特表 2024-514791 骨髄特異的プロモーター及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-03

(54)【発明の名称】骨髄特異的プロモーター及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20240327BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240327BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240327BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240327BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240327BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240327BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240327BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20240327BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240327BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240327BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240327BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240327BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20240327BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240327BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240327BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z

C12N5/10 ZNA

C12N15/867 Z

C12N15/12

C12N7/01

A61P37/06

A61P29/00

A61P31/00

A61P37/02

A61P43/00 105

A61K48/00

A61K35/12

A61K35/28

A61K31/7088

A61K35/76

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023560869

(86)(22)【出願日】2022-04-08

(85)【翻訳文提出日】2023-11-29

(86)【国際出願番号】 CN2022085852

(87)【国際公開番号】W WO2022228086

(87)【国際公開日】2022-11-03

(31)【優先権主張番号】202110455720.7

(32)【優先日】2021-04-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202110761757.2

(32)【優先日】2021-07-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520319705

【氏名又は名称】ベイジン・メイカン・ジーノ－イミューン・バイオテクノロジー・カンパニー・リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＢＥＩＪＩＮＧ ＭＥＩＫＡＮＧ ＧＥＮＯ－ＩＭＭＵＮＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ Ｂ１０４， １ｓｔ Ｆｌｏｏｒ， Ｎｏ． ５，Ｋａｉｔｕｏ Ｒｏａｄ， Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８５， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チャン，ルン－ジー

(72)【発明者】

【氏名】ユアン，ハオクン

(72)【発明者】

【氏名】ジャン，ルイ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AA97X

4B065AA97Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB071

4C084ZB072

4C084ZB081

4C084ZB082

4C084ZB111

4C084ZB112

4C084ZB211

4C084ZB212

4C084ZB311

4C084ZB312

4C086AA01

4C086AA03

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB07

4C086ZB08

4C086ZB11

4C086ZB21

4C086ZB31

4C087AA01

4C087AA03

4C087BB44

4C087BB65

4C087BC83

4C087NA14

4C087ZB07

4C087ZB08

4C087ZB11

4C087ZB21

4C087ZB31

(57)【要約】

骨髄特異的プロモーター及びその使用が提供される。骨髄特異的プロモーターは、配列番号１又は配列番号２に示される核酸配列を含む。骨髄特異的プロモーターは骨髄組織に特異性を示す。このプロモーターは、骨髄細胞では高い効率で遺伝子発現を開始するが、非骨髄細胞では相対的に低い効率で遺伝子発現を開始する。このように、骨髄特異的プロモーターは骨髄組織における遺伝子の特異的発現を制御する。骨髄特異的プロモーター及びＣＹＢＢ遺伝子がレンチウイルスベクターに挿入され、構築されたレンチウイルス発現ベクターは骨髄組織に特異性を示し、ｇｐ９１－ｐｈｏｘタンパク質の発現を効果的に回復させ、ＲＯＳの生成機能を回復させることができる。このことはＣＧＤ治療にとって非常に重要である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１又は配列番号２に示される核酸配列を含む、骨髄特異的プロモーター。

【請求項2】

請求項１に記載の骨髄特異的プロモーターを含む組換え発現ベクターであって、
好ましくは、組換え発現ベクターが、請求項１に記載の骨髄特異的プロモーターを含むウイルスベクター又はプラスミドベクターを含み、
好ましくは、ウイルスベクターが、ｐＴＹＦレンチウイルスベクターを含む、
組換え発現ベクター。

【請求項3】

チトクロムｂ－２４５β鎖（ＣＹＢＢ）遺伝子をさらに含み、
好ましくは、ＣＹＢＢ遺伝子が、配列番号３に示される核酸配列を含み、
好ましくは、骨髄特異的プロモーターが、ＣＹＢＢ遺伝子の発現を開始する、
請求項２に記載の組換え発現ベクター。

【請求項4】

請求項２又は３に記載の組換え発現ベクターを含む、組換えレンチウイルス。

【請求項5】

請求項１に記載の骨髄特異的プロモーターを含む組換え細胞であって、
好ましくは、組換え細胞が、請求項２又は３に記載の組換え発現ベクターを含み、
好ましくは、組換え細胞が、請求項４に記載の組換えレンチウイルスを含む、
組換え細胞。

【請求項6】

請求項５に記載の組換え細胞を調製するための方法であって、
組換え細胞を得るために、請求項２若しくは３に記載の組換え発現ベクター又は請求項４に記載の組換えレンチウイルスを宿主細胞に導入することを含み、
好ましくは、導入は、電気的遺伝子導入、ウイルスベクター系、非ウイルスベクター系又は遺伝子銃インジェクションのいずれか１つを含む方法によって実施され、
好ましくは、宿主細胞は造血幹細胞を含む、
方法。

【請求項7】

以下のステップ：
（１）レンチウイルスベクターを構築すること、
（２）ステップ（１）のレンチウイルスベクター及び１つのパッケージングプラスミド又は複数のパッケージングプラスミドを、レンチウイルスベクターのパッケージングのために哺乳動物細胞に共トランスフェクトすること、及び
（３）組換え細胞を得るために、ステップ（２）においてパッケージングされたレンチウイルスベクターを宿主細胞に導入すること、
を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

