特表2024-515005関節軟骨欠損の修復における骨髄間葉系幹細胞エクソソームの応用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-04
(54)【発明の名称】関節軟骨欠損の修復における骨髄間葉系幹細胞エクソソームの応用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0775 20100101AFI20240328BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240328BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20240328BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0775
A61P19/02
A61K35/28
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023551722
(86)(22)【出願日】2022-10-19
(85)【翻訳文提出日】2023-08-24
(86)【国際出願番号】 CN2022126040
(87)【国際公開番号】W WO2023179000
(87)【国際公開日】2023-09-28
(31)【優先権主張番号】202210620951.3
(32)【優先日】2022-06-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511128206
【氏名又は名称】南通大学
(74)【代理人】
【識別番号】100095407
【弁理士】
【氏名又は名称】木村 満
(74)【代理人】
【識別番号】100132883
【弁理士】
【氏名又は名称】森川 泰司
(74)【代理人】
【識別番号】100148633
【弁理士】
【氏名又は名称】桜田 圭
(74)【代理人】
【識別番号】100147924
【弁理士】
【氏名又は名称】美恵 英樹
(72)【発明者】
【氏名】孫 誠
(72)【発明者】
【氏名】顧 暁松
(72)【発明者】
【氏名】▲ゴン▼ 蕾蕾
(72)【発明者】
【氏名】从 猛
(72)【発明者】
【氏名】楊 洪偉
(72)【発明者】
【氏名】張 愉
(72)【発明者】
【氏名】李 枚原
(72)【発明者】
【氏名】王 暁敏
(72)【発明者】
【氏名】徐 来
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065BC03
4B065BC07
4B065BD15
4B065BD18
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA04
4C087BB44
4C087CA04
4C087NA14
4C087ZA96
(57)【要約】
【課題】骨髄間葉系幹細胞エクソソームの関節軟骨欠損の修復中の応用を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明は、バイオ医薬品の分野に属し、特に、骨髄間葉系幹細胞エクソソームの調製方法及び関節軟骨欠損の修復における応用に関する。前記骨髄間葉系幹細胞エクソソームは、培地により骨髄間葉系幹細胞を刺激して産生され、継代後に培養液から骨髄間葉系幹細胞エクソソームを抽出し、前記骨髄間葉系幹細胞は腸骨又は大腿骨の骨髄に由来する。骨髄間葉系幹細胞から調製された細胞外小胞は、エクソソームの典型的な特徴を有しており、調製したエクソソームは軟骨細胞の活性を向上し、細胞増殖を促進させ、細胞遊走能を増強することができる。ウサギ関節軟骨欠損モデルにおいて、調製したエクソソームは軟骨修復を大幅に促進することができる。
【選択図】図１
【解決手段】本発明は、バイオ医薬品の分野に属し、特に、骨髄間葉系幹細胞エクソソームの調製方法及び関節軟骨欠損の修復における応用に関する。前記骨髄間葉系幹細胞エクソソームは、培地により骨髄間葉系幹細胞を刺激して産生され、継代後に培養液から骨髄間葉系幹細胞エクソソームを抽出し、前記骨髄間葉系幹細胞は腸骨又は大腿骨の骨髄に由来する。骨髄間葉系幹細胞から調製された細胞外小胞は、エクソソームの典型的な特徴を有しており、調製したエクソソームは軟骨細胞の活性を向上し、細胞増殖を促進させ、細胞遊走能を増強することができる。ウサギ関節軟骨欠損モデルにおいて、調製したエクソソームは軟骨修復を大幅に促進することができる。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
関節軟骨疾患の治療薬の調製における骨髄間葉系幹細胞エクソソームの応用であって、前記骨髄間葉系幹細胞エクソソームは、培地により骨髄間葉系幹細胞を刺激して産生され、継代後に培養液から前記骨髄間葉系幹細胞エクソソームを抽出し、前記骨髄間葉系幹細胞は腸骨又は大腿骨の骨髄に由来することを特徴とする、応用。
【請求項2】
前記応用は、軟骨細胞の活性を促進するための薬剤の調製における応用、
軟骨細胞の増殖を促進するための薬剤の調製における応用、
軟骨細胞遊走を促進するための薬剤の調製における応用、及び、
軟骨欠損を修復するための薬剤の調製における応用
のいずれかを含むことを特徴とする、請求項１に記載の応用。
【請求項3】
前記培地は、完全培地であることを特徴とする、請求項１に記載の応用。
【請求項4】
前記骨髄間葉系幹細胞の培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２であることを特徴とする、請求項１に記載の応用。
【請求項5】
