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特表2024-515015フィブリン由来シトルリン化ペプチドと、ＣＤ３８及び／又はＣＤ１３８に結合する抗体又は抗体断片とを含むハイブリッド分子並びにその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-04
(54)【発明の名称】フィブリン由来シトルリン化ペプチドと、ＣＤ３８及び／又はＣＤ１３８に結合する抗体又は抗体断片とを含むハイブリッド分子並びにその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/745 20060101AFI20240328BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20240328BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240328BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20240328BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240328BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240328BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240328BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240328BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240328BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240328BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240328BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240328BHJP
A61K 38/36 20060101ALI20240328BHJP
【ＦＩ】
C07K14/745
C07K14/00 ZNA
C07K19/00
C07K14/47
C12N15/12
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K47/68
A61K47/64
A61P37/02
A61P29/00 101
A61P19/02
A61P43/00 121
A61K38/36
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023555855
(86)(22)【出願日】2022-03-18
(85)【翻訳文提出日】2023-11-07
(86)【国際出願番号】 FR2022050505
(87)【国際公開番号】W WO2022195238
(87)【国際公開日】2022-09-22
(31)【優先権主張番号】2102804
(32)【優先日】2021-03-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510139564
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・トゥールーズ・トロワ－ポール・サバティエ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＴＯＵＬＯＵＳＥ ＩＩＩ－ＰＡＵＬ ＳＡＢＡＴＩＥＲ
(71)【出願人】
【識別番号】507002516
【氏名又は名称】アンセルム（アンスティチュート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル）
(71)【出願人】
【識別番号】523346951
【氏名又は名称】ソントル オスピタリエ ユニヴェルシテール ドゥ トゥールーズ
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＨＯＳＰＩＴＡＬＩＥＲ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＩＲＥ ＤＥ ＴＯＵＬＯＵＳＥ
(71)【出願人】
【識別番号】523346962
【氏名又は名称】ソントル オスピタリエ ユニヴェルシテール ドゥ モンペリエ
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＨＯＳＰＩＴＡＬＩＥＲ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＩＲＥ ＤＥ ＭＯＮＴＰＥＬＬＩＥＲ
(71)【出願人】
【識別番号】515011944
【氏名又は名称】ウニヴェルシテ・ドゥ・モンペリエ
(71)【出願人】
【識別番号】523346973
【氏名又は名称】アートリティス ルシェルシュ エ デヴロプマン
【氏名又は名称原語表記】ＡＲＴＨＲＩＴＩＳ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＆ ＤＥＶＥＬＯＰＰＥＭＥＮＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(74)【代理人】
【識別番号】100133503
【弁理士】
【氏名又は名称】関口 一哉
(72)【発明者】
【氏名】ヴァシン， ポーリーヌ
(72)【発明者】
【氏名】ルイ－プランス， パスカル
(72)【発明者】
【氏名】ヨルゲンセン， クリスチャン
(72)【発明者】
【氏名】エスケール， カミーユ
(72)【発明者】
【氏名】クラヴェール， シリール
(72)【発明者】
【氏名】セール， ギィ， ブリューノ， ルネ
(72)【発明者】
【氏名】コンブ， エブ
(72)【発明者】
【氏名】ロベール， ブリューノ
(72)【発明者】
【氏名】マルティノー， ピエール
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC07
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA18
4C084BA23
4C084BA41
4C084CA18
4C084DC11
4C084NA05
4C084NA13
4C084ZA961
4C084ZA962
4C084ZB071
4C084ZB072
4C084ZB151
4C084ZB152
4C084ZC751
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB41
4C085BB43
4C085BB44
4C085CC22
4C085CC23
4C085EE01
4H045AA11
4H045BA40
4H045CA40
4H045DA65
4H045DA75
4H045EA22
(57)【要約】
本発明は、フィブリン由来シトルリン化ペプチドと、ＣＤ３８及び／又はＣＤ１３８に結合する抗体又は抗体断片とを含むハイブリッド分子、そのようなハイブリッド分子の使用、並びにその製造方法に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つのシトルリル残基を有する少なくとも１つのフィブリン由来ペプチドを含むハイブリッド分子であって、前記ペプチドが、少なくとも１つの抗体又は少なくとも１つの抗体断片に共有結合しており、前記抗体又は断片が、ＣＤ３８及び／又はＣＤ１３８に結合することができ、１つ以上のスペーサーが、前記ペプチドと前記抗体又は前記断片との間に存在していてもよい、ハイブリッド分子。
【請求項2】
前記ペプチドがスペーサーに共有結合しており、前記スペーサー自体が前記抗体又は抗体断片に共有結合している、請求項１に記載のハイブリッド分子。
【請求項3】
前記ペプチドが、少なくとも１つのアルギニル残基をシトルリル残基で置換することによる脊椎動物のフィブリンのα鎖又はβ鎖の配列の全部又は一部に由来し、前記脊椎動物のフィブリンが、好ましくは哺乳動物、好ましくはヒトのフィブリンである、請求項１又は２のいずれかに記載のハイブリッド分子。
【請求項4】
前記スペーサーが、エーテル基を含有する１つ以上の繰り返し単位を含有するポリマーであり、前記スペーサーが、好ましくは式ＰＥＧｎのポリエチレングリコールであり、式中、ｎは、１～１００、好ましくは１～１０、特に１、２、３、４又は８の整数を表す、請求項１～３のいずれか一項に記載のハイブリッド分子。
【請求項5】
前記ペプチドが、少なくとも１つのシトルリル残基を含み、ａ）配列Ｘ１ＰＡＰＰＰＩＳＧＧＧＹＸ２ＡＸ３（配列番号１）で定義されるペプチドであって、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２又はＸ３残基の少なくとも１つがシトルリル残基である、ペプチド；
ｂ）配列ＧＰＸ１ＶＶＥＸ２ＨＱＳＡＣＫＤＳ（配列番号２）で定義されるペプチドであって、Ｘ１及びＸ２がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２残基の少なくとも一方がシトルリル残基である、ペプチド；
ｃ）配列ＳＧＩＧＴＬＤＧＦＸ１ＨＸ２ＨＰＤ（配列番号３）で定義されるペプチドであって、Ｘ１及びＸ２がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２残基の少なくとも一方がシトルリル残基である、ペプチド；
ｄ）配列ＶＤＩＤＩＫＩＸ１ＳＣＸ２ＧＳＣＳ（配列番号４）で定義されるペプチドであって、Ｘ１及びＸ２がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２残基の少なくとも一方がシトルリル残基である、ペプチド；
ｅ）配列Ｘ１ＧＨＡＫＳＸ２ＰＶＸ３ＧＩＨＴＳ（配列番号１２）で定義されるペプチドであって、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２又はＸ３残基の少なくとも１つがシトルリル残基である、ペプチド；
ｆ）上記ペプチドａ）～ｅ）の１つからの少なくとも１つのシトルリル残基を含む少なくとも５個の連続アミノ酸を含むペプチド
からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載のハイブリッド分子。
【請求項6】
前記ペプチドが、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３からなる群から選択され、より詳細には配列番号５、配列番号６、配列番号１４、配列番号１８及び配列番号１９、より詳細には配列番号１８及び配列番号１９、からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載のハイブリッド分子。
【請求項7】
前記断片が、断片、ｓｃＦｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載のハイブリッド分子。
【請求項8】
前記抗体又はＦ（ａｂ’）２断片が、二重特異性抗体又はＦ（ａｂ’）２断片であり、－ ＣＤ３８及び別の形質細胞標的、又は
－ ＣＤ１３８及び別の形質細胞標的、又は
－ ＣＤ３８及びＣＤ１３８
に対する、請求項１～７のいずれか一項に記載のハイブリッド分子。
【請求項9】
前記分子が、－ 配列番号１９又は配列番号１８によって表されるペプチドにカップリングしたシクロオクチンに共有結合したアジドに、それ自体カップリングするＰＥＧｎスペーサーに結合したＣＤ３８に結合することができる抗体断片；
－ 配列番号１９又は配列番号１８によって表されるペプチドに、それ自体結合したＰＥＧｎスペーサーにカップリングしたシクロオクチンに共有結合したアジドに、それ自体カップリングしたＰＥＧｎスペーサーに結合したＣＤ３８に結合することができる抗体断片
によって表され、
ｎは、好ましくは１～１０、より詳細には１、２、３、４又は８の整数を表す、
請求項１～８のいずれか一項に記載のハイブリッド分子。
【請求項10】
医薬品として使用するための、特に抗シトルリン化タンパク質自己抗体の産生に関連する自己免疫疾患、特にグージュロー・シェーグレン症候群及び関節リウマチの治療に使用するための、請求項１～９のいずれか一項に記載のハイブリッド分子。
【請求項11】
第２のハイブリッド分子と組み合わせて医薬品として使用するための、請求項１～１０のいずれか一項に記載のハイブリッド分子であって、前記第２の分子が、シトルリル残基の少なくとも１つのフィブリン由来ペプチドキャリアに共有結合した少なくとも１つのＦｃ抗体断片を含み、スペーサーが、前記Ｆｃ断片と前記ペプチドとの間に存在していてもよい、請求項１～１０のいずれか一項に記載のハイブリッド分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、フィブリン由来シトルリン化ペプチドと、ＣＤ３８及び／又はＣＤ１３８に結合する抗体又は抗体断片とを含むハイブリッド分子、そのようなハイブリッド分子の使用及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
関節リウマチは、最も一般的なタイプの炎症性リウマチ又は関節炎であるが、最も一般的な自己免疫疾患でもある。この疾患は、滑膜関節の慢性炎症を特徴とし、不可逆的な関節破壊をもたらす。
【0003】
抗シトルリン化タンパク質自己抗体（ＡＣＰＡ）として知られる、シトルリン化タンパク質に対するクラスＧ自己抗体の存在は、関節リウマチに非常に特異的である。ＡＣＰＡを含有する患者由来の血清、それらをそれらの膜上に発現するリンパ球細胞及び患者自身は全て「ＡＣＰＡ陽性」であると言われる。いくつかの研究は、これらのＡＣＰＡがリウマチ様疾患に特異的な自己免疫反応の中心にあり、したがって選択される治療標的であることを実証している。
【0004】
ＡＣＰＡの抗原標的は特徴付けられている。それらは、特に、炎症を起こした滑膜組織に豊富に存在するタンパク質であるフィブリンのα及びβポリペプチド鎖の脱イミン化形態又はシトルリン化形態に対して特異的に向けられる。このシトルリン化は、ペプチジル－アルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）の作用によるタンパク質のアルギニル残基の酵素的脱イミン化に対応する。
【0005】
より具体的には、フィブリンのα及びβポリペプチド鎖上のＡＣＰＡによって認識される免疫優性エピトープは、特にＰＣＴ／ＦＲ００／０１８５７又はＰＣＴ／ＦＲ２００７／０００７５８の出願において特徴付けられ、公開されている。免疫優性エピトープを有する５つのシトルリン化ペプチドは、より詳細には、α３６－５０Ｃｉｔ（配列番号５に示すように）、α１７１－１８５Ｃｉｔ（配列番号６に示すように）、α５０１－５１５Ｃｉｔ（配列番号１４に示すように）、α６２１－６３５Ｃｉｔ（配列番号１８に示すように）及びβ６０－７４Ｃｉｔ（配列番号１９に示すように）と命名されたペプチドである。ＡＣＰＡ陽性患者の血清は、これら５つのペプチドのうちの１つ以上を認識する。
【0006】
局所形質細胞によってリウマチ滑膜組織に分泌されたＡＣＰＡは、そこに高濃度で見出される。それらは、それらの主な標的であるシトルリン化フィブリンに近いままであり、これも間質沈着物の形態でそこに豊富に存在する。これらの沈着物へのＡＣＰＡの結合、及び関節リウマチに関連し、また局所形質細胞によって分泌される別の自己抗体であるリウマチ因子に結合する固定化免疫複合体の結果として生じる形成は、炎症促進性事象のカスケードを引き起こす。
