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特表2024-514982ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体に基づく生体柔軟性エラストマー腸吻合ステント及び製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-03
(54)【発明の名称】ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体に基づく生体柔軟性エラストマー腸吻合ステント及び製造方法
(51)【国際特許分類】
A61L 31/06 20060101AFI20240327BHJP
A61L 31/14 20060101ALI20240327BHJP
A61L 31/16 20060101ALI20240327BHJP
A61L 31/04 20060101ALI20240327BHJP
【ＦＩ】
A61L31/06
A61L31/14 500
A61L31/16
A61L31/04 120
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023565946
(86)(22)【出願日】2022-04-25
(85)【翻訳文提出日】2023-10-26
(86)【国際出願番号】 CN2022088874
(87)【国際公開番号】W WO2022228357
(87)【国際公開日】2022-11-03
(31)【優先権主張番号】202110487844.3
(32)【優先日】2021-04-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522426722
【氏名又は名称】国科温州研究院（温州生物材料与工程研究所）
(74)【代理人】
【識別番号】110002262
【氏名又は名称】ＴＲＹ国際弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】石 長燦
(72)【発明者】
【氏名】李 徐堅
(72)【発明者】
【氏名】潘 ▲る▼▲ち▼
(72)【発明者】
【氏名】季 志孝
(72)【発明者】
【氏名】楊 嘯
【テーマコード（参考）】
4C081
【Ｆターム（参考）】
4C081AC03
4C081AC05
4C081AC09
4C081BA16
4C081BB07
4C081CA191
4C081CC02
4C081CD022
4C081CE01
4C081DC04
4C081EA02
(57)【要約】
ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体に基づく生体柔軟性エラストマー腸吻合ステント及び製造方法であって、生体適合性のある分解性高分子医療材料であるＰＴＭＣ及びＰＥＧが選択され、エレクトロスピニング法で製造され、当該吻合管のサイズを人体の管腔の大きさに応じて調整して、小腸、大腸に適する吻合器だけでなく、食道、動脈、静脈などの吻合、初期の支持に適する管腔吻合器として設計することができ、本発明で製造される吻合管は管壁が薄く、弾性に優れており、臨床手術で縫合する時に医師が縫合しやすいよう、革新的にも当該吻合管は硬さの高い植物性セルロース管の外部に隙間なく嵌められる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体に基づく生体柔軟性エラストマー腸吻合ステントであって、前記腸吻合ステントは全体としてＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体材料を用いて作製され、前記ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体は高分子医療材料ＰＴＭＣ及びＰＥＧに対して開環重合の方法を用いて合成されるトリブロックＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体であり、前記ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体中のＰＥＧの含有量は１０～２０％であり、前記腸吻合ステントの厚さは０．０５～０．３ｍｍであることを特徴とする生体柔軟性エラストマー腸吻合ステント。
【請求項2】
前記生体柔軟性エラストマー腸吻合ステントのＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体材料にトリクロサン（ｔｒｉｃｌｏｓａｎ、ＴＣＳ）が担持されることを特徴とする請求項１に記載の生体柔軟性エラストマー腸吻合ステント。
【請求項3】
前記腸吻合ステント内にはさらに植物性セルローススリーブが設けられ、前記腸吻合ステントは隙間のない嵌着構造であり、内部は植物性セルロース材料の管であり、外部はＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体材料であることを特徴とする請求項１に記載の生体柔軟性エラストマー腸吻合ステント。
【請求項4】
（１）ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの開環重合：ＰＥＧ及びＴＭＣモノマーを反応容器に移し、Ｎ２雰囲気下、触媒Ｓｎ（Ｏｃｔ）２を無水トルエン溶液に溶解し、ピペットで１００ｐｐｍを取り出して反応容器に加えて共重合反応させ、プロセス全体で水と酸素がないことを保証し、２４時間後に生成物を溶解し、完全に溶解すると、ポリマー溶液を精製し、複数回繰り返し、精製後の共重合体を箱型真空乾燥機の中で４８時間乾燥し、次に乾燥キャビネットの中で保管するステップ、（２）エレクトロスピニングによる吻合ステントの製造：乾燥後のサンプルをＤＭＦ／ＴＨＦ混合溶液に溶解し、調製した溶液の濃度は５～１０．０％であり、混合溶液の０．１～１．０ｗｔ％で抗菌剤を加え、混合後に３７℃でシェーカーに置いてサンプルが充分に溶解することにより、均一な共溶解紡糸原液を得て、原液を２．５ｍＬの注射器に入れ、当該注射器は内径が０．５ｍｍである１本の金属針を含み、紡糸後のサンプルの厚さは０．２±０．０１ｍｍであり、得られた繊維を箱型真空乾燥機の中で室温でさらに乾燥して、残留した有機溶媒及び水分を除去するステップより製造することを特徴とする請求項１に記載の生体柔軟性エラストマー腸吻合ステントの製造方法。
【請求項5】
前記ステップ（１）でＴＭＣモノマーは７０～９０ｗｔ％であり、ＰＥＧは５～２９ｗｔ％であり、触媒Ｓｎ（Ｏｃｔ）２溶液は１～５ｗｔ％であることを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
【請求項6】
前記ステップ（１）で共重合反応の条件は温度１００～１５０℃、反応時間２４～４８時間であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項7】
前記ステップ（１）で生成物の溶解の条件はＣＨＣｌ３又はＤＭＦ又はＴＨＦで溶解して、シェーカーに置き、シェーカーの温度を３７℃と設定することであることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項8】
前記ステップ（１）で精製の条件はｎ－ヘキサン又はエタノールで精製し、且つガラス棒で不断に撹拌することであることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項9】
前記ステップ（２）でＤＭＦ／ＴＨＦ混合溶液中のＤＭＦ：ＴＨＦ＝１：１であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項10】
前記ステップ（２）の紡糸ステップは、具体的には、所定のサイズの植物性セルローススリーブをエレクトロスピニングレセプターに嵌めて紡糸し、パラメータを制御して対応するサイズの管を得ることができることであり、前記針先の押し速度はＶ＝１．０～５．０ｍＬ／ｈであり、ローラーの回転速度はＶ＝１００～５００ｒｐｍであり、温度Ｔ＝２５～３５℃、湿度ＷＥＴ＝２０～４０％であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、具体的には、高分子材料の技術分野に関し、具体的には、ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体に基づく生体柔軟性エラストマー腸吻合ステント及び製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
消化管の再建・吻合術は腹部外科で最も一般的な手術操作の１つであり、１世紀近くにわたる消化管外科の発展の歩みを見ると、吻合部漏出の発生率は明らかに低下しておらず、これは消化器外科手術の成功を妨げる世界的な難題の１つである。消化管の良性及び悪性腫瘍、消化管穿孔、消化管閉塞、出血、虚血などの腸管病変は、一般に病変腸管の一部を切除して吻合する必要があり、従来の方法では、手動縫合による吻合が殆どであるが、ここ数十年、管式吻合器による端々若しくは端側吻合、又は直線型切断吻合器（リニアステープラー）による側々吻合が多く行われるようになる。どの吻合方式であろうと、吻合部漏出という致命的な合併症は防げられないのである。
【0003】
現在、国内外の結腸直腸外科医によって一般的に認可及び実施されているのは、一時的なバイパスルート変更手術であり、例えば、一時的な回腸瘻造設又は結腸瘻造設であり、このような付加的な手術は吻合部漏出から起こる合併症を確実に避けられるが、吻合部漏出の発生率を低減できるかどうかについては言及している文献がまだない。しかしながら、ルート変更手術では計画的な二次手術を行って復元させる必要があり、再び復元を行うのは消化管の再建と吻合を再び行うことになるため、依然として吻合部漏出、吻合部狭窄などの関連合併症が発生する可能性はあるが、初回の手術と比べて発生の可能性は低い。吻合部の両端の血液供給が良好で、張力を伴わず突き合わせている場合、吻合部領域における腸管内容物、特に糞便内容物の隔離を実現して、相対的に隔絶している、清潔な局所環境を実現するのは、吻合部漏出や、腹膜炎、腹腔内膿瘍などの合併症を予防するための効果的な方式である。当該方式を実現する上で大きな技術的ボトルネックは理想的な吻合補助材料の取得である。
【0004】
腸管吻合の目的は吻合部の両端の腸管の物理学的、組織学的及び生理学的機能を回復させることである。現在、従来の吻合器の主な問題点は以下を含む。（１）金属吻合器は生分解性ではないため、体内に永続的に留置される。（２）分解性高分子材料吻合器は、創傷組織との機械的適合性が不十分である。（３）吻合器は組織修復の調節機能を備えないため、腸管の正常な機能の回復に対して合理的な調節を行えない。例えば、発明特許ＣＮ１１１４４９７０７Ａは、ハンドルベースと、伝動アセンブリと、トリガーアセンブリと、キスカットアセンブリとを含む肛門－直腸吻合器を提案し、伝動アセンブリは、ハンドルベースの内部に設けられるボールねじと、ハンドルベースの尾端に設けられ前記ボールねじの尾端に接続される調節機構とを含み、ボールねじの前端にはステイプル当たり座が固定して取り付けられ、トリガーアセンブリは、ハンドルベースに設けられる可動ハンドルと、ボールねじに嵌設されるストレートプッシュロッドとを含み、キスカットアセンブリは、ステイプル押し板と、ステイプルカートリッジハウジングと、ステイプルカートリッジと、環状ナイフとを含む。当該発明ではステイプル押し板、ステイプルカートリッジハウジング及びステイプルカートリッジがいずれも金属材料で作製され、部品は体内で分解できないため、体内に永続的に留置されるか二次手術で取り出すしない。特許ＣＮ１０９４８０９４３Ａは分解性材料で作製され、ステイプルボディで穿孔して固定する方式を採用し、ステイプルボディの後端にサポートフレームが設計されるが、吻合リングは硬さが高く、弾性がないため、腸管の蠕動にうまく適応できず、明らかな異物感がある。似ている発明特許としてＣＮ１０３２３０２６５Ａがあり、それは分解性材料であるポリグリコール酸、ポリ乳酸を原料とし、消化管の吻合のために利用される。当該吻合器は崩れやすいという特性があるが、腸管組織との機械的適合性はやはり不十分である。理想的な吻合器は次の特徴を備える。（１）腸管内容物を効果的に隔離する。（２）吻合器の埋め込み操作は吻合部の腸壁に対する損傷が小さい。（３）操作が簡単で行いやすい。現在市場の吻合装置はどれもが上記の要件を同時に満たすことができない。
【0005】
