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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-04
(54)【発明の名称】官能化生体触媒組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20240328BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240328BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20240328BHJP
A61K 38/38 20060101ALI20240328BHJP
A61K 31/77 20060101ALI20240328BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240328BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20240328BHJP
A61K 47/04 20060101ALI20240328BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61P35/00
A61K38/02
A61K38/38
A61K31/77
A61K39/395 V
A61K39/395 Y
A61K47/42
A61K47/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023564674
(86)(22)【出願日】2022-04-21
(85)【翻訳文提出日】2023-12-14
(86)【国際出願番号】 EP2022060562
(87)【国際公開番号】W WO2022223699
(87)【国際公開日】2022-10-27
(31)【優先権主張番号】21169848.5
(32)【優先日】2021-04-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】22151420.1
(32)【優先日】2022-01-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523396901
【氏名又は名称】ペルセオ ファーマ アーゲー
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ラプレヴォット， エミリー
(72)【発明者】
【氏名】デュダル， イヴ ヴィクトール ルネ
(72)【発明者】
【氏名】ブリオン， マノン
(72)【発明者】
【氏名】カルリーニ， エマニュエル
(72)【発明者】
【氏名】シャハガルディアン， パトリック
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076DD29
4C076DD29A
4C076EE41Q
4C076FF70
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA17
4C084BA03
4C084DA37
4C084NA03
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C085AA33
4C085BB42
4C085EE01
4C086AA01
4C086AA02
4C086FA02
4C086MA03
4C086MA05
4C086NA03
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB26
(57)【要約】
本発明は、固体担体と、固体担体の表面に固定化されている酵素と、酵素を包埋することによって、酵素を保護する保護層と、保護層の表面に固定化されている機能性成分とを含む組成物に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組成物であって、固体担体と、固体担体の表面に固定化されている酵素またはその断片と、酵素またはその断片を包埋することによって、酵素またはその断片を保護する保護層と、保護層の表面に固定化されている機能性成分とを含む、組成物。
【請求項2】
組成物が対象に投与される場合、保護層の表面に固定化されている機能性成分が、ｉ）組成物の食作用を減少させ、ｉｉ）組成物の循環時間を増加させ、かつ／またはｉｉｉ）腫瘍を標的とし、かつ／もしくは組成物の腫瘍細胞への内部移行を促進する、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
保護層の表面に固定化されている機能性成分が、両親媒性薬物、アミノ酸、ペプチド、タンパク質またはその断片、シラン共重合体、ならびにタンパク質またはその断片とシラン共重合体との組み合わせからなる群から選択され、ただし、タンパク質またはその断片が、固体担体の表面に固定化されている酵素またはその断片ではない、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
機能性成分が、共有結合によって保護層の表面に固定化されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
機能性成分が、血清アルブミンまたはその断片；血清アルブミンまたはその断片およびポリエチレングリコール／シラン共重合体；ポリエチレングリコール／シラン共重合体；免疫グロブリンのＦｃ断片；ならびに免疫グロブリンのＦｃ断片および架橋剤からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項6】
機能性成分が、ポリエチレングリコール／シラン共重合体、好ましくはｍシラン－ＰＥＧ ２ｋＤａまたはｍシラン－ＰＥＧ ５ｋＤａである、請求項１に記載の組成物。
【請求項7】
機能性成分が、血清アルブミンまたはその断片である、請求項１に記載の組成物。
【請求項8】
機能性成分が、ペプチド；ペプチドおよび架橋剤；免疫グロブリンまたはその断片；ならびに免疫グロブリンまたはその断片および架橋剤からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項9】
酵素またはその断片が、ヒドロラーゼまたはその断片である、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
酵素またはその断片が、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒｉｇｉｎａｓｅ）またはその断片である、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項11】
保護層が、固体担体を包埋し、固体担体の表面に固定化されている酵素またはその断片を包埋する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項12】
保護層の表面に固定化されている機能性成分が、保護層によって包埋されていない、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項13】
組成物が、キレート剤をさらに含み、キレート剤が、任意選択的に、放射性標識または発光性標識を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項14】
医薬として使用するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項15】
対象におけるがんを予防、進行の遅延または処置する方法において使用するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物であって、方法が、前記組成物を対象に投与することを含み、組成物が、対象を処置するのに十分な量で投与される、組成物。
【請求項16】
対象における組成物の分布を測定する方法において使用するための、請求項１３に記載の組成物。
【請求項17】
組成物を生成する方法であって、組成物が、固体担体と、固体担体の表面に固定化されている酵素またはその断片と、酵素またはその断片を包埋することによって、酵素またはその断片を保護する保護層と、保護層の表面に固定化されている機能性成分とを含み、方法が、以下の工程：（ａ）固体担体を提供する工程と、
（ｂ）酵素またはその断片を固体担体に固定化する工程と、
（ｃ）固体担体の表面に保護層を形成して、固体担体に固定化されている酵素またはその断片を保護する工程と、
（ｄ）保護層の表面に機能性成分を固定化する工程と、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、固体担体と、固体担体の表面に固定化されている酵素またはその断片と、酵素またはその断片を包埋することによって、酵素またはその断片を保護する保護層と、保護層の表面に固定化されている機能性成分とを含む組成物に関する。本発明はまた、前記組成物を生成する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
酵素などのタンパク質は、例えば工業用途、診断、または治療的使用で頻繁に必要とされる。タンパク質を安定化するために、かつ／または様々なタイプのストレスに対する耐性を提供するために、タンパク質を担体の表面に固定化し、それらを保護材料の層で保護することが先行技術において示唆されている。そのような手法は、例えば、固体担体、酵素および酵素を包埋することによって、酵素を保護するための保護層を含む生体触媒組成物、ならびにそのような生体触媒組成物を生成する方法を開示する国際公開第２０１５／０１４８８８号パンフレットに記載されている。しかしながら、例えば国際公開第２０１５／０１４８８８号パンフレットに記載されているような生体触媒組成物は、それらの生体適合性およびバイオアベイラビリティの欠如のために治療用途に使用することができない。したがって、治療用途に適合し、有用な生体触媒組成物を提供する必要がある。
【発明の概要】
【0003】
本発明は、固体担体と、固体担体の表面に固定化されている酵素またはその断片と、酵素またはその断片を包埋することによって、酵素またはその断片を保護する保護層と、保護層の表面に固定化されている機能性成分とを含む組成物を提供する。
【0004】
本発明はまた、
固体担体と、固体担体の表面に固定化されている酵素またはその断片と、酵素またはその断片を包埋することによって、酵素またはその断片を保護する保護層と、保護層の表面に固定化されている機能性成分とを含む前記組成物を生成する方法であって、方法が以下の工程：
（ａ）固体担体を提供する工程と、
（ｂ）酵素またはその断片を固体担体に固定化する工程と、
（ｃ）固体担体の表面に保護層を形成して、固体担体に固定化されている酵素またはその断片を保護する工程と、
（ｄ）保護層の表面に機能性成分を固定化する工程と、を含む、方法を提供する。
固体担体と、固体担体の表面に固定化されている酵素またはその断片と、酵素またはその断片を包埋することによって、酵素またはその断片を保護する保護層と、保護層の表面に固定化されている機能性成分とを含む前記組成物を生成する方法であって、方法が以下の工程：
（ａ）固体担体を提供する工程と、
（ｂ）酵素またはその断片を固体担体に固定化する工程と、
（ｃ）固体担体の表面に保護層を形成して、固体担体に固定化されている酵素またはその断片を保護する工程と、
（ｄ）保護層の表面に機能性成分を固定化する工程と、を含む、方法を提供する。
【0005】
驚くべきことに、本出願の発明者らは、治療的に適用された場合、本発明によって提供される組成物が、免疫原性が低いまたは免疫原性がないことを示唆する予想外の低い抗酵素抗体応答を有し、低い細胞傷害性を示し、溶血性ではなく、血液中で速いクリアランスを示し、したがって治療的使用に極めて有望であることを見出した。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1】本発明の組成物を生成するプロセスの概略図である：ａ）酵素または断片は、固体担体に固定化される；ｂ）およびｃ）固定化酵素またはその断片を包埋する保護層が固定化酵素またはその断片の周囲に成長する；ｄ）保護層の表面に機能性成分が固定化される。
