特表 2024-515083 β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを調製するための酵素組成物及びその応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-04

(54)【発明の名称】β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを調製するための酵素組成物及びその応用

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/88 20060101AFI20240328BHJP

   C12N 9/12 20060101ALI20240328BHJP

   C12N 15/70 20060101ALN20240328BHJP

   C12P 19/30 20060101ALN20240328BHJP

【ＦＩ】

C12N9/88

C12N9/12

C12N15/70 Z ZNA

C12P19/30

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023563927

(86)(22)【出願日】2021-09-13

(85)【翻訳文提出日】2023-10-13

(86)【国際出願番号】 CN2021117960

(87)【国際公開番号】W WO2022217827

(87)【国際公開日】2022-10-20

(31)【優先権主張番号】202110397619.0

(32)【優先日】2021-04-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523390415

【氏名又は名称】シェンチェン リードライン バイオテック シーオー．，エルティーディー．

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＥＮＺＨＥＮ ＲＥＡＤＬＩＮＥ ＢＩＯＴＥＣＨ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ユ，ティエメイ

(72)【発明者】

【氏名】ヘ，シュウシュウ

(72)【発明者】

【氏名】クィン，グオフゥ

(72)【発明者】

【氏名】リン，ルイメイ

(72)【発明者】

【氏名】リン，リフェン

(72)【発明者】

【氏名】タン，ウェンジン

(72)【発明者】

【氏名】パン，ジュンフェン

(72)【発明者】

【氏名】リウ，ジアン

【テーマコード（参考）】

4B064

【Ｆターム（参考）】

4B064AE63

4B064CA02

4B064CC24

4B064CE10

4B064DA01

(57)【要約】

本発明は、生物技術の分野に関し、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを調製するための酵素組成物及びその使用を開示する。本発明では、アデノシン、ニコチンアミドを原料とし、ＰＮＰ酵素とＮＲＫ酵素の酵素組成物の酵素触媒下でＤ－リボース－１－リン酸及びニコチンアミドリボシド中間体を生成し、ＮＭＮを得る。反応系全体には２つの酵素のみの関与が必要になり、副生成物のアデニンはリサイクルして再利用できる。同時に、１分子のＮＭＮを生成する同時に１分子のＡＴＰのみが消費されるため、プロセスコストが大幅に削減される。最後のステップにおけるＮＲＫ酵素触媒によるＮＭＮ合成反応は不可逆的であるので、基質変換率が大幅に向上し、生産コストがさらに削減される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＥＣ番号がＥＣ２．４．２．１のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びＥＣ番号がＥＣ２．７．１．２２のニコチンアミドリボシドキナーゼからなる酵素組成物であって、前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは、子牛の脾臓（ｃａｌｆ ｓｐｌｅｅｎ）、ボス・タウルス（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・クラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、ウシ・サルモネラ・エンテリカ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、及びエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）のうちの１種又は２種以上に由来することを特徴とする、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを調製するための酵素組成物。

【請求項2】

前記ニコチンアミドリボシドキナーゼが、類鼻疽菌（Ｂ． ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、アッシビヤ・ゴシッピー（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、クプリアビドゥス・メタリデュランス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ）、ザントモナス・カンペストリス・ｐｖ．カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ． Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、アグロバクテリウム・ビティス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）、シューダースロバクター・クロロフェノリカス（Ｐｓｅｕｄａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ）、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、及びアッシビヤ・ゴシッピー（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）のうちの１種又は２種以上に由来することを特徴とする、請求項１に記載の酵素組成物。

【請求項3】

β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを合成するための酵素製剤の調製又はβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドの合成における、請求項１又は２に記載の酵素組成物の使用。

【請求項4】

アデノシンと、ニコチンアミドと、ＡＴＰと、Ｍｇイオン及びＭｎイオンから選択された一つのイオンと、リン酸塩とを原料とし、請求項１又は２に記載の酵素組成物の酵素触媒作用下でβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドを合成する工程を含むことを特徴とする、酵素触媒法によるβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドの合成方法。

【請求項5】

前記酵素組成物が、各酵素を発現する宿主細胞、各酵素の酵素液、又は各酵素の固定化酵素の形態で酵素触媒反応に関与することを特徴とする、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記各酵素を発現する宿主細胞が、各酵素を発現するベクター又は２つの酵素を共発現するベクターを含有する大腸菌であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記各酵素の酵素液が、各酵素を発現する宿主細胞から抽出された酵素液であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

ろ過、クロマトグラフィーによる分離、濃縮・結晶化及び乾燥を行って純粋なβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドを得るというβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製工程、をさらに含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【相互参照】

【0001】

この出願は、２０２１年０４月１４日に中国特許庁に提出された、出願番号２０２１１０３９７６１９．０、発明名称「β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを調製するための酵素組成物及びその応用」である中国特許出願の優先権を主張し、その全部内容が参照により本明細書に組み込まれる。

【技術分野】

【0002】

本発明は、生物技術の分野に関し、特に、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを調製するための酵素組成物及びその応用に関する。

【背景技術】

【0003】

β－ニコチンアミドモノヌクレオチド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、略称ＮＭＮ）は、生体内に存在する物質であり、ニコチンアミドヌクレオチドアデノシルトランスフェラーゼによりアデニル化された後、生体細胞の生存が依存する重要な物質であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋、補酵素Ｉとも呼ばれる）に転換される。２０１７年３月にＤａｖｉｄ Ｓｃｉｎｃｌａｉｒの研究チームが「ｓｃｉｅｎｃｅ」に発表した研究では、マウス体内のＮＡＤ＋の増加により、高齢のマウスの組織と筋肉の老化の兆候が逆転され、人間の若返りがもはや夢ではないことが示された。ＮＡＤ＋は、分子量が大きすぎるため、経口投与では細胞内に取り込むことができず、主に体内での細胞合成に依存しており、合成量が非常に少ない。ところが、ＮＡＤ＋の前駆体小分子物質であるＮＭＮに関する研究により、β－ＮＭＮを摂取すると体内のＮＡＤ＋の含有量が効果的に増加し、老化による代謝を大幅に抑制できることが判明しており、β－ＮＭＮが「不老の奇跡の薬」となっている。今まで、ニコチンアミドモノヌクレオチドには、老化の遅延やパーキンソン病などの老人性疾患の治療、インスリン分泌の調節、ｍＲＮＡの発現への影響などの多くの医療及びヘルスケア用途があることが発見されてきた。

