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特表2024-515014抗体Ｆｃ断片及び少なくとも１つのフィブリン由来シトルリン化ペプチドを含むハイブリッド分子及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-04
(54)【発明の名称】抗体Ｆｃ断片及び少なくとも１つのフィブリン由来シトルリン化ペプチドを含むハイブリッド分子及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240328BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20240328BHJP
C07K 14/75 20060101ALI20240328BHJP
C07K 7/08 20060101ALI20240328BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240328BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240328BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240328BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20240328BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240328BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C07K16/00 ZNA
C07K14/75
C07K7/08
A61P37/06
A61P29/00 101
A61P19/02
A61K38/17
A61K39/395 N
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023555853
(86)(22)【出願日】2022-03-18
(85)【翻訳文提出日】2023-11-07
(86)【国際出願番号】 FR2022050504
(87)【国際公開番号】W WO2022195237
(87)【国際公開日】2022-09-22
(31)【優先権主張番号】2102803
(32)【優先日】2021-03-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510139564
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・トゥールーズ・トロワ－ポール・サバティエ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＴＯＵＬＯＵＳＥ ＩＩＩ－ＰＡＵＬ ＳＡＢＡＴＩＥＲ
(71)【出願人】
【識別番号】507002516
【氏名又は名称】アンセルム（アンスティチュート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル）
(71)【出願人】
【識別番号】523346951
【氏名又は名称】ソントル オスピタリエ ユニヴェルシテール ドゥ トゥールーズ
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＨＯＳＰＩＴＡＬＩＥＲ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＩＲＥ ＤＥ ＴＯＵＬＯＵＳＥ
(71)【出願人】
【識別番号】523346962
【氏名又は名称】ソントル オスピタリエ ユニヴェルシテール ドゥ モンペリエ
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＨＯＳＰＩＴＡＬＩＥＲ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＩＲＥ ＤＥ ＭＯＮＴＰＥＬＬＩＥＲ
(71)【出願人】
【識別番号】515011944
【氏名又は名称】ウニヴェルシテ・ドゥ・モンペリエ
(71)【出願人】
【識別番号】523346973
【氏名又は名称】アートリティス ルシェルシュ エ デヴロプマン
【氏名又は名称原語表記】ＡＲＴＨＲＩＴＩＳ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＆ ＤＥＶＥＬＯＰＰＥＭＥＮＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(74)【代理人】
【識別番号】100133503
【弁理士】
【氏名又は名称】関口 一哉
(72)【発明者】
【氏名】コンブ， エブ
(72)【発明者】
【氏名】ロベール， ブリューノ
(72)【発明者】
【氏名】マルティノー， ピエール
(72)【発明者】
【氏名】ルイ－プランス， パスカル
(72)【発明者】
【氏名】ヴィラルバ， マルタン
(72)【発明者】
【氏名】ヨルゲンセン， クリスチャン
(72)【発明者】
【氏名】トロゲラー， アントニー
(72)【発明者】
【氏名】クラヴェール， シリール
(72)【発明者】
【氏名】セール， ギィ， ブリューノ， ルネ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA41
4C084NA14
4C084ZA961
4C084ZA962
4C084ZB081
4C084ZB082
4C084ZB151
4C084ZB152
4C085AA21
4C085BB11
4C085BB36
4C085BB42
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA17
4H045BA41
4H045BA57
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA50
(57)【要約】
本発明は、少なくとも１つのシトルリル残基を有する少なくとも１つのフィブリン由来ペプチドに共有結合した少なくとも１つの抗体Ｆｃ断片を含むハイブリッド分子、そのようなハイブリッド分子の使用、及びその製造方法に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つのシトルリル残基を有する少なくとも１つのフィブリン由来ペプチドに共有結合した少なくとも１つの抗体Ｆｃ断片を含むハイブリッド分子であって、少なくとも１つのスペーサーが前記Ｆｃ断片と前記ペプチドとの間に存在していてもよい、ハイブリッド分子。
【請求項2】
前記ペプチドが、少なくとも１つのアルギニル残基をシトルリル残基により置換することにより、脊椎動物のフィブリンのα鎖又はβ鎖の配列の全部又は一部に由来し、前記脊椎動物のフィブリンが、好ましくは哺乳動物、より詳細にはヒトのフィブリンである、請求項１に記載のハイブリッド分子。
【請求項3】
前記スペーサーが、エーテル基を含有する１つ又は複数の繰り返し単位を含有するポリマーであり、前記スペーサーが、好ましくは式ＰＥＧｎのポリエチレングリコールであり、式中、ｎは１～１００、好ましくは１～１０、特に１、２、３、４又は８を表す、請求項１又は２のいずれかに記載のハイブリッド分子。
【請求項4】
前記ペプチドが、少なくとも１つのシトルリル残基を含み、以下からなる群：ａ）配列Ｘ１ＰＡＰＰＰＩＳＧＧＧＹＸ２ＡＸ３（配列番号１）によって定義されるペプチドであって、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、前記Ｘ１又はＸ２又はＸ３残基の少なくとも１つがシトルリル残基である、ペプチド；
ｂ）配列ＧＰＸ１ＶＶＥＸ２ＨＱＳＡＣＫＤＳ（配列番号２）によって定義されるペプチドであって、Ｘ１及びＸ２がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、前記Ｘ１又はＸ２残基の少なくとも１つがシトルリル残基である、ペプチド；
ｃ）配列ＳＧＩＧＴＬＤＧＦＸ１ＨＸ２ＨＰＤ（配列番号３）によって定義されるペプチドであって、Ｘ１及びＸ２がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、前記Ｘ１又はＸ２残基の少なくとも１つがシトルリル残基である、ペプチド；
ｄ）配列ＶＤＩＤＩＫＩＸ１ＳＣＸ２ＧＳＣＳ（配列番号４）によって定義されるペプチドであって、Ｘ１及びＸ２がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、前記Ｘ１又はＸ２残基の少なくとも１つがシトルリル残基である、ペプチド；
ｅ）配列Ｘ１ＧＨＡＫＳＸ２ＰＶＸ３ＧＩＨＴＳ（配列番号１２）によって定義されるペプチドであって、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、前記Ｘ１又はＸ２又はＸ３残基の少なくとも１つがシトルリル残基である、ペプチド；
ｆ）前記ペプチドａ）～ｅ）の１つからの少なくとも１つのシトルリル残基を含む少なくとも５個の連続アミノ酸を含むペプチド、から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載のハイブリッド分子。
【請求項5】
前記ペプチドが、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３からなる群から選択され、より詳細には配列番号５、配列番号６、配列番号１４、配列番号１８及び配列番号１９からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載のハイブリッド分子。
【請求項6】
前記Ｆｃ断片が、ヒトＦｃ断片、特にＩｇＧ、より詳細にはＩｇＧ１のものである、請求項１～５のいずれか一項に記載のハイブリッド分子。
【請求項7】
前記Ｆｃ断片が野生型又は変異型であり、前記変異型Ｆｃ断片が好ましくは少なくとも以下の突然変異：－Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、又は
－Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ、又は
－Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ、又は
－Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ及びＩ３３２Ｅ、又は
－Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ
を含み、前記ナンバリングは、ＥＵインデックスに従ってヒトＩｇＧ１の配列で示される、請求項1～６のいずれかに記載のハイブリッド分子。
【請求項8】
－前記Ｆｃ断片が、少なくとも１つのアジドにカップリングされており、前記ペプチドが、シクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにカップリングされている、又は－前記Ｆｃ断片が、少なくとも１つのアルキン、例えばシクロオクチン、特にＤＢＣＯにカップリングされており、前記ペプチドが、アジドにカップリングされている、又は
－前記Ｆｃ断片が、少なくとも１つのアジドにカップリングされており、前記ペプチドが、シクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにそれ自体がカップリングされているスペーサーに結合している、又は
－前記Ｆｃ断片が、少なくとも１つのアルキン、例えばシクロオクチン、特にＤＢＣＯにカップリングされており、前記ペプチドが、アジドにそれ自体がカップリングされているスペーサーに結合している、又は
－前記Ｆｃ断片が、アジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのスペーサーに結合しており、前記ペプチドが、シクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにカップリングされている、又は
－前記Ｆｃ断片が、シクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのスペーサーに結合しており、前記ペプチドが、アジドにカップリングされている、又は
－前記Ｆｃ断片が、アジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのスペーサーに結合しており、前記ペプチドが、シクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにそれ自体がカップリングされているスペーサーに結合している、又は
－前記Ｆｃ断片が、シクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのスペーサーに結合しており、前記ペプチドが、アジドにそれ自体がカップリングされているスペーサーに結合している、請求項1～７のいずれか一項に記載のハイブリッド分子であって、
前記Ｆｃ断片と前記ペプチドとの間の共有結合は、場合により１つ又は複数のスペーサーの存在下で、前記アジドと前記アルキンとの間に作り出される、ハイブリッド分子。
【請求項9】
請求項1～８のいずれか一項に記載のハイブリッド分子であって、前記分子が、以下：－配列番号１９又は配列番号１８で表されるペプチドにカップリングされているシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した野生型Ｆｃ断片、
－配列番号１９又は配列番号１８で表されるペプチドにカップリングされているシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合したＳ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９又は配列番号１８で表されるペプチドにカップリングされているシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９又は配列番号１８によって表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているシクロオクチンに共有結合した少なくとも１つのアジドにそれ自体がカップリングされているＰＥＧｎスペーサーに結合した野生型Ｆｃ断片、
－配列番号１９又は配列番号１８によって表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合したＳ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片、によって表され、
ｎは、好ましくは１～１０の整数、より詳細には１、２、３又は４を表す、ハイブリッド分子。
【請求項10】
医薬品として使用するための、特に抗シトルリン化タンパク質自己抗体の産生に関連する自己免疫疾患、特にグージュロー・カルティーウド（Ｇｏｕｇｅｒｏｔ－Ｓｊｏｇｒｅｎ）症候群及び関節リウマチの処置に使用するための、請求項１～９のいずれか一項に記載のハイブリッド分子。
【請求項11】
第２のハイブリッド分子と組み合わせて医薬品として使用するための請求項１～１０のいずれか一項に記載のハイブリッド分子であって、前記第２のハイブリッド分子が、少なくとも１つのシトルリル残基を有する少なくとも１つのフィブリン由来ペプチドを含み、前記ペプチドが、少なくとも１つの抗体又は少なくとも１つの抗体断片に共有結合しており、前記抗体又は断片が、ＣＤ３８及び／又はＣＤ１３８に結合することができ、１つ又は複数のスペーサーが、前記ペプチドと前記抗体又は前記断片との間に存在していてもよい、ハイブリッド分子。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、１つ又は複数のシトルリル残基を含む少なくとも１つのフィブリン由来ペプチドに共有結合した少なくとも１つの抗体Ｆｃ断片を含むハイブリッド分子、そのようなハイブリッド分子の使用、及びその製造プロセスに関する。
【背景技術】
【0002】
関節リウマチは、最も一般的なタイプの炎症性リウマチ又は関節炎であるが、最も一般的な自己免疫疾患でもある。この疾患は、滑膜関節の慢性炎症を特徴とし、不可逆的な関節破壊をもたらす。
【0003】
抗シトルリン化タンパク質自己抗体（ＡＣＰＡ）と呼ばれる、シトルリン化タンパク質に対する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）自己抗体の存在は、関節リウマチに非常に特異的である。ＡＣＰＡを含有する患者由来の血清、それらをそれらの膜上に発現するリンパ球細胞及び患者自身はすべて「ＡＣＰＡ陽性」であると言われる。いくつかの研究は、これらのＡＣＰＡがリウマチ疾患に特異的な自己免疫反応の中心にあり、したがって選択の治療標的を表すことを実証している。
【0004】
ＡＣＰＡの抗原標的は特徴付けられている。それらは、特に、炎症を起こした滑膜組織に豊富に存在するタンパク質であるフィブリンのα及びβポリペプチド鎖の脱イミン化形態又はシトルリン化形態に対して特異的に向けられる。このシトルリン化は、ペプチジル－アルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）の作用によるこれらのポリペプチド鎖のアルギニル残基の酵素的脱イミン化に対応する。
【0005】
より具体的には、フィブリンのα及びβポリペプチド鎖上のＡＣＰＡによって認識される免疫優性エピトープは、特にＰＣＴ／ＦＲ００／０１８５７又はＰＣＴ／ＦＲ２００７／０００７５８の出願において特徴付けられ、公開されている。免疫優性エピトープを有する５つのシトルリン化ペプチドは、より詳細には、α３６－５０Ｃｉｔ（配列番号５に示される）、α１７１－１８５Ｃｉｔ（配列番号６に示される）、α５０１－５１５Ｃｉｔ（配列番号１４に示される）、α６２１－６３５Ｃｉｔ（配列番号１８に示される）及びβ６０－７４Ｃｉｔ（配列番号１９に示される）と命名されたペプチドである。ＡＣＰＡ陽性患者由来の血清は、これら５つのペプチドのうちの１つ又は複数を認識する。
【0006】
ＡＣＰＡは、局所形質細胞によってリウマチ滑膜組織に分泌されて、そこに高濃度で見出される。それらは、それらの主な標的であるシトルリン化フィブリンに近いままであり、これも間質沈着物の形態でそこに豊富に存在する。ＡＣＰＡがこれらの沈着物に結合し、その結果、固定化免疫複合体が形成され、次いで、関節リウマチに関連し局所形質細胞から分泌される他の自己抗体であるリウマチ因子に結合することにより、炎症促進性事象のカスケードが引き起こされる。
【0007】
これらの免疫マクロ複合体によるマクロファージ細胞の、本質的にそれらの膜Ｆｃ－ガンマ受容体を介した刺激は、炎症促進性サイトカイン、特にＴＮＦ－アルファを分泌させ、これはリウマチ性炎症に関与する主要なサイトカインとして同定されている。
【0008】
今日まで、関節リウマチの治癒的処置はない。処置は、再発の処置及び／又はその出現の予防のみを目的とする。
【0009】
したがって、本発明の目的は、関節リウマチの処置を提供することである。
【0010】
ＡＣＰＡはオリゴクローナルであるため、少数のクローンＢリンパ球の分化から生じる少数のクローン形質細胞によってのみ分泌される。
【0011】
関節リウマチの場合、クローンＢリンパ球は、それらの膜上にＡＣＰＡ特異性を有する免疫グロブリンを発現する（これらはＡＣＰＡ陽性Ｂリンパ球である）が、ＡＣＰＡ陽性クローンＢリンパ球の分化から生じる形質細胞（これらはＡＣＰＡ陽性形質細胞である）は、それらの微小環境中にこれらの同じＡＣＰＡを豊富に分泌する。
【0012】
本発明は、（ｉ）少なくとも１つのシトルリル残基を有する少なくとも１つのフィブリン由来ペプチド及び（ｉｉ）ヒト免疫グロブリンのＦｃ断片を含むハイブリッド分子を使用して、それらの表面上にＡＣＰＡを発現するＢリンパ球クローンを標的化し、それらを排除することが可能であることを示す本発明者らの結果に基づく。これらのハイブリッド分子は、ＡＣＰＡ陽性Ｂリンパ球を特異的に標的とし（前記ＡＣＰＡによって認識される少なくとも１つのシトルリル残基を有するフィブリン由来ペプチドを使用する）、その後、Ｆｃ断片がマクロファージ（食作用を介して）及び／又はＮＫ細胞（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、すなわちＡＤＣＣを介して）によって、及び／又は補体カスケードの活性化によって細胞のＦｃ受容体に結合した後に除去される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0013】
【特許文献1】ＰＣＴ／ＦＲ００／０１８５７
【特許文献2】ＰＣＴ／ＦＲ２００７／０００７５８
【発明の概要】
【0014】
したがって、ＡＣＰＡを発現するＢリンパ球クローン及びそれ自体がＡＣＰＡを分泌する形質細胞に分化する細胞を標的とすることによって、本発明のハイブリッド分子は、ＡＣＰＡを患者の身体から消失させることを目的とする。
【0015】
本発明によるハイブリッド分子
第１の態様では、本発明は、少なくとも１つのシトルリル残基を有する少なくとも１つのフィブリン由来ペプチドに共有結合した少なくとも１つの抗体Ｆｃ断片を含むハイブリッド分子に関し、少なくとも１つのスペーサーが前記Ｆｃ断片と前記ペプチドとの間に存在していてもよい。そのような構造の図を図１に示す。
第１の態様では、本発明は、少なくとも１つのシトルリル残基を有する少なくとも１つのフィブリン由来ペプチドに共有結合した少なくとも１つの抗体Ｆｃ断片を含むハイブリッド分子に関し、少なくとも１つのスペーサーが前記Ｆｃ断片と前記ペプチドとの間に存在していてもよい。そのような構造の図を図１に示す。
【0016】
本発明によれば、「ハイブリッド分子」は、異なる性質の少なくとも２つの成分、この場合は抗体Ｆｃ断片及び前記ペプチドを有する分子を意味する。
【0017】
本発明によれば、抗体の「Ｆｃ断片」は、第１の免疫グロブリン定常領域ドメイン（すなわちＣＨ１－ＣＬ）を除く免疫グロブリンの定常領域を意味する。したがって、Ｆｃ断片はホモダイマーを指し、各モノマーは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧの最後の２つの定常ドメイン（すなわちＣＨ２及びＣＨ３）、又はＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常ドメイン（すなわち、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）を含む。
【0018】
本発明によれば、「共有結合した」という表現は、共有結合、すなわち２つの原子が２つの電子を共有する化学結合を意味する。前記共有結合は、極性又は非極性であり得る。
【0019】
本発明によれば、「スペーサー」は、抗体のＦｃ断片を、少なくとも１つのシトルリル残基を有する前記フィブリン由来ペプチドに共有結合的に連結することを可能にする一方で、前記Ｆｃ断片を前記ペプチドから分離する（したがって、起こり得る立体障害を低減する）カップリング剤である。それは、任意の分子、特にペプチドであり得る。好ましくは、スペーサーは、ハイブリッド分子の物理的及び化学的特性を改変しない。
【0020】
少なくとも１つのスペーサーの存在は有利であり；ハイブリッド分子の２つのパートナーの独立したアクセス可能性を容易にし（前記ペプチドがＡＣＰＡ陽性Ｂリンパ球に結合するためにより容易にアクセス可能であるのと同様に、Ｆｃ断片は、Ｆｃ受容体に結合するためにより容易にアクセス可能である）、及び／又は、ハイブリッド分子を安定化し、及び／又はハイブリッド分子の溶解度を増加させる。
【0021】
一実施形態によれば、本発明によるハイブリッド分子は、１つ又は複数のスペーサーを含み得る。好ましくは、ハイブリッド分子は、１つ又は２つのスペーサーを含む。一実施形態によれば、少なくとも１つのスペーサーが本発明の前記ハイブリッド分子中に存在する場合、前記Ｆｃ断片はスペーサーに共有結合し、前記スペーサーはそれ自体が前記ペプチドに共有結合している。別の実施形態によれば、本発明の前記ハイブリッド分子中に少なくとも２つのスペーサーが存在する場合、前記Ｆｃ断片は第１のスペーサーに共有結合し、前記第１のスペーサーはそれ自体が第２のスペーサーに共有結合し、第２のスペーサーはそれ自体が前記ペプチドに共有結合している。したがって、Ｆｃ断片とペプチドとの間の結合は、直接的又はスペーサーの存在下では間接的でさえあり得る。
【0022】
一実施形態によれば、本発明によるハイブリッド分子は、少なくとも１つのシトルリル残基を有する少なくとも１つのフィブリン由来ペプチドを含み得る。これは、Ｆｃ断片が１つ又は２つのペプチドに結合し得ることを意味する。実際、Ｆｃ断片は２つのモノマーを含み、したがって、Ｆｃ断片は２つのモノマーのうちの１つのみのペプチドに共有結合することができ、又はＦｃ断片は各モノマーのペプチドに共有結合することができる。好ましくは、２つのペプチドがＦｃ断片に結合している場合、その２つのペプチドは同一であり、例えば、配列番号１８又は配列番号１９の２つのペプチドである。
【0023】
一実施形態によれば、前記スペーサーは、エーテル基を含有する１つ又は複数の繰り返し単位を含有するポリマーである。特定の実施形態によれば、前記スペーサーは、式ＰＥＧｎのポリエチレングリコールであり、式中ｎは、１～１００、好ましくは１～１０、特に１、２、３、４又は８の整数を表す。本発明によれば、前記ポリエチレングリコールは、例えばアミン基（ＰＥＧ－ＮＨ２などのＰＥＧｎ－アミン）で官能化することができる。本発明によれば、「１～１００の整数」は、１～１００のすべての整数値、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９及び１００を表す。
【0024】