【図2】ＰＥＧによるナノ粒子の官能化を示す図である。遮蔽ナノ粒子（ＮＰ－１）を、４００ｒｐｍで撹拌しながら２０℃で１時間、シラン－ＰＥＧ－ＦＩＴＣと反応させた。ヒストグラムは、遮蔽ナノ粒子および反応ナノ粒子の蛍光強度（ｌｅｘ：４８９ｎｍ；ｌｅｍ：５１５ｎｍ）を表す。
【図3】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）によるナノ粒子の官能化を示す図である。 遮蔽ナノ粒子を、４００ｒｐｍで撹拌しながら２０℃で１時間、ＨＳＡとインキュベートした。ヒストグラムは、ＨＳＡの初期溶液と比較した、反応後のナノ粒子の上清中のＨＳＡのローリータンパク質定量化を表す。
【図4】クリックケミストリーによるナノ粒子の官能化を示す図である。 エチニルナノ粒子を、４００ｒｐｍで撹拌しながら２０℃で６時間、Ｎ３－ＦＩＴＣとインキュベートした。 ヒストグラムは、ナノ粒子に固定化されている遊離Ｎ３－ＦＩＴＣおよびＮ３－ＦＩＴＣの蛍光偏光を表す（ｌｅｘ：４８９ｎｍ；ｌｅｍ：５１５ｎｍ）。
【図5】遊離酵素と比較したＮＰ－１の持続的な活性を示す図である。ＮＰ－１について酵素活性を測定し、１３週間の期間にわたって等価量の遊離酵素と比較した。データ値を０日目の対照のパーセンテージとして表す。
【図6】生体液中のＮＰ－１の持続的な活性を示す図である。生体液中のＮＰ－１の酵素活性を評価し、リン酸バッファー中のその活性と比較した。活性データ値は、リン酸バッファー中の対照のパーセンテージとして表す。
【図7】ＮＰ－１に対するより低いＡｂ－酵素結合を示す図である。ＥＬＩＳＡを、ナノ粒子の発達の異なる段階で評価した。ＥＬＩＳＡデータを酵素濃度（ｍｇ／ｍＬ）として表す。
【図8】タンパク質分解酵素に対する耐性を示す図である。ＮＰ－１、部分的に遮蔽された酵素および遊離酵素をプロテアーゼ（１０ｍｇ／ｍＬ）に２０時間曝露した。酵素活性データ値は、ｔ０での対照のパーセンテージとして表す。
【図9】ＬＤＨアッセイによるＮＰ－１の細胞傷害性評価を示す図である。ＨｅｐＧ２を、漸増濃度の酵素不活性化ナノ粒子に４８時間曝露した。乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）アッセイを使用して、細胞損傷を評価した。ＮＰ－１の細胞傷害性データ値を、トリトン（１ｍｇ／ｍＬ）で処理した対照細胞のパーセンテージとして表す。
【図10A-B】ＮＰ－１の溶血評価を示す図である。全血を漸増濃度のＮＰ－１と３７℃で３時間インキュベートし、試料を３０分ごとに混合した。（Ａ）写真は、８００ｇで１５分間遠心分離した後の試料を示す。（Ｂ）ヒストグラムは、総血中ヘモグロビン（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｅ）と比較したナノ粒子処理試料の溶血のパーセンテージを表す：トリトン（１０ｍｇ／ｍＬ）およびＰＢＳをそれぞれポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして使用した。
【図11A-B】ナノ粒子の生体内分布を示す図である。ＮＰ－１－Ｄ（Ａ－Ｃ）およびＮＰ－２－Ｄ（Ｂ－Ｄ）を動物に静脈内注射した。臓器／組織（Ｃ－Ｄ）中の血液（Ａ～Ｂ）中に回収されたＩＤのパーセント（％ ＩＤ／ｇ）を異なる最終時点で計算した。
【図11C-D】ナノ粒子の生体内分布を示す図である。ＮＰ－１－Ｄ（Ａ－Ｃ）およびＮＰ－２－Ｄ（Ｂ－Ｄ）を動物に静脈内注射した。臓器／組織（Ｃ－Ｄ）中の血液（Ａ－Ｂ）中に回収されたＩＤのパーセント（％ ＩＤ／ｇ）を異なる最終時点で計算した。
【図12A】ＮＰ－２の抗腫瘍効果を示す図である。（Ａ）ＰＡＮＣ－１、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＪＨＨ－５細胞を、漸増濃度の遊離アスパラギナーゼ、ＮＰ－２および不活性化ＮＰ－２に４８時間曝露した。細胞生存率を、ＭＴＴアッセイを使用して評価した。生存率データは、トリトン（１ｍｇ／ｍＬ）で処理した対照細胞のパーセンテージとして表す。
【図12B】ＮＰ－２の抗腫瘍効果を示す図である。（Ｂ）酵素活性を、遊離アスパラギナーゼおよびＮＰ－２について４８時間にわたって測定した。ネスラー反応を使用して活性を測定した。
【図13】ＰＢＭＣの増殖を示す図である。新鮮分離したＰＢＭＣをＣＦＳＥで標識し、漸増濃度のＮＰ－１およびＮＰ－２（０～１０００ｕｇ／ｍＬ）またはＰＨＡ（１０ｕｇ／ｍＬ）に７２時間曝露した。ヒストグラムは、フローサイトメトリーによって決定された増殖細胞のパーセンテージを示す。
【図14】がん細胞標的化ナノ粒子の抗腫瘍効果を示す図である。（Ａ）ＲＡＪＩ細胞を蛍光性ＮＰ－１または蛍光性ＮＰ－５と氷上で３０分間インキュベートした。 がん細胞上のＮＰ－１およびＮＰ－５それぞれの特異的結合をフローサイトメトリーによって評価した。ヒストグラムは、細胞の蛍光強度を表す。（Ｂ）ＲＡＪＩ細胞を、漸増濃度の遊離アスパラギナーゼ、ＮＰ－１、ＮＰ－１不活性化またはＮＰ－５に４８時間曝露した。細胞生存率を、ＭＴＴアッセイを使用して評価した。生存率データは、トリトン（１ｍｇ／ｍＬ）で処理した対照細胞のパーセンテージとして表す。
【発明を実施するための形態】
【0007】
本発明は、固体担体と、固体担体の表面に固定化されている酵素またはその断片と、酵素またはその断片を包埋することによって、酵素またはその断片を保護する保護層と、保護層の表面に固定化されている機能性成分とを含む組成物に関する。
【0008】
本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、必要に応じて、単数形で使用される用語は、複数形も含み、その逆も同様である。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことを理解されたい。
【0009】
本発明の特定の態様、実施形態または実施例に関連して記載される特徴、整数、特性、化合物は、それと矛盾しない限り、本明細書に記載される任意の他の態様、実施形態または実施例に適用可能であると理解されるべきである。本明細書（添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）に開示された特徴のすべて、および／またはそのように開示された任意の方法もしくはプロセスの工程のすべては、そのような特徴および／または工程のうちの少なくともいくつかが相互に排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本発明は、任意の前述の実施形態の詳細に限定されない。
【0010】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語およびその変形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、一般に、含むという意味で、すなわち「含むが限定されない」、すなわち１つ以上の特徴または構成要素の存在を可能にするものとして使用される。
【0011】
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、内容が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。
【0012】
「約」という用語は、指定された値の±１０％の値の範囲を指す。例えば、「約２００」という語句は、２００の±１０％、または１８０～２２０を含む。
【0013】
本明細書で使用される「固体担体」という用語は、通常、粒子を指す。好ましくは、固体担体は、単分散粒子または多分散粒子であり、より好ましくは単分散粒子である。固体担体は、通常、有機粒子、無機粒子、有機－無機粒子、自己集合性有機粒子、シリカ粒子、金粒子、チタン粒子を含み、好ましくはシリカ粒子、より好ましくはシリカナノ粒子（ＳＮＰ）である。固体担体の粒径は、通常１ｎｍ～１０００μｍ、好ましくは１０ｎｍ～１００μｍ、特に約５０ｎｍである。
【0014】
本明細書で同義的に使用される「リンカー」または「架橋剤」という用語は、特定の官能基（例えば、第一級アミン、スルフヒドリルなど）に結合することができる基を含有する任意の連結試薬を指す。本発明の文脈におけるリンカーは、通常、固体担体の表面を酵素と接続する。例えば、リンカーを固体担体の表面、例えば担体材料としてのシリカ表面に固定化し、次いで酵素をリンカーの非占有結合部位に結合させ得る。あるいは、リンカーは、最初に酵素に結合し、次いで酵素に結合したリンカーは、その非占有結合部位で固体担体に結合し得る。様々なタイプのリンカーが当技術分野で既知であり、これらには、タグとして当技術分野で既知の直鎖または分岐鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、ペプチドリンカー、ポリエーテルリンカーおよびリンカーが含まれるが、これらに限定されない。
【0015】
本明細書で使用される「保護層」という用語は、固体担体の表面に固定化されている酵素の機能的特性を保護するための層を指す。本発明の保護層は、通常、ビルディングブロックを用いて構築され、その少なくとも一部は、通常、共有結合によって互いに相互作用することができるモノマーであり、通常、非共有結合によって固定化酵素と相互作用することができるモノマーである。保護層は、通常、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％の酵素またはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片が保護層に包埋された均一な層である。
【0016】
「酵素またはその断片」という用語は、天然に存在する酵素またはその断片を含み、人工的に操作された酵素またはその断片も含む。人工的に操作された酵素またはその断片は、例えば、酵素のバリアントまたは機能的に活性な断片である。本発明の酵素に関して「そのバリアントまたは機能的に活性な断片」とは、断片またはバリアント（アナログ、誘導体または変異体など）が酵素と同じ生理的機能を発揮することができることを意味する。そのようなバリアントには、天然に存在する対立遺伝子バリアントおよび天然に存在しないバリアントが含まれる。修飾が断片またはバリアントの機能活性の喪失をもたらさない限り、アミノ酸のうちの１つ以上の付加、欠失、置換および誘導体化が企図される。好ましくは、機能的に活性な断片またはバリアントは、酵素の関連部分に対して少なくとも約８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性を有する。
【0017】
本明細書において、「部分的に酵素が包埋されている」とは、保護層によって酵素が完全に覆われておらず、したがって、保護層に酵素が完全に包埋されていないことを意味するものとする。一実施形態では、目的の酵素の５０％未満が保護層によって覆われるが、典型的には少なくとも７０％以上が覆われ、したがって酵素の保護が改善される。好ましい実施形態では、目的の酵素の少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が保護層によって覆われている。別の好ましい実施形態では、目的の酵素の約７０％～約９５％、より好ましくは約８０％～約９５％、さらにより好ましくは約９０％～約９５％、最も好ましくは約９０％～約９５、９６、９７、９８または９９％が保護層によって覆われている。特に好ましい実施形態では、目的の酵素の約７０％、特に約８０％、より具体的には約９０％、最も具体的には約９５％が保護層によって覆われている。より特に好ましい実施形態では、目的の酵素の約７０％、特に約８０％、より特に約９０％、最も特に約９５％が保護層によって覆われており、活性部位は覆われていない。
【0018】
本明細書で使用される「完全に包埋された酵素」という用語は、本発明による目的の酵素が完全に、すなわち保護層によって１００％覆われていること、すなわち活性部位も覆われていることを意味するものとする。
【0019】
