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特表2024-514893抗原に露出されたＣＤ８ Ｔ細胞の活性化及び増殖方法、そして、それにより製造された抗ガン活性が強化されたＣＤ８ Ｔ細胞及びその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-03
(54)【発明の名称】抗原に露出されたＣＤ８ Ｔ細胞の活性化及び増殖方法、そして、それにより製造された抗ガン活性が強化されたＣＤ８ Ｔ細胞及びその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20240327BHJP
C12N 5/16 20060101ALI20240327BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240327BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240327BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240327BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240327BHJP
A61P 31/10 20060101ALI20240327BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240327BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240327BHJP
A61P 33/00 20060101ALI20240327BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240327BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240327BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20240327BHJP
A61K 35/763 20150101ALI20240327BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20240327BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240327BHJP
C12N 15/86 20060101ALN20240327BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783 ZNA
C12N5/16
A61P37/02
A61K35/17
A61K48/00
A61P35/00
A61P31/10
A61P31/04
A61P31/12
A61P33/00
A61P35/02
A61K35/76
A61K35/761
A61K35/763
C12N15/63 Z
C12N15/12
C12N15/86 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023563002
(86)(22)【出願日】2022-03-11
(85)【翻訳文提出日】2023-10-12
(86)【国際出願番号】 KR2022003482
(87)【国際公開番号】W WO2022220412
(87)【国際公開日】2022-10-20
(31)【優先権主張番号】10-2021-0047002
(32)【優先日】2021-04-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】17/478,445
(32)【優先日】2021-09-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523387448
【氏名又は名称】メドジーン セラピューティックス，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】ソン，ノ ヒョン
(72)【発明者】
【氏名】ナ，ジン ウ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA92X
4B065AA92Y
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065BC01
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA13
4C084MA56
4C084MA65
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZB071
4C084ZB072
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4C084ZB321
4C084ZB322
4C084ZB331
4C084ZB332
4C084ZB351
4C084ZB352
4C084ZB371
4C084ZB372
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB43
4C087BB65
4C087BC83
4C087NA14
4C087ZB07
4C087ZB26
4C087ZB27
4C087ZB32
4C087ZB33
4C087ZB35
4C087ZB37
(57)【要約】
本発明は、細胞活性化の方法及びそれにより活性化された細胞及びその用途に関するものであって、より具体的には、個体から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団、またはＣＤ８ Ｔ細胞を遺伝的に形質転換したＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞などでＫｌｆ４タンパク質の過発現を誘導する段階を含む試験管内の条件での疲弊段階ＣＤ８ Ｔ細胞の機能向上、回復及び増殖方法、方法によって、Ｋｌｆ４タンパク質が過発現されて抗ガン活性が強化されたＣＤ８ Ｔ細胞及びその用途を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）個体から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞、ｂ）前記ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団、及びｃ）前記ＣＤ８ Ｔ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を暗号化する遺伝子を形質導入したＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞で構成される群から選択される細胞でＫｌｆ４タンパク質の過発現を誘導する段階を含む、試験管内の条件でのＣＤ８ Ｔ細胞の疲弊状態の抑制方法。
【請求項2】
ａ）個体から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞、ｂ）前記ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団、及びｃ）前記ＣＤ８ Ｔ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を暗号化する遺伝子を形質導入したＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞で構成される群から選択される細胞でＫｌｆ４タンパク質の過発現を誘導する段階を含む、試験管内の条件でのＣＤ８ Ｔ細胞の増殖方法。
【請求項3】
ａ）個体から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞、ｂ）前記ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団、及びｃ）前記ＣＤ８ Ｔ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を暗号化する遺伝子を形質導入したＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞で構成される群から選択される細胞でＫｌｆ４タンパク質の過発現を誘導する段階を含む、試験管内の条件でのＣＤ８ Ｔ細胞の抗ガン免疫反応の強化方法。
【請求項4】
前記Ｋｌｆ４タンパク質の過発現は、Ｋｌｆ４タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターで前記ＣＤ８ Ｔ細胞を形質感染させるか、Ｋｌｆ４誘導剤を前記ＣＤ８ Ｔ細胞に処理することで達成される、請求項１から請求項３のうち何れか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記発現ベクターは、ウイルス性ベクターまたは非ウイルス性ベクターである、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記ウイルス性ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター、フラビウイルスベクター、ラドボウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記非ウイルス性ベクターは、ｍＲＮＡ、ＤＮＡベクター、ナノ粒子、カチオン性ポリマー、エクソソーム、細胞外小胞またはリポソームである、請求項５に記載の方法。
【請求項8】
前記ｍＲＮＡは、前記Ｋｌｆ４タンパク質を暗号化するｍＲＮＡ単独または前記ｍＲＮＡ以外の前記非ウイルス性ベクターとの組み合わせで使われる、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記発現ベクターは、１つまたは２つ以上の免疫増強ペプチドを暗号化するポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項10】
前記免疫増強ペプチドは、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＢＴＬＡ、ＤＲ３、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＳＬＡＭ、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＮＫＧ２Ｄ／ＤＡＰ１２、ＴＩＭ１、ＴＩＭ２、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２２６、ＣＤ１６０、ＬＡＧ３、Ｂ７－１、Ｂ７－Ｈ１、ＧＩＴＲ、Ｆｌｔ３リガンド、フラジェリン、ＨＶＥＭまたはＯＸ４０Ｌの細胞質ドメインまたはこれらのうち、２つ以上の連結体である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記Ｋｌｆ４誘導剤は、ＡＰＴＯ－２５３である、請求項４に記載の方法。
【請求項12】
Ｋｌｆ４遺伝子が過発現されたＣＤ８ Ｔ細胞を有効成分として含む、癌治療用薬学的組成物。
【請求項13】
前記Ｋｌｆ４遺伝子が過発現されたＣＤ８ Ｔ細胞は、治療を必要とする個体から分離された自家由来ＣＤ８ Ｔ細胞または他人から分離された他家由来ＣＤ８ Ｔ細胞である、請求項１２に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項14】
前記Ｋｌｆ４遺伝子が過発現されたＣＤ８ Ｔ細胞は、ＣＤ８ Ｔ細胞に対するＫｌｆ４遺伝子が含まれた発現ベクターの形質導入及び／または前記ＣＤ８ Ｔ細胞に対するＫｌｆ４誘導剤の処理によって製造される、請求項１３に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項15】
Ｋｌｆ４遺伝子が過発現されるように形質転換された、形質転換ＣＤ８ Ｔ細胞。
【請求項16】
個体から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞またはそれを含む細胞集団を宿主細胞として前記宿主細胞にＫｌｆ４タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを形質導入することで製造される、請求項１５に記載の形質転換ＣＤ８ Ｔ細胞。
【請求項17】
前記発現ベクターは、ウイルス性ベクターまたは非ウイルス性ベクターである、請求項１５に記載の形質転換ＣＤ８ Ｔ細胞。
【請求項18】
前記ウイルス性ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター、フラビウイルスベクター、ラドボウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項１７に記載の形質転換ＣＤ８ Ｔ細胞。
【請求項19】
前記非ウイルス性ベクターは、ｍＲＮＡ、ＤＮＡベクター、ナノ粒子、カチオン性ポリマー、エクソソーム、細胞外小胞またはリポソームである、請求項１７に記載の形質転換ＣＤ８ Ｔ細胞。
【請求項20】
前記ｍＲＮＡは、Ｋｌｆ４タンパク質を暗号化するｍＲＮＡ単独または前記ｍＲＮＡ以外の前記非ウイルス性ベクターとの組み合わせで使われる、請求項１９に記載の形質転換ＣＤ８ Ｔ細胞。
【請求項21】
外来性Ｋｌｆ４タンパク質及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が発現されるように形質転換された、形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞。
【請求項22】
前記ＣＡＲは、一本鎖基盤の抗体類似体－細胞膜通過ドメイン－補助刺激因子－細胞内信号伝達ドメインを含む融合タンパク質である、請求項２１に記載の形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞。
【請求項23】
前記一本鎖基盤の抗体類似体は、癌抗原または病原体由来の抗原に対して特異的に結合する抗体類似体である、請求項２２に記載の形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞。
【請求項24】
前記癌抗原は、ＥｐＣＡＭ、Ｔｒｏｐ－２、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、癌胚芽性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＭＵＣ－１、ＢＣＲ／ＡＢＬ、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＬＭＰ２ａのようなエプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）由来の抗原、Ｂ型ヒト肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来の抗原、Ｃ型ヒト肝炎ウイルス（ＨＣＶ）由来の抗原、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ３、ＷＴ－１、ＰＡＰ、Ｇ２５０、メラノーマ抗原遺伝子（ＭＡＧＥ）、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、チロシナーゼ、チロシナーゼ－関連タンパク質－１（ＴＲＰ－１）、ＴＲＰ－２、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、Ｉｇ Ｉｄｉｏｔｙｐｅ、ＣＤＫ４、ｃａｓｐａｓｅ－８、β－ｃａｔｅｎｉｎ、ＢＣＲ／ＡＢＬ、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７）、ＨＨＶ－８、５Ｔ４、ｐ５３、癌抗原１２５（ＣＡ－１２５）、癌抗原－７２－４（ＣＡ－７２－４）、癌抗原－１５－３（ＣＡ－１５－３）、または癌抗原－１９－９（ＣＡ－１９－９）である、請求項２３に記載の形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞。
【請求項25】
前記病原体由来の抗原は、病原性微生物、ウイルスまたは寄生虫由来の抗原である、請求項２３に記載の形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞。
【請求項26】
前記病原性微生物は、病原性細菌または病原性真菌である、請求項２５に記載の形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞。
【請求項27】
前記病原性細菌は、百日咳菌、破傷風菌、ジフテリア菌、ヘリコバクター・ピロリ、肺炎球菌、結核菌、コレラ、ブドウ球菌、赤痢菌、ボレリア菌またはサルモネラ菌である、請求項２６に記載の形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞。
【請求項28】
前記病原性真菌は、カンジダ菌、トリコフィトン菌、アスペルギルス菌、Ｆｏｎｓｅｃａｅａ ｓｐ．、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｓｐ．、Ｐｉｅｄｒａｉａ ｓｐ．、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｓｐ．、Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐ．、Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐ．、Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐ．、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｐ．、Ｍｕｃｏｒ ｓｐ．、Ａｂｓｉｄｉａ ｓｐ．、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｗａｎｇｉｅｌｌａ ｓｐ．、Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ ｓｐ．、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｐ．である、請求項２６に記載の形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞。
【請求項29】
前記ウイルスは、インフルエンザウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、水疱性口内炎ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ａ型肝炎ウイルス抗原（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎Ｃ（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、ヘルペスシンプレックスウイルス、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、請求項２５に記載の形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞。
【請求項30】
前記一本鎖基盤の抗体類似体は、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ、Ａｆｆｉｌｉｎ、Ａｆｆｉｍｅｒ、Ａｆｆｉｔｉｎ、Ａｌｐｈａｂｏｄｙ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ、Ａｖｉｍｅｒ、ＤＡＲＰｉｎ、Ｆｙｎｏｍｅｒ、Ｋｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ、ｍｏｎｏｂｏｄｙ、ｎａｎｏＣＬＡＭＰ、可変リンパ球受容体（ＶＬＲ）またはｒｅｐｅｂｏｄｙである、請求項２２に記載の形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞。
【請求項31】
