特表 2024-514875 タンパク質発現を増強できるポリヌクレオチド及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-03

(54)【発明の名称】タンパク質発現を増強できるポリヌクレオチド及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/67 20060101AFI20240327BHJP

   C12N 15/50 20060101ALI20240327BHJP

   C12N 15/44 20060101ALI20240327BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240327BHJP

   C12N 15/88 20060101ALI20240327BHJP

   C12N 15/89 20060101ALI20240327BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240327BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240327BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240327BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240327BHJP

【ＦＩ】

C12N15/67 Z ZNA

C12N15/50

C12N15/44

C12N15/11 Z

C12N15/88 Z

C12N15/89

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023562896

(86)(22)【出願日】2022-04-15

(85)【翻訳文提出日】2023-11-09

(86)【国際出願番号】 IB2022053578

(87)【国際公開番号】W WO2022219606

(87)【国際公開日】2022-10-20

(31)【優先権主張番号】63/175,459

(32)【優先日】2021-04-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521564467

【氏名又は名称】バイオーケストラ カンパニー， リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】リュ， ジン－ヒョブ

(72)【発明者】

【氏名】リ， サン ム

(72)【発明者】

【氏名】キム， ウン ハ

(72)【発明者】

【氏名】ソン， ラク キュン

(72)【発明者】

【氏名】ミン， ヒュン ス

(72)【発明者】

【氏名】リム， ユ ナ

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA43

4B065CA44

(57)【要約】

本開示は、目的のタンパク質をコードするＯＲＦ及びＵＴＲ（例えば、５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲ）を含むポリヌクレオチドに関し、ＵＴＲは、コードされたタンパク質に対して異種であり、コードされたタンパク質の発現を、ＵＴＲを含まない対応するポリヌクレオチドと比較して増加させることができる。本開示はまた、様々な疾患及び障害を治療するためのそのようなポリヌクレオチドの使用にも関する。本開示は、コードされたタンパク質の発現増強を誘導することができる改変ポリヌクレオチド、ならびに様々な疾患及び障害を治療するためのかかるポリヌクレオチドの使用を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、（ｉ）インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の５’－非翻訳領域要素（５’－ＵＴＲ）、（ｉｉ）インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の３’－非翻訳領域要素（３’－ＵＴＲ）、または（ｉ）と（ｉｉ）の両方と、を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記ＯＲＦが、前記５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、または５’－ＵＴＲと３’－ＵＴＲの両方に対して異種であるタンパク質をコードする、前記単離ポリヌクレオチド。

【請求項2】

前記５’－ＵＴＲ及び前記３’－ＵＴＲの両方を含む、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項3】

前記５’－ＵＴＲが、配列番号１３に記載の核酸配列（ＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＡＡ）を含む、請求項１または２に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項4】

前記５’－ＵＴＲが、配列番号１３に記載の核酸配列（ＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＡＡ）からなる、請求項１～３のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項5】

前記３’－ＵＴＲが、配列番号１４に記載の核酸配列（ＣＡＴＴＡＧＧＡＴＴＴＣＡＧＡＡＧＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＡＣＡＣＣＣＴＴＧＴＴＴＣＴＡＣＴ）を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項6】

前記３’－ＵＴＲが、配列番号１４に記載の核酸配列（ＣＡＴＴＡＧＧＡＴＴＴＣＡＧＡＡＧＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＡＣＡＣＣＣＴＴＧＴＴＴＣＴＡＣＴ）からなる、請求項１～５のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項7】

前記５’－ＵＴＲ、前記３’－ＵＴＲ、または前記５’－ＵＴＲ及び前記３’－ＵＴＲの両方は、細胞にトランスフェクトされた場合、前記ＯＲＦによってコードされる前記異種タンパク質の発現を、前記５’－ＵＴＲ及び前記３’－ＵＴＲの両方を含まない参照ポリヌクレオチドをトランスフェクトした細胞における対応する発現と比較して増加させることができる、請求項１～６のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項8】

５’キャップ、ポリ（Ａ）テール、少なくとも１つの翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）、翻訳開始配列、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位またはそのシード、連結ヌクレオシドの３’テーリング領域、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、転写後制御モジュレーター、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項9】

前記５’キャップが、ｍ_２ ^{７，２’－Ｏ}Ｇｐｐ_ｓｐＧＲＮＡ、ｍ^７ＧｐｐｐＧ、ｍ^７Ｇｐｐｐｐｍ^７Ｇ、ｍ_２ ^{（７，３’－Ｏ）}ＧｐｐｐＧ、ｍ_２ ^{（７，２’－Ｏ）}ＧｐｐｓｐＧ（Ｄ１）、ｍ_２ ^{（７，２’－Ｏ）}ＧｐｐｓｐＧ（Ｄ２）、ｍ_２ ^{７，３’－Ｏ}Ｇｐｐｐ（ｍ_１ ^２’－Ｏ）ＡｐＧ、（ｍ^７Ｇ－３’ ｍｐｐｐ－Ｇ、これは、同等なものとして、３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを指定することができる）、Ｎ７，２’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン、ｍ^７Ｇｍ－ｐｐｐ－Ｇ、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－ｍ^３’－ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ、ｐＮ２ｐ、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ、７ｍＧ（５’）－ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ ｍｐ、ｍ（７）Ｇｐｐｐｍ（３）（６，６，２’）Ａｐｍ（２’）Ａｐｍ（２’）Ｃｐｍ（２）（３，２’）Ｕｐ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジド－グアノシン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項８に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項10】

連結ヌクレオシドの前記３’テーリング領域が、ポリＡテール、ポリＡ－Ｇカルテット、またはステムループ配列を含む、請求項８または９に記載の単離ナノ粒子。

【請求項11】

少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項12】

前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドが、６－アザ－シチジン、２－チオ－シチジン、α－チオ－シチジン、シュード－イソ－シチジン、５－アミノアリル－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、α－チオ－ウリジン、４－チオ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン、デオキシ－チミジン、シュード－ウリジン、イノシン、α－チオ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、Ｏ６－メチル－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、Ｎ１－メチル－アデノシン、２－アミノ－６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－２－アミノ－プリン、６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－アデノシン、α－チオ－アデノシン、８－アジド－アデノシン、７－デアザ－アデノシン、ピロロ－シチジン、５－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチル－シチジン、５－メチル－ウリジン、５－ヨード－シチジン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１１に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項13】

前記ＯＲＦによってコードされる前記異種タンパク質が、コロナウイルスタンパク質を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項14】

前記コロナウイルスタンパク質が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含む、請求項１３に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項15】

前記ＯＲＦによってコードされる前記異種タンパク質が、インフルエンザタンパク質を含む、請求項３～１２のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項16】

前記インフルエンザタンパク質が、ＨＡタンパク質、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックス１（Ｍ１）タンパク質、マトリックス２（Ｍ２）タンパク質、非構造タンパク質１（ＮＳ１）、非構造タンパク質２（ＮＳ２）、ポリメラーゼ酸性（ＰＡ）タンパク質、ポリメラーゼ塩基性１（ＰＢ１）タンパク質、ＰＢ１－Ｆ２タンパク質、ポリメラーゼ塩基性２（ＰＢ２）タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１５に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項17】

前記ＯＲＦによってコードされる前記異種タンパク質が、腫瘍抗原を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項18】

前記腫瘍抗原が、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ－ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ、例えばＭＡＧＥＡ３）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＴＡＧ－７２、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ＧＤ２、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、メソテリン、ＶＥＧＦＲ、α－葉酸受容体、ＣＥ７Ｒ、ＩＬ－３、がん－精巣抗原（例えば、ニューヨーク食道扁平上皮癌１（ＮＹ－ＥＳＯ－１））、ＭＡＲＴ－１ ｇｐ１００、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、グリピカン２、グリピカン３、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１７に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項19】

前記ＯＲＦによってコードされる前記異種タンパク質が、遺伝子疾患に関連するタンパク質を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項20】

前記遺伝性疾患が、ハンター症候群を含む、請求項１９に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項21】

５’～３’の方向に、
（ａ）配列番号１３（ＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＡＡ）に記載の核酸配列を含む、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の５’－非翻訳領域要素（５’－ＵＴＲ）と、
（ｂ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、
（ｃ）配列番号１４（ＣＡＴＴＡＧＧＡＴＴＴＣＡＧＡＡＧＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＡＣＡＣＣＣＴＴＧＴＴＴＣＴＡＣＴ）に記載の核酸配列を含む、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の３’－非翻訳領域要素（３’－ＵＴＲ）と、を含む、単離ポリヌクレオチドであって、
前記ＯＲＦが、前記５’－ＵＴＲ及び前記３’－ＵＴＲの両方に対して異種であるタンパク質をコードする、前記単離ポリヌクレオチド。

【請求項22】

請求項１～２１のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項23】

請求項１～２１のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチド、または請求項２２に記載のベクターを含む、細胞。

【請求項24】

（ｉ）請求項１～２１のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチド、請求項２２に記載のベクター、または請求項２３に記載の細胞と、（ｉｉ）薬学的に許容される賦形剤と、を含む医薬組成物。

【請求項25】

（ｉ）請求項１～２１のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチド、請求項２２に記載のベクター、または請求項２３に記載の細胞と、（ｉｉ）使用説明書と、を含むキット。

【請求項26】

疾患または障害の治療を必要とする対象の疾患または障害を治療する方法であって、請求項１～２１のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチドを前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項27】

前記疾患または障害が、ウイルス感染症、がん、遺伝子疾患、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記ウイルス感染症が、コロナウイルス感染症、インフルエンザウイルス感染症、またはその両方を含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記がんが、乳癌、頭頸部癌、子宮癌、脳腫瘍、皮膚癌、腎癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、食道癌、眼癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））癌、消化管癌、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項30】

前記遺伝性疾患が、ハンター症候群を含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項31】

免疫応答を誘導する必要のある対象に免疫応答を誘導する方法であって、請求項１～２１のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチドを前記対象に投与することを含み、前記投与の後、前記ＯＲＦによってコードされる前記異種タンパク質に対する免疫応答が前記対象内に誘導される、前記方法。

【請求項32】

タンパク質の発現を増加させる方法であって、請求項１～２１のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチドを細胞と接触させることを含む、前記方法。

【請求項33】

前記接触させることが、インビボで起こる、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記接触させることが、エクスビボで起こる、請求項３２に記載の方法。

【請求項35】

前記タンパク質の前記発現が、前記５’－ＵＴＲ及び前記３’－ＵＴＲの両方を含まない参照ポリヌクレオチドと接触させた細胞における前記タンパク質の発現と比較して、少なくとも約０．５倍、約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、２０倍、約３０倍、約４０倍、または約５０倍増加する、請求項３２～３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記単離ポリヌクレオチドが、送達剤中で送達される、請求項２６～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

前記送達剤が、ミセル、エクソソーム、リピドイド、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、細胞外小胞、合成小胞、ポリマー化合物、ペプチド、タンパク質、細胞、ナノ粒子模倣体、ナノチューブ、コンジュゲート、ウイルスベクター、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記送達剤が、
［ＷＰ］－Ｌ１－［ＣＣ］－Ｌ２－［ＡＭ］（式Ｉ）
または
［ＷＰ］－Ｌ１－［ＡＭ］－Ｌ２－［ＣＣ］（式ＩＩ）
（式中、
ＷＰは、水溶性バイオポリマー部分であり、
ＣＣは、カチオン性キャリア部分であり、
ＡＭは、アジュバント部分であり、
Ｌ１及びＬ２は、独立して任意選択のリンカーである）を含むカチオン性キャリアユニットを含む、請求項３６または３７に記載の方法。

【請求項39】

前記カチオン性キャリアユニットと前記単離ポリヌクレオチドとが、互いに混合される際に互いに結合してミセルを形成することができる、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記結合が、共有結合によるものである、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記結合が、非共有結合によるものである、請求項３９に記載の方法。

【請求項42】

前記非共有結合が、イオン結合を含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記水溶性ポリマーが、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α－ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリグリセロール、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン（「ＰＯＺ」）、ポリ（Ｎ－アクリロイルモルホリン）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３８～４２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項44】

前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリグリセロール、またはポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）を含む、請求項３８～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項45】

前記水溶性ポリマーが、下式：

【化18】

（式中、ｎは、１～１０００である）を有する、請求項３８～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

前記ｎが、少なくとも約１１０、少なくとも約１１１、少なくとも約１１２、少なくとも約１１３、少なくとも約１１４、少なくとも約１１５、少なくとも約１１６、少なくとも約１１７、少なくとも約１１８、少なくとも約１１９、少なくとも約１２０、少なくとも約１２１、少なくとも約１２２、少なくとも約１２３、少なくとも約１２４、少なくとも約１２５、少なくとも約１２６、少なくとも約１２７、少なくとも約１２８、少なくとも約１２９、少なくとも約１３０、少なくとも約１３１、少なくとも約１３２、少なくとも約１３３、少なくとも約１３４、少なくとも約１３５、少なくとも約１３６、少なくとも約１３７、少なくとも約１３８、少なくとも約１３９、少なくとも約１４０、または少なくとも約１４１である、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記ｎが、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１１０、約１１０～約１２０、約１２０～約１３０、約１４０～約１５０、またはあるいは、または約１５０～約１６０である、請求項４５に記載の方法。

【請求項48】

前記ｎが約１１４である、請求項４５～４７のいずれか１項に記載の方法。。

【請求項49】

前記水溶性ポリマーが、直鎖状、分枝鎖状、または樹枝状である、請求項３８～４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

前記カチオン性キャリア部分が、１つ以上の塩基性アミノ酸を含む、請求項３８～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

前記カチオン性キャリア部分が、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、少なくとも約２０個、少なくとも約２１個、少なくとも約２２個、少なくとも約２３個、少なくとも約２４個、少なくとも約２５個、少なくとも約２６個、少なくとも約２７個、少なくとも約２８個、少なくとも約２９個、少なくとも約３０個、少なくとも約３１個、少なくとも約３２個、少なくとも約３３個、少なくとも約３４個、少なくとも約３５個、少なくとも約３６個、少なくとも約３７個、少なくとも約３８個、少なくとも約３９個、少なくとも約４０個、少なくとも約４１個、少なくとも約４２個、少なくとも約４３個、少なくとも約４４個、少なくとも約４５個、少なくとも約４６個、少なくとも約４７個、少なくとも約４８個、少なくとも約４９個、または少なくとも約５０個の塩基性アミノ酸を含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記カチオン性キャリア部分が、約６０個、約７０個、約８０個、約９０、または約１００個の塩基性アミノ酸を含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記カチオン性キャリア部分が、約８０個の塩基性アミノ酸を含む、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記塩基性アミノ酸が、アルギニン、リシン、ヒスチジン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項５０～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

前記カチオン性キャリア部分が、約８０個のリシンモノマーを含む、請求項３８～５４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項56】

前記アジュバント部分が、免疫反応、炎症反応、及び／または組織微小環境を調節することができる、請求項３８～５５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項57】

前記アジュバント部分が、イミダゾール誘導体、アミノ酸、ビタミン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３８～５６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項58】

前記アジュバント部分が、下式：

【化19】

（式中、Ｇ１及びＧ２のそれぞれは、Ｈ、芳香環、もしくは１～１０アルキルであるか、またはＧ１とＧ２とはともに芳香環を形成し、ｎは１～１０である）を有する、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記アジュバント部分がニトロイミダゾールを含む、請求項５７に記載の方法。

【請求項60】

前記アジュバント部分が、メトロニダゾール、チニダゾール、ニモラゾール、ジメトリダゾール、プレトマニド、オルニダゾール、メガゾール、アザニダゾール、ベンズニダゾール、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項５７に記載の方法。

【請求項61】

前記アジュバント部分が、アミノ酸を含む、請求項３８～６０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項62】

前記アジュバント部分が、下式：

【化20】

（式中、Ａｒは、

【化21】

であり、
Ｚ１及びＺ２のそれぞれは、ＨまたはＯＨである）を有する、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記アジュバント部分が、ビタミンを含む、請求項３８～６２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項64】

前記ビタミンが、環式環または環式ヘテロ原子環及びカルボキシル基またはヒドロキシル基を含む、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記ビタミンが、下式：

【化22】

（式中、Ｙ１及びＹ２のそれぞれは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり、ｎは１または２である）を有する、請求項６３または６４に記載の方法。

【請求項66】

前記ビタミンが、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＭ、ビタミンＨ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項６３～６５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項67】

前記ビタミンが、ビタミンＢ３である、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記アジュバント部分が、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、または少なくとも約２０個のビタミンＢ３を含む、請求項６６または６７に記載の方法。

【請求項69】

前記アジュバント部分が、約５個のビタミンＢ３を含む、請求項６６～６８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項70】

前記送達剤が、約１２０個～約１３０個のＰＥＧユニットを有する水溶性バイオポリマー部分と、約８０個のリシンを有するポリリシンを含むカチオン性キャリア部分と、約５個のビタミンＢ３を有するアジュバント部分と、を含む、請求項６６～６９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項71】

前記送達剤が、
［ＣＣ］－Ｌ１－［ＣＭ］－Ｌ２－［ＨＭ］（図式Ｉ）、
［ＣＣ］－Ｌ１－［ＨＭ］－Ｌ２－［ＣＭ］（図式ＩＩ）、
［ＨＭ］－Ｌ１－［ＣＭ］－Ｌ２－［ＣＣ］（図式ＩＩＩ）、
［ＨＭ］－Ｌ１－［ＣＣ］－Ｌ２－［ＣＭ］（図式ＩＶ）、
［ＣＭ］－Ｌ１－［ＣＣ］－Ｌ２－［ＨＭ］（図式Ｖ）、または
［ＣＭ］－Ｌ１－［ＨＭ］－Ｌ２－［ＣＣ］（図式ＶＩ）、
（式中、
ＣＣは、正に荷電したキャリア部分であり、
ＣＭは、架橋部分であり、
ＨＭは、疎水性部分であり、
Ｌ１及びＬ２は、独立して任意選択のリンカーである）を含むカチオン性キャリアユニットであって、
ＨＭの数が、［ＣＣ］及び［ＣＭ］に対して４０％未満である、前記カチオン性キャリアユニットを含む、請求項３６または３７に記載の方法。

【請求項72】

ＨＭの前記数が、［ＣＣ］及び［ＣＭ］に対して３９％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％である、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

前記カチオン性キャリアユニットが、請求項１～２１に記載の単離ポリヌクレオチドと相互作用することができる、請求項７１または７２に記載の方法。

【請求項74】

前記カチオン性キャリア部分が、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、少なくとも約２０個、少なくとも約２１個、少なくとも約２２個、少なくとも約２３個、少なくとも約２４個、少なくとも約２５個、少なくとも約２６個、少なくとも約２７個、少なくとも約２８個、少なくとも約２９個、少なくとも約３０個、少なくとも約３１個、少なくとも約３２個、少なくとも約３３個、少なくとも約３４個、少なくとも約３５個、少なくとも約３６個、少なくとも約３７個、少なくとも約３８個、少なくとも約３９個、少なくとも約４０個、少なくとも約４１個、少なくとも約４２個、少なくとも約４３個、少なくとも約４４個、少なくとも約４５個、少なくとも約４６個、少なくとも約４７個、少なくとも約４８個、少なくとも約４９個、少なくとも約５０個、少なくとも約５１個、少なくとも約５２個、少なくとも約５３個、少なくとも約５４個、少なくとも約５５個、少なくとも約５６個、少なくとも約５７個、少なくとも約５８個、少なくとも約５９個、少なくとも約６０個、少なくとも約６１個、少なくとも約６２個、少なくとも約６３個、少なくとも約６４個、少なくとも約６５個、少なくとも約６６個、少なくとも約６７個、少なくとも約６８個、少なくとも約６９個、少なくとも約７０個、少なくとも約７１個、少なくとも約７２個、少なくとも約７３個、少なくとも約７４個、少なくとも約７５個、少なくとも約７６個、少なくとも約７７個、少なくとも約７８個、少なくとも約７９個、または少なくとも約８０個のアミノ酸を含む、請求項７１～７３に記載の方法。

【請求項75】

前記カチオン性キャリア部分が、約８０個のアミノ酸を含む、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

前記アミノ酸が、リシンを含む、請求項７５に記載の方法。

【請求項77】

前記疎水性部分が、それぞれがビタミンに連結された少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、少なくとも約２０個、少なくとも約２１個、少なくとも約２２個、少なくとも約２３個、少なくとも約２４個、少なくとも約２５個、少なくとも約２６個、少なくとも約２７個、少なくとも約２８個、少なくとも約２９個、少なくとも約３０個、少なくとも約３１個、少なくとも約３２個、少なくとも約３３個、少なくとも約３４個、または少なくとも約３５個のアミノ酸を含む、請求項７１～７６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項78】

前記疎水性部分が、約２個のビタミンＢ３、約３個のビタミンＢ３、約４個のビタミンＢ３、約５個のビタミンＢ３、約６個のビタミンＢ３、約７個のビタミンＢ３、約８個のビタミンＢ３、約９個のビタミンＢ３、約１０個のビタミンＢ３、約１１個のビタミンＢ３、約１２個のビタミンＢ３、約１３個のビタミンＢ３、約１４個のビタミンＢ３、約１５個のビタミンＢ３、約１６個のビタミンＢ３、約１７個のビタミンＢ３、約１８個のビタミンＢ３、約１９個のビタミンＢ３、約２０個のビタミンＢ３、約２１個のビタミンＢ３、約２２個のビタミンＢ３、約２３個のビタミンＢ３、約２４個のビタミンＢ３、約２５個のビタミンＢ３、約２６個のビタミンＢ３、約２７個のビタミンＢ３、約２８個のビタミンＢ３、約２９個のビタミンＢ３、約個のビタミンＢ３、約３１個のビタミンＢ３、約３２個のビタミンＢ３、約３３個のビタミンＢ３、約３４個のビタミンＢ３、または約３５個のビタミンＢ３を含む、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

前記カチオン性キャリア部分が、約３５個～約４５個のリシンを含み、前記架橋部分が約５個～約４０個のリシン－チオールを含み、前記疎水性部分が約１個～約１０個のリシン－ビタミンＢ３を含む、請求項７１～７８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項80】

前記カチオン性キャリア部分が約４０個のリシンを含み、前記架橋部分が約３５個のリシン－チオールを含み、前記疎水性部分が約５個のリシン－ビタミンＢ３を含む、請求項７９に記載の方法。

【請求項81】

前記水溶性バイオポリマー部分が、約１２０個～約１３０個のＰＥＧ単位を含む、請求項７１～８０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項82】

前記水溶性バイオポリマー部分が、約１１４個のＰＥＧ単位を含む、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

前記単離ポリヌクレオチドが、非経口投与、筋肉内投与、皮下投与、点眼、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、眼窩内投与、鼻腔内投与、脳内投与、頭蓋内投与、脳室内投与、脊髄内投与、心室内投与、髄腔内投与、大槽内投与、嚢内投与、腫瘍内投与、局所投与、またはそれらの任意の組み合わせで投与される、請求項２６～８１のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

開示の分野
本ＰＣＴ出願は、２０２１年４月１５日出願の米国仮特許出願第６３／１７５，４５９号の優先権の利益を主張するものであり、その全体を参照によって本明細書に援用するものである。

【0002】

ＥＦＳ－ＷＥＢを介して電子的に提出された配列表の参照
本出願中に提出される電子的に提出される配列表（ファイル名：４３６６＿０２８ＰＣ０１＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、サイズ：１２４，５５５バイト、作成日：２０２２年４月１５日）の内容の全体を参照によって本明細書に援用するものである。

【0003】

開示の分野
本開示は、コードされたタンパク質の発現増強を誘導することができる改変ポリヌクレオチド、ならびに様々な疾患及び障害を治療するためのかかるポリヌクレオチドの使用を提供する。

【背景技術】

【0004】

開示の背景
ワクチンは世界の健康に多大な影響を与えている。例えば、天然痘は根絶され、ポリオもほぼ撲滅されている。それにもかかわらず、最近のコロナウイルスのパンデミックが証明しているように、まだ封じ込めに成功していないヒトの病原体が数多く存在している。さらに、従来のワクチン接種戦略には一般に、「生」（弱毒化）ワクチンまたは「死滅」ワクチンの投与が含まれる。このようなワクチンは、しばしば、望ましくない副作用及びリスク（例えば、弱毒化生ワクチンは病原体に戻る可能性がある）を伴うか、有効性が限られている。
より最近では、ワクチンプラットフォーム（例えば、ＤＮＡワクチン及びｍＲＮＡワクチン）としてのポリヌクレオチドの使用に大きな関心が集まっている。従来のワクチンと比較して、ポリヌクレオチドベースのワクチンは一般に安全で製造が容易であり、広範囲の免疫反応を誘導することができる。しかしながら、一般にそのようなワクチンの有効性は、特にヒトにおいては限定的である（Ｈｏｂｅｒｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ １９（１１）：３６０５（Ｎｏｖ．２０１８）を参照）。その結果、現在に至るまで、ヒトでの使用が承認されたＤＮＡワクチンは存在していない。そして、ようやく最近のパンデミックのために、３つのコロナウイルス特異的ｍＲＮＡワクチンが承認された。したがって、ヒトに使用するためのより大きな効力を有する新たなポリヌクレオチドベースのワクチンが依然求められている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｈｏｂｅｒｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ １９（１１）：３６０５（Ｎｏｖ．２０１８）

【発明の概要】

【0006】

本明細書では、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、及び（ｉ）インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の５’－非翻訳領域要素（５’－ＵＴＲ）、（ｉｉ）インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の３’－非翻訳領域要素（３’－ＵＴＲ）、または（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む単離ポリヌクレオチドであって、ＯＲＦが、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、または５’－ＵＴＲと３’－ＵＴＲの両方に対して異種であるタンパク質をコードする、単離ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様では、単離ポリヌクレオチドは、５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲの両方を含む。

【0007】

いくつかの態様では、５’－ＵＴＲは、配列番号１３に記載の核酸配列（ＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＡＡ）を含む。いくつかの態様では、５’－ＵＴＲは、配列番号１３（ＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＡＡ）に記載の核酸配列からなる。いくつかの態様では、３’－ＵＴＲは、配列番号１４（ＣＡＴＴＡＧＧＡＴＴＴＣＡＧＡＡＧＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＡＣＡＣＣＣＴＴＧＴＴＴＣＴＡＣＴ）に記載の核酸配列を含む。いくつかの態様では、３’－ＵＴＲは、配列番号１４（ＣＡＴＴＡＧＧＡＴＴＴＣＡＧＡＡＧＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＡＣＡＣＣＣＴＴＧＴＴＴＣＴＡＣＴ）に記載の核酸配列からなる。

【0008】

いくつかの態様では、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、または５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲの両方は、細胞にトランスフェクトされた場合、ＯＲＦによってコードされる異種タンパク質の発現を、５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲの両方を含まない参照ポリヌクレオチドをトランスフェクトした細胞における対応する発現と比較して増加させることができる。

【0009】

いくつかの態様では、本開示の単離ポリヌクレオチドは、５’キャップ、ポリ（Ａ）テール、少なくとも１つの翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）、翻訳開始配列、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位またはそのシード、連結ヌクレオシドの３’テーリング領域、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、転写後制御モジュレーター、またはそれらの組み合わせをさらに含む。

【0010】

いくつかの態様では、５’キャップは、ｍ_２ ^{７，２’－Ｏ}Ｇｐｐ_ｓｐＧＲＮＡ、ｍ^７ＧｐｐｐＧ、ｍ^７Ｇｐｐｐｐｍ^７Ｇ、ｍ_２ ^{（７，３’－Ｏ）}ＧｐｐｐＧ、ｍ_２ ^{（７，２’－Ｏ）}ＧｐｐｓｐＧ（Ｄ１）、ｍ_２ ^{（７，２’－Ｏ）}ＧｐｐｓｐＧ（Ｄ２）、ｍ_２ ^{７，３’－Ｏ}Ｇｐｐｐ（ｍ_１ ^２’－Ｏ）ＡｐＧ、（ｍ^７Ｇ－３’ ｍｐｐｐ－Ｇ、これは、同等なものとして、３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを指定することができる）、Ｎ７，２’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン、ｍ^７Ｇｍ－ｐｐｐ－Ｇ、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－ｍ^３’－ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ、ｐＮ２ｐ、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ、７ｍＧ（５’）－ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ、ｍ（７）Ｇｐｐｐｍ（３）（６，６，２’）Ａｐｍ（２’）Ａｐｍ（２’）Ｃｐｍ（２）（３，２’）Ｕｐ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジド－グアノシン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、連結ヌクレオシドの３’テーリング領域は、ポリＡテール、ポリＡ－Ｇカルテット、またはステムループ配列を含む。

【0011】

いくつかの態様では、本開示の単離ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドを含む。特定の態様では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドは、６－アザ－シチジン、２－チオ－シチジン、α－チオ－シチジン、シュード－イソ－シチジン、５－アミノアリル－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、α－チオ－ウリジン、４－チオ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン、デオキシ－チミジン、シュード－ウリジン、イノシン、α－チオ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、Ｏ６－メチル－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、Ｎ１－メチルアデノシン、２－アミノ－６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－２－アミノ－プリン、６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－アデノシン、α－チオ－アデノシン、８－アジド－アデノシン、７－デアザ－アデノシン、ピロロ－シチジン、５－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチル－シチジン、５－メチル－ウリジン、５－ヨード－シチジン、またはそれらの組み合わせを含む。

【0012】

いくつかの態様では、本明細書に記載の単離ポリヌクレオチドのＯＲＦによってコードされる異種タンパク質は、コロナウイルスタンパク質を含む。いくつかの態様では、コロナウイルスタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含む。

【0013】

いくつかの態様では、本明細書に記載の単離ポリヌクレオチドのＯＲＦによってコードされる異種タンパク質は、インフルエンザタンパク質を含む。特定の態様では、インフルエンザタンパク質は、ＨＡタンパク質、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックス１（Ｍ１）タンパク質、マトリックス２（Ｍ２）タンパク質、非構造タンパク質１（ＮＳ１）、非構造タンパク質２（ＮＳ２）、ポリメラーゼ酸性（ＰＡ）タンパク質、ポリメラーゼ塩基性１（ＰＢ１）タンパク質、ＰＢ１－Ｆ２タンパク質、ポリメラーゼ塩基性２（ＰＢ２）タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0014】

いくつかの態様では、ＯＲＦによってコードされる異種タンパク質は腫瘍抗原を含む。いくつかの態様では、腫瘍抗原は、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ－ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ、例えばＭＡＧＥＡ３）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＴＡＧ－７２、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ＧＤ２、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、メソテリン、ＶＥＧＦＲ、α－葉酸受容体、ＣＥ７Ｒ、ＩＬ－３、がん－精巣抗原（例えば、ニューヨーク食道扁平上皮癌１（ＮＹ－ＥＳＯ－１））、ＭＡＲＴ－１ ｇｐ１００、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、グリピカン２、グリピカン３、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド、またはこれらの組み合わせを含む。

【0015】

いくつかの態様では、本明細書に記載の単離ポリヌクレオチドのＯＲＦによってコードされる異種タンパク質は、遺伝子疾患に関連したタンパク質を含む。特定の態様では、遺伝子疾患はハンター症候群を含む。

【0016】

また、本明細書では、単離ポリヌクレオチドであって、５’～３’の方向に、（ａ）配列番号１３（ＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＡＡ）に記載の核酸配列を含む、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の５’非翻訳領域要素（５’－ＵＴＲ）、（ｂ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、及び（ｃ）配列番号１４（ＣＡＴＴＡＧＧＡＴＴＴＣＡＧＡＡＧＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＡＣＡＣＣＣＴＴＧＴＴＴＣＴＡＣＴ）に記載の核酸配列を含む、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の３’非翻訳領域要素（３’－ＵＴＲ）を含み、ＯＲＦが５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲの両方に対して異種であるタンパク質をコードする、単離ポリヌクレオチドも提供される。

【0017】

本開示は、本明細書に記載の単離ポリヌクレオチドのいずれかを含むベクターをさらに提供する。本明細書では、本明細書に記載の単離ポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかを含む細胞も提供される。

【0018】

本明細書では、（ｉ）本明細書に記載の単離ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞のいずれかと、（ｉｉ）薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物が提供される。本明細書では、（ｉ）本明細書に記載される単離ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞のいずれかと、（ｉｉ）使用説明書と、を含むキットも提供される。

【0019】

本明細書ではまた、疾患または障害の治療を必要とする対象の疾患または障害を治療する方法であって、本明細書に記載の単離ポリヌクレオチドのいずれかを対象に投与することを含む、方法も提供される。いくつかの態様では、治療可能な疾患または障害には、ウイルス感染症、がん、遺伝子疾患、またはそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの態様では、ウイルス感染症は、コロナウイルス感染症、インフルエンザウイルス感染症、またはその両方を含む。いくつかの態様では、がんは、乳癌、頭頸部癌、子宮癌、脳腫瘍、皮膚癌、腎癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、食道癌、眼癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））癌、消化管癌、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、またはそれらの組み合わせを含む。特定の態様では、遺伝子疾患はハンター症候群を含む。

【0020】

また、本明細書では、タンパク質の発現を増加させる方法であって、細胞を本開示の単離ポリヌクレオチドのいずれかと接触させることを含む方法も提供される。いくつかの態様では、接触させることは、インビボで行われる。いくつかの態様では、接触させることは、エクスビボで行われる。いくつかの態様では、タンパク質の発現は、５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲの両方を含まない参照ポリヌクレオチドと接触させた細胞におけるタンパク質の発現と比較して、少なくとも約０．５倍、約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、または約５０倍増加する。

【0021】

いくつかの態様では、本明細書で提供される単離ポリヌクレオチドは、例えば送達剤中で対象に送達される。特定の態様では、送達剤は、ミセル、エクソソーム、リピドイド、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、細胞外小胞、合成小胞、ポリマー化合物、ペプチド、タンパク質、細胞、ナノ粒子模倣体、ナノチューブ、コンジュゲート、ウイルスベクター、またはそれらの組み合わせを含む。

【0022】

いくつかの態様では、送達剤は、下式：
［ＷＰ］－Ｌ１－［ＣＣ］－Ｌ２－［ＡＭ］（式Ｉ）
または
［ＷＰ］－Ｌ１－［ＡＭ］－Ｌ２－［ＣＣ］（式ＩＩ）
（式中、
ＷＰは、水溶性バイオポリマー部分であり、
ＣＣは、カチオン性キャリア部分であり、
ＡＭは、アジュバント部分であり、
Ｌ１及びＬ２は、独立して任意選択のリンカーである）を含むカチオン性キャリアユニットを含む。

【0023】

いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットと単離ポリヌクレオチドとは、互いに混合される際に互いに結合してミセルを形成することができる。いくつかの態様では、結合は、共有結合を介する。他の態様では、結合は、非共有結合を介する。いくつかの態様では、非共有結合はイオン結合を含む。

【0024】

いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットの水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α－ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリグリセロール、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン（「ＰＯＺ」）、ポリ（Ｎ－アクリロイルモルホリン）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリグリセロール、またはポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）を含む。

【0025】

いくつかの態様では、水溶性ポリマーは、下式：

【化1】

（式中、ｎは、１～１０００である）を有する。

【0026】

いくつかの態様では、ｎは、少なくとも約１１０、少なくとも約１１１、少なくとも約１１２、少なくとも約１１３、少なくとも約１１４、少なくとも約１１５、少なくとも約１１６、少なくとも約１１７、少なくとも約１１８、少なくとも約１１９、少なくとも約１２０、少なくとも約１２１、少なくとも約１２２、少なくとも約１２３、少なくとも約１２４、少なくとも約１２５、少なくとも約１２６、少なくとも約１２７、少なくとも約１２８、少なくとも約１２９、少なくとも約１３０、少なくとも約１３１、少なくとも約１３２、少なくとも約１３３、少なくとも約１３４、少なくとも約１３５、少なくとも約１３６、少なくとも約１３７、少なくとも約１３８、少なくとも約１３９、少なくとも約１４０、または少なくとも約１４１である。特定の態様では、ｎは、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１１０、約１１０～約１２０、約１２０～約１３０、約１４０～約１５０、または約１５０～約１６０である。いくつかの態様では、ｎは約１１４である。

【0027】

いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットの水溶性ポリマーは、直鎖状、分枝鎖状、または樹枝状である。

【0028】

いくつかの態様では、カチオン性キャリア部分は、１つ以上の塩基性アミノ酸を含む。いくつかの態様では、カチオン性キャリア部分は、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、少なくとも約２０個、少なくとも約２１個、少なくとも約２２個、少なくとも約２３個、少なくとも約２４個、少なくとも約２５個、少なくとも約２６個、少なくとも約２７個、少なくとも約２８個、少なくとも約２９個、少なくとも約３０個、少なくとも約３１個、少なくとも約３２個、少なくとも約３３個、少なくとも約３４個、少なくとも約３５個、少なくとも約３６個、少なくとも約３７個、少なくとも約３８個、少なくとも約３９個、少なくとも約４０個、少なくとも約４１個、少なくとも約４２個、少なくとも約４３個、少なくとも約４４個、少なくとも約４５個、少なくとも約４６個、少なくとも約４７個、少なくとも約４８個、少なくとも約４９個、または少なくとも約５０個の塩基性アミノ酸を含む。いくつかの態様では、カチオン性キャリア部分は、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、または約１００個の塩基性アミノ酸を含む。いくつかの態様では、カチオン性キャリア部分は、約８０個の塩基性アミノ酸を含む。

【0029】

いくつかの態様では、塩基性アミノ酸は、アルギニン、リシン、ヒスチジン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、カチオン性キャリア部分は、約８０個のリシンモノマーを含む。

【0030】

いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットのアジュバント部分は、免疫反応、炎症反応、及び／または組織微小環境を調節することができる。いくつかの態様では、アジュバント部分は、イミダゾール誘導体、アミノ酸、ビタミン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、アジュバント部分は、下式：

【化2】

（式中、Ｇ１及びＧ２のそれぞれは、Ｈ、芳香環、もしくは１～１０アルキルであるか、またはＧ１とＧ２はともに芳香環を形成し、ｎは１～１０である）を有する。

【0031】

いくつかの態様では、アジュバント部分は、ニトロイミダゾールを含む。いくつかの態様では、アジュバント部分は、メトロニダゾール、チニダゾール、ニモラゾール、ジメトリダゾール、プレトマニド、オルニダゾール、メガゾール、アザニダゾール、ベンズニダゾール、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0032】

いくつかの態様では、アジュバント部分は、アミノ酸を含む。いくつかの態様では、アジュバント部分は、下式：

【化3】

（式中、Ａｒは、

【化4】

であり、
Ｚ１及びＺ２のそれぞれは、ＨまたはＯＨである）を有する。

【0033】

いくつかの態様では、アジュバント部分は、ビタミンを含む。いくつかの態様では、ビタミンは、環式環または環式ヘテロ原子環及びカルボキシル基またはヒドロキシル基を含む。いくつかの態様では、ビタミンは、下式：

【化5】

（式中、Ｙ１及びＹ２のそれぞれは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり、ｎは１または２である）を有する。

【0034】

いくつかの態様では、ビタミンは、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＭ、ビタミンＨ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。

【0035】

いくつかの態様では、ビタミンは、ビタミンＢ３である。いくつかの態様では、アジュバント部分は、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個、少なくとも約４０個、少なくとも約４５個、または少なくとも約５０個のビタミンＢ３を含む。いくつかの態様では、アジュバント部分は、約３５個のビタミンＢ３を含む。

【0036】

いくつかの態様では、送達剤は、約１２０個～約１３０個のＰＥＧユニットを有する水溶性バイオポリマー部分と、約８０個のリシンを有するポリリシンを含むカチオン性キャリア部分と、約３５個のビタミンＢ３を有するアジュバント部分と、を含む。

【0037】

いくつかの態様では、送達剤は、下式：
［ＣＣ］－Ｌ１－［ＣＭ］－Ｌ２－［ＨＭ］（図式Ｉ）、
［ＣＣ］－Ｌ１－［ＨＭ］－Ｌ２－［ＣＭ］（図式ＩＩ）、
［ＨＭ］－Ｌ１－［ＣＭ］－Ｌ２－［ＣＣ］（図式ＩＩＩ）、
［ＨＭ］－Ｌ１－［ＣＣ］－Ｌ２－［ＣＭ］（図式ＩＶ）、
［ＣＭ］－Ｌ１－［ＣＣ］－Ｌ２－［ＨＭ］（図式Ｖ）、または
［ＣＭ］－Ｌ１－［ＨＭ］－Ｌ２－［ＣＣ］（図式ＶＩ）、
（式中、
ＣＣは、正に荷電したキャリア部分であり、
ＣＭは、架橋部分であり、
ＨＭは、疎水性部分であり、
Ｌ１及びＬ２は、独立して任意選択のリンカーである）を含むカチオン性キャリアユニットであって、
ＨＭの数が、［ＣＣ］及び［ＣＭ］に対して４０％未満である、カチオン性キャリアユニットを含む。