本明細書で使用される「少なくとも部分的に包埋された酵素」という用語は、酵素が少なくとも部分的に包埋され、保護層によって完全に包埋され得ることを意味するものとする。したがって、「少なくとも部分的に包埋された酵素」は、保護層が酵素またはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片の約３０％～１００％、好ましくは約５０％～約１００％、より好ましくは約８０％～約１００％、さらにより好ましくは約９０％～約１００％、最も好ましくは約９５％～約１００％を覆い、活性部位が好ましくは覆われていることを意味する。
【0020】
本明細書で使用される「機能性成分」という用語は、保護層の表面に固定化された後、その特性、機能的特性を保持する成分を指す。本発明の意味における機能性成分は、例えば、両親媒性薬物、アミノ酸、ペプチド、タンパク質もしくはその断片、シラン共重合体またはタンパク質もしくはその断片とシラン共重合体との組み合わせであり得るが、ただし、タンパク質またはその断片は、固体担体の表面に固定化されている酵素またはその断片ではない。
【0021】
本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、隣接する残基のアルファ－アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに接続された一連のアミノ酸残基を示し、通常、少なくとも１０個のアミノ酸と１００個以下のアミノ酸との間を含むアミノ酸配列を有する。
【0022】
本明細書で使用される「タンパク質またはその断片」という用語は、通常１００～１５００個のアミノ酸、好ましくは１００～８００個のアミノ酸、より好ましくは１００～５００個のアミノ酸を含有する。本明細書で定義されるタンパク質の断片は、通常、それが由来するタンパク質と同じ機能的特性を有する。
【0023】
「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書では「抗体」とも同義的に呼ばれ、一般に、４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含み、したがって、多量体タンパク質またはその等価なＩｇホモログ（例えば、重鎖または軽鎖のいずれかに由来し得る重鎖単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）のみを含むラクダ科のナノボディ）であり；完全長機能性変異体、そのバリアントまたは誘導体（限定されないが、Ｉｇ分子の必須エピトープ結合特徴を保持するマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体を含み、デュアル特異性免疫グロブリン、二重特異性免疫グロブリン、多重特異性免疫グロブリンおよび二重可変ドメイン免疫グロブリンを含む）を含み；免疫グロブリン分子は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌおよびＩｇＡ２）ならびにアロタイプであり得る。
【0024】
本明細書で使用される「免疫グロブリン断片」は、単独または任意の組み合わせで、（ｉ）可変軽鎖（ＶＬ）、可変重鎖（ＶＨ）、定常軽鎖（ＣＬ）および定常重鎖１（ＣＨＩ）ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨａｎｄ ＣＨ１ドメインからなるＦａｂ（Ｆａ）断片の重鎖部分；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬａｎｄ ＶＨドメインからなる可変断片（Ｆｖ）断片、（ｖ）単一可変ドメインを含むドメイン抗体（ｄＡｂ）断片；（ｖｉ）分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；（ｖｉｉｉ）ＶＨａｎｄ ＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによってドメインを別の鎖の相補性ドメインとペアリングさせ、２つの抗原結合部位を作り出す二価二重特異性抗体であるダイアボディ；ならびに（ｉｘ）相補性軽鎖ポリペプチドと一緒になって、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む直鎖状抗体；（ｘ）ナノボディならびに（ｘｉ）免疫グロブリン重鎖および／もしくは軽鎖の他の非完全長部分、またはその変異体、バリアントもしくは誘導体、を含むが、これらに限定されない、完全長ではない抗体に由来する少なくとも１つのポリペプチド鎖を含む分子に関する。好ましい免疫グロブリンは、抗ＣＤ１９抗体、特にヒトモノクローナル抗ＣＤ１９抗体である。
【0025】
第１の態様では、本発明は、固体担体と、固体担体の表面に固定化されている酵素またはその断片と、酵素またはその断片を包埋することによって、酵素またはその断片を保護する保護層と、保護層の表面に固定化されている機能性成分とを含む組成物を提供する。
【0026】
酵素は、非共有結合または共有結合によって固体担体の表面に固定化することができる。非共有結合には、ｐ－ｐ（芳香族）相互作用、ファンデルワールス相互作用、Ｈ結合相互作用、およびイオン相互作用が含まれる。好ましくは、酵素は、共有結合またはリンカーを介した共有結合によって固体担体の表面に固定化される。
【0027】
一実施形態では、固体担体は、有機粒子、無機粒子、有機－無機粒子、自己集合性有機粒子、シリカ粒子、金粒子、チタン粒子の群から選択され、好ましくはシリカ粒子、より好ましくはシリカナノ粒子（ＳＮＰ）である。粒径は、通常、粒子の直径を測定することによって測定され、通常、１ｎｍ～１０００ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ～１００ｎｍ、特に約５０ｎｍである。固体担体が単分散粒子である場合、サイズは、通常、１ｎｍ～１０００ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ～１００ｎｍ、特に約５０ｎｍである。固体担体が多分散粒子である場合、サイズは、通常、１ｎｍ～１０００μｍ、好ましくは１０ｎｍ～１００μｍ、特に５０ｎｍ～５０μｍである。
【0028】
通常、単分散粒子または多分散粒子、好ましくは単分散粒子が本発明における固体担体として使用される。好ましい実施形態では、単分散粒子は、球状単分散粒子である。さらに好ましい実施形態では、多分散粒子は、非球状多分散粒子である。
【0029】
固体担体は、通常、懸濁状態で提供される。固体担体の懸濁液は、例えば、水、バッファーもしくは非イオン性界面活性剤またはそれらの混合物、好ましくは水と非イオン性界面活性剤との混合物であり得る。本発明の方法において使用され得るバッファーは、ホスフェート、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）、２－ヒドロキシ－３－モルホリノプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ－ビス［２－ヒドロキシエチル］－２－アミノエタンスルホン酸）、（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）、２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、３－（Ｎ，Ｎ－ビス［２－ヒドロキシエチル］アミノ）－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－３－アミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、ジグリシン、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］－３－アミノプロパンスルホン酸、Ｎ－（１，１－ジメチル－２－ヒドロキシエチル）－３－アミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸である。
【0030】
一実施形態では、固体担体の表面は、アンカーポイントとして、すなわち酵素または酵素を固体担体に接続するリンカーのアンカーポイントとして分子または官能性化学基を導入するように修飾される。好ましくは、前記アンカーポイントは、アミン官能性化学基または部分である。非限定的な例として、固体担体のアミノ修飾表面、例えばアミノ修飾シリカ表面は、修飾固体担体として使用され得る。固体担体のこのようなアミノ修飾表面は、シリカ表面を有する固体担体をアミノシラン、例えばＡＰＴＥＳと反応させることによって得られ得る。したがって、好ましい実施形態では、固体担体は、アミノ修飾表面を有するシリカ表面を有する固体担体、より好ましくはシリカ表面を有する固体担体をアミノシラン、例えばＡＰＴＥＳと反応させることによって得られる固体担体である。そのような修飾担体は、担体材料の表面で酵素とアミン基との間にアミド結合を形成してもよく、または担体材料の表面でリンカーとアミン基との間にアミド結合を形成してもよい。一実施形態では、アンカーポイントとして導入された分子または官能性化学基は、固体担体の表面上に均一に分配されている。好ましくは、固体担体の表面は、部分的にのみアミノ修飾されている。したがって、好ましい実施形態では、固体担体は、アミノ修飾表面を有するシリカ表面を有する固体担体、より好ましくはシリカ表面を有する固体担体をアミノシラン、例えばＡＰＴＥＳと反応させることによって得られる固体担体、さらにより好ましくはシリカ表面を部分的に有する固体担体をアミノシラン、例えばＡＰＴＥＳと反応させることによって得られる固体担体である。
【0031】
いくつかの実施形態では、保護層は、約１～約２００ｎｍ、通常１～約１００ｎｍ、好ましくは約１～約５０ｎｍ、より好ましくは約１～約２５ｎｍ、さらにより好ましくは約１～約２０ｎｍ、特に約１～約１５ｎｍの規定の厚さを有する。最も好ましい規定の厚さは、約１～約１５ｎｍである。いくつかの実施形態では、層は、約５～約１００ｎｍ、好ましくは約５～約５０ｎｍ、より好ましくは約５～約２５ｎｍ、さらにより好ましくは約５～約２０ｎｍ、特に約５～約１５ｎｍの規定の厚さを有する。最も好ましい規定の厚さは、約５～約１５ｎｍである。保護層は、通常、多孔質であり、孔径は、１～１００ｎｍ、好ましくは１～２０ｎｍである。
【0032】
一実施形態では、酵素またはその断片は、保護層によって部分的に包埋される。別の実施形態では、酵素またはその断片は、保護層によって完全に包埋される。好ましい実施形態では、酵素またはその断片は、保護層によって少なくとも部分的に包埋される。
【0033】
一実施形態では、保護層は、固体担体を包埋し、固体担体の表面に固定化されている酵素またはその断片を包埋する。一実施形態では、保護層の表面に固定化されている機能性成分は、保護層に包埋されない。好ましくは、保護層は、固体担体を完全に包埋し、固体担体の表面に固定化されている酵素またはその断片を完全に包埋する。より好ましくは、保護層は、固体担体を完全に包埋し、固体担体の表面に固定化されている酵素またはその断片を完全に包埋し、保護層の表面に固定化されている機能性成分は、保護層に包埋されない。保護層が固体担体を完全に包埋し、固体担体の表面に固定化されている酵素またはその断片を完全に包埋する場合、酵素は完全に、すなわち保護層によって１００％覆われ、その結果、活性部位も覆われ、固体担体は、完全に、すなわち保護層によって１００％覆われる。
【0034】
一実施形態では、本発明は、固体担体と、固体担体の表面に固定化されている酵素またはその断片と、酵素またはその断片を包埋することによって、酵素またはその断片を保護する保護層と、保護層の表面に固定化されている機能性成分とを含む組成物であって、保護層の表面に固定化されている機能性成分が、固体担体の表面に固定化されている酵素またはその断片とは異なる、組成物を含む。一実施形態では、本発明は、固体担体と、固体担体の表面に固定化されている酵素またはその断片と、酵素またはその断片を包埋することによって、酵素またはその断片を保護する保護層と、保護層の表面に固定化されている機能性成分とを含む組成物であって、保護層の表面に固定化されている機能性成分が、固体担体の表面に固定化されている酵素またはその断片ではない、組成物を含む。
【0035】
