抗体;抗CD25抗体;抗CCR4抗体;抗CCR8抗体;抗TNFR2抗体;及びこれらに任意の組合せから選択される抗制御性T細胞(Treg)剤とを含む医薬組合せ。
【請求項2】
前記STINGアクチベーターが、小分子、特に、サイクリックジヌクレオチド;STINGアゴニストをコードする核酸;STING又はSTINGアゴニストを発現するベクター又は細胞;抗体コンジュゲートSTINGアゴニスト;及びエクトヌクレオチドピロホスファターゼホスホジエステラーゼ1(ENPP1)の阻害剤から選択される、請求項1に記載の組合せ。
【請求項3】
前記小分子が、サイクリックジヌクレオチド、例えば、サイクリックグアノシン一リン酸-アデノシン一リン酸(cGAMP)、サイクリック二量体グアノシン一リン酸(c-di-GMP)又はサイクリック二量体アデノシン一リン酸(c-di-AMP)である、請求項2に記載の組合せ。
【請求項4】
前記ベクターが、小胞、特に、リポソーム;エキソソーム;ウイルス、例えば、アデノウイルス若しくは腫瘍溶解性ウイルス;ウイルス様粒子(VLP);ポリマー;又はヒドロゲルである、請求項1から3のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項5】
前記ウイルス様粒子(VLP)が、ウイルス融合性糖タンパク質を含むリポタンパク質エンベロープを含み、及びサイクリックグアノシン一リン酸-アデノシン一リン酸(cGAMP)を含有し、前記cGAMPが、前記ウイルス様粒子にパッケージングされている、請求項4に記載の組合せ。
【請求項6】
前記STINGアクチベーターが、ジチオ-(RP,RP)-[サイクリック[A(20,50)pA(30,50)p]](ML RR-S2 CDA、別名ADU-S100);MK-1454;5,6-ジメチル-キサンテノン酢酸(DMXAA);フラボン-8-酢酸(FAA);10-カルボキシメチル-9-アクリダノン(CMA);α-マンゴスチン(キサントン);ML RR-S2 CDG;ML RR-S2 cGAMP;6-ブロモ-N-(ナフタレン-1-イル)ベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-カルボキサミド(BNBC);ジスピロジケトピペラジン(DSDP);2'3'-cGSASMP;大環状分子架橋STINGアゴニスト(MBSA);E7766;ベンゾチオフェンオキソブタン酸(MSA-2)誘導体;SB11285;ジアミドベンゾイミダゾール(diABZI);IMSA-101、TAK-676;CRD5500;TTI-10001;及びSEL312-4787から選択される小分子である、請求項2に記載の組合せ。
【請求項7】
前記抗CTLA4抗体の前記IgG1定常領域の前記変異が、前記(Fc)定常領域のCH2ドメインに位置する、請求項1から6のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項8】
前記変異が、233、234、235、236、237、238、239、243、247、256、262、267、268、270、271、280、290、292、298、300、305、324、326、328、330、332、333、334、339又は396(EUインデックス)から選択されるアミノ酸位置に存在する、請求項7に記載の組合せ。
【請求項9】
前記Fc定常領域の2つのCH2ドメインの各々が、239、330及び332から選択されるアミノ酸位置における少なくとも1つの変異、好ましくは、S239D、A330L及び/又はI332E置換を含む、請求項8に記載の組合せ。
【請求項10】
前記Fc定常領域の第1のCH2ドメインが、234、235、236、239、268、270、298から選択されるアミノ酸位置における少なくとも1つの変異、好ましくは、L234Y、L235Q、G236W、S239M、H268D、D270E及びS298Aから選択される置換を含み、前記Fc定常領域の第2のCH2ドメインが、270、326、330及び334から選択されるアミノ酸位置における少なくとも1つの変異、好ましくは、D270E、K326D、A330M及びK334Eから選択される置換を含む、請求項8に記載の組合せ。
【請求項11】
対象におけるがんの予防又は処置における使用のための、請求項1から10のいずれか一項に記載の医薬組合せ。
【請求項12】
前記STINGアクチベーターが、皮下、経口、腹腔内、筋肉内、皮内又は静脈内経路により前記対象に投与されることになる、請求項11に記載の使用のための医薬組合せ。
【請求項13】
前記抗Treg剤が、腹腔内、経口、皮下又は静脈内経路により前記対象に投与されることになる、請求項11又は12に記載の使用のための医薬組合せ。
【請求項14】
少なくとも2つの部分を含むキットであって、第1の部分が、インターフェロン遺伝子刺激因子(STING)アクチベーターを含むベクターを含み、第2の部分が、抗制御性T細胞(Treg)剤を含み、前記キットの前記第1及び第2の部分が、好ましくは、別個の区画又は容器内にある、キット。
【請求項15】
前記インターフェロン遺伝子刺激因子(STING)アクチベーターが、請求項5に記載のウイルス様粒子(VLP)であり、前記抗制御性T細胞(Treg)剤が、イマチニブ若しくはその誘導体若しくは塩、又はIgG2定常領域若しくは変異したIgG1定常領域を有する抗CTLA-4抗体のどちらかである、請求項14に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫療法に、特に、宿主の免疫応答を増強する組成物及び方法に、より具体的には、エフェクターT細胞を誘導し、制御性T細胞、好ましくは腫瘍内制御性T細胞の宿主免疫応答を抑制する能力を遮断するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【0002】
腫瘍の発生には3つの主要なステージがある。最初のステージの間、免疫細胞は、インターフェロン-γ(IFN-γ)産生及びリンパ球エフェクター機能のおかげで形質転換細胞の生成を継続的に排除する。腫瘍発生の第2のステージは、動力学的バランスの平衡相であり、ここで、IFN-γ産生及びリンパ球エフェクター機能は、腫瘍細胞を容赦なく攻撃することによって腫瘍成長を妨げるが、形質転換細胞を根絶することはできない。この平衡ステージは、排除を免れる細胞における腫瘍不均一性及び遺伝的不安定性の発生を可能にする。腫瘍発生の最終ステージは、逃避である。平衡相の間に選択された腫瘍細胞バリアントは、今や、有能な免疫系の存在下であってもチェックされずに成長することができる(Dunnら、2004、Immunity、21巻、137～148頁)。
【0003】
腫瘍は、腫瘍特異的CD8+細胞傷害性T細胞(CTL)への陽性シグナルの下方制御並びに腫瘍微小環境(TME)内、即ち腫瘍内及び周辺への制御性T(Treg)細胞の蓄積をはじめとする複数の機序を、免疫異物排除を回避するために利用する。Tregは、エフェクターCD4+及びCD8+並びにナチュラルキラー(NK)細胞等の様々な免疫細胞に影響を及ぼすが樹状細胞活性化を阻害する制御特性が与えられたCD4+T細胞の抑制性サブセットであることが、今では確立されている。機能的には、Tregは、サイトカイン(TGF-β1)及びIL-10の分泌、CD39及びCD73による代謝的破壊(Deaglioら、2007、J Exp Med.、204巻(6):1257～65頁)、又はプログラム死リガンド1(PD-L1)シグナル伝達による接触依存的阻害(Wuら、2018、Oncoimmunology、7巻、11号、e1500107)等の、幾つかの機序によって、CLTの増殖及び致死活性を阻害することができる。Tregによる高腫瘍浸潤、及びエフェクターT細胞(Teff)のTregに対する低い比は、固形腫瘍における転帰不良に関連付けられる。
【0004】
Tregは、高親和性IL-2受容体、CD25、及び転写因子フォークヘッドボックスP3(Foxp3)を発現することを特徴とする(Shimon Sakaguchiら、2008、Eur. J. Immunol. 38: 901～937頁)。Foxp3は、Treg細胞における主要制御因子であり、それらの発生及び抑制機能に不可欠である(Maruyamaら、2011、Semin. Immunol.、23巻(6):418～23頁)。腫瘍進行中に観察されるTreg発現は、天然に存在するTreg(nTreg)の増殖に起因することもあり、又はIL-2及びTGF-b1の存在下でのCD4+CD25-FoxP3-T細胞のCD4+CD25+FoxP3+Treg(iTreg)への変換に起因することもある。それらの抑制機能の点では同一であるが、これらの細胞は、Foxp3についてのそれらの不安定性の点で異なる。nTREGでは、Foxp3発現が非常に安定しており、構成的に発現されるが、腫瘍部位で誘導されるもの等のiTREGでは、Foxp3発現が不安定である(Floessら、2007、PLoS Biol. 2007年2月;5(2): e38)。腫瘍におけるFoxp3転写レベルの測定によって、腫瘍微小環境におけるTregの量の明白な証拠は得られない。腫瘍不均一性は、がん免疫療法の成功を妨げる第1の障害である。
【0005】
多くの型のがんにおいて、免疫チェックポイント分子、例えば、プログラム死1(PD-1)並びに他の阻害性受容体、例えば、T細胞免疫グロブリンムチン3(TIM-3)、細胞傷害性Tリンパ球抗原-4(CTLA-4)、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体(GITR)、及びリンパ球活性化遺伝子-3(LAG-3)の上方制御が、腫瘍浸潤Treg細胞において起こる(Parkら、2012、Cell Immunol.、278(1-2):76～83頁)。T細胞Ig及びITIMドメイン(TIGIT)といった別の免疫チェックポイントも、Tregに存在する(Kimら、2019、Journal for ImmunoTherapy of Cancer 7:339頁)。
【0006】
Tregは、免疫細胞による腫瘍の根絶にとっての高い障壁の1つであるため、薬物及び抗体を使用するそれらの治療的枯渇又はそれらの機能的不活性化は、がん免疫療法に対する応答を改善する。Treg上に発現される幾つかの受容体及び酵素が、抗腫瘍免疫を増強するための潜在的標的として同定されている(Sundeeら、2021、Eur.J. Immunol.、51:280～291頁)。しかし、エフェクターT細胞及びNK細胞をはじめとする他の免疫細胞上のこれらの受容体の一部の発現に起因して、がんの免疫治療的処置としてのそれらの使用の妥当性は、まだ議論中である。更に、制御性T細胞(Treg)、特に腫瘍内制御性T細胞の適切な数及び機能が、バランスのとれた免疫系には不可欠であること:例えば、これらの細胞の過少は自己免疫につながり、過多は効率的な免疫応答を妨げ、抗腫瘍免疫にとって有害な結果を伴うことに留意すべきである。
【0007】
ヒト化IgG1抗ヒトCD25抗体であるダクリズマブ、又はヒトIL-2とジフテリア毒素の断片を併せ持つ組換え融合タンパク質であるデニロイキンジフチトクス、又は抗ヒトCD25 FvとシュードモナスエンドトキシンA(PE)を併せ持つ融合タンパク質であるLMB-2と組み合わせた、ワクチンの使用を探究する臨床研究には、循環Tregの数及びワクチン誘導性免疫に対する影響にばらつきがあった(Lukeら、2016、Journal for ImmunoTherapy of Cancer 4:35頁/Jacobsら、2010、Clin Cancer Res 16:5067～5078頁/Powellら、2007、J Immunol.、179(7): 4919～4928頁)。その上、抗CD25抗体を使用するTregの腫瘍における選択的排除又は不活性化は、依然として大きな課題である。なぜなら、これらの細胞は、活性化された従来型の非抑制性T細胞と同じ細胞マーカー(CD25)を共有するからである。Tregの完全な枯渇は、自己寛容機序を大きく損なわせる可能性がある。それ故に、Tregの全身的な枯渇は、がん処置に適した選択肢ではない可能性がある。
【0008】
別のアプローチは、阻害性分子の結合を遮断し、抗腫瘍免疫応答を高めるために、免疫チェックポイント遮断(ICB)抗体の使用に頼る。現在では、市販されている幾つかのFDAにより承認されたICB抗体が、CTLA-4に対して(イピリムマブ)、PD-1に対して(ペムブロリズマブ、ニボルマブ及びセミプリマブ)、及びPD-L1に対して(アテゾリズマブ、アベルマブ及びデュルバルマブ)存在する。免疫療法の大きな進歩にもかかわらず、ICB抗体の臨床使用は、少数のがん型に限られている(C. Lee Ventola、2017、P&T(登録商標)、42巻8号)。更に、ICB抗体に対する獲得耐性が追加の処置の必要性を明示している。
【0009】
インターフェロン遺伝子刺激因子(STING)タンパク質は、サイクリックジヌクレオチドを認識し、それに結合する、小胞体に局在する膜貫通受容体である。対象において免疫応答を誘導することができるSTINGアゴニストを含むアジュバント製剤は、WO2019136118において開示されている。これらの製剤は、細胞からの抗原放出を誘導するための手段として使用されたとき、処置中に細胞から放出される抗原の免疫原性を増強する。がんの処置において免疫活性を増大させるための別の選択肢は、STINGアゴニストの及びプリン作動性受容体アゴニストの組合せの使用である(WO2020/227159)。チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用される他のSTINGアゴニスト、特に、化合物番号14は、組合せに曝露された幾つかのマウス相乗的腫瘍モデルにおいて数日間、有益な効果をもたらす(WO2021/005541)。しかし、逆に最近の研究は、適応抗腫瘍免疫応答に対するSTING活性化の、とりわけ、T細胞増殖を阻害すること及びそれらの死を促進することによる、潜在的阻害効果を示唆している。更に、STINGの非免疫機能は、転移性がん細胞の生存及び成長を助長すると記載されている(Zhuら、2019、Molecular Cancer、18:152頁)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】WO2019136118
【特許文献2】WO2020/227159
【特許文献3】WO2021/005541
【特許文献4】国際特許出願WO2014/093936
【特許文献5】国際特許出願WO2014/189805
【特許文献6】国際特許出願WO2013/185052
【特許文献7】国際特許出願WO2015/077354
【特許文献8】国際特許出願WO2015/185565
【特許文献9】米国特許出願公開第2014/0341976号
【特許文献10】国際特許出願WO2011/138251
【特許文献11】EP 3430147 B1
【特許文献12】国際特許出願WO 2017/175147
【特許文献13】国際特許出願WO 2019/069270
【特許文献14】米国特許第4,889,803号
【特許文献15】米国特許第5,047,335号
【特許文献16】国際特許出願WO2018/200812
【特許文献17】米国特許第5,500,161号
【非特許文献】
【0011】
【非特許文献1】Dunnら、2004、Immunity、21巻、137～148頁
【非特許文献2】Deaglioら、2007、J Exp Med.、204巻(6):1257～65頁
【非特許文献3】Wuら、2018、Oncoimmunology、7巻、11号、e1500107
【非特許文献4】Shimon Sakaguchiら、2008、Eur. J. Immunol. 38: 901～937頁
【非特許文献5】Maruyamaら、2011、Semin. Immunol.、23巻(6):418～23頁
【非特許文献6】Floessら、2007、PLoS Biol. 2007年2月; 5(2): e38
【非特許文献7】Parkら、2012、Cell Immunol.、278(1-2):76～83頁
【非特許文献8】Kimら、2019、Journal for ImmunoTherapy of Cancer 7:339頁
【非特許文献9】Sundeeら、2021、Eur.J. Immunol.、51:280～291頁
【非特許文献10】Lukeら、2016、Journal for ImmunoTherapy of Cancer 4:35頁
【非特許文献11】Jacobsら、2010、Clin Cancer Res 16:5067～5078頁
【非特許文献12】Powellら、2007、J Immunol.、179(7): 4919～4928頁
【非特許文献13】C. Lee Ventola、2017、P&T(登録商標)、42巻8号
【非特許文献14】Zhuら、2019、Molecular Cancer、18:152頁
【非特許文献15】Corrales及びGajewski、2015、Clin Cancer Res.、21(21):4774～4779頁
【非特許文献16】Fengら、2020、Drug Discovery Today、25巻(1)、230～237頁
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【非特許文献34】Allison、1998、Dev. Biol. Stand.、92:3～11頁
【非特許文献35】Unkelessら、1998、Annu. Rev. Immunol.、6:251～281頁
【非特許文献36】Phillipsら、1992、Vaccine、10: 151～158頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
したがって、特に、Treg細胞の免疫抑制作用の操作を最適化するために使用するための、特に、がんの処置を改善するために使用するための、治療剤及び方法が、強く求められている。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明は、インターフェロン遺伝子刺激因子(STING)経路の活性化を、制御性T細胞(Treg)亜集団の、より一層好ましくは腫瘍内制御性T細胞の調節、好ましくは阻害、と組み合わせることが、がんの処置を有意に且つ有利に改善することを可能にするという発見に、少なくとも一部は基づく。
【0014】
本発明は、i)STING(インターフェロン遺伝子刺激因子)アクチベーター、好ましくは、ベクター化形態のSTINGアクチベーター、即ち、STINGアクチベーターを含む(含有する又は発現する)ベクター、言い換えると、ベクター化STINGアクチベーターとii)イマニチブ又はその誘導体若しくは塩;ダサチニブ又はその誘導体若しくは塩;IgG2定常領域又は変異したIgG1定常領域を有する抗CTLA-4抗体;抗LAG3抗体;抗TIM-3抗体;抗ICOS抗体;抗CD25抗体;抗CCR4抗体;抗CCR8抗体;抗TNFR2抗体;及びこれらに任意の組合せから選択される抗制御性T細胞(Treg)剤、好ましくは抗腫瘍内Treg剤とを含む組成物/組合せに関する。
【0015】
本発明者により記載される本明細書における組成物/組合せは、実験を目的としてin vitro、及び治療を目的としてin vivo、両方に適している。本発明は、i)STING(インターフェロン遺伝子刺激因子)アクチベーター、好ましくは、ベクター化形態のSTINGアクチベーター、即ち、STINGアクチベーターを含む(含有する又は発現する)ベクターと、ii)イマニチブ又はその誘導体若しくは塩;ダサチニブ又はその誘導体若しくは塩;IgG2定常領域又は変異したIgG1定常領域を有する抗CTLA-4抗体;抗LAG3抗体;抗TIM-3抗体;抗ICOS抗体;抗CD25抗体;抗CCR4抗体;抗CCR8抗体;抗TNFR2抗体;及びこれらに任意の組合せから選択される抗制御性T細胞(Treg)剤、好ましくは抗腫瘍内Treg剤とを含む医薬組成物/組合せ、例えば、治療用医薬組成物/組合せ、ワクチン用又は獣医学用組成物/組合せに、特に関する。
【0016】
好ましくは、STINGアクチベーターは、小分子、特に、サイクリックジヌクレオチド;STINGアゴニストをコードする核酸;STING又はSTINGアゴニストを発現するベクター又は細胞;抗体コンジュゲートSTINGアゴニスト;及びエクトヌクレオチドピロホスファターゼホスホジエステラーゼ1(ENPP1)の阻害剤から選択される。
【0017】
好ましくは、サイクリックジヌクレオチドは、サイクリックグアノシン一リン酸-アデノシン一リン酸(cGAMP)、サイクリック二量体グアノシン一リン酸(c-di-GMP)、サイクリック二量体アデノシン一リン酸(c-di-AMP)、又はそのベクター化形態である。より好ましくは、cGAMPサイクリックジヌクレオチドは、2'-3'-サイクリックGMP-AMP若しくは3'-3'-サイクリックGMP-AMP又はこれらの混合物である。
【0018】
好ましくは、STINGアクチベーターを含むベクターは、小胞、特に、リポソーム;エキソソーム、例えば、exoSTING(商標);ウイルス、例えば、アデノウイルス若しくは腫瘍溶解性ウイルス;ウイルス様粒子(VLP);ポリマー;又はヒドロゲルである。
【0019】
特定の態様では、STINGアクチベーターは、ベクター化ジヌクレオチドであり、ベクター化ジヌクレオチドは、ウイルス様粒子(VLP)であって、ウイルス融合性糖タンパク質を含むリポタンパク質エンベロープを含み、及びサイクリックグアノシン一リン酸-アデノシン一リン酸(cGAMP)を含有し、cGAMPが前記ウイルス様粒子にパッケージングされている、ウイルス様粒子(VLP)である。
【0020】
別の態様では、STINGアクチベーターは、小分子であり、小分子は、ジチオ-(RP,RP)-[サイクリック[A(20,50)pA(30,50)p]](ML RR-S2 CDA、別名ADU-S100);MK-1454;5,6-ジメチル-キサンテノン酢酸(DMXAA);フラボン-8-酢酸(FAA);10-カルボキシメチル-9-アクリダノン(CMA);α-マンゴスチン(キサントン);ML RR-S2 CDG;ML RR-S2 cGAMP;6-ブロモ-N-(ナフタレン-1-イル)ベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-カルボキサミド(BNBC);ジスピロジケトピペラジン(DSDP);2'3'-cGSASMPという名の、2'3'cGAMPのビスホスホロチオエートアナログ;大環状分子架橋STINGアゴニスト(MBSA);E7766という名のADU-S100のMBSA誘導体;ベンゾチオフェンオキソブタン酸(MSA-2)誘導体;SB11285;ジアミドベンゾイミダゾール(diABZI);IMSA-101、TAK-676;CRD5500;TTI-10001;及びSEL312-4787から選択される。
【0021】
好ましい態様では、抗Treg剤は、IgG2定常領域を有する抗CTLA-4抗体、例えば、トレメリムマブ(CP-675,206)である。
【0022】
別の好ましい態様では、抗制御性T細胞(Treg)剤は、変異したIgG1定常領域を有する抗CTLA-4抗体、例えば、BMS 986249(若しくは別名CTLA4-プロボディ)、BMS-986288(若しくは別名CTLA4-NF)、ザリフレリマブ(若しくは別称AGEN1884)、クアボンリマブ(若しくは別称MK-1308)、HBM4003(Harbour BioMed社からの)又はONC-392である。
【0023】
別の好ましい態様では、抗制御性T細胞(Treg)剤、好ましくは、抗腫瘍内Treg剤は、IgG1定常領域の変異が(Fc)定常領域のCH2ドメインに位置する、抗CTLA-4抗体である。
【0024】
更なる好ましい態様では、抗Treg剤、好ましくは、抗腫瘍内Treg剤は、IgG1定常領域の変異が(Fc)定常領域のCH3ドメインに位置する、抗CTLA-4抗体である。
【0025】
別の好ましい態様では、抗Treg剤、好ましくは、抗腫瘍内Treg剤は、IgG1定常領域の変異がFab領域のCH1ドメインに位置する、抗CTLA-4抗体である。