レンチウイルスベクターを構築するステップ（１）が、請求項１に記載の骨髄特異的プロモーター及びＣＹＢＢ遺伝子をｐＴＹＦレンチウイルスベクターに挿入することを含み、
好ましくは、ステップ（２）のパッケージングプラスミドが、ｐＮＨＰ及びｐＨＥＦ－ＶＳＶＧを含み、
好ましくは、ステップ（２）の哺乳動物細胞が、２９３Ｔ細胞を含む、
請求項７に記載の方法。

【請求項9】

医薬組成物であって、請求項１に記載の骨髄特異的プロモーター、請求項２又は３に記載の組換え発現ベクター、請求項４に記載の組換えレンチウイルス又は請求項５に記載の組換え細胞のいずれか１つ又は少なくとも２つの組合せを含み、
好ましくは、医薬組成物が、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤のいずれか１つ又は少なくとも２つの組合せをさらに含む、
医薬組成物。

【請求項10】

疾患を治療するための薬物の調製における、請求項１に記載の骨髄特異的プロモーター、請求項２又は３に記載の組換え発現ベクター、請求項４に記載の組換えレンチウイルス、請求項５に記載の組換え細胞又は請求項９に記載の医薬組成物の使用であって、
好ましくは、疾患が慢性肉芽腫性疾患を含む、
使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は遺伝子工学の技術分野に属し、骨髄特異的プロモーター及びその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）オキシダーゼの機能障害により好中球や単球が侵される遺伝性の原発性免疫不全症である。ＣＧＤは、再発性の重症感染症、炎症及び自己免疫により特徴づけられる。

【0003】

ＮＡＤＰＨオキシダーゼは、膜結合タンパク質と細胞質タンパク質からなり、食細胞が活性化されると、この２種類のタンパク質は相乗的に作用して活性酸素種（ＲＯＳ）を産生するのを助け、細菌や真菌を死滅させる。ＮＡＤＰＨオキシダーゼの５つのサブユニットのいずれかに突然変異があると、ＣＧＤ症候群になることとなる。ＣＧＤ症例の約６７％は、Ｘ染色体上のチトクロムｂ－２４５β鎖（ＣＹＢＢ）遺伝子の欠損が原因であり、この遺伝子は膜貫通型糖タンパク質ｇｐ９１－ｐｈｏｘサブユニットをコードしている。

【0004】

現在、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）が、ＣＧＤを治療するための主な方法である。ＨＳＣＴは、徹底した骨髄破壊的移植前治療を必要とし、同種ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合ドナーを見つける必要がある。しかし、多くの場合、患者がＨＬＡ適合ドナーを見つけることは困難である。さらに、ＨＳＣＴは移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のリスクも有する。移植失敗、高い死亡率、低いドナーキメリズムなどの問題に加えて、ＨＳＣＴは患者の免疫拒絶反応を引き起こす可能性もあり、このことは造血幹細胞の再移植を非常に困難にしている。

【0005】

遺伝子治療とは、欠損遺伝子や異常遺伝子に起因する疾患を治療する目的で、欠損遺伝子や異常遺伝子を補正又は代償するために、正常な外来遺伝子を標的細胞に導入することを指す。ＣＧＤの遺伝子治療は、１９９０年代後半に、研究者がアデノウイルスベクターをＣＧＤ遺伝子治療に使用することを試みたことから始まった。外来遺伝子を効率的かつ継続的に発現させることができないことに加え、この方法は、ベクターが免疫応答を引き起こすという問題も有していた。

【0006】

γ－レトロウイルスベクター（γ－ＲＶ）もＣＧＤ治療に用いられているが、限られた治療効果しか得られていない。Ｋａｎｇらは、ｇｐ９１－Ｐｈｏｘの発現を媒介するγ－ＲＶを用いて、１９～２３歳の３人のＸ－ＣＧＤ患者に対して遺伝子治療の臨床試験を行った。細胞がウイルスベクターで形質導入された後、初期の陽性細胞の割合は２５％～７３％の間であった。遺伝子治療後７カ月目には、患者１の末梢血中の機能的に補正された細胞の割合は２４％～１％に減少した。遺伝子治療後１１カ月目には、患者２の末梢血中の機能的に補正された細胞の割合は４％～０．０３％に減少した。４週間後、補正された細胞は、患者３の末梢血中に検出できなかった（Ｈｙｏｕｎｇ，Ｊｉｎ，Ｋａｎｇら、Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ： Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｆｒｏｍ Ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ Ｔｒｉａｌ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１１、１９、２０９２～２１０１、を参照されたい）。

【0007】

ＲａｖｉｎらはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を用いてＣＧＤ患者のＣＹＢＢ遺伝子の突然変異を修復した。しかし、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を用いた遺伝子編集には、効率が低い、安全性に問題があるなどの問題がある。さらに、この方法は厳しい条件を必要とし、コストが高く、結果が不安定である（Ｄｅ Ｒａｖｉｎら、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｅ ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１７、９、ｅａａｈ ３４８０）。