一実施形態では、酵素またはその断片は、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスペプチダーゼもしくはリガーゼ、またはそれらの断片およびそれらの混合物からなる群から選択される。特に好ましいのは、ヒドロラーゼまたはその断片、より具体的には、デアミナーゼまたはその断片、グルクロニダーゼまたはその断片およびペプチダーゼまたはその断片からなる群から選択されるヒドロラーゼまたはその断片、さらにより具体的には、ペプチダーゼまたはその断片、好ましくはシステイナーゼ、メチオニナーゼアルギナーゼおよびアスパラギナーゼ（ａｓｐａｒｉｇｉｎａｓｅ）またはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片からなる群から選択されるペプチダーゼまたはその断片、最も具体的にはアスパラギナーゼ（ａｓｐａｒｉｇｉｎａｓｅ）またはその断片である。
【0036】
保護層の厚さは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）、光散乱法などの顕微鏡を使用することによって、またはエリプソメトリーによって測定することができる。
【0037】
本発明の組成物は、通常、反応器のような反応器中で生成される。保護層の形成は、通常、ビルディングブロックによってそれぞれの保護層を形成することによって行われ、ビルディングブロックは、重縮合反応で保護層を構築する。重縮合は、異なる溶媒中、好ましくは水溶液中で行うことができる。重縮合を容易に制御し、必要に応じて停止することができ、保護層の規定の厚さの達成を可能にする。保護層を構築するために使用することができるビルディングブロックの選択肢は、最適かつ／または所望のパラメータに従って保護層の親和性を適合させるために、酵素の既知の構造に依存し得る。保護層のビルディングブロックとして、通常、構造ビルディングブロックおよび保護ビルディングブロックが、保護層を構築するために使用される。使用することができる構造ビルディングブロックは、例えばオルトケイ酸テトラエチル（本明細書では「ＴＥＯＳ」または「Ｔ」と示される）である。使用することができる保護ビルディングブロックは、例えば、３－アミノプロピルトリエトキシシラン（本明細書では「ＡＰＴＥＳ」または「Ａ」と示される）、プロピルトリエトキシシラン（本明細書では「ＰＴＥＳ」または「Ｐ」と示される）、イソブチルトリエトキシシラン（「ＩＢＴＥＳ」と示される）、ヒドロキシメチルトリエトキシシラン（本明細書では「ＨＴＭＥＯＳ」またはＨと示される）、ベンジルトリエトキシシラン（本明細書では「ＢＴＥＳ」と示される）、ウレイドプロピルトリエトキシシラン（「ＵＰＴＥＳ」と示される）、またはカルボキシエチルトリエトキシシラン（本明細書では「ＣＥＴＥＳ」と示される）である。構造ビルディングブロックは、通常、形成された層に４つの共有結合を形成することができる無機シリカの前駆体である。保護ビルディングブロックは、通常、酵素と相互作用する能力を備えた有機部分を有するオルガノシランである（例えば、酵素）。好ましい構造ビルディングブロックは、四価シラン、特にテトラアルコキシシランである。好ましい保護ビルディングブロックは、三価シラン、特にトリアルコキシシランである。より好ましい構造ビルディングブロックは、四価シランと三価シランとの混合物、特にテトラアルコキシシランとトリアルコキシシランとの混合物である。さらにより好ましい構造ビルディングブロックは、オルトケイ酸テトラエチル、テトラ－（２－ヒドロキシエチル）シラン、およびオルトケイ酸テトラメチルからなる群から選択される。さらにより好ましい保護ビルディングブロックは、カルボキシエチルシラントリオール、ベンジルシラン、プロピルシラン、イソブチルシラン、ｎ－オクチルシラン、ヒドロキシシラン、ビス（２－ヒドロキシエチル）－３－アミノプロピルシラン、アミノプロピルシラン、ウレイドプロピルシラン、（Ｎ－アセチルグリシル）－３－アミノプロピルシラン、ヒドロキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］トリエトキシシランからなる群から選択され、特に、ベンジルトリエトキシシラン、プロピルトリエトキシシラン、イソブチルトリエトキシシラン、ｎ－オクチルトリエトキシシラン、ヒドロキシメチルトリエトキシシラン、ビス（２－ヒドロキシエチル）－３－アミノプロピルトリエトキシシラン、３－アミノプロピルトリエトキシシラン、ウレイドプロピルトリエトキシシラン、（Ｎ－アセチルグリシル）－３－アミノプロピルトリエトキシシランから選択されるか、またはベンジルトリメトキシシラン（ｂｅｎｚｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｆｌａｎｅ）、プロピルトリメトキシシラン、イソブチルメトキシシラン、ｎ－オクチルトリメトキシシラン、ヒドロキシルネチルトリメトキシシラン、ビス（２－ヒドロキシエチル）－３－アミノプロピルトリメトキシシラン、アルニノプロピルトリメトキシシラン、ウレイドプロピルトリメトキシシラン（Ｎ－アセチルグリシル）－３－アミノプロピルトリメトキシシランから選択されるか、またはベンジルトリヒドロキシエトキシシラン、プロピルトリヒドロキシエトキシシラン、イソブチルトリヒドロキシエトキシシラン、ｎ－オクチルトリヒドロキシエトキシシラン、ヒドロキシメチルトリヒドロキシエトキシシラン（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｆｉｌｙｌｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）－３－アミノプロピルトリヒドロキシエトキシシラン、アミノプロピルトリヒドロキシエトキシシラン、ウレイドプロピルトリヒドロキシエトキシシラン、（Ｎ－アセチルグリシル）－３－アミノプロピルトリヒドロキシメトキシシランから選択される。
【0038】
特に好ましいビルディングブロックは、構造ビルディングブロックとしてＴＥＯＳ、ならびに保護ビルディングブロックとしてＡＰＴＥＳ、ＰＴＥＳおよび／またはＨＴＭＥＯＳ、好ましくはＡＰＴＥＳである。特に、構造ビルディングブロックとしてのＴＥＯＳおよび保護ビルディングブロックとしてのＡＰＴＥＳが、保護層を構築するために使用される。
【0039】
ビルディングブロックと固体担体との反応時間は、リンカーが使用される場合、リンカーの長さ、および酵素のサイズに依存する。反応は、通常、０．５～１０時間、好ましくは１～５時間、より好ましくは１～４時間、さらにより好ましくは２～４時間、好ましくは水溶液中で、好ましくは約５～約２５℃または約２０℃の室温で行われる。保護層の形成は、重縮合反応を能動的に停止させることによって、例えば未反応のビルディングブロックを、例えば洗浄工程によって除去することによって、または限られた量のビルディングブロック（ｂｕｉｄｌｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）によって引き起こされる重縮合反応の自己停止によって、停止させることができる。
【0040】
さらにより好ましい実施形態では、酵素は、酵素について上に記載されるように分子をアンカーポイントとして導入することによって、ならびにリンカー、好ましくはアンカーポイントおよび酵素に結合する架橋剤を使用することによって、固体担体の表面を少なくとも部分的に修飾することによって、固体担体に固定化される。
【0041】
一実施形態では、アンカーポイントとして導入された分子および／またはリンカーは、固体担体の表面上に均一に分配されている。
【0042】
好ましい実施形態では、架橋剤は、グルタルアルデヒド、酒石酸ジスクシンイミジル、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）、ジメチルアジピミダート、ジメチルピメリミデート、スルホスクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン、活性化スルフヒドリル、スルフヒドリル反応性２－ピリジルジチオール、ＢＳＯＣＯＥＳ（ビス［２－（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン）、ＤＳＰ（ジチオビス［スクシンイミジル］プロピオネート］）、ＤＴＳＳＰ（３，３’－ジチオビス［スルホスクシンイミジル］プロピオネート）、ＤＴＢＰ（ジメチル３，３’－ジチオビスプロピオニミダート・２ＨＣｌ）、ＤＳＴ（ジスクシンイミジルタルタレート）、スルホ－ＬＣ－ＳＭＰＴ（４－スルホスクシンイミジル－６－メチル－ａ－（２－ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート）、ＳＰＤＰ（Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＬＣ－ＳＰＤＰ（スクシンイミジル６－（３－［２－ピリジルジチオ］プロピオンアミド）ヘキサノエート）、ＳＭＰＴ（４－スクシンイミジルオキシカルボニル－メチル－ａ－［２－ピリジルジチオ］トルエン）、ＤＰＤＰＢ（１，４－ジ－［３’－（２’－ピリジルジチオ）－プロピオンアミド］ブタン）、ＤＴＭＥ（ジチオ－ビスマレイミドエタン）、ＢＭＤＢ（１，４ビスマレイミジル－２，３－ジヒドロキシブタン）、ジベンゾシクロオクチン－マレイミド（ＤＢＣＯ－マレイミド）およびアジドＰＥＧマレイミド（Ｎ３－ＰＥＧ－マレイミド）からなる群から選択される。より好ましくは、架橋剤は、グルタルアルデヒド、ジスクシンイミジルタルトレート、スベリン酸ジスクシンイミジル、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）、ジメチルアジピミダート、ジメチルピメリミデート、スルホスクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン、活性化スルフヒドリル（例えば、スフルヒドリル反応性２－ピリジルジチオ）、ジベンゾシクロオクチン－マレイミド（ＤＢＣＯ－マレイミド）およびアジドＰＥＧマレイミド（Ｎ３－ＰＥＧ－マレイミド）から選択される。グルタルアルデヒド、ジベンゾシクロオクチン－マレイミド（ＤＢＣＯ－マレイミド）およびアジドＰＥＧマレイミド（Ｎ３－ＰＥＧ－マレイミド）が特に好ましい。グルタルアルデヒドが最も好ましい。例えば、ジベンゾシクロオクチン－マレイミド（ＤＢＣＯ－マレイミド）およびアジドＰＥＧマレイミド（Ｎ３－ＰＥＧ－マレイミド）のような上記の架橋剤のいくつかの化合物は、それぞれ、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕで、例えば、「クリックケミストリー」反応（銅触媒アジド－アルキン環化付加、例えば、Ｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．４０（１１）２００４－２０２１参照）で互いに反応することによって架橋剤を形成し、例えば、ジベンゾシクロオクチン－マレイミド（ＤＢＣＯ－マレイミド）は、保護層の表面に結合することができ、アジドＰＥＧマレイミド（Ｎ３－ＰＥＧ－マレイミド）は、機能化（ｆｕｎｃｔｉｏｎｌｉｓａｔｉｏｎ）成分、例えば、免疫グロブリンに結合することができ、保護層の表面に結合したジベンゾシクロオクチルマレイミド（ＤＢＣＯ－マレイミド）と機能化（ｆｕｎｃｔｉｏｎｌｉｓａｔｉｏｎ）成分に結合したアジドＰＥＧマレイミド（Ｎ３－ＰＥＧ－マレイミド）とを、ｉｎ ｓｉｔｕでクリックケミストリーによって反応させて、架橋剤を介して保護層の表面に固定化されている機能性成分を含む組成物を形成し、架橋剤は、アジドＰＥＧマレイミド（Ｎ３－ＰＥＧ－マレイミド）と反応したジベンゾシクロオクチルマレイミド（ＤＢＣＯ－マレイミド）から構成される。したがって、好ましい実施形態では、架橋剤は、クリックケミストリーによって反応させた２つの化合物から構成され、より好ましくは、架橋剤は、アジドＰＥＧマレイミド（Ｎ３－ＰＥＧ－マレイミド）と反応させたジベンゾシクロオクチン－マレイミド（ＤＢＣＯ－マレイミド）から構成される。
【0043】