【0038】

いくつかの態様では、ＨＭの数は、［ＣＣ］及び［ＣＭ］に対して３９％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％である。いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットは、本明細書に記載の単離ポリヌクレオチドのいずれかと相互作用することができる。

【0039】

いくつかの態様では、カチオン性キャリア部分は、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、少なくとも約２０個、少なくとも約２１個、少なくとも約２２個、少なくとも約２３個、少なくとも約２４個、少なくとも約２５個、少なくとも約２６個、少なくとも約２７個、少なくとも約２８個、少なくとも約２９個、少なくとも約３０個、少なくとも約３１個、少なくとも約３２個、少なくとも約３３個、少なくとも約３４個、少なくとも約３５個、少なくとも約３６個、少なくとも約３７個、少なくとも約３８個、少なくとも約３９個、少なくとも約４０個、少なくとも約４１個、少なくとも約４２個、少なくとも約４３個、少なくとも約４４個、少なくとも約４５個、少なくとも約４６個、少なくとも約４７個、少なくとも約４８個、少なくとも約４９個、少なくとも約５０個、少なくとも約５１個、少なくとも約５２個、少なくとも約５３個、少なくとも約５４個、少なくとも約５５個、少なくとも約５６個、少なくとも約５７個、少なくとも約５８個、少なくとも約５９個、少なくとも約６０個、少なくとも約６１個、少なくとも約６２個、少なくとも約６３個、少なくとも約６４個、少なくとも約６５個、少なくとも約６６個、少なくとも約６７個、少なくとも約６８個、少なくとも約６９個、少なくとも約７０個、少なくとも約７１個、少なくとも約７２個、少なくとも約７３個、少なくとも約７４個、少なくとも約７５個、少なくとも約７６個、少なくとも約７７個、少なくとも約７８個、少なくとも約７９個、または少なくとも約８０個のアミノ酸を含む。いくつかの態様では、カチオン性キャリア部分は、８０個のアミノ酸を含む。

【0040】

いくつかの態様では、アミノ酸はリシンを含む。

【0041】

いくつかの態様では、疎水性部分は、それぞれがビタミンに連結された少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、少なくとも約２０個、少なくとも約２１個、少なくとも約２２個、少なくとも約２３個、少なくとも約２４個、少なくとも約２５個、少なくとも約２６個、少なくとも約２７個、少なくとも約２８個、少なくとも約２９個、少なくとも約３０個、少なくとも約３１個、または少なくとも約３２個のアミノ酸を含む。いくつかの態様では、疎水性部分は、約２個のビタミンＢ３、約３個のビタミンＢ３、約４個のビタミンＢ３、約５個のビタミンＢ３、約６個のビタミンＢ３、約７個のビタミンＢ３、約８個のビタミンＢ３、約９個のビタミンＢ３、約１０個のビタミンＢ３、約１１個のビタミンＢ３、約１２個のビタミンＢ３、約１３個のビタミンＢ３、約１４個のビタミンＢ３、約１５個のビタミンＢ３、約１６個のビタミンＢ３、約１７個のビタミンＢ３、約１８個のビタミンＢ３、約１９個のビタミンＢ３、約２０個のビタミンＢ３、約２１個のビタミンＢ３、約２２個のビタミンＢ３、約２３個のビタミンＢ３、約２４個のビタミンＢ３、約２５個のビタミンＢ３、約２６個のビタミンＢ３、約２７個のビタミンＢ３、約２８個のビタミンＢ３、約２９個のビタミンＢ３、約個のビタミンＢ３、約３１個のビタミンＢ３、約３２個のビタミンＢ３、約３３個のビタミンＢ３、約３４個のビタミンＢ３、または約３５個のビタミンＢ３を含む。

【0042】

いくつかの態様では、本明細書に記載の送達剤のカチオン性キャリアユニットは約３５個～約４５個のリシンを含み、架橋部分は約５個～約４０個のリシン－チオールを含み、疎水性部分は約１個～約５０個のリシン－ビタミンＢ３を含む。特定の態様では、カチオン性キャリア部分は約４０個のリシンを含み、架橋部分は約５個のリシン－チオールを含み、疎水性部分は約３５個のリシン－ビタミンＢ３を含む。いくつかの態様では、水溶性バイオポリマー部分は、約１１４個のＰＥＧ単位を含む。

【0043】

いくつかの態様では、本明細書に記載の単離ポリヌクレオチドのいずれかは、例えば、非経口投与、筋肉内投与、皮下投与、点眼、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、眼窩内投与、鼻腔内投与、脳内投与、頭蓋内投与、脳室内投与、脊髄内投与、心室内投与、髄腔内投与、大槽内投与、嚢内投与、腫瘍内投与、局所投与、またはそれらの任意の組み合わせで対象に投与される。

【図面の簡単な説明】

【0044】

【図1】本明細書に記載される例示的なポリヌクレオチドの概略図を示す。図に示されるように、ポリヌクレオチドは（５’～３’の方向に）、（ｉ）５’－キャップ、（ｉｉ）ＨＡ－５’－ＵＴＲ（配列番号１３）、（ｉｉｉ）目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（「抗原－ＣＤＳ」）、（ｉｖ）ＨＡ－３’－ＵＴＲ（配列番号１４）、及び（ｖ）３’－ポリ（Ａ）テールを含む。

【0045】

【図2】（ｉ）本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）を含むＨＡコードポリヌクレオチド（右のパネル）（「改変ｍＲＮＡ」）、または（ｉｉ）ＵＴＲを欠く対応するポリヌクレオチド（中央のパネル）（「コントロールｍＲＮＡ」）のいずれかをトランスフェクトした細胞におけるインフルエンザＨＡタンパク質発現（免疫蛍光アッセイを使用して測定した）の比較を示す。非トランスフェクト細胞をコントロールとして用いた（左のパネル）。

【0046】

【図3】（ｉ）本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）を含むＨＡコードポリヌクレオチド（最後の列）（「改変ｍＲＮＡ」）、または（ｉｉ）ＵＴＲを欠く対応するポリヌクレオチド（中央の列）（「コントロールｍＲＮＡ」）のいずれかをトランスフェクトした細胞におけるインフルエンザＨＡタンパク質発現（ウエスタンブロットを使用して測定した）の比較を示す。非トランスフェクト細胞をコントロール（「モック」）として用いた（最初の列）。ＨＡタンパク質の発現は、トランスフェクション後６時間及び２４時間の両方で測定した。

【0047】

【図4】（ｉ）本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）を含むＧＦＰコードポリヌクレオチド（中央の列）（「改変ｍＲＮＡ」）、または（ｉｉ）ＵＴＲを欠く対応するポリヌクレオチド（最後の列）（「コントロールｍＲＮＡ」）のいずれかをトランスフェクトした細胞におけるＧＦＰ発現（免疫蛍光顕微鏡法を使用して測定した）の比較を示す。非トランスフェクト細胞をコントロール（「モック」）として用いた（最初の列）。ＧＦＰ発現は、トランスフェクション後６時間（上の段）、１２時間（中央の段）、及び２４時間（下の段）に測定した。

【0048】

【図5】（ｉ）本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）を含むＧＦＰコードポリヌクレオチド（最後の列）（「改変ｍＲＮＡ」）、または（ｉｉ）ＵＴＲを欠く対応するポリヌクレオチド（中央の列）（「コントロールｍＲＮＡ」）のいずれかをトランスフェクトした細胞におけるＧＦＰ発現（ウエスタンブロットを使用して測定した）の比較を示す。非トランスフェクト細胞をコントロール（「モック」）として用いた（最初の列）。１μｇまたは３μｇの２つの異なる濃度のポリヌクレオチドを細胞にトランスフェクトした。

【0049】

【図6】（ｉ）本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）を含むＧＦＰコードポリヌクレオチド（右のパネル）（「改変ｍＲＮＡ」）、または（ｉｉ）ＵＴＲを欠く対応するポリヌクレオチド（中央のパネル）（「コントロールｍＲＮＡ」）のいずれかをトランスフェクトした細胞におけるＧＦＰ発現の平均蛍光強度（フローサイトメーターを使用して測定した）の比較を示す。非トランスフェクト細胞をコントロール（「モック」）として用いた（左のパネル）。

【0050】

【図7】（ｉ）本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）を含むｌｕｃコードポリヌクレオチド（最後の列）（「改変ｍＲＮＡ」）、または（ｉｉ）ＵＴＲを欠く対応するポリヌクレオチド（中央の列）（「コントロールｍＲＮＡ」）のいずれかをトランスフェクトした細胞におけるルシフェラーゼ（ｌｕｃ）発現（ＩＶＩＳイメージングを使用して測定した）の比較を示す。非トランスフェクト細胞をコントロール（「モック」）として用いた（最初の列）。１μｇ（上の段）または３μｇ（下の段）の２つの異なる濃度のポリヌクレオチドを細胞にトランスフェクトした。

【0051】

【図8】（ｉ）本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）を含むｌｕｃコードポリヌクレオチド（最後の列）（「改変ｍＲＮＡ」）、または（ｉｉ）ＵＴＲを欠く対応するポリヌクレオチド（中央の列）（「コントロールｍＲＮＡ」）のいずれかをトランスフェクトした細胞におけるルシフェラーゼ（ｌｕｃ）発現（ウエスタンブロットを使用して測定した）の比較を示す。非トランスフェクト細胞をコントロール（「モック」）として用いた（最初の列）。Ｌｕｃ発現は、トランスフェクション後６時間及び２４時間に測定した。

【0052】

【図9】（ｉ）本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）を含むｌｕｃコードポリヌクレオチド（「３」）、または（ｉｉ）ＵＴＲを欠く対応するポリヌクレオチド（「２」）のいずれかを投与したマウスにおけるルシフェラーゼ（ｌｕｃ）発現の比較を示す。非処理動物をコントロールとして用いた（「１」）。各段は、異なる視点から撮影したマウスの画像を表す。Ｌｕｃ発現は、投与の６時間、１日、２日、３日、４日、５日、及び６日後に測定した。

【0053】

【図10】（ｉ）本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）を含むＧＦＰコードポリヌクレオチド（「改変ｍＲＮＡ」）、または（ｉｉ）実施例６に記載のコントロールＵＴＲ配列を含む対応するポリヌクレオチド（「コントロール－ＵＴＲ－ｍＲＮＡ」）のいずれかをトランスフェクトした細胞におけるＧＦＰ発現（免疫蛍光顕微鏡法を使用して測定した）の比較を示す。０．５μｇ、１μｇ、及び３μｇの３つの異なる濃度のポリヌクレオチドを細胞にトランスフェクトした。非トランスフェクト細胞をコントロール（「モック」）として用いた。ＧＦＰ発現は、トランスフェクション後６時間（上の段）、１２時間（中央の段）、及び２４時間（下の段）に測定した。

【0054】

【図11】（ｉ）本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）を含むＧＦＰコードポリヌクレオチド（「改変ｍＲＮＡ」）、または（ｉｉ）実施例６に記載のコントロールＵＴＲ配列を含む対応するポリヌクレオチド（「コントロール－ＵＴＲ－ｍＲＮＡ」）のいずれかをトランスフェクトした細胞におけるＧＦＰ発現（ウエスタンブロットを使用して測定した）の比較を示す。０．５μｇ、１μｇ、及び３μｇの３つの異なる濃度のポリヌクレオチドを細胞にトランスフェクトした。非トランスフェクト細胞をコントロール（「モック」）として用いた。ＧＦＰ発現は、トランスフェクション後６時間（上の段）、１２時間（中央の段）、及び２４時間（下の段）に測定した。

【0055】

【図12】（ｉ）本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）を含むＳタンパク質コードポリヌクレオチド（「改変ｍＲＮＡ」）、または（ｉｉ）ＵＴＲを欠く対応するポリヌクレオチド（「コントロールｍＲＮＡ」）のいずれかをトランスフェクトした細胞におけるコロナウイルスＳタンパク質の発現（ウエスタンブロットを使用して測定した）の比較を示す。非トランスフェクト細胞をコントロール（「モック」）として用いた。Ｓタンパク質の発現は、トランスフェクション後６時間及び２４時間で測定した。

【0056】

【図13】以下の処理、すなわち、（ｉ）非処理（「モック」）、（ｉｉ）ヌクレアーゼフリー水のみ（「ＮＦＷ」）、または（ｉｉｉ）インフルエンザＨＡタンパク質をコードし、本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）を含むポリヌクレオチド（「ｍＨＡ」）のうちの１つを投与し、その後インフルエンザ感染によりチャレンジした動物の体重（Ａ）及び生存率（Ｂ）をそれぞれ示す。

【0057】

【図14】本開示のキャリアユニット及びミセルの例示的な構造を示す。例示的なキャリアユニットは、任意選択の組織特異的標的化部分、水溶性ポリマー、及びカチオン性キャリアユニット（それぞれアニオン性ペイロードと相互作用することができる）を含む（Ａ）。いくつかの態様では、カチオン性キャリアとアニオン性ペイロードとは繋留されておらず、静電的に相互作用する。Ｂは、アニオン性ペイロードの模式図を示す。いくつかの態様では、カチオン性キャリアとアニオン性ペイロードとは繋留されており、静電的に相互作用する。Ｃは、Ａ及びＢのカチオン性キャリアとアニオン性ペイロードを含むミセルの概略図を示す。

【0058】

【図15】Ａ～Ｅは、カチオン性キャリアユニットの例示的な組成を示す。Ａは、標的化部分と、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）と、８０個のリシン残基を含むカチオン性キャリアユニットとを含むキャリアユニットを示し、ただし、６４個のリシン残基は修飾されておらず（例えば、正に荷電した－ＮＨ３＋を含む）、１６個のリシン残基は架橋のために修飾されている（例えば、チオール、アルキルチオール、またはリシン－チオールに連結されている）。Ｂは、標的化部分と、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）と、８０個のリシン残基を含むカチオン性キャリアユニットとを含むキャリアユニットを示し、ただし、４０個のリシン残基は修飾されておらず（例えば、正に荷電したアミン基、例えば、－ＮＨ３＋を含む）、３５個のリシン残基は架橋のために修飾されており（例えば、チオール、アルキルチオール、またはリシン－チオールに連結されている）、５個のリシン残基は疎水性部分（例えば、ビタミン）を含むように修飾されている。Ｃは、標的化部分と、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）と、８０個のリシン残基を含むカチオン性キャリアユニットとを含むキャリアユニットを示し、ただし、３８個のリシン残基は修飾されておらず（例えば、正に荷電したアミン基、例えば、－ＮＨ３＋を含む）、２３個のリシン残基は架橋のために修飾されており（例えば、チオール、アルキルチオール、またはリシン－チオールに連結されている）、１９個のリシン残基は疎水性部分（例えば、ビタミン）を含むように修飾されている。Ｄは、標的化部分と、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）と、８０個のリシン残基を含むカチオン性キャリアユニットとを含むキャリアユニットを示し、ただし、３２個のリシン残基は修飾されておらず（例えば、正に荷電したアミン基、例えば、－ＮＨ３＋を含む）、１６個のリシン残基は架橋のために修飾されており（例えば、チオール、アルキルチオール、またはリシン－チオールに連結されている）、３２個のリシン残基は疎水性部分（例えば、ビタミン）を含むように修飾されている。Ｅは、標的化部分と、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）と、８０個のリシン残基を含むカチオン性キャリアユニットとを含むキャリアユニットを示し、ただし、６３個のリシン残基は修飾されておらず（例えば、正に荷電したアミン基、例えば、ＮＨ３＋を含む）、１７個のリシン残基は疎水性部分（例えば、ビタミン）を含むように修飾されている。

【0059】

【図16】Ａ及びＢは、（ｉ）本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）を含むＧＦＰコードポリヌクレオチド（「ＨＡ－ＵＴＲ－ＥＧＦＰ」）、または（ｉｉ）実施例９に記載のヒトβグロビン（ｈＢｇ）のＵＴＲ配列を含む対応するポリヌクレオチド（「ｈＢｇ－ＵＴＲ－ＥＧＦＰ」）のいずれかをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現（蛍光顕微鏡法を使用して測定した）の比較を示す。非トランスフェクト細胞をコントロール（「モック」）として用いた。Ａは、トランスフェクション後６時間（「６ｈｐｔ」、上のパネル）及び２４時間（「２４ｈｐｔ」、下のパネル）のタンパク質発現を示す。Ｂは、トランスフェクション後４８時間（「４８ｈｐｔ」、上のパネル）及び７２時間（「７２ｈｐｔ」、下のパネル）のタンパク質発現を示す。スケールバー＝２５０μｍ。

【0060】

【図17】（ｉ）本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）を含むＧＦＰコードポリヌクレオチド（「ＨＡ－ＵＴＲ－ＥＧＦＰ」）、または（ｉｉ）実施例９に記載のヒトβグロビン（ｈＢｇ）のＵＴＲ配列を含む対応するポリヌクレオチド（「ｈＢｇ－ＵＴＲ－ＥＧＦＰ」）のいずれかをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現（ウエスタンブロットを使用して測定した）の比較を示す。非トランスフェクト細胞をコントロール（「モック」）として用いた。タンパク質発現は、トランスフェクション後６時間（「６ｈｐｔ」）、２４時間（「２４ｈｐｔ」）、４８時間（「４８ｈｐｔ」）、及び７２時間（「７２ｈｐｔ」）に測定した。β－アクチンの発現を内部コントロールとして示している。

【0061】

【図18】（ｉ）本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）を含むＧＦＰコードポリヌクレオチド（「ＨＡ－ＵＴＲ－ＥＧＦＰ」）、または（ｉｉ）実施例９に記載のヒトβグロビン（ｈＢｇ）のＵＴＲ配列を含む対応するポリヌクレオチド（「ｈＢｇ－ＵＴＲ－ＥＧＦＰ」）のいずれかをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）（フローサイトメトリーを使用して測定した）の比較を示す。非トランスフェクト細胞をコントロール（「モック」）として用いた。示されたＧＦＰのＭＦＩ値は、各群のＧＦＰ発現の正のゲート値に対応する。統計分析は、スチューデントのｔ検定（対応のない両側、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）を使用して行った。

【0062】

【図19】（ｉ）本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）を含むルシフェラーゼコードポリヌクレオチド（「ＨＡ－ＵＴＲ－Ｆｌｕｃ」）、または（ｉｉ）実施例９に記載のヒトβグロビン（ｈＢｇ）のＵＴＲ配列を含む対応するポリヌクレオチド（「ｈＢｇ－ＵＴＲ－Ｆｌｕｃ」）のいずれかをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるルシフェラーゼ発現の生物発光イメージング分析を示す。非トランスフェクト細胞をコントロール（「モック」）として用いた。タンパク質発現は、トランスフェクション後６時間（「６ｈｐｔ」）、２４時間（「２４ｈｐｔ」）、４８時間（「４８ｈｐｔ」）、及び７２時間（「７２ｈｐｔ」）に測定した。

【0063】

【図20】（ｉ）本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）を含むＧＦＰコードポリヌクレオチド（「ＨＡ－ＵＴＲ－ＥＧＦＰ」）、または（ｉｉ）実施例９に記載のヒトβグロビン（ｈＢｇ）のＵＴＲ配列を含む対応するポリヌクレオチド（「ｈＢｇ－ＵＴＲ－ＥＧＦＰ」）のいずれかをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるルシフェラーゼ発現（ウエスタンブロットを使用して測定した）の比較を示す。非トランスフェクト細胞をコントロール（「モック」）として用いた。タンパク質発現は、トランスフェクション後６時間（「６ｈｐｔ」）、２４時間（「２４ｈｐｔ」）、４８時間（「４８ｈｐｔ」）、及び７２時間（「７２ｈｐｔ」）に測定した。β－アクチンの発現を内部コントロールとして示している。

【0064】

【図21】Ａ及びＢは、以下の処理、すなわち、（ｉ）非処理（「モック」、アスタリスク）、（ｉｉ）ヌクレアーゼフリー水のみ（「ＮＦＷ」、三角形）、または（ｉｉｉ）インフルエンザＨＡタンパク質をコードし、本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）を含むポリヌクレオチド（「ＩＶＪ＋ｍＨＡ」、四角形）（２．５μｇ／マウス）のうちの１つを投与し、その後インフルエンザ感染によりチャレンジした動物の体重Ａ及び生存率Ｂのさらなる比較をそれぞれ示す。ＨＡ－ＵＴＲ－ＨＡは、実施例８に記載されるようにｍＲＮＡ送達試薬中に配合した。

【0065】

【図22】（ｉ）本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）（「ＨＡ－ＵＴＲ－Ｈ３」）を含むか、または（ｉｉ）含まない（「Ｈ３－ＯＲＦ」）、のいずれかであるＡ／Ｈ３Ｎ２株のＨＡタンパク質をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。非トランスフェクト細胞をコントロール（「モック」）として用いた。タンパク質発現は、トランスフェクション後６時間（「６ｈｐｔ」）、２４時間（「２４ｈｐｔ」）、４８時間（「４８ｈｐｔ」）、及び７２時間（「７２ｈｐｔ」）に測定した。β－アクチンの発現を内部コントロールとして示している。

【0066】

【図23】（ｉ）本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）を含む（「ＨＡ－ＵＴＲ」）か、または（ｉｉ）含まない（「ＯＲＦ」）、のいずれかであるＢ／Ｙａｍａｇａｔａ株のＨＡタンパク質をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。非トランスフェクト細胞をコントロール（「モック」）として用いた。タンパク質発現は、トランスフェクション後６時間（「６ｈｐｔ」）、２４時間（「２４ｈｐｔ」）、４８時間（「４８ｈｐｔ」）、及び７２時間（「７２ｈｐｔ」）に測定した。β－アクチンの発現を内部コントロールとして示している。

【0067】

【図24】（ｉ）本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）を含む（「ＨＡ－ＵＴＲ－ＩＤＳ」）か、または（ｉｉ）含まない（「ＩＤＳ－ＯＲＦ」）、のいずれかであるＩＤＳタンパク質をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるイズロネート－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）発現（前駆体形態及び成熟形態の両方）のウエスタンブロット分析を示す。１μｇ（上のパネル）または３μｇ（下のパネル）の２つの異なる用量のポリヌクレオチドを細胞にトランスフェクトした。非トランスフェクト細胞をコントロール（「モック」）として用いた。タンパク質発現は、トランスフェクション後６時間（「６ｈｐｔ」）、２４時間（「２４ｈｐｔ」）、４８時間（「４８ｈｐｔ」）、及び７２時間（「７２ｈｐｔ」）に測定した。β－アクチンの発現を内部コントロールとして示している。

【0068】

【図25】（ｉ）本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）を含む（「ＨＡ－ＵＴＲ－ＮＹＥＳＯ１」）か、または（ｉｉ）含まない（「ＮＹＥＳＯ１」）、のいずれかであるＮＹＥＳＯ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ Ｔ細胞におけるＮＹＥＳＯ１タンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。非トランスフェクト細胞をコントロール（「モック」）として用いた。ＧＡＤＰＨの発現を内部コントロールとして示している。

【0069】

【図26】（ｉ）本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）を含む（「ＨＡ－ＵＴＲ－ＭＡＧＥＡ３」）か、または（ｉｉ）含まない（「ＭＡＧＥＡ３」）、のいずれかであるＭＡＧＥＡ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ Ｔ細胞におけるＭＡＧＥＡ３タンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。非トランスフェクト細胞をコントロール（「モック」）として用いた。ＧＡＤＰＨの発現を内部コントロールとして示している。

【発明を実施するための形態】

【0070】

開示の詳細な説明
本開示は、１つ以上の改善された特性を示すように改変されたポリヌクレオチド（例えば、単離ポリヌクレオチド）に関する。したがって、本開示のポリヌクレオチドは、天然に存在する参照ポリヌクレオチドとは（例えば、構造的及び／または機能的に）異なるものである。例えば、いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、（ｉ）目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、及び（ｉｉ）コードされたタンパク質の発現を翻訳時に増加させることができる１つ以上の追加の構成要素（例えば、本明細書で提供されるＵＴＲ配列）を含む。

【0071】

記載される特定の組成物またはプロセスステップは無論のこと異なりうることから、本開示をより詳細に記載するのに先立って、本開示は特定の組成物またはプロセスステップに限定されない点を理解されたい。本開示を読むことで当業者にとって明らかとなるように、本明細書に記載及び例示される個々の態様の各々は、本開示の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの態様のいずれかの特徴から容易に分離するかまたはそれらの特徴と組み合わせることができる個別の構成要素及び特徴を有する。記載されるいずれの方法も、記載される事象の順序で、または論理的に可能な他の任意の順序で実施することが可能である。

【0072】

本明細書に示される見出しは本開示の様々な態様を限定するものではなく、本開示の態様は、本明細書の全体を参照することによって定義されうるものである。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものであるので、本明細書で使用される用語は、あくまで特定の態様を説明することを目的としたものであって、限定することを目的としたものではない点も理解されるべきである。

【0073】

Ｉ．用語
本開示をより容易に理解できるように、特定の用語を最初に定義する。本出願で使用する場合、本明細書に別段明記されない限り、以下の用語のそれぞれは、下記に記載する意味を有するものとする。追加の定義は、本出願の全体を通じて記載される。

【0074】

「ａ」または「ａｎ」なる用語で示される実体は、その実体の１つ以上を指し、例えば、「ａ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ヌクレオチド配列）」は、１つ以上のヌクレオチド配列を表すものとして理解される点に留意されたい。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、ならびに「ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ」（１つ以上の）、及び「ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ」（少なくとも１つの）は、本開示では互換的に用いられる場合がある。各請求項は、あらゆる任意選択的な要素を除外するように起草される場合もある点にも留意されたい。したがって、この記載は、請求項の要素の記載との関連において「～だけの」、「～のみ」などといった除外的な語の使用に対する、または否定による限定の使用に対する先行詞としての役割を有するものとする。

【0075】

さらに、本明細書で使用する場合、「及び／または」とは、他方を伴うかまたは伴わない、２つの特定の特性または要素のそれぞれの具体的な開示として理解されるべきである。したがって、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」などの語句で使用される「及び／または」という用語は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」などの語句で使用される「及び／または」という用語は、以下の態様、すなわち、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）の各々を包含することが意図される。

【0076】

本明細書において「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」なる文言で態様が説明されている場合は常に、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ（からなる）」及び／または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（から本質的になる）」なる用語で記載される他の類似の態様も提供される点を理解されたい。

【0077】

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本開示が関係する当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及びＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示において使用される用語の多くの一般的辞書を当業者に提供する。

【0078】

単位、接頭辞、及び記号は、それらのＳｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）で認められた形態で示される。数値範囲は、その範囲を規定する数値を含むものとする。数値の範囲が記載されている場合、その範囲の記載された上限と下限との間にあるそれぞれの介在する整数値、及びそのそれぞれの分数もまた、そのような値の間のそれぞれの部分範囲とともに具体的に開示される点は理解されるべきである。任意の範囲の上限値及び下限値は独立してその範囲に含まれる場合も、その範囲から除外される場合もあるが、どちらかの限界値が含まれるか、どちらの限界値も含まれないか、または両方の限界値が含まれるそれぞれの範囲もまた、本開示に包含される。したがって、本明細書に記載される範囲は、記載される端点を含む、その範囲内のすべての値の簡略的な表記であるものとして理解される。例えば、１～１０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲を含むものとして理解される。

【0079】

本明細書で使用される場合、「ｕｇ」及び「ｕＭ」という用語は、それぞれ「μｇ」及び「μΜ」と互換的に使用される。

【0080】

値が明示的に記載されている場合、記載されている値とほぼ同じ数または量である値もまた、本開示の範囲内に含まれる点を理解されたい。ある組み合わせが開示される場合、その組み合わせの要素の部分的な組み合わせのそれぞれも具体的に開示され、本開示の範囲内に含まれる。逆に、異なる要素または要素群が個別に開示される場合、それらの組み合わせも開示される。開示の任意の要素が複数の代替手段を有するものとして開示される場合、各代替手段が単独でまたは他の代替手段との任意の組み合わせで除外されるその開示の例も本明細書により開示される、開示の複数の要素がそのような除外を有し得、そのような除外を有する要素のすべての組み合わせが本明細書により開示される。

【0081】

ヌクレオチドは、それらの一般的に認められている１文字のコードによって表される。特に断らない限り、ヌクレオチド配列は５’～３’の方向に左から右に記載する。本明細書においてヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される一般的に公知のヌクレオチドの１文字記号により表記される。したがって、「ａ」はアデニンを表し、「ｃ」はシトシンを表し、「ｇ」はグアニンを表し、「ｔ」はチミンを表し、「ｕ」はウラシルを表す。

【0082】

アミノ酸配列はアミノ末端からカルボキシ末端の方向に左から右に記載する。本明細書では、アミノ酸は、それらの一般的に知られる３文字記号、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会により推奨される１文字記号で呼称する。

【0083】

「約」という用語は、本明細書では、およそ、大体、おおよそ、またはその範囲内の意味で使用される。「約」という用語が数値範囲とともに使用される場合、記載される数値よりも上及び下の境界値を広げることによって、その範囲を修飾する。一般に、「約」という用語は、例えば、上または下に１０パーセント（より高いまたはより低い）の変動で、明示される値の上及び下に数値を修正することができる。

【0084】

本明細書で使用する場合、「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）なる用語には、これらに限定されるものではないが、ＡＡＶタイプ１、ＡＡＶタイプ２、ＡＡＶタイプ３（タイプ３Ａ及び３Ｂを含む）、ＡＡＶタイプ４、ＡＡＶタイプ５、ＡＡＶタイプ６、ＡＡＶタイプ７、ＡＡＶタイプ８、ＡＡＶタイプ９、ＡＡＶタイプ１０、ＡＡＶタイプ１１、ＡＡＶタイプ１２、ＡＡＶタイプ１３、ＡＡＶｒｈ．７４、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１（２００４））及びＭｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｖｉｒｏｌ． ３３：３７５（２００４））に開示されるＡＡＶ血清型及び系統群、ならびに現在知られているかもしくは今後発見される他の任意のＡＡＶが含まれる（例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照）。いくつかの態様では、「ＡＡＶ」には、既知のＡＡＶの誘導体が含まれる。いくつかの態様では、「ＡＡＶ」には、改変された、または人工ＡＡＶが含まれる。

【0085】

「投与」、「投与すること」なる用語、及びその文法的変化形は、本開示のポリヌクレオチドなどの組成物を、薬学的に許容される経路により対象に導入することを指す。本開示のポリヌクレオチドを含むミセルなどの組成物の対象への導入は、腫瘍内、経口、肺、鼻腔内、非経口（静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、もしくは皮下）、直腸、リンパ内、髄腔内、眼周または局所を含む任意の好適な経路によるものである。投与は、自己投与及び他者による投与を含む。適当な投与経路によって、組成物または薬剤はその目的とする機能を実行することができる。例えば、適当な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物または薬剤を対象の静脈内に導入することによって投与される。

【0086】

本明細書で使用する場合、対象とする１つ以上の値に適用される「およそ」という用語は、記載される参照値と同様の値を指す。ある特定の態様では、「ほぼ」という用語は、特に明記しない限り、または他のことが文脈から明らかでない限り、明示される参照値の両方向に（数を超えるか、またはそれ未満の）１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下の範囲内の値の範囲を指す（かかる数がとり得る値の１００％を超える場合を除く）。

【0087】

本明細書で使用する場合、「保存された」という用語は、比較されている２つ以上の配列の同じ位置において不変に見出されるものである、それぞれポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を指す。相対的に保存されているヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列の他の部分で出現するヌクレオチドまたはアミノ酸と比べてより関連する配列の間で保存されているものである。

【0088】

いくつかの態様では、２つ以上の配列は、それらが互いに１００％同一である場合、「完全に保存されている」または「同一である」と言われる。いくつかの態様では、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも７０％同一であるか、少なくとも８０％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、または少なくとも９５％同一である場合、「高度に保存されている」と言われる。いくつかの態様において、２つ以上の配列は、互いに約７０％同一である、約８０％同一である、約９０％同一である、約９５％、約９８％、または約９９％同一である場合、「高度に保存された」と言われる。いくつかの態様では、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも３０％同一であるか、少なくとも４０％同一であるか、少なくとも５０％同一であるか、少なくとも６０％同一であるか、少なくとも７０％同一であるか、少なくとも８０％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、または少なくとも９５％同一である場合、「保存されている」と言われる。いくつかの態様では、２つ以上の配列は、それらが互いに約３０％同一であるか、約４０％同一であるか、約５０％同一であるか、約６０％同一であるか、約７０％同一であるか、約８０％同一であるか、約９０％同一であるか、約９５％同一であるか、約９８％同一であるか、または約９９％同一である場合、「保存されている」と言われる。配列の保存は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全長に適用することができ、または部分、領域、もしくはそれらの特徴に適用することができる。

【0089】

本明細書で使用する場合、「由来する」という用語は、特定の分子もしくは生物または情報（例えば、アミノ酸または核酸の配列）を使用して、特定の分子もしくは生物から単離されるか、製造される構成要素を指す。例えば、第２の核酸配列に由来する核酸配列は、第２の核酸配列のヌクレオチド配列と同一であるか、または実質的に類似するヌクレオチド配列を含み得る。ヌクレオチドまたはポリペプチドの場合、派生した種は、例えば、自然に生じる変異誘発、人為的定方向突然変異誘発、または人為的ランダム変異誘発により得られ得る。ヌクレオチドまたはポリペプチドを派生させるために使用される変異誘発は、意図的に定方向、もしくは意図的にランダムであるか、または各々の組み合わせである。最初のものに由来する異なるヌクレオチドまたはポリペプチドを作製するためのヌクレオチドまたはポリペプチドの変異誘発は、ランダム事象（例えば、ポリメラーゼの不忠実さにより引き起こされる）であり得、派生したヌクレオチドまたはポリペプチドの同定は、例えば、本明細書において述べられる適切なスクリーニング法によりなされ得る。一部の態様では、第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列に由来するヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、それぞれ第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対する少なくとも約５０％、少なくとも約５１％、少なくとも約５２％、少なくとも約５３％、少なくとも約５４％、少なくとも約５５％、少なくとも約５６％、少なくとも約５７％、少なくとも約５８％、少なくとも約５９％、少なくとも約６０％、少なくとも約６１％、少なくとも約６２％、少なくとも約６３％、少なくとも約６４％、少なくとも約６５％、少なくとも約６６％、少なくとも約６７％、少なくとも約６８％、少なくとも約６９％、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有し、ここで、第１のヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の生物活性を保持する。

【0090】

本明細書で使用する場合、「コーディング領域」または「コーディング配列」とは、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの部分である（例えば、オープンリーディングフレーム）。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は通常はアミノ酸に翻訳されないがコーディング領域の一部とみなすことができる。ただし、すべてのフランキング配列、例えば、ＵＴＲ、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどはコーディング領域の一部ではない。コーディング領域の境界は、得られるポリヌクレオチドのアミノ末端をコードする５’末端の開始コドンと、得られるポリヌクレオチドのカルボキシ末端をコードする３’末端の翻訳終止コドンとによって一般的に決定される。

【0091】

「相補的」及び「相補性」という用語は、ワトソン・クリック型塩基対形成則により互いに関連する２つ以上のオリゴマー（すなわち、それぞれが核酸塩基配列を含む）、またはオリゴマーと標的遺伝子との間を指す。例えば、核酸塩基配列「Ｔ－Ｇ－Ａ（５’→３’）」は、核酸塩基配列「Ａ－Ｃ－Ｔ（３’→５’」に相補的である。相補性は「部分的」であってよく、その場合、所与の核酸塩基配列の核酸塩基のすべてより少ないものが塩基対形成則に従って他の核酸塩基配列と一致している。例えば、いくつかの態様では、所与の核酸塩基配列と他の核酸塩基配列との間の相補性は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％であり得る。したがって、特定の態様では、「相補性」という用語は、標的核酸配列との少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の一致または相補性を指す。または例に続き、「完全な」または「完璧な」（１００％）相補性が、所与の核酸塩基配列と他の核酸塩基配列との間に存在し得る。いくつかの態様では、核酸塩基配列間の相補性の程度は、配列間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に顕著な影響を与える。

【0092】

「下流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の３’側に存在するヌクレオチド配列を指す。ある特定の態様では、下流ヌクレオチド配列は、転写開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に存在する。

【0093】

「賦形剤」及び「キャリア」という用語は、互換的に使用され、化合物、例えば本開示のｍｉＲＮＡ阻害剤の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。

【0094】

本明細書で使用する場合、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えばＲＮＡまたはポリペプチド（例えば、治療用タンパク質、例えば、コロナウイルスタンパク質）を生成するプロセスを指す。発現には、マイクロＲＮＡ結合部位、小分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または他の任意のＲＮＡ産物へのポリヌクレオチドの転写が限定されることなく含まれる。発現には、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へのポリヌクレオチドの転写、及びｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が限定されることなく含まれる。発現によって、「遺伝子産物」が生成される。本明細書で使用する場合、遺伝子産物は、例えば遺伝子の転写によって生成されるＲＮＡなどの核酸であってよい。本明細書で使用する場合、遺伝子産物は、核酸、遺伝子の転写によって生成されるＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ、または転写産物から翻訳されたポリペプチドであってよい。本明細書に記載される遺伝子産物には、例えばポリアデニル化またはスプライシングなどの転写後修飾を有する核酸、または、例えばリン酸化、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの結合、またはタンパク質分解切断などの翻訳後修飾を有するポリペプチドがさらに含まれる。

【0095】

いくつかの態様では、ポリマー分子は、分子における少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％のモノマーが同一（厳密に同じモノマー）であるか、または類似する（保存的置換）場合、互いに「相同である」とみなされる。「相同である」という用語は、必然的に少なくとも２つの配列（例えば、ポリヌクレオチド配列）間の比較を指す。

【0096】

本開示との関連で、置換（それらがアミノ酸置換と称される場合でも）は、核酸レベルで行われ、すなわち、アミノ酸残基を代替アミノ酸残基で置換することは、第１のアミノ酸をコードするコドンを第２のアミノ酸をコードするコドンで置換することによって行われる。

【0097】

より大きなポリペプチドまたはポリヌクレオチドの一部であるポリペプチド部分またはポリヌクレオチド部分に関する「異種」とは、それぞれ、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド分子の残りの部分とは異なるポリペプチドまたはポリヌクレオチドに由来するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを表す。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの追加の異種構成要素は、それぞれ本明細書に記載の残りのポリペプチドまたはポリヌクレオチドと同じ生物に由来するものであってよく、または追加の構成要素は異なる生物に由来するものであってもよい。例えば、異種ポリペプチドは、合成であってもよいし、異なる種、個体の異なる細胞タイプ、または異なる個体の同じタイプもしくは異なるタイプの細胞に由来するものであってもよい。本明細書に記載されるように、本明細書に記載のポリヌクレオチドのＯＲＦによってコードされるタンパク質（またはポリペプチド）は、ポリヌクレオチドのＵＴＲ（例えば、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）に対して異種である。

【0098】

本明細書で使用する場合、「同一性」（例えば、配列同一性）という用語は、ポリマー分子間の、例えば、ポリヌクレオチド分子間の全体的なモノマー保存性を指す。いかなる追加の修飾語もない「同一である」という用語、例えば、「ポリヌクレオチドＡはポリヌクレオチドＢと同一である」は、ポリヌクレオチド配列同士が１００％同一（１００％の配列同一性）であることを意味する。例えば、「７０％同一である」と２つの配列を表現することは、例えば、「７０％配列同一性」を有するとそれらを表現することに等しい。

【0099】

２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の同一率（％）の計算は、例えば、最適な比較のために２つの配列をアラインメントすることにより実行され得る（例えば、最適なアラインメントのために第１及び第２のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の一方または両方にギャップが導入され得、同一でない配列が比較のために無視され得る）。特定の実施形態では、比較目的のためにアラインメントされる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次いで、対応するアミノ酸位のアミノ酸、またはポリヌクレオチドの場合は塩基が比較される。

【0100】

第１の配列におけるある位置が第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸またはヌクレオチドにより占められる場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一率（％）は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、配列により共有される同一の位置の数の関数である。配列の比較及び２つの配列間の同一率（％）の決定は、数学アルゴリズムを使用して達成され得る。

【0101】

異なる配列同士（例えば、ポリヌクレオチド配列）をアラインするために使用することができる適当なソフトウェアプログラムは様々なソースから入手可能である。配列同一率（％）を決定するための適当なプログラムの１つに、米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なＢＬＡＳＴパッケージプログラムの一部であるｂｌ２ｓｅｑがある。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して、２個の配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮが核酸配列を比較するために使用されるのに対して、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために使用される。他の好適なプログラムは、例えば、ＥＭＢＯＳＳバイオインフォマティクスプログラム集の一部であり、またｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａのＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）から利用可能である、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒである。