【0008】

さらに、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの機能はＲＯＳを産生することであり、細胞内でＲＯＳが過剰発現すると、細胞の正常な機能に影響を及ぼすことがある。遺伝子治療は、ＨＣＳにおけるＲＯＳの産生を回復させることができる。ＲＯＳは、ＨＳＣの休息、複製、増殖及び分化などのプロセスのバランスに大きな影響を及ぼす。非組織特異的プロモーターによるＮＡＤＰＨオキシダーゼの異所性発現は、ＨＳＣにおけるＲＯＳの過剰発現につながることとなる。過剰なＲＯＳは、休止中のＨＳＣのアポトーシスを促進し、ＨＳＣの分化を誘導し、ＨＳＣの自己再生能力を弱め、その結果、ＨＳＣプールが見かけ上枯渇する可能性がある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｈｙｏｕｎｇ，Ｊｉｎ，Ｋａｎｇら、Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ： Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｆｒｏｍ Ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ Ｔｒｉａｌ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１１、１９、２０９２～２１０１

【非特許文献2】Ｄｅ Ｒａｖｉｎら、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｅ ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１７、９、ｅａａｈ ３４８０

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

要約すると、アデノウイルスベクター、γ－レトロウイルスベクター、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は、安全性、遺伝子導入効率、長期発現の点で欠点があり、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの非特異的過剰発現によるＨＳＣのアポトーシスなどの問題がある。したがって、遺伝子導入効率が高く、幹細胞改変に適したウイルスベクターを提供し、ＣＧＤの治療効果を向上させることが必要であり、このことは、ＣＧＤ治療分野において非常に重要である。

【課題を解決するための手段】

【0011】

（発明の要旨）
本開示は、骨髄特異的プロモーター及びその使用を提供する。骨髄特異的プロモーターは骨髄組織に特異性を示す。このプロモーターは、骨髄細胞では高い効率で遺伝子発現を開始するが、非骨髄細胞では相対的に低い効率で遺伝子発現を開始する。

【0012】

第１の態様において、本開示は、配列番号１又は配列番号２に示される核酸配列を含む骨髄特異的プロモーターを提供する。

【0013】

本開示の骨髄特異的プロモーターは、骨髄組織に特異性を示す。このプロモーターは、骨髄細胞では高い効率で遺伝子発現を開始するが、非骨髄細胞では相対的に低い効率で遺伝子発現を開始する。このように、骨髄特異的プロモーターは骨髄組織における遺伝子の特異的発現を制御し、このことは遺伝子治療の分野において非常に重要である。

【0014】

配列番号１

【0015】

【化1】

【0016】

配列番号２

【0017】

【化2】

【0018】

第２の態様において、本開示は、第１の態様に記載の骨髄特異的プロモーターを含む組換え発現ベクターを提供する。

【0019】

一部の特定の実施形態において、組換え発現ベクターは、第１の態様に記載の骨髄特異的プロモーターを含むウイルスベクター又はプラスミドベクターを含む。

【0020】

好ましくは、ウイルスベクターは、ｐＴＹＦレンチウイルスベクターを含む。

【0021】

好ましくは、組換え発現ベクターはＣＹＢＢ遺伝子をさらに含む。

【0022】

好ましくは、ＣＹＢＢ遺伝子は、配列番号３に示される核酸配列を含む。

【0023】

配列番号３

【0024】

【化3】

【0025】

好ましくは、骨髄特異的プロモーターは、ＣＹＢＢ遺伝子の発現を開始する。

【0026】

一部の特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、遺伝子治療中に遺伝子が効率的に導入されるように、高効率、高安定性及び高安全性を有する血液幹細胞又は体細胞の形質導入に使用される。一方、骨髄特異的プロモーターは、レンチウイルスベクターが骨髄細胞においてＣＹＢＢ遺伝子を特異的に発現するように使用され、それにより、Ｘ染色体上の遺伝子突然変異に起因する慢性肉芽腫性疾患を効果的に治療する。

【0027】

第３の態様において、本開示は、第２の態様に記載の組換え発現ベクターを含む組換えレンチウイルスを提供する。

【0028】

第４の態様において、本開示は、第１の態様に記載の骨髄特異的プロモーターを含む組換え細胞を提供する。

【0029】

一部の特定の実施形態において、組換え細胞は、第２の態様に記載の組換え発現ベクターを含む。

【0030】

一部の特定の実施形態において、組換え細胞は、第３の態様に記載の組換えレンチウイルスを含む。

【0031】

第５の態様において、本開示は、第４の態様に記載の組換え細胞を調製するための方法であって、
組換え細胞を得るために、第２の態様に記載の組換え発現ベクター又は第３の態様に記載の組換えレンチウイルスを宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。

【0032】

好ましくは、導入は、電気的遺伝子導入、ウイルスベクター系、非ウイルスベクター系又は遺伝子銃インジェクションのいずれか１つを含む法によって実施される。

【0033】

好ましくは、宿主細胞は造血幹細胞を含む。

【0034】

好ましくは、本方法は：
（１）レンチウイルスベクターを構築すること、
（２）ステップ（１）のレンチウイルスベクター及び１つのパッケージングプラスミド又は複数のパッケージングプラスミドを、レンチウイルスベクターのパッケージングのために哺乳動物細胞に共トランスフェクトすること、及び
（３）組換え細胞を得るために、ステップ（２）においてパッケージされたレンチウイルスベクターを宿主細胞に導入すること、
を含む。