骨髄を完全培地に加えてピペッティングでよく混ぜて、インキュベーターに入れて培養し、３日目に半分量交換し、６日目に全量交換し、その後２日ごとに交換し、細胞が８０～９０％に増殖するまで、Ｐ１継代まで継代し、さらに３回の継代を経て初代骨髄間葉系幹細胞が得られることを特徴とする、請求項１に記載の応用。
【請求項6】
前記骨髄間葉系幹細胞を培養する場合、細胞を対数増殖期まで増殖させた後、培地を捨て、ＰＢＳで洗浄した後、２％小胞除去血清培地に交換して細胞が８０～９０％に増殖するまで培養し、上清を回収し、ろ液をエクソソーム抽出に使用することを特徴とする、請求項１に記載の応用。
【請求項7】
メンブレンアフィニティースピンカラムを用いて前記骨髄間葉系幹細胞エクソソームをろ過して回収することを特徴とする、請求項１に記載の応用。
【請求項8】
ろ過した上清を等量のＸＢＰバッファーに加えてよく混ぜた後、前記メンブレンアフィニティースピンカラムに加えて処理し、カラムに吸着したエクソソームをＸＥバッファーで溶出させることを特徴とする、請求項６に記載の応用。
【請求項9】
前記ろ過方法は、０．２μｍろ過膜を用いてろ過することを特徴とする、請求項８に記載の応用。
【請求項10】
よく混ぜた後、前記メンブレンアフィニティースピンカラムに加えて処理し、５００ｇで１分間遠心分離することを特徴とする、請求項８に記載の応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオ医薬品の分野に属し、特に、骨髄間葉系幹細胞エクソソームの調製方法及び軟骨細胞活性の促進、軟骨細胞増殖の促進、軟骨細胞遊走の増強、軟骨欠損の修復におけるその応用に関する。
【背景技術】
【0002】
軟骨は、コラーゲン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖タンパク質、若干の細胞及び６０～８０％の水分等の成分で構成される。軟骨細胞と周囲の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は共同で軟骨単位を構成し、軟骨の主要な構造、機能、及び代謝の単位とみなされる。正常な軟骨において、軟骨細胞がコラーゲン、プロテオグリカン、及びグリコサミノグリカンなどの物質を合成して、軟骨の恒常性維持、及び傷んだ軟骨の置換に用いられる。軟骨は人体の中で荷重に耐え、関節間の骨の摩擦を軽減するという重要な役割を果たしている。しかし、成人の軟骨組織には血管や神経が存在しないため、傷んだ軟骨組織が自体を修復する能力は非常に限られている。軟骨機能の欠損は、多くの場合、変形性関節症（例えば変形性関節炎、老人性関節炎、肥厚性関節炎）の発生と密接に関係している。変形性関節症を治療するための臨床方法には、非手術的治療及び手術的治療が含まれる。非手術的治療は非ステロイド性抗炎症薬の経口投与、関節内注射、及びリハビリテーションなどが主で、短期的には痛みを和らげ症状を改善できるが、長期的な効果はない。手術的治療には、マイクロフラクチャー、ドリリング、関節置換術、自家軟骨細胞移植、若年同種移植軟骨移植、自家骨軟骨移植などが含まれる。しかし、これらの異なる外科手術の限界（線維軟骨の下位形成、組織の利用可能性の制限、初代軟骨細胞の増殖過程での脱分化による機能喪失、及びドナー部軟骨周囲炎症の可能性を含む）により、軟骨再生のための新規な代替治療戦略が喫緊になる。幹細胞の分化能に基づく軟骨損傷の治療法は、大きな潜在的可能性が臨床的に確認され、幹細胞の腫瘍原性の制約を避けるため、幹細胞から放出される細胞外小胞、特にエクソソームが産生するパラクリン作用による軟骨損傷の修復への注目が益々高まっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明の目的は、軟骨細胞活性の促進、軟骨細胞増殖の促進、軟骨細胞遊走の増強、軟骨欠損の修復における骨髄間葉系幹細胞エクソソームの応用を提供することである。前記エクソソームは、軟骨細胞の活性を向上し、細胞増殖を促進させ、細胞遊走能を増強することができる。エクソソームプロセッシングは、欠損した軟骨の修復を大幅に促進し、欠損した軟骨の再生も大幅に改善することができる。
【課題を解決するための手段】
【0004】
関節軟骨疾患の治療薬の調製における骨髄間葉系幹細胞エクソソームの応用であって、前記骨髄間葉系幹細胞エクソソームは、培地により骨髄間葉系幹細胞を刺激して産生され、継代後に培養液から骨髄間葉系幹細胞エクソソームを抽出し、前記骨髄間葉系幹細胞は腸骨又は大腿骨の骨髄に由来する。
【0005】
さらに、前記応用は、
軟骨細胞の活性を促進するための薬剤の調製における応用、
軟骨細胞の増殖を促進するための薬剤の調製における応用、
軟骨細胞遊走を促進するための薬剤の調製における応用、
軟骨欠損を修復するための薬剤の調製における応用、
のいずれかを含む。
軟骨細胞の活性を促進するための薬剤の調製における応用、
軟骨細胞の増殖を促進するための薬剤の調製における応用、
軟骨細胞遊走を促進するための薬剤の調製における応用、
軟骨欠損を修復するための薬剤の調製における応用、
のいずれかを含む。
【0006】
さらに、前記培地は、完全培地である。
【0007】
さらに、骨髄間葉系幹細胞の培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２である。
【0008】
さらに、骨髄を完全培地に加えてピペッティングでよく混ぜて、インキュベーターに入れて培養し、３日目に半分量交換し、６日目に全量交換し、その後２日ごとに交換し、細胞が８０～９０％に増殖するまで、Ｐ１継代まで継代し、さらに３回の継代を経て初代骨髄間葉系幹細胞が得られる。