前記細胞膜通過ドメインは、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、活性化ＮＫ細胞受容体、免疫グロブリンタンパク質、Ｂ７－Ｈ３、ＢＡＦＦＲ、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＢＴＬＡ、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１９ａ、ＣＤ２、ＣＤ２４７、ＣＤ２７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３０、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ８４、ＣＤ８、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＤｌ ｌａ、ＣＤｌ ｌｂ、ＣＤｌ ｌｃ、ＣＤｌ ｌｄ、ＣＤＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、サイトカイン受容体、ＤＡＰ－１０、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、Ｆｃガンマ受容体、ＧＡＤＳ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＩＡ４、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－１、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、誘導性Ｔ細胞共同刺激子（ＩＣＯＳ）、インテグリン、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＩＴＧＢｌ、ＫＩＲＤＳ２、ＬＡＴ、ＬＦＡ－１、ＬＦＡ－１、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＢＲ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、リンパ球機能－関連抗原－１（ＬＦＡ－１；ＣＤｌ－ｌａ／ＣＤ１８）、ＭＨＣ部類１分子、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＯＸ－４０、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、プログラム化された死滅－１（ＰＤ－１）、ＰＳＧＬ１、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、信号伝達リンパ球性活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１；ＣＤ１５０；ＩＰＯ－３）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４；２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ；Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＰ－７６、ＴＮＦ受容体タンパク質、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＳＦ１４、トールリガンド受容体、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＶＬＡ１、またはＶＬＡ－６由来の膜通過ドメインである、請求項２２に記載の形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞。
【請求項32】
前記補助刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＢＴＬＡ、ＤＲ３、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＳＬＡＭ、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＮＫＧ２Ｄ／ＤＡＰ１２、ＴＩＭ１、ＴＩＭ２、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２２６、ＣＤ１６０、ＬＡＧ３、Ｂ７－１、Ｂ７－Ｈ１、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭまたはＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）の細胞質ドメインまたはこれらのうち、２つ以上の連結体である、請求項２２に記載の形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞。
【請求項33】
前記細胞内信号伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬ－２Ｒβ／ＣＤ１２２、ＩＬ－２Ｒα／ＣＤ１３２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、そして、ＣＤ４０のうちから１つまたはそれ以上の細胞質内ドメインの一部または全部を含む、請求項２２に記載の形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞。
【請求項34】
請求項１４に記載の形質転換ＣＤ８ Ｔ細胞または請求項２１に記載の形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞を有効成分として含む、組成物。
【請求項35】
先天性免疫反応が必要な疾患の治療に使われる、請求項３４に記載の組成物。
【請求項36】
前記先天性免疫反応が必要な疾患は、癌、細菌性感染症、真菌性感染症、ウイルス感染症または寄生虫感染症である、請求項３５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
［技術分野］
本発明は、細胞増殖と活性化方法及びそれにより活性化された細胞及びその用途に係り、より具体的には、抗原に慢性的に露出されたＣＤ８ Ｔ細胞の活性化と増殖方法及びそれにより製造された抗ガン活性が強化されたＣＤ８ Ｔ細胞及びその用途に関する。
［背景技術］
腫瘍組織内に存在するＣＤ８ Ｔ細胞は、癌細胞の抗原を認知して活性化された後、グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ）、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）、パーフォリン（Ｐｅｒｆｏｒｉｎ）のような活性サイトカイン（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）を分泌することにより、癌細胞を除去する機能を有している。したがって、腫瘍組織内のＣＤ８ Ｔ細胞の活性を高めれば、効果的に癌を制御することができる。しかし、一般的な免疫反応とは異なって、癌という特殊な環境では、この免疫細胞が癌抗原に持続的に露出されながら、その特性が変化してしまい、これらの活性を制御することは遥かに難しいと知られている。
本発明は、細胞増殖と活性化方法及びそれにより活性化された細胞及びその用途に係り、より具体的には、抗原に慢性的に露出されたＣＤ８ Ｔ細胞の活性化と増殖方法及びそれにより製造された抗ガン活性が強化されたＣＤ８ Ｔ細胞及びその用途に関する。
［背景技術］
腫瘍組織内に存在するＣＤ８ Ｔ細胞は、癌細胞の抗原を認知して活性化された後、グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ）、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）、パーフォリン（Ｐｅｒｆｏｒｉｎ）のような活性サイトカイン（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）を分泌することにより、癌細胞を除去する機能を有している。したがって、腫瘍組織内のＣＤ８ Ｔ細胞の活性を高めれば、効果的に癌を制御することができる。しかし、一般的な免疫反応とは異なって、癌という特殊な環境では、この免疫細胞が癌抗原に持続的に露出されながら、その特性が変化してしまい、これらの活性を制御することは遥かに難しいと知られている。
【0002】
癌環境内では、持続して存在する癌細胞抗原の慢性的な刺激によってＣＤ８ Ｔ細胞で疲弊現象（Ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）が起こる。このように疲弊したＣＤ８ Ｔ細胞は、正常な活性サイトカイン分泌及び細胞分裂機能が弱化して正常な免疫反応を行うことができず、癌細胞を効率的に除去することができなくなる。特に、このように疲弊したＣＤ８ Ｔ細胞は、時間が過ぎても、再び正常な機能を有する細胞に容易に戻ることができない特性を有する。したがって、腫瘍組織内のＣＤ８ Ｔ細胞の疲弊現象を防ぎ、疲弊した細胞の機能を活性化させることが、癌を制御するにあたり核心的要素であると言える。最近の研究結果として抗原に持続的に露出されたＣＤ８ Ｔ細胞は、数段階の疲弊過程を経るサブセット細胞グループで構成されていることが知られた。慢性前駆細胞サブセット（疲弊前駆細胞１、疲弊前駆細胞２）、慢性エフェクター細胞サブセット（中間疲弊細胞）及び末期疲弊細胞サブセット（末期疲弊細胞）などである。これらのうち、慢性エフェクター細胞は、癌細胞を認識して除去するエフェクター機能を有しているが、末期疲弊細胞は、その機能を相当部分喪失した状態と知られている。一般的に、癌組織に存在するＣＤ８ Ｔ細胞は、ほとんど末期疲弊状態において免疫機能が十分に作動しないと知られている。したがって、癌細胞に特異的なＣＤ８ Ｔ細胞から慢性エフェクター細胞への発生及び機能を促進させる方法を開発するならば、それを癌細胞制御に効果的に活用することができる。
【0003】
ＣＤ８ Ｔ細胞を利用した抗ガン治療と関連して、米国特許ＵＳ８１０６０９２は、２次癌を有した個体に局所的及び／または腫瘍内にｉｎｇｅｎｏｌ－３－ａｎｇｅｌａｔｅを投与することにより、癌細胞の一次的壊死を誘導し、ＣＤ８ Ｔ細胞のような抗ガン－特異的Ｔ細胞の生成を促進する２次癌の治療方法が開示されており、米国特許公開公報ＵＳ２０１９０２１８５１５Ａは、癌患者から分離されたＴ細胞を癌細胞とＣＤ１２３／ＣＤ３に対する二重特異性抗体、ＣＤ１９／ＣＤ３に対する二重特異性抗体またはＥｐＣＡＭ／ＣＤ３に対する二重特異性抗体と共に反応させて活性化されたＴ細胞を生産する方法が開示されている。
【0004】
一方、Ｔ細胞治療剤は、現在まで３世代まで開発されているが、第１世代Ｔ細胞治療剤は、血液または癌組織内に存在するあらゆるＴ細胞（ｂｕｌｋ Ｔ ｃｅｌｌｓ）を増殖させて患者に投与したために、癌細胞に対する特異性が低くて効力を期待することができず、第２世代Ｔ細胞治療剤は、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞のみ（Ａｇ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ）を分離／大量培養して癌患者に投与する方法で増進した治療効果を示したが、培養基間が長く、工程が複雑であるという問題が台頭し、第３世代Ｔ細胞治療剤は、１）特定の癌抗原を認識するＴＣＲ遺伝子をＴ細胞に直接導入するか、２）特定の抗原を認識する単クローン抗体の抗原認識部位（ｓｃＦｖ）にＴ細胞活性化ドメイン（Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）を結合させてＴ細胞に導入することにより、抗原特異性を高め、製造期間を短縮しただけではなく、その治療効能も非常に優れて、一部の白血病及びリンパ腫で１００％に近い治療効果を誘導した。そのうち、二番目の形態の第３世代Ｔ細胞治療剤は、いわゆるキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下、「ＣＡＲ」と略称する）を発現するように遺伝子組み換えされたことを特徴としている。
【0005】
前記ＣＡＲ導入Ｔ細胞技術に基づいて最もリードしている企業は、米国のＮｏｖａｒｔｉｓ，Ｊｕｎｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社、そして、Ｋｉｔｅ Ｐｈａｒｍａ社であって、いずれもＢ細胞特異抗原であるＣＤ１９を標的化するＣＡＲ導入Ｔ細胞を開発し、抵抗性／再発性急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）で８０～９０％に迫る高い治療率を示して、標的指向性免疫細胞治療剤分野の先頭走者として位置づけられて（Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．９（９）：１１８３－１１９７，２０１７）おり、最近、韓国ノバルティス（株）が許可申請した世界最初キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）治療剤「キムリア（登録商標）（チサゲンレクルーセル）」を「先端再生バイオ法」による第１号先端バイオ医薬品として許可さされている。
［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
しかし、前記先行技術も、体内でＣＤ８ Ｔ細胞が疲弊する現象を考慮せず、これらの特定化された細胞を活用するか、この状態を克服することを目標としていないという限界点を有している。
［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
しかし、前記先行技術も、体内でＣＤ８ Ｔ細胞が疲弊する現象を考慮せず、これらの特定化された細胞を活用するか、この状態を克服することを目標としていないという限界点を有している。
【0006】
本発明は、前記問題点を含む多様な問題点を解決するためのものであって、ＣＤ８ Ｔ細胞の生体内の疲弊過程を調節して癌を制御することができる方法及び組成物を提供することを目的とする。しかし、前記目的によって、本発明の範囲が制限されるものではない。
［課題を解決するための手段］
本発明の一観点によれば、ａ）個体から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞、ｂ）前記ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団、及びｃ）前記ＣＤ８ Ｔ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を暗号化する遺伝子を形質導入したＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞で構成される群から選択される細胞でＫｌｆ４タンパク質の過発現を誘導する段階を含む試験管内の条件でのＣＤ８ Ｔ細胞の疲弊状態の抑制方法が提供される。
［課題を解決するための手段］
本発明の一観点によれば、ａ）個体から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞、ｂ）前記ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団、及びｃ）前記ＣＤ８ Ｔ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を暗号化する遺伝子を形質導入したＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞で構成される群から選択される細胞でＫｌｆ４タンパク質の過発現を誘導する段階を含む試験管内の条件でのＣＤ８ Ｔ細胞の疲弊状態の抑制方法が提供される。
【0007】
本発明の一観点によれば、ａ）個体から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞、ｂ）前記ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団、及びｃ）前記ＣＤ８ Ｔ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を暗号化する遺伝子を形質導入したＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞で構成される群から選択される細胞でＫｌｆ４タンパク質の過発現を誘導する段階を含む試験管内の条件でのＣＤ８ Ｔ細胞の免疫反応の強化方法が提供される。
【0008】
本発明の一観点によれば、ａ）個体から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞、ｂ）前記ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団、及びｃ）前記ＣＤ８ Ｔ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を暗号化する遺伝子を形質導入したＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞で構成される群から選択される細胞でＫｌｆ４タンパク質の過発現を誘導する段階を含む試験管内の条件でのＣＤ８ Ｔ細胞の増殖方法が提供される。
【0009】
本発明の他の一観点によれば、Ｋｌｆ４タンパク質が過発現されるように形質転換された形質転換ＣＤ８ Ｔ細胞またはＫｌｆ４タンパク質及びキメラ抗原受容体が過発現されるように形質転換された形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞を有効成分として含む癌治療用薬学的組成物が提供される。
【0010】
本発明の他の一観点によれば、Ｋｌｆ４タンパク質が過発現されるように形質転換された形質転換ＣＤ８ Ｔ細胞が提供される。
【0011】
本発明の他の一観点によれば、外来性Ｋｌｆ４タンパク質及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が発現されるように形質転換された形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞が提供される。
【0012】
本発明の他の一観点によれば、前記形質転換ＣＤ８ Ｔ細胞または形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞を含む組成物が提供される。
【0013】
本発明の他の一観点によれば、癌にかかった個体から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞または前記ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団でＫｌｆ４タンパク質の過発現を誘導する段階；及びＫｌｆ４タンパク質が過発現されたＣＤ８ Ｔ細胞または前記ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団を前記個体に投与する段階；を含む前記個体の癌の治療方法が提供される。
［発明の効果］
本発明の一実施例による方法は、免疫細胞の疲弊現象を防止することにより、より効率的な抗ガン細胞治療剤の開発に有用に使われる。
［図面の簡単な説明］
［図１Ａ］本発明の一実施例によるＣＤ８ Ｔ細胞に対する抗原の反復刺激試験の設計を概略的に示す概要図である。
［図１Ｂ］前記図１Ａの実験設計によって行われた実験結果であって、抗原の刺激程度によるＣＤ８ Ｔ細胞の疲弊状態に関するマーカーであるＴｏｘ（左側）及びＫｌｆ４（右側）のｍＲＮＡレベルでの発現程度を測定した結果を示す一連のグラフである。
［図１Ｃ］マウスにＭＣ３８大腸癌細胞を注入して誘発された癌組織及び脾臓に存在する多様な段階のＣＤ８ Ｔ細胞サブセットに対するマーカー表現型を示す概要図である。
［図１Ｄ］これらのＣＤ８ Ｔ細胞の各サブセットのＫｌｆ４タンパク質発現程度をｍＲＮＡレベルで測定した結果を示すグラフである。
［図２Ａないし図２Ｅ］本発明の一実施例によって、対照群レトロウイルスベクター（ＭｉｇＲＩ）に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞またはＫｌｆ４遺伝子を含むレトロウイルスベクター（Ｋｌｆ４）に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞の特性を分析したものであって、対照群（ＭｉｇＲＩ）とＫｌｆ４の本発明の一観点によれば、個体から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞、前記ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団、または前記ＣＤ８ Ｔ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を暗号化する遺伝子を形質導入したＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞でＫｌｆ４タンパク質の過発現を誘導する段階を含む試験管内の条件での前記ＣＤ８ Ｔ細胞の疲弊状態の抑制方法が提供される。図２Ａは、電子によって形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞を前述したサブセットのマーカーを用いてＦＡＣＳ分析で分析した結果を示すものであり、図２Ｂは、対照群（ＭｉｇＲＩ）とＫｌｆ４遺伝子に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞とターゲット癌細胞とを共に培養した時、死んでいる癌細胞の比率をＦＡＣＳ分析を通じて分析した結果に係わるグラフであり、図２Ｃは、対照群（ＭｉｇＲＩ）とＫｌｆ４遺伝子に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞でのＫｌｆ４（左側）及びＴｏｘ（右側）の遺伝子発現レベルをｍＲＮＡレベルで測定した結果を示すグラフであり、図２Ｄは、対照群（ＭｉｇＲＩ）及びＫｌｆ４遺伝子に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞（Ｋｌｆ４）でのグランザイムＢの発現程度をＦＡＣＳ分析で分析して、各細胞（ＭｉｇＲＩ ＧＦＰ－、ＭｉｇＲＩ ＧＦＰ＋、Ｋｌｆ４ ＧＦＰ－、Ｋｌｆ４ ＧＦＰ＋）でＣＤ８ Ｔ細胞の標的細胞殺害機能に核心的なグランザイムＢを発現する細胞の比率を測定した結果に係わるグラフ（左側）及び２次元ヒストグラム（右側）を示し、図２Ｅは、対照群（ＭｉｇＲＩ）及びＫｌｆ４遺伝子に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞の機能に核心的なＩＦＮ－γの発現程度をＦＡＣＳ分析で分析して、各細胞（ＭｉｇＲＩ ＧＦＰ－、ＭｉｇＲＩ ＧＦＰ＋、Ｋｌｆ４ ＧＦＰ－、Ｋｌｆ４ ＧＦＰ＋）でＩＦＮ－γを発現する細胞の比率を測定した結果に係わるグラフ（左側）及び２次元ヒストグラム（右側）を示す。