【0035】

好ましくは、レンチウイルスベクターを構築するステップ（１）は、第１の態様に記載の骨髄特異的プロモーター及びＣＹＢＢ遺伝子をｐＴＹＦレンチウイルスベクターに挿入することを含む。

【0036】

好ましくは、ステップ（２）のパッケージングプラスミドは、ｐＮＨＰ及びｐＨＥＦ－ＶＳＶＧを含む。

【0037】

好ましくは、ステップ（２）の哺乳動物細胞は、２９３Ｔ細胞を含む。

【0038】

第６の態様において、本開示は、第１の態様に記載の骨髄特異的プロモーター配列、第２の態様に記載の組換え発現ベクター、第３の態様に記載の組換えレンチウイルス、又は第４の態様に記載の組換え細胞のいずれか１つ又は少なくとも２つの組合せを含む医薬組成物を提供する。

【0039】

好ましくは、医薬組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤のいずれか１つ又は少なくとも２つの組合せをさらに含む。

【0040】

第７の態様において、本開示は、疾患を治療するための薬物の調製における、第１の態様に記載の骨髄特異的プロモーター、第２の態様に記載の組換え発現ベクター、第３の態様に記載の組換えレンチウイルス、第４の態様に記載の組換え細胞、又は第６の態様に記載の医薬組成物の使用を提供する。

【0041】

好ましくは、疾患はＣＧＤを含む。

【0042】

従来技術と比較して、本開示は以下の有益な効果を有する。

【0043】

（１）本開示の骨髄特異的プロモーターは、骨髄組織に特異性を示す。このプロモーターは、骨髄細胞では高い効率で遺伝子発現を開始するが、非骨髄細胞では相対的に低い効率で遺伝子発現を開始する。このように、骨髄特異的プロモーターは骨髄組織における遺伝子の特異的発現を制御する。

【0044】

（２）本開示において、高い形質導入効率、高い安定性、高い安全性を有し、骨髄細胞に特異的な発現を行うことができるレンチウイルスベクターを得るために、骨髄特異的プロモーターがレンチウイルスベクターに挿入される。

【0045】

（３）本開示において、骨髄特異的プロモーターとＣＹＢＢ遺伝子がレンチウイルスベクターに挿入され、構築されたレンチウイルス発現ベクターは骨髄組織に特異性を示し、ｇｐ９１－ｐｈｏｘタンパク質の発現を効果的に回復させ、ＲＯＳの生成機能を回復させることができ、このことはＣＧＤ治療にとって非常に重要である。

【図面の簡単な説明】

【0046】

【図1】Ｃ５７マウス骨髄ＨＳＣにおけるウイルスベクターコピー数（ＶＣＮ）を示す図である。

【図2】レンチウイルスでトランスフェクトされた後、５日目と１４日目のＣ５７マウスＨＳＣにおけるＧＦＰ発現を示す図である。

【図3】レンチウイルスで形質導入された後、５日目と１４日目のＣ５７マウスＨＳＣにおけるＧＦＰの発現率を示す図である。

【図4】Ｘ－ＣＧＤマウスＨＳＣにおけるＣＹＢＢ遺伝子の発現結果を示す図である。

【図5】Ｘ－ＣＧＤマウスＨＳＣにおけるＲＯＳの生成レベルを示す図である。

【図6】分化誘導１４日目に骨髄細胞に分化したマウスＨＳＣの割合を示す図である。

【図7】エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）貪食実験の結果を示す図である。

【図8】レンチウイルスで形質導入されたＸ－ＣＧＤマウスＨＳＣにおけるＶＣＮの結果を示す図である。

【図9】インビボでのマウス細胞におけるＣＹＢＢ遺伝子の発現結果を示す図である。

【図10】インビボでのマウス細胞におけるＲＯＳの生成レベルの結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0047】

本開示において採用される技術的手段及び達成される効果をさらに詳しく説明するために、本開示は実施例及び図面と併せて以下にさらに説明される。以下に示す具体的な実施例は、本開示を説明するためのものであり、本開示を限定するものではないことを理解されたい。

【0048】

実施例の中に特定の技術又は条件が記載されていない実験は、当該技術分野の文献又は製品仕様書に記載されている技術又は条件に従って実施される。本明細書で使用される試薬又は器具は、製造者が明記されていない場合、適切なルートから市販されている従来の製品である。

【実施例】

【0049】

［実施例１］
組換えレンチウイルスを調製した。組換えレンチウイルスを調製する方法は、以下に記載するステップを含む。

【0050】

（１）レンチウイルスベクターの構築
１）ｐＴＹＦレンチウイルスベクターを、野生型５’スプライスドナー部位ＧＴをＣＡに突然変異させ、Ｕ３領域のエンハンサーを欠失させることにより改変させた。具体的な改変方法については「Ｃｕｉ Ｙ、Ｉｗａｋｕｍａ Ｔ、Ｃｈａｎｇ Ｌ Ｊ． Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｓｐｌｉｃｅ Ｓｉｔｅｓ ａｎｄ ｃｉｓ－Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９９、７３ （７）： ６１７１」を参照されたい。