【0102】

配列アライメントは、当該技術分野では周知の方法、例えば、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、またはＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）、ＭＵＳＣＬＥなどを使用して実施され得る。

【0103】

ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列と整列する単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の異なる領域は、それぞれ、それら自体の配列同一率（％）を有することができる。配列同一率（％）は、１０分の１の位に四捨五入される点に留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は、８０．１に切り捨てられ、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は８０．２に切り上げられる。また、長さの値は常に整数である点に留意されたい。

【0104】

ある特定の態様では、同一性パーセンテージ（％ＩＤ）または第１のアミノ酸配列（または核酸配列）の第２のアミノ酸配列（または核酸配列）に対する同一性パーセンテージ（％ＩＤ）は、％ＩＤ＝１００×（Ｙ／Ｚ）として計算され、式中、Ｙは、第１及び第２の配列のアラインメント（目視検査または特定の配列アライメントプログラムによりアラインメントされる）において完全な一致と評価されたアミノ酸残基（または核酸塩基）の数であり、Ｚは、第２の配列における残基の総数である。第１の配列の長さが第２の配列を超える場合、第１の配列の第２の配列に対する同一率（％）は、第２の配列の第１の配列に対する同一率（％）より高くなる。

【0105】

当業者であれば、配列同一率（％）を計算するための配列アラインメントの生成が、一次配列データによってのみ行われるバイナリー配列間比較に限定されない点は理解されよう。配列アライメントは、配列データを異種の供給源由来のデータ、例えば、構造データ（例えば、タンパク質結晶構造）、機能データ（例えば、変異の位置）、または系統学的データと統合することにより生成され得ることも理解されよう。異種のデータを統合して多重配列アラインメントを生成する好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで利用可能であり、代替的に例えば、ＥＢＩから利用可能なＴ－Ｃｏｆｆｅｅである。配列同一率（％）を計算するために使用される最終的なアラインメントは、自動または手動のいずれかで管理され得ることも理解されよう。

【0106】

本明細書で使用する場合、「単離された」、「精製された」、「抽出された」という用語、及びそれらの文法的変化形は、互換的に使用され、１つ以上の精製プロセスを受けた本開示の所望の組成物、例えば、本開示のポリヌクレオチドの調製状態を指す。いくつかの態様では、本明細書で使用する場合、単離または精製は、夾雑物を含有する試料から、本開示の組成物、例えば、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）を取り出す、（例えば、画分を）部分的に取り出すプロセスである。

【0107】

いくつかの態様では、単離された組成物は、検出可能な望ましくない活性を有さないか、または代替的に、望ましくない活性のレベルもしくは量が許容可能なレベルまたは量以下である。他の態様では、単離された組成物は、許容可能な量及び／または濃度及び／または活性以上の量及び／または濃度の本開示の所望の組成物を有する。他の態様では、単離された組成物は、組成物が取得される出発物質と比較して濃縮される。この濃縮は、出発物質と比較して少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％、少なくとも約９９．９９９％、少なくとも約９９．９９９９％、または９９．９９９９％超であり得る。

【0108】

いくつかの態様では、単離された調製物は、残留する生物学的産物を実質的に含まない。いくつかの態様では、単離された調製物は、任意の混入している生物学的物質を１００％、少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９７％、少なくとも約９６％、少なくとも約９５％、少なくとも約９４％、少なくとも約９３％、少なくとも約９２％、少なくとも約９１％、または少なくとも約９０％含まない。残留する生物学的産物は、非生物物質（化学物質を含む）または不要な核酸、タンパク質、脂質、もしくは代謝産物を含み得る。

【0109】

本明細書で使用する場合、「連結された」という用語は、共有結合または非共有結合によりそれぞれ第２のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列に結合された、第１のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列を指す。第１のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列は、第２のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列に直接的に結合もしくは並列され得るか、または代替的に介在配列が第１の配列から第２の配列までに共有結合により加わり得る。「連結された」という用語は、第１のポリヌクレオチド配列の第２のポリヌクレオチド配列への５’末端または３’末端での融合を意味するだけでなく、第２のポリヌクレオチド配列（または第１のポリヌクレオチド配列）における任意の２つのヌクレオチドへの第１のポリヌクレオチド配列（またはそれぞれ第２のポリヌクレオチド配列）全体の挿入も含む。第１のポリヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合またはリンカーにより第２のポリヌクレオチド配列に連結され得る。リンカーは、例えば、ポリヌクレオチドであり得る。

【0110】

本明細書で使用する場合、「調節する」、「修飾する」という用語、及びそれらの文法的変化形は、一般に、特定の濃度、レベル、発現、機能、または行動に適用される場合、例えば、アンタゴニストまたはアゴニストとして作用するために、特定の濃度、レベル、発現、機能、または行動を増加または減少させること、例えば、直接または間接的に、促進すること／刺激すること／上方調節することまたはそれらに干渉すること／それらを阻害すること／それらを下方調節することにより変化させる能力を指す。場合によっては、修飾因子は、ある特定の濃度、レベル、活性、または機能を、コントロールと比較して、または一般に予想される活性の平均レベルと比較して、もしくは活性のコントロールレベルと比較して増加及び／または減少させ得る。

【0111】

「核酸」、「核酸分子」、「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」、及びそれらの文法的変化形は、互換的に使用され、一本鎖形態または二重螺旋のいずれかでのリン酸エステルポリマー形態のリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、またはシチジン；「ＲＮＡ分子」）もしくはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、またはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）、またはそれらの任意のホスホエステルアナログ、例えば、ホスホロチオネート及びチオエステルを指す。一本鎖核酸配列は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を指す。二本鎖ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ、及びＲＮＡ－ＲＮＡ螺旋が可能である。核酸分子及び特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子という用語は、分子の一次及び二次構造のみを指し、任意の特定の三次形態に限定されない。したがって、この用語は、とりわけ線形または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、プラスミド、スーパーコイルＤＮＡ、及び染色体に見出される二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造について述べる際、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿った５’～３’方向での配列のみを提供する通常の慣例に従って本明細書に記載され得る。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。ＤＮＡとしては、限定されるものではないが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及び半合成ＤＮＡが挙げられる。本開示の「核酸組成物」は、本明細書に記載されるような１つ以上の核酸を含む。本明細書に記載されるように、本開示のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む。いくつかの態様では、「ポリヌクレオチド」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含有する）、スプライシングされたまたはスプライシングされていないにかかわらず、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡを含む、ポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含有する）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ－またはＣ－配糖体である任意の他の種類のポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド骨格を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸「ＰＮＡ」）及びポリモルホリノポリマー、ならびにＤＮＡ及びＲＮＡにおいて見出されるような塩基対形成及び塩基スタッキングを可能にする配置で核酸塩基を含有することを条件とする他の配列特異的合成核酸ポリマーを含む。

【0112】

「薬学的に許容されるキャリア」、「薬学的に許容される賦形剤」という用語、及びそれらの文法的変化形は、ヒトを含む動物に使用するための米国連邦政府の規制機関により承認されたか、または米国薬局方に列挙される薬剤のいずれか、ならびに対象への組成物の投与を禁止する程度まで望ましくない生理作用の発生を引き起こさず、投与される化合物の生物活性及び特性を抑制しない任意のキャリアまたは希釈剤を包含する。医薬組成物を調製するのに有用であり、一般に安全で、非毒性であり、望ましい賦形剤及び担体が含まれる。

【0113】

本明細書で使用する場合、「医薬組成物」という用語は、１種以上の他の化学成分、例えば、薬学的に許容されるキャリア及び賦形剤と混合もしくは混ぜ合わされたか、またはそれらの中に懸濁された、例えば、本開示のポリヌクレオチドなどの本明細書に記載される化合物のうちの１種以上を指す。

【0114】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、例えば本明細書に記載のポリヌクレオチドによりコードされた、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指して本明細書において互換的に使用される。ポリマーは、修飾アミノ酸を含み得る。これらの用語は、自然に修飾された、または、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合など、他の任意の操作もしくは改変などの介入により修飾されたアミノ酸ポリマーも包含される。例えば、１つ以上のアミノ酸アナログ（例えば、ホモシステイン、オルニチン、ｐ－アセチルフェニルアラニン、Ｄ－アミノ酸、及びクレアチンなどの非天然アミノ酸が挙げられる）、及び当該技術分野において公知の他の修飾を含有するポリペプチドも定義の範囲内に含まれる。本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。

【0115】

ポリペプチドとしては、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、上述のもののホモログ、オーソログ、パラログ、フラグメント及び他の等価物、バリアント、ならびにアナログが挙げられる。

【0116】

ポリペプチドは、単一のポリペプチドであり得るか、またはダイマー、トリマー、もしくはテトラマーなどの多分子複合体であり得る。それらは、一本鎖または多連鎖ポリペプチドも含み得る。最も一般的に、ジスルフィド結合は、多鎖ポリペプチドに見られる。ポリペプチドという用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的アナログであるようなアミノ酸ポリマーにも適用され得る。いくつかの態様では、「ペプチド」は、アミノ酸約５０個以下の長さ、例えば、アミノ酸約５個、約１０個、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約４５個、または約５０個の長さであり得る。

【0117】

本明細書で使用する場合、「予防する」、「予防すること」という用語、及びそれらの変化形は、疾患、障害、及び／または状態の発症を部分的または完全に遅延させること；特定の疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の症状、特徴、または臨床徴候の発症を部分的または完全に遅延させること；特定の疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の症状、特徴、または徴候の発症を部分的または完全に遅延させること；特定の疾患、障害、及び／または状態の進行を部分的または完全に遅延させること；及び／または疾患、障害、及び／または状態に関連する病理を生じるリスクを減少させることを指す。いくつかの態様では、転帰の予防は、予防的治療によって実現される。

【0118】

本明細書で使用する場合、「プロモーター」及び「プロモーター配列」という用語は互換可能であり、コーディング配列または機能性ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一般的に、コーディング配列は、プロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、天然遺伝子にその全体が由来してもよく、または自然界にみられる異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されてもよく、またはさらには、合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞タイプにおいて、または発生の異なる段階において、または異なる環境的もしくは生理学的条件に応じて、遺伝子の発現を誘導することができる点は、当業者には理解されよう。ほとんどの細胞タイプでほとんどの時間に遺伝子を発現させるプロモーターは一般的に「構成的プロモーター」と呼ばれる。特定の細胞タイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターは、一般的に「細胞特異的プロモーター」または「組織特異的プロモーター」と呼ばれる。発生または細胞分化の特定の段階で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般的に「発生特異的プロモーター」または「細胞分化特異的プロモーター」と呼ばれる。プロモーターを誘導する薬剤、生物学的分子、化学物質、リガンド、光などによる細胞の曝露または処理後に誘導されて遺伝子を発現させるプロモーターは、一般的に「誘導性プロモーター」または「調節可能なプロモーター」と呼ばれる。多くの場合で調節配列の正確な境界は完全には定義されていないことから、異なる長さのＤＮＡフラグメントが同じプロモーター活性を有し得る点もさらに認識されよう。

【0119】

プロモーター配列の境界はその３’末端では転写開始部位であり、バックグラウンドよりも高い検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小の数の塩基またはエレメントを含むように上流（５’方向）に延びている。プロモーター配列内には、転写開始部位（例えばヌクレアーゼＳ１によるマッピングによって簡便に定義される）ばかりでなく、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）も見出される。いくつかの態様では、本開示とともに使用することができるプロモーターには、組織特異的プロモーターが含まれる。

【0120】

本明細書で使用する場合、「予防」とは、疾患もしくは状態の発症を予防するために、または疾患もしくは状態に関連する症状を予防または遅延させるために使用される治療的行動または行動方針を指す。

【0121】

本明細書で使用する場合、「予防法」は、健康を維持し、疾患または状態の発症を予防するために、または疾患もしくは状態に関連する症状を予防もしくは遅延させるために取られる手段を指す。

【0122】

本明細書で使用する場合、「遺伝子調節領域」または「調節領域」という用語は、コーディング領域の上流（５’側のノンコーディング配列）、その内部、またはその下流（３’側のノンコーディング配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシング、安定性または関連するコーディング領域の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節領域には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、またはステムループ構造が含まれ得る。コーディング領域が真核細胞内での発現のためのものである場合、ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列がコーディング配列の３’側に通常は配置される。

【0123】

いくつかの態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、１つ以上のコーディング領域と機能的に関連付けられたプロモーター及び／または他の発現（例えば、転写）制御エレメント（例えば、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）を含むことができる。機能的関連付けにおいて、遺伝子産物のコーディング領域は、１つ以上の調節領域と、その遺伝子産物の発現が調節領域（複数可）の影響または制御下に置かれるようにして関連付けられる。例えば、コーディング領域とプロモーターとは、プロモーター機能の誘導が、そのコーディング領域によってコードされた遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらし、かつプロモーターとコーディング領域との連結の性質が、プロモーターが遺伝子産物の発現を誘導する能力を妨げず、またはＤＮＡ鋳型が転写される能力も妨げない場合に、「機能的に関連付けられている」。プロモーター以外の他の発現制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルを、遺伝子産物の発現を誘導するようにコーディング領域と機能的に関連付けることもできる。

【0124】

本明細書で使用する場合、「類似性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子間の全体的関連性を指す。ポリマー分子同士の互いに対する類似率（％）の計算は、類似率（％）の計算が当該技術分野で理解されるところの保存的置換を考慮している点を除いて、同一率（％）の計算と同様にして行うことができる。類似率（％）は、用いられる比較尺度、すなわち、核酸同士が、例えばそれらの進化的な近さ、電荷、体積、柔軟性、極性、疎水性、芳香族性、等電点、抗原性、またはそれらの組み合わせのどれにしたがって比較されるかによって左右されることが理解される。

【0125】

「対象」、「患者」、「個体」、及び「宿主」なる用語、及びそれらの変化形は、本明細書において互換的に使用され、限定されるものではないが、ヒト、家庭用動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、及び実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）が挙げられる、診断、処置、または治療が所望される任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。本明細書に記載される方法は、ヒトの治療及び獣医学的用途の両方に適用可能である。

【0126】

本明細書で使用する場合、「その必要がある対象」という表現は、本開示のポリヌクレオチドの投与から恩恵を受ける哺乳動物対象などの対象を含む。

【0127】

本明細書で使用する場合、「治療有効量」または「有効量」という用語は、所望の治療効果、薬理学的、及び／または生理学的効果をもたらす必要がある対象において所望の治療効果、薬理学的、及び／または生理学的効果をもたらすのに十分な、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）を含む試薬または医薬化合物の量である。治療有効量は、予防が治療とみなされ得る場合、「予防有効量」であり得る。

【0128】

本明細書で使用する場合、「処置する」、「処置」、または「処置すること」という用語は、例えば、疾患または状態の重症度の低減、疾患経過の期間の低減、疾患または状態（例えば、糖尿病）に関連する１つ以上の症状の改善または除去、疾患または状態を必ずしも治療しない、疾患または状態を有する対象に対する有益な効果の提供を指す。この用語には、疾患もしくは状態またはその症状の予防または防止も含まれる。

【0129】

本明細書で使用する場合、「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」という用語は、転写されるが翻訳されない遺伝子の領域を指す。「５’ＵＴＲ」は転写開始部位で始まり、開始コドンまで続くが、開始コドンは含まれない。一方、「３’ＵＴＲ」は終止コドンの直後から始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子の安定性と翻訳の観点から、ＵＴＲが果たす調節的役割についての多くの証拠が示されつつある。ＵＴＲの調節的機能を本発明に記載のポリヌクレオチドに組み込むことで、分子の安定性を高めることができる。本発明のポリヌクレオチドが望ましくない臓器部位に誤って誘導された場合に備えて、転写物の発現低下の制御を行うための特定の機能を組み込むこともできる。

【0130】

「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の５’側に位置するヌクレオチド配列を指す。

【0131】

ＩＩ．改変ポリヌクレオチド
ＩＩ．Ａ．非翻訳領域（ＵＴＲ）
本開示のポリヌクレオチド（例えば、単離ポリヌクレオチド）は、（ｉ）目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、及び（ｉｉ）１つ以上の追加の構成要素を含むように改変されており、追加の構成要素は、ポリヌクレオチドの１つ以上の特性を改善することができる。本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、１つ以上の追加の構成要素は、（ｉ）インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質（またはその機能的断片）の５’－非翻訳領域要素（５’－ＵＴＲ）（本明細書では「ＨＡ－５’－ＵＴＲ」とも称する）、（ｉｉ）インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質（またはその機能的断片）の３’－非翻訳領域要素（３’－ＵＴＲ）（本明細書では「ＨＡ－３’－ＵＴＲ」とも称する）、または（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方を含む。

【0132】

したがって、いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、単離ポリヌクレオチド）は、（ｉ）目的のタンパク質をコードするＯＲＦ、及び（ｉｉ）ＨＡ－５’－ＵＴＲを含み、ただし、目的のタンパク質は、ＨＡ－５’－ＵＴＲと異種である（すなわち、同じインフルエンザＨＡタンパク質ではない）。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド（例えば、単離ポリヌクレオチド）は、（ｉ）目的のタンパク質をコードするＯＲＦ、及び（ｉｉ）ＨＡ－３’－ＵＴＲを含み、ただし、目的のタンパク質は、ＨＡ－３’－ＵＴＲと異種である（すなわち、同じインフルエンザＨＡタンパク質ではない）。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、（ｉ）目的のタンパク質をコードするＯＲＦ、（ｉｉ）ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及び（ｉｉｉ）ＨＡ－３’－ＵＴＲを含み、ただし、目的のタンパク質は、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及び／またはＨＡ－３’－ＵＴＲと異種である。

【0133】

いくつかの態様では、ＨＡ－５’－ＵＴＲは、ＯＲＦの５’末端に隣接する（すなわち、隣接する位置にある）。いくつかの態様では、１つ以上の追加の構成要素（例えば、セクションＩＩ．Ｃでさらに説明される）は、ＨＡ－５’－ＵＴＲとＯＲＦの５’末端との間に存在する。いくつかの態様では、ＨＡ－３’－ＵＴＲは、ＯＲＦの３’末端に隣接する。いくつかの態様では、１つ以上の追加の構成要素（例えば、セクションＩＩ．Ｃでさらに説明される）は、ＯＲＦの３’末端とＨＡ－３’－ＵＴＲとの間に存在する。

【0134】

いくつかの態様では、ＨＡ－５’－ＵＴＲは、配列番号１３（ＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＡＡ）に記載の核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のＨＡ－５’－ＵＴＲは、配列番号１３（ＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＡＡ）に記載の核酸配列からなる。いくつかの態様では、ＨＡ－３’－ＵＴＲは、配列番号１４（ＣＡＴＴＡＧＧＡＴＴＴＣＡＧＡＡＧＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＡＣＡＣＣＣＴＴＧＴＴＴＣＴＡＣＴ）に記載の核酸配列を含む。いくつかの態様では、ＨＡ－３’－ＵＴＲは、配列番号１４（ＣＡＴＴＡＧＧＡＴＴＴＣＡＧＡＡＧＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＡＣＡＣＣＣＴＴＧＴＴＴＣＴＡＣＴ）に記載の核酸配列からなる。

【0135】

本明細書で示されるように、出願人は、ポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載のものなど）の構築において、本明細書で提供される１つ以上のＵＴＲ配列（例えば、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）を含めることで、コードされたタンパク質の発現を翻訳時に増加させることができることを特定した。いくつかの態様では、タンパク質の発現は、参照発現量（例えば、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及び／またはＨＡ－３’－ＵＴＲを欠くポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質の発現量）と比較して、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、または少なくとも約１００倍増加する。

【0136】

本明細書にさらに示されるように、いくつかの態様では、本明細書で提供されるＵＴＲ配列（例えば、配列番号１３または配列番号１４）は、当該技術分野で知られるものを含む他のＵＴＲ配列と比較してタンパク質の発現をより大きく増加させることができる。例えば、いくつかの態様では、他のＵＴＲ配列（例えば、本明細書に参照によりその全容を援用するところの米国特許第１０，３０１，３６８ Ｂ２号に開示される２ｈＢｇＵＴＲ（配列番号１５））と比較して、本明細書に記載のＵＴＲ配列（例えば、配列番号１３または配列番号１４）は、コードされたタンパク質の発現を、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、または少なくとも約１００倍以上増加させる。

【0137】

ＵＴＲは、例えば、安定性、局在化及び／または翻訳効率の増加または減少といった、調節的役割を与える特性を有することができる。いずれの理論にも束縛されるものではないが、いくつかの態様では、本開示のＵＴＲ配列（例えば、配列番号１３または配列番号１４）は、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの安定性、局在化、及び／または翻訳効率を改善することによって目的のタンパク質の発現を増加させることができる。特定の態様では、本明細書に記載されるＵＴＲ配列は、当該技術分野で知られる他のＵＴＲ配列（例えば、２ｈＢｇＵＴＲ、配列番号１５）と比較して、ポリヌクレオチドのそのような側面（例えば、安定性、局在化、及び／または翻訳効率）を調節する能力がより高い。

【0138】

本開示から明らかなように、いくつかの態様では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、単一のＵＴＲ配列を含み、例えば、配列番号１３または配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる。いくつかの態様では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、複数（例えば、２つ以上）のＵＴＲを含み、ＵＴＲのうちの少なくとも１つは、本開示のＨＡ－５’－ＵＴＲ及び／またはＨＡ－３’－ＵＴＲ（例えば、配列番号１３または配列番号１４）から選択される。特定の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、複数（例えば、２つ以上）の５’－ＵＴＲを含む。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、複数（例えば、２つ以上）の３’－ＵＴＲを含む。さらなる態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、複数（例えば、２つ以上）の５’－ＵＴＲ及び複数（例えば、２つ以上）の３’－ＵＴＲを含む。複数のＵＴＲを含むポリヌクレオチドの場合、いくつかの態様では、ＵＴＲのそれぞれは同じヌクレオチド配列を有する。いずれの理論にも束縛されるものではないが、いくつかの態様では、反復ＵＴＲ配列を含めることは、関連するポリヌクレオチドの安定性及び／または翻訳効率をさらに高めるのに役立ち得る。特定の態様では、複数のＵＴＲのうちの１つ以上のものは、異なるヌクレオチド配列を有する。さらなる態様では、複数のＵＴＲのそれぞれは、異なるヌクレオチド配列を有する。

【0139】

特に断らない限り、本開示のＵＴＲ（例えば、配列番号１３または配列番号１４）は、当該技術分野では周知の任意の適当なＵＴＲと組み合わせて使用することができる。いくつかの態様では、本開示のＵＴＲと組み合わせて使用できる追加のＵＴＲには、特定の細胞、組織、及び／または臓器で多く発現される遺伝子中に存在するＵＴＲが含まれる。このような追加のＵＴＲを含めることによって、いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドを、例えば対象に投与される際に、特定の細胞、組織、及び／または臓器で優先的に発現させることができる。例えば、肝臓で発現されるｍＲＮＡ（例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子）のＵＴＲ（例えば、５－ＵＴＲ）をさらに導入することで、肝臓及び／または肝細胞株における本明細書に記載のポリヌクレオチドの発現を増加させることができる。このような組織特異的ＵＴＲの非限定的な例としては、（ａ）筋肉：ｍｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、及びヘルクリン、（ｂ）内皮細胞：Ｔｉｅ－１及びＣＤ３６、（ｃ）骨髄細胞：Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ－１、及びｉ－ＮＯＳ、（ｄ）白血球：ＣＤ４５及びＣＤ１８、（ｅ）脂肪組織：ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、及びアディポネクチン、及び（ｆ）肺上皮細胞：ＳＰ－Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄに由来するものが挙げられる。

【0140】

本開示のＵＴＲ（例えば、配列番号１３または配列番号１４）と組み合わせて使用することができるＵＴＲのさらなる例としては、α－グロビンまたはβ－グロビンなどのグロビン（例えばアフリカツメガエル、マウス、ウサギ、またはヒトグロビン）；強力なコザック翻訳開始シグナル；ＣＹＢＡ（例えば、ヒトシトクロムｂ－２４５αポリペプチド）；アルブミン（例えば、ヒトアルブミン７）；ＨＳＤ１７Ｂ４（ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ）；ウイルス（例、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、ベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、デング熱ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、ＣＭＶ即時初期１型（ＩＥ１））、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、シンドビスウイルス、またはＰＡＶオオムギ黄矮性ウイルス）；熱ショックタンパク質（例えば、ｈｓｐ７０）；翻訳開始因子（例えば、ｅｌＦ４Ｇ）；グルコーストランスポーター（例えば、ｈＧＬＵＴ１（ヒトグルコーストランスポーター１））；アクチン（例えば、ヒトαまたはβアクチン）；ＧＡＰＤＨ；チューブリン；ヒストン；クエン酸回路酵素；トポイソメラーゼ（例えば、５’ＴＯＰモチーフ（オリゴピリミジントラクト）を欠くＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲ）；リボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）；リボソームタンパク質（例えば、ｒｐｓ９などのヒトまたはマウスリボソームタンパク質）；ＡＴＰシンターゼ（例えば、ＡＴＰ５Ａ１またはミトコンドリアＨ^＋－ＡＴＰシンターゼのβサブユニット）；成長ホルモンｅ（例えば、ウシ（ｂＧＨ）またはヒト（ｈＧＨ））；伸長因子（例えば、伸長因子１α１（ＥＥＦ１Ａ１））；マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）；筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）；β－Ｆ１－ＡＴＰａｓｅ、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；コラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲン、α２（Ｃｏｌ１Ａ２）、Ｉ型コラーゲン、α１（Ｃｏｌ１Ａ１）、ＶＩ型コラーゲン、α２（Ｃｏｌ６Ａ２）、ＶＩ型コラーゲン、α１（Ｃｏｌ６Ａ１））；リボホリン（例えば、リボホリンＩ（ＲＰＮＩ））；低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（例えば、ＬＲＰ１）；カルディオトロフィン様サイトカイン因子（例えば、Ｎｎｔ１）；カルレティキュリン（Ｃａｌｒ）；プロコラーゲン－リシン、２－オキソグルタル酸５－ジオキシゲナーゼ１（Ｐｌｏｄ１）；ヌクレオビンジン（例えば、Ｎｕｃｂ１）；及びそれらの組み合わせの核酸配列に由来する１つ以上の５’－ＵＴＲ及び／または３’－ＵＴＲが挙げられる。

【0141】

ＩＩ．Ｂ．オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、タンパク質をコードするＯＲＦと、コードされたタンパク質の発現を増強することができる１つ以上のＵＴＲ（例えば、配列番号１３または配列番号１４）とを含む。本明細書にさらに記載されるように、コードされたタンパク質は、本明細書に記載される１つ以上のＵＴＲに対して異種である。したがって、コードされたタンパク質と本明細書に記載のＵＴＲ（例えば、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）とは、自然界では一緒に見出されない（例えば、インフルエンザウイルスの同じ株に由来しない）。そうでない場合、当該技術分野では周知の任意の適当なタンパク質を、本開示のポリヌクレオチドを使用してコードすることができる。例えば、いくつかの態様では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドのＯＲＦは、治療用タンパク質をコードする。本明細書で使用する「治療用タンパク質」という用語は、治療効果を発揮することができる（例えば、タンパク質またはポリペプチドに対する免疫応答を誘導する）任意のタンパク質またはポリペプチドを指す。本明細書で使用する場合、「治療効果」という用語は、対象に何らかの利益をもたらす効果（例えば、疾患または異常な状態、その症状、及び／またはその副作用の軽減、消失、または予防）を指す。

【0142】

いくつかの態様では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドのＯＲＦは、ウイルスタンパク質（すなわち、治療用タンパク質）をコードする。いくつかの態様では、ウイルスタンパク質はコロナウイルスに由来する（「コロナウイルスタンパク質」）。特定の態様では、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）、またはその両方を含む。特定の態様では、コロナウイルスは、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ；ＥＭＣ／２０１２としても知られる）を含む。したがって、特定の態様では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、単離ポリヌクレオチド）は、（ｉ）コロナウイルスタンパク質をコードするＯＲＦ、（ｉｉ）インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の５’非翻訳領域要素（５’－ＵＴＲ）（例えば、配列番号１３）、及び（ｉｉｉ）インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の３’非翻訳領域要素（３’－ＵＴＲ）（例えば、配列番号１４）を含む。本明細書で示されるように、いくつかの態様では、５’－ＵＴＲ及び／または３’－ＵＴＲは、ポリヌクレオチドが翻訳される際に、コードされたコロナウイルスタンパク質の発現を増加させる。

【0143】

コロナウイルスファミリーのすべてのメンバーは、２７～３３ｋｂのサイズの長い＋センスの一本鎖ＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスである。コロナウイルスのゲノムは、すべてのコロナウイルスに共通する、５’側のフレームシフトしたポリタンパク質（ＯＲＦ１ａ／ＯＲＦ１ａｂ）と４つのカノニカルな３’側の構造タンパク質、すなわちスパイク（Ｓ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質、及びヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質を含む５つの主要なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードしている。ウイルスエンベロープは脂質二重層で構成されており、その中に膜（Ｍ）、エンベロープ（Ｅ）、及びスパイク（Ｓ）構造タンパク質が固定されている（本明細書に参照によりその全容を援用するところのＣｈｅｎ ｅｔ． ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ ９２（４）：４１８－４２３（Ａｐｒ．２０２０））。現在知られているヒトコロナウイルス株には、（ｉ）ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）、（ｉｉ）ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３）、（ｉｉｉ）重症急性呼吸器症候群コロナウイルス１（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）、（ｉｖ）ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ニューヘブンコロナウイルス）、（ｖ）ヒトコロナウイルスＨＫＵ１、（ｖｉ）中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、新型コロナウイルス２０１２及びＨＣｏＶ－ＥＭＣとしても知られる）、及び（ｖｉｉ）重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）（２０１９－ｎＣｏＶ、新型コロナウイルス２０１９、またはＣＯＶＩＤ１９としても知られる）の７つがある。特に断らない限り、本明細書で使用する「コロナウイルス」という用語は、本明細書に記載のヒトコロナウイルスなどのコロナウイルス科のすべてのコロナウイルスを含み、そのすべての変異体及びバリアントを含む。いくつかの態様では、コロナウイルスは、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマクロナウイルス、デルタコロナウイルス、またはそれらの組み合わせである。このようなコロナウイルスの例示的な説明は、例えば、本明細書に参照によりその全容を援用するところのＫｒｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ａｄｖ ７（１０）：ｅａｂｆ１００４（Ｍａｒ．２０２１）に示されている。特定の態様では、コロナウイルスタンパク質（例えば、スパイクタンパク質）は、本明細書に参照によりその全容を援用するところのＴｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １５７（１２）：２３４９－５５（Ｄｅｃ．２０１２）に記載されるようなコウモリコロナウイルス（ＢｔＣｏＶ）に由来する。いくつかの態様では、コロナウイルスは人獣共通感染症コロナウイルス（すなわち、動物からヒトに移行したもの）を含む（例えば、本明細書に参照によりその全容を援用するところのＣｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７１（６５３０）：７３５－７４１（Ｆｅｂ．２０２１）を参照）。

【0144】

いくつかの態様では、コロナウイルスタンパク質は、スパイクタンパク質（またはその断片）を含む。例えば、特定の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、本開示の１つ以上のＵＴＲを含む）のＯＲＦは、Ｓ１スパイクタンパク質（またはその断片）をコードする。いくつかの態様では、ＯＲＦは、Ｓ１スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）をコードする。特定の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドのＯＲＦは、Ｓ２スパイクタンパク質（またはその断片）をコードする。特定の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドのＯＲＦは、コロナウイルスのＳ２’スパイクタンパク質（またはその断片）をコードする。いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドのＯＲＦは、コロナウイルスのエンベロープ（Ｅ）タンパク質（またはその断片）をコードする。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドのＯＲＦは、コロナウイルスの膜（Ｍ）タンパク質（またはその断片）をコードする。

【0145】

いくつかの態様では、ウイルスタンパク質はインフルエンザウイルス（「インフルエンザタンパク質」）に由来し、インフルエンザウイルスは本明細書に記載される１つ以上のＵＴＲに対して異種である。例えば、本明細書に記載されるように（例えば、実施例１を参照）、配列番号１３及び１４にそれぞれ記載のＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲは、それぞれ、２００９年パンデミックインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９＿Ａ／Ｋｏｒｅａ／０１／０９）のＨＡタンパク質に由来するものとした。したがって、本明細書に記載のポリヌクレオチドが配列番号１３及び１４に記載されるＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む場合、ポリヌクレオチドのＯＲＦは、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９＿Ａ／Ｋｏｒｅａ／０１／０９由来のＨＡタンパク質をコードしない。代わりに、いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドが、配列番号１３及び１４に記載されるＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む場合、ＯＲＦはＨ１Ｎ１ｐｄｍ０９＿Ａ／Ｋｏｒｅａ／０１／０９由来の非ＨＡインフルエンザタンパク質（例えば、本明細書に記載されるものなど）をコードする。特定の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドが、配列番号１３及び１４に記載されるＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む場合、ＯＲＦは、異なるインフルエンザ株に由来するタンパク質をコードする。このようなインフルエンザ株の非限定的な例は、当該技術分野では周知のものである（例えば、本明細書にそれぞれ参照によりその全容を援用するところの米国特許出願公開第２００７／０１４１０７８Ａ１号；及びＫｒａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｉｓ Ｐｒｉｍｅｒｓ ４（１）：３（Ｊｕｎ．２０１８）を参照）。

【0146】

インフルエンザウイルスは、セグメント化された－センスの一本鎖ＲＮＡゲノムを含むエンベロープウイルスである。インフルエンザウイルスには、（１）Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）、（２）Ｂ型インフルエンザウイルス（ＩＢＶ）、（３）Ｃ型インフルエンザウイルス（ＩＣＶ）、及び（４）Ｄ型インフルエンザウイルス（ＩＤＶ）の４つの種がある。ＩＡＶとＩＢＶには、１０種類の主要なタンパク質をコードする８つのゲノムセグメントがある。ＩＣＶとＩＤＶには、９種類の主要なタンパク質をコードする７つのゲノムセグメントがある。３つのセグメントは、転写酵素であるＰＢ１、５’キャップを認識するＰＢ２、及びエンドヌクレアーゼであるＰＡ（ＩＣＶ及びＩＤＶではＰ３）のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）複合体の３つのサブユニットをコードしている。マトリックスタンパク質（Ｍ１）と膜タンパク質（Ｍ２）は、非構造タンパク質（ＮＳ１）と核輸送タンパク質（ＮＥＰ）と同様にセグメントを共有している。ＩＡＶとＩＢＶでは、ヘマグルチニン（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）がそれぞれ１つのセグメントにコードされているのに対して、ＩＣＶとＩＤＶでは、ＨＡとＮＡの機能を融合したヘマグルチニン－エステラーゼ融合（ＨＥＦ）タンパク質が１つのセグメントにコードされている。最後のゲノムセグメントはウイルス核タンパク質（ＮＰ）をコードしている。インフルエンザウイルスは、ＰＢ１－Ｆ２及びＰＡ－Ｘなどの様々なアクセサリータンパク質もコードしており、これらは別のオープンリーディングフレームから発現され、宿主防御の抑制、毒性、及び病原性に重要である。

【0147】

インフルエンザウイルス株は、起源の宿主種、単離された地理的場所及び年、シリアル番号に従って分類され、Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）ではＨＡ及びＮＡのサブタイプの血清学的特性によって分類される。ＩＡＶでは、少なくとも１６のＨＡサブタイプ（Ｈ１～Ｈ１６）と９つのＮＡサブタイプ（Ｎ１～Ｎ９）が確認されている。例えば、本明細書にそれぞれ参照によりその全容を援用するところの米国特許出願公開第２００７／０１４１０７８Ａ１号；及びＫｒａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｉｓ Ｐｒｉｍｅｒｓ ４（１）：３（Ｊｕｎ．２０１８）を参照）。そうでない旨が示されない限り、本明細書で使用する「インフルエンザ」という用語は、インフルエンザウイルスのすべての種、サブタイプ、及び／または株を含む。

【0148】

本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドのＯＲＦは、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質をコードし、ＨＡタンパク質は、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９＿Ａ／Ｋｏｒｅａ／０１／０９に由来しない。いくつかの態様では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドのＯＲＦは、インフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質をコードする。いくつかの態様では、ＯＲＦはインフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）をコードする。いくつかの態様では、ＯＲＦはインフルエンザマトリックス１（Ｍ１）タンパク質をコードする。いくつかの態様では、ＯＲＦはインフルエンザマトリックス２（Ｍ２）タンパク質をコードする。いくつかの態様では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドのＯＲＦは、インフルエンザ非構造タンパク質１（ＮＳ１）タンパク質をコードする。いくつかの態様では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドのＯＲＦは、インフルエンザ非構造タンパク質２（ＮＳ２）タンパク質をコードする。特定の態様では、ＯＲＦはインフルエンザポリメラーゼ酸性（ＰＡ）タンパク質をコードする。いくつかの態様では、ＯＲＦはインフルエンザポリメラーゼ塩基性１（ＰＢ１）タンパク質をコードする。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドのＯＲＦは、インフルエンザＰＢ１－Ｆ２タンパク質をコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドのＯＲＦはインフルエンザポリメラーゼ塩基性２（ＰＢ２）タンパク質をコードする。

【0149】

いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドのＯＲＦは、腫瘍抗原をコードする。したがって、いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、単離ポリヌクレオチド）は、（ｉ）腫瘍抗原をコードするＯＲＦ、（ｉｉ）インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の５’非翻訳領域要素（５’－ＵＴＲ）（例えば、配列番号１３）、及び（ｉｉｉ）インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の３’非翻訳領域要素（３’－ＵＴＲ）（例えば、配列番号１４）を含む。本開示から明らかなように、当該技術分野では周知の任意の腫瘍抗原を、本明細書に記載のポリヌクレオチドのＯＲＦを使用してコードすることができる。そのような腫瘍抗原の非限定的な例としては、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ－ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ、例えばＭＡＧＥＡ３）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＴＡＧ－７２、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ＧＤ２、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、メソテリン、ＶＥＧＦＲ、α－葉酸受容体、ＣＥ７Ｒ、ＩＬ－３、がん－精巣抗原（例えば、ニューヨーク食道扁平上皮癌１（ＮＹ－ＥＳＯ－１））、ＭＡＲＴ－１ ｇｐ１００、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、グリピカン２、グリピカン３、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド、及びこれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの態様では、腫瘍抗原はＢＣＭＡである。いくつかの態様では、腫瘍抗原はＮＹ－ＥＳＯ－１である。いくつかの態様では、腫瘍抗原はＭＡＧＥＡ３である。

【0150】

いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドのＯＲＦは、遺伝子疾患に関連したタンパク質をコードする。いずれの理論にも束縛されるものではないが、いくつかの態様では、ＯＲＦは、遺伝子疾患を有する対象における機能不全のタンパク質をコードすることができ、それにより、ＯＲＦを含むポリヌクレオチドが対象に投与される際、コードされたタンパク質が機能不全のタンパク質に関連する機能の回復を助けることができ、それによって遺伝子疾患に関連する１つ以上の症状を治療及び／または軽減することができる。例えば、いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドを使用して治療することができる遺伝子疾患には、ハンター症候群が含まれる。

【0151】

本明細書で使用する場合、「ハンター症候群」とは、グリコサミノグリカン（またはＧＡＧまたはムコ多糖）と呼ばれる大きな糖分子が様々な身体組織に蓄積する稀な遺伝子疾患を指す。ＧＡＧの蓄積は、これらに限定されるものではないが、顔面異常（例えば、唇の肥厚、広い鼻と広がった鼻孔、舌の突出）、拡大した頭部；低くてかすれた声；異常な骨の大きさまたは形状ならびにその他の骨格の不規則性；臓器の肥大による腹部の膨張；慢性下痢；小石に似た白色皮膚増殖；関節の剛直；攻撃的な行動；成長の鈍化；発達の遅れ（歩行または発話の遅れなど）；難聴；心臓弁関連疾患；閉塞性呼吸器疾患；睡眠時無呼吸；及びそれらの組み合わせを含む広範な症状を引き起こす可能性がある。ハンター症候群は、リソソーム酵素であるイズロネート－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）の欠損によって引き起こされる。したがって、いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドのＯＲＦは、Ｉ２Ｓ酵素をコードする。

【0152】

いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、目的のタンパク質をコードする単一のＯＲＦを含む。特定の態様では、記載されるポリヌクレオチドは、複数のＯＲＦを含む（すなわち、ポリシストロン性ポリヌクレオチド）。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれよりも多いＯＲＦを含む。特定の態様では、複数のＯＲＦのうちの１つ以上のものは、異なる目的のタンパク質をコードする。