【0026】
ある態様では、抗腫瘍内抗制御性T細胞(Treg)剤は、イマチニブ又はその誘導体若しくは塩である。
【0027】
別の態様では、抗腫瘍内抗制御性T細胞(Treg)剤は、ダサチニブ又はその誘導体若しくは塩である。
【0028】
特定の実施形態では、STINGアクチベーターを含有するVLP、イマチニブ、及び免疫チェックポイント阻害剤は、組み合わせて、特に、本発明の組成物において使用される。
【0029】
別の実施形態では、STINGアクチベーターを含有するVLP、IgG2定常領域又は変異したIgG1定常領域を有する抗CTLA4阻害剤、及び免疫チェックポイント阻害剤は、組み合わせて、特に、本発明の組成物において使用される。
【0030】
重ねて別の特定の態様では、STINGアクチベーターを含有するVLP、抗CD25抗体、特に、IgG2定常領域又は変異したIgG1定常領域を有する抗CD25阻害剤、及び免疫チェックポイント阻害剤は、組み合わせて、特に、本発明の組成物において使用される。
【0031】
本発明は、医薬としての使用のための、本明細書に記載の医薬組成物/組合せ、特に、治療用、ワクチン用又は獣医学用組成物/組合せにも関する。本発明は、特に、対象におけるがんの又はSTING媒介疾患若しくは障害の、好ましくはがんの、予防又は処置における使用のためのそのような組成物/組合せに関する。
【0032】
本発明は、対象におけるがん又はSTING媒介疾患若しくは障害、特にがんを処置のための、或いは対象におけるがん又はSTING媒介疾患若しくは障害を予防するための、特にがん再燃を予防するための、方法にも関する。この方法は、本明細書で開示の組成物、特に、医薬組成物、ワクチン用組成物又は獣医用組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。本発明は、特に、対象におけるがんを予防又は処置するための医薬又はワクチンの製造のための、本明細書で開示の組成物、特に、医薬組成物、ワクチン用組成物又は獣医学用組成物の使用に関する。本発明は、がんを予防又は処置するための、特に、がん再燃を予防するための、使用のための本明細書で開示の医薬組成物/組合せ、ワクチン用組成物/組合せ又は獣医学用組成物/組合せにも関する。
【0033】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象において治療免疫効果を誘導又は刺激するための方法に関する。方法は、i)STING(インターフェロン遺伝子刺激因子)アクチベーター、好ましくは、ベクター化形態のSTINGアクチベーター、即ち、STINGアクチベーターを含む(含有する又は発現する)ベクターとii)本明細書に記載の、抗制御性T細胞(Treg)剤、好ましくは、抗腫瘍内Treg剤とを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することにより、Treg細胞の免疫抑制活性を低下させる又は阻害するステップを含み、Treg細胞、特に、腫瘍内Treg細胞の活性を低下させる又は阻害することにより、対象において、対象が罹患している疾患、典型的にはがんに対する治療効果が誘導される。
【0034】
更なる態様では、本発明は、対象における免疫抑制機能を低下させる又は阻害する方法に関する。方法は、i)STING(インターフェロン遺伝子刺激因子)アクチベーター、好ましくは、ベクター化形態のSTINGアクチベーター、即ち、STINGアクチベーターを含む(含有する又は発現する)ベクターとii)本明細書に記載の抗制御性T細胞(Treg)剤、好ましくは、抗腫瘍内Treg剤とを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することにより、Treg細胞の免疫抑制活性を低下させる又は阻害するステップを含み、Treg細胞の活性を低下させる又は阻害することにより、対象における免疫抑制機能が低下又は阻害される。
【0035】
好ましくは、STINGアクチベーターは、対象に、全身性経路、特に、皮下(s.c.)、経口、腹腔内(i.p.)、筋肉内(i.m.)、皮内(i.d.)、又は静脈内(i.v.)経路、好ましくは、皮下経路により、投与されることになる。
【0036】
好ましくは、抗Treg剤は、全身性経路、特に、腹腔内、経口、皮下又は静脈内経路により投与されることになる。
【0037】
本発明は、少なくとも2つの部分を含むキットであって、第1の部分が、STING(インターフェロン遺伝子刺激因子)アクチベーター、好ましくは、ベクター化形態のSTINGアクチベーター、即ち、STINGアクチベーターを含む(含有する又は発現する)ベクターを含み、第2の部分が、抗制御性T細胞(Treg)剤、好ましくは、抗腫瘍内Treg剤を含み、キットの第1及び第2の部分が、好ましくは、別個の区画又は容器内にある、キットにも関する。
【0038】
特定の態様では、キットの第1の部分は、ウイルス様粒子(VLP)である、ベクター化形態のSTING(インターフェロン遺伝子刺激因子)アクチベーター、言い換えると、STINGアクチベーターを含む(含有する又は発現する)ベクターを含み、キットの第2の部分は、イマチニブ又はその誘導体若しくは塩であるか或いはIgG2定常領域又は変異したIgG1定常領域を有する抗CTLA-4である、抗制御性T細胞(Treg)剤、好ましくは、抗腫瘍内Treg剤を含む。
【0039】
本発明は、対象におけるがん又はSTING媒介疾患若しくは障害、好ましくはがんを予防又は処置するための医薬の製造のための、本明細書に記載の組成物の又はキットの使用にも関する。
【図面の簡単な説明】
【0040】
【図1】MCA-OVA腫瘍モデルにおいてイマチニブ化学療法剤と組み合わせたcGAMP-VLPの効果を研究するための実験計画の概要の図である。MCA-OVA腫瘍細胞注射(s.c.)の6日後に、マウスを4つの処置群:(1)PBS+PBS;(2)PBS+イマチニブ 10mg/kg;(3)cGAMP-VLP(50ng cGAMP)+PBS及び(4)cGAMP-VLP(50ng cGAMP)+イマチニブ 10mg/kgに、無作為に割り当てた。cGAMP-VLPを皮下(s.c.)経路によって投与し、イマチニブを腹腔内(i.p.)経路によって投与した。
【図2】6日目にcGAMP-VLP又はビヒクル(PBS)で処置したMCA-OVA腫瘍担持マウスにおける血清中炎症性サイトカインレベル(pg/mL)の図である。6日目の処置の3時間後に、血清試料を、s.c.注射後のマウスの別々の群から収集した。
【図3】特異的CD8及びCD4 T細胞応答の図である。cGAMP-VLPの初回s.c.注射の10日後、末梢血単核細胞(PBMC)をOVA及びp15ペプチドで刺激し、IFN-γ ELISPOTにより評価した。
【図4】図に示された異なる処置での経時的な腫瘍成長(cm3)の平均値の図である。
【図5】図に示された異なる処置での21日目の腫瘍成長(cm3)の平均値の図である。
【図6】全ての群の生存曲線である。死亡イベントは、腫瘍サイズ>2cm3と定義されている。ログランク(マンテル-コックス)検定を使用して、統計量を計算した。
【図7】イマチニブ処置中のマウスの体重減少のパーセンテージの図である。
【図8】MCA-OVA腫瘍モデルにおいて抗Treg剤CTLA-4-mIgG2aと組み合わせたcGAMP-VLPの効果を研究するための実験計画の概要の図である。MCA-OVA腫瘍細胞注射(s.c.)の6日後に、マウスを4つの処置群:(1)PBS+抗IgG2aアイソタイプ;(2)PBS+抗CTLA4-mIgG2a;(3)cGAMP-VLP(50ng cGAMP)+抗IgG2aアイソタイプ及び(4)cGAMP-VLP(50ng cGAMP)+抗CTLA4-mIgG2aに、無作為に割り当てた。cGAMP-VLPを皮下(s.c.)経路によって投与し、抗体を腹腔内(i.p.)経路によって投与した。
【図9】6日目にcGAMP-VLP、及び/又は抗CTLA4-mIgG2a又はビヒクル(PBS)で処置したMCA-OVA腫瘍担持マウスにおける血清中炎症性サイトカインレベル(pg/mL)の図である。6日目の処置の3時間後に、血清試料を、s.c.注射後のマウスの別々の群から収集した。
【図10】抗CTLA4-mIgG2a及びアイソタイプのi.p.注射後のMCA-OVA腫瘍、血液及び脾臓におけるフローサイトメトリーによるTregのパーセンテージ及び数の測定結果の代表プロットである。
【図11】抗CTLA4-mIgG2a及びアイソタイプのi.p.注射後のMCA-OVA腫瘍、血液及び脾臓におけるフローサイトメトリーによるTregのパーセンテージ及び数の測定結果の代表プロットである。
【図12】抗体のi.p.注射の48時間後の腫瘍試料(MCA-OVA腫瘍)における全CD45+TCRb+CD4+T細胞に対するFOXP3+Treg細胞のパーセンテージ及び数とCD4+/Treg及びCD8+/Treg細胞比の図である。
【図13】i.p.抗体注射の48時間後の血液における全CD45+TCRb+CD4+T細胞に対するFOXP3+Treg細胞のパーセンテージとCD4+/Treg及びCD8+/Treg細胞比の図である。
【図14】i.p.抗体注射の48時間後の脾臓における全CD45+TCRb+CD4+T細胞に対するFOXP3+Treg細胞のパーセンテージとCD4+/Treg及びCD8+/Treg細胞比の図である。
【図15】特異的CD8及びCD4 T細胞応答の図である。抗CTLA4-mIgG2aを伴う又は伴わないcGAMP-VLPの初回s.c.注射の10日後、末梢血単核細胞(PBMC)をOVA及びp15ペプチドで刺激し、IFN-γ ELISPOTにより評価した。
【図16】特異的CD8及びCD4 T細胞応答の図である。抗CTLA4-mIgG2aを伴う又は伴わないcGAMP-VLPの初回s.c.注射の10日後、末梢血単核細胞(PBMC)をOVA及びp15ペプチドで刺激し、IFN-γ ELISPOTにより評価した。
【図17】ノギスでの腫瘍サイズ(cm3)の測定結果の図である。全ての線が個々のC57BL/6Jマウスを表す。
【図18】図に示された及び実施例2で示される異なる処置での経時的な腫瘍成長の平均値の図である。
【図19】全ての群の生存曲線である。死亡イベントは、腫瘍サイズ>2cm3と定義されている。ログランク(マンテル-コックス)検定を使用して、統計量を計算した。
【図20】95日目のMCA-OVA再チャレンジ(s.c.)後の担腫瘍マウス及び無腫瘍マウスの腫瘍体積の図である。CR、完全レスポンダーマウス。
【図21】MCA-OVA腫瘍モデルにおいて抗Treg剤CD25-mIgG2a(KLC)と組み合わせたcGAMP-VLPの効果を研究するための実験計画の概要の図である。MCA-OVA腫瘍細胞注射(s.c.)の6日後に、マウスを4つの処置群:(1)PBS+抗IgG2aアイソタイプ;(2)PBS+抗CD25-mIgG2a(KLC);(3)cGAMP-VLP(50ng cGAMP)+抗IgG2aアイソタイプ及び(4)cGAMP-VLP(50ng cGAMP)+抗CD25-mIgG2a(KLC)に、無作為に割り当てた。cGAMP-VLPを皮下(s.c.)経路によって投与し、抗体を腹腔内(i.p.)経路によって投与した。
【図22】抗体のi.p.注射の48時間後の脾細胞及び腫瘍試料における全TCRb+CD4+T細胞に対するFOXP3+細胞のパーセンテージの図である。
【図23】特異的CD4及びCD8 T細胞応答の図である。抗CD25-mIgG2aを伴う又は伴わないcGAMP-VLPの初回s.c.注射の10日後、末梢血単核細胞(PBMC)を2つのOVAで刺激し、IFN-γ ELISPOTにより評価した。
【図24】図に示された及び実施例3で示される異なる処置での経時的な腫瘍成長(cm3)の平均値の図である。
【発明を実施するための形態】
【0041】
本発明らは、がん又はSTING媒介疾患若しくは障害、より一般的には、制御性T細胞が(例えば、特定のがんにおいて)エフェクターT細胞の免疫応答を遮断している疾患を、予防、緩和又は処置するために使用されうる組成物/組合せを開発した。特に、本発明者らが初めて記載する本明細書における組成物は、処置された対象において、腫瘍の完全退縮を可能にし、全身性抗腫瘍免疫を誘導する。
【0042】
第1の態様では、本発明は、i)STING(インターフェロン遺伝子刺激因子)アクチベーター、好ましくは、ベクター化形態のSTINGアクチベーター、即ち、STINGアクチベーターを含む(含有する又は発現する)ベクターと、ii)イマニチブ又はその誘導体若しくは塩;ダサチニブ又はその誘導体若しくは塩;IgG2定常領域又は変異したIgG1定常領域を有する抗CTLA-4抗体;抗LAG3抗体;抗TIM-3抗体;抗ICOS抗体;抗CD25抗体;抗CCR4抗体;抗CCR8抗体;抗TNFR2抗体;及びこれらに任意の組合せから選択される抗制御性T細胞(Treg)剤、好ましくは抗腫瘍内Treg剤とを含む組成物/組合せ、典型的には、医薬組成物/組合せ、例えば、治療用、ワクチン用又は獣医学用組成物/組合せに関する。
【0043】
例えば、本発明の組成物/組合せは、i)STING(インターフェロン遺伝子刺激因子)アクチベーター、好ましくは、ベクター化形態のSTINGアクチベーター、即ち、STINGアクチベーターを含む(含有する又は発現する)ベクターと、ii)イマニチブ又はその誘導体若しくは塩、IgG2定常領域若しくは変異したIgG1定常領域を有する抗CTLA-4抗体、及び/又は抗CD25抗体、又は前の段落に記載されている抗制御性T細胞(Treg)剤の任意の他の組合せとを含む。
【0044】
本明細書に記載の組成物/組合せはまた、本明細書では「医薬」と見なされる。
【0045】
表現「STING(インターフェロン遺伝子刺激因子)」及び「インターフェロン遺伝子刺激因子(STING)」は、小胞体内に位置するアダプター膜貫通タンパク質を示す。TMEM173、MITA、ERIS及びMPYSとしても公知の、STINGは、サイトゾル核酸に対する自然免疫応答における中心的なシグナル伝達分子である。ヒト及びマウスSTINGアミノ酸配列は、それぞれ、NCBI Locus NP_938023及びNP_082537で見つけることができる。
【0046】
STINGは、二本鎖DNAがサイトゾルに入ると活性化される。感染原因物質(ウイルス、細菌、寄生虫及び真菌)の存在を感知する上でのその役割以外に、STING経路はまた、哺乳動物DNAの感知に直接関与する。サイトゾルDNAは、グアノシン三リン酸(GTP)及びアデノシン三リン酸(ATP)からのサイクリックGMP-AMP(cGAMP)の合成を触媒するセンサーサイクリックGMP-AMPシンターゼ(cGAS、MB21D1)に結合すると検出される。cGAMPは、STINGに結合してそれを活性化する二次メッセンジャーとして機能する。cGAMPが結合すると、STINGは、立体構造変化を来たし、それによって、小胞体(ER)からゴルジへ、そして核周囲エンドソームへのその輸送が誘発される。その結果として、STINGは、tank結合キナーゼ1(TBK1)を動員し、その結果、TBK1によってリン酸化され、それによって、転写因子インターフェロン制御因子3(IRF3)の結合に利用できるようになる。次いで、TBK1は、IRF3をリン酸化し、それが核に転座してIFN-β及び他の遺伝子の転写を駆動する(Corrales及びGajewski、2015、Clin Cancer Res.、21(21):4774～4779頁)。
【0047】
「STINGアクチベーター」とは、ヒトPBMCとのインキュベーション時に、STINGに結合し、インデューサー、アゴニスト又はエンハンサーとして作用して、1型インターフェロン及び他のサイトカインの発現を誘導又は刺激する、任意の天然又は合成化合物を意味する。この結合にはcGAS-STINGシグナル伝達経路が関与する。それ故、ヒトインターフェロンの発現を誘導又は刺激する化合物は、前がん症状及びがん等の、様々な疾患又は障害の予防又は処置に有用でありうる。例えば、STINGアクチベーターが、腫瘍微小環境(TME)内、即ち腫瘍内又はその周辺のSTINGを活性化すると、それによって、CD8+T細胞への腫瘍特異的抗原の効率的クロスプライミングが生じる結果となり、例えばインターフェロンγ(IFN-γ)等の、肝要なケモカインを誘導することによりエフェクターT細胞の輸送が助長される。
【0048】
STINGアクチベーター活性は、インターフェロン刺激アッセイ、hSTING wtアッセイ、THP1-Dualアッセイ、TANK結合キナーゼ1(TBK1)アッセイ、及びインターフェロン-γ誘導性タンパク質10(IP-10)分泌アッセイから選択される1つ又は複数のSTINGアゴニストアッセイにより決定されうる。
【0049】
STINGアゴニストとしても公知の、STINGアクチベーターは、それらの化学的足場、並びにSTINGのサイトゾルドメインのリガンド結合ポケット内に侵入する及びそのポケット内の特定のアミノ酸に結合するそれらの能力に基づいて、3つのクラスに分類されうる(Fengら、2020、Drug Discovery Today、25巻(1)、230～237頁)。サイクリックジヌクレオチド(CDN)は、STINGに結合すること及びSTINGを活性化することができる分子の第1のクラスとして同定された。STINGのリガンド結合ドメイン(LBD)と直接接続し、cGAS-STING経路を活性化する、分子の第2のクラスは、フラボノイド類及びキサントン誘導体である。STINGアゴニストの第3のクラスは、ジアミノベンゾイミダゾール(diABZI)を包含する。cGAS-STING経路を活性化する、CDNとは無関係の作用因子と一緒に、STINGアゴニストの第3のクラスの化合物を大別することができ、これらは、本明細書では「小分子」とされる。
【0050】
特定の態様では、STINGアクチベーターは、小分子、特に、サイクリックジヌクレオチド;STINGアゴニストをコードする核酸;STING又はSTINGアゴニストを含む/含有する/発現するベクター又は細胞;例えばSB11325/11396等の、抗体コンジュゲートSTINGアゴニスト;及び例えばMAVU-104等の、エクトヌクレオチドピロホスファターゼホスホジエステラーゼ1(ENPP1)の阻害剤から選択される。
【0051】
用語「サイクリックジヌクレオチド」は、小胞体常在受容体STING(インターフェロン遺伝子刺激因子)に直接結合すること並びにI型インターフェロン及びまた核因子-κB(MFkB)依存性炎症性サイトカインの発現を誘導するシグナル伝達経路を活性化することができる、小分子二次メッセンジャーを指す。天然サイクリックジヌクレオチドは、サイクリックグアノシン一リン酸-アデノシン一リン酸(cGAMP)、より具体的には、c[G(2',5')pA(3',5')p](CAS番号:1441190-66-4)若しくはc[G(3',5')pA(3',5')p](CAS番号:849214-04-6)、サイクリック二量体グアノシン一リン酸(c-di-GMP)、より具体的には、ビス-(3'-5')-サイクリック二量体グアノシン一リン酸(3',5'-サイクリックジグアニル酸、サイクリックdi-GMP、c-di-GMP)、又はサイクリック二量体アデノシン一リン酸(c-di-AMP)、より具体的には、ビス-(3'-5')-サイクリック二量体アデノシン一リン酸(3',5'-サイクリックジアデニル酸、サイクリック-di-AMP、c-di-AMP)でありうる。
【0052】
好ましい態様では、本発明の組成物/組合せにおいて使用されるcGAMPサイクリックジヌクレオチドは、2'-3'-サイクリックGMP-AMPである。別の好ましい態様では、本発明の組成物/組合せにおいて使用されるcGAMPサイクリックジヌクレオチドは、3'-3'-サイクリックGMP-AMPである。
【0053】
本発明の組成物/組合せへの組み込みに適した他のサイクリックジヌクレオチドの中には、天然CDNの誘導体もある。天然CDN 2'-3'cAMPのジチオ誘導体であるADU-S100(MIW815又はML RR-S2 CDAとしても公知)、及びAD-S100の大環状分子架橋誘導体であるE7766は、最初に研究された合成CDNである。例えば、MK1454、SB11285及びBMS-986301等の、他の非天然CDNが、現在開発中である。
【0054】
国際特許出願WO2014/093936、WO2014/189805、WO2013/185052、WO2015/077354、WO2015/185565及び米国特許出願公開第2014/0341976号は、サイクリックジヌクレオチドの例を提供している。例えばサイクリックジヌクレオチド等の、STINGアクチベーターを、ベクター化形態で、本発明に関連して使用することができる。
【0055】
ベクター、例えば、サイクリックジヌクレオチドを含有するベクター、又はSTINGアクチベーター若しくはアゴニストを発現するベクターは、小胞、特に、リポソーム;エキソソーム;ウイルス、例えば、アデノウイルス若しくは腫瘍溶解性ウイルス;ウイルス様粒子(VLP);ポリマー;又はヒドロゲルでありうる。好ましくは、ベクターは、ウイルス又はウイルス様粒子(VLP)、より一層好ましくは、VLPである。
【0056】
本発明に関して適している市販のエキソソームは、例えば、exoSTING(商標)(CODIAK社、Cambridge、MA 02140)でありうる。exoSTING(商標)は、高レベルのPTGFRN及びエキソソームタンパク質を(腫瘍常在抗原提示細胞への特異的取り込みを助長するためにエキソソームの表面に)発現するように操作されたエキソソームであって、STINGアゴニストが負荷されている(エキソソームの内腔に位置する)エキソソームで、構成されている。
【0057】
リポソームと共に、ポリマー及びヒドロゲルは、STINGアゴニストを送達するために近頃使用されている主な送達系である。
【0058】
ポリマー、更に特に、高分子ナノ粒子は、in vivo加水分解性、制御された薬物負荷及び放出動態、並びに全体的な安全性をはじめとする、それらの好適な特性からして、STINGアゴニストに適したナノ担体である。本発明に関連して使用可能なポリマーは、ポリ(ベータ-アミノエステル)(PBAE)、ポリ(エチレングリコール)-block-[(2-ジエチルアミノエチルメタクリレート)-co-(ブチルメタクリレート)-co-(ピリジルジスルフィドエチルメタクリレート)](PEG-DBP)、及びアセチル化デキストラン(Ace-DEX)を含む群から選択されうる。
【0059】
ヒドロゲルは、腫瘍毒性免疫細胞の動員につながる局所的な及び制御された薬物放出を助長する、高親水性ポリマー網である。本発明に関連して使用可能なヒドロゲルは、直鎖状ポリエチレンイミン(LPEI)/ヒアルロン酸(HA)、HAヒドロゲル足場、Matrigel及びSTINGelを含む群から選択されうる。
【0060】
本発明に関連してベクターとして使用可能なウイルスは、アデノウイルス又は腫瘍溶解性ウイルス、例えば、単純疱疹-1ウイルス、水疱性口内炎ウイルス(VSV)又はニューカッスル病ウイルス(NDV)に由来するウイルス等でありうる。
【0061】
好ましい態様では、本発明の組成物において使用されるSTINGアクチベーターは、ベクター化ジヌクレオチドであり、ベクター化ジヌクレオチドは、ウイルス様粒子(VLP)であり、ジヌクレオチドは、前記ウイルス様粒子にパッケージングされており、ウイルス様粒子は、ウイルス融合性糖タンパク質を含むリポタンパク質エンベロープを含む。特定の態様では、VLPは、ウイルス融合性糖タンパク質を含むリポタンパク質エンベロープを含み、及びサイクリックグアノシン一リン酸-アデノシン一リン酸(cGAMP)を含有し、cGAMPは、前記ウイルス様粒子にパッケージングされている。
【0062】
VLP又はウイルス様粒子は、ウイルスに似ているが、非感染性である。それは、いずれの野生型ウイルス遺伝物質も含有せず、より好ましくは、いずれのウイルス感染性遺伝物質も含有しない。エンベロープ又はカプシド等の、ウイルス構造タンパク質の発現は、VLPの自己組織化をもたらす。VLPは、ビロソーム(即ち、カプシドを欠いているリポタンパク質エンベロープ)であることもあり、又はカプシドとリポタンパク質エンベロープの両方を含むVLPであることもある。VLPは、エピトープ、抗原、又は興味のある任意の他のタンパク質若しくは核酸、好ましくは、腫瘍関連抗原、又はこれらの組合せを更に含みうる。