【0007】
これらの免疫マクロ複合体によるマクロファージ細胞の、本質的にそれらの膜Ｆｃ－ガンマ受容体を介した刺激は、マクロファージ細胞に炎症促進性サイトカイン、特にＴＮＦ－アルファを分泌させ、これはリウマチ性炎症に関与する主要なサイトカインとして同定されている。
【0008】
今日まで、関節リウマチの治癒的治療法はない。治療は、再発の発生を治療及び／又は予防することのみを目的とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】ＰＣＴ／ＦＲ００／０１８５７
【特許文献2】ＰＣＴ／ＦＲ２００７／０００７５８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
したがって、本発明の目的は、関節リウマチの治療を提供することである。
【0011】
ＡＣＰＡはオリゴクローナルであるため、少数のクローンＢリンパ球の分化から生じる少数のクローン形質細胞によってのみ分泌される。
【0012】
関節リウマチの場合、クローンＢリンパ球は、その膜上にＡＣＰＡ特異性を有する免疫グロブリンを発現し（これらはＡＣＰＡ陽性Ｂリンパ球である）、一方、ＡＣＰＡ陽性クローンＢリンパ球の分化から生じる形質細胞（これらはＡＣＰＡ陽性形質細胞である）は、これらのＡＣＰＡをそれらの微小環境中に豊富に分泌する。
【0013】
本発明は、（ｉ）少なくとも１つのシトルリル残基を有するフィブリン由来ペプチドと、（ｉｉ）ＣＤ３８及び／又はＣＤ１３８に結合する抗体又は抗体断片とを含むハイブリッド分子を使用して、微小環境において豊富にＡＣＰＡを分泌する形質細胞を標的化し、それらを排除することが可能であることを示す本発明者らの結果に基づく。これらのハイブリッド分子は、（当該形質細胞の表面上に発現される分子マーカーであるＣＤ３８及び／又はＣＤ１３８に結合する抗体又は抗体断片を使用して）形質細胞を標的とし、少なくとも１つのシトルリル残基を有するフィブリン由来ペプチドのおかげで、ハイブリッド分子は、ＡＣＰＡによって特異的に認識されるであろう（ペプチドは、これらのＡＣＰＡの標的である）。架橋（形質細胞に結合したハイブリッド分子自体へのＡＣＰＡの結合）後、形質細胞は、アポトーシスによって、マクロファージの存在下での食作用によって、ＮＫ細胞の存在下でのＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）によって、又は補体活性化によって溶解される。
【0014】
したがって、本発明のハイブリッド分子は、ＡＣＰＡを分泌する形質細胞を標的とすることによって、患者の身体及びこれらのＡＣＰＡの供給源からのＡＣＰＡの消失を引き起こして、疾患の寛解を誘導することを目的とする。
【0015】
形質細胞及びハイブリッドを使用して当該形質細胞によって放出される抗体の標的化は、例えば欧州特許第２８９２９２６号明細書に既に記載されている。しかし、関節リウマチに関する特定の構築物又は結果は開示されていない。
【課題を解決するための手段】
【0016】
本発明によるハイブリッド分子
第１の態様では、少なくとも１つのシトルリル残基を有する少なくとも１つのフィブリン由来ペプチドを含むハイブリッド分子に関し、当該ペプチドは、少なくとも１つの抗体又は少なくとも１つの抗体断片に共有結合しており、当該抗体又は断片は、ＣＤ３８及び／又はＣＤ１３８に結合することができ、１つ以上のスペーサーが、当該ペプチドと当該抗体又は当該断片との間に存在していてもよい。そのような構築物の図を図２に示す。
第１の態様では、少なくとも１つのシトルリル残基を有する少なくとも１つのフィブリン由来ペプチドを含むハイブリッド分子に関し、当該ペプチドは、少なくとも１つの抗体又は少なくとも１つの抗体断片に共有結合しており、当該抗体又は断片は、ＣＤ３８及び／又はＣＤ１３８に結合することができ、１つ以上のスペーサーが、当該ペプチドと当該抗体又は当該断片との間に存在していてもよい。そのような構築物の図を図２に示す。
【0017】
本発明によれば、「ハイブリッド分子」は、異なる性質の少なくとも２つの成分、この場合、当該ペプチド、並びにＣＤ３８及び／又はＣＤ１３８に結合することができる抗体又は抗体断片を有する分子を意味する。
【0018】
本発明によれば、「抗体」は免疫グロブリンを意味する。免疫グロブリンは、各々が重鎖及び軽鎖からなる２つの二量体の集合体からなる。重鎖及び軽鎖の各々は、定常領域及び可変領域からなる。より具体的には、各軽鎖は、可変領域（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ）からなる。各重鎖は、可変領域（ＶＨ）と、３つ又は４つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び場合によりＣＨ４からなる定常領域とからなる。抗体とは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥを意味する。好ましくは、抗体はＩｇＧ、より詳細にはＩｇＧ１である。本発明による抗体はまた、２つの異なる抗原に対して親和性を有する二重特異性抗体を意味する。本発明によるハイブリッド分子に使用される抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。
【0019】
本発明によれば、「抗体断片」は、抗原結合部位を有する抗体の一部を意味する。そのような抗体断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、単離されたＶＨ又はＶＬ断片などの単鎖断片、ラクダ科ＶＨＨ、軟骨魚類ＶＮＡＲ、又は更には異なる断片からなる多重特異性抗体、例えばタンデムの二重特異性抗体、又は「ナノボディ」、「ダイアボディ」、「トリアボディ」、「テトラボディ」、若しくはｓｃＦｖである。これらの断片は当業者に周知である。これらの断片及び構築物に関する更なる情報は、例えば、国際出願である国際公開第２０１７１３７５７９号、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９－５８８３、又はＮｅｌｓｏｎ，ｍＡｂｓ ２：１，７７－８３；Ｊａｎｕａｒｙ／Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１０に記載される。
【0020】
典型的には、「Ｆａｂ」は、ジスルフィド架橋によって連結された抗体の重鎖のＮ末端側の約半分及び軽鎖全体を含む抗体断片である。Ｆａｂは、特にプロテアーゼ、パパインでの処理によってＩｇＧから得ることができる。したがって、「Ｆ（ａｂ’）２」は、ジスルフィド架橋によって一緒に連結された、上で定義したような２つのＦａｂ断片を示す。Ｆ（ａｂ’）２は、特にプロテアーゼ、ペプシンでの処理によってＩｇＧから得ることができる。
【0021】
典型的には、「Ｆｖ」は、２つの非共有結合ＶＬ及びＶＨドメインに対応し、「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド架橋によって連結されたＶＨ及びＶＬの会合に対応する。
【0022】
典型的には、「ｓｃＦｖ」（一本鎖Ｆｖ）は、ＶＬドメイン及びＶＨドメインをコードする遺伝子と、これらのドメインを連結することを意図したペプチドをコードする配列とを使用して合成されたＶＨ：ＶＬポリペプチドである。ｓｃＦｖは互いに関連付けられ、例えば、ダイアボディ（２ ｓｃＦｖ）、トリアボディ（３ ｓｃＦｖ）又はテトラボディ（４ ｓｃＦｖ）を形成し得る。そのような構築物では、ｓｃＦｖは、一般に、１つ以上のペプチド結合によって一緒に連結される。そのような多量体構築物に関与する各ｓｃＦｖの抗原特異性は、同じであっても異なっていてもよい。
【0023】
好ましい実施形態によれば、当該ハイブリッド分子において、当該断片は、断片ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２、より詳細にはＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２から選択される。
【0024】
本発明によれば、「ＣＤ３８」及び「ＣＤ１３８」は、形質細胞の表面上に発現されるマーカーを指す。ＣＤ１３８は形質細胞に特異的である。ＣＤ３８は形質細胞に特異的ではないが、形質細胞はそれにもかかわらず、このマーカーを最も強く発現する細胞の１つである。ダラツムマブは、ＣＤ３８を標的とする治療用抗体の一例である。好ましくは、当該抗体又は当該断片はＣＤ３８に対するものである。
【0025】
別の実施形態によれば、当該ハイブリッド分子において、当該抗体又は当該断片は二重特異性であり、ＣＤ３８及び別の形質細胞標的又はＣＤ１３８及び別の形質細胞標的又はＣＤ３８及びＣＤ１３８に対するものである。より詳細には、一実施形態によれば、当該ハイブリッド分子において、当該抗体又はＦ（ａｂ’）２断片は、二重特異性抗体又はＦ（ａｂ’）２断片であり、
－ ＣＤ３８及び別の形質細胞標的、又は
－ ＣＤ１３８及び別の形質細胞標的、又は
－ ＣＤ３８及びＣＤ１３８
に対するものである。
－ ＣＤ３８及び別の形質細胞標的、又は
－ ＣＤ１３８及び別の形質細胞標的、又は
－ ＣＤ３８及びＣＤ１３８
に対するものである。
【0026】
本発明によれば、「別の形質細胞標的」は、形質細胞の表面に発現される任意のマーカーを意味する。
【0027】
本発明によれば、「共有結合した」という表現は、共有結合、すなわち２つの原子が２つの電子を共有する化学結合を意味する。当該共有結合は、極性又は非極性であり得る。
【0028】
本発明によれば、「スペーサー」は、当該抗体又は抗体断片を当該ペプチドから分離しながら（したがって、起こり得る立体障害を低減しながら）、少なくとも１つのシトルリル残基を有する当該フィブリン由来ペプチドへの当該抗体又は抗体断片の共有結合を可能にするカップリング剤である。スペーサーは、任意の分子、特にペプチドであり得る。好ましくは、スペーサーは、ハイブリッド分子の物理的及び化学的特性を改変しない。
【0029】
少なくとも１つのスペーサーの存在は有利である：それは、ハイブリッド分子の２つのパートナーの独立したアクセスを容易にし（当該ペプチドがＡＣＰＡ陽性Ｂ細胞に結合するためにより容易にアクセス可能であるのと同様に、抗体又は抗体断片は、形質細胞に結合するためにより容易にアクセス可能である）、及び／又はハイブリッド分子を安定化し、及び／又はハイブリッド分子の溶解度を増加させる。
【0030】
一実施形態によれば、本発明によるハイブリッド分子は、１つ以上のスペーサーを含み得る。好ましくは、ハイブリッド分子は、１つ又は２つのスペーサーを含む。一実施形態によれば、少なくとも１つのスペーサーが本発明の当該ハイブリッド分子中に存在する場合、当該抗体又は抗体断片はスペーサーに共有結合し、当該スペーサーはそれ自体が当該ペプチドに共有結合している。別の実施形態によれば、少なくとも２つのスペーサーが本発明の当該ハイブリッド分子中に存在する場合、当該抗体又は抗体断片は第１のスペーサーに共有結合し、当該第１のスペーサーはそれ自体が第２のスペーサーに共有結合し、第２のスペーサーはそれ自体が当該ペプチドに共有結合する。したがって、抗体又は抗体断片とペプチドとの間の結合は、スペーサーの存在下で直接的又は間接的でさえあり得る。
【0031】
一実施形態によれば、本発明によるハイブリッド分子は、少なくとも１つのシトルリル残基を有する少なくとも１つのフィブリン由来ペプチドを含み得る。これは、抗体又は抗体断片が１つ又は２つのペプチドに連結され得ることを意味する。これは、抗体又は抗体断片が２つのモノマーを含み、したがって、抗体又は抗体断片は、２つのモノマーのうちの１つのみのペプチドに共有結合することができ、又は抗体又は抗体断片は、各モノマーのペプチドに共有結合することができるからである（二重特異性抗体又は断片の場合、３つ又は４つであってもよい）。好ましくは、２つのペプチドが抗体又は抗体断片に結合している場合、２つのペプチドは同一であり、例えば、配列番号１８又は配列番号１９の２つのペプチドである。
【0032】
一実施形態によれば、当該スペーサーは、エーテル基を含有する１つ以上の繰り返し単位を含有するポリマーである。特定の一実施形態によれば、当該スペーサーは、式ＰＥＧｎ（式中、ｎは１～１００、好ましくは１～１０、特に１、２、３、４又は８の整数を表す）のポリエチレングリコールである。本発明によれば、当該ポリエチレングリコールは、例えばアミン基（ＰＥＧ－ＮＨ２などのＰＥＧｎ－アミン）で官能化することができる。本発明によれば、「１～１００の整数」は、１～１００の全ての整数値、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、及び１００を表す。
【0033】
本発明によれば、「少なくとも１つのシトルリル残基を有するフィブリン由来ペプチド」という表現は、少なくとも１つのアルギニル残基がシトルリル残基によって置換されたフィブリン又はフィブリノーゲンの分子を意味する。本発明による「少なくとも１つのシトルリル残基を有するフィブリン由来ペプチド」は、ＡＣＰＡによって認識されるペプチドを意味し、「シトルリン化ペプチド」と表すこともできる。そのようなペプチドは、天然、組換え又は合成のフィブリン又はフィブリノーゲンの断片から得ることができる。このようなペプチドは、直接合成によっても得ることができる。ペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ又はＤアミノ酸、好ましくはＬであり得る。当該置換は、例えば、ペプチジル－アルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）の作用下で酵素的脱イミン化工程によって行うことができる。そのようなペプチドは、１つ以上のシトルリル残基を合成ペプチドに直接組み込むことによっても得ることができる。本発明によるペプチドはＡＣＰＡに結合し、少なくとも１つのシトルリル残基を有する当該フィブリン由来ペプチドとＡＣＰＡとの間の結合は、ＥＬＩＳＡ試験を用いて、又はＳｅｂｂａｇ Ｍ，Ｍｏｉｎａｒｄ Ｎ，Ａｕｇｅｒ Ｉ，Ｃｌａｖｅｌ Ｃ，Ａｒｎａｕｄ Ｊ，Ｎｏｇｕｅｉｒａ Ｌ，Ｒｏｕｄｉｅｒ Ｊ，Ｓｅｒｒｅ Ｇ，Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３６：２２５０－２２６３，２００６による刊行物に記載されるように実証され得る。
【0034】
一実施形態によれば、本発明による当該ハイブリッド分子において、当該ペプチドは、少なくとも１つのアルギニル残基をシトルリル残基で置換することによって、脊椎動物のフィブリンのα鎖又はβ鎖の配列の全部又は一部に由来する。好ましくは、当該ペプチドは、脊椎動物のフィブリンのα鎖（特に、配列番号２７によって表される）又はβ（特に、配列番号２８によって表される）の少なくとも５個の連続したアミノ酸の配列に由来する。更により詳細には、当該脊椎動物のフィブリンは、哺乳動物、好ましくはヒトのフィブリンである。
【0035】
一実施形態によれば、本発明による当該ハイブリッド分子において、ペプチドは、少なくとも２個の連続するアミノ酸、３個の連続するアミノ酸、４個の連続するアミノ酸、好ましくは５個の連続するアミノ酸、更により好ましくは５～２５個のアミノ酸のサイズを有する。本発明によれば、「５～２５」は、全ての値：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４及び２５を意味する。好ましくは、当該ペプチドは、１０～２０アミノ酸、より詳細には１５アミノ酸のサイズを有する。
【0036】