本発明によれば、「少なくとも１つのシトルリル残基を有するフィブリン由来ペプチド」という表現は、少なくとも１つのアルギニル残基がシトルリル残基によって置換されたフィブリン又はフィブリノーゲンの分子を意味する。本発明による「少なくとも１つのシトルリル残基を有するフィブリン由来ペプチド」とは、ＡＣＰＡによって認識されるペプチドを意味し、「シトルリン化ペプチド」と呼ぶこともできる。そのようなペプチドは、天然、組換え又は合成のフィブリン又はフィブリノーゲンの断片から得ることができる。このようなペプチドは、直接合成によっても得ることができる。ペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ又はＤアミノ酸、好ましくはＬであり得る。前記置換は、例えば、ペプチジル－アルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）の作用下で酵素的脱イミン化工程によって行うことができる。このようなペプチドは、合成されたペプチドに１つ又は複数のシトルリル残基を直接組み込むことによっても得ることができる。本発明によるペプチドはＡＣＰＡに結合し、少なくとも１つのシトルリル残基を有する前記フィブリン由来ペプチドとＡＣＰＡとの間の結合は、ＥＬＩＳＡ試験を用いて、又はＳｅｂｂａｇ Ｍ，Ｍｏｉｎａｒｄ Ｎ，Ａｕｇｅｒ Ｉ，Ｃｌａｖｅｌ Ｃ，Ａｒｎａｕｄ Ｊ，Ｎｏｇｕｅｉｒａ Ｌ，Ｒｏｕｄｉｅｒ Ｊ，Ｓｅｒｒｅ Ｇ，Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３６：２２５０－２２６３，２００６による刊行物に記載されているように検証することができる。
【0025】
一実施形態によれば、本発明による前記ハイブリッド分子において、前記ペプチドは、少なくとも１つのアルギニル残基をシトルリル残基で置換することにより、脊椎動物のフィブリンのα鎖又はβ鎖の配列の全部又は一部に由来する。好ましくは、前記ペプチドは、脊椎動物のフィブリンのα鎖（特に、配列番号２７によって表される）又はβ（特に、配列番号２８によって表される）の少なくとも５個の連続したアミノ酸の配列に由来する。さらにより詳細には、前記脊椎動物のフィブリンは、哺乳動物、好ましくはヒトのフィブリンである。
【0026】
一実施形態によれば、本発明による前記ハイブリッド分子において、ペプチドは、少なくとも２個の連続するアミノ酸、３個の連続するアミノ酸、４個の連続するアミノ酸、好ましくは５個の連続するアミノ酸、さらにより好ましくは５～２５個のアミノ酸のサイズを有する。本発明によれば、「５～２５」は、すべての値：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４及び２５を意味する。好ましくは、前記ペプチドは、１０～２０アミノ酸、より詳細には１５アミノ酸のサイズを有する。
【0027】
一実施形態によれば、本発明による前記ハイブリッド分子において、ペプチドは直鎖状である。
【0028】
一実施形態によれば、本発明による前記ハイブリッド分子において、ペプチドは、ＡＣＰＡに対するその反応性を改善するように改変することができる。例として、ペプチドは環化することができ、ペプチドは、レトロペプチド（Ｌアミノ酸は、再生されるペプチドの逆配列に従って結合する）又はレトロインベルソペプチド（アミノ酸Ｄアミノ酸は、天然のＬアミノ酸の代わりに、再生されるペプチドの逆配列に従って結合する）であり得る。なおさらなる特定の実施形態によれば、本発明による前記ハイブリッド分子において、前記ペプチドの末端カルボキシル官能基（ＣＯＯＨ）は、カルボキサミド官能基（ＣＯＮＨ２）によって置き換えられる。好ましくは、配列番号１２のペプチドでは、前記ペプチドの末端カルボキシル官能基（ＣＯＯＨ）がカルボキサミド官能基（ＣＯＮＨ２）によって置き換えられている。例として、β６０－７４Ｃｉｔペプチド（配列番号１９で表される）は、有利には、このようなカルボキサミド官能基を有する。
【0029】
別の実施形態によれば、本発明による前記ハイブリッド分子において、ペプチドは、その合成を容易にし、及び／又はその安定性を改善するように改変することができる（例えばアルキル化による）。なおさらなる特定の実施形態によれば、本発明による前記ハイブリッド分子において、前記ペプチドの末端アミン官能基（ＮＨ２）はアセチルかされている。好ましくは、配列番号１のペプチドにおいて、前記ペプチドの末端アミン官能基はアセチル化されている。例として、α６２１－６３５Ｃｉｔペプチド（配列番号１８に示される）は、有利には、その末端アミン（ＮＨ２）にそのようなアセチル官能基を有する。
【0030】
一実施形態によれば、本発明による前記ハイブリッド分子において、ペプチドのアミン官能基及びカルボキシル官能基は、酸又は塩基に対応する塩の形態であり得る。
【0031】
一実施形態によれば、本発明による前記ハイブリッド分子において、前記ペプチドは、少なくとも１つのシトルリル残基を含み、以下からなる群から選択される。
ａ）配列Ｘ１ＰＡＰＰＰＩＳＧＧＧＹＸ２ＡＸ３（配列番号１）によって定義されるペプチドであって、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２又はＸ３残基の少なくとも１つがシトルリル残基である、ペプチド；
ｂ）配列ＧＰＸ１ＶＶＥＸ２ＨＱＳＡＣＫＤＳ（配列番号２）によって定義されるペプチドであって、Ｘ１及びＸ２がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２残基の少なくとも１つがシトルリル残基である、ペプチド；
ｃ）配列ＳＧＩＧＴＬＤＧＦＸ１ＨＸ２ＨＰＤ（配列番号３）によって定義されるペプチドであって、Ｘ１及びＸ２がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２残基の少なくとも１つがシトルリル残基である、ペプチド；
ｄ）配列ＶＤＩＤＩＫＩＸ１ＳＣＸ２ＧＳＣＳ（配列番号４）によって定義されるペプチドであって、Ｘ１及びＸ２がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２残基の少なくとも１つがシトルリル残基である、ペプチド；
ｅ）配列Ｘ１ＧＨＡＫＳＸ２ＰＶＸ３ＧＩＨＴＳ（配列番号１２）によって定義されるペプチドであって、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２又はＸ３残基の少なくとも１つがシトルリル残基である、ペプチド；
ｆ）前記ペプチドａ）～ｅ）の１つからの少なくとも１つのシトルリル残基を含む少なくとも５個の連続アミノ酸を含むペプチド。
ａ）配列Ｘ１ＰＡＰＰＰＩＳＧＧＧＹＸ２ＡＸ３（配列番号１）によって定義されるペプチドであって、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２又はＸ３残基の少なくとも１つがシトルリル残基である、ペプチド；
ｂ）配列ＧＰＸ１ＶＶＥＸ２ＨＱＳＡＣＫＤＳ（配列番号２）によって定義されるペプチドであって、Ｘ１及びＸ２がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２残基の少なくとも１つがシトルリル残基である、ペプチド；
ｃ）配列ＳＧＩＧＴＬＤＧＦＸ１ＨＸ２ＨＰＤ（配列番号３）によって定義されるペプチドであって、Ｘ１及びＸ２がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２残基の少なくとも１つがシトルリル残基である、ペプチド；
ｄ）配列ＶＤＩＤＩＫＩＸ１ＳＣＸ２ＧＳＣＳ（配列番号４）によって定義されるペプチドであって、Ｘ１及びＸ２がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２残基の少なくとも１つがシトルリル残基である、ペプチド；
ｅ）配列Ｘ１ＧＨＡＫＳＸ２ＰＶＸ３ＧＩＨＴＳ（配列番号１２）によって定義されるペプチドであって、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２又はＸ３残基の少なくとも１つがシトルリル残基である、ペプチド；
ｆ）前記ペプチドａ）～ｅ）の１つからの少なくとも１つのシトルリル残基を含む少なくとも５個の連続アミノ酸を含むペプチド。
【0032】
１つの特定の実施形態によれば、前記ペプチドは、少なくとも１つのシトルリル残基を含み、以下からなる群から選択される。
－Ｘ１若しくはＸ２若しくはＸ３から選択される少なくとも１つの残基がシトルリル残基である、配列番号１の配列によって定義されるペプチド、又は前記シトルリル残基（複数可）を含有する前記配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸の断片を含むペプチド；
－少なくともＸ１若しくはＸ２がシトルリル残基である、配列番号２の配列によって定義されるペプチド、又は前記シトルリル残基（複数可）を含有する前記配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸の断片を含むペプチド；
－少なくともＸ１若しくはＸ２がシトルリル残基である、配列番号３の配列によって定義されるペプチド、又は前記シトルリル残基（単数又は複数）を含有する前記配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸の断片を含むペプチド；
－少なくともＸ１若しくはＸ２がシトルリル残基である、配列番号４の配列によって定義されるペプチド、又は前記シトルリル残基（複数可）を含有する前記配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸の断片を含むペプチド；
－Ｘ１若しくはＸ２若しくはＸ３から選択される少なくとも１つの残基がシトルリル残基である、配列番号１２の配列によって定義されるペプチド、又は前記シトルリル残基（単数又は複数）を含有する前記配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸の断片を含むペプチド。
－Ｘ１若しくはＸ２若しくはＸ３から選択される少なくとも１つの残基がシトルリル残基である、配列番号１の配列によって定義されるペプチド、又は前記シトルリル残基（複数可）を含有する前記配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸の断片を含むペプチド；
－少なくともＸ１若しくはＸ２がシトルリル残基である、配列番号２の配列によって定義されるペプチド、又は前記シトルリル残基（複数可）を含有する前記配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸の断片を含むペプチド；
－少なくともＸ１若しくはＸ２がシトルリル残基である、配列番号３の配列によって定義されるペプチド、又は前記シトルリル残基（単数又は複数）を含有する前記配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸の断片を含むペプチド；
－少なくともＸ１若しくはＸ２がシトルリル残基である、配列番号４の配列によって定義されるペプチド、又は前記シトルリル残基（複数可）を含有する前記配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸の断片を含むペプチド；
－Ｘ１若しくはＸ２若しくはＸ３から選択される少なくとも１つの残基がシトルリル残基である、配列番号１２の配列によって定義されるペプチド、又は前記シトルリル残基（単数又は複数）を含有する前記配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸の断片を含むペプチド。
【0033】
なおさらなる特定の実施形態によれば、本発明による前記ハイブリッド分子において、前記ペプチドは、少なくとも１つのシトルリル残基を含み、以下からなる群から選択される。
－Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３がシトルリル残基である、配列番号１の配列によって定義されるペプチド、又は前記配列を含む少なくとも１５アミノ酸のペプチド（配列番号１９のペプチドである）；
－Ｘ１及びＸ２がシトルリル残基である、配列番号２の配列によって定義されるペプチド、又は前記シトルリル残基を含有する前記配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸の断片を含むペプチド（配列番号５のペプチドである）；
－Ｘ１及びＸ２がシトルリル残基である、配列番号３の配列によって定義されるペプチド、又は前記シトルリル残基を含有する前記配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸の断片を含むペプチド（配列番号１４のペプチドである）；
－Ｘ１及びＸ２がシトルリル残基である、配列番号４の配列によって定義されるペプチド、又は前記シトルリル残基を含有する前記配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸の断片を含むペプチド（配列番号６のペプチドである）；
－Ｘ１、Ｘ２及びＸ３がシトルリル残基である、配列番号１２の配列によって定義されるペプチド、又は前記シトルリル残基を含有する前記配列の少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片を含むペプチド（配列番号１８のペプチドである）。
－Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３がシトルリル残基である、配列番号１の配列によって定義されるペプチド、又は前記配列を含む少なくとも１５アミノ酸のペプチド（配列番号１９のペプチドである）；
－Ｘ１及びＸ２がシトルリル残基である、配列番号２の配列によって定義されるペプチド、又は前記シトルリル残基を含有する前記配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸の断片を含むペプチド（配列番号５のペプチドである）；
－Ｘ１及びＸ２がシトルリル残基である、配列番号３の配列によって定義されるペプチド、又は前記シトルリル残基を含有する前記配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸の断片を含むペプチド（配列番号１４のペプチドである）；
－Ｘ１及びＸ２がシトルリル残基である、配列番号４の配列によって定義されるペプチド、又は前記シトルリル残基を含有する前記配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸の断片を含むペプチド（配列番号６のペプチドである）；
－Ｘ１、Ｘ２及びＸ３がシトルリル残基である、配列番号１２の配列によって定義されるペプチド、又は前記シトルリル残基を含有する前記配列の少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片を含むペプチド（配列番号１８のペプチドである）。
【0034】
なおさらなる特定の実施形態によれば、本発明による前記ハイブリッド分子において、前記ペプチドは、配列番号５（α３６－５０ｃｉｔ３８，４２）、配列番号６（α１７１－１８５ｃｉｔ１７８，１８１）、配列番号７（α１８３－１９７ｃｉｔ１８６，１９０）、配列番号８（α２４６－２６０ｃｉｔ２５８）、配列番号９（α２５９－２７３ｃｉｔ２６３，２７１）、配列番号１０（α３６６－３８０ｃｉｔ３６７）、配列番号１１（α３９６－４１０ｃｉｔ４０４）、配列番号１３（α４１１－４２５ｃｉｔ４２５）、配列番号１４（α５０１－５１５ｃｉｔ５１０，５１２）、配列番号１５（α５４６－５６０ｃｉｔ５４７）、配列番号１６（α５６１－５７５ｃｉｔ５７３）、配列番号１７（α５８８－６０２ｃｉｔ５９１）、配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）、配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）、配列番号２０（β２１０－２２４ｃｉｔ２２４）、配列番号２１（β２８１－２９５ｃｉｔ２８５，２９４）、配列番号２２（β ４２０－４３４ｃｉｔ４２１）及び配列番号２３（β４３３－４４７ｃｉｔ４３６，４４５）からなる群から選択され、より好ましくは配列番号５（α３６－５０ｃｉｔ３８，４２）、配列番号６（α１７１－１８５ｃｉｔ１７８，１８１）、配列番号１４（α５０１－５１５ｃｉｔ５１０，５１２）、配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）及び配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）からなる群から選択され、さらにより好ましくは配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）及び配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）から選択される。
【0035】
一実施形態によれば、本発明による前記ハイブリッド分子において、前記Ｆｃ断片は、ヒトＦｃ断片、特にＩｇＧ、より詳細にはＩｇＧ１のものである。ＩｇＧ１は、任意のアロタイプ変異体、例えばＧ１ｍ３又はｎＧ１ｍ１に対応し得る。一例として、ＩｇＧ１のＦｃ断片は、配列番号２４、配列番号２５（Ｆｃ＋Ｑ－タグ）又は配列番号２６（Ｆｃ＋Ｑ－タグビス）によって表される。
【0036】
一実施形態によれば、本発明による前記ハイブリッド分子において、前記Ｆｃ断片は野生型（ＷＴ）又は変異型である。突然変異（複数可）は、血漿半減期を増加若しくは減少させること、又はＦｃ断片のエフェクター機能を改変することを目的とし得る。なおさらなる特定の実施形態によれば、前記変異型Ｆｃ断片は、少なくとも以下の突然変異：
－Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）、又は
－Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）、又は
－Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ（ＧＡＳＤＩＥ）、又は
－Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ及びＩ３３２Ｅ（ＧＡＳＤＡＬＩＥ）、又は
－Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ（ＳＤＨＦＳＴＩＥ又はＳＤＨ）を含み、
ナンバリングは、ＥＵインデックスに従ってヒトＩｇＧ１の配列で示される。そのような突然変異は、Ｂｒｕｈｎｓ ａｎｄ Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１５ Ｎｏｖ；２６８（１）：２５－５１による論文に記載されている。好ましくは、ハイブリッド分子が治療に使用される場合、前記変異型Ｆｃ断片は、少なくともＧＡＳＤＩＥ、ＧＡＳＤＡＬＩＥ又はＳＤＨ突然変異を含む。
－Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）、又は
－Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）、又は
－Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ（ＧＡＳＤＩＥ）、又は
－Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ及びＩ３３２Ｅ（ＧＡＳＤＡＬＩＥ）、又は
－Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ（ＳＤＨＦＳＴＩＥ又はＳＤＨ）を含み、
ナンバリングは、ＥＵインデックスに従ってヒトＩｇＧ１の配列で示される。そのような突然変異は、Ｂｒｕｈｎｓ ａｎｄ Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１５ Ｎｏｖ；２６８（１）：２５－５１による論文に記載されている。好ましくは、ハイブリッド分子が治療に使用される場合、前記変異型Ｆｃ断片は、少なくともＧＡＳＤＩＥ、ＧＡＳＤＡＬＩＥ又はＳＤＨ突然変異を含む。
【0037】
一実施形態によれば、本発明による前記ハイブリッド分子において、前記Ｆｃ断片は、グリコシル化形態の０％～１００％のフコシル化率を有する。本発明によれば、「０％～１００％」は、０～１００のすべての整数値、すなわち、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９及び１００％を表す。Ｆｃ断片の弱いフコシル化は、強いＡＤＣＣ応答を引き起こす。これが、特定の実施形態によれば、前記Ｆｃ断片が、グリコシル化形態の０％～６０％、特に５０％、４０％、３０％、２０％、１０％又は０％のフコシル化率を有する理由である。本発明によれば、フコシル化率は、Ｆｃ断片が運ぶことができるフコースの最大量に対する、Ｆｃ断片によって運ばれるフコースの平均割合として定義される。
【0038】
Ｆｃ断片及びペプチドは、それぞれＮ末端及びＣ末端を有する。したがって、Ｆｃ断片は、そのＮ末端又はＣ末端を介してペプチドのＮ末端又はＣ末端に結合することができる。一実施形態によれば、本発明による前記ハイブリッド分子において、前記共有結合は、前記Ｆｃ断片のＣ末端と前記ペプチドのＮ末端との間、又は前記Ｆｃ断片のＮ末端と前記ペプチドのＮ末端との間に位置する。一実施形態によれば、スペーサーが存在する場合、スペーサーは、そのＮ末端又はＣ末端を介してＦｃ断片に連結され得る。別の実施形態によれば、２つのスペーサーが存在する場合、第１のスペーサーは、そのＮ末端又はＣ末端を介してＦｃ断片に結合することができ、第２のスペーサーは、そのＮ末端又はＣ末端、特にＮ末端を介してペプチドに結合することができる。あるいは、前記Ｆｃ断片と前記ペプチドとの間の前記共有結合（１つ又は複数のスペーサーの存在下であってもよい）は、Ｆｃ断片の全部又は一部に作製され得る。本発明によれば、「Ｆｃ断片の全部又は一部」は、Ｆｃ断片を構成する異なるアミノ酸が前記ペプチドとの共有結合に関与し得ることを意味する。
【0039】
好ましい実施形態によれば、少なくとも１つのスペーサーが本発明による前記ハイブリッド分子中に存在する場合、これにより、Ｆｃ断片が、前記ペプチドとの共有結合にそれ自体が関与するアジド又はアルキンに結合することが可能になる。一実施形態によれば、少なくとも１つのスペーサーが本発明による前記ハイブリッド分子中に存在する場合、これにより、ペプチドが、Ｆｃ断片との共有結合にそれ自体が関与するアルキン又はアジドに結合することも可能にし得る。好ましい実施形態によれば、本発明によるハイブリッド分子は、少なくとも２つのスペーサー：Ｆｃ断片がアジド又はアルキンに結合することを可能にする第１のスペーサー及びペプチドがアジド（Ｆｃ断片がアルキンに結合している場合）又はアルキン（Ｆｃ断片がアジドに結合している場合）に結合することを可能にする第２のスペーサーを含む。
【0040】
本発明による一実施形態によれば、本発明による前記ハイブリッド分子において、前記Ｆｃ断片は、
－少なくとも１つのアジド若しくは１つのアルキン、例えばシクロオクチン、特にＤＢＣＯにカップリングされているか、又は
－アジド又はアルキン、例えばシクロオクチン、特にＤＢＣＯにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのスペーサーに結合しており、
且つ、前記ペプチドは、
－アジド又はアルキン、例えばシクロオクチン、特にＤＢＣＯとカップリングされているか、
－又は、アジド又はアルキン、例えばシクロオクチン、特にＤＢＣＯにそれ自体がカップリングされているスペーサーに結合しており、
前記Ｆｃ断片と前記ペプチドとの間の共有結合は、１つ又は複数のスペーサーの存在下であってもよく、アジドとアルキンとの間に作り出される。
－少なくとも１つのアジド若しくは１つのアルキン、例えばシクロオクチン、特にＤＢＣＯにカップリングされているか、又は
－アジド又はアルキン、例えばシクロオクチン、特にＤＢＣＯにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのスペーサーに結合しており、
且つ、前記ペプチドは、
－アジド又はアルキン、例えばシクロオクチン、特にＤＢＣＯとカップリングされているか、
－又は、アジド又はアルキン、例えばシクロオクチン、特にＤＢＣＯにそれ自体がカップリングされているスペーサーに結合しており、
前記Ｆｃ断片と前記ペプチドとの間の共有結合は、１つ又は複数のスペーサーの存在下であってもよく、アジドとアルキンとの間に作り出される。
【0041】
本発明による一実施形態によれば、本発明による前記ハイブリッド分子において、
－Ｆｃ断片は、少なくとも１つのアジドにカップリングされ、前記ペプチドは、シクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにカップリングされているか、又は
－Ｆｃ断片は、少なくとも１つのアルキン、例えばシクロオクチン、特にＤＢＣＯにカップリングされており、前記ペプチドは、アジドにカップリングされており、
前記Ｆｃ断片と前記ペプチドとの間の共有結合は、アジドとアルキンとの間に作り出される。
－Ｆｃ断片は、少なくとも１つのアジドにカップリングされ、前記ペプチドは、シクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにカップリングされているか、又は
－Ｆｃ断片は、少なくとも１つのアルキン、例えばシクロオクチン、特にＤＢＣＯにカップリングされており、前記ペプチドは、アジドにカップリングされており、
前記Ｆｃ断片と前記ペプチドとの間の共有結合は、アジドとアルキンとの間に作り出される。
【0042】