【0009】
さらに、骨髄間葉系幹細胞を培養する場合、細胞を対数増殖期まで増殖させた後、培地を捨て、ＰＢＳで洗浄した後、２％小胞除去血清培地に交換して細胞が８０～９０％に増殖するまで培養し、上清を回収し、ろ液をエクソソーム抽出に使用する。
【0010】
さらに、メンブレンアフィニティースピンカラムを用いて骨髄間葉系幹細胞エクソソームをろ過して回収する。
【0011】
さらに、ろ過した上清を等量のＸＢＰバッファーに加えてよく混ぜた後、メンブレンアフィニティースピンカラムに加えて処理し、カラムに吸着したエクソソームをＸＥバッファーで溶出させる。
【0012】
さらに、前記ろ過方法は、０．２μｍろ過膜を用いてろ過する。
【0013】
さらに、よく混ぜた後、メンブレンアフィニティースピンカラムに加えて処理し、５００ｇで１分間遠心分離する。
【発明の効果】
【0014】
本発明は、関節軟骨疾患の治療薬の調製における骨髄間葉系幹細胞エクソソームの応用を提供するものとした。前記エクソソームは、軟骨細胞の活性を向上し、細胞増殖を促進させ、細胞遊走能を増強することができる。エクソソームプロセッシングは、欠損した軟骨の修復を大幅に促進し、欠損した軟骨の再生も大幅に改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】骨髄間葉系幹細胞エクソソームの抽出と同定を示す図である（（ａ）：骨髄間葉系幹細胞エクソソームの抽出フロー、（ｂ）：骨髄間葉系幹細胞エクソソームの電子顕微鏡写真、（ｃ）：ナノ粒子トラッキング解析装置で解析された骨髄間葉系幹細胞エクソソーム、（ｄ）：骨髄間葉系幹細胞エクソソームのタンパク質同定（１：骨髄間葉系幹細胞の総タンパク質サンプル、２：骨髄間葉系幹細胞エクソソームのタンパク質サンプル。）、タンパク質発現はウエスタンブロット法で解析され、（ｅ）骨髄間葉系幹細胞エクソソーム内在化の同定。ＦＩＴＣ－Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ：細胞骨格の標識に使用されるフルオレセインイソチオシアネート－ファロイジン、ＰＫＨ－２６：エクソソームの標識に使用される赤色の蛍光色素、ＤＡＰＩ：核の標識に使用される４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール、Ｍｅｒｇｅ：結合された画像）。
【図2】骨髄間葉系幹細胞エクソソームが軟骨細胞の活性及び細胞増殖を促進することを示す図である（（ａ）骨髄間葉系幹細胞エクソソームは、軟骨細胞の活性を向上したもの、（ｂ）骨髄間葉系幹細胞エクソソームは、軟骨細胞の増殖を促進したもの。＊ｐ＜０．０５，＊＊＊ｐ＜０．００１，スチューデントのｔ検定で分析）。
【図3】骨髄間葉系幹細胞エクソソームは、軟骨細胞遊走を促進することを示す図である（（ａ）骨髄間葉系幹細胞エクソソームで軟骨細胞を治療し、創傷治癒試験により細胞遊走能を測定したもの、（ｂ）創傷治癒試験の結果の定量分析をしたもの。＊＊＊ｐ＜０．００１、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ分析）。
【図4】軟骨細胞における骨髄間葉系幹細胞エクソソームの内在化動態解析を示す図である（（ａ）骨髄間葉系幹細胞エクソソームの内在化。骨髄間葉系幹細胞エクソソームをＰＫＨ２６で標記し、標記したエクソソームを軟骨細胞の治療に使用し、細胞内ＰＫＨ２６のシグナルを異なる時点で検出した。（ｂ）異なる時点での軟骨細胞における骨髄間葉系幹細胞エクソソームのＰＨＫ２６強度の定量分析。ＦＩＴＣ－Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ：細胞骨格の標識に使用されるフルオレセインイソチオシアネート－ファロイジン、ＰＫＨ－２６：エクソソームの標識に使用される赤色の蛍光色素、ＤＡＰＩ：核の標識に使用される４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール、Ｍｅｒｇｅ：結合された画像。＊＊＊ｐ＜０．００１、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ分析）。
【図5】骨髄間葉系幹細胞エクソソームが軟骨修復を促進することを示す図である（（ａ）実験フロー、（ｂ）ウサギ膝関節軟骨の外観図、（ｃ）ウサギ膝関節軟骨のヘマトキシリン・エオシン染色（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－ｅｏｓｉｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ））。
【図6】骨髄間葉系幹細胞エクソソームが軟骨再生を促進することを示す図である（（ａ）サフラニンＯ－ファストグリーン染色（Ｓａｆ－Ｏ／Ｆａｓｔ Ｇｒｅｅｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ）。（ｂ）国際軟骨修復学会のスコアリング基準に従い軟骨再生をスコアリングしたもの。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ分析）。
【発明を実施するための形態】
【0016】
一、実験手順
１．ヒト骨髄間葉系幹細胞エクソソームの抽出、培養、同定