一実施形態によれば、本発明による当該ハイブリッド分子において、当該ペプチドは好ましくは直鎖状である。
【0037】
一実施形態によれば、本発明による当該ハイブリッド分子において、ペプチドは、ＡＣＰＡに対するその反応性を改善するように修飾することができる。例として、ペプチドは環化することができ、ペプチドはレトロペプチド（Ｌアミノ酸は、再生されるペプチドの逆配列に従って連結される）又はレトロインベルソ（ｒｅｔｒｏ－ｉｎｖｅｒｓｏ）ペプチド（アミノ酸Ｄアミノ酸は、天然のＬアミノ酸の代わりに、再生されるペプチドの逆配列に従って連結される）であり得る。なお更なる特定の実施形態によれば、本発明による当該ハイブリッド分子において、当該ペプチドの末端カルボキシル官能基（ＣＯＯＨ）は、カルボキサミド官能基（ＣＯＮＨ２）によって置き換えられる。好ましくは、配列番号１２のペプチドでは、当該ペプチドの末端カルボキシル官能基（ＣＯＯＨ）がカルボキサミド官能基（ＣＯＮＨ２）によって置き換えられている。例として、β６０－７４Ｃｉｔペプチド（配列番号１９で表されるように）は、有利には、このようなカルボキサミド機能を有する。
【0038】
別の実施形態によれば、本発明による当該ハイブリッド分子において、ペプチドは、例えばアルキル化によって、その合成を容易にし、及び／又はその安定性を改善するように修飾することができる。更により特定の実施形態によれば、本発明による当該ハイブリッド分子において、当該ペプチドの末端アミン官能基（ＮＨ２）はアセチル化されている。好ましくは、配列番号１のペプチドにおいて、当該ペプチドの末端アミン官能基はアセチル化されている。例として、α６２１－６３５Ｃｉｔペプチド（配列番号１８に示すように）は、有利には、その末端アミン（ＮＨ２）にそのようなアセチル官能基を有する。
【0039】
一実施形態によれば、本発明による当該ハイブリッド分子において、ペプチドのアミン官能基及びカルボキシル官能基は、酸又は塩基に対応する塩の形態であり得る。
【0040】
一実施形態では、本発明による当該ハイブリッド分子において、当該ペプチドは、少なくとも１つのシトルリル残基を含み、
ａ）配列Ｘ１ＰＡＰＰＰＩＳＧＧＧＹＸ２ＡＸ３（配列番号１）で定義されるペプチドであって、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２又はＸ３残基の少なくとも１つがシトルリル残基である、ペプチド；
ｂ）配列ＧＰＸ１ＶＶＥＸ２ＨＱＳＡＣＫＤＳ（配列番号２）で定義されるペプチドであって、Ｘ１及びＸ２がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２残基の少なくとも一方がシトルリル残基である、ペプチド；
ｃ）配列ＳＧＩＧＴＬＤＧＦＸ１ＨＸ２ＨＰＤ（配列番号３）で定義されるペプチドであって、Ｘ１及びＸ２がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２残基の少なくとも一方がシトルリル残基である、ペプチド；
ｄ）配列ＶＤＩＤＩＫＩＸ１ＳＣＸ２ＧＳＣＳ（配列番号４）で定義されるペプチドであって、Ｘ１及びＸ２がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２残基の少なくとも一方がシトルリル残基である、ペプチド；
ｅ）配列Ｘ１ＧＨＡＫＳＸ２ＰＶＸ３ＧＩＨＴＳ（配列番号１２）で定義されるペプチドであって、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２又はＸ３残基の少なくとも１つがシトルリル残基である、ペプチド；
ｆ）上記ペプチドａ）～ｅ）の１つからの少なくとも１つのシトルリル残基を含む少なくとも５個の連続アミノ酸を含むペプチド
からなる群から選択される。
ａ）配列Ｘ１ＰＡＰＰＰＩＳＧＧＧＹＸ２ＡＸ３（配列番号１）で定義されるペプチドであって、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２又はＸ３残基の少なくとも１つがシトルリル残基である、ペプチド；
ｂ）配列ＧＰＸ１ＶＶＥＸ２ＨＱＳＡＣＫＤＳ（配列番号２）で定義されるペプチドであって、Ｘ１及びＸ２がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２残基の少なくとも一方がシトルリル残基である、ペプチド；
ｃ）配列ＳＧＩＧＴＬＤＧＦＸ１ＨＸ２ＨＰＤ（配列番号３）で定義されるペプチドであって、Ｘ１及びＸ２がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２残基の少なくとも一方がシトルリル残基である、ペプチド；
ｄ）配列ＶＤＩＤＩＫＩＸ１ＳＣＸ２ＧＳＣＳ（配列番号４）で定義されるペプチドであって、Ｘ１及びＸ２がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２残基の少なくとも一方がシトルリル残基である、ペプチド；
ｅ）配列Ｘ１ＧＨＡＫＳＸ２ＰＶＸ３ＧＩＨＴＳ（配列番号１２）で定義されるペプチドであって、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３がそれぞれシトルリル残基又はアルギニル残基を表し、Ｘ１又はＸ２又はＸ３残基の少なくとも１つがシトルリル残基である、ペプチド；
ｆ）上記ペプチドａ）～ｅ）の１つからの少なくとも１つのシトルリル残基を含む少なくとも５個の連続アミノ酸を含むペプチド
からなる群から選択される。
【0041】
１つの特定の実施形態によれば、当該ペプチドは、少なくとも１つのシトルリル残基を含み、
－ 配列番号１の配列によって定義されるペプチドであって、Ｘ１又はＸ２又はＸ３から選択される少なくとも１つの残基がシトルリル残基である、ペプチド、あるいは当該シトルリル残基（複数可）を含む当該配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸の断片を含むペプチド；
－ 少なくともＸ１又はＸ２がシトルリル残基である配列番号２によって定義されるペプチド、又は当該シトルリル残基（複数可）を含有する当該配列の少なくとも５個の連続アミノ酸の断片を含むペプチド；
－ 少なくともＸ１又はＸ２がシトルリル残基である配列番号３によって定義されるペプチド、又は当該シトルリル残基（複数可）を含有する当該配列の少なくとも５個の連続アミノ酸の断片を含むペプチド；
－ 少なくともＸ１又はＸ２がシトルリル残基である配列番号４によって定義されるペプチド、又は当該シトルリル残基（複数可）を含有する当該配列の少なくとも５個の連続アミノ酸の断片を含むペプチド；
－ 少なくともＸ１又はＸ２又はＸ３がシトルリル残基である配列番号１２によって定義されるペプチド、又は当該シトルリル残基（複数可）を含有する当該配列の少なくとも５個の連続アミノ酸の断片を含むペプチド
からなる群から選択される。
－ 配列番号１の配列によって定義されるペプチドであって、Ｘ１又はＸ２又はＸ３から選択される少なくとも１つの残基がシトルリル残基である、ペプチド、あるいは当該シトルリル残基（複数可）を含む当該配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸の断片を含むペプチド；
－ 少なくともＸ１又はＸ２がシトルリル残基である配列番号２によって定義されるペプチド、又は当該シトルリル残基（複数可）を含有する当該配列の少なくとも５個の連続アミノ酸の断片を含むペプチド；
－ 少なくともＸ１又はＸ２がシトルリル残基である配列番号３によって定義されるペプチド、又は当該シトルリル残基（複数可）を含有する当該配列の少なくとも５個の連続アミノ酸の断片を含むペプチド；
－ 少なくともＸ１又はＸ２がシトルリル残基である配列番号４によって定義されるペプチド、又は当該シトルリル残基（複数可）を含有する当該配列の少なくとも５個の連続アミノ酸の断片を含むペプチド；
－ 少なくともＸ１又はＸ２又はＸ３がシトルリル残基である配列番号１２によって定義されるペプチド、又は当該シトルリル残基（複数可）を含有する当該配列の少なくとも５個の連続アミノ酸の断片を含むペプチド
からなる群から選択される。
【0042】
なお更なる特定の実施形態では、本発明による当該ハイブリッド分子において、当該ペプチドは、少なくとも１つのシトルリル残基を含み、
－ Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３がシトルリル残基である、配列番号１によって定義されるペプチド、又は当該配列（配列番号１９のペプチド）を含む少なくとも１５アミノ酸のペプチド；
－ Ｘ１及びＸ２がシトルリル残基である配列番号２によって定義されるペプチド、又は当該シトルリル残基を含有する当該配列の少なくとも５個の連続アミノ酸の断片を含むペプチド（これは配列番号５のペプチドである）；
－ Ｘ１及びＸ２がシトルリル残基である配列番号３によって定義されるペプチド、又は当該シトルリル残基を含有する当該配列の少なくとも５個の連続アミノ酸の断片を含むペプチド（これは配列番号１４のペプチドである）；
－ Ｘ１及びＸ２がシトルリル残基である配列番号４によって定義されるペプチド、又は当該シトルリル残基を含有する当該配列の少なくとも５個の連続アミノ酸の断片を含むペプチド（これは配列番号６のペプチドである）；
－ Ｘ１及びＸ２及びＸ３がシトルリル残基である配列番号１２によって定義されるペプチド、又は当該シトルリル残基を含有する当該配列の少なくとも１０個の連続アミノ酸の断片を含むペプチド（これは配列番号１８のペプチドである）
からなる群から選択される。
－ Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３がシトルリル残基である、配列番号１によって定義されるペプチド、又は当該配列（配列番号１９のペプチド）を含む少なくとも１５アミノ酸のペプチド；
－ Ｘ１及びＸ２がシトルリル残基である配列番号２によって定義されるペプチド、又は当該シトルリル残基を含有する当該配列の少なくとも５個の連続アミノ酸の断片を含むペプチド（これは配列番号５のペプチドである）；
－ Ｘ１及びＸ２がシトルリル残基である配列番号３によって定義されるペプチド、又は当該シトルリル残基を含有する当該配列の少なくとも５個の連続アミノ酸の断片を含むペプチド（これは配列番号１４のペプチドである）；
－ Ｘ１及びＸ２がシトルリル残基である配列番号４によって定義されるペプチド、又は当該シトルリル残基を含有する当該配列の少なくとも５個の連続アミノ酸の断片を含むペプチド（これは配列番号６のペプチドである）；
－ Ｘ１及びＸ２及びＸ３がシトルリル残基である配列番号１２によって定義されるペプチド、又は当該シトルリル残基を含有する当該配列の少なくとも１０個の連続アミノ酸の断片を含むペプチド（これは配列番号１８のペプチドである）
からなる群から選択される。
【0043】
なお更なる特定の実施形態によれば、本発明による当該ハイブリッド分子において、当該ペプチドは、配列番号５（α３６－５０ｃｉｔ３８，４２）、配列番号６（α１７１－１８５ｃｉｔ１７８，１８１）、配列番号７（α１８３－１９７ｃｉｔ１８６，１９０）、配列番号８（α２４６－２６０ｃｉｔ２５８）、配列番号９（α２５９－２７３ｃｉｔ２６３，２７１）、配列番号１０（α３６６－３８０ｃｉｔ３６７）、配列番号１１（α３９６－４１０ｃｉｔ４０４）、配列番号１３（α４１１－４２５ｃｉｔ４２５）、配列番号１４（α５０１－５１５ｃｉｔ５１０，５１２）、配列番号１５（α５４６－５６０ｃｉｔ５４７）、配列番号１６（α５６１－５７５ｃｉｔ５７３）、配列番号１７（α５８８－６０２ｃｉｔ５９１）、配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）、配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）、配列番号２０（β２１０－２２４ｃｉｔ２２４）、配列番号２１（β２８１－２９５ｃｉｔ２８５，２９４）、配列番号２２（β４２０－４３４ｃｉｔ４２１）及び配列番号２３（β４３３－４４７ｃｉｔ４３６，４４５）からなる群から選択され、より詳細には、配列番号５（α３６－５０ｃｉｔ３８，４２）、配列番号６（α１７１－１８５ｃｉｔ１７８，１８１）、配列番号１４（α５０１－５１５ｃｉｔ５１０，５１２）、配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）及び配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）からなる群から選択され、更により詳細には、配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）及び配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）から選択される。
【0044】
抗体又は抗体断片及びペプチドは、それぞれＮ末端及びＣ末端を有する。したがって、抗体又は抗体断片は、そのＮ末端又はＣ末端を介してペプチドのＮ末端又はＣ末端に結合することができる。別の好ましい実施形態によれば、本発明による当該ハイブリッド分子において、当該共有結合は、当該ペプチドのＮ末端と当該抗体若しくは抗体断片のＮ末端との間、又は当該ペプチドのＮ末端と当該抗体若しくは抗体断片のＣ末端との間に位置する。１つの実施形態によれば、スペーサーが存在するとき、スペーサーは、そのＮ末端又はＣ末端を介して抗体又は抗体断片に結合され得る。別の実施形態によれば、２つのスペーサーが存在する場合、第１のスペーサーは、そのＮ末端又はＣ末端を介して抗体又は抗体断片に結合することができ、第２のスペーサーは、そのＮ末端又はＣ末端、特にＮ末端を介してペプチドに結合することができる。あるいは、当該抗体又は抗体断片と当該ペプチドとの間の当該共有結合は（場合により１つ以上のスペーサーの存在下で）、後者が形質細胞に結合するその能力を保持する限り、抗体又は抗体断片の全部又は一部に作り出すことができる。本発明によれば、「抗体又は断片の全部又は一部」は、抗体又は断片を構成する異なるアミノ酸が当該ペプチドとの共有結合に関与し得ることを意味する。
【0045】
好ましい実施形態によれば、少なくとも１つのスペーサーが本発明による当該ハイブリッド分子中に存在する場合、当該スペーサーは、それ自体が当該ペプチドとの共有結合に関与するアジド又はアルキンへの抗体又は断片の結合を可能にする。一実施形態によれば、少なくとも１つのスペーサーが本発明による当該ハイブリッド分子中に存在する場合、当該スペーサーは、それ自体が抗体又は断片との共有結合に関与するアルキン又はアジドへのペプチドの結合を可能にする。更により好ましい実施形態によれば、本発明によるハイブリッド分子は、少なくとも２つのスペーサー：抗体又は断片のアジド又はアルキンへの結合を可能にする第１のスペーサー及びペプチドのアジド（抗体又は断片がアルキンに結合している場合）又はアルキン（Ｆｃ断片がアジドに結合している場合）への結合を可能にする第２のスペーサーを含む。
【0046】
本発明による一実施形態によれば、本発明による当該ハイブリッド分子において、当該抗体又は当該断片は、
－ シクロオクチンなどのアジド又はアルキン、特にＤＢＣＯにカップリングされている、又は
－ それ自体がアジド又はアルキン、例えばシクロオクチン、特にＤＢＣＯにカップリングしているスペーサーに結合しており、当該ペプチドは、
－ アジド又はアルキン、例えばシクロオクチン、特にＤＢＣＯとカップリングされているか、
－ 又はそれ自体がアジド若しくはアルキン、例えばシクロオクチン、特にＤＢＣＯにカップリングされたスペーサーに結合されるかのいずれかであり、