【0004】

ＮＭＮを合成する主な方法には、化学合成、生体触媒法が含まれている。化学法はコストが高く、深刻な環境汚染を引き起こす恐れがあるため、生体触媒法に置き換えられてきた。それに対して、生体酵素法によるＮＭＮの触媒生産は、より効果的で、コストがより低く、省エネで環境に優しい。ＮＭＮを生産する生体触媒方法としては、以下の３つがある。１つ目は、ニコチンアミドリボシド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ Ｒｉｂｏｓｉｄｅ）を原料とし、ニコチンアミドリボシドキナーゼ（Ｒｉｂｏｓｙｌｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ、ＥＣ２．７．１．２２）によりＡＴＰを供給しながらＮＭＮを生成する。２つ目は、ニコチンアミド、リボース及びＡＴＰを基質とし、Ｄ－リボキナーゼ（Ｒｉｂｏｋｉｎａｓｅ、ＥＣ２．７．１．１５）、リボースリン酸ピロホスホキナーゼ（ｒｉｂｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｋｉｎａｓｅ、ＥＣ２．７．６．１）、及びニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＥＣ．２．４．２．１２）による触媒反応によりＮＭＮを生成する。３つ目は、アデノシン又はＡＭＰ、ＡＴＰ、ニコチンアミドを原料とし、アデノシンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．２０）（ただし、ＡＭＰを原料とする場合はこの酵素は必要ない）、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．２．７）、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＥＣ．２．４．２．１２）により触媒されてＮＭＮを生成する。

【0005】

上記１つ目の方法は、直接にニコチンアミドリボシドを原料とし、基質の変換率が高いが、ニコチンアミドリボシドが高価であり、コスト的に有利ではない。２つ目、３つ目の方法は、最終にＰＲＰＰとニコチンアミドからニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＥＣ．２．４．２．１２）によりＮＭＮを調製することになっており、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼは、可逆反応を触媒するので、ＮＭＮを合成しながらＮＭＮを加水分解することもあり、これらの方法の反応変換率が低くなり、また、中間体のＰＲＰＰ化合物は不安定であり、反応の進行に不利になる。さらに、上記２つの方法の多段階反応にはＡＴＰが反応に関与する必要があり、プロセス全体で大量のＡＴＰが消費されるので、これらの生体触媒法の生産コストが依然として高くなっている。だから、より効果的で低コストのＮＭＮの生体触媒による新規な調製方法が求められている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものであって、アデノシン、ニコチンアミドを原料としてβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドを合成する際に、１分子のＮＭＮを生成する同時に１分子のＡＴＰだけを消費することができ、反応中の最後のステップにおけるＮＭＮの合成反応が不可逆的であり、基質変換率の大幅向上や生産コストの削減が図れる、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）を調製するための酵素組成物を提供することを目的とする。

【0007】

本発明は、上記酵素組成物を用いたＮＭＮの合成方法を提供すること、及びＮＭＮ合成における上記酵素組成物の使用を提供することを別の目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

上記目的を達成するために、本発明は以下の技術方案を提供する。

【0009】

ＥＣ番号がＥＣ２．４．２．１のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ｐｕｒｉｎｅ－ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ、略称ＰＮＰ酵素）とＥＣ番号がＥＣ２．７．１．２２のニコチンアミドリボシドキナーゼ（ｒｉｂｏｓｙｌｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ、略称ＮＲＫ酵素）とを含む、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを調製するための酵素組成物。

【0010】

本発明は、現在の酵素触媒法の多くの欠陥を考慮し、酵素反応技術を利用し、以下の反応経路で示される、アデノシン（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、ニコチンアミド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）を使用してβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドを合成する別のプロセスを提供する。

【0011】

【化1】

【0012】

まず、アデノシンとリン酸塩からＰＮＰ酵素の作用下でＤ－リボース－１－リン酸を合成し、その後、まだ該酵素の触媒下でニコチンアミドと反応してニコチンアミドリボシドを合成し、次に１分子のＡＴＰを消費してＮＲＫ酵素の触媒下で不可逆反応によりＮＭＮを生成する。

【0013】

上記反応過程において、ＰＮＰ酵素は、子牛の脾臓、ボス・タウルス、大腸菌、ネズミチフス菌、セレウス菌、バチルス・クラウジ、エロモナス・ハイドロフィラ、ウシ・サルモネラ・エンテリカ、バクテロイデス・フラジリス、デイノコッカス・ラディオデュランス、及びエロモナス・ハイドロフィラのうちの１種又は２種以上に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼを含む。また、前記ＰＮＰ酵素は、子牛の脾臓、ボス・タウルス（ウシ）、大腸菌Ｋ１２、ネズミチフス菌（ＡＴＣＣ ７００７２０株）、セレウス菌（ＡＴＣＣ １４５７９株）、バチルス・クラウジ（ＫＳＭ－Ｋ１６株）、エロモナス・ハイドロフィラ、ウシ・サルモネラ・エンテリカ、バクテロイデス・フラジリス（ＡＴＣＣ ２５２８５株）、デイノコッカス・ラディオデュランス（ＡＴＣＣ １３９３９株）、及びエロモナス・ハイドロフィラのうちの一種又は二種以上に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼを含むことが好ましい。

【0014】

本発明においては、Ｄ－リボース－１－リン酸の生成にもニコチンアミドリボシドの生成にもＰＮＰ酵素の関与を必要とするが、Ｄ－リボース－１－リン酸の生成過程には、ＰＮＰ酵素の由来が特に限定されず、ＥＣ２．４．２．１に属するＰＮＰ酵素であればよく、ニコチンアミドリボシドの生成過程には、所定のＰＮＰが必要である。本発明で提供されるＰＮＰ酵素であれば、二つのステップの反応とも行える。

【0015】

ＮＲＫ酵素は、類鼻疽菌、アッシビヤ・ゴシッピー、インフルエンザ菌、出芽酵母、分裂酵母、ネズミチフス菌、クプリアビドゥス・メタリデュランス、ザントモナス・カンペストリス・ｐｖ．カンペストリス、アグロバクテリウム・ビティス、シューダースロバクター・クロロフェノリカス、アクチノバチルス・サクシノゲネス、ホモ・サピエンス、出芽酵母、及びアッシビヤ・ゴシッピーのうちの１種又は２種以上に由来する。また、前記ＮＲＫ酵素は、類鼻疽菌Ｋ９６２４３、アッシビヤ・ゴシッピーＡＴＣＣ １０８９５、インフルエンザ菌ＡＴＣＣ ５１９０７、出芽酵母ＡＴＣＣ ２０４５０８、分裂酵母ＡＴＣＣ ２４８４３、ネズミチフス菌（ＡＴＣＣ ７００７２０株）、クプリアビドゥス・メタリデュランス（ＡＴＣＣ ４３１２３株）、デイノコッカス・ラディオデュランス（ＡＴＣＣ １３９３９株）、ザントモナス・カンペストリス・ｐｖ．カンペストリス（ＡＴＣＣ ３３９１３株）、アグロバクテリウム・ビティス（ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８４６株）（リゾビウム・ヴィティス（Ｓ４株））、シューダースロバクター・クロロフェノリカス、アクチノバチルス・サクシノゲネス（ＡＴＣＣ ５５６１８株）、ホモ・サピエンス（ヒト）、出芽酵母（ＡＴＣＣ ２０４５０８株）（パン酵母）、及びアッシビヤ・ゴシッピー（ＡＴＣＣ １０８９５株）のうちの１種又は２種以上に由来することが好ましい。