［図３Ａ］本発明の一実施例によって、Ｋｌｆ４遺伝子が形質導入されたＣＤ８ Ｔ細胞を利用した動物実験の投与スケジュールを概略的に示す概要図である。
［図３Ｂ］対照群とＫｌｆ４遺伝子が形質導入されたＣＤ８ Ｔ細胞のＫｌｆ４遺伝子の発現レベルをｍＲＮＡレベルで測定した結果を示すグラフである。
［図３Ｃ］対照群（ＭｉｇＲＩ）及び本発明の一実施例によって、Ｋｌｆ４遺伝子が形質導入されたＣＤ８ Ｔ細胞が投与された癌モデル動物での経時的な腫瘍組織の体積の変化を示すグラフである。
［図３Ｄ］前記動物実験後、犠牲になった動物の腫瘍組織から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞サブセットで細胞分裂程度を示すＫｉ－６７発現程度をＦＡＣＳ分析で分析したものであって、分離されたＣＤ８ Ｔ細胞のマーカー表現型による全体ＣＤ８ Ｔ細胞のうち、Ｋｉ－６７発現細胞の比率を測定した結果に係わるグラフ（左側）及び２次元ヒストグラム（右側）を示す。
［図３Ｅ］前記動物実験後、犠牲になった動物の腫瘍組織から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞のグランザイムＢ発現程度をＦＡＣＳ分析で分析して、分離されたＣＤ８ Ｔ細胞のマーカー表現型による全体ＣＤ８ Ｔ細胞のうち、グランザイムＢ発現細胞の比率を測定した結果に係わるグラフ（左側）及び２次元ヒストグラム（右側）を示す。
［図３Ｆ］前記動物実験後、犠牲になった動物の腫瘍組織から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞のＴＮＦ－α及びＩＮＦ－γ発現程度をＦＡＣＳ分析で分析して、分離されたＣＤ８ Ｔ細胞のマーカー表現型による全体ＣＤ８ Ｔ細胞のうち、ＴＮＦ－α及びＩＮＦ－γ発現細胞の比率を測定した結果に係わるグラフ（左側）及び２次元ヒストグラム（右側）を示す。
［図４Ａ］本発明の一実施例によって、ＡＰＴＯ－２５３が処理されたＣＤ８ Ｔ細胞を利用した動物実験の投与スケジュールを概略的に示す概要図である。
［図４Ｂ］対照群（ＰＢＳ）とＡＰＴＯ－２５３とが処理されたＣＤ８ Ｔ細胞を投与した実験動物でＫｌｆ４遺伝子の発現レベルをｍＲＮＡレベルで測定した結果を示すグラフである。
［図４Ｃ］対照群（ＰＢＳ）及び本発明の一実施例によって、ＡＰＴＯ－２５３が処理されたＣＤ８ Ｔ細胞が投与された癌モデル動物での経時的な腫瘍組織の体積の変化を示すグラフである。
［図５］本発明の一実施例による多様なＣＡＲコンストラクト（ＥｐＣＡＭ ＣＡＲ、Ｔｒｏｐ－２ ＣＡＲ、ＣＥＡＣＡＭ６ ＣＡＲ及びＣＥＡＣＡＭ５ ＣＡＲ）の構造を概略的に示す概要図である。
［発明を実施するための形態］
本発明の一観点によれば、ａ）個体から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞、ｂ）前記ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団、及びｃ）前記ＣＤ８ Ｔ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を暗号化する遺伝子を形質導入したＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞で構成される群から選択される細胞でＫｌｆ４タンパク質の過発現を誘導する段階を含む試験管内の条件でのＣＤ８ Ｔ細胞の疲弊状態の抑制方法が提供される。
［発明の効果］
本発明の一実施例による方法は、免疫細胞の疲弊現象を防止することにより、より効率的な抗ガン細胞治療剤の開発に有用に使われる。
［図面の簡単な説明］
［図１Ａ］本発明の一実施例によるＣＤ８ Ｔ細胞に対する抗原の反復刺激試験の設計を概略的に示す概要図である。
［図１Ｂ］前記図１Ａの実験設計によって行われた実験結果であって、抗原の刺激程度によるＣＤ８ Ｔ細胞の疲弊状態に関するマーカーであるＴｏｘ（左側）及びＫｌｆ４（右側）のｍＲＮＡレベルでの発現程度を測定した結果を示す一連のグラフである。
［図１Ｃ］マウスにＭＣ３８大腸癌細胞を注入して誘発された癌組織及び脾臓に存在する多様な段階のＣＤ８ Ｔ細胞サブセットに対するマーカー表現型を示す概要図である。
［図１Ｄ］これらのＣＤ８ Ｔ細胞の各サブセットのＫｌｆ４タンパク質発現程度をｍＲＮＡレベルで測定した結果を示すグラフである。
［図２Ａないし図２Ｅ］本発明の一実施例によって、対照群レトロウイルスベクター（ＭｉｇＲＩ）に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞またはＫｌｆ４遺伝子を含むレトロウイルスベクター（Ｋｌｆ４）に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞の特性を分析したものであって、対照群（ＭｉｇＲＩ）とＫｌｆ４の本発明の一観点によれば、個体から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞、前記ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団、または前記ＣＤ８ Ｔ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を暗号化する遺伝子を形質導入したＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞でＫｌｆ４タンパク質の過発現を誘導する段階を含む試験管内の条件での前記ＣＤ８ Ｔ細胞の疲弊状態の抑制方法が提供される。図２Ａは、電子によって形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞を前述したサブセットのマーカーを用いてＦＡＣＳ分析で分析した結果を示すものであり、図２Ｂは、対照群（ＭｉｇＲＩ）とＫｌｆ４遺伝子に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞とターゲット癌細胞とを共に培養した時、死んでいる癌細胞の比率をＦＡＣＳ分析を通じて分析した結果に係わるグラフであり、図２Ｃは、対照群（ＭｉｇＲＩ）とＫｌｆ４遺伝子に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞でのＫｌｆ４（左側）及びＴｏｘ（右側）の遺伝子発現レベルをｍＲＮＡレベルで測定した結果を示すグラフであり、図２Ｄは、対照群（ＭｉｇＲＩ）及びＫｌｆ４遺伝子に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞（Ｋｌｆ４）でのグランザイムＢの発現程度をＦＡＣＳ分析で分析して、各細胞（ＭｉｇＲＩ ＧＦＰ－、ＭｉｇＲＩ ＧＦＰ＋、Ｋｌｆ４ ＧＦＰ－、Ｋｌｆ４ ＧＦＰ＋）でＣＤ８ Ｔ細胞の標的細胞殺害機能に核心的なグランザイムＢを発現する細胞の比率を測定した結果に係わるグラフ（左側）及び２次元ヒストグラム（右側）を示し、図２Ｅは、対照群（ＭｉｇＲＩ）及びＫｌｆ４遺伝子に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞の機能に核心的なＩＦＮ－γの発現程度をＦＡＣＳ分析で分析して、各細胞（ＭｉｇＲＩ ＧＦＰ－、ＭｉｇＲＩ ＧＦＰ＋、Ｋｌｆ４ ＧＦＰ－、Ｋｌｆ４ ＧＦＰ＋）でＩＦＮ－γを発現する細胞の比率を測定した結果に係わるグラフ（左側）及び２次元ヒストグラム（右側）を示す。
［図３Ａ］本発明の一実施例によって、Ｋｌｆ４遺伝子が形質導入されたＣＤ８ Ｔ細胞を利用した動物実験の投与スケジュールを概略的に示す概要図である。
［図３Ｂ］対照群とＫｌｆ４遺伝子が形質導入されたＣＤ８ Ｔ細胞のＫｌｆ４遺伝子の発現レベルをｍＲＮＡレベルで測定した結果を示すグラフである。
［図３Ｃ］対照群（ＭｉｇＲＩ）及び本発明の一実施例によって、Ｋｌｆ４遺伝子が形質導入されたＣＤ８ Ｔ細胞が投与された癌モデル動物での経時的な腫瘍組織の体積の変化を示すグラフである。
［図３Ｄ］前記動物実験後、犠牲になった動物の腫瘍組織から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞サブセットで細胞分裂程度を示すＫｉ－６７発現程度をＦＡＣＳ分析で分析したものであって、分離されたＣＤ８ Ｔ細胞のマーカー表現型による全体ＣＤ８ Ｔ細胞のうち、Ｋｉ－６７発現細胞の比率を測定した結果に係わるグラフ（左側）及び２次元ヒストグラム（右側）を示す。
［図３Ｅ］前記動物実験後、犠牲になった動物の腫瘍組織から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞のグランザイムＢ発現程度をＦＡＣＳ分析で分析して、分離されたＣＤ８ Ｔ細胞のマーカー表現型による全体ＣＤ８ Ｔ細胞のうち、グランザイムＢ発現細胞の比率を測定した結果に係わるグラフ（左側）及び２次元ヒストグラム（右側）を示す。
［図３Ｆ］前記動物実験後、犠牲になった動物の腫瘍組織から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞のＴＮＦ－α及びＩＮＦ－γ発現程度をＦＡＣＳ分析で分析して、分離されたＣＤ８ Ｔ細胞のマーカー表現型による全体ＣＤ８ Ｔ細胞のうち、ＴＮＦ－α及びＩＮＦ－γ発現細胞の比率を測定した結果に係わるグラフ（左側）及び２次元ヒストグラム（右側）を示す。
［図４Ａ］本発明の一実施例によって、ＡＰＴＯ－２５３が処理されたＣＤ８ Ｔ細胞を利用した動物実験の投与スケジュールを概略的に示す概要図である。
［図４Ｂ］対照群（ＰＢＳ）とＡＰＴＯ－２５３とが処理されたＣＤ８ Ｔ細胞を投与した実験動物でＫｌｆ４遺伝子の発現レベルをｍＲＮＡレベルで測定した結果を示すグラフである。
［図４Ｃ］対照群（ＰＢＳ）及び本発明の一実施例によって、ＡＰＴＯ－２５３が処理されたＣＤ８ Ｔ細胞が投与された癌モデル動物での経時的な腫瘍組織の体積の変化を示すグラフである。
［図５］本発明の一実施例による多様なＣＡＲコンストラクト（ＥｐＣＡＭ ＣＡＲ、Ｔｒｏｐ－２ ＣＡＲ、ＣＥＡＣＡＭ６ ＣＡＲ及びＣＥＡＣＡＭ５ ＣＡＲ）の構造を概略的に示す概要図である。
［発明を実施するための形態］
本発明の一観点によれば、ａ）個体から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞、ｂ）前記ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団、及びｃ）前記ＣＤ８ Ｔ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を暗号化する遺伝子を形質導入したＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞で構成される群から選択される細胞でＫｌｆ４タンパク質の過発現を誘導する段階を含む試験管内の条件でのＣＤ８ Ｔ細胞の疲弊状態の抑制方法が提供される。
【0014】
本発明の一観点によれば、ａ）個体から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞、ｂ）前記ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団、及びｃ）前記ＣＤ８ Ｔ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を暗号化する遺伝子を形質導入したＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞で構成される群から選択される細胞でＫｌｆ４タンパク質の過発現を誘導する段階を含む試験管内の条件でのＣＤ８ Ｔ細胞の免疫反応の強化方法が提供される。
【0015】
本発明の一観点によれば、ａ）個体から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞、ｂ）前記ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団、及びｃ）前記ＣＤ８ Ｔ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を暗号化する遺伝子を形質導入したＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞で構成される群から選択される細胞でＫｌｆ４タンパク質の過発現を誘導する段階を含む試験管内の条件でのＣＤ８ Ｔ細胞の増殖方法が提供される。
【0016】
前記方法において、前記Ｋｌｆ４タンパク質の過発現は、Ｋｌｆ４タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターで前記ＣＤ８ Ｔ細胞を形質感染させるか、前記ＣＤ８ Ｔ細胞にＫｌｆ４タンパク質を発現するｍＲＮＡを導入するか、Ｋｌｆ４誘導剤を前記ＣＤ８ Ｔ細胞に処理することで行われる。前記Ｋｌｆ４タンパク質は、配列番号４または配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含み、前記Ｋｌｆ４タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号６に記載される核酸配列を含みうる。しかし、本発明が、前記特定の配列に限定されるものではなく、他の哺乳動物由来のものであれば、如何なるものでも使われ、望ましくは、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、基本猿、カニクイ猿、赤猿のような霊長類由来のＫｌｆ４タンパク質またはそれを暗号化する核酸分子が使われる。
【0017】
前記方法において、前記発現ベクターは、ウイルス性ベクターまたは非ウイルス性ベクターであり、前記ウイルス性ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター、フラビウイルスベクター、ラドボウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり、前記非ウイルス性ベクターは、ＤＮＡベクター、ナノ粒子、カチオン性ポリマー、エクソソーム、細胞外小胞またはリポソームであり、前記ＤＮＡベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージミドベクターまたは人工ヒト染色体である。
【0018】
前記発現ベクターは、前記ＣＤ８ Ｔ細胞内で前記Ｋｌｆ４タンパク質が過発現されるように前記Ｋｌｆ４タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドに連結される適切な調節配列を含み、前記調節配列は、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、この場合、調節配列とそれに作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを統合して「遺伝子コンストラクト」と称する。前記遺伝子コンストラクトは、発現ベクター内に適切なクローニングのために両末端に切実な制限酵素認識部位を含みうる。
【0019】
本明細書で使われる用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ）」とは、目的とする核酸配列（例えば、試験管内の転写／翻訳システムで、または宿主細胞で）が、その発現が行われるようにする方式で前記調節配列に連結されているということを意味する。前記「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー及び他の調節要素（例、ポリアデニル化信号）を含む意味である。調節配列には、多くの宿主細胞で目的とする核酸が恒常的に発現されるように指示すること、特定の組織細胞のみで目的とする核酸が発現されるように指示すること（例、組織特異的調節配列）、そして、特定の信号によって発現が誘導されるように指示すること（例、誘導性調節配列）が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択及び所望のタンパク質発現のレベルのような因子によって変わるということは、当業者であれば、理解することができる。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入されて前記融合タンパク質を発現することができる。前記真核細胞及び原核細胞での発現を可能にする調節配列は、当業者によく知られている。前述したように、これらは、通常、転写開始を担当する調節配列及び、選択的に転写物の転写終結及び安定化を担当するポリ－Ａ信号を含む。追加的な調節配列は、転写調節因子以外にも翻訳増進因子及び／または天然－組み合わせまたは異種性プロモーター領域を含みうる。例えば、哺乳類宿主細胞で発現を可能にする可能な調節配列は、ＣＭＶ－ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０、ＲＳＶ－プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ヒト腎臓要素１α－プロモーター、グルココルチコイド－誘導性ＭＭＴＶ－プロモーター（モロニーマウス腫瘍ウイルス）、メタロチオネイン－誘導性またはテトラサイクリン－誘導性プロモーター、または、ＣＭＶ増幅剤またはＳＶ４０－増幅剤のような増幅剤を含む。神経細胞内の発現のために、神経微細繊維－プロモーター（ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ－ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ＰＧＤＦ－プロモーター、ＮＳＥ－プロモーター、ＰｒＰ－プロモーターまたはｔｈｙ－１－プロモーターが使われるということが考慮されている。前記プロモーターは、当該分野に知られており、文献（Ｃｈａｒｒｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２５７３９－２５７４５，１９９５）に記述されている。原核細胞内の発現のために、ｌａｃ－プロモーター、ｔａｃ－プロモーターまたはｔｒｐプロモーターを含む多数のプロモーターが開示されている。転写を開始することができる因子の以外に、前記調節配列は、本発明の一実施例によるポリヌクレオチドの下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）にＳＶ４０－ポリ－Ａ部位またはＴＫ－ポリ－Ａ部位のような転写終結信号を含むこともある。本明細書において、適当な発現ベクターは、当該分野に知られており、その例としては、岡山－ベルグ（Ｏｋａｙａｍａ－Ｂｅｒｇ）ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐａｒｍａｃｉａ）、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎ－ｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）、ｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ｐＧＸ２７（特許第１４４２２５４号）、ｐＸ（Ｐａｇａｎｏ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５，１１４４－１１４７）、酵母２－ハイブリッド（ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ）ベクター、例えば、ｐＥＧ２０２及びｄｐＪＧ４－５（Ｇｙｕｒｉｓ（１９９５）Ｃｅｌｌ ７５，７９１－８０３）または原核発現ベクター、例えば、ラムダｇｔ１１またはｐＧＥＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ－Ｐｈａｒｍａｃｉａ）がある。本発明の核酸分子の以外に、ベクターは、分泌信号を暗号化するポリヌクレオチドをさらに含みうる。前記分泌信号は、当業者によく知られている。そして、使われた発現システムによって、融合タンパク質を細胞区画に導くことができるリーダー配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が、本発明の一実施例によるポリヌクレオチドのコーディング配列に組み合わせられ、望ましくは、解毒されたタンパク質またはそのタンパク質を細胞質周辺または細胞外媒質に直接分泌することができるリーダー配列である。
