特表 2024-514790 組換え凝固第ＶＩＩＩ因子及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-03

(54)【発明の名称】組換え凝固第ＶＩＩＩ因子及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/755 20060101AFI20240327BHJP

   C12N 15/90 20060101ALI20240327BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240327BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240327BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240327BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240327BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240327BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240327BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240327BHJP

   A61K 38/37 20060101ALI20240327BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20240327BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALN20240327BHJP

【ＦＩ】

C07K14/755

C12N15/90 Z ZNA

C12N15/867 Z

C12N15/12

C12N7/01

C12N5/10

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

A61K38/37

A61P7/04

C12N5/0789

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023560862

(86)(22)【出願日】2022-04-08

(85)【翻訳文提出日】2023-11-29

(86)【国際出願番号】 CN2022085853

(87)【国際公開番号】W WO2022228087

(87)【国際公開日】2022-11-03

(31)【優先権主張番号】202110455812.5

(32)【優先日】2021-04-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202110762308.X

(32)【優先日】2021-07-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520319705

【氏名又は名称】ベイジン・メイカン・ジーノ－イミューン・バイオテクノロジー・カンパニー・リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＢＥＩＪＩＮＧ ＭＥＩＫＡＮＧ ＧＥＮＯ－ＩＭＭＵＮＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ Ｂ１０４， １ｓｔ Ｆｌｏｏｒ， Ｎｏ． ５，Ｋａｉｔｕｏ Ｒｏａｄ， Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８５， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チャン，ルン－ジー

(72)【発明者】

【氏名】ゴン，ジエ

(72)【発明者】

【氏名】ジャン，ルイ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084CA53

4C084DC15

4C084MA66

4C084NA06

4C084NA14

4C084ZA531

4C084ZA532

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045CA42

4H045DA66

4H045EA24

4H045FA74

(57)【要約】

組換え凝固第ＶＩＩＩ因子及びその応用用途が提供される。組換え凝固第ＶＩＩＩ因子は、配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の８０％より多くを含む。Ｂドメインの遺伝子改変により、組換え凝固第ＶＩＩＩ因子は、糖鎖付加部位に富み、良好な凝固機能を有し、細胞外に容易に分泌され、トロンビン（ＥＩＩａ）などの補因子と容易に相互作用する。さらに、組換え凝固第ＶＩＩＩ因子は、抗体応答を誘導する弱い能力を有し、治療効果を効果的に実現することができ、免疫拒絶のリスクを低減させることができ、治療コストを低下させることができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の８０％より多くを含む、組換え凝固第ＶＩＩＩ因子。

【請求項2】

配列番号８又は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＢドメインを含有する、請求項１に記載の組換え凝固第ＶＩＩＩ因子。

【請求項3】

配列番号３又は配列番号４に示される核酸配列を含む、請求項１又は２に記載の組換え凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする、遺伝子。

【請求項4】

配列番号５又は配列番号６に示される核酸配列を含む、請求項３に記載の組換え凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子。

【請求項5】

請求項３又は４に記載の組換え凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターであって、
好ましくは、請求項３又は４に記載の組換え凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子を含有するウイルスベクター又はプラスミドベクターを含み、
好ましくは、ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターｐＥＧＷＩを含み、
好ましくは、レンチウイルスベクターｐＥＧＷＩの５’スプライスドナー部位ＧＴが、ＣＡに突然変異しており、
好ましくは、レンチウイルスベクターｐＥＧＷＩのＵ３領域におけるエンハンサーが欠失しており、
好ましくは、レンチウイルスベクターｐＥＧＷＩのＵ３領域が、インスレーターを含有する、組換え発現ベクター。

【請求項6】

請求項３又は４に記載の組換え凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子を含有する組換えレンチウイルス。

【請求項7】

請求項３又は４に記載の組換え凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子を含有する組換え細胞。

【請求項8】

組換え細胞のゲノムが、請求項３又は４に記載の組換え凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子と融合しており、
好ましくは、組換え細胞が、請求項５に記載の組換え発現ベクターを含有する、請求項７に記載の組換え細胞。

【請求項9】

請求項７又は８に記載の組換え細胞を調製するための方法であって、
請求項３若しくは４に記載の組換え凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子、請求項５に記載の組換え発現ベクター又は請求項６に記載の組換えレンチウイルスを、宿主細胞に導入して、組換え細胞を得るステップ
を含み、
好ましくは、導入が、電気的形質導入、ウイルスベクター系、非ウイルスベクター系又は直接遺伝子注入のうちのいずれか１つを含む方法により実施され、
好ましくは、宿主細胞が造血幹細胞を含む、方法。