【0016】

本発明で提供されるβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドを調製するための酵素組成物によれば、アデノシン及びニコチンアミドを原料としてＰＮＰ酵素、ＮＲＫ酵素によりＮＭＮを合成する場合、２つの酵素だけの関与でＮＭＮを得ることができ、原料のアデノシンおよびニコチンアミドが安価であり、副生成物のアデニンがリサイクルして再利用できるため、コストを大幅に削減することが図れる。また、１分子のＮＭＮを生成する同時に１分子のＡＴＰのみが消費されるので、コストがさらに大幅に削減される。従来の酵素触媒法とさらに異なるのは、最後のステップにおけるＮＲＫ酵素触媒によるＮＭＮ合成反応は不可逆的であり、従って基質変換率が大幅に向上し、生産コストがさらに削減される。

【0017】

さらに、本発明は、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを合成するための酵素製剤の調製又はβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドの合成における前記酵素組成物の使用も提供する。

【0018】

また、本発明は、上記の使用に基づいて、アデノシン、ニコチンアミド、ＡＴＰ、Ｍｇイオン又はＭｎイオン、リン酸塩を原料とし、本発明に係る酵素組成物の酵素触媒作用下でβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド及び次の反応過程にリサイクルできるリン酸塩を合成する、酵素触媒法によるβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドの合成方法も提供する。反応は通常、トリスやＰＢＳ緩衝液などの緩衝液中で行われるが、便利かつ効果的のためにＰＢＳ緩衝液を採用する。ＰＢＳ緩衝液は、反応媒体とすることもできるし、反応中のリン酸塩として反応を開始することもできる。

【0019】

補酵素因子であるマグネシウムイオン又はマンガンイオンとしては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、亜硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化マンガン、硫酸マンガン、及び硝酸マンガンのうちの一つまたは複数により提供されることが好ましい。

【0020】

前記酵素組成物は、各酵素を発現する宿主細胞、各酵素の酵素液又は各酵素の固定化酵素の形態で酵素触媒反応に関与することが好ましい。本発明の具体的な実施形態において、前記各酵素を発現する宿主細胞は、各酵素を発現するベクターを含有する大腸菌であり、また前記ベクターは、その中の１つの酵素を単独で発現することもあるし、２つの酵素を共発現することもある。その具体的な調製過程は次の通りである。

【0021】

菌株ＤＮＡをテンプレートとして抽出し、ＰＣＲにより標的ＰＮＰ酵素又はＮＲＫ酵素のＤＮＡ断片を増幅し（大腸菌のコドン優先に従って最適化してもよい）。本明細書の表１には、各実施形態で使用されたＰＮＰ酵素又はＮＲＫ酵素の配列が列挙されている。増幅された遺伝子は、制限酵素で切断部位から切断し、同じ酵素で切断されたベクタープラスミドに接続する。遺伝子配列決定により確認された正しいプラスミドがＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に移され、ＬＢ培地に培養された後、ＩＰＴＧ条件下で発現を誘導し、各酵素の湿細胞を収集する。前記ベクタープラスミドとしては市販のｐＥＴ２８ａプラスミドを使用した。各酵素の増幅プライマーは各酵素のコード配列に基づいて設計することができる。

【0022】

本発明の具体的な実施形態において、前記各酵素の酵素液は、各酵素を発現する宿主細胞から抽出された酵素液である。その抽出方法は、収集された湿細胞を高圧下で破砕し、高速遠心分離して粗タンパク質含有上清、即ち酵素含有酵素液を収集することである。上清は、さらに精製してもよい。

【0023】

本発明において、ろ過、クロマトグラフィーによる分離、濃縮・結晶化、乾燥を経して純粋なβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドを得るというβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製工程をさらに含むことが好ましい。

【0024】

本発明の方法に従ってＮＭＮを製造すれば、基質変換率（アデノシンとして計算、アデノシンに対する生成物のモル比）が９０～９９％になり、得られたＮＭＮ製品の純度が９９％以上に達する。

【0025】

上記の技術方案から分かるように、本発明では、アデノシンおよびニコチンアミドを原料とし、ＰＮＰ酵素とＮＲＫ酵素の酵素組成物の酵素触媒下でＤ－リボース－１－リン酸及びニコチンアミドリボシド中間体を生成し、ＮＭＮを得、また反応系全体には２つの酵素のみの関与が必要であり、副生成物のアデニンがリサイクルして再利用できる。また、１分子のＮＭＮが生成すると同時に１分子のＡＴＰのみが消費されるので、プロセスコストが大幅に削減される。最後のステップにおけるＮＲＫ酵素触媒によるＮＭＮ合成反応は不可逆的であることから、基質変換率が大幅に向上し、生産コストがさらに削減される。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本発明は、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを調製するための酵素組成物及びその使用を開示するものであり、当業者が本明細書の内容を参考にして、適切にプロセスパラメータを改善して実現することができる。類似の置換や修正は当業者にとって明らかであり、本発明に含まれるものとみなされることに留意されたい。本発明に係る酵素組成物及びその使用については、好ましい実施形態を通じて説明してきたが、当業者なら、本発明の内容、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書における酵素組成物及びその使用に対して修正又は適切な変更及び組み合わせを行うことで、本発明の技術を実現及び適用することができることは明らかである。

【0027】

本発明に記載されている合成方法及びその反応原理の概略図は、中心の反応経路を明確に説明するものであり、反応全体が一工程で行われるか複数工程で行われるかを限定するものではない。

【0028】

本発明で使用される各酵素は、配列に従って人工的に合成することもできるし、本発明で提供される方法に従ってプラスミドベクターを介して各酵素の発現遺伝子を搭載し、宿主細胞を介して発現を誘導することもできる。