本発明による一実施形態によれば、本発明による前記ハイブリッド分子において、
－Ｆｃ断片は、少なくとも１つのアジドにカップリングされ、前記ペプチドは、シクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにそれ自体がカップリングされているスペーサーに結合されているか、又は
－Ｆｃ断片は、少なくとも１つのアルキン、例えばシクロオクチン、特にＤＢＣＯにカップリングされており、前記ペプチドは、それ自体がアジドにカップリングされているスペーサーに結合されているか、又は
－Ｆｃ断片は、それ自体がアジドにカップリングされた少なくとも１つのスペーサーに結合されており、前記ペプチドは、シクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにカップリングされているか、又は
－Ｆｃ断片は、シクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのスペーサーに結合されており、前記ペプチドは、アジドにカップリングされているか、又は
－Ｆｃ断片は、それ自体がアジドにカップリングされた少なくとも１つのスペーサーに結合されており、前記ペプチドは、シクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにそれ自体がカップリングされているスペーサーに結合されているか、又は
－Ｆｃ断片は、シクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのスペーサーに結合されており、前記ペプチドは、それ自体がアジドにカップリングされたスペーサーに結合されており、
前記Ｆｃ断片と前記ペプチドとの間の共有結合は、１つ又は複数のスペーサーの存在下で、アジドとアルキンとの間に作り出される。
－Ｆｃ断片は、少なくとも１つのアジドにカップリングされ、前記ペプチドは、シクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにそれ自体がカップリングされているスペーサーに結合されているか、又は
－Ｆｃ断片は、少なくとも１つのアルキン、例えばシクロオクチン、特にＤＢＣＯにカップリングされており、前記ペプチドは、それ自体がアジドにカップリングされているスペーサーに結合されているか、又は
－Ｆｃ断片は、それ自体がアジドにカップリングされた少なくとも１つのスペーサーに結合されており、前記ペプチドは、シクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにカップリングされているか、又は
－Ｆｃ断片は、シクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのスペーサーに結合されており、前記ペプチドは、アジドにカップリングされているか、又は
－Ｆｃ断片は、それ自体がアジドにカップリングされた少なくとも１つのスペーサーに結合されており、前記ペプチドは、シクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにそれ自体がカップリングされているスペーサーに結合されているか、又は
－Ｆｃ断片は、シクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのスペーサーに結合されており、前記ペプチドは、それ自体がアジドにカップリングされたスペーサーに結合されており、
前記Ｆｃ断片と前記ペプチドとの間の共有結合は、１つ又は複数のスペーサーの存在下で、アジドとアルキンとの間に作り出される。
【0043】
一実施形態によれば、上記の分子、より詳細には８ページ２２行目～９ページ６行目において、使用されるスペーサーは好ましくはＰＥＧｎスペーサーであり、より詳細には、ｎは１～１０の整数を表す。本発明によるハイブリッド分子が少なくとも２つのＰＥＧｎスペーサーを含む場合、２つのスペーサーの数字ｎは、同一であっても異なっていてもよい。例えば、第１のスペーサーはＰＥＧ２とすることができ、第２のスペーサーはＰＥＧ３又はＰＥＧ４とすることができる。
【0044】
特に好ましい実施形態によれば、上記の分子、より詳細には８ページ２２行目～９ページ６行目において、ペプチドはヒトフィブリン又はフィブリノーゲンに由来し、Ｆｃ断片はヒトＦｃ、好ましくはヒトＩｇＧ１である。
【0045】
本発明によれば、アジドとアルキンとの間の共有結合の形成は、「クリック化学」工程として知られているものに対応し、アジドのＮ３部分はアルキンと反応する。アジドは、ヒドラゾ酸ＨＮ３の塩、又は窒素原子の１つが有機化合物の炭素原子と共有結合している有機アジド（例えば、メチルアジドＣＨ３Ｎ３）を意味する。好ましくは、アジドは式Ｎ３で表される。アルキンは、少なくとも１つの三重結合の存在を特徴とする、一般式ＣｎＨ２ｎ－２を有する分子を意味する。アルキンは、好ましくはシクロオクチンであり、さらにより好ましくはジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）である。
【0046】
Ｆｃ断片、前記ペプチド及び場合により前記スペーサー（複数可）は、任意の従来使用されている分子カップリング技術（コンジュゲーションなど）によってアルキン又はアジドにカップリングされる。Ｆｃ断片をスペーサーに共有結合させるため、及び／又はペプチドをスペーサーに共有結合させるために、任意の技術を使用してもよい。
【0047】
より詳細には、コンジュゲーション技術は、酵素的コンジュゲーション又は化学的コンジュゲーションを意味する。酵素的コンジュゲーションは、例えば、遊離アミン基とグルタミン又はリジン残基との間の共有結合の形成を触媒するトランスグルタミナーゼを使用するコンジュゲーション、又はさらにはソルターゼなどのトランスペプチダーゼを使用するコンジュゲーションを意味する。酵素的コンジュゲーションに関するさらなる情報については、例えば、特許出願ＵＳ２０１６０３６１４３４若しくはＵＳ２０１７０３１３７８７、又はＯｈｔｓｕｋａらによる刊行物、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌｕｍｅ ６４，２０００－Ｉｓｓｕｅ １２，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｃｙｌ ｄｏｎｏｒｓを参照されたい。トランスグルタミナーゼ基質は、例えば、配列番号２９（ＬＬＱＧ）で表されるグルタミル残基（Ｑタグ）を含むペプチドである。化学的コンジュゲーションは、例えば、ジスルフィド架橋の還元後に単離されるか又はジスルフィド架橋に関与するシステインと、例えばマレイミドとの間の共有結合を意味する。そのようなコンジュゲーションの例を図９に示す。この例では、Ｆｃ断片はＱ－タグペプチドを含み、前記Ｆｃ断片は、Ｑ－タグのグルタミル残基とＰＥＧｎスペーサーが有するＮＨ２基との間に共有結合を生成するトランスグルタミナーゼの作用により、（それ自体がアジドにカップリングされている）スペーサーに結合する。
【0048】
本発明によれば、「カップリングされた」又は「分子カップリング」という用語は、共有結合の確立を意味し、したがってＦｃ断片及び／又はペプチド及び／又はスペーサーは、アルキン又はアジドに共有結合している。「結合した」という用語もまた、共有結合を意味する。したがって、例として、「Ｆｃ断片は、アジドにカップリングされていて、前記ペプチドは、シクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにそれ自体がカップリングされているスペーサーに結合されている」という表現は、「Ｆｃ断片は、アジドに共有結合しており、前記ペプチドは、スペーサーに共有結合しており、前記スペーサーは、それ自体がシクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯに共有結合している」と読むこともできる。
【0049】
本発明による一実施形態によれば、前記ハイブリッド分子は、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにカップリングされたシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合された野生型Ｆｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにカップリングされたシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合された、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにカップリングされたシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに連結された突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているアジドに共有結合したシクロオクチンにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した野生型Ｆｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているアジドに共有結合したシクロオクチンにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているアジドに共有結合したシクロオクチンにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した野生型Ｆｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているスペーサーＰＥＧｎにカップリングされているシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにカップリングされたシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合された、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにカップリングされたシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合された、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片によって表され、
ｎは、好ましくは１～１０の整数、より詳細には１、２、３、４又は８を表す。
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにカップリングされたシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合された野生型Ｆｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにカップリングされたシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合された、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにカップリングされたシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに連結された突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているアジドに共有結合したシクロオクチンにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した野生型Ｆｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているアジドに共有結合したシクロオクチンにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているアジドに共有結合したシクロオクチンにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した野生型Ｆｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているスペーサーＰＥＧｎにカップリングされているシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにカップリングされたシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合された、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにカップリングされたシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合された、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片によって表され、
ｎは、好ましくは１～１０の整数、より詳細には１、２、３、４又は８を表す。
【0050】
本発明による一実施形態によれば、前記ハイブリッド分子は、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにカップリングされたシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合された野生型Ｆｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにカップリングされたシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合された、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにカップリングされたシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合された、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した野生型Ｆｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片、
ｎは、好ましくは１～１０の整数、より詳細には１、２、３、４又は８を表す。
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにカップリングされたシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合された野生型Ｆｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにカップリングされたシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合された、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにカップリングされたシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合された、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した野生型Ｆｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片、
ｎは、好ましくは１～１０の整数、より詳細には１、２、３、４又は８を表す。
【0051】
本発明によるさらにより特定の実施形態によれば、前記ハイブリッド分子は、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）で表されるペプチドにカップリングされたシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合された野生型Ｆｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）で表されるペプチドにカップリングされたシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合された、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）で表されるペプチドにカップリングされたシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合された、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているシクロオクチンに共有結合した少なくとも１つのアジドにそれ自体がカップリングされているＰＥＧｎスペーサーに結合した野生型Ｆｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片、
ｎは、好ましくは１～１０の整数、より詳細には１、２、３、４又は８を表す。
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）で表されるペプチドにカップリングされたシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合された野生型Ｆｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）で表されるペプチドにカップリングされたシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合された、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）で表されるペプチドにカップリングされたシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合された、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ突然変異を含むＦｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているシクロオクチンに共有結合した少なくとも１つのアジドにそれ自体がカップリングされているＰＥＧｎスペーサーに結合した野生型Ｆｃ断片、
－配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片、
ｎは、好ましくは１～１０の整数、より詳細には１、２、３、４又は８を表す。
【0052】
本発明によるハイブリッド分子の使用
第２の態様では、本発明はまた、医薬品として使用するための上記で定義されたハイブリッド分子に関する。
第２の態様では、本発明はまた、医薬品として使用するための上記で定義されたハイブリッド分子に関する。
【0053】
より詳細には、本発明によれば、前記ハイブリッド分子は、患者の体内を標的とし、ＡＤＣＣ及び／又は食作用及び／又は補体活性化によって、全ての「ＡＣＰＡ陽性」Ｂ細胞（すなわち、その表面上に抗シトルリン化タンパク質自己抗体［ＡＣＰＡ］を発現するＢリンパ球）を溶解することが意図されている。実際、本発明によるハイブリッド分子は、少なくとも１つのシトルリル残基を有するフィブリン由来ペプチド（ＡＣＰＡの標的エピトープである）のおかげで、「ＡＣＰＡ陽性」Ｂリンパ球に結合する。本発明によるハイブリッド分子はまた、細胞に結合し、特にマクロファージの表面だけでなくＮＫ細胞（「ナチュラルキラー」細胞）の表面にも存在するそれらのＦｃ断片、天然Ｆｃ受容体リガンド（例えば、Ｆｃ断片がＩｇＧに由来する場合、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ））のために、「ＡＣＰＡ陽性」Ｂリンパ球を破壊することを可能にする。
【0054】
特定の実施形態によれば、本発明は、シトルリン化タンパク質に対する自己抗体の産生に関連する自己免疫疾患、特に、グージュロー・カルティーウド（Ｇｏｕｇｅｒｏｔ－Ｓｊｏｇｒｅｎ）症候群及び関節リウマチの処置におけるその使用のための、上で定義されるようなハイブリッド分子に関する。この実施形態では、抗シトルリン化タンパク質自己抗体の産生に関連する前記自己免疫疾患の重症型、並びに乾癬性関節炎又は全身性エリテマトーデスなどの他の慢性関節炎を伴う様々ないわゆる「境界」型が標的とされる。
【0055】
一実施形態によれば、本発明はまた、薬学的に許容され得るビヒクルと組み合わせて、先行する請求項のいずれか一項に記載のハイブリッド分子を含む医薬組成物に関する。
【0056】
本発明によれば、「薬学的に許容され得るビヒクル」は、組成物を任意のガレヌス形態で患者に投与するのに適したものにする任意の製剤を意味する。
【0057】
上記のように、本発明は、「ＡＣＰＡ陽性」Ｂリンパ球を破壊することを目的とする。しかしながら、ＡＣＰＡ分泌形質細胞に分化した「ＡＣＰＡ陽性」Ｂリンパ球は、もはや前述のハイブリッド分子によって標的化されない。したがって、特定の実施形態によれば、本発明は、第２のハイブリッド分子と組み合わせて医薬品として使用するための前述のハイブリッド分子に関し、前記第２のハイブリッド分子は、少なくとも１つのシトルリル残基を有する少なくとも１つのフィブリン由来ペプチドを含み、前記ペプチドは、少なくとも１つの抗体又は少なくとも１つの抗体断片に共有結合しており、前記抗体又は断片は、ＣＤ３８及び／又はＣＤ１３８に結合することができ、１つ又は複数のスペーサーが前記ペプチドと前記抗体又は前記断片との間に存在していてもよい。そのような併用療法は、ＡＣＰＡ陽性クローン形質細胞及びＢリンパ球を特異的に標的化及び破壊し、したがって、患者の身体からＡＣＰＡを排除することを可能にする。使用される抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。
【0058】
特定の実施形態によれば、この第２のハイブリッド分子において、断片は、抗体の抗原結合部位又は可変領域を含む抗体部分を意味する。そのような抗体断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、単離されたＶＨ又はＶＬ断片などの単鎖断片、ラクダ科ＶＨＨ、軟骨魚類ＶＮＡＲ、又は異なる断片からなる多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体、又は「ナノボディ」、「ダイアボディ」、「トリアボディ」、「テトラボディ」、若しくはタンデムのｓｃＦｖなどである。これらの断片は当業者に周知である。これらの断片及び構造に関するさらなる情報は、例えば、国際出願ＷＯ ２０１７１３７５７９、Ｂｉｒｄら、１９８８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；及びＨｕｓｔｏｎら、１９８８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９－５８８３、又はＮｅｌｓｏｎ，ｍＡｂｓ ２：１，７７－８３；Ｊａｎｕａｒｙ／Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１０に記載されている。断片は、好ましくはＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２である。
【0059】
特定の実施形態によれば、この第２のハイブリッド分子において、前記抗体又はＦ（ａｂ’）２断片は、ＣＤ３８及び別の形質細胞標的に対する二重特異性抗体又はＦ（ａｂ’）２断片である。あるいは、この第２のハイブリッド分子において、前記抗体又はＦ（ａｂ’）２断片は、ＣＤ１３８及び別の形質細胞標的に対する二重特異性抗体又はＦ（ａｂ’）２断片である。本発明によれば、「別の形質細胞標的」は、形質細胞の表面に発現される任意のマーカーを意味する。
【0060】
別の特定の実施形態によれば、この第２のハイブリッド分子において、前記抗体又はＦ（ａｂ’）２断片は、ＣＤ３８及びＣＤ１３８に対する二重特異性抗体又はＦ（ａｂ’）２断片である。
【0061】
本発明のこの特定の実施形態によれば、第１及び第２のハイブリッド分子は、同時に、別々に、又は経時的に徐々に投与される。
【0062】
別の実施形態によれば、本発明によるハイブリッド分子は、少なくとも１つの放射性同位体又はＡ４８８若しくはＡ６４７などの少なくとも１つの蛍光色素にカップリングすることができる。そのような分子は、分子トレーサーツールとして有利に使用することができる。
【0063】
したがって、別の実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つのシトルリル残基を有する少なくとも１つのフィブリン由来ペプチドに共有結合した少なくとも１つの抗体Ｆｃ断片を含むハイブリッド分子の分子ツールとしてのインビトロ又はエクスビボでの使用に関し、少なくとも１つのスペーサーが前記Ｆｃ断片と前記ペプチドとの間に存在していてもよい。そのような構造は、特に、ＡＣＰＡ並びにマクロファージ及びＮＫ細胞のＦｃ受容体へのハイブリッド分子の結合を分析するため、並びにマクロファージ及びＮＫ細胞のハイブリッドの結合に対する反応性、続いてＡＣＰＡによる後者の架橋などを分析するために使用することができる。放射性同位元素及び／又は蛍光色素は、好ましくはＦｃ断片に、さらにより詳細にはＱタグのレベル（存在する場合）又はリジンのレベルでカップリングされる。
【0064】
本発明によるハイブリッド分子の製造するための方法
別の態様では、本発明はまた、先に定義されたハイブリッド分子が移植された免疫細胞を得ることを可能にする方法に関する。
別の態様では、本発明はまた、先に定義されたハイブリッド分子が移植された免疫細胞を得ることを可能にする方法に関する。
【0065】
したがって、一実施形態によれば、本発明は、以下の工程：
－（ｉ）Ｆｃ断片にカップリングされたアジドを得ること、又はＦｃ断片にカップリングされたアルキンを得ること、