【0153】

ＩＩ．Ｃ．他の構成要素
いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）は、コードされたタンパク質の発現をさらに増加させるのに役立つ１つ以上の追加の構成要素をさらに含む。そのような構成要素の非限定的な例を以下に記載する。

【0154】

ＩＩ．Ｃ．１．キャップ
例えば、特定の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは５’キャップを含む。したがって、いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは（５’～３’の方向に）、（ｉ）５’キャップ、（ｉｉ）ＨＡ－５’－ＵＴＲ（例えば、配列番号１３）、（ｉｉｉ）目的のタンパク質をコードするＯＲＦ、及び（ｉｖ）ＨＡ－３’－ＵＴＲ（例えば、配列番号１４）を含む。

【0155】

本明細書で使用される場合、「５’キャップ」という用語は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’末端に付加され得る修飾ヌクレオチド（例えば、グアニン）を指す。５’キャップ構造は、ポリヌクレオチドの核輸送（例えば、翻訳が行われる細胞質への）においての役割を果たすことができ、かつ／またはポリヌクレオチドの安定性を促進することができる。いくつかの態様では、５’キャップは、５’－５’－三リン酸結合を介して本明細書に記載のポリヌクレオチドの５’末端に連結することができる。特定の態様では、５’キャップはメチル化することができる（例えば、ｍ７ＧｐｐｐＮ、ここで、Ｎはポリヌクレオチドの末端５’ヌクレオチドである）。当該技術分野では周知の任意の適当な５’キャップを、本開示とともに使用することができる。本開示とともに使用することができる５’キャップの非限定的な例としては、ｍ_２ ^{７，２’－Ｏ}Ｇｐｐ_ｓｐＧＲＮＡ、ｍ^７ＧｐｐｐＧ、ｍ^７Ｇｐｐｐｐｍ^７Ｇ、ｍ_２ ^{（７，３’－Ｏ）}ＧｐｐｐＧ、ｍ_２ ^{（７，２’－Ｏ）}ＧｐｐｓｐＧ（Ｄ１）、ｍ_２ ^{（７，２’－Ｏ）}ＧｐｐｓｐＧ（Ｄ２）、ｍ_２ ^{７，３’－Ｏ}Ｇｐｐｐ（ｍ_１ ^２’－Ｏ）ＡｐＧ、（ｍ^７Ｇ－３’ｍｐｐｐ－Ｇ、これは、同等なものとして、３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを指定することができる）、Ｎ７，２’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン、ｍ^７Ｇｍ－ｐｐｐ－Ｇ、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－ｍ^３’－ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ、ｐＮ２ｐ、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ、７ｍＧ（５’）－ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ ｍｐ、ｍ（７）Ｇｐｐｐｍ（３）（６，６，２’）Ａｐｍ（２’）Ａｐｍ（２’）Ｃｐｍ（２）（３，２’）Ｕｐ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジド－グアノシン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ、またはそれらの組み合わせが挙げられる。

【0156】

いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドとともに使用することができる５’キャップは、キャップアナログ（「合成キャップアナログ」、「化学キャップ」、「化学キャップアナログ」、または「構造的または機能的キャップアナログ」としても知られる）を含む。「キャップアナログ」は、キャップ機能を保持する一方で、それらの化学構造において天然（すなわち、内因性、野生型、または生理学的）５’キャップとは異なる。キャップアナログの非限定的な例は、本明細書にそれぞれ参照によりその全容を援用するところのＵＳ８，５１９，１１０及びＫｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１：４５７０－４５７４（２０１３）に記載されている。

【0157】

いくつかの態様では、５’キャップは修飾される。５’キャップの修飾により、ポリヌクレオチドの安定性、半減期、及び／または翻訳効率をさらに高めることができる。いくつかの態様では、修飾５’キャップは、以下の修飾、すなわち、キャップされたグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）の２’及び／または３’位の修飾、（炭素環式環を形成する）糖環の酸素のメチレン部分（ＣＨ２）による置換、キャップ構造の三リン酸架橋部分の修飾、または核酸塩基（Ｇ）部分の修飾のうちの１つ以上のものを含む。例えば、本明細書に参照によりその全容を援用するところのＵＳ２０１４／０１４７４５４及びＷＯ２０１８／１６０５４０を参照されたい。

【0158】

ＩＩ．Ｃ．２．ポリ（Ａ）テール
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）は、ポリヌクレオチドの３’末端にアデニンヌクレオチドの長鎖（本明細書では「ポリ（Ａ）テール」と呼ぶ）をさらに含む。特定の態様では、ポリ（Ａ）テールは、単独で、または本明細書に記載の他の構成要素（例えば、５’キャップ）と組み合わせて存在する。したがって、いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは（５’～３’の方向に）、（ｉ）５’キャップ、（ｉｉ）ＨＡ－５’－ＵＴＲ（例えば、配列番号１３）、（ｉｉｉ）目的のタンパク質をコードするＯＲＦ、（ｉｖ）ＨＡ－３’－ＵＴＲ（例えば、配列番号１４）、及び（ｖ）３’ポリ（Ａ）テールを含む。

【0159】

いくつかの態様では、ポリ（Ａ）テールの長さは、約３０ヌクレオチド長よりも長い。特定の態様では、ポリ（Ａ）テールの長さは、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１１０ヌクレオチド、少なくとも約１２０ヌクレオチド、少なくとも約１３０ヌクレオチド、少なくとも約１４０ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約１６０ヌクレオチド、少なくとも約１７０ヌクレオチド、少なくとも約１８０ヌクレオチド、少なくとも約１９０ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約２５０ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約３５０ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくとも約４５０ヌクレオチド、または少なくとも約５００ヌクレオチドまたはそれよりも大きい長さである。

【0160】

当該技術分野では周知の任意の適当なポリ（Ａ）テールを、本開示とともに使用することができる。本開示とともに使用することができるポリ（Ａ）テールの非限定的な例としては、ＳＶ４０ポリ（Ａ）、ｂＧＨポリ（Ａ）、アクチンポリ（Ａ）、ヘモグロビンポリ（Ａ）、ポリ（Ａ）－Ｇカルテット、またはその組み合わせが挙げられる。

【0161】

ＩＩ．Ｃ．３．エンハンサー
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）によってコードされるタンパク質の発現は、１つ以上のエンハンサー配列（本明細書では「翻訳エンハンサーエレメント」または「ＴＥＥ」とも呼ばれる）を使用してさらに増加させることができる。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個、少なくとも約４０個、少なくとも約４５個、または少なくとも約５０個またはそれよりも多くのエンハンサー配列を含む。ポリヌクレオチドが複数のエンハンサーを含む場合、特定の態様では、各エンハンサーは同じである。いくつかの態様では、１つ以上のエンハンサーが異なる。いくつかの態様では、１つ以上のエンハンサーはスペーサーによって分離される。

【0162】

当該技術分野では周知の任意のエンハンサーを本開示のポリヌクレオチドとともに使用することができる（例えば、本明細書にそれぞれ参照によりその全容を援用するところのＷＯ１９９９０２４５９５、ＷＯ２０１２００９６４４、ＷＯ２００９０７５８８６及びＷＯ２００７０２５００８、欧州特許公開第ＥＰ２６１０３４１Ａ１及びＥＰ２６１０３４０Ａ１、米国特許第６，３１０，１９７号、米国特許第６，８４９，４０５号、米国特許第７，４５６，２７３号、米国特許第７，１８３，３９５号を参照されたい）。いくつかの態様では、本開示で有用なエンハンサーは、組織特異エンハンサーである。特定の態様では、本開示とともに使用できるエンハンサーは、ヒト骨格アクチン遺伝子エレメント、心臓アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ（例えばＭＥＦ２）、ＭｙｏＤエンハンサーエレメント、心臓エンハンサー因子（ＣＥＦ）部位、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格速筋型トロポニンＣ遺伝子エレメント、遅筋型心筋トロポニンＣ遺伝子エレメント、遅筋型トロポニンＩ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性エレメント、グルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。

【0163】

ＩＩ．Ｃ．４．マイクロＲＮＡ結合部位
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）中に存在し得る１つ以上の追加の構成要素は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位を含む。

【0164】

ｍｉＲＮＡは、ポリヌクレオチドの３’－ＵＴＲに結合する非コード配列であり、ポリヌクレオチドの安定性を低下させるかまたは翻訳を阻害することによって遺伝子発現を減少させることができる。いずれの理論にも束縛されるものではないが、いくつかの態様では、ｍｉＲＮＡ結合部位を本明細書に記載のポリヌクレオチドに組み込むことによって、コードされたタンパク質の発現をさらに調節することができる。例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチドが肝臓を標的とすることを意図していない場合、肝臓に豊富に存在するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１２２）に対する結合部位を含むようにポリヌクレオチドを改変することによって、対象に投与される際にコードされたタンパク質が肝臓で発現されないようにすることができる。異なる組織で豊富に発現されるｍｉＲＮＡの非限定的な例としては、肝臓（ｍｉＲ－１２２）、筋肉（ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ－１７－９２、ｍｉＲ－１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７）、脂肪組織（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ－１ｄ、ｍｉＲ－１４９）、腎臓（ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－２０４）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１２６）が挙げられる。

【0165】

ｍｉＲＮＡは免疫細胞内で差次的に発現されることも知られている。本明細書で使用する場合、「免疫細胞」には、これらに限定されるものではないが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞及びマクロファージ）、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。いくつかの態様では、特定の免疫細胞で豊富に発現されるｍｉＲＮＡに対する結合部位を導入することによって、本開示のポリヌクレオチドを、特定の免疫細胞にターゲティングすることができ、それにより宿主免疫応答を調節することができる（例えば、骨髄樹状細胞で豊富に発現されるｍｉＲ－１４２及び／またはｍｉＲ－１４６に対する結合部位を導入することにより、そのような細胞を標的化することを回避するように本開示のポリヌクレオチドを操作することができる）。

【0166】

同様に、特定の罹患細胞／組織（例えば、腫瘍細胞または病原体に感染した細胞）は、健康な細胞／組織と比較して異なるｍｉＲＮＡ発現プロファイルを有する（例えば、あるものは過剰発現され、他のものは過小発現される）。例えば、本明細書にそれぞれ参照によりその全容を援用するところのＵＳ２０１３／００５３２６４（前立腺癌）、ＵＳ２０１１／０１７１６４６（膵臓癌）、ＵＳ８，４１５，０９６（喘息及び炎症）、ＵＳ２０１２／０３２９６７２（肝臓癌）、及びＵＳ２０１３／００５３２６３（肺疾患）を参照されたい。したがって、特定のｍｉＲＮＡに対する結合部位を導入することによって、本開示のポリヌクレオチドは、特定の罹患細胞／組織を特異的に標的とするように操作することもできる。

【0167】

いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含む。特定の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、複数のｍｉＲＮＡ結合部位を含む。例えば、いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、または少なくとも約１０個またはそれよりも多くのｍｉＲＮＡ結合部位を含む。ポリヌクレオチドが複数のｍｉＲＮＡ結合部位を含む場合、いくつかの態様では、複数のｍｉＲＮＡ結合部位は同じである。特定の態様では、複数のｍｉＲＮＡ結合部位のうちの１つ以上のものは異なる（例えば、複数のｍｉＲＮＡ結合部位のそれぞれは、異なるｍｉＲＮＡに特異的である）。

【0168】

ＩＩ．Ｃ．５．ＩＲＥＳ配列
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。ＩＲＥＳは、５’キャップ構造の非存在下でタンパク質合成を開始する際に重要な役割を果たす。ＩＲＥＳは、唯一のリボソーム結合部位として機能することもでき、ポリヌクレオチドの複数のリボソーム結合部位のうちの１つとして機能することもできる。複数の機能的リボソーム結合部位を含むポリヌクレオチドは、リボソームによって独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードすることができる（「ポリシストロン性ポリヌクレオチド」）。したがって、本明細書に記載のポリヌクレオチドがＩＲＥＳをコードする配列を含む場合、特定の態様では、ポリヌクレオチドは複数（例えば、少なくとも２つ）の翻訳可能領域を含むことができる。

【0169】

当該技術分野では周知の任意のＩＲＥＳ配列を本開示とともに使用することができる。本開示で使用することができるＩＲＥＳ配列の非限定的な例としては、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、コオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）、またはそれらの組み合わせに由来する配列が挙げられる。

【0170】

ＩＩ．Ｃ．６．転写後調節エレメント
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）とともに使用することができる追加の構成要素は、転写後調節エレメントを含む。いくつかの態様では、転写後調節エレメントは、本明細書に記載されるポリヌクレオチド中に本明細書に記載される１つ以上の他の構成要素（例えば、５’キャップ、３’ポリ（Ａ）テール、エンハンサー配列、ｍｉＲＮＡ結合部位、ＩＲＥＳ配列、またはそれらの組み合わせ）と組み合わせて存在することができる。特定の態様では、翻訳後調節エレメントは、本明細書に記載のポリヌクレオチドのＯＲＦの３’側に位置する。本開示で有用な転写後調節エレメントの非限定的な例としては、変異型ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、マイクロＲＮＡ結合部位、ＤＮＡ核標的化配列、またはそれらの組み合わせが挙げられる。

【0171】

いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）中に存在し得る１つ以上の追加の構成要素は、プロモーターを含む。特定の態様では、ポリヌクレオチドは単一のプロモーターを含むことができる。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリヌクレオチドのＯＲＦと機能的に連結された複数のプロモーター（例えば、２、３、４、または５個以上）を含むことができる。ポリヌクレオチドが複数のプロモーターを含む場合、いくつかの態様では、複数のプロモーターのそれぞれは同じである。特定の態様では、複数のプロモーターのうちの１つ以上は異なる。

【0172】

いくつかの態様では、本開示で有用なプロモーターは、哺乳動物プロモーター、ウイルスプロモーター、またはその両方を含む。特定の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドとともに使用できるプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、またはその両方を含む。

【0173】

構成的哺乳動物プロモーターとしては、これらに限定されるものではないが、以下の遺伝子のプロモーターが挙げられる：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、β－アクチンプロモーター、及びその他の構成的プロモーター。真核細胞において構成的に機能するウイルスプロモーターの例としては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）、及びその他のレトロウイルス由来のプロモーター、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、本開示とともに使用することができるプロモーターとしては、誘導性プロモーターがある。誘導性プロモーターは、誘導剤の存在下で発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、特定の金属イオンの存在下で誘導されて転写及び翻訳を促進する。いくつかの態様では、使用することができるプロモーターはＴ７プロモーターを含む。

【0174】

ＩＩ．Ｄ．修飾ヌクレオシド／ヌクレオチド
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）は、少なくとも１つの化学修飾ヌクレオシド及び／またはヌクレオチドを含む。本開示のポリヌクレオチドが化学修飾されている場合、ポリヌクレオチドは、「修飾されたポリヌクレオチド」と称され得る。

【0175】

「ヌクレオシド」は、糖分子（例えば、ペントースまたはリボース）またはその誘導体を、有機塩基（例えば、プリンまたはピリミジン）またはその誘導体（本明細書において「核酸塩基」とも称される）とともに含有する化合物を指す。「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾されたヌクレオチドは、１つ以上の修飾されたまたは非天然ヌクレオシドを含むように、任意の有用な方法により、例えば、化学的に、酵素的に、または組換えにより合成され得る。

【0176】

ポリヌクレオチドは、連結されたヌクレオシドの領域または複数の領域を含み得る。かかる領域は、可変的な骨格結合を有し得る。結合は、標準的なホスホジエステル結合であってよく、その場合、ポリヌクレオチドはヌクレオチドの領域を含む。

【0177】

本明細書のポリヌクレオチドは、様々な異なる修飾を含むことができる。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、１個、２個、またはそれ以上（任意選択的に異なる）のヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を有することができる。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、１つ以上の所望の特性、例えば、未修飾ポリヌクレオチドと比較して改善された熱または化学安定性、低減された免疫原性、低減された分解、標的マイクロＲＮＡに対する結合の増加、他のマイクロＲＮＡまたは他の分子に対する低減された非特異的結合を示し得る。

【0178】

いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、化学修飾されている。本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチドに関して、「化学修飾」または必要に応じて「化学修飾された」という用語は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、チミジン（Ｔ）、またはシチジン（Ｃ）リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドに対する、限定されるものではないが、それらの核酸塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるそれらの位置、パターン、パーセント、または集団のうちの１つ以上における修飾を指す。

【0179】

いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、同じヌクレオシド種類のすべてもしくはいずれかの均一な化学修飾、または同じヌクレオシド種類のすべてもしくはいずれかにおける同じ出発修飾の下方滴定（ｄｏｗｎｗａｒｄ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）によって生成される修飾の群、またはランダムな組み込みを伴うことを除いて同じヌクレオシド種類のすべてもしくはいずれかの測定されたパーセントの化学修飾を有し得る。さらなる態様では、本開示のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド全体にわたって同じヌクレオシド種類のうちの２つ、３つ、または４つの均一な化学修飾を有し得る（例えば、すべてのウリジン及び／またはすべてのシトシンなどが、同じように修飾される）。

【0180】

修飾されたヌクレオチドの塩基対形成は、標準的なアデニン－チミン、アデニン－ウラシル、またはグアニン－シトシン塩基対だけでなく、ヌクレオチド及び／または非標準的もしくは修飾塩基を含む修飾ヌクレオチドの間で形成される塩基対も包含し、ここで、水素結合ドナー及び水素結合アクセプターの配置が、非標準的塩基と標準的塩基との間、または２つの相補的な非標準的塩基構造間の水素結合を可能にする。かかる非標準的塩基対形成の１つの例は、修飾された核酸塩基イノシンとアデニン、シトシン、またはウラシルとの間の塩基対形成である。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせが、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。

【0181】

当業者は、特に注記される場合を除き、本出願に記載されるポリヌクレオチド配列は、代表的なＤＮＡ配列において「Ｔ」を列挙するが、配列がＲＮＡを表す場合、「Ｔ」は「Ｕ」と置換されることを理解するであろう。例えば、本開示のＴＤは、ＲＮＡとして、ＤＮＡとして、またはＲＮＡ及びＤＮＡ単位の両方を含むハイブリッド分子として投与することができる。

【0182】

いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、８つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１８、２０以上）の修飾された核酸塩基の組み合わせを含む。

【0183】

いくつかの態様では、ポリヌクレオチド内の核酸塩基、糖、骨格結合、またはそれらの任意の組み合わせは、少なくとも約５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％修飾される。

【0184】

ＩＩ．Ｄ．１．塩基修飾
特定の態様では、化学修飾は、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）中の核酸塩基に行われる。いくつかの態様では、少なくとも１つの化学修飾ヌクレオシドは、修飾されたウリジン（例えば、シュードウリジン（ψ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１ψ）、または５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ））、修飾されたシトシン（例えば、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ））、修飾されたアデノシン（例えば、１－メチル－アデノシン（ｍ１Ａ）、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）、または２－メチルアデニン（ｍ２Ａ））、修飾されたグアノシン（例えば、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）または１－メチルグアノシン（ｍ１Ｇ））、またはそれらの組み合わせである。

【0185】

いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、特定の修飾について均一に修飾される（例えば、完全に修飾される、配列全体にわたって修飾されるなど）。例えば、ポリヌクレオチドは、同じ種類の塩基修飾、例えば、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）により均一に修飾され得、これは、ポリヌクレオチド配列におけるすべてのシトシン残基が、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）と置き換えられることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドは、配列に存在する任意の種類のヌクレオシド残基について、修飾されたヌクレオシド、例えば、上記に記載されるもののいずれかとの置換により均一に修飾され得る。

【0186】

いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の修飾された核酸塩基の組み合わせを含む。いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチド中の１種類の核酸塩基の少なくとも約５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％が、修飾された核酸塩基である。

【0187】

ＩＩ．Ｄ．２．骨格修飾
いくつかの態様では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ヌクレオシド間の任意の有用な結合を含むことができる。本開示の組成物において有用な、骨格修飾を含むそのような結合としては、これらに限定されるものではないが、以下のものが挙げられる：３’－アルキレンホスホネート、３’－アミノホスホロアミダート、アルケン含有骨格、アミノアルキルホスホロアミダート、アミノアルキルホスホトリエステル、ボラノホスフェート、－ＣＨ_２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２－、キラルホスホネート、キラルホスホロチオネート、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレン（メチルイミノ）、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、モルホリノ結合、－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、ヘテロ原子ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオシド、ホスフィナート、ホスホロアミダート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、ホスホロチオネート、ホスホトリエステル、ＰＮＡ、シロキサン骨格、スルファメート骨格、スルフィド、スルホキシド、及びスルホン骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにチオノホスホロアミダート。

【0188】

いくつかの態様では、上記に開示される骨格結合の存在は、本開示のポリヌクレオチドの安定性及び分解に対する耐性を増加させる。いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチド中の少なくとも約５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の骨格結合が修飾される（例えば、それらのすべてがホスホロチオエートである）。

【0189】

いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドに含めることができる骨格修飾は、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）及び／またはホスホロチオエート（ＰＳ）修飾を含む。

【0190】

ＩＩ．Ｄ．３．糖修飾
本開示のポリヌクレオチドに組み込まれ得る修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチドは、核酸の糖に対して修飾され得る。ＬＮＡまたは２’－置換糖などの親和性改善ヌクレオチドアナログを組み込むことによって、ポリヌクレオチドの長さ及び／またはサイズを変える（例えば、減少させる）ことができる。

【0191】

いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチド中の少なくとも約５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチドが糖修飾（例えば、ＬＮＡ）を有する。

【0192】

本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であってよい。一般に、ＲＮＡは、酸素を有する五員環である糖基リボースを含む。非限定的な例示的修飾ヌクレオチドとしては、リボースにおける酸素の（例えば、Ｓ、Ｓｅ、またはアルキレン、例えば、メチレンまたはエチレンとの）置換；二重結合の付加（例えば、リボースのシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルとの置換）；リボースの環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの四員環の形成）；リボースの環拡大（例えば、追加の炭素またはヘテロ原子を有する六または七員環の形成、例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、及びホスホロアミダート骨格も有するモルホリノ）；多環式形態（例えば、トリシクロ、及び「アンロックド」形態、例えば、グリコール核酸（ＧＮＡ）（例えば、Ｒ－ＧＮＡまたはＳ－ＧＮＡ、ここで、リボースは、ホスホジエステル結合に結合されたグリコールユニットと置き換えられる）、トレオース核酸（ＴＮＡ、ここで、リボースは、α－Ｌ－トレオフラノシル－（３’→２’）と置き換えられる）、及びペプチド核酸（ＰＮＡ、ここで、２－アミノ－エチル－グリシン結合が、リボース及びホスホジエステル骨格と置き換わる）が挙げられる。糖基は、リボースにおける対応する炭素と反対の立体化学配置を有する１つ以上の炭素も含有し得る。したがって、ポリヌクレオチド分子は、糖として、例えば、アラビノースを含有するヌクレオチドを含み得る。

【0193】

リボースの２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、いくつかの異なる置換基で修飾または置換され得る。２’－位での例示的な置換としては、限定されるものではないが、Ｈ、ハロ、任意選択的に置換されたＣ_１～６アルキル；任意選択的に置換されたＣ_１～６アルコキシ；任意選択的に置換されたＣ_６～１０アリールオキシ；任意選択的に置換されたＣ_３～８シクロアルキル；任意選択的に置換されたＣ_３～８シクロアルコキシ；任意選択的に置換されたＣ_６～１０アリールオキシ；任意選択的に置換されたＣ_６～１０アリール－Ｃ_１～６アルコキシ、任意選択的に置換されたＣ_１～１２（ヘテロシクリル）オキシ；糖（例えば、リボース、ペントース、または本明細書に記載されるいずれか）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、－Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２ＯＲ（ここで、Ｒは、Ｈまたは任意選択的に置換されたアルキルであり、ｎは、０～２０（例えば、０～４、０～８、０～１０、０～１６、１～４、１～８、１～１０、１～１６、１～２０、２～４、２～８、２～１０、２～１６、２～２０、４～８、４～１０、４～１６、及び４～２０）の整数である）；「ロックド」核酸（ＬＮＡ）（２’－ヒドロキシが、Ｃ_１～６アルキレンまたはＣ_１～６ヘテロアルキレン架橋により、同じリボース糖の４’－炭素に連結されており、ここで、例示的な架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、アミノ架橋、アミノアルキル、アミノアルコキシ、アミノ、及びアミノ酸が挙げられる）が挙げられる。

【0194】

いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドアナログは、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡユニット、２’－ＯＭｅ－ＲＮＡユニット、２’－Ｏ－アルキル－ＳＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡユニット、２’－フルオロ－ＤＮＡユニット、ＬＮＡユニット、アラビノ核酸（ＡＮＡ）ユニット、２’－フルオロ－ＡＮＡユニット、ＨＮＡユニット、ＩＮＡ（インターカレーティング核酸）ユニット、２’ＭＯＥユニット、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、ＬＮＡは、例えば、オキシＬＮＡ（例えば、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡまたはα－Ｌ－オキシ－ＬＮＡ）、アミノＬＮＡ（例えば、β－Ｄ－アミノ－ＬＮＡまたはα－Ｌ－アミノ－ＬＮＡ）、チオＬＮＡ（例えば、β－Ｄ－チオ０－ＬＮＡまたはα－Ｌ－チオ－ＬＮＡ）、ＥＮＡ（例えば、β－Ｄ－ＥＮＡまたはα－Ｌ－ＥＮＡ）、またはそれらの任意の組み合わせである。さらなる態様では、本開示のポリヌクレオチドに含めることができるヌクレオチドアナログは、ロック核酸（ＬＮＡ）、アンロック核酸（ＵＮＡ）、アラビノ核酸（ＡＢＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、及び／またはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。

【0195】

いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、修飾されたＲＮＡヌクレオチドアナログ（例えば、ＬＮＡ）及びＤＮＡ単位の両方を含み得る。いくつかの態様では、ｍｉＲ－４８５阻害剤はギャップマーである。例えば、米国特許第８，４０４，６４９号、同第８，５８０，７５６号、同第８，１６３，７０８号、同第９，０３４，８３７号（これらのいずれも本明細書に参照によりその全容を援用する）を参照されたい。いくつかの態様では、

【0196】

いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼによる速やかな分解を防止するための修飾を含むことができる。修飾としては、これらに限定されるものではないが、例えば、（ａ）末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、脱リン酸化、共役化、反転結合など）、３’末端修飾（共役化、ＤＮＡヌクレオチド、反転結合など）、（ｂ）塩基修飾、例えば、修飾塩基、安定化塩基、不安定化塩基、または広範なパートナーと塩基対合する塩基、または共役化塩基による置換、（ｃ）糖修飾（例えば、２’位または４’位における）または糖の置換、ならびに（ｄ）ホスホジエステル結合の修飾または置換を含む、ヌクレオシド間結合の修飾が挙げられる。

【0197】

ＩＩＩ．ベクター
いくつかの態様では、本明細書では、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）を含むベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。本明細書に記載されるように、かかるベクターは、宿主細胞及び治療的介入の標的とされる細胞における組換え発現に有用である。「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子、または別の核酸を輸送することができるそのような核酸分子を含む存在を指すことが意図される。いくつかの態様では、ベクターは、「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。いくつかの態様では、ベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲートすることができる。特定のベクターまたはベクターの一部であるポリヌクレオチドは、それらが導入される宿主細胞において自己複製が可能である（例えば、細菌起源の複製を有する細菌ベクター及びエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれることが可能で、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが機能可能に連結された遺伝子の発現を誘導することができる。そのようなベクターは、本明細書では、「組み換え発現ベクター」（または、単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組み換えＤＮＡ技法において利用される発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。プラスミドは最も一般的に使用されるベクターの形態であることから、本開示では「プラスミド」と「ベクター」とは、文脈に応じて互換的に使用される場合があり得る。しかしながら、本開示では、同等の機能を有するウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、複製不能レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスなど）などの他の形態の発現ベクターも開示される。

【0198】

いくつかの態様では、ベクターは、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）及び調節エレメントを含む。例えば、特定の態様では、ベクターは、プロモーターに機能的に連結された本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）を含む。いくつかの態様では、ベクターは、第１のＯＲＦ及び第２のＯＲＦを含むことができ、第１のＯＲＦは第１のプロモーターの制御下にあり、第２のＯＲＦは第２のプロモーターの制御下にある。本明細書に記載のポリヌクレオチドが複数のＯＲＦ（例えば、２、３、４、または５つ以上）を含む場合、特定の態様では、複数のプロモーターのそれぞれは同じである。いくつかの態様では、複数のプロモーターのうちの１つ以上は異なる。

【0199】

当該技術分野において既知の任意の適したプロモーターを本開示で使用することができる。いくつかの態様では、本開示に有用なプロモーターは、構成的または誘導的プロモーターなどの哺乳動物またはウイルスプロモーターを含む。いくつかの態様では、本開示のためのプロモーターは、少なくとも１つの構成的プロモーター及び少なくとも１つの誘導的プロモーター、例えば、組織特異的なプロモーターを含む。

【0200】

構成的哺乳動物プロモーターとしては、以下の遺伝子に対するプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ベータ－アクチンプロモーター、及びその他の構成的プロモーター。真核細胞において構成的に機能する例示的なウイルスプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）、及びその他のレトロウイルス由来のプロモーター、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。本明細書に記載される通り、いくつかの態様では、本開示で使用され得るプロモーターは、誘導的プロモーターである。誘導的プロモーターは、誘導剤の存在下において発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、特定の金属イオンの存在下において転写及び翻訳を促進するよう誘導される。複数の誘導性プロモーターが存在する場合、それらを同じインデューサー分子または異なるインデューサーによって誘導することができる。いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドとともに使用することができるプロモーターには、Ｔ７プロモーターが含まれる。

【0201】

本開示の他の場所にさらに記載されるように、いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）を含むベクターは、１つ以上の調節エレメントをさらに含むことができる。調節エレメントの非限定的な例としては、翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）、翻訳開始配列、マイクロＲＮＡ結合部位もしくはそのシード、連結ヌクレオシドの３’テーリング領域、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、転写後制御モジュレーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、局在化配列（例えば、膜局在化配列、核局在化配列、核排除配列（ｎｕｃｌｅａｒ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、もしくはプロテアソーム標的化配列）、翻訳後修飾配列（例えば、ユビキチン化、リン酸化、もしくは脱リン酸化）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。

【0202】

いくつかの態様では、ベクターは、転位因子をさらに含んでもよい。したがって、特定の態様では、ベクターは、少なくとも２つのトランスポゾン特異的な末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が隣接した、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）を含む。いくつかの態様では、トランスポゾン特異的ＩＴＲは、ＤＮＡトランスポゾンによって認識される。いくつかの態様では、トランスポゾン特異的なＩＴＲは、レトロトランスポゾンによって認識される。核酸分子を宿主細胞、例えば、免疫細胞のゲノムに導入するために、当該技術分野において既知の任意のトランスポゾン系を使用することができる。いくつかの態様では、トランスポゾンは、ｈＡＴ様Ｔｏｌ２、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの態様では、トランスポゾンは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙを含む。いくつかの態様では、トランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃを含む。例えば、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｌ．Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５（１）：１２０－２５（２０１６）（本明細書に参照によりその全容を援用する）を参照されたい。

【0203】

いくつかの態様において、ベクターは、トランスファーベクターである。用語「トランスファーベクター」は、単離された核酸（例えば、本開示のポリヌクレオチド）を含み、細胞の内部に単離された核酸を送達するために使用され得る物質の組成物を指す。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と関連づけられるポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含むが、これらに限定されない多数のベクターが当該技術分野で知られている。したがって、「トランスファーベクター」という用語は、自己複製プラスミドまたはウイルスを含む。その用語はまた、細胞への核酸の移行を容易化する非プラスミド及び非ウイルス性化合物、例えば、ポリリジン化合物、リポソーム等をさらに含むように解釈されるべきである。ウイルストランスファーベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0204】

いくつかの態様では、ベクターは、発現ベクターである。「発現ベクター」という用語は、発現させられるヌクレオチド配列に機能可能に連結された発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチド（例えば、本開示のポリペプチド）を含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によってまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現システムにおいて供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、むき出しまたはリポソームに含有される）及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）を含む、当該技術分野で知られているすべてのものが含まれる。

【0205】

いくつかの態様では、ベクターは、ウイルスベクター、哺乳動物ベクター、または細菌ベクターである。いくつかの態様では、ベクターは、アデノウイルスベクター、レンチウイルス、センダイウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ハイブリッドベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターからなる群から選択される。

【0206】

いくつかの態様では、非ウイルス的方法を、対象の細胞または組織に本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）を送達するために使用することができる。いくつかの態様では、非ウイルス的方法には、トランスポゾンの使用が含まれる。いくつかの態様では、非ウイルス的送達方法の使用は、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の再プログラミング、及び対象への細胞の直接的注入を可能とする。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム及びゲノム編集の代替的手段、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びメガヌクレアーゼ（ＭＮ）を使用することによって標的細胞（例えば、Ｔ細胞）または宿主細胞（例えば、コードされたタンパク質の組換え発現のための細胞）のゲノムに挿入することができる。

【0207】

ＩＶ．送達剤
いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、送達剤とともに（例えば、それを必要とする対象に）投与することができる。使用することができる送達剤の非限定的な例としては、リピドイド、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、ポリマー化合物、ペプチド、タンパク質、細胞、ナノ粒子模倣体、ナノチューブ、ミセル、コンジュゲート、及びそれらの組み合わせが挙げられる。

【0208】

したがって、いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）及び送達剤を含む組成物も提供する。いくつかの態様では、送達剤は、下式：
［ＷＰ］－Ｌ１－［ＣＣ］－Ｌ２－［ＡＭ］（式Ｉ）
または
［ＷＰ］－Ｌ１－［ＡＭ］－Ｌ２－［ＣＣ］（式ＩＩ）
（式中、
ＷＰは、水溶性バイオポリマー部分であり、
ＣＣは、正に荷電したキャリア部分であり、
ＡＭは、アジュバント部分であり、
Ｌ１及びＬ２は、独立して、任意選択のリンカーである）を有するカチオン性キャリアユニットを含み、
カチオン性キャリアユニットは、約１：１のイオン比で核酸と混合される場合にミセルを形成する。

【0209】

いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む組成物は、イオン結合を介してカチオン性キャリアユニットと相互作用する。

【0210】

いくつかの態様では、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α－ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリグリセロール、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン（「ＰＯＺ」）、ポリ（Ｎ－アクリロイルモルホリン）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリグリセロール、またはポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）を含む。いくつかの態様では、水溶性ポリマーは、下式：

【化6】

（式中、ｎは、１～１０００である）を有する。

【0211】

いくつかの態様では、ｎは、少なくとも約１１０、少なくとも約１１１、少なくとも約１１２、少なくとも約１１３、少なくとも約１１４、少なくとも約１１５、少なくとも約１１６、少なくとも約１１７、少なくとも約１１８、少なくとも約１１９、少なくとも約１２０、少なくとも約１２１、少なくとも約１２２、少なくとも約１２３、少なくとも約１２４、少なくとも約１２５、少なくとも約１２６、少なくとも約１２７、少なくとも約１２８、少なくとも約１２９、少なくとも約１３０、少なくとも約１３１、少なくとも約１３２、少なくとも約１３３、少なくとも約１３４、少なくとも約１３５、少なくとも約１３６、少なくとも約１３７、少なくとも約１３８、少なくとも約１３９、少なくとも約１４０、または少なくとも約１４１である。いくつかの態様では、ｎは、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１１０、約１１０～約１２０、約１２０～約１３０、約１４０～約１５０、約１５０～約１６０である。特定の態様では、ｎは約１１４である。

【0212】

いくつかの態様では、水溶性ポリマーは、直鎖状、分枝鎖状、または樹枝状である。いくつかの態様では、カチオン性キャリア部分は、１つ以上の塩基性アミノ酸を含む。いくつかの態様では、カチオン性キャリア部分は、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、少なくとも約２０個、少なくとも約２１個、少なくとも約２２個、少なくとも約２３個、少なくとも約２４個、少なくとも約２５個、少なくとも約２６個、少なくとも約２７個、少なくとも約２８個、少なくとも約２９個、少なくとも約３０個、少なくとも約３１個、少なくとも約３２個、少なくとも約３３個、少なくとも約３４個、少なくとも約３５個、少なくとも約３６個、少なくとも約３７個、少なくとも約３８個、少なくとも約３９個、少なくとも約４０個、少なくとも約４１個、少なくとも約４２個、少なくとも約４３個、少なくとも約４４個、少なくとも約４５個、少なくとも約４６個、少なくとも約４７個、少なくとも約４８個、少なくとも約４９個、少なくとも約５０個、少なくとも約５１個、少なくとも約５２個、少なくとも約５３個、少なくとも約５４個、少なくとも約５５個、少なくとも約５６個、少なくとも約５７個、少なくとも約５８個、少なくとも約５９個、少なくとも約６０個、少なくとも約６１個、少なくとも約６２個、少なくとも約６３個、少なくとも約６４個、少なくとも約６５個、少なくとも約６６個、少なくとも約６７個、少なくとも約６８個、少なくとも約６９個、少なくとも約７０個、少なくとも約７１個、少なくとも約７２個、少なくとも約７３個、少なくとも約７４個、少なくとも約７５個、少なくとも約７６個、少なくとも約７７個、少なくとも約７８個、少なくとも約７９個、少なくとも約８０個、少なくとも約８１個、少なくとも約８２個、少なくとも約８３個、少なくとも約８４個、少なくとも約８５個、少なくとも約８６個、少なくとも約８７個、少なくとも約８８個、少なくとも約８９個、少なくとも約９０個、少なくとも約９１個、少なくとも約９２個、少なくとも約９３個、少なくとも約９４個、少なくとも約９５個、少なくとも約９６個、少なくとも約９７個、少なくとも約９８個、少なくとも約９９個、少なくとも約１００個、少なくとも約１１０個、少なくとも約１２０個、少なくとも約１３０個、少なくとも約１４０個の塩基性アミノ酸を含む。いくつかの態様では、カチオン性キャリア部分は、約３０～約５０の塩基性アミノ酸を含む。いくつかの態様では、カチオン性キャリア部分は、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、または約１００個の塩基性アミノ酸を含む。特定の態様では、カチオン性キャリア部分は、約８０個の塩基性アミノ酸を含む。いくつかの態様では、塩基性アミノ酸は、アルギニン、リシン、ヒスチジン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、カチオン性キャリア部分は、約４０個のリシンモノマーを含む。

【0213】

いくつかの態様では、アジュバント部分は、免疫反応、炎症反応、及び／または組織微小環境を調節することができる。いくつかの態様では、アジュバント部分は、イミダゾール誘導体、アミノ酸、ビタミン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、アジュバント部分は、下式：

【化7】

（式中、Ｇ１及びＧ２のそれぞれは、Ｈ、芳香環、もしくは１～１０アルキルであるか、またはＧ１とＧ２はともに芳香環を形成し、ｎは１～１０である）を有する。

【0214】

いくつかの態様では、アジュバント部分は、ニトロイミダゾールを含む。いくつかの態様では、アジュバント部分は、メトロニダゾール、チニダゾール、ニモラゾール、ジメトリダゾール、プレトマニド、オルニダゾール、メガゾール、アザニダゾール、ベンズニダゾール、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、アジュバント部分は、アミノ酸を含む。

【0215】

いくつかの態様では、アジュバント部分は、下式：

【化8】

（式中、Ａｒは、

【化9】

であり、
Ｚ１及びＺ２のそれぞれは、ＨまたはＯＨである）を有する。

【0216】

いくつかの態様では、アジュバント部分は、ビタミンを含む。いくつかの態様では、ビタミンは、環式環または環式ヘテロ原子環及びカルボキシル基またはヒドロキシル基を含む。いくつかの態様では、ビタミンは、下式：

【化10】

（式中、Ｙ１及びＹ２のそれぞれは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり、ｎは１または２である）を有する。

【0217】

いくつかの態様では、ビタミンは、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＭ、ビタミンＨ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様では、ビタミンは、ビタミンＢ３である。

【0218】

いくつかの態様では、アジュバント部分は、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、少なくとも約２０個、少なくとも約２１個、少なくとも約２２個、少なくとも約２３個、少なくとも約２４個、少なくとも約２５個、少なくとも約２６個、少なくとも約２７個、少なくとも約２８個、少なくとも約２９個、少なくとも約３０個、少なくとも約３１個、少なくとも約３２個、少なくとも約３３個、少なくとも約３４個、少なくとも約３５個、少なくとも約３６個、少なくとも約３７個、少なくとも約３８個、少なくとも約３９個、少なくとも約４０個、少なくとも約４１個、少なくとも約４２個、少なくとも約４３個、少なくとも約４４個、少なくとも約４５個、少なくとも約４６個、少なくとも約４７個、少なくとも約４８個、少なくとも約４９個、または少なくとも約５０個のビタミンＢ３を含む。いくつかの態様では、アジュバント部分は、約３５個のビタミンＢ３を含む。