【0029】

固定化を行う際、この分野の従来の固定化酵素の調製方法を参照することができる。本発明の具体的な実施形態において、本発明は、ＬＸ－１０００ＥＰエポキシ樹脂（ＳＵＮＲＥＳＩＮ Ｘｉ'ａｎ）で次の通りに１回的混合固定を行った。１Ｌのリン酸カリウム緩衝液（１Ｍ ｐＨ７．５）に上記のＰＮＰ純酵素液１００ｍｌ、ＮＲＫ純酵素液１０ｍｌを加えてよく混合し、８０ｇのＬＸ－１０００ＥＰエポキシ樹脂を加え、室温で８時間攪拌した後、樹脂をろ過し、２５ｍＭ ｐＨ８．０リン酸カリウム緩衝液で３回洗浄し、吸引濾過した後に固定化酵素を得た。この固定化酵素を測定したところ、ＰＮＰ酵素活力が８００Ｕ／ｇ、ＮＲＫ酵素活力が８０Ｕ／ｇであった。

【0030】

本発明のプロセスの反応経路における各反応物質の用量は、実際の状況に応じて調整すればよいが、效率を最大化するために、以下の各反応物質の濃度及び用量を採用することができる。ＰＮＰ酵素とＮＲＫ酵素の比率は、酵素活性として、ＰＮＰ：ＮＲＫの酵素活性比を１：（０．０１～１００）とし、好ましくは１：（０．１～１０）とする。アデノシンの基質濃度を１～１５０ｍＭ、ニコチンアミドの基質濃度を１～１５０ｍＭ、ＡＴＰの基質濃度を１ｍＭ～１５０ｍＭ、マグネシウムイオン又はマンガンイオンの濃度を５ｍＭ～２００ｍＭ、リン酸塩又はトリス緩衝液の濃度を５～２００ｍＭとする。

【0031】

反応過程における反応液のｐＨは６．５以上９．５以下の範囲、好ましくは７．０以上８．５以下の範囲に維持し、反応温度は２５℃以上５０℃以下の範囲、好ましくは３５℃以上４５℃以下の範囲に維持する。

【0032】

本発明の具体的な実施形態で使用される酵素に関する情報については、表１及び表２を参照のこと。

【0033】

【表1】

【0034】

【表2】

【実施例】

【0035】

以下、実施例を参照しながら本発明をさらに説明する。

【0036】

実施例１：
ＰＮＰ酵素の由来：ボス・タウルス（ウシ）
ＮＲＫ酵素の調製由来：インフルエンザ菌（ＡＴＣＣ ５１９０７）

【0037】

ＰＮＰ／ＮＲＫ酵素比１：１、３７℃、ｐＨ６．５、アデノシンの基質濃度が１５０ｍＭ、ニコチンアミドの基質濃度が１５０ｍＭ、ＡＴＰの基質濃度が１５０ｍＭ、マグネシウムイオンの濃度が２０ｍＭ、リン酸塩の濃度が２０ｍＭ、基質変換率が９０％であった。

【0038】

ＰＮＰ酵素の調製：ボス・タウルスに由来するＰＮＰ酵素は、タンバク質配列が表１に示され、対応するＤＮＡ遺伝子配列がコドン最適化後にＧｅｎｅｒａｌ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ａｎｈｕｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄによりインビトロで合成され、Ｎｄｅ Ｉ／Ｘｈｏ Ｉ酵素（ＮＥＢ社）により切断され、同じ酵素で切断されたｐＥＴ２８ａプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅから購入）に接続された。構築したプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ（ＤＥ３）菌株（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｗｅｉｄｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に移し、正しいと確認されたコロニーをカナマイシン１００ｕＭ含有ＬＢ培地に接種した。ただし、ＬＢ培地は、１％トリプトン、０．５％酵母粉末、１％ＮａＣｌ、１％リン酸水素二カリウム、１％リン酸二水素カリウム及び５％のグリセリンで構成された。細胞が対数期中期から後期まで増殖したら、０．２ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えて３０℃でタンパク質発現を５時間誘導し、遠心分離して湿菌体を収集した。

【0039】

ＮＲＫ酵素の調製：インフルエンザ菌ＡＴＣＣ ５１９０７菌株のＤＮＡをテンプレートとして抽出し、ＰＣＲによりＮａｄＲ遺伝子断片（ｇｅｎｂａｎｋ：ＮＺ＿ＣＰ００９６１０．１），（ＮａｄＲセンスプライマー：Ｆ：５’－ｃａｔａｔｇｃｇａｇｃｔａａｇｔａｔａａｃｇｃａａａａｔ－３’，ＮａｄＲアンチセンスプライマー：Ｒ：５’－ｃｔｃｇａｇｔｃａｔｔｇａｇａｔｇｔｃｃｃｔｔｔｔａｔａｇｇａａａｇｇｔ－３’，ＧＥＮＥＷＩＺ社により合成されたもの）を増幅し、この遺伝子断片に対応するタンバク質配列を表１に示す。増幅された遺伝子は、ＮＥＢ社から購入されたＮｄｅ Ｉ／Ｘｈｏ Ｉ酵素により切断し、同じ酵素で切断されたｐＥＴ２８ａプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅから購入）に接続した。構築したプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｗｅｉｄｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に移し、正しいと確認されたコロニーをカナマイシン１００ｕＭ含有ＬＢ培地に培養した。ただし、ＬＢ培地は、１％トリプトン、０．５％酵母粉末、１％ＮａＣｌ、１％リン酸水素二カリウム、１％リン酸二水素カリウム及び５％のグリセリンで構成された。細胞が対数期中期から後期まで増殖したら、０．２ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えて３０℃でタンパク質発現を５時間誘導し、遠心分離して湿細胞を収集した。

【0040】

上記ＰＮＰ酵素、ＮＲＫ酵素の各湿細胞 １００ｇをそれぞれ２０ｍＭトリスｐＨ７．５水溶液１０００ｍｌに再懸濁したものを高圧破砕してＰＮＰ酵素及びＮＲＫ酵素の粗酵素液を得た。ＰＮＰ酵素及びＮＲＫ酵素活性の測定には、従来技術に記載された公知の方法を使用し、特定の条件下で１分間以内に１マイクロモルの基質を変換するのに必要な酵素量を１活力単位（Ｕ）とした。本発明のＰＮＰ酵素の酵素活性は、１分間に１マイクロモルのアデノシンを転換してＤ－リボース－１－リン酸を生成するのに必要な酵素量を１活力単位（Ｕ）するように定義される。本発明のＮＲＫ酵素の酵素活性は、１分間に１マイクロモルのニコチンアミドリボシドを転換してβ－ニコチンアミドリボシドモノヌクレオチドを生成するのに必要な酵素量を１活力単位（Ｕ）とするように定義される。上記ＰＮＰ粗酵素液の酵素活力を７５Ｕ／ｍｌ、ＮＲＫ酵素活力を６００Ｕ／ｍｌと測定した。