【0051】

野生型５’スプライスドナー部位 配列番号４：

【0052】

【化4】

【0053】

突然変異体５’スプライスドナー部位 配列番号５：

【0054】

【化5】

【0055】

２）ＣＹＢＢ遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号３）、ｍｉＲ２２３プロモーター配列（配列番号１）及びＣＤ６８プロモーター配列（配列番号２）を合成し、これらの配列を制限酵素部位を通してレンチウイルスベクターＴＹＦに対応してライゲーションさせ、ｍｉＲ２２３＋ＣＹＢＢレンチウイルスベクター及びＣＤ６８＋ＣＹＢＢレンチウイルスベクターを得た。

【0056】

（２）レンチウイルスのパッケージング及び濃縮
１）２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む新鮮なダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に接種し、１７時間インキュベートした。

【0057】

２）ステップ（１）において調製した２種類のレンチウイルスベクター、ＤＭＥＭ、ｐＮＨＰ及びｐＨＥＦ－ＶＳＶ－Ｇを、順次滅菌遠心チューブに添加し、ボルテックスして混合した後、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔトランスフェクション試薬（ＱＩＡＧＥＮ）を遠心チューブに添加した。この系を室温で８分間静置した。

【0058】

３）遠心チューブ内で調製された混合液を、２９３Ｔ細胞に滴下添加し、５％ＣＯ_２下、３７℃において５時間インキュベートした。

【0059】

４）細胞培養培地を廃棄し、細胞を洗浄し、新しい培地を添加して培養を継続した。

【0060】

５）細胞培養培地を回収し、細胞を洗浄した後、培養培地を新しい培養培地に交換した。新しい培地を、５％ＣＯ_２インキュベーター内で一晩培養した。次いで、細胞培養培地を回収し、－８０℃において保存した。

【0061】

６）パッケージしたレンチウイルスを、１０００×ｇにおいて５分間遠心分離し、細胞断片を除去し、残ったレンチウイルスを－８０℃において保存した。

【0062】

７）レンチウイルスの上清を、遠心フィルターチューブに添加し、２５００×ｇにおいて３０分間遠心分離した。濃縮ウイルスを遠心チューブに集め、－８０℃において保存し、ＣＹＢＢを発現するレンチウイルスＬＶ－ｍｉＲ２２３及びＬＶ－ＣＤ６８を得た。

【0063】

［実施例２］
遺伝子導入効率及びプロモーター特異性を、Ｃ５７マウスＨＳＣにおいて検証した。

【0064】

Ｃ５７マウス骨髄ＨＳＣを、ＣＹＢＢ発現レンチウイルスＬＶ－ＥＦ１α、ＬＶ－ｍｉＲ２２３、ＬＶ－ＣＤ６８及びＬＶ－ＶＥＣで別々に形質導入した。ここで、ＬＶ－ＥＦ１αは広く発現している強力な哺乳動物ＥＦ１αプロモーターを持つレンチウイルスであり、ＬＶ－ＶＥＣは内皮細胞特異的プロモーターを持つレンチウイルスであり、レンチウイルスで形質導入されない細胞を陰性対照（ＮＣ）として用いた。

【0065】

Ｃ５７マウスＨＳＣを、以下に述べる方法で形質導入した。

【0066】

（１）Ｃ５７マウスの脛骨から骨髄を採取し、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なＥａｓｙＳｅｐ（商標） Ｍｏｕｓｅ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて骨髄からＨＳＣを分離及び抽出した。

【0067】

（２）１×１０^６のマウスＨＳＣを、サイトカイン（５０ｎｇ／ｍＬの幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、５０ｎｇ／ｍＬのＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３－Ｌ）、１０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン６（ＩＬ６）、５０ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙより入手可能）を含む１００μＬの培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ培地）に再懸濁し、刺激し、１７時間インキュベートした。

【0068】

（３）５０μＬの培地を廃棄し、サイトカインを含む５０μＬの新しい培地を添加して、細胞を再懸濁した。８μｇ／ｍＬのポリブレンを添加し、レンチウイルスを添加して混合した。トランスフェクションの感染多重度（ＭＯＩ）は２００であった。細胞を、１日１回、合計２回トランスフェクションした。１００×ｇ、室温で１００分間、遠心分離した。

【0069】

（４）形質導入終了後、細胞を回収し、２０ｎｇ／ｍＬのマウス顆粒球コロニー刺激因子（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能なｍＧ－ＣＳＦサイトカイン）により骨髄細胞への分化を誘導した。５日目と１４日目に細胞を回収し、フローサイトメトリーによって緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を測定した。