ヒト骨髄サンプルは、６名の健常な成人（平均年齢３５歳、範囲３０～４０歳、男性３名、女性３名）の腸骨又は大腿骨に由来する。抽出したヒト骨髄１ｍｌを６０ｍｍシャーレに入れ、完全培地８ｍｌを加え、ピペッティングでよく混ぜる。前記完全培地は、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン及びストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ細胞培養液である。その後、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で培養し、３日目に半分量交換し、６日目に全量交換し、その後２日ごとに交換し、細胞が８０～９０％に増殖するまで、Ｐ１継代まで継代する。このようにして、３回の継代を経た後、比較的純粋な初代骨髄間葉系幹細胞が得られ、Ｐ３～Ｐ５継代の細胞がその後の実験に使用される。
１．ヒト骨髄間葉系幹細胞エクソソームの抽出、培養、同定
ヒト骨髄サンプルは、６名の健常な成人（平均年齢３５歳、範囲３０～４０歳、男性３名、女性３名）の腸骨又は大腿骨に由来する。抽出したヒト骨髄１ｍｌを６０ｍｍシャーレに入れ、完全培地８ｍｌを加え、ピペッティングでよく混ぜる。前記完全培地は、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン及びストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ細胞培養液である。その後、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で培養し、３日目に半分量交換し、６日目に全量交換し、その後２日ごとに交換し、細胞が８０～９０％に増殖するまで、Ｐ１継代まで継代する。このようにして、３回の継代を経た後、比較的純粋な初代骨髄間葉系幹細胞が得られ、Ｐ３～Ｐ５継代の細胞がその後の実験に使用される。
【0017】
２．骨髄間葉系幹細胞エクソソームの抽出
細胞を対数増殖期まで増殖させた後、培地を捨て、ＰＢＳで１回洗浄し、２％小胞除去血清培地に交換して培養する。前記２％小胞除去血清培地は、ウシ胎児血清を超遠心分離（１００，０００ｇ、１６時間、４℃）して小胞を除去し、細胞培養培地の調製に使用されるものである。培地の組成：ＤＭＥＭ細胞培養液内に２％小胞除去ウシ胎児血清、１％ペニシリン、及びストレプトマイシンを含む。細胞が８０～９０％まで増殖したら、上清を回収し、０．２μＭフィルターでろ過したろ液をエクソソーム抽出に使用する。０．２μＭフィルターでろ過したろ液を新しいチューブに移し、等量のＸＢＰバッファーを加え、チューブを５回ゆっくりと反転させて溶液を混合する。混合物をエクソソームキットのｅｘｏＥａｓｙ Ｋｉｔカラムに加え、５００ｇで１分間遠心分離した。流出した溶液を捨て、混合物が完全にろ過されるまでサンプルを再度加えた。カラムを同じコレクションチューブに入れ、ＸＷＰバッファー１０ｍｌを加え、５０００ｇで５分間遠心分離してカラム内の残留液体を除去した。下部の液体を捨て、カラムを新しいコレクションチューブに移し、カラムに吸着したエクソソームをＸＥバッファーで溶出した。得られたエクソソームを－８０℃の冷蔵庫に保存して、その後の実験に使用される。
細胞を対数増殖期まで増殖させた後、培地を捨て、ＰＢＳで１回洗浄し、２％小胞除去血清培地に交換して培養する。前記２％小胞除去血清培地は、ウシ胎児血清を超遠心分離（１００，０００ｇ、１６時間、４℃）して小胞を除去し、細胞培養培地の調製に使用されるものである。培地の組成：ＤＭＥＭ細胞培養液内に２％小胞除去ウシ胎児血清、１％ペニシリン、及びストレプトマイシンを含む。細胞が８０～９０％まで増殖したら、上清を回収し、０．２μＭフィルターでろ過したろ液をエクソソーム抽出に使用する。０．２μＭフィルターでろ過したろ液を新しいチューブに移し、等量のＸＢＰバッファーを加え、チューブを５回ゆっくりと反転させて溶液を混合する。混合物をエクソソームキットのｅｘｏＥａｓｙ Ｋｉｔカラムに加え、５００ｇで１分間遠心分離した。流出した溶液を捨て、混合物が完全にろ過されるまでサンプルを再度加えた。カラムを同じコレクションチューブに入れ、ＸＷＰバッファー１０ｍｌを加え、５０００ｇで５分間遠心分離してカラム内の残留液体を除去した。下部の液体を捨て、カラムを新しいコレクションチューブに移し、カラムに吸着したエクソソームをＸＥバッファーで溶出した。得られたエクソソームを－８０℃の冷蔵庫に保存して、その後の実験に使用される。
【0018】
３．エクソソームの同定
（１）エクソソームをＰＢＳに再懸濁し、Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｅｓ（ＮＴＡ）でエクソソーム粒子径及び濃度を測定し、
（２）エクソソームの溶液は、ポリメチル酢酸ビニルとカーボンコーティングされた３００メッシュ銅グリッド上に堆積し、室温で３分間放置した後、１．５％酢酸ウラニルで染色した。透過型電子顕微鏡によりグリッドを画像化、観察、写真撮影し、
（３）ウエスタンブロットを用いて骨髄間葉系幹細胞エクソソームの関連タンパク質（ＣＤ８１、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｏｎ－１、ＴＳＧ１０１を含む）の発現を検出した。
（１）エクソソームをＰＢＳに再懸濁し、Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｅｓ（ＮＴＡ）でエクソソーム粒子径及び濃度を測定し、
（２）エクソソームの溶液は、ポリメチル酢酸ビニルとカーボンコーティングされた３００メッシュ銅グリッド上に堆積し、室温で３分間放置した後、１．５％酢酸ウラニルで染色した。透過型電子顕微鏡によりグリッドを画像化、観察、写真撮影し、