【0041】

１Ｌ反応槽に１５０ｍＭ アデノシン、１５０ｍＭ ニコチンアミド、２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１５０ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭのｐＨ８．０のＰＢＳ緩衝液を加え、ｐＨ値を６．５に調整し、反応液の総体積を０．８Ｌとし、上記ＰＮＰの粗酵素液３２ｍｌを加え、上記ＮＲＫの粗酵素液４ｍｌを加え、３７℃で撹拌しかつｐＨ８．０を維持しながら８時間反応させ、ＮＭＮ １３５ｍＭ（４５．１ｇ／Ｌ）を生成した。基質変換率が９０％になった。反応液をろ過、クロマトグラフィーにより分離し、濃縮・結晶化して乾燥した後に、純粋なＮＭＮ ２７．１ｇを得た。ＮＭＮ生成物の純度が９９．２％、ＮＭＮ生成物の核磁気結果が次の通りである。¹H NMR(400 MHz, D₂O) δ 9.46 (s, 1H), 9.29 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 8.99 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 8.31 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 6.22 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 4.64 (s, 1H), 4.58-4.55 (m, 1H), 4.46-4.43 (m, 1H), 4.32-4.29 (m, 1H), 4.17-4.13 (m ,1H )。

【0042】

実施例２：
ＰＮＰ酵素１の由来：大腸菌（Ｋ１２株）
ＰＮＰ酵素２の由来：バチルス・クラウジ（ＫＳＭ－Ｋ１６株）
ＮＲＫ酵素の由来：ネズミチフス菌（ＡＴＣＣ ７００７２０）

【0043】

ＰＮＰ／ＮＲＫ酵素比１００：１、３５℃、ｐＨ８．５、アデノシンの基質濃度が１３５ｍＭ、ニコチンアミドの基質濃度が１３５ｍＭ、ＡＴＰの基質濃度が１３５ｍＭ、マグネシウムイオンの濃度が２００ｍＭ、トリス緩衝液の濃度が２０ｍＭ、基質変換率が９２％であった。

【0044】

ＰＮＰ酵素１の調製：大腸菌（Ｋ１２株）に由来するＰＮＰ酵素は、タンパク質配列が表１に示され、対応するＤＮＡ遺伝子配列がコドン最適化後にＧｅｎｅｒａｌ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ａｎｈｕｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄによりインビトロで合成された。そして、実施例１の方法に従って遺伝子組換え細菌を構築して菌体を培養し、遠心分離して湿菌体を収集した。

【0045】

ＰＮＰ酵素２の調製：バチルス・クラウジ（ＫＳＭ－Ｋ１６株）に由来するＰＮＰ酵素は、タンパク質配列が表１に示され、対応するＤＮＡ遺伝子配列が、コドン最適化後にＧｅｎｅｒａｌ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ａｎｈｕｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄによりインビトロで合成された。そして、実施例１の方法に従って遺伝子組換え細菌を構築して菌体を培養し、遠心分離して湿菌体を収集した。

【0046】

ＮＲＫ酵素の調製：ネズミチフス菌（ＡＴＣＣ ７００７２０）に由来するＮＲＫ酵素は、タンパク質配列が表１示され、対応するＤＮＡ遺伝子配列が、コドン最適化後にＧｅｎｅｒａｌ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ａｎｈｕｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄによりインビトロで合成された。そして、実施例１の方法に従って遺伝子組換え細菌を構築して菌体を培養し、遠心分離して湿菌体を収集した。

【0047】

上記ＰＮＰ酵素１、ＰＮＰ酵素２、ＮＲＫ酵素の各湿細胞 １００ｇをそれぞれ２０ｍＭトリスｐＨ７．５の水溶液１０００ｍｌに再懸濁したものを高圧破砕してＰＮＰ酵素１、ＰＮＰ酵素２及びＮＲＫ酵素の粗酵素液を得た。上記ＰＮＰ酵素１の粗酵素液の酵素活力を２００Ｕ／ｍｌ、ＰＮＰ酵素２の粗酵素液の酵素活力を５００Ｕ／ｍｌ、ＮＲＫ酵素活力を５０Ｕ／ｍｌと測定した。

【0048】

１Ｌ反応槽に１３５ｍＭアデノシン、１３５ｍＭニコチンアミド、２００ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１３５ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭトリス緩衝液を加え、ｐＨ値を８．５に調整し、反応液の総体積を０．８Ｌとし、上記ＰＮＰ酵素１の粗酵素液５０ｍｌ、ＰＮＰ酵素２の粗酵素液３０ｍｌ、上記ＮＲＫの粗酵素液５ｍｌを加え、３５℃で撹拌しかつｐＨ８．５を維持しながら２４時間反応させ、ＮＭＮ １２４．２ｍＭ（４１．５ｇ／Ｌ）を生成した。基質変換率が９２％になった。反応液をろ過、クロマトグラフィーにより分離し、濃縮・結晶化して乾燥した後に、純粋なＮＭＮ ２８．２ｇを得た。ＮＭＮ生成物の純度が９９．３％になった

【0049】

実施例３：
ＰＮＰ酵素の由来：バクテロイデス・フラジリス（ＡＴＣＣ ２５２８５株）
ＮＲＫ酵素の由来：類鼻疽菌Ｋ９６２４３
固定化酵素の形態
ＰＮＰとＮＲＫ酵素の割合（１０：１）

【0050】

ＰＮＰ／ＮＲＫ酵素比１０：１、４０℃、ｐＨ７．０、アデノシンの基質濃度が５０ｍＭ、ニコチンアミドの基質濃度が５０ｍＭ、ＡＴＰの基質濃度が８０ｍＭ、マンガンイオンの濃度が５ｍＭ、リン酸塩の濃度が２００ｍＭ、基質変換率が９１．１％であった。

【0051】

ＰＮＰ酵素の調製：バクテロイデス・フラジリス（ＡＴＣＣ ２５２８５株）に由来するＰＮＰ酵素は、タンパク質配列が表１に示され、対応するＤＮＡ遺伝子配列が、コドン最適化後にＧｅｎｅｒａｌ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ａｎｈｕｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄによりインビトロで合成された。そして、実施例１の方法に従って遺伝子組換え細菌を構築して菌体を培養し、遠心分離して湿菌体を収集した。

【0052】

ＮＲＫ酵素の調製：類鼻疽菌Ｋ９６２４３に由来するＮＲＫ酵素は、タンパク質配列が表１示され、対応するＤＮＡ遺伝子配列が、コドン最適化後にＧｅｎｅｒａｌ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ａｎｈｕｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄによりインビトロで合成された。そして、実施例１の方法に従って遺伝子組換え細菌を構築して菌体を培養し、遠心分離して湿菌体を収集した。