【請求項10】

請求項１若しくは２に記載の組換え凝固第ＶＩＩＩ因子、請求項３若しくは４に記載の組換え凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子、請求項５に記載の組換え発現ベクター、請求項６に記載の組換えレンチウイルス又は請求項７若しくは８に記載の組換え細胞のうちのいずれか１つ又はこれらの組合せを含む医薬組成物であって、
好ましくは、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤のうちのいずれか１つ又はこれらのうちの少なくとも２つの組合せをさらに含む、医薬組成物。

【請求項11】

請求項１若しくは２に記載の組換え凝固第ＶＩＩＩ因子、請求項３若しくは４に記載の組換え凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子、請求項５に記載の組換え発現ベクター、請求項６に記載の組換えレンチウイルス、請求項７若しくは８に記載の組換え細胞又は請求項１０に記載の医薬組成物の、血友病を治療するための医薬の調製のための使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０２１年４月２６日出願の中国特許出願第ＣＮ２０２１１０４５５８１２．５号の優先権を主張し、その開示は、その全体にわたって参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本出願は、バイオテクノロジーの分野に属し、組換え凝固第ＶＩＩＩ因子及びその使用に関する。

【背景技術】

【0003】

血友病Ａ（ＨＡ）は、遺伝性の抗血友病性グロブリン欠乏症又はＦＶＩＩＩ欠乏症としても公知であり、凝固第ＶＩＩＩ因子遺伝子（ＦＶＩＩＩ遺伝子又はＦ８遺伝子）の遺伝的欠損により引き起こされる凝固障害である。現在、ＨＡは主に、血漿由来凝固因子又は外因的に培養された組換えタンパク質に基づくタンパク質補充療法（ＲＰＴ）により治療される。しかし、ＰＲＴは、短い半減期、高いコスト及び長い治療期間などの限界を有する。

【0004】

遺伝子療法は、欠損遺伝子及び異常な遺伝子により引き起こされる疾患を治療することを目的として、欠損遺伝子及び異常な遺伝子を矯正又は代償するため、正常な外来遺伝子が標的細胞に導入されることを指す。現在、遺伝子療法は、ＨＡについての最も有望な治療と考えられている。

【0005】

ヒトＦ８遺伝子の分析は、ヒトＦ８遺伝子の発現タンパク質が、Ａ１－Ａ２－Ｂ－Ａ３－Ｃ１－Ｃ２として発現される明確なドメインを有することを示す。Ｂドメインは、非常に大きいエキソンによりコードされ、オリゴ糖に結合したアスパラギン（Ｎ）からなる高度に保存された領域を含有する。Ｍｉａｏらは、無傷のアスパラギン結合糖鎖付加部位６つを含有する、Ｎ末端の２２６個のアミノ酸を保持するＢドメインの部分欠失が、Ｆ８のインビトロ分泌を１０倍増大させうることを指摘した（Ｍｉａｏ，Ｈ．Ｚ．、Ｓｉｒａｃｈａｉｎａｎ，Ｎ．、Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ、Ｋｕｃａｂ，Ｐ．、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｍ．Ａ．ら Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ、２００４、１０３（９）、３４１２～３４１９頁を参照のこと。）。しかし、Ｂ－ドメイン欠失Ｆ８遺伝子（Ｆ８－ＢＤＤ）を使用する遺伝子療法は、タンパク質の分泌及び機能の低下、Ｆ８ウイルスベクターの形質導入効率の低下、並びに抗体及び阻害因子形成に関連する応答（免疫拒絶）などの問題を有する。

【0006】

まとめると、良好な凝固機能、及び阻害抗体のインビボでの弱い応答誘導を有し、ＨＡ遺伝子療法の分野で非常に意義深い、組換え凝固第ＶＩＩＩ因子が提供される。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｍｉａｏ，Ｈ．Ｚ．、Ｓｉｒａｃｈａｉｎａｎ，Ｎ．、Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ、Ｋｕｃａｂ，Ｐ．、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｍ．Ａ．ら Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ、２００４、１０３（９）、３４１２～３４１９頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

（要旨）
本出願は、組換え凝固第ＶＩＩＩ因子及びその使用を提供する。組換え凝固第ＶＩＩＩ因子は、糖鎖付加部位に富み、良好な凝固機能及び抗体への弱い応答を有し、細胞外に容易に分泌され、血友病Ａを効率的に矯正することができる。

【課題を解決するための手段】

【0009】

第１の態様において、本出願は、配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の８０％より多くを含む組換え凝固第ＶＩＩＩ因子を提供する。

【0010】

本出願の組換え凝固第ＶＩＩＩ因子は、糖鎖付加部位の配列に富み、良好な凝固機能を有し、細胞外に容易に分泌され、トロンビン（ＦＩＩａ）などの補因子と容易に相互作用する。さらに、組換え凝固第ＶＩＩＩ因子は、抗体を誘導する弱い応答を有し、治療効果を効果的に実現することができ、免疫拒絶のリスクを低減させることができ、治療コストを低下させることができる。