【0020】
また、本発明で使われる発現ベクターは、例えば、標準組換えＤＮＡ技術によって製造可能であり、標準組換えＤＮＡ技術には、例えば、平滑末端及び接着末端ライゲーション、適切な末端を提供するための制限酵素処理、不適切な結合を防止するために、アルカリポステイズ処理によるリン酸基の除去及びＴ４ ＤＮＡリガーゼによる酵素的連結などが含まれる。化学的合成または遺伝子組換え技術によって得られた信号ペプチドをコーディングするＤＮＡ、本発明の一実施例による融合タンパク質を暗号化するＤＮＡを適切な調節配列が含まれているベクターに組換えることにより、本発明のベクターが製造可能である。前記調節配列が含まれているベクターは、商業的に購入または製造することができる。
【0021】
また、前記方法において、前記遺伝子コンストラクトは、１つまたは２つ以上の免疫増強ペプチドを暗号化するポリヌクレオチドをさらに含み、この場合、前記免疫増強ペプチドは、別途の調節配列に連結された形態、すなわち、ｂｉｃｉｓｔｒｏｎ形態に発現ベクトルに含まれるか、１つの調節配列に連結されるが、２つのタンパク質を暗号化するポリヌクレオチドの間にＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）が挿入されて１つのｍＲＮＡに転写後、それぞれのタンパク質でそれぞれ翻訳される形態に示すことができる。前記免疫増強ペプチドは、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）、ＣＴＬＡ４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）、ＰＤ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＢＴＬＡ（Ｂ ａｎｄ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＤＲ３（ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３）、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＳＬＡＭ（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＮＫＧ２Ｄ（ｎａｔｕｒａｌ－ｋｉｌｌｅｒ ｇｒｏｕｐ ２、ｍｅｍｂｅｒ Ｄ）／ＤＡＰ１２（ＤＮＡＸ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １２）、ＴＩＭ１（Ｔ－Ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ｍｕｃｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＴＩＭ２、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２２６、ＣＤ１６０、ＬＡＧ３（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ３）、Ｂ７－１、Ｂ７－Ｈ１、ＧＩＴＲ（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＴＮＦＲ ｆａｍｉｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｆｌｔ３リガンド（ｆｍｓ－ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ３ ｌｉｇａｎｄ）、フラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）、ＨＶＥＭ（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒ）またはＯＸ４０Ｌ［ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２５２］の細胞質ドメインまたはこれらのうち、２つ以上の連結体である。
【0022】
前記方法において、前記Ｋｌｆ４誘導剤は、ＡＰＴＯ－２５３｛２－（５－ｆｌｕｏｒｏ－２－ｍｅｔｈｙｌ－ １Ｈ－ｉｎｄｏｌ－３－ｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｆ］［１，１０］ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ｝である。
【0023】
本発明の他の一観点によれば、Ｋｌｆ４遺伝子が過発現されるように形質転換された形質転換ＣＤ８ Ｔ細胞が提供される。
【0024】
前記形質転換ＣＤ８ Ｔ細胞は、個体から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞またはそれを含む細胞集団にＫｌｆ４タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを形質導入することで製造可能である。前記発現ベクターは、ウイルス性ベクターまたは非ウイルス性ベクターであり、前記ウイルス性ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター、フラビウイルスベクター、ラドボウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり、前記非ウイルス性ベクターは、ｍＲＮＡ、ＤＮＡベクター、ナノ粒子、カチオン性ポリマー、エクソソーム、細胞外小胞またはリポソームであり、前記ｍＲＮＡは、Ｋｌｆ４タンパク質を暗号化するｍＲＮＡ単独または前記ｍＲＮＡ以外の前記非ウイルス性ベクターとの組み合わせで使われ、前記ＤＮＡベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージミドベクターまたは人工ヒト染色体である。
【0025】
本発明の他の一観点によれば、外来性Ｋｌｆ４タンパク質及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が発現されるように形質転換された形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞が提供される。
【0026】
前記形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞は、Ｋｌｆ４タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含む遺伝子コンストラクト及び前記ＣＡＲを暗号化するポリヌクレオチドを含む遺伝子コンストラクトでＣＤ８ Ｔ細胞、望ましくは、治療を必要とする患者から単離されたＣＤ８ Ｔ細胞または前記ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団を形質感染させることで製造可能であり、前記２種の遺伝子コンストラクトは、別個のベクターにクローニングされて共形質感染され、それとも１つのベクター内にクローニングされて宿主ＣＤ８ Ｔ細胞に形質導入される。この場合、それぞれの遺伝子は、別途の調節部位、例えば、プロモーター及び／またはエンハンサーなどと作動可能に連結されて別個のｍＲＮＡに発現にもなり、１つの転写調節因子下ＩＲＥＳで連結されて１つのｍＲＮＡに発現された後、翻訳及び修飾過程のみ別途に行われることもある。外来遺伝子の形質導入のためのベクター及びプロモーターなど多様な技術については、前述した通りである。
【0027】
本明細書で使われる用語「キメラ抗原受容体」は、抗原認識部位としてｓｃＦｖ、ｓｄＡｂのような一本鎖基盤の抗体類似体－細胞膜通過ドメイン－補助刺激ドメイン－細胞内信号伝達ドメインで構成された合成タンパク質であって、Ｔ細胞など免疫細胞に形質導入されて癌細胞特異的な抗原を認識して、これらの免疫細胞の癌細胞に対する抗ガン活性を向上させるとよく知られている。
【0028】
前記形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞において、前記ＣＡＲは、抗体類似体－細胞膜通過ドメイン－補助刺激因子－細胞内信号伝達ドメインを含む融合タンパク質である。前記一本鎖基盤の抗体類似体は、癌抗原または病原体由来の抗原に対して特異的に結合することができるが、前記癌抗原は、ＥｐＣＡＭ（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、Ｔｒｏｐ－２（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ２）、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ５）、ＣＥＡＣＡＭ６（ＣＥＡ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ６）、癌胚芽性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ、ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性ホスファターゼ（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＰＡＰ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＭＵＣ－１、ＢＣＲ／ＡＢＬ、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＬＭＰ２ａのようなエプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）由来の抗原、Ｂ型ヒト肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来の抗原、Ｃ型ヒト肝炎ウイルス（ＨＣＶ）由来の抗原、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ３、ＷＴ－１、ＰＡＰ（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、Ｇ２５０、メラノーマ抗原遺伝子（ＭＡＧＥ、ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｅｎｅ）、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、チロシナーゼ－関連タンパク質－１（ＴＲＰ－１）、ＴＲＰ－２、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、Ｉｇ Ｉｄｉｏｔｙｐｅ、ＣＤＫ４、ｃａｓｐａｓｅ－８、β－ｃａｔｅｎｉｎ、ＢＣＲ／ＡＢＬ、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７）、ＨＨＶ－８、５Ｔ４、ｐ５３、癌抗原１２５（ＣＡ－１２５）、癌抗原－７２－４（ＣＡ－７２－４）、癌抗原－１５－３（ＣＡ－１５－３）、または癌抗原－１９－９（ＣＡ－１９－９）である。前記病原体由来の抗原は、病原性微生物（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）、ウイルスまたは寄生虫由来の抗原であり、前記病原性微生物は、病原性細菌（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ）または病原性真菌（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｊｉ）であり、前記病原性細菌は、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、破傷風菌（ｔｅｔａｎｕｓ）、ジフテリア菌（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｏｃｕｌｏｓｉｓ）、コレラ（Ｃｈｏｌｅｒａ ｓｐ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．）、ボレリア菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｓｐ．）またはサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．）であり、前記病原性真菌は、カンジダ菌（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）、トリコフィトン菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｓｐ．）、アスペルギルス菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、Ｆｏｎｓｅｃａｅａ ｓｐ．、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｓｐ．、Ｐｉｅｄｒａｉａ ｓｐ．、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｓｐ．、Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐ．、Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐ．、Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐ．、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｐ．、Ｍｕｃｏｒ ｓｐ．、Ａｂｓｉｄｉａ ｓｐ．、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｗａｎｇｉｅｌｌａ ｓｐ．、Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ ｓｐ．、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｐ．である。また、前記ウイルスは、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、ヒトパピローマウイルス（ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ、ＨＰＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）、Ａ型肝炎ウイルス抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ、ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ、ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎Ｃ（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）及びＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）、呼吸器多核体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｔｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ、ＲＳＶ）、ヘルペスシンプレックスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）抗原またはヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ、ＨＩＶ）である。前記寄生虫は、回虫、蟯虫、有鉤条虫、肝吸虫、肺吸虫、住血吸虫、肝ジストマ、肺ジストマ、プラスモジウムファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、またはトキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）である。
【0029】
本明細書で使われる「抗体類似体（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｉｍｅｔｉｃ）」は、２本の重鎖及び２本の軽鎖が異種四合体の４次構造を形成して機能を発揮する通常の全長抗体とは異なって、抗体から由来したが、２本の鎖で構成されたものではなく、一本鎖からなる抗原－結合断片または非抗体由来のタンパク質スキャフォールドから製造される抗体と類似した機能、すなわち、抗原結合能を有するタンパク質を意味する。具体的に、このような抗体類似体としては、抗体基盤の一本鎖抗体断片で抗体のＶＨとＶＬとをリンカーで連結して製造された一本鎖抗体断片であるｓｃＦｖ（Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９（６）：１３６２－１３６７，１９９０）、抗体の単一可変領域断片で構成された抗体断片であるｓｄＡｂ（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、軽鎖なしに重鎖のみで構成される抗体であるラクダ科または軟骨魚類由来の抗体の抗原－結合断片（ＶＨＨ、ＶＮＡＲなど）などが存在し、非抗体由来のタンパク質スキャフォールドから製造される抗体類似タンパク質には、タンパク質ＡのＺ ｄｏｍａｉｎ由来のＡｆｆｉｂｏｄｙ（Ｎｙｇｒｅｎ，Ｐ．Ａ．，ＦＥＢＳ Ｊ．２７５（１１）：２６６８－２６７６，２００８）、Ｇａｍｍａ－Ｂ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎまたはＵｂｉｑｕｉｔｉｎ由来のＡｆｆｉｌｉｎ（Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７２（１）：１７２－１８５，２００７）、Ｃｙｓｔａｔｉｎ由来のＡｆｆｉｍｅｒ（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８４（１５）：６５５３－６５６０，２０１２）、Ｓａｃ７ｄ由来のＡｆｆｉｔｉｎ（Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８３（５）：１０５８－１０６８，２００８）、Ｔｒｉｐｌｅ ｈｅｌｉｘ ｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌタンパク質由来のＡｌｐｈａｂｏｄｙ（Ｄｅｓｍｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．５：５２３７，２０１４）、ｌｉｐｏｃａｌｉｎ由来のＡｎｔｉｃａｌｉｎ（Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｊ．２７５（１１）：２６７７－２６８３，２００８）、多様な膜受容体のドメイン由来のＡｖｉｍｅｒ（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１２）：１５５６－１５６１，２００５）、Ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｍｏｔｉｆ由来のＤＡＲＰｉｎ（Ｓｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ．１３（１５－１６）：６９５－７０１，２００８）、Ｆｙｎタンパク質のＳＨ３ドメイン由来のＦｙｎｏｍｅｒ（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（５）：３１９６－３２０４，２００７）、多様なタンパク質阻害剤のＫｕｎｉｔｚドメイン由来のＫｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｎｉｘｏｎ ａｎｄ Ｗｏｏｄ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖ．９（２）：２６１－２６８，２００６）、フィブロネクチンの１０番目の第３型ドメイン由来のｍｏｎｏｂｏｄｙ（Ｋｏｉｄｅ ａｎｄ Ｋｏｉｄｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５２：９５－１０９，２００７）、炭水化物結合モジュール３２－２由来のｎａｎｏＣＬＡＭＰ（Ｓｕｄｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．１３４：１１４－１２４，２０１７）、ヌタウナギ由来の可変リンパ球受容体（ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＶＬＲ）（Ｂｏｅｈｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：２０３－２２０，２０１２）、及び前記ＶＬＲに基づいて抗原親和性を向上させるように操作されたｒｅｐｅｂｏｄｙ（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０９：３２９９－３３０４，２０１２）などが含まれる。
【0030】