【0063】
エンベロープを有するVLPは、(a)同じウイルスの異なるウイルス株、(b)同じウイルスの異なる血清型、及び/又は(c)異なる宿主に対して特異的な異なるウイルス株から選択されうる、幾つかの、特に2つ以上の、異なるエピトープ/抗原を含みうる。異なるウイルス株は、例えば、インフルエンザウイルスの異なる株、例えば、インフルエンザウイルスA型株H1N1、H5N1、H9N1、H1N2、H2N2、H3N2及び/若しくはH9N2、インフルエンザウイルスB型、並びに/又はインフルエンザウイルスC型である。異なる血清型は、例えば、ヒトパピローマウイルス(HPV)の異なる血清型、例えば、血清型6、11、16、18、31、33、35、39、45、48、52、58 62、66、68、70、73及び/又は82であるが、癌原遺伝子性の型(proto-oncogenic type) HPV 5、8、14、17、20及び/若しくは47の血清型、又はパピローマ関連型HPV 6、11、13、26、28、32及び/若しくは60の血清型でもある。
【0064】
VLPのリポタンパク質エンベロープは、融合タンパク質を含みうる。本明細書での用語「融合タンパク質」又は「融合性糖タンパク質」は、3つのクラスに分類されているウイルスI型膜貫通タンパク質を指す。クラスIウイルス融合タンパク質は、大きい球状ヘッド領域及び長いα-ヘリックスコイルドコイルストーク領域を有する、三量体である。クラスIウイルス融合タンパク質の例としては、インフルエンザHA、呼吸器合胞体及びウイルスF、HIV gp4が挙げられるが、これらに限定されない。クラスII融合タンパク質は、β-シートで本質的に構成されている三量体である。クラスIIウイルス融合タンパク質の例としては、ダニ媒介脳炎ウイルスE、セムリキ森林ウイルスE1、リフトバレー熱ウイルスGcが挙げられるが、これらに限定されない。クラスIIIウイルス融合タンパク質は、二次構造要素であるα-ヘリックスとβ-鎖の両方で構成されている5ドメイン分子である。クラスIIIウイルス融合タンパク質の例としては、水疱性口内炎ウイルスG、単純疱疹ウイルスgB又はバキュロウイルスgp64が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の組成物において使用されるVLPのリポタンパク質エンベロープは、クラスIIIウイルス融合タンパク質を含む。
【0065】
ウイルス融合タンパク質又は融合性タンパク質は、レトロウイルス科(レンチウイルス及びレトロウイルス、例えば、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルスを含む)、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、D型肝炎ウイルス、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、フィロウイルス科、ラブドウイルス科、ブニヤウイルス科又はオルソポックスウイルス科(例えば、痘瘡)からの、糖タンパク質、又は幾つかの糖タンパク質の組合せでありうる。好ましい態様では、ウイルス融合性糖タンパク質は、フラビウイルス科、レトロウイルス科、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ブニヤウイルス科又はヘパドナウイルス科からのものである。特異的な態様では、ウイルス融合性糖タンパク質は、オルソミクソウイルス、ラブドウイルス又はレトロウイルスからのものである。より好ましい態様では、ウイルス融合性糖タンパク質は、HIV-1及びHIV-2を含むHIV(ヒト免疫不全ウイルス)、インフルエンザA型(例えば、H5N1及びH1N1亜型)及びインフルエンザB型を含むインフルエンザ、ソゴトウイルス又はVSV(水疱性口内炎ウイルス)からの糖タンパク質である。
【0066】
ウイルス様粒子は、好ましくは更にカプシドを含む。好ましくは、カプシドは、レトロウイルス科からのものである。レトロウイルス科は、レンチウイルス及びレトロウイルス、例えば、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス及びイプシロンレトロウイルスを含む。例えば、カプシドは、HIV-1及びHIV-2を含むヒト免疫不全ウイルス(HIV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ピューマレンチウイルス、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、ネコ白血病ウイルス(FeLV)、マウス白血病ウイルス(MLV)、ウシ白血病ウイルス(BLV)、ヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV、例えば、HTLV-1、-2、-3又は-4)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、トリ肉腫・白血病ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)からのものである。より好ましくは、レトロウイルスカプシドは、HIV又はMLVからのものである。好ましくは、カプシドは、レンチウイルス又はレトロウイルスからのものである。
【0067】
必要に応じて、ウイルス糖タンパク質を、興味のある抗原又は興味のある任意の他のタンパク質若しくは核酸、好ましくは腫瘍関連抗原、又はこれらの組合せに、融合又は共有結合させることができる。ウイルス糖タンパク質及びカプシドタンパク質に加えて、VLPに更に含めることができる抗原の非網羅的リストが、以下に開示される。より具体的には、VLPは、腫瘍関連抗原、例えば、Her2/neu、CEA(癌胎児性抗原)、HER2/neu、MAGE2及びMAGE3(黒色腫関連抗原)、RAS、メソテリン又はp53からの、HIV、例えば、Vpr、Vpx、Vpu、Vif及びEnvからの、細菌、例えば、C.アルビカンス(C.Albicans)SAP2(分泌アスパルチルプロテイナーゼ2)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)からの、寄生虫、例えば、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)タンパク質、例えば、CSP(スポロゾイト周囲タンパク質)、AMA-1(頂端膜抗原-1)、TRAP/SSP2(スポロゾイト表面タンパク質2、LSA(肝臓ステージ抗原)、Pf Exp1(Pf搬出タンパク質1(Pf exported protein 1))、SALSA(Pf抗原2スポロゾイト及び肝臓ステージ抗原)、STARP(スポロゾイトスレオニン及びアスパラギンリッチタンパク質)又は国際特許出願WO2011/138251に開示されている任意のタンパク質からの抗原も含みうる。
【0068】
VLPの組成物及びそれらを産生する方法は、EP 3430147 B1において詳細に開示されている。
【0069】
既述の通り、本明細書に記載の特定の態様では、STINGアクチベーターは、小分子である。本明細書での用語「小分子」は、STINGを標的とし、STINGに結合し、cGAS-STING経路を活性化し、それによって、IKK関連キナーゼTANK結合キナーゼ1(TBK1)シグナル伝達を促進し、腫瘍微小環境(TME)における免疫細胞の核因子-カッパB(NF-kB)及びインターフェロン制御因子3(IRF3)を活性化する、天然の又は合成起源の、任意の化合物を指す。これは、インターフェロン(IFN)をはじめとする炎症性サイトカインの産生、より具体的には、IFN-ベータ(IFN-β)の産生/発現につながる。小分子のSTINGへの結合は、腫瘍細胞に対する細胞傷害性Tリンパ球(CTL)媒介免疫応答を生じさせる結果となり、腫瘍細胞溶解を引き起こす。化学構造におけるそれらの食い違いのため、及び本発明に関して、小分子は、天然CDNと合成CDNの両方を含むCDN、並びにCDNとは無関係の作用因子であるSTINGアゴニスト、例えば、フラボノイド類及びキサントン誘導体、並びにジアミノベンゾイミダゾール(diABZI)を包含する。
【0070】
フラボノイド類の中で、フラボン酢酸(FAA)は、最初に同定されたSTINGアゴニストである。有効性を改善する試みにおいて、様々な改変がFAAの分子構造に導入され、その結果、5,6-ジメチルキサンテノン-4-酢酸(DMXAA、これはASA404又はバジメザンとしても公知)をはじめとする一連の誘導体が得られた。
【0071】
α-マンゴスチンは、キサントン足場内に置換されたアリル及びヒドロキシル基を有するキサントン誘導体である。レポーターアッセイにおいてI型IFNを誘導する作用強度がcGAMPと比較して弱いにもかかわらず、α-マンゴスチンは、本明細書に記載の治療的使用に関連して使用可能な興味深いSTINGアゴニストである。
【0072】
FAA及びジメチルオキソキサンテニル酢酸(DMXAA)は、特異的なマウス(m)STINGアゴニストであり、α-マンゴスチンは、ヒト(h)STINGに対してmSTINGよりも高い親和性を示す。
【0073】
ジアミノベンゾイミダゾール(別名diABZI又はアミドベンゾイミダゾール二量体)は、cGAMPと比較して、STINGへの結合及び細胞機能の増強を示す。更に、diABZIは、I型IFN及び炎症性サイトカインのSTING依存的活性化を誘発する。そのような化合物は、ビスピラゾール二酸又はビスフェノール二量体と共に、国際特許出願WO 2017/175147及びWO 2019/069270において開示されている。
【0074】
E7766は、大環状分子架橋STINGアゴニスト(MBSA)の新規クラスに属する。ADU S100のMBSA誘導体であるE7766は、がん患者において独立型の静脈内介入として現在試験中の唯一のSTINGアゴニストである。この分子の耐容性、安全性及び予備的活性は、進行固形腫瘍又はリンパ腫を有する患者(NCT04144140)、並びに筋層非浸潤性膀胱がんに罹患している個体(NCT04109092)において調査されている。
【0075】
例えば、MK-2118、GSK3745417、IMSA-101、TAK-676、CDR5500、TTI-10001及びSEL312-4787等の、小分子に対する他のSTINGは、現在、開発中である。
【0076】
好ましくは、STINGアクチベーターは、ジチオ-(RP,RP)-[サイクリック[A(20,50)pA(30,50)p]](ML RR-S2 CDA、別名ADU-S100);MK-1454;5,6-ジメチル-キサンテノン酢酸(DMXAA);フラボン-8-酢酸(FAA);10-カルボキシメチル-9-アクリダノン(CMA);α-マンゴスチン(キサントン);ML RR-S2 CDG;ML RR-S2 cGAMP;6-ブロモ-N-(ナフタレン-1-イル)ベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-カルボキサミド(BNBC);ジスピロジケトピペラジン(DSDP);2'3'-cGSASMP(2'3'-cGAMPのビスホスホロチオエートアナログ);大環状分子架橋STINGアゴニスト(MBSA);E7766(ADU-S100のMBSA誘導体);ベンゾチオフェンオキソブタン酸(MSA-2)誘導体;SB11285;ジアミドベンゾイミダゾール(diABZI);IMSA-101、TAK-676;CRD5500;TTI-10001;及びSEL312-4787から選択される小分子である。
【0077】
表現「STINGアクチベーターをコードする核酸」とは、ポリペプチドの核酸配列を直接特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、ATG、GTG又はTTG等の開始コドンで始まってTAA、TAG又はTGA等の終止コドンで終わるオープンリーディングフレームによって、一般に決定される。コード配列は、ゲノムDNA、cDNA、合成DNA、又はこれらの組合せでありうる。
【0078】
STINGアゴニストをコードする上述の核酸は、その転写及び翻訳を最適化するベクターにパッケージングされうる。用語「ベクター」は、本発明のSTINGアゴニストをコードするポリヌクレオチドを含み、その発現を可能にする制御配列に作動可能に連結されている、直鎖状又は環状DNA分子を意味する。発現ベクターは、本発明のSTINGアゴニストを発現させるのに適している発現カセットを含む。本発明において使用されうる発現ベクターとしては、非網羅的に、真核生物発現ベクター、特に、哺乳動物発現ベクター、ウイルスベースの発現ベクター、バキュロウイルス発現ベクター、植物発現ベクター、及びプラスミド発現ベクターが挙げられる。適する発現ベクターは、ウイルス、例えば、バキュロウイルス、パポバウイルス、例えばSV40等、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮狂犬病ウイルス又はレトロウイルスに、特に、レンチウイルスに由来しうる。
【0079】
ベクターはまた、ウイルス起源のものでありうる。例えば、細菌STINGアゴニストc-di-GMPを産生するアデノウイルス。或いは、STINGアゴニストのコード配列を細胞に、細胞の染色体又はその細胞質どちらかに、組み込むことができる。任意の真核細胞をその方法において使用することができる。例えば、産生に使用される細胞は、哺乳動物細胞、例えば、COS-1細胞、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞(米国特許第4,889,803号;米国特許第5,047,335号)、HEK(ヒト胎児由来腎臓)細胞、細胞系、例えば、293、293T、HL-116、Vero及びBHK(ベビーハムスター腎臓)細胞系からの細胞;植物細胞(例えば、ベンサミアナタバコ(N. bethamiana));昆虫細胞、例えば、ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)(5/J由来細胞、例えば、Sf-9細胞)、SF21、Hi-5、Express Sf+、及びS2シュナイダー細胞、特に、バキュロウイルス-昆虫発現系でのもの;又はトリ細胞でありうる。
【0080】
別の態様では、STINGアクチベーターは、具体的な標的が本発明の出願日現在で依然として不明であるSTINGアゴニスト、例えばSB11325/11396等、とコンジュゲートした抗体でありうる。用語「イムノコンジュゲート」及び「抗体コンジュゲート」は、本明細書では同義で使用される。STINGのアゴニストを含む抗体コンジュゲートは、国際特許出願WO2018/200812において開示されている。
【0081】
ホスホジエステラーゼによる2'3'-cGAMPの加水分解は、STINGシグナル伝達経路の活性化の障壁でありうる。最近、エクトヌクレオチドピロホスファターゼホスホジエステラーゼ1(ENPP1)の幾つかの阻害剤、例えば、MAVU-104、MV626及びSR8314が、STING間接的に活性化するために、設計され、開発された。
【0082】
別の態様では、STINGアクチベーターは、エクトヌクレオチドピロホスファターゼホスホジエステラーゼ1(ENPP1)の阻害剤、例えば、MAVU-104でありうる。
【0083】
本発明の組成物/組合せは、(即ち、恐らく幾つかの)抗制御性T細胞(Treg)剤、好ましくは、本明細書で開示の腫瘍内Treg剤も含む。表現「制御性T細胞」とは、IL2ra(CD25)、Ikzf2(Helios)、Ikzf4(Eos)、IL2rb(CD122)、Socs2、Nrp1、Ebi3又はCTLA等のマーカーを発現する、T細胞の亜集団、特に、腫瘍内に位置するT細胞の亜集団を意味する。Treg細胞の免疫抑制活性は、当業者にとって、CD25-CD4+T及びCD8+T細胞の増殖を抑制するTregの能力を指す。T細胞増殖アッセイは、Treg免疫抑制活性を評価するための究極の判断基準である。構成的及び誘導性、CD4+及びCD8+、FoxP3+及びFoxP3-であるTregの複数の亜集団が、悪性病変に関連して記載されている。殆どの研究は、腫瘍内のCD4+CD25+FoxP3+ Tregの存在を予後不良と関連付けている。
【0084】
用語「Treg」又は「制御性T細胞」は、CD4+CD25-及びCD8+T細胞増殖及び/若しくはエフェクター機能を抑制する、又は免疫応答を別様に下方調節するCD4+T細胞を指す。注目すべきことに、Tregは、ナチュラルキラー(NK)細胞、ナチュラルキラーT細胞並びに他の免疫細胞により媒介される免疫応答を下方制御することができる。好ましい態様では、本発明のTregは、Foxp3+である。
【0085】
用語「制御性T細胞機能」又は「Tregの機能」は、CD4+CD25-若しくはCD8+T細胞増殖の低減又はエフェクターT細胞媒介免疫応答の低減を生じさせる結果となるTregの任意の生物学的機能を指すために、同義で使用される。Treg機能を本技術分野において確立された技術により測定することができる。Treg機能の測定に有用なin vitroアッセイの非限定的な例としては、トランスウェル抑制アッセイ、より一般的には、ヒト末梢血若しくは臍帯血(又はマウス脾臓若しくはリンパ節)から精製された標的従来型T細胞(Tconv)及びTreg(又は抗原提示細胞(APC)、例えば、照射脾細胞若しくは精製樹状細胞(DC)若しくは照射PBMC等)が、必要に応じて抗CD3+抗CD28コートビーズにより活性化される、in vitroアッセイ、続いての、従来型T細胞増殖の(例えば、放射性ヌクレオチド(例えば、[3H]-チミン等)若しくは蛍光ヌクレオチドを測定することによる、又はCayman Chemical社MTT Cell Proliferation Assay Kitによる、又は緑色蛍光色素エステルCFSE若しくはSeminaphtharhodafluor(SNARF-1)色素の希釈をフローサイトメトリーによりモニターすることによる)in vitro検出が挙げられる。他の一般的なアッセイは、T細胞サイトカイン応答を測定する。Treg機能の有用なin vivoアッセイとしては、Tregが重要な役割を果たす疾患の動物モデル、例えば、(1)恒常性モデル(Tregにより主として抑制される標的細胞としてナイーブ恒常的拡大CD4+T細胞を使用する)、(2)炎症性腸疾患(IBD)回復モデル(Tregにより主として抑制される標的細胞としてTh1 T細胞(Th17)を使用する)、(3)実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデル(Tregにより主として抑制される標的細胞としてTh17及びTh1 T細胞を使用する)、(4)B16黒色腫モデル(抗腫瘍免疫の抑制)(Tregにより主として抑制される標的細胞としてCD8+T細胞を使用する)、(5)ナイーブCD4+CD45+RBhi Tconv細胞がRag1-/-マウスにトランスフェクトされる養子移入大腸炎における結腸炎症の抑制、及び(6)Foxp3レスキューモデル(Tregにより主として抑制される標的細胞としてリンパ球を使用する)におけるアッセイが挙げられる。1つのプロトコールによると、モデルの全てに、ドナーT細胞集団のためのマウスは勿論、レシピエント用のRag1-/-又はFoxp3マウスも必要である。様々な有用なアッセイに関する更なる詳細については、例えば、Collison及びVignali、In Vitro Treg Suppression Assays、Regulatory T Cellsにおける第2章: Methods and Protocols、Methods in Molecular Biology、Kassiotis及びListon編、Springer、2011、707:21～37頁;Workmanら、In Vivo Treg Suppression Assays、Regulatory T Cellsにおける第9章: Methods and Protocols、Methods in Molecular Biology、Kassiotis及びListon編、Springer、2011、119～156頁;Takahashiら、Int. Immunol.、1998、10:1969～1980頁;Thorntonら、J. Exp. Med.、1998、188:287～296頁;Collisonら.、J. Immunol.、2009、182:6121～6128頁;Thornton及びShevach、J. Exp. Med.、1998、188:287～296頁;Assemanら、J. Exp. Med.、1999、190:995～1004頁;Dieckmannら、J. Exp. Med.、2001、193:1303～1310頁;Belkaid、Nature Reviews、2007、7:875～888頁;Tang及びBluestone、Nature Immunology、2008、9:239～244頁;Bettini及びVignali、Curr. Opin. Immunol.、2009、21:612～618頁;Dannullら、J Clin Invest、2005、115(12):3623～33頁;Tsaknaridisら、J Neurosci Res.、2003、74:296～308頁を参照されたい。
【0086】
表現「抗制御性T細胞(Treg)剤」又は「抗腫瘍内制御性T細胞(Treg)剤」とは、Tregの異なる亜集団、特に、腫瘍内に存在するTregの亜集団を、Tregの数を低減させること又はそれらの表現型シグネチャーを調節することのどちらかにより、調節することができる化合物を意味する。好ましい態様では、本発明の組成物/組合せにおいて使用される抗制御性T細胞(Treg)剤は、CD45+TCRb+ CD4+ Treg、特に、CD25+FoxP3+及びFoxP3+Ki67+ Tregの亜集団、特に、腫瘍内に位置するTregの亜集団を、特に標的とする。
【0087】
本明細書に記載の特定の態様では、本発明の化合物は、プリン作動性受容体アゴニストを含まない。特に、抗制御性T細胞(Treg)剤、好ましくは、抗腫瘍内Treg剤は、プリン作動性受容体アゴニストではない。
【0088】
本明細書に記載の特定の態様では、抗制御性T細胞(Treg)剤、好ましくは、抗腫瘍内Treg剤は、イマニチブ又はその誘導体若しくは塩;ダサチニブ又はその誘導体若しくは塩;IgG2定常領域又は変異したIgG1定常領域を有する抗CTLA-4抗体;抗LAG3抗体;抗TIM-3抗体;抗ICOS抗体;抗CD25抗体;抗CCR4抗体;抗CCR8抗体;抗TNFR2抗体;及びこれらに任意の組合せから選択される。例えば、抗制御性T細胞(Treg)剤、好ましくは、抗腫瘍内Treg剤は、イマニチブ又はその誘導体若しくは塩、IgG2定常領域又は変異したIgG1定常領域を有する抗CTLA-4抗体;抗CD25抗体;及びこれらに任意の組合せから選択される。
【0089】
CTLA4、LAG3、TIM-3及びICOSは、免疫チェックポイントである。これらの免疫チェックポイントのアゴニスト、特に、抗体は、免疫チェックポイント阻害剤として作用する。用語「免疫チェックポイント阻害剤」とは、一部の型の免疫形細胞、例えばT細胞、及びがん細胞によって作られるチェックポイントと呼ばれるタンパク質を遮断する、任意の薬物を意味する。これらのチェックポイントは、免疫応答が強くなりすぎることを防ぐのに役立ち、ときには、T細胞ががん細胞を死滅させることを防ぐことができる。これらのチェックポイントが遮断されると、T細胞は、より効率的にがん細胞を死滅させることができる。T細胞又はがん細胞上に見られるチェックポイントタンパク質の例としては、LAG3/MHC-II及びCTLA-4/B7-1/B7-2が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に関して、興味のある本明細書に記載の免疫チェックポイントは、Treg上に遍在するものである。
【0090】