【0011】

配列番号１：（下線は本出願における合成Ｂドメイン［Ｎ８］であり、Ａ２及びＡ３ドメインがそれぞれＢドメインの前後にある。）

【0012】

【化1】

【0013】

配列番号２：（下線は本出願における合成Ｂドメイン［２９９］であり、Ａ２及びＡ３ドメインがそれぞれＢドメインの前後にある。）

【0014】

【化2】

【0015】

本出願の一部の実施形態において、組換え凝固第ＶＩＩＩ因子は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＢドメインを含有する。

【0016】

配列番号８：（Ｂドメイン［Ｎ８］）

【0017】

【化3】

【0018】

本出願の一部の実施形態において、組換え凝固第ＶＩＩＩ因子は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＢドメインを含有する。

【0019】

配列番号９：（Ｂドメイン［２９９］）

【0020】

【化4】

【0021】

第２の態様において、本出願は、本出願の組換え凝固第ＶＩＩＩ因子のＢドメインをコードする、配列番号３及び配列番号４に示される遺伝子配列を提供する。

【0022】

配列番号３：

【0023】

【化5】

【0024】

配列番号４：

【0025】

【化6】

【0026】

一部の特定の実施形態において、組換え凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子は、配列番号５又は配列番号６に示される核酸配列を含む。

【0027】

配列番号５：（全長Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８タンパク質をコードする核酸配列）

【0028】

【化7】

【0029】

配列番号６：（全長Ｆ８－ＢＤＤ－２９９タンパク質をコードする核酸配列）

【0030】

【化8】

【0031】

本出願の組換え凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子は、糖鎖付加部位の配列に富み、発現された凝固第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８タンパク質）は、良好な凝固機能を有し、細胞外に容易に分泌され、トロンビン（ＦＩＩａ）などの補因子と容易に相互作用する。さらに、発現された凝固第ＶＩＩＩ因子は、抗体応答を誘導する弱い能力を有し、治療効果を効果的に実現することができ、免疫拒絶のリスクを低減させることができ、治療コストを低下させることができる。

【0032】

第３の態様において、本出願は、組換え発現ベクターを提供する。組換え発現ベクターは、第２の態様による組換え凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子を含む。

【0033】

好ましくは、組換え発現ベクターは、第２の態様による組換え凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子を含有するウイルスベクター又はプラスミドベクターを含む。

【0034】

好ましくは、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターｐＥＧＷＩを含む。

【0035】

好ましくは、レンチウイルスベクターｐＥＧＷＩの５’スプライスドナー部位ＧＴは、ＣＡに突然変異している。

【0036】

好ましくは、レンチウイルスベクターｐＥＧＷＩのＵ３領域におけるエンハンサーは欠失している。

【0037】

好ましくは、レンチウイルスベクターｐＥＧＷＩのＵ３領域は、インスレーターを含有する。

【0038】

好ましくは、組換え発現ベクターは、ＥＦ１αプロモーターを含む。

【0039】

本出願において、レンチウイルスベクターｐＥＧＷＩは改変されている：野生型５’スプライスドナー部位ＧＴがＣＡに突然変異しており、Ｕ３領域におけるエンハンサーが欠失しており、インスレーター（ｃＨＳ４）がＵ３領域に付加されており、これらのことが、ベクター生成コストを低減させるためにｐＥＧＷＩの形質導入効率及び発現効率を効果的に改善することができ、さらに安全性を改善することができる。

【0040】

第４の態様において、本出願は、組換えレンチウイルスを提供する。組換えレンチウイルスは、第２の態様による組換え凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子を含む。

【0041】

好ましくは、組換えレンチウイルスを調製するための方法は、
パッケージングプラスミドを使用して、第３の態様によるレンチウイルスベクターをパッケージングして、組換えレンチウイルスを得ること
を含む。

【0042】

好ましくは、パッケージングプラスミドは、ｐＮＨＰ及びｐＨＥＦ－ＶＳＶ－Ｇを含む。

【0043】

好ましくは、組換えレンチウイルスを調製するための方法は、以下のステップを含む：
（１）第３の態様によるレンチウイルスベクター、並びにパッケージングプラスミドｐＮＨＰ及びｐＨＥＦ－ＶＳＶ－Ｇを、哺乳動物細胞ＨＥＫ２９３Ｔにコトランスフェクトし、哺乳動物細胞ＨＥＫ２９３Ｔを２４～７２時間培養するステップ、並びに
（２）精製及び濃縮を実施して、組換えレンチウイルスを得るステップ。