－（ｉｉ）ペプチドにカップリングされたアルキンを得ること、又はペプチドにカップリングされたアジドを得ること、
－（ｉｉｉ）アジドとアルキンとの間の共有結合の形成、を含む上記で定義したハイブリッド分子を製造するための方法に関し、
－工程（ｉ）は、工程（ｉｉ）の前又は後に、あるいは同時に行うことができる。
－（ｉ）Ｆｃ断片にカップリングされたアジドを得ること、又はＦｃ断片にカップリングされたアルキンを得ること、
－（ｉｉ）ペプチドにカップリングされたアルキンを得ること、又はペプチドにカップリングされたアジドを得ること、
－（ｉｉｉ）アジドとアルキンとの間の共有結合の形成、を含む上記で定義したハイブリッド分子を製造するための方法に関し、
－工程（ｉ）は、工程（ｉｉ）の前又は後に、あるいは同時に行うことができる。
【0066】
したがって、一実施形態によれば、本発明は、以下の工程：
－（ｉ）場合により少なくとも１つのスペーサーの存在下での、少なくとも１つのアジドとＦｃ断片とのカップリング、又は場合によりスペーサーの存在下での、少なくとも１つのアルキンと少なくとも１つのＦｃ断片とのカップリング、
－（ｉｉ）場合によりスペーサーの存在下でのアルキンとペプチドとのカップリング、又は場合によりスペーサーの存在下でのアジドとペプチドとのカップリング、
－（ｉｉｉ）アジドとアルキンとの間の共有結合（複数可）の形成、を含む上記で定義したハイブリッド分子を製造するための方法に関し、
－工程（ｉ）は、工程（ｉｉ）の前又は後に、あるいは同時に行うことができる。
－（ｉ）場合により少なくとも１つのスペーサーの存在下での、少なくとも１つのアジドとＦｃ断片とのカップリング、又は場合によりスペーサーの存在下での、少なくとも１つのアルキンと少なくとも１つのＦｃ断片とのカップリング、
－（ｉｉ）場合によりスペーサーの存在下でのアルキンとペプチドとのカップリング、又は場合によりスペーサーの存在下でのアジドとペプチドとのカップリング、
－（ｉｉｉ）アジドとアルキンとの間の共有結合（複数可）の形成、を含む上記で定義したハイブリッド分子を製造するための方法に関し、
－工程（ｉ）は、工程（ｉｉ）の前又は後に、あるいは同時に行うことができる。
【0067】
したがって、別の実施形態によれば、本発明は、以下の工程：
－（ｉ）場合により少なくとも１つのスペーサーの存在下での、Ｆｃ断片の各モノマー上の少なくとも１つのアジドのカップリング、又は場合によりスペーサーの存在下での、Ｆｃ断片の各モノマー上の少なくとも１つのアルキンのカップリング、
－（ｉｉ）場合によりスペーサーの存在下でのアルキンとペプチドとのカップリング、又は場合によりスペーサーの存在下でのアジドとペプチドとのカップリング、
－（ｉｉｉ）アジドとアルキンとの間の共有結合（複数可）の形成、を含む上記で定義したハイブリッド分子を製造するための方法に関し、
－工程（ｉ）は、工程（ｉｉ）の前又は後に、あるいは同時に行うことができる。
－（ｉ）場合により少なくとも１つのスペーサーの存在下での、Ｆｃ断片の各モノマー上の少なくとも１つのアジドのカップリング、又は場合によりスペーサーの存在下での、Ｆｃ断片の各モノマー上の少なくとも１つのアルキンのカップリング、
－（ｉｉ）場合によりスペーサーの存在下でのアルキンとペプチドとのカップリング、又は場合によりスペーサーの存在下でのアジドとペプチドとのカップリング、
－（ｉｉｉ）アジドとアルキンとの間の共有結合（複数可）の形成、を含む上記で定義したハイブリッド分子を製造するための方法に関し、
－工程（ｉ）は、工程（ｉｉ）の前又は後に、あるいは同時に行うことができる。
【0068】
本発明の配列を以下の表１に示す。
【表1】
【0069】
本発明の他の特徴、詳細及び利点は、本発明を説明する添付の図面及び実施例を読むことによって明らかになり、決して本発明を限定することを意図するものではない。
【0070】
例示されたハイブリッド分子では、ＰＥＧｎスペーサーに結合しているのはＦｃ断片のＮ末端であり（Ｃｔｅｒ－ＰＥＧで示される場合を除く［図４参照］）、ＤＢＣＯシクロオクチン又は存在する場合には第２のＰＥＧｎスペーサーに結合しているのは常に前記ペプチドのＮ末端である。さらに、例示されたハイブリッド分子では、Ｆｃ断片に結合したＰＥＧｎスペーサーにおいて、ｎはより詳細には３又は４を表し、ペプチドに結合したＰＥＧｎスペーサーにおいて、ＰＥＧｎスペーサーは３又は８を表すが、ｎの他の任意の値、特に１～１０を使用することができる。
【0071】
以下の実施例では、「アーム化（ａｒｍｅｄ）又はプレアーム化（ｐｒｅ－ａｒｍｅｄ）」細胞は、本発明によるハイブリッド分子が付着している細胞を意味する。したがって、ハイブリッド分子は、そのＦｃ断片のために細胞のＦｃ受容体に結合する。
【図面の簡単な説明】
【0072】
【図1】図１は、本発明によるハイブリッド分子の一例の図を示す。 抗体Ｆｃ断片と、シトルリル残基を有するフィブリン由来ペプチド（「シトルリン化ペプチド」と称される）との間にスペーサー（任意）が示されている。
【図2】図２は、本発明によるハイブリッド分子に結合した膜貫通ＡＣＰＡをその表面で発現するＢリンパ球を示し、前記ハイブリッド分子は、それ自体がＦｃ断片によってＮＫ細胞に結合している。 したがって、ＮＫ細胞は、ＡＤＣＣによってＢリンパ球を破壊することができる。より具体的には、この図は、その表面にＡＣＰＡ型ＢＣＲを発現し、ハイブリッド分子によって担持されるシトルリン化ペプチドと特異的に相互作用するＢ細胞（又はＢリンパ球）を示す。ＮＫ細胞の表面上に発現されたＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）に対する、同じハイブリッド分子によって担持されたＦｃ断片の結合は、ＡＤＣＣを活性化し、ＡＣＰＡ陽性Ｂリンパ球の特異的破壊を誘導する。（ＡＣＰＡ、抗シトルリン化タンパク質自己抗体；ＡＤＣＣ：抗体依存性細胞傷害性；ＢＣＲ、Ｂ細胞受容体；ＦｃγＲ、Ｆｃ－γ受容体；ＮＫ細胞、ナチュラルキラー細胞）。
【図3】図３は、本発明によるハイブリッド分子に結合した膜貫通ＡＣＰＡをその表面で発現するＢリンパ球を示し、前記ハイブリッド分子は、それ自体がＦｃ断片によってマクロファージに結合している。 したがって、マクロファージは、食作用によってＢリンパ球を破壊することができる。より具体的には、この図は、それらの表面にＡＣＰＡ型ＢＣＲを発現し、ハイブリッド分子によって担持されるシトルリン化ペプチドと特異的に相互作用するＢ細胞（又はＢリンパ球）を示す。マクロファージの表面上に発現された異なるＦｃγＲに対する、これらの同じハイブリッド分子によって担持されたＦｃ断片の結合は、ＡＤＰ（すなわち食作用）を活性化し、ＡＣＰＡ陽性Ｂリンパ球の特異的破壊を誘導する。（ＡＣＰＡ、抗シトルリン化タンパク質自己抗体；ＡＤＰ：抗体依存性食作用；ＢＣＲ、Ｂ細胞受容体；ＦｃγＲ、Ｆｃ－γ受容体）。
【図4】図４は、配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）のペプチドを含むいくつかのハイブリッド分子のＡＣＰＡに対する反応性を示す。 β６０－７４は、配列番号１９のペプチドを表す。Ｆｃ－ＷＴ－β６０－７４は、配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）で表されるペプチドにカップリングされたＤＢＣＯシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合された野生型Ｆｃ断片を表す。Ｆｃ－ＬＡＬＡ－β６０－７４は、配列番号１９で表されるペプチドにカップリングされたＤＢＣＯシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合された、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ突然変異を含むＦｃ断片を表す。Ｆｃ－ＳＤＨ－β６０－７４は、配列番号１９で表されるペプチドにカップリングされたＤＢＣＯシクロオクチンに共有結合されたアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合された、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片を表す。Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－β６０－７４は、配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているＤＢＣＯシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した野生型Ｆｃ断片を表す。Ｆｃ－ＳＤＨ－ＰＥＧ－β６０－７４は、配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているＤＢＣＯシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片を表す。Ｆｃ－ＳＤＨ（Ｃｔｅｒ）－ＰＥＧ－β６０－７４は、ハイブリッドＦｃ－ＳＤＨ（Ｃｔｅｒ）－ＰＥＧ－β６０－７４において、第１のＰＥＧｎがＮ末端に付着している他の例とは異なり、第１のＰＥＧｎがＦｃ断片のＣ末端に付着していることを除いて、Ｆｃ－ＳＤＨ－ＰＥＧ－β６０－７４に対応する。ｎは、ＰＥＧｎスペーサーを使用する場合、１～１０の数を表し、好ましくは１、２、３、４又は８である。
【図5】図５は、配列番号１８のペプチ（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）を含むハイブリッド分子の、ＡＣＰＡに対する反応性を示す。 α６２１－６３５は、配列番号１８のペプチドを表す。Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５は、配列番号１８で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているＤＢＣＯシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した野生型Ｆｃ断片を表す。Ｆｃ－ＳＤＨ－ＰＥＧ－α６２１－６３５は、配列番号１８で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているＤＢＣＯシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片を表す。ｎは、ＰＥＧｎスペーサーを使用する場合、１～１０の数を表し、好ましくは１、２、３、４又は８である。
【図6】図６は、配列番号１８のペプチドを含むハイブリッド分子に対する、ＳＤＨ型突然変異を有する未改変又は改変Ｆｃを含む組換えヒトモノクローナルＡＣＰＡ（クローン２Ｈ０６）の反応性を示す。 ＦｃＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５は、配列番号１８で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているＤＢＣＯシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した野生型Ｆｃ断片を表す。ＦｃＳＤＨ－ＰＥＧ－α６２１－６３５は、配列番号１８で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているＤＢＣＯシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片を表す。ｎは、ＰＥＧｎスペーサーを使用する場合、１～１０の数を表し、好ましくは１、２、３、４又は８である。
【図8】図８は、ハイブリッド分子Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ａｒｇ及びＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔの存在下における食作用及びＢリンパ球のパーセンテージの進化を示す。 実施例６に示した６つの実験の結果を示す（Ｎ＝６）。Ｐ値は以下の通りである：＊＜０．０５；＊＊＜０．０１；＊＊＊＜０．００１。
【図9】図９は、ハイブリッドＦｃＷＴ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－α６２１－６３５Ｃｉｔ及びＦｃＳＤＨ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－α６２１－６３５Ｃｉｔの存在下で、その膜上に組換えモノクローナルＡＣＰＡを発現する形質導入悪性リンパ芽球性ヒトＢ細胞株由来の細胞のヒトＮＫ細胞による溶解を示す。 Ｎａｌｍ６は、Ｎａｌｍ６細胞のみをインキュベートした場合；Ｎａｌｍ６＋ＮＫは、Ｎａｌｍ６細胞をＮＫ細胞とインキュベートした場合；ＷＴαＣＩＴは、ＷＴαＣＩＴハイブリッドをＮａｌｍ６細胞及びＮＫ細胞とインキュベートした場合；ＷＴαＡｒｇは、ＷＴαＡｒｇハイブリッドをＮａｌｍ６細胞及びＮＫ細胞とインキュベートした場合；ＳＤＨαＣＩＴは、ＳＤＨαＣＩＴハイブリッドをＮａｌｍ６細胞及びＮＫ細胞とインキュベートした場合；及びＳＤＨαＡｒｇは、ＳＤＨαＡｒｇハイブリッドをＮａｌｍ６細胞及びＮＫ細胞とインキュベートした場合を表す。 その膜上に組換えモノクローナルＡＣＰＡを発現する形質導入リンパ芽球性悪性ヒトＢ細胞株は、実施例１１及び図１０に記載のＮａｌｍ６株に対応する。モノクローナル抗体は、２Ｈ０６として公知の０２２０１４ＣＣＰ１４ＣＦＣＴ２Ｈ０６クローンである。
【図10】図１０は、形質導入後のＢリンパ芽球性Ｎａｌｍ６株（２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６）によるモノクローナル２Ｈ０６ ＡＣＰＡの膜発現を示す。 Ａ－ＩｇＧ抗Ｆａｂ抗体及びα６２１－６３５ｃｉｔペプチドテトラマー（配列番号１８）による二重標識を用いた、モノクローナル２Ｈ０６ ＡＣＰＡのその膜上での発現のためのＮａｌｍ６ Ｂ株の形質導入効率のフローサイトメトリーによる分析。Ｂ－抗Ｆａｂ抗体を使用して実施した細胞選別後の２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６形質導入細胞における濃縮のフローサイトメトリーによる分析。Ｃ－形質導入Ｎａｌｍ６株によって発現された膜２Ｈ０６ ＡＣＰＡと、蛍光色素Ａ６４７にカップリングされたＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔ（ｃｉｔ）又はＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ａｒｇ（ａｒｇ）とのハイブリッドとの間の相互作用のフローサイトメトリー分析。ＮＴ Ｎａｌｍ６：形質導入されていない対照Ｎａｌｍ６株。Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５は、配列番号１８で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているＤＢＣＯシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した野生型Ｆｃ断片を表す。Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ａｒｇは、Ｘ残基がシトルリン化されていない（すなわち、それらはアルギニン残基である）という点で、配列番号１８で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているＤＢＣＯシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した野生型Ｆｃ（ＷＴ）断片を表す。 モノクローナル２Ｈ０６ ＡＣＰＡを発現するＮａｌｍ６細胞は、実施例で述べた形質導入Ｎａｌｍ６株に対応する。
【図11】図１１は、形質導入２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＡＣＰＡ＋Ｂ株の細胞のＦｃ－ペプチドα６２１－６３５ハイブリッドで前処置したマクロファージによる食作用を示す。 Ａ－図は、細胞集団を散布図の形態で表したフローサイトメトリー実験の結果を示す。Ｔ０は、Ｎａｌｍ６標的細胞とマクロファージとを接触させた後の時間０における結果を表す。Ｔ２は、ハイブリッド分子の非存在下でＮａｌｍ６標的細胞とマクロファージとを互いに接触させた２時間後である、時間２ｈにおける結果を表す（自発的食作用）。他のすべてのサイトメトリーダイアグラムは、Ｎａｌｍ６標的細胞を、Ｆｃ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔ（シトルリン化）ハイブリッド又はＦｃ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ａｒｇ（非シトルリン化）対照ハイブリッドをアーム化したマクロファージと接触させた２時間後に得られた結果を表す。ハイブリッドは、異なるタイプのＦｃ断片：野生型（ＷＴ）Ｆｃ断片、ＧＡＳＤＩＥ Ｆｃ断片（Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ突然変異を表す）又はＦｃ ＳＤＨ断片（Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を表す）を使用したことを除いて、図１０に記載されるものと同一である。二重蛍光（ＰＫＨ－６７緑色／ＰＫＨ－２６赤色）を示す細胞は、標的細胞を貪食したマクロファージに対応する。単一のＰＫＨ－２６蛍光を示す細胞は、残存する（すなわち、マクロファージの存在下で２時間後に貪食されない）Ｎａｌｍ６標的細胞に対応する（％標的集団）。サイトメトリーダイアグラムの各象限において、異なる細胞集団は、総細胞集団のパーセンテージとして表される。Ｂ－図は、Ａに記載される各実験条件について、３回の実験の結果から計算された二重陽性細胞のパーセンテージの平均及び標的集団の細胞のパーセンテージの平均をヒストグラムの形態で示す。黒色のヒストグラムは対照条件を表す。白色のヒストグラムは、Ｆｃ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔハイブリッドの存在下における条件を表す。ｐ値は以下の通りである：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。
【図12】図１２は、種々の濃度のＦｃ－ペプチドα６２１－６３５ハイブリッドの存在下における２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＡＣＰＡ＋Ｂ株の細胞のプレアーム化マクロファージによる食作用を示す。 この図は、様々な濃度のＦｃ－ペプチドα６２１－６３５ハイブリッドの存在下でのインキュベーションによって、２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ Ｂ細胞のプレアーム化マクロファージによる食作用の後に行われたフローサイトメトリー実験の結果を示す。Ａ－図は、各実験条件について、二重陽性細胞のパーセンテージをヒストグラムの形態で示す。Ｂ－図は、残存する標的Ｎａｌｍ６集団（すなわち貪食されていない）のパーセンテージを示す。暗いヒストグラムは、非シトルリン化Ｆｃ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ａｒｇハイブリッドの存在下で得られた対照条件を表す。明るいヒストグラムは、Ｆｃ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔハイブリッドの存在下における条件を表す。使用されるハイブリッドの濃度は、５μｇ／ｍｌ～５ｎｇ／ｍｌである。ハイブリッドは、図１１に記載されているものと同一であり、Ｆｃ ＧＡＳＤＡＬＩＥ断片（Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含む）を有するハイブリッド分子も試験したという点が異なる。
【図13】図１３は、ＦｃＷＴ－ＰＥＧ－ペプチドα６２１－６３５ハイブリッドをプレアーム化したマクロファージによる２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＡＣＰＡ＋形質導入株の食作用のプロセスの確認を示す。 これらの図は、先の実験でサイトメトリーで観察された二重陽性細胞が、マクロファージによるＮａｌｍ６標的細胞の食作用によく対応することを示す。左側の４つのパネルは、食作用阻害剤であるサイトカラシンＤの存在下又は非存在下で、ｐＨＲｏｄｏ ＳＥで標識された２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６細胞とＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッドでアーム化されたマクロファージとを一緒にした後に得られたフローサイトメトリー結果を示す。右側の２つのパネルは、ＭＧＧで染色した後に光学顕微鏡によって観察された実験終了時の細胞集団を示す。ハイブリッドは、図１０に記載されているものと同一である。
【図14】図１４は、Ｆｃ－ペプチドα６２１－６３５ハイブリッドでプレアーム化した、又はＦｃ－ペプチドα６２１－６３５ハイブリッドの存在下でインキュベートしたマクロファージによる２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＡＣＰＡ＋形質導入株の食作用を示す。 この図は、フローサイトメトリーによって分析された実験の結果を示す：点群は細胞集団に対応する。Ｔ０は、Ｎａｌｍ６標的細胞とマクロファージとを接触させた直後の時間０における結果を表す。Ｔ２は、ハイブリッド分子の非存在下でＮａｌｍ６標的細胞及びマクロファージを接触させた２時間後の結果を表す（自発的食作用）。残りのサイトメトリーダイアグラムは、ＦｃＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５若しくはＦｃＧＡＳＤＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッドでプレアーム化した、シトルリン化した若しくはしていない、又は、ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５若しくはＦｃＧＡＳＤＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッドでインキュベートした、シトルリン化した若しくはしていない、インキュベーション培地中に溶解させた、Ｎａｌｍ６標的細胞及びマクロファージを接触させた２時間後に得られた結果を示す。ハイブリッドは、図１１に記載されているものと同一である。 二重蛍光（ＰＫＨ－６７緑色／ＰＫＨ－２６赤色）を示す細胞は、Ｎａｌｍ６標的Ｂ細胞を貪食したマクロファージに対応する（％二重陽性）。単一のＰＫＨ－６７蛍光を示す細胞は、残存する（すなわち、マクロファージの存在下で２時間後に貪食されない）Ｎａｌｍ６標的Ｂ細胞に対応する。サイトメトリーダイアグラムの各象限において、異なる細胞集団は、総細胞集団のパーセンテージとして表される。
【図15】図１５は、Ｆｃ－ＰＥＧ－ペプチドα６２１－６３５ハイブリッドの存在下及び生理学的血清濃度でのヒトＩｇＧの存在下又は非存在下でインキュベートしたマクロファージによる２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＡＣＰＡ＋形質導入株の食作用を示す。 図は、Ｆｃ－ＰＥＧ－ペプチドα６２１－６３５ハイブリッドの存在下及び生理学的血清濃度でのヒトＩｇＧの存在下又は非存在下でインキュベートしたマクロファージによる２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＡＣＰＡ＋形質導入株の細胞の食作用の４回（ｎ＝４）の独立した同一の実験の結果の平均を示す。図は、各実験条件について、マクロファージと、競合するヒトＩｇＧの存在下（灰色ヒストグラム）又は非存在下（黒色ヒストグラム）で１μｇ／ｍｌの濃度で可溶性であるシトルリン化（ｃｉｔ）又は非シトルリン化（ａｒｇ）Ｆｃ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッドとを接触させた２時間後の標的細胞の集団の平均残存率を示す。ｐ値は以下の通りである：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。ハイブリッドは、図１１に記載されているものと同一である。
【図16】図１６は、生理学的濃度のヒトＩｇＧ又はヒト血清の存在下又は非存在下で、Ｆｃ－ペプチドα６２１－６３５ハイブリッドと共にインキュベートしたヒトマクロファージによる２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＡＣＰＡ＋形質導入株の食作用を示す。 図は、フローサイトメトリーによって分析された実験の結果を示し、細胞集団は散布図によって表される。Ｔ０は、２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６標的細胞とマクロファージとを接触させた直後に得られた結果に相当する。Ｔ２は、ハイブリッド分子の非存在下で標的細胞及びマクロファージを接触させた２時間後の結果を示す（自発的食作用）。残りの図は、標的細胞及びマクロファージを接触させ、ＦｃＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５又はＦｃＧＡＳＤＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッド、シトルリン化（ｃｉｔ）又は非シトルリン化（ａｒｇ）、及びこれを生理学的血清濃度でのヒトＩｇＧ又はヒト血清の存在下又は非存在下でインキュベートした２時間後に得られた結果を表す。ＣＦＳＥ＋ＣＤ１１ｂ＋二重陽性細胞は、標的細胞を貪食したマクロファージに対応する。ＣＦＳＥ＋単一陽性細胞は、２時間後に貪食されなかった残存Ｎａｌｍ６標的細胞に対応する。サイトメトリーダイアグラムの各象限において、異なる細胞集団は、総細胞集団のパーセンテージとして表される。ハイブリッドは、図１１に記載されているものと同一である。