好ましくは、抗制御性T細胞(Treg)剤は、IgG2定常領域を有する抗CTLA-4(これはCD152としても公知)、例えば、トレメリムマブ(CP-675,206)、又は変異したIgG1定常領域を有する抗CTLA-4、例えば、BMS 986249(若しくは別名CTLA4-プロボディ)、BMS-986288(若しくは別名CTLA4-NF)、ザリフレリマブ(若しくは別称AGEN1884)、クアボンリマブ(若しくは別称MK-1308)、HBM4003(Harbour BioMed社からの)、ONC-392、若しくは例えば、本明細書中の下記のもの;抗LAG3モノクローナル抗体、例えば、Sym-2011、MK-4280、TSR-033、IMP321、レラトリマブ(BMS986016)、LAG525、REGN3767、MGD013、FS118、INCAGN02385又はEOC202;抗TIM-3モノクローナル抗体、例えば、Sym-023、BMS-986258、LY3321367、SHR-1702又はコボリマブ(TSR-022);抗ICOSモノクローナル抗体、例えば、JTX-2011、GSK3359609、BMS-986226、KY1044又はMEDI-570から選択される。より好ましくは、抗LAG3、抗TIM-3又は抗ICOS抗体は、IgG2定常領域又は変異したIgG1定常領域(本明細書中、下記で更に定義されるような)を有する。
【0091】
CD25、CCR4、CCR8及びTNFR2は、T細胞の、特にTregの、表面に存在する受容体である。好ましくは、抗制御性T細胞(Treg)剤は、抗CD25抗体、例えば、ダクリズマブ、RG-6292(RO7296682)、又はカミダンルマブ テシリン(ADCT-301);毒素とカップリングされている抗CD25抗体、例えば、RFT5-dgAイムノトキシン(IMTOX25);抗CCR4抗体、例えば、モガムリズマブ;抗CCR8抗体、例えば、BMS-986340、JTX-1811、SRF114、HBM1022、MAB1429、FPA157;抗TNFR2抗体から選択される。より好ましくは、抗CD25、抗CCR4、抗CCR8又は抗TNFR2抗体は、IgG2定常領域又は変異したIgG1定常領域(本明細書中、下記で更に定義されるような)を有する。
【0092】
より好ましくは、抗Treg剤、好ましくは、腫瘍内Treg剤は、そのFc定常領域において及び/又はFab領域において、好ましくは、特異的な本明細書に記載の位置で、操作された、典型的には変異された、IgG1アイソタイプの抗CDTL-4抗体である。CH1、CH2 and/or CH3定常領域の操作は、遺伝子配列の意図的なヒトによる操作に相当する。変異は、好ましくは、あるアミノ酸の別のものによる置換である。IgG1サブタイプの抗CTLA-4抗体のFc定常領域に関する本明細書中、下記で定義される変異はまた、抗LAG3、抗TIM-3、抗ICOS、抗CD25、抗CCR4、抗CCR8又は抗TNFR2抗体のFc定常領域に置き換え可能である。
【0093】
好ましい態様では、抗腫瘍内制御性T細胞(Treg)剤は、IgG1定常領域の変異がCH2ドメイン((Fc)定常領域の)に位置する、抗CTLA-4抗体である。
【0094】
更なる好ましい態様では、抗腫瘍内Treg剤は、IgG1定常領域の変異がCH3ドメイン((Fc)定常領域の)に位置する、抗CTLA-4抗体である。
【0095】
別の好ましい態様では、抗腫瘍内Treg剤は、IgG1定常領域の変異がCH1ドメイン(Fab領域の)に位置する、抗CTLA-4抗体である。
【0096】
更なる好ましい態様では、抗腫瘍内制御性T細胞(Treg)剤は、CH1、CH2及び/又はCH3ドメインに位置する少なくとも2つの変異を含む、抗CTLA-4抗体である。
【0097】
Fc領域において行われる好ましいアミノ酸置換は、IgG1アイソタイプの抗CTLA-4抗体のエフェクター機能の増強、特に、抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性の増強の原因となる。Fc定常領域は、CH2(配列番号1のアミノ酸113～223位に対応する)又はCH3ドメイン(配列番号1のアミノ酸224～329に対応する)の以下の位置における1個又は複数のアミノ酸を改変することにより、ADCCを増大させるように及び/又はFcy受容体(FcyR)に対する親和性を増大させるように改変されうる:233、234、235、236、237、238、239、243、247、256、262、267、268、270、271、280、290、292、298、300、305、324、326、328、330、332、333、334、339又は396(この最後の番号付けは、EUインデックスのもの又はKabatスキームにおける等価のものである)。アミノ酸位置の番号付けは、今はデータベース内で配列AH007035に置き換えられている配列J00228(配列番号1)のIGHG1アミノ酸翻訳の結果として生じる。J00228は、IGHG1*01アレル(アレルのアラインメント:ヒトIGHG1)に、及びG1m1、17鎖(G1mアロタイプ)に対応する。EUガンマ1鎖は、IGHG1*03アレルによりコードされており(CH1 K120>R、CH3 D12>E及びL14>M)、G1m3鎖(G1mアロタイプ)である。EU番号付けは、Edelmanら(Proc. Natl. Acad. USA、63、78～85 (1969))により定義された。Kabat番号付けは、Kabatら、Sequences of proteins of immunological interest. 第5版 - US Department of Health and Human Services、NIH出版番号91-3242、662、680、689頁 (1991)において開示されている。
【0098】
好ましくは、IgG1の変異は、CH2及び/又はCH3ドメインに存在する。
【0099】
一態様では、抗CTLA4抗体のFc定常領域の第1のCH2ドメインは、234、235、236、239、268、270、298から選択されるアミノ酸位置における少なくとも1つの変異、好ましくは、L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A置換を含み、抗CTLA4抗体のFc定常領域の第2のCH2ドメインは、270、326、330及び334から選択されるアミノ酸位置における少なくとも1つの変異、好ましくは、D270E/K326D/A330M/K334E置換を含む。
【0100】
別の態様では、抗CTLA4抗体Fc定常領域の2つのCH2ドメインの各々は、239、330及び332から選択されるアミノ酸位置における少なくとも1つの変異、好ましくは、S239D/A330L/I332E置換を含む。
【0101】
別の態様では、抗CTLA4抗体Fc定常領域の少なくとも1つのCH2ドメインは、アミノ酸236、238、239、267及び/又は328位における変異、好ましくは、G236D、P238D、S239D、S267E、L328F、L328E及びこれらの任意の組合せから選択される置換を含む。
【0102】
別の態様では、抗CTLA4抗体Fc定常領域の少なくとも1つのCH2ドメインは、置換P238Dと、以下の群から選択される1つ又は複数の置換とを含む:
- E233D、G237D、H268D、P271G、及びA330R;
- V262E、S267E、及びL328F;並びに
- V264E、S267E及びL328F。
- E233D、G237D、H268D、P271G、及びA330R;
- V262E、S267E、及びL328F;並びに
- V264E、S267E及びL328F。
【0103】
別の態様では、抗CTLA4抗体Fc定常領域の少なくとも1つのCH2ドメインは、236、239、267、268、324、332から選択されるアミノ酸位置における少なくとも1つの変異、好ましくは、236A、239D、239E、267E、268D、268E、268F、324T、332D及び332Eから選択される少なくとも1つの置換を含む。
【0104】
別の態様では、抗CTLA4抗体Fc定常領域の少なくとも1つのCH2及び/又はCH3ドメインは、236、239、243、256、290、292、298、300、305、330、332、333、334、339、396から選択されるアミノ酸位置における少なくとも1つの変異、好ましくは、G236A、S239D、F243L、T256A、K290A、R292P、S298A、Y300L、V305I、A330L、I332E、E333A、K334A、A339T及びP396Lから選択される少なくとも1つの置換を含む。
【0105】
別の態様では、抗CTLA4抗体Fc定常領域の少なくとも1つのCH2及び/又はCH3ドメインは、243、247、280、290、292、298、300、305、326、333、334、339、396から選択されるアミノ酸位置における少なくとも1つの変異、好ましくは、243L、247I、280H、290S、292P、298A、298D、298V、300L、305I、326A、333A、334A、339D、339Q及び396Lから選択される少なくとも1つの置換を含む。
【0106】
更に好ましくは、IgG1の変異は、CH1ドメイン(Fab領域の)(配列番号1のアミノ酸1～97位に対応する)及び/又はCH2ドメイン(Fc領域の)に存在する。
【0107】
一態様では、抗CTLA4抗体の少なくとも1つのCH1及び/又はCH2ドメインは、135、137、139、181、216、217から選択されるアミノ酸位置における少なくとも1つの変異、好ましくは、M135Y、S137T、T139E、S181A、E216A及びK217Aから選択される少なくとも1つの置換を含む。
【0108】
本発明の組成物において使用可能な別の適する抗CTLA-4抗体は、トレメリムマブ(CP-675,206)である。トレメリムマブは、FCGRIIAによく結合するがFCGRIIIAにはしないIgG2抗体である。
【0109】
本発明の組成物において使用される抗CTLA-4抗体は、野生型(即ち、変異/操作されていない)IgG1定常領域を有さない。特に、本発明の組成物において使用される抗CTLA-4抗体は、イピリムマブではない。
【0110】
好ましい態様では、本発明の組成物において使用される抗CTLA-4抗体は、IgG2、特に、IgG2A(アイソタイプ2A)抗CTLA-4抗体である。
【0111】
好ましくは、抗CTLA-4抗体、又はその断片は、約10-8M、好ましくは約10-9M、より好ましくは約10-10M、より一層好ましくは10-11Mの、CTLA-4に対する結合親和性を有する。
【0112】
本明細書に記載の特定の態様では、抗制御性T細胞(Treg)剤、好ましくは、抗腫瘍内Treg剤は、イマチニブ又はその誘導体若しくは塩である。
【0113】
用語「イマチニブ」は、白血球の産生増加に関与する、Bcr-Ablチロシンキナーゼと呼ばれる、特異的酵素に結合する化合物(CAS番号152459-95-5)を示す。それは、他の幾つかのTK受容体:Kit、癌源遺伝子c-KitによりコードされるSCF(幹細胞因子)受容体、ジスコイジンドメイン受容体(DDR1及びDDR2)、CSF-1R(コロニー刺激因子受容体)及びPDGF(血小板由来増殖因子:PDGFR-アルファ及びPDGFR-ベータ)受容体、も阻害する。イマチニブは、これらの受容体キナーゼの活性化により媒介される細胞プロセスも阻害する。市販のイマチニブは、GLIVEC(商標)である。
【0114】
別の特定の態様では、抗制御性T細胞(Treg)剤、好ましくは、抗腫瘍内Treg剤は、ダサチニブ又はその誘導体若しくは塩である。
【0115】
用語「ダサチニブ」は、二重BCR/ABL及びSrcファミリーチロシンキナーゼ阻害剤(CAS番号302962-49-8)を示す。ダサチニブの主な標的は、切断点クラスター領域Abelson(BCRABL)、SRC、エフリン及び増殖因子(GFR)である。市販のダサチニブは、SPRYCEL(商標)である。
【0116】
別の特定の態様では、別個の抗制御性Treg剤の組合せが、本発明の組成物において使用される。
【0117】
別の特定の態様では、STINGアクチベーターは、VLPである。このVLPは、IgG2定常領域又は変異したIgG1定常領域を有する抗CTLA4抗体と一緒に、及び本明細書に記載の、別の別個の抗Treg剤と一緒に、特に、別の別個の免疫チェックポイント阻害剤と一緒に、使用されうる。
【0118】
本発明は、医薬としての使用のための、本明細書に記載の医薬組成物/組合せ、特に、治療用組成物、ワクチン用組成物又は獣医学用組成物にも関する。
【0119】
本発明の組成物/組合せを薬物/医薬として、例えば、ワクチン又はワクチンアジュバントとして使用することができる。それ故、本発明は、i)本明細書に記載のSTING(インターフェロン遺伝子刺激因子)アクチベーター、好ましくは、ベクター化形態のSTINGアクチベーター、即ち、STINGアクチベーターを含む(含有する又は発現する)ベクターとii)本明細書に記載の、抗制御性T細胞(Treg)剤、好ましくは、抗腫瘍内Treg剤とを含む医薬組成物/組合せ、例えば、治療用医薬組成物/組合せ、ワクチン用又は獣医学用組成物にも関する。
【0120】
特定の態様では、本発明は、i)本明細書に記載のSTING(インターフェロン遺伝子刺激因子)アクチベーター、好ましくは、ベクター化形態のSTINGアクチベーター、即ち、STINGアクチベーターを含む(含有する又は発現する)ベクターとii)本明細書に記載の抗腫瘍内制御性T細胞(Treg)剤とを含む医薬組成物/組合せ、例えば、治療用医薬組成物/組合せ、ワクチン用又は獣医学用組成物にも関する。
【0121】
組成物は、アジュバントを更に含みうる。組成物はまた、1つ又は複数の更なる活性物質を含みうるか、又はそれ(ら)と組み合わせて投与されうる。i)STING(インターフェロン遺伝子刺激因子)アクチベーター、好ましくは、ベクター化形態のSTINGアクチベーター、即ち、STINGアクチベーターを含む(含有する又は発現する)ベクターと、ii)抗制御性T細胞(Treg)剤、好ましくは、抗腫瘍内制御性T細胞(Treg)剤と、薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む医薬組成物、ワクチン用組成物又は獣医学用組成物が、特に、本明細書に記載される。
【0122】
本発明の医薬組成物/組合せは、実際には、薬学的に許容される担体、支持体又は賦形剤を含むことがあり、これらは、本明細書で使用される場合、所望される特定の剤形に適するような、溶媒、分散媒、希釈剤又は他の液体ビヒクル、分散又は分散助剤、界面活性剤、等張剤、増粘又は乳化剤、保存薬、固体結合剤、滑沢剤及びこれらに類するものを含むこともあり、又は含まないこともある。Remington's The Science and Practice of Pharmacy、第21版、A. R. Gennaro (Lippincott, Williams and Wilkins社、Baltimore、MD、2006)には、医薬組成物の製剤化に使用される様々な賦形剤、及びその調製のための公知の技術が記載されている。いずれかの従来の賦形剤媒体が、いずれかの望ましくない生物学的効果を生じさせること又はそうでなければ医薬組成物にいずれかの他の成分と有害な形で相互作用すること等から、物質又はその誘導体と不適合性である場合を除いて、その使用は、本発明の範囲内であることが企図される。薬学的に許容される賦形剤は、保存薬、不活性希釈剤、分散剤、界面活性剤及び/又は乳化剤、緩衝剤並びにこれらに類するものでありうる。適する賦形剤としては、例えば、水、食塩水、デキストロース、スクロース、トレハロース、グリセロール、エタノール又は同様のもの、及びこれらの組合せが挙げられる。加えて、所望される場合には、ワクチンは、補助物質、例えば、湿潤若しくは乳化剤、pH緩衝剤、又は組成物の有効性を増強するアジュバントを含有しうる。一部の態様では、本明細書に記載の(医薬)組成物は、1つ又は複数の保存薬を含む。一部の態様では、本明細書に記載の(医薬)組成物は、保存薬を含まない。
【0123】
本明細書で開示の(医薬)組成物/組合せは、アジュバントを含みうる。任意のアジュバントを本発明に従って使用することができる。多数のアジュバントが公知である。多くのそのような化合物の有用な一覧が、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)により用意されており、当業者は、それを見つけることができる(www.niaid.nih.gov/daids/vaccine/pdf/compendium.pdf)。Allison(1998、Dev. Biol. Stand.、92:3～11頁;参照により本明細書に組み込まれる)、Unkelessら(1998、Annu. Rev. Immunol.、6:251～281頁;参照により本明細書に組み込まれる)、及びPhillipsら(1992、Vaccine、10: 151～158頁;参照により本明細書に組み込まれる)も参照されたい。何百もの異なるアジュバントが当技術分野において公知であり、それらを本発明の実施の際に利用することができる。本発明に関連して利用することができる例示的なアジュバントとしては、サイトカイン、ゲルタイプのアジュバント(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム等);微生物アジュバント(例えば、CpGモチーフを含む免疫調節性DNA配列;エンドトキシン、例えば、モノホスホリルリピドA;エキソトキシン、例えば、コレラ毒素、大腸菌(E. coli)熱不安定性毒素、及び百日咳毒素;ムラミルジペプチド等);油乳剤及び乳化剤ベースのアジュバント(例えば、フロイントアジュバント、MF59[Novartis社]、SAF等);微粒子状アジュバント(例えば、リポソーム、生分解性マイクロスフェア、サポニン等);合成アジュバント(例えば、非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチド類似体、ポリホスファゼン、合成ポリヌクレオチド等);及び/又はこれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。他の例示的なアジュバントとしては、一部のポリマー(例えば、米国特許第5,500,161号に記載されているポリホスファゼン)、Q57、QS21、スクアレン、テトラクロロデカオキシド等が挙げられる。
【0124】
本発明は、特に、対象におけるがんの又はSTING媒介疾患若しくは障害、特にSTING媒介がんの予防又は処置における使用のための本明細書に記載の組成物/組合せに関する。
【0125】
本明細書で開示の医薬組成物/組合せは、それを必要とする対象における免疫応答/効果を誘導又は刺激/増強するのに有用である。本発明は、それを必要とする対象における免疫応答を誘導又は増強するための方法であって、本明細書に記載の、i)STING(インターフェロン遺伝子刺激因子)アクチベーター、好ましくは、ベクター化形態のSTINGアクチベーター、即ち、STINGアクチベーターを含む(含有する又は発現する)ベクターとii)抗制御性T細胞(Treg)剤、好ましくは、抗腫瘍内Treg剤とを含む本明細書で開示の医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することにより、Treg細胞、好ましくは、腫瘍内に存在するTreg細胞の免疫抑制活性を低下させる又は阻害するステップを含み、Treg細胞、好ましくは、腫瘍内及びその周辺(即ち、腫瘍の微小環境内)に存在するTreg細胞の活性を低下させる又は阻害することによって、対象において対象が罹患している疾患、特にがんに対する治療効果が誘導される、方法に関する。免疫応答は、細胞免疫を指すことがあり、液性免疫を指すことがあり、又は両方を含むこともある。免疫応答を免疫系の一部に限定することもできる。例えば、ある特定の態様では、本明細書に記載の免疫原性組成物は、IFNy応答の増大を誘導することができる。ある特定の態様では、本明細書に記載の免疫原性組成物は、粘膜IgA応答(例えば、鼻及び/又は直腸洗浄液において測定されるような)を誘導することができる。ある特定の態様では、本明細書に記載の免疫原性組成物は、全身性IgG応答(例えば、血清において測定されるような)を誘導することができる。ある特定の態様では、本明細書に記載の免疫原性組成物は、ウイルス中和抗体、又は中和抗体応答を、誘導することができる。ある特定の態様では、本明細書に記載の免疫原性組成物は、CTL応答を誘導することができる。
【0126】
対象における免疫抑制機能を低下させる又は阻害する方法も、本明細書に記載される。方法は、i)STING(インターフェロン遺伝子刺激因子)アクチベーター、好ましくは、ベクター化形態のSTINGアクチベーター、即ち、STINGアクチベーターを含む(含有する又は発現する)ベクターとii)本明細書に記載の、抗制御性T細胞(Treg)剤、好ましくは、抗腫瘍内Treg剤とを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することにより、Treg細胞の、好ましくは、腫瘍内に存在するTreg細胞の、免疫抑制活性を低下させる又は阻害するステップを含み、Treg細胞の、好ましくは、腫瘍内及びその周辺(即ち、腫瘍の微小環境内)に存在するTreg細胞の、活性を低下させる又は阻害することにより、対象における免疫抑制機能が低下又は阻害される。
【0127】
したがって、本発明の医薬組成物/組合せは、ワクチンとして又はワクチンアジュバンとして有用である。本発明の組成物を使用して、患者における様々な疾患を処置することができる。疾患は、がん性であることあり、又は非がん性であることもある。がん性疾患は、腫瘍を生成するがんは勿論、腫瘍を生じさせないがん、例えば、血液学的悪性病変も含みうる。
【0128】
一態様では、STINGアクチベーター及び抗制御性T細胞(Treg)剤は、併用投与される。別の態様では、STINGアクチベーター剤及び抗制御性T細胞(Treg)剤は、逐次的に又は同時に、併用投与される。
【0129】
好ましい態様では、STINGアクチベーター及び抗腫瘍内制御性T細胞(Treg)剤は、併用投与される。別の好ましい態様では、STINGアクチベーター剤及び抗腫瘍内制御性T細胞(Treg)剤は、逐次的に又は同時に、併用投与される。
【0130】
一態様では、本発明は、それを必要とする対象において、がん又はSTING媒介疾患若しくは障害、好ましくはがんを処置するための、又はがん又はSTING媒介疾患若しくは障害を予防するための、特に、がん再燃を予防するための、方法に関する。方法は、本明細書に記載の医薬組成物/組合せ、特に、医薬組成物、ワクチン用組成物又は獣医用組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。本発明は、特に、対象におけるがんを処置するための医薬、例えばワクチンの製造のための、本明細書で開示の組成物/組合せ、特に、医薬組成物、ワクチン用組成物又は獣医学用組成物の使用に関する。本発明は、がんを処置又はがん再燃を予防するための使用のための、本明細書で開示の医薬組成物/組合せにも関する。
【0131】
「処置するための方法」とは、個体、例えば、哺乳動物、特にヒトの状態の有益な変化を生じさせることを目的とするプロセスを意味する。ヒトの処置と獣医学的処置が両方とも企図される。有益な変化は、機能の回復、症状の軽減、疾患、障害若しくは状態の制限若しくは減速、又は患者の状態、疾患若しくは障害の悪化の予防、制限若しくは減速のうちの1つ又は複数を含むことができ、特に、本明細書で使用される場合、用語「処置」(「処置する」又は「処置すること」も)は、特定の疾患、障害及び/若しくは状態又は疾患に対する素因を、部分的に又は完全に緩和する、軽快させる、和らげる、抑える、その発症を遅延させる、その重症度を低下させる及び/又はその1つ若しくは複数の症状若しくは特徴の発生率を低下させる免疫原性組成物の任意の投与を指す。そのような処置は、関連疾患、障害、及び/若しくは状態の徴候を示さない対象の処置、並びに/又は疾患、障害、及び/若しくは状態の初期徴候のみを示す対象の処置でありうる。或いは又は加えて、そのような処置は、関連疾患、障害、及び/又は状態の1つ又は複数の確立された徴候を示す対象の処置でありうる。ある特定の態様では、用語「処置すること」は、患者のワクチン接種を指す。