【0044】

第５の態様において、本出願は、組換え細胞を提供する。組換え細胞は、第２の態様による組換え凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子を含む。

【0045】

好ましくは、組換え細胞のゲノムは、第２の態様による組換え凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子と融合している。

【0046】

好ましくは、組換え細胞は、第３の態様による組換え発現ベクターを含有する。

【0047】

第６の態様において、本出願は、第５の態様による組換え細胞を調製するための方法を提供する。本方法は、
第２の態様による組換え凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子、第３の態様による組換え発現ベクター又は第４の態様による組換えレンチウイルスを、宿主細胞に導入して、組換え細胞を得ること
を含む。

【0048】

好ましくは、導入は、電気的形質導入、ウイルスベクター系、非ウイルスベクター系又は直接遺伝子注入のうちのいずれか１つを含む方法により実施される。

【0049】

好ましくは、宿主細胞は造血幹細胞を含む。

【0050】

第７の態様において、本出願は、医薬組成物を提供する。医薬組成物は、第１の態様による組換え凝固第ＶＩＩＩ因子、第２の態様による組換え凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子、第３の態様による組換え発現ベクター、第４の態様による組換えレンチウイルス又は第５の態様による組換え細胞のうちのいずれか１つ又はこれらの組合せを含む。

【0051】

好ましくは、医薬組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤のうちのいずれか１つ又はこれらのうちの少なくとも２つの組合せをさらに含む。

【0052】

第８の態様において、本出願は、第１の態様による組換え凝固第ＶＩＩＩ因子、第２の態様による組換え凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子、第３の態様による組換え発現ベクター、第４の態様による組換えレンチウイルス、第５の態様による組換え細胞又は第７の態様による医薬組成物の、血友病を治療するための医薬の調製のための使用を提供する。

【0053】

既存の技術と比較して、本出願は、以下の有益な効果を有する。

【0054】

（１）遺伝子改変により、本出願の組換え凝固第ＶＩＩＩ因子は、糖鎖付加部位に富み、良好な凝固機能を有し、細胞外に容易に分泌され、トロンビン（ＦＩＩａ）などの補因子と容易に相互作用する。さらに、組換え凝固第ＶＩＩＩ因子は、抗体への弱い応答を有し、治療効果を効果的に実現することができ、免疫拒絶のリスクを低減させることができ、治療コストを低下させることができる。

【0055】

（２）本出願において、レンチウイルスベクターｐＥＧＷＩは改変されており、このことが、ベクターコストを低減させるためにｐＥＧＷＩの形質導入効率及び発現効率を効果的に改善することができ、さらに安全性を改善することができる。

【0056】

（３）本出願において、組換え凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子及びレンチウイルスベクターを使用することにより構築される発現ベクターは、ＨＡマウスにおけるインビボでの発現を順調に実施することができ、ＨＡマウスの出血の表現型をある程度まで矯正することができる。発現ベクターは、抗体への弱い応答を有し、遺伝子療法の有効性を実現することにおいて非常に意義深く、このことが、ＨＡ症状をより早く軽減し、より広範囲で長期にわたる遺伝子療法効果を達成するための基礎となる。

【図面の簡単な説明】

【0057】

【図1】レンチウイルスベクターｐＥＧＷＩの構造図である。

【図2A】正常なＦ８－ＢＤＤ遺伝子の構造図である。

【図2B】Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８遺伝子の構造図である。

【図2C】Ｆ８－ＢＤＤ－２９９遺伝子の構造図である。

【図2D】組換えレンチウイルスベクターの構造図である。

【図3】組換えレンチウイルスのウイルスコピー数を示すグラフである。

【図4】組換えレンチウイルスによりトランスフェクトされた細胞のタンパク質発現の分析についてのフローチャートである。

【図5】組換えレンチウイルスにより形質導入された細胞のタンパク質発現の結果を示すグラフである。

【図6】ＡＰＴＴアッセイによる、インビトロ血漿の検出結果を示すグラフである。

【図7】基質発光アッセイによる、インビトロ血漿の検出結果を示すグラフである。

【図8】糖鎖付加阻害因子により処理された第ＶＩＩＩ因子のウェスタンブロッティング結果を示すグラフである。

【図9】第ＶＩＩＩ因子のインビトロ活性を示すグラフである。

【図10】ＨＡマウスの処理についてのフローチャートである。

【図11】マウスにおける第ＶＩＩＩ因子のインビボ活性を示すグラフである。

【図12】ＡＰＴＴアッセイによる、マウス血漿の検出結果を示すグラフである。

【図13】酵素結合免疫吸着アッセイによる、マウス血漿の検出結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0058】

採用された技術手段及び本出願において達成される効果についてさらに詳述するため、本出願が、実施例及び図と併せて、以下でさらに記載される。本明細書で記載される具体的な実施形態は、本出願を例示することを意図され、本出願を限定することを意図されないことが理解されるべきである。