製造の面からみると、ステントは異なる個体に適応するよう異なる長さと直径にして製造され、複雑な保管プロセスは一切不要でなければならない。これらは全て要件を満たしながら、ステントの経済性とアフォーダビリティを保たなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、従来技術の技術上の欠点を解決するために、ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体に基づく生体柔軟性エラストマー腸吻合ステント及び製造方法を提供し、それは腸管に適合する弾性を有し、組織修復の調節機能を有し、腸管吻合部の漏出及び他の合併症の発生率を明らかに低減することができる。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明が採用する技術的解決手段は次のとおりである。ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体に基づく生体柔軟性エラストマー腸吻合ステントであって、前記腸吻合ステントは全体としてＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体材料を用いて作製され、前記ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体は高分子医療材料ＰＴＭＣ及びＰＥＧに対して開環重合の方法を用いて合成されるトリブロックＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体であり、前記ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体中のＰＥＧの含有量は１０～２０％であり、前記腸吻合ステントの厚さは０．０５～０．３ｍｍである。
【0008】
前記生体柔軟性エラストマー腸吻合ステントのＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体材料にトリクロサン（ｔｒｉｃｌｏｓａｎ、ＴＣＳ）が担持される。
【0009】
前記腸吻合ステント内にはさらに植物性セルローススリーブが設けられ、前記腸吻合ステントは隙間のない嵌着構造であり、内部は植物性セルロース材料の管であり、外部はＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体材料である。
【0010】
生体柔軟性エラストマー腸吻合ステントの製造方法であって、以下のステップより製造する。
（１）ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの開環重合：ＰＥＧ及びＴＭＣモノマーを反応容器に移し、Ｎ２雰囲気下、触媒Ｓｎ（Ｏｃｔ）２を無水トルエン溶液に溶解し、ピペットで１００ｐｐｍを取り出して反応容器に加えて共重合反応させ、プロセス全体で水と酸素がないことを保証し、２４時間後に生成物を溶解し、完全に溶解すると、ポリマー溶液を精製し、複数回繰り返し、精製後の共重合体を箱型真空乾燥機の中で４８時間乾燥し、次に乾燥キャビネットの中で保管する。
（２）エレクトロスピニングによる吻合ステントの製造：乾燥後のサンプルをＤＭＦ／ＴＨＦ混合溶液に溶解し、調製した溶液の濃度は５～１０．０％であり、混合溶液の０．１～１．０ｗｔ％で抗菌剤を加え、混合後に３７℃でシェーカーに置いてサンプルが充分に溶解することにより、均一な共溶解紡糸原液を得て、原液を２．５ｍＬの注射器に入れ、当該注射器は内径が０．５ｍｍである１本の金属針を含み、紡糸後のサンプルの厚さは０．２±０．０１ｍｍであり、得られた繊維を箱型真空乾燥機の中で室温でさらに乾燥して、残留した有機溶媒及び水分を除去する。
（１）ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの開環重合：ＰＥＧ及びＴＭＣモノマーを反応容器に移し、Ｎ２雰囲気下、触媒Ｓｎ（Ｏｃｔ）２を無水トルエン溶液に溶解し、ピペットで１００ｐｐｍを取り出して反応容器に加えて共重合反応させ、プロセス全体で水と酸素がないことを保証し、２４時間後に生成物を溶解し、完全に溶解すると、ポリマー溶液を精製し、複数回繰り返し、精製後の共重合体を箱型真空乾燥機の中で４８時間乾燥し、次に乾燥キャビネットの中で保管する。
（２）エレクトロスピニングによる吻合ステントの製造：乾燥後のサンプルをＤＭＦ／ＴＨＦ混合溶液に溶解し、調製した溶液の濃度は５～１０．０％であり、混合溶液の０．１～１．０ｗｔ％で抗菌剤を加え、混合後に３７℃でシェーカーに置いてサンプルが充分に溶解することにより、均一な共溶解紡糸原液を得て、原液を２．５ｍＬの注射器に入れ、当該注射器は内径が０．５ｍｍである１本の金属針を含み、紡糸後のサンプルの厚さは０．２±０．０１ｍｍであり、得られた繊維を箱型真空乾燥機の中で室温でさらに乾燥して、残留した有機溶媒及び水分を除去する。
【0011】
前記ステップ（１）でＴＭＣモノマーは７０～９０ｗｔ％であり、ＰＥＧは５～２９ｗｔ％であり、触媒Ｓｎ（Ｏｃｔ）２溶液は１～５ｗｔ％である。
【0012】
前記ステップ（１）で共重合反応の条件は温度１００～１５０℃、反応時間２４～４８時間である。
【0013】
前記ステップ（１）で生成物の溶解の条件はＣＨＣｌ３又はＤＭＦ又はＴＨＦで溶解して、シェーカーに置き、シェーカーの温度を３７℃と設定することである。
【0014】
前記ステップ（１）で精製の条件はｎ－ヘキサン又はエタノールで精製し、且つガラス棒で不断に撹拌することである。
【0015】
前記ステップ（２）でＤＭＦ／ＴＨＦ混合溶液中のＤＭＦ：ＴＨＦ＝１：１である。
【0016】
前記ステップ（２）の紡糸ステップは、具体的には以下のとおりである。所定のサイズの植物性セルローススリーブをエレクトロスピニングレセプターに嵌めて紡糸し、パラメータを制御して対応するサイズの管を得ることができ、前記針先の押し速度はＶ＝１．０～５．０ｍＬ／ｈであり、ローラーの回転速度はＶ＝１００～５００ｒｐｍであり、温度Ｔ＝２５～３５℃、湿度ＷＥＴ＝２０～４０％である。
【発明の効果】
【0017】
本発明の有益な効果は次のとおりである。本発明はＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体に基づく生体柔軟性エラストマー腸吻合ステント及び製造方法を提供し、生体適合性のある分解性高分子医療材料であるＰＴＭＣ及びＰＥＧが選択され、エレクトロスピニング法で製造され、当該吻合管のサイズを人体の管腔の大きさに応じて調整して、小腸、大腸に適する吻合器だけでなく、食道、動脈、静脈などの吻合、初期の支持に適する管腔吻合器として設計することができ、本発明で製造される吻合管は管壁が薄く、弾性に優れており、臨床手術で縫合する時に医師が縫合しやすいよう、革新的にも当該吻合管は硬さの高い植物性セルロース管の外部に隙間なく嵌められる。当該植物性セルロースは市販品であり、縫合時に支持する効果があるため、操作しやすく、腸管環境の中では１５～３０分間だけで完全に分解されて体外へ排出されるため、後の吻合管の性能には影響が及ばず、また抗菌、消炎、線維芽細胞の増殖と遊走を調節する異なる機能因子を担持することで、分解性腸管吻合管に組織の微小環境を調節する機能を与え、吻合部の微小環境を調節することで、吻合部漏出の可能性を低減させるという目的を達成する。当該ステントは一般に体内で２～３週間で分解され、腸管から体外へ排出されるため、金属装置は分解性ではないという欠点を補うことができ、優れた組織従順性を有し、分解性吻合装置の組織従順性が不十分であるという欠点を補い、後の特性評価では、当該分解性吻合管は患者の術後の吻合部の出血を低減させ、患者の術後の肛門の不快感、消化管の機能の乱れを軽減させ、医療費を低減させる上で利点があり、特に吻合部に異物が残留しない面ではそうであるということが証明された。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】体内試験のプロセスであり、（１）盲腸への切開部であり、（２）吻合ステントの埋め込みであり、（３）断続全層縫合である。
【図2】本発明のトリブロック共重合体の合成プロセスの概略図である。
【図3】ＰＴＭＣ、ＰＥＧ及び共重合体ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの赤外吸収スペクトルである。
【図4】ブロック共重合体ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。
【図5】ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ複合繊維のＳＥＭ写真であり、図中ＰＴＭＣの含有量に対して、ＰＥＧのパーセンテージは０．５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％である。
【図6】ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ繊維の繊維直径分布であり、ここで、ＰＴＭＣの含有量に対するＰＥＧの重量パーセンテージは（Ａ）０．５％、（Ｂ）１０％、（Ｃ）２０％、（Ｄ）３０％、（Ｅ）４０％及び（Ｆ）５０％である。
【図7】トリブロック共重合体（Ａ）の異なるサンプルの接触角の値の経時的変化であり、（Ｂ）ＰＢＳ溶液に２４時間入れていたサンプルの吸水率である。
【図8】異なるＰＥＧの含有量でのエレクトロスピニング腸吻合ステントをＰＢＳ溶液に入れる前と後の機械的特性であり、（Ａ）弾性率であり、（Ｂ）引張強さであり、（Ｃ）破断伸びであり、（Ｄ）機械的特性の変化の傾向である。
【図9】（Ａ）ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの体外酵素分解の重量損失と分解時間の関係であり、（Ｂ）ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ膜の酵素分解後のリパーゼ溶液のｐＨ曲線であり、（Ｃ）異なる時間での体内分解状況、（Ｄ）埋め込む前と後の吻合ステントの比較、（Ｅ）重量の減少、（Ｆ）対応する時間でラットの体から取り出した吻合ステントの長さの減少である。
【図10】トリクロサンを含まないサンプル（上の図）及びトリクロサンを含むサンプル（下の図）の抗菌効果であり、Ａは黄色ブドウ球菌であり、Ｂは大腸菌であり、縮尺が１ｃｍである。
【図11】異なる材料の溶血速度であり、（Ａ）ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体試験群であり、（Ｂ）ＴＣＳ／ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体試験群である。
【図12】サンプルの細胞毒性作用であり、ＡはＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体基であり、ＢはＴＣＳ／ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体基である。
【図13】腸吻合術後の異なる時間の腹部癒着スコアリングである。
【図14】術後７日目の、異なるサンプル群の吻合部の破裂圧であり、ＡはＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ群であり、ＢはＴＣＳ／ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ群である。
【図15】吻合部の近くの腸壁組織に対するＨ＆Ｅ及びマッソン（Ｍａｓｓｏｎ）染色である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
以下、本発明の実施例の図面を参照しながら、本発明の実施例の技術的解決手段を明瞭かつ完全に説明し、言うまでもないが、説明される実施例は本発明の全ての実施例ではなく、その一部の実施例に過ぎない。当業者が本発明の実施例に基づいて、新規性のある作業をせず得ている他の実施例は、全て本発明の請求範囲に属する。
【0020】
材料：
ポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ））（ＰＥＧ、Ｍｎ＝５０００）、オクタン酸第一スズ（（Ｓｎ（Ｏｃｔ）２）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）、トリクロサン（ＴＣＳ）、トルエン、ｎ－ヘキサン、リパーゼ（Ｌｉｐａｓｅ、ニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来、溶液、１０万Ｕ／ｇ以上）、以上はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣより購入、ポリマーグレードの１，３－トリメチレンカーボネート（Ｐｏｌｙｍｅｒ ｇｒａｄｅ １，３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｃａｒｂｏｎａｔｅ、ＴＭＣ、中国Ｄａｉｇａｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｙ）。全ての試薬と化学品は分析グレードであり、精製しなくても使用できる。
ポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ））（ＰＥＧ、Ｍｎ＝５０００）、オクタン酸第一スズ（（Ｓｎ（Ｏｃｔ）２）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）、トリクロサン（ＴＣＳ）、トルエン、ｎ－ヘキサン、リパーゼ（Ｌｉｐａｓｅ、ニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来、溶液、１０万Ｕ／ｇ以上）、以上はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣより購入、ポリマーグレードの１，３－トリメチレンカーボネート（Ｐｏｌｙｍｅｒ ｇｒａｄｅ １，３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｃａｒｂｏｎａｔｅ、ＴＭＣ、中国Ｄａｉｇａｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｙ）。全ての試薬と化学品は分析グレードであり、精製しなくても使用できる。
【0021】
マウス線維芽細胞株Ｌ９２９は中国科学院典型培養物保藏センター（中国上海）が提供した。培養皿はコーニング（米国ニューヨーク）より購入された。ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）改変イーグル（Ｅａｇｌｅ）培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）に１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシンを添加して培養した。全ての細胞はいずれも３７℃、５％ＣＯ２、完全に加湿された条件でインキュベーターの中で培養された。
【0022】
温州医科大学（中国温州）試験動物センターによって提供された雄のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（２００±２０ｇ）を２５℃と湿度５５％の条件で飼育した。全ての動物試験は倫理委員会によって評価及び承認されるガイドラインに従って行われた。
【0023】
ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣを基材とする腸管吻合ステントの製造ステップ：
ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの開環重合：
開環重合の方法を用いてトリブロックＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体を合成した［４９］。簡単に言えば、計量したＰＥＧ及びＴＭＣを磁気撹拌棒を備える完全に乾燥したガラス反応器に移した。Ｎ２雰囲気下、Ｓｎ（Ｏｃｔ）２を無水トルエン溶液に溶解し、ピペットで１００ｐｐｍを取り出して反応容器に加えた。共重合反応は１３０±２℃で２４時間反応し、プロセス全体で水と酸素がないことを保証した。２４時間後に生成物をクロロホルムに溶解し、完全に溶解すると、ポリマー溶液に対して過剰のｎ－ヘキサンで生成物を精製し、３回繰り返した。精製後の共重合体を４０℃の箱型真空乾燥機の中で４８時間乾燥し、次に乾燥キャビネットの中で保管した。
ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの開環重合：
開環重合の方法を用いてトリブロックＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体を合成した［４９］。簡単に言えば、計量したＰＥＧ及びＴＭＣを磁気撹拌棒を備える完全に乾燥したガラス反応器に移した。Ｎ２雰囲気下、Ｓｎ（Ｏｃｔ）２を無水トルエン溶液に溶解し、ピペットで１００ｐｐｍを取り出して反応容器に加えた。共重合反応は１３０±２℃で２４時間反応し、プロセス全体で水と酸素がないことを保証した。２４時間後に生成物をクロロホルムに溶解し、完全に溶解すると、ポリマー溶液に対して過剰のｎ－ヘキサンで生成物を精製し、３回繰り返した。精製後の共重合体を４０℃の箱型真空乾燥機の中で４８時間乾燥し、次に乾燥キャビネットの中で保管した。
【0024】
エレクトロスピニングによる吻合ステントの製造：
乾燥後のサンプルをＤＭＦ／ＴＨＦ（１：１、Ｖ：Ｖ）混合溶液に溶解し、調製した溶液の濃度は１０．０％であり、３７℃でシェーカーに３６時間置いてサンプルが充分に溶解することにより、均一な共溶解紡糸原液を得た。原液を２．５ｍＬの注射器に入れ、当該注射器は内径が０．５ｍｍである１本の金属針を含む。具体的な紡糸条件は実験室の経験から得られ［５０］、詳しくは表１の資料を参照する。紡糸後のサンプルの厚さは０．２±０．０１ｍｍであった。得られた繊維を箱型真空乾燥機の中で室温でさらに２４時間乾燥して、残留した有機溶媒及び水分を除去した。紡糸後のサンプルを用いて機械的特性試験及び体外分解試験を行った。
乾燥後のサンプルをＤＭＦ／ＴＨＦ（１：１、Ｖ：Ｖ）混合溶液に溶解し、調製した溶液の濃度は１０．０％であり、３７℃でシェーカーに３６時間置いてサンプルが充分に溶解することにより、均一な共溶解紡糸原液を得た。原液を２．５ｍＬの注射器に入れ、当該注射器は内径が０．５ｍｍである１本の金属針を含む。具体的な紡糸条件は実験室の経験から得られ［５０］、詳しくは表１の資料を参照する。紡糸後のサンプルの厚さは０．２±０．０１ｍｍであった。得られた繊維を箱型真空乾燥機の中で室温でさらに２４時間乾燥して、残留した有機溶媒及び水分を除去した。紡糸後のサンプルを用いて機械的特性試験及び体外分解試験を行った。
【0025】
具体的な製造方法は次のとおりであった。
１．ｍＰＥＧ－ＰＴＭＣの合成：合成プロセスは水と酸素のない環境で操作する必要があり、７０～９０ｗｔ％のＴＭＣモノマー、５～２９ｗｔ％のＰＥＧ５０００及び１～５ｗｔ％の触媒Ｓｎ（Ｏｃｔ）２溶液を反応管に加え、反応管に撹拌子を入れ、反応管内に水と酸素がないことを保証して、管口をシリコーングリースで密封し、最後にパラフィルムで管口を密封して酸素と水分が入らないことを確保した。反応管をオイルバスに入れて反応させ、温度は１００～１５０℃であり、反応時間は２４～４８時間であり、反応終了後、使用に備えて取り出した。
１．ｍＰＥＧ－ＰＴＭＣの合成：合成プロセスは水と酸素のない環境で操作する必要があり、７０～９０ｗｔ％のＴＭＣモノマー、５～２９ｗｔ％のＰＥＧ５０００及び１～５ｗｔ％の触媒Ｓｎ（Ｏｃｔ）２溶液を反応管に加え、反応管に撹拌子を入れ、反応管内に水と酸素がないことを保証して、管口をシリコーングリースで密封し、最後にパラフィルムで管口を密封して酸素と水分が入らないことを確保した。反応管をオイルバスに入れて反応させ、温度は１００～１５０℃であり、反応時間は２４～４８時間であり、反応終了後、使用に備えて取り出した。
【0026】
２．ｍＰＥＧ－ＰＴＭＣの溶解：１：５の固液比で、合成材料をＣＨＣｌ３又はＤＭＦ又はＴＨＦで溶解した。最初にＣＨＣｌ３又はＤＭＦ又はＴＨＦで内壁を複数回洗浄して、シリコーングリース及び未反応のモノマーを落とし、次に過剰のＣＨＣｌ３又はＤＭＦ又はＴＨＦを加えて、シェーカーに置き、シェーカーの温度を３７℃と設定し、溶液が完全に溶解するのを待った。
【0027】
３．ｍＰＥＧ－ＰＴＭＣの精製：溶解した溶液をｎ－ヘキサン又はエタノールが入ったビーカーにゆっくりと注いで精製し、ゆっくりと注ぎながらガラス棒で不断に撹拌した。得られた綿状物ｍＰＥＧ－ＰＴＭＣを吸引濾過し、続いて箱型真空乾燥機に入れて４８時間乾燥した。
【0028】
４．エレクトロスピニング溶液の調製：合成材料ｍＰＥＧ－ＰＴＭＣを溶媒ＤＭＦ／ＴＨＦ（ＤＭＦ：ＴＨＦ＝１：１）に溶解し、当該溶液の質量分率は５～１０ｗｔ％であった。添加される抗菌剤の質量は材料の添加量の０．１～１．０ｗｔ％程度であった。ポリマーｍＰＥＧ－ＰＴＭＣ、抗菌剤及び２種の溶媒を混合し、調製した溶液を、完全に溶解するまで３７℃の恒温シェーカーに２４時間置いた。完全に溶解すると紡糸操作を行った。
【0029】
５．エレクトロスピニングによる吻合管の製造：型番がＴＬ－Ｐｒｏ－ＢＭであるエレクトロスピニング装置において紡糸を行った。所定のサイズの植物性セルローススリーブをエレクトロスピニングレセプターに嵌めて紡糸し、パラメータを制御して対応するサイズの管を得ることができる。エレクトロスピニングより得た吻合管は２つの部分からなる隙間のない嵌着構造であり、内部は植物性セルロース材料の管であり、外部は合成ポリマー材料の管であった。パラメータの設定範囲は、電圧（－５，３０）Ｖ、針先の押し速度Ｖ＝１．０～５．０ｍＬ／ｈ、ローラーの回転速度Ｖ＝１００～５００ｒｐｍ、温度Ｔ＝２５～３５℃、湿度ＷＥＴ＝２０～４０％であった。
【表1】
【0030】
特性評価：
物理的及び化学的特性の評価：
ＡＴＲアクセサリを備えるＮｉｃｏｌｅｔ Ｍａｇｎａ－５６０分光計でポリマーＰＴＭＣ、ＰＥＧ及びブロック共重合体ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣのＦＴＩＲ－ＡＴＲスペクトルを測定した。Ｂｒｕｋｅｒ分光計でＰＴＭＣ及びブロック共重合体ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを測定し、全ての１Ｈ ＮＭＲはテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部参照とし、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）を溶媒とし、ｐｐｍ単位でサンプルの化学シフトを記録した。
物理的及び化学的特性の評価：
ＡＴＲアクセサリを備えるＮｉｃｏｌｅｔ Ｍａｇｎａ－５６０分光計でポリマーＰＴＭＣ、ＰＥＧ及びブロック共重合体ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣのＦＴＩＲ－ＡＴＲスペクトルを測定した。Ｂｒｕｋｅｒ分光計でＰＴＭＣ及びブロック共重合体ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを測定し、全ての１Ｈ ＮＭＲはテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部参照とし、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）を溶媒とし、ｐｐｍ単位でサンプルの化学シフトを記録した。
【0031】
日立冷陰極電界放出型走査電子顕微鏡ＳＵ８０１０を用いてサンプルのエレクトロスピニング後の微視的形態、及び動物の体内に埋め込まれて分解した後の微視的形態を撮影した。
【0032】
ＤＳＣ８０００（米国ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてＤＳＣ分析を行い、１０℃／ｍｉｎの加熱速度でポリマーＰＴＭＣ、ＰＥＧ及びブロック共重合体ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの熱特性を記録した。
【0033】
Ｂｉｏｌｉｎ Ｔｈｅｔａシリーズ動的接触角分析装置を用いて、３７℃で異なるＰＥＧの含有量のサンプルの動的接触角を測定し、接触角の大きさを５分間ごとに、安定的になるまで記録した。
【0034】
ウベローデ粘度計を用いて２５℃の恒温ウォーターバスにおいてＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの固有粘度を測定し、溶媒はフェノール／１，１，２，２－テトラクロロエタン（２：３、Ｗ：Ｗ）であり、試験結果は３回の試験の平均値であった。Ｍａｒｋ－Ｈｏｕｗｉｎｋの式でポリマーの粘度平均分子量を計算した。
［η］＝ＫＭｖ α、Ｍｖ＝（［η］／Ｋ）１／α
式中、Ｋ＝７．９×１０－２ｃｍ３／ｇ、α＝０．６３。
［η］＝ＫＭｖ α、Ｍｖ＝（［η］／Ｋ）１／α
式中、Ｋ＝７．９×１０－２ｃｍ３／ｇ、α＝０．６３。
【0035】
機械的特性は電子万能試験機（Ｉｎｓｔｒｏｎ５９４４）において測定し、エレクトロスピニング後のサンプルに対してサイズが４５．０ｍｍ×２５．０ｍｍ×０．２ｍｍであるシート状になるよう処理し、ＳＤラットの盲腸のサイズは４５．０ｍｍ×２５．０ｍｍ×０．３ｍｍであり、生理食塩水で洗い流してきれいにし、表面から余分な水分を拭き取った。
【0036】
ステントの繊維直径及び孔隙率：
１枚の走査型電子顕微鏡写真において少なくとも２０本の繊維及び５０のセグメントを測定して繊維の平均直径及び直径分布を得て、ステントの孔隙率は下式［５１］で計算した。
Ｐ＝（１－ρ′／ρ０）
式中、Ｐはステントの孔隙率であり、ρ′はステントの見掛け密度であり、ρ０は共重合体のかさ密度である。
１枚の走査型電子顕微鏡写真において少なくとも２０本の繊維及び５０のセグメントを測定して繊維の平均直径及び直径分布を得て、ステントの孔隙率は下式［５１］で計算した。
Ｐ＝（１－ρ′／ρ０）
式中、Ｐはステントの孔隙率であり、ρ′はステントの見掛け密度であり、ρ０は共重合体のかさ密度である。
【0037】
吸水率：
初期重量が約４０ｍｇ（Ｗ０）であるサンプルはＰＢＳ（３７℃）の中で膨張した。２４時間後に、濾紙で表面から余分な水分を除去し、膨張したサンプルの質量（Ｗｓ）を改めて秤量した。サンプルの吸水率は下式で決定される。
吸水率（Ｗａｔｅｒ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）＝（Ｗｓ－Ｗ０）／Ｗ０×１００％
初期重量が約４０ｍｇ（Ｗ０）であるサンプルはＰＢＳ（３７℃）の中で膨張した。２４時間後に、濾紙で表面から余分な水分を除去し、膨張したサンプルの質量（Ｗｓ）を改めて秤量した。サンプルの吸水率は下式で決定される。