【0132】
用語「がん」は、がん、前がん性症状及び腫瘍転移等の、疾患又は障害を包含する。がんは、固形がんであることもあり、又は液性がんであることもある。好ましくは、がんは、固形がんである。本発明の組成物に有益な抗腫瘍効果がある、がん疾患及び状態の例としては、肺、骨、膵臓、皮膚、頭部、頸部、子宮、卵巣、胃、直腸、心臓、食道、小腸、腸、内分泌系、甲状腺、副甲状腺、副腎、尿道、前立腺、陰茎、精巣、尿管、膀胱、腎臓若しくは肝臓のがん;直腸がん;肛門部のがん;卵管、子宮内膜、子宮頸、膣、外陰部、腎盂、腎細胞の癌腫;軟部組織の肉腫;粘液腫;横紋筋肉腫;線維腫;脂肪腫;奇形腫;胆管細胞癌;肝芽腫;血管肉腫;血管腫;肝細胞癌;線維肉腫;軟骨肉腫;骨髄腫;慢性若しくは急性白血病;リンパ球性リンパ腫;原発性CNSリンパ腫;CNSの新生物;脊髄軸腫瘍;扁平上皮癌;滑膜肉腫;悪性胸膜中皮腫;脳幹神経膠腫;下垂体腺腫;気管支腺腫;軟骨性過誤腫;中皮腫;ホジキン病又は前述のがんの1つ若しくは複数についての組合せが挙げられるが、それらに限定されない。
【0133】
固形がんを処置するために又は固形がん再燃を予防するために使用されたとき、本明細書で開示の医薬組成物/組合せは、有利なことに、腫瘍及びその微小環境内に存在するTreg細胞を枯渇させる。
【0134】
本明細書で開示の医薬組成物/組合せを、更に、1つ又は複数の第2の治療剤、特に、化学療法剤(即ち、がん治療剤)と組み合わせて使用することができる。化学療法剤としては、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、bcg、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンポテカン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン(estramnustine)、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、タキソール、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、二塩化チタノセン、トポテカン、トラツズマブ、トレチノイン、トリメトレキサート、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン(CA)、5-アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコホルマイシン、4-ヒドロキシペルオキシシクロホスファミド、5-フルオロウラシル(5-FU)、5-フルオロデオキシウリジン(5-FUdR)及びメトトレキサート(MTX)を挙げることができるが、これらに限定されない。
【0135】
本明細書で開示の医薬組成物に曝露された患者は、例えば、腫瘍の型に、患者の状態に、及び他の健康な組織に依存して、更に、放射線療法に曝露されること及び/又は外科手術、ホルモン療法若しくは骨髄移植により処置されることがある。
【0136】
本明細書で使用される場合、用語「ワクチン接種」は、例えば疾患を引き起こす原因物質(例えば、ウイルス)への、免疫応答を生じさせることを目的とする組成物の投与を指す。本発明では、ワクチン接種を、疾患を引き起こす原因物質への曝露の前、その最中及び/又はその後に、並びにある特定の態様では、原因物質への曝露の前、その最中及び/又はその直後に、行うことができる。一部の態様では、ワクチン接種は、ワクチン接種用組成物の、時間の適切な間隔を空けた、複数回投与を含む。本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、任意の医学的処置に適用可能な妥当な損益比で、処置される対象に治療効果をもたらすのに十分な量(又は用量)を指す。治療効果は、客観的(即ち、何らかの試験若しくはマーカーにより測定可能)であることもあり、又は主観的であることもある(即ち、対象が効果の兆候若しくは感触を与える)。特に、「治療有効量」は、所望の疾患又は状態を予防する、軽快させる又は処置するために有効な、或いは疾患に関連する症状を軽快させること、疾患の発症の予防する若しくは遅延させること、及び/又は、更に、疾患の症状の重症度若しくは頻度を低めること等により、検出可能な治療効果又は予防効果を示すために有効な、本発明の組成物の量を指す。治療有効量は、複数の単位用量を含みうる投薬レジメンで通常は投与される。いずれの特定の免疫原性組成物についても、治療有効量(及び/又は有効な投薬レジメンの中で適切な他人に用量)は、例えば、投与経路に依存して、他の医薬品との組合せに依存して、変わりうる。また、任意の特定の患者のための具体的な治療有効量(及び/又は単位用量)は、処置されることになる障害及びその障害の重症度;利用される具体的な医薬品の活性;利用される具体的な組成物;患者の年齢、体重、総体的な健康、性別及び食事;利用される具体的な免疫原性組成物の投与の回数、投与経路、及び/又は排泄若しくは代謝率;並びに医学技術分野において周知の同様の因子を含む、様々な因子に依存しうる。そのような量に対応するであろう所与の化合物の量は、特定の化合物[例えば、特定の化合物の作用強度(pIC50)、有効性(EC50)、及び生物学的半減期]、病状及びその重症度、処置を必要とする患者の正体(例えば、年齢、サイズ及び体重)等の因子に依存して変わることになるが、それでもやはり、当業者は、それを常套的に決定することができる。同様に、処置の継続期間、及び化合物の投与の時点(投薬間の期間及び投薬のタイミング、例えば、食前/食中/食後)は、処置を必要とする対象の正体(例えば、体重)、特定の化合物及びその特性(例えば、薬理学的特性)、疾患又は障害及びその重症度、並びに使用されることになる具体的な組成物及び方法に従って変わることになるが、それでもやはり、当業者は、それを常套的に決定することができる。
【0137】
用語「用量」は、本明細書では以降、本発明の組成物の「単位」用量、即ち、本明細書中、上記で説明されたように、処置を必要とする対象に投与されうる用量、典型的には、がんに、又はSTING媒介疾患若しくは障害に、特にがんに罹患している対象、或いはがん又はSTING媒介疾患若しくは障害、特にがんを予防すべき対象における用量に存在する特定の成分に関して使用される。上記で説明されたように、用語「用量」及び「量」は、同義である。
【0138】
特定の態様では、本発明の組成物に存在するサイクリックジヌクレオチド(好ましくは、ウイルス様粒子にパッケージングされている)、例えば、cGAMPの用量は、約1ng～約100mgの範囲であり、本発明の組成物に存在するイマチニブの用量は、約1mg～約1gの範囲である。
【0139】
別の特定の態様では、本発明の組成物に存在するサイクリックジヌクレオチド(好ましくは、ウイルス様粒子にパッケージングされている)、例えば、cGAMPの用量は、約1ng～約100mgの範囲であり、本発明の組成物に存在する抗CTLA-4抗体の用量は、約10mg～約1gの範囲である。
【0140】
別の特定の態様では、本発明の組成物に存在するサイクリックジヌクレオチド(好ましくは、ウイルス様粒子にパッケージングされている)、例えば、cGAMPの用量は、約1ng～約100mgの範囲であり、本発明の組成物に存在するダサチニブの用量は、約10mg～約1gの範囲である。
【0141】
別の特定の態様では、本発明の組成物に存在するサイクリックジヌクレオチド(好ましくは、ウイルス様粒子にパッケージングされている)、例えば、cGAMPの用量は、約1ng～約100mgの範囲であり、本発明の組成物に存在する抗LAG3抗体の用量は、約1mg～約1gの範囲である。
【0142】
別の特定の態様では、本発明の組成物に存在するサイクリックジヌクレオチド(好ましくは、ウイルス様粒子にパッケージングされている)、例えば、cGAMPの用量は、約1ng～約100mgの範囲であり、本発明の組成物に存在する抗TIM-3抗体の用量は、約1mg～約1gの範囲である。
【0143】
別の特定の態様では、本発明の組成物に存在するサイクリックジヌクレオチド(好ましくは、ウイルス様粒子にパッケージングされている)、例えば、cGAMPの用量は、約1ng～約100mgの範囲であり、本発明の組成物に存在する抗ICOS抗体の用量は、約1mg～約1gの範囲である。
【0144】
別の特定の態様では、本発明の組成物に存在するサイクリックジヌクレオチド(好ましくは、ウイルス様粒子にパッケージングされている)、例えば、cGAMPの用量は、約1ng～約100mgの範囲であり、本発明の組成物に存在する抗CD25抗体の用量は、約1mg～約1gの範囲である。
【0145】
別の特定の態様では、本発明の組成物に存在するサイクリックジヌクレオチド(好ましくは、ウイルス様粒子にパッケージングされている)、例えば、cGAMPの用量は、約1ng～約100mgの範囲であり、本発明の組成物に存在する抗CCR4抗体の用量は、約1mg～約1gの範囲である。
【0146】
別の特定の態様では、本発明の組成物に存在するサイクリックジヌクレオチド(好ましくは、ウイルス様粒子にパッケージングされている)、例えば、cGAMPの用量は、約1ng～約100mgの範囲であり、本発明の組成物に存在する抗CCR8抗体の用量は、約1mg～約1gの範囲である。
【0147】
別の特定の態様では、本発明の組成物に存在するサイクリックジヌクレオチド(好ましくは、ウイルス様粒子にパッケージングされている)、例えば、cGAMPの用量は、約1ng～約100mgの範囲であり、本発明の組成物に存在する抗TNFR2抗体の用量は、約1mg～約1gの範囲である。
【0148】
本明細書で使用される場合、用語「軽快」又は「改善」とは、対象の容態の予防、軽減、若しくは一時的に和らげること、又は対象の容態の改善を意味する。軽快は、疾患、障害又は状態の完全回復又は完全予防を含むが、それを必要としない。用語「予防」は、疾患、障害又は状態の発症を遅延させることを指す。予防は、疾患、障害又は状態の発症が、事前に定義された期間にわたって遅延されたとき、完全と見なされうる。本明細書で使用される場合、用語「剤形」及び「単位剤形」は、処置されることになる患者のための治療剤の物理的に別個の単位を指す。各々の単位は、所望の治療効果を生じさせるように計算された所定量の活性材料を含有する。しかし、組成物の総投薬量が担当医によって正当な医学的判断の範囲内で決定されることは、理解されるであろう。「投薬レジメン」(又は「治療レジメン」)は、この用語が本明細書で使用される場合、典型的には期間を離して、対象に個々に投与される1セットの単位用量(典型的には1より多くの)である。一部の態様では、所与の治療剤は、1又は複数用量を含みうる、推奨投薬レジメンを有する。一部の態様では、投薬レジメンは、複数の用量を含み、その用量の各々は、同じ長さの期間、離され、一部の態様では、投薬レジメンは、複数の用量、及び個々の用量を隔てる少なくとも2つの異なる期間を含む。
【0149】
本明細書で使用される場合、用語「対象」、「個体」、又は「患者」は、哺乳動物を指し、特に、ヒト又は非ヒト哺乳動物対象を、その年齢又は性別が何であれ、指す。処置されることになる個体(「患者」又は「対象」とも呼ばれる)は、がんに罹患している個体(胎児、乳児、小児、青少年又は成人)である。一部の態様では、対象は、ヒトである。本明細書に記載の一部の他の態様では、対象は、動物、特に、ペット(例えば、イヌ及びネコ)、家畜(例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、イノシシ科動物、魚類、家禽)、又はウマである。
【0150】
本発明の医薬組成物/組合せは、特定の態様では、任意の全身若しくは局所投与経路により投与されうる、又は任意の全身若しくは局所投与経路による投与に適している。例えば、経路は、非経口経路、例えば、腹腔内、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内、動脈内、間接内及び髄内経路;又は経腸経路、例えば、経口及び粘膜(例えば、舌下、鼻腔内、直腸内、膣内若しくは気管支内)経路でありうる。好ましい投与経路は、腹腔内、皮下、静脈内及び経口経路である。
【0151】
例えば、ここで提供される医薬組成物は、無菌注射用形態(例えば、皮下注射又は静脈内注射に適している形態)で提供されうる。例えば、一部の態様では、医薬組成物は、注射/注入に適している液体剤形で提供される。一部の態様では、医薬組成物は、注射の前に水性希釈剤(例えば、水、緩衝液、食塩溶液等)で再構成される、必要に応じて真空下で、粉末(例えば、凍結乾燥された及び/又は滅菌された)として、提供される。一部の態様では、医薬組成物は、水、塩化ナトリウム溶液、酢酸ナトリウム溶液、ベンジルアルコール溶液、リン酸緩衝食塩水等で希釈及び/又は再構成される。一部の態様では、粉末を水性希釈剤と穏やかに混合するべきである(例えば、振盪するべきでない)。
【0152】
特定の態様では、STINGアクチベーターは、全身性経路、例えば、皮下、経口、腹腔内、筋肉内、経皮又は静脈内経路により、好ましくは皮下経路により、対象に投与されることになる。
【0153】
特定の態様では、STINGアクチベーターがウイルス様粒子(VLP)であるとき、VLPは、全身性経路、例えば、皮下、経口、腹腔内又は静脈内経路により、好ましくは皮下経路により、対象に投与されることになる。
【0154】
特定の態様では、抗Treg剤は、全身性経路、例えば、腹腔内、経口、皮下又は静脈内経路により、好ましくは腹腔内経路により、対象に投与されることになる。
【0155】
医薬組成物及び__並びに本明細書に記載のキットの部分は、冷蔵及び/凍結されうる形態で提供することができる。或いは、それらを、冷蔵及び/又は凍結されえない形態で提供することができる。必要に応じて、再構成溶液及び/又は液体剤形は、凍結後、ある特定の期間(例えば、2時間、12時間、24時間、2日、5日、7日、10日、2週間、1カ月、2カ月、又はそれより長く)保管することができる。
【0156】
本明細書に記載の医薬組成物及びキットの部分の製剤は、薬理学技術分野において公知の又は今後開発される任意の方法により調製することができる。そのような調製のための方法は、活性成分を1つ若しくは複数の賦形剤及び/又は1つ若しくは複数の他の補助成分と会合状態にするステップ、そしてその後、必要な場合及び/又は望ましい場合、生成物を成形及び/又は包装して所望の単一又は複数用量単位にするステップを含む。本発明による医薬組成物は、単一単位用量として、及び/又は多数の単一単位用量として、調製すること、包装すること、及び/又は大量に販売することができる。
【0157】
本発明による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤及び/又は任意の追加の成分の相対量は、処置される対象の正体、サイズ及び/若しくは状態に依存して、並びに/又は組成物が投与されることになる経路に依存して、変わりうる。例として、組成物は、0.1パーセント～100パーセント(w/w)の間の活性成分を含みうる。
【0158】
本明細書に記載の組成物は、一般に、免疫応答を誘導するのに必要又は十分であるような量で及びそのような時間にわたって投与されることになる。投薬レジメンは、ある期間にわたって単一用量又は複数の用量からなりうる。投与されることになる免疫原性組成物[例えば、i)インターフェロン遺伝子刺激因子(STING)アクチベーターとii)抗制御性T細胞(Treg)剤、好ましくは抗腫瘍内Treg剤との組合せ]の正確な量は、対象によって変わりうるものであり、幾つかの因子に依存しうる。したがって、一般に、使用される正確な用量が、担当医により決定されるような用量となり、対象の体重及び投与経路に依存するばかりでなく、対象の年齢、及び症状の重症度、及び/又は感染のリスクにも依存することになることは、理解されるであろう。第1の態様では、医薬組成物の特定の量が単一用量として投与される。或いは、医薬組成物の特定の量は、1用量より多い用量(例えば、1～12カ月隔てられる1～3用量)として投与される。その代わりに、医薬組成物の特定の量は、数回にわたって単位用量(例えば、1～12カ月隔てられる1～3用量)として投与される。医薬組成物は、初回用量で及び少なくとも1ブースター用量で投与されうる。
【0159】
本発明は、少なくとも2つの部分を含む部分のキット(kit of part)であって、第1の部分が、本明細書で開示のSTING(インターフェロン遺伝子刺激因子)アクチベーター、好ましくは、ベクター化形態のSTINGアクチベーター、即ち、STINGアクチベーターを含む(含有する又は発現する)ベクターを含み、第2の部分が、本明細書で開示の、抗制御性T細胞(Treg)剤、好ましくは、抗腫瘍内Treg剤を含み、キットの第1及び第2の部分が、好ましくは、別個の区画内にある、部分のキットにも関する。
【0160】
特定の態様では、キットの第1の部分は、ウイルス様粒子(VLP)である、STING(インターフェロン遺伝子刺激因子)アクチベーターを含み、キットの第2の部分は、イマチニブ又はその誘導体若しくは塩である、抗腫瘍内制御性T細胞(Treg)剤を含む。
【0161】
別の特定の態様では、キットの第1の部分は、ウイルス様粒子(VLP)である、STING(インターフェロン遺伝子刺激因子)アクチベーターを含み、キットの第2の部分は、ダサチニブ又はその誘導体若しくは塩である、抗腫瘍内制御性T細胞(Treg)剤を含む。
【0162】
別の特定の態様では、キットの第1の部分は、ウイルス様粒子(VLP)である、STING(インターフェロン遺伝子刺激因子)アクチベーターを含み、キットの第2の部分は、本明細書に記載のIgG2定常領域又は変異したIgG1定常領域を有する抗CTLA-4抗体である、抗腫瘍内制御性T細胞(Treg)剤を含む。
【0163】
別の特定の態様では、キットの第1の部分は、ウイルス様粒子(VLP)である、STING(インターフェロン遺伝子刺激因子)アクチベーターを含み、キットの第2の部分は、本明細書に記載の、抗CD25抗体、特に、IgG2定常領域又は変異したIgG1定常領域を有する抗CD25抗体である、抗腫瘍内制御性T細胞(Treg)剤を含む。
【0164】
一態様では、STINGアクチベーター、好ましくは、ベクター化形態のSTINGアクチベーターを含む、キットの部分は、経口、腹腔内、静脈内経路に又は皮下経路に、好ましくは、皮下経路に適応した形態でもある。本発明の組成物の経口経路は、非固形腫瘍又は血液悪性病変の処置において、よく適応した免疫応答を惹起すると予想される。
【0165】
一態様では、抗制御性T細胞剤、好ましくは、抗腫瘍内Treg細胞剤を含む、キットの部分は、経口、腹腔内又は静脈内経路に、好ましくは、腹腔内経路に適した形態である。
【0166】
処置されることになる適応症に依存して、STINGアクチベーター、好ましくはベクター化STINGアクチベーターを含むキットの第1の部分、及び抗制御性T細胞(Treg)剤、好ましくは抗腫瘍内Treg細胞剤を含むキットの第2の部分は、併用投与される。一態様では、STINGアクチベーター剤、好ましくはベクター化STINGアクチベーター剤を含むキットの第1の部分、及び抗制御性T細胞(Treg)剤、特に、抗腫瘍内Treg細胞剤を含むキットの第2の部分は、逐次的に又は同時に、併用投与される。
【0167】
本発明は、本明細書における上記の、がん又はSTING関連疾患若しくは障害を処置するための使用のための、本明細書で開示の本発明のキットにも関する。一態様では、がんに関して「処置する」、「処置すること」又は「処置」は、がんを緩和すること、がんの1つ又は複数の症状を消失させる又は軽減すること、がんの進行を緩徐化する又は消失させること、及び以前に罹患した又は診断された患者又は対象における状態の再発を遅延させることを指す。別の態様では、感染性疾患に関して「処置する」、「処置すること」又は「処置」は、疼痛、発熱、ウイルス負荷を緩和すること、バイオフィルム形成を低減させること等を指す。
【0168】
対象におけるがん又はSTING媒介疾患若しくは障害、特にSTING媒介がんを処置するための医薬の製造のための、本発明のキットの使用も、本明細書で開示される。
【0169】
別の態様では、本発明は、生きている哺乳動物対象において治療免疫効果を刺激するための方法に関する。方法は、i)STING(インターフェロン遺伝子刺激因子)アクチベーター、好ましくは、ベクター化STINGアクチベーターとii)本明細書で開示の、抗制御性T細胞(Treg)剤、好ましくは、抗腫瘍内Treg剤とを含む治療用組成物を、生きている哺乳動物対象に投与することにより、Treg細胞の、好ましくは、腫瘍内に存在するTreg細胞の、免疫抑制効果を低下させるステップを含み、Treg細胞の活性を低下させる及び/又は阻害することにより、生きている哺乳動物対象における疾患に対する治療効果が誘導される。
【0170】
更なる態様では、本発明は、対象における免疫抑制機能を阻害する又は低下させる方法に関する。方法は、i)STING(インターフェロン遺伝子刺激因子)アクチベーター、好ましくは、ベクター化形態のSTINGアクチベーター、即ち、STINGアクチベーターを含む(含有する又は発現する)ベクターとii)本明細書で開示の、抗制御性T細胞(Treg)剤、好ましくは、抗腫瘍内Treg剤とを含む治療用組成物を、それを必要とする対象に投与することにより、Treg細胞の、好ましくは、腫瘍内に存在するTreg細胞の、免疫抑制活性を阻害する又は低下させるステップを含み、Treg細胞の、好ましくは、TME内、即ち腫瘍内及びその周辺のTreg細胞の、活性を低下させる又は阻害することにより、対象における免疫抑制機能が低下又は阻害される。
【0171】
本明細書で言及される場合の「免疫寛容の抑制」は、対象の免疫系による腫瘍回避の任意の自然寛容及び/又は抑制を含む、疾患の抗原の存在を寛容する自己免疫系の能力を抑制することに関する。
【0172】
本発明の方法は、それを必要とする対象に本発明の組成物を投与するステップを含み、組成物の投与によって、対象の免疫系による疾患及び/又は疾患の抗原の寛容が抑制されうる。本明細書記載の組成物の対象への投与は、対象における腫瘍回避機序を非活性化することを可能にし、より良好な腫瘍根絶につながる。好ましくは、組成物の投与は、CD4+CD25+FoxP3+であるTreg細胞の活性を抑制する。本明細書で言及される場合の「Treg」細胞は、CD4+CD25+FoxP3+であり且つnTregとiTregの両方を含む、制御性T細胞に関する。本明細書で言及される場合のナイーブT細胞は、CD4+CD25-FoxP3-であるT細胞である。
【0173】
本発明の方法は、様々な方法でTreg細胞、特に、腫瘍内に存在するTreg細胞を抑制することを含む。Treg細胞の活性の抑制は、例えば、ナイーブT細胞のiTreg細胞への変換を阻害することによるものでありうる。方法は、ナイーブ細胞のTreg細胞への変換に、例えば、FoxP3の活性を調節することにより、干渉する本明細書に記載の組成物を投与するステップを含みうる。FoxP3は、免疫抑制活性を引き起こすことができる細胞のマーカーである転写因子である。細胞内のFoxP3の非存在又は逆転は、細胞が抑制機能を行わない又はもはや行わない兆候である。
【0174】
本明細書で開示される方法は、獣医学的適用、例えば、イヌ科動物及びネコ科の動物への適用に使用することができる。所望される場合、本明細書記載の方法は、ヒツジ類、鳥類、ウシ亜科動物、ブタ類及びウマ科動物育種等の、家畜のために使用することもできる。
【0175】
以下の実施例は、本発明のある特定の好ましい態様を実証及び更に例証するために提供されるものであり、本発明の範囲の制限と見なすべきではない。
実験の部
実験の部
【実施例1】
【0176】
材料及び方法
細胞系