【0059】

実施例における、具体的な技法又は条件が言及されない実験は、当技術分野における文献又は製品仕様書に記載される技法又は条件に従って実施される。製造業者が明記されない、本明細書において使用される試薬又は機器は、然るべき経路から市販されている従来の製品である。

【実施例】

【0060】

［実施例１］
レンチウイルスベクターを構築した。方法は、具体的に以下のステップを含む。

【0061】

（１）レンチウイルスベクターｐＥＧＷＩの構造図が、図１に示される。野生型５’スプライスドナー部位ＧＴをＣＡに突然変異させ、Ｕ３におけるエンハンサーを欠失させ、インスレーター（ｃＨＳ４）をＵ３に付加した。具体的な改変方法については、「Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｓｐｌｉｃｅ Ｓｉｔｅｓ ａｎｄ ｃｉｓ－Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｃｕｉら Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９９年７月、６１７１～６１７６頁」を参照のこと。

【0062】

（２）プロモーター及びＦ８－ＢＤＤ／Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８／Ｆ８－ＢＤＤ－２９９遺伝子を挿入した。

【0063】

正常な未改変のＦ８－ＢＤＤ遺伝子配列（配列番号７に示される）、Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８遺伝子配列（配列番号５に示される）及びＦ８－ＢＤＤ－２９９遺伝子配列（配列番号６に示される）を、選択された可能な糖鎖付加部位の配列で化学的に合成し、ヒトＥＦ１α（ｈＥＦ１α）プロモーター配列を付加した。正常なＦ８－ＢＤＤの遺伝子構造が、図２Ａに示される。Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８及びＦ８－ＢＤＤ－２９９には、合成された糖鎖付加部位関連配列を個々に挿入し、それらの遺伝子構造が、図２Ｂ及び２Ｃに示される。正常なＦ８－ＢＤＤ、Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８及びＦ８－ＢＤＤ－２９９を、制限酵素消化部位を介してレンチウイルスベクターｐＥＧＷＩに挿入した。得られた生成物を、シークエンシング及び二重の消化により特定し（最良の反応条件については、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ［ＮＥＢ］の元の提言を参照のこと。）、ＢａｍＨＩクローニング部位（ｇｇａｔｃｃ－ａｃｃ）－ＡＵＧを５’末端に使用し、ＳｐｅＩクローニング部位（ａｃｔａｇｔ）を３’末端に使用して、ｈＥＦ１αにより制御される、正常なＦ８－ＢＤＤ、Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８又はＦ８－ＢＤＤ－２９９遺伝子を担持する、正しく結合したレンチウイルスベクターを得た。レンチウイルスベクターの具体的な結合位置及び組成が、図２Ｄに示される。

【0064】

配列番号７：

【0065】

【化9】

【0066】

［実施例２］
この実施例では、実施例１において構築されたレンチウイルスベクターを、さらにパッケージングし、精製し、濃縮して、組換えレンチウイルスを得た。実験方法については、［１］Ｃｈａｎｇ Ｌ－Ｊ、Ｕｒｌａｃｈｅｒ Ｖ、Ｉｗａｋｕｍａ Ｔ、ら Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９９、６（５）：７１５～７２８頁。［２］Ｃｈａｎｇ Ｌ Ｊ、Ｚａｉｓｓ Ａ Ｋ．Ｃｈａｎｇ，Ｌ－Ｊ及びＺａｉｓｓ、ＡＫ．Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｓｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ６９：３０３～３１８頁［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００２、６９：３０３～３１８頁を参照のこと。

【0067】

具体的なステップについては、先に列挙された文献を参照のこと。実験方法は、以下のように簡潔に記載される。

【0068】

（１）実施例１において構築されたレンチウイルスベクター並びにパッケージングプラスミドｐＮＨＰ及びｐＨＥＦ－ＶＳＶ－Ｇを、哺乳動物細胞ＨＥＫ２９３Ｔにコトランスフェクトし、次いで哺乳動物細胞ＨＥＫ２９３Ｔを４８ｈ培養し、ウイルスベクター上清を収集した。

【0069】

（２）培養物から収集されたレンチウイルスを精製し、濃縮して、組換えレンチウイルスを得た。

【0070】

（３）各レンチウイルスのウイルスコピー数（ＶＣＮ）を検出した。検出結果が図３に示される。同じ感染多重度で、ＬＶ－Ｆ８－ＢＤＤ、ＬＶ－Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８及びＬＶ－Ｆ８－ＢＤＤ－２９９レンチウイルスは、基本的に同様のコピー数を有する。