【0053】

上記収集したＰＮＰ酵素、ＮＲＫ酵素を含む菌体細胞を混合した後、それぞれ高圧破砕、遠心分離を経て粗タンパク質含有上清を収集した。上清をそれぞれニッケルイオンキレートアフィニティーカラム（Ｙｅａｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いて精製し、ＰＮＰ純酵素液及びＮＲＫ純酵素液を得た。ＰＮＰ純酵素液の活力が６８００Ｕ／ｍｌ、ＮＲＫ純酵素液の活力が６４００Ｕ／ｍｌであった。

【0054】

得られた純酵素液をＬＸ－１０００ＥＰエポキシ樹脂（ＳＵＮＲＥＳＩＮ）で次の通りに１回固定した。１Ｌのリン酸カリウム緩衝液（１Ｍ ｐＨ７．５）に上記ＰＮＰ純酵素液１００ｍｌ、ＮＲＫ純酵素液１０ｍｌを加えてよく混合し、８０ｇのＬＸ－１０００ＥＰエポキシ樹脂を加え、室温で８時間攪拌した後、樹脂をろ過し、２５ｍＭ ｐＨ８．０リン酸カリウム緩衝液で３回洗浄し、吸引濾過した後に固定化酵素を得た。この固定化酵素を測定したところ、ＰＮＰ酵素活力が８００Ｕ／ｇ、ＮＲＫ酵素活力が８０Ｕ／ｇであった。

【0055】

１Ｌ反応槽に５０ｍＭ アデノシン、５０ｍＭ ニコチンアミド、５ｍＭ ＭｎＣｌ₂、８０ｍＭ ＡＴＰ、２００ｍＭ ｐＨ７．０ ＰＢＳ緩衝液を加え、ｐＨ値を７．０に調整し、反応液の総体積を０．８Ｌとし、上記固定化酵素２０ｇを加え、４０℃で撹拌しかつｐＨ７．０を維持しながら８時間反応させ、ＮＭＮ ４５．５ｍＭ（１５．２ｇ／Ｌ）を生成した。基質変換率が９１．１％になった。反応液をろ過、クロマトグラフィーにより分離し、濃縮・結晶化して乾燥した後に、純粋なＮＭＮ ９．１２ｇを得た。ＮＭＮ生成物の純度が９９．２％になった

【0056】

実施例４：
ＰＮＰ酵素の由来：ネズミチフス菌（ＡＴＣＣ ７００７２０）
ＮＲＫ酵素の由来：類鼻疽菌Ｋ９６２４３精製酵素

【0057】

ＰＮＰ／ＮＲＫ酵素比１：１００、３５℃、ｐＨ７．５、アデノシンの基質濃度が１００ｍＭ、ニコチンアミドの基質濃度が１００ｍＭ、ＡＴＰの基質濃度が１００ｍＭ、マグネシウムイオンの濃度が２０ｍＭ、リン酸塩の濃度が５ｍＭ、基質変換率が９９％であった。

【0058】

ＰＮＰ酵素の調製：ネズミチフス菌（ＡＴＣＣ ７００７２０）に由来するＰＮＰ酵素は、タンパク質配列が表１に示され、対応するＤＮＡ遺伝子配列が、コドン最適化後にＧｅｎｅｒａｌ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ａｎｈｕｉ） Ｃｏ．，Ｌｔｄによりインビトロで合成された。そして、実施例１の方法に従って遺伝子組換え細菌を構築して菌体を培養し、遠心分離して湿菌体を収集した。実施例３の方法に従ってＰＮＰ純酵素液を調製し、ＰＮＰ純酵素液の活力が６２００Ｕ／ｍｌであった。

【0059】

１０００ｍｌ三角フラスコに１００ｍＭアデノシン、１００ｍＭニコチンアミド、２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１００ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ ｐＨ８．０ ＰＢＳ緩衝液を加え、ｐＨ値を８．０に調整し、反応液の総体積を５００ｍｌとし、上記のＰＮＰ純酵素液４．８ｍｌを加え、類鼻疽菌Ｋ９６２４３に由来するＮＲＫ純酵素液４６ｍｌを加え、３５℃で撹拌しかつｐＨ８．０を維持しながら２４時間反応させ、ＮＭＮ ９９ｍＭ（３０．０７ｇ／Ｌ）を生成した。基質変換率が９９％になった。反応液をろ過、クロマトグラフィーにより分離し、濃縮・結晶化して乾燥した後に、純粋なＮＭＮ １２．７ｇを得た。ＮＭＮ生成物の純度が９９．４％になった

【0060】

実施例５：
ＰＮＰ酵素の由来：エロモナス・ハイドロフィラ
ＮＲＫ酵素の由来：出芽酵母ＡＴＣＣ ２０４５０８
ＮＲＫ ＰＮＰ共発現＋全細胞触媒の形態（酵素活性比１：１）

【0061】

ＰＮＰ／ＮＲＫ酵素比１：１、３７℃、ｐＨ８．０、アデノシンの基質濃度が１３５ｍＭ、ニコチンアミドの基質濃度が１３５ｍＭ、ＡＴＰの基質濃度が１３５ｍＭ、マグネシウムイオンの濃度が２０ｍＭ、リン酸塩の濃度が２０ｍＭ、基質変換率が９２％であった。

【0062】

全細胞の調製：エロモナス・ハイドロフィラに由来するＰＮＰ酵素は、タンパク質配列が表１に示され、対応するＤＮＡ遺伝子配列が、コドン最適化後にＧｅｎｅｒａｌ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｎｈｕｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄによりインビトロで合成され、ＢａｍＨ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ酵素（ＮＥＢ社）により切断された。出芽酵母ＡＴＣＣ ２０４５０８に由来するＮＲＫ酵素は、タンパク質配列が表１に示され、対応するＤＮＡ遺伝子配列が、コドン最適化後にＧｅｎｅｒａｌ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ａｎｈｕｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄによりインビトロで合成され、ＢａｍＨ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ酵素（ＮＥＢ社）により切断された。酵素で切断された上記の二つの遺伝子をともに、同じ酵素で切断されたｐＲＳＦＤｕｅｔ－１プラスミド（ｂｉｏｆｅｎｇから購入）に接続した。構築したプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｗｅｉｄｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）に移し、正しいと確認されたコロニーをカナマイシン１００ｕＭ含有ＬＢ培地に培養した。ただし、ＬＢ培地は、１％トリプトン、０．５％酵母粉末、１％ＮａＣｌ、１％リン酸水素二カリウム、１％リン酸二水素カリウム及び５％のグリセリンで構成された。細胞が対数期中期から後期まで増殖したら、０．２ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えて３０℃でタンパク質発現を５時間誘導し、遠心分離して湿細胞を収集した。