293T細胞を、10%ウシ胎孔血清(FBS、GIBCO)と1%ペニシリン-ストレプトマイシン(GIBCO)とを補充したダルベッコ変性イーグル培地(DMEM)で培養した。THP-1細胞を、10%FBS(GIBCO)と1%ペニシリン-ストレプトマイシン(GIBCO)とを補充したロズウェルパーク記念研究所(Roswell Park Memorial Institute)(RPMI)1640培地で培養した。in vivo実験に使用した細胞は、当初ATCCから購入したマウス線維肉腫細胞系MCA-OVAであった。腫瘍細胞を、37℃で、5%CO2で、10%ウシ胎孔血清(FCS、Biosera社)と1%ペニシリン-ストレプトマイシンと1mM β-メルカプトエタノール(GIBCO)とを補充したRPMI 1640培地において単層で成長させた。集密に達する前に、腫瘍細胞を0.05%トリプシンによって回収し、洗浄し、注射のためにハンクス平衡塩類溶液(HBSS、GIBCO)に懸濁させた。細胞系は、PCRによる検査でマイコプラズマ種(Mycoplasma ssp.)をはじめとする幾つかの病原体に対して陰性を示した。
細胞系
293T細胞を、10%ウシ胎孔血清(FBS、GIBCO)と1%ペニシリン-ストレプトマイシン(GIBCO)とを補充したダルベッコ変性イーグル培地(DMEM)で培養した。THP-1細胞を、10%FBS(GIBCO)と1%ペニシリン-ストレプトマイシン(GIBCO)とを補充したロズウェルパーク記念研究所(Roswell Park Memorial Institute)(RPMI)1640培地で培養した。in vivo実験に使用した細胞は、当初ATCCから購入したマウス線維肉腫細胞系MCA-OVAであった。腫瘍細胞を、37℃で、5%CO2で、10%ウシ胎孔血清(FCS、Biosera社)と1%ペニシリン-ストレプトマイシンと1mM β-メルカプトエタノール(GIBCO)とを補充したRPMI 1640培地において単層で成長させた。集密に達する前に、腫瘍細胞を0.05%トリプシンによって回収し、洗浄し、注射のためにハンクス平衡塩類溶液(HBSS、GIBCO)に懸濁させた。細胞系は、PCRによる検査でマイコプラズマ種(Mycoplasma ssp.)をはじめとする幾つかの病原体に対して陰性を示した。
【0177】
マウス
全ての動物を、キュリー研究所の動物委員会により承認されたプロトコールに従って使用し、バリア施設において病原体不在条件で維持した。C57BL/6JマウスをCharles River Laboratories社から購入した。マウスを、少なくとも3日間、収容施設に順応させた。全ての実験を、6～8週齢の間の雌マウスを使用して開始した。
全ての動物を、キュリー研究所の動物委員会により承認されたプロトコールに従って使用し、バリア施設において病原体不在条件で維持した。C57BL/6JマウスをCharles River Laboratories社から購入した。マウスを、少なくとも3日間、収容施設に順応させた。全ての実験を、6～8週齢の間の雌マウスを使用して開始した。
【0178】
精製前のcGAMP-VLP産生
7,500,000個の293T細胞を150cm2細胞培養フラスコに播種し、一晩インキュベートする。翌日、13μgのマウスcGAS(pVAX1-cGAS)、8.1μgのHIV-1 GAGPOL(psPAX2)、3.3μgのVSVG(pVAX1-VSVG-INDIANA2)、及び50μLのPEIpro(Ozyme社、reference POL115-010)を製造業者の使用説明書に従って用いて各フラスコにトランスフェクトする。トランスフェクションミックスをOpti-MEM(GIBCO)で作製した。トランスフェクションの翌朝、培地に、52mLの温VLP産生培地(10mM HEPES及び50μg/mLのゲンタマイシンを添加した、293T培養培地)を加え、細胞を37℃で、5%CO2で、翌日までインキュベートした。
7,500,000個の293T細胞を150cm2細胞培養フラスコに播種し、一晩インキュベートする。翌日、13μgのマウスcGAS(pVAX1-cGAS)、8.1μgのHIV-1 GAGPOL(psPAX2)、3.3μgのVSVG(pVAX1-VSVG-INDIANA2)、及び50μLのPEIpro(Ozyme社、reference POL115-010)を製造業者の使用説明書に従って用いて各フラスコにトランスフェクトする。トランスフェクションミックスをOpti-MEM(GIBCO)で作製した。トランスフェクションの翌朝、培地に、52mLの温VLP産生培地(10mM HEPES及び50μg/mLのゲンタマイシンを添加した、293T培養培地)を加え、細胞を37℃で、5%CO2で、翌日までインキュベートした。
【0179】
cGAMP-VLP回収及びスクロースクッションでの精製
cGAMP-VLP含有培地を細胞から回収し、10分間、200gで、4℃で遠心分離し、0.45μmで濾過した。39mLのcGAMP-VLP含有培地を、6本のUltra-Clearチューブ(Beckman Coulter社、ref 344058)内の6mLの冷20%滅菌濾過済みエンドトキシン不含スクロースの上に穏やかにかぶせ、1時間30分間、100,000gで、4℃で遠心分離した。培地及びスクロースを穏やかに吸引し、ペレットを冷PBSに再懸濁させ、1本のUltra-Clear 13.2mL(Beckman Coulter社、ref 344059)に移し、再び100,000gで、4℃で、1時間30分間、遠心分離した。PBSを穏やかに流出させ、ペレットを適切な量、典型的には320μLの冷PBSに再懸濁させた。
cGAMP-VLP含有培地を細胞から回収し、10分間、200gで、4℃で遠心分離し、0.45μmで濾過した。39mLのcGAMP-VLP含有培地を、6本のUltra-Clearチューブ(Beckman Coulter社、ref 344058)内の6mLの冷20%滅菌濾過済みエンドトキシン不含スクロースの上に穏やかにかぶせ、1時間30分間、100,000gで、4℃で遠心分離した。培地及びスクロースを穏やかに吸引し、ペレットを冷PBSに再懸濁させ、1本のUltra-Clear 13.2mL(Beckman Coulter社、ref 344059)に移し、再び100,000gで、4℃で、1時間30分間、遠心分離した。PBSを穏やかに流出させ、ペレットを適切な量、典型的には320μLの冷PBSに再懸濁させた。
【0180】
THP-1活性化及びSIGLEC-1発現測定
50,000個のTHP-1細胞を丸底96ウェルプレート内の100μLの培地に播種し、100μLのcGAMP-VLP希釈物及び可溶性2'3'cGAMP希釈物で刺激した。細胞を18～24時間インキュベートし、抗ヒトSIGLEC-1(Miltenyi社、ref 130-098-645)で染色し、PFA 1%で固定し、BD FACS Verseサイトメーターを使用してデータを取得した。
50,000個のTHP-1細胞を丸底96ウェルプレート内の100μLの培地に播種し、100μLのcGAMP-VLP希釈物及び可溶性2'3'cGAMP希釈物で刺激した。細胞を18～24時間インキュベートし、抗ヒトSIGLEC-1(Miltenyi社、ref 130-098-645)で染色し、PFA 1%で固定し、BD FACS Verseサイトメーターを使用してデータを取得した。
【0181】
腫瘍成長
雌C57BL/6Jマウスの右下側腹部に100μLのPBS中の5×105個のMCA-OVA細胞を皮下接種した。マウスを体重減少、罹病及び死亡について毎日モニターした。腫瘍を週に2回又は3回モニターした。潰瘍化が起こった場合には、又は腫瘍体積が2000mm3に達したら、マウスを人道的に安楽死させた。腫瘍サイズは、デジタルノギスを使用して測定し、腫瘍体積は、式(長さ×幅2)/2で計算した。腫瘍植込み後、Stimunity社により提供されているRandmiceソフトウェアを使用してマウスを処置群に無作為に割り当てた。
雌C57BL/6Jマウスの右下側腹部に100μLのPBS中の5×105個のMCA-OVA細胞を皮下接種した。マウスを体重減少、罹病及び死亡について毎日モニターした。腫瘍を週に2回又は3回モニターした。潰瘍化が起こった場合には、又は腫瘍体積が2000mm3に達したら、マウスを人道的に安楽死させた。腫瘍サイズは、デジタルノギスを使用して測定し、腫瘍体積は、式(長さ×幅2)/2で計算した。腫瘍植込み後、Stimunity社により提供されているRandmiceソフトウェアを使用してマウスを処置群に無作為に割り当てた。
【0182】
In vivo免疫療法
STING全身(s.c.)療法は、50μLのPBS緩衝液中のcGAMP-VLP(50ng cGAMP)を注射することからなった。腫瘍が35～50mm3の間まで成長したら、S.C.注射を開始した。U-100インスリン注射器又は等価物:0.33mm(29G)×12.7mm(0.5mL)に組成物を充填し、全ての気泡を除去した。マウスをイソフルランで麻酔した。皮膚に向けて傾斜を付けて、針を腫瘍の隣接エリアに浅く入れ、針を皮下で、それが腫瘍の裏側(1cm)に達するまで移動させた。組成物を腫瘍に近いこのエリアにゆっくりと注射した。次いで、逆流しないようにそっと針を抜いた。
STING全身(s.c.)療法は、50μLのPBS緩衝液中のcGAMP-VLP(50ng cGAMP)を注射することからなった。腫瘍が35～50mm3の間まで成長したら、S.C.注射を開始した。U-100インスリン注射器又は等価物:0.33mm(29G)×12.7mm(0.5mL)に組成物を充填し、全ての気泡を除去した。マウスをイソフルランで麻酔した。皮膚に向けて傾斜を付けて、針を腫瘍の隣接エリアに浅く入れ、針を皮下で、それが腫瘍の裏側(1cm)に達するまで移動させた。組成物を腫瘍に近いこのエリアにゆっくりと注射した。次いで、逆流しないようにそっと針を抜いた。
【0183】
In vivo抗体Treg枯渇
Treg枯渇研究のために、MCA-OVA黒色腫の植込み後6、7、8、9及び10日目に腹腔内経路(i.p.)により、10mg/kgのイマチニブ化学療法剤(イマチニブメシレート-SIGMA社)でMCA-OVA腫瘍担持マウスを処置するか又はマウスにPBSを施した。最終イマチニブ注射の72時間後に腫瘍及び脾臓を使用してFACSによりTreg枯渇を確認した。
Treg枯渇研究のために、MCA-OVA黒色腫の植込み後6、7、8、9及び10日目に腹腔内経路(i.p.)により、10mg/kgのイマチニブ化学療法剤(イマチニブメシレート-SIGMA社)でMCA-OVA腫瘍担持マウスを処置するか又はマウスにPBSを施した。最終イマチニブ注射の72時間後に腫瘍及び脾臓を使用してFACSによりTreg枯渇を確認した。
【0184】
Ex vivo刺激アッセイ
T細胞応答を、cGAMP-VLP又はPBSの初回s.c.注射の10日後にIFN-γ ELISPOTによって評価した。マウスの後眼窩洞から採血し、赤血球を溶解することにより全血からPBMCを単離した。2×105個のPBMCを、ウェルごとに、1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含有するRPMI培地に播種し、一晩、陰性対照としての培地、10μg/mLのp15ペプチド(KSPWFTTL、配列番号2)、10μg/mLのOVA 257～264ペプチド(OVA-1)(SIINFEKL、配列番号3)、又は40μg/mLのOVA 265～280ペプチド(OVA-2)(TEWTSSNVMEERKIKV、配列番号4)で刺激した。マウスIFN-γ ELISPOT抗体(Diaclone社)を製造業者の使用説明書に従って使用してスポットを現像し、ImmunoSpotアナライザーを使用してスポットの数を数えた。
T細胞応答を、cGAMP-VLP又はPBSの初回s.c.注射の10日後にIFN-γ ELISPOTによって評価した。マウスの後眼窩洞から採血し、赤血球を溶解することにより全血からPBMCを単離した。2×105個のPBMCを、ウェルごとに、1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含有するRPMI培地に播種し、一晩、陰性対照としての培地、10μg/mLのp15ペプチド(KSPWFTTL、配列番号2)、10μg/mLのOVA 257～264ペプチド(OVA-1)(SIINFEKL、配列番号3)、又は40μg/mLのOVA 265～280ペプチド(OVA-2)(TEWTSSNVMEERKIKV、配列番号4)で刺激した。マウスIFN-γ ELISPOT抗体(Diaclone社)を製造業者の使用説明書に従って使用してスポットを現像し、ImmunoSpotアナライザーを使用してスポットの数を数えた。
【0185】
LEGENDplex(商標)アッセイ
初回(s.c)注射の3時間後に収集した血清試料を、Mouse Inflammation LEGENDplex(商標)キット(BioLegend社)により製造業者の使用説明書に従って炎症性サイトカイン(IFN-α、IFN-β、TNF-α、IL-6、MCP-1及びIL-1β)について解析した。FACS Verseサイトメーター(BD Biosciences社)でデータを取得し、BioLegend社のLEGENDplex Data Analysis Softwareで解析した。標準曲線回帰を使用して各々の標的サイトカインの濃度を計算した。
初回(s.c)注射の3時間後に収集した血清試料を、Mouse Inflammation LEGENDplex(商標)キット(BioLegend社)により製造業者の使用説明書に従って炎症性サイトカイン(IFN-α、IFN-β、TNF-α、IL-6、MCP-1及びIL-1β)について解析した。FACS Verseサイトメーター(BD Biosciences社)でデータを取得し、BioLegend社のLEGENDplex Data Analysis Softwareで解析した。標準曲線回帰を使用して各々の標的サイトカインの濃度を計算した。
【0186】
定量化及び統計解析
データをGraphPad Prism 8ソフトウェアで解析した。全てのデータは、平均±標準誤差(SEM)として提示される。複数の群及び平均腫瘍体積に関するデータを一元配置ANOVAとチューキー多重比較検定により解析した。生存曲線をログランク(マンテル-コックス)検定により解析した。p≦0.05を有意と見なした。
データをGraphPad Prism 8ソフトウェアで解析した。全てのデータは、平均±標準誤差(SEM)として提示される。複数の群及び平均腫瘍体積に関するデータを一元配置ANOVAとチューキー多重比較検定により解析した。生存曲線をログランク(マンテル-コックス)検定により解析した。p≦0.05を有意と見なした。
【0187】
結果
cGAMP-VLPの皮下(s.c.)投与に対する免疫応答を最適化するために、T細胞及び腫瘍成長に対するイマチニブの効果を調査した。
cGAMP-VLPの皮下(s.c.)投与に対する免疫応答を最適化するために、T細胞及び腫瘍成長に対するイマチニブの効果を調査した。
【0188】
MCA-OVA腫瘍モデルのスケジュール
単一MCA-OVA黒色腫側腹部腫瘍を担持しているマウスを、腫瘍生着から6日目に開始する、5日間、毎日のイマチニブ(10mg/kg)の腹腔内注射を伴う又は伴わない、10日にわたって3回注射する50ngのcGAMP-VLPで、皮下的に処置した(図1)。
単一MCA-OVA黒色腫側腹部腫瘍を担持しているマウスを、腫瘍生着から6日目に開始する、5日間、毎日のイマチニブ(10mg/kg)の腹腔内注射を伴う又は伴わない、10日にわたって3回注射する50ngのcGAMP-VLPで、皮下的に処置した(図1)。
【0189】
炎症性サイトカインの合成
cGAMP-VLPの初回注射の3時間後、炎症性サイトカインの産生を血清においてLEGENDplexにより測定した(図2)。cGAMP-VLP+イマチニブで処置したマウスからの血清は、単独でのイマチニブと比較して有意な増加、及び単独でのcGAMP-VLPと比較してサイトカインレベル(IFN-α、IFN-β、IL-6)の上昇を示した。
cGAMP-VLPの初回注射の3時間後、炎症性サイトカインの産生を血清においてLEGENDplexにより測定した(図2)。cGAMP-VLP+イマチニブで処置したマウスからの血清は、単独でのイマチニブと比較して有意な増加、及び単独でのcGAMP-VLPと比較してサイトカインレベル(IFN-α、IFN-β、IL-6)の上昇を示した。
【0190】
CD8及びCD4 T細胞応答
cGAMP-VLPの3回目の.c.注射の4日後、cGAMP-VLP+/-イマチニブで処置したマウスの群は、PBS+/-イマチニブで処置した群と比較して、末梢血における腫瘍特異的T細胞応答の有意な増大を示した(図3)。イマチニブ処置は、PBS群と比較して腫瘍特異的T細胞応答を誘導しなかった。加えて、cGAMP-VLP+イマチニブで処置した群は、単独でのcGAMP-VLPより高いT細胞応答を示し、これは、OVA-2ペプチドについて有意であった。
cGAMP-VLPの3回目の.c.注射の4日後、cGAMP-VLP+/-イマチニブで処置したマウスの群は、PBS+/-イマチニブで処置した群と比較して、末梢血における腫瘍特異的T細胞応答の有意な増大を示した(図3)。イマチニブ処置は、PBS群と比較して腫瘍特異的T細胞応答を誘導しなかった。加えて、cGAMP-VLP+イマチニブで処置した群は、単独でのcGAMP-VLPより高いT細胞応答を示し、これは、OVA-2ペプチドについて有意であった。
【0191】
腫瘍成長モニタリング
腫瘍成長に対する処置の影響をモニターした。単独でのイマチニブは、対照群と比較して腫瘍に対して効果がなかった(図4)。s.c.経路により単独で注射したcGAMP-VLPは、短期間の間、腫瘍成長を安定させ、対照群比較して遅延させた。イマチニブ処置とcGAMP-VLPの組合せは、単独でのcGAMP-VLP又は単独でのイマチニブと比較して、cGAMP-VLPとイマチニブとの相乗的な作用機序を示唆する、抗腫瘍応答の有意な増加を示した(図5)。
腫瘍成長に対する処置の影響をモニターした。単独でのイマチニブは、対照群と比較して腫瘍に対して効果がなかった(図4)。s.c.経路により単独で注射したcGAMP-VLPは、短期間の間、腫瘍成長を安定させ、対照群比較して遅延させた。イマチニブ処置とcGAMP-VLPの組合せは、単独でのcGAMP-VLP又は単独でのイマチニブと比較して、cGAMP-VLPとイマチニブとの相乗的な作用機序を示唆する、抗腫瘍応答の有意な増加を示した(図5)。
【0192】
処置マウスの毒性及び生存期間
単独のイマチニブで処置したマウスは、PBS処置と比較して延命効果を示さなかった(図6)。cGAMP-VLP処置は、PBS処置と比較して生存を有意に__。cGAMP-VLP+イマチニブ処置は、単独でのcGAMP-VLP処置と比較して生存期間の有意な延長を示した。これらの結果は、腫瘍により誘導される死からの保護に対するcGAMP-VLPとイマチニブの相乗効果と一致する。イマチニブで処置したマウスは、全ての実験中に体重減少を示さず、このことによってこの処置による毒性の非存在が確認された(図7)。
本発明者らは、イマチニブ処置が、全身性腫瘍特異的T細胞応答及び抗腫瘍効果を生じさせる上で、cGAMP-VLPとの予想外の相乗作用を実証すると結論付ける。
単独のイマチニブで処置したマウスは、PBS処置と比較して延命効果を示さなかった(図6)。cGAMP-VLP処置は、PBS処置と比較して生存を有意に__。cGAMP-VLP+イマチニブ処置は、単独でのcGAMP-VLP処置と比較して生存期間の有意な延長を示した。これらの結果は、腫瘍により誘導される死からの保護に対するcGAMP-VLPとイマチニブの相乗効果と一致する。イマチニブで処置したマウスは、全ての実験中に体重減少を示さず、このことによってこの処置による毒性の非存在が確認された(図7)。
本発明者らは、イマチニブ処置が、全身性腫瘍特異的T細胞応答及び抗腫瘍効果を生じさせる上で、cGAMP-VLPとの予想外の相乗作用を実証すると結論付ける。
【実施例2】
【0193】
材料及び方法
細胞系
293T細胞を、10%ウシ胎孔血清(FBS、GIBCO)と1%ペニシリン-ストレプトマイシン(GIBCO)とを補充したダルベッコ変性イーグル培地(DMEM)で培養した。THP-1細胞を、10%FBS(GIBCO)と1%ペニシリン-ストレプトマイシン(GIBCO)とを補充したロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640培地で培養した。in vivo実験に使用した細胞は、当初ATCCから購入したマウス線維肉腫細胞系MCA-OVAであった。腫瘍細胞を、37℃で、5%CO2で、10%ウシ胎孔血清(FCS、Biosera社)と1%ペニシリン-ストレプトマイシンと1mM β-メルカプトエタノール(GIBCO)とを補充したRPMI 1640培地において単層で成長させた。集密に達する前に、腫瘍細胞を0.05%トリプシンによって回収し、洗浄し、注射のためにハンクス平衡塩類溶液(HBSS、GIBCO)に懸濁させた。細胞系は、PCRによる検査でマイコプラズマ種をはじめとする幾つかの病原体に対して陰性を示した。
細胞系
293T細胞を、10%ウシ胎孔血清(FBS、GIBCO)と1%ペニシリン-ストレプトマイシン(GIBCO)とを補充したダルベッコ変性イーグル培地(DMEM)で培養した。THP-1細胞を、10%FBS(GIBCO)と1%ペニシリン-ストレプトマイシン(GIBCO)とを補充したロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640培地で培養した。in vivo実験に使用した細胞は、当初ATCCから購入したマウス線維肉腫細胞系MCA-OVAであった。腫瘍細胞を、37℃で、5%CO2で、10%ウシ胎孔血清(FCS、Biosera社)と1%ペニシリン-ストレプトマイシンと1mM β-メルカプトエタノール(GIBCO)とを補充したRPMI 1640培地において単層で成長させた。集密に達する前に、腫瘍細胞を0.05%トリプシンによって回収し、洗浄し、注射のためにハンクス平衡塩類溶液(HBSS、GIBCO)に懸濁させた。細胞系は、PCRによる検査でマイコプラズマ種をはじめとする幾つかの病原体に対して陰性を示した。
【0194】
マウス
全ての動物を、キュリー研究所の動物委員会により承認されたプロトコールに従って使用し、バリア施設において病原体不在条件で維持した。C57BL/6JマウスをCharles River Laboratories社から購入した。マウスを、少なくとも3日間、収容施設に順応させた。全ての実験を、6～8週齢の間の雌マウスを使用して開始した。
全ての動物を、キュリー研究所の動物委員会により承認されたプロトコールに従って使用し、バリア施設において病原体不在条件で維持した。C57BL/6JマウスをCharles River Laboratories社から購入した。マウスを、少なくとも3日間、収容施設に順応させた。全ての実験を、6～8週齢の間の雌マウスを使用して開始した。
【0195】
精製前のcGAMP-VLP産生
7,500,000個の293T細胞を150cm2細胞培養フラスコに播種し、一晩インキュベートする。翌日、13μgのマウスcGAS(pVAX1-cGAS)、8.1μgのHIV-1 GAGPOL(psPAX2)、3.3μgのVSVG(pVAX1-VSVG-INDIANA2)、及び50μLのPEIpro(Ozyme社、reference POL115-010)を製造業者の使用説明書に従って用いて各フラスコにトランスフェクトする。トランスフェクションミックスをOpti-MEM(GIBCO)で作製した。トランスフェクションの翌朝、培地に、52mLの温VLP産生培地(10mM HEPES及び50μg/mLのゲンタマイシンを添加した、293T培養培地)を加え、細胞を37℃で、5%CO2で、翌日までインキュベートした。