【0070】

ウイルス形質導入後、ｑ－ＰＣＲを用いて細胞内のＶＣＮを測定した。結果を図１に示す。形質導入後のレンチウイルスＬＶ－ｍｉＲ２２３及びＬＶ－ＣＤ６８のウイルスＶＣＮは、それぞれ２０６．３３％及び１９６．８７％であり、本開示で構築された骨髄特異的プロモーターを含むレンチウイルスベクターが細胞に効果的にトランスフェクトされ、遺伝子治療の要件を満たすことができることを示している。

【0071】

レンチウイルスベクターはＧＦＰ蛍光遺伝子を持っていた。写真を撮影し、ＧＦＰの発現率を測定することによってレンチウイルスベクターの発現を解析した。５日目のＧＦＰの発現（細胞は骨髄細胞に分化していなかった（ｕｎｄｉｆｆｓ）。）と１４日目のＧＦＰの発現（細胞は骨髄細胞に分化していた（ｄｉｆｆｓ）。）を比較し、２つのプロモーターの骨髄特異性を解析した。

【0072】

結果を図２及び図３に示す。図２は、分化誘導後５日目と１４日目の細胞におけるＧＦＰの発現を示す図であり、１列目は蛍光写真であり、２列目は白色光写真である。図３は、レンチウイルスで形質導入した後、５日目と１４日目のＣ５７マウスＨＳＣにおけるＧＦＰの発現率を示す図である。ＥＦ１α群におけるｕｎｄｉｆｆ細胞及びｄｉｆｆ細胞のＧＦＰ発現率は、それぞれ８４．７２％及び８５．３５％であり、同程度であった。ＶＥＣ群におけるｕｎｄｉｆｆ細胞及びｄｉｆｆ細胞のＧＦＰ発現率は、それぞれ２８．２８％及び３２．２２％であり、同程度であった。ｍｉＲ２２３を介したＧＦＰ発現率は、ｕｎｄｉｆｆ細胞で２６．４２％、ｄｉｆｆ細胞で８９．１６％であり、有意差があった。ＣＤ８６を介したＧＦＰ発現率は、ｕｎｄｉｆｆ細胞で５８．０１％、ｄｉｆｆ細胞で７７．４９％であり、有意差があった。このことから、ｍｉＲ２２３プロモーターとＣＤ８６プロモーターは、骨髄細胞において非骨髄細胞よりも高効率で遺伝子発現を開始すること、すなわち、ｍｉＲ２２３プロモーターとＣＤ８６プロモーターは骨髄特異性を有することがわかる。さらに、ｍｉＲ２２３プロモーターは発現に大きな差があり、すなわちｍｉＲ２２３プロモーターはより高い特異性を持つ。

【0073】

［実施例３］
遺伝子導入効率を検証し、ＣＧＤマウス（Ｘ－ＣＧＤマウス、Ｂ６．１２９Ｓ－Ｃｙｂ ｂｔｍ１Ｄｉｎ／Ｊ）のＨＳＣにおいて、ＣＹＢＢ遺伝子の発現を開始させ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの機能を回復させるプロモーターの能力及びプロモーターの特異性を比較した。

【0074】

Ｘ－ＣＧＤマウスＨＳＣを、以下に述べる方法で形質導入した。

【0075】

（１）Ｘ－ＣＧＤマウスの脛骨から骨髄を採取し、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なＥａｓｙＳｅｐ（商標） Ｍｏｕｓｅ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて骨髄からＨＳＣを分離及び抽出した。

【0076】

（２）１×１０^６のマウスＨＳＣを、サイトカイン（５０ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ３－Ｌ、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ６、５０ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ、Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙより入手可能）を含む１００μＬの培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ培地）に再懸濁し、刺激し、１７時間インキュベートした。

【0077】

（３）５０μＬの培地を廃棄し、サイトカインを含む５０μＬの新しい培地を添加して、細胞を再懸濁した。８μｇ／ｍＬのポリブレンを添加し、ウイルスベクターを添加し混合した。形質導入のＭＯＩは２００であった。細胞を１日１回、合計２回形質導入した。１００×ｇ、室温で１００分間遠心分離した。

【0078】

（４）形質導入終了後、細胞を回収し、２０ｎｇ／ｍＬのマウス顆粒球コロニー刺激因子（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能なｍＧ－ＣＳＦサイトカイン）により骨髄細胞への分化を誘導した。

【0079】

ＣＹＢＢ遺伝子の発現（ｇｐ９１－ｐｈｏｘタンパク質の発現）を、それぞれ５日目と１４日目に検出し、すなわち、５日目（ｕｎｄｉｆｆ）及び１４日目（ｄｉｆｆ）のｇｐ９１－ｐｈｏｘ陽性細胞の割合をフローサイトメトリーによって測定した。結果を図４に示す。ここで、ＮＣはレンチウイルスで形質導入されないＸ－ＣＧＤマウスＨＳＣを表し、ＣＧＤはレンチウイルスで形質導入されないが抗ｇｐ９１－ｐｈｏｘ抗体で染色されたＸ－ＣＧＤマウスＨＳＣを表し、ＷＴは野生型マウス細胞を表す。