保護層が形成された後、酵素および保護層を含む固体担体を保存することができる。保存は、通常、例えば形成された組成物を例えばバッファーで洗浄し、所望の期間そのバッファーに懸濁または溶解させて保存することによって実現される。好ましい実施形態では、酵素および保護層を含む固体担体は、２～２５℃の一定温度で保存される。さらに好ましい実施形態では、酵素および保護層を含む固体担体は、５～４８時間、好ましくは１０～３０時間保存される。より好ましくは、酵素および保護層を含む固体担体は、２～２５℃の一定温度、好ましくは室温で１０～３０時間保存される。
【0044】
一実施形態では、本発明の組成物が対象に投与される場合、機能性成分は、ｉ）組成物の食作用を減少させ、ｉｉ）組成物の循環時間を増加させ、かつ／またはｉｉｉ）腫瘍を標的とし、かつ／もしくは組成物の腫瘍細胞への内部移行を促進する、好ましくは、機能性成分は、組成物の食作用を減少させ、かつ／もしくは組成物の循環時間を増加させ、または腫瘍を標的とし、かつ／もしくは組成物の腫瘍細胞への内部移行を促進する。
【0045】
一実施形態では、機能性成分は、両親媒性薬物、アミノ酸、ペプチド、タンパク質またはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片、シラン共重合体、およびタンパク質またはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片とシラン共重合体との組み合わせからなる群から選択されるが、ただし、タンパク質またはその断片は、固体担体の表面に固定化されている酵素またはその断片ではない。両親媒性薬物は、好ましくはカチオン性両親媒性薬物である。特徴的には、カチオン性両親媒性薬物は、非極性環系からなる疎水性部分および生理的ｐＨで正味の正電荷を有することができる１つ以上の窒素基を有する親水性基を含有する。より好ましくは、両親媒性薬物は、フルオキセチン、チロダジン、プロマジン、マプロチリン、ロラタジン、イミプラミン、ドキセピン、デシプラミン、クロザピン、クロミプラミン、クロプロマジン、クロロキン、ラベタロール、ダポキセチン、フルボキサミン、インダルピン、パロキセチン、ジメリジン、セルタリンおよびプロパノールならびにそれらの塩、代謝産物およびプロドラッグからなる群から選択されるカチオン性両親媒性薬物である。好適なカチオン性両親媒性薬物のさらなる例としては、フルフェナジン、ハロペリドール（Ｈａｌｄｏｌ、Ｓｅｒｅｎａｃｅ）、プロクロルペラジン、メソリダジン、ロキサピン、モリドン（Ｍｏｂａｎ）、ペルフェナジン（Ｔｒｉｌｉｆｏｎ）、チオチキセン（Ｎａｖａｎｅ）、トリフルオロペラジン（Ｓｔｅｌａｚｉｎｅ）、フルフェナジン（Ｐｒｏｌｉｘｉｎ）、ドロペリドール、ズクロペンチキソール（Ｃｌｏｐｉｘｏｌ）、ペリシアジン、トリフルプロマジン、オランザピン、クエチアピン、アセナピン、スルピリド、アミスルピリド、レモキシプリド、メルペロン、ロペリドン、パリペリドン、リスペリドン、ペロスピロン、ジプラシドン、セルチンドール、アリピプラゾール、フルボキサミン（Ｌｕｖｏｘ）、パロキセチン（Ｐａｘｉｌ）、セルトラリン（Ｚｏｌｏｆｔ）、デスベンラファキシン（Ｐｒｉｓｔｉｑ）、デュロキセチン（Ｃｙｍｂａｌｔａ）、ミルナシプラム（Ｉｘｅｌ）、ベンラファキシン（Ｅｆｆｅｘｏｒ）、ミアンセリン（Ｔｏｌｖｏｎ）、ミルタザピン、アトモキセチン（Ｓｔｒａｔｔｅｒａ）、マジンドール（Ｍａｚａｎｏｒ、Ｓａｎｏｒｅｘ）、レボキセチン（Ｅｄｒｏｎａｘ）、ビロキサジン（Ｖｉｖａｌａｎ）、ブプロピオン、チアネプチン、アゴメラチン、アミトリプチリン（Ｅｌａｖｉｌ、Ｅｎｄｅｐ）、クロミプラミン（Ａｎａｆｒａｎｉｌ）、ドキセピン（Ａｄａｐｉｎ、Ｓｉｎｅｑｕａｎ）、イミプラミン（Ｔｏｆｒａｎｉｌ）、トリミプラミン（Ｓｕｒｍｏｎｔｉｌ）、ノルトリプチリン（Ｐａｍｅｌｏｒ、Ａｖｅｎｔｙｌ）、プロトリプチリン（Ｖｉｖａｃｔｉｌ）、モクロベミド（Ａｕｒｏｒｉｘ、Ｍａｎｅｒｉｘ）、トラニルシプロミン（Ｐａｒｎａｔｅ）、ブスピロン（Ｂｕｓｐａｒ）、ゲピロン（Ａｒｉｚａ）、ネファゾドン（Ｓｅｒｚｏｎｅ）、タンドスピロン（Ｓｅｄｉｅｌ）、トラゾドン（Ｄｅｓｙｒｅｌ）、ドスレピン、エトペリドン、フェモキセチン、ロフェプラミン、マジンドール、ミルナシプラン、ネファゾドン、ニソキセチン、ノミフェンシン、オキサプロチリン、プロトリプチリン、ビロキサジン、ジフェンヒドラミン、ロラタジン、デスロラタジン、メクリジン、クエチアピン、フェキソフェナジンフェニラミン、セチリジン、プロメタジン、クロロフェニラミン、レボセチジン、シメチジン、ファメジン、ラニチジン、ニザチジン、ロキサチジン、ラフチジン、Ａ－３４９，８２１、ＡＢＴ－２３９、シプロキシファンクロベンプロピット、チオペラミド、チオペラミド、ＪＮＪ ７７７７１２０、ＶＵＦ－６００２、アルプレノロール、ブシンドロール、カルテオロール、カルベジロール、ラベタロール、ナドロール、ペンブトロール、ピンドロール、チモロール、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、セリプロロール、エスモロール、メトプロロール、ネビボロールおよびブタキサミンのような上記の薬物、ならびにその塩、代謝産物およびプロドラッグが含まれる。さらにより好ましくは、両親媒性薬物は、クロロキンまたはクロルプロマジンである。アミノ酸は、通常、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群より選択され、好ましくはリジンである。ペプチドは、通常、ペネトラチン（ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１９５２：Ｋｏｎｄｏ Ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ ｃｏｍｍｕｎ，２０１２；Ｄｅｒｏｓｓｉ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４；２６９：１０４４４－１０４５０）ならびにＲＧＤ（アルギニン、グリシンおよびアスパラギン酸からなるトリペプチド）のような細胞透過性ペプチドからなる群から選択され、好ましくはＲＧＤである。タンパク質またはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片は、通常、血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片および免疫グロブリンまたはその断片からなる群から選択され、好ましくは血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片であり、より好ましくはヒト血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片である。免疫グロブリンまたはその断片は、通常、免疫グロブリンのＦｃまたはＦａｂ断片、免疫グロブリンのＦｃまたはＦａｂ断片および架橋剤、モノクローナル抗体およびナノボディからなる群より選択され、好ましくは免疫グロブリンのＦｃ断片または免疫グロブリンのＦｃ断片および架橋剤である。シラン共重合体は、通常、ポリエチレングリコール／シラン共重合体およびポリソルベート／シラン共重合体からなる群から選択され、好ましくはシランＰＥＧ（ＰＥＧ－Ｓｉ）、より好ましくはｍシラン－ＰＥＧ ２ｋＤａまたはｍシラン－ＰＥＧ ５ｋＤａである。
【0046】
好ましい実施形態では、機能性成分は、血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片；血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片およびポリエチレングリコール／シラン共重合体；ポリエチレングリコール／シラン共重合体；免疫グロブリンのＦｃ断片；ならびに免疫グロブリンのＦｃ断片および架橋剤からなる群から選択される。
【0047】
さらに好ましい実施形態では、機能性成分は、保護層の表面に結合する血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片；ポリエチレングリコール／シラン共重合体の一方の部分（端部）が、保護層の表面に結合し、他方の一部（端部）が、血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片に結合する血清アルブミンまたはその断片およびポリエチレングリコール／シラン共重合体；保護層の表面に結合するポリエチレングリコール／シラン共重合体；免疫グロブリンのＦｃまたはＦａｂ断片；ならびに、架橋剤の一方の部分（末端）が、保護層の表面に結合し、他方の部分（末端）が、免疫グロブリンのＦｃまたはＦａｂ断片に結合する免疫グロブリンのＦｃまたはＦａｂ断片および架橋剤からなる群から選択される。
【0048】
さらに好ましい実施形態では、機能性成分は、ポリエチレングリコール／シラン共重合体、好ましくはｍシラン－ＰＥＧ ２ｋＤａまたはｍシラン－ＰＥＧ ５ｋＤａであり、ポリエチレングリコール／シラン共重合体は、保護層の表面に結合する。
【0049】
より好ましい実施形態では、機能性成分は、血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片；血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片およびポリエチレングリコール／シラン共重合体；ポリエチレングリコール／シラン共重合体；免疫グロブリンのＦｃ断片；ならびに免疫グロブリンのＦｃ断片および架橋剤からなる群から選択され、機能性成分は、組成物の食作用を減少させ、かつ／または組成物の循環時間を増加させる。
【0050】
さらにより好ましい実施形態では、機能性成分は、血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片、好ましくは保護層の表面に結合する血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片；ポリエチレングリコール／シラン共重合体の一方の部分（端部）が、保護層の表面に結合し、他方の部分（端部）が、血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片に結合する血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片およびポリエチレングリコール／シラン共重合体；保護層の表面に結合するポリエチレングリコール／シラン共重合体；免疫グロブリンのＦｃまたはＦａｂ断片；ならびに、架橋剤の一方の部分（端部）が、保護層の表面に結合し、他方の部分（端部）が、免疫グロブリンのＦｃまたはＦａｂ断片に結合する免疫グロブリンのＦｃまたはＦａｂ断片および架橋剤からなる群から選択され、機能性成分は、組成物の食作用を減少させ、かつ／または組成物の循環時間を増加させる。
【0051】
さらにより好ましい実施形態では、機能性成分は、血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片、好ましくは血清アルブミンである。好ましくは、血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片は、保護層の表面に結合する。本明細書で機能性成分として使用される血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片は、好ましくはヒトおよび／もしくは組換え血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片であり、より好ましくはヒト血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片である。
【0052】
さらにより好ましい実施形態では、機能性成分は、血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片、好ましくは血清アルブミンであり、機能性成分は、組成物の食作用を減少させ、かつ／または組成物の循環時間を増加させる。
【0053】
さらにより好ましい実施形態では、機能性成分は、ポリエチレングリコール／シラン共重合体、好ましくはｍシラン－ＰＥＧ ２ｋＤａまたはｍシラン－ＰＥＧ ５ｋＤａであり、ポリエチレングリコール／シラン共重合体は、保護層の表面に結合する。