【0219】

いくつかの態様では、組成物は、約１００個～約１３０個のＰＥＧユニットを有する水溶性バイオポリマー部分と、約３０個～約１００個のリシン（例えば、約８０個のリシン）を有するポリリシンを含むカチオン性キャリア部分と、約５個～約５０個のビタミンＢ３（例えば、約３５個のビタミンＢ３）を有するアジュバント部分と、を含む。

【0220】

いくつかの態様では、組成物は、（ｉ）約１００個～約２００個のＰＥＧユニットを有する水溶性バイオポリマー部分と、（ｉｉ）アミン基を有する約３０個～約１００個のリシン（例えば、約４０個のリシン）と、（ｉｉｉ）それぞれがチオール基を有する約１個～２０個のリシン（例えば、それぞれがチオール基を有する約５個のリシン）と、（ｉｖ）ビタミンＢ３に融合された約５個～５０個のリシン（例えば、それぞれがビタミンＢ３に融合された約３５個のリシン）と、を含む。いくつかの態様では、組成物は、水溶性ポリマーに結合された標的化部分、例えばＬＡＴ１標的化リガンド、例えばフェニルアラニンをさらに含む。いくつかの態様では、組成物中のチオール基は、ジスルフィド結合を形成する。

【0221】

いくつかの態様では、組成物は、（１）（ｉ）約１００個～約２００個のＰＥＧユニット（例えば約１１４個のユニット）と、（ｉｉ）アミン基を有する約３０個～約１００個のリシン（例えば、約４０個のリシン）と、（ｉｉｉ）それぞれがチオール基を有する約３個～５０個のリシン（例えば、それぞれがチオール基を有する約３５個のリシン）と、（ｉｖ）ビタミンＢ３に融合された約２個～２０個のリシン（例えば、それぞれがビタミンＢ３に融合された約５個のリシン）と、を含むミセルと、（２）本明細書に記載の単離ポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）と、を含み、単離ポリヌクレオチドはミセル内に封入される。いくつかの態様では、組成物は、ＰＥＧユニットに結合された標的化部分、例えばＬＡＴ１標的化リガンド、例えばフェニルアラニンをさらに含む。いくつかの態様では、ミセル中のチオール基は、ジスルフィド結合を形成する。

【0222】

本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）を含むミセルであって、ポリヌクレオチドと送達剤とが互いに結合しているミセルも提供する。

【0223】

いくつかの態様では、結合は、共有結合、非共有結合、またはイオン結合である。いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットのカチオン性キャリア部分の正電荷は、溶液中で本明細書に開示されるポリヌクレオチドと混合される際にミセルを形成するのに十分であり、溶液中のカチオン性キャリアユニットのカチオン性キャリア部分の正電荷とポリヌクレオチド（またはポリヌクレオチドを含むベクター）の負電荷の全体的イオン比は、約１：１である。

【0224】

いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットは、酵素分解から本開示のポリヌクレオチドを保護することができる。本明細書に参照によりその全体を援用するところの２０２０年１２月３０日に公開されたＰＣＴ公開第ＷＯ２０２０／２６１２２７を参照されたい。

【0225】

いくつかの態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）は、ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ分子もしくはその組み合わせ）、ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡ分子もしくはその組み合わせ）、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、ゲノムもしくはｃＤＮＡ形態の一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡ（例えば、ｓｓＤＮＡもしくはｄｓＤＮＡ）、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含む核酸配列を含み、それぞれが化学的または生化学的に改変された、非天然、または誘導化ヌクレオチド塩基を含んでもよい。本明細書に記載されるように、かかる核酸配列は、これらに限定されるものではないが、ポリＡ配列、改変コザック配列、ならびにエピトープタグ、搬出シグナル、及び分泌シグナル、核局在化シグナル、及び細胞膜局在化シグナルをコードする配列を含む、コードされたポリペプチドの発現及び／または精製を促進するうえで有用なさらなる配列を含んでもよい。

【0226】

ＩＶ．Ａ．キャリアユニット
本開示は、ミセルに自己集合できるかまたはミセルに組み込むことができるキャリアユニットを提供する。いくつかの態様では、本開示のキャリアユニットは、水溶性バイオポリマー部分（例えば、ＰＥＧ）、荷電したキャリア部分、架橋部分、及び疎水性部分を含む。いくつかの態様では、荷電キャリア部分は、カチオン性（例えば、ポリリシン）である（例えば、図１４Ａを参照）。

【0227】

本開示のキャリアユニットは、負に荷電したペイロード（例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチド）を送達するために使用することができる。いくつかの態様では、ミセルによって送達することができる負に荷電したペイロード（例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチド）は、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約１１００、少なくとも約１２００、少なくとも約１３００、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００、少なくとも約１７００、少なくとも約１８００、少なくとも約１９００、少なくとも約２０００、少なくとも約２１００、少なくとも約２２００、少なくとも約２３００、少なくとも約２４００、少なくとも約２５００、少なくとも約２６００、少なくとも約２７００、少なくとも約２８００、少なくとも約２９００、少なくとも約３０００、少なくとも約３１００、少なくとも約３２００、少なくとも約３３００、少なくとも約３４００、少なくとも約３５００、少なくとも約３６００、少なくとも約３７００、少なくとも約３８００、少なくとも約３９００、または少なくとも約４０００ヌクレオチドの長さを有する。カチオン性の荷電したキャリア部分を有するキャリアユニットは、アニオン性ペイロード（例えば、ポリヌクレオチド）の送達に使用され得る。アニオン性の荷電したキャリア部分を有するキャリアユニットは、カチオン性ペイロード（例えば、正に荷電したポリヌクレオチド）の送達に使用され得る。いくつかの態様では、カチオン性荷電キャリア部分とアニオン性ペイロードとは、互いに静電的に相互作用することができる。

【0228】

得られるキャリアユニット：ペイロード複合体は、水溶性バイオポリマー部分を含む「頭部」と、ペイロードに静電的に結合したカチオン性キャリア部分を含む「尾部」とを有する。

【0229】

キャリアユニット：ペイロード複合体は、単独で、または他の分子との組み合わせで自己結合することで、アニオン性ペイロード（例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチド）がミセルのコアに存在し、水溶性バイオポリマー部分が溶媒に面したミセルを与えることができる。「本開示のミセル」という用語は、典型的なミセルだけでなく小粒子、小型ミセル、ミセル、桿状構造、またはポリマソームも包含する。ポリマソームが内腔を含むことを考慮すると、典型的なミセルの「コア」に関連するすべての開示が、本開示のキャリアユニットを含むポリマソームにおける内腔に等しく適用されると理解されたい。

【0230】

本開示のキャリアユニットは、１つ以上の任意選択のリンカーにより水溶性バイオポリマー部分に共有結合された標的化部分（例えば、標的化リガンド）を含み得る。ミセルが形成されると、標的化部分はミセルの表面に位置することができ、特定の標的組織、特定の細胞種にミセルを送達し得、及び／または生理学的バリア（例えば、細胞形質膜）を通した輸送を促進することができる。いくつかの態様では、本開示のミセルは、２種類以上の標的化部分を含み得る。

【0231】

本開示のキャリアユニットは、荷電したカチオンキャリア部分に共有結合された疎水性部分（ＨＭ）も含み得る。疎水性部分は、例えば、治療効果、共治療効果を有するか、または標的細胞もしくは標的組織の恒常性にプラスの影響を及ぼすことができる。いくつかの態様では、ＨＭは、１つ以上のアミノ酸を含む。いくつかの態様では、ＨＭは、疎水性分子（例えば、ビタミン）に連結された１つ以上のアミノ酸を含む。いくつかの態様では、ＨＭは、疎水性分子（例えば、ビタミン）に共有結合された１つ以上のリシン残基を含む。

【0232】

いくつかの態様では、アニオン性ペイロード（例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチド）は、キャリアユニットに共有結合によって連結されていない。特定の態様では、アニオン性ペイロード（例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチド）は、カチオン性キャリアユニット、例えば、切断可能なリンカーなどのリンカーに共有結合によって連結され得る。

【0233】

様々な態様の非限定的な例を本開示に示す。本開示は、特に、例えば、核酸などのアニオン性ペイロードを送達するための、カチオン性キャリアユニットの使用に関する。しかしながら、キャリア部分及びペイロードの電荷を逆転させること（すなわち、カチオン性ペイロードを送達するためにキャリアユニットにアニオン性キャリア部分を使用すること）により、またはアニオン性もしくはカチオン性キャリア部分と静電的相互作用するそれぞれカチオン性もしくはアニオン性アダプターに連結された中性ペイロードを使用することにより、本開示がカチオン性ペイロードの送達または中性ペイロードの送達に同様に適用され得ることが当業者には明らかであろう。

【0234】

したがって、一態様において、本開示は、図式Ｉ～図式ＶＩ：
［ＣＣ］－Ｌ１－［ＣＭ］－Ｌ２－［ＨＭ］（図式Ｉ）、
［ＣＣ］－Ｌ１－［ＨＭ］－Ｌ２－［ＣＭ］（図式ＩＩ）、
［ＨＭ］－Ｌ１－［ＣＭ］－Ｌ２－［ＣＣ］（図式ＩＩＩ）、
［ＨＭ］－Ｌ１－［ＣＣ］－Ｌ２－［ＣＭ］（図式ＩＶ）、
［ＣＭ］－Ｌ１－［ＣＣ］－Ｌ２－［ＨＭ］（図式Ｖ）、または
［ＣＭ］－Ｌ１－［ＨＭ］－Ｌ２－［ＣＣ］（図式ＶＩ）、
（式中、
ＣＣは、カチオン性キャリア部分、例えば、ポリリシンであり、
ＣＭは、架橋部分であり、
ＨＭは、疎水性部分、例えば、ビタミン、例えば、ビタミンＢ３であり、
Ｌ１及びＬ２は、独立して任意選択のリンカーである）のカチオン性キャリアユニットを提供する。

【0235】

いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットは、水溶性ポリマー（ＷＰ）をさらに含む。いくつかの態様では、水溶性ポリマーは、［ＣＣ］、［ＨＭ］、及び／または［ＣＭ］に結合される。いくつかの態様では、水溶性ポリマーは、［ＣＣ］、［ＨＭ］、または［ＣＭ］のＮ末端に結合される。いくつかの態様では、水溶性ポリマーは、［ＣＣ］のＮ末端に結合される。いくつかの態様では、水溶性ポリマーは、［ＣＣ］、［ＨＭ］、または［ＣＭ］のＣ末端に結合される。いくつかの態様では、水溶性ポリマーは、［ＣＣ］のＣ末端に結合される。

【0236】

いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットは、
［ＷＰ］－Ｌ３－［ＣＣ］－Ｌ１－［ＣＭ］－Ｌ２－［ＨＭ］（図式Ｉ’）、
［ＷＰ］－Ｌ３－［ＣＣ］－Ｌ１－［ＨＭ］－Ｌ２－［ＣＭ］（図式ＩＩ’）、
［ＷＰ］－Ｌ３－［ＨＭ］－Ｌ１－［ＣＭ］－Ｌ２－［ＣＣ］（図式ＩＩＩ’）、
［ＷＰ］－Ｌ３－［ＨＭ］－Ｌ１－［ＣＣ］－Ｌ２－［ＣＭ］（図式ＩＶ’）、
［ＷＰ］－Ｌ３－［ＣＭ］－Ｌ１－［ＣＣ］－Ｌ２－［ＨＭ］（図式Ｖ’）、または
［ＷＰ］－Ｌ３－［ＣＭ］－Ｌ１－［ＨＭ］－Ｌ２－［ＣＣ］（図式ＶＩ’）を含む。

【0237】

上記の図式Ｉ’～ＶＩ’のコンストラクトのいくつかの態様では、［ＷＰ］構成要素は、少なくとも１つの標的化部分、すなわち、［Ｔ］ｎ－［ＷＰ］－…に連結され得、式中、ｎは整数、例えば、１、２、または３である。

【0238】

図１５Ａ～１５Ｅは、本開示のカチオン性キャリアユニットの模式図を示す。簡単のために、図１５Ａ～１５Ｅのユニットは、直線的に示されている。しかしながら、いくつかの態様では、キャリアユニットは、例えば、（ｉ）正に荷電したユニット（例えば、ポリリシン）を含むポリマーＣＣ部分と、（ｉｉ）ＣＣ部分のＮ末端またはＣ末端に結合されたＣＭ（例えば架橋剤に連結されたリシン、例えばリシン－チオール）と、（ｉｉｉ）ＣＭ部分のＮ末端またはＣ末端に結合されたＨＭ（例えば、疎水性物質に連結されたリシン、例えば、ビタミンＢ３に連結されたリシン）とを含む、分枝状のスカフォールド配置（図１５Ａ及び図１４Ｅを参照）として構成されたＣＣ、ＣＭ、及びＨＭ部分を含むことができる。

【0239】

いくつかの態様では、キャリアユニットは、例えば、（ｉ）正に荷電したユニット（例えば、ポリリシン）を含むポリマーＣＣ部分と、（ｉｉ）ＣＣ部分のＮ末端またはＣ末端に結合されたＣＭ（例えば架橋剤に連結されたリシン、例えばリシン－チオール）と、（ｉｉｉ）ＣＭ部分のＮ末端またはＣ末端に結合されたＨＭ（例えば、疎水性物質に連結されたリシン、例えば、ビタミンＢ３に連結されたリシン）とを含む、分枝状のスカフォールド配置として構成されたＣＣ、ＣＭ、及びＨＭ部分を含むことができる。

【0240】

本開示のカチオン性キャリアユニットとアニオン性ペイロード（例えば、核酸）とが約２０：約１のイオン比（すなわち、アニオン性ペイロード中の負電荷の数が、カチオン性キャリア部分中の正電荷の数の約２０倍大きい場合）～約２０：約１のイオン比（すなわち、カチオン性キャリア部分中の正電荷の数が、アニオン性ペイロード中の負電荷の数の約１０倍大きい場合）で混合される場合、主として静電的相互作用を介した、カチオン性キャリア部分中の正電荷によるアニオン性ペイロード中の負電荷の中和によって、変化のない親水性部分（ＷＰ部分を含む）と、大幅に疎水性が高い部分（カチオン性キャリア部分＋疎水性部分及びアニオン性ペイロードとの間の結合に起因する）とを有するカチオン性キャリアユニット：アニオン性ペイロード複合体が形成される。

【0241】

いくつかの態様では、疎水性部分は、それ自身の正電荷を、アニオン性ペイロード（例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチド）の負電荷と相互作用するカチオン性キャリア部分の正電荷に与えることができる。カチオン性キャリア部分とアニオン性ペイロード（例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチド）との間の相互作用（例えば、静電的相互作用）への言及は、疎水性部分及びカチオン性キャリア部分の電荷とアニオン性ペイロードの電荷との間の相互作用も包含することを理解されたい。

【0242】

アニオン性ペイロードの負電荷との静電的相互作用による正電荷の中性化に起因するカチオン性キャリアユニットのカチオン性キャリア部分の疎水性の増加は、両親媒性複合体をもたらす。かかる両親媒性複合体は、単独でまたは他の両親媒性成分との組み合わせでミセルに自己組織化し得る。得られたミセルは、溶媒に面しているＷＰ部分（すなわち、ＷＰ部分はミセルの外面に向いている）を含むが、ＣＣ及びＨＭ部分ならびに結合したペイロード（例えば、ヌクレオチド配列、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせ）はミセルの中心に存在する。

【0243】

いくつかの特定の態様では、カチオン性キャリアユニットは、
（ａ）ＷＰ部分であって、水溶性バイオポリマーが、式ＩＩＩ（下記参照）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（ただし、ｎは約１２０～約ＰＥＧ１３０である）（例えば、ＰＥＧは、ＰＥＧ５０００またはＰＥＧ６０００である）である、ＷＰ部分と、
（ｂ）ＣＣ部分であって、カチオン性キャリア部分が、例えば、約２０個～約１００個のリシン（例えば、直鎖状ポリ（Ｌ－リシン）ｎ（ここで、ｎは約３０～約４０である））、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、またはキトサンを含む、ＣＣ部分と、
（ｃ）ＣＭ部分であって、架橋部分が、それぞれが架橋剤に結合した約１０個～約５０個のリシン（例えば１０個～４０個のリシン－チオール）を含む、ＣＭ部分と、
（ｄ）ＨＭ部分であって、疎水性部分が、それぞれがビタミンＢ３単位に結合した約１個～約２０個のリシンを有する、ＨＭ部分と、を含む。

【0244】

いくつかの特定の態様では、カチオン性キャリアユニットは、
（ａ）ＷＰ部分であって、水溶性バイオポリマーが、式ＩＩＩ（下記参照）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（ただし、ｎは約１２０～約ＰＥＧ１３０である）（例えば、ＰＥＧは、ＰＥＧ５０００またはＰＥＧ６０００である）である、ＷＰ部分と、
（ｂ）ＣＣ部分であって、カチオン性キャリア部分が、例えば、約２０個～約１００個のリシン（例えば、直鎖状ポリ（Ｌ－リシン）ｎ（ここで、ｎは約３０～約４０である））、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、またはキトサンを含む、ＣＣ部分と、
（ｃ）ＣＭ部分であって、架橋部分が、それぞれが架橋剤に結合した約１０個～約５０個のリシン（例えば１０個～４０個のリシン－チオール）を含む、ＣＭ部分と、
（ｄ）ＨＭ部分であって、疎水性部分が、それぞれがビタミンＢ３単位に結合した約１個～約１０個のリシンを有する、ＨＭ部分と、を含む。

【0245】

いくつかの特定の態様では、カチオン性キャリアユニットは、
（ａ）ＷＰ部分であって、水溶性バイオポリマーが、式ＩＩＩ（下記参照）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（ただし、ｎは約１２０～約ＰＥＧ１３０である）（例えば、ＰＥＧは、ＰＥＧ５０００またはＰＥＧ６０００である）である、ＷＰ部分と、
（ｂ）ＣＣ部分であって、カチオン性キャリア部分が、例えば、約２０個～約１００個のリシン（例えば、直鎖状ポリ（Ｌ－リシン）ｎ（ここで、ｎは約３０～約４０である））、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、またはキトサンを含む、ＣＣ部分と、
（ｃ）ＣＭ部分であって、架橋部分が、それぞれが架橋剤に結合した約１０個～約５０個のリシン（例えば１０個～４０個のリシン－チオール）を含む、ＣＭ部分と、
（ｄ）ＨＭ部分であって、疎水性部分が、それぞれがビタミンＢ３単位に結合した約５個～約１０個のリシンを有する、ＨＭ部分と、を含む。

【0246】

いくつかの特定の態様では、カチオン性キャリアユニットは、
（ａ）ＷＰ部分であって、水溶性バイオポリマーが、式ＩＩＩ（下記参照）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（ただし、ｎは約１２０～約ＰＥＧ１３０である）（例えば、ＰＥＧは、ＰＥＧ５０００またはＰＥＧ６０００である）である、ＷＰ部分と、
（ｂ）ＣＣ部分であって、カチオン性キャリア部分が、例えば、約２０個～約１００個のリシン（例えば、直鎖状ポリ（Ｌ－リシン）ｎ（ここで、ｎは約３０～約４０、例えば４０である））、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、またはキトサンを含む、ＣＣ部分と、
（ｃ）ＣＭ部分であって、架橋部分が、それぞれが架橋剤に結合した約１０個～約５０個のリシン（例えば１０個～４０個のリシン－チオール、例えば３５個のリシン－チオール）を含む、ＣＭ部分と、
（ｄ）ＨＭ部分であって、疎水性部分が、それぞれがビタミンＢ３単位に結合した約１個～約５個（例えば、約５個）のリシンを有する、ＨＭ部分と、を含む。

【0247】

いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットは、カチオン性キャリアユニットのＷＰ部分に結合された少なくとも１つの標的化部分をさらに含む。いくつかの態様では、ミセルの表面に提示される標的化部分の数及び／または密度は、標的化部分を有するカチオン性キャリアユニット対標的化部分を有さないカチオン性キャリアユニットの特定の比率を使用することにより調節され得る。いくつかの態様では、標的化部分を有するカチオン性キャリアユニット対標的化部分を有さないカチオン性キャリアユニットの比は、少なくとも約１：５、少なくとも約１：１０、少なくとも約１：２０、少なくとも約１：３０、少なくとも約１：４０、少なくとも約１：５０、少なくとも約１：６０、少なくとも約１：７０、少なくとも約１：８０、少なくとも約１：９０、少なくとも約１：１００、少なくとも約１：１２０、少なくとも約１：１４０、少なくとも約１：１６０、少なくとも約１：１８０、少なくとも約１：２００、少なくとも約１：２５０、少なくとも約１：３００、少なくとも約１：３５０、少なくとも約１：４００、少なくとも約１：４５０、少なくとも約１：５００、少なくとも約１：６００、少なくとも約１：７００、少なくとも約１：８００、少なくとも約１：９００、または少なくとも約１：１０００である。

【0248】

いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットは、
（ｉ）輸送体ＬＡＴ１を標的とする標的化部分（Ａ）（例えば、フェニルアラニン）と、
（ｉｉ）ＰＥＧである水溶性ポリマーと、
（ｉｉｉ）リシンであるカチオン性ポリマーブロックを含むカチオン性キャリア部分と、
（ｉｖ）架橋部分に連結されたリシンである架橋ポリマーブロックを含む架橋部分と、
（ｖ）ビタミンＢ３に連結されたリシンである疎水性ポリマーブロックを含む疎水性部分と、を含む。

【0249】

いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットは、
（ｉ）輸送体ＬＡＴ１を標的とする標的化部分（Ａ）（例えば、フェニルアラニン）と、
（ｉｉ）ＰＥＧである水溶性ポリマーであって、ｎ＝１００～２００、例えば、１００～１５０、例えば、１２０～１３０である、水溶性ポリマーと、
（ｉｉｉ）カチオン性ポリマーブロックを含むカチオン性キャリア部分、例えば、ポリリシンと、
（ｉｖ）架橋部分に連結されたリシンである架橋ポリマーブロックを含む架橋部分と、
（ｉｖ）ビタミンＢ３に連結されたリシンである疎水性ポリマーブロックを含む疎水性部分と、を含む。

【0250】

いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットは、
（ｉ）輸送体ＬＡＴ１を標的とする標的化部分（Ａ）（例えば、フェニルアラニン）と、
（ｉｉ）ＰＥＧである水溶性ポリマーであって、ｎ＝１００～２００、例えば、１００～１５０、例えば、１２０～１３０である、水溶性ポリマーと、
（ｉｉｉ）カチオン性ポリマーブロックを含むカチオン性キャリア部分、例えば、１０～１００個のリシン、例えば、１０～５０個のリシン、例えば、３０～４０個のリシンと、
（ｉｖ）架橋部分に連結されたリシンである架橋ポリマーブロックを含む架橋部分と、
（ｉｖ）ビタミンＢ３に連結されたリシンである疎水性ポリマーブロックを含む疎水性部分と、を含む。

【0251】

いくつかの態様では、ＨＭの数（割合）は、［ＣＣ］及び［ＣＭ］に対して３９％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％である。いくつかの態様では、ＨＭの数（割合）は、［ＣＣ］及び［ＣＭ］に対して約３５％～約１％、約３５％～約５％、約３５％～約１０％、約３５％～約１５％、約３５％～約２０％、約３５％～約２５％、約３５％～約３０％、約３０％～約１％、約３０％～約５％、約３０％～約１０％、約３０％～約１５％、約３０％～約２０％、約３０％～約２５％、約２５％～約１％、約２５％～約５％、約２５％～約１０％、約２５％～約１５％、約２５％～約２０％、約２０％～約１％、約２０％～約５％、約２０％～約１０％、約２０％～約１５％、約１５％～約１％、約１５％～約５％、約１５％～約１０％、約１０％～約１％、または約１０％～約５％である。いくつかの態様では、ＨＭの数（割合）は、［ＣＣ］及び［ＣＭ］に対して約３９％～約３０％、約３０％～約２０％、約２０％～約１０％、約１０％～約５％、及び約５％～約１％である。いくつかの態様では、ＨＭの数（割合）は、［ＣＣ］及び［ＣＭ］に対して約３９％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、または約１％である。いくつかの態様では、ＨＭの数は、［ＣＣ］及び［ＣＭ］に対する［ＨＭ］の割合として表される。

【0252】

いくつかの態様では、本開示のカチオン性キャリアユニットは、約１００～約４０００ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチドペイロードと相互作用する。いくつかの態様では、約１００～約４０００ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチドペイロードは、１つ以上のタンパク質またはその断片、例えば、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）スパイクタンパク質、またはその任意の断片をコードする。

【0253】

いくつかの態様では、ビタミンＢ３ユニットは、好適なコンジュゲーション試薬、例えば、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の存在下での例えば、リシンのＮＨ２基とビタミンＢ３のＣＯＯＨ基との間のカップリング反応によりＨＭ部分の側鎖に導入される。

【0254】

本開示は、本開示のキャリアユニット（例えば、カチオン性キャリアユニット）を含む組成物を提供する。他の態様では、本開示は、ペイロード（例えば、ヌクレオチド配列などのアニオン性ペイロード、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせ）に非共有結合的に結合された、本開示のキャリアユニット（例えば、カチオン性キャリアユニットユニット）を含む複合体を提供し、ここで、キャリアユニットとペイロードとは静電的に相互作用する。他の態様では、本開示は、ペイロード（例えば、ヌクレオチド配列などのアニオン性ペイロード、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせ）に共有結合的に結合された、本開示のキャリアユニット（例えば、カチオン性キャリアユニットユニット）を含む複合体を提供し、ここで、キャリアユニットとペイロードとは静電的に相互作用する。いくつかの態様では、キャリアユニット及びペイロードは、切断可能なリンカーにより連結され得る。いくつかの態様では、キャリアユニット及びペイロードは、静電的相互作用することに加えて、共有結合的に相互作用し得る（例えば、静電的相互作用後、キャリアユニット及びペイロードは、ジスルフィド結合または切断可能な結合により「ロック」され得る）。

【0255】

いくつかの特定の態様では、カチオン性キャリアユニットは、約１２０～約１３０個の単位を有するＰＥＧを含む水溶性ポリマーと、約２０～約６０個のリシン単位（例えば、約４０個のリシン）を有するポリリシンを含むカチオン性キャリア部分と、約３～約４０個のリシン－チオール単位（例えば、それぞれがチオール基を有する約５個のリシン）を含む架橋部分と、約１～約５０個の、ビタミンＢ３単位に連結されたリシン（例えば、それぞれがビタミンＢ３に融合された約３５個のリシン）を含む疎水性部分と、を含む。

【0256】

いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットは、少なくとも１つのイオン結合により（すなわち、カチオン性キャリアユニットのカチオン性キャリア部分との静電的相互作用により）カチオン性キャリア部分と相互作用する負に荷電したペイロード（例えば、ヌクレオチド配列、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせ）と結合する。

【0257】

本開示のカチオン性キャリアユニットの具体的な構成要素を、以下に詳細に開示する。

【0258】

ＩＶ．Ａ．１．水溶性バイオポリマー
いくつかの態様では、本開示のカチオン性キャリアユニットは、少なくとも１つの水溶性バイオポリマーを含む。本明細書で使用する場合、「水溶性バイオポリマー」という用語は、生体適合性、生物学的に不活性、非免疫原性、非毒性、かつ親水性のポリマー、例えば、ＰＥＧを指す。

【0259】

いくつかの態様では、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α－ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリグリセロール、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン（「ＰＯＺ」）、ポリ（Ｎ－アクリロイルモルホリン）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、水溶性バイオポリマーは、直鎖状、分枝鎖状、または樹枝状である。

【0260】

いくつかの態様では、水溶性バイオポリマーは、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリグリセロール（「ＰＧ」）、またはポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）を含む。ＰＰＧは、ＰＥＧより毒性が少ないため、現在多くの生物学的製剤が、ＰＥＧの代わりにＰＰＧで製造されている。

【0261】

いくつかの態様では、水溶性バイオポリマーは、式Ｒ３－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－またはＲ３－（０－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－Ｏ－（式中、Ｒ３は水素、メチル、またはエチルであり、ｎは２～２００の値を有する）を特徴とするＰＥＧを含む。いくつかの態様では、ＰＥＧは、次式を有し、

【化11】

式中、ｎは、１～１０００である。

【0262】

いくつかの態様では、ＰＥＧのｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８９、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、または２００の値を有する。

【0263】

いくつかの態様では、ｎは、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、少なくとも約２００、少なくとも約２１０、少なくとも約２２０、少なくとも約２３０、少なくとも約２４０、少なくとも約２５０、少なくとも約２６０、少なくとも約２７０、少なくとも約２８０、少なくとも約２９０、少なくとも約３００、少なくとも約３１０、少なくとも約３２０、少なくとも約３３０、少なくとも約３４０、少なくとも約３５０、少なくとも約３６０、少なくとも約３７０、少なくとも約３８０、少なくとも約３９０、少なくとも約４００、少なくとも約４１０、少なくとも約４２０、少なくとも約４３０、少なくとも約４４０、少なくとも約４５０、少なくとも約４６０、少なくとも約４７０、少なくとも約４８０、少なくとも約４９０、少なくとも約５００、少なくとも約５１０、少なくとも約５２０、少なくとも約５３０、少なくとも約５４０、少なくとも約５５０、少なくとも約５６０、少なくとも約６７０、少なくとも約５８０、少なくとも約５９０、少なくとも約６００、少なくとも約６１０、少なくとも約６２０、少なくとも約６３０、少なくとも約６４０、少なくとも約６５０、少なくとも約６６０、少なくとも約６７０、少なくとも約６８０、少なくとも約６９０、少なくとも約７００、少なくとも約７１０、少なくとも約７２０、少なくとも約７３０、少なくとも約７４０、少なくとも約７５０、少なくとも約７６０、少なくとも約７７０、少なくとも約７８０、少なくとも約７９０、少なくとも約８００、少なくとも約８１０、少なくとも約８２０、少なくとも約８３０、少なくとも約８４０、少なくとも約８５０、少なくとも約８６０、少なくとも約８７０、少なくとも約８８０、少なくとも約８９０、少なくとも約９００、少なくとも約９１０、少なくとも約９２０、少なくとも約９３０、少なくとも約９４０、少なくとも約９５０、少なくとも約９６０、少なくとも約９７０、少なくとも約９８０、少なくとも約９９０、または約１０００である。

【0264】

いくつかの態様では、ｎは、約５０～約１００、約１００～約１５０、約１５０～約２００、約２００～約２５０、約２５０～約３００、約３００～約３５０、約３５０～約４００、約４００～約４５０、約４５０～約５００、約５００～約５５０、約５５０～約６００、約６００～約６５０、約６５０～約７００、約７００～約７５０、約７５０～約８００、約８００～約８５０、約８５０～約９００、約９００～約９５０、または約９５０～約１０００である。

【0265】

いくつかの態様では、ｎは、少なくとも約８０、少なくとも約８１、少なくとも約８２、少なくとも約８３、少なくとも約８４、少なくとも約８５、少なくとも約８６、少なくとも約８７、少なくとも約８８、少なくとも約８９、少なくとも約９０、少なくとも約９１、少なくとも約９２、少なくとも約９３、少なくとも約９４、少なくとも約９５、少なくとも約９６、少なくとも約９７、少なくとも約９８、少なくとも約９９、少なくとも約１００、少なくとも約１０１、少なくとも約１０２、少なくとも約１０３、少なくとも約１０４、少なくとも約１０５、少なくとも約１０６、少なくとも約１０７、少なくとも約１０８、少なくとも約１０９、少なくとも１１０、少なくとも約１１１、少なくとも約１１２、少なくとも約１１３、少なくとも約１１４、少なくとも約１１５、少なくとも約１１６、少なくとも約１１７、少なくとも約１１８、少なくとも約１１９、少なくとも約１２０、少なくとも約１２１、少なくとも約１２２、少なくとも約１２３、少なくとも約１２４、少なくとも約１２５、少なくとも約１２６、少なくとも約１２７、少なくとも約１２８、少なくとも約１２９、少なくとも約１３０、少なくとも約１３１、少なくとも約１３２、少なくとも約１３３、少なくとも約１３４、少なくとも約１３５、少なくとも約１３６、少なくとも約１３７、少なくとも約１３８、少なくとも約１３９、少なくとも約１４０、少なくとも約１４１、少なくとも約１４２、少なくとも約１４３、少なくとも約１４４、少なくとも約１４５、少なくとも約１４６、少なくとも約１４７、少なくとも約１４８、少なくとも約１４９、少なくとも約１５０、少なくとも約１５１、少なくとも約１５２、少なくとも約１５３、少なくとも約１５４、少なくとも約１５５、少なくとも約１５６、少なくとも約１５７、少なくとも約１５８、少なくとも約１５９、または少なくとも約１６０である。

【0266】

いくつかの態様では、ｎは、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１１０、約１１０～約１２０、約１２０～約１３０、約１３０～約１４０、約１４０～約１５０、約１５０～約１６０、約８５～約９５、約９５～約１０５、約１０５～約１１５、約１１５～約１２５、約１２５～約１３５、約１３５～約１４５、約１４５～約１５５、約１５５～約１６５、約８０～約１００、約１００～約１２０、約１２０～約１４０、約１４０～約１６０、約８５～約１０５、約１０５～約１２５、約１２５～約１４５、または約１４５～約１６５である。

【0267】

いくつかの態様では、ｎは、約１００～約１５０である。いくつかの態様では、ｎは、約１００～約１４０である。いくつかの態様では、ｎは、約１００～約１３０である。いくつかの態様では、ｎは、約１１０～約１５０である。いくつかの態様では、ｎは、約１１０～約１４０である。いくつかの態様では、ｎは、約１１０～約１３０である。いくつかの態様では、ｎは、約１１０～約１２０である。いくつかの態様では、ｎは、約１２０～約１５０である。いくつかの態様では、ｎは、約１２０～約１４０である。いくつかの態様では、ｎは、約１２０～約１３０である。いくつかの態様では、ｎは、約１３０～約１５０である。いくつかの態様では、ｎは、約１３０～約１４０である。いくつかの態様では、ｎは約１１４である。

【0268】

したがって、いくつかの態様では、ＰＥＧは、分枝鎖ＰＥＧである。分枝鎖ＰＥＧは、中心コア基から延びる３～１０本のＰＥＧ鎖を有する。ある特定の態様では、ＰＥＧ部分は、単分散ポリエチレングリコールである。本開示の文脈において、単分散ポリエチレングリコール（ｍｄＰＥＧ）は、単一の既定の鎖長及び分子量を有するＰＥＧである。ｍｄＰＥＧは、通常、クロマトグラフィーによる重合混合物からの分離により生成される。ある特定の式において、単分散ＰＥＧ部分は、略語ｍｄＰＥＧを割り当てられる。

【0269】

いくつかの態様では、ＰＥＧは、Ｓｔａｒ ＰＥＧである。Ｓｔａｒ ＰＥＧは、中心コア基から延びる１０～１００本のＰＥＧ鎖を有する。いくつかの態様では、ＰＥＧは、Ｃｏｍｂ ＰＥＧである。Ｃｏｍｂ ＰＥＧは、通常、ポリマー主鎖上にグラフトされた複数のＰＥＧ鎖を有する。

【0270】

ある特定の態様では、ＰＥＧは、約１０００ｇ／ｍｏｌ～約２０００ｇ／ｍｏｌ、約２０００ｇ／ｍｏｌ～約３０００ｇ／ｍｏｌ、約３０００ｇ／ｍｏｌ～約４０００ｇ／ｍｏｌ、約４０００ｇ／ｍｏｌ～約５０００ｇ／ｍｏｌ、約５０００ｇ／ｍｏｌ～約６０００ｇ／ｍｏｌ、約６０００ｇ／ｍｏｌ～約７０００ｇ／ｍｏｌ、または７０００ｇ／ｍｏｌ～約８０００ｇ／ｍｏｌのモル質量を有する。

【0271】

いくつかの態様では、ＰＥＧは、ＰＥＧ_１００、ＰＥＧ_２００、ＰＥＧ_３００、ＰＥＧ_４００、ＰＥＧ_５００、ＰＥＧ_６００、ＰＥＧ_７００、ＰＥＧ_８００、ＰＥＧ_９００、ＰＥＧ_１０００、ＰＥＧ_１１００、ＰＥＧ_１２００、ＰＥＧ_１３００、ＰＥＧ_１４００、ＰＥＧ_１５００、ＰＥＧ_１６００、ＰＥＧ_１７００、ＰＥＧ_１８００、ＰＥＧ_１９００、ＰＥＧ_２０００、ＰＥＧ_２１００、ＰＥＧ_２２００、ＰＥＧ_２３００、ＰＥＧ_２４００、ＰＥＧ_２５００、ＰＥＧ_１６００、ＰＥＧ_１７００、ＰＥＧ_１８００、ＰＥＧ_１９００、ＰＥＧ_２０００、ＰＥＧ_２１００、ＰＥＧ_２２００、ＰＥＧ_２３００、ＰＥＧ_２４００、ＰＥＧ_２５００、ＰＥＧ_２６００、ＰＥＧ_２７００、ＰＥＧ_２８００、ＰＥＧ_２９００、ＰＥＧ_３０００、ＰＥＧ_３１００、ＰＥＧ_３２００、ＰＥＧ_３３００、ＰＥＧ_３４００、ＰＥＧ_３５００、ＰＥＧ_３６００、ＰＥＧ_３７００、ＰＥＧ_３８００、ＰＥＧ_３９００、ＰＥＧ_４０００、ＰＥＧ_４１００、ＰＥＧ_４２００、ＰＥＧ_４３００、ＰＥＧ_４４００、ＰＥＧ_４５００、ＰＥＧ_４６００、ＰＥＧ_４７００、ＰＥＧ_４８００、ＰＥＧ_４９００、ＰＥＧ_５０００、ＰＥＧ_５１００、ＰＥＧ_５２００、ＰＥＧ_５３００、ＰＥＧ_５４００、ＰＥＧ_５５００、ＰＥＧ_５６００、ＰＥＧ_５７００、ＰＥＧ_５８００、ＰＥＧ_５９００、ＰＥＧ_６０００、ＰＥＧ_６１００、ＰＥＧ_６２００、ＰＥＧ_６３００、ＰＥＧ_６４００、ＰＥＧ_６５００、ＰＥＧ_６６００、ＰＥＧ_６７００、ＰＥＧ_６８００、ＰＥＧ_６９００、ＰＥＧ_７０００、ＰＥＧ_７１００、ＰＥＧ_７２００、ＰＥＧ_７３００、ＰＥＧ_７４００、ＰＥＧ_７５００、ＰＥＧ_７６００、ＰＥＧ_７７００、ＰＥＧ_７８００、ＰＥＧ_７９００、またはＰＥＧ_８０００である。いくつかの態様では、ＰＥＧは、ＰＥＧ_５０００である。いくつかの態様では、ＰＥＧは、ＰＥＧ_６０００である。いくつかの態様では、ＰＥＧは、ＰＥＧ_４０００である。

【0272】

いくつかの態様では、ＰＥＧは、単分散、例えば、ｍＰＥＧ_１００、ｍＰＥＧ_２００、ｍＰＥＧ_３００、ｍＰＥＧ_４００、ｍＰＥＧ_５００、ｍＰＥＧ_６００、ｍＰＥＧ_７００、ｍＰＥＧ_８００、ｍＰＥＧ_９００、ｍＰＥＧ_１０００、ｍＰＥＧ_１１００、ｍＰＥＧ_１２００、ｍＰＥＧ_１３００、ｍＰＥＧ_１４００、ｍＰＥＧ_１５００、ｍＰＥＧ_１６００、ｍＰＥＧ_１７００、ｍＰＥＧ_１８００、ｍＰＥＧ_１９００、ｍＰＥＧ_２０００、ｍＰＥＧ_２１００、ｍＰＥＧ_２２００、ｍＰＥＧ_２３００、ｍＰＥＧ_２４００、ｍＰＥＧ_２５００、ｍＰＥＧ_１６００、ｍＰＥＧ_１７００、ｍＰＥＧ_１８００、ｍＰＥＧ_１９００、ｍＰＥＧ_２０００、ｍＰＥＧ_２１００、ｍＰＥＧ_２２００、ｍＰＥＧ_２３００、ｍＰＥＧ_２４００、ｍＰＥＧ_２５００、ｍＰＥＧ_２６００、ｍＰＥＧ_２７００、ｍＰＥＧ_２８００、ｍＰＥＧ_２９００、ｍＰＥＧ_３０００、ｍＰＥＧ_３１００、ｍＰＥＧ_３２００、ｍＰＥＧ_３３００、ｍＰＥＧ_３４００、ｍＰＥＧ_３５００、ｍＰＥＧ_３６００、ｍＰＥＧ_３７００、ｍＰＥＧ_３８００、ｍＰＥＧ_３９００、ｍＰＥＧ_４０００、ｍＰＥＧ_４１００、ｍＰＥＧ_４２００、ｍＰＥＧ_４３００、ｍＰＥＧ_４４００、ｍＰＥＧ_４５００、ｍＰＥＧ_４６００、ｍＰＥＧ_４７００、ｍＰＥＧ_４８００、ｍＰＥＧ_４９００、ｍＰＥＧ_５０００、ｍＰＥＧ_５１００、ｍＰＥＧ_５２００、ｍＰＥＧ_５３００、ｍＰＥＧ_５４００、ｍＰＥＧ_５５００、ｍＰＥＧ_５６００、ｍＰＥＧ_５７００、ｍＰＥＧ_５８００、ｍＰＥＧ_５９００、ｍＰＥＧ_６０００、ｍＰＥＧ_６１００、ｍＰＥＧ_６２００、ｍＰＥＧ_６３００、ｍＰＥＧ_６４００、ｍＰＥＧ_６５００、ｍＰＥＧ_６６００、ｍＰＥＧ_６７００、ｍＰＥＧ_６８００、ｍＰＥＧ_６９００、ｍＰＥＧ_７０００、ｍＰＥＧ_７１００、ｍＰＥＧ_７２００、ｍＰＥＧ_７３００、ｍＰＥＧ_７４００、ｍＰＥＧ_７５００、ｍＰＥＧ_７６００、ｍＰＥＧ_７７００、ｍ ＰＥＧ_７８００、ｍＰＥＧ_７９００、またはｍＰＥＧ_８０００である。いくつかの態様では、ｍＰＥＧは、ｍＰＥＧ_５０００である。いくつかの態様では、ｍＰＥＧは、ｍＰＥＧ_６０００である。いくつかの態様では、ｍＰＥＧは、ｍＰＥＧ_４０００である。