当該断片と当該ペプチドとの間の共有結合は、場合により１つ以上のスペーサーの存在下で、アジドとアルキンとの間に作り出される。
－ シクロオクチンなどのアジド又はアルキン、特にＤＢＣＯにカップリングされている、又は
－ それ自体がアジド又はアルキン、例えばシクロオクチン、特にＤＢＣＯにカップリングしているスペーサーに結合しており、当該ペプチドは、
－ アジド又はアルキン、例えばシクロオクチン、特にＤＢＣＯとカップリングされているか、
－ 又はそれ自体がアジド若しくはアルキン、例えばシクロオクチン、特にＤＢＣＯにカップリングされたスペーサーに結合されるかのいずれかであり、
当該断片と当該ペプチドとの間の共有結合は、場合により１つ以上のスペーサーの存在下で、アジドとアルキンとの間に作り出される。
【0047】
本発明による一実施形態によれば、本発明による当該ハイブリッド分子において、
－ 当該抗体又は当該断片が少なくとも１つのアジドにカップリングされ、当該ペプチドがシクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにカップリングされるか、又は
－ 当該抗体又は当該断片が、少なくとも１つのアルキン、例えばシクロオクチン、特にＤＢＣＯにカップリングされ、当該ペプチドがアジドにカップリングされ、
当該抗体又は当該断片と当該ペプチドとの間の共有結合が、アジドとアルキンとの間に作り出される。
－ 当該抗体又は当該断片が少なくとも１つのアジドにカップリングされ、当該ペプチドがシクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにカップリングされるか、又は
－ 当該抗体又は当該断片が、少なくとも１つのアルキン、例えばシクロオクチン、特にＤＢＣＯにカップリングされ、当該ペプチドがアジドにカップリングされ、
当該抗体又は当該断片と当該ペプチドとの間の共有結合が、アジドとアルキンとの間に作り出される。
【0048】
本発明による一実施形態によれば、本発明による当該ハイブリッド分子において、
－ 当該抗体又は当該断片がスペーサーに結合し、それ自体がアジドにカップリングしており、当該ペプチドがシクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにカップリングしているか、又は
－ 当該抗体又は当該断片は、それ自体がシクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにカップリングされたスペーサーに結合され、当該ペプチドはアジドにカップリングされ、
当該抗体又は当該断片と当該ペプチドとの間の共有結合は、スペーサーの存在下でアジドとアルキンとの間に作り出される。
－ 当該抗体又は当該断片がスペーサーに結合し、それ自体がアジドにカップリングしており、当該ペプチドがシクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにカップリングしているか、又は
－ 当該抗体又は当該断片は、それ自体がシクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにカップリングされたスペーサーに結合され、当該ペプチドはアジドにカップリングされ、
当該抗体又は当該断片と当該ペプチドとの間の共有結合は、スペーサーの存在下でアジドとアルキンとの間に作り出される。
【0049】
本発明による一実施形態によれば、本発明による当該ハイブリッド分子において、
－ 当該抗体又は当該断片は、それ自体がアジドにカップリングされたスペーサーに結合され、当該ペプチドはまた、それ自体がシクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにカップリングされた第２のスペーサーに結合され、又は
－ 当該抗体又は当該断片は、それ自体がシクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにカップリングしたスペーサーに結合しており、当該ペプチドは、それ自体がアジドにカップリングした第２のスペーサーにも結合しており、
当該抗体又は当該断片と当該ペプチドとの間の共有結合は、１つ以上のスペーサーの存在下でアジドとアルキンとの間に作り出される。
－ 当該抗体又は当該断片は、それ自体がアジドにカップリングされたスペーサーに結合され、当該ペプチドはまた、それ自体がシクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにカップリングされた第２のスペーサーに結合され、又は
－ 当該抗体又は当該断片は、それ自体がシクロオクチンなどのアルキン、特にＤＢＣＯにカップリングしたスペーサーに結合しており、当該ペプチドは、それ自体がアジドにカップリングした第２のスペーサーにも結合しており、
当該抗体又は当該断片と当該ペプチドとの間の共有結合は、１つ以上のスペーサーの存在下でアジドとアルキンとの間に作り出される。
【0050】
一実施形態によれば、上記の分子、より詳細には９頁１５行～１０頁１２行（原文）において、使用されるスペーサーは好ましくはＰＥＧｎスペーサーであり、ｎは好ましくは１～１０の整数を表す。本発明によるハイブリッド分子が少なくとも２つのＰＥＧｎスペーサーを含む場合、２つのスペーサーのｎの値は同一であっても異なっていてもよい。例えば、第１のスペーサーはＰＥＧ２とすることができ、第２のスペーサーはＰＥＧ３又はＰＥＧ４とすることができる。
【0051】
特に好ましい一実施形態によれば、上記の分子、より詳細には９頁１５行～１０頁１２行（原文）において、ペプチドはヒトフィブリン又はフィブリノーゲンに由来し、抗体又は抗体断片はヒトである。
【0052】
本発明による一実施形態によれば、本発明による当該ハイブリッド分子は、
－ 配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）若しくは配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにカップリングしたシクロオクチンに共有結合したアジドに、それ自体カップリングした、ＰＥＧｎスペーサー、好ましくはＰＥＧ３に結合したＣＤ３８に結合することができる抗体断片、又は
－ 配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）によって表されるペプチドに結合した、ＰＥＧｎスペーサー、好ましくはＰＥＧ３にカップリングしたシクロオクチンに共有結合したアジドに、それ自体カップリングした、ＰＥＧｎスペーサー、好ましくはＰＥＧ３に結合したＣＤ３８に結合することができる抗体断片
によって表され、ｎは、好ましくは１～１０、より詳細には１、２、３、４又は８の整数を表し、好ましくはＦａｂ断片である。
－ 配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）若しくは配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにカップリングしたシクロオクチンに共有結合したアジドに、それ自体カップリングした、ＰＥＧｎスペーサー、好ましくはＰＥＧ３に結合したＣＤ３８に結合することができる抗体断片、又は
－ 配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）又は配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）によって表されるペプチドに結合した、ＰＥＧｎスペーサー、好ましくはＰＥＧ３にカップリングしたシクロオクチンに共有結合したアジドに、それ自体カップリングした、ＰＥＧｎスペーサー、好ましくはＰＥＧ３に結合したＣＤ３８に結合することができる抗体断片
によって表され、ｎは、好ましくは１～１０、より詳細には１、２、３、４又は８の整数を表し、好ましくはＦａｂ断片である。
【0053】
本発明による更により特定の実施形態によれば、本発明による当該ハイブリッド分子は、
－ 配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）で表されるペプチドにカップリングしたシクロオクチンに共有結合したアジドに、それ自体カップリングした、ＰＥＧｎスペーサー、好ましくはＰＥＧ３に結合したＣＤ３８に結合することができる抗体断片、又は
－ 配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）で表されるペプチドにカップリングした、ＰＥＧｎスペーサー、好ましくはＰＥＧ３にカップリングしたシクロオクチンに共有結合したアジドに、それ自体カップリングした、ＰＥＧｎスペーサー、好ましくはＰＥＧ３に結合したＣＤ３８に結合することができる抗体断片、又は
－ 配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにカップリングした、ＰＥＧｎスペーサー、好ましくはＰＥＧ３にカップリングしたシクロオクチンに共有結合したアジドに、それ自体カップリングした、ＰＥＧｎスペーサー、好ましくはＰＥＧ３に結合したＣＤ３８に結合することができる抗体断片
によって表され、
ｎは、好ましくは１～１０、より詳細には１、２、３、４又は８の整数を表し、当該断片は、好ましくはＦａｂ断片である。
－ 配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）で表されるペプチドにカップリングしたシクロオクチンに共有結合したアジドに、それ自体カップリングした、ＰＥＧｎスペーサー、好ましくはＰＥＧ３に結合したＣＤ３８に結合することができる抗体断片、又は
－ 配列番号１９（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）で表されるペプチドにカップリングした、ＰＥＧｎスペーサー、好ましくはＰＥＧ３にカップリングしたシクロオクチンに共有結合したアジドに、それ自体カップリングした、ＰＥＧｎスペーサー、好ましくはＰＥＧ３に結合したＣＤ３８に結合することができる抗体断片、又は
－ 配列番号１８（α６２１－６３５ｃｉｔ６２１，６２７，６３０）で表されるペプチドにカップリングした、ＰＥＧｎスペーサー、好ましくはＰＥＧ３にカップリングしたシクロオクチンに共有結合したアジドに、それ自体カップリングした、ＰＥＧｎスペーサー、好ましくはＰＥＧ３に結合したＣＤ３８に結合することができる抗体断片
によって表され、
ｎは、好ましくは１～１０、より詳細には１、２、３、４又は８の整数を表し、当該断片は、好ましくはＦａｂ断片である。
【0054】
本発明によれば、アジドとアルキンとの間の共有結合の形成は、「クリック化学」工程として知られているものに対応し、アジドのＮ３部分はアルキンと反応する。アジドは、ヒドラゾ酸ＨＮ３の塩、又は窒素原子の１つが有機化合物の炭素原子と共有結合している有機アジド（例えば、メチルアジドＣＨ３Ｎ３）を意味する。好ましくは、アジドは式Ｎ３で表される。アルキンは、少なくとも１つの三重結合の存在を特徴とする、一般式ＣｎＨ２ｎ－２を有する分子を意味する。アルキンは、好ましくはシクロオクチンであり、更により好ましくはジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）である。
【0055】
抗体又は断片、当該ペプチド及び場合により当該スペーサーは、任意の従来使用されている分子カップリング技術（コンジュゲーションなど）によってアルキン又はアジドにカップリングされる。抗体又は断片をスペーサーに、及び／又はペプチドをスペーサーに共有結合させるために、任意の技術を使用してもよい。
【0056】
より詳細には、コンジュゲーション技術は、酵素的コンジュゲーション又は化学的コンジュゲーションを意味する。酵素的コンジュゲーションは、例えば、遊離アミン基とグルタミン又はリジン残基との間の共有結合の形成を触媒するトランスグルタミナーゼを使用するコンジュゲーション、又は更にはソルターゼなどのトランスペプチダーゼを使用するコンジュゲーションを意味する。酵素コンジュゲーションに関する更なる情報については、例えば、特許出願米国特許第２０１６０３６１４３４号若しくは米国特許第２０１７０３１３７８７号、又はＯｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌｕｍｅ ６４，２０００－Ｉｓｓｕｅ １２，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｃｙｌ ｄｏｎｏｒｓによる刊行物を参照されたい。トランスグルタミナーゼ基質は、例えば、配列番号２９（ＬＬＱＧ）で表されるグルタミル残基（Ｑタグ）を含むペプチドである。抗体又は断片はＱタグを担持し得る。化学的コンジュゲーションは、例えば、ジスルフィド架橋の還元後に単離されるか又はジスルフィド架橋に関与するシステインと、例えばマレイミドとの間の共有結合を意味する。
【0057】
本発明によれば、「カップリングされた」又は「分子カップリング」という用語は、共有結合の確立を意味し、したがって抗体又は断片及び／又はペプチド及び／又はスペーサーは、アルキン又はアジドに共有結合している。「結合した」という用語はまた、共有結合を意味する。したがって、例として、表現「当該抗体又は当該断片は、アジドにカップリングされたスペーサーに結合され、当該ペプチドはまた、シクロオクチンなどのアルキンにカップリングされた第２のスペーサーにも結合される」は、「当該抗体又は当該断片は、アジドに共有結合されたスペーサーに共有結合され、当該ペプチドはまた、シクロオクチンなどのアルキンに共有結合された第２のスペーサーにも共有結合される」と読み取ることもできる。
【0058】
本発明によるハイブリッド分子の使用
第２の態様では、本発明はまた、医薬品として使用するための上で定義されたハイブリッド分子に関する。
第２の態様では、本発明はまた、医薬品として使用するための上で定義されたハイブリッド分子に関する。
【0059】
より詳細には、本発明によれば、当該ハイブリッド分子は、アポトーシスによって、食作用によって、ＡＤＣＣによって、又は補体活性化によって、患者の体内のＡＣＰＡ分泌形質細胞を標的とし、溶解することを意図している。これは、ＣＤ３８及び／又はＣＤ１３８に結合する抗体又は断片のおかげで形質細胞に結合する本発明によるハイブリッド分子に起因する。本発明によるハイブリッド分子はまた、シトルリル残基を有するフィブリン由来ペプチドのおかげでＡＣＰＡに結合し、フィブリン由来ペプチドは当該ＡＣＰＡの標的である。ＡＣＰＡは、形質細胞の表面に結合した本発明によるハイブリッド分子の架橋を可能にし、したがってそれらのアポトーシスを誘導する。ＡＣＰＡは、任意の抗体と同様に、それらの標的抗原に結合した後に活性化されるエフェクター機能を有し、したがって食作用及び／又はＡＤＣＣ及び／又は補体活性化による形質細胞の破壊に関与する。
【0060】
１つの特定の実施形態によれば、本発明は、シトルリン化タンパク質に対する自己抗体の産生に伴う自己免疫疾患、特に、ゴーゲロット・シェーグレン症候群及び関節リウマチの治療におけるその使用のための上記で定義されるようなハイブリッド分子に関する。この実施形態では、抗シトルリン化タンパク質自己抗体の産生に関連する当該自己免疫疾患の重篤な形態、並びに乾癬性関節炎又は全身性エリテマトーデスなどの他の慢性関節炎に「接する」形態が標的化される。
【0061】
一実施形態によれば、本発明はまた、薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせて、先行する請求項のいずれか一項に記載のハイブリッド分子を含む医薬組成物に関する。
【0062】
本発明によれば、「薬学的に許容されるビヒクル」は、組成物を任意のガレノス形態で患者に投与するのに適したものにする任意の製剤を意味する。