（３）ウエスタンブロットを用いて骨髄間葉系幹細胞エクソソームの関連タンパク質（ＣＤ８１、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｏｎ－１、ＴＳＧ１０１を含む）の発現を検出した。
【0019】
４．軟骨細胞の抽出と培養
軟骨細胞の抽出：（１）生後４週間のニュージーランドウサギの膝関節から軟骨スライスを採取し、（２）それを細かく切断し、ＰＢＳで３回洗浄した後、（３）０．２５％トリプシンで３０分間消化し、（４）上清を捨て、０．２％コラゲナーゼタイプＩＩを加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れて一晩消化し、（５）２００メッシュのフィルターでろ過し、ろ液を５００ｇで５分間遠心分離し、（６）沈殿して軟骨細胞完全培地で再懸濁し、インキュベーターに入れて培養した。
軟骨細胞の抽出：（１）生後４週間のニュージーランドウサギの膝関節から軟骨スライスを採取し、（２）それを細かく切断し、ＰＢＳで３回洗浄した後、（３）０．２５％トリプシンで３０分間消化し、（４）上清を捨て、０．２％コラゲナーゼタイプＩＩを加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れて一晩消化し、（５）２００メッシュのフィルターでろ過し、ろ液を５００ｇで５分間遠心分離し、（６）沈殿して軟骨細胞完全培地で再懸濁し、インキュベーターに入れて培養した。
【0020】
軟骨細胞の継代：（１）細胞が８０～９０％に増殖するまで２日ごとに完全培地に交換し、（２）ＰＢＳで２回洗浄した後、適量の０．２５％トリプシンを加えて消化し、完全培地を加えて消化を停止させ、細胞を回収し、遠心分離した後細胞播種プレートを再懸濁し、（３）このようにして、１回の継代を経た後、比較的純粋な初代骨髄間葉系幹細胞が得られ、Ｐ３～Ｐ５継代の軟骨細胞がその後の実験に使用される。
【0021】
５．軟骨細胞の活性測定
９６ウェルプレートに、５×１０３／ｍｌの密度で軟骨細胞を接種する。接種から４時間経った後、２％小胞除去血清を含む培地に交換し、異なる濃度のエクソソーム（５．０×１０８／ｍｌ、１．０×１０９／ｍｌ、２．０×１０９／ｍｌ）を加えて２４時間培養した。培地総量の１／１０のＣＣＫ－８溶液を加えた。培養プレートを３７℃のインキュベーターに入れ、２～４時間インキュベートした。波長４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
９６ウェルプレートに、５×１０３／ｍｌの密度で軟骨細胞を接種する。接種から４時間経った後、２％小胞除去血清を含む培地に交換し、異なる濃度のエクソソーム（５．０×１０８／ｍｌ、１．０×１０９／ｍｌ、２．０×１０９／ｍｌ）を加えて２４時間培養した。培地総量の１／１０のＣＣＫ－８溶液を加えた。培養プレートを３７℃のインキュベーターに入れ、２～４時間インキュベートした。波長４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【0022】
６．軟骨細胞増殖の測定
９６ウェルプレートに、５×１０３／ｍｌの密度で軟骨細胞を接種する。接種から４時間経った後、２％小胞除去血清を含む培地に交換し、調製したエクソソーム（１．０×１０９／ｍｌ）を加えて２４時間培養した。各ウェルの培地を吸引除去し、５０μｌのＥｄＵ培地を各ウェルに加え、２時間インキュベートする。培地を捨て、ＰＢＳで洗浄した後、固定液１００μｌを加えて室温で１５分間固定し、２ｍｇ／ｍｌグリシン溶液１００μｌを加え、５分間中和し、ＰＢＳ１００μｌを加えて５分間洗浄し、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００のＰＢＳ１００μｌを加えて１０分間反応させ、ＰＢＳで５分間洗浄した。染色反応溶液１００μｌを加え、遮光して室温で３０分間インキュベートした。０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００のＰＢＳ１００μｌを加え、５分間ずつ２回洗浄した。Ｈｏｅｃｈｓｔ染色溶液１００μｌを加え、遮光して室温で１５分間インキュベートした。ＰＢＳで振とうして脱色し、５～１０分間ずつ３回洗浄し、細胞画像は蛍光顕微鏡ＥＶＯＳ ＦＬ Ａｕｔｏで撮影された。
９６ウェルプレートに、５×１０３／ｍｌの密度で軟骨細胞を接種する。接種から４時間経った後、２％小胞除去血清を含む培地に交換し、調製したエクソソーム（１．０×１０９／ｍｌ）を加えて２４時間培養した。各ウェルの培地を吸引除去し、５０μｌのＥｄＵ培地を各ウェルに加え、２時間インキュベートする。培地を捨て、ＰＢＳで洗浄した後、固定液１００μｌを加えて室温で１５分間固定し、２ｍｇ／ｍｌグリシン溶液１００μｌを加え、５分間中和し、ＰＢＳ１００μｌを加えて５分間洗浄し、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００のＰＢＳ１００μｌを加えて１０分間反応させ、ＰＢＳで５分間洗浄した。染色反応溶液１００μｌを加え、遮光して室温で３０分間インキュベートした。０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００のＰＢＳ１００μｌを加え、５分間ずつ２回洗浄した。Ｈｏｅｃｈｓｔ染色溶液１００μｌを加え、遮光して室温で１５分間インキュベートした。ＰＢＳで振とうして脱色し、５～１０分間ずつ３回洗浄し、細胞画像は蛍光顕微鏡ＥＶＯＳ ＦＬ Ａｕｔｏで撮影された。
【0023】
７．細胞スクラッチ実験