【0273】

いくつかの態様では、水溶性バイオポリマー部分は、式（（Ｒ_３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＨ－ＣＨ_２Ｏ）ｎ－）で表現されるポリグリセロール（ＰＧ）であり、Ｒ_３は、水素、メチル、またはエチルであり、ｎは３～２００の値を有する。いくつかの態様では、水溶性バイオポリマー部分は、式（Ｒ^３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＲ^５－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－）で表現され、Ｒ^５が水素である分枝鎖状ポリグリセロールまたは式（Ｒ^３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＨ－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－）で表現される直鎖状グリセロール鎖であり、Ｒ^３は、水素、メチル、またはエチルである。いくつかの態様では、水溶性バイオポリマー部分は、式（Ｒ^３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＲ^５－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－）で表現され、Ｒ^５が水素である超分岐ポリグリセロール、または式（Ｒ^３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＲ^６－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－）で表現され、Ｒ^６が水素であるグリセロール鎖、または式（Ｒ^３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＲ^７－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－）で表現され、Ｒ^７水素であるグリセロール鎖、または式（Ｒ^３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＨ－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－）で表現される直鎖状グリセロール鎖であり、Ｒ^３は、水素、メチル、またはエチルである。超分岐グリセロール及びその合成方法は、Ｏｕｄｓｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２７：５４７１－５４７９；Ｗｉｌｍｓ ｅｔ ａｌ．（２０１００ Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４３，１２９－４１、及びその中で引用される参考文献に記載されている。

【0274】

ある特定の態様では、ＰＧは、約１０００ｇ／ｍｏｌ～約２０００ｇ／ｍｏｌ、約２０００ｇ／ｍｏｌ～約３０００ｇ／ｍｏｌ、約３０００ｇ／ｍｏｌ～約４０００ｇ／ｍｏｌ、約４０００ｇ／ｍｏｌ～約５０００ｇ／ｍｏｌ、約５０００ｇ／ｍｏｌ～約６０００ｇ／ｍｏｌ、約６０００ｇ／ｍｏｌ～約７０００ｇ／ｍｏｌ、または７０００ｇ／ｍｏｌ～約８０００ｇ／ｍｏｌのモル質量を有する。

【0275】

いくつかの態様では、ＰＧは、ＰＧ_１００、ＰＧ_２００、ＰＧ_３００、ＰＧ_４００、ＰＧ_５００、ＰＧ_６００、ＰＧ_７００、ＰＧ_８００、ＰＧ_９００、ＰＧ_１０００、ＰＧ_１１００、ＰＧ_１２００、ＰＧ_１３００、ＰＧ_１４００、ＰＧ_１５００、ＰＧ_１６００、ＰＧ_１７００、ＰＧ_１８００、ＰＧ_１９００、ＰＧ_２０００、ＰＧ_２１００、ＰＧ_２２００、ＰＧ_２３００、ＰＧ_２４００、ＰＧ_２５００、ＰＧ_１６００、ＰＧ_１７００、ＰＧ_１８００、ＰＧ_１９００、ＰＧ_２０００、ＰＧ_２１００、ＰＧ_２２００、ＰＧ_２３００、ＰＧ_２４００、ＰＧ_２５００、ＰＧ_２６００、ＰＧ_２７００、ＰＧ_２８００、ＰＧ_２９００、ＰＧ_３０００、ＰＧ_３１００、ＰＧ_３２００、ＰＧ_３３００、ＰＧ_３４００、ＰＧ_３５００、ＰＧ_３６００、ＰＧ_３７００、ＰＧ_３８００、ＰＧ_３９００、ＰＧ_４０００、ＰＧ_４１００、ＰＧ_４２００、ＰＧ_４３００、ＰＧ_４４００、ＰＧ_４５００、ＰＧ_４６００、ＰＧ_４７００、ＰＧ_４８００、ＰＧ_４９００、ＰＧ_５０００、ＰＧ_５１００、ＰＧ_５２００、ＰＧ_５３００、ＰＧ_５４００、ＰＧ_５５００、ＰＧ_５６００、ＰＧ_５７００、ＰＧ_５８００、ＰＧ_５９００、ＰＧ_６０００、ＰＧ_６１００、ＰＧ_６２００、ＰＧ_６３００、ＰＧ_６４００、ＰＧ_６５００、ＰＧ_６６００、ＰＧ_６７００、ＰＧ_６８００、ＰＧ_６９００、ＰＧ_７０００、ＰＧ_７１００、ＰＧ_７２００、ＰＧ_７３００、ＰＧ_７４００、ＰＧ_７５００、ＰＧ_７６００、ＰＧ_７７００、ＰＧ_７８００、ＰＧ_７９００、またはＰＧ_８０００である。いくつかの態様では、ＰＧは、ＰＧ_５０００である。いくつかの態様では、ＰＧは、ＰＧ_６０００である。いくつかの態様では、ＰＧは、ＰＧ_４０００である。

【0276】

いくつかの態様では、ＰＧは、単分散、例えば、ｍＰＧ_１００、ｍＰＧ_２００、ｍＰＧ_３００、ｍＰＧ_４００、ｍＰＧ_５００、ｍＰＧ_６００、ｍＰＧ_７００、ｍＰＧ_８００、ｍＰＧ_９００、ｍＰＧ_１０００、ｍＰＧ_１１００、ｍＰＧ_１２００、ｍＰＧ_１３００、ｍＰＧ_１４００、ｍＰＧ_１５００、ｍＰＧ_１６００、ｍＰＧ_１７００、ｍＰＧ_１８００、ｍＰＧ_１９００、ｍＰＧ_２０００、ｍＰＧ_２１００、ｍＰＧ_２２００、ｍＰＧ_２３００、ｍＰＧ_２４００、ｍＰＧ_２５００、ｍＰＧ_１６００、ｍＰＧ_１７００、ｍＰＧ_１８００、ｍＰＧ_１９００、ｍＰＧ_２０００、ｍＰＧ_２１００、ｍＰＧ_２２００、ｍＰＧ_２３００、ｍＰＧ_２４００、ｍＰＧ_２５００、ｍＰＧ_２６００、ｍＰＧ_２７００、ｍＰＧ_２８００、ｍＰＧ_２９００、ｍＰＧ_３０００、ｍＰＧ_３１００、ｍＰＧ_３２００、ｍＰＧ_３３００、ｍＰＧ_３４００、ｍＰＧ_３５００、ｍＰＧ_３６００、ｍＰＧ_３７００、ｍＰＧ_３８００、ｍＰＧ_３９００、ｍＰＧ_４０００、ｍＰＧ_{４１００、}ｍＰＧ_４２００、ｍＰＧ_４３００、ｍＰＧ_４４００、ｍＰＧ_４５００、ｍＰＧ_４６００、ｍＰＧ_４７００、ｍＰＧ_４８００、ｍＰＧ_４９００、ｍＰＧ_５０００、ｍＰＧ_５１００、ｍＰＧ_５２００、ｍＰＧ_５３００、ｍＰＧ_５４００、ｍＰＧ_５５００、ｍＰＧ_５６００、ｍＰＧ_５７００、ｍＰＧ_５８００、ｍＰＧ_５９００、ｍＰＧ_６０００、ｍＰＧ_６１００、ｍＰＧ_６２００、ｍＰＧ_６３００、ｍＰＧ_６４００、ｍＰＧ_６５００、ｍＰＧ_６６００、ｍＰＧ_６７００、ｍＰＧ_６８００、ｍＰＧ_６９００、ｍＰＧ_７０００、ｍＰＧ_７１００、ｍＰＧ_７２００、ｍＰＧ_７３００、ｍＰＧ_７４００、ｍＰＧ_７５００、ｍＰＧ_７６００、ｍＰＧ_７７００、ｍ ＰＧ_７８００、ｍＰＧ_７９００、またはｍＰＧ_８０００である。

【0277】

いくつかの態様では、水溶性バイオポリマーは、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）を含む。いくつかの態様では、ＰＰＧは下式により特徴付けられ、ｎは１～１０００の値を有する：

【化12】

【0278】

いくつかの態様では、ＰＰＧのｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８９、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、または２００の値を有する。

【0279】

いくつかの態様では、ＰＰＧのｎは、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、少なくとも約２００、少なくとも約２１０、少なくとも約２２０、少なくとも約２３０、少なくとも約２４０、少なくとも約２５０、少なくとも約２６０、少なくとも約２７０、少なくとも約２８０、少なくとも約２９０、少なくとも約３００、少なくとも約３１０、少なくとも約３２０、少なくとも約３３０、少なくとも約３４０、少なくとも約３５０、少なくとも約３６０、少なくとも約３７０、少なくとも約３８０、少なくとも約３９０、少なくとも約４００、少なくとも約４１０、少なくとも約４２０、少なくとも約４３０、少なくとも約４４０、少なくとも約４５０、少なくとも約４６０、少なくとも約４７０、少なくとも約４８０、少なくとも約４９０、少なくとも約５００、少なくとも約５１０、少なくとも約５２０、少なくとも約５３０、少なくとも約５４０、少なくとも約５５０、少なくとも約５６０、少なくとも約６７０、少なくとも約５８０、少なくとも約５９０、少なくとも約６００、少なくとも約６１０、少なくとも約６２０、少なくとも約６３０、少なくとも約６４０、少なくとも約６５０、少なくとも約６６０、少なくとも約６７０、少なくとも約６８０、少なくとも約６９０、少なくとも約７００、少なくとも約７１０、少なくとも約７２０、少なくとも約７３０、少なくとも約７４０、少なくとも約７５０、少なくとも約７６０、少なくとも約７７０、少なくとも約７８０、少なくとも約７９０、少なくとも約８００、少なくとも約８１０、少なくとも約８２０、少なくとも約８３０、少なくとも約８４０、少なくとも約８５０、少なくとも約８６０、少なくとも約８７０、少なくとも約８８０、少なくとも約８９０、少なくとも約９００、少なくとも約９１０、少なくとも約９２０、少なくとも約９３０、少なくとも約９４０、少なくとも約９５０、少なくとも約９６０、少なくとも約９７０、少なくとも約９８０、少なくとも約９９０、または約１０００である。

【0280】

いくつかの態様では、ＰＰＧのｎは、約５０～約１００、約１００～約１５０、約１５０～約２００、約２００～約２５０、約２５０～約３００、約３００～約３５０、約３５０～約４００、約４００～約４５０、約４５０～約５００、約５００～約５５０、約５５０～約６００、約６００～約６５０、約６５０～約７００、約７００～約７５０、約７５０～約８００、約８００～約８５０、約８５０～約９００、約９００～約９５０、または約９５０～約１０００である。

【0281】

いくつかの態様では、ＰＰＧのｎは、少なくとも約８０、少なくとも約８１、少なくとも約８２、少なくとも約８３、少なくとも約８４、少なくとも約８５、少なくとも約８６、少なくとも約８７、少なくとも約８８、少なくとも約８９、少なくとも約９０、少なくとも約９１、少なくとも約９２、少なくとも約９３、少なくとも約９４、少なくとも約９５、少なくとも約９６、少なくとも約９７、少なくとも約９８、少なくとも約９９、少なくとも約１００、少なくとも約１０１、少なくとも約１０２、少なくとも約１０３、少なくとも約１０４、少なくとも約１０５、少なくとも約１０６、少なくとも約１０７、少なくとも約１０８、少なくとも約１０９、少なくとも１１０、少なくとも約１１１、少なくとも約１１２、少なくとも約１１３、少なくとも約１１４、少なくとも約１１５、少なくとも約１１６、少なくとも約１１７、少なくとも約１１８、少なくとも約１１９、少なくとも約１２０、少なくとも約１２１、少なくとも約１２２、少なくとも約１２３、少なくとも約１２４、少なくとも約１２５、少なくとも約１２６、少なくとも約１２７、少なくとも約１２８、少なくとも約１２９、少なくとも約１３０、少なくとも約１３１、少なくとも約１３２、少なくとも約１３３、少なくとも約１３４、少なくとも約１３５、少なくとも約１３６、少なくとも約１３７、少なくとも約１３８、少なくとも約１３９、少なくとも約１４０、少なくとも約１４１、少なくとも約１４２、少なくとも約１４３、少なくとも約１４４、少なくとも約１４５、少なくとも約１４６、少なくとも約１４７、少なくとも約１４８、少なくとも約１４９、少なくとも約１５０、少なくとも約１５１、少なくとも約１５２、少なくとも約１５３、少なくとも約１５４、少なくとも約１５５、少なくとも約１５６、少なくとも約１５７、少なくとも約１５８、少なくとも約１５９、または少なくとも約１６０である。

【0282】

いくつかの態様では、ＰＰＧのｎは、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１１０、約１１０～約１２０、約１２０～約１３０、約１３０～約１４０、約１４０～約１５０、約１５０～約１６０、約８５～約９５、約９５～約１０５、約１０５～約１１５、約１１５～約１２５、約１２５～約１３５、約１３５～約１４５、約１４５～約１５５、約１５５～約１６５、約８０～約１００、約１００～約１２０、約１２０～約１４０、約１４０～約１６０、約８５～約１０５、約１０５～約１２５、約１２５～約１４５、または約１４５～約１６５である。

【0283】

したがって、いくつかの態様では、ＰＰＧは、分枝鎖状ＰＰＧである。分枝鎖状ＰＰＧは、中心コア基から延びる３～１０本のＰＰＧ鎖を有する。ある特定の態様では、ＰＰＧ部分は、単分散ポリエチレングリコールである。本開示の文脈において、単分散ポリエチレングリコール（ｍｄＰＰＧ）は、単一の既定の鎖長及び分子量を有するＰＰＧである。ｍｄＰＥＧは、通常、クロマトグラフィーによる重合混合物からの分離により生成される。ある特定の式において、単分散ＰＰＧ部分は、略語ｍｄＰＰＧを割り当てられる。

【0284】

いくつかの態様では、ＰＰＧは、Ｓｔａｒ ＰＰＧである。Ｓｔａｒ ＰＰＧは、中心コア基から延びる１０～１００本のＰＰＧ鎖を有する。いくつかの態様では、ＰＰＧは、Ｃｏｍｂ ＰＰＧである。Ｃｏｍｂ ＰＰＧは、通常、ポリマー主鎖上にグラフトされた複数のＰＰＧ鎖を有する。

【0285】

ある特定の態様では、ＰＰＧは、約１０００ｇ／ｍｏｌ～約２０００ｇ／ｍｏｌ、約２０００ｇ／ｍｏｌ～約３０００ｇ／ｍｏｌ、約３０００ｇ／ｍｏｌ～約４０００ｇ／ｍｏｌ、約４０００ｇ／ｍｏｌ～約５０００ｇ／ｍｏｌ、約５０００ｇ／ｍｏｌ～約６０００ｇ／ｍｏｌ、約６０００ｇ／ｍｏｌ～約７０００ｇ／ｍｏｌ、または７０００ｇ／ｍｏｌ～約８０００ｇ／ｍｏｌのモル質量を有する。

【0286】

いくつかの態様では、ＰＰＧは、ＰＰＧ_１００、ＰＰＧ_２００、ＰＰＧ_３００、ＰＰＧ_４００、ＰＰＧ_５００、ＰＰＧ_６００、ＰＰＧ_７００、ＰＰＧ_８００、ＰＰＧ_９００、ＰＰＧ_１０００、ＰＰＧ_１１００、ＰＰＧ_１２００、ＰＰＧ_１３００、ＰＰＧ_１４００、ＰＰＧ_１５００、ＰＰＧ_１６００、ＰＰＧ_１７００、ＰＰＧ_１８００、ＰＰＧ_１９００、ＰＰＧ_２０００、ＰＰＧ_２１００、ＰＰＧ_２２００、ＰＰＧ_２３００、ＰＰＧ_２４００、ＰＰＧ_２５００、ＰＰＧ_１６００、ＰＰＧ_１７００、ＰＰＧ_１８００、ＰＰＧ_１９００、ＰＰＧ_２０００、ＰＰＧ_２１００、ＰＰＧ_２２００、ＰＰＧ_２３００、ＰＰＧ_２４００、ＰＰＧ_２５００、ＰＰＧ_２６００、ＰＰＧ_２７００、ＰＰＧ_２８００、ＰＰＧ_２９００、ＰＰＧ_３０００、ＰＰＧ_３１００、ＰＰＧ_３２００、ＰＰＧ_３３００、ＰＰＧ_３４００、ＰＰＧ_３５００、ＰＰＧ_３６００、ＰＰＧ_３７００、ＰＰＧ_３８００、ＰＰＧ_３９００、ＰＰＧ_４０００、ＰＰＧ_４１００、ＰＰＧ_４２００、ＰＰＧ_４３００、ＰＰＧ_４４００、ＰＰＧ_４５００、ＰＰＧ_４６００、ＰＰＧ_４７００、ＰＰＧ_４８００、ＰＰＧ_４９００、ＰＰＧ_５０００、ＰＰＧ_５１００、ＰＰＧ_５２００、ＰＰＧ_５３００、ＰＰＧ_５４００、ＰＰＧ_５５００、ＰＰＧ_５６００、ＰＰＧ_５７００、ＰＰＧ_５８００、ＰＰＧ_５９００、ＰＰＧ_６０００、ＰＰＧ_６１００、ＰＰＧ_６２００、ＰＰＧ_６３００、ＰＰＧ_６４００、ＰＰＧ_６５００、ＰＰＧ_６６００、ＰＰＧ_６７００、ＰＰＧ_６８００、ＰＰＧ_６９００、ＰＰＧ_７０００、ＰＰＧ_７１００、ＰＰＧ_７２００、ＰＰＧ_７３００、ＰＰＧ_７４００、ＰＰＧ_７５００、ＰＰＧ_７６００、ＰＰＧ_７７００、ＰＰＧ_７８００、ＰＰＧ_７９００、またはＰＰＧ_８０００である。いくつかの態様では、ＰＰＧは、ＰＰＧ_５０００である。いくつかの態様では、ＰＰＧは、ＰＰＧ_６０００である。いくつかの態様では、ＰＰＧは、ＰＰＧ_４０００である。

【0287】

いくつかの態様では、ＰＰＧは、単分散、例えば、ｍＰＰＧ_１００、ｍＰＰＧ_２００、ｍＰＰＧ_３００、ｍＰＰＧ_４００、ｍＰＰＧ_５００、ｍＰＰＧ_６００、ｍＰＰＧ_７００、ｍＰＰＧ_８００、ｍＰＰＧ_９００、ｍＰＰＧ_１０００、ｍＰＰＧ_１１００、ｍＰＰＧ_１２００、ｍＰＰＧ_１３００、ｍＰＰＧ_１４００、ｍＰＰＧ_１５００、ｍＰＰＧ_１６００、ｍＰＰＧ_１７００、ｍＰＰＧ_１８００、ｍＰＰＧ_１９００、ｍＰＰＧ_２０００、ｍＰＰＧ_２１００、ｍＰＰＧ_２２００、ｍＰＰＧ_２３００、ｍＰＰＧ_２４００、ｍＰＰＧ_２５００、ｍＰＰＧ_１６００、ｍＰＰＧ_１７００、ｍＰＰＧ_１８００、ｍＰＰＧ_１９００、ｍＰＰＧ_２０００、ｍＰＰＧ_２１００、ｍＰＰＧ_２２００、ｍＰＰＧ_２３００、ｍＰＰＧ_２４００、ｍＰＰＧ_２５００、ｍＰＰＧ_２６００、ｍＰＰＧ_２７００、ｍＰＰＧ_２８００、ｍＰＰＧ_２９００、ｍＰＰＧ_３０００、ｍＰＰＧ_３１００、ｍＰＰＧ_３２００、ｍＰＰＧ_３３００、ｍＰＰＧ_３４００、ｍＰＰＧ_３５００、ｍＰＰＧ_３６００、ｍＰＰＧ_３７００、ｍＰＰＧ_３８００、ｍＰＰＧ_３９００、ｍＰＰＧ_４０００、ｍＰＰＧ_４１００、ｍＰＰＧ_４２００、ｍＰＰＧ_４３００、ｍＰＰＧ_４４００、ｍＰＰＧ_４５００、ｍＰＰＧ_４６００、ｍＰＰＧ_４７００、ｍＰＰＧ_４８００、ｍＰＰＧ_４９００、ｍＰＰＧ_５０００、ｍＰＰＧ_５１００、ｍＰＰＧ_５２００、ｍＰＰＧ_５３００、ｍＰＰＧ_５４００、ｍＰＰＧ_５５００、ｍＰＰＧ_５６００、ｍＰＰＧ_５７００、ｍＰＰＧ_５８００、ｍＰＰＧ_５９００、ｍＰＰＧ_６０００、ｍＰＰＧ_６１００、ｍＰＰＧ_６２００、ｍＰＰＧ_６３００、ｍＰＰＧ_６４００、ｍＰＰＧ_６５００、ｍＰＰＧ_６６００、ｍＰＰＧ_６７００、ｍＰＰＧ_６８００、ｍＰＰＧ_６９００、ｍＰＰＧ_７０００、ｍＰＰＧ_７１００、ｍＰＰＧ_７２００、ｍＰＰＧ_７３００、ｍＰＰＧ_７４００、ｍＰＰＧ_７５００、ｍＰＰＧ_７６００、ｍＰＰＧ_７７００、ｍ ＰＰＧ_７８００、ｍＰＰＧ_７９００、またはｍＰＰＧ_８０００である。いくつかの態様では、ｍＰＰＧは、ｍＰＰＧ_５０００である。いくつかの態様では、ｍＰＰＧは、ｍＰＰＧ_６０００である。いくつかの態様では、ｍＰＰＧは、ｍＰＰＧ_４０００である。

【0288】

ＩＶ．Ａ．２．カチオン性キャリア
いくつかの態様では、本開示のカチオン性キャリアユニットは、少なくとも１つのカチオン性キャリア部分を含む。「カチオン性キャリア」という用語は、アニオン性ペイロード（またはペイロードに結合されたアニオン性キャリア）と静電的相互作用し、結合することができる複数の正電荷を含む、本開示のカチオン性キャリアユニットの部分または一部を指す。いくつかの態様では、カチオン性キャリアの正電荷または正に荷電した基の数は、アニオン性ペイロード（またはペイロードに結合されたアニオン性キャリア）の負電荷または負に荷電した基の数と同程度である。いくつかの態様では、カチオン性キャリアは、バイオポリマー、例えば、ペプチド（例えば、ポリリシン）を含む。

【0289】

いくつかの態様では、カチオン性キャリアは、１つ以上の塩基性アミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン、またはそれらの組み合わせ）を含む。いくつかの態様では、カチオン性キャリアは、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、少なくとも約２０個、少なくとも約２１個、少なくとも約２２個、少なくとも約２３個、少なくとも約２４個、少なくとも約２５個、少なくとも約２６個、少なくとも約２７個、少なくとも約２８個、少なくとも約２９個、少なくとも約３０個、少なくとも約３１個、少なくとも約３２個、少なくとも約３３個、少なくとも約３４個、少なくとも約３５個、少なくとも約３６個、少なくとも約３７個、少なくとも約３８個、少なくとも約３９個、少なくとも約４０個、少なくとも約４１個、少なくとも約４２個、少なくとも約４３個、少なくとも約４４個、少なくとも約４５個、少なくとも約４６個、少なくとも約４７個、少なくとも約４８個、少なくとも約４９個、少なくとも約５０個、少なくとも約５１個、少なくとも約５２個、少なくとも約５３個、少なくとも約５４個、少なくとも約５５個、少なくとも約５６個、少なくとも約５７個、少なくとも約５８個、少なくとも約５９個、少なくとも約６０個、少なくとも約６１個、少なくとも約６２個、少なくとも約６３個、少なくとも約６４個、少なくとも約６５個、少なくとも約６６個、少なくとも約６７個、少なくとも約６８個、少なくとも約６９個、少なくとも約７０個、少なくとも約７１個、少なくとも約７２個、少なくとも約７３個、少なくとも約７４個、少なくとも約７５個、少なくとも約７６個、少なくとも約７７個、少なくとも約７８個、少なくとも約７９個、少なくとも約８０個、少なくとも約８１個、少なくとも約８２個、少なくとも約８３個、少なくとも約８４個、少なくとも約８５個、少なくとも約８６個、少なくとも約８７個、少なくとも約８８個、少なくとも約８９個、少なくとも約９０個、少なくとも約９１個、少なくとも約９２個、少なくとも約９３個、少なくとも約９４個、少なくとも約９５個、少なくとも約９６個、少なくとも約９７個、少なくとも約９８個、少なくとも約９９個、または少なくとも約１００個の塩基性アミノ酸、例えば、リシン、アルギニン、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、カチオン性キャリア部分は、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、または約１００個の塩基性アミノ酸を含む。特定の態様では、カチオン性キャリア部分は、約８０個の塩基性アミノ酸を含む。

【0290】

いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットは、少なくとも約４０個の塩基性アミノ酸、例えば、リシンを含む。いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットは、少なくとも約４５個の塩基性アミノ酸、例えば、リシンを含む。いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットは、少なくとも約５０個の塩基性アミノ酸、例えば、リシンを含む。いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットは、少なくとも約５５個の塩基性アミノ酸、例えば、リシンを含む。いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットは、少なくとも約６０個の塩基性アミノ酸、例えば、リシンを含む。いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットは、少なくとも約６５個の塩基性アミノ酸、例えば、リシンを含む。いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットは、少なくとも約７０個の塩基性アミノ酸、例えば、リシンを含む。いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットは、少なくとも約７５個の塩基性アミノ酸、例えば、リシンを含む。いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットは、少なくとも約８０個の塩基性アミノ酸、例えば、リシンを含む。

【0291】

いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットは、約３０個～約１０００個、約３０個～約９００個、約３０個～約８００個、約３０個～約７００個、約３０個～約６００個、約３０個～約５００個、約３０個～約４００個、約３０個～約３００個、約３０個～約２００個、約３０個～約１００個、約４０個～約１０００個、約４０個～約９００個、約４０個～約８００個、約４０個～約７００個、約４０個～約６００個、約４０個～約５００個、約４０個～約４００個、約４０個～約３００個、約４０個～約２００個、または約４０個～約１００個の塩基性アミノ酸、例えば、リシンを含む。いくつかの態様では、塩基性アミノ酸、例えばリシンは、－ＮＨ３＋（例えば、正電荷）を有するように修飾されていない。

【0292】

いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットは、約３０個～約１００個、約３０個～約９０個、約３０個～約８０個、約３０個～約７０個、約３０個～約６０個、約３０個～約５０個、約３０個～約４０個、約４０個～約１００個、約４０個～約９０個、約４０個～約８０個、約４０個～約７０個、約４０個～約６０個、約７０個～約８０個、約７５個～約８５個、約６５個～約７５個、約６５個～約８０個、約６０個～約８５個、または約４０個～約５００の塩基性アミノ酸、例えば、リシンを含む。

【0293】

いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットは、約１００個～約１０００個、約１００個～約９００個、約１００個～約８００個、約１００個～約７００個、約１００個～約６００個、約１００個～約５００個、約１００個～約４００個、約１００個～約３００個、約１００個～約２００個、約２００個～約１０００個、約２００個～約９００個、約２００個～約８００個、約２００個～約７００個、約２００個～約６００個、約２００個～約５００個、約２００個～約４００個、約２００個～約３００個、約３００個～約１０００個、約３００個～約９００個、約３００個～約８００個、約３００個～約７００個、約３００個～約６００個、約３００個～約５００個、約３００個～約４００個、約４００個～約１０００個、約４００個～約９００個、約４００個～約８００個、約４００個～約７００個、約４００個～約６００個、約４００個～約５００個、約５００個～約１０００個、約５００個～約９００個、約５００個～約８００個、約５００個～約７００個、約５００個～約６００個、約６００個～約１０００個、約６００個～約９００個、約６００個～約８００個、約６００個～約７００個、約７００個～約１０００個、約７００個～約９００個、約７００個～約８００個、約８００個～約１０００個、約８００個～約９００個、または約９００個～約１０００の塩基性アミノ酸、例えば、リシンを含む。

【0294】

いくつかの態様では、塩基性アミノ酸、例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン、またはそれらの組み合わせの数は、アニオン性ペイロードの長さに基づいて調整され得る。例えば、より長い配列を有するアニオン性ペイロードは、より大きな数の塩基性アミノ酸（例えば、リシン）と対合させることができる。いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニット中の塩基性アミノ酸、例えばリシンの数は、ポリマー中のプロトン化アミンとアニオン性ペイロード、例えばｍＲＮＡ中のリン酸とのモル比（Ｎ／Ｐ比）が、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、または少なくとも約２０となるように計算することができる。いくつかの態様では、ポリマー中のプロトン化アミンとアニオン性ペイロード、例えばｍＲＮＡ中のリン酸とのモル比（Ｎ／Ｐ比）は、約１～約２０の間、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、または約２０である。いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットの塩基性アミノ酸、例えば、リシンの数は、ポリマー中のプロトン化アミンと、アニオン性ペイロード、例えばｍＲＮＡ中のリン酸とのモル比（Ｎ／Ｐ）が、約１～約１０、例えば約３～約４、約４～約５、約５～約６、約６～約７、または約７～約８となるように計算される。いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットの塩基性アミノ酸、例えば、リシンの数は、ポリマー中のプロトン化アミンと、アニオン性ペイロード、例えばｍＲＮＡ中のリン酸とのモル比（Ｎ／Ｐ比）が、約１～約２となるように計算される。いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットの塩基性アミノ酸、例えば、リシンの数は、ポリマー中のプロトン化アミンと、アニオン性ペイロード、例えばｍＲＮＡ中のリン酸とのモル比（Ｎ／Ｐ比）が、約３～約４となるように計算される。いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットの塩基性アミノ酸、例えば、リシンの数は、ポリマー中のプロトン化アミンと、アニオン性ペイロード、例えばｍＲＮＡ中のリン酸とのモル比（Ｎ／Ｐ比）が、約２～約３となるように計算される。いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットの塩基性アミノ酸、例えば、リシンの数は、ポリマー中のプロトン化アミンと、アニオン性ペイロード、例えばｍＲＮＡ中のリン酸とのモル比（Ｎ／Ｐ比）が、約４～約５となるように計算される。いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットの塩基性アミノ酸、例えば、リシンの数は、ポリマー中のプロトン化アミンと、アニオン性ペイロード、例えばｍＲＮＡ中のリン酸とのモル比（Ｎ／Ｐ比）が、約５～約６となるように計算される。いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットの塩基性アミノ酸、例えば、リシンの数は、ポリマー中のプロトン化アミンと、アニオン性ペイロード、例えばｍＲＮＡ中のリン酸とのモル比（Ｎ／Ｐ比）が、約６～約７となるように計算される。いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットの塩基性アミノ酸、例えば、リシンの数は、ポリマー中のプロトン化アミンと、アニオン性ペイロード、例えばｍＲＮＡ中のリン酸とのモル比（Ｎ／Ｐ比）が、約７～約８となるように計算される。いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットの塩基性アミノ酸、例えば、リシンの数は、ポリマー中のプロトン化アミンと、アニオン性ペイロード、例えばｍＲＮＡ中のリン酸とのモル比（Ｎ／Ｐ比）が、約８～約９となるように計算される。いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットの塩基性アミノ酸、例えば、リシンの数は、ポリマー中のプロトン化アミンと、アニオン性ペイロード、例えばｍＲＮＡ中のリン酸とのモル比（Ｎ／Ｐ比）が、約９～約１０となるように計算される。

【0295】

当業者は、カチオン性キャリア部分の役割はペイロードの負電荷（例えば、ｍＲＮＡのリン酸骨格における負電荷）を静電的相互作用により中性化することであるため、いくつかの態様では（例えば、ペイロードがａｎｔｉｍｉＲなどの核酸である場合）、カチオン性キャリアの長さ、カチオン性キャリアの正に荷電した基の数、ならびにカチオン性キャリアに存在する電荷の分布及び配置は、ペイロード分子の長さ及び電荷分布に依存することを理解するであろう。

【0296】

いくつかの態様では、カチオン性キャリアは、約５個～約１０個、約１０個～約１５個、約１５個～約２０個、約２０個～約２５個、約２５個～約３０個、約３０個～約３５個、約３５個～約４０個、約４０個～約４５個、約４５個～約５０個、約５０個～約５５個、約５５個～約６０個、約６０個～約６５個、約個～約７０個、約７０個～約７５個、または約７５個～約８０個の塩基性アミノ酸を含む。いくつかの特定の態様では、正に荷電したキャリアは、３０個～約５０個の塩基性アミノ酸を含む。いくつかの特定の態様では、正に荷電したキャリアは、７０個～約８０個の塩基性アミノ酸を含む。

【0297】

いくつかの態様では、塩基性アミノ酸は、アルギニン、リシン、ヒスチジン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、塩基性アミノ酸は、Ｄ－アミノ酸である。いくつかの態様では、塩基性アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸である。いくつかの態様では、正に荷電したキャリアは、Ｄ－アミノ酸及びＬ－アミノ酸を含む。いくつかの態様では、塩基性アミノ酸は、少なくとも１つの非天然アミノ酸またはその誘導体を含む。いくつかの態様では、塩基性アミノ酸は、アルギニン、リジン、ヒスチジン、Ｌ－４－アミノメチル－フェニルアラニン、Ｌ－４－グアニジン－フェニルアラニン、Ｌ－４－アミノメチル－Ｎ－イソプロピル－フェニルアラニン、Ｌ－３－ピリジル－アラニン、Ｌ－ｔｒａｎｓ－４－アミノメチルシクロヘキシル－アラニン、Ｌ－４－ピペリジニル－アラニン、Ｌ－４－アミノシクヘキシル－アラニン、４－グアニジノ酪酸、Ｌ－２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸、ＤＬ－５－ヒドロキシリジン、ピロリジン、５－ヒドロキシ－Ｌ－リジン、メチルリジン、ヒプシン、またはそれらの任意の組み合わせである。特定の態様では、正に荷電したキャリアは、約４０個のリシンを含む。特定の態様では、正に荷電したキャリアは、約５０個のリシンを含む。特定の態様では、正に荷電したキャリアは、約６０個のリシンを含む。特定の態様では、正に荷電したキャリアは、約７０個のリシンを含む。特定の態様では、正に荷電したキャリアは、約８０個のリシンを含む。

【0298】

他の態様では、カチオン性キャリアは、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、少なくとも３５個、少なくとも３６個、少なくとも３７個、少なくとも３８個、少なくとも３９個、少なくとも４０個、少なくとも４１個、少なくとも４２個、少なくとも４３個、少なくとも４４個、少なくとも４５個、少なくとも４６個、少なくとも４７個、少なくとも４８個、少なくとも４９個、少なくとも５０個、少なくとも５１個、少なくとも５２個、少なくとも５３個、少なくとも５４個、少なくとも５５個、少なくとも５６個、少なくとも５７個、少なくとも５８個、少なくとも５９個、少なくとも６０個、少なくとも６１個、少なくとも６２個、少なくとも６３個、少なくとも６４個、少なくとも６５個、少なくとも６６個、少なくとも６７個、少なくとも６８個、少なくとも６９個、少なくとも７０個、少なくとも７１個、少なくとも７２個、少なくとも７３個、少なくとも７４個、少なくとも７５個、少なくとも７６個、少なくとも７７個、少なくとも７８個、少なくとも７９個、または少なくとも８０個のカチオン性基（例えば、アミノ基）を含むポリマーまたはコポリマーを含む。いくつかの態様では、カチオン性キャリアは、約５～約１０のカチオン性基、約１０～約１５のカチオン性基、約１５～約２０のカチオン性基、約２０～約２５のカチオン性基、約２５～約３０のカチオン性基、約３０～約３５のカチオン性基、約３５～約４０のカチオン性基、約４０～約４５のカチオン性基、約４５～約５０のカチオン性基、約５０～約５５のカチオン性基、約５５～約６０のカチオン性基、約６０～約６５のカチオン性基、約６５～約７０のカチオン性基、約７０～約７５のカチオン性基、または約４５～約５０のカチオン性基（例えば、アミノ基）を含むポリマーまたはコポリマーを含む。いくつかの特定の態様では、カチオン性キャリアは、３０～約５０のカチオン性基（例えば、アミノ基）を含むポリマーまたはコポリマーを含む。いくつかの特定の態様では、カチオン性キャリアは、７０～約８０のカチオン性基（例えば、アミノ基）を含むポリマーまたはコポリマーを含む。いくつかの態様では、ポリマーまたはコポリマーは、アクリレート、ポリアルコール、または多糖である。

【0299】

いくつかの態様では、カチオン性キャリア部分は、単一のペイロード分子に結合する。他の態様では、カチオン性キャリア部分は、同一であり得るか、または異なり得る複数のペイロード分子に結合し得る。

【0300】

いくつかの態様では、カチオン性キャリア部分の正電荷と核酸ペイロードの負電荷とのイオン比は、約２０：１、約１９：１、約１８：１、約１７：１、約１６：１、約１５：１、約１４：１、約１３：１、約１２：１、約１１：１、約１０：１、約９：１、約８：１ 約７：１、約６：１ 約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、または約１：１である。いくつかの態様では、核酸ペイロードの負電荷とカチオン性キャリア部分の正電荷とのイオン比は、約２０：１、約１９：１、約１８：１、約１７：１、約１６：１、約１５：１、約１４：１、約１３：１、約１２：１、約１１：１、約１０：１、約９：１、約８：１ 約７：１、約６：１ 約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、または約１：１である。

【0301】

いくつかの態様では、アニオン性ペイロードは、約１０～約１０００（例えば、約１００～約１０００）の長さを有するヌクレオチド配列を含み、カチオン性キャリア部分とアニオン性ペイロードとのＮ／Ｐ比は、約２～約１０、例えば、約２～約９、約２～約８、約２～約７、約２～約６、約２～約５、約２～約４、約２～約３、例えば、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０である。いくつかの態様では、カチオン性キャリア部分と、約１０～約１０００ヌクレオチドの長さのアニオン性ペイロードとのＮ／Ｐ比は、約１～約１０、例えば、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０である。

【0302】

いくつかの態様では、アニオン性ペイロードは、約１０００～約２０００の長さを有するヌクレオチド配列を含み、カチオン性キャリア部分とアニオン性ペイロードとのＮ／Ｐ比は、約３～約１２、例えば、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、または約１２である。いくつかの態様では、カチオン性キャリア部分とアニオン性ペイロードとのＮ／Ｐ比は、約４～約７、例えば、約４、約５、約６、または約７である。

【0303】

いくつかの態様では、アニオン性ペイロードは、約２０００～約３０００の長さを有するヌクレオチド配列を含み、カチオン性キャリア部分とアニオン性ペイロードとのＮ／Ｐ比は、約３～約１６、例えば、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６である。いくつかの態様では、カチオン性キャリア部分とアニオン性ペイロードとのＮ／Ｐ比は、約６～約９、例えば、約６、約７、約８、または約９である。