【図17】図１７は、形質導入されていないＮａｌｍ６株の存在下における、Ｆｃ－ペプチドα６２１－６３５ハイブリッドでプレアーム化されたヒトマクロファージによる２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＡＣＰＡ＋形質導入株の食作用を示す。 図は、同じ野生型非形質導入Ｎａｌｍ６株の細胞の存在下で、Ｆｃペプチドα６２１－６３５ハイブリッドでプレアーム化したマクロファージによる２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＡＣＰＡ＋形質導入株の細胞の食作用の実験の結果を示す。フローサイトメトリー分析の結果は、細胞集団を表す点群の形態で現れる。Ｔ ０は、２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６標的細胞、非形質導入ＮＴ Ｎａｌｍ６細胞及びマクロファージを接触させた直後の時間０における状況を示す。Ｔ２は、ハイブリッド分子の非存在下での２時間後の結果を表す（自発的基礎食作用）。残りのサイトメトリーダイアグラムは、ＦｃＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５又はＦｃＧＡＳＤＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッド、シトルリン化（ｃｉｔ）又は非シトルリン化（ａｒｇ）でアーム化されたマクロファージの存在下で２時間後に得られた結果を表す。ＣＦＳＥ＋ＣＤ１９＋二重陽性細胞は、残存する（すなわちマクロファージの存在下で２時間後に貪食されない）２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６標的細胞に対応する。ＣＦＳＥ－ＣＤ１９－二重陰性細胞はマクロファージである。ＣＦＳＥ－ＣＤ１９＋単一陽性細胞は、残存する（すなわちマクロファージの存在下で２時間後に貪食されない）非形質導入（ＮＴ）Ｎａｌｍ６細胞に対応する。ＣＦＳＥ＋ＣＤ１９－単一陽性細胞は、２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６標的細胞を貪食したマクロファージに対応する。サイトメトリーダイアグラムの各象限において、異なる細胞集団は、総細胞集団のパーセンテージとして表される。ハイブリッドは、図１１に記載されているものと同一である。
【図18】図１８は、ＳＣＩＤ／ＢＥＩＧＥ免疫不全マウスにおけるＦｃ－ペプチドα６２１－６３５ハイブリッドの存在下での２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＡＣＰＡ＋株のヒトＮＫ細胞による特異的インビボ破壊を示す。 図は、ＳＣＩＤ／ＢＥＩＧＥ免疫不全マウスの腹膜腔におけるヒトＮＫ細胞による、シトルリン化Ｆｃ－ペプチドα６２１－６３５ハイブリッドの存在下でのＡＣＰＡ＋標的細胞（形質導入２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６株）の破壊を示す。Ａ－図は、形質導入されていない２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６及びＮＴ Ｎａｌｍ６細胞の集団のフローサイトメトリーによる分析を示す。観察されたピークは、標的細胞（２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＣＴＶｈｉｇｈ）又は対照細胞（ＮＴ Ｎａｌｍ６ ＣＴＶｌｏｗ）に対応する。Ｂ－図は、７匹のＳＣＩＤ／ＢＥＩＧＥ免疫不全マウスの４つの群について得られた全ての結果を示す。これらの結果は、２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６細胞（ＣＴＶｈｉｇｈ）及びＮＴ Ｎａｌｍ６細胞（ＣＴＶｌｏｗ）にそれぞれ対応するＣＴＶｈｉｇｈ／ＣＴＶｌｏｗ蛍光の比として表される。比率の減少は、２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６標的細胞の消失を反映する。ｐ値は以下の通りである：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ ｐ＜０．００１。ハイブリッドは、図１０に記載されているものと同一である。
【図19】図１９は、ＳＣＩＤ／ＢＥＩＧＥ免疫不全マウスにおけるＦｃ－ペプチドα６２１－６３５ハイブリッドでプレアーム化されたヒトマクロファージによる２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＡＣＰＡ＋株の特異的インビボ破壊を示す。 図は、ＳＣＩＤ／ＢＥＩＧＥ免疫不全マウスの腹膜腔におけるヒトマクロファージによる、シトルリン化Ｆｃ－ペプチドα６２１－６３５ハイブリッドの存在下でのＡＣＰＡ＋標的細胞（２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６形質導入株）の破壊を示す。図は、５匹のＳＣＩＤ／ＢＥＩＧＥ免疫不全マウスの４つの群について得られた結果を示す。実験終了時の各群の残存２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＣＴＶｈｉｇｈ標的細胞の数が示されており、食作用の効率を示している。ｐ値は以下の通りである：＊ｐ＜０．０５。ハイブリッドは、図１０に記載されているものと同一である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【0073】
実施例１：本発明によるハイブリッド分子の製造例
本明細書に記載のハイブリッド分子は、以下の構造を含む：アジドにそれ自体がカップリングされた少なくとも１つのＰＥＧｎに共有結合したＦｃ断片、前記アジドは、シトルリン化ペプチドに結合したＰＥＧｎスペーサーにそれ自体がカップリングされたアルキンに共有結合されている。そのような分子は、Ｆｃ－ＰＥＧｎ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－ＰＥＧｎ－シトルリン化ペプチドと読むことができる。２つのＰＥＧｎは同一であっても異なっていてもよい（例えば、第１のＰＥＧｎはＰＥＧ３であることができ、第２はＰＥＧ２であることができる）。
本明細書に記載のハイブリッド分子は、以下の構造を含む：アジドにそれ自体がカップリングされた少なくとも１つのＰＥＧｎに共有結合したＦｃ断片、前記アジドは、シトルリン化ペプチドに結合したＰＥＧｎスペーサーにそれ自体がカップリングされたアルキンに共有結合されている。そのような分子は、Ｆｃ－ＰＥＧｎ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－ＰＥＧｎ－シトルリン化ペプチドと読むことができる。２つのＰＥＧｎは同一であっても異なっていてもよい（例えば、第１のＰＥＧｎはＰＥＧ３であることができ、第２はＰＥＧ２であることができる）。
【0074】
１．ＮＨ２－ＰＥＧｎ－Ｎ３（すなわち、一方の端部でアジドにカップリングさせ、他方の端部で遊離アミン官能基を有するスペーサー）の合成。
【0075】
２．ＮＨ２－ＰＥＧｎ－Ｎ３を、Ｑタグを有するＦｃ断片及びトランスグルタミナーゼと、好ましくは３７°Ｃで１６時間接触させること。このいわゆる「誘導体化」工程は、好ましくはＦｃ断片のモル数の２０倍のモル数のＮＨ２－ＰＥＧｎ－Ｎ３を用いて行われる。トランスグルタミナーゼは、（一方又は両方のモノマー上に）存在するＱタグ当たり１５Ｕ／μｍｏｌのレベルで使用される。場合により、脱塩を行って、工程の最後にＦｃ断片に結合していない過剰なスペーサーを除去することができる。これにより、Ｆｃ－ＰＥＧｎ－Ｎ３が生成される。Ｆｃ断片が２つのＱタグ（各モノマーに担持されたもの）を含む場合、Ｆｃ断片は２つのＰＥＧｎ－Ｎ３を担持することができる。
【0076】
３．シトルリン化Ｃｙｓ－ＰＥＧｎ－ペプチド（すなわち、一方の末端でペプチドに結合し、他方の末端に遊離システインを有するスペーサー）の合成。次いで、アルキン、例えばＤＢＣＯを、Ｃｙｓ－ＰＥＧ－シトルリン化ペプチドにシステインでカップリングさせ、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－シトルリン化ペプチドを生成する。
【0077】
４．「クリック」の形成：Ｎ３とＤＢＣＯとの間のカップリング。ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－シトルリン化ペプチドを、好ましくはＦｃ－ＰＥＧｎ－Ｎ３のモル数よりも１０倍多いモル数のＤＢＣＯ－ＰＥＧ－シトルリン化ペプチドで、Ｆｃ－ＰＥＧｎ－Ｎ３と接触させる。クリック反応は、特に室温で行われ、４時間後にほぼ完了する。
【0078】
５．ハイブリッド分子：Ｆｃ－ＰＥＧｎ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－ＰＥＧｎ－シトルリン化ペプチドの生成。この実施形態を図７に示す。
【0079】
同様に、Ｆｃ－ＰＥＧｎ－ＤＢＣＯ及びＮ３－ＰＥＧｎ－シトルリン化ペプチドを得ることができ、次いでカップリングさせて、Ｆｃ－ＰＥＧｎ－ＤＢＣＯ－Ｎ３－ＰＥＧｎ－シトルリン化ペプチドを得ることができる。
【0080】
同様に、Ｆｃ－ＰＥＧｎ－ＤＢＣＯ及びＮ３－シトルリン化ペプチド（又はＦｃ－ＰＥＧｎ－Ｎ３及びシトルリン化ＤＢＣＯ－ペプチド）を得ることができ、次いでカップリングさせて、それぞれＦｃ－ＰＥＧｎ－ＤＢＣＯ－Ｎ３－シトルリン化ペプチド又はＦｃ－ＰＥＧｎ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－シトルリン化ペプチドを得ることができる。
【0081】
実施例２：本発明によるハイブリッド分子に対する、シトルリン化され、ｐＨ ３で溶出されたペプチド（ｐＨ３画分）を用いたペプチドアフィニティークロマトグラフィーによって精製されたＡＣＰＡの反応性
使用されるＡＣＰＡ（ここではＡＣＰＡ、ｐＨ３画分）は、ＡＣＰＡ陽性関節リウマチに罹患している患者の血清から得られるＡＣＰＡである。そのようなＡＣＰＡは、本発明の５つの免疫優性ペプチド（配列番号５、配列番号６、配列番号１４、配列番号１８又は配列番号１９を参照）の１つ又は複数を結合抗原として使用して、当業者に公知の標準的なカラムアフィニティークロマトグラフィー法によって得た。
使用されるＡＣＰＡ（ここではＡＣＰＡ、ｐＨ３画分）は、ＡＣＰＡ陽性関節リウマチに罹患している患者の血清から得られるＡＣＰＡである。そのようなＡＣＰＡは、本発明の５つの免疫優性ペプチド（配列番号５、配列番号６、配列番号１４、配列番号１８又は配列番号１９を参照）の１つ又は複数を結合抗原として使用して、当業者に公知の標準的なカラムアフィニティークロマトグラフィー法によって得た。
【0082】
ａ．β６０－７４ｃｉｔペプチドを含有するハイブリッド分子を用いた実施例
ペプチドβ６０－７４ｃｉｔ（配列番号１９、β６０－７４とも呼ばれる）、又はハイブリッド分子Ｆｃ－ＷＴ－β６０－７４ｃｉｔ、Ｆｃ－ＬＡＬＡ－β６０－７４ｃｉｔ、Ｆｃ－ＳＤＨ－β６０－７４ｃｉｔ、Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－β６０－７４ｃｉｔ、Ｆｃ－ＳＤＨ－ＰＥＧ－β６０－７４ｃｉｔ若しくはＦｃ－ＳＤＨ（Ｃｔｅｒ）－ＰＥＧ－β６０－７４ｃｉｔのいずれかを含む１００μＬの溶液を使用して、マイクロタイターＥＬＩＳＡプレートウェルを受動吸着によってコーティングした。これらの溶液をそれぞれＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）緩衝液中５μｇ／ｍｌの濃度で使用し、４°Ｃで一晩インキュベートした。非シトルリン化ペプチド及び非シトルリン化ペプチドで構築されたハイブリッド分子（シトルリル残基がアルギニル残基によって置き換えられた配列番号１９のペプチドに対応するβ６０－７４ａｒｇ）を、陰性対照と同じ濃度で使用した。次いで、ウェルを２％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）で４°Ｃにて１時間飽和させた。洗浄後、精製したＡＣＰＡを１、０．５又は０．２５μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ ２％ ＢＳＡ ２Ｍ ＮａＣｌ緩衝液で希釈）で４°Ｃにて１時間インキュベートした。洗浄後、ＰＢＳ ２％ ＢＳＡ緩衝液で１／２５００に希釈したヒトＩｇＧ抗Ｆａｂ二次抗体を用いてＡＣＰＡ反応性を検出した。結果はΔＯＤ（光学密度の変化）で表され、β６０－７４ｃｉｔペプチド又はβ６０－７４ｃｉｔペプチドで構築されたハイブリッド分子で得られたＯＤを、β６０－７４ａｒｇペプチド又はβ６０－７４ａｒｇペプチドで構築された対応するハイブリッド分子で得られたＯＤからそれぞれ差し引いたものに相当する。
ペプチドβ６０－７４ｃｉｔ（配列番号１９、β６０－７４とも呼ばれる）、又はハイブリッド分子Ｆｃ－ＷＴ－β６０－７４ｃｉｔ、Ｆｃ－ＬＡＬＡ－β６０－７４ｃｉｔ、Ｆｃ－ＳＤＨ－β６０－７４ｃｉｔ、Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－β６０－７４ｃｉｔ、Ｆｃ－ＳＤＨ－ＰＥＧ－β６０－７４ｃｉｔ若しくはＦｃ－ＳＤＨ（Ｃｔｅｒ）－ＰＥＧ－β６０－７４ｃｉｔのいずれかを含む１００μＬの溶液を使用して、マイクロタイターＥＬＩＳＡプレートウェルを受動吸着によってコーティングした。これらの溶液をそれぞれＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）緩衝液中５μｇ／ｍｌの濃度で使用し、４°Ｃで一晩インキュベートした。非シトルリン化ペプチド及び非シトルリン化ペプチドで構築されたハイブリッド分子（シトルリル残基がアルギニル残基によって置き換えられた配列番号１９のペプチドに対応するβ６０－７４ａｒｇ）を、陰性対照と同じ濃度で使用した。次いで、ウェルを２％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）で４°Ｃにて１時間飽和させた。洗浄後、精製したＡＣＰＡを１、０．５又は０．２５μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ ２％ ＢＳＡ ２Ｍ ＮａＣｌ緩衝液で希釈）で４°Ｃにて１時間インキュベートした。洗浄後、ＰＢＳ ２％ ＢＳＡ緩衝液で１／２５００に希釈したヒトＩｇＧ抗Ｆａｂ二次抗体を用いてＡＣＰＡ反応性を検出した。結果はΔＯＤ（光学密度の変化）で表され、β６０－７４ｃｉｔペプチド又はβ６０－７４ｃｉｔペプチドで構築されたハイブリッド分子で得られたＯＤを、β６０－７４ａｒｇペプチド又はβ６０－７４ａｒｇペプチドで構築された対応するハイブリッド分子で得られたＯＤからそれぞれ差し引いたものに相当する。
【0083】
結果を図４に示す。それらは、ハイブリッド分子Ｆｃ－ＷＴ－β６０－７４ｃｉｔ、Ｆｃ－ＬＡＬＡ－β６０－７４ｃｉｔ、Ｆｃ－ＳＤＨ－β６０－７４ｃｉｔ、Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－β６０－７４ｃｉｔ、Ｆｃ－ＳＤＨ－ＰＥＧ－β６０－７４ｃｉｔ又はＦｃ－ＳＤＨ（Ｃｔｅｒ）－ＰＥＧ－β６０－７４ｃｉｔに関して、β６０－７４ｃｉｔペプチド上で精製されたＡＣＰＡの用量依存的反応性を示す。それらは、様々なハイブリッドに含まれる場合、シトルリン化ペプチドがＡＣＰＡと完全に反応性のままであることを示す。
【0084】
ｂ．α６２１－６３５ｃｉｔペプチドを含有するハイブリッド分子を用いた実施例
ＥＬＩＳＡプレートウェルを、ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水）中５μｇ／ｍｌの濃度で、ペプチドα６２１－６３５ｃｉｔ（配列番号１８、α６２１－６３５とも呼ばれる）又はハイブリッド分子Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔ又はＦｃ－ＳＤＨ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔも含む１００μＬの溶液でコーティングし、４°Ｃで一晩インキュベートした。非シトルリン化ペプチドα６２１－６３５ａｒｇ及び非シトルリン化ペプチドで構築された対応するハイブリッド分子（シトルリル残基がアルギニル残基によって置き換えられた配列番号１８のペプチドに対応するα６２１－６３５ａｒｇ）を、陰性対照と同じ濃度で使用した。次いで、ウェルをＰＢＳ緩衝液中２％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）で４°Ｃにて１時間飽和させた。洗浄後、精製したＡＣＰＡを４、２及び１μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ ２％ ＢＳＡ ２Ｍ ＮａＣｌ緩衝液で希釈）で４°Ｃにて１時間インキュベートした。洗浄後、ＰＢＳ ２％ ＢＳＡ緩衝液で１／２５００に希釈したヒトＩｇＧ抗Ｆａｂ二次抗体を用いてＡＣＰＡ反応性を検出した。結果はΔＯＤ（光学密度の変化）で表され、α６２１－６３５ｃｉｔペプチド又はα６２１－６３５ｃｉｔペプチドで構築されたハイブリッド分子で得られたＯＤを、α６２１－６３５ａｒｇペプチド又はα６２１－６３５ａｒｇペプチドで構築された対応するハイブリッド分子で得られたＯＤからそれぞれ差し引いたものに相当する。
ＥＬＩＳＡプレートウェルを、ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水）中５μｇ／ｍｌの濃度で、ペプチドα６２１－６３５ｃｉｔ（配列番号１８、α６２１－６３５とも呼ばれる）又はハイブリッド分子Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔ又はＦｃ－ＳＤＨ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔも含む１００μＬの溶液でコーティングし、４°Ｃで一晩インキュベートした。非シトルリン化ペプチドα６２１－６３５ａｒｇ及び非シトルリン化ペプチドで構築された対応するハイブリッド分子（シトルリル残基がアルギニル残基によって置き換えられた配列番号１８のペプチドに対応するα６２１－６３５ａｒｇ）を、陰性対照と同じ濃度で使用した。次いで、ウェルをＰＢＳ緩衝液中２％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）で４°Ｃにて１時間飽和させた。洗浄後、精製したＡＣＰＡを４、２及び１μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ ２％ ＢＳＡ ２Ｍ ＮａＣｌ緩衝液で希釈）で４°Ｃにて１時間インキュベートした。洗浄後、ＰＢＳ ２％ ＢＳＡ緩衝液で１／２５００に希釈したヒトＩｇＧ抗Ｆａｂ二次抗体を用いてＡＣＰＡ反応性を検出した。結果はΔＯＤ（光学密度の変化）で表され、α６２１－６３５ｃｉｔペプチド又はα６２１－６３５ｃｉｔペプチドで構築されたハイブリッド分子で得られたＯＤを、α６２１－６３５ａｒｇペプチド又はα６２１－６３５ａｒｇペプチドで構築された対応するハイブリッド分子で得られたＯＤからそれぞれ差し引いたものに相当する。
【0085】
結果を図５に示す。それらは、ハイブリッド分子Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔ及びＦｃ－ＳＤＨ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔに関して、α６２１－６３５ｃｉｔペプチド上で精製されたＡＣＰＡの強い用量依存的反応性を示す。ハイブリッド分子に対するＡＣＰＡの反応性は比較的強いが、それらはα６２１－６３５ｃｉｔペプチドよりも低いエピトープ密度を示す。
【0086】
実施例３：本発明によるハイブリッド分子に対する、野生形態（野生型、ＷＴ）又はそれらのＦｃ断片において突然変異した（ＳＤＨ突然変異）組換えモノクローナル２Ｈ０６ ＡＣＰＡの反応性
ここで使用されるＡＣＰＡは、組換えモノクローナルヒトＡＣＰＡ（２Ｈ０６として知られるクローン０２２０１４ＣＣＰ１４ＣＦＣＴ２Ｈ０６）である。そのようなＡＣＰＡは、Ｔｉｔｃｏｍｂｅ Ｐ．Ｊ．，Ｗｉｇｅｒｂｌａｄ Ｇ．，Ｓｉｐｐｌ Ｎ．，Ｚｈａｎｇ Ｎ．，Ｓｈｍａｇｅｌ Ａ．Ｋ．，Ｓａｈｌｓｔｒｏｍ Ｐ．，Ｚｈａｎｇ Ｙ．，Ｂａｒｓｎｅｓｓ Ｌ．Ｏ．，Ｇｈｏｄｋｅ－Ｐｕｒａｎｉｋ Ｙ．，Ｂａｈａｒｐｏｏｒ Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ－Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｌａｄｅｓ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ２０１８，７０（１２），１９３３－１９４５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ａｒｔ．４０５９０に記載されているように得ることができる。２Ｈ０６ ＡＣＰＡ ＶＨは、Ｇｅｎｂａｎｋの下でアクセッション番号ＭＨ６２９７１０．１を有し、ＶＬは、アクセッション番号ＭＨ６２９７００．１を有する。
ここで使用されるＡＣＰＡは、組換えモノクローナルヒトＡＣＰＡ（２Ｈ０６として知られるクローン０２２０１４ＣＣＰ１４ＣＦＣＴ２Ｈ０６）である。そのようなＡＣＰＡは、Ｔｉｔｃｏｍｂｅ Ｐ．Ｊ．，Ｗｉｇｅｒｂｌａｄ Ｇ．，Ｓｉｐｐｌ Ｎ．，Ｚｈａｎｇ Ｎ．，Ｓｈｍａｇｅｌ Ａ．Ｋ．，Ｓａｈｌｓｔｒｏｍ Ｐ．，Ｚｈａｎｇ Ｙ．，Ｂａｒｓｎｅｓｓ Ｌ．Ｏ．，Ｇｈｏｄｋｅ－Ｐｕｒａｎｉｋ Ｙ．，Ｂａｈａｒｐｏｏｒ Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ－Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｌａｄｅｓ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ２０１８，７０（１２），１９３３－１９４５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ａｒｔ．４０５９０に記載されているように得ることができる。２Ｈ０６ ＡＣＰＡ ＶＨは、Ｇｅｎｂａｎｋの下でアクセッション番号ＭＨ６２９７１０．１を有し、ＶＬは、アクセッション番号ＭＨ６２９７００．１を有する。
【0087】
ＥＬＩＳＡプレートウェルを、ハイブリッド分子Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔ又はＦｃ－ＳＤＨ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔのいずれかを含有する１００μＬの溶液でコーティングし、ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水）中５μｇ／ｍｌの濃度で使用し、４°Ｃで一晩インキュベートした。非シトルリン化ペプチド（α６２１－６３５ａｒｇ）で構築したハイブリッド分子を陰性対照と同じ濃度で使用した。次いで、ウェルをＰＢＳ ２％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）緩衝液中で４°Ｃにて１時間飽和させた。洗浄後、ＷＴ及びＳＤＨ組換えモノクローナル２Ｈ０６ ＡＣＰＡを４０、２０及び１０μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ ２％ ＢＳＡ ２Ｍ ＮａＣｌ緩衝液で希釈）で４°Ｃにて１時間インキュベートした。洗浄後、ＰＢＳ ２％ ＢＳＡ緩衝液で１／２５００に希釈したヒトＩｇＧ抗Ｆａｂ二次抗体を用いてそれらの反応性を検出した。結果はΔＯＤ（光学密度の変化）で表され、ペプチドα６２１－６３５ｃｉｔで構築したハイブリッド分子で得られたＯＤを、α６２１－６３５ａｒｇ陰性対照ペプチドで構築したハイブリッド分子で得られたＯＤから差し引いたものに相当する。
【0088】
Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔ及びＦｃ－ＳＤＨ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔハイブリッド分子は、実施例２で使用したものと同一である。
【0089】
結果を図６に示す。結果は、ハイブリッド分子Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔ及びＦｃ－ＳＤＨ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔに対するＷＴ及びＳＤＨモノクローナルＡＣＰＡの強い用量依存的反応性を示す。
【0090】
実施例４：生理学的温度での２時間及び２０時間でのマクロファージへのハイブリッド分子の結合