【0063】
上記のように、本発明は、ＡＣＰＡ分泌形質細胞を標的とすることを目的とする。しかし、形質細胞の前駆体であるＡＣＰＡ陽性Ｂリンパ球は、それらの分化前に、本発明による当該ハイブリッド分子によって標的化されないか、又はわずかしか標的化されない。したがって、１つの特定の実施形態によれば、本発明は、第２のハイブリッド分子と組み合わせた医薬品としてのその使用について前述したようなハイブリッド分子に関し、当該第２のハイブリッド分子は、少なくとも１つのシトルリル残基を有する少なくとも１つのフィブリン由来ペプチドに共有結合した少なくとも１つの抗体Ｆｃ断片を含み、スペーサーは、当該Ｆｃ断片と当該ペプチドとの間に存在していてもよい。そのような併用療法は、その前駆体であるＡＣＰＡ分泌クローン形質細胞及びＡＣＰＡ陽性Ｂリンパ球を特異的に標的化及び破壊することを可能にし、したがって、患者の身体からのＡＣＰＡの消失を引き起こし、それらの再出現を防止する。
【0064】
１つの特定の実施形態によれば、本発明による当該第２のハイブリッド分子において、当該Ｆｃ断片は、ヒトＦｃ断片、特にＩｇＧ、より詳細にはＩｇＧ１のヒトＦｃ断片である。ＩｇＧ１は、そのアロタイプのいずれか、例えばＧ１ｍ３又はｎＧ１ｍ１に対応し得る。一例として、ＩｇＧ１のＦｃ断片は、配列番号２４、配列番号２５（Ｆｃ＋Ｑ－ｔａｇ）又は配列番号２６（Ｆｃ＋Ｑ－ｔａｇ ｂｉｓ）によって表される。
【0065】
一実施形態によれば、本発明による当該第２のハイブリッド分子において、当該Ｆｃ断片は野生型又は変異型である。突然変異（複数可）は、血漿半減期を増加若しくは減少させること、又はＦｃ断片のエフェクター機能を改変することなどを目的とし得る。
【0066】
なお更なる特定の実施形態によれば、当該変異型Ｆｃ断片は、少なくとも以下の変異を含む：
－ Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）、又は
－ Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）、又は
－ Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ（ＧＡＳＤＩＥ）、又は
－ Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ及びＩ３３２Ｅ（ＧＡＳＤＡＬＩＥ）、又は
－ Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ（ＳＤＨＦＳＴＩＥ又はＳＤＨ）、
ナンバリングは、ＥＵインデックスに従ってヒトＩｇＧ１の配列で示される。そのような突然変異は、Ｂｒｕｈｎｓ ａｎｄ Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１５ Ｎｏｖ；２６８（１）：２５－５１による論文に記載されている。好ましくは、ハイブリッド分子が治療に使用される場合、当該変異型Ｆｃ断片は、少なくともＧＡＳＤＩＥ、ＧＡＳＤＡＬＩＥ又はＳＤＨ変異を含む。
－ Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）、又は
－ Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）、又は
－ Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ（ＧＡＳＤＩＥ）、又は
－ Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ及びＩ３３２Ｅ（ＧＡＳＤＡＬＩＥ）、又は
－ Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ及びＩ３３２Ｅ（ＳＤＨＦＳＴＩＥ又はＳＤＨ）、
ナンバリングは、ＥＵインデックスに従ってヒトＩｇＧ１の配列で示される。そのような突然変異は、Ｂｒｕｈｎｓ ａｎｄ Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１５ Ｎｏｖ；２６８（１）：２５－５１による論文に記載されている。好ましくは、ハイブリッド分子が治療に使用される場合、当該変異型Ｆｃ断片は、少なくともＧＡＳＤＩＥ、ＧＡＳＤＡＬＩＥ又はＳＤＨ変異を含む。
【0067】
１つの特定の実施形態によれば、本発明による当該第２のハイブリッド分子において、当該Ｆｃ断片は、グリコシル化形態の０％～１００％のフコシル化率を有する。本発明によれば、「０％～１００％」は、０～１００の全ての整数値、すなわち０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、及び１００％を表す。Ｆｃ断片の弱いフコシル化は、強いＡＤＣＣ応答を引き起こす。これが、１つの特定の実施形態によれば、当該Ｆｃ断片が、０％～６０％、特に５０％、４０％、３０％、２０％、１０％又は０％のグリコシル化形態のフコシル化率を有する理由である。本発明によれば、フコシル化率は、Ｆｃ断片が運ぶことができるフコースの最大量に対する、Ｆｃ断片によって運ばれるフコースの平均割合として定義される。
【0068】
本発明のこの特定の実施形態によれば、第１及び第２のハイブリッド分子は、同時に、別々に、又は経時的に徐々に投与される。
【0069】
別の実施形態によれば、本発明によるハイブリッド分子は、少なくとも１つの放射性同位体又はＡ４８８若しくはＡ６４７などの少なくとも１つの蛍光色素にカップリングすることができる。そのような分子は、分子トレーサツールとして有利に使用することができる。
【0070】
したがって、別の実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つのシトルリル残基を有する少なくとも１つのフィブリン由来ペプチドを含むハイブリッド分子の分子ツールとしてのインビトロ又はエクスビボでの使用に関し、当該ペプチドは、少なくとも１つの抗体又は少なくとも１つの抗体断片に共有結合しており、当該抗体又は断片は、ＣＤ３８及び／又はＣＤ１３８に結合することができ、１つ以上のスペーサーが、当該ペプチドと当該抗体又は当該断片との間に存在していてもよい。そのような構築物は、特に、ハイブリッド分子のＡＣＰＡ及び形質細胞への結合を分析するため、並びに形質細胞の、ハイブリッドの結合とそれに続くＡＣＰＡへの架橋などに対する反応性を分析するために使用することができる。放射性同位元素及び／又は蛍光色素は、好ましくは抗体断片にカップリングされる。
【0071】
本発明によるハイブリッド分子の製造方法
別の態様では、本発明はまた、先に定義されたハイブリッド分子で移植された免疫細胞を得ることを可能にする方法に関する。
別の態様では、本発明はまた、先に定義されたハイブリッド分子で移植された免疫細胞を得ることを可能にする方法に関する。
【0072】
したがって、一実施形態によれば、本発明は、上で定義されたハイブリッド分子を製造するための方法に関し、以下の工程を含む。
－ （ｉ）ＣＤ３８及び／又はＣＤ１３８に結合することができる抗体、又は断片にカップリングされたアジドを得る工程、あるいはＣＤ３８及び／又はＣＤ１３８に結合することができる抗体又は断片にカップリングされたアルキンを得る工程、
－ （ｉｉ）ペプチドにカップリングされたアルキンを得る工程、又はペプチドにカップリングされたアジドを得る工程、
－ （ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で生成された生成物を混合する工程であって、共有結合がアジドとアルキンとの間に特異的に確立される工程、
工程（ｉ）を工程（ｉｉ）の前若しくは後に、又はそうでなければ同時に行うことが可能である。
－ （ｉ）ＣＤ３８及び／又はＣＤ１３８に結合することができる抗体、又は断片にカップリングされたアジドを得る工程、あるいはＣＤ３８及び／又はＣＤ１３８に結合することができる抗体又は断片にカップリングされたアルキンを得る工程、
－ （ｉｉ）ペプチドにカップリングされたアルキンを得る工程、又はペプチドにカップリングされたアジドを得る工程、
－ （ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で生成された生成物を混合する工程であって、共有結合がアジドとアルキンとの間に特異的に確立される工程、
工程（ｉ）を工程（ｉｉ）の前若しくは後に、又はそうでなければ同時に行うことが可能である。
【0073】
したがって、一実施形態によれば、本発明は、上で定義されたハイブリッド分子を製造するための方法に関し、以下の工程を含む。
－ （ｉ）場合によりスペーサーの存在下で、アジドを、ＣＤ３８及び／又はＣＤ１３８に結合することができる抗体又は断片にカップリングする工程、
－ （ｉｉ）場合によりスペーサーの存在下で、アルキンをペプチドにカップリングさせる工程、
－ （ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で生成された生成物を混合する工程であって、共有結合がアジドとアルキンとの間に特異的に確立される工程。
工程（ｉ）を工程（ｉｉ）の前若しくは後に、又はそうでなければ同時に行うことが可能である。
－ （ｉ）場合によりスペーサーの存在下で、アジドを、ＣＤ３８及び／又はＣＤ１３８に結合することができる抗体又は断片にカップリングする工程、
－ （ｉｉ）場合によりスペーサーの存在下で、アルキンをペプチドにカップリングさせる工程、
－ （ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で生成された生成物を混合する工程であって、共有結合がアジドとアルキンとの間に特異的に確立される工程。
工程（ｉ）を工程（ｉｉ）の前若しくは後に、又はそうでなければ同時に行うことが可能である。
【0074】
別の実施形態によれば、本発明はまた、上で定義されるようなハイブリッド分子を製造するための方法に関し、以下の工程を含む。
－ （ｉ）場合によりスペーサーの存在下で、アルキンを、ＣＤ３８及び／又はＣＤ１３８に結合することができる抗体又は断片にカップリングする工程、
－ （ｉｉ）場合によりスペーサーの存在下で、アジドをペプチドにカップリングさせる工程、
－ （ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で生成された生成物を混合する工程であって、共有結合がアジドとアルキンとの間に特異的に確立され、工程（ｉ）を工程（ｉｉ）の前若しくは後に、又はそうでなければ同時に行うことが可能である、工程。
－ （ｉ）場合によりスペーサーの存在下で、アルキンを、ＣＤ３８及び／又はＣＤ１３８に結合することができる抗体又は断片にカップリングする工程、
－ （ｉｉ）場合によりスペーサーの存在下で、アジドをペプチドにカップリングさせる工程、
－ （ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で生成された生成物を混合する工程であって、共有結合がアジドとアルキンとの間に特異的に確立され、工程（ｉ）を工程（ｉｉ）の前若しくは後に、又はそうでなければ同時に行うことが可能である、工程。
【0075】
別の実施形態によれば、本発明はまた、上で定義されるようなハイブリッド分子を製造するための方法に関し、以下の工程を含む。
－ （ｉ）場合によりスペーサーの存在下で、少なくとも１つのアルキン又はアジドを、ＣＤ３８及び／又はＣＤ１３８に結合することができる抗体又は断片の各モノマーにカップリングさせる工程、
－ （ｉｉ）場合によりスペーサーの存在下で、少なくとも１つのアジド又はアルキンをペプチドにカップリングする工程、
－ （ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で生成された生成物を混合する工程であって、共有結合がアジドとアルキンとの間に特異的に確立され、工程（ｉ）を工程（ｉｉ）の前若しくは後に、又はそうでなければ同時に行うことが可能である、工程。
－ （ｉ）場合によりスペーサーの存在下で、少なくとも１つのアルキン又はアジドを、ＣＤ３８及び／又はＣＤ１３８に結合することができる抗体又は断片の各モノマーにカップリングさせる工程、
－ （ｉｉ）場合によりスペーサーの存在下で、少なくとも１つのアジド又はアルキンをペプチドにカップリングする工程、
－ （ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で生成された生成物を混合する工程であって、共有結合がアジドとアルキンとの間に特異的に確立され、工程（ｉ）を工程（ｉｉ）の前若しくは後に、又はそうでなければ同時に行うことが可能である、工程。
【0076】
本発明の配列を以下の表１に示す。
【表1】
【0077】
本発明の他の特徴、詳細及び利点は、本発明を説明する添付の図面及び実施例を読むことから明らかであり、決して本発明を限定することを意図するものではない。
【0078】
例示されるハイブリッド分子では、ＰＥＧｎスペーサーに結合しているのはＦａｂ断片のＮ末端であり、シクロオクチン、ＤＢＣＯ又は存在する場合は第２のＰＥＧｎスペーサーに結合しているのは常に当該ペプチドのＮ末端である。更に、例示されたハイブリッド分子において、Ｆａｂ断片に結合したＰＥＧｎスペーサーでは、ｎはより詳細には３又は４を表し、ペプチドに結合したＰＥＧｎスペーサーでは、ＰＥＧｎスペーサーは３又は８を表すが、ｎの他の任意の値、特に１～１０の間を使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0079】
【図1A】本発明によるＤａｒａ－Ｆａｂ－シトルリン化ペプチドハイブリッド分子（シトルリン化ペプチドに共有結合したダラツムマブ抗体のＦａｂ断片）が連結されたＣＤ３８分子をその表面に発現する形質細胞を示す図である。 当該ハイブリッド分子自体は、シトルリン化ペプチドによってＡＣＰＡに結合される。ＡＣＰＡによるＤａｒａ－Ｆａｂ－シトルリン化ペプチドハイブリッド分子の架橋は細胞傷害性であり、形質細胞の死をもたらす。
【図1B】形質細胞の表面上のＤａｒａ－Ｆａｂ－シトルリン化ペプチドハイブリッド分子のＡＣＰＡ架橋後のＣＤ３８＋形質細胞のマクロファージ（ＡＤＰ）による食作用又はＮＫ細胞誘導細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す図である。 形質細胞は、その表面に、本発明によるＤａｒａ－Ｆａｂ－シトルリン化ペプチドハイブリッド分子が結合したＣＤ３８分子を発現し、当該ハイブリッド分子自体は、シトルリン化ペプチドによってＡＣＰＡに結合している。マクロファージの表面に発現される異なるＦｃγＲ又はＮＫ細胞の表面に発現されるＦｃγＲＩＩＩＡへのＡＣＰＡのＦｃ断片の結合は、食作用（ＡＤＰ）及び／又は抗体誘導細胞傷害（ＡＤＣＣ）を活性化し、形質細胞の特異的破壊をもたらす。
【図2】本発明によるハイブリッド分子の一例の図を示す図である。 スペーサー（任意である）は、ＣＤ３８（Ｄａｒａ）に結合する抗体又は抗体断片と、シトルリル残基を有するフィブリン由来ペプチド（「シトルリン化ペプチド」と称される）との間に示される。Ｆ（ａｂ）’２断片を有する構築物も示されている。例えば、Ｆ（ａｂ）’２は、ＣＤ３８及びＣＤ１３８の両方に結合することができる。Ｆａｂ：断片抗原結合。Ｄａｒａ Ｆａｂ：ＣＤ３８分子に対する特異的抗体のＦａｂ（ダラツムマブ）。