【0054】
さらにより好ましい実施形態では、機能性成分は、ポリエチレングリコール／シラン共重合体、好ましくはｍシラン－ＰＥＧ ２ｋＤａまたはｍシラン－ＰＥＧ ５ｋＤａであり、ポリエチレングリコール／シラン共重合体は、保護層の表面に結合し、機能性成分は、組成物の食作用を減少させ、かつ／または組成物の循環時間を増加させる。
【0055】
一実施形態では、機能性成分は、ペプチド；ペプチドおよび架橋剤；免疫グロブリンまたはその断片；ならびに免疫グロブリンまたはその断片および架橋剤からなる群より選択される。
【0056】
好ましい実施形態では、機能性成分は、保護層の表面に結合するペプチド；架橋剤の一方の部分（端部）が、保護層の表面に結合し、他方の部分（端部）が、ペプチドに結合するペプチドおよび架橋剤；保護層の表面に結合する免疫グロブリンまたはその断片；ならびに、架橋剤の一方の部分（端部）が、保護層の表面に結合し、他方の部分（端部）が、免疫グロブリンまたはその断片に結合する免疫グロブリンまたはその断片および架橋剤からなる群から選択される。
【0057】
より好ましい実施形態では、機能性成分は、保護層の表面に結合するペプチド；架橋剤の一方の部分（端部）が、保護層の表面に結合し、他方の部分（端部）が、ペプチドに結合するペプチドおよび架橋剤；保護層の表面に結合する免疫グロブリンまたはその断片；ならびに、架橋剤の一方の部分（端部）が、保護層の表面に結合し、他方の部分（端部）が、免疫グロブリンもしくはその断片に結合し、ペプチドおよび免疫グロブリンもしくはその断片が、腫瘍を標的とし、かつ／または組成物の腫瘍細胞への内部移行を促進する免疫グロブリンまたはその断片および架橋剤からなる群から選択される。
【0058】
好ましい実施形態では、機能性成分は、タンパク質またはその断片、好ましくは血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片；シラン共重合体、好ましくはポリエチレングリコール／シラン共重合体；免疫グロブリンまたはその断片、好ましくは抗体またはその断片；ならびに免疫グロブリンまたはその断片および架橋剤、好ましくは抗体またはその断片および架橋剤、好ましくは抗体またはその断片およびクリックケミストリーによって反応させた２つの化合物から構成される架橋剤からなる群から選択される。
【0059】
好ましい実施形態では、機能性成分は、タンパク質またはその断片、好ましくは血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片；シラン共重合体、好ましくはポリエチレングリコール／シラン共重合体；免疫グロブリンまたはその断片、好ましくは抗体またはその断片；ならびに免疫グロブリンまたはその断片および架橋剤、好ましくは抗体またはその断片および架橋剤、好ましくは抗体またはその断片およびクリックケミストリーによって反応させた２つの化合物から構成される架橋剤からなる群から選択され、機能性成分は、組成物の食作用を減少させ、かつ／または組成物の循環時間を増加させ、かつ／または腫瘍を標的とし、かつ／または組成物の腫瘍細胞への内部移行を促進する、好ましくは機能性成分は、組成物の循環時間を増加させ、腫瘍を標的とする。
【0060】
一実施形態では、保護層の表面は、固定化されている機能性成分によって部分的にのみ覆われる。好ましくは、保護層の表面の約０．１％～約１００％が、固定化されている機能性成分によって覆われる。より好ましくは、保護層の表面の約５％～約８０％、さらにより好ましくは約１０％～約５０％、最も好ましくは約２０％が、固定化されている機能性成分によって覆われる。
【0061】
一実施形態では、機能性成分は、結合、好ましくは共有結合によって保護層の表面に固定化される。
【0062】
保護層の表面への機能性成分の固定化は、通常、例えば、水、バッファーもしくは非イオン性界面活性剤またはそれらの混合物中、好ましくは水と非イオン性界面活性剤との混合物中で、上記の保護層に包埋された酵素を担持する固体担体を懸濁することによって、反応器のような反応器中で担持される。次いで、機能性成分を懸濁液に添加し、通常は撹拌下で保護層の表面と反応させて、機能性成分を保護層の表面に固定化する。有用には、そのような得られた組成物を洗浄し、水、バッファーもしくは非イオン性界面活性剤またはそれらの混合物に再懸濁する。使用される機能性成分に応じて、例えばＰＥＧシランが機能性成分として使用される場合には重縮合によって、または例えばタンパク質が機能性成分として使用される場合には共有結合によって、固定化が起こる。機能性成分はまた、例えば「ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（Ｃｏｐｐｅｒ－ｃａｔａｌｙｓｅｄ ａｚｉｄｅ－ａｌｋｙｎｅ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ、例えば、Ｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．４０（１１）２００４－２０２１参照）を使用して保護層の表面および機能性成分を化学的に修飾することによって固定化され得るが、上記のように保護層に包埋された酵素を担持する固体担体は、最初にエチニル化合物のような反応性化合物と反応し、機能性成分は、反応性化合物、例えばアジド残留物を添加することによって修飾され、次いで両方の成分を反応させて、保護層の表面に機能性成分を固定化する。
【0063】
さらなる実施形態では、組成物は、キレート剤をさらに含み、キレート剤は、任意選択的に、放射性標識または発光性標識を含む。好ましくは、キレート剤は、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、ＮＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＡＡＺＴＡ、ＴＲＡＰ、ＮＯＰＯおよびＨＥＨＡからなる群から選択される。より好ましくは、ＤＯＴＡまたはＨＥＨＡが使用される。さらにより好ましくは、放射性標識または発光性標識を含むキレート剤が使用され、特にｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－ＤＯＴＡまたはルテチウム－１７７－放射性標識－ＤＯＴＡが使用される。組成物がキレート剤をさらに含む場合、保護層に包埋された酵素を担持する固体担体は、通常、キレート剤で前処理され、放射性標識または発光性標識を含む異なるキレート剤がそのような前処理された組成物に添加される。
【0064】
好ましくは、放射性標識、より好ましくはランタニドファミリーの化合物、さらにより好ましくはガドリニウム、ルテチウムまたはユーロピウムが使用される。
【0065】
さらなる態様では、本発明は、医薬として使用するための上記の組成物を提供する。
【0066】
さらなる態様では、本発明は、対象におけるがんを予防、進行の遅延または処置する方法に使用するための組成物を提供し、方法は、前記組成物を対象に投与することを含み、組成物は、対象を処置するのに十分な量で投与される。また、対象におけるがんの予防、進行の遅延または処置のための医薬を製造するための本明細書に記載の組成物の使用も提供される。また、対象におけるがんの予防、進行の遅延または処置のための本明細書に記載の組成物の使用も提供される。また、対象におけるがんの予防、進行の遅延または処置のための方法であって、治療的有効量の本明細書に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法も提供される。対象におけるがんの予防、進行の遅延または処置のための方法において、本発明の組成物における保護層の表面に固定化されている機能性成分は、好ましくは、両親媒性薬物、アミノ酸、ペプチド、タンパク質またはその断片、シラン共重合体およびタンパク質またはその断片とシラン共重合体との組み合わせからなる群から選択されるが、ただし、タンパク質またはその断片は、固体担体の表面に固定化されている酵素またはその断片ではなく；より好ましくは、保護層の表面に結合する血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片；ポリエチレングリコール／シラン共重合体の一方の部分（端部）が、保護層の表面に結合し、他方の部分（端部）が、血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片に結合する血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片およびポリエチレングリコール／シラン共重合体；保護層の表面に結合するポリエチレングリコール／シラン共重合体；免疫グロブリンのＦｃまたはＦａｂ断片；ならびに、架橋剤の一方の部分（端部）が、保護層の表面に結合し、他方の部分（端部）が、免疫グロブリンのＦｃまたはＦａｂ断片に結合する免疫グロブリンのＦｃまたはＦａｂ断片および架橋剤；さらにより好ましくは、血清アルブミンもしくはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片、またはポリエチレングリコール／シラン共重合体、特に、血清アルブミンまたはｍシラン－ＰＥＧ ２ｋＤａまたはｍシラン－ＰＥＧ ５ｋＤａ、より具体的にはヒトおよび／もしくは組換え血清アルブミンもしくはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片、またはｍシラン－ＰＥＧ ２ｋＤａもしくはｍシラン－ＰＥＧ ５ｋＤａ、さらにより具体的にはヒト血清アルブミンもしくはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片、またはｍシラン－ＰＥＧ ２ｋＤａもしくはｍシラン－ＰＥＧ ５ｋＤａ、さらにより具体的にはタンパク質またはその断片、好ましくは血清アルブミンまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片；シラン共重合体、好ましくはポリエチレングリコール／シラン共重合体；免疫グロブリンまたはその断片、好ましくは抗体またはその断片；ならびに免疫グロブリンまたはその断片および架橋剤、好ましくは抗体またはその断片および架橋剤、好ましくは抗体またはその断片およびクリックケミストリーによって反応させた２つの化合物から構成される架橋剤からなる群から選択される。
【0067】
本明細書で使用される「処置」／「処置すること」という用語は、（１）病態、障害もしくは状態に罹患しているか、またはかかりやすいが、病態、障害または状態の臨床症状または不顕性症状をまだ経験または示していない動物、特に哺乳動物、特にヒトにおいて発症する病態、障害または状態の臨床症状の出現を遅延させること；（２）病態、障害または状態を阻害すること（例えば、少なくとも１つのその臨床的または不顕性の症状の、疾患の発症、または維持処置の場合にはその再発を制止させること、減少させること、もしくは遅延させること）；および／または（３）状態を軽減すること（すなわち、病態、障害もしくは状態、またはその臨床的もしくは不顕性の症状のうちの少なくとも１つの後退を引き起こす）を含む。処置される患者に対する利益は、患者または医師にとって統計的に有意であるか、または少なくとも知覚可能である。しかしながら、疾患を処置するために医薬が患者に投与される場合、その結果は必ずしも有効な処置であるとは限らないことが理解されよう。
【0068】
本明細書で使用される場合、「進行の遅延」は、がんの症状もしくはがんに関連するマークが出現するまでの時間を増加させること、またはがんの症状の重症度の増加を遅らせることを意味する。さらに、本明細書で使用される「進行の遅延」は、疾患進行の逆転または阻害を含む。対象における疾患進行または疾患合併症の「阻害」は、対象における疾患進行および／または疾患合併症を予防または低減することを意味する。
【0069】