健常対象の末梢血から単離したＣＤ１４＋単球からＭ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下でインビトロで分化させたヒトマクロファージを、５μｇ／ｍｌのハイブリッド分子、ＦｃＷＴ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－β６０－７４Ｃｉｔ（表２及び３においてＷＴと呼ばれる、配列番号１９によって表されるペプチドにカップリングされたＤＢＣＯシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされたＰＥＧｎスペーサーに結合した野生型Ｆｃ断片）、ＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－β６０－７４Ｃｉｔ（表２及び３においてＳＤＨと呼ばれる、配列番号１９によって表されるペプチドにカップリングされたＤＢＣＯに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされたＰＥＧｎスペーサーに結合したＳ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片）又はＦｃＬＡＬＡＰＧ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－β６０－７４Ｃｉｔ（表２及び３においてＬＡＬＡＰＧと呼ばれる、配列番号１９で表されるペプチドにカップリングされたＤＢＣＯシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされたＰＥＧｎスペーサーに結合したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ突然変異を含むＦｃ断片）の存在下、３７°Ｃで２時間又は２０時間、５００，０００細胞／ウェルでインキュベートした。マクロファージの表面へのハイブリッド分子の付着は、１／１０００で使用されるＦＩＴＣにカップリングされた抗Ｆｃ抗体とマクロファージとのインキュベーション後に細胞蛍光測定法（ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ）によって実証及び定量される。構造において、ｎは、ＰＥＧｎスペーサーが使用される場合、１～１０の数、好ましくは１、２、３、４又は８を表す。
健常対象の末梢血から単離したＣＤ１４＋単球からＭ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下でインビトロで分化させたヒトマクロファージを、５μｇ／ｍｌのハイブリッド分子、ＦｃＷＴ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－β６０－７４Ｃｉｔ（表２及び３においてＷＴと呼ばれる、配列番号１９によって表されるペプチドにカップリングされたＤＢＣＯシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされたＰＥＧｎスペーサーに結合した野生型Ｆｃ断片）、ＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－β６０－７４Ｃｉｔ（表２及び３においてＳＤＨと呼ばれる、配列番号１９によって表されるペプチドにカップリングされたＤＢＣＯに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされたＰＥＧｎスペーサーに結合したＳ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片）又はＦｃＬＡＬＡＰＧ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－β６０－７４Ｃｉｔ（表２及び３においてＬＡＬＡＰＧと呼ばれる、配列番号１９で表されるペプチドにカップリングされたＤＢＣＯシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされたＰＥＧｎスペーサーに結合したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ突然変異を含むＦｃ断片）の存在下、３７°Ｃで２時間又は２０時間、５００，０００細胞／ウェルでインキュベートした。マクロファージの表面へのハイブリッド分子の付着は、１／１０００で使用されるＦＩＴＣにカップリングされた抗Ｆｃ抗体とマクロファージとのインキュベーション後に細胞蛍光測定法（ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ）によって実証及び定量される。構造において、ｎは、ＰＥＧｎスペーサーが使用される場合、１～１０の数、好ましくは１、２、３、４又は８を表す。
【0091】
結果を以下の表２及び表３に示す。「ＮＭ」及び「ＡＮＴＩ ＦＣ」はそれぞれ、抗体なしで、又は抗Ｆｃ抗体のみと共にインキュベートしたマクロファージを含むウェルを表す。
【表2】
【表3】
【0092】
表２及び表３に示される結果は、３７°Ｃの生理学的温度でのハイブリッド分子ＦｃＷＴ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－β６０－７４Ｃｉｔ及びＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－β６０－７４Ｃｉｔが、２時間目からマクロファージ膜に結合し、２０時間後もそこに存在することを示す。これらの結果はまた、ハイブリッドＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－β６０－７４Ｃｉｔの結合が野生形態ＦｃＷＴ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－β６０－７４Ｃｉｔの結合よりも大きいことを示す。
【0093】
実施例５：Ｂ細胞をＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）を介して精製ＡＣＰＡでアーム化した場合、シトルリン化Ｆｃ－ＳＤＨβ６０ペプチドハイブリッドによって誘導される食作用
ＣＤ１９＋磁気選別によって健常ドナーの末梢血から新たに精製したヒトＢリンパ球を緑色ＰＫＨ－６７（Ｐａｕｌ Ｋａｒｌ Ｈｏｒａｎ／蛍光脂質マーカー）で標識し、次いで、β６０－７４ｃｉｔペプチド（配列番号１９）上の精製ＡＣＰＡ（実施例２と同様にして得られたｐＨ３画分）と共に、５μｇ／ｍｌの濃度で３７°Ｃで３０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、次いで、ＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－β６０－７４Ｃｉｔハイブリッド（配列番号１９で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているＤＢＣＯシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのスペーサーＰＥＧｎに結合した、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片）の存在下に置いた。この構造は、以下の表４においてＣＩＴと呼ばれる）。細胞を、ＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－β６０－７４Ａｒｇハイブリッド（β６０－７４ペプチドがシトルリン化されていないＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－β６０－７４Ｃｉｔ構築物に対応する）の存在下にも置いた。この構造は、以下の表４においてＮＣＩＴと呼ばれる）。細胞を、１０μｇ／ｍｌのハイブリッドの存在下、３７°Ｃで３０分間置いた。洗浄後、細胞を３７°Ｃで２時間、１個のマクロファージに対して１個のＢリンパ球の比でマクロファージ（ＰＫＨ－２６赤色でマーク）と接触させた。次いで、細胞を分離し、フローサイトメトリーによって分析した。二重蛍光（ＰＫＨ－６７緑色／ＰＫＨ－２６赤色）を示す細胞は、リンパ球を貪食したマクロファージに対応する。異なる細胞集団は、全細胞集団のパーセンテージ：食作用のパーセンテージ及びＢリンパ球のパーセンテージとして表される。構造において、ｎは、ＰＥＧｎスペーサーが使用される場合、１～１０の数、好ましくは１、２、３、４又は８を表す。
ＣＤ１９＋磁気選別によって健常ドナーの末梢血から新たに精製したヒトＢリンパ球を緑色ＰＫＨ－６７（Ｐａｕｌ Ｋａｒｌ Ｈｏｒａｎ／蛍光脂質マーカー）で標識し、次いで、β６０－７４ｃｉｔペプチド（配列番号１９）上の精製ＡＣＰＡ（実施例２と同様にして得られたｐＨ３画分）と共に、５μｇ／ｍｌの濃度で３７°Ｃで３０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、次いで、ＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－β６０－７４Ｃｉｔハイブリッド（配列番号１９で表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているＤＢＣＯシクロオクチンに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのスペーサーＰＥＧｎに結合した、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片）の存在下に置いた。この構造は、以下の表４においてＣＩＴと呼ばれる）。細胞を、ＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－β６０－７４Ａｒｇハイブリッド（β６０－７４ペプチドがシトルリン化されていないＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－β６０－７４Ｃｉｔ構築物に対応する）の存在下にも置いた。この構造は、以下の表４においてＮＣＩＴと呼ばれる）。細胞を、１０μｇ／ｍｌのハイブリッドの存在下、３７°Ｃで３０分間置いた。洗浄後、細胞を３７°Ｃで２時間、１個のマクロファージに対して１個のＢリンパ球の比でマクロファージ（ＰＫＨ－２６赤色でマーク）と接触させた。次いで、細胞を分離し、フローサイトメトリーによって分析した。二重蛍光（ＰＫＨ－６７緑色／ＰＫＨ－２６赤色）を示す細胞は、リンパ球を貪食したマクロファージに対応する。異なる細胞集団は、全細胞集団のパーセンテージ：食作用のパーセンテージ及びＢリンパ球のパーセンテージとして表される。構造において、ｎは、ＰＥＧｎスペーサーが使用される場合、１～１０の数、好ましくは１、２、３、４又は８を表す。
【0094】
結果を、４つの独立した実験に対応する４つの線として表４に示す。
【表4】
【0095】
得られた結果は、シトルリン化ハイブリッドの存在下で食作用活性が増加することを確認する（Ｂリンパ球の集団の減少に関連する食作用の増加）。実際、４回の独立した実験では、ハイブリッドＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－β６０－７４Ｃｉｔ（ＣＩＴ）対ＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－β６０－７４Ａｒｇ（ＮＣＩＴ）でＢリンパ球をコーティングした場合、常にＢリンパ球の集団の有意な減少に関連する食作用のパーセンテージの有意な増加が観察された。
【0096】
実施例６：ハイブリッドＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔをアーム化したマクロファージによる、ＳＤＨ突然変異を有する組換えモノクローナルヒト２Ｈ０６ ＡＣＰＡを負荷したＢリンパ球の食作用
ＣＤ１９＋磁気選別によって健常ドナーの末梢血から新たに精製したヒトＢリンパ球を緑色ＰＫＨ－６７（Ｐａｕｌ Ｋａｒｌ Ｈｏｒａｎ／蛍光脂質マーカー）で標識し、次いで、ＦｃがＳＤＨ突然変異を有するヒト組換えモノクローナル２Ｈ０６ ＡＣＰＡと共に１０μｇ／ｍｌの濃度で３７°Ｃで１時間インキュベートした。このような抗体は、実施例３と同様にして得ることができる。並行して、ＰＫＨ－２６赤色で標識されたマクロファージを、Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔハイブリッド（配列番号１８で表されるペプチドにそれ自体が結合したＰＥＧｎスペーサーにカップリングされたＤＢＣＯに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされた少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した野生型Ｆｃ断片）及びＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ａｒｇ（これはＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔハイブリッドであり、ペプチドがシトルリン化されていないという違いがある）の存在下、５μｇ／ｍｌで３７°Ｃにて１時間置いた。洗浄後、細胞を、３７°Ｃで２時間、１個のマクロファージに対して１個のＢリンパ球の割合で接触させた。次いで、細胞を分離し、フローサイトメトリーによって分析した。食作用のパーセンテージは、２つの蛍光色素（ＰＫＨ－６７緑色／ＰＫＨ－２６赤色）によってマークされた細胞のパーセンテージに対応する。構造において、ｎは、ＰＥＧｎスペーサーが使用される場合、１～１０の数、好ましくは１、２、３、４又は８を表す。
ＣＤ１９＋磁気選別によって健常ドナーの末梢血から新たに精製したヒトＢリンパ球を緑色ＰＫＨ－６７（Ｐａｕｌ Ｋａｒｌ Ｈｏｒａｎ／蛍光脂質マーカー）で標識し、次いで、ＦｃがＳＤＨ突然変異を有するヒト組換えモノクローナル２Ｈ０６ ＡＣＰＡと共に１０μｇ／ｍｌの濃度で３７°Ｃで１時間インキュベートした。このような抗体は、実施例３と同様にして得ることができる。並行して、ＰＫＨ－２６赤色で標識されたマクロファージを、Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔハイブリッド（配列番号１８で表されるペプチドにそれ自体が結合したＰＥＧｎスペーサーにカップリングされたＤＢＣＯに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされた少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合した野生型Ｆｃ断片）及びＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ａｒｇ（これはＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔハイブリッドであり、ペプチドがシトルリン化されていないという違いがある）の存在下、５μｇ／ｍｌで３７°Ｃにて１時間置いた。洗浄後、細胞を、３７°Ｃで２時間、１個のマクロファージに対して１個のＢリンパ球の割合で接触させた。次いで、細胞を分離し、フローサイトメトリーによって分析した。食作用のパーセンテージは、２つの蛍光色素（ＰＫＨ－６７緑色／ＰＫＨ－２６赤色）によってマークされた細胞のパーセンテージに対応する。構造において、ｎは、ＰＥＧｎスペーサーが使用される場合、１～１０の数、好ましくは１、２、３、４又は８を表す。
【0097】
結果を、５つの独立した実験に対応する６つの線として表５に示す。ＮＣＩＴは、Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ａｒｇペプチドでの結果を表し、ＣＩＴは、Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔペプチドでの結果を表し、（ΔＣＩＴ－ＮＣＩＴ）は、Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔの存在下で得られたＯＤと、Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ａｒｇの存在下で得られたＯＤとの差を、Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ａｒｇの存在下で得られたＯＤで割ったものを表す。
【表5】
【0098】
結果は、シトルリン化ハイブリッドの存在下で食作用活性が増加することを示す：Ｂリンパ球の集団の減少（３％から１７％）に関連する食作用の増加（２１％から６３％）。６つの実験のそれぞれにおいて、二重陽性のパーセンテージはより高く、そのため、マクロファージがＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ａｒｇ（ＮＣＩＴ）ハイブリッドに対してＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔ（ＣＩＴ）ハイブリッドでアーム化されている場合、食作用が増大し、集団Ｂが減少する。結果を図８Ａ及び図８Ｂにも示す。
【0099】
実施例７：生理学的温度で３０分、２４時間及び４８時間後のＮＫ細胞へのＦｃ－ＳＤＨ Ａ４８８及びＦｃ－ＳＤＨ β６０シトルリン化ペプチドハイブリッドの結合の安定性
ＮＫ細胞を、ＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－Ａ４８８（ＤＢＣＯに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされた少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合したＳ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片であって、分子が、蛍光色素Ａ４８８で標識されている、Ｆｃ断片）又はＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－β６０－７４ｃｉｔ－ｌｙｓｉｎｅＡ４８８（配列番号１９のペプチドに結合したＰＥＧｎスペーサーにカップリングされたＤＢＣＯに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされた少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合したＳ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片であって、分子が、リジンを介して分子に結合したＡ４８８蛍光色素で標識されている、Ｆｃフラグメント）の存在下、３７°Ｃで３０分間、２４時間又は４８時間インキュベートした。ＮＫ細胞へのこれら２つの蛍光プローブの結合を細胞蛍光測定法によって分析した。構造において、ｎは、ＰＥＧｎスペーサーが使用される場合、１～１０の数、好ましくは１、２、３、４又は８を表す。
ＮＫ細胞を、ＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－Ａ４８８（ＤＢＣＯに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされた少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合したＳ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片であって、分子が、蛍光色素Ａ４８８で標識されている、Ｆｃ断片）又はＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－β６０－７４ｃｉｔ－ｌｙｓｉｎｅＡ４８８（配列番号１９のペプチドに結合したＰＥＧｎスペーサーにカップリングされたＤＢＣＯに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされた少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合したＳ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片であって、分子が、リジンを介して分子に結合したＡ４８８蛍光色素で標識されている、Ｆｃフラグメント）の存在下、３７°Ｃで３０分間、２４時間又は４８時間インキュベートした。ＮＫ細胞へのこれら２つの蛍光プローブの結合を細胞蛍光測定法によって分析した。構造において、ｎは、ＰＥＧｎスペーサーが使用される場合、１～１０の数、好ましくは１、２、３、４又は８を表す。
【0100】
結果を以下の表６（３０分）、表７（２４時間）及び表８（４８時間）に示す。ＵＭは、抗体なしの非標識ＮＫ細胞を表す。
【表6】
【表7】
【表8】
【0101】
表６～表８に示される結果は、ＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－Ａ４８８及びＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－β６０－７４ｃｉｔ－ｌｙｓｉｎｅ Ａ４８８が生理学的温度で少なくとも４８時間ＮＫ細胞膜に付着したままであり、Ｆｃ断片へのペプチドの付着がＮＫ細胞のＦｃガンマ受容体との相互作用を妨げないことを示す。
【0102】
実施例８：蛍光色素Ａ６４７で標識された様々な形態のＦｃ（ＷＴ、ＳＤＨ及びＬＡＬＡＰＧ）のＮＫ細胞への結合
ＮＫ細胞を、１０μｇ／ｍｌのＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－Ａ６４７断片（ＤＢＣＯに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされた少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合したＳ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片であって、分子が蛍光色素Ａ６４７で標識されている、Ｆｃ断片）の存在下、３７°Ｃで３０分間インキュベートした。この構造は、以下の表９ではＳＤＨと呼ばれる）。実験はまた、以下のハイブリッド：ＦｃＷＴ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－Ａ６４７（ＤＢＣＯに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされた少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに連結された野生型Ｆｃ断片であって、分子が蛍光色素Ａ６４７で標識されている、野生型Ｆｃ断片）又はＦｃＬＡＬＡＰＧ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－Ａ６４７（ＤＢＣＯに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされた少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ突然変異を含むＦｃ断片であって、分子が蛍光色素Ａ６４７で標識されている、Ｆｃ断片）を用いて同じ濃度で行った。これらの２つの構造は、以下の表９においてそれぞれＷＴ及びＬＡＬＡＰＧと呼ばれる。構造において、ｎは、ＰＥＧｎスペーサーが使用される場合、１～１０の数、好ましくは１、２、３、４又は８を表す。ＮＫ細胞へのＦｃ断片の結合を細胞蛍光測定法によって分析した。結果を表９に示す。
ＮＫ細胞を、１０μｇ／ｍｌのＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－Ａ６４７断片（ＤＢＣＯに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされた少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合したＳ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片であって、分子が蛍光色素Ａ６４７で標識されている、Ｆｃ断片）の存在下、３７°Ｃで３０分間インキュベートした。この構造は、以下の表９ではＳＤＨと呼ばれる）。実験はまた、以下のハイブリッド：ＦｃＷＴ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－Ａ６４７（ＤＢＣＯに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされた少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに連結された野生型Ｆｃ断片であって、分子が蛍光色素Ａ６４７で標識されている、野生型Ｆｃ断片）又はＦｃＬＡＬＡＰＧ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－Ａ６４７（ＤＢＣＯに共有結合したアジドにそれ自体がカップリングされた少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ突然変異を含むＦｃ断片であって、分子が蛍光色素Ａ６４７で標識されている、Ｆｃ断片）を用いて同じ濃度で行った。これらの２つの構造は、以下の表９においてそれぞれＷＴ及びＬＡＬＡＰＧと呼ばれる。構造において、ｎは、ＰＥＧｎスペーサーが使用される場合、１～１０の数、好ましくは１、２、３、４又は８を表す。ＮＫ細胞へのＦｃ断片の結合を細胞蛍光測定法によって分析した。結果を表９に示す。
【表9】
【0103】
表９に示す結果は、ＦｃＷＴ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－Ａ６４７、ＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－Ａ６４７断片がＮＫ細胞の膜に結合することを示している。ＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－Ａ６４７の結合は、ＦｃＷＴ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－Ａ６４７の結合よりもはるかに大きい。