【0063】

上記遠心分離した湿細胞を２０ｍＭ ｐＨ７．０ ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した後に再懸濁し、０．１５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を加えて低速で３０分間攪拌し、遠心分離して湿細胞を収集した。透過後の湿細胞を測定したところ、ＰＮＰ酵素活力が７５０Ｕ／ｇ、ＮＲＫ酵素活力が７５０Ｕ／ｇであった。

【0064】

１Ｌ反応槽に１３５ｍＭアデノシン、１３５ｍＭニコチンアミド、２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１３５ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ ｐＨ８．０のＰＢＳ緩衝液を加え、ｐＨ値を８．０に調整し、反応液の総体積を０．８Ｌとし、上記湿細胞３２ｇを加え、３７℃で撹拌しかつｐＨ８．０を維持しながら１２時間反応させ、ＮＭＮ １２４．２ｍＭ（４１．４８ｇ／Ｌ）を生成した。基質変換率が９２％になった。反応液をろ過、クロマトグラフィーにより分離し、濃縮・結晶化して乾燥した後に、純粋なＮＭＮ ２４．２２ｇを得た。ＮＭＮ生成物の純度が９９．１％になった

【0065】

実施例６：
ＰＮＰ酵素１の由来：デイノコッカス・ラディオデュランス（ＡＴＣＣ １３９３９株）
ＰＮＰ酵素２の由来：ホモ・サピエンス（ヒト）
ＮＲＫ酵素源：アッシビヤ・ゴシッピー（ＡＴＣＣ １０８９５株）
この実施例には、同じ酵素活性下で（１：０．５１８）、様々な形態の粗酵素、純酵素、固定化酵素の効果を比較した。

【0066】

ＰＮＰ酵素１／ＮＲＫ酵素比１：０．５１８、粗酵素、３７℃、ｐＨ８．０、アデノシンの基質濃度が１００ｍＭ、ニコチンアミドの基質濃度が１００ｍＭ、ＡＴＰの基質濃度が１００ｍＭ、マグネシウムイオンの濃度が２０ｍＭ、リン酸塩の濃度が２０ｍＭ、基質変換率が９０％であった。

【0067】

ＰＮＰ酵素１／ＮＲＫ酵素比１：０．５１８、純酵素、３７℃、ｐＨ８．０、アデノシンの基質濃度が１００ｍＭ、ニコチンアミドの基質濃度が１００ｍＭ、ＡＴＰの基質濃度が１００ｍＭ、マグネシウムイオンの濃度が２０ｍＭ、リン酸塩の濃度が２０ｍＭ、基質変換率が９５％であった。

【0068】

ＰＮＰ酵素１／ＮＲＫ酵素比１：０．５１８、固定化酵素、３７℃、ｐＨ８．０、アデノシンの基質濃度が１００ｍＭ、ニコチンアミドの基質濃度が１００ｍＭ、ＡＴＰの基質濃度が１００ｍＭ、マグネシウムイオンの濃度が２０ｍＭ、リン酸塩の濃度が２０ｍＭ、基質変換率が９４％であった。

【0069】

ＰＮＰ酵素１／ＮＲＫ酵素比１：０．５１８、固定化酵素、２５℃、ｐＨ９．５、アデノシンの基質濃度が１ｍＭ、ニコチンアミドの基質濃度が１ｍＭ、ＡＴＰの基質濃度が１ｍＭ、マグネシウムイオンの濃度が５ｍＭ、リン酸塩の濃度が５ｍＭ、基質変換率が９９％であった。

【0070】

ＰＮＰ酵素１／ＮＲＫ酵素比１：０．５１８、固定化酵素、４５℃、ｐＨ９．５、アデノシンの基質濃度が１ｍＭ、ニコチンアミドの基質濃度が１ｍＭ、ＡＴＰの基質濃度が１ｍＭ、マグネシウムイオンの濃度が５ｍＭ、リン酸塩の濃度が５ｍＭ、基質変換率が９９％であった。

【0071】

ＰＮＰ酵素１の調製：デイノコッカス・ラディオデュランス（ＡＴＣＣ １３９３９株）に由来するＰＮＰ酵素は、タンパク質配列が表１に示され、対応するＤＮＡ遺伝子配列が、コドン最適化後にＧｅｎｅｒａｌ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ａｎｈｕｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄによりインビトロで合成された。そして、実施例１の方法に従って遺伝子組換え細菌を構築して菌体を培養し、遠心分離して湿菌体を収集した。

【0072】

ＰＮＰ酵素２の調製：ホモ・サピエンス（ヒト）に由来するＰＮＰ酵素は、タンパク質配列が表１に示され、対応するＤＮＡ遺伝子配列が、コドン最適化後にＧｅｎｅｒａｌ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｎｈｕｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄによりインビトロで合成された。そして、実施例１の方法に従って遺伝子組換え細菌を構築して菌体を培養し、遠心分離して湿菌体を収集した。

【0073】

ＮＲＫ酵素の調製：アッシビヤ・ゴシッピー（ＡＴＣＣ １０８９５株）のＮＲＫ酵素は、タンパク質配列が表１に示され、対応するＤＮＡ遺伝子配列が、コドン最適化後にＧｅｎｅｒａｌ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ａｎｈｕｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄによりインビトロで合成された。そして、実施例１の方法に従って遺伝子組換え細菌を構築して菌体を培養し、遠心分離して湿菌体を収集した。

【0074】

上記ＰＮＰ酵素１湿細胞、ＰＮＰ酵素２湿細胞、ＮＲＫ酵素湿細胞をそれぞれ１００ｇ秤量し、それぞれ２０ｍＭトリスｐＨ７．５の水溶液１０００ｍｌに再懸濁したものを高圧破砕してＰＮＰ酵素の粗酵素液及びＮＲＫ酵素の粗酵素液を得た。上記ＰＮＰ酵素１の粗酵素液の酵素活力を４５０Ｕ／ｍｌ、ＰＮＰ酵素２の粗酵素液の酵素活力を５５０Ｕ／ｍｌ、ＮＲＫの粗酵素液の酵素活力を７６０Ｕ／ｍｌと測定した。

【0075】

上記方法に従って調製したＰＮＰ酵素１、ＮＲＫの粗酵素液から遠心分離により上清を収集した。この上清をそれぞれニッケルイオンキレートアフィニティーカラム（Ｙｅａｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）で精製し、ＰＮＰ酵素１純酵素液及びＮＲＫ純酵素液を得た。ＰＮＰ酵素１純酵素液の活力が４８００Ｕ／ｍｌ、ＮＲＫ純酵素液の活力が６７００Ｕ／ｍｌであった。