【0071】

［実施例３］
この実施例では、実施例２において調製された組換えレンチウイルスを、インビトロで試験した。

【0072】

正常なＦ８－ＢＤＤ、Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８又はＦ８－ＢＤＤ－２９９遺伝子を担持する、実施例２において調製された３種のレンチウイルス（ＬＶ－Ｆ８－ＢＤＤ、ＬＶ－Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８及びＬＶ－Ｆ８－ＢＤＤ－２９９）を、ＥＡ－ｈｙ９２６内皮細胞に、個々に形質導入した。レンチウイルスを、以下の方法により形質導入した。

【0073】

１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液を含有するＤＭＥＭ培地を、６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）に添加した。１ウェルあたり４×１０^４個のＥＡ－ｈｙ９２６内皮細胞株を播種し、３７℃で１８時間、５％ＣＯ_２下でインキュベートし、ＭＯＩ ５０でレンチウイルスによりトランスフェクトした。ポリブレン（８μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、培地の最終体積が６００μＬとなるまで添加した。形質導入を２４ｈ実施し、次いで細胞コンフルエンスが９０．０％に到達するまで、培地を新しい培地に毎日交換した。細胞をＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）に移した。

【0074】

タンパク質発現を検出して、細胞におけるＦ８－ＢＤＤ、Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８及びＦ８－ＢＤＤ－２９９遺伝子の発現を決定した。具体的な工程が図４に示される。形質導入されたＥＡ－ｈｙ９２６細胞により分泌された上清を収集し、濃縮し、細胞内抽出物も収集した。タンパク質発現を、ウェスタンブロッティングにより検出した。レンチウイルスなしで形質導入された細胞を、陰性対照（ＮＣ）として使用した。内部基準としてＧＡＰＤＨを用いて、結果が図５に示され、Ｌは細胞抽出物の検出結果を示し、Ｓは細胞培養物上清の検出結果を示す。図５に示されるように、少量の第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８タンパク質）が、レンチウイルスなしで形質導入された細胞において発現され（低活性、４３ｋＤａ）、一方、比較的多量のＦ８－ＢＤＤ、Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８又はＦ８－ＢＤＤ－２９９が、正常なＦ８－ＢＤＤ、Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８又はＦ８－ＢＤＤ－２９９遺伝子を担持するレンチウイルスにより形質導入された細胞において明らかに発現された。Ｆ８－ＢＤＤと比較して、より完全なＦ８タンパク質（１１０～２００ｋＤａ）が、Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８又はＦ８－ＢＤＤ－２９９により形質導入された細胞の上清において得られる。このことは、遺伝的に改変されたＦ８－ＢＤＤ遺伝子：本出願におけるＦ８－ＢＤＤ－Ｎ８及びＦ８－ＢＤＤ－２９９により発現された第ＶＩＩＩ因子が、より細胞外に分泌されやすく、効果的な凝固を実現することを示す。

【0075】

凝固機能は、２つの方法により主に評価される：活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイ及び基質発光アッセイ。ＡＰＴＴ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＧｍｂＨ、ドイツ）アッセイは、以下のように実施された：３７℃で細胞上清５０μＬを、試験される血漿５０μＬに添加し、次いでＡＰＴＴ中アクチン試薬（第ＸＩＩ因子活性化因子及び大脳リン脂質）１００μＬを添加し、完全に混合し、７℃で３分間インキュベートし、最後にカルシウムイオン（ＣａＣｌ_２）１００μＬを添加して、血漿凝固に必要な時間、すなわち活性化部分トロンボプラスチン時間を観察した。

【0076】

基質発光アッセイは、Ｆ８発色アッセイキット（Ｈｙｐｈｅｎ ＢｉｏＭｅｄ、フランス）により活性を決定するための方法である。基質発光アッセイは以下のように実施した：試験される血漿及びブランク対照群を、トリス－ＢＳＡ緩衝液（Ｒ４＋）で４０倍に希釈し、５０μＬをマイクロプレートに添加し、第Ｘ因子（Ｒ１）５０μＬ、活性化第ＩＸ因子混合物（Ｒ２）５０μＬ及びＳＸａ－１１基質（Ｒ３）５０μＬを個々に添加し、３７℃で５分間インキュベートし、２０％酢酸５０μＬを添加して、反応を停止させた。吸光度を４０５ｎｍで読み取った。

【0077】

先に収集された、ウイルスにより形質導入されたＥＡ－ｈｙ９２６細胞の上清を－８０℃から取り出し、氷上で解凍した。各上清を、Ｆ８欠乏患者の血漿と混合した。Ｆ８欠乏患者の血漿を陰性対照（ＮＣ）として使用し、健康なボランティアの血漿を陽性対照（ＰＣ）として使用した。検出を、ＡＰＴＴアッセイ及び基質発光アッセイにより実施した。