【0104】
実施例９：生理学的血清濃度まで、増加する濃度のヒトＩｇＧの存在下での同じハイブリッドの結合と比較した、蛍光色素Ａ６４７標識Ｆｃ－ＳＤＨ断片のＮＫ細胞への結合
ＮＫ細胞を、１０μｇ／ｍｌのＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－Ａ６４７断片（ＤＢＣＯに共有結合したアジドにそれ自体がさらにカップリングされた少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合したＳ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片であって、分子が蛍光色素Ａ６４７で標識されている、Ｆｃ断片）の存在下、又はこの同じ１０μｇ／ｍｌのＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－Ａ６４７断片の存在下、３７°Ｃで３０分間インキュベートし、増加する濃度（１、１０、１００、１，０００、１０，０００μｇ／ｍｌ）でヒトＩｇＧと共インキュベートした。構造において、ｎは、ＰＥＧｎスペーサーが使用される場合、１～１０の数、好ましくは１、２、３、４又は８を表す。ＮＫ細胞へのＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－Ａ６４７断片（ＳＤＨとして公知）の結合を細胞蛍光測定法によって分析した。
ＮＫ細胞を、１０μｇ／ｍｌのＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－Ａ６４７断片（ＤＢＣＯに共有結合したアジドにそれ自体がさらにカップリングされた少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合したＳ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片であって、分子が蛍光色素Ａ６４７で標識されている、Ｆｃ断片）の存在下、又はこの同じ１０μｇ／ｍｌのＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－Ａ６４７断片の存在下、３７°Ｃで３０分間インキュベートし、増加する濃度（１、１０、１００、１，０００、１０，０００μｇ／ｍｌ）でヒトＩｇＧと共インキュベートした。構造において、ｎは、ＰＥＧｎスペーサーが使用される場合、１～１０の数、好ましくは１、２、３、４又は８を表す。ＮＫ細胞へのＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－Ａ６４７断片（ＳＤＨとして公知）の結合を細胞蛍光測定法によって分析した。
【0105】
結果を表１０に示す。
【表10】
【0106】
結果は、１００μｇ／ｍｌのＩｇＧからの、ＮＫ細胞へのＦｃＳＤＨＦＳＴＩＥ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－Ａ６４７の結合の用量依存的減少を示し、これは、ヒトにおけるＩｇＧの生理学的血清濃度に対応するＦｃ断片（１０，０００μｇ／ｍｌ）の濃度よりも１０００倍高いＩｇＧの濃度の存在下でも有効かつ高いままである。
【0107】
実施例１０：ＦｃＷＴ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－α６２１－６３５Ｃｉｔ及びＦｃＳＤＨ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－α６２１－６３５Ｃｉｔハイブリッドの存在下での、その膜上に組換えモノクローナルＡＣＰＡを発現する形質芽球性悪性ヒトＢ株の細胞のヒトＮＫ細胞による溶解
ＷＴαＣＩＴは、配列番号１８によって表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているＤＢＣＯシクロオクチンに共有結合しているアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合している野生型Ｆｃ断片を含むハイブリッドを表し；ＷＴαＡｒｇは、配列番号１８のペプチドがシトルリン化されていないことを除いて、ハイブリッドＷＴαＣＩＴに対応し；ＳＤＨαＣＩＴは、配列番号１８によって表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているＤＢＣＯシクロオクチンに共有結合しているアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合している、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片を表し；ＳＤＨαＡｒｇは、配列番号１８のペプチドがシトルリン化されていないことを除いて、ＳＤＨαＣＩＴハイブリッドに対応する。構造において、ｎは、ＰＥＧｎスペーサーが使用される場合、１～１０の数、好ましくは１、２、３、４又は８を表す。
ＷＴαＣＩＴは、配列番号１８によって表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているＤＢＣＯシクロオクチンに共有結合しているアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合している野生型Ｆｃ断片を含むハイブリッドを表し；ＷＴαＡｒｇは、配列番号１８のペプチドがシトルリン化されていないことを除いて、ハイブリッドＷＴαＣＩＴに対応し；ＳＤＨαＣＩＴは、配列番号１８によって表されるペプチドにそれ自体が結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングされているＤＢＣＯシクロオクチンに共有結合しているアジドにそれ自体がカップリングされている少なくとも１つのＰＥＧｎスペーサーに結合している、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ突然変異を含むＦｃ断片を表し；ＳＤＨαＡｒｇは、配列番号１８のペプチドがシトルリン化されていないことを除いて、ＳＤＨαＣＩＴハイブリッドに対応する。構造において、ｎは、ＰＥＧｎスペーサーが使用される場合、１～１０の数、好ましくは１、２、３、４又は８を表す。
【0108】
実験は、９６ウェル丸底プレートで行った。Ｎａｌｍ６株の細胞（組換えヒトモノクローナル２Ｈ０６ ＡＣＰＡの膜発現のために形質導入されたもの）を標的細胞として使用した。１００，０００細胞／ウェルを、一方では１５μｇ／ｍｌで使用したＷＴαＣｉｔ又はＳＤＨαＣｉｔハイブリッド分子の存在下で、他方ではエフェクター細胞として使用した新たに精製したＮＫ細胞（紫色細胞トレーサーでマーク）の存在下で、同じく１００，０００細胞／ウェルで、３７°Ｃで１７時間インキュベートした。特異性対照として使用したＷＴαＡｒｇ及びＳＤＨαＡｒｇハイブリッド分子を同じ条件下でインキュベートした。陰性対照として、Ｎａｌｍ６細胞を、ハイブリッドの非存在下、単独で又はＮＫ細胞の存在下でインキュベートした。細胞溶解を、蛍光プローブ７－ＡＡＤで標識することによるフローサイトメトリーによって測定した。結果は、このマーカーについて陽性の細胞のパーセンテージ（％死細胞）を示す。（％）（ΔＣＩＴ－Ａｒｇ）は、ＷＴ型シトルリン化ペプチド及びＳＤＨ型シトルリン化ペプチドを保有するハイブリッドの存在下における７－ＡＡＤ陽性死細胞のパーセンテージと、それらの非シトルリン化対応物との差を、対応する非シトルリン化ハイブリッドの存在下における７－ＡＡＤ陽性細胞のパーセンテージで割ったものを表す。
【0109】
【0110】
結果は、シトルリン化ハイブリッド（ＷＴ及びＳＤＨ）が、ＮＫ細胞によって引き起こされるＮａｌｍ６ ＡＣＰＡ陽性標的細胞のＡＤＣＣによる溶解を特異的に増加させることができることを示している。この死亡率の増加は、ＷＴ型ハイブリッドについては６２％であり、ＳＤＨ型ハイブリッドについては８３％である。
【0111】
実施例１１：形質導入後のＮａｌｍ６ Ｂリンパ芽球性株によるモノクローナル２Ｈ０６ ＡＣＰＡの膜発現
Ａ－ヒトＢリンパ芽球性細胞株「Ｎａｌｍ６」を形質導入して、組換えモノクローナル２Ｈ０６ ＡＣＰＡの膜発現を誘導した。形質導入効率を、ＩｇＧ抗Ｆａｂ抗体及び蛍光アビジンに付着したビオチン化α６２１－６３５ｃｉｔペプチドのテトラマーによる二重標識を使用してフローサイトメトリーによって分析した。Ｂ－７０００万個のＮａｌｍ６細胞に対して行った選別により、Ｎａｌｍ６ Ｆａｂ＋細胞を回収することが可能になり、そこから、３００，０００個の細胞のプールを培養に戻した。増殖後、形質導入された２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６株の濃縮をフローサイトメトリーによって確認した。Ｃ－Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔ及びａｒｇハイブリッドを、「Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｌｉｎｋ」キットを使用してＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７で標識した。形質導入されていない（ＮＴ）Ｎａｌｍ６及び２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６株を、Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッドとインキュベートした。洗浄後、Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッドの膜結合をフローサイトメトリーによって分析した。
Ａ－ヒトＢリンパ芽球性細胞株「Ｎａｌｍ６」を形質導入して、組換えモノクローナル２Ｈ０６ ＡＣＰＡの膜発現を誘導した。形質導入効率を、ＩｇＧ抗Ｆａｂ抗体及び蛍光アビジンに付着したビオチン化α６２１－６３５ｃｉｔペプチドのテトラマーによる二重標識を使用してフローサイトメトリーによって分析した。Ｂ－７０００万個のＮａｌｍ６細胞に対して行った選別により、Ｎａｌｍ６ Ｆａｂ＋細胞を回収することが可能になり、そこから、３００，０００個の細胞のプールを培養に戻した。増殖後、形質導入された２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６株の濃縮をフローサイトメトリーによって確認した。Ｃ－Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔ及びａｒｇハイブリッドを、「Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｌｉｎｋ」キットを使用してＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７で標識した。形質導入されていない（ＮＴ）Ｎａｌｍ６及び２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６株を、Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッドとインキュベートした。洗浄後、Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッドの膜結合をフローサイトメトリーによって分析した。
【0112】
結果を図１０及び表１２に示す。
【0113】
表１２は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）及び蛍光ハイブリッドの存在下の条件と細胞がマークされていない対照条件との間のＭＦＩの比を表す。ＵＭは、蛍光ハイブリッドのない、マークされていないＮａｌｍ６細胞を表す。
【表12】
【0114】
結果は、細胞の選別及び増殖の後、Ｎａｌｍ６細胞の８９．１％がＩｇＧ Ｆａｂ（２Ｈ０６ ＡＣＰＡのもの）を発現することを示しており、形質導入の成功及び２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６株の確立を実証している（Ｂ）。結果は、２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６株と蛍光Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔハイブリッドとの間の強い相互作用を示すが、非シトルリン化Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ａｒｇハイブリッド（Ｃ）との相互作用は存在しない。蛍光Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔハイブリッド及び蛍光ＩｇＧ抗Ｆａｂ抗体による二重標識は、２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６株上の２つの標識の完全な相関を示すが、２つのいずれも非形質導入Ｎａｌｍ６株を標識しない（Ａ）。これらの結果は、ハイブリッドＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔの結合が２Ｈ０６ ＡＣＰＡの膜発現に厳密に結合していることを示す。
【0115】
実施例１２：形質導入２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＡＣＰＡ＋Ｂ株の細胞のＦｃ－ペプチドα６２１－６３５ハイブリッドで前処置したマクロファージによる食作用
マクロファージを緑色ＰＫＨ－６７膜蛍光色素で標識し、次いで、シトルリン化（Ｃｉｔ）又は非シトルリン化（Ａｒｇ）形態で、Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５、Ｆｃ－ＳＤＨ－ＰＥＧ－α６２１－６３５又はＦｃ－ＧＡＳＤＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッドと共に、５μｇ／ｍｌの濃度で３７°Ｃで６０分間インキュベートした。その膜上のモノクローナル２Ｈ０６ ＡＣＰＡの発現のために形質導入されたＮａｌｍ６ヒトＢリンパ芽球性株の細胞を、赤色ＰＫＨ－２６（蛍光脂質マーカー）で標識し、次いで、１個のマクロファージに対して２個のＮａｌｍ６標的細胞の比で、マクロファージの存在下に置いた。３７°Ｃで２時間後、マクロファージを剥離し、次いで、細胞集団をフローサイトメトリーによって分析した。
マクロファージを緑色ＰＫＨ－６７膜蛍光色素で標識し、次いで、シトルリン化（Ｃｉｔ）又は非シトルリン化（Ａｒｇ）形態で、Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５、Ｆｃ－ＳＤＨ－ＰＥＧ－α６２１－６３５又はＦｃ－ＧＡＳＤＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッドと共に、５μｇ／ｍｌの濃度で３７°Ｃで６０分間インキュベートした。その膜上のモノクローナル２Ｈ０６ ＡＣＰＡの発現のために形質導入されたＮａｌｍ６ヒトＢリンパ芽球性株の細胞を、赤色ＰＫＨ－２６（蛍光脂質マーカー）で標識し、次いで、１個のマクロファージに対して２個のＮａｌｍ６標的細胞の比で、マクロファージの存在下に置いた。３７°Ｃで２時間後、マクロファージを剥離し、次いで、細胞集団をフローサイトメトリーによって分析した。
【0116】
図１１Ａの結果は、Ｔ２において、ハイブリッドの非存在下で、Ｎａｌｍ６細胞の自発的基礎食作用を証明する二重陽性細胞の増加があることを示す。２時間で、使用したハイブリッド（ＷＴ、ＳＤＨ又はＧＡＳＤＩＥ）に関係なくハイブリッドの存在下で、マクロファージがアーム化されたシトルリン化ハイブリッドである場合、二重陽性細胞の強い増加及び標的細胞の数の崩壊が観察されるが、ハイブリッドの非シトルリン化バージョンでは存在しない。ここで、本発明者らは、二重陽性細胞の５２％から、ハイブリッドＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５の存在下で１４．６％、Ｆｃ－ＳＤＨ－ＰＥＧ－α６２１－６３５については２４．５％、及びＦｃ－ＧＡＳＤＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５については最大８％に進み、これが最も効果的である。
【0117】
３つの独立した実験の合成（図１１Ｂを参照）により、二重陽性細胞の７０％の平均増加及びＮａｌｍ６標的細胞の少なくとも５０％の減少を伴って、その効果がすべての条件において再現可能かつ有意であることが確認される。
【0118】
実施例１３：様々な濃度のＦｃ－ペプチドα６２１－６３５ハイブリッドの存在下でのプレアーム化されたマクロファージによる２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＡＣＰＡ＋Ｂ細胞株の食作用
マクロファージを緑色ＰＫＨ－６７膜蛍光色素で標識し、次いで、種々の濃度（５μｇ／ｍｌ；１μｇ／ｍｌ；１００ｎｇ／ｍｌ；５０ｎｇ／ｍｌ；１０ｎｇ／ｍｌ；５ｎｇ／ｍｌ）で、３７°Ｃで６０分間、シトルリン化（Ｃｉｔ）形態又は非シトルリン化（Ａｒｇ）形態のハイブリッドＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５、Ｆｃ－ＳＤＨ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ Ｆｃ－ＧＡＳＤＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５又はＦｃ－ＧＡＳＤＡＬＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５でアーム化した。モノクローナル２Ｈ０６ ＡＣＰＡの発現のために形質導入されたＮａｌｍ６ Ｂ株の細胞を、赤色ＰＫＨ－２６（蛍光脂質マーカー）でマークし、次いで、１個のマクロファージに対して１個のＮａｌｍ６標的細胞の比で、アーム化されたマクロファージの存在下に置いた。３７°Ｃで２時間後、マクロファージを剥離し、次いで、細胞集団をフローサイトメトリーによって分析した。
マクロファージを緑色ＰＫＨ－６７膜蛍光色素で標識し、次いで、種々の濃度（５μｇ／ｍｌ；１μｇ／ｍｌ；１００ｎｇ／ｍｌ；５０ｎｇ／ｍｌ；１０ｎｇ／ｍｌ；５ｎｇ／ｍｌ）で、３７°Ｃで６０分間、シトルリン化（Ｃｉｔ）形態又は非シトルリン化（Ａｒｇ）形態のハイブリッドＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５、Ｆｃ－ＳＤＨ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ Ｆｃ－ＧＡＳＤＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５又はＦｃ－ＧＡＳＤＡＬＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５でアーム化した。モノクローナル２Ｈ０６ ＡＣＰＡの発現のために形質導入されたＮａｌｍ６ Ｂ株の細胞を、赤色ＰＫＨ－２６（蛍光脂質マーカー）でマークし、次いで、１個のマクロファージに対して１個のＮａｌｍ６標的細胞の比で、アーム化されたマクロファージの存在下に置いた。３７°Ｃで２時間後、マクロファージを剥離し、次いで、細胞集団をフローサイトメトリーによって分析した。
【0119】
図１２に示される結果は、マクロファージがシトルリン化Ｆｃ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッドでアーム化されている場合、それらがＷＴ、ＳＤＨ、ＧＡＳＤＩＥ又はＧＡＳＤＡＬＩＥであるかにかかわらず、二重陽性細胞（Ａ）のパーセンテージの強い増加が標的細胞（Ｂ）のパーセンテージの強い減少に関連することを示す。両方とも、非シトルリン化ハイブリッド（Ｆｃ－ＰＥＧ－α６２１－６３５Ａｒｇ）には存在しない。この特異的食作用は、それらをアーム化するために使用される溶液中のＦｃ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッドの濃度と相関する。このモデルは、食作用が５０ｎｇ／ｍｌまでのすべてのシトルリン化ハイブリッドについて依然として観察されるので、特に堅牢である。ＦｃγＲに対するそれらの増大した親和性のために、Ｆｃ－ＧＡＳＤＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５Ｃｉｔ及びＦｃ－ＧＡＳＤＡＬＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５Ｃｉｔハイブリッドは、Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５Ｃｉｔ又はＦｃ－ＳＤＨ－ＰＥＧ－α６２１－６３５Ｃｉｔよりも効果的であり、５０ｎｇ／ｍｌ超で活性のままである。
【0120】
実施例１４：ＦｃＷＴ－ＰＥＧ－ペプチドα６２１－６３５ハイブリッドをアーム化したマクロファージによる２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＡＣＰＡ＋形質導入株の食作用プロセスの確認
２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ Ｂ細胞の破壊が食作用プロセスに起因することを確認するために、２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ Ｂ細胞を、中性ｐＨで弱い蛍光強度を示すが酸性培地中で強い蛍光を発するｐＨ感受性色素ｐＨＲｏｄｏＳＥで標識した。しかしながら、貪食された要素が見出される細胞質内小胞（リソソーム）のｐＨは酸性である。したがって、非貪食細胞は検出できないが、リソソーム区画に内在化された貪食細胞は蛍光性になる。
２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ Ｂ細胞の破壊が食作用プロセスに起因することを確認するために、２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ Ｂ細胞を、中性ｐＨで弱い蛍光強度を示すが酸性培地中で強い蛍光を発するｐＨ感受性色素ｐＨＲｏｄｏＳＥで標識した。しかしながら、貪食された要素が見出される細胞質内小胞（リソソーム）のｐＨは酸性である。したがって、非貪食細胞は検出できないが、リソソーム区画に内在化された貪食細胞は蛍光性になる。
【0121】
したがって、２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６細胞を２０ｎｇ／ｍｌのｐＨＲｏｄｏＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で標識した。標識されたＮａｌｍ６細胞は、５μｇ／ｍｌのＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５Ｃｉｔ又はＡｒｇハイブリッドでアーム化された又はされていないマクロファージと３７℃で１時間インキュベートされ、２μｇ／ｍｌのサイトカラシンＤで３０分間、その後貪食の間１μｇ／ｍｌで処理された又はされなかった。細胞を３７°Ｃで２時間インキュベートし、次いでマクロファージを分離し、細胞集団をフローサイトメトリーによって分析するか、又は光学顕微鏡による形態学的分析のためにＭａｙ Ｇｒｕｎｗａｌｄ Ｇｉｅｍｓａ（ＭＧＧ）で染色した。
【0122】
図１３に示される結果は、Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５Ｃｉｔハイブリッドでアーム化されたマクロファージの存在下でのｐＨＲｏｄｏＳＥ陽性集団（２番目のピーク）の出現を示し、この集団は、マクロファージがハイブリッドの非シトルリン化バージョンでアーム化されている場合には存在しない。この集団はサイトカラシンＤ（食作用阻害剤）の存在下では現れず、これは実際に、２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ Ｂ細胞を特異的に貪食したマクロファージの集団に対応することが確認される。これらの結果は、光学顕微鏡分析によって確認され、この分析では、多数の貪食された２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ Ｂ細胞が、Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５シトルリン化ハイブリッドでアーム化されたマクロファージにおいて細胞質内状況で観察されるが（上のパネル）、マクロファージが非シトルリン化形態のハイブリッドでアーム化された場合、この状況は完全に存在しない。
【0123】
実施例１５：Ｆｃ－ペプチドα６２１－６３５ハイブリッドでプレアーム化した、又はＦｃ－ペプチドα６２１－６３５ハイブリッドの存在下でインキュベートしたマクロファージによる２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＡＣＰＡ＋形質導入株の食作用
２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ Ｂ株の細胞を緑色ＰＫＨ－６７膜蛍光色素で標識し、マクロファージを赤色ＰＫＨ－２６で標識した。シトルリン化（Ｃｉｔ）又は非シトルリン化（Ａｒｇ）形態のＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５及びＦｃ－ＧＡＳＤＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッドを、５μｇ／ｍｌの濃度でマクロファージと共に３７°Ｃで１時間インキュベートし（アーム化後に洗浄する）、その後、１個のマクロファージに対して１個のＮａｌｍ６標的細胞の比で標的細胞と接触させ、３７°Ｃで２時間インキュベートするか、又は、Ｎａｌｍ６標的細胞及びマクロファージを同じ１／１比で含む培地中、同じ濃度で３７°Ｃで２時間インキュベートした。次いで、マクロファージを分離し、細胞集団をフローサイトメトリーによって分析した。