吸水率（Ｗａｔｅｒ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）＝（Ｗｓ－Ｗ０）／Ｗ０×１００％
【0038】
生分解性：
サイズが１０．０×１０．０×０．２ｍｍであるＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ膜を１ｍＬのリパーゼ溶液に入れて、３７℃の空気浴の中に置き、毎日８時間振とうし、振幅は６５回／分であった。酵素溶液を３日ごとに１回交換して酵素の活性を維持し、それぞれ、１日後、５日後、１０日後、１５日後、２０日後にサンプルを取り出し、ランダムに３つの並行サンプルを選択した。サンプルを蒸留水で充分に洗浄した後、濾紙で表面の水分を吸い取り、３７℃で１２時間真空乾燥して質量が一定になった。乾燥サンプルの質量及び分解生成物を含有する媒体の水素イオン濃度を記録した。
サイズが１０．０×１０．０×０．２ｍｍであるＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ膜を１ｍＬのリパーゼ溶液に入れて、３７℃の空気浴の中に置き、毎日８時間振とうし、振幅は６５回／分であった。酵素溶液を３日ごとに１回交換して酵素の活性を維持し、それぞれ、１日後、５日後、１０日後、１５日後、２０日後にサンプルを取り出し、ランダムに３つの並行サンプルを選択した。サンプルを蒸留水で充分に洗浄した後、濾紙で表面の水分を吸い取り、３７℃で１２時間真空乾燥して質量が一定になった。乾燥サンプルの質量及び分解生成物を含有する媒体の水素イオン濃度を記録した。
【0039】
体内の生分解性挙動は、吻合ステントの埋め込み前と後の質量及びサイズを記録することにより得た。吻合ステントを取り出した後は蒸留水で洗浄してきれいにし、濾紙で表面の水分を吸い取った。重量損失率は下式で計算した。
重量損失率（Ｗｅｉｇｈｔ ｌｏｓｓ）（％）＝（Ｗ０－Ｗｔ）／Ｗ０×１００％
式中、Ｗ０、Ｗｔは、それぞれ、サンプルの分解前と分解後の乾燥重量を表す。
重量損失率（Ｗｅｉｇｈｔ ｌｏｓｓ）（％）＝（Ｗ０－Ｗｔ）／Ｗ０×１００％
式中、Ｗ０、Ｗｔは、それぞれ、サンプルの分解前と分解後の乾燥重量を表す。
【0040】
生物学的特性の評価：
共重合体の溶血性研究：
溶血率はヘモグロビン膜の血液適合性を評価するために利用される。これまで報告された方法［５２］に従って、２０ｍｇのサンプルを９ｍＬの生理食塩水に浸漬して２４時間培養（３７℃）することにより、ＰＨＭｓの浸出液を得た。２００μＬの新鮮な抗凝固血液を１ｍＬの浸出液に注射して充分に混合した。１時間インキュベート（３７℃）した後、抗凝固血液と浸出液の混合物を遠心分離した（３０００回転／分、１０分）。最後に、ハイブリッドマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ ＮＥＯ２、ＢｉｏＴｅｋ、米国）を用いて上清の吸光度（５４５ｎｍ）を測定した。超純水、生理食塩水をそれぞれ陰性対照、陽性対照とした。血液適合性は溶血率（％）で次のとおりに表示する。
共重合体の溶血性研究：
溶血率はヘモグロビン膜の血液適合性を評価するために利用される。これまで報告された方法［５２］に従って、２０ｍｇのサンプルを９ｍＬの生理食塩水に浸漬して２４時間培養（３７℃）することにより、ＰＨＭｓの浸出液を得た。２００μＬの新鮮な抗凝固血液を１ｍＬの浸出液に注射して充分に混合した。１時間インキュベート（３７℃）した後、抗凝固血液と浸出液の混合物を遠心分離した（３０００回転／分、１０分）。最後に、ハイブリッドマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ ＮＥＯ２、ＢｉｏＴｅｋ、米国）を用いて上清の吸光度（５４５ｎｍ）を測定した。超純水、生理食塩水をそれぞれ陰性対照、陽性対照とした。血液適合性は溶血率（％）で次のとおりに表示する。
【0041】
サンプル材料を予め蒸留水で洗い流してきれいにし、表面から余分な水分を拭き取り、ヒト全血を使用した。試験群：１５ｍｇのエレクトロスピニングサンプルをＥＰ管に入れて、１ｍＬの生理食塩水及び０．１ｍＬの全血を加え、陰性対照群：ＥＰ管に１ｍＬの生理食塩水及び０．１ｍＬの全血を加え、陽性対照群：ＥＰ管に１ｍＬの超純水及び０．１ｍＬの全血を加えた。上記のサンプルを全て３７℃で２時間インキュベートすることで、溶血反応試験を行った。
【0042】
全てのサンプルを３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清がまだ透明でなければ再び遠心分離を１回繰り返した。写真を撮った後に上清を吸い出してウェルプレートに移し、各サンプルの上清から３つの並行サンプルを作り、各サンプルは２００μＬ取り出して、７２１分光光度計を用いて波長５４０ｎｍで吸光度（ＯＤ）を測定して結果を記録した。
【0043】
データ処理：サンプル群、対照群からそれぞれ３つのサンプルのＯＤの平均値を得た。下式でサンプルの溶血率を計算した。
Ｈ（％）＝（ＯＤｔ－ＯＤｎｃ）／（ＯＤｐｃ－ＯＤｎｃ）×１００％
式中、Ｈ％は溶血率であり、ＯＤｔはサンプルの吸光度であり、ＯＤｎｃは陰性対照サンプルの吸光度であり、ＯＤｐｃは陽性対照サンプルの吸光度であった。ＧＢ／Ｔ１４２３．２－１９９３基準に従って、材料と赤血球が体外で接触する過程で起きている赤血球の溶解及びヘモグロビンの遊離の程度を測定することにより、材料の体外溶血性を評価し、溶血反応が５％を超えれば陽性であった。
Ｈ（％）＝（ＯＤｔ－ＯＤｎｃ）／（ＯＤｐｃ－ＯＤｎｃ）×１００％
式中、Ｈ％は溶血率であり、ＯＤｔはサンプルの吸光度であり、ＯＤｎｃは陰性対照サンプルの吸光度であり、ＯＤｐｃは陽性対照サンプルの吸光度であった。ＧＢ／Ｔ１４２３．２－１９９３基準に従って、材料と赤血球が体外で接触する過程で起きている赤血球の溶解及びヘモグロビンの遊離の程度を測定することにより、材料の体外溶血性を評価し、溶血反応が５％を超えれば陽性であった。
【0044】
細胞毒性研究：
最初に、密度が５×１０４個の細胞である細胞懸濁液（１００μＬ）を９６ウェルプレートの各ウェルに加え、細胞を付着させるために、３７℃、５％ＣＯ２の空気環境の中で２４時間インキュベートした。次に、サンプル浸出液（１００ｍＬ）で培地を置き換え、２４時間、４８時間インキュベートした。続いて、各ウェルにＣＣＫ－８溶液（１０ｍＬ、完全培地中１０％）を加えることでＣＣＫ－８測定を行い、３７℃、５％ＣＯ２でさらに２時間インキュベートした。マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでの吸光度を測定した。何の処理も行わなかった細胞をブランク対照とした。
最初に、密度が５×１０４個の細胞である細胞懸濁液（１００μＬ）を９６ウェルプレートの各ウェルに加え、細胞を付着させるために、３７℃、５％ＣＯ２の空気環境の中で２４時間インキュベートした。次に、サンプル浸出液（１００ｍＬ）で培地を置き換え、２４時間、４８時間インキュベートした。続いて、各ウェルにＣＣＫ－８溶液（１０ｍＬ、完全培地中１０％）を加えることでＣＣＫ－８測定を行い、３７℃、５％ＣＯ２でさらに２時間インキュベートした。マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでの吸光度を測定した。何の処理も行わなかった細胞をブランク対照とした。
【0045】
ＣＣＫ－８法を用いて試験サンプルの毒性学研究を行い、試験ステップは次のとおりであった。
細胞培養液の調製：ＲＰＭＩ１６４０培地５００ｍＬ＋ウシ胎児血清５０ｍＬ＋ペニシリン／ストレプトマイシン５ｍＬ。
細胞培養液の調製：ＲＰＭＩ１６４０培地５００ｍＬ＋ウシ胎児血清５０ｍＬ＋ペニシリン／ストレプトマイシン５ｍＬ。
【0046】
試験群浸出液の調製：サンプルを予め７５％アルコールで滅菌・消毒し、次にクリーンベンチにおいて正面と背面にそれぞれ紫外線を３０分間照射した。エレクトロスピニングサンプルをそれぞれ切断して辺長１．８２ｃｍの正方形のフィルムにし、２ｍＬの完全培地を加え、３７℃の環境で２４時間共インキュベートして、紡糸サンプル浸出液を得た。
【0047】
細胞の作製：細胞培養液でＬ９２９細胞を（細胞が壁に付着するまで）体外培養し、培養フラスコいっぱいになるまで、３世代以上増殖させた。ＰＢＳで３回洗い流した（細胞が流されないよう、正面から細胞に当たらない）。続いて５０μＬの０．２５％トリプシンでそれを３０秒（３７℃）消化して、細胞懸濁液に変えた。すぐに３～５ｍＬの完全培地を加えて遠心分離管に移し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、上部の廃液を捨て、遠心分離管に５ｍＬのＰＢＳを加え、ピペットでピペッティングして細胞を均一に分散させた。１μＬを取り出して、細胞計数盤に滴下して細胞を計数し、細胞の濃度を５×１０４個／ｍＬに調整した。
【0048】
共培養：希釈後のＬ９２９細胞を９６ウェルプレートに接種し、１ウェルあたり１００μＬであり、各ウェルには５０００～８０００個の細胞を必要とし、３７℃、５％ＣＯ２の環境で２４時間培養し、細胞が完全に壁に付着すると培養液を捨て、それぞれ、試験群浸出液及び陽性溶液（陽性対照群は１０％ＤＭＳＯ（２００μＬ））各１００μＬをウェルに加え、各群は６ウェル並行であり、３７℃のインキュベーターで２４時間インキュベートした。
【0049】
ＣＣＫ－８測定：それぞれ、予め設定した時点（２４時間、４８時間）で９６ウェルプレートを取り出し、原液を吸い出してサンプルウェルの周りに加え、各ウェルにはそれぞれ１０μＬのＣＣＫ－８試薬、１００μＬの完全培地を加え（予め２種の溶液を混合した）、３７℃のインキュベーターで２時間インキュベートした後、多目的マイクロプレートリーダー（吸光度４５０ｎｍ）で吸光度（ＯＤ）の値を測定した。
【0050】
細胞の相対的増殖率の計算：各群の６ウェルのＯＤ値の平均値を算出し、下式で各群の細胞の相対的増殖率（ＲＧＲ）を計算した。
細胞生存率（Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）（％）＝（Ａｓ－Ａｂ）／（Ａｃ－Ａｂ）×１００％
式中、Ａｓは試験ウェルの吸光度であり（ポリマー抽出液あり、細胞培地あり、ＣＣＫ－８あり）、
Ａｃは対照ウェルの吸光度であり（ポリマー抽出液なし、細胞培地あり、ＣＣＫ－８あり）、
Ａｂは試験ウェルの吸光度であった（ポリマー抽出液なし、細胞培地なし、ＣＣＫ－８あり）。
細胞生存率（Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）（％）＝（Ａｓ－Ａｂ）／（Ａｃ－Ａｂ）×１００％
式中、Ａｓは試験ウェルの吸光度であり（ポリマー抽出液あり、細胞培地あり、ＣＣＫ－８あり）、
Ａｃは対照ウェルの吸光度であり（ポリマー抽出液なし、細胞培地あり、ＣＣＫ－８あり）、
Ａｂは試験ウェルの吸光度であった（ポリマー抽出液なし、細胞培地なし、ＣＣＫ－８あり）。
【0051】
抗菌性研究：
それぞれ、凍結保存していた大腸菌、黄色ブドウ球菌の細菌原液を５０μＬ取り出して５ｍＬの細菌培養液が入った遠心分離管に加え、細菌インキュベーターで２４時間インキュベートしておいた。材料に対して直径１．０ｃｍの円形のシート状になるよう裁断し、７５％アルコールで洗い流してきれいにした後に表面から余分な水分を拭き取り、紫外線で３０分間殺菌した。それぞれ、希釈後の細菌を１００μＬ取り出して培地に均一に塗布し、円形のシート状の材料を細菌を塗布された培地の上に置き、３７℃の細菌インキュベーターで２４時間インキュベートした。
それぞれ、凍結保存していた大腸菌、黄色ブドウ球菌の細菌原液を５０μＬ取り出して５ｍＬの細菌培養液が入った遠心分離管に加え、細菌インキュベーターで２４時間インキュベートしておいた。材料に対して直径１．０ｃｍの円形のシート状になるよう裁断し、７５％アルコールで洗い流してきれいにした後に表面から余分な水分を拭き取り、紫外線で３０分間殺菌した。それぞれ、希釈後の細菌を１００μＬ取り出して培地に均一に塗布し、円形のシート状の材料を細菌を塗布された培地の上に置き、３７℃の細菌インキュベーターで２４時間インキュベートした。
【0052】
体内生体適合性研究：
ＳＤラットによる体内試験：
試験前に、サンプルを７５％アルコールで１０分間浸漬し、紫外線で３０分間滅菌・消毒した。一般グレードのＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ雄ラットが１８０匹おり、体重は２００±１０ｇであり、体重基準で１０％抱水クロラールを腹腔内注射して麻醉した。試験では、ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ群、ＴＣＳ／ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ群及びブランク対照群の３群を設け、各群は４つの時点を設定し、それぞれ７日、１４日、２１日、２８日であり、５匹のラットの並行群を設けた。マウスの腹部を除毛し、腹部を切開して、ラットの盲腸を露出させ、盲腸の中上部に切開部を作り、サイズは１０±１ｍｍであり、盲腸内容物を全て取り出し、ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ群、ＴＣＳ／ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ群は試験サンプルを入れて縫合し、ブランク群は材料を入れず直接縫合した。吻合部の縫合はいずれも４針の単純断続全層縫合で行い、盲腸の横断面に対して、それぞれ、時計の３時、６時、９時、１２時に対応する各位置において全層断続縫合を行い、ピッチは約０．４ｃｍであり、間隔は約０．５ｃｍであった。術後２群のラットが麻醉から目覚めると直ちに自由に摂食、飲水させた。