【0080】

図４からわかるように、ＷＴ群におけるｄｉｆｆ細胞及びｕｎｄｉｆｆ細胞のｇｐ９１－ｐｈｏｘタンパク質の発現率は、それぞれ７２．５８％及び６４．３８％であり、ＥＦ１α群におけるｄｉｆｆ細胞及びｕｎｄｉｆｆ細胞のｇｐ９１－ｐｈｏｘタンパク質の発現率は、それぞれ８０．２８％及び８１．７％であり、ｍｉＲ２２３群におけるｄｉｆｆ細胞及びｕｎｄｉｆｆ細胞のｇｐ９１－ｐｈｏｘタンパク質の発現率は、それぞれ７１．１７％及び５４．１７％であり、及びＣＤ６８群におけるｄｉｆｆ細胞及びｕｎｄｉｆｆ細胞のｇｐ９１－ｐｈｏｘタンパク質の発現率は、それぞれ７０．８％及び６５．９％であった。要約すると、ｍｉＲ２２３プロモーター及びＣＤ８６プロモーターは、骨髄細胞において非骨髄細胞よりも高効率で遺伝子発現を開始すること、すなわち、ｍｉＲ２２３プロモーター及びＣＤ８６プロモーターは骨髄特異性を有することがわかる。さらに、ｍｉＲ２２３プロモーターはより高い特異性を持つ。

【0081】

細胞をホルボールエステル（ＰＭＡ）によって刺激し、ジヒドロローダミン（ＤＨＲ１２３）で染色し、１４日目にフローサイトメトリーによって細胞内のＲＯＳの生成レベルを測定し、ＣＹＢＢ遺伝子の発現をさらに検証した。結果を図５に示す。ＷＴ群のＤＨＲ１２３＋％は７２．９７％、ＥＦ１α群のＤＨＲ１２３＋％は６２．９９％、ＭｉＲ２２３群のＤＨＲ１２３＋％は６２．７６％、ＣＤ６８群のＤＨＲ１２３＋％は５３．５８％であった。本開示において構築したレンチウイルスベクターは、ＣＹＢＢ遺伝子を効果的に発現させることができること、すなわち、レンチウイルスベクターは、ＣＧＤ細胞におけるＲＯＳの発生レベルを、正常野生型細胞におけるＲＯＳの発生レベルに近いレベルまで効果的に回復させることができることがわかる。

【0082】

［実施例４］
Ｘ－ＣＧＤマウスＨＳＣの分化能に対するウイルスベクターの影響を調べた。

【0083】

Ｘ－ＣＧＤマウスＨＳＣを、以下に述べる方法で形質導入した。

【0084】

（１）Ｘ－ＣＧＤマウスの脛骨から骨髄を採取し、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なＥａｓｙＳｅｐ（商標） Ｍｏｕｓｅ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて骨髄からＨＳＣを分離及び抽出した。

【0085】

（２）１×１０^６のマウスＨＳＣを、サイトカイン（Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙより入手可能な５０ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ３－Ｌ、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ６、５０ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯを含む）を含む１００μＬの培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ培地）に再懸濁し、刺激し、１７時間インキュベートした。

【0086】

（３）５０μＬの培地を廃棄し、サイトカインを含む５０μＬの新しい培地を添加して、細胞を再懸濁した。８μｇ／ｍＬのポリブレンを添加し、ウイルスベクターを添加し混合した。形質導入のＭＯＩは２００であった。細胞を１日１回、合計２回形質導入した。１００×ｇ、室温で１００分間遠心分離した。

【0087】

（４）トランスフェクション終了後、細胞を回収し、２０％ＦＢＳを含む新しいＲＰＭＩ１６４０培地に接種し、２０μｇ／ｍＬのマウス顆粒球コロニー刺激因子（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能なｍＧ－ＣＳＦサイトカイン）により分化誘導した。培地を２日ごとに交換し、細胞を１４日間培養した。

【0088】

マウスＨＳＣは、マウス顆粒球コロニー刺激因子によって骨髄細胞（食細胞及び好中球）へ分化が誘導されうる。ＣＤ１１ｂは骨髄細胞の重要なマーカーであるので、細胞の分化を決定するために、フローサイトメトリーによってＣＤ１１ｂ陽性細胞の割合を測定した。結果を図６に示す。ここでは、レンチウイルスで形質導入されず、アイソタイプ抗体で処理した細胞を陰性対照（ＩＳＯ）として用いた。

【0089】

図６からわかるように、ＷＴ群のＣＤ１１ｂ＋％は８５．８％、ｍｉＲ２２３群のＣＤ１１ｂ＋％は９７．２６％、ＣＤ６８群のＣＤ１１ｂ＋％は８３．８６％であり、本開示において構築したレンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターで形質導入された細胞の分化能に影響を与えないであろうこと、すなわち、レンチウイルスベクターは安全であることを示している。

【0090】

［実施例５］
分化後のＸ－ＣＧＤマウスＨＳＣの貪食機能に対するレンチウイルスベクターの影響を調べた。

【0091】

レンチウイルスの形質導入と分化誘導実験は、実施例４に記載したものと同じであった。完全に分化誘導させた細胞を採取し、ＰＢＳを用いて洗浄し、計数し、１：１００の細胞／エシェリキア・コリＧＦＰ＋に従って実験を行った。培地は２０％ＦＢＳを含む新しいＲＰＭＩ１６４０培地であり、細胞を合計２．５時間培養し、ＰＢＳを用いて洗浄した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）の蛍光を、フローサイトメトリーによって検査した。結果を図７に示す。