２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ Ｂ株の細胞を緑色ＰＫＨ－６７膜蛍光色素で標識し、マクロファージを赤色ＰＫＨ－２６で標識した。シトルリン化（Ｃｉｔ）又は非シトルリン化（Ａｒｇ）形態のＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５及びＦｃ－ＧＡＳＤＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッドを、５μｇ／ｍｌの濃度でマクロファージと共に３７°Ｃで１時間インキュベートし（アーム化後に洗浄する）、その後、１個のマクロファージに対して１個のＮａｌｍ６標的細胞の比で標的細胞と接触させ、３７°Ｃで２時間インキュベートするか、又は、Ｎａｌｍ６標的細胞及びマクロファージを同じ１／１比で含む培地中、同じ濃度で３７°Ｃで２時間インキュベートした。次いで、マクロファージを分離し、細胞集団をフローサイトメトリーによって分析した。
【0124】
図１４に示される結果は、マクロファージをプレアーム化したか、又はシトルリン化形態のＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５若しくはＦｃ－ＧＡＳＤＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッドと共にインキュベートした場合、２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６標的細胞集団の崩壊に関連する二重陽性細胞（食作用）の大きな増加を示す。この結果は、ハイブリッドの非シトルリン化形態では起こらないので、特異的である。
【0125】
実施例１６：生理学的血清濃度でのヒトＩｇＧの存在下又は非存在下でＦｃ－ＰＥＧ－ペプチドα６２１－６３５ハイブリッドと共にインキュベートしたマクロファージによる２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＡＣＰＡ＋形質導入株の食作用
２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６株の細胞を蛍光色素ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）で標識し、次いで、Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５又はＦｃ－ＧＡＳＤＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッドのそれらのシトルリン化（Ｃｉｔ）又は非シトルリン化（Ａｒｇ）形態の存在下、１μｇ／ｍｌの濃度で、３７°Ｃで２時間、１０ ｍｇ／ｍｌの生理学的血清濃度（ハイブリッドとＩｇＧとの濃度比：１／１０．０００）の競合ヒトＩｇＧの存在下又は非存在下で、マクロファージとインキュベートした。マクロファージを剥離し、次いで抗ＣＤ１１ｂ ＢＶ４２１抗体で標識し、細胞集団をフローサイトメトリーによって分析した。
２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６株の細胞を蛍光色素ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）で標識し、次いで、Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５又はＦｃ－ＧＡＳＤＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッドのそれらのシトルリン化（Ｃｉｔ）又は非シトルリン化（Ａｒｇ）形態の存在下、１μｇ／ｍｌの濃度で、３７°Ｃで２時間、１０ ｍｇ／ｍｌの生理学的血清濃度（ハイブリッドとＩｇＧとの濃度比：１／１０．０００）の競合ヒトＩｇＧの存在下又は非存在下で、マクロファージとインキュベートした。マクロファージを剥離し、次いで抗ＣＤ１１ｂ ＢＶ４２１抗体で標識し、細胞集団をフローサイトメトリーによって分析した。
【0126】
図１５に示される結果は、競合するＩｇＧの非存在下では、細胞と共にインキュベートされた２つの可溶性ハイブリッドＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５及びＦｃ－ＧＡＳＤＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５のシトルリン化形態は、非シトルリン化形態を有する２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６細胞の集団には存在しないので、ほぼ完全かつ特異的な食作用を誘導することを示す。ＩｇＧの存在は、Ｔ２で自発的食作用の相対的であるが有意な阻害（ｐ＜０．０１）、Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔハイブリッドによって誘導される食作用のほぼ完全かつ有意な阻害（ｐ＜０．０５）を誘導するが、この阻害は、Ｆｃ－ＧＡＳＤＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッド（そのＦｃは突然変異しており、血清ＩｇＧのものよりもＦｃガンママクロファージ受容体に対する親和性が高い）では部分的かつ非有意であるにすぎない。
【0127】
実施例１７：生理学的濃度のヒトＩｇＧ又はヒト血清の存在下又は非存在下で、Ｆｃ－ペプチドα６２１－６３５ハイブリッドと共にインキュベートしたヒトマクロファージによる２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＡＣＰＡ＋形質導入株の食作用
２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６株の細胞を蛍光色素ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）で標識し、次いで、シトルリン化（ｃｉｔ）又は非シトルリン化（ａｒｇ）形態のＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５又はＦｃ－ＧＡＳＤＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッドの存在下、１０ μｇ／ｍｌの濃度でマクロファージとインキュベートした。実験は、１０ｍｇ／ｍｌの濃度の競合ヒトＩｇＧ又は同じＩｇＧ濃度を有するヒト血清の混合物の存在下又は非存在下、３７°Ｃで２時間にわたって行った。したがって、ここでは、ハイブリッドとＩｇＧとの間の濃度比は１／１０００である。細胞を取り出し、マクロファージを同定するために抗ＣＤ１１ｂ ＢＶ４２１抗体でマークし、次いでフローサイトメトリーによって分析した。
２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６株の細胞を蛍光色素ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）で標識し、次いで、シトルリン化（ｃｉｔ）又は非シトルリン化（ａｒｇ）形態のＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５又はＦｃ－ＧＡＳＤＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッドの存在下、１０ μｇ／ｍｌの濃度でマクロファージとインキュベートした。実験は、１０ｍｇ／ｍｌの濃度の競合ヒトＩｇＧ又は同じＩｇＧ濃度を有するヒト血清の混合物の存在下又は非存在下、３７°Ｃで２時間にわたって行った。したがって、ここでは、ハイブリッドとＩｇＧとの間の濃度比は１／１０００である。細胞を取り出し、マクロファージを同定するために抗ＣＤ１１ｂ ＢＶ４２１抗体でマークし、次いでフローサイトメトリーによって分析した。
【0128】
図１６に示される結果は、２つのシトルリン化ハイブリッドＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５及びＦｃ－ＧＡＳＤＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５を１０μｇ／ｍｌの濃度で使用すると、２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６細胞の食作用が特異的かつ非常に効果的に誘導されることを示す。ハイブリッドとの競合により、ＩｇＧはマクロファージによる２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６細胞の食作用を阻害するが、阻害効果は、Ｆｃ－ＷＴハイブリッド（野生型）の方が、ＧＡＳＤＩＥハイブリッド（突然変異しており、Ｆｃガンママクロファージ受容体に対してより高い親和性を有する）よりもはるかに強い。ヒト血清の存在下で同等の結果が得られ、したがって、後者がＩｇＧ以外の食作用阻害因子を含有しないことを示している。
【0129】
実施例１８：形質導入されていないＮａｌｍ６株の存在下における、Ｆｃ－ペプチドα６２１－６３５ハイブリッドでプレアーム化されたヒトマクロファージによる２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＡＣＰＡ＋形質導入株の食作用
２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６株の細胞を蛍光色素ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）で標識し、次いで、形質導入されていない（ＮＴ）Ｎａｌｍ６細胞と１／４の比（４個の形質導入されていない細胞に対して１個の形質導入細胞）で混合した。マクロファージを、３７°Ｃで１ｇ／ｍｌの濃度で１時間インキュベートすることによって、シトルリン化（Ｃｉｔ）形態又は非シトルリン化（Ａｒｇ）形態のＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５又はＦｃ－ＧＡＳＤＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッドでプレアーム化した。次いで、２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６細胞及び非形質導入ＮＴ Ｎａｌｍ６細胞を識別するために、Ｎａｌｍ６細胞をマクロファージの存在下に３７°Ｃで２時間置いた後、マクロファージを剥離し、全細胞集団をサンプリングし、抗ＣＤ１９ ＡＰＣ抗体でマークした。次いで、全細胞集団をフローサイトメトリーによって分析した。
２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６株の細胞を蛍光色素ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）で標識し、次いで、形質導入されていない（ＮＴ）Ｎａｌｍ６細胞と１／４の比（４個の形質導入されていない細胞に対して１個の形質導入細胞）で混合した。マクロファージを、３７°Ｃで１ｇ／ｍｌの濃度で１時間インキュベートすることによって、シトルリン化（Ｃｉｔ）形態又は非シトルリン化（Ａｒｇ）形態のＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５又はＦｃ－ＧＡＳＤＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッドでプレアーム化した。次いで、２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６細胞及び非形質導入ＮＴ Ｎａｌｍ６細胞を識別するために、Ｎａｌｍ６細胞をマクロファージの存在下に３７°Ｃで２時間置いた後、マクロファージを剥離し、全細胞集団をサンプリングし、抗ＣＤ１９ ＡＰＣ抗体でマークした。次いで、全細胞集団をフローサイトメトリーによって分析した。
【0130】
シトルリン化ハイブリッドの存在下でのＡＣＰＡ＋細胞に対する食作用の特異性を確認するために、本発明者らは、２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６標的細胞（ＡＣＰＡ＋）及び非形質導入ＮＴ Ｎａｌｍ６細胞（ＡＣＰＡ－）を共インキュベートした。図１７に示される結果は、膜２Ｈ０６ ＡＣＰＡを発現するＮａｌｍ６細胞（ＣＦＳＥ＋ＣＤ１９＋）のみが消失し、マクロファージがシトルリン化形態（Ｃｉｔ）のＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５又はＦｃ－ＧＡＳＤＩＥ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッドで予めアーム化されている場合、マクロファージによって貪食されたことが見出されることを示す。対照的に、ＮＴ Ｎａｌｍ６細胞、野生型非形質導入ＡＣＰＡ－（ＣＤ １９＋ＣＦＳＥ－）の割合は、条件にかかわらず変化せず、誘導された相互作用が実際に特異的であり、ＡＣＰＡに対するシトルリン化ペプチドの結合に起因することが確認される。１／９の比（９個の非形質導入ＮＴ Ｎａｌｍ６細胞に対して１個の２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６細胞）について同じ結果が得られた。
【0131】
実施例１９：ＳＣＩＤ／ＢＥＩＧＥ免疫不全マウスにおけるＦｃ－ペプチドα６２１－６３５ハイブリッドの存在下でのヒトＮＫ細胞による２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＡＣＰＡ＋株の特異的インビボ破壊
２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６標的細胞上の２Ｈ０６ ＡＣＰＡの膜発現を抗Ｆａｂ抗体で標識することによって確認し、エフェクターヒトＮＫ細胞の溶解活性（ＡＤＣＣ）をインビトロで検証した。２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６標的細胞を高濃度（５μＭ）でＣＴＶ蛍光マーカー（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ）で標識し、非形質導入ＮＴ Ｎａｌｍ６細胞を同じマーカーであるが１０倍低い濃度（０．５μＭ）で標識した。したがって、フローサイトメトリーでは、強く標識された細胞（２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＣＴＶｈｉｇｈ）を弱く標識された細胞（ＮＴ Ｎａｌｍ６ ＣＴＶｌｏｗ）と区別することができる。ＳＣＩＤ／ＢＥＩＧＥ免疫不全マウスに、マウス腹腔マクロファージのＦｃＲを遮断するために５０μｇの抗ＦｃＲ抗体を腹腔内（ＩＰ）投与し、次いで、３０分後に、新たに調製したヒトＮＫ細胞及びＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッド（シトルリン化（ｃｉｔ）又は非シトルリン化（ａｒｇ））の存在下又は非存在下で、２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６標的細胞及び非形質導入ＮＴ Ｎａｌｍ６細胞をＩＰ注射した。
２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６標的細胞上の２Ｈ０６ ＡＣＰＡの膜発現を抗Ｆａｂ抗体で標識することによって確認し、エフェクターヒトＮＫ細胞の溶解活性（ＡＤＣＣ）をインビトロで検証した。２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６標的細胞を高濃度（５μＭ）でＣＴＶ蛍光マーカー（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ）で標識し、非形質導入ＮＴ Ｎａｌｍ６細胞を同じマーカーであるが１０倍低い濃度（０．５μＭ）で標識した。したがって、フローサイトメトリーでは、強く標識された細胞（２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＣＴＶｈｉｇｈ）を弱く標識された細胞（ＮＴ Ｎａｌｍ６ ＣＴＶｌｏｗ）と区別することができる。ＳＣＩＤ／ＢＥＩＧＥ免疫不全マウスに、マウス腹腔マクロファージのＦｃＲを遮断するために５０μｇの抗ＦｃＲ抗体を腹腔内（ＩＰ）投与し、次いで、３０分後に、新たに調製したヒトＮＫ細胞及びＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッド（シトルリン化（ｃｉｔ）又は非シトルリン化（ａｒｇ））の存在下又は非存在下で、２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６標的細胞及び非形質導入ＮＴ Ｎａｌｍ６細胞をＩＰ注射した。
【0132】
以下の細胞及びハイブリッドの組み合わせを腹腔内注射（ＩＰ）によって受けた７匹のＳＣＩＤ／ＢＥＩＧＥマウスの４つの群：
－１／ ２．１０５ Ｎａｌｍ６－２Ｈ０６標的細胞＋２．１０５ ＮＴ Ｎａｌｍ６細胞
－２／ ２．１０５ Ｎａｌｍ６－２Ｈ０６標的細胞＋２．１０５ ＮＴ Ｎａｌｍ６細胞＋２．１０５ ＮＫ細胞
－３／ ２．１０５ Ｎａｌｍ６－２Ｈ０６標的細胞＋２．１０５ ＮＴ Ｎａｌｍ６細胞＋２．１０５ ＮＫ／細胞＋３μｇ／マウスのＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５Ｃｉｔハイブリッド
－４／ ２．１０５ Ｎａｌｍ６－２Ｈ０６標的細胞＋２．１０５ ＮＴ Ｎａｌｍ６細胞＋２．１０５ ＮＫ細胞＋３μｇ／マウスのＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５Ａｒｇハイブリッド
－１／ ２．１０５ Ｎａｌｍ６－２Ｈ０６標的細胞＋２．１０５ ＮＴ Ｎａｌｍ６細胞
－２／ ２．１０５ Ｎａｌｍ６－２Ｈ０６標的細胞＋２．１０５ ＮＴ Ｎａｌｍ６細胞＋２．１０５ ＮＫ細胞
－３／ ２．１０５ Ｎａｌｍ６－２Ｈ０６標的細胞＋２．１０５ ＮＴ Ｎａｌｍ６細胞＋２．１０５ ＮＫ／細胞＋３μｇ／マウスのＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５Ｃｉｔハイブリッド
－４／ ２．１０５ Ｎａｌｍ６－２Ｈ０６標的細胞＋２．１０５ ＮＴ Ｎａｌｍ６細胞＋２．１０５ ＮＫ細胞＋３μｇ／マウスのＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５Ａｒｇハイブリッド
【0133】
注射の５時間後、細胞をＰＢＳ ２％ ＦＣＳによる腹膜洗浄によって回収し、次いで、７ＡＡＤ及びアネキシン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎキット）で標識した後、フローサイトメトリーによって分析した。
【0134】
図１８に示される結果は、ＳＣＩＤ／ＢＥＩＧＥ免疫不全マウスの腹膜腔において、Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ＣｉｔハイブリッドがＮＫ細胞による２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６標的細胞の完全かつ特異的な破壊を誘導することを示す。実際、２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６細胞に対応するＣＴＶｈｉｇｈピークは、ＮＫ細胞及びＦｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５Ｃｉｔハイブリッドの存在下でのみ消失する。
【0135】
この非常に有意な結果（＊＊＊ ｐ＜０．００１）は、ＡＣＰＡ標的エピトープを有するＦｃ－シトルリン化ペプチドハイブリッドの存在下でのヒトＮＫ細胞によるＡＣＰＡ＋細胞のＡＤＣＣ溶解の有効性及び特異性のインビボ証明を提供する。
【0136】
実施例２０：ＳＣＩＤ／ＢＥＩＧＥ免疫不全マウスにおけるＦｃ－ペプチドα６２１－６３５ハイブリッドでプレアーム化されたヒトマクロファージによる２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＡＣＰＡ＋株の特異的インビボ破壊
２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６標的細胞上の２Ｈ０６ ＡＣＰＡの膜発現を抗Ｆａｂ抗体で標識することによって確認した。単球の精製は、健常ドナー由来の末梢血を用いて行った。１００ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦの存在下で単球のマクロファージへの分化を誘導し、このようにして生成されたマクロファージの食作用活性をインビトロで検証した。
２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６標的細胞上の２Ｈ０６ ＡＣＰＡの膜発現を抗Ｆａｂ抗体で標識することによって確認した。単球の精製は、健常ドナー由来の末梢血を用いて行った。１００ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦの存在下で単球のマクロファージへの分化を誘導し、このようにして生成されたマクロファージの食作用活性をインビトロで検証した。
【0137】
腹腔内（ＩＰ）注射の前に、マクロファージに様々なシトルリン化（ｃｉｔ）又はシトルリン化されていない（ａｒｇ）Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッドでアーム化し、２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６標的細胞を０．５μＭの蛍光マーカーＣＴＶ（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ）で標識した：それらが遊離している場合は蛍光が強く（２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６ ＣＴＶｈｉｇｈ）、これらの細胞はマクロファージによる食作用後にはるかに弱い蛍光（Ｎａｌｍ６－２Ｈ０６ ＣＴＶｌｏｗ）を示す。
【0138】
５匹のＳＣＩＤ／ＢＥＩＧＥマウスからなる４つの群に、下記の組み合わせに従って、新鮮なプレアーム化マクロファージの存在下又は非存在下及びＦｃＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔ又はａｒｇハイブリッドの存在下又は非存在下で、ＩＰ注射によって標的細胞を与えた：
－１／ ２．１０５ Ｎａｌｍ６－２Ｈ０６標的細胞
－２／ ２．１０５ Ｎａｌｍ６－２Ｈ０６標的細胞＋２．１０５ 非アーム化マクロファージ
－３／ ２．１０５ Ｎａｌｍ６－２Ｈ０６標的細胞＋２．１０５ マクロファージ（Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５Ｃｉｔハイブリッドでプレアーム化されている）
－４／ ２．１０５ Ｎａｌｍ６－２Ｈ０６標的細胞 ２．１０５ マクロファージ（Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５Ａｒｇハイブリッドでプレアーム化されている）
－１／ ２．１０５ Ｎａｌｍ６－２Ｈ０６標的細胞
－２／ ２．１０５ Ｎａｌｍ６－２Ｈ０６標的細胞＋２．１０５ 非アーム化マクロファージ
－３／ ２．１０５ Ｎａｌｍ６－２Ｈ０６標的細胞＋２．１０５ マクロファージ（Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５Ｃｉｔハイブリッドでプレアーム化されている）
－４／ ２．１０５ Ｎａｌｍ６－２Ｈ０６標的細胞 ２．１０５ マクロファージ（Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５Ａｒｇハイブリッドでプレアーム化されている）
【0139】
注射の２時間後、細胞をＰＢＳ ５％ ＦＣＳによる腹膜洗浄によって回収し、穏やかな溶解によって赤血球を除去し、細胞を抗ヒトＣＤ４５－ＦＩＴＣ抗体、次いで７ＡＡＤ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎキット）で標識した後、フローサイトメトリー分析を行った。
【0140】
図１９に示される結果は、ＳＣＩＤ／ＢＥＩＧＥ免疫不全マウスの腹膜腔において、Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔハイブリッドを負荷したマクロファージが２Ｈ０６ Ｎａｌｍ６標的細胞を特異的に貪食し、対照（非シトルリン化Ｆｃ－ＷＴ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ａｒｇハイブリッド）と比較したそれらの減少が有意である（ｐ＜０．０５）ことを示す。
【0141】
この結果は、ＡＣＰＡ標的エピトープを有するＦｃ－シトルリン化ペプチドハイブリッドを負荷したヒトマクロファージによるＡＣＰＡ＋細胞食作用の有効性及び特異性のインビボ証明を提供する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】
【国際調査報告】