ＳＤラットによる体内試験：
試験前に、サンプルを７５％アルコールで１０分間浸漬し、紫外線で３０分間滅菌・消毒した。一般グレードのＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ雄ラットが１８０匹おり、体重は２００±１０ｇであり、体重基準で１０％抱水クロラールを腹腔内注射して麻醉した。試験では、ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ群、ＴＣＳ／ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ群及びブランク対照群の３群を設け、各群は４つの時点を設定し、それぞれ７日、１４日、２１日、２８日であり、５匹のラットの並行群を設けた。マウスの腹部を除毛し、腹部を切開して、ラットの盲腸を露出させ、盲腸の中上部に切開部を作り、サイズは１０±１ｍｍであり、盲腸内容物を全て取り出し、ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ群、ＴＣＳ／ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ群は試験サンプルを入れて縫合し、ブランク群は材料を入れず直接縫合した。吻合部の縫合はいずれも４針の単純断続全層縫合で行い、盲腸の横断面に対して、それぞれ、時計の３時、６時、９時、１２時に対応する各位置において全層断続縫合を行い、ピッチは約０．４ｃｍであり、間隔は約０．５ｃｍであった。術後２群のラットが麻醉から目覚めると直ちに自由に摂食、飲水させた。
【0053】
術後１ケージ１匹で独立して飼育し、マウスの摂食、排便及び行為挙動の状況を常に観察した。３群の術後の一般状況及び死亡状況を記録した。各群のラットはそれぞれ対応する時点になると麻醉して開腹し、腹腔内癒着の状況、腹腔内感染があるかどうか、吻合部漏出の現象があるかどうかを観察及び記録した。
【0054】
腹腔内癒着スコアリング（Ａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅ）：
術後ＳＤラットの腹腔内癒着に対して段階評価を行って、定量化結果を得た。スコアリング基準はスコア０～３であった。
スコア０：癒着なし、
スコア１：軽度の癒着であり、吻合部の近くだけは組織によって覆われており、剥離しやすい。
スコア２：中等度の癒着であり、吻合部が腹腔内組織と癒着しており、剥離しにくいが、剥離はまだ可能である。
スコア３：重度の癒着であり、吻合部は腹腔内組織又は他の臓器組織と癒着しており、又は包まれて癒着している。
術後ＳＤラットの腹腔内癒着に対して段階評価を行って、定量化結果を得た。スコアリング基準はスコア０～３であった。
スコア０：癒着なし、
スコア１：軽度の癒着であり、吻合部の近くだけは組織によって覆われており、剥離しやすい。
スコア２：中等度の癒着であり、吻合部が腹腔内組織と癒着しており、剥離しにくいが、剥離はまだ可能である。
スコア３：重度の癒着であり、吻合部は腹腔内組織又は他の臓器組織と癒着しており、又は包まれて癒着している。
【0055】
吻合部の破壊圧力：
吻合部組織の破壊圧力は吻合部の癒合強度を測定する上で重要な機械的指標であり、それは腸管が耐えられる圧力の大きさを反映しているため、一般には吻合部の癒合強度を測定するために利用される。
吻合部組織の破壊圧力は吻合部の癒合強度を測定する上で重要な機械的指標であり、それは腸管が耐えられる圧力の大きさを反映しているため、一般には吻合部の癒合強度を測定するために利用される。
【0056】
術後７日目に吻合部の腸管部分の破壊圧力試験を行い、体外圧力測定法を用いた。吻合部とその周りの約５ｃｍの腸管を切り出して生理食塩水で腸内容物を洗い流した。腹腔内癒着を適切に剥離して、各吻合部の腸管部分を露出させ、腸管の片端に圧力計（ＹＢ－１５０Ａ精密圧力計）を接続させて、２本の絹糸で結紮して固定し、吻合部を隔てた他端は同様に２本の絹糸で結紮して腸管腔を閉鎖させ、腸管を圧力計と同じ高さに保った。蠕動ポンプを用いて１０ｍＬ／ｍｉｎの速度で腸管にメチレンブルー希釈液（０．１６ｍｇ／ｍＬ）を定速で注入し、吻合部を観察しながら、吻合部から青い液体が溢れた（又は圧力が突然低下した）時の圧力計の表示値を記録し、これが吻合部の破壊圧力であった。
【0057】
Ｈ＆Ｅ染色：
吻合部の組織を４％ホルムアルデヒド溶液で固定し、通常のパラフィン包埋を行い、４μｍに切片し、切片をキシレンで通常脱蝋し、各濃度のエタノールで洗浄し、最後には水で洗浄し、スライドガラスから水を切ってヘマトキシリン溶液に入れて染色し、時間は４分であった。１％塩酸・エタノールで分化し、弱アルカリ性水の中で約３０分間青色に戻し、流水で５～１０秒間洗い流して無水エタノールガラスタンクに入れて撹拌しながら３０秒間振とうし、次にスライドガラスから水を切ってエオシン染色液に入れた。染色後の切片を光学顕微鏡下で観察した。
吻合部の組織を４％ホルムアルデヒド溶液で固定し、通常のパラフィン包埋を行い、４μｍに切片し、切片をキシレンで通常脱蝋し、各濃度のエタノールで洗浄し、最後には水で洗浄し、スライドガラスから水を切ってヘマトキシリン溶液に入れて染色し、時間は４分であった。１％塩酸・エタノールで分化し、弱アルカリ性水の中で約３０分間青色に戻し、流水で５～１０秒間洗い流して無水エタノールガラスタンクに入れて撹拌しながら３０秒間振とうし、次にスライドガラスから水を切ってエオシン染色液に入れた。染色後の切片を光学顕微鏡下で観察した。
【0058】
マッソン（Ｍａｓｓｏｎ）染色：
組織を１０％中性緩衝ホルマリン溶液で固定して、流水で洗い流し、通常の脱水包埋を行った。鉄ヘマトキシリン（鉄ヘマトキシリンのＡ液、Ｂ液の等比率混合液）で１０分間染色した。１％塩酸・エタノール分化液で分化した後、ポンソー酸性フクシン液で１０分間染色し、リンモリブデン酸溶液で約５分間処理し、水洗せず直接アニリンブルー液で５分間再染色し、最後にエタノールで３回脱水し、キシレンで３回透徹させた。
組織を１０％中性緩衝ホルマリン溶液で固定して、流水で洗い流し、通常の脱水包埋を行った。鉄ヘマトキシリン（鉄ヘマトキシリンのＡ液、Ｂ液の等比率混合液）で１０分間染色した。１％塩酸・エタノール分化液で分化した後、ポンソー酸性フクシン液で１０分間染色し、リンモリブデン酸溶液で約５分間処理し、水洗せず直接アニリンブルー液で５分間再染色し、最後にエタノールで３回脱水し、キシレンで３回透徹させた。
【0059】
免疫組織化学染色：
パラフィン切片を水で脱蝋し、続いて抗原賦活用クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）が入った圧力鍋に組織切片を入れて抗原賦活化を行った。３％過酸化水素水溶液（過酸化水素：純水＝１：９）で内因性ペルオキシダーゼをブロックし、３％ＢＳＡを加えてブロッキングし、次に４℃で一次抗体と共に一晩インキュベートした。一次抗体に対応する種の二次抗体を加えて室温で５０分間インキュベートし、核をヘマトキシリンで染色した。インキュベートするたびに、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。蛍光顕微鏡（ＮＩＫＯＮ ＥＣＬＩＰＳＥ ＴＩ－ＳＲ）を用いて染色した細胞の写真を撮った。
パラフィン切片を水で脱蝋し、続いて抗原賦活用クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）が入った圧力鍋に組織切片を入れて抗原賦活化を行った。３％過酸化水素水溶液（過酸化水素：純水＝１：９）で内因性ペルオキシダーゼをブロックし、３％ＢＳＡを加えてブロッキングし、次に４℃で一次抗体と共に一晩インキュベートした。一次抗体に対応する種の二次抗体を加えて室温で５０分間インキュベートし、核をヘマトキシリンで染色した。インキュベートするたびに、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。蛍光顕微鏡（ＮＩＫＯＮ ＥＣＬＩＰＳＥ ＴＩ－ＳＲ）を用いて染色した細胞の写真を撮った。
【0060】
画像分析システムを用いて切片組織の測定領域を自動的に読み取り、それぞれ分析して測定領域内の弱、中程度、強陽性の細胞数を計算した（陰性は着色なしであり、スコア０と記し、弱陽性は薄黄色であり、スコア１と記し、中程度の陽性は黄褐色であり、スコア２と記し、強陽性は茶色であり、スコア３と記した）。組織化学スコア（Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｃｏｒｅ、Ｈ－ｓｃｏｒｅ）を計算して、陽性の強度を反映した。
【0061】
Ｈ－ｓｃｏｒｅ＝Σ（Ｐｉ×ｉ）＝（弱い強度の細胞のパーセンテージ（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｗｅａｋ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｃｅｌｌｓ）×１）＋（中程度の強度の細胞のパーセンテージ（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｍｏｄｅｒａｔｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｃｅｌｌｓ）×２）＋（強い強度の細胞のパーセンテージ（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｓｔｒｏｎｇ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｃｅｌｌｓ）×３）：式中、Ｐｉは陽性細胞の割合を表し、ｉは着色の強度を表す）。
【0062】
ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの合成及びその特性評価の結果：
ポリエチレングリコールヒドロキシル基によって開始される炭酸トリメチレンの開環重合により、ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣトリブロック共重合体を合成した（図２）。Ｓｎ（Ｏｃｔ）２の触媒で、ＴＭＣとＰＥＧが共重合してＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣブロック共重合体が合成された。異なるＰＥＧブロック比での共重合反応及び生成物の一部の物性を表１に示す。
ポリエチレングリコールヒドロキシル基によって開始される炭酸トリメチレンの開環重合により、ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣトリブロック共重合体を合成した（図２）。Ｓｎ（Ｏｃｔ）２の触媒で、ＴＭＣとＰＥＧが共重合してＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣブロック共重合体が合成された。異なるＰＥＧブロック比での共重合反応及び生成物の一部の物性を表１に示す。
【0063】
異なる分子量のブロック共重合体の分解速度及び機械的特性に違いが大きく、投入比はブロック共重合体の分子量に大きな影響を与え、腸管に埋め込むから製品には適切な分解速度と優れた機械的特性が求められるため、当試験では、ブロック共重合体ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの分子量及び特性に対する原料中のＴＭＣモノマーとＰＥＧの異なる比の影響を重点的に検討した。原料中のＴＭＣモノマーとＰＥＧの異なる質量比という要因を研究し、反応時間を２４時間に限定し、結果を表１に示す。データは、原料中のＰＥＧの割合の低減に伴い、ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの固有粘度が増加し、分子量が増大することを示す。
【0064】
ＰＴＭＣ、ＰＥＧ及び共重合体ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの赤外吸収スペクトルを図３に示す。共重合体ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ及びＰＴＭＣの１７３５ｃｍ－１及び１２１８ｃｍ－１での特徴的な吸収ピークが重なり、当該ピークは、それぞれ、炭酸エステルのカルボニル基とエーテル結合の特徴的なピークであった。１０９９ｃｍ－１におけるＰＥＧの特徴的な吸収ピーク及び１０９２ｃｍ－１におけるＰＴＭＣの特徴的な吸収ピークはＣ－Ｏの特徴的な吸収ピークであり、共重合体ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの１１０８ｃｍ－１におけるピークの相対強度は１０９２ｃｍ－１より高かった。