7,500,000個の293T細胞を150cm2細胞培養フラスコに播種し、一晩インキュベートする。翌日、13μgのマウスcGAS(pVAX1-cGAS)、8.1μgのHIV-1 GAGPOL(psPAX2)、3.3μgのVSVG(pVAX1-VSVG-INDIANA2)、及び50μLのPEIpro(Ozyme社、reference POL115-010)を製造業者の使用説明書に従って用いて各フラスコにトランスフェクトする。トランスフェクションミックスをOpti-MEM(GIBCO)で作製した。トランスフェクションの翌朝、培地に、52mLの温VLP産生培地(10mM HEPES及び50μg/mLのゲンタマイシンを添加した、293T培養培地)を加え、細胞を37℃で、5%CO2で、翌日までインキュベートした。
【0196】
cGAMP-VLP回収及びスクロースクッションでの精製
cGAMP-VLP含有培地を細胞から回収し、10分間、200gで、4℃で遠心分離し、0.45μmで濾過した。39mLのcGAMP-VLP含有培地を、6本のUltra-Clearチューブ(Beckman Coulter社、ref 344058)内の6mLの冷20%滅菌濾過済みエンドトキシン不含スクロースの上に穏やかにかぶせ、1時間30分間、100,000gで、4℃で遠心分離した。培地及びスクロースを穏やかに吸引し、ペレットを冷PBSに再懸濁させ、1本のUltra-Clear 13.2mL(Beckman Coulter社、ref 344059)に移し、再び100,000gで、4℃で、1時間30分間、遠心分離した。PBSを穏やかに流出させ、ペレットを適切な量、典型的には320μLの冷PBSに再懸濁させた。
cGAMP-VLP含有培地を細胞から回収し、10分間、200gで、4℃で遠心分離し、0.45μmで濾過した。39mLのcGAMP-VLP含有培地を、6本のUltra-Clearチューブ(Beckman Coulter社、ref 344058)内の6mLの冷20%滅菌濾過済みエンドトキシン不含スクロースの上に穏やかにかぶせ、1時間30分間、100,000gで、4℃で遠心分離した。培地及びスクロースを穏やかに吸引し、ペレットを冷PBSに再懸濁させ、1本のUltra-Clear 13.2mL(Beckman Coulter社、ref 344059)に移し、再び100,000gで、4℃で、1時間30分間、遠心分離した。PBSを穏やかに流出させ、ペレットを適切な量、典型的には320μLの冷PBSに再懸濁させた。
【0197】
2'3' cGAMP ELISA
メタノールでのcGAMP抽出後、VLP中の2'3'-cGAMPの定量化のためにELISAキットを製造業者の使用説明書に従って使用した(Cayman社のキット)。
メタノールでのcGAMP抽出後、VLP中の2'3'-cGAMPの定量化のためにELISAキットを製造業者の使用説明書に従って使用した(Cayman社のキット)。
【0198】
THP-1活性化及びSIGLEC-1発現測定
50,000個のTHP-1細胞を丸底96ウェルプレート内の100μLの培地に播種し、100μLのcGAMP-VLP希釈物及び可溶性2'3'cGAMP希釈物で刺激した。細胞を18～24時間インキュベートし、抗ヒトSIGLEC-1(Miltenyi社、ref 130-098-645)で染色し、PFA 1%で固定し、BD FACS Verseサイトメーターを使用してデータを取得した。
50,000個のTHP-1細胞を丸底96ウェルプレート内の100μLの培地に播種し、100μLのcGAMP-VLP希釈物及び可溶性2'3'cGAMP希釈物で刺激した。細胞を18～24時間インキュベートし、抗ヒトSIGLEC-1(Miltenyi社、ref 130-098-645)で染色し、PFA 1%で固定し、BD FACS Verseサイトメーターを使用してデータを取得した。
【0199】
LEGENDplex(商標)アッセイ
初回s.c.注射の3時間後に収集した血清試料を、Mouse Inflammation LEGENDplex(商標)キット(BioLegend社)により製造業者の使用説明書に従って炎症性サイトカイン(IFN-α、IFN-β、TNF-α、IL-6、MCP-1及びIL-1β)について解析した。FACS Verseサイトメーター(BD Biosciences社)でデータを取得し、BioLegend社のLEGENDplex Data Analysis Softwareで解析した。標準曲線回帰を使用して各々の標的サイトカインの濃度を計算した。
初回s.c.注射の3時間後に収集した血清試料を、Mouse Inflammation LEGENDplex(商標)キット(BioLegend社)により製造業者の使用説明書に従って炎症性サイトカイン(IFN-α、IFN-β、TNF-α、IL-6、MCP-1及びIL-1β)について解析した。FACS Verseサイトメーター(BD Biosciences社)でデータを取得し、BioLegend社のLEGENDplex Data Analysis Softwareで解析した。標準曲線回帰を使用して各々の標的サイトカインの濃度を計算した。
【0200】
腫瘍成長
雌C57BL/6Jマウスの右下側腹部に100μLのPBS中の5×105個のMCA-OVA細胞を皮下接種した。マウスを罹病及び死亡について毎日モニターした。腫瘍を週に2回又は3回モニターした。潰瘍化が起こった場合には、又は腫瘍体積が2000mm3に達したら、マウスを人道的に安楽死させた。腫瘍サイズは、デジタルノギスを使用して測定し、腫瘍体積は、式(長さ×幅2)/2で計算した。腫瘍植込み後、Stimunity社により提供されているRandmiceソフトウェアを使用してマウスを処置群に無作為に割り当てた。原発性腫瘍の再燃の数週間後、無腫瘍生存マウスの反対側の注射していない側腹部に、腫瘍細胞を再チャレンジした。同齢のナイーブマウスを対照として使用した。
雌C57BL/6Jマウスの右下側腹部に100μLのPBS中の5×105個のMCA-OVA細胞を皮下接種した。マウスを罹病及び死亡について毎日モニターした。腫瘍を週に2回又は3回モニターした。潰瘍化が起こった場合には、又は腫瘍体積が2000mm3に達したら、マウスを人道的に安楽死させた。腫瘍サイズは、デジタルノギスを使用して測定し、腫瘍体積は、式(長さ×幅2)/2で計算した。腫瘍植込み後、Stimunity社により提供されているRandmiceソフトウェアを使用してマウスを処置群に無作為に割り当てた。原発性腫瘍の再燃の数週間後、無腫瘍生存マウスの反対側の注射していない側腹部に、腫瘍細胞を再チャレンジした。同齢のナイーブマウスを対照として使用した。
【0201】
In vivo免疫療法
STING全身(s.c.)療法は、50μLのPBS緩衝液中のcGAMP-VLP(1用量当たり50ngのcGAMP)を注射することからなった。腫瘍が35～50mm3の間まで成長したら、S.C.注射を開始した。U-100インスリン注射器又は等価物:0.33mm(29G)×12.7mm(0.5mL)に組成物を充填し、全ての気泡を除去した。マウスをイソフルランで麻酔した。皮膚に向けて傾斜を付けて、針を腫瘍の隣接エリアに浅く入れ、針を皮下で、それが腫瘍の裏側(1cm)に達するまで移動させた。組成物を腫瘍に近いこのエリアにゆっくりと注射した。次いで、逆流しないようにそっと針を抜いた。
STING全身(s.c.)療法は、50μLのPBS緩衝液中のcGAMP-VLP(1用量当たり50ngのcGAMP)を注射することからなった。腫瘍が35～50mm3の間まで成長したら、S.C.注射を開始した。U-100インスリン注射器又は等価物:0.33mm(29G)×12.7mm(0.5mL)に組成物を充填し、全ての気泡を除去した。マウスをイソフルランで麻酔した。皮膚に向けて傾斜を付けて、針を腫瘍の隣接エリアに浅く入れ、針を皮下で、それが腫瘍の裏側(1cm)に達するまで移動させた。組成物を腫瘍に近いこのエリアにゆっくりと注射した。次いで、逆流しないようにそっと針を抜いた。
【0202】
In vivo抗体Treg枯渇
Treg枯渇研究のために、MCA-OVA腫瘍担持マウスを、MCA-OVA黒色腫の植込み後6、9及び12日目に、腹腔内経路(i.p.)により、200μgの抗CTLA4モノクローナル抗体(抗mCTLA4-mIgG2a InvivoFit、Invivogen社)又は200μgのアイソタイプ対照抗体(マウスIgG2a、BioXcell社)で処置した。最終抗体注射の48時間後に腫瘍、脾臓、流入領域リンパ節及び血液試料を使用してFACSによりTreg枯渇を確認した。
Treg枯渇研究のために、MCA-OVA腫瘍担持マウスを、MCA-OVA黒色腫の植込み後6、9及び12日目に、腹腔内経路(i.p.)により、200μgの抗CTLA4モノクローナル抗体(抗mCTLA4-mIgG2a InvivoFit、Invivogen社)又は200μgのアイソタイプ対照抗体(マウスIgG2a、BioXcell社)で処置した。最終抗体注射の48時間後に腫瘍、脾臓、流入領域リンパ節及び血液試料を使用してFACSによりTreg枯渇を確認した。
【0203】
Ex vivo刺激アッセイ
T細胞応答を、cGAMP-VLP又はPBSの初回s.c.注射の10日後にIFN-γ ELISPOTによって評価した。マウスの後眼窩洞から採血し、赤血球を溶解することにより全血からPBMCを単離した。2×105個のPBMCを、ウェルごとに、1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含有するRPMI培地に播種し、一晩、陰性対照としての培地、10μg/mLのp15ペプチド(KSPWFTTL、配列番号2)、10μg/mLのOVA 257～264ペプチド(OVA-1)(SIINFEKL、配列番号3)、又は40μg/mLのOVA 265～280ペプチド(OVA-2)(TEWTSSNVMEERKIKV、配列番号4)で刺激した。マウスIFN-γ ELISPOT抗体(Diaclone社)を製造業者の使用説明書に従って使用してスポットを現像し、ImmunoSpotアナライザーを使用してスポットの数を数えた。
T細胞応答を、cGAMP-VLP又はPBSの初回s.c.注射の10日後にIFN-γ ELISPOTによって評価した。マウスの後眼窩洞から採血し、赤血球を溶解することにより全血からPBMCを単離した。2×105個のPBMCを、ウェルごとに、1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含有するRPMI培地に播種し、一晩、陰性対照としての培地、10μg/mLのp15ペプチド(KSPWFTTL、配列番号2)、10μg/mLのOVA 257～264ペプチド(OVA-1)(SIINFEKL、配列番号3)、又は40μg/mLのOVA 265～280ペプチド(OVA-2)(TEWTSSNVMEERKIKV、配列番号4)で刺激した。マウスIFN-γ ELISPOT抗体(Diaclone社)を製造業者の使用説明書に従って使用してスポットを現像し、ImmunoSpotアナライザーを使用してスポットの数を数えた。
【0204】
定量化及び統計解析
データをGraphPad Prism 8ソフトウェアで解析した。全てのデータは、平均±標準誤差(SEM)として提示される。複数の群及び平均腫瘍体積に関するデータを一元配置ANOVAとチューキー多重比較検定により解析した。生存曲線をログランク(マンテル-コックス)検定により解析した。p≦0.05を有意と見なした。
データをGraphPad Prism 8ソフトウェアで解析した。全てのデータは、平均±標準誤差(SEM)として提示される。複数の群及び平均腫瘍体積に関するデータを一元配置ANOVAとチューキー多重比較検定により解析した。生存曲線をログランク(マンテル-コックス)検定により解析した。p≦0.05を有意と見なした。
【0205】
結果
腫瘍におけるTreg枯渇を研究するために、及びcGAMP-VLPの皮下(s.c.)投与に対する免疫応答を最適化するために、T細胞及び腫瘍成長に対する抗CTLA4-mIgG2a(腫瘍微小環境(「TME」)内、即ち、腫瘍内及び周辺でTregを特異的に枯渇/阻害するが、このエリア外ではしない、又は言い換えると、Tregを全身的に枯渇させない、例えば、血液中又は非流入領域リンパ器官におけるTregを枯渇させない、アイソタイプ)の効果を調査した。
腫瘍におけるTreg枯渇を研究するために、及びcGAMP-VLPの皮下(s.c.)投与に対する免疫応答を最適化するために、T細胞及び腫瘍成長に対する抗CTLA4-mIgG2a(腫瘍微小環境(「TME」)内、即ち、腫瘍内及び周辺でTregを特異的に枯渇/阻害するが、このエリア外ではしない、又は言い換えると、Tregを全身的に枯渇させない、例えば、血液中又は非流入領域リンパ器官におけるTregを枯渇させない、アイソタイプ)の効果を調査した。
【0206】
MCA-OVA腫瘍モデルのスケジュール
単一MCA-OVA黒色腫側腹部腫瘍を担持しているマウスを、腫瘍生着から6日目に開始する、マウスIgG2a抗CTLA4(200μg/マウス)の腹腔内注射を伴う又は伴わない、12日にわたって3回注射するcGAMP-VLP(1用量当たり50ngのcGAMP)で、皮下的に処置した(図8)。
単一MCA-OVA黒色腫側腹部腫瘍を担持しているマウスを、腫瘍生着から6日目に開始する、マウスIgG2a抗CTLA4(200μg/マウス)の腹腔内注射を伴う又は伴わない、12日にわたって3回注射するcGAMP-VLP(1用量当たり50ngのcGAMP)で、皮下的に処置した(図8)。
【0207】
炎症性サイトカインの合成
cGAMP-VLPの初回注射の3時間後、炎症性サイトカインの産生を血清においてLEGENDplexにより測定した(図9)。cGAMP-VLPで処置したマウスからの血清は、PBS+/-抗CTLA4-mIgG2aを施した群と比較して、サイトカインレベルの有意な上昇(mIg2aアイソタイプ対照及び抗CTLA4-mIgG2群でのIL-6及びTNF-α;mIgG2aアイソタイプ対照群のみでのIFN-α及びMCP-1)を示した。
cGAMP-VLPの初回注射の3時間後、炎症性サイトカインの産生を血清においてLEGENDplexにより測定した(図9)。cGAMP-VLPで処置したマウスからの血清は、PBS+/-抗CTLA4-mIgG2aを施した群と比較して、サイトカインレベルの有意な上昇(mIg2aアイソタイプ対照及び抗CTLA4-mIgG2群でのIL-6及びTNF-α;mIgG2aアイソタイプ対照群のみでのIFN-α及びMCP-1)を示した。
【0208】
Treg枯渇
免疫調節抗体の活性への腫瘍内Treg細胞枯渇の寄与を実証する証拠に基づいて、本発明者らは、腫瘍が定着したマウスの血液、脾臓及び腫瘍におけるTreg細胞の頻度に対する抗CTLA4-mIgG2aの影響を比較した(図10及び図11)。腫瘍チャレンジ後6、9及び12日目における200μgの抗CTLA4-mIgG2aの投与は、腫瘍浸潤Treg(CD4+Foxp3+CD25+)細胞の頻度の低下、並びにCD8+ T細胞とCD4+FoxP3+ T細胞の比及びCD4+ FoxP3-とCD4+FoxP3+の比の上昇を生じさせる結果となった(図12)。しかし、抗CTLA4-mIgG2aは、血液(図13)及び脾臓(図14)においてTreg細胞を枯渇させることができなかった。それらの頻度は、未処置マウスのものと同等のままであった。
免疫調節抗体の活性への腫瘍内Treg細胞枯渇の寄与を実証する証拠に基づいて、本発明者らは、腫瘍が定着したマウスの血液、脾臓及び腫瘍におけるTreg細胞の頻度に対する抗CTLA4-mIgG2aの影響を比較した(図10及び図11)。腫瘍チャレンジ後6、9及び12日目における200μgの抗CTLA4-mIgG2aの投与は、腫瘍浸潤Treg(CD4+Foxp3+CD25+)細胞の頻度の低下、並びにCD8+ T細胞とCD4+FoxP3+ T細胞の比及びCD4+ FoxP3-とCD4+FoxP3+の比の上昇を生じさせる結果となった(図12)。しかし、抗CTLA4-mIgG2aは、血液(図13)及び脾臓(図14)においてTreg細胞を枯渇させることができなかった。それらの頻度は、未処置マウスのものと同等のままであった。
【0209】
CD8及びCD4 T細胞応答
cGAMP-VLPの3回目のs.c.注射の4日後、cGAMP-VLP及び/又は抗CTLA4-mIgG2aで処置したマウスの群は、PBS処置群と比較して、末梢血におけるOVA腫瘍抗原特異的T細胞応答の有意な増大を示した(図15)。cGAMP-VLP単独で又は抗CTLA4-mIgG2a単独で処置したマウスは、p15腫瘍抗原に対して有意な応答を誘導しなかった。その一方で、cGAMP-VLPを抗CTLA4-mIgG2aを組み合わせることで、p15に対する有意なレベルの血液T細胞応答が誘導された(図16)。
cGAMP-VLPの3回目のs.c.注射の4日後、cGAMP-VLP及び/又は抗CTLA4-mIgG2aで処置したマウスの群は、PBS処置群と比較して、末梢血におけるOVA腫瘍抗原特異的T細胞応答の有意な増大を示した(図15)。cGAMP-VLP単独で又は抗CTLA4-mIgG2a単独で処置したマウスは、p15腫瘍抗原に対して有意な応答を誘導しなかった。その一方で、cGAMP-VLPを抗CTLA4-mIgG2aを組み合わせることで、p15に対する有意なレベルの血液T細胞応答が誘導された(図16)。
【0210】
腫瘍成長モニタリング
次に、本発明者らは、腫瘍の処置における抗CTLA4-mIgG2aの可能性をモニターした。単独での抗CTLA4-mIgG2aは、対照群と比較して腫瘍成長の安定化又は減少を誘導することができた(図17)。s.c.経路により単独で注射したcGAMP-VLPは、短期間の間、腫瘍成長を安定させ、対照群比較して遅延させた。しかし、抗CTLA4-mIgG2aと組み合わせたcGAMP-VLPは、単独でのcGAMP-VLP又は単独での抗CTLA4-mIgG2aと比較して、cGAMP-VLPと抗CTLA4-mIgG2aの相乗的な作用機序を示す強力な抗腫瘍応答及び完全腫瘍退縮を誘導した(図18)。
次に、本発明者らは、腫瘍の処置における抗CTLA4-mIgG2aの可能性をモニターした。単独での抗CTLA4-mIgG2aは、対照群と比較して腫瘍成長の安定化又は減少を誘導することができた(図17)。s.c.経路により単独で注射したcGAMP-VLPは、短期間の間、腫瘍成長を安定させ、対照群比較して遅延させた。しかし、抗CTLA4-mIgG2aと組み合わせたcGAMP-VLPは、単独でのcGAMP-VLP又は単独での抗CTLA4-mIgG2aと比較して、cGAMP-VLPと抗CTLA4-mIgG2aの相乗的な作用機序を示す強力な抗腫瘍応答及び完全腫瘍退縮を誘導した(図18)。
【0211】
処置マウスの生存時間
cGAMP-VLPと抗CTLA4-mIgG2aからなる処置は、マウスの100%において定着MCA-OVA腫瘍を根絶し、その結果、90日を超える長期生存に至った(図19)。
cGAMP-VLPと抗CTLA4-mIgG2aからなる処置は、マウスの100%において定着MCA-OVA腫瘍を根絶し、その結果、90日を超える長期生存に至った(図19)。
【0212】
記憶免疫
完全レスポンダーマウスは、2回目のMCA-OVAチャレンジを拒絶することができる記憶T細胞応答を生じさせた(図20)。
完全レスポンダーマウスは、2回目のMCA-OVAチャレンジを拒絶することができる記憶T細胞応答を生じさせた(図20)。
【0213】
本発明者らは、抗CTLA4-mIgG2aが、cGAMP-VLPと組み合わせて使用したとき、腫瘍及びその微小環境からの(即ち、TMEからの)Tregの選択的枯渇に起因して相乗的抗腫瘍効果を生じさせる結果となると結論付けた。この組合せは、ロバストな全身性の腫瘍特異的T細胞応答並びに持続的な抗腫瘍及び記憶免疫を生じさせる。
【実施例3】
【0214】
材料及び方法
細胞系
293T細胞を、10%ウシ胎孔血清(FBS、GIBCO)と1%ペニシリン-ストレプトマイシン(GIBCO)とを補充したダルベッコ変性イーグル培地(DMEM)で培養した。THP-1細胞を、10%FBS(GIBCO)と1%ペニシリン-ストレプトマイシン(GIBCO)とを補充したロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640培地で培養した。in vivo実験に使用した細胞は、当初ATCCから購入したマウス線維肉腫細胞系MCA-OVAであった。腫瘍細胞を、37℃で、5%CO2で、10%ウシ胎孔血清(FCS、Biosera社)と1%ペニシリン-ストレプトマイシンと1mM β-メルカプトエタノール(GIBCO)とを補充したRPMI 1640培地において単層で成長させた。集密に達する前に、腫瘍細胞を0.05%トリプシンによって回収し、洗浄し、注射のためにハンクス平衡塩類溶液(HBSS、GIBCO)に懸濁させた。細胞系は、PCRによる検査でマイコプラズマ種をはじめとする幾つかの病原体に対して陰性を示した。
細胞系
293T細胞を、10%ウシ胎孔血清(FBS、GIBCO)と1%ペニシリン-ストレプトマイシン(GIBCO)とを補充したダルベッコ変性イーグル培地(DMEM)で培養した。THP-1細胞を、10%FBS(GIBCO)と1%ペニシリン-ストレプトマイシン(GIBCO)とを補充したロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640培地で培養した。in vivo実験に使用した細胞は、当初ATCCから購入したマウス線維肉腫細胞系MCA-OVAであった。腫瘍細胞を、37℃で、5%CO2で、10%ウシ胎孔血清(FCS、Biosera社)と1%ペニシリン-ストレプトマイシンと1mM β-メルカプトエタノール(GIBCO)とを補充したRPMI 1640培地において単層で成長させた。集密に達する前に、腫瘍細胞を0.05%トリプシンによって回収し、洗浄し、注射のためにハンクス平衡塩類溶液(HBSS、GIBCO)に懸濁させた。細胞系は、PCRによる検査でマイコプラズマ種をはじめとする幾つかの病原体に対して陰性を示した。
【0215】
マウス
全ての動物を、キュリー研究所の動物委員会により承認されたプロトコールに従って使用し、バリア施設において病原体不在条件で維持した。C57BL/6JマウスをCharles River Laboratories社から購入した。マウスを、少なくとも3日間、収容施設に順応させた。全ての実験を、6～8週齢の間の雌マウスを使用して開始した。
全ての動物を、キュリー研究所の動物委員会により承認されたプロトコールに従って使用し、バリア施設において病原体不在条件で維持した。C57BL/6JマウスをCharles River Laboratories社から購入した。マウスを、少なくとも3日間、収容施設に順応させた。全ての実験を、6～8週齢の間の雌マウスを使用して開始した。
【0216】
精製前のcGAMP-VLP産生
7,500,000個の293T細胞を150cm2細胞培養フラスコに播種し、一晩インキュベートする。翌日、13μgのマウスcGAS(pVAX1-cGAS)、8.1μgのHIV-1 GAGPOL(psPAX2)、3.3μgのVSVG(pVAX1-VSVG-INDIANA2)、及び50μLのPEIpro(Ozyme社、reference POL115-010)を製造業者の使用説明書に従って用いて各フラスコにトランスフェクトする。トランスフェクションミックスをOpti-MEM(GIBCO)で作製した。トランスフェクションの翌朝、培地に、52mLの温VLP産生培地(10mM HEPES及び50μg/mLのゲンタマイシンを添加した、293T培養培地)を加え、細胞を37℃で、5%CO2で、翌日までインキュベートした。
7,500,000個の293T細胞を150cm2細胞培養フラスコに播種し、一晩インキュベートする。翌日、13μgのマウスcGAS(pVAX1-cGAS)、8.1μgのHIV-1 GAGPOL(psPAX2)、3.3μgのVSVG(pVAX1-VSVG-INDIANA2)、及び50μLのPEIpro(Ozyme社、reference POL115-010)を製造業者の使用説明書に従って用いて各フラスコにトランスフェクトする。トランスフェクションミックスをOpti-MEM(GIBCO)で作製した。トランスフェクションの翌朝、培地に、52mLの温VLP産生培地(10mM HEPES及び50μg/mLのゲンタマイシンを添加した、293T培養培地)を加え、細胞を37℃で、5%CO2で、翌日までインキュベートした。