防止処置は、予防処置を含む。防止用途では、本発明の医薬組み合わせは、がんを有することが疑われるか、またはがんを発症するリスクがある対象に投与される。治療用途では、医薬組み合わせは、疾患の症状を治癒または少なくとも部分的に制止させるのに十分な量で、既にがんに罹患している患者などの対象に投与される。この使用に有効な量は、疾患の重症度および経過、以前の治療、対象の健康状態および薬物に対する応答、ならびに処置する医師の判断に依存する。
【0070】
対象の状態が改善しない場合、本発明の医薬組み合わせは、対象の疾患または状態の症状を改良するか、そうでなければ制御するか、または制限するために、対象の寿命の全期間を含む長期間にわたって慢性的に投与され得る。
【0071】
対象の状態が改善する場合、医薬組み合わせは、連続的に投与され得、あるいは、投与される薬物の用量を一時的に減少させるか、または一定の長さの時間（すなわち、「休薬期間」）一時的に中断され得る。患者の状態の改善が起こると、本発明の医薬組み合わせの維持量が必要に応じて投与される。その後、投与量もしくは投与頻度、またはその両方を、症状の関数として、改善された疾患が保持されるレベルまで任意選択的に減少させる。
【0072】
本明細書で使用される「有効量」または「治療的有効量」という表現は、本発明の組み合わせを受けている対象において以下の効果のうちの１つ以上をもたらすことができる量を指す：（ｉ）腫瘍増殖速度を低下させることまたは完全増殖制止を引き起こすことを含む腫瘍増殖の阻害または制止；（ｉｉ）完全な腫瘍縮小；（ｉｉｉ）腫瘍サイズの縮小；（ｉｖ）腫瘍数の減少；（ｖ）末梢臓器への腫瘍細胞浸潤の転移の阻害（すなわち、減少、減速または完全停止）；（ｖｉ）腫瘍の退縮または排除をもたらし得るが、そうでなくてもよい抗腫瘍免疫応答の増強；（ｖｉｉ）がんに関連する１つ以上の症状のある程度の軽減；（ｖｉｉｉ）組み合わせを受けている対象の無増悪生存期間（ＰＦＳ）および／または全生存期間（ＯＳ）の延長。
【0073】
治療的有効量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。いくつかの実施形態では、治療的有効量は、（ｉ）がん細胞の数を減少させる；（ｉｉ）腫瘍サイズを縮小させる；（ｉｉｉ）末梢臓器へのがん細胞の浸潤を阻害、遅滞、ある程度遅らせる、好ましくは停止する；（ｉｖ）腫瘍転移を阻害する（例えば、ある程度遅く、好ましくは停止する）；（ｖ）腫瘍増殖を阻害する；（ｖｉ）腫瘍の発生および／または再発を遅延させる；かつ／または（ｖｉｉ）がんに関連する症状のうちの１つ以上をある程度軽減することができる。様々な実施形態では、その量は、がんの症状のうちの１つ以上を改良する、和らげる、緩和する、かつ／または遅延させるのに十分である。
【0074】
一実施形態では、がんは、固形腫瘍である。さらなる実施形態では、がんは、血液学的悪性腫瘍である。好ましい実施形態では、がんは、白血病である。より好ましい実施形態では、がんは、リンパ芽球性がん、より好ましくはバーキットリンパ腫またはＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）からなる群から選択されるリンパ芽球性がんである。
【0075】
さらなる態様では、本発明は、対象における組成物の分布を測定する方法に使用するための上記の組成物を提供する。一実施形態では、対象における組成物の分布を測定するための方法は、固体担体、固体担体の表面に固定化されている酵素またはその断片、酵素またはその断片を包埋することによって、酵素またはその断片を保護する保護層、および保護層の表面に固定化されている機能性成分を含み、放射性標識または発光性標識を含むキレート剤をさらに含む組成物を対象に投与することと、放射性放出または発光性放出を分析することと、を含む。
【0076】
本発明はまた、対象における組成物の分布を測定する方法であって、固体担体、固体担体の表面に固定化されている酵素またはその断片、酵素またはその断片を包埋することによって、酵素またはその断片を保護する保護層、および保護層の表面に固定化されている機能性成分を含み、放射性標識または発光性標識を含むキレート剤をさらに含む組成物を対象に投与することと、放射性放出または発光性放出を分析することと、を含む、方法を提供する。
【0077】
さらなる態様では、本発明は、上記の組成物、例えば、組成物、固体担体、固体担体の表面に固定化されている酵素またはその断片、酵素またはその断片を包埋することによって酵素またはその断片を保護する保護層、および保護層の表面に固定化されている機能性成分を生成する方法であって、方法が、以下の工程：
（ａ）固体担体を提供する工程と、
（ｂ）酵素またはその断片を固体担体に固定化する工程と、
（ｃ）固体担体の表面に保護層を形成して、固体担体に固定化されている酵素またはその断片を保護する工程と、
（ｄ）保護層の表面に機能性成分を固定化する工程と、を含む、方法を提供する。
（ａ）固体担体を提供する工程と、
（ｂ）酵素またはその断片を固体担体に固定化する工程と、
（ｃ）固体担体の表面に保護層を形成して、固体担体に固定化されている酵素またはその断片を保護する工程と、
（ｄ）保護層の表面に機能性成分を固定化する工程と、を含む、方法を提供する。
【0078】
工程（ａ）は、通常、固体担体を水またはバッファー中に懸濁させて提供することによって行われる。懸濁液は、例えば４００ｒｐｍ、２０℃で３０分間撹拌することができる。本方法の工程ｂ）における固体担体への酵素の固定化は、通常、固体担体の懸濁液に酵素の溶液を添加することによって行われる。好ましい実施形態では、固体担体上の酵素の固定化は、固体担体の懸濁液を提供し、酵素の溶液を添加することによって行われ、酵素の添加溶液を含む懸濁液は、酵素が固体担体の表面に結合することを可能にするためにインキュベートされる。好ましい実施形態では、固体担体の表面は、固体担体上の酵素の固定化を改善するために、少なくとも部分的に修飾される。特に、固体担体の表面は、酵素が固定化される前に少なくとも部分的に修飾される。固体担体の表面は、上記のように、酵素のアンカーポイントとして分子を固体担体の表面に導入することによって少なくとも部分的に修飾することができる。本方法の工程（ｃ）による保護層の形成は、通常、ビルディングブロックを用いてそれぞれの保護層を形成することによって行われ、ビルディングブロックは、上記のように重縮合反応で保護層を構築する。本方法の工程（ｄ）による保護層の表面への機能性成分の固定化は、通常、上記のようにして行われる。
【0079】
一実施形態では、保護層は、ビルディングブロックによって形成され、ビルディングブロックとして、構造ビルディングブロックおよび保護ビルディングブロックは、保護層を形成するために使用され、構造ビルディングブロックは、形成された層に４つの共有結合を形成することができる無機シリカの前駆体であり、保護ビルディングブロックは、オルガノシランである。
【0080】
一実施形態では、保護層は、酵素の約３０％～約１００％を包埋する。
【0081】
一実施形態では、固体担体は、有機粒子、無機粒子、有機－無機粒子、自己組織化有機粒子、シリカ粒子、金粒子、磁性粒子およびチタン粒子の群から選択される。
【実施例】
【0082】
試薬：
オルトケイ酸テトラエチル９９％（ＴＥＯＳ）、（３－アミノプロピル）－トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、アンモニウム水酸化物（ＡＣＳグレード、２８～３０％）、エタノール（ＡＣＳグレード、無水）、グルタルアルデヒド（グレードＩ、水中２５％）、硫酸銅、アスコルビン酸ナトリウム、Ｃｈｅｌｅｘ（登録商標）１００ナトリウム形態、アスパラギナーゼ（ＥＣ３．５．１．１）、Ｌ－アスパラギン、トリクロロ酢酸、ネスラー試薬、エタノールアミン、ｔｗｅｅｎ ２０、ヘモグロビン標準液、ドラブキン溶液、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、ジギトニンおよびジベンゾシクロオクチン－マレイミド（ＤＢＣＯ－マレイミド）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
オルトケイ酸テトラエチル９９％（ＴＥＯＳ）、（３－アミノプロピル）－トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、アンモニウム水酸化物（ＡＣＳグレード、２８～３０％）、エタノール（ＡＣＳグレード、無水）、グルタルアルデヒド（グレードＩ、水中２５％）、硫酸銅、アスコルビン酸ナトリウム、Ｃｈｅｌｅｘ（登録商標）１００ナトリウム形態、アスパラギナーゼ（ＥＣ３．５．１．１）、Ｌ－アスパラギン、トリクロロ酢酸、ネスラー試薬、エタノールアミン、ｔｗｅｅｎ ２０、ヘモグロビン標準液、ドラブキン溶液、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、ジギトニンおよびジベンゾシクロオクチン－マレイミド（ＤＢＣＯ－マレイミド）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【0083】
ｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－ＤＯＴＡは、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓから購入した。
【0084】
トリエトキシエチニルシラン（ＥＴＥＳ）は、Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。
【0085】
様々な分子量を有するメトキシＰＥＧシラン（ＰＥＧシラン）、シラン－ＰＥＧ－フルオレセインイソチオシアネート（シラン－ＰＥＧ－ＦＩＴＣ）およびアジドＰＥＧマレイミド（Ｎ３－ＰＥＧ－マレイミド）は、Ｎａｎｏｃｓから購入した。
【0086】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄから購入した。
【0087】
ポリクローナル抗アスパラギナーゼ抗体（ＬＳ－Ｃ１４７３３０）は、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ製のＬＳ－ＢｉｏおよびＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ウサギ抗体（４３Ｒ－ＩＧ０３６ｈｒｐ）から購入した。アミン反応性９６ウェルプレート（ＮＨＳ基を有する）は、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍから購入した。ＨＲＰ発色基質３，３，５，５－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）およびダルベッコのホスフェート緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。
【0088】
ＬＤＨ活性アッセイキットは、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎで購入した。
【0089】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＭＴＴ（（３－［４，５－ジメチルチアゾール－２－イル］－２，５ジフェニルテトラゾリウム臭化物）、ＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）は、Ｓｉｇｍａから購入した。
【0090】
ＲＡＪＩ、ＰＡＮＣ－１およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、ＬＧＣから購入した。
【0091】
ＪＨＨ５細胞は、ＴｅｂｕＢｉｏから購入した。
【0092】
ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。
【0093】
バフィーコートは、Ｂａｓｅｌ献血センター（Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅｚｅｎｔｒｕｍ ＳＲＫ Ｂｅｉｄｅｒ Ｂａｓｅｌ）から入手した。
【0094】
ヒトＣＤ１９抗体（抗ＣＤ１９抗体）は、Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅから購入した。
【0095】