ｉｂｉｄｉ装置によるスクラッチ実験のシミュレーション：（１）２ウェル装置を、プレコートされた小さな皿に挿入して、創傷治癒試験を実施する。（２）前処理した細胞懸濁液を用意し、つまり細胞を無血清培地に再懸濁する。ウェルあたり２×１０５／ｍｌの濃度（１００μｌ）の濃度で細胞懸濁液を加える。（３）１２時間後、滅菌ピンセットで２ウェル装置を静かに引き上げ、ＰＢＳで１回洗浄する。（４）対照群は２％小胞除去血清培地に、治療群はエクソソーム（１．０×１０９／ｍｌ）を含む２％小胞除去血清培地に交換し、２４時間及び４８時間培養する。（５）細胞の遊走過程を顕微鏡で観察し、写真を撮る。
ｉｂｉｄｉ装置によるスクラッチ実験のシミュレーション：（１）２ウェル装置を、プレコートされた小さな皿に挿入して、創傷治癒試験を実施する。（２）前処理した細胞懸濁液を用意し、つまり細胞を無血清培地に再懸濁する。ウェルあたり２×１０５／ｍｌの濃度（１００μｌ）の濃度で細胞懸濁液を加える。（３）１２時間後、滅菌ピンセットで２ウェル装置を静かに引き上げ、ＰＢＳで１回洗浄する。（４）対照群は２％小胞除去血清培地に、治療群はエクソソーム（１．０×１０９／ｍｌ）を含む２％小胞除去血清培地に交換し、２４時間及び４８時間培養する。（５）細胞の遊走過程を顕微鏡で観察し、写真を撮る。
【0024】
８．エクソソーム内在化実験
ＰＫＨ２６でエクソソームを標識するプロセスは次のとおりである。（１）１×１０１１／ｍｌの濃度のエクソソーム溶液（１００μｌ）を用意する。（２）エクソソームを２５０μｌのＤｉｌｕｅｎｔ Ｃに加え、穏やかに混合する。（３）新しいＥＰチューブを取り、２μｌのＰＫＨ２６を２５０μｌのＤｉｌｕｅｎｔ Ｃに加える。（４）（２）を（３）に加えてよく混ぜる。（５）室温で４分間放置し、１分ごとにピペットでよく混ぜる。（６）等量の１％ＢＳＡを加えて染色を停止させる。（７）アミコンウルトラ遠心式フィルターで溶液を濃縮して用意しておく。（８）濃縮したエクソソームを無血清培地で希釈し、最終的に１．０×１０９／ｍｌのエクソソームを含む溶液を調製した。（９）軟骨細胞を４時間接種した後、ＰＫＨ２６で標識したエクソソームを加え、３、６、１２、２４、４８、７２時間共培養する。（１０）結合処理後に細胞を４％ＰＦＡで固定する。（１１）ＰＢＳで１０分間ずつ２回洗浄する。（１２）１００μｌのＤＡＰＩ染色溶液を加え、遮光して室温で１５分間インキュベートする。（１３）共焦点顕微鏡で観察し、写真を撮る。
ＰＫＨ２６でエクソソームを標識するプロセスは次のとおりである。（１）１×１０１１／ｍｌの濃度のエクソソーム溶液（１００μｌ）を用意する。（２）エクソソームを２５０μｌのＤｉｌｕｅｎｔ Ｃに加え、穏やかに混合する。（３）新しいＥＰチューブを取り、２μｌのＰＫＨ２６を２５０μｌのＤｉｌｕｅｎｔ Ｃに加える。（４）（２）を（３）に加えてよく混ぜる。（５）室温で４分間放置し、１分ごとにピペットでよく混ぜる。（６）等量の１％ＢＳＡを加えて染色を停止させる。（７）アミコンウルトラ遠心式フィルターで溶液を濃縮して用意しておく。（８）濃縮したエクソソームを無血清培地で希釈し、最終的に１．０×１０９／ｍｌのエクソソームを含む溶液を調製した。（９）軟骨細胞を４時間接種した後、ＰＫＨ２６で標識したエクソソームを加え、３、６、１２、２４、４８、７２時間共培養する。（１０）結合処理後に細胞を４％ＰＦＡで固定する。（１１）ＰＢＳで１０分間ずつ２回洗浄する。（１２）１００μｌのＤＡＰＩ染色溶液を加え、遮光して室温で１５分間インキュベートする。（１３）共焦点顕微鏡で観察し、写真を撮る。
【0025】
９．軟骨欠損モデルの構築
ニュージーランドウサギは南通大学動物センターから提供された。ウサギを対照群、手術群、手術＋低用量エクソソーム群、手術＋高用量エクソソーム群という４群に分け、各群は６匹である。まず、メデトミジン（２０μｇ／ｋｇ）、ケタミン（５ｍｇ／ｋｇ）、ブプレノルフィン（０．０３ｍｇ／ｋｇ）を組み合わせた薬剤を筋肉内注射する。イソフルランで麻酔をかけ、ウサギの左後肢にドリルビットを用いて、膝関節の大腿骨滑車溝に直径４ｍｍ、深さ３ｍｍの骨軟骨欠損を作製した。切開部を閉じて層ごとに縫合した。感染を防ぐためにペニシリン（５万単位／ｋｇ）を３日間連続で筋肉内注射し、鎮痛のためトラマドール２ｍｇ／ｋｇを投与した。異なる濃度のエクソソーム３００μｌ（低用量：１．０×１０１０／ｍｌ、高用量：５．０×１０１０／ｍｌ）を週に１回関節腔に注射し、合計４回の治療を行った。
ニュージーランドウサギは南通大学動物センターから提供された。ウサギを対照群、手術群、手術＋低用量エクソソーム群、手術＋高用量エクソソーム群という４群に分け、各群は６匹である。まず、メデトミジン（２０μｇ／ｋｇ）、ケタミン（５ｍｇ／ｋｇ）、ブプレノルフィン（０．０３ｍｇ／ｋｇ）を組み合わせた薬剤を筋肉内注射する。イソフルランで麻酔をかけ、ウサギの左後肢にドリルビットを用いて、膝関節の大腿骨滑車溝に直径４ｍｍ、深さ３ｍｍの骨軟骨欠損を作製した。切開部を閉じて層ごとに縫合した。感染を防ぐためにペニシリン（５万単位／ｋｇ）を３日間連続で筋肉内注射し、鎮痛のためトラマドール２ｍｇ／ｋｇを投与した。異なる濃度のエクソソーム３００μｌ（低用量：１．０×１０１０／ｍｌ、高用量：５．０×１０１０／ｍｌ）を週に１回関節腔に注射し、合計４回の治療を行った。
【0026】
１０．パラフィン切片
実験終了後、ウサギを安楽死させ、膝関節を完全に摘出し、パラホルムアルデヒドで２４時間固定し、１０％ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）で２～３ヶ月間脱灰し、パラフィンに包埋し、５μｍの厚さのスライスに切断した。パラフィン切片を水で脱脂し、順次切片をキシレン（Ｉ）２０分－キシレン（ＩＩ）２０分－無水エタノール（Ｉ）５分－無水エタノール（ＩＩ）５分－７５％エタノール５分に入れ、水道水で洗った。