【図3】精製抗β６０－７４ ＡＣＰＡに対する、配列番号１９のペプチド（β６０－７４ｃｉｔ６０，７２，７４）を含むいくつかのハイブリッド分子の反応性を示す図である。 β６０－７４は、配列番号１９のペプチドを表す。ＤａｒａＦａｂ－β６０－７４は、配列番号１９のペプチドにカップリングしたシクロオクチン（ＤＢＣＯ）に共有結合したアジドに、それ自体カップリングしているＰＥＧｎスペーサーに結合したＣＤ３８に結合することができるＦａｂを表す。ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４は、それ自体が配列番号１９のペプチドに結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングしているシクロオクチン（ＤＢＣＯ）に共有結合しているアジドに、それ自体がカップリングしている、ＰＥＧｎスペーサーに結合したＣＤ３８に結合することができるＦａｂを表す。ｎは、ＰＥＧｎスペーサーが使用される場合、１～１０の数、好ましくは１、２、３、４又は８を表す。
【図4】抗α６２１－６３５精製ＡＣＰＡに対する、配列番号１８のペプチド（α６２１）を含むいくつかのハイブリッド分子の反応性を示す図である。 α６２１は、配列番号１８のペプチドを表す。ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５は、それ自体が配列番号１８のペプチドに結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングしているシクロオクチン（ＤＢＣＯ）に共有結合しているアジドに、それ自体がカップリングしているＰＥＧｎスペーサーに結合した、ＣＤ３８に結合することができるＦａｂを表す。ｎは１～１０、好ましくは１、２、３、４又は８の数を表す。
【図5】精製抗β６０－７４ ＡＣＰＡによる架橋後の、関節リウマチ患者のリンパ球から産生されたＢＡＥＶ Ｂ細胞株（ＢＣ－９）に対するＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４Ｃｉｔの細胞傷害性を示す図である。 左側は生細胞のパーセンテージを表し、右側は後期アポトーシスにおける細胞のパーセンテージを表す。
【図6】分化前（左）及び分化後（右）のＢＣ－９細胞におけるＣＤ３８の発現及びＦａｂ Ｄａｒａの結合（蛍光色素Ａ６４７で標識されたＣＤ３８に結合するＦａｂ断片）を示す図である。
【図7】ＫＭＳ－１２－ＰＥ骨髄腫細胞株の表面上のＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５及び精製抗α６２１－６３５ｃｉｔ ＡＣＰＡ又は２Ｈ０６ ＡＣＰＡの相互作用を示す図である。 ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５は、それ自体が配列番号１８のペプチドに結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングしているシクロオクチン（ＤＢＣＯ）に共有結合しているアジドに、それ自体がカップリングしているＰＥＧｎスペーサーに結合した、ＣＤ３８に結合することができるＦａｂを表す。ｎは１～１０、好ましくは１、２、３、４又は８の数を表す。
【図8】ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ Ｃｉｔハイブリッド及び２Ｈ０６ ＡＣＰＡの存在下でのマクロファージによる分化ＫＭＳ－１２－ＰＥ骨髄腫細胞株の食作用を示す図である。 ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔは、図７に記載のハイブリッド分子を表す。ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ａｒｇは、それ自体が配列番号１８のペプチドに結合したＰＥＧｎスペーサーにカップリングしたシクロオクチン（ＤＢＣＯ）に共有結合したアジドに、それ自体カップリングしたＰＥＧｎスペーサーに結合したＣＤ３８に結合することができるＦａｂを表し、Ｘはアルギニル残基を表す（すなわち、ペプチドはシトルリン化されていない）。
【図9】ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４又はＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５及びそれぞれ精製抗β６０－７４ｃｉｔ又は抗α６２１－６３５ｃｉｔ ＡＣＰＡの存在下でのマクロファージによる分化ＫＭＳ－１２－ＰＥ骨髄腫細胞株の食作用を示す図である。 ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５は、図７に示されるような分子である。ＤａｒａＦａｂ－α６２１－６３５は、配列番号１８のペプチドにカップリングしたシクロオクチン（ＤＢＣＯ）に共有結合したアジドに、それ自体カップリングしているＰＥＧｎスペーサーに結合したＣＤ３８に結合することができるＦａｂを表す。ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４は、それ自体が配列番号１９のペプチドに結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングしているシクロオクチン（ＤＢＣＯ）に共有結合しているアジドに、それ自体がカップリングしている、ＰＥＧｎスペーサーに結合した、ＣＤ３８に結合することができるＦａｂを表す（ｎは１～１０、好ましくは１、２、３、４又は８の数を表す）。ＤａｒａＦａｂ－β６０－７４は、配列番号１９のペプチドにカップリングしたシクロオクチン（ＤＢＣＯ）に共有結合したアジドに、それ自体カップリングしているＰＥＧｎスペーサーに結合したＣＤ３８に結合することができるＦａｂを表す。
【実施例】
【0080】
実施例１：本発明によるハイブリッド分子の製造例
本明細書に記載のハイブリッド分子は、以下の構築物：それ自体がアジドにカップリングされたＰＥＧｎに共有結合するＦａｂ断片であって、当該アジドは、シトルリン化ペプチドにカップリングされたスペーサーにそれ自体が結合されたアルキンに共有結合されている、Ｆａｂ断片を含む。そのような分子を読み取ることができる：Ｆａｂ－ＰＥＧｎ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－ＰＥＧｎ－シトルリン化ペプチド。
本明細書に記載のハイブリッド分子は、以下の構築物：それ自体がアジドにカップリングされたＰＥＧｎに共有結合するＦａｂ断片であって、当該アジドは、シトルリン化ペプチドにカップリングされたスペーサーにそれ自体が結合されたアルキンに共有結合されている、Ｆａｂ断片を含む。そのような分子を読み取ることができる：Ｆａｂ－ＰＥＧｎ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－ＰＥＧｎ－シトルリン化ペプチド。
【0081】
１．ＮＨ２－ＰＥＧｎ－Ｎ３（すなわち、一方の端部でアジドにカップリングされ、他方の端部で遊離アミン官能基を有するスペーサー）の合成。
【0082】
２．ＮＨ２－ＰＥＧｎ－Ｎ３を、Ｑタグ及びトランスグルタミナーゼを有するＦａｂ断片と、好ましくは３７℃で１６時間接触させること。この「誘導体化」工程は、好ましくは、Ｆａｂ断片のモル数よりも１０倍多いモルのＮＨ２－ＰＥＧｎ－Ｎ３を用いて行われる。トランスグルタミナーゼは、存在するＱタグ当たり１５Ｕ／μｍｏｌのレベルで使用される。脱塩を任意選択的に行って、工程の最後にＦａｂ断片に結合していない過剰なスペーサーを除去することができる。これにより、Ｆａｂ－ＰＥＧｎ－Ｎ３が生成される。抗体又は断片が２つのＱタグ（各モノマーに担持されたもの）を有する場合、抗体又は断片は２つのＰＥＧｎ－Ｎ３を担持することができる。
【0083】
３．シトルリン化Ｃｙｓ－ＰＥＧｎ－ペプチド（すなわち、一方の末端でペプチドにカップリングし、他方の末端に遊離システインを有するスペーサー）の合成。次いで、ＤＢＣＯをシステインでＣｙｓ－ＰＥＧｎ－シトルリン化ペプチドにカップリングさせ、したがって、ＤＢＣＯ－ＰＥＧｎ－シトルリン化ペプチドを生成する。
【0084】
４．「クリック」の形成：Ｎ３とＤＢＣＯとの間のカップリング。ＤＢＣＯ－ＰＥＧｎ－シトルリン化ペプチドをＦａｂ－ＰＥＧｎ－Ｎ３と接触させ、好ましくはＦａｂ－ＰＥＧｎ－Ｎ３のモル数の１０倍多いＤＢＣＯ－ＰＥＧｎ－シトルリン化ペプチドを使用する。クリック反応は室温で行われ、４時間後にほぼ完了する。
【0085】
５．ハイブリッド分子：Ｆａｂ－ＰＥＧｎ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－ＰＥＧｎ－シトルリン化ペプチドの生成。
【0086】
同様に、Ｆａｂ－ＰＥＧｎ－ＤＢＣＯ及びＮ３－ＰＥＧｎ－シトルリン化ペプチドを得ることができ、次いで、Ｆａｂ－ＰＥＧｎ－ＤＢＣＯ－Ｎ３－ＰＥＧｎ－シトルリン化ペプチドを得るためにカップリングさせることができる。
【0087】
同様に、Ｆａｂ－ＰＥＧｎ－ＤＢＣＯ及びＮ３－シトルリン化ペプチドを得ることができるか、又はＦａｂ－ＰＥＧｎ－Ｎ３及びシトルリン化ＤＢＣＯペプチドを得た後、それらをカップリングさせて、それぞれＦａｂ－ＰＥＧｎ－ＤＢＣＯ－Ｎ３－シトルリン化ペプチド又はＦａｂ－ＰＥＧｎ－Ｎ３－ＤＢＣＯ－シトルリン化ペプチドを得ることができる。
【0088】
同じ方法を、抗体又は別のタイプの抗体断片と共に使用することができる。
【0089】
実施例２：ＤａｒａＦａｂ－Ｃｉｔペプチドハイブリッドに関する、シトルリン化ペプチドに対する精製ＡＣＰＡの反応性
使用されるＡＣＰＡ（ここではＡＣＰＡ、ｐＨ３画分）は、ＡＣＰＡ陽性関節リウマチに罹患している患者の血清から得られるＡＣＰＡである。そのようなＡＣＰＡは、本発明の５つの免疫優性ペプチド（配列番号５、配列番号６、配列番号１４、配列番号１８又は配列番号１９を参照のこと）の１つ以上を結合抗原として使用して、当業者に公知の標準的なカラムアフィニティークロマトグラフィー法によって得た。
使用されるＡＣＰＡ（ここではＡＣＰＡ、ｐＨ３画分）は、ＡＣＰＡ陽性関節リウマチに罹患している患者の血清から得られるＡＣＰＡである。そのようなＡＣＰＡは、本発明の５つの免疫優性ペプチド（配列番号５、配列番号６、配列番号１４、配列番号１８又は配列番号１９を参照のこと）の１つ以上を結合抗原として使用して、当業者に公知の標準的なカラムアフィニティークロマトグラフィー法によって得た。
【0090】
ａ．β６０－７４ｃｉｔペプチドを含有するハイブリッド分子を用いた実施例
ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを、β６０－７４ｃｉｔペプチド（配列番号１９）又はハイブリッド分子：ＤａｒａＦａｂ－β６０－７４又はＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４のいずれかを含有する１００μｌ／ウェルの溶液でコーティングした。これらの溶液をそれぞれＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）緩衝液中５μｇ／ｍｌの濃度で使用し、４℃で一晩インキュベートした。非シトルリン化ペプチド及び非シトルリン化ペプチド（β６０～７４ａｒｇ）で構築されたハイブリッド分子を同じ濃度で対照として使用した。次いで、ウェルをＰＢＳ２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）緩衝液中で４℃にて１時間飽和させた。洗浄後、精製したＡＣＰＡをＰＢＳ２％ＢＳＡ ２ＭＮａＣｌ緩衝液で希釈した１、０．５又は０．２５μｇ／ｍｌで４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ＰＢＳ２％ＢＳＡ緩衝液で１／１０，０００に希釈したＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ二次抗体を用いてＡＣＰＡ反応性を検出した。結果は、β６０－７４ｃｉｔペプチド又はβ６０－７４ｃｉｔペプチドで構築されたハイブリッド分子で得られたＯＤに対応するΔＯＤ（光学密度の変化）で表され、β６０－７４ａｒｇペプチド又はβ６０－７４ａｒｇペプチドで構築されたハイブリッド分子で得られたＯＤからそれぞれ差し引かれる。
ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを、β６０－７４ｃｉｔペプチド（配列番号１９）又はハイブリッド分子：ＤａｒａＦａｂ－β６０－７４又はＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４のいずれかを含有する１００μｌ／ウェルの溶液でコーティングした。これらの溶液をそれぞれＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）緩衝液中５μｇ／ｍｌの濃度で使用し、４℃で一晩インキュベートした。非シトルリン化ペプチド及び非シトルリン化ペプチド（β６０～７４ａｒｇ）で構築されたハイブリッド分子を同じ濃度で対照として使用した。次いで、ウェルをＰＢＳ２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）緩衝液中で４℃にて１時間飽和させた。洗浄後、精製したＡＣＰＡをＰＢＳ２％ＢＳＡ ２ＭＮａＣｌ緩衝液で希釈した１、０．５又は０．２５μｇ／ｍｌで４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ＰＢＳ２％ＢＳＡ緩衝液で１／１０，０００に希釈したＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ二次抗体を用いてＡＣＰＡ反応性を検出した。結果は、β６０－７４ｃｉｔペプチド又はβ６０－７４ｃｉｔペプチドで構築されたハイブリッド分子で得られたＯＤに対応するΔＯＤ（光学密度の変化）で表され、β６０－７４ａｒｇペプチド又はβ６０－７４ａｒｇペプチドで構築されたハイブリッド分子で得られたＯＤからそれぞれ差し引かれる。
【0091】
結果を図３に示す。結果は、ハイブリッド分子ＤａｒａＦａｂ－β６０－７４及びＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４に関して、ペプチドβ６０－７４に対する精製ＡＣＰＡの用量依存的反応性を示す。β６０－７４ペプチドに対するＡＣＰＡの反応性は比較的弱いが、ハイブリッド分子のエピトープ密度よりも大きいエピトープ密度を示す。したがって、エピトープは、ハイブリッド分子上でより接近可能である。
【0092】
ｂ．α６２１－６３５ｃｉｔペプチドを含有するハイブリッド分子を有する実施例
ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）緩衝液中５μｇ／ｍｌの濃度で４℃で一晩使用した、α６２１－６３５ｃｉｔペプチド（配列番号１８）又はＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッド分子のいずれかを含有する１００μｌ／ウェルの溶液でコーティングした。非シトルリン化ペプチドα６２１－６３５ａｒｇ及び非シトルリン化ペプチド（α６２１－６３５ａｒｇ）で構築されたハイブリッド分子を同じ濃度で対照として使用した。次いで、ウェルをＰＢＳ２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）緩衝液中で４℃にて１時間飽和させた。洗浄後、精製したＡＣＰＡをＰＢＳ２％ＢＳＡ ２ＭＮａＣｌ緩衝液で希釈した４、２又は１μｇ／ｍｌで４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ＰＢＳ２％ＢＳＡ緩衝液で１／１０，０００に希釈したＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ二次抗体を用いてＡＣＰＡ反応性を検出した。結果は、α６２１－６３５ｃｉｔペプチド又はα６２１－６３５ｃｉｔペプチドで構築されたハイブリッド分子で得られたＯＤに対応するΔＯＤ（光学密度の変化）で表され、α６２１－６３５ａｒｇペプチド又はα６２１－６３５ａｒｇペプチドで構築されたハイブリッド分子で得られたＯＤからそれぞれ差し引かれる。
ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）緩衝液中５μｇ／ｍｌの濃度で４℃で一晩使用した、α６２１－６３５ｃｉｔペプチド（配列番号１８）又はＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッド分子のいずれかを含有する１００μｌ／ウェルの溶液でコーティングした。非シトルリン化ペプチドα６２１－６３５ａｒｇ及び非シトルリン化ペプチド（α６２１－６３５ａｒｇ）で構築されたハイブリッド分子を同じ濃度で対照として使用した。次いで、ウェルをＰＢＳ２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）緩衝液中で４℃にて１時間飽和させた。洗浄後、精製したＡＣＰＡをＰＢＳ２％ＢＳＡ ２ＭＮａＣｌ緩衝液で希釈した４、２又は１μｇ／ｍｌで４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ＰＢＳ２％ＢＳＡ緩衝液で１／１０，０００に希釈したＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ二次抗体を用いてＡＣＰＡ反応性を検出した。結果は、α６２１－６３５ｃｉｔペプチド又はα６２１－６３５ｃｉｔペプチドで構築されたハイブリッド分子で得られたＯＤに対応するΔＯＤ（光学密度の変化）で表され、α６２１－６３５ａｒｇペプチド又はα６２１－６３５ａｒｇペプチドで構築されたハイブリッド分子で得られたＯＤからそれぞれ差し引かれる。
【0093】
結果を図４に示す。結果は、ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔハイブリッド分子に関して、α６２１－６３５Ｃｉｔペプチドに対する精製ＡＣＰＡの強い用量依存的反応性を示す。α６２１－６３５ｃｉｔペプチドに対するＡＣＰＡの反応性は比較的弱いが、そのエピトープ密度はハイブリッド分子のエピトープ密度よりも大きい。したがって、エピトープは、ハイブリッド分子上でより接近可能である。
【0094】
実施例３：ｐＨ３で溶出したβ６０－７４に対する精製ＡＣＰＡによって誘導されたＤａｕｄｉ細胞株（ＣＤ３８＋）の細胞に対するＤａｒａ－Ｆａｂペプチドβ６０Ｃｉｔの細胞傷害性（ハイブリッド架橋）
実施例２と同様にしてＡＣＰＡを得る。
実施例２と同様にしてＡＣＰＡを得る。
【0095】
本明細書においてＤａｒａＦａｂ－ペプチドＣＩＴは、配列番号１９のペプチドに結合したシクロオクチン（ＤＢＣＯ）に共有結合したアジドに、それ自体カップリングしているＰＥＧｎスペーサーに結合したＣＤ３８に結合することができるＦａｂを表す。ここで、ＤａｒａＦａｂ－ペプチドＮＣＩＴは、配列番号１９のペプチドにカップリングしたシクロオクチン（ＤＢＣＯ）に共有結合したアジドに、それ自体カップリングしたＰＥＧｎスペーサーに結合した、ＣＤ３８に結合することができるＦａｂを表し、ここで、アルギニル残基はシトルリル残基によって置換されていない（すなわち、ペプチドはシトルリン化されていない）。ｎは、１～１０の数、好ましくは１、２、３、４又は８を表す。
【0096】
Ｄａｕｄｉ細胞株（ＣＤ３８＋）由来の細胞を、完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳ、１％グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中５０，０００細胞／ウェルの量で９６ウェルプレートに入れ、１０μｇ／ｍｌのＤａｒａＦａｂ－ペプチド－ＣＩＴ又はＤａｒａＦａｂ－ペプチド－ＮＣＩＴハイブリッドと共に３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ｐＨ３、５μｇ／ｍｌで２０時間、３７℃で溶出したヒトＩｇＧ（陰性対照）又は精製抗β６０－７４ ＡＣＰＡを添加した後、アネキシンＶ（アポトーシスマーカー）で標識した。次いで、細胞を収集し、フローサイトメトリー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡＮＴＯ ＩＩ）によって分析した。最初の３列に示される値は、アネキシンＶ陽性細胞のパーセンテージに対応する。Δ（ＣＩＴ－ＮＣＩＴ）（％）は、ＤａｒａＦａｂ－ペプチドＣＩＴの存在下でのアネキシンＶ陽性細胞の百分率対ＮＣＩＴの百分率の差を、ＤａｒａＦａｂ－β６０－７４ペプチドＮＣＩＴの存在下でのアネキシンＶ陽性細胞の百分率で割ったものを表す。この指標は、ＩｇＧ又はＡＣＰＡの存在下でのアポトーシスの調節を示す。
【0097】
結果を表２に示す。
【表2】
【0098】
結果は、ＤＡＵＤＩ細胞をＤａｒａＦａｂ－β６０－７４ＣＩＴハイブリッドで処理した場合、ＤａｒａＦａｂ－β６０－７４ＮＣＩＴで処理したものと比較して、ＡＣＰＡの存在下での細胞死の増加を示す。ＡＣＰＡによる架橋後の非シトルリン化形態（ＤａｒａＦａｂ－β６０－７４ＮＣＩＴ）と比較した、シトルリン化ハイブリッド分子（ＤａｒａＦａｂ－β６０－７４ＣＩＴ）の存在下での細胞死の増加は、平均１６．５％である。
【0099】
Ｄａｕｄｉ細胞株（ＣＤ３８＋）由来の細胞を、完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳ、１％グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中５０，０００細胞／ウェルの量で９６ウェルプレートに入れ、１０μｇ／ｍｌのＤａｒａＦａｂ－β６０－７４ＣＩＴ又はＤａｒａＦａｂ－β６０－７４ＮＣＩＴハイブリッドと共に３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、５μｇ／ｍｌでｐＨ３で溶出したヒトＩｇＧ（陰性対照）又は精製抗β６０－７４ ＡＣＰＡを添加し、３７℃で２０時間インキュベートした。細胞生存性試験（ＭＴＴ：細胞ミトコンドリア活性の比色マーカー）を行った。次いで、細胞を取り出し、ＯＤを分光法（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ｆｃ）によって分析した。示されている値は、各実験条件下で得られたＯＤに対応する。
【0100】
Δ（ＣＩＴ－ＮＣＩＴ）（％）は、ＤａｒａＦａｂ－β６０－７４ＣＩＴの存在下で得られたＯＤとＮＣＩＴとの差を表し、ＤａｒａＦａｂ－β６０－７４ＮＣＩＴの存在下で得られたＯＤで割ったものである。
【0101】
結果を表３に示す。
【表3】
【0102】
結果は、Ｄａｕｄｉ細胞をＤａｒａＦａｂ－β６０－７４ＣＩＴハイブリッドで処理した場合、ＤａｒａＦａｂ－β６０－７４ＮＣＩＴで処理したものと比較して、ＡＣＰＡの存在下での細胞生存率の減少を示す。
【0103】
ＡＣＰＡによる架橋後の非シトルリン化形態（ＤａｒａＦａｂ－β６０－７４ＮＣＩＴ）と比較した、シトルリン化ハイブリッド分子（ＤａｒａＦａｂ－β６０－７４ＣＩＴ）の存在下での細胞生存率の低下は、平均１７．３３％である。
【0104】
実施例４：精製抗β６０－７４ ＡＣＰＡによる架橋後の、関節リウマチ患者のリンパ球から産生されたＢＡＥＶ Ｂ細胞株（ＢＣ－９）に対するＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４Ｃｉｔの細胞傷害性
実施例２と同様にしてＡＣＰＡを得る。
実施例２と同様にしてＡＣＰＡを得る。
【0105】
関節リウマチ患者の血液リンパ球からのＢＣ－９細胞株（Ｂ ＢＡＥＶ）の細胞を、完全ＩＭＤＭ培地（１０％ＦＢＳ、１％グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中１００，０００細胞／ウェルの量で９６ウェルプレートに入れ、１０μｇ／ｍｌのＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４ｃｉｔ及びＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４ａｒｇハイブリッドと共に３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ｐＨ３、５μｇ／ｍｌで溶出した精製抗β６０－７４ＡＣＰＡを３７℃で２０時間添加した後、７－ＡＡＤ（後期アポトーシスマーカー）で標識した。次いで、細胞を取り出し、フローサイトメトリー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡＮＴＯ ＩＩ）によって分析した。提示されたデータは、４つの独立した実験の平均に対応する。統計分析は、スチューデントのｔ検定を使用して行った（＊ｐ＜０．０５）。
【0106】
本明細書においてＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４ｃｉｔは、配列番号１９のペプチドにカップリングしたシクロオクチン（ＤＢＣＯ）に共有結合したアジドに、それ自体カップリングしているＰＥＧｎスペーサーに結合したＣＤ３８に結合することができるＦａｂを表す。ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４ａｒｇは、配列番号１９のペプチドにカップリングしたシクロオクチン（ＤＢＣＯ）に共有結合したアジドに、それ自体カップリングしたＰＥＧｎスペーサーに結合した、ＣＤ３８に結合することができるＦａｂを表し、ここで、アルギニル残基はシトルリル残基によって置換されていない（すなわち、ペプチドはシトルリン化されていない）。ｎは、１～１０の数、好ましくは１、２、３、４又は８を表す。したがって、結果（図５に提示）は、ＢＣ－９細胞を以前にシトルリン化ハイブリッドＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４ｃｉｔと共にインキュベートした場合、ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４ａｒｇと共にインキュベートしたものの生存率と比較して、精製ＡＣＰＡの存在下で細胞生存率の有意な減少（左側）があることを示す。同時に、これらの同じ条件下で後期アポトーシスの有意な増加がある（右部分）。
【0107】
実施例５：ｐＨ３で溶出した精製抗β６０－７４ ＡＣＰＡによるハイブリッドの架橋後の、関節リウマチ患者のリンパ球に由来する分化ＢＡＥＶ Ｂ細胞株に対するＤａｒａ－Ｆａｂペプチド－β６０Ｃｉｔ及びＤａｒａ－Ｆａｂペプチド－α６２１Ｃｉｔハイブリッドの細胞毒性
実施例２と同様にしてＡＣＰＡを得る。
実施例２と同様にしてＡＣＰＡを得る。
【0108】
図６に示すように、その表面上のＣＤ３８マーカーの発現を増加させるために、ＢＣ－９細胞株（Ｂ ＢＡＥＶ）からの細胞を分化させた（７日間）。
【0109】
ここで、ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５は、それ自体が配列番号１８のペプチドに結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングしているシクロオクチン（ＤＢＣＯ）に共有結合しているアジドに、それ自体がカップリングしている、ＰＥＧｎスペーサーに連結したＣＤ３８に結合することができるＦａｂ断片を表す。ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔはペプチドがシトルリン化されているハイブリッドを表し、ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ａｒｇはペプチドがシトルリン化されていない場合を表す。ｎは、１～１０の数、好ましくは１、２、３、４又は８を表す。
【0110】
ここで、ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４は、それ自体が配列番号１９のペプチドに結合しているＰＥＧｎスペーサーにカップリングしているシクロオクチン（ＤＢＣＯ）に共有結合しているアジドに、それ自体がカップリングしている、ＰＥＧｎスペーサーに連結したＣＤ３８に結合することができるＦａｂを表す。ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４ｃｉｔはペプチドがシトルリン化されているハイブリッドを表し、ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４ａｒｇはペプチドがシトルリン化されていない場合を表す。ｎは、１～１０の数、好ましくは１、２、３、４又は８を表す。
【0111】
形質細胞分化プロトコルに７日間供された関節リウマチ患者の血液リンパ球からのＢＣ－９細胞株（Ｂ ＢＡＥＶ）由来の細胞を、完全ＩＭＤＭ培地（１０％ＦＢＳ、１％グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中１００，０００細胞／ウェルの量で９６ウェルプレートに入れ、次いで、１０μｇ／ｍｌのＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４ｃｉｔ／ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４ａｒｇ及びＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔ／ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ａｒｇハイブリッドと共に３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、ｐＨ３、５μｇ／ｍｌで２４又は４８時間、３７℃で溶出したヒトＩｇＧ（陰性対照）又は精製抗β６０－７４ＡＣＰＡを添加した後、アネキシンＶ（初期アポトーシスマーカー）及び７－ＡＡＤ（後期アポトーシスマーカー）で標識した。次いで、細胞を収集し、細胞死分析装置（Ｌｕｍｉｎｅｘ，ＭＵＳＥ）によって分析した。示されている値は、アネキシン陽性細胞のパーセンテージに対応する。Δ（ｃｉｔ－ａｒｇ）（％）は、ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４ｃｉｔ又はＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔの存在下でのアネキシンＶ陽性細胞のパーセンテージと、ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４ａｒｇ又はＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ａｒｇの存在下でのアネキシンＶ陽性細胞のパーセンテージとの差を、ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４ａｒｇ又はＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ａｒｇの存在下でのアネキシンＶ陽性細胞のパーセンテージで割ったものを表す。
【0112】
結果を表４に示す。
【表4】
【0113】