本明細書で使われる用語「ｓｃＦｖ」は、「ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ」の略語であって、実際の抗体の断片ではなく、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とを約２５ａ．ａ．サイズのリンカーペプチドで連結して製造した一種の融合タンパク質であって、固有の抗体断片ではないことにも拘らず、抗原結合能を有したと知られている（Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９（６）：１３６２－１３６７，１９９０）。
【0031】
前記形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞において、前記細胞膜通過ドメインは、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、活性化ＮＫ細胞受容体、免疫グロブリンタンパク質、Ｂ７－Ｈ３、ＢＡＦＦＲ、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＢＴＬＡ、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１９ａ、ＣＤ２、ＣＤ２４７、ＣＤ２７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３０、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ８４、ＣＤ８、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＤｌ ｌａ、ＣＤｌ ｌｂ、ＣＤｌ ｌｃ、ＣＤｌ ｌｄ、ＣＤＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、サイトカイン受容体、ＤＡＰ－１０、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、Ｆｃガンマ受容体、ＧＡＤＳ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＩＡ４、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－１、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、誘導性Ｔ細胞共同刺激子（ＩＣＯＳ）、インテグリン、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＩＴＧＢｌ、ＫＩＲＤＳ２、ＬＡＴ、ＬＦＡ－１、ＬＦＡ－１、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＢＲ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、リンパ球機能－関連抗原－１（ＬＦＡ－１；ＣＤｌ－ｌａ／ＣＤ１８）、ＭＨＣ部類１分子、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＯＸ－４０、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、プログラム化された死滅－１（ＰＤ－１）、ＰＳＧＬ１、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、信号伝達リンパ球性活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１；ＣＤ１５０；ＩＰＯ－３）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４；２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ；Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＰ－７６、ＴＮＦ受容体タンパク質、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＳＦ１４、トールリガンド受容体、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＶＬＡ１、またはＶＬＡ－６由来の膜通過ドメインである。
【0032】
本明細書で使われる用語「補助刺激ドメイン（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｄｏｍａｉｎ）」は、Ｔ／ＮＫ活性化を補助する免疫関連タンパク質である補助刺激因子（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）のＴ細胞補助刺激の機能を担当する細胞質ドメイン（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄｏｍａｉｎ）を意味する。
【0033】
前記形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞において、前記補助刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＢＴＬＡ、ＤＲ３、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＳＬＡＭ、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＮＫＧ２Ｄ／ＤＡＰ１２、ＴＩＭ１、ＴＩＭ２、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２２６、ＣＤ１６０、ＬＡＧ３、Ｂ７－１、Ｂ７－Ｈ１、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭまたはＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）の細胞質ドメインまたはこれらのうち、２つ以上の連結体である。
【0034】
本明細書で使われる用語「細胞内信号伝達ドメイン」は、免疫細胞でリガンドが受容体に結合される時、免疫反応を媒介する細胞内信号を伝達する機能を担当する細胞質内ドメインを意味する。
【0035】
前記形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞において、前記細胞内信号伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬ－２Ｒβ／ＣＤ１２２、ＩＬ－２Ｒα／ＣＤ１３２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、そして、ＣＤ４０のうちから１つまたはそれ以上の細胞質内ドメインの一部または全部を含む。
【0036】
本発明の一実施例による、形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞は、疲弊現象を最大限抑制し、癌－抗原に対する認識及び認識された癌－抗原に対する免疫反応を増加させることにより、抗ガン治療において、相加または相乗効果を示すことができる。
【0037】
本発明の他の一観点によれば、前記形質転換ＣＤ８ Ｔ細胞または前記形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞を含む組成物が提供される。
【0038】
前記組成物において、前記Ｋｌｆ４遺伝子が過発現されたＣＤ８ Ｔ細胞は、治療を必要とする個体から分離された自家由来ＣＤ８ Ｔ細胞または他人から分離された他家由来ＣＤ８ Ｔ細胞であるが、自家由来ＣＤ８ Ｔ細胞であることが望ましい。前記Ｋｌｆ４遺伝子が過発現されたＣＤ８ Ｔ細胞は、ＣＤ８ Ｔ細胞にＫｌｆ４遺伝子が含まれた発現ベクターの形質導入及び／または前記ＣＤ８ Ｔ細胞にＫｌｆ４誘導剤の処理を通じて製造可能である。
【0039】
前記形質導入とＫｌｆ４誘導剤に関する説明は、前述した通りである。
【0040】
前記組成物は、先天性免疫反応が必要な疾患の治療に使われ、前記先天性免疫反応が必要な疾患は、癌、細菌性感染症、真菌性感染症、ウイルス感染症または寄生虫感染症である。
【0041】
本発明の他の観点によれば、前記形質転換ＣＤ８ Ｔ細胞または前記形質転換ＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞を有効成分として含む癌治療用薬学的組成物が提供される。
【0042】
前記組成物は、前記担体以外に薬学的に許容可能な補助剤、賦形剤または希釈剤をさらに含みうる。
【0043】
本明細書で使われる用語「薬学的に許容可能な」とは、生理学的に許容され、ヒトに投与される時、通常の胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応またはそれと類似した反応を起こさない組成物を言う。前記担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油が挙げられる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などをさらに含みうる。
【0044】
また、本発明の一実施例による薬学的組成物は、哺乳動物に投与時に、活性成分の迅速な放出、または持続または遅延された放出が可能に当業者に公知の方法を使用して剤形化される。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、軟質または硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末の形態を含む。
【0045】
本発明の一実施例による組成物は、多様な経路に投与されるが、一般的な全身性投与または局所性投与、例えば、皮下注射、滑膜腔内注射、腹腔内注射、筋肉内注射または静脈内注射方式で投与されるが、これに制限されるものではない。
【0046】
本発明の一実施例による組成物は、一般的に使われる薬学的に許容可能な担体と共に適した形態に剤形化される。薬学的に許容される担体としては、例えば、水、適したオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコールのような非経口投与用担体などがあり、安定化剤及び保存剤をさらに含みうる。適した安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適した保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、メチル－またはプロピル－パラベン及びクロロブタノールがある。また、本発明による組成物は、その投与方法や剤形によって必要な場合、懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、酸化防止剤などを適切に含みうる。前記例示されたものを含めて、本発明に適した薬学的に許容される担体及び製剤は、文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最新版］に詳しく記載されている。
【0047】
また、本発明の組成物は、治療的に有効な量で投与される。
【0048】
本明細書で使われる用語「治療的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な恵み／危険の比率で疾患の治療に十分な量を意味し、有効容量レベルは、個体の種類及び重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時使われる薬物を含む要素及びその他の医学分野によく知られた要素によって決定されうる。本発明のワクチン組成物または薬学的組成物は、０．１～１ｇ／ｋｇの容量で投与され、さらに望ましくは、１～５００ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される。一方、前記投与量は、患者の年齢、性別及び状態によって適切に調節される。
【0049】
本発明の他の一観点によれば、癌にかかった個体から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞または前記ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団でＫｌｆ４遺伝子の過発現を誘導する段階；及びＫｌｆ４遺伝子が過発現されたＣＤ８ Ｔ細胞または前記ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団を前記個体に投与する段階；を含む前記個体の癌の治療方法が提供される。
【0050】
前記癌の治療方法において、前記ＣＤ８ Ｔ細胞または前記ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団は、さらに癌抗原を標的としたキメラ抗原受容体を暗号化するポリヌクレオチドに形質導入される。
【0051】
以下、実施例及び実験例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。しかし、本発明は、以下で開示される実施例及び実験例に限定されるものではなく、互い異になる多様な形態として具現可能なものであって、以下の実施例及び実験例は、本発明の開示を完全にし、当業者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものである。
【0052】
実施例
一般的方法
Ｋｌｆ４遺伝子形質導入のためのレトロウイルスの製作
プラチナＥ細胞株（ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、ｐｌａｔＥ、ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＡＢＳ、ＵＳＡ）を１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）、抗生剤であるストレプトマイシン＆ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ、ＷＥＬＧＥＮＥ）、ブラストマイシン（１０μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＤＭＥＭ培地（ＷＥＬＧＥＮＥ）で細胞飽和度に注意して過成長しないように３７℃ ５％ ＣＯ２細胞培養器で培養した。細胞飽和度が９０％程度に至れば、培地を除去した後、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）を５ｍｌ加えて洗浄した後、除去し、このような洗浄過程をもう一回繰り返した。引き続き、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（ＷＥＬＧＥＮＥ）２～３ｍｌを滴加した後、３７℃細胞培養器で３分間反応させた。以後、ＤＭＥＭ培地１０ｍｌに分離された細胞をよくピペッティングした後、１５ｍｌチューブに移した後、４℃ １，５００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離した。上澄み液を除去し、ペレットを１０％ ＦＢＳのみ添加されたＤＭＥＭ培地（無抗生剤培地）で再懸濁した後、細胞を計数した。６０ｍｍの培養皿に２．５ｘ１０６個のｐｌａｔＥ細胞を３ｍｌの抗生剤が添加されていないＤＭＥＭ培地で再懸濁した後、均一に播種し、６～８時間３７℃ ５％ ＣＯ２細胞培養器で培養した。６～８時間が経過した後、カルシウム形質感染のために、２Ｘ ＨＢＳ、２Ｍ ＣａＣｌ２、３次蒸留水、そして、ＭｉｇＲＩベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ、ＵＳＡ）にマウスｋｌｆ４遺伝子のＣＤＳ配列（配列番号１）を挿入することにより、ＭｉｇＲＩ－Ｋｌｆ４ベクターを製造した。この際、マウスｋｌｆ４２遺伝子のクローニングは、ＭｉｇＩベクターへのクローニングのための制限酵素（ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩ）認識部位を付加したプライマーセット（配列番号２及び配列番号３）を使用したＰＣＲ増幅を通じて行われたが、フォワードプライマーには、ＢｇｌＩＩ認識部位と開始コドン（ＡＴＧ）との間には、コザック配列（Ｋｏｚａｋ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）でＡＣＣを挿入した。その後、Ｘ ＨＢＳを一側の１．５ｍｌの遠心分離チューブに３１２．５μｌ分注した後、他側の遠心分離チューブには、２Ｍ ＣａＣｌ２ ３８．７５μｌ、ＤＮＡベクター１０μｇに該当する体積を添加し、残部は、３次蒸留水を用いて３１２．５μｌを合わせた。その後、２Ｘ ＨＢＳが分注されている遠心分離チューブを低い強度でボルテックシングし、ＤＮＡベクターが分注されている遠心分離チューブの溶液をピペットを用いて滴加方式で２Ｘ ＨＢＳが分注されている遠心分離チューブに移し、３０分間常温で反応させた。引き続き、混合溶液をピペットを用いてあらかじめ播種して準備しておいたｐｌａｔＥ培養皿に滴加方式で加えた。その後、３７℃ ５％ ＣＯ２細胞培養器で１６時間程度培養した。培養を終えた後、培養培地を除去し、暖かいＰＢＳを用いて二回洗浄した後、抗生剤が添加されていないＤＭＥＭ培地を６０ｍｍの培養皿当たり３ｍｌずつ分注した後、３７℃ ５％ ＣＯ２細胞培養器で追加的に４８時間培養した。培養が終了した後、培養上澄み液のみ移して入れた後、０．４５μｍフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）を用いて濾過した。濾過が完了したウイルスが含まれた上澄み液は、直ちに実験に使用するか、液体窒素を用いて急速冷凍させた後、超低温冷凍庫（ｄｅｅｐ ｆｒｅｅｚｅｒ）で－８０℃の温度条件で保管した。
一般的方法
Ｋｌｆ４遺伝子形質導入のためのレトロウイルスの製作
プラチナＥ細胞株（ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、ｐｌａｔＥ、ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＡＢＳ、ＵＳＡ）を１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）、抗生剤であるストレプトマイシン＆ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ、ＷＥＬＧＥＮＥ）、ブラストマイシン（１０μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＤＭＥＭ培地（ＷＥＬＧＥＮＥ）で細胞飽和度に注意して過成長しないように３７℃ ５％ ＣＯ２細胞培養器で培養した。細胞飽和度が９０％程度に至れば、培地を除去した後、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）を５ｍｌ加えて洗浄した後、除去し、このような洗浄過程をもう一回繰り返した。引き続き、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（ＷＥＬＧＥＮＥ）２～３ｍｌを滴加した後、３７℃細胞培養器で３分間反応させた。以後、ＤＭＥＭ培地１０ｍｌに分離された細胞をよくピペッティングした後、１５ｍｌチューブに移した後、４℃ １，５００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離した。上澄み液を除去し、ペレットを１０％ ＦＢＳのみ添加されたＤＭＥＭ培地（無抗生剤培地）で再懸濁した後、細胞を計数した。６０ｍｍの培養皿に２．５ｘ１０６個のｐｌａｔＥ細胞を３ｍｌの抗生剤が添加されていないＤＭＥＭ培地で再懸濁した後、均一に播種し、６～８時間３７℃ ５％ ＣＯ２細胞培養器で培養した。６～８時間が経過した後、カルシウム形質感染のために、２Ｘ ＨＢＳ、２Ｍ ＣａＣｌ２、３次蒸留水、そして、ＭｉｇＲＩベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ、ＵＳＡ）にマウスｋｌｆ４遺伝子のＣＤＳ配列（配列番号１）を挿入することにより、ＭｉｇＲＩ－Ｋｌｆ４ベクターを製造した。この際、マウスｋｌｆ４２遺伝子のクローニングは、ＭｉｇＩベクターへのクローニングのための制限酵素（ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩ）認識部位を付加したプライマーセット（配列番号２及び配列番号３）を使用したＰＣＲ増幅を通じて行われたが、フォワードプライマーには、ＢｇｌＩＩ認識部位と開始コドン（ＡＴＧ）との間には、コザック配列（Ｋｏｚａｋ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）でＡＣＣを挿入した。その後、Ｘ ＨＢＳを一側の１．５ｍｌの遠心分離チューブに３１２．５μｌ分注した後、他側の遠心分離チューブには、２Ｍ ＣａＣｌ２ ３８．７５μｌ、ＤＮＡベクター１０μｇに該当する体積を添加し、残部は、３次蒸留水を用いて３１２．５μｌを合わせた。その後、２Ｘ ＨＢＳが分注されている遠心分離チューブを低い強度でボルテックシングし、ＤＮＡベクターが分注されている遠心分離チューブの溶液をピペットを用いて滴加方式で２Ｘ ＨＢＳが分注されている遠心分離チューブに移し、３０分間常温で反応させた。引き続き、混合溶液をピペットを用いてあらかじめ播種して準備しておいたｐｌａｔＥ培養皿に滴加方式で加えた。その後、３７℃ ５％ ＣＯ２細胞培養器で１６時間程度培養した。培養を終えた後、培養培地を除去し、暖かいＰＢＳを用いて二回洗浄した後、抗生剤が添加されていないＤＭＥＭ培地を６０ｍｍの培養皿当たり３ｍｌずつ分注した後、３７℃ ５％ ＣＯ２細胞培養器で追加的に４８時間培養した。培養が終了した後、培養上澄み液のみ移して入れた後、０．４５μｍフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）を用いて濾過した。濾過が完了したウイルスが含まれた上澄み液は、直ちに実験に使用するか、液体窒素を用いて急速冷凍させた後、超低温冷凍庫（ｄｅｅｐ ｆｒｅｅｚｅｒ）で－８０℃の温度条件で保管した。