【0065】
図４はブロック共重合体ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの１Ｈ ＮＭＲスペクトルであった。それは化学シフトδ ４．２５ｐｐｍ（ａ）がＰＴＭＣブロック中の酸素の隣のメチレンプロトンに属し、δ ２．０６ｐｐｍ（ｂ）がＰＴＭＣブロック中の他のメチレンプロトンに属し、δ ３．６８ｐｐｍ（ｃ）がＰＥＧ主鎖中のメチレンプロトンに属することを明瞭に示す。
【0066】
ＤＳＣデータを表２に示す。ガラス転移温度は共重合体の組成に関係しており、共重合体におけるＰＥＧのモル分率は５０％から０．５％に低減し、ガラス転移温度は－３０．８８℃から－１９．４８℃に上昇していた。結果は、共重合体が生理的温度においていずれもゴム状態であり、体内埋め込みに適することを示す。
ａ．［η］＝ＫＭαより求められる。Ｋ＝１．９８６×１０－４、α＝０．７８９。
【表2】
【0067】
エレクトロスピニング繊維：
エレクトロスピニング繊維の形態は、電圧、紡糸の流速、紡糸の距離及び溶液の特性（例えば、粘度、導電率、表面張力）など様々なパラメータから決められる。サンプルの微視的形態に対するＰＥＧブロックの含有量の影響を知るために、異なる拡大倍率下の二次電子による走査型電子顕微鏡写真を得た（図５）。ＰＥＧブロックの含有量が０．４％から５０％に増加する時、繊維の直径が徐々に粗くなることが観察された。ＰＥＧの含有量が３０％を超える時、繊維の癒着現象が増え、繊維は不均一な状態になり始めた。図６はエレクトロスピニング膜の平均繊維直径及び直径分布を示す。ＰＥＧの含有量が２０％以下である時、似ている平均繊維直径が測定された。ＰＥＧの含有量がさらに増加する時、平均繊維直径が増加し、繊維直径の差も大きくなり、特にＰＥＧの含有量が５０％である時、繊維の平均直径は３．３６μｍに達していた。２０％及び３０％のサンプルの繊維癒着現象の変化はエレクトロスピニングプロセス中のジェットの不安定性から起こるということができ、エレクトロスピニングのジェットの安定性は紡糸溶液の特性（例えば、粘度、導電率）から影響を受け［５８］、ＰＥＧの添加は溶液の粘度及び張力を変えていた。エレクトロスピニングで安定的なジェットを実現するために、粘度と張力との間のバランスが必要である。表３はエレクトロスピニング繊維膜の孔隙率をまとめている。得られたエレクトロスピニング膜は７２％±２％から９８％±２％までの孔隙率を有しており、ＰＥＧ０．５％は最も高い孔隙率を有し、それは相対的に大きい孔径（図５）と狭くて均一な繊維直径分布（図６）を有するためであった。
エレクトロスピニング繊維の形態は、電圧、紡糸の流速、紡糸の距離及び溶液の特性（例えば、粘度、導電率、表面張力）など様々なパラメータから決められる。サンプルの微視的形態に対するＰＥＧブロックの含有量の影響を知るために、異なる拡大倍率下の二次電子による走査型電子顕微鏡写真を得た（図５）。ＰＥＧブロックの含有量が０．４％から５０％に増加する時、繊維の直径が徐々に粗くなることが観察された。ＰＥＧの含有量が３０％を超える時、繊維の癒着現象が増え、繊維は不均一な状態になり始めた。図６はエレクトロスピニング膜の平均繊維直径及び直径分布を示す。ＰＥＧの含有量が２０％以下である時、似ている平均繊維直径が測定された。ＰＥＧの含有量がさらに増加する時、平均繊維直径が増加し、繊維直径の差も大きくなり、特にＰＥＧの含有量が５０％である時、繊維の平均直径は３．３６μｍに達していた。２０％及び３０％のサンプルの繊維癒着現象の変化はエレクトロスピニングプロセス中のジェットの不安定性から起こるということができ、エレクトロスピニングのジェットの安定性は紡糸溶液の特性（例えば、粘度、導電率）から影響を受け［５８］、ＰＥＧの添加は溶液の粘度及び張力を変えていた。エレクトロスピニングで安定的なジェットを実現するために、粘度と張力との間のバランスが必要である。表３はエレクトロスピニング繊維膜の孔隙率をまとめている。得られたエレクトロスピニング膜は７２％±２％から９８％±２％までの孔隙率を有しており、ＰＥＧ０．５％は最も高い孔隙率を有し、それは相対的に大きい孔径（図５）と狭くて均一な繊維直径分布（図６）を有するためであった。
【表3】
【0068】
共重合体の親水性と疎水性：
材料の良好な親水性により、より良い生体適合性が得られ、ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの親水性と疎水性を評価するために、動的接触角試験によってサンプルの表面の水接触角を測定し、表４に示す。結果は、共重合体中のＰＥＧの含有量の低減に伴い、動的接触角が増大するということを明瞭に示し、これは共重合体の親水性が共重合体中のＰＥＧの含有量に正比例することを示す。５分間ごとにサンプルの表面の水接触角を測定し（図７（Ａ））、疎水性サンプルを含め全てのサンプルは時間の経過とともに接触角が小さくなることから、エレクトロスピニングより得た粗鬆の多孔質構造により材料は良い吸水性を有し、且つＰＥＧの含有量の増加により、接触角の変化速度が増大するということが示された。
材料の良好な親水性により、より良い生体適合性が得られ、ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの親水性と疎水性を評価するために、動的接触角試験によってサンプルの表面の水接触角を測定し、表４に示す。結果は、共重合体中のＰＥＧの含有量の低減に伴い、動的接触角が増大するということを明瞭に示し、これは共重合体の親水性が共重合体中のＰＥＧの含有量に正比例することを示す。５分間ごとにサンプルの表面の水接触角を測定し（図７（Ａ））、疎水性サンプルを含め全てのサンプルは時間の経過とともに接触角が小さくなることから、エレクトロスピニングより得た粗鬆の多孔質構造により材料は良い吸水性を有し、且つＰＥＧの含有量の増加により、接触角の変化速度が増大するということが示された。
【0069】
吸水率（図７（Ｂ））からも、繊維ステントの高い孔隙率と親水性ＰＥＧの添加がステントの吸水率を大幅に高めているということが裏付けられた。ＰＥＧの含有量が２０％を超える時、その吸水率の増大が明らかであった。
【表4】
【0070】
エレクトロスピニングサンプルの機械的特性の評価：
ＰＥＧブロックの比率が異なることは、材料の機械的特性にも大きな影響を与える。ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣを用いてエレクトロスピニングより製造した吻合ステントの機械的特性を表５に示す。ＰＥＧブロックの比例の低減に伴い、共重合体の弾性率はそれぞれ２９．７６±０．４７ＭＰａから１６．２７±０．０８ＭＰａに低減し、また引張強さ及び破断伸びは共に低減しており、これはＰＥＧが半結晶性ミクロ相の状態であり、ステントに対して可塑化及び硬化させる効果があり、ＰＥＧの増加に伴い、材料の結晶化度が増大し、破断伸びが低減するためであった。
ＰＥＧブロックの比率が異なることは、材料の機械的特性にも大きな影響を与える。ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣを用いてエレクトロスピニングより製造した吻合ステントの機械的特性を表５に示す。ＰＥＧブロックの比例の低減に伴い、共重合体の弾性率はそれぞれ２９．７６±０．４７ＭＰａから１６．２７±０．０８ＭＰａに低減し、また引張強さ及び破断伸びは共に低減しており、これはＰＥＧが半結晶性ミクロ相の状態であり、ステントに対して可塑化及び硬化させる効果があり、ＰＥＧの増加に伴い、材料の結晶化度が増大し、破断伸びが低減するためであった。
【0071】
ステント材料の生理学的条件下の機械的特性は埋め込み材料としての重要な指標の１つであり、生理学的条件下の材料の機械的特性を観察するために、試験前に、サンプルをＰＢＳ溶液に２４時間浸漬し、次に、サンプルのＰＥＧの含有量が２０％を超える時、ステントの引張強さ及び弾性率を大きく低減させるという影響について試験した。サンプルをＰＢＳに２４時間浸漬した後にステントの破断伸びはいずれもある程度増加しており（図８（Ｃ））、これはステントの親水性の更なる増大のためであった。ＰＥＧの添加量が２０％以上である時、ステントは吸水した後、その弾性率及び破断伸びの変化の差が大きく（図８（Ａ）、（Ｂ））、これは生理学的条件下で、その機械的特性が不安定であるということを示し、これは望ましくないことである。ＰＥＧの含有量が少ないほど、乾燥状態と湿潤状態下の機械的特性の差が小さく、しかしながらＰＥＧの含有量が０．５％である時、ステントはほぼ親水性を持たないため、腸管吻合ステントの設計の原点から逸脱しているのであった。以上から分かるように、ＰＥＧを添加すると材料の機械的特性は変わるが、マクロレベルにおいてこの傾向を知るために、図８（Ｄ）からその影響及び変化の傾向を直感的に見ることができ、目的に照らして、我々はＰＥＧの含有量が１０～２０％である時、その機械的特性及び親水性は埋め込みの要件に適合すると考える。当該範囲内では、吻合ステントが一定の親水性を有し、且つ乾燥及び湿潤状態ではいずれも機械的特性が非常に安定的であり、一定の機械的強度が保たれ且つ優れた従順性があり、これは強度を満たすと同時に異物感と不快感がないことを保証し、腸管が損傷する時に良好な担体として組織を修復できる。
ａ：吸水率、ｂ：弾性率（そのまま）、ｃ：弾性率（２４時間予備湿潤）、ｄ：引張強さ（そのまま）、ｅ：引張強さ（２４時間予備湿潤）、ｆ：伸び：破断伸び（完成品）、ｇ：破断伸び（２４時間予備湿潤）。
【表5】
【0072】
親水性、機械的特性、体外酵素溶液での分解といった総合的な要因から、当方はＰＥＧの含有量が１０～２０％以内であれば、ステントの総合的な性能は当方の期待に沿えると考える。当試験ではＰＥＧの含有量が１５％であるサンプルを吻合ステントとして選択してマウスの盲腸に埋め込み、後の体内分解及び癒合促進効果を観察した。そのため、当方は当該ＰＥＧの含有量のサンプルを選択してエレクトロスピニングを行って、異なるエレクトロスピニングパラメータより得た異なる厚さのサンプルの機械的特性に対する影響を研究した。
【0073】
同じエレクトロスピニングパラメータより得た異なる厚さのサンプルの機械的特性に対する影響の研究：
親水性、機械的特性、体外酵素溶液での分解といった総合的な要因から、当方はＰＥＧの含有量が１０～２０％以内であれば、ステントの総合的な性能は当方の期待に沿えると考える。当試験ではＰＥＧの含有量が１５％であるサンプルを吻合ステントとして選択してマウスの盲腸に埋め込み、後の体内分解及び癒合促進効果を観察した。そのため、当方は当該ＰＥＧの含有量のサンプルを選択してエレクトロスピニングを行って、異なるエレクトロスピニングパラメータより得た異なる厚さのサンプルの機械的特性に対する影響を研究した。
親水性、機械的特性、体外酵素溶液での分解といった総合的な要因から、当方はＰＥＧの含有量が１０～２０％以内であれば、ステントの総合的な性能は当方の期待に沿えると考える。当試験ではＰＥＧの含有量が１５％であるサンプルを吻合ステントとして選択してマウスの盲腸に埋め込み、後の体内分解及び癒合促進効果を観察した。そのため、当方は当該ＰＥＧの含有量のサンプルを選択してエレクトロスピニングを行って、異なるエレクトロスピニングパラメータより得た異なる厚さのサンプルの機械的特性に対する影響を研究した。
【0074】
乾燥後のサンプルをクロロホルム／ＤＭＦ（９：１、Ｖ：Ｖ）混合溶液に溶解し、調製した溶液の濃度は５．５％であり、３７℃でシェーカーに３６時間置いてサンプルが充分に溶解することにより、均一な共溶解紡糸原液を得た。原液を２．５ｍＬの注射器に入れ、当該注射器は内径が０．５ｍｍである１本の金属針を含む。具体的なエレクトロスピニングの条件の詳細は表１を参照する。紡糸後のサンプルの厚さは具体的なエレクトロスピニング時間によって決められた。得られた繊維を箱型真空乾燥機の中で室温でさらに２４時間乾燥して、残留した有機溶媒及び水分を除去した。紡糸後のサンプルを用いて機械的特性試験及び体外分解試験を行った。
【0075】
エレクトロスピニングの条件
【表6】
【表7】
【0076】
体外生分解性の評価：
ポリマーの親水性はその分解挙動及び生体適合性に大きな影響を与える。ＰＴＭＣホモポリマーの分解速度が非常に遅いから、ＴＭＣとＰＥＧ、ラクトン、乳酸の共重合はすでにＰＴＭＣの分解特性を改善するための効果的な方式となっており、これはＰＴＭＣの医療材料としての応用範囲を大いに拡大させている。疎水性主鎖に親水性ブロックを導入することによりＨ２Ｏの基材への浸透を加速させることができるため、これは分解率を高めるための簡単かつ効果的な方法である。本明細書で合成された親水性ＰＥＧブロックを含むＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体はＰＴＭＣホモポリマーよりも良い分解特性を有している。