【0076】

得られた純酵素液をＬＸ－１０００ＥＰエポキシ樹脂（ＳＵＮＲＥＳＩＮ）で次の通りに１回固定した。２Ｌのリン酸カリウム緩衝液（１Ｍ ｐＨ７．５）に上記ＰＮＰ酵素１純酵素液５０ｍｌ、ＮＲＫ純酵素液４０ｍｌを加えてよく混合し、１６０ｇのＬＸ－１０００ＥＰエポキシ樹脂を加え、室温で８時間攪拌した後、樹脂をろ過し、２５ｍＭ ｐＨ８．０リン酸カリウム緩衝液で３回洗浄し、吸引濾過した後に固定化酵素を得た。この固定化酵素を測定したところ、ＰＮＰ酵素１の酵素活力が９８．４Ｕ／ｇ、ＮＲＫ酵素活力が１９０Ｕ／ｇであった。

【0077】

粗酵素形態（ＰＮＰ酵素１）：１Ｌ反応槽に１００ｍＭアデノシン、１００ｍＭニコチンアミド、２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１００ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ ｐＨ８．０ ＰＢＳ緩衝液を加え、ｐＨ値を８．０に調整し、反応液の総体積を０．８Ｌとした。上記調製したＰＮＰ酵素１の粗酵素液３５ｍｌ、ＮＲＫ粗酵素液４０ｍｌを加え、３７℃で撹拌しかつｐＨ８．０を維持しながら６時間反応させ、ＮＭＮ ９０ｍＭ（３０．０６ｇ／Ｌ）を生成した。基質変換率が９０％になった。反応液をろ過、クロマトグラフィーにより分離し、濃縮・結晶化して乾燥した後に、純粋なＮＭＮ １８．０４ｇを得た。ＮＭＮ生成物の純度が９９．１％になった

【0078】

粗酵素形態（ＰＮＰ酵素２）：１Ｌ反応槽に１００ｍＭアデノシン、１００ｍＭニコチンアミド、２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１００ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ ｐＨ８．０のＰＢＳ緩衝液を加え、ｐＨ値を８．０に調整し、反応液の総体積を０．８Ｌとした。上記調製したＰＮＰ酵素２の粗酵素液２８．８ｍｌ、ＮＲＫ粗酵素液４０ｍｌを加え、３７℃で撹拌しかつｐＨ８．０を維持しながら６時間反応させ、ＮＭＮ １ｍＭ（０．３３ｇ／Ｌ）を生成した。基質変換率が１％になった。基質変換率は低すぎて、純粋な生成物は得られなかった。

【0079】

第１ステップの反応のみを完了できるが第２ステップの反応を完了できないＰＮＰ酵素２を使用した。その結果から、反応が第１ステップまでしか進行できなかったこと、又は効率が非常に低かったことが確認された。また、これから、ニコチンアミドリボシドの生成過程には、所定のＰＮＰ酵素が必要であることが示された。

【0080】

純酵素形態（ＰＮＰ酵素１）：１Ｌ反応槽に１００ｍＭアデノシン、１００ｍＭニコチンアミド、２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１００ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ ｐＨ８．０ ＰＢＳ緩衝液を加え、ｐＨ値を８．０に調整し、反応液の総体積を０．８Ｌとした。上記調製したＰＮＰ酵素１の純酵素液３．２８ｍｌ、ＮＲＫ純酵素液４．５３ｍｌを加え、３７℃で撹拌しかつｐＨ８．０を維持しながら５時間反応させ、ＮＭＮ ９５ｍＭ（３１．７３ｇ／Ｌ）を生成した。基質変換率が９５％になった。反応液をろ過、クロマトグラフィーにより分離し、濃縮・結晶化して乾燥した後に、純粋なＮＭＮ ２０．０５ｇを得た。ＮＭＮ生成物の純度が９９．４％になった

【0081】

固定化酵素形態（ＰＮＰ酵素１）：１Ｌ反応槽に１００ｍＭアデノシン、１００ｍＭニコチンアミド、２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１００ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ ｐＨ８．０ ＰＢＳ緩衝液を加え、ｐＨ値を８．０に調整し、反応液の総体積を０．８Ｌとした。上記調製したＰＮＰ酵素１、ＮＲＫ固定化酵素１６０ｇを加え、３７℃で撹拌しかつｐＨ８．０を維持しながら５．５時間反応させ、ＮＭＮ ９４ｍＭ（３１．３９ｇ／Ｌ）を生成した。基質変換率が９４％になった。反応液をろ過、クロマトグラフィーにより分離し、濃縮・結晶化して乾燥した後に、純粋なＮＭＮ １９．８ｇを得た。ＮＭＮ生成物の純度が９９．４％になった

【0082】

固定化酵素形態（ＰＮＰ酵素１、２５℃）：１Ｌ反応槽に１ｍＭアデノシン、１ｍＭニコチンアミド、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ｐＨ８．０のＰＢＳ緩衝液を加え、ｐＨ値を９．５に調整し、反応液の総体積を０．８Ｌとした。上記調製したＰＮＰ酵素１、ＮＲＫ固定化酵素１６０ｇを加え、２５℃で撹拌しかつｐＨ９．５を維持しながら５．５時間反応させ、ＮＭＮ ０．９９ｍＭ（０．３３ｇ／Ｌ）を生成した。基質変換率が９９％になった。反応液をろ過、クロマトグラフィーにより分離し、濃縮・結晶化して乾燥した後に、純粋なＮＭＮ ０．１３ｇを得た。ＮＭＮ生成物の純度が９９．４％になった

【0083】

固定化酵素形態（ＰＮＰ酵素１、４５℃）：１Ｌ反応槽に１ｍＭ アデノシン、１ｍＭ ニコチンアミド、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ｐＨ８．０のＰＢＳ緩衝液を加え、ｐＨ値を９．５で調整し、反応液の総体積を０．８Ｌとした。上記調製したＰＮＰ酵素１、ＮＲＫ固定化酵素１６０ｇを加え、４５℃で撹拌しかつｐＨ９．５を維持しながら０．５時間反応させ、ＮＭＮ ０．９９ｍＭ（０．３３ｇ／Ｌ）を生成した。基質変換率が９７％になった。反応液をろ過、クロマトグラフィーにより分離し、濃縮・結晶化して乾燥した後に、純粋なＮＭＮ ０．１３ｇを得た。ＮＭＮ生成物の純度が９９．４％になった

【0084】

上記は、本発明の好ましい実施形態にすぎず、当業者にとって、本発明の原理から逸脱することなく、いくつかの改良及び修正を行い得る。これらの改良及び修正も本発明の保護範囲に入るべきであることに留意されたい。

【配列表】

2024515083000001.app

【国際調査報告】