【0078】

ＡＰＴＴアッセイの検出結果が図６に示される。陰性対照と比較して、Ｆ８－ＢＤＤを形質導入された細胞の上清、Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８を形質導入された細胞の上清及びＦ８－ＢＤＤ－２９９を形質導入された細胞の上清は、良好な凝固活性、及び血漿凝固時間が有意に低減するという点で、有意な凝固効果をそれぞれ有する。Ｆ８－ＢＤＤ－２９９を形質導入された細胞の上清は、凝固時間が９４．３秒であるという点で最良の効果を有し、この効果は、陽性対照の効果（５７．５ｓ）と比較して一定の統計上の差（ｐ＜０．０５）を有する。Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８を形質導入された細胞の上清の凝固時間は１１３．７秒であり、この凝固時間は、Ｆ８－ＢＤＤ－２９９及び陽性対照の凝固時間と比較して、一定の統計上の差（ｐ平均）＜０．０５）を有する。Ｆ８－ＢＤＤをトランスフェクトされた細胞の上清の凝固時間は１５６．７秒であり、この凝固時間は、Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８、Ｆ８－ＢＤＤ－２９９及び陽性対照の凝固時間と比較して、比較的大きい統計上の差（ｐ平均）＜０．００１）を有する。このことは、改変されたＦ８－ＢＤＤ遺伝子：本出願におけるＦ８－ＢＤＤ－Ｎ８及びＦ８－ＢＤＤ－２９９により発現された第ＶＩＩＩ因子が、良好な凝固効果を有することを示す。

【0079】

図７は、基質発光アッセイの検出結果を示す。活性を、Ｆ８発色アッセイキットを使用して得、次いで第ＶＩＩＩ因子をＥＬＩＳＡにより定量化して、単位活性を得た。Ｆ８－ＢＤＤ－２９９により発現された第ＶＩＩＩ因子の単位活性は、Ｆ８－ＢＤＤにより発現された第ＶＩＩＩ因子の単位活性の１００倍であり、Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８により発現された第ＶＩＩＩ因子の単位活性の２．８倍である。

【0080】

要約すれば、本出願において、レンチウイルスベクターは、改変されたＦ８－ＢＤＤ遺伝子：Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８及びＦ８－ＢＤＤ－２９９をそれぞれ使用して構築され、細胞において順調に発現され、Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８及びＦ８－ＢＤＤ－２９９により発現された第ＶＩＩＩ因子は、細胞外により容易に分泌され、良好な凝固効果を有する。

【0081】

［実施例４］
この実施例では、第ＶＩＩＩ因子のＮ－糖鎖付加を検出した。

【0082】

Ｆ８－ＢＤＤ、Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８及びＦ８－ＢＤＤ－２９９を形質導入された内皮細胞の上清を、糖鎖付加阻害因子：ノイラミニダーゼ（Ｎ）及びペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ（Ｇ）で個々に処理した。糖鎖付加阻害因子は、糖鎖除去を誘導し、分子量を低減しうる。ウェスタンブロッティングの結果が図８に示され、「＋」は対応する酵素での処理を示し、「－」は対応する酵素での処理を行わないことを示す。糖鎖付加阻害因子での処理後の、糖鎖除去後に低減したタンパク質分子量を有するタンパク質バンドが、矢印により示される。Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８及びＦ８－ＢＤＤ－２９９により発現された第ＶＩＩＩ因子の分子量は有意に低減し（－レーンと比較した＋＋レーン）、一方、Ｆ８－ＢＤＤにより発現された第ＶＩＩＩ因子の分子量は低減せず、本出願におけるＦ８－ＢＤＤ遺伝子の改変が、糖鎖付加部位を効果的に導入しうることを示す。

【0083】

トロンビン（ＦＩＩａ）は、第ＶＩＩＩ因子にとって重要な補因子である。ＦＩＩａは、Ｂドメインの改変が、プロコアグラント補因子との相互作用にも影響を及ぼすか否かを調べるため、形質導入された内皮細胞の上清を処理するために使用される。トロンビンの添加はＦ８の活性化を増強し、第ＶＩＩＩ因子のＡ２領域に関連するより多くのタンパク質（分子量４３ｋＤａを有する）が生成される。トロンビンを添加した後、活性検出を２分ごとに実施した（先に記載された基質発光アッセイにより）。結果が図９に示される。２分目からは、Ｆ８－ＢＤＤ－２９９により発現された第ＶＩＩＩ因子の活性は有意に増大し、Ｆ８－ＢＤＤ及びＦ８－ＢＤＤ－Ｎ８により発現された第ＶＩＩＩ因子の活性はわずかに増大する。