【0217】
cGAMP-VLP回収及びスクロースクッションでの精製
cGAMP-VLP含有培地を細胞から回収し、10分間、200g、4℃で遠心分離し、0.45μmで濾過した。39mLのcGAMP-VLP含有培地を、6本のUltra-Clearチューブ(Beckman Coulter社、ref 344058)内の6mLの冷20%滅菌濾過済みエンドトキシン不含スクロースの上に穏やかにかぶせ、1時間30分間、100,000gで、4℃で遠心分離した。培地及びスクロースを穏やかに吸引し、ペレットを冷PBSに再懸濁させ、1本のUltra-Clear 13.2mL(Beckman Coulter社、ref 344059)に移し、再び100,000gで、4℃で、1時間30分間、遠心分離した。PBSを穏やかに流出させ、ペレットを適切な量、典型的には320μLの冷PBSに再懸濁させた。
cGAMP-VLP含有培地を細胞から回収し、10分間、200g、4℃で遠心分離し、0.45μmで濾過した。39mLのcGAMP-VLP含有培地を、6本のUltra-Clearチューブ(Beckman Coulter社、ref 344058)内の6mLの冷20%滅菌濾過済みエンドトキシン不含スクロースの上に穏やかにかぶせ、1時間30分間、100,000gで、4℃で遠心分離した。培地及びスクロースを穏やかに吸引し、ペレットを冷PBSに再懸濁させ、1本のUltra-Clear 13.2mL(Beckman Coulter社、ref 344059)に移し、再び100,000gで、4℃で、1時間30分間、遠心分離した。PBSを穏やかに流出させ、ペレットを適切な量、典型的には320μLの冷PBSに再懸濁させた。
【0218】
THP-1活性化及びSIGLEC-1発現測定
50,000個のTHP-1細胞を丸底96ウェルプレート内の100μLの培地に播種し、100μLのcGAMP-VLP希釈物及び可溶性2'3'cGAMP希釈物で刺激した。細胞を18～24時間インキュベートし、抗ヒトSIGLEC-1(Miltenyi社、ref 130-098-645)で染色し、PFA 1%で固定し、BD FACS Verseサイトメーターを使用してデータを取得した。
50,000個のTHP-1細胞を丸底96ウェルプレート内の100μLの培地に播種し、100μLのcGAMP-VLP希釈物及び可溶性2'3'cGAMP希釈物で刺激した。細胞を18～24時間インキュベートし、抗ヒトSIGLEC-1(Miltenyi社、ref 130-098-645)で染色し、PFA 1%で固定し、BD FACS Verseサイトメーターを使用してデータを取得した。
【0219】
腫瘍成長
雌C57BL/6Jマウスの右下側腹部に100μLのPBS中の5×105個のMCA-OVA細胞を皮下接種した。マウスを体重減少、罹病及び死亡について毎日モニターした。腫瘍を週に2回又は3回モニターした。潰瘍化が起こった場合には、又は腫瘍体積が2000mm3に達したら、マウスを人道的に安楽死させた。腫瘍サイズは、デジタルノギスを使用して測定し、腫瘍体積は、式(長さ×幅2)/2で計算した。腫瘍植込み後、Stimunity社により提供されているRandmiceソフトウェアを使用してマウスを処置群に無作為に割り当てた。
雌C57BL/6Jマウスの右下側腹部に100μLのPBS中の5×105個のMCA-OVA細胞を皮下接種した。マウスを体重減少、罹病及び死亡について毎日モニターした。腫瘍を週に2回又は3回モニターした。潰瘍化が起こった場合には、又は腫瘍体積が2000mm3に達したら、マウスを人道的に安楽死させた。腫瘍サイズは、デジタルノギスを使用して測定し、腫瘍体積は、式(長さ×幅2)/2で計算した。腫瘍植込み後、Stimunity社により提供されているRandmiceソフトウェアを使用してマウスを処置群に無作為に割り当てた。
【0220】
In vivo免疫療法
STING全身(皮下、s.c.)療法は、50μLのPBS緩衝液中のcGAMP-VLP(50ng cGAMP)を注射することからなった。腫瘍が35～50mm3の間まで成長したら、S.C.注射を開始した。U-100インスリン注射器又は等価物:0.33mm(29G)×12.7mm(0.5mL)に組成物を充填し、全ての気泡を除去した。マウスをイソフルランで麻酔した。皮膚に向けて傾斜を付けて、針を腫瘍の隣接エリアに浅く入れ、針を皮下で、それが腫瘍の近く(1cm)に達するまで移動させた。組成物を腫瘍に近いこのエリアにゆっくりと注射した。次いで、逆流しないようにそっと針を抜いた。
STING全身(皮下、s.c.)療法は、50μLのPBS緩衝液中のcGAMP-VLP(50ng cGAMP)を注射することからなった。腫瘍が35～50mm3の間まで成長したら、S.C.注射を開始した。U-100インスリン注射器又は等価物:0.33mm(29G)×12.7mm(0.5mL)に組成物を充填し、全ての気泡を除去した。マウスをイソフルランで麻酔した。皮膚に向けて傾斜を付けて、針を腫瘍の隣接エリアに浅く入れ、針を皮下で、それが腫瘍の近く(1cm)に達するまで移動させた。組成物を腫瘍に近いこのエリアにゆっくりと注射した。次いで、逆流しないようにそっと針を抜いた。
【0221】
In vivo抗体Treg枯渇
Treg枯渇研究のために、MCA-OVA腫瘍担持マウスを、MCA-OVA黒色腫の植込み後6、9及び12日目に、腹腔内経路(i.p.)により、150μgの抗CD25 IgG2a(KLC)モノクローナル抗体(mIgG2a KLC抗mCD25、Invivogen社)又は150μgのアイソタイプ対照抗体(マウス抗b-Gal-mIgG2a、Invivogen社)で処置した。最終抗体注射の48時間後に腫瘍及び脾臓試料を使用してFACSによりTreg枯渇を確認した。
Treg枯渇研究のために、MCA-OVA腫瘍担持マウスを、MCA-OVA黒色腫の植込み後6、9及び12日目に、腹腔内経路(i.p.)により、150μgの抗CD25 IgG2a(KLC)モノクローナル抗体(mIgG2a KLC抗mCD25、Invivogen社)又は150μgのアイソタイプ対照抗体(マウス抗b-Gal-mIgG2a、Invivogen社)で処置した。最終抗体注射の48時間後に腫瘍及び脾臓試料を使用してFACSによりTreg枯渇を確認した。
【0222】
Ex vivo刺激アッセイ
T細胞応答を、cGAMP-VLP又はPBSの初回s.c.注射の10日後にIFN-γ ELISPOTによって評価した。マウスの後眼窩洞から採血し、赤血球を溶解することにより全血からPBMCを単離した。2×105個のPBMCを、ウェルごとに、1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含有するRPMI培地に播種し、一晩、陰性対照としての培地、10μg/mLのOVA 257～264ペプチド(OVA-1)(SIINFEKL、配列番号3)、又は40μg/mLのOVA 265～280ペプチド(OVA-2)(TEWTSSNVMEERKIKV、配列番号4)で刺激した。マウスIFN-γ ELISPOT抗体(Diaclone社)を製造業者の使用説明書に従って使用してスポットを現像し、ImmunoSpotアナライザーを使用してスポットの数を数えた。
T細胞応答を、cGAMP-VLP又はPBSの初回s.c.注射の10日後にIFN-γ ELISPOTによって評価した。マウスの後眼窩洞から採血し、赤血球を溶解することにより全血からPBMCを単離した。2×105個のPBMCを、ウェルごとに、1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含有するRPMI培地に播種し、一晩、陰性対照としての培地、10μg/mLのOVA 257～264ペプチド(OVA-1)(SIINFEKL、配列番号3)、又は40μg/mLのOVA 265～280ペプチド(OVA-2)(TEWTSSNVMEERKIKV、配列番号4)で刺激した。マウスIFN-γ ELISPOT抗体(Diaclone社)を製造業者の使用説明書に従って使用してスポットを現像し、ImmunoSpotアナライザーを使用してスポットの数を数えた。
【0223】
定量化及び統計解析
データをGraphPad Prism 8ソフトウェアで解析した。全てのデータは、平均±標準誤差(SEM)として提示される。複数の群及び平均腫瘍体積に関するデータを一元配置ANOVAとチューキー多重比較検定により解析した。生存曲線をログランク(マンテル-コックス)検定により解析した。p≦0.05を有意と見なした。
データをGraphPad Prism 8ソフトウェアで解析した。全てのデータは、平均±標準誤差(SEM)として提示される。複数の群及び平均腫瘍体積に関するデータを一元配置ANOVAとチューキー多重比較検定により解析した。生存曲線をログランク(マンテル-コックス)検定により解析した。p≦0.05を有意と見なした。
【0224】
結果
腫瘍におけるTreg枯渇を研究するために、及びcGAMP-VLPの皮下(s.c.)投与に対する免疫応答を最適化するために、T細胞及び腫瘍成長に対する抗CD25-mIgG2a(腫瘍微小環境(「TME」)内、即ち、腫瘍内及び周辺でTregを特異的に枯渇/阻害するが、このエリア外ではしない、又は言い換えると、Tregを全身的に枯渇させない、例えば、血液中又は非流入領域リンパ器官におけるTregを枯渇させない、アイソタイプ)の効果を調査した。
腫瘍におけるTreg枯渇を研究するために、及びcGAMP-VLPの皮下(s.c.)投与に対する免疫応答を最適化するために、T細胞及び腫瘍成長に対する抗CD25-mIgG2a(腫瘍微小環境(「TME」)内、即ち、腫瘍内及び周辺でTregを特異的に枯渇/阻害するが、このエリア外ではしない、又は言い換えると、Tregを全身的に枯渇させない、例えば、血液中又は非流入領域リンパ器官におけるTregを枯渇させない、アイソタイプ)の効果を調査した。
【0225】
MCA-OVA腫瘍モデルのスケジュール
単一MCA-OVA黒色腫側腹部腫瘍を担持しているマウスを、腫瘍生着から6日目に開始する、マウスIgG2a抗CD25(150μg/マウス)の腹腔内注射を伴う又は伴わない、12日にわたって3回注射するcGAMP-VLP(1用量当たり50ngのcGAMP)で、皮下的に処置した(図21)。
単一MCA-OVA黒色腫側腹部腫瘍を担持しているマウスを、腫瘍生着から6日目に開始する、マウスIgG2a抗CD25(150μg/マウス)の腹腔内注射を伴う又は伴わない、12日にわたって3回注射するcGAMP-VLP(1用量当たり50ngのcGAMP)で、皮下的に処置した(図21)。
【0226】
Treg枯渇
免疫調節抗体の活性への腫瘍内Treg細胞枯渇の寄与を実証する証拠に基づいて、本発明者らは、腫瘍が定着したマウスの脾臓及び腫瘍におけるTreg細胞の頻度に対する抗CD25-mIgG2aの影響を比較した(図22)。腫瘍チャレンジ後6、9及び12日目における150μgの抗CD25-mIgG2aの投与は、腫瘍浸潤FOXP3+細胞の頻度(全TCRb+CD4+細胞の中で)の統計的に有意な低下を生じさせる結果となった。しかし、抗CD25-mIgG2aは、脾臓においてFOXP3+細胞をわずかに且つ非有意に枯渇させた。それらの頻度は、未処置マウスのものと同等のままであった。
免疫調節抗体の活性への腫瘍内Treg細胞枯渇の寄与を実証する証拠に基づいて、本発明者らは、腫瘍が定着したマウスの脾臓及び腫瘍におけるTreg細胞の頻度に対する抗CD25-mIgG2aの影響を比較した(図22)。腫瘍チャレンジ後6、9及び12日目における150μgの抗CD25-mIgG2aの投与は、腫瘍浸潤FOXP3+細胞の頻度(全TCRb+CD4+細胞の中で)の統計的に有意な低下を生じさせる結果となった。しかし、抗CD25-mIgG2aは、脾臓においてFOXP3+細胞をわずかに且つ非有意に枯渇させた。それらの頻度は、未処置マウスのものと同等のままであった。
【0227】
CD8及びCD4 T細胞応答
cGAMP-VLPの3回目のs.c.注射の4日後、cGAMP-VLPで処置したマウスの群は、PBS処置群と比較して、末梢血におけるOVA腫瘍抗原特異的T細胞応答の有意な増大を示した(図23)。抗CD25-mIgG2a単独で処置したマウスは、OVA 265～280腫瘍抗原に対して有意な応答を誘導しなかった。その一方で、cGAMP-VLPを抗CD25-mIgG2aを組み合わせることで、OVAペプチドに対する有意なレベルの血液CD4 T細胞応答が誘導された。
cGAMP-VLPの3回目のs.c.注射の4日後、cGAMP-VLPで処置したマウスの群は、PBS処置群と比較して、末梢血におけるOVA腫瘍抗原特異的T細胞応答の有意な増大を示した(図23)。抗CD25-mIgG2a単独で処置したマウスは、OVA 265～280腫瘍抗原に対して有意な応答を誘導しなかった。その一方で、cGAMP-VLPを抗CD25-mIgG2aを組み合わせることで、OVAペプチドに対する有意なレベルの血液CD4 T細胞応答が誘導された。
【0228】
腫瘍成長モニタリング
次に、本発明者らは、腫瘍の処置における抗CD25-mIgG2aの可能性をモニターした。単独での抗CD25-mIgG2aは、対照群と比較して腫瘍成長の安定化又は減少を誘導することができた(図24)。s.c.経路により単独で注射したcGAMP-VLPは、短期間の間、腫瘍成長を安定させ、対照群比較して遅延させた。しかし、抗CD25-mIgG2aと組み合わせたcGAMP-VLPは、PBS対照群と比較して、cGAMP-VLPと抗CD25-mIgG2aの相乗的な作用機序を示す有意な抗腫瘍応答及び腫瘍成長の遅延を誘導した。抗CD25-mIgG2aと組み合わせたcGAMP-VLPからなる処置は、マウスにおける定着MCA-OVA腫瘍を減少させ(declined)、その結果、対照群と比較して10日を超えるマウス死亡の遅延に至った。
次に、本発明者らは、腫瘍の処置における抗CD25-mIgG2aの可能性をモニターした。単独での抗CD25-mIgG2aは、対照群と比較して腫瘍成長の安定化又は減少を誘導することができた(図24)。s.c.経路により単独で注射したcGAMP-VLPは、短期間の間、腫瘍成長を安定させ、対照群比較して遅延させた。しかし、抗CD25-mIgG2aと組み合わせたcGAMP-VLPは、PBS対照群と比較して、cGAMP-VLPと抗CD25-mIgG2aの相乗的な作用機序を示す有意な抗腫瘍応答及び腫瘍成長の遅延を誘導した。抗CD25-mIgG2aと組み合わせたcGAMP-VLPからなる処置は、マウスにおける定着MCA-OVA腫瘍を減少させ(declined)、その結果、対照群と比較して10日を超えるマウス死亡の遅延に至った。
【0229】
本発明者らは、抗CD25-mIgG2aが、cGAMP-VLPと組み合わせて使用したとき、腫瘍及びその微小環境からの(即ち、TMEからの)Tregの選択的枯渇/阻害に起因して相乗的抗腫瘍効果を生じさせる結果となると結論付けた。この組合せは、ロバストな全身性の腫瘍特異的T細胞応答及び抗腫瘍を生じさせる。
【符号の説明】
【0230】
5-FU 5-フルオロウラシル
5-FUdR 5-フルオロデオキシウリジン
Ace-DEX アセチル化デキストラン
ADCC 抗体依存性細胞傷害
AMA-1 頂端膜抗原-1
APC 抗原提示細胞
ATP アデノシン三リン酸
BCRABL 切断点クラスター領域Abelson
BHK ベビーハムスター腎臓
BIV ウシ免疫不全ウイルス
BLV ウシ白血病ウイルス
BNBC 6-ブロモ-N-(ナフタレン-1-イル)ベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-カルボキサミド
c-di-AMP サイクリック二量体アデノシン一リン酸
c-di-GMP サイクリック二量体グアノシン一リン酸
CA シタラビン
CDN サイクリックジヌクレオチド
CEA 癌胎児性抗原
cGAMP サイクリックグアノシン一リン酸-アデノシン一リン酸
cGAS サイクリックGMP-AMPシンターゼ
CHO チャイニーズハムスター卵巣
CMA 10-カルボキシメチル-9-アクリダノン
CTL 細胞傷害性T細胞
CTLA-4 細胞傷害性Tリンパ球抗原-4
CR 完全レスポンダーマウス
CSF-1R コロニー刺激因子受容体
CSP スポロゾイト周囲タンパク質
DC 樹状細胞
DDR ジスコイジンドメイン受容体
DMXAA 5,6-ジメチル-キサンテノン酢酸又は5,6-ジメチルキサンテノン-4-酢酸又はジメチルオキソキサンテニル酢酸
diABZI ジアミドベンゾイミダゾール又はジアミノベンゾイミダゾール
DMEM ダルベッコ変性イーグル培地
DSDP ジスピロジケトピペラジン
EAE 実験的自己免疫性脳脊髄炎
ENPP1 エクトヌクレオチドピロホスファターゼホスホジエステラーゼ1
ER 小胞体
FAA フラボン-8-酢酸又はフラボン酢酸
FBS ウシ胎孔血清
FcyR Fcy受容体
FeLV ネコ白血病ウイルス
Foxp3 フォークヘッドボックスP3
FIV ネコ免疫不全ウイルス
GITR グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体
GFR 増殖因子
GTP グアノシン三リン酸
IBD 炎症性腸疾患
ICB 免疫チェックポイント遮断
HA ヒアルロン酸
HBSS ハンクス平衡塩類溶液
HEK ヒト胎児腎臓
HIV ヒト免疫不全ウイルス
HTLV ヒトTリンパ球向性ウイルス
HPV ヒトパピローマウイルス
i.d. 皮内
i.m. 筋肉内
i.p. 腹腔内
i.v. 静脈内
IFN インターフェロン
IRF3 インターフェロン制御因子3
IP-10 インターフェロン-γ誘導性タンパク質10
LAG-3 リンパ球活性化遺伝子-3
LBD リガンド結合ドメイン
LSA 肝臓ステージ抗原
LPEI 直鎖状ポリエチレンイミン
MBSA 大環状分子架橋STINGアゴニスト
MLV マウス白血病ウイルス
MMLV モロニーマウス白血病ウイルス
MSA-2 ベンゾチオフェンオキソブタン酸
MTX メトトレキサート
NDV ニューカッスル病ウイルス
NFkB 核因子-κB
NK ナチュラルキラー
nTreg 天然に存在するTreg
OVA-1 OVA 257～264ペプチド
OVA-2 OVA 265～280ペプチド
PBAE ポリ(ベータ-アミノエステル)
PD-1 プログラム死1
PD-L1 プログラム死リガンド1
PDGF 血小板由来増殖因子
PDGFR 血小板由来増殖因子受容体
PE シュードモナスエンドトキシンA
Pf Exp1 Pf搬出タンパク質1
PEG-DBP ポリ(エチレングリコール)-block-[(2-ジエチルアミノエチルメタクリレート)-co-(ブチルメタクリレート)-co-(ピリジルジスルフィドエチルメタクリレート)]
RPMI ロズウェルパーク記念研究所
RSV ラウス肉腫ウイルス
s.c. 皮下
SALSA Pf抗原2スポロゾイト及び肝臓ステージ抗原
SAP2 分泌アスパルチルプロテイナーゼ2
SCF 幹細胞因子
SIV サル免疫不全ウイルス
SSP2 スポロゾイト表面タンパク質2
STARP スポロゾイトスレオニン及びアスパラギンリッチタンパク質
STING インターフェロン遺伝子刺激因子
Tconv 従来型T細胞
TBK1 TANK結合キナーゼ1
TIGIT T細胞Ig及びITIMドメイン
TIM-3 T細胞免疫グロブリンムチン3
TME 腫瘍微小環境
Teff エフェクターT細胞
Treg 制御性T細胞
VLP ウイルス様粒子
VSV 水疱性口内炎ウイルス
5-FUdR 5-フルオロデオキシウリジン
Ace-DEX アセチル化デキストラン
ADCC 抗体依存性細胞傷害
AMA-1 頂端膜抗原-1
APC 抗原提示細胞
ATP アデノシン三リン酸
BCRABL 切断点クラスター領域Abelson
BHK ベビーハムスター腎臓
BIV ウシ免疫不全ウイルス
BLV ウシ白血病ウイルス
BNBC 6-ブロモ-N-(ナフタレン-1-イル)ベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-カルボキサミド
c-di-AMP サイクリック二量体アデノシン一リン酸
c-di-GMP サイクリック二量体グアノシン一リン酸
CA シタラビン
CDN サイクリックジヌクレオチド
CEA 癌胎児性抗原
cGAMP サイクリックグアノシン一リン酸-アデノシン一リン酸
cGAS サイクリックGMP-AMPシンターゼ
CHO チャイニーズハムスター卵巣
CMA 10-カルボキシメチル-9-アクリダノン
CTL 細胞傷害性T細胞
CTLA-4 細胞傷害性Tリンパ球抗原-4
CR 完全レスポンダーマウス
CSF-1R コロニー刺激因子受容体
CSP スポロゾイト周囲タンパク質
DC 樹状細胞
DDR ジスコイジンドメイン受容体
DMXAA 5,6-ジメチル-キサンテノン酢酸又は5,6-ジメチルキサンテノン-4-酢酸又はジメチルオキソキサンテニル酢酸
diABZI ジアミドベンゾイミダゾール又はジアミノベンゾイミダゾール
DMEM ダルベッコ変性イーグル培地
DSDP ジスピロジケトピペラジン
EAE 実験的自己免疫性脳脊髄炎
ENPP1 エクトヌクレオチドピロホスファターゼホスホジエステラーゼ1
ER 小胞体
FAA フラボン-8-酢酸又はフラボン酢酸
FBS ウシ胎孔血清
FcyR Fcy受容体
FeLV ネコ白血病ウイルス
Foxp3 フォークヘッドボックスP3
FIV ネコ免疫不全ウイルス
GITR グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体
GFR 増殖因子
GTP グアノシン三リン酸
IBD 炎症性腸疾患
ICB 免疫チェックポイント遮断
HA ヒアルロン酸
HBSS ハンクス平衡塩類溶液
HEK ヒト胎児腎臓
HIV ヒト免疫不全ウイルス
HTLV ヒトTリンパ球向性ウイルス
HPV ヒトパピローマウイルス
i.d. 皮内
i.m. 筋肉内
i.p. 腹腔内
i.v. 静脈内
IFN インターフェロン
IRF3 インターフェロン制御因子3
IP-10 インターフェロン-γ誘導性タンパク質10
LAG-3 リンパ球活性化遺伝子-3
LBD リガンド結合ドメイン
LSA 肝臓ステージ抗原
LPEI 直鎖状ポリエチレンイミン
MBSA 大環状分子架橋STINGアゴニスト
MLV マウス白血病ウイルス
MMLV モロニーマウス白血病ウイルス
MSA-2 ベンゾチオフェンオキソブタン酸
MTX メトトレキサート
NDV ニューカッスル病ウイルス
NFkB 核因子-κB
NK ナチュラルキラー
nTreg 天然に存在するTreg
OVA-1 OVA 257～264ペプチド
OVA-2 OVA 265～280ペプチド
PBAE ポリ(ベータ-アミノエステル)
PD-1 プログラム死1
PD-L1 プログラム死リガンド1
PDGF 血小板由来増殖因子
PDGFR 血小板由来増殖因子受容体
PE シュードモナスエンドトキシンA
Pf Exp1 Pf搬出タンパク質1
PEG-DBP ポリ(エチレングリコール)-block-[(2-ジエチルアミノエチルメタクリレート)-co-(ブチルメタクリレート)-co-(ピリジルジスルフィドエチルメタクリレート)]
RPMI ロズウェルパーク記念研究所
RSV ラウス肉腫ウイルス
s.c. 皮下
SALSA Pf抗原2スポロゾイト及び肝臓ステージ抗原
SAP2 分泌アスパルチルプロテイナーゼ2
SCF 幹細胞因子
SIV サル免疫不全ウイルス
SSP2 スポロゾイト表面タンパク質2
STARP スポロゾイトスレオニン及びアスパラギンリッチタンパク質
STING インターフェロン遺伝子刺激因子
Tconv 従来型T細胞
TBK1 TANK結合キナーゼ1
TIGIT T細胞Ig及びITIMドメイン
TIM-3 T細胞免疫グロブリンムチン3
TME 腫瘍微小環境
Teff エフェクターT細胞
Treg 制御性T細胞
VLP ウイルス様粒子
VSV 水疱性口内炎ウイルス
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【配列表】
【国際調査報告】