【0304】

いくつかの態様では、アニオン性ペイロードは、約３０００～約４０００の長さを有するヌクレオチド配列を含み、カチオン性キャリア部分とアニオン性ペイロードとのＮ／Ｐ比は、約３～約２０、例えば、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、または約２０である。いくつかの態様では、カチオン性キャリア部分とアニオン性ペイロードとのＮ／Ｐ比は、約７～約１０、例えば、約７、約８、約９、または約１０である。

【0305】

いくつかの態様では、カチオン性キャリア部分は、自由末端を有し、ここで、末端基は反応性基である。いくつかの態様では、カチオン性キャリア部分は、自由末端（例えば、ポリリシンカチオン性キャリア部分におけるＣ末端）を有し、ここで、末端基は、アミノ（－ＮＨ２）基である。いくつかの態様では、カチオン性キャリア部分は、自由末端を有し、ここで、末端基はスルフヒドリル基である。いくつかの態様では、カチオン性キャリア部分の反応性基は、疎水性部分、例えば、ビタミンＢ３疎水性部分に結合される。

【0306】

ＩＶ．Ａ．３．架橋部分
いくつかの態様では、本開示のカチオン性キャリアユニットは、少なくとも１つの架橋部分を含む。「架橋部分」という用語は、架橋を形成することができる複数の物質を含むポリマーブロックの化学部分または部分を指す。いくつかの態様では、架橋を形成することができるいくつかの物質は、架橋剤の側鎖を有するアミノ酸を含む。いくつかの態様では、ＣＭは、バイオポリマー、例えば、架橋剤に連結されたペプチド（例えば、ポリリシン）を含む。

【0307】

いくつかの態様では、架橋部分は、１つ以上のアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン、またはそれらの組み合わせ）を含む。いくつかの態様では、架橋部分は、それぞれが架橋剤に連結された少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、少なくとも約２０個、少なくとも約２１個、少なくとも約２２個、少なくとも約２３個、少なくとも約２４個、少なくとも約２５個、少なくとも約２６個、少なくとも約２７個、少なくとも約２８個、少なくとも約２９個、少なくとも３０個、少なくとも約３１個、少なくとも約３２個、少なくとも約３３個、少なくとも約３４個、少なくとも約３５個、少なくとも約３６個、少なくとも約３７個、少なくとも約３８個、少なくとも約３９個、少なくとも約４０個、少なくとも約４１個、少なくとも約４２個、少なくとも約４３個、少なくとも約４４個、少なくとも約４５個、少なくとも約４６個、少なくとも約４７個、少なくとも約４８個、少なくとも約４９個、または少なくとも約５０個のアミノ酸、例えば、リシン、アルギニン、またはそれらの組み合わせを含む。

【0308】

いくつかの態様では、架橋部分は、それぞれが架橋剤に連結された少なくとも約１０個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、架橋部分は、それぞれが架橋剤に連結された少なくとも約１１個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、架橋部分は、それぞれが架橋剤に連結された少なくとも約１２個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、架橋部分は、それぞれが架橋剤に連結された少なくとも約１３個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、架橋部分は、それぞれが架橋剤に連結された少なくとも約１４個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、架橋部分は、それぞれが架橋剤に連結された少なくとも約１５個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、架橋部分は、それぞれが架橋剤に連結された少なくとも約１６個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、架橋部分は、それぞれが架橋剤に連結された少なくとも約１７個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、架橋部分は、それぞれが架橋剤に連結された少なくとも約１８個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、架橋部分は、それぞれが架橋剤に連結された少なくとも約１９個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、架橋部分は、それぞれが架橋剤に連結された少なくとも約２０個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。

【0309】

いくつかの態様では、架橋剤はチオールである。いくつかの態様では、架橋剤はチオール誘導体である。

【0310】

ＩＶ．Ａ．４．疎水性部分
いくつかの態様では、本開示のカチオン性キャリアユニットは、少なくとも１つの疎水性部分を含む。本明細書で使用する場合、「疎水性部分」という用語は、例えば、（ｉ）ペイロードの治療活性もしくは予防活性を補足し得るか、（ｉｉ）ペイロードの治療活性もしくは予防活性を調節し得るか、（ｉｉｉ）標的組織もしくは標的細胞において治療薬及び／または予防薬として機能し得るか、（ｉｖ）生理学的バリア、例えば、ＢＢＢ及び／または形質膜を通したカチオン性キャリアユニットの輸送を促進し得るか、（ｖ）標的組織もしくは標的細胞の恒常性を改善し得るか、（ｖｉ）正に荷電した基をカチオン性キャリア部分に提供し得るか、または（ｖｉｉ）それらの任意の組み合わせであり得る分子実体を指す。

【0311】

いくつかの態様では、疎水性部分は、例えば、免疫反応、炎症反応、または組織微小環境を調節することができる。

【0312】

いくつかの態様では、免疫反応を調節することができる疎水性部分は、例えば、チロシンまたはドーパミンを含み得る。チロシンは、Ｌ－ドーパに変換され得、次いで、２ステップの酵素反応によりドーパミンに変換される。通常、ドーパミンレベルは、パーキンソン病患者において低い。したがって、いくつかの態様では、チロシンは、パーキンソン病の治療に使用されるカチオン性キャリアユニットにおける疎水性部分である。トリプトファンは、食欲、感情、ならびに運動機能、認知機能、及び自律神経機能において役割を果たすと考えられている神経伝達物質であるセロトニンに変換され得る。したがって、いくつかの態様では、低セロトニンレベルに関連する疾患または状態の治療に使用される本開示のカチオン性キャリアユニットは、疎水性部分としてトリプトファンを含む。

【0313】

いくつかの態様では、疎水性部分は、例えば、腫瘍微小環境における低酸素状態を阻害または低減することにより、腫瘍を有する対象における腫瘍微小環境を調節し得る。

【0314】

いくつかの態様では、疎水性部分は、例えば、イミダゾール誘導体、ビタミン、またはそれらの任意の組み合わせに連結されたアミノ酸を含む。

【0315】

いくつかの態様では、疎水性部分は、下式を含むイミダゾール誘導体に連結されたアミノ酸（例えば、リシン）：

【化13】

（式中、Ｇ１及びＧ２のそれぞれは、独立して、Ｈ、芳香環、もしくは１～１０アルキルであるか、またはＧ１及びＧ２は、ともに芳香環を形成し、ｎは１～１０である。）を含む。

【0316】

いくつかの態様では、疎水性部分は、ニトロイミダゾールに連結されたアミノ酸（例えば、リシン）を含む。ニトロイミダゾールは、抗生物質として機能する。ニトロイミダゾールにおけるニトロ複素環は、低酸素細胞において還元的に活性化され得、次いで、酸化還元リサイクルを受け得るか、または細胞毒性産物に分解し得る。還元は、通常、嫌気性細菌または無酸素組織においてのみ起こるため、それらのヒト細胞または好気性細菌に対する影響は比較的小さい。いくつかの態様では、疎水性部分は、メトロニダゾール、チニダゾール、ニモラゾール、ジメトリダゾール、プレトマニド、オルニダゾール、メガゾール、アザニダゾール、ベンズニダゾール、ニトロイミダゾール、またはそれらの任意の組み合わせに連結されたアミノ酸（例えば、リシン）を含む。

【0317】

いくつかの態様では、疎水性部分は、下式を含む：

【化14】

（式中、Ａｒは、

【化15】

であり、
Ｚ１及びＺ２のそれぞれは、ＨまたはＯＨである）。

【0318】

いくつかの態様では、疎水性部分は、炎症反応を阻害または低減することができる。

【0319】

いくつかの態様では、疎水性部分は、ビタミンに連結されたアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、ビタミンは、環式環（ｃｙｃｌｉｃ ｒｉｎｇ）または環式ヘテロ原子環（ｃｙｃｌｉｃ ｈｅｔｅｒｏ ａｔｏｍ ｒｉｎｇ）及びカルボキシル基またはヒドロキシル基を含む。いくつかの態様では、ビタミンは、下式を含む：

【化16】

（式中、Ｙ１及びＹ２のそれぞれは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり、ｎは１または２である）。

【0320】

いくつかの態様では、ビタミンは、ビタミンＡ（レチノール）、ビタミンＢ１（チアミン塩化物）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシンアミド）、ビタミンＢ６（ピリドキサール）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ９（葉酸）、ビタミンＢ１２（コバラミン）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、ビタミンＥ（トコフェロール）、ビタミンＭ、ビタミンＨ、それらの誘導体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。

【0321】

いくつかの態様では、ビタミンは、以下のビタミンＢ３（ナイアシンまたはニコチン酸としても公知）である。

【化17】

【0322】

いくつかの態様では、疎水性部分は、それぞれがビタミンＢ３に連結された少なくとも１個、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、または少なくとも約２０個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、疎水性部分は、それぞれがビタミンＢ３に連結された約１個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、疎水性部分は、それぞれがビタミンＢ３に連結された約２個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、疎水性部分は、それぞれがビタミンＢ３に連結された約３個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、疎水性部分は、それぞれがビタミンＢ３に連結された約４個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、疎水性部分は、それぞれがビタミンＢ３に連結された約５個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、疎水性部分は、それぞれがビタミンＢ３に連結された約６個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、疎水性部分は、それぞれがビタミンＢ３に連結された約７個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、疎水性部分は、それぞれがビタミンＢ３に連結された約８個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、疎水性部分は、それぞれがビタミンＢ３に連結された約９個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、疎水性部分は、それぞれがビタミンＢ３に連結された約１０個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、疎水性部分は、それぞれがビタミンＢ３に連結された約１１個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、疎水性部分は、それぞれがビタミンＢ３に連結された約１２個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、疎水性部分は、それぞれがビタミンＢ３に連結された約１３個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、疎水性部分は、それぞれがビタミンＢ３に連結された約１４個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、疎水性部分は、それぞれがビタミンＢ３に連結された約１５個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、疎水性部分は、それぞれがビタミンＢ３に連結された約１６個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、疎水性部分は、それぞれがビタミンＢ３に連結された約１７個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、疎水性部分は、それぞれがビタミンＢ３に連結された約１８個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、疎水性部分は、それぞれがビタミンＢ３に連結された少なくとも約１９個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。いくつかの態様では、疎水性部分は、それぞれがビタミンＢ３に連結された少なくとも約２０個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。

【0323】

いくつかの態様では、疎水性部分は、それぞれがビタミンＢ３に連結された約１個～約１０個のアミノ酸（例えば、リシン）、それぞれがビタミンＢ３に結合された約５個～約１０個のアミノ酸（例えば、リシン）、それぞれがビタミンＢ３に結合された約１０個～約１５個のアミノ酸（例えば、リシン）、それぞれがビタミンＢ３に結合された約１５個～約２０個のアミノ酸（例えば、リシン）、それぞれがビタミンＢ３に結合された約１個～約２０個のビタミンアミノ酸（例えば、リシン）、それぞれがビタミンＢ３に結合された約１個～約１５個のビタミンアミノ酸（例えば、リシン）、それぞれがビタミンＢ３に結合された約１個～約１０個のアミノ酸（例えば、リシン）、それぞれがビタミンＢ３に結合された約１個～約５個のアミノ酸（例えば、リシン）を含む。

【0324】

ナイアシンは、インビボにおいて補酵素であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）の前駆体である。ＮＡＤは、酵素ＮＡＤ＋キナーゼの存在下でのリン酸化によりＮＡＤＰに変換される。ＮＡＤＰ及びＮＡＤは、多数の水素転移プロセスに関与する多数のデヒドロゲナーゼの補酵素である。ＮＡＤは、脂肪、炭水化物、タンパク質、及びアルコールの異化、ならびに細胞シグナル伝達及びＤＮＡ修復に重要であり、ＮＡＤＰは、主に同化反応、例えば、脂肪酸及びコレステロール合成に重要である。エネルギー必要量が高い（脳）か、または代謝回転速度が速い器官（消化管、皮膚）は、通常、それらの欠乏に最も感受性が高い。

【0325】

ナイアシンは、脳、消化管、皮膚、及び血管組織を含む種々の組織においてＮＩＡＣＲ１の活性化により顕著な抗炎症効果をもたらす。ナイアシンは、神経炎症を減弱することが示されており、多発性硬化症及びパーキンソン病などの神経免疫障害の処置における有効性を有し得る。Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ ＆ Ｓｃｈｗａｎｉｎｇｅｒ（２０１５）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２１：２４５－２６６；Ｃｈａｉ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｒｅｐｏｒｔｓ １５：３２５；Ｇｒａｆｆ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ６５：１０２－１３；及びＷａｋａｄｅ ＆ Ｃｈｏｎｇ（２０１４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３４７：３４－８（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

【0326】

ＩＶ．Ａ．５．標的化部分
いくつかの態様では、カチオン性キャリアユニットは、任意選択的にリンカーにより水溶性ポリマーに連結されている標的化部分を含む。本明細書で使用する場合、「標的化部分」という用語は、特定の生体物質または部位に結合する生体認識分子を指す。いくつかの態様では、標的化部分は、ある特定の標的分子に対して特異的（例えば、受容体を標的とするリガンドまたは表面タンパク質を標的とする抗体）であるか、組織に対して特異的（例えば、特定の器官または組織、例えば、肝臓、脳、または内皮にミセルを優先的に輸送する分子）であるか、または生理学的バリアを通した輸送を促進する（例えば、血液脳関門または形質膜を通した輸送を促進し得るペプチドまたは他の分子）。

【0327】

ペイロード（例えば、ヌクレオチド分子、例えば、ｍＲＮＡ）を本開示に従って標的化するために、標的化部分は、カチオン性キャリアユニットに連結され得、これによって、ミセルの外面に連結され得る一方で、ミセルは、その核内に封入されたペイロードを有する。

【0328】

いくつかの態様では、標的化部分は、本開示のミセルを組織に標的化することができる標的化部分である。いくつかの態様では、組織は、肝臓、脳、腎臓、肺、卵巣、膵臓、甲状腺、乳房、胃、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様では、組織は、がん組織、例えば、肝臓癌、脳癌、腎臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、甲状腺癌、乳癌、胃癌、またはそれらの任意の組み合わせである。

【0329】

特定の態様では、組織は、肝臓である。特定の態様では、肝臓を標的とする標的化部分は、コレステロールである。他の態様では、肝臓を標的とする標的化部分は、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分と結合するリガンドである。いくつかの態様では、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分は、ＧａｌＮＡｃクラスターを含む。いくつかの態様では、ＧａｌＮＡｃクラスターは、一価、二価、三価、または四価のＧａｌＮＡｃクラスターである。

【0330】

別の態様では、組織は、膵臓である。いくつかの態様では、膵臓を標的とする標的化部分は、膵臓細胞上のαｖβ３インテグリン受容体を標的とするリガンドを含む。いくつかの態様では、標的化部分は、アルギニルグリシルアスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド配列（Ｌ－アルギニル－グリシル－Ｌ－アスパラギン酸、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）を含む。

【0331】

いくつかの態様では、組織は、中枢神経系の組織、例えば、神経組織である。いくつかの態様では、中枢神経系を標的とする標的化部分は、大型中性アミノ酸輸送体１（ＬＡＴ１）により輸送されることができる。ＬＡＴ１（ＳＬＣ７Ａ５）は、大型中性アミノ酸及びいくつかの医薬品の両方の取り込みのための輸送体である。ＬＡＴ１は、Ｌ－ドーパまたはガバペンチンなどの薬物を輸送し得る。

【0332】

いくつかの態様では、標的化部分は、グルコース輸送体１（またはＧＬＵＴ１）に結合することができ、ＢＢＢを通過することができるグルコース、例えば、Ｄ－グルコースを含む。溶質輸送体ファミリー２促進性グルコース輸送体メンバー１（ＳＬＣ２Ａ１）としても公知のＧＬＵＴ１は、ヒトにおいてＳＬＣ２Ａ１遺伝子によりコードされる単輸送体タンパク質である。ＧＬＵＴ１は、哺乳動物細胞の形質膜を通したグルコースの輸送を促進する。この遺伝子は、哺乳動物の血液脳関門における主要なグルコース輸送体をコードする。

【0333】

いくつかの態様では、標的化部分は、ＧＬＵＴ１輸送体に結合することができ、ＢＢＢを通過することができるガラクトース（例えば、Ｄ－ガラクトース）を含む。いくつかの態様では、標的化部分は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（ＡＣｈＥＩ）及び／またはＥＡＡＴ阻害剤に結合することができ、ＢＢＢを通過することができるグルタミン酸を含む。アセチルコリンエステラーゼは、コリンエステラーゼ酵素ファミリーの主要なメンバーである酵素である。アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（ＡＣｈＥＩ）は、アセチルコリンエステラーゼがアセチルコリンをコリン及び酢酸に分解するのを阻害し、これにより、アセチルコリン受容体が豊富である中枢神経系、自律神経節、及び神経筋接合部における神経伝達物質アセチルコリンのレベル及び作用持続時間の両方を増加させる阻害剤である。アセチルコリンエステラーゼ阻害剤は、２種類のコリンエステラーゼ阻害剤のうちの１つであり、もう一方は、ブチルコリンエステラーゼ阻害剤である。

【0334】

いくつかの態様では、標的化部分により標的とされる組織は、骨格筋である。いくつかの態様では、骨格筋を標的とする標的化部分は、大型中性アミノ酸輸送体１（ＬＡＴ１）により輸送されることができる。

【0335】

ＬＡＴ１は、Ｔ細胞、がん細胞、及び脳内皮細胞を含む多数の細胞種で発現される。ＬＡＴ１は、脳微小血管内皮細胞において一貫して高レベルで発現される。溶質輸送体が主にＢＢＢに存在するため、本開示のミセルのＬＡＴ１への標的化により、ＢＢＢを通した送達を可能となる。いくつかの態様では、本開示のミセルをＬＡＴ１輸送体に標的化する標的化部分は、アミノ酸、例えば、分枝鎖または芳香族アミノ酸である。いくつかの態様では、アミノ酸は、バリン、ロイシン、及び／またはイソロイシンである。いくつかの態様では、アミノ酸は、トリプトファン及び／またはチロシンである。いくつかの態様では、アミノ酸は、トリプトファンである。他の態様では、アミノ酸は、チロシンである。

【0336】

いくつかの態様では、標的化部分は、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、チロキシン、メルファラン、Ｌ－ドーパ、ガバペンチン、３，５－Ｉ－ジヨードチロシン、３－ヨード－Ｉ－チロシン、フェンクロニン、アシビシン、ロイシン、ＢＣＨ、メチオニン、ヒスチジン、バリン、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるＬＡＴ１リガンドである。

【0337】

Ｓｉｎｇｈ ＆ Ｅｃｋｅｒ（２０１８）“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｌｉｇａｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｌａｒｇｅ Ｎｅｕｔｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １，ＬＡＴ１，” Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．１９：１２７８；Ｇｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｌｉｇａｎｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｌａｒｇｅ－ｎｅｕｔｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １，ＬＡＴ－１，” Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０：５４８０－８５；及びＣｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）“Ｒｅｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｌ－ｔｙｐｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（ＬＡＴ１），” Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ６１：７３５８－７３（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

【0338】

標的化部分の非限定的な例が、以下に記載される。

【0339】

ＩＶ．Ａ．５．ａ．リガンド
リガンドは、別の物質に対する選択的（または特異的）親和性を有する選択的に結合可能な物質として定義される標的化部分の一種として機能する。リガンドは、必ずしもではないが、通常、より大きな特異的に結合する物体または「結合パートナー」または「受容体」により認識及び結合される。標的化に好適なリガンドの例は、とりわけ、抗原、ハプテン、ビオチン、ビオチン誘導体、レクチン、ガラクトサミン及びフコシルアミン部分、受容体、基質、補酵素、ならびに補因子である。

【0340】

本開示のミセルに適用される場合、リガンドとしては、その対応する抗体もしくはその断片により、またはそれらに結合されることができる抗原またはハプテンが挙げられる。任意のＤＮＡ及びＲＮＡウイルス、ＡＩＤＳ、ＨＩＶ、及び肝炎ウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、アレナウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、ヘルペスウイルス、ミクソウイルス、オンコルナウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、ラブドウイルス、ライノウイルス、トガウイルス、及びウイロイド由来のものを含むウイルス抗原またはヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ及びヌクレオカプシド；グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属、腸内細菌、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ属、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕｓ属のものを含む任意の細菌抗原；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ属、真菌症、藻菌類、及び酵母のものを含む任意の真菌抗原；任意のマイコプラズマ抗原；任意のリケッチア抗原；任意の原生動物抗原；任意の寄生虫抗原；血液細胞、ウイルス感染細胞、遺伝マーカー、心疾患、腫瘍性タンパク質、血漿タンパク質、補体因子、リウマチ因子のものを含む任意のヒト抗原も挙げられる。がん及び腫瘍抗原、例えば、とりわけ、αフェトプロテイン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）及びＣＥＡ、がんマーカー、ならびに腫瘍性タンパク質も挙げられる。

【0341】

本開示のミセルを標的化するためのリガンドとして機能し得る他の物質は、ある特定のビタミン（すなわち、葉酸、Ｂ_１２）、ステロイド、プロスタグランジン、炭水化物、脂質、抗生物質、薬物、ジゴキシン、殺虫剤、麻薬、神経伝達物質、及びリガンドとして機能するように使用または修飾される物質である。

【0342】

いくつかの態様では、標的化部分は、細胞親和性を有するタンパク質またはタンパク質断片（例えば、ホルモン、毒素）及び合成または天然ポリペプチドを含む。リガンドとしては、組換えＤＮＡ、遺伝子工学、及び分子工学により作製される、リゲーターに対する選択的親和性を有する様々な物質も挙げられる。特に明示される場合を除き、本開示のリガンドには、米国特許第３，８１７，８３７号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において定義されるリガンドも含まれる。

【0343】

ＩＶ．Ａ．５．ｂ．リゲーター
リゲーターは、必ずしもではないが、通常、結合することができるリガンドより大きな特異的に結合する物体または「パートナー」または「受容体」と本開示において定義される標的化部分の一種として機能する。本開示の目的のため、リゲーターは、特異的リガンドとの選択的親和性結合ができる特異的な物質または材料または化学物質または「反応物質」であり得る。リゲーターは、抗体などのタンパク質、タンパク質でない結合する物体、または「特異的反応を示すもの」であり得る。

【0344】

本開示に適用される場合、リゲーターとしては、すべてのクラスの抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ断片、それらの断片及び誘導体を含むと定義される抗体が挙げられる。「抗体」という用語は、天然であるか、または一部もしくは全体が合成により生成されたかどうかにかかわらず、免疫グロブリン及びその断片を包含する。この用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインに相同である結合ドメインを有するあらゆるタンパク質を包含する。「抗体」には、抗原を特異的に結合及び認識する、免疫グロブリン遺伝子またはその断片由来のフレームワーク領域を含むポリペプチドもさらに含まれる。抗体という用語の使用は、全長抗体、ポリクローナル、モノクローナル、及び組換え抗体、それらの断片を含み、一本鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス／ヒト、マウス／霊長類、霊長類／ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、（ｓｃＦａｂ）_２、（ｓｃＦｖ）_２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及び、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ１）_２、Ｆｖ、ｄＡｂ、ならびにＦｄ断片、ダイアボディ、ならびに抗体関連ポリペプチドをさらに含むことを意図する。抗体は、所望の生物学的活性または機能を有するものである限り、二重特異性抗体及び多重特異性抗体を含む。本開示のいくつかの態様では、標的化部分は、抗体または分子であって、その抗原結合断片を含む、抗体または分子である。いくつかの態様では、抗体は、ナノボディである。いくつかの態様では、抗体は、ＡＤＣである。「抗体薬物コンジュゲート」及び「ＡＤＣ」という用語は、互換的に使用され、例えば、共有結合により治療薬（場合により、本明細書において、薬剤、薬物、または活性医薬成分と称される）または薬剤に連結された抗体を指す。本開示のいくつかの態様では、標的化部分は、抗体薬物コンジュゲートである。

【0345】

ある特定の状況では、本開示は、他の物質のリゲーターとしての使用にも適用可能である。例えば、標的化に好適な他のリゲーターとしては、ホルモン、ビタミン、薬物、抗生物質、がんマーカー、遺伝マーカー、ウイルス、及び組織適合性マーカーに特異的に結合する、天然に存在する受容体、任意のヘマグルチニン及び細胞膜及び核の誘導体が挙げられる。別の類のリゲーターとしては、任意のＲＮＡ及びＤＮＡ結合物質、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びポリペプチドまたはタンパク質、例えば、ヒストン及びプロタミンが挙げられる。

【0346】

他のリゲーターとしては、酵素、特にノイラミニダーゼなどの細胞表面酵素、血漿タンパク質、アビジン、ストレプトアビジン、ケイロン、キャビタンド、チログロブリン、内因子、グロブリン、キレート剤、界面活性剤、有機金属物質、ブドウ球菌プロテインＡ、プロテインＧ、リボソーム、バクテリオファージ、シトクロム、レクチン、ある特定の樹脂、及び有機ポリマーも挙げられる。

【0347】

標的化部分としては、様々な物質、例えば、組換えＤＮＡ、遺伝子工学、及び分子工学により作製される、任意の細胞、組織、または微生物の表面に対する親和性を有する任意のタンパク質、タンパク質断片、またはポリペプチドも挙げられる。したがって、いくつかの態様では、標的化部分は、本開示のミセルを特定の組織（すなわち、肝臓組織または脳組織）、特定の種類の細胞（例えば、ある特定の種類のがん細胞）、または生理学的区画もしくは生理学的バリア（例えば、ＢＢＢ）に誘導する。

【0348】

ＩＶ．Ａ．６リンカー
前述したように、本明細書に開示されるカチオン性キャリアユニットは、１つ以上のリンカーを含み得る。本明細書で使用する場合、「リンカー」という用語は、主な機能が本明細書において開示されるカチオン性キャリアユニットにおける２つの部分を連結することである、ペプチドもしくはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列）、または非ペプチドリンカーを指す。いくつかの態様では、本開示のカチオン性キャリアユニットは、組織特異的標的化部分（ＴＭ）を水溶性ポリマー（ＷＳ）と連結する少なくとも１つのリンカー、水溶性バイオポリマー（ＷＰ）をカチオン性キャリア（ＣＣ）もしくは疎水性部分（ＨＭ）もしくは架橋部分（ＣＭ）と連結する少なくとも１つのリンカー、カチオン性キャリア（ＣＣ）を疎水性部分（ＨＭ）と連結する少なくとも１つのリンカー、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの態様では、２つ以上のリンカーを直列に連結することができる。

【0349】

複数のリンカーが本明細書において開示されるカチオン性キャリアユニットに存在する場合、リンカーの各々は、同一であり得るか、または異なり得る。一般に、リンカーは、カチオン性キャリアユニットに柔軟性を提供する。リンカーは、通常切断されないが、ある特定の態様では、かかる切断が望ましいことがあり得る。したがって、いくつかの態様では、リンカーは、リンカーの配列内に位置するかまたはリンカー配列のいずれかの末端でリンカーに隣接させることができる１つ以上のプロテアーゼ切断部位を含むことができる。

【0350】

一態様では、リンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個、少なくとも約４０個、少なくとも約４５個、少なくとも約５０個、少なくとも約５５個、少なくとも約６０個、少なくとも約６５個、少なくとも約７０個、少なくとも約７５個、少なくとも約８０個、少なくとも約８５個、少なくとも約９０個、少なくとも約９５個、または少なくとも約１００個のアミノ酸を含むことができる。

【0351】

いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも約１１０個、少なくとも約１２０個、少なくとも約１３０個、少なくとも約１４０個、少なくとも約１５０個、少なくとも約１６０個、少なくとも約１７０個、少なくとも約１８０個、少なくとも約１９０個、または少なくとも約２００個のアミノ酸を含むことができる。

【0352】

他の態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも約２００個、少なくとも約２５０個、少なくとも約３００個、少なくとも約３５０個、少なくとも約４００個、少なくとも約４５０個、少なくとも約５００個、少なくとも５５０個、少なくとも約６００個、少なくとも約６５０個、少なくとも約７００個、少なくとも約７５０個、少なくとも約８００個、少なくとも約８５０個、少なくとも約９００個、少なくとも約９５０個、または少なくとも約１，０００個のアミノ酸を含むことができる。

【0353】

ペプチドリンカーは、１～約５個の個のアミノ酸、１～約１０個のアミノ酸、１～約２０個のアミノ酸、約１０～約５０個のアミノ酸、約５０～約１００個のアミノ酸、約１００～約２００個のアミノ酸、約２００～約３００個のアミノ酸、約３００～約４００個のアミノ酸、約４００～約５００個のアミノ酸、約５００～約６００個のアミノ酸、約６００～約７００個のアミノ酸、約７００～約８００個のアミノ酸、約８００～約９００個のアミノ酸、または約９００～約１０００アミノ酸を含むことができる。

【0354】

ペプチドリンカーの例は、当該技術分野では周知のものである。いくつかの態様では、リンカーはグリシン／セリンリンカーである。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、式［（Ｇｌｙ）ｎ－Ｓｅｒ］ｍによるグリシン／セリンリンカーであり、式中、ｎは、１～１００の任意の整数であり、ｍは、１～１００から任意の整数である。他の態様では、グリシン／セリンリンカーは、式［（Ｇｌｙ）ｘ－Ｓｅｒｙ］ｚ（配列番号１）によるものであり、式中、ｘは、１～４の整数であり、ｙは、０または１であり、ｚは、１～５０の整数である。一態様では、ペプチドリンカーは、配列Ｇｎを含み、式中、ｎは、１～１００の整数であり得る。特定の態様では、ペプチドリンカーの配列は、ＧＧＧＧ（配列番号２）である。

【0355】

いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、配列（ＧｌｙＡｌａ）ｎ（配列番号３）を含み得、式中、ｎは、１～１００の整数である。他の態様では、ペプチドリンカーは、配列（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｎ（配列番号４）を含み得、式中、ｎは、１～１００の整数である。

【0356】

他の態様では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）を含む。さらに他の態様では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳ）ｎ（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号６）を含む。これらの例において、ｎは、１～１００の整数であり得る。他の例において、ｎは、１～２０の整数、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０であり得る。

【0357】

リンカーの例としては、限定されるものではないが、ＧＧＧ、ＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号７）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号８）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１０）、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１）が挙げられる。他の態様では、リンカーは、ポリＧ配列（ＧＧＧＧ）ｎ（配列番号１２）であり、式中、ｎは、１～１００の整数であり得る。

【0358】

一態様では、ペプチドリンカーは、合成、すなわち、非天然である。一態様では、ペプチドリンカーは、アミノ酸の第１の直線配列を、第１の直線配列が自然には連結されていない、または遺伝子的に融合されていないアミノ酸の第２の直線配列に連結または遺伝子的に融合するアミノ酸配列を含むペプチド（またはポリペプチド）（例えば、天然または非天然ペプチド）を含む。例えば、一態様では、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチドの改変された形態（例えば、付加、置換または欠失などの変異を含む）である非天然のポリペプチドを含むことができる。別の態様では、ペプチドリンカーは、非天然アミノ酸を含み得る。別の態様では、ペプチドリンカーは、自然に生じない直鎖状配列で生じる天然に存在するアミノ酸を含み得る。さらに別の態様では、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチド配列を含み得る。

【0359】

いくつかの態様では、リンカーは、非ペプチドリンカーを含む。他の態様では、リンカーは、非ペプチドリンカーからなる。いくつかの態様では、非ペプチドリンカーは、例えば、マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、メトキシルポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）、４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、４－（ｐ－マレイミドフェニル）酪酸スクシンイミジル（ＳＭＰＢ）、（４－ヨードアセチル）アミノ安息香酸Ｎ－スクシンイミジル（ＳＩＡＢ）、６－［３－（２－ピリジルジチオ）－プロピオンアミド］ヘキサン酸スクシンイミジル（ＬＣ－ＳＰＤＰ）、４－スクシンイミジルオキシカルボニル－α－メチル－α－（２－ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）、など（米国特許第７，３７５，０７８号を参照のこと）であり得る。

【0360】

リンカーは、当該技術分野において公知の技術（例えば、化学的コンジュゲーション、組換え技術、またはペプチド合成）を使用してポリペプチド配列に導入され得る。改変は、ＤＮＡ配列解析により確認され得る。いくつかの態様では、リンカーは、組換え技術を使用して導入され得る。他の態様では、リンカーは、固相ペプチド合成を使用して導入され得る。ある特定の態様では、本明細書において開示されるカチオン性キャリアユニットは、組換え技術を使用して導入された１つ以上のリンカー、及び固相ペプチド合成または当該技術分野において公知の化学的コンジュゲーションの方法を使用して導入された１つ以上のリンカーを同時に含有し得る。いくつかの態様では、リンカーは切断部位を含む。

【0361】

Ｖ．細胞
いくつかの態様では、本明細書では、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）を含むように改変された細胞が提供される。特定の態様では、細胞は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルスベクター）を含む。

【0362】

いずれの理論にも束縛されるものではないが、いくつかの態様では、本明細書に記載の細胞（すなわち、本開示のポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチドを含むベクターを含む）は、タンパク質（例えば、本明細書に記載の治療用タンパク質、例えば、コロナウイルスタンパク質）を産生するのに有用である。本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）は、細胞内でコードされたタンパク質の発現を増加させることができる。したがって、いくつかの態様では、本明細書に記載の細胞（すなわち、本開示のポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチドを含むベクターを含む）は、参照細胞と比較して、コードされたタンパク質のより多くの発現を生じる。特定の態様では、参照細胞は、本明細書に記載のＨＡ－５’－ＵＴＲ及び／またはＨＡ－３’－ＵＴＲを欠くポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、本明細書に記載の細胞におけるコードされたタンパク質（例えば、本明細書に記載の治療用タンパク質）の発現は、参照細胞における対応する発現と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、または少なくとも約１００倍以上増加する、

【0363】

いくつかの態様では、本明細書に記載の細胞（すなわち、本開示のポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチドを含むベクターを含む）は、コードされたタンパク質をインビトロで産生することができる。特定の態様では、本明細書に記載の細胞（すなわち、本開示のポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチドを含むベクターを含む）は、コードされたタンパク質をインビボで産生することができる。例えば、いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチドを含むベクターは、エクスビボで（例えば、トランスフェクションにより）細胞に導入し、その後、細胞を対象に投与することができ（例えば、養子細胞療法）、コードされたタンパク質は投与後に対象内で産生される。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチドを含むベクターは、例えば、遺伝子治療の一環として対象に投与することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載の細胞（すなわち、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチドを含むベクターを含む）は、コードされたタンパク質をインビトロ及びインビボの両方で産生することができる。

【0364】

当該技術分野では周知の任意の適当な細胞を、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）またはそのポリヌクレオチドを含むベクターを含むように改変することができる。いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を（例えば、インビボで）産生するために使用することができる細胞は、ヒト細胞を含む。特定の態様では、ヒト細胞は、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチドを含むベクターを投与しようとする対象の細胞である。特定の態様では、ヒト細胞は、ドナー（例えば、健康なヒト対象）に由来する。

【0365】

いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を（例えば、インビトロで）産生するために使用することができる細胞は、宿主細胞を含む。いくつかの態様では、宿主細胞は、真核細胞である。いくつかの態様では、宿主細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、トランスジェニック哺乳動物細胞、植物細胞、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様では、宿主細胞は、原核細胞である。いくつかの態様では、原核細胞は、細菌細胞である。

【0366】

いくつかの態様では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。本開示に適した哺乳動物宿主細胞の非限定的な例としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ ２９３、ＮＩＨ ３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２Ｏ及びＴ４７Ｄ、ＮＳ０（免疫グロブリン鎖を内因的に産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１またはＣＯＳ）、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０、ＢＭＴ１０、ＨＢＫ、ＮＳＯ、ＨＴ１０８０、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞、及びそれらの組み合わせが挙げられる。

【0367】

ＶＩ．医薬組成物
本開示から明らかなように、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ベクター、タンパク質（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされる治療用タンパク質）、及び細胞（本明細書では「活性化合物」とも呼ばれる）のいずれも、投与に適した医薬組成物に添加することができる。したがって、いくつかの態様では、医薬組成物は、活性化合物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む。

【0368】

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される賦形剤」（本明細書では「薬学的に許容される担体」とも呼ばれる）という用語は、医薬投与に適合したあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。医薬活性化合物用のかかる媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野では周知のものである。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性化合物を組成物に添加することもできる。

【0369】

いくつかの態様では、本明細書では、（ａ）本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）と、（ｂ）薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が開示される。いくつかの態様では、本明細書では、（ａ）本明細書に記載のベクター（例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルスベクター）と、（ｂ）薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が開示される。いくつかの態様では、本明細書では、（ａ）本明細書に記載の細胞（例えば、本開示のポリヌクレオチドを含むように改変されたもの）と、（ｂ）薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が開示される。

【0370】

本開示の医薬組成物は、その意図される投与経路に適合するように配合される。いくつかの態様では、本開示とともに使用することができる適当な投与経路は、筋肉内投与を含む。いくつかの態様では、適当な投与経路には、鼻腔内投与が含まれる。適当な投与経路のさらなる非限定的な例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口、経皮（局所）、及び経粘膜、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。別の投与経路としては肺投与が挙げられる。さらに、治療有効量の医薬組成物を治療が必要な領域に局所的に投与することが望ましい場合もある。これは、例えば、手術中の局所的または局部的な注入または灌流、局所塗布、注射、カテーテル、坐剤、またはインプラント（例えば、シアラスティック膜などの膜または繊維を含む多孔質、非多孔質、またはゼラチン状材料で形成されたインプラント）によって行うことができる。いくつかの態様では、治療有効量の医薬組成物は、リポソームなどの小胞中で送達される（例えば、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－３３，１９９０及びＴｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．３５３－６５，１９８９を参照）。

【0371】

いくつかの態様では、本明細書に記載の医薬組成物は、制御放出システムで送達することができる。例えば、特定の態様では、ポンプを使用することができる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－３３，１９９０；Ｓｅｆｔｏｎ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１－４０，１９８７；Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７－１６，１９８０；Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ．Ｊ Ｍｅｄ．３２１：５７４－７９，１９８９を参照）。いくつかの態様では、ポリマー材料を使用することができる（例えば、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０－９２，１９８５；Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒａｌ．２５：３５１－５６，１９８９；Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５－１２，１９８９を参照）。Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－３３，１９９０）により記載されるような他の放出制御システムも使用することができる。

【0372】

許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される用量及び濃度で投与対象に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。

【0373】

非経口製剤中に使用される薬学的に許容できる担体としては、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗微生物剤、等張剤、バッファー、酸化防止剤、局所麻酔剤、懸濁剤及び分散剤、乳化剤、封鎖剤またはキレート剤、ならびに他の薬学的に許容できる物質が挙げられる。水性ビヒクルの例には、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張デキストロース注射液、滅菌水注射液、デキストロース及び乳酸加リンゲル注射液が含まれる。非水性非経口ビヒクルとしては、植物由来の不揮発性油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、及びピーナッツ油が挙げられる。フェノールまたはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチル及びプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、ベンザルコニウムクロリド、及びベンゼトニウムクロリドを含む複数用量容器に包装される非経口調製物に、静菌性または静真菌性の濃度の抗微生物剤を加えてもよい。等張剤は、塩化ナトリウム及びデキストロースを含む。バッファーは、リン酸塩及びクエン酸塩を含む。抗酸化剤は、重硫酸ナトリウムを含む。局所麻酔剤は、塩酸プロカインを含む。懸濁剤及び分散剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びポリビニルピロリドンを含む。乳化剤は、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）を含む。金属イオンの封鎖剤またはキレート剤は、ＥＤＴＡを含む。医薬担体としては、水混和性ビヒクル用のエチルアルコール、ポリエチレングリコール、及びプロピレングリコール、ならびにｐＨ調整用の水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、または乳酸も挙げられる。

【0374】

非経口、皮内、または皮下投与に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分、すなわち、無菌の希釈剤、例えば、注射用の水、生理食塩液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはホスフェート、及び張度の調整のための剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースを含むことができる。ｐＨは、塩酸や水酸化ナトリウムなどの酸または塩基によって調整することができる。非経口製剤は、ガラスもしくはプラスチックで形成されたアンプル、使い捨て注射器、または複数用量バイアルに封入することができる。

【0375】

注射用途に適した医薬組成物としては、滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液及び滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与の場合、適当な担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＳ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いずれの場合も、組成物は滅菌状態でなければならず、かつ容易に注射可能な程度の流動性を有さなければならない。組成物は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）及びそれらの適当な混合物を含む溶媒または分散媒とすることができる。例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合の必要な粒径の維持、及び／または界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。微生物の活動の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって実現することができる。多くの場合、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に加えることが好ましい。例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる剤を組成物に加えることによって注射用組成物の吸収を遅延させることができる。