【0084】

［実施例５］
Ｆ８－ＢＤＤ、Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８又はＦ８－ＢＤＤ－２９９を担持する３種のレンチウイルス（ＬＶ－Ｆ８－ＢＤＤ、ＬＶ－Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８及びＬＶ－Ｆ８－ＢＤＤ－２９９）を、実施例２に示されたように調製し、マウスの造血幹細胞に形質導入した。ＨＡマウスを、図１０に示されるように処理した。Ｆ８遺伝子のノックアウトを有するＣ５７ＢＬ／６マウス（６週齢、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｉｏｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）を、ＨＡマウスとして使用した。マウスを全て、病原体不含環境に配置し、Ｘ線照射キャビネット（Ｆａｘｉｔｒｏｎ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ、ＵＳＡ）を用いて照射した（９．５Ｇｙ／マウス）。骨髄細胞を、ＨＡマウスの脛骨及び大腿骨から収集した。造血幹細胞を骨髄細胞から単離し、レンチウイルスＬＶ－Ｆ８－ＢＤＤ、ＬＶ－Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８及びＬＶ－Ｆ８－ＢＤＤ－２９９それぞれを形質導入して、Ｆ８－ＢＤＤ、Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８又はＦ８－ＢＤＤ－２９９遺伝子を担持する幹細胞を得た。形質導入された幹細胞を、疾患治療のため、静脈内注射によりＨＡマウスに注射して戻した。

【0085】

同種骨髄移植から１５日目、３０日目、４５日目及び６０日目に、血液をマウスから採取し、血漿を血液から単離した。血漿中の第ＶＩＩＩ因子の活性を、対照として未処理の血友病マウス（偽）及び野生型マウス（ＷＴ）を用いて、２ステップ基質発光アッセイにより決定した。結果が図１１に示される。Ｆ８－ＢＤＤ－２９９により発現された第ＶＩＩＩ因子の活性は、１５日目の５％から６０日目の８％まで連続的に増大する。Ｆ８－ＢＤＤ及びＦ８－ＢＤＤ－Ｎ８により発現された第ＶＩＩＩ因子の活性は約３．０％に留まり、これは、Ｆ８－ＢＤＤ－２９９の活性と一定の統計上の差（Ｐ＜０．０５）を有する。血漿の凝固機能を、ＡＰＴＴアッセイにより決定した。結果が図１２に示される。Ｆ８－ＢＤＤ－２９９により発現された第ＶＩＩＩ因子の凝固時間が最も短く、野生型マウスの凝固時間に最も近い（ｐ＜０．０５）。

【0086】

さらに、抗体の応答について、先に処理されたマウスの眼窩末梢血を収集し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心処理して血漿を得た。血漿をトリス－ＢＳＡ緩衝液で、１：２００で希釈し、ＰＶＣマイクロプレートに配置し、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス全ＩｇＧを添加した。次いで、発光基質３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のために添加して、第ＶＩＩＩ因子に対する抗体の応答を評価した。第ＶＩＩＩ因子に対するモノクローナル抗体を注射されたＨＡマウスを、陽性対照（Ｃｔｒｌ＋）として使用した。結果が図１３に示される。Ｆ８－ＢＤＤ－Ｎ８及びＦ８－ＢＤＤ－２９９により発現された第ＶＩＩＩ因子は、Ｆ８－ＢＤＤにより発現された第ＶＩＩＩ因子よりも、ＩｇＧ抗体に対し弱い応答を有し、Ｆ８－ＢＤＤ－２９９により発現された第ＶＩＩＩ因子は、ＩｇＧ抗体に対し最も弱い応答を有する。

【0087】

要約すれば、本出願において、Ｆ８－ＢＤＤ遺伝子は、遺伝的に改変され、糖鎖付加部位配列を付加され、発現ベクターは、改変されたレンチウイルスベクターを使用することにより構築される。発現ベクターは、高い形質導入及び発現効率を有し、発現された第ＶＩＩＩ因子は、細胞外に容易に分泌され、効率的な凝固機能を有し、ＨＡマウスの出血の表現型をある程度まで矯正することができ、抗体応答を誘導する弱い能力を有し、このことが、遺伝子療法の有効性を実現することにおいて非常に意義深く、ＨＡ症状をより早く軽減し、より広範囲で長期にわたる遺伝子療法を達成するための基礎となる。

【0088】

出願者は、本出願の詳細な方法が、先に記載された実施例により記載されるが、本出願が、先に記載された詳細な方法に限定されないことを明記しており、このことは、本出願の実施が、先に記載された詳細な方法に必ずしもよらないことを意味する。本出願における、本出願になされる任意の改善、生成物の各種原料の同等の代替物、補助成分の添加及び具体的な様式の選択などが全て、本出願の保護範囲及び開示範囲に入ることが、当業者には明らかであるはずである。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

2024514790000001.app

【国際調査報告】