実験終了後、ウサギを安楽死させ、膝関節を完全に摘出し、パラホルムアルデヒドで２４時間固定し、１０％ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）で２～３ヶ月間脱灰し、パラフィンに包埋し、５μｍの厚さのスライスに切断した。パラフィン切片を水で脱脂し、順次切片をキシレン（Ｉ）２０分－キシレン（ＩＩ）２０分－無水エタノール（Ｉ）５分－無水エタノール（ＩＩ）５分－７５％エタノール５分に入れ、水道水で洗った。
【0027】
１１．ヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色
ヘマトキシリン液（６０℃）で３０～６０秒間染色し、ヘマトキシリン液を流水で５～１０秒間洗い流し、１％塩酸エタノールに１～３秒間浸け、水で１～２秒間軽く洗浄し、青色促進溶液を５～１０秒間青色に戻し、流水で１５～３０秒間洗い流し、０．５％エオシン溶液で３０～６０秒間染色し、蒸留水で１～２秒間洗浄し、８０％エタノール１～２秒、９５％エタノール１～２秒、無水エタノール１～２秒、キシレン（Ｉ）２～３秒、キシレン（ＩＩ）２～３秒に浸け、ニュートラルバルサムでフ封入する。
ヘマトキシリン液（６０℃）で３０～６０秒間染色し、ヘマトキシリン液を流水で５～１０秒間洗い流し、１％塩酸エタノールに１～３秒間浸け、水で１～２秒間軽く洗浄し、青色促進溶液を５～１０秒間青色に戻し、流水で１５～３０秒間洗い流し、０．５％エオシン溶液で３０～６０秒間染色し、蒸留水で１～２秒間洗浄し、８０％エタノール１～２秒、９５％エタノール１～２秒、無水エタノール１～２秒、キシレン（Ｉ）２～３秒、キシレン（ＩＩ）２～３秒に浸け、ニュートラルバルサムでフ封入する。
【0028】
１２．サフラニンＯ－ファストグリーン染色（Ｓａｆｒａｎｉｎ Ｏ／Ｆａｓｔ Ｇｒｅｅｎ）染色
ファストグリーン染色：スライスをファストグリーン染色液に５～１０分間浸し、軟骨が無色になるまで余分な染色液を洗い流し、分化液にしばらく浸し、３回蒸留水ですすぐ。サフラニン染色：切片をサフラニン染色溶液に１５～３０秒間浸漬し、無水エタノールで素早く脱水した。透徹・封入：キシレンで５分間透徹させ、ニュートラルバルサムで封入する。顕微鏡で検査し、画像を収集して分析した。
ファストグリーン染色：スライスをファストグリーン染色液に５～１０分間浸し、軟骨が無色になるまで余分な染色液を洗い流し、分化液にしばらく浸し、３回蒸留水ですすぐ。サフラニン染色：切片をサフラニン染色溶液に１５～３０秒間浸漬し、無水エタノールで素早く脱水した。透徹・封入：キシレンで５分間透徹させ、ニュートラルバルサムで封入する。顕微鏡で検査し、画像を収集して分析した。
【0029】
１３．軟骨再生のスコアリング
国際軟骨修復協会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｒｅｐａｉｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ、ＩＣＲＳ）に従い軟骨損傷を等級分けし、スコアリングした。
国際軟骨修復協会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｒｅｐａｉｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ、ＩＣＲＳ）に従い軟骨損傷を等級分けし、スコアリングした。
【0030】
まず、上清中の細胞破片を遠心分離により除去し、得られた上清をろ過した後、市販のエクソソーム抽出キットでエクソソームを抽出した（図１ａ）。得られたエクソソームを同定した。まず、抽出されたエクソソームを電子顕微鏡で観察したところ、抽出されたエクソソームは典型的なエクソソームの形状、つまり二重膜を有するカップ状構造の小胞を示していることが分かった（図１ｂ）。その後、ナノ粒子トラッキング解析装置で解析したところ、抽出されたエクソソームの平均直径は１３１．２０ｎｍ、濃度は２ｘ１０１１粒子／ｍｌであることが分かった（図１ｃ。タンパク質を検出したところ、抽出されたエクソソームの典型的なタンパク質にはＣＤ８１、ＴＳＧ１０、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｏｎ １が含まれ、アクチンを発現しないことが分かった（図１ｄ）。最後に、抽出されたエクソソームの内在化能力をテストし、結果は、エクソソームを軟骨細胞と共培養し、エクソソームが内在化できることが判明したことを示している（図１ｅ）。上述の結果は、骨髄間葉系幹細胞の上清から抽出された細胞外小胞がエクソソームであることを示している。
【0031】
機能実験により、抽出されたエクソソームが軟骨細胞の活性を向上（図２ａ）し、細胞増殖を促進（図２ｂ）し、細胞遊走能（図３ａ、ｂ）を増強できることが示されている。インビボプロセシングを決定するため、エクソソーム内在化動態アッセイを実施した。結果では、軟骨細胞と３時間共培養した後の細胞内にエクソソームが観察され、プロセシング時間の延長とともに細胞内のエクソソーム数が徐々に増加し、プロセシング後７２時間目に内在化のピークが現れたことを示している（図４ａ、ｂ）。インビボ実験では、ウサギ後肢膝関節軟骨欠損モデルを使用し、調製したエクソソームを関節腔に計４回注射し、その後形態学的検査を行って軟骨修復状況を解析した（図５ａ）。ウサギの膝関節の全体的な形態を観察したところ、手術群のウサギの膝関節軟骨欠損がまだはっきりと見えることが分かった。エクソソームプロセッシング後、軟骨欠損は明らかに回復し、高用量群の回復がさらに良好である（図５ｂ）。ヘマトキシリン・エオシン染色の結果は、エクソソームプロセシングが欠損した軟骨の修復を大幅に促進できることも示している（図５ｃ）。サフラニンＯ－ファストグリーン染色の結果では、手術群のウサギの膝関節軟骨欠損は改善されなかったが、エクソソームプロセシングにより欠損した軟骨の再生を大幅に改善できることを示している（図６ａ）。国際軟骨修復学会が定めた基準でスコアリングすると、エクソソームプロセッシングは当該スコアを大幅に上げさせることができ、高用量のエクソソーム群のスコアは低用量のエクソソーム群よりも優れている（図６ｂ）。