【0092】

図７からわかるように、野生型細胞（ＷＴ群）においては、ＣＤ１１ｂ＋％は８３．２７％であり、エシェリキア・コリＧＦＰ＋％は８７．０７％であり、レンチウイルスＬＶ－ｍｉＲ２２３で形質導入された細胞（ｍｉＲ２２３群）においては、ＣＤ１１ｂ＋％は８９．７６％であり、エシェリキア・コリＧＦＰ＋％は８４．５９％であり、レンチウイルスＬＶ－ＣＤ６８で形質導入された細胞（ＣＤ６８群）においては、ＣＤ１１ｂ＋％は８３．９９％であり、エシェリキア・コリＧＦＰ＋％は８２．７７％であった。この比較から、本開示において設計されたレンチウイルスがＨＳＣにトランスフェクトされた後、レンチウイルスはＨＳＣの骨髄細胞への分化及び分化した細胞の貪食機能に影響を及ぼさないことがわかる。したがって、本開示において設計されたレンチウイルスベクターは、安全であることが証明される。

【0093】

［実施例６］
Ｘ－ＣＧＤマウスにおいて、レンチウイルスベクターによる食細胞及び好中球の機能補正能力を評価した。

【0094】

１．５×１０^６のＸ－ＣＧＤマウスＨＳＣを採取し、インビトロで２００のＭＯＩでレンチウイルスＬＶ－ｍｉＲ２２３、ＬＶ－ＣＤ８６及びＬＶ－ＥＦ１αにより別々に形質導入した。Ｘ－ＣＧＤマウスＨＳＣを、実施例４と同様の方法で形質導入した。

【0095】

Ｘ－ＣＧＤマウスに４．５Ｇｙの放射線を照射することによって、骨髄破壊的移植前治療を行った。治療後４日目に、レンチウイルスで形質導入した上記細胞を、尾静脈から移植した。４週間後、ｑＰＣＲによるＶＣＮの検出、フローサイトメトリーによるＣＹＢＢ遺伝子の発現の検出を含む検出、ＤＨＲ１２３で染色した細胞におけるＲＯＳの生成レベルの測定のために、末梢血が採取された。

【0096】

図８は、ＶＣＮの結果を示す図である。図９は、ＣＹＢＢ遺伝子の発現結果を示す図である。図１０は、細胞におけるＲＯＳの生成レベルの結果を示す図である。図８は、レンチウイルスを効率的にトランスフェクトできることを示す図である。図９及び図１０からわかるように、アイソタイプ野生型Ｃ５７マウス（ＷＴ群）においては、ｇｐ９１－ｐｈｏｘ＋％は５９．３７％、ローダミン１２３＋％は６８．５９％であり、野生型Ｃ５７マウスＨＳＣが移植されたＣＧＤマウス（ＷＴ－ｔｒａｎｓ群）においては、ｇｐ９１－ｐｈｏｘ＋％は５７．１４％、ローダミン１２３＋％は６１．２６％であり、ＬＶ－ｍｉＲ２２３で形質導入したＨＳＣが移植されたＣＧＤマウス（ｍｉＲ２２３群）においては、ｇｐ９１－ｐｈｏｘ＋％は５８．９８％、ローダミン１２３＋％は５８．２９％であり、ＬＶ－ＣＤ６８で形質導入したＨＳＣが移植されたＣＧＤマウス（ＣＤ６８群）においては、ｇｐ９１－ｐｈｏｘ＋％は５８．２９％、ローダミン１２３＋％は６１．３５％であった。この比較から、本開示において設計したレンチウイルスベクターで形質導入したＨＳＣをＸ－ＣＧＤマウスに再移植した後、レンチウイルスベクターはｇｐ９１－ｐｈｏｘタンパク質の発現及びＲＯＳの生成機能を効果的に回復させることができることがわかる。したがって、本開示において設計されたレンチウイルスベクターは有効であることが証明される。

【0097】

要約すると、本開示においては、骨髄特異的プロモーター及びＣＹＢＢ遺伝子がレンチウイルス発現ベクターに挿入される。構築されたレンチウイルス発現ベクターは、高い形質導入効率、安定した発現能力、安全性及び骨髄特異性を有する。レンチウイルス発現ベクターは、骨髄細胞において効果的に発現され、ｇｐ９１－ｐｈｏｘタンパク質の発現を効果的に回復させ、ＲＯＳの生成機能を回復させることができる。このことはＣＧＤ治療にとって非常に重要である。

【0098】

本出願人は、本開示の詳細な方法が上述した実施例を通じて記載されているが、本開示は上述した詳細な方法に限定されず、このことは、本開示の実施は必ずしも上述した詳細な方法に依存しないことを意味することを宣言する。本開示に対してなされた改良、本開示の製品の原料の等価置換、本開示の製品へのアジュバント成分の添加、及び特定の方法の選択などはすべて、本開示の保護範囲及び開示範囲に含まれることは、当業者には明らかであろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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【国際調査報告】