ポリマーの親水性はその分解挙動及び生体適合性に大きな影響を与える。ＰＴＭＣホモポリマーの分解速度が非常に遅いから、ＴＭＣとＰＥＧ、ラクトン、乳酸の共重合はすでにＰＴＭＣの分解特性を改善するための効果的な方式となっており、これはＰＴＭＣの医療材料としての応用範囲を大いに拡大させている。疎水性主鎖に親水性ブロックを導入することによりＨ２Ｏの基材への浸透を加速させることができるため、これは分解率を高めるための簡単かつ効果的な方法である。本明細書で合成された親水性ＰＥＧブロックを含むＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体はＰＴＭＣホモポリマーよりも良い分解特性を有している。
【0077】
ＰＴＭＣは主に体外酵素分解及び体内表面侵食より分解されるということは文献に記載されており、ＰＴＭＣはＰＢＳ溶液の中で不活性であり、質量と相対分子量はほぼ変わらず、ＰＴＭＣの酵素溶液における重量損失率は加水分解による重量損失率をはるかに上回っている。ＰＢＳ溶液におけるＰＴＭＣの安定性とリパーゼ溶液におけるその迅速な分解はリパーゼが分解反応に関与していることを示す。ＺｈａｎｇらもＹａｎｇらも酵素は界面活性化の役割を果たし、酵素は分解された生成物の溶液へと流出する速度を加速させることができると考えている。分解生成物の拡散におけるリパーゼの界面活性剤としての役割から、ＰＴＭＣは高い体外酵素分解率を有し、そのため体外では酵素分解を重点的に注目する。これまで、共重合体の形態が分解に大きな影響を与えるということは多くの報告に見られるため、腸管ステントについて、当方はエレクトロスピニング後の膜状材料の分解特性を研究した。
【0078】
重量損失率に対する酵素の影響を研究し（図９（Ａ））、試験結果は、ＰＥＧの割合の増加に伴い、ブロック共重合体ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの親水性が向上し、分解が早くなるということを示す。リパーゼ溶液のｐＨは６．０８であり、分解過程の溶液のｐＨの変化を観察したところ、ほぼ変わらなかった（図９（Ｂ））。
【0079】
当方は、腸管吻合ステントとしては、その機械的特性を満たすことを前提に、良好な親水性及び適切な分解速度を有するのは好ましいと考える。ＰＥＧの含有量の高いステントは親水性が良好であるが、分解速度が非常に早く、且つ結晶領域がステントの機械的特性に大きな影響を与えるため、吸水後の機械的特性は不安定になる。ＰＥＧの含有量が１０～２０％の範囲である場合、ステントは優れたかつ安定的な機械的特性を有し、複雑な腸管環境への要件を満たしており、且つその分解速度は過不足がなく、２週間で４０～５０％の分解になり、ある程度の親水性により、良好な生体適合性が得られた。
【0080】
当回の動物試験の対象は雄のＳＤラットであり、ラットの腸管癒合期間は１４日程度であることから、腸管に埋め込まれた吻合ステントは少なくとも２週間持続する機械的特性の強さと、約３週間で分解されるという要件を満たすべきである。腸管環境と体外酵素溶液との違いから、生理的環境における材料の分解速度は酵素溶液のそれより低く、両者の分解速度の関係性については現在まだ定量的なデータがなく、当方が以前に実施した試験によれば、体外酵素分解の速度は体内分解より少し早い。親水性、機械的特性、体外酵素溶液での分解といった総合的な要因から、当方はＰＥＧの含有量が１０～２０％以内であれば、ステントの総合的な性能は当方の期待に沿えると考える。当試験ではＰＥＧの含有量が１５％であるサンプルを吻合ステントとして選択してマウスの盲腸に埋め込み、後の体内分解及び癒合促進効果を観察した。
【0081】
体内吻合ステントを対応する時点に取り出して微視的形態を観察した（図９（Ｃ））。吻合ステントの質量及び長さは、程度の差はあるがいずれも減少しており（図９（Ｅ）、（Ｆ））、２１日後に質量は４０％以上減少し、長さは７０％減少しており、このように長さの減少率が質量損失率をはるかに上回っていることの原因は、材料の吸水にある可能性がある。体内分解後にその形態は崩れ始めているが、マクロレベルにおいて全体としてよく維持されており（図９（Ｄ））、依然として一定の支持効果があった。２８日後にラットの盲腸を解剖したところ、吻合ステントが見つからないため、２１日後にステントは崩壊の加速により腸管の老廃物と共に代謝・排出され、又は機械的特性が腸管を支持するのに不十分であるため手術縫合糸から切り離されて排出されると想定される。しかしどちらの場合でも、ステントは少なくとも体内で吻合部を２週間保護するという要件を満たしているため、当方は分解に関してはＰＥＧの含有量が１５％である材料が優れると考えている。
【0082】
体外生物学的評価：
抗菌：
周知のように、創傷が癒合する過程では細菌に感染する可能性があり、これは創傷の癒合を遅らせてしまう。腸管中の微生物と細菌は数え切れないほどあり、細菌の桁数は１０１４に達し、種類は１０００種を超えており［６３，６４］、他の上皮と比べて、腸管の癒合中に出現する病原性細菌はより高い密度を有し、それらは創傷の癒合という正常な生理的プロセスをかき乱す。手術部位の性質上、腸管吻合部で比較的清潔な環境を保つのは難しいから、この時には吻合ステントの抗菌と隔離効果が非常に重要な役割を果たす。
抗菌：
周知のように、創傷が癒合する過程では細菌に感染する可能性があり、これは創傷の癒合を遅らせてしまう。腸管中の微生物と細菌は数え切れないほどあり、細菌の桁数は１０１４に達し、種類は１０００種を超えており［６３，６４］、他の上皮と比べて、腸管の癒合中に出現する病原性細菌はより高い密度を有し、それらは創傷の癒合という正常な生理的プロセスをかき乱す。手術部位の性質上、腸管吻合部で比較的清潔な環境を保つのは難しいから、この時には吻合ステントの抗菌と隔離効果が非常に重要な役割を果たす。
【0083】
この課題を解決するために、抗菌剤トリクロサンを一定の比率でサンプルに添加し、材料に抗菌性を持たせて、創傷部が比較的清潔であることを保証した。図１０に示すように、トリクロサンを含まないサンプルは細菌への抵抗力がなく、トリクロサンを添加したサンプルは緑膿菌、大腸菌及び黄色ブドウ球菌に対して明らかな阻害領域があった。ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの分解は表面侵食分解であり、表面から徐々に内部へと分解していく過程であるため、トリクロサンがゆっくりと放出されて滅菌の役割を果たし続けることになる。
【0084】
溶血率：
吻合ステントが腸吻合部に直接接触するため、材料の関係で赤血球が破裂してしまえば、一般にアデノシン二リン酸が放出され、血小板の凝集が加速されることで、血栓が発生する。体外の材料を血液に直接接触させることにより、吻合ステントの溶血性を評価し、試験結果を図１１に示し、その溶血率は０．１％未満であり、埋め込み型医療機器の５％の上限値をはるかに下回っていた。ＰＥＧを親水性部分として導入すると、材料が水分と接触して１つの「水膜」を形成できる。このような水層は、赤血球の疎水性基材との直接接触を効果的に防止して、材料自体が引き起こす赤血球破裂の問題を最大限に緩和することができる。
吻合ステントが腸吻合部に直接接触するため、材料の関係で赤血球が破裂してしまえば、一般にアデノシン二リン酸が放出され、血小板の凝集が加速されることで、血栓が発生する。体外の材料を血液に直接接触させることにより、吻合ステントの溶血性を評価し、試験結果を図１１に示し、その溶血率は０．１％未満であり、埋め込み型医療機器の５％の上限値をはるかに下回っていた。ＰＥＧを親水性部分として導入すると、材料が水分と接触して１つの「水膜」を形成できる。このような水層は、赤血球の疎水性基材との直接接触を効果的に防止して、材料自体が引き起こす赤血球破裂の問題を最大限に緩和することができる。
【0085】
細胞毒性：
Ｌ９２９細胞を細胞毒性及び細胞適合性の体外試験に用いて、純粋なＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ及びトリクロサンを添加したＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの細胞適合性を評価した（図１２）。Ｌ９２９細胞をサンプルと共に２４時間、４８時間インキュベートし、且つトリクロサンを添加したサンプルの細胞毒性を表す値は単純なブロック共重合体と大差がなく、細胞生存率はいずれも９０％以上に保たれており、これはトリクロサンの添加量は効果的かつ実施可能であり、滅菌効果をもたらすと同時に組織細胞を傷つけることはないということを示していた。
Ｌ９２９細胞を細胞毒性及び細胞適合性の体外試験に用いて、純粋なＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ及びトリクロサンを添加したＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの細胞適合性を評価した（図１２）。Ｌ９２９細胞をサンプルと共に２４時間、４８時間インキュベートし、且つトリクロサンを添加したサンプルの細胞毒性を表す値は単純なブロック共重合体と大差がなく、細胞生存率はいずれも９０％以上に保たれており、これはトリクロサンの添加量は効果的かつ実施可能であり、滅菌効果をもたらすと同時に組織細胞を傷つけることはないということを示していた。
【0086】
創傷回復状況の評価：
腹腔内癒着スコアリング及び吻合部の破壊圧力：
腸管吻合部の癒合には主に炎症反応、細胞増殖、腸壁構造の再構成などの段階があり、機械的、組織学的及び機能的の３つの面の修復を実現しないと最終的には癒合にたどり着けない。そのうち機能的な修復は非常に長いプロセスであり、消化吸収、内外分泌、神経修復及び伝播性の収縮運動（ｍｉｇｒａｔｉｎｇ ｍｏｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ）に関わり、機械的な面及び組織学的な面で指標を満たさないと、吻合部の癒合が完了すると考えることはできない。手術操作と結び付ければ、動物試験の段階では次の指標を満たすべきである。破壊圧力試験：機械的癒合の指標、腹腔内癒着スコアリング：吻合部の近くの局所的な炎症状況の反映、吻合部組織のＨＥ染色、マッソン（Ｍａｓｓｏｎ）染色及び免疫組織化学染色：炎症細胞の浸潤の程度と、コラーゲンの沈着状況の評価。
腹腔内癒着スコアリング及び吻合部の破壊圧力：
腸管吻合部の癒合には主に炎症反応、細胞増殖、腸壁構造の再構成などの段階があり、機械的、組織学的及び機能的の３つの面の修復を実現しないと最終的には癒合にたどり着けない。そのうち機能的な修復は非常に長いプロセスであり、消化吸収、内外分泌、神経修復及び伝播性の収縮運動（ｍｉｇｒａｔｉｎｇ ｍｏｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ）に関わり、機械的な面及び組織学的な面で指標を満たさないと、吻合部の癒合が完了すると考えることはできない。手術操作と結び付ければ、動物試験の段階では次の指標を満たすべきである。破壊圧力試験：機械的癒合の指標、腹腔内癒着スコアリング：吻合部の近くの局所的な炎症状況の反映、吻合部組織のＨＥ染色、マッソン（Ｍａｓｓｏｎ）染色及び免疫組織化学染色：炎症細胞の浸潤の程度と、コラーゲンの沈着状況の評価。
【0087】
それぞれ、術後７日目、１４日目、２１日目、２８日目に開腹し、腹腔内癒着の状況についてスコアリングし、結果の詳細を図１３に示す。損傷の刺激又は感染により、腹腔では局所的にフィブリノゲンのコロイド溶液が生成し、それは早くフィブリンの凝固物に変わって損傷した粘膜の表面を覆って、修復保護の役割を果たす。フィブリンは高い接着性を有するため、互いに隣接する腹腔の粘膜をつなげる。損傷が癒合した後は、体がこれらのフィブリンを良好に吸収できれば、痕跡は残らない。吸収が不完全であれば、癒着は存在し続け、深刻な場合は癒着性腸閉塞になり、腸管の正常な生理的活動に影響を与える。吻合ステントによる癒合支援群は癒着がブランク対照群より明らかに少なく、これは吻合ステントが創傷と腸管内容物の直接接触を効果的に遮り、感染の発生を軽減させることにより、吻合部の修復・癒合速度が早くなるためであった。
【0088】
吻合部の破壊圧力は腸管吻合術から一定の期間後の吻合部の癒合の強度を効果的に反映でき、当該機械的指標で、吻合部が耐えられる張力の大きさを定量的に示すことができる。腸管が癒合する過程では、粘膜の下層のコラーゲン合成の沈着と再構築の速度との間のバランスは大きな要因である。組織修復の不足又は過剰はいずれも正常な腸管の機能に影響を与え、修復が不足する場合は潰瘍と瘻が起こり、修復過剰は繊維症と狭窄を引き起こす。術後４日目までは、コラーゲンの再構築の速度は沈着の速度をはるかに上回り、術後５日目からは、コラーゲンの沈着がメインとなり、最終的に７日目には増殖期のピークに達していた。増殖期のピークへの到達の遅延又は損傷は吻合部の裂開を引き起こす可能性がある。コラーゲンの沈着過剰と炎症は吻合部の狭窄を引き起こす。そのため、術後７日目に、吻合部の局所的な状況に影響を与えないことを前提として、癒着を剥離し、次に手術対象区間の盲腸を取得し、吻合部盲腸区間の破壊圧力試験を行った（図１３）。対照群で生存する２０匹のラットの破壊圧力は１８３ｍｍＨｇであり、吻合ステント群で生存する２０匹のラットの１９７．６ｍｍＨｇ（ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ群）、２１７．３ｍｍＨｇ（ＴＣＳ／ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ群）より低かった。吻合ステントは創傷の癒合に明らかな促進効果を果たし、且つトリクロサンを加えるのは創傷部の細菌を減らし、創傷の癒合に役立った。３群では統計学的有意差があった（Ｐ＜０．００１）。