【0053】
未接触ＣＤ８ Ｔ細胞の分離及び活性化
マウスを犠牲にして脾臓を摘出した。その後、ＰＢＳに入れられた脾臓を細かく粉砕した後、メッシュで濾過して１５ｍｌの遠心分離チューブに移した後、４℃ １，５００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離した。上澄み液は除去し、ペレットは、Ａｃｋ溶解緩衝液１ｍｌに再懸濁して常温で３分間反応させた。引き続き、ＰＢＳ １０ｍｌを追加し、４℃ １５００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離した。蛍光標識された抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４４抗体をＰＢＳに１００：１の体積比で混合して抗体混合物を製造した後、遠心分離されて沈んだ細胞ペレットに加えた後、再懸濁し、４℃で３０分間反応させた。その後、ＰＢＳ １０ｍｌを追加した後、４℃ １，５００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離した。上澄み液を除去し、ペレットをＰＢＳ １ｍｌに再懸濁した後、細胞濾過器（ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ）で濾過し、適量のＰＢＳあるいはＲＰＭＩ培地（ＷＥＬＧＥＮＥ）を添加して細胞密度を調節した。引き続き、細胞分離器（ＳＨ８００、Ｓｏｎｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を用いてＣＤ８＋ＣＤ４４ｌｏｗ細胞（未接触ＣＤ８ Ｔ細胞）を分離した。
マウスを犠牲にして脾臓を摘出した。その後、ＰＢＳに入れられた脾臓を細かく粉砕した後、メッシュで濾過して１５ｍｌの遠心分離チューブに移した後、４℃ １，５００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離した。上澄み液は除去し、ペレットは、Ａｃｋ溶解緩衝液１ｍｌに再懸濁して常温で３分間反応させた。引き続き、ＰＢＳ １０ｍｌを追加し、４℃ １５００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離した。蛍光標識された抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４４抗体をＰＢＳに１００：１の体積比で混合して抗体混合物を製造した後、遠心分離されて沈んだ細胞ペレットに加えた後、再懸濁し、４℃で３０分間反応させた。その後、ＰＢＳ １０ｍｌを追加した後、４℃ １，５００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離した。上澄み液を除去し、ペレットをＰＢＳ １ｍｌに再懸濁した後、細胞濾過器（ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ）で濾過し、適量のＰＢＳあるいはＲＰＭＩ培地（ＷＥＬＧＥＮＥ）を添加して細胞密度を調節した。引き続き、細胞分離器（ＳＨ８００、Ｓｏｎｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を用いてＣＤ８＋ＣＤ４４ｌｏｗ細胞（未接触ＣＤ８ Ｔ細胞）を分離した。
【0054】
４８ウェルプレート（ＳＰＬ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に分離が完了する１時間３０分～２時間前に抗ＣＤ３抗体をコーティングするが、具体的に、抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）が５μｇ／ｍｌの濃度になるようにＰＢＳを用いて希釈した後、４８ウェルプレートの各ウェルに１５０μｌずつ分注した。以後、３７℃細胞培養器で１時間３０分～２時間程度反応させることにより、抗体をコーティングした。抗体コーティングが完了したプレートの各ウェルから抗体混合物を除去し、ＰＢＳ １５０μｌを用いて洗浄し、同一洗浄過程をもう一回繰り返した。分離が完了した未接触ＣＤ８ Ｔ細胞を４℃ １，５００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離した後、上澄み液を除去し、ペレットを１０％ ＦＢＳ、ストレプトマイシン＆ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）が添加されたＲＰＭＩ培地を用いて再懸濁した。準備された抗ＣＤ３抗体がコーティングされたプレートの一ウェル当たり１．５ｘ１０６個の細胞を添加した。この際、さらに抗ＣＤ２８抗体（２μｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、ｍＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を処理した。その後、３７℃ ５％ ＣＯ２細胞培養器で１８～２４時間培養した。
【0055】
活性化されたＣＤ８細胞の増殖及びレトロウイルスを利用したＫｌｆ４遺伝子形質導入
高効率のレトロウイルス形質導入の効率を得るために、活性化されたＣＤ８ Ｔ細胞の増殖過程を先に行った。前記で１８～２４時間活性化処理された細胞を１５ｍｌの遠心分離チューブによく移して入れた後、２５℃ １，５００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離した。引き続き、１００％パーコール（ｐｅｒｃｏｌｌ）、ＲＰＭＩ培地、そして、ＰＢＳを用いてそれぞれ３０％及び６０％に希釈されたパーコール溶液を製造した。遠心分離されたペレットを３０％パーコール溶液４ｍｌに再懸濁した後、６０％パーコール溶液３ｍｌを気をつけて下階に配置した。その後、２５℃ ２，０００ｒｐｍの条件で２０分間遠心分離した。この際、加速と減速は、最小に設定した。遠心分離後、上層の３ｍｌは除去し、界面に位置した細胞を新たな１５ｍｌの遠心分離チューブに移動させた。引き続き、ＰＢＳ １０ｍｌを追加して洗浄した後、２５℃ １，５００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離した。遠心分離後、ペレットをＰＢＳ １０ｍｌでもう一回洗浄した後、２５℃ １，５００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離し、細胞ペレットをＲＰＭＩ培地に再懸濁させた後、細胞を計数した。引き続き、１２ウェル非コーティングプレート（ＳＰＬ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にウェル当たり５ｘ１０５個ずつ細胞を分注した。
高効率のレトロウイルス形質導入の効率を得るために、活性化されたＣＤ８ Ｔ細胞の増殖過程を先に行った。前記で１８～２４時間活性化処理された細胞を１５ｍｌの遠心分離チューブによく移して入れた後、２５℃ １，５００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離した。引き続き、１００％パーコール（ｐｅｒｃｏｌｌ）、ＲＰＭＩ培地、そして、ＰＢＳを用いてそれぞれ３０％及び６０％に希釈されたパーコール溶液を製造した。遠心分離されたペレットを３０％パーコール溶液４ｍｌに再懸濁した後、６０％パーコール溶液３ｍｌを気をつけて下階に配置した。その後、２５℃ ２，０００ｒｐｍの条件で２０分間遠心分離した。この際、加速と減速は、最小に設定した。遠心分離後、上層の３ｍｌは除去し、界面に位置した細胞を新たな１５ｍｌの遠心分離チューブに移動させた。引き続き、ＰＢＳ １０ｍｌを追加して洗浄した後、２５℃ １，５００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離した。遠心分離後、ペレットをＰＢＳ １０ｍｌでもう一回洗浄した後、２５℃ １，５００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離し、細胞ペレットをＲＰＭＩ培地に再懸濁させた後、細胞を計数した。引き続き、１２ウェル非コーティングプレート（ＳＰＬ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にウェル当たり５ｘ１０５個ずつ細胞を分注した。
【0056】
前記から準備されたレトロウイルス上澄み液（ＭｉｇＲＩ－Ｋｌｆ４及びＭｉｇＲＩ）１～２ｍｌを各ウェルに添加した後、ｍＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を追加した。引き続き、パラフィルムで隙間を密封し、２５℃ １，８００ｘｇの条件で１時間遠心分離した。この際も、同様に加速及び減速は、最小に設定した。遠心分離が終われば、パラフィルムを除去し、３７℃ ５％ ＣＯ２細胞培養器で３０分間培養した。以後、細胞を１５ｍｌの遠心分離チューブに移し、ＲＰＭＩ培地１０ｍｌを追加して洗浄した後、２５℃ １，５００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離した。遠心分離後、細胞ペレットをＲＰＭＩ培地１０ｍｌに再懸濁し、もう一回洗浄した後、２５℃ １，５００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離した。遠心分離後、細胞ペレットをＰＢＳで再懸濁し、それを直ちにマウスに静脈内注射することにより、免疫細胞移植（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を行うか、追加的な培養を通じて細胞実験に使用した。
【0057】
ＡＰＴＯ－２５３を利用したＫｌｆ４の過発現誘導
本発明者らは、レトロウイルスを利用したＫｌｆ４遺伝子形質導入以外にも転写因子であるＫｌｆ４の上位信号伝達経路を調節することにより、未接触ＣＤ８ Ｔ細胞の内在的なＫｌｆ４遺伝子の過発現が可能であると予想した。これにより、Ｋｌｆ４発現誘導剤として知られているＡＰＯ－２５３（Ｃｅｒｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｎｅｗ．Ｄｒｕｇ．３３（５）：１０８６－１０９２，２０１５）を未接触ＣＤ８細胞に処理してＫｌｆ４遺伝子を過発現させる場合にも、レトロウイルスベクターを利用した形質導入と類似した効果を示すと推定した。
本発明者らは、レトロウイルスを利用したＫｌｆ４遺伝子形質導入以外にも転写因子であるＫｌｆ４の上位信号伝達経路を調節することにより、未接触ＣＤ８ Ｔ細胞の内在的なＫｌｆ４遺伝子の過発現が可能であると予想した。これにより、Ｋｌｆ４発現誘導剤として知られているＡＰＯ－２５３（Ｃｅｒｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｎｅｗ．Ｄｒｕｇ．３３（５）：１０８６－１０９２，２０１５）を未接触ＣＤ８細胞に処理してＫｌｆ４遺伝子を過発現させる場合にも、レトロウイルスベクターを利用した形質導入と類似した効果を示すと推定した。
【0058】
これにより、前記の方法と同様に未接触ＣＤ８ Ｔ細胞を分離した後、抗ＣＤ３抗体がコーティングされたプレートに未接触ＣＤ８ Ｔ細胞を入れ、活性化させる過程で、抗ＣＤ２８抗体（２μｇ／ｍｌ）及びｍＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）を処理する時、３μＭのＡＰＴＯ－２５３（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、ＬＬＣ）を処理した。引き続き、３７℃ ５％ ＣＯ２細胞培養器で７２時間培養した。培養が終了した後、細胞を１５ｍｌの遠心分離チューブに移した後、ＲＰＭＩ培地を追加して体積を３ｍｌに調整した。その後、下階にＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ）３ｍｌを気をつけて配置した。引き続き、２５℃ ２，０００ｒｐｍの条件で３０分間遠心分離させ、この際、加速と減速は、最小に設定した。遠心分離後、上層部の培養液を除去した後、界面に存在する細胞を回収して１５ｍｌの遠心分離チューブに移してＰＢＳ １０ｍｌに再懸濁した後、４℃ １，５００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離した。遠心分離後、上澄み液を除去し、細胞ペレットをＰＢＳ １０ｍｌでもう一回洗浄し、４℃ １，５００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離した。遠心分離後、上澄み液を除去し、細胞ペレットを適量のＰＢＳに再懸濁した後、細胞を計数した。最終的に、５ｘ１０５個の細胞を２００μｌのＰＢＳに希釈して１ｍｌの注射器に積載した後、マウスに静脈内注射して免疫細胞移植を行った。
【0059】
実施例１：ＣＤ８ Ｔ細胞の疲弊現象の機転研究
前述したように、ＣＤ８ Ｔ細胞が癌抗原などに慢性的に露出されれば、疲弊現象が起こり、このように疲弊したＣＤ８ Ｔ細胞は、正常な活性サイトカイン分泌及び細胞分裂を行うことができず、まともな免疫反応を行うことができないだけではなく、時間が過ぎても、再び正常な機能を有する細胞に回復しない。
前述したように、ＣＤ８ Ｔ細胞が癌抗原などに慢性的に露出されれば、疲弊現象が起こり、このように疲弊したＣＤ８ Ｔ細胞は、正常な活性サイトカイン分泌及び細胞分裂を行うことができず、まともな免疫反応を行うことができないだけではなく、時間が過ぎても、再び正常な機能を有する細胞に回復しない。
【0060】
これにより、本発明者らは、ＣＤ８ Ｔ細胞が活性化されてから経時的に疲弊する現象の原因を究明するために、試験管内の条件で疲弊状況を模倣するための実験を行った。
【0061】
１－１：疲弊模倣の試験管内試験
このために、具体的に、本発明者らは、ＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）－ペプチド特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＯＴ－Ｉ形質転換マウスのＣＤ８ Ｔ細胞を分離して５日間繰り返してＯＶＡペプチドを処理する実験を行った。あらゆる実験セットでは、ＣＤ８ Ｔ細胞の生存度を高めるために、ＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ－７（５ｎｇ／ｍｌ）を処理した。ＯＶＡペプチド（１０ｎｇ／ｍｌ）を処理し、その翌日、洗浄後、再びサイトカイン及びＯＶＡペプチドを同一組成で処理する方式で５日間繰り返して刺激を加えた（反復的刺激処理群）。この際、対照群としてＯＶＡペプチドを処理せず、サイトカインのみ処理したグループとＯＶＡペプチド（１０ｎｇ／ｍｌ）を２日間処理し、洗浄した後、サイトカインのみ処理して休止させる単一刺激処理群を追加した。また、ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化を助ける因子として知られたＩＬ－２１を処理したセットも追加した（反復刺激＋ＩＬ－２１処理群）（図１Ａ）。５日が過ぎた時点で生きているＣＤ８ Ｔ細胞を細胞分離器（ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）を用いて分離した後、ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した後、多様な遺伝子の発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲを通じて確認した。その結果、疲弊状態を模倣した反復刺激処理群で疲弊現象の代表的マーカーであるＴｏｘ遺伝子の発現が増加し、ＩＬ－２１を処理した反復刺激＋ＩＬ－２１処理群では、Ｔｏｘ遺伝子の発現が再び減少することを確認した。このような状況でＫｌｆ４の発現態様を確認した結果、反復刺激処理群でＫｌｆ４遺伝子の発現が増加し、Ｔｏｘとは異なって、反復刺激＋ＩＬ－２１処理群では、むしろＫｌｆ４遺伝子の発現がさらに増加することを確認することができた（図１Ｂ）。これは、活性化因子であるＩＬ－２１にＣＤ８ Ｔ細胞が反応してＫｌｆ４遺伝子の発現がさらに高くなったものであって、Ｋｌｆ４が疲弊状態でＣＤ８ Ｔ細胞の活性化と関連した要素であるということを推測可能にする。
このために、具体的に、本発明者らは、ＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）－ペプチド特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＯＴ－Ｉ形質転換マウスのＣＤ８ Ｔ細胞を分離して５日間繰り返してＯＶＡペプチドを処理する実験を行った。あらゆる実験セットでは、ＣＤ８ Ｔ細胞の生存度を高めるために、ＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ－７（５ｎｇ／ｍｌ）を処理した。ＯＶＡペプチド（１０ｎｇ／ｍｌ）を処理し、その翌日、洗浄後、再びサイトカイン及びＯＶＡペプチドを同一組成で処理する方式で５日間繰り返して刺激を加えた（反復的刺激処理群）。この際、対照群としてＯＶＡペプチドを処理せず、サイトカインのみ処理したグループとＯＶＡペプチド（１０ｎｇ／ｍｌ）を２日間処理し、洗浄した後、サイトカインのみ処理して休止させる単一刺激処理群を追加した。また、ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化を助ける因子として知られたＩＬ－２１を処理したセットも追加した（反復刺激＋ＩＬ－２１処理群）（図１Ａ）。５日が過ぎた時点で生きているＣＤ８ Ｔ細胞を細胞分離器（ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）を用いて分離した後、ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した後、多様な遺伝子の発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲを通じて確認した。その結果、疲弊状態を模倣した反復刺激処理群で疲弊現象の代表的マーカーであるＴｏｘ遺伝子の発現が増加し、ＩＬ－２１を処理した反復刺激＋ＩＬ－２１処理群では、Ｔｏｘ遺伝子の発現が再び減少することを確認した。このような状況でＫｌｆ４の発現態様を確認した結果、反復刺激処理群でＫｌｆ４遺伝子の発現が増加し、Ｔｏｘとは異なって、反復刺激＋ＩＬ－２１処理群では、むしろＫｌｆ４遺伝子の発現がさらに増加することを確認することができた（図１Ｂ）。これは、活性化因子であるＩＬ－２１にＣＤ８ Ｔ細胞が反応してＫｌｆ４遺伝子の発現がさらに高くなったものであって、Ｋｌｆ４が疲弊状態でＣＤ８ Ｔ細胞の活性化と関連した要素であるということを推測可能にする。
【0062】
１－２：疲弊模倣の生体内実験
前記実施例１－１の細胞実験での結果が動物実験でも再現されるかを確認するために、本発明者らは、疲弊模倣を実験動物を用いて生体内条件で行った。
前記実施例１－１の細胞実験での結果が動物実験でも再現されるかを確認するために、本発明者らは、疲弊模倣を実験動物を用いて生体内条件で行った。
【0063】
具体的に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＭＣ３８癌細胞（３ｘ１０５）を接種した後、１８日目に脾臓及び腫瘍組織を摘出した。一方、前記動物実験は、大韓民国のソウル大学動物実験倫理委員会の規定によって行われた。脾臓では、ＣＤ４４の発現が低いＣＤ４４ｌｏｗ未接触（Ｎａ△ｖｅ）ＣＤ８ Ｔ細胞と抗原刺激を受けてＣＤ４４の発現が高いＣＤ４４ｈｉｇｈエフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）ＣＤ８ Ｔ細胞とを細胞分離器を用いて分離した。腫瘍組織では、既存の研究から知られた情報に基づいて、慢性線条細胞（ｃｈｒｏｎｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）として知られたＬｙ１０８＋ＣＤ８ Ｔ細胞、慢性エフェクター細胞（ｃｈｒｏｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）として知られたＬｙ１０８－ＣＤ６９－Ｔｉｍ３＋ＣＤ８ Ｔ細胞、そして、最終疲弊状態のＣＤ８ Ｔ細胞として知られたＬｙ１０８－ＣＤ６９＋Ｔｉｍ３＋ＣＤ８ Ｔ細胞を細胞分離器を用いて分離した（図１Ｃ）。このように分離された５グループの細胞のＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した後、多様な遺伝子の発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲを通じて確認した。