【0032】
［付記］
［付記１］
関節軟骨疾患の治療薬の調製における骨髄間葉系幹細胞エクソソームの応用であって、前記骨髄間葉系幹細胞エクソソームは、培地により骨髄間葉系幹細胞を刺激して産生され、継代後に培養液から前記骨髄間葉系幹細胞エクソソームを抽出し、前記骨髄間葉系幹細胞は腸骨又は大腿骨の骨髄に由来することを特徴とする、応用。
［付記１］
関節軟骨疾患の治療薬の調製における骨髄間葉系幹細胞エクソソームの応用であって、前記骨髄間葉系幹細胞エクソソームは、培地により骨髄間葉系幹細胞を刺激して産生され、継代後に培養液から前記骨髄間葉系幹細胞エクソソームを抽出し、前記骨髄間葉系幹細胞は腸骨又は大腿骨の骨髄に由来することを特徴とする、応用。
【0033】
［付記２］
前記応用は、
軟骨細胞の活性を促進するための薬剤の調製における応用、
軟骨細胞の増殖を促進するための薬剤の調製における応用、
軟骨細胞遊走を促進するための薬剤の調製における応用、及び、
軟骨欠損を修復するための薬剤の調製における応用
のいずれかを含むことを特徴とする、付記１に記載の応用。
前記応用は、
軟骨細胞の活性を促進するための薬剤の調製における応用、
軟骨細胞の増殖を促進するための薬剤の調製における応用、
軟骨細胞遊走を促進するための薬剤の調製における応用、及び、
軟骨欠損を修復するための薬剤の調製における応用
のいずれかを含むことを特徴とする、付記１に記載の応用。
【0034】
［付記３］
前記培地は、完全培地であることを特徴とする、付記１に記載の応用。
前記培地は、完全培地であることを特徴とする、付記１に記載の応用。
【0035】
［付記４］
前記骨髄間葉系幹細胞の培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２であることを特徴とする、付記１に記載の応用。
前記骨髄間葉系幹細胞の培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２であることを特徴とする、付記１に記載の応用。
【0036】
［付記５］
骨髄を完全培地に加えてピペッティングでよく混ぜて、インキュベーターに入れて培養し、３日目に半分量交換し、６日目に全量交換し、その後２日ごとに交換し、細胞が８０～９０％に増殖するまで、Ｐ１継代まで継代し、さらに３回の継代を経て初代骨髄間葉系幹細胞が得られることを特徴とする、付記１に記載の応用。
骨髄を完全培地に加えてピペッティングでよく混ぜて、インキュベーターに入れて培養し、３日目に半分量交換し、６日目に全量交換し、その後２日ごとに交換し、細胞が８０～９０％に増殖するまで、Ｐ１継代まで継代し、さらに３回の継代を経て初代骨髄間葉系幹細胞が得られることを特徴とする、付記１に記載の応用。
【0037】
［付記６］
前記骨髄間葉系幹細胞を培養する場合、細胞を対数増殖期まで増殖させた後、培地を捨て、ＰＢＳで洗浄した後、２％小胞除去血清培地に交換して細胞が８０～９０％に増殖するまで培養し、上清を回収し、ろ液をエクソソーム抽出に使用することを特徴とする、付記１に記載の応用。
前記骨髄間葉系幹細胞を培養する場合、細胞を対数増殖期まで増殖させた後、培地を捨て、ＰＢＳで洗浄した後、２％小胞除去血清培地に交換して細胞が８０～９０％に増殖するまで培養し、上清を回収し、ろ液をエクソソーム抽出に使用することを特徴とする、付記１に記載の応用。
【0038】
［付記７］
メンブレンアフィニティースピンカラムを用いて前記骨髄間葉系幹細胞エクソソームをろ過して回収することを特徴とする、付記１に記載の応用。
メンブレンアフィニティースピンカラムを用いて前記骨髄間葉系幹細胞エクソソームをろ過して回収することを特徴とする、付記１に記載の応用。
【0039】
［付記８］
ろ過した上清を等量のＸＢＰバッファーに加えてよく混ぜた後、前記メンブレンアフィニティースピンカラムに加えて処理し、カラムに吸着したエクソソームをＸＥバッファーで溶出させることを特徴とする、付記６に記載の応用。
ろ過した上清を等量のＸＢＰバッファーに加えてよく混ぜた後、前記メンブレンアフィニティースピンカラムに加えて処理し、カラムに吸着したエクソソームをＸＥバッファーで溶出させることを特徴とする、付記６に記載の応用。
【0040】
［付記９］
前記ろ過方法は、０．２μｍろ過膜を用いてろ過することを特徴とする、付記８に記載の応用。
前記ろ過方法は、０．２μｍろ過膜を用いてろ過することを特徴とする、付記８に記載の応用。
【0041】
［付記１０］
よく混ぜた後、前記メンブレンアフィニティースピンカラムに加えて処理し、５００ｇで１分間遠心分離することを特徴とする、付記８に記載の応用。
よく混ぜた後、前記メンブレンアフィニティースピンカラムに加えて処理し、５００ｇで１分間遠心分離することを特徴とする、付記８に記載の応用。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【国際調査報告】