【0089】
組織学的分析：
急性及び慢性腸炎の間に、マクロファージ及び好中球は活性酸素種及び組織分解酵素を分泌することにより局所的な組織損傷を誘導する。組織の損傷が深刻な場合は、筋線維芽細胞が欠損した部位まで遊走する。炎症は、Ｔ細胞、マクロファージ、好中球などの免疫細胞の浸潤に関係しており、それが常に炎症の起きる組織に深刻な損傷をもたらす。このような持続的な炎症は繊維症及び狭窄の形成を引き起こす可能性がある。
急性及び慢性腸炎の間に、マクロファージ及び好中球は活性酸素種及び組織分解酵素を分泌することにより局所的な組織損傷を誘導する。組織の損傷が深刻な場合は、筋線維芽細胞が欠損した部位まで遊走する。炎症は、Ｔ細胞、マクロファージ、好中球などの免疫細胞の浸潤に関係しており、それが常に炎症の起きる組織に深刻な損傷をもたらす。このような持続的な炎症は繊維症及び狭窄の形成を引き起こす可能性がある。
【0090】
当方は、術後の対応する時点に、吻合部の近くの腸壁組織に対してＨ＆Ｅ及びマッソン（Ｍａｓｓｏｎ）染色を行った（図１５）。時間順で、組織癒合の過程を炎症期、増殖期及び再構築期に分けることができ、３つのプロセスでは厳密な境界がない。一般には、７日目は炎症期と増殖期の境目とされ、１４日目は増殖期と再構築期の境目とされる。炎症期は好中球を中心とする炎症細胞の凝集及び浸潤として認識され、増殖期は線維芽細胞数の増加、無秩序に並んだ大量の弱いコラーゲン繊維の生成として認識され、再構築期では急性炎症が明らかに減少し、代わりに慢性炎症のマーカーである多核巨細胞が生成され、且つコラーゲン繊維は明らかに増加する。ＨＥ染色は炎症細胞の浸潤の程度を反映することができる。術後の対応する時点で、対照群の炎症細胞の浸潤は吻合ステント支援群を明らかに上回り、トリクロサンを添加した吻合ステント群の炎症細胞はトリクロサンを添加しなった吻合ステント群より明らかに少なかった。マッソン（Ｍａｓｓｏｎ）染色の方も上述したことを裏付けており、ステント群は細菌を隔絶させて炎症反応を低減させているため、繊維の再生に役立ち、トリクロサンの添加は創傷の癒合を一層促進していた。
【0091】
免疫組織化学分析：
創傷の修復は細胞によって分泌される成長因子、例えば、トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）を介して行われる。ＴＧＦ－βはα－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）の最も効果的かつ重要な誘導物質である。実験的小腸・結腸炎及びクローン病患者の繊維化部位の筋線維芽細胞の中で、ＴＧＦ－βが増加している。トランスフォーミング成長因子はｉ型コラーゲンの発現を誘導でき、且つα－ＳＭＡの発現を効果的に刺激できる。創傷形成の初期に、ＴＧＦ－βが大量に生成するが、ＴＧＦ－βレベルが高くあり続けると創傷部にはコラーゲン繊維が過剰に凝集して繊維症となり、そのため創傷の癒合に伴い、ＴＧＦ－βレベルは徐々に低下していく。創傷部のＴＧＦ－βレベルを測定すれば、創傷回復の早さとその良さを直感的に知ることができる。
創傷の修復は細胞によって分泌される成長因子、例えば、トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）を介して行われる。ＴＧＦ－βはα－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）の最も効果的かつ重要な誘導物質である。実験的小腸・結腸炎及びクローン病患者の繊維化部位の筋線維芽細胞の中で、ＴＧＦ－βが増加している。トランスフォーミング成長因子はｉ型コラーゲンの発現を誘導でき、且つα－ＳＭＡの発現を効果的に刺激できる。創傷形成の初期に、ＴＧＦ－βが大量に生成するが、ＴＧＦ－βレベルが高くあり続けると創傷部にはコラーゲン繊維が過剰に凝集して繊維症となり、そのため創傷の癒合に伴い、ＴＧＦ－βレベルは徐々に低下していく。創傷部のＴＧＦ－βレベルを測定すれば、創傷回復の早さとその良さを直感的に知ることができる。
【0092】
創傷感染は負傷した患者が死亡する主な原因の１つであるため、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）を監視指標として選び、免疫組織化学分析により感染の予防における吻合ステントの効果について試験した。ＴＮＦ－αは腫瘍細胞を直接殺すことができ正常な細胞に対して明らかな毒性がないサイトカインであり、つまりそれはＴ細胞による様々な炎症因子の生成を促進し、さらに炎症反応の発生を促進することができる。組織に多くの炎症が生じれば、ＴＮＦ－αは比較的高いレベルで測定される。
【0093】
結論：
吻合後の腸管の癒合は複雑かつ長い生理学的プロセスである。実際には、腸管の吻合は物理的癒合、組織学的癒合及び生理学的癒合の３つのプロセスを含む。物理的癒合とは吻合後の腸管が腸管腔を閉鎖させることができ、腸管内容物は腹腔に入ることができず、腸壁は一定の圧力に耐えられることを指す。組織学的癒合とは吻合部の粘膜上皮は組織学的に結合していることを指す。吻合部の両端の腸管には本来の神経支配が戻り、全体において規律的な腸管運動と蠕動を実現することを指し、このプロセスを生理学的癒合と呼ぶ。７週間の破壊圧力試験の結果は吻合ステントの埋め込みが吻合部の物理的癒合を促進していることを裏付けており、マッソン（Ｍａｓｓｏｎ）染色の結果は吻合ステント群ではコラーゲンがより良く形成され、吻合部の組織学的癒合を促進できることを示していた。
吻合後の腸管の癒合は複雑かつ長い生理学的プロセスである。実際には、腸管の吻合は物理的癒合、組織学的癒合及び生理学的癒合の３つのプロセスを含む。物理的癒合とは吻合後の腸管が腸管腔を閉鎖させることができ、腸管内容物は腹腔に入ることができず、腸壁は一定の圧力に耐えられることを指す。組織学的癒合とは吻合部の粘膜上皮は組織学的に結合していることを指す。吻合部の両端の腸管には本来の神経支配が戻り、全体において規律的な腸管運動と蠕動を実現することを指し、このプロセスを生理学的癒合と呼ぶ。７週間の破壊圧力試験の結果は吻合ステントの埋め込みが吻合部の物理的癒合を促進していることを裏付けており、マッソン（Ｍａｓｓｏｎ）染色の結果は吻合ステント群ではコラーゲンがより良く形成され、吻合部の組織学的癒合を促進できることを示していた。
【0094】
吻合部の張力は癒合不良につながる主な原因である。この張力は組織から来てもよいし、持続的に緊張している血管への血液供給不足が引き起こす可能性もある。当試験で製造した腸管吻合ステントは組織従順性を備えるため、このような張力を大いに軽減できるため、吻合部にはより良い癒合効果が得られる。また、吻合ステントは細菌やウィルスなどの不利な要因を効果的に隔絶させて、創傷に比較的清潔な環境を作ることができ、これは吻合部の癒合にとって極めて重要であり、Ｈ＆Ｅ染色、ＴＧＦ－β及びＴＮＦ－αはいずれも上記の結論を裏付けていた。
【0095】
なお、上記の特定の実施形態で本発明を説明しているが、本発明の趣旨は当該開示に限定されず、本発明の趣旨を用いた作り変えであれば、いずれも本特許の請求範囲に入るということを当業者は知るべきである。
【0096】
上述したのは本発明の好ましい実施形態に過ぎず、本発明の請求範囲は上記の実施例に限定されず、本発明の趣旨に基づく技術的解決手段であればいずれも本発明の請求範囲に属する。なお、当業者は本発明の原理を逸脱しない限りはいくつかの改良と修飾を行うことができ、これらの改良と修飾も本発明の請求範囲と見なすべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【手続補正書】
【提出日】2023-11-14
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体に基づく生体柔軟性エラストマー腸吻合ステントであって、前記腸吻合ステントは全体としてＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体材料を用いて作製され、前記ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体は高分子医療材料ＰＴＭＣ及びＰＥＧに対して開環重合の方法を用いて合成されるトリブロックＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体であり、前記ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体中のＰＥＧの含有量は１０～２０％であり、前記腸吻合ステントの厚さは０．０５～０．３ｍｍであることを特徴とする生体柔軟性エラストマー腸吻合ステント。
【請求項2】
前記生体柔軟性エラストマー腸吻合ステントのＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体材料にトリクロサン（ｔｒｉｃｌｏｓａｎ、ＴＣＳ）が担持されることを特徴とする請求項１に記載の生体柔軟性エラストマー腸吻合ステント。
【請求項3】
前記腸吻合ステント内にはさらに植物性セルローススリーブが設けられ、前記腸吻合ステントは隙間のない嵌着構造であり、内部は植物性セルロース材料の管であり、外部はＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣ共重合体材料であることを特徴とする請求項１に記載の生体柔軟性エラストマー腸吻合ステント。
【請求項4】
（１）ＰＴＭＣ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＣの開環重合：ＰＥＧ及びＴＭＣモノマーを反応容器に移し、Ｎ２雰囲気下、触媒Ｓｎ（Ｏｃｔ）２を無水トルエン溶液に溶解し、ピペットで１００ｐｐｍを取り出して反応容器に加えて共重合反応させ、プロセス全体で水と酸素がないことを保証し、２４時間後に生成物を溶解し、完全に溶解すると、ポリマー溶液を精製し、複数回繰り返し、精製後の共重合体を箱型真空乾燥機の中で４８時間乾燥し、次に乾燥キャビネットの中で保管するステップ、（２）エレクトロスピニングによる吻合ステントの製造：乾燥後のサンプルをＤＭＦ／ＴＨＦ混合溶液に溶解し、調製した溶液の濃度は５～１０．０％であり、混合溶液の０．１～１．０ｗｔ％で抗菌剤を加え、混合後に３７℃でシェーカーに置いてサンプルが充分に溶解することにより、均一な共溶解紡糸原液を得て、原液を２．５ｍＬの注射器に入れ、当該注射器は内径が０．５ｍｍである１本の金属針を含み、紡糸後のサンプルの厚さは０．２±０．０１ｍｍであり、得られた繊維を箱型真空乾燥機の中で室温でさらに乾燥して、残留した有機溶媒及び水分を除去するステップより製造することを特徴とする請求項１に記載の生体柔軟性エラストマー腸吻合ステントの製造方法。
【請求項5】
前記ステップ（１）でＴＭＣモノマーは７０～９０ｗｔ％であり、ＰＥＧは５～２９ｗｔ％であり、触媒Ｓｎ（Ｏｃｔ）２溶液は１～５ｗｔ％であることを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
【請求項6】
前記ステップ（１）で共重合反応の条件は温度１００～１５０℃、反応時間２４～４８時間であることを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
【請求項7】
前記ステップ（１）で生成物の溶解の条件はＣＨＣｌ３又はＤＭＦ又はＴＨＦで溶解して、シェーカーに置き、シェーカーの温度を３７℃と設定することであることを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
【請求項8】
前記ステップ（１）で精製の条件はｎ－ヘキサン又はエタノールで精製し、且つガラス棒で不断に撹拌することであることを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
【請求項9】
前記ステップ（２）でＤＭＦ／ＴＨＦ混合溶液中のＤＭＦ：ＴＨＦ＝１：１であることを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
【請求項10】
前記ステップ（２）の紡糸ステップは、具体的には、所定のサイズの植物性セルローススリーブをエレクトロスピニングレセプターに嵌めて紡糸し、パラメータを制御して対応するサイズの管を得ることができることであり、前記針先の押し速度はＶ＝１．０～５．０ｍＬ／ｈであり、ローラーの回転速度はＶ＝１００～５００ｒｐｍであり、温度Ｔ＝２５～３５℃、湿度ＷＥＴ＝２０～４０％であることを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
【国際調査報告】