【0376】

必要な量の活性化合物を適当な溶媒中に、必要に応じて上記に列挙した成分の１つまたは組み合わせとともに添加した後、滅菌濾過を行うことによって滅菌注射液を調製することができる。一般的に、分散液は、塩基性分散媒及び上記に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに活性化合物を添加することによって調製される。滅菌注射液の調製用の滅菌粉末の場合、調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥であってよく、予め滅菌濾過したその溶液から有効成分及び任意の追加的な所望の成分の粉末が得られる。

【0377】

吸入による投与の場合、化合物は、適切な噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含む加圧容器またはディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。全身投与も、経粘膜的または経皮的手段によって行うことができる。

【0378】

経粘膜または経皮投与を行うには、浸透させるバリアに対して適当な浸透剤が製剤中に用いられる。かかる浸透剤は、当該技術分野では周知のものであり、例えば、経粘膜投与の場合では、洗剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、点鼻薬または坐剤を使用して行うことができる。経皮投与の場合、活性化合物は、当該技術分野で一般的に知られているように、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリームとして製剤化される。化合物は、直腸投与用の坐剤（例えば、ココアバター及び他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含むもの）または停留浣腸の形態で調製することもできる。

【0379】

いくつかの態様では、活性化合物は、インプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤など、身体からの急速な排出から化合物を保護する担体とともに調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸のような、生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の調製方法は当業者には明らかであろう。これらの材料は、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液も、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者には周知の方法に従って調製することができる。

【0380】

いくつかの態様では、本開示の活性化合物は、投与の容易さ及び投与量の均一性のために単位剤形として製剤化することができる。本明細書で使用する場合、単位剤形とは、治療される対象の単位用量として適当な物理的に個別の単位のことを言い、各単位は、所望の治療効果が得られるように計算された所定量の活性化合物を必要な医薬担体とともに含む。本開示の単位剤形の仕様は、活性化合物の固有の特性及び得ようとする特定の治療効果、ならびに個人の治療用のかかる機能性化合物の調合技術に特有の制限によって規定され、これらに直接依存する。医薬組成物は、投与説明書とともに容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。

【0381】

ＶＩＩ．キット
本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ベクター、コードされたタンパク質、細胞、及び／または医薬組成物のいずれかと、必要に応じて使用説明書、例えば本明細書に開示される方法に従った使用説明書と、を含むキットまたは製品も提供する。したがって、いくつかの態様では、本明細書では、（ｉ）本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）と、（ｉｉ）使用説明書と、を含むキットが開示される。いくつかの態様では、本明細書では、（ｉ）本明細書に記載のベクターと、（ｉｉ）使用説明書と、を含むキットが開示される。いくつかの態様では、本明細書では、（ｉ）本明細書に記載の細胞と、（ｉｉ）使用説明書と、を含むキットが開示される。いくつかの態様では、本明細書では、（ｉ）本明細書に記載の医薬組成物と、（ｉｉ）使用説明書と、を含むキットが開示される。

【0382】

いくつかの態様では、キットまたは製品は、単一の容器中に本明細書に記載されるポリヌクレオチド、ベクター、コードされたタンパク質、細胞、及び／または医薬組成物を含む。特定の態様では、キットまたは製品は、複数（例えば、少なくとも２つ）の容器、１つ以上の容器中に本明細書に記載されるポリヌクレオチド、ベクター、コードされたタンパク質、細胞、及び／または医薬組成物を含む。本明細書のベクター、ポリヌクレオチド、細胞、タンパク質、及び医薬組成物のいずれも、当該技術分野では周知の確立されたキット形式の１つに容易に組み込むことができる点は当業者には容易に認識されよう。

【0383】

ＶＩＩＩ．使用及び方法
ＶＩＩＩ．Ａ．製造方法
本明細書では、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）を作製する方法も開示される。いくつかの態様では、当該技術分野では周知の任意の方法によって本明細書に記載されるポリヌクレオチドを得ることができ、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。目的のタンパク質（例えば、治療用タンパク質、例えば、コロナウイルスタンパク質）をコードするヌクレオチド配列は、当該技術分野では周知の方法を使用して決定することができる。すなわち、特定のアミノ酸をコードすることが知られているヌクレオチドコドンを、ポリペプチドをコードする核酸を生成するような形で編成する。ポリペプチドをコードするそのようなポリヌクレオチドは、化学的に合成したオリゴヌクレオチドから編成することができ（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ Ｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４），ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２－６に記載されるよう）、簡単に述べると、ポリペプチドをコードする配列の部分を含む重複するオリゴヌクレオチドの合成と、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリング及びライゲーション、その後のＰＣＲによるライゲートされたオリゴヌクレオチドの増幅を行う。

【0384】

特定のポリペプチドをコードする核酸を含むクローンが入手できないが、ポリペプチド分子の配列がわかっている場合、ポリペプチドをコードする核酸は化学的に合成するか、または適当な供給源（例えば、ｃＤＮＡライブラリー、または目的のタンパク質を発現する任意の組織または細胞、例えば、本明細書に記載のポリペプチドを発現するように選択された細胞などから作製されたｃＤＮＡライブラリー、またはそれらから単離された核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から、配列の３’及び５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅によって、または例えば、ポリペプチドをコードするｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンを同定するための特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用したクローニングによって得ることができる。次いで、ＰＣＲによって生成された増幅された核酸を、当該技術分野では周知の任意の方法を使用して複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。

【0385】

本明細書に記載のポリヌクレオチドを作製するために使用できる例示的な方法のさらなる説明は、例えば、ＵＳ９，５９７，３８０、ＵＳ２０１３／０２５９９２３、及びＵＳ２０１３／０１１５２７２に示されており、これらはそれぞれ、本明細書に参照によってその全容を援用するものである。

【0386】

本明細書に記載のポリヌクレオチドをコードするＤＮＡは容易に単離することができ、従来の手法を使用して（例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチドをコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）配列決定することができる。多くの細胞がそのようなＤＮＡの供給源となりうる。ＤＮＡは、単離した後、発現ベクターに入れることができ、次いでこれを、発現ベクターがなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ ＧＳ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｌｏｎｚａ）からのＣＨＯ細胞）、または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトすることで、組換え宿主細胞中でポリペプチドの合成が行われる。

【0387】

本明細書では、目的のタンパク質（例えば、治療用タンパク質、例えば、コロナウイルスタンパク質）を生産する方法も提供される。いくつかの態様では、このような方法は、本明細書に記載の細胞を適当な条件下で培養することと、場合により目的のタンパク質を回収することと、を含む。特定の態様では、目的のタンパク質を生産する方法は、コードされたタンパク質が対象内で産生されるように、タンパク質の産生を必要とする対象に本開示のポリヌクレオチドを投与することを含む。タンパク質を産生するそのようなインビボの方法に関するさらなる開示は、本開示の他の箇所で示される（例えば、「治療用途」を参照）。

【0388】

ＶＩＩＩ．Ｂ．治療用途
本開示から明らかなように、本明細書で提供される組成物（例えば、ポリヌクレオチド、ベクター、タンパク質、細胞、及び医薬組成物）は、多くのインビトロ及びインビボでの有用性を有する。例えば、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）は、培養細胞に、インビトロもしくはエクスビボで、または例えば疾患を治療するためにインビボでヒト対象に投与することができる。

【0389】

したがって、いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ベクター、タンパク質、細胞、及び医薬組成物のいずれかを使用する治療方法に関する。いくつかの態様では、本明細書では、目的のタンパク質（例えば、治療用タンパク質）の発現を必要とする対象において目的のタンパク質を発現させる方法であって、本開示のポリヌクレオチド（例えば、目的のタンパク質をコードするＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）を対象に投与することを含み、目的のタンパク質は投与後に対象で発現される、方法が開示される。

【0390】

本明細書に記載されるように、本開示のＵＴＲ（例えば、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）は、翻訳される際にポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現を増加させることができる。したがって、特定の態様では、本明細書では、タンパク質の発現を増加させる方法であって、細胞を、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、タンパク質をコードするＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）またはポリペプチドを含むベクターと接触させることを含む方法が提供される。いくつかの態様では、接触させることは、インビボで行われる（例えば、遺伝子治療）。特定の態様では、接触させることは、エクスビボで行われる。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドと細胞を接触させることにより、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲを欠く、対応するポリヌクレオチドと細胞を接触させる場合と比較して、タンパク質発現が増加する。特定の態様では、タンパク質の発現は、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、または少なくとも約１００倍以上増加する。

【0391】

いくつかの態様では、本明細書では、疾患または障害の治療を必要とする対象の疾患または障害を治療する方法であって、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ベクター、タンパク質、細胞及び／または医薬組成物のいずれかを対象に投与することを含む、方法も提供される。本開示から明らかなように、特定の態様では、投与により、コードされたタンパク質が対象で産生される。いずれの理論にも束縛されるものではないが、いくつかの態様では、コードされたタンパク質は、産生されると、対象の免疫応答（例えば、細胞性免疫応答及び／または抗体媒介性免疫応答）を調節（例えば、誘導または抑制）し、それにより疾患または障害を治療することができる。特定の態様では、コードされたタンパク質は、産生されると、対象内の他の生物学的プロセスを調節することができる。本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされ得るタンパク質（例えば、治療用タンパク質）の非限定的な例は、本開示の他の箇所に示される（セクションＩＩ．Ｂ．「オープンリーディングフレーム」を参照）。

【0392】

したがって、特定の態様では、本開示は、免疫応答の誘導を必要とする対象に免疫応答を誘導する方法であって、対象に本開示のポリヌクレオチド（例えば、異種タンパク質をコードするＯＲＦ、ＨＡ－５’－ＵＴＲ、及びＨＡ－３’－ＵＴＲを含む）を投与することを含み、投与後に対象に異種タンパク質に対する免疫応答が誘導される、方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、免疫応答の抑制を必要とする対象の免疫応答を抑制する方法であって、本開示のポリヌクレオチドを対象に投与することを含み、コードされるタンパク質が対象の免疫応答を抑制（例えば、抑制性細胞、例えば、制御性Ｔ細胞の活性化及び／または増殖を誘導することによって）することができる、方法を提供する。

【0393】

本明細書に示される開示に基づけば、コードされたタンパク質が疾患または障害に対して治療効果を発揮することができるという点に留意すると、本開示によって任意の疾患または障害を治療できることは当業者には明らかであろう。特定の態様では、本開示で治療することができる疾患または障害は、ウイルス感染症（またはウイルス感染症に関連する疾患または障害）を含む。いくつかの態様では、ウイルス感染症は、コロナウイルス感染症、インフルエンザウイルス感染症、またはその両方を含む。

【0394】

本開示から明らかなように、いくつかの態様では、本開示により治療することができる疾患または障害は、がんを含む。がんの非限定的な例としては、乳癌、頭頸部癌、子宮癌、脳腫瘍、皮膚癌、腎癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、食道癌、眼癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌、消化管癌、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、またはそれらの組み合わせが挙げられる。

【0395】

いくつかの態様では、本開示により治療することができる疾患または障害は、遺伝子疾患を含む。特定の態様では、遺伝子疾患はハンター症候群を含む。

【0396】

いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ベクター、タンパク質、細胞、及び医薬組成物は、静脈内、経皮、皮内、皮下、経口、肺、またはそれらの任意の組み合わせで投与することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ベクター、タンパク質、細胞、及び医薬組成物は、局所、上皮粘膜、鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、または胸骨内経路を介して投与することができる。いくつかの態様では、本開示の組成物（例えば、ポリヌクレオチド、ベクター、タンパク質、細胞、及び医薬組成物）のいずれかが対象に筋肉内投与される。いくつかの態様では、本開示の組成物（例えば、ポリヌクレオチド、ベクター、タンパク質、細胞、及び医薬組成物）が対象に静脈内投与される。いくつかの態様では、本開示の組成物（例えば、ポリヌクレオチド、ベクター、タンパク質、細胞、及び医薬組成物）が対象に皮下投与される。

【0397】

以下の実施例は、例示のために示すものであって、限定のためのものではない。

【実施例】

【0398】

実施例１：改変ＲＮＡコンストラクトの構築
本明細書に記載の改変ポリヌクレオチドを構築するため、２００９年パンデミックインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９＿Ａ／Ｋｏｒｅａ／０１／０９）のヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の５’－ＵＴＲ（配列番号１３）及び３’－ＵＴＲ（配列番号１４）配列を使用した。簡単に述べると、ｍＲＮＡ鋳型を生成するため、プラスミドのコード配列をＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ、ＴＯＹＯＢＯ）で増幅した。Ｔ７ポリメラーゼ（ＥＺ（商標）ＭＥＧＡ Ｔ７転写キット、Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）を使用して３７℃で転写を２時間行い、ＬｉＣｌ沈殿によって精製した。次に、ワクシニアキャッピングシステム（ＮＥＢ）及びｍＲＮＡ Ｃａｐ ２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＮＥＢ）を使用してＲＮＡをキャッピングし、ＬｉＣｌ沈殿によって精製した。Ｅ．ｃｏｌｉポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して３’－ポリ（Ａ）テールを付加し、ＬｉＣｌ沈殿によって精製した。図１は、本明細書に記載される例示的なＲＮＡコンストラクトを示す。

【0399】

実施例２：インフルエンザＨＡタンパク質発現のインビトロ分析
タンパク質発現を誘導する改変ポリヌクレオチドの能力を評価するため、実施例１に記載の５’－ＵＴＲ配列及び３’－ＵＴＲ配列を、インフルエンザＨＡ（２００９ ｐＨ１Ｎ１）タンパク質をコードするｍＲＮＡに適用した（「改変ｍＲＮＡコンストラクト」または「ｍｏｄ－ｍＲＮＡ」）。次に、免疫蛍光アッセイとウエスタンブロットの両方を使用して、ＨＡタンパク質の発現を評価した。

【0400】

免疫蛍光アッセイでは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２４ウェルプレート中のカバースリップ上に、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｗｅｌｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）中、３７℃で播種した（７×１０^４細胞／ウェル）。次いで、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して、細胞に改変ｍＲＮＡコンストラクト（０．５μｇ）またはコントロールのｍＲＮＡコンストラクト（０．５μｇ）（すなわち、上記の５’－ＵＴＲ配列及び３’－ＵＴＲ配列を欠いた、対応するｍＲＮＡ）のいずれかをトランスフェクトした。非トランスフェクト細胞をコントロールとして用いた。２４時間後、細胞を４％ホルムアルデヒドで２０分間固定し、次いで２．５％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で室温にて１時間ブロックした。その後、細胞を一次抗ＨＡ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）とともに室温で２時間インキュベートし、次いで二次抗ウサギＡｌｅｘａ ４８８結合抗体とともに室温で１時間インキュベートした。抗体で染色した後、４，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含む封入剤とともにカバーガラスをスライドガラスに載せ、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して画像化した。

【0401】

ウエスタンブロットでは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレート中に、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｗｅｌｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）中、３７℃で播種した（３．５×１０^５細胞／ウェル）。次いで、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して、細胞に改変ｍＲＮＡコンストラクト（３μｇ）またはコントロールのｍＲＮＡコンストラクト（３μｇ）をトランスフェクトした。非トランスフェクト細胞をコントロールとして用いた。トランスフェクションの６時間または２４時間後に細胞を回収し、総タンパク質をＲＩＰＡバッファー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で抽出し、タンパク質ＢＣＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。次に、タンパク質（５０μｇ）を１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルメンブレンにロードし、分離されたタンパク質をＰＶＤＦ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）に転写し、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を添加したＰＢＳ中の３％（ｗ／ｖ）スキムミルクで４℃にて一晩ブロックした。その後、メンブレンを一次抗ＨＡ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で室温にて２時間染色した。β－アクチンを正規化コントロールとして使用した（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈ．）。次に、メンブレンをＰＢＳ／Ｔで３回洗浄し、抗マウスまたはウサギ結合ＨＲＰとともに室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ＬＡＳ５００システム（ＧＥヘルスケア）を使用した視覚化を行うために、メンブレンをＥＣＬ溶液（ＧＥヘルスケア）とともにインキュベートした。

【0402】

図２に示すように、改変ｍＲＮＡコンストラクト（すなわち、本明細書に記載の５’－ＵＴＲ配列及び３’－ＵＴＲ配列を含む）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、免疫蛍光アッセイで測定した場合に最大のＨＡタンパク質発現量を示した。同様の結果がウエスタンブロットを使用して観察された（図３を参照）。トランスフェクションの６時間後及び２４時間後の両方で、改変ｍＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトした細胞は、５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲ配列を欠くコントロールｍＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトした細胞と比較して、大幅に多量のＨＡタンパク質を発現した。

【0403】

上記の結果は、本明細書に記載の５’－ＵＴＲ配列及び３’－ＵＴＲ配列を含めることにより、ＨＡタンパク質をコードするｍＲＮＡコンストラクトの翻訳効率を高めることができることを実証するものである。

【0404】

実施例３：ＥＧＦＰタンパク質発現のインビトロ分析
本明細書に記載の５’－ＵＴＲ配列及び３’－ＵＴＲ配列が非インフルエンザタンパク質の発現を増加させる能力を評価するため、実施例１に記載の方法を用いて、ＥＧＦＰをコードする改変ｍＲＮＡコンストラクトを構築した。

【0405】

簡単に述べると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレート中に、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｗｅｌｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）中、３７℃で播種した（３．５×１０^５細胞／ウェル）。次いで、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して、細胞に、改変ｍＲＮＡコンストラクト（すなわち、実施例１に記載される５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲ配列を含む）（３μｇ）またはコントロールｍＲＮＡコンストラクト（すなわち、実施例１に記載される５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲを含まない、対応するコンストラクト）（３μｇ）をトランスフェクトした。トランスフェクションの６、１２、及び２４時間後に、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＥＧＦＰシグナルを測定した。

【0406】

ウエスタンブロッティングを行うため、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して、ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞に改変ｍＲＮＡコンストラクトまたはコントロールｍＲＮＡコンストラクトを１μｇ及び３μｇの２つの異なる用量でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に総タンパク質をＲＩＰＡバッファー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で抽出し、タンパク質ＢＣＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。次いで、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルメンブレンを使用して各タンパク質を分離し、分析した（実施例２を参照）。

【0407】

ＨＡタンパク質で観察された結果と同様に、蛍光顕微鏡及びウエスタンブロット（それぞれ図４及び図５を参照）で測定した場合に、ＥＧＦＰをコードする修飾ｍＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトした細胞は、モックコントロール細胞及び非改変コントロールｍＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトした細胞の両方と比較して、大幅に高いＥＧＦＰ発現を示した。

【0408】

次に、本明細書に記載の５’－ＵＴＲ配列及び３’－ＵＴＲ配列が個々の細胞レベルでタンパク質の発現を増加させることができるかどうかを評価するため、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２％ウシ胎児血清（Ｗｅｌｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｗｅｌｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）中、３７℃で６ウェルプレート（３．５×１０^５細胞／ウェル）に播種した。次いで、ＥＧＦＰをコードする改変ｍＲＮＡ（すなわち、５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲ配列を含む）、または同じくＥＧＦＰをコードするが、実施例１に記載される５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲ配列は含まないコントロール改変ｍＲＮＡのいずれかを細胞にトランスフェクトした。非トランスフェクト細胞をコントロール（「モック」）として使用した。トランスフェクションの２４時間後、ＥＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。詳細には、各群から２０，０００個の細胞が収集され、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）チャネルを通じてＥＧＦＰシグナルが捕捉された。

【0409】

図６に示されるように、異なる群からのＥＧＦＰ＋細胞間では、細胞に改変ｍＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトした場合、コントロールｍＲＮＡコンストラクトと比較して、平均のＥＧＦＰ発現レベルは大幅に高かった。

【0410】

まとめると、上記の結果は、本明細書で提供される５’－ＵＴＲ配列及び３’－ＵＴＲ配列がＥＧＦＰの細胞発現を増加させる能力を証明するものである。

【0411】

実施例４：ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）タンパク質発現のインビトロ分析
上記の結果を確認するため、ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードする改変ｍＲＮＡコンストラクトを実施例１に記載されるようにして構築した。次いで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を実施例２及び３に記載されるようにして６ウェルプレートに播種した。次いで、Ｌｕｃをコードする改変ｍＲＮＡコンストラクト（すなわち、実施例１に記載の５’－ＵＴＲ配列及び３’－ＵＴＲ配列を含む）または５’－ＵＴＲ配列及び３’－ＵＴＲ配列を欠くコントロールｍＲＮＡコンストラクトを細胞にトランスフェクトした。各ｍＲＮＡコンストラクトは２つの異なる用量（１μｇ及び３μｇ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＤ－ルシフェリン（１５０μｇ）で処理し、暗所で５分間インキュベートした後、ＩＶＩＳイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用してルシフェラーゼシグナルを視覚化した。実施例２に示される方法を使用し、ウエスタンブロットを使用してＬＵＣタンパク質の発現も評価した。

【0412】

図７に示されるように、ＩＶＩＳイメージングシステムを使用して測定した場合、改変ｍＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトした細胞（右列）は、コントロールｍＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトした細胞（中列）と比較して有意に高いルシフェラーゼ発現を発現した。改変ｍＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトした細胞とコントロールｍＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトした細胞の両方で３μｇで大幅に高いルシフェラーゼ発現が観察されたため、ルシフェラーゼ発現量の増加はｍＲＮＡコンストラクトの用量に依存しているものと考えられた。同様の結果がウエスタンブロットを使用した場合にも観察された（図８を参照）。

【0413】

上記の結果は、先に記載されたデータを証明するものであり、本明細書で提供される５’－ＵＴＲ配列及び３’－ＵＴＲ配列を使用してインフルエンザタンパク質及び他の異種タンパク質（例えば、ＥＧＦＰ及びＬｕｃ）の両方の発現を増加させることができることを証明するものである。

【0414】

実施例５：ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）タンパク質発現のインビボ分析
本開示の５’－ＵＴＲ配列及び３’－ＵＴＲ配列が、タンパク質発現をインビボでも増加させることができるかどうかを評価するため、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（雌）を使用した。簡単に述べると、Ｌｕｃをコードする改変ｍＲＮＡコンストラクトまたはコントロールｍＲＮＡコンストラクトのいずれかでマウスを処理した。各ｍＲＮＡコンストラクトを動物の両後肢に筋肉内注射した（５μｇ／肢）。非処理動物をコントロールとして用いた。次に、イメージングの５分前（処置の６時間、１日、２日、３日、４日、５日、及び６日後）、動物にＶＩＶＯＧＬＯ（商標）ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）（３ｍｇ）を（腹腔内）注射し、全身イメージングを用いてルシフェラーゼシグナルを評価した。

【0415】

図９に示されるように、コントロールｍＲＮＡコンストラクトを注射した動物（すなわち、第２群）の一部は、トランスフェクションの６時間後に弱いルシフェラーゼシグナルを示し、これはトランスフェクションの約３日後までに消失した。これに対して、改変ｍＲＮＡコンストラクトで処理した動物（すなわち第３群）のすべては、トランスフェクションの６時間後に注射部位で大幅に高いルシフェラーゼシグナルを示した。発現量の増加は、トランスフェクション後、５日目まで維持された。

【0416】

これらの結果は、５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲ配列はインビボでもタンパク質（異種タンパク質を含む）の発現を増加させることができることを証明するものである。

【0417】

実施例６：コントロールＵＴＲ配列との比較
本明細書で提供される５’－ＵＴＲ配列及び３’－ＵＴＲ配列の優位性を実証するため、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、実施例３に記載の改変ＥＧＦＰ ｍＲＮＡコンストラクト、または参照ＵＴＲ配列（ｃｔｃｇａｇａｇｃｔｃｇｃｔｔｔｃｔｔｇｃｔｇｔｃｃａａｔｔｔｃｔａｔｔａａａｇｇｔｔｃｃｔｔｔｇｔｔｃｃｃｔａａｇｔｃｃａａｃｔａｃｔａａａｃｔｇｇｇｇｇａｔａｔｔａｔｇａａｇｇｇｃｃｔｔｇａｇｃａｔｃｔｇｇａｔｔｃｔｇｃｃｔａａｔａａａａａａｃａｔｔｔａｔｔｔｔｃａｔｔｇｃｔｇｃｇｔｃｇａｇａｇｃｔｃｇｃｔｔｔｃｔｔｇｃｔｇｔｃｃａａｔｔｔｃｔａｔｔａａａｇｇｔｔｃｃｔｔｔｇｔｔｃｃｃｔａａｇｔｃｃａａｃｔａｃｔａａａｃｔｇｇｇｇｇａｔａｔｔａｔｇａａｇｇｇｃｃｔｔｇａｇｃａｔｃｔｇｇａｔｔｃｔｇｃｃｔａａｔａａａａａａｃａｔｔｔａｔｔｔｔｃａｔｔｇｃｔｇｃｇｔｃ）（配列番号１５）を含むＥＧＦＰ ｍＲＮＡコンストラクトのいずれかをトランスフェクトした（米国特許第１０，３０１，３６８ Ｂ２号を参照）。ｍＲＮＡコンストラクトは、以下の用量、すなわち、０μｇ、０．５μｇ、１μｇ、及び３μｇのうちの１つでトランスフェクトした。次に、トランスフェクション後の様々な時点（６時間、１２時間、及び２４時間）で、蛍光顕微鏡とウエスタンブロットの両方を使用してＥＧＦＰ発現を評価した。

【0418】

図１０及び１１に示されるように、コントロールＵＴＲ配列と比較して、本明細書で提供される５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲ配列は、トランスフェクションの６時間後という早い時点で、より多くのＥＧＦＰタンパク質の翻訳を誘導することができた。ルシフェラーゼ発現の増加は、測定したすべての時点で明らかであり、用量依存的であるようであった（例えば、トランスフェクションの１２時間後では、０．５μｇの改変ｍＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトした細胞と比較して、３μｇの改変ｍＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトした細胞でより高いルシフェラーゼ発現が観察された）。

【0419】

上記の結果は、本明細書で提供される５’－ＵＴＲ配列及び３’－ＵＴＲ配列を含めることにより、当該技術分野では周知の他のＵＴＲ配列と比較して翻訳効率を大幅に増加させることができることを示唆するものである。

【0420】

実施例７：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする改変ｍＲＮＡコンストラクトのタンパク質発現の分析
上記で与えられたデータに加えて、本明細書で提供される５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲ配列が他のウイルスタンパク質も増加させることができるかどうかを調べるため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードし、かつ実施例に記載される５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲ配列を含むｍＲＮＡコンストラクトを、本明細書に示される方法（例えば、実施例１）を用いて構築した。コントロールとして、５’－ＵＴＲ及び３－ＵＴＲ配列を欠くＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ｍＲＮＡコンストラクトも作製した。次に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｍＲＮＡコンストラクト（３μｇ）をトランスフェクトし、ウエスタンブロットを使用してスパイクタンパク質の発現を評価した。

【0421】

本明細書に記載の結果と同様、改変ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ｍＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトした細胞は、コントロールｍＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトした細胞と比較して、有意に大きな量のスパイクタンパク質を発現した（図１２を参照）。ここに示される結果は、本明細書で提供されるＵＴＲ配列が広範なタンパク質の発現を増加させる能力をさらに証明するものである。

【0422】

実施例８：改変ＨＡ ｍＲＮＡコンストラクトの治療効果の分析
上述のタンパク質発現の増加が治療効果の改善と相関するかどうかを評価するために、実施例１及び２に記載の改変ＨＡ ｍＲＮＡコンストラクト（すなわち、実施例１に記載の５’－ＵＴＲ配列及び３’－ＵＴＲ配列を含む）を６週齢のＤＢＡ２／Ｊ系雌マウス（ＯｒｉｅｎｔＢｉｏ）に投与した。改変ｍＲＮＡコンストラクトを両方の後肢に筋肉内注射した（２０μｇ／肢、合計４０μｇ／マウス）。一部の動物では、改変ｍＲＮＡコンストラクトを送達試薬、すなわちＩＮ ＶＩＶＯ－ＪＥＴＲＮＡ（登録商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、Ｆｒａｎｃｅ）中に配合してから動物に投与した（２．５μｇ／脚）。コントロール動物は、非処理かつ感染させていないか（「モック」）またはヌクレアーゼフリー水（エンザイノミクス）で処理した。動物は０日目及び２８日目の両方で処理した。その後、最初の処理から５６日目に、動物をインフルエンザウイルス（Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ／０１／２００９のＭＬＤ_５０）に感染させた。「モック」コントロール動物は感染させなかった。感染後１４日間にわたって動物の体重と生存率の両方を監視した。

【0423】

体重に関しては、改変ＨＡ ｍＲＮＡコンストラクトまたはヌクレアーゼフリー水で処理した動物間で有意差は認められなかった（図１３Ａを参照）。しかし、感染後１０日目までに、ヌクレアーゼフリー水で処理した動物はすべて感染により死亡した（図１３Ｂ及び図２１Ｂを参照）。これに対して、改変ＨＡ ｍＲＮＡコンストラクトで処理した動物の少なくとも４０％は、感染後１４日目でもまだ生存していた。送達試薬中に配合した改変ＨＡ ｍＲＮＡで処置した動物では、感染後１４日目にすべての動物が生存していた（図２１Ｂを参照）。いずれの理論にも束縛されるものではないが、いくつかの態様では、送達試薬により、より多くの改変ＨＡ ｍＲＮＡコンストラクトの送達が可能となった可能性がある。

【0424】

ここに示される結果は、本明細書に提供されるＵＴＲ配列が治療効果も改善できることを実証するものであり、ワクチンコンストラクトの一部としてそれらが含まれることを示唆している。さらに、ここで観察された効果の向上は、特定の送達剤を使用しなくても実現された。また、上記で実証されたように、適切な送達剤（例えば、本明細書に記載されるもの）の使用は、本開示の改変ｍＲＮＡコンストラクトの治療効果をさらに改善しうるものである。

【0425】

実施例９：ヒトβグロビンＵＴＲ配列との比較
本明細書に記載のＵＴＲ配列の能力をさらに実証するため、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードし、かつ（ｉ）実施例１に記載の５’－ＵＴＲ配列及び３’－ＵＴＲ配列を含むｍＲＮＡコンストラクト（「ＨＡ ＵＴＲを有するＧＦＰ ｍＲＮＡ」）または（ｉｉ）ヒトβグロビン（ｈＢｇ）の５’－ＵＴＲ配列及び３’－ＵＴＲ配列を含むｍＲＮＡコンストラクト（「ｈＢｇ ＵＴＲを有するＧＦＰ ｍＲＮＡ」）（ｍＲＮＡ発現率を高めるために当該技術分野で一般的に使用されているもの）のいずれかをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ｈＢｇ－５’－ＵＴＲ及びｈＢｇ－３’－ＵＴＲの配列を表１（下記）に示す。

【表1】

【0426】

簡単に述べると、先の実施例に記載したように、ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞を６ウェルプレート中に、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｗｅｌｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）中、３７Ｃで播種した（４×１０^５細胞／ウェル）。次いで、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して１μｇのＧＦＰコードｍＲＮＡコンストラクトのいずれかを細胞にトランスフェクトした。非トランスフェクト細胞をコントロールとして用いた。６時間、２４時間、４８時間、及び７２時間の時点で、ＧＦＰシグナルを様々な手法（蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ウエスタンブロット分析、及びフローサイトメトリー）を使用して測定した。

【0427】

図１６Ａ及び１６Ｂに示されるように、評価したすべての時点で、ＨＡ ＵＴＲを有するＧＦＰ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ Ｔ細胞は、ｈＢｇ ＵＴＲを有するＧＦＰ ｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞と比較して、一貫してより高いＧＦＰ発現を有していた。同様の結果が、ウエスタンブロット分析（図１７を参照）及びフローサイトメトリー（図１８を参照）の両方を使用して観察された。

【0428】

上記の結果がＧＦＰに特異的ではないことを実証するため、（ｉ）本開示のＵＴＲ（実施例１に記載のもの）を含むルシフェラーゼコードｍＲＮＡコンストラクト（「ＨＡ ＵＴＲを有するＬｕｃ ｍＲＮＡ」）または（ｉｉ）ヒトβグロビン（ｈＢｇ）の５’－ＵＴＲ配列及び３’－ＵＴＲ配列を含むルシフェラーゼコードｍＲＮＡコンストラクト（「ｈＢｇ ＵＴＲを含むＬｕｃ ｍＲＮＡ」）も構築し、ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞にトランスフェクトするために使用した。一般的なトランスフェクション手法は、上記及び先の実施例で使用したものと同様とした（例えば、１μｇのｍＲＮＡコンストラクトを使用してリポフェクタミン２０００でトランスフェクトした）。生物発光分析では、細胞を暗所でＤ－ルシフェリン（１５０μｇ／ｍＬ）とともに５分間インキュベートした後、ルシフェラーゼシグナルをＩＶＩＳイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により視覚化した。ウエスタンブロット分析では、一般的な方法は実施例２に記載したものと同様とした。

【0429】

図１９及び２０に示されるように、ルシフェラーゼ発現も、ｈＢｇ ＵＴＲを有するＬｕｃ ｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞と比較して、ＨＡ ＵＴＲを有するＬｕｃ ｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞では有意に増加した。

【0430】

まとめると、上記の結果は、当該技術分野で利用可能な他のＵＴＲと比較して、翻訳効率の向上における本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、ＨＡ－５’－ＵＴＲ及びＨＡ－３’－ＵＴＲ）の優位性をさらに証明するものである。

【0431】

実施例１０：インフルエンザＨＡタンパク質発現のさらなるインビトロ分析
実施例２（上記に示される）に加えて、本明細書に記載のＵＴＲ（すなわち、実施例１に記載の５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲ配列）の、異なるインフルエンザウイルス株のＨＡタンパク質発現を増強する能力を評価した。簡単に述べると、上記の実施例（例えば、実施例１）に示される方法を使用して、以下のインフルエンザ株、すなわち、（ｉ）Ａ／Ｈ３Ｎ２、及び（ｉｉ）Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａの１つに由来するＨＡタンパク質をコードするｍＲＮＡコンストラクトを構築した。一部のｍＲＮＡコンストラクトは、２００９年パンデミックインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９＿Ａ／Ｋｏｒｅａ／０１／０９）のヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の５’－ＵＴＲ（配列番号１３）及び３’－ＵＴＲ（配列番号１４）配列をさらに含むものとした。次に、実施例１に記載のＵＴＲを含む、または含まないｍＲＮＡコンストラクトを使用して、ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後の様々な時点（６時間、２４時間、４８時間、及び７２時間）でウエスタンブロット分析を行ってトランスフェクトした細胞におけるＨＡタンパク質の発現を測定した。トランスフェクション及びウエスタンブロット分析に使用した一般的な方法は、先の実施例に記載したものと同じとした（例えば、実施例２を参照）。

【0432】

図２２及び２３に示されるように、インフルエンザ株に関係なく、本明細書に記載のＵＴＲの使用により、評価したすべての時点でコードされたＨＡタンパク質の発現が増加した。これらの結果は、本開示のＵＴＲ（２００９年パンデミックインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９＿Ａ／Ｋｏｒｅａ／０１／０９）に属する）が、Ｈ１Ｎ１ ＨＡタンパク質の発現を増加させることができるだけでなく（実施例２を参照）、他のインフルエンザ株に属するＨＡタンパク質の発現の増加にも有用であることを実証するものである。

【0433】

実施例１１：イズロネート－２－スルファターゼ発現のインビトロ分析
イズロネート－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）は、ヘパリン硫酸及びデルマタン硫酸のリソソーム分解に関与する酵素である。異常なＩＤＳ活性は酵素欠損を引き起こし、ハンター症候群などの疾患を引き起こす可能性がある。本明細書に記載のＵＴＲ（例えば、実施例１に記載の５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲ配列）がそのような疾患の治療（例えば、遺伝子置換療法の一環として）に有用であるかどうかを評価するため、イズロネート－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）をコードするｍＲＮＡコンストラクトを構築した。一部のｍＲＮＡコンストラクトは、本明細書に記載の５’－ＵＴＲ（配列番号１３）及び３’－ＵＴＲ（配列番号１４）配列をさらに含むものとした。次に、本明細書に記載のＨＡ－ＵＴＲを含む、または含まない、ＩＤＳをコードしたｍＲＮＡコンストラクトを使用して、ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞をトランスフェクトした（１μｇまたは３μｇ）。トランスフェクション後の様々な時点（６時間、２４時間、４８時間、及び７２時間）でウエスタンブロット分析を行ってトランスフェクトした細胞におけるＨＡタンパク質の発現を測定した。トランスフェクション及びウエスタンブロット分析に使用した一般的な方法は、先の実施例に記載したものと同じとした（例えば、実施例２を参照）。

【0434】

図２４に示されるように（及び先の実施例と一致して）、本明細書に記載のＵＴＲを含めることにより、ＵＴＲを含まないＩＤＳをコードしたｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞と比較して、トランスフェクトされた細胞におけるＩＤＳタンパク質の発現は有意に増加した。本明細書に記載のＨＡ－ＵＴＲを含むＩＤＳをコードしたｍＲＮＡをより高用量でトランスフェクトした細胞で最も高いタンパク質発現が観察されたことから、発現の増加は用量依存的であるものと考えられた。

【0435】

上記の結果は、本明細書に記載のＨＡ－ＵＴＲが、様々な遺伝病に関連するタンパク質を含む異種タンパク質の発現を増加させることができることをさらに実証するものである。いずれの理論にも束縛されるものではないが、上記の結果は、本明細書に記載のＨＡ－ＵＴＲが、多くの遺伝子疾患に対する遺伝子置換療法の開発に有用であり得ることも実証するものである。

【0436】

実施例１２：腫瘍タンパク質発現のインビトロ分析
本明細書に記載のＵＴＲ（例えば、実施例１に記載の５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲ配列）の治療可能性をさらに評価するため、特定の腫瘍抗原（ＮＹＥＳＯ１またはＭＡＧＥＡ３）をコードするｍＲＮＡコンストラクトを構築した。先の実施例と同様、一部のｍＲＮＡコンストラクトは、本明細書に記載の５’－ＵＴＲ（配列番号１３）及び３’－ＵＴＲ（配列番号１４）配列を含むものとした。次いで、本明細書に記載のＨＡ－ＵＴＲを含む、及び含まない腫瘍抗原をコードしたｍＲＮＡコンストラクトを用いてＨＥＫ２９３ Ｔ細胞をトランスフェクトし（１μｇ）、腫瘍抗原の発現をウエスタンブロットを用いて評価した。トランスフェクション及びウエスタンブロット分析に使用した一般的な方法は、先の実施例に記載したものと同じとした（例えば、実施例２を参照）。

【0437】

図２５及び２６に示されるように、ＨＡ－ＵＴＲを欠くｍＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトした細胞と比較して、本明細書に記載のＨＡ－ＵＴＲを含む、腫瘍抗原をコードしたｍＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトした細胞は、有意に高いレベルの腫瘍抗原発現（ＮＹＥＳＯ１及びＭＡＧＥＡ３の両方）を示した。

【0438】

上記の結果は、がん免疫療法における本明細書に記載のＨＡ－ＵＴＲの利点を示唆するものであり、本明細書に記載のＨＡ－ＵＴＲに関連する広範な治療用途を証明するものである。

【0439】

＊＊＊
特許請求の範囲を解釈するうえで、「発明の概要」及び「要約」のセクションではなく、「発明の詳細な説明」のセクションを用いることが意図されている点は認識されるべきである。発明の概要及び要約セクションは、本発明者（複数可）により意図される１つ以上であるが、すべてではない本開示の例示的態様を示し得、したがって、本開示及び添付の特許請求の範囲を如何様にも限定することを意図しない。

【0440】

本開示は、特定の機能及びそれらの関係の実施を示す機能的構成単位を用いて上記された。これらの機能的要素の境界は、説明の便宜上、本明細書では任意に定義されている。特定の機能及びそれらの関係性が適切に実施されている限り、代替的な境界を定義することもできる。

【0441】

具体的な態様の上記の具体的な説明は本開示の一般的な性質を余すところなく示しているため、他者は、当業者の技能の範囲内の知識を適用することで、不要な実験を行うことなく、本開示の一般的概念から逸脱せずに、かかる具体的な態様を容易に改変し、及び／またはさまざまな用途に適合させることができる。したがって、そのような適合及び改変は、本明細書に示される教示及び助言に基づき、開示される態様の均等物の意味及び範囲内に包含されるものとする。本明細書における語句または用語は、説明を目的としたものであって、限定を目的とするものではなく、本明細書における語句または用語は本明細書の教示及び助言を考慮することで当業者によって理解されるはずである。

【0442】

本開示の幅及び範囲は、上記に記載した例示的な態様のいずれによっても限定されるべきでなく、下記の請求項及びそれらの均等物のみにしたがって定義されるべきものである。

【0443】

本出願全体を通じて引用され得る全ての引用参考文献（参考文献、特許、特許出願、及びウェブサイトを含む）の内容の全体を、あらゆる目的で、参照によって本明細書に明示的に援用し、また、それらに引用される文献も同様に援用する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【配列表】

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【国際調査報告】