結果は、ＢＣ－９細胞がＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４ｃｉｔ又はＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ｃｉｔで前処理された場合、非シトルリン化形態ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４ａｒｇ及びＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ａｒｇで前処理されたものと比較して、ＡＣＰＡの存在下で誘導されたアポトーシスの定量化を示す。
【0114】
非シトルリン化形態と比較した、シトルリン化ハイブリッド分子（ＤａｒａＦａｂ－β６０－７４ｃｉｔ及びＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１ｃｉｔ）の存在下でのアポトーシスの増加は、精製ＡＣＰＡによる架橋後、２４時間後に約３０％、４８時間後に４０％である。
【0115】
実施例６：ヒト骨髄腫又は悪性形質細胞腫に由来するＫＭＳ－１２－ＰＥ細胞株の表面上のＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ハイブリッド及び精製抗α６２１－６３５ｃｉｔ ＡＣＰＡ又は２Ｈ０６ ＡＣＰＡの相互作用
ＡＣＰＡ（ここで、精製ＡＣＰＡ）は、ＡＣＰＡ陽性の関節リウマチ患者の血清から得られたＡＣＰＡである。そのようなＡＣＰＡは、本発明の５つの免疫優性ペプチド（配列番号５、配列番号６、配列番号１４、配列番号１８又は配列番号１９を参照のこと）の１つ以上を結合抗原として使用して、当業者に公知の標準的なカラムアフィニティークロマトグラフィー法によって得た。
ＡＣＰＡ（ここで、精製ＡＣＰＡ）は、ＡＣＰＡ陽性の関節リウマチ患者の血清から得られたＡＣＰＡである。そのようなＡＣＰＡは、本発明の５つの免疫優性ペプチド（配列番号５、配列番号６、配列番号１４、配列番号１８又は配列番号１９を参照のこと）の１つ以上を結合抗原として使用して、当業者に公知の標準的なカラムアフィニティークロマトグラフィー法によって得た。
【0116】
ここでも使用されるＡＣＰＡは、組換えモノクローナルヒトＡＣＰＡ（２Ｈ０６として知られるクローン０２２０１４ＣＣＰ１４ＣＦＣＴ２Ｈ０６）である。そのようなＡＣＰＡは、Ｔｉｔｃｏｍｂｅ Ｐ．Ｊ．，Ｗｉｇｅｒｂｌａｄ Ｇ．，Ｓｉｐｐｌ Ｎ．，Ｚｈａｎｇ Ｎ．，Ｓｈｍａｇｅｌ Ａ．Ｋ．，Ｓａｈｌｓｔｒｏｍ Ｐ．，Ｚｈａｎｇ Ｙ．，Ｂａｒｓｎｅｓｓ Ｌ．Ｏ．，Ｇｈｏｄｋｅ－Ｐｕｒａｎｉｋ Ｙ．，Ｂａｈａｒｐｏｏｒ Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ－Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｌａｄｅｓ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ２０１８，７０（１２），１９３３－１９４５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ａｒｔ．４０５９０に記載されているように得ることができる。２Ｈ０６ ＡＣＰＡ ＶＨはＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＭＨ６２９７１０．１を有し、ＶＬは受託番号ＭＨ６２９７００．１を有する。
【0117】
ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ Ｃｉｔ／ＡｒｇハイブリッドをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７蛍光色素で標識し、精製抗α６２１－６３５ｃｉｔ ＡＣＰＡ並びに２Ｈ０６ ＡＣＰＡを、市販のキット（Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｌｉｎｋ，Ａｂｃａｍ）を使用してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８蛍光色素で標識した。ＫＭＳ－１２－ＰＥヒト骨髄腫細胞株からの細胞を、完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ、１％グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中２００，０００細胞／ウェルの量で９６ウェルプレートに入れ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識した１０μｇ／ｍｌのＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ Ｃｉｔ／Ａｒｇハイブリッドと共に４℃で３０分間インキュベートし、次いで精製抗α６２１－６３５ｃｉｔ ＡＣＰＡ又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８で標識した２Ｈ０６ ＡＣＰＡと共に５μｇ／ｍｌで４℃で３０分間インキュベートした。２％ＰＢＳ ＢＳＡ緩衝液で洗浄した後、ＫＭＳ－１２－ＰＥ細胞を収集し、フローサイトメトリー（（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｎｔｏ ＩＩ）によって分析した。
【0118】
図７に示される結果は、二重陽性ＡＦ６４７／ＡＦ４８８集団の出現によって可視化される、ＫＭＳ－１２－ＰＥ骨髄腫細胞株の表面上のＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ Ｃｉｔハイブリッド分子と抗α６２１－６３５ｃｉｔ ＡＣＰＡ又は２Ｈ０６ ＡＣＰＡとの相互作用を示す。ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５Ａｒｇハイブリッドの存在下では観察されないため、この相互作用は特異的であり、ペプチドと関連している。
【0119】
実施例７：ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５及び２Ｈ０６ ＡＣＰＡの存在下でのマクロファージによる分化ＫＭＳ－１２－ＰＥ骨髄腫細胞株の食作用
実施例６と同様にして２Ｈ０６ ＡＣＰＡを得る。
実施例６と同様にして２Ｈ０６ ＡＣＰＡを得る。
【0120】
（Ａ）ＫＭＳ－１２－ＰＥ骨髄腫細胞株からの細胞を４日間分化させて、１００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ－α、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６、及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５からなるサイトカインの混合物を使用して、その表面上のＣＤ３８マーカーの発現を増加させた。次いで、細胞をＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル、蛍光細胞内マーカー）で標識し、ダラツムマブ（陽性対照として使用した抗ＣＤ３８モノクローナルＡＣ）の存在下又はＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ Ｃｉｔ／Ａｒｇハイブリッドの存在下で、３７℃の完全ＲＰＭＩ培地中１０μｇ／ｍｌで３０分間置いた。次いで、細胞を完全ＲＰＭＩ培地中で５０μｇ／ｍｌの２Ｈ０６ ＡＣＰＡと共に３７℃で３０分間インキュベートし、洗浄せずに、１マクロファージ当たり１ ＫＭＳ－１２－ＰＥ細胞の量で、ヒトマクロファージ（健常被験体の末梢血から単離されたＣＤ１４＋単球からＭ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下でインビトロで分化させる、非標識）と３７℃で２時間接触させた。次いで、マクロファージを分離し、Ｃｄ１１ｂ ＢＶ４２１標識（マクロファージ特異的膜マーカー）を使用してフローサイトメトリーによって分析した。異なる細胞集団を全細胞集団のパーセンテージとして表し、ＣＦＳＥ／ＢＶ４２１二重陽性（貪食されたＫＭＳ－１２－ＰＥ細胞を有するマクロファージ）のパーセンテージ及び残留ＫＭＳ－１２－ＰＥ標的集団のパーセンテージを含む。（Ｂ）データは、４つの独立した同一の実験を表す。統計分析は、対応のあるスチューデントのｔ検定を使用して行った（＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【0121】
（Ａ）図８に示される結果は、食作用活性がハイブリッドＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２５－６３１ Ｃｉｔ及び２Ｈ０６ ＡＣＰＡの存在下で増強されることを示す。二重陽性事象の７０％の増加が観察され、標的集団の７３％の減少に関連する。更に、ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２５－６３１ Ｃｉｔハイブリッド及び２Ｈ０６ ＡＣＰＡの存在下で得られた食作用活性は、ダラツムマブ対照で得られた食作用活性よりも高い。（Ｂ）この実験を４回実施したところ、二重陽性集団の７８％の特異的かつ有意な増加（＊＊＊ｐ＜０．００１、対応のあるｔ検定）が、ハイブリッドＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２５－６３１ Ｃｉｔ及び２Ｈ０６ ＡＣＰＡの存在下で観察され、標的集団の７５％の有意な減少（＊＊ｐ＜０．０１、対応のあるｔ検定）が観察された。
【0122】
実施例８：精製ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４又はＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５及びＡＣＰＡ、それぞれ抗β６０－７４ｃｉｔ又は抗α６２１－６３５ｃｉｔの存在下でのマクロファージによる分化骨髄腫ＫＭＳ－１２－ＰＥ細胞株の食作用
実施例６と同様にして２Ｈ０６ ＡＣＰＡを得る。
実施例６と同様にして２Ｈ０６ ＡＣＰＡを得る。
【0123】
ＫＭＳ－１２－ＰＥ骨髄腫細胞株からの細胞を４日間分化させて、１００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ－α、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６、及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５からなるサイトカインの混合物を使用して、その表面上のＣＤ３８マーカーの発現を増加させた。次いで、細胞をＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル、蛍光細胞内マーカー）で標識し、ダラツムマブ（陽性対照として使用した抗ＣＤ３８モノクローナル抗体）の存在下、又はＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ Ｃｉｔ／Ａｒｇハイブリッド若しくはＤａｒａＦａｂ－α６２１－６３５ Ｃｉｔ／Ａｒｇハイブリッド若しくはＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－β６０－７４ Ｃｉｔ／Ａｒｇ若しくはＤａｒａＦａｂ－β６０－７４ Ｃｉｔ／Ａｒｇハイブリッドの存在下、３７℃の完全ＲＰＭＩ培地中１０μｇ／ｍｌで３０分間置いた。次いで、細胞を、３７℃の完全ＲＰＭＩ培地中、５μｇ／ｍｌの精製抗α６２１－６３５ｃｉｔ又は抗β６０－７４ｃｉｔ ＡＣＰＡと共に３０分間インキュベートした。ＫＭＳ－１２－ＰＥ細胞を、洗浄せずに、Ｍ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下でインビトロで分化させた、健常被験体の末梢血から単離したＣＤ１４＋単球から、標識されていない、マクロファージ１個当たり１個のＫＭＳ－１２－ＰＥ細胞の量で、３７℃で２時間、ヒトマクロファージと接触させた。次いで、マクロファージを分離し、続いて、Ｃｄ１１ｂ ＢＶ４２１標識（マクロファージ特異的膜マーカー）を使用してフローサイトメトリーによって分析した。
【0124】
結果を図９に示し、ＤａｒａＦａｂ－ペプチドα６２５－６３１ Ｃｉｔ又はＤａｒａＦａｂ－ペプチドβ６０－７４ Ｃｉｔハイブリッド及び対応する精製ＡＣＰＡ、抗α６２１－６３５ｃｉｔ又は抗β６０－７４ｃｉｔの存在下で食作用活性が増加することを示す。更に、ＤａｒａＦａｂ－ペプチドα６２５－６３１ Ｃｉｔハイブリッド及び精製抗α６２５－６３１ｃｉｔ ＡＣＰＡの存在下で得られた食作用活性は、ダラツムマブ対照で得られた食作用活性よりも高い。ＤａｒＦａｂβ６０－７４ｃｉｔハイブリッド及び精製抗β６０－７４ｃｉｔＡＣＰＡを使用した条件下では、食作用活性は、ダラツムマブ対照で得られたものと同等である。
【0125】
実施例９：ＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５及び精製抗α６２１－６３５ｃｉｔＡＣＰＡ又は２Ｈ０６ ＡＣＰＡの存在下でのＮＫ細胞による分化ＫＭＳ－１２－ＰＥ骨髄腫細胞株の細胞におけるアポトーシスの誘導
精製されたＡＣＰＡ及び２Ｈ０６モノクローナル抗体は、実施例６に記載されるように得られる。
精製されたＡＣＰＡ及び２Ｈ０６モノクローナル抗体は、実施例６に記載されるように得られる。
【0126】
ＫＭＳ－１２－ＰＥ骨髄腫細胞株からの細胞を３日間分化させて、１００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ－α、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６、及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５を含むサイトカインの混合物を使用して、その表面上のＣＤ３８マーカーの発現を増加させた。９６ウェルプレートにおいて、１００，０００細胞／ウェルを、完全ＲＰＭＩ培地中でＤａｒａＦａｂ－α６２１－６３５ Ｃｉｔハイブリッド分子と共に３０分間、３７℃で１０μｇ／ｍｌで、次いで２Ｈ０６ ＡＣＰＡと共に５０μｇ／ｍｌで、又は精製抗α６２１－６３５ｃｉｔ ＡＣＰＡと共に１０μｇ／ｍｌで、エフェクター細胞として使用した新たに精製したＮＫ細胞（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｖｉｏｌｅｔで標識）の存在下で、１００，０００細胞／ウェルで、３７℃で１６時間インキュベートした。特異性対照として使用したＤａｒａＦａｂ－α６２１－６３５Ａｒｇハイブリッド分子を同じ条件下でインキュベートした。陰性対照として、ＫＭＳ－１２－ＰＥ細胞を、ハイブリッドの非存在下、単独又はＮＫ細胞の存在下でインキュベートした。細胞溶解を、蛍光プローブ７－ＡＡＤ及びアネキシンＶ－ＰＥによる標識化を使用するフローサイトメトリーによって測定した。
【0127】
結果を図１０に示し、精製抗α６２１－６３５ｃｉｔ ＡＣＰＡ又は２Ｈ０６ ＡＣＰＡの存在下でのＤａｒａＦａｂ－ＰＥＧ－α６２１－６３５ Ｃｉｔハイブリッドが、ＫＭＳ－１２－ＰＥ標的細胞のＮＫ細胞によって引き起こされるＡＤＣＣによる溶解を特異的に増加させることができることを示す。標的細胞の破壊は、２Ｈ０６ ＡＣＰＡの存在下では４７％から６８％に、精製抗α６２１－６３５ｃｉｔ ＡＣＰＡの存在下では４９％から５７％に増加する。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】