【0064】
その結果、Ｋｌｆ４の場合、腫瘍組織に存在する疲弊状態のＣＤ８ Ｔ細胞（慢性前駆細胞、慢性エフェクター細胞及び最終疲弊状態細胞）で未接触ＣＤ８ Ｔ細胞に比べて、全般的にいずれも発現量が高いことを確認することができたが、特に、慢性エフェクター細胞として知られたＬｙ１０８－ＣＤ６９－Ｔｉｍ３＋ＣＤ８ Ｔ細胞でＫｌｆ４遺伝子の発現が最も高いということを確認することができた（図１Ｄ）。以上を通じて、試験管内の条件だけではなく、生体内条件いずれもで疲弊状態で活性度が高いＣＤ８ Ｔ細胞がさらに高いＫｌｆ４遺伝子発現レベルを示すことを確認することができた。
【0065】
実施例２：遺伝子形質導入を通じたＫｌｆ４過発現ＣＤ８ Ｔ細胞の製造
本発明者らは、前記実施例１の結果から疲弊状態でＫｌｆ４の遺伝子発現が高くなるが、疲弊状態でそれさえも抗ガン活性を保持しているエフェクター細胞でＫｌｆ４の発現がさらに高いという点に着眼して、Ｋｌｆ４がエフェクター細胞の発生及び機能を促進させることができるという仮説を樹立した。
本発明者らは、前記実施例１の結果から疲弊状態でＫｌｆ４の遺伝子発現が高くなるが、疲弊状態でそれさえも抗ガン活性を保持しているエフェクター細胞でＫｌｆ４の発現がさらに高いという点に着眼して、Ｋｌｆ４がエフェクター細胞の発生及び機能を促進させることができるという仮説を樹立した。
【0066】
これにより、本発明者らは、前記仮説が正しいかを確認するために、ＣＤ８ Ｔ細胞でＫｌｆ４の発現を人為的に増加させる場合、エフェクター細胞の発生が促進されるかの有無、及び抗原に対する慢性刺激によって発生する疲弊現象が抑制され、エフェクター細胞としての機能が促進されるかの有無を確認しようとした。
【0067】
このために、まず、本発明者らは、分離されたＣＤ８ Ｔ細胞にＫｌｆ４遺伝子を形質導入させてＫｌｆ４遺伝子を過発現させる実験を行った。
【0068】
具体的に、ＣＤ８ Ｔ細胞に２４時間抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体及びｍＩＬ－２を処理した後、ＣＤ８ Ｔ細胞にレトロウイルスを用いて対照群であるＭｉｇＲＩベクター、実験群としては、ＭｉｇＲＩベクターにＫｌｆ４が挿入されたベクター（以下、「Ｋｌｆ４」と略称する）を過発現させた。レトロウイルスを利用した形質導入は、前述した一般的方法を用いて行った。以後、３日間ｍＩＬ－７及びｍＩＬ－１５を処理して休止状態のＣＤ８ Ｔ細胞を誘導し、ＭｉｇＲＩベクターでは、基本的にＧＦＰを発現するために、過発現された細胞は、ＧＦＰ＋であることを用いてＦＡＣＳ分析を行った。形質転換されていない対照群であるＭｉｇＲＩ ＧＦＰ－、ＭｉｇＲＩ ＧＦＰ＋、Ｋｌｆ４ ＧＦＰ－のＫｌｆ４が過発現されていない細胞に比べて、Ｋｌｆ４ ＧＦＰ＋ＣＤ８ Ｔ細胞の場合、前述した慢性エフェクター細胞（Ｌｙ１０８－ＣＤ６９－）サブセットが大きく増加することを確認することができた（図２Ａ）。これを通じて、Ｋｌｆ４の過発現が慢性エフェクター細胞セブンセットの発生に重要な要素であるということが分かった。
【0069】
次いで、Ｋｌｆ４過発現がエフェクター細胞の機能を促進させるかを確認するために、ｇｐ１００抗原を特異的に認識するＴ細胞受容体を有するＰｍｅｌＩマウス由来のＣＤ８ Ｔ細胞を分離し、前記の方法で対照群（ＭｉｇＲＩ）及びＫｌｆ４遺伝子を過発現させた後、ｇｐ１００抗原を過発現している標的癌細胞（ＭＣ３８－ｇｐ１００）と６時間共に培養して死んだ標的癌細胞の比率を測定した。その結果、対照群（ＭｉｇＲＩ）に比べてＫｌｆ４遺伝子を過発現させたＰｍｅｌＩ由来ＣＤ８ Ｔ細胞と共に培養した場合、死んだターゲット癌細胞の比率が増加することを通じて、Ｋｌｆ４過発現ＣＤ８ Ｔ細胞がさらに効果的に癌細胞を殺害することができるということが分かった（図２Ｂ）。
【0070】
それだけではなく、直接的な疲弊状態でＫｌｆ４過発現が慢性エフェクター細胞の機能を促進させるかを確認するために、実施例１－１で行った試験管内疲弊モデルを応用した。ＯＶＡペプチドを処理し、２４時間が経過した時点でＣＤ８ Ｔ細胞にレトロウイルスを用いて対照群であるＭｉｇＲＩベクター、Ｋｌｆ４ベクターを過発現させた。以後、残りの４日間繰り返してＯＶＡペプチドを処理してｉｎ ｖｉｔｒｏ疲弊状態を誘導し、ＭｉｇＲＩ ＧＦＰ＋及びＫｌｆ４ ＧＦＰ＋ＣＤ８ Ｔ細胞を細胞分離器を用いて分離した後、遺伝子発現を表１に記載されたプライマー対を利用したｑＲＴ－ＰＣＲを通じて分析した。その結果、Ｋｌｆ４過発現ＣＤ８ Ｔ細胞は、Ｋｌｆ４遺伝子発現がＭｉｇＲＩベクター対照群に比べて非常に高いことを確認し、同時に疲弊状態のマーカーであるＴｏｘ遺伝子発現は、逆に非常に減少したことを確認することができた（図２Ｃ）。また、ＦＡＣＳ分析を通じて、これらのＣＤ８ Ｔ細胞から分泌されるグランザイムＢ及びインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）の量を測定したが、Ｋｌｆ４が過発現されたＣＤ８ Ｔ細胞で有意味にサイトカイン分泌量が増加したことを確認することができた（図２Ｄ及び図２Ｅ）。以上を通じて、さらに高いＫｌｆ４遺伝子の発現レベルが慢性エフェクター細胞（Ｌｙ１０８－ＣＤ６９－）の形成を促進し，ターゲット癌細胞を殺害する能力を促進させ、疲弊状態のＣＤ８ Ｔ細胞でこれ以上の疲弊現象を抑制し，活性サイトカインのさらに多くの分泌を促進するということを確認することができた。
【0071】
【表1】
【0072】
実施例３：動物実験を通じた疲弊状態の抑制分析
３－１：Ｋｌｆ４遺伝子形質導入を通じた動物実験
前記結果から、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏ状況でもＣＤ８ Ｔ細胞でのＫｌｆ４過発現が細胞活性を増加させて、癌の発生を抑制することができるかをマウス腫瘍モデルを使用して確認した。このために、具体的に、Ｔ細胞が存在しないＲａｇ２ ＫＯマウスにｇｐ１００を発現するＭＣ３８癌細胞（ＭＣ３８－ｇｐ１００）を３ｘ１０５個接種し、一日後、ＭｉｇＲＩ及びｇｐ１００－特異的ＴＣＲを発現するように形質転換されたＰｍｅｌＩ形質転換マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、国立癌センターから分譲を受ける）由来のＣＤ８ Ｔ細胞を前記発現ベクターに形質転換させて、Ｋｌｆ４が過発現されるように形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞１ｘ１０６個を静脈内注射を通じて投与した。癌細胞を接種し、１５日目になる日まで腫瘍体積をチェックし、１５日目のマウスを犠牲にさせて実験に利用した（図３Ａ）。マウスの分析に先立って、ＭｉｇＲＩ及びＫｌｆ４を過発現させたＣＤ８ Ｔ細胞でＫｌｆ４遺伝子の発現レベルを確認した結果、Ｋｌｆ４遺伝子が成功的に過発現されたということを確認することができた（図３Ｂ）。Ｋｌｆ４を過発現させたＣＤ８ Ｔ細胞が投与されたマウスの場合、ＭｉｇＲＩのみ利用した対照群に比べて癌の発生が著しく減ることを確認することができた（図３Ｃ）。また、腫瘍組織内に存在する浸潤性ＣＤ８ Ｔ細胞サブセットで細胞分裂の尺度で表われるＫｉ－６７の発現程度をＦＡＣＳで分析した結果、対照群（ＭｉｇＲＩ）に比べてＫｌｆ４が過発現されたＣＤ８ Ｔ細胞サブセット、特に、慢性エフェクター細胞での増殖が効率的に行われているということが分かった（図３Ｄ）。それだけではなく、グランザイムＢ、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αのような活性サイトカインがいずれも増加していることを確認することができた（図３Ｅ及び図３Ｆ）。以上を通じて、Ｋｌｆ４を過発現させたＣＤ８ Ｔ細胞が遥かに優れた抗ガン免疫反応を示すということを確認することができた。
３－１：Ｋｌｆ４遺伝子形質導入を通じた動物実験
前記結果から、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏ状況でもＣＤ８ Ｔ細胞でのＫｌｆ４過発現が細胞活性を増加させて、癌の発生を抑制することができるかをマウス腫瘍モデルを使用して確認した。このために、具体的に、Ｔ細胞が存在しないＲａｇ２ ＫＯマウスにｇｐ１００を発現するＭＣ３８癌細胞（ＭＣ３８－ｇｐ１００）を３ｘ１０５個接種し、一日後、ＭｉｇＲＩ及びｇｐ１００－特異的ＴＣＲを発現するように形質転換されたＰｍｅｌＩ形質転換マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、国立癌センターから分譲を受ける）由来のＣＤ８ Ｔ細胞を前記発現ベクターに形質転換させて、Ｋｌｆ４が過発現されるように形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞１ｘ１０６個を静脈内注射を通じて投与した。癌細胞を接種し、１５日目になる日まで腫瘍体積をチェックし、１５日目のマウスを犠牲にさせて実験に利用した（図３Ａ）。マウスの分析に先立って、ＭｉｇＲＩ及びＫｌｆ４を過発現させたＣＤ８ Ｔ細胞でＫｌｆ４遺伝子の発現レベルを確認した結果、Ｋｌｆ４遺伝子が成功的に過発現されたということを確認することができた（図３Ｂ）。Ｋｌｆ４を過発現させたＣＤ８ Ｔ細胞が投与されたマウスの場合、ＭｉｇＲＩのみ利用した対照群に比べて癌の発生が著しく減ることを確認することができた（図３Ｃ）。また、腫瘍組織内に存在する浸潤性ＣＤ８ Ｔ細胞サブセットで細胞分裂の尺度で表われるＫｉ－６７の発現程度をＦＡＣＳで分析した結果、対照群（ＭｉｇＲＩ）に比べてＫｌｆ４が過発現されたＣＤ８ Ｔ細胞サブセット、特に、慢性エフェクター細胞での増殖が効率的に行われているということが分かった（図３Ｄ）。それだけではなく、グランザイムＢ、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αのような活性サイトカインがいずれも増加していることを確認することができた（図３Ｅ及び図３Ｆ）。以上を通じて、Ｋｌｆ４を過発現させたＣＤ８ Ｔ細胞が遥かに優れた抗ガン免疫反応を示すということを確認することができた。
【0073】
３－２：Ｋｌｆ４誘導剤を利用した疲弊状態の抑制分析
前記実施例３－１の結果から、本発明者らは、Ｋｌｆ４遺伝子形質導入の代わりに、Ｋｌｆ４を過発現させることができる薬物を利用するならば、前述したように、Ｋｌｆ４遺伝子発現の増加による抗ガン効果を確認することができると思い、既存の研究を通じてＫｌｆ４の誘導剤として知られたＡＰＴＯ－２５３を用いて動物実験を行った。このために、具体的に、リンパ球が欠けているＲａｇ２ ＫＯマウスにＭＣ３８癌細胞３ｘ１０５個を注入し、その翌日、ＰＢＳあるいはＡＰＴＯ－２５３が３日間処理されたＣＤ８ Ｔ細胞５ｘ１０５個を静脈内注射を通じて投与した。癌細胞を接種し、１５日目になる日まで腫瘍体積をチェックし、１５日目のマウスを犠牲にさせて実験に利用した（図４Ａ）。マウスの分析に先立って、ＡＰＴＯ－２５３を３日間処理したＣＤ８ Ｔ細胞でＫｌｆ４遺伝子発現レベルを確認した結果、ＡＰＴＯ－２５３を処理したＣＤ８ Ｔ細胞の場合、ＰＢＳを処理したＣＤ８ Ｔ細胞に比べて、Ｋｌｆ４遺伝子発現レベルが増加したことを確認することができた（図４Ｂ）。また、ＡＰＴＯ－２５３を処理したＣＤ８ Ｔ細胞を投与したマウスの場合、ＰＢＳを処理したＣＤ８ Ｔ細胞を導入したマウスに比べて、癌の成長が抑制されることを確認することができた（図４Ｃ）。以上を通じて、Ｋｌｆ４遺伝子形質導入以外にもＫｌｆ４誘導剤であるＡＰＴＯ－２５３を通じたＣＤ８ Ｔ細胞のＫｌｆ４遺伝子発現の増加も、ＣＤ８ Ｔ細胞の抗ガン免疫反応を強化させるということを確認することができた。
前記実施例３－１の結果から、本発明者らは、Ｋｌｆ４遺伝子形質導入の代わりに、Ｋｌｆ４を過発現させることができる薬物を利用するならば、前述したように、Ｋｌｆ４遺伝子発現の増加による抗ガン効果を確認することができると思い、既存の研究を通じてＫｌｆ４の誘導剤として知られたＡＰＴＯ－２５３を用いて動物実験を行った。このために、具体的に、リンパ球が欠けているＲａｇ２ ＫＯマウスにＭＣ３８癌細胞３ｘ１０５個を注入し、その翌日、ＰＢＳあるいはＡＰＴＯ－２５３が３日間処理されたＣＤ８ Ｔ細胞５ｘ１０５個を静脈内注射を通じて投与した。癌細胞を接種し、１５日目になる日まで腫瘍体積をチェックし、１５日目のマウスを犠牲にさせて実験に利用した（図４Ａ）。マウスの分析に先立って、ＡＰＴＯ－２５３を３日間処理したＣＤ８ Ｔ細胞でＫｌｆ４遺伝子発現レベルを確認した結果、ＡＰＴＯ－２５３を処理したＣＤ８ Ｔ細胞の場合、ＰＢＳを処理したＣＤ８ Ｔ細胞に比べて、Ｋｌｆ４遺伝子発現レベルが増加したことを確認することができた（図４Ｂ）。また、ＡＰＴＯ－２５３を処理したＣＤ８ Ｔ細胞を投与したマウスの場合、ＰＢＳを処理したＣＤ８ Ｔ細胞を導入したマウスに比べて、癌の成長が抑制されることを確認することができた（図４Ｃ）。以上を通じて、Ｋｌｆ４遺伝子形質導入以外にもＫｌｆ４誘導剤であるＡＰＴＯ－２５３を通じたＣＤ８ Ｔ細胞のＫｌｆ４遺伝子発現の増加も、ＣＤ８ Ｔ細胞の抗ガン免疫反応を強化させるということを確認することができた。
【0074】
これは、本発明の一実施例によって、遺伝子形質導入または薬物処理によってＫｌｆ４遺伝子が過発現されたＣＤ８ Ｔ細胞が体内で反復的な抗原刺激によって誘発される免疫疲弊効果を抑制することにより、先天性免疫反応を通じて癌細胞を効果的に死滅させることができるということを立証する結果である。
【0075】
実施例４：発現が誘導されたＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞の製造
４－１：ＥｐＣＡＭ－結合ＣＡＲコンストラクトの構築
例示的なＣＡＲ構築物を示す概要図が図５に提供される。ＣＡＲコンストラクトは、下記のような方法を通じて生成される。抗ＥｐＣＡＭ ｓｃＦｖ（配列番号：１１）、ＣＤ８αヒンジ（配列番号：１２）、ＣＤ２８ ＴＭ（配列番号：１３）、ＣＤ２８ ＩＣＤ（配列番号：１４）及びＣＤ３ζ ＩＣＤ（配列番号：１５）を順次に含むＣＡＲコンストラクト（ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、図５）のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を暗号化するｃＤＮＡに対する核酸配列は、標準技術によって合成され、ＰＣＲで増幅され、ｐＲＲＬ－ＳＩＮ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ－ＷＰＲＥ（Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３－８４７１，１９９８）またはｐＥＬＮＳ（Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６：３３６０－３３６５，２００９）に基づいた３世代自己不活性化レンチウイルスベクターである、ｐＣＬＰＳ（Ｐａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｕｕｎｏｌ．，１７１：１６６－１７４，２００３）に連結される。但し、本発明で使われたベクターは、外来遺伝子発現のためのプロモーターであって、ＣＭＶをＥＦ－１αに置き換えた点でｐＣＬＰＳと異なる。暗号化されたＣＡＲは、ＥｐＣＡＭ（配列番号：１１）に結合するためのｓｃＦｖを含む。
４－１：ＥｐＣＡＭ－結合ＣＡＲコンストラクトの構築
例示的なＣＡＲ構築物を示す概要図が図５に提供される。ＣＡＲコンストラクトは、下記のような方法を通じて生成される。抗ＥｐＣＡＭ ｓｃＦｖ（配列番号：１１）、ＣＤ８αヒンジ（配列番号：１２）、ＣＤ２８ ＴＭ（配列番号：１３）、ＣＤ２８ ＩＣＤ（配列番号：１４）及びＣＤ３ζ ＩＣＤ（配列番号：１５）を順次に含むＣＡＲコンストラクト（ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、図５）のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を暗号化するｃＤＮＡに対する核酸配列は、標準技術によって合成され、ＰＣＲで増幅され、ｐＲＲＬ－ＳＩＮ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ－ＷＰＲＥ（Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３－８４７１，１９９８）またはｐＥＬＮＳ（Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６：３３６０－３３６５，２００９）に基づいた３世代自己不活性化レンチウイルスベクターである、ｐＣＬＰＳ（Ｐａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｕｕｎｏｌ．，１７１：１６６－１７４，２００３）に連結される。但し、本発明で使われたベクターは、外来遺伝子発現のためのプロモーターであって、ＣＭＶをＥＦ－１αに置き換えた点でｐＣＬＰＳと異なる。暗号化されたＣＡＲは、ＥｐＣＡＭ（配列番号：１１）に結合するためのｓｃＦｖを含む。
【0076】
４－２：抗Ｔｒｏｐ－２ ＣＡＲコンストラクトの構築
抗Ｔｒｏｐ－２ ｓｃＦｖ（配列番号：１６）、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ２８及びＣＤ３ζ ＩＣＤが順次に連結されたＣＡＲ（抗Ｔｒｏｐ－２－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、図５）を発現するためのレンチウイルスベクターは、ａｎｔｉ－ＥｐＣＡＭ－ｓｃＦｖをエンコーディングするヌクレオチド配列がａｎｔｉ－Ｔｒｏｐ－２ ｓｃＦｖの核酸配列に置き換えるという点を除いては、実施例４－１から製造された方法と同様に製造される。
抗Ｔｒｏｐ－２ ｓｃＦｖ（配列番号：１６）、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ２８及びＣＤ３ζ ＩＣＤが順次に連結されたＣＡＲ（抗Ｔｒｏｐ－２－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、図５）を発現するためのレンチウイルスベクターは、ａｎｔｉ－ＥｐＣＡＭ－ｓｃＦｖをエンコーディングするヌクレオチド配列がａｎｔｉ－Ｔｒｏｐ－２ ｓｃＦｖの核酸配列に置き換えるという点を除いては、実施例４－１から製造された方法と同様に製造される。
【0077】
４－３：抗ＣＥＡＣＡＭ６ ＣＡＲコンストラクトの構築
抗ＣＥＡＣＡＭ６ ｓｃＦｖ（配列番号：１７）、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ２８ ＴＭ、及びＣＤ３ζ ＩＣＤが順次に連結されたＣＡＲ（抗ＣＥＡＣＭ６－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、図５）を発現するためのレンチウイルスベクターは、ａｎｔｉ－ＥｐＣＡＭ－ｓｃＦｖをエンコーディングするヌクレオチド配列がａｎｔｉ－ＣＥＡＣＡＭ６ ｓｃＦｖの核酸配列に置き換えるという点を除いては、実施例４－１から製造された方法と同様に製造される。
抗ＣＥＡＣＡＭ６ ｓｃＦｖ（配列番号：１７）、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ２８ ＴＭ、及びＣＤ３ζ ＩＣＤが順次に連結されたＣＡＲ（抗ＣＥＡＣＭ６－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、図５）を発現するためのレンチウイルスベクターは、ａｎｔｉ－ＥｐＣＡＭ－ｓｃＦｖをエンコーディングするヌクレオチド配列がａｎｔｉ－ＣＥＡＣＡＭ６ ｓｃＦｖの核酸配列に置き換えるという点を除いては、実施例４－１から製造された方法と同様に製造される。
【0078】
４－４：抗ＣＥＡＣＡＭ５ ＣＡＲコンストラクトの構築
抗ＣＥＡＣＡＭ５ ｓｃＦｖ（配列番号：１８）、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ２８ ＴＭ、及びＣＤ３ζ ＩＣＤが順次に連結されたＣＡＲ（抗ＣＥＡＣＡＭ５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、図５）を発現するためのレンチウイルスベクターは、ａｎｔｉ－ＥｐＣＡＭ－ｓｃＦｖをエンコーディングするヌクレオチド配列がａｎｔｉ－ＣＥＡＣＡＭ５ ｓｃＦｖの核酸配列に置き換えるという点を除いては、実施例４－１から製造された方法と同様に製造される。
抗ＣＥＡＣＡＭ５ ｓｃＦｖ（配列番号：１８）、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ２８ ＴＭ、及びＣＤ３ζ ＩＣＤが順次に連結されたＣＡＲ（抗ＣＥＡＣＡＭ５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、図５）を発現するためのレンチウイルスベクターは、ａｎｔｉ－ＥｐＣＡＭ－ｓｃＦｖをエンコーディングするヌクレオチド配列がａｎｔｉ－ＣＥＡＣＡＭ５ ｓｃＦｖの核酸配列に置き換えるという点を除いては、実施例４－１から製造された方法と同様に製造される。
【0079】
実施例５：ＣＡＲ構築物を含むレンチウイルス粒子の生産
前記実施例に記載のように、作製された高力価、複製－欠陥レンチウイルスベクターは、Ｐａｒｒｙなど（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７１：１６６－１７４，２００３）に記載の方法によって製造になる。簡単に言えば、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）は、ＲＰＭＩ １６４０、１０％熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭ グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン及び１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン硫酸塩で培養される。細胞は、７μｇのｐＭＤＧ．１（ＶＳＶ－Ｇ外皮）、１８μｇのｐＲＳＶ．ｒｅｖ（ＨＩＶ－１ Ｒｅｖ暗号化プラスミド）、１８μｇのｐＭＤＬｇで形質感染させる２４時間前にＴ １５０組織培養フラスコ当たり５ｘ１０６ｃｅｌｌｓで播種される。ｐ．ＲＲＥ（パッケージングプラスミド）及びＦｕｇｅｎｅ ６（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して形質導入されるレンチウイルスベクター１５μｇを処理する。培地は、形質感染６時間後、置き換えられ、ウイルス上澄み液は、形質感染後、２４時間及び４８時間に収獲される。ウイルス粒子は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ２８ローターを使用して２８，０００ｒｐｍで３時間超遠心分離によって１０倍濃縮される。
前記実施例に記載のように、作製された高力価、複製－欠陥レンチウイルスベクターは、Ｐａｒｒｙなど（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７１：１６６－１７４，２００３）に記載の方法によって製造になる。簡単に言えば、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）は、ＲＰＭＩ １６４０、１０％熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭ グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン及び１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン硫酸塩で培養される。細胞は、７μｇのｐＭＤＧ．１（ＶＳＶ－Ｇ外皮）、１８μｇのｐＲＳＶ．ｒｅｖ（ＨＩＶ－１ Ｒｅｖ暗号化プラスミド）、１８μｇのｐＭＤＬｇで形質感染させる２４時間前にＴ １５０組織培養フラスコ当たり５ｘ１０６ｃｅｌｌｓで播種される。ｐ．ＲＲＥ（パッケージングプラスミド）及びＦｕｇｅｎｅ ６（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して形質導入されるレンチウイルスベクター１５μｇを処理する。培地は、形質感染６時間後、置き換えられ、ウイルス上澄み液は、形質感染後、２４時間及び４８時間に収獲される。ウイルス粒子は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ２８ローターを使用して２８，０００ｒｐｍで３時間超遠心分離によって１０倍濃縮される。
【0080】
実施例６：ＣＡＲレンチウイルスを使用したＴ細胞の形質導入
特定の目的のために、正常個体のＴ細胞は、構成体テスト及び設計のために対象ＣＡＲ構成体と共に使われる。初度培養ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐキット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した陰性選択によって白血球成分の採集後、元気な志願者、寄贈者または癌患者のＰＢＭＣから分離される。Ｔ細胞は、完全培地（１０％熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭ グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン硫酸塩及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳが補充されたＲＰＭＩ １６４０）で培養され、単クローン抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体がコーティングされたビーズを１２～２４時間処理し、ＭＯＩ（感染多重度）５～１０で形質導入対象レンチウイルスベクターに形質導入する。ヒト組換えＩＬ－２を隔日で５０Ｕ／ｍＬの最終濃度及び０．５～１．０ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度を保持させる。Ｋｌｆ４コンストラクトを利用した形質導入は、ＣＡＲコンストラクト内にＫｌｆ４を暗号化するポリヌクレオチドが含まれて形質導入されるか、別途のＣＡＲコンストラクトの形質導入と共に行われるか、または順次に行われる。
特定の目的のために、正常個体のＴ細胞は、構成体テスト及び設計のために対象ＣＡＲ構成体と共に使われる。初度培養ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐキット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した陰性選択によって白血球成分の採集後、元気な志願者、寄贈者または癌患者のＰＢＭＣから分離される。Ｔ細胞は、完全培地（１０％熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭ グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン硫酸塩及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳが補充されたＲＰＭＩ １６４０）で培養され、単クローン抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体がコーティングされたビーズを１２～２４時間処理し、ＭＯＩ（感染多重度）５～１０で形質導入対象レンチウイルスベクターに形質導入する。ヒト組換えＩＬ－２を隔日で５０Ｕ／ｍＬの最終濃度及び０．５～１．０ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度を保持させる。Ｋｌｆ４コンストラクトを利用した形質導入は、ＣＡＲコンストラクト内にＫｌｆ４を暗号化するポリヌクレオチドが含まれて形質導入されるか、別途のＣＡＲコンストラクトの形質導入と共に行われるか、または順次に行われる。
【0081】
実施例７：癌患者からの自家ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成及び評価
癌患者から自家ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成有無は、Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓなど（Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５：１７７ｒａ３８，２０１３）の方法によって調査される。簡単に言えば、ＰＢＭＣは、白血球成分採集術によって癌患者から収得され、洗浄され、冷凍保存される。Ｔ細胞は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８マグネチックビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に活性化され、対象レンチウイルスベクターに形質導入された解凍された白血球成分採集集団から分離される。形質導入されたＴ細胞は、要求される形質導入Ｔ細胞容量を果たすために、ＷＡＶＥ生物反応器でさらに増殖される。
癌患者から自家ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成有無は、Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓなど（Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５：１７７ｒａ３８，２０１３）の方法によって調査される。簡単に言えば、ＰＢＭＣは、白血球成分採集術によって癌患者から収得され、洗浄され、冷凍保存される。Ｔ細胞は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８マグネチックビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に活性化され、対象レンチウイルスベクターに形質導入された解凍された白血球成分採集集団から分離される。形質導入されたＴ細胞は、要求される形質導入Ｔ細胞容量を果たすために、ＷＡＶＥ生物反応器でさらに増殖される。
【0082】
本発明は、前述した実施例を参考にして説明されたが、これは例示的なものに過ぎず、当業者ならば、これより多様な変形及び均等な他実施例が可能であるという点を理解できるであろう。したがって、本発明の真の技術的保護範囲は、特許請求の範囲の技術的思想によって決定されねばならない。
［産業上の利用可能性］
本発明の一実施例による方法及び物質は、医薬、特に、抗ガン剤の製造に活用される。
［産業上の利用可能性］
本発明の一実施例による方法及び物質は、医薬、特に、抗ガン剤の製造に活用される。
【図面の簡単な説明】
【0083】
【図1A】本発明の一実施例によるＣＤ８ Ｔ細胞に対する抗原の反復刺激試験の設計を概略的に示す概要図である。
【図1B】前記図１Ａの実験設計によって行われた実験結果であって、抗原の刺激程度によるＣＤ８ Ｔ細胞の疲弊状態に関するマーカーであるＴｏｘ（左側）及びＫｌｆ４（右側）のｍＲＮＡレベルでの発現程度を測定した結果を示す一連のグラフである。
【図1C】マウスにＭＣ３８大腸癌細胞を注入して誘発された癌組織及び脾臓に存在する多様な段階のＣＤ８ Ｔ細胞サブセットに対するマーカー表現型を示す概要図である。
【図1D】これらのＣＤ８ Ｔ細胞の各サブセットのＫｌｆ４タンパク質発現程度をｍＲＮＡレベルで測定した結果を示すグラフである。
【図2A】本発明の一実施例によって、対照群レトロウイルスベクター（ＭｉｇＲＩ）に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞またはＫｌｆ４遺伝子を含むレトロウイルスベクター（Ｋｌｆ４）に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞の特性を分析したものであって、対照群（ＭｉｇＲＩ）とＫｌｆ４の本発明の一観点によれば、個体から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞、前記ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団、または前記ＣＤ８ Ｔ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を暗号化する遺伝子を形質導入したＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞でＫｌｆ４タンパク質の過発現を誘導する段階を含む試験管内の条件での前記ＣＤ８ Ｔ細胞の疲弊状態の抑制方法が提供される。図２Ａは、電子によって形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞を前述したサブセットのマーカーを用いてＦＡＣＳ分析で分析した結果を示すものである。
【図2B】本発明の一実施例によって、対照群レトロウイルスベクター（ＭｉｇＲＩ）に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞またはＫｌｆ４遺伝子を含むレトロウイルスベクター（Ｋｌｆ４）に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞の特性を分析したものであって、対照群（ＭｉｇＲＩ）とＫｌｆ４の本発明の一観点によれば、個体から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞、前記ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団、または前記ＣＤ８ Ｔ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を暗号化する遺伝子を形質導入したＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞でＫｌｆ４タンパク質の過発現を誘導する段階を含む試験管内の条件での前記ＣＤ８ Ｔ細胞の疲弊状態の抑制方法が提供される。図２Ｂは、対照群（ＭｉｇＲＩ）とＫｌｆ４遺伝子に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞とターゲット癌細胞とを共に培養した時、死んでいる癌細胞の比率をＦＡＣＳ分析を通じて分析した結果に係わるグラフである。
【図2C】本発明の一実施例によって、対照群レトロウイルスベクター（ＭｉｇＲＩ）に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞またはＫｌｆ４遺伝子を含むレトロウイルスベクター（Ｋｌｆ４）に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞の特性を分析したものであって、対照群（ＭｉｇＲＩ）とＫｌｆ４の本発明の一観点によれば、個体から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞、前記ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団、または前記ＣＤ８ Ｔ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を暗号化する遺伝子を形質導入したＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞でＫｌｆ４タンパク質の過発現を誘導する段階を含む試験管内の条件での前記ＣＤ８ Ｔ細胞の疲弊状態の抑制方法が提供される。図２Ｃは、対照群（ＭｉｇＲＩ）とＫｌｆ４遺伝子に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞でのＫｌｆ４（左側）及びＴｏｘ（右側）の遺伝子発現レベルをｍＲＮＡレベルで測定した結果を示すグラフである。
【図2D】本発明の一実施例によって、対照群レトロウイルスベクター（ＭｉｇＲＩ）に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞またはＫｌｆ４遺伝子を含むレトロウイルスベクター（Ｋｌｆ４）に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞の特性を分析したものであって、対照群（ＭｉｇＲＩ）とＫｌｆ４の本発明の一観点によれば、個体から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞、前記ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団、または前記ＣＤ８ Ｔ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を暗号化する遺伝子を形質導入したＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞でＫｌｆ４タンパク質の過発現を誘導する段階を含む試験管内の条件での前記ＣＤ８ Ｔ細胞の疲弊状態の抑制方法が提供される。図２Ｄは、対照群（ＭｉｇＲＩ）及びＫｌｆ４遺伝子に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞（Ｋｌｆ４）でのグランザイムＢの発現程度をＦＡＣＳ分析で分析して、各細胞（ＭｉｇＲＩ ＧＦＰ－、ＭｉｇＲＩ ＧＦＰ＋、Ｋｌｆ４ ＧＦＰ－、Ｋｌｆ４ ＧＦＰ＋）でＣＤ８ Ｔ細胞の標的細胞殺害機能に核心的なグランザイムＢを発現する細胞の比率を測定した結果に係わるグラフ（左側）及び２次元ヒストグラム（右側）を示す。
【図2E】本発明の一実施例によって、対照群レトロウイルスベクター（ＭｉｇＲＩ）に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞またはＫｌｆ４遺伝子を含むレトロウイルスベクター（Ｋｌｆ４）に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞の特性を分析したものであって、対照群（ＭｉｇＲＩ）とＫｌｆ４の本発明の一観点によれば、個体から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞、前記ＣＤ８ Ｔ細胞を含む細胞集団、または前記ＣＤ８ Ｔ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を暗号化する遺伝子を形質導入したＣＡＲ－ＣＤ８ Ｔ細胞でＫｌｆ４タンパク質の過発現を誘導する段階を含む試験管内の条件での前記ＣＤ８ Ｔ細胞の疲弊状態の抑制方法が提供される。図２Ｅは、対照群（ＭｉｇＲＩ）及びＫｌｆ４遺伝子に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞の機能に核心的なＩＦＮ－γの発現程度をＦＡＣＳ分析で分析して、各細胞（ＭｉｇＲＩ ＧＦＰ－、ＭｉｇＲＩ ＧＦＰ＋、Ｋｌｆ４ ＧＦＰ－、Ｋｌｆ４ ＧＦＰ＋）でＩＦＮ－γを発現する細胞の比率を測定した結果に係わるグラフ（左側）及び２次元ヒストグラム（右側）を示す。
【図3A】本発明の一実施例によって、Ｋｌｆ４遺伝子が形質導入されたＣＤ８ Ｔ細胞を利用した動物実験の投与スケジュールを概略的に示す概要図である。
【図3B】対照群とＫｌｆ４遺伝子が形質導入されたＣＤ８ Ｔ細胞のＫｌｆ４遺伝子の発現レベルをｍＲＮＡレベルで測定した結果を示すグラフである。
【図3C】対照群（ＭｉｇＲＩ）及び本発明の一実施例によって、Ｋｌｆ４遺伝子が形質導入されたＣＤ８ Ｔ細胞が投与された癌モデル動物での経時的な腫瘍組織の体積の変化を示すグラフである。
【図3D】前記動物実験後、犠牲になった動物の腫瘍組織から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞サブセットで細胞分裂程度を示すＫｉ－６７発現程度をＦＡＣＳ分析で分析したものであって、分離されたＣＤ８ Ｔ細胞のマーカー表現型による全体ＣＤ８ Ｔ細胞のうち、Ｋｉ－６７発現細胞の比率を測定した結果に係わるグラフ（左側）及び２次元ヒストグラム（右側）を示す。
【図3E】前記動物実験後、犠牲になった動物の腫瘍組織から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞のグランザイムＢ発現程度をＦＡＣＳ分析で分析して、分離されたＣＤ８ Ｔ細胞のマーカー表現型による全体ＣＤ８ Ｔ細胞のうち、グランザイムＢ発現細胞の比率を測定した結果に係わるグラフ（左側）及び２次元ヒストグラム（右側）を示す。
【図3F】前記動物実験後、犠牲になった動物の腫瘍組織から分離されたＣＤ８ Ｔ細胞のＴＮＦ－α及びＩＮＦ－γ発現程度をＦＡＣＳ分析で分析して、分離されたＣＤ８ Ｔ細胞のマーカー表現型による全体ＣＤ８ Ｔ細胞のうち、ＴＮＦ－α及びＩＮＦ－γ発現細胞の比率を測定した結果に係わるグラフ（左側）及び２次元ヒストグラム（右側）を示す。
【図4A】本発明の一実施例によって、ＡＰＴＯ－２５３が処理されたＣＤ８ Ｔ細胞を利用した動物実験の投与スケジュールを概略的に示す概要図である。
【図4B】対照群（ＰＢＳ）とＡＰＴＯ－２５３とが処理されたＣＤ８ Ｔ細胞を投与した実験動物でＫｌｆ４遺伝子の発現レベルをｍＲＮＡレベルで測定した結果を示すグラフである。
【図4C】対照群（ＰＢＳ）及び本発明の一実施例によって、ＡＰＴＯ－２５３が処理されたＣＤ８ Ｔ細胞が投与された癌モデル動物での経時的な腫瘍組織の体積の変化を示すグラフである。
【図5】本発明の一実施例による多様なＣＡＲコンストラクト（ＥｐＣＡＭ ＣＡＲ、Ｔｒｏｐ－２ ＣＡＲ、ＣＥＡＣＡＭ６ ＣＡＲ及びＣＥＡＣＡＭ５ ＣＡＲ）の構造を概略的に示す概要図である。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】