炭酸ナトリウム（≧９９．５％、Ｐｈ．Ｅｕｒ．、ＵＳＰ、ＢＰ、無水）および炭酸水素ナトリウム（≧９９．５％、ＣＥＬＬＰＵＲＥ（登録商標））は、Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈから購入した。
【0096】
合成シリカナノ粒子：
５０ｎｍ粒径のシリカナノ粒子は、国際公開第２０１５／０１４８８８号パンフレットに記載されている元のＳｔｏｂｅｒプロセスに従って合成されている。簡潔には、エタノール、蒸留水（６Ｍ）およびアンモニウム水酸化物（０．１３Ｍ）を混合し、４００ｒｐｍで１時間撹拌した。ＴＥＯＳ（０．２８Ｍ）を添加し、溶液を４００ｒｐｍ、２０℃で２２時間撹拌した。次いで、溶液を２００００ｇで２０分間遠心分離し、エタノールおよび水で連続的に洗浄した。画像解析ソフトウェアＯｌｙｍｐｕｓ ｓｔｒｅａｍ ｍｏｔｉｏｎを使用して、１５００００ｘの倍率で取得したＳＥＭ顕微鏡写真に対して粒径測定を行った。
５０ｎｍ粒径のシリカナノ粒子は、国際公開第２０１５／０１４８８８号パンフレットに記載されている元のＳｔｏｂｅｒプロセスに従って合成されている。簡潔には、エタノール、蒸留水（６Ｍ）およびアンモニウム水酸化物（０．１３Ｍ）を混合し、４００ｒｐｍで１時間撹拌した。ＴＥＯＳ（０．２８Ｍ）を添加し、溶液を４００ｒｐｍ、２０℃で２２時間撹拌した。次いで、溶液を２００００ｇで２０分間遠心分離し、エタノールおよび水で連続的に洗浄した。画像解析ソフトウェアＯｌｙｍｐｕｓ ｓｔｒｅａｍ ｍｏｔｉｏｎを使用して、１５００００ｘの倍率で取得したＳＥＭ顕微鏡写真に対して粒径測定を行った。
【0097】
酵素遮蔽：
水－ポリソルベート８０（８ｍｇ／Ｌ）中のシリカナノ粒子を、撹拌下（４００ｒｐｍ）、２０℃で３０分間、ＡＰＴＥＳ（２．７５ｍＭ）と反応させた。未反応試薬を、３００ｋＤａのＮＭＷＬ、Ｂｉｏｍａｘポリエーテルスルホン限外濾過ディスクを有するアミコン撹拌細胞を使用してナノ粒子懸濁液から除去し、ナノ粒子懸濁液を氷上で６２．５ワットで５分間超音波処理した（以下、「洗浄工程」と呼ぶ）。次いで、ナノ粒子を、撹拌下（４００ｒｐｍ）、２０℃で３０分間、０．１％（ｖ／ｖ）のグルタルアルデヒド水溶液とインキュベートした。洗浄工程後、ナノ粒子を、ポリソルベート８０（８ｍｇ／Ｌ）を含むＭＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ６．２）に再懸濁し、撹拌下（４００ｒｐｍ）、２０℃で１時間、アスパラギナーゼ（２０μｇ／ｍＬ）と反応させた。ナノ粒子を洗浄し、ＴＥＯＳ（４２．５ｍＭ）を添加し、撹拌下（４００ｒｐｍ）、２０℃で１時間反応させた。その後、ＡＰＴＥＳ（４．５ｍＭ）を反応混合物に添加した。シラン重縮合は、ナノ粒子懸濁液を洗浄することによって２１時間後に停止した。シラン重縮合後に得られるシリカナノ粒子は、重縮合シランを含む保護層によって完全に包埋されたシリカ粒子の表面に固定化されている酵素アスパラギナーゼを含む。国際公開第２０１５／０１４８８８号パンフレットに記載されているように生成されたこれらのナノ粒子は、本明細書では「遮蔽ナノ粒子」、「酵素遮蔽ナノ粒子」、「ナノ粒子１」または「ＮＰ－１」とさらに称される。画像解析ソフトウェアＯｌｙｍｐｕｓ ｓｔｒｅａｍ ｍｏｔｉｏｎを使用して、１５００００ｘの倍率で取得したＳＥＭ顕微鏡写真に対して粒径測定を行った。
水－ポリソルベート８０（８ｍｇ／Ｌ）中のシリカナノ粒子を、撹拌下（４００ｒｐｍ）、２０℃で３０分間、ＡＰＴＥＳ（２．７５ｍＭ）と反応させた。未反応試薬を、３００ｋＤａのＮＭＷＬ、Ｂｉｏｍａｘポリエーテルスルホン限外濾過ディスクを有するアミコン撹拌細胞を使用してナノ粒子懸濁液から除去し、ナノ粒子懸濁液を氷上で６２．５ワットで５分間超音波処理した（以下、「洗浄工程」と呼ぶ）。次いで、ナノ粒子を、撹拌下（４００ｒｐｍ）、２０℃で３０分間、０．１％（ｖ／ｖ）のグルタルアルデヒド水溶液とインキュベートした。洗浄工程後、ナノ粒子を、ポリソルベート８０（８ｍｇ／Ｌ）を含むＭＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ６．２）に再懸濁し、撹拌下（４００ｒｐｍ）、２０℃で１時間、アスパラギナーゼ（２０μｇ／ｍＬ）と反応させた。ナノ粒子を洗浄し、ＴＥＯＳ（４２．５ｍＭ）を添加し、撹拌下（４００ｒｐｍ）、２０℃で１時間反応させた。その後、ＡＰＴＥＳ（４．５ｍＭ）を反応混合物に添加した。シラン重縮合は、ナノ粒子懸濁液を洗浄することによって２１時間後に停止した。シラン重縮合後に得られるシリカナノ粒子は、重縮合シランを含む保護層によって完全に包埋されたシリカ粒子の表面に固定化されている酵素アスパラギナーゼを含む。国際公開第２０１５／０１４８８８号パンフレットに記載されているように生成されたこれらのナノ粒子は、本明細書では「遮蔽ナノ粒子」、「酵素遮蔽ナノ粒子」、「ナノ粒子１」または「ＮＰ－１」とさらに称される。画像解析ソフトウェアＯｌｙｍｐｕｓ ｓｔｒｅａｍ ｍｏｔｉｏｎを使用して、１５００００ｘの倍率で取得したＳＥＭ顕微鏡写真に対して粒径測定を行った。
【0098】
ナノ粒子の不活性化
上記の「酵素遮蔽」の項に従って生成された酵素遮蔽ナノ粒子は、ナノ粒子を９５℃で２０分間加熱することによって熱的に不活性化され、本明細書では以下「酵素不活性化ＮＰ」または「不活性化ＮＰ」と称される。
上記の「酵素遮蔽」の項に従って生成された酵素遮蔽ナノ粒子は、ナノ粒子を９５℃で２０分間加熱することによって熱的に不活性化され、本明細書では以下「酵素不活性化ＮＰ」または「不活性化ＮＰ」と称される。
【0099】
ナノ粒子の官能化：
－ＰＥＧによる官能化：
上記の「酵素遮蔽」の項に従ってポリソルベート８０（８ｍｇ／Ｌ）を含むＭＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ６、２）中で生成された酵素遮蔽ナノ粒子を、撹拌（ｓｔｒｉｒｒｉｎｇ）（４００ｒｐｍ）下、２０℃で１時間、ＰＥＧシラン５０００またはＰＥＧ－シラン－ＦＩＴＣ（１ｍｇ／ｍＬ）と反応させた。洗浄工程後、ナノ粒子を、ポリソルベート８０（８ｍｇ／Ｌ）を含むＭＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ６．２）に再懸濁した。ＰＥＧによる官能化後に得られたシリカナノ粒子は、重縮合シランを含む保護層によって完全に包埋されたシリカ粒子の表面に固定化されている酵素アスパラギナーゼを含み、保護層の表面に固定化されている機能性成分としてＰＥＧシランをさらに含む。ＰＥＧシラン５０００で官能化されたこれらのナノ粒子は、本明細書では「ナノ粒子２」または「ＮＰ－２」とさらに称される。
－ＰＥＧによる官能化：
上記の「酵素遮蔽」の項に従ってポリソルベート８０（８ｍｇ／Ｌ）を含むＭＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ６、２）中で生成された酵素遮蔽ナノ粒子を、撹拌（ｓｔｒｉｒｒｉｎｇ）（４００ｒｐｍ）下、２０℃で１時間、ＰＥＧシラン５０００またはＰＥＧ－シラン－ＦＩＴＣ（１ｍｇ／ｍＬ）と反応させた。洗浄工程後、ナノ粒子を、ポリソルベート８０（８ｍｇ／Ｌ）を含むＭＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ６．２）に再懸濁した。ＰＥＧによる官能化後に得られたシリカナノ粒子は、重縮合シランを含む保護層によって完全に包埋されたシリカ粒子の表面に固定化されている酵素アスパラギナーゼを含み、保護層の表面に固定化されている機能性成分としてＰＥＧシランをさらに含む。ＰＥＧシラン５０００で官能化されたこれらのナノ粒子は、本明細書では「ナノ粒子２」または「ＮＰ－２」とさらに称される。
【0100】
－ヒト血清アルブミンによる官能化：：
上記の「酵素遮蔽」の項に従ってＭＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ６．２）中で生成された酵素遮蔽ナノ粒子を、撹拌（ｓｔｒｉｒｒｉｎｇ）（４００ｒｐｍ）下、２０℃で１時間、ＨＳＡ（２０μｇ／ｍＬ）と反応させた。洗浄工程後、ナノ粒子を、ポリソルベート８０（８ｍｇ／Ｌ）を含むＭＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ６．２）に再懸濁した。ＰＥＧによる官能化後に得られたシリカナノ粒子は、重縮合シランを含む保護層によって完全に包埋されたシリカ粒子の表面に固定化されている酵素アスパラギナーゼを含み、保護層の表面に固定化されている機能性成分としてＨＳＡをさらに含む。ＨＳＡで官能化されたこれらのナノ粒子は、本明細書では「ナノ粒子３」または「ＮＰ－３」とさらに称される。
上記の「酵素遮蔽」の項に従ってＭＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ６．２）中で生成された酵素遮蔽ナノ粒子を、撹拌（ｓｔｒｉｒｒｉｎｇ）（４００ｒｐｍ）下、２０℃で１時間、ＨＳＡ（２０μｇ／ｍＬ）と反応させた。洗浄工程後、ナノ粒子を、ポリソルベート８０（８ｍｇ／Ｌ）を含むＭＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ６．２）に再懸濁した。ＰＥＧによる官能化後に得られたシリカナノ粒子は、重縮合シランを含む保護層によって完全に包埋されたシリカ粒子の表面に固定化されている酵素アスパラギナーゼを含み、保護層の表面に固定化されている機能性成分としてＨＳＡをさらに含む。ＨＳＡで官能化されたこれらのナノ粒子は、本明細書では「ナノ粒子３」または「ＮＰ－３」とさらに称される。
【0101】
－クリックケミストリーを使用した官能化：
上記の「酵素遮蔽」の項に従ってポリソルベート８０（８ｍｇ／Ｌ）を含むボレートバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ８、５）中で生成された酵素遮蔽ナノ粒子を、撹拌（ｓｔｒｉｒｒｉｎｇ）（４００ｒｐｍ）下、２０℃で１時間、ＥＴＥＳ（８０ｍＭ）と反応させた。洗浄工程後、エチニルナノ粒子をＭＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ６．２）に再懸濁し、アスコルビン酸ナトリウム（４μＭ）および硫酸銅（０．４μＭ）の存在下でＮ３修飾化合物を添加し（４０μＭ）、撹拌下（４００ｒｐｍ）、２０℃で６時間反応させた。洗浄工程後、ナノ粒子を、ポリソルベート８０（８ｍｇ／Ｌ）を含むＭＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ６．２）に再懸濁した。ＰＥＧによる官能化後に得られたシリカナノ粒子は、シリカ粒子の表面に固定化され、重縮合シランの保護層によって完全に包埋された酵素アスパラギナーゼを含み、保護層の表面に固定化されている機能性成分としてＮ３－ＦＩＴＣなどのＮ３修飾化合物をさらに含む。Ｎ３修飾化合物で官能化されたこれらのナノ粒子は、本明細書では「ナノ粒子４」または「ＮＰ－４」とさらに称される。
上記の「酵素遮蔽」の項に従ってポリソルベート８０（８ｍｇ／Ｌ）を含むボレートバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ８、５）中で生成された酵素遮蔽ナノ粒子を、撹拌（ｓｔｒｉｒｒｉｎｇ）（４００ｒｐｍ）下、２０℃で１時間、ＥＴＥＳ（８０ｍＭ）と反応させた。洗浄工程後、エチニルナノ粒子をＭＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ６．２）に再懸濁し、アスコルビン酸ナトリウム（４μＭ）および硫酸銅（０．４μＭ）の存在下でＮ３修飾化合物を添加し（４０μＭ）、撹拌下（４００ｒｐｍ）、２０℃で６時間反応させた。洗浄工程後、ナノ粒子を、ポリソルベート８０（８ｍｇ／Ｌ）を含むＭＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ６．２）に再懸濁した。ＰＥＧによる官能化後に得られたシリカナノ粒子は、シリカ粒子の表面に固定化され、重縮合シランの保護層によって完全に包埋された酵素アスパラギナーゼを含み、保護層の表面に固定化されている機能性成分としてＮ３－ＦＩＴＣなどのＮ３修飾化合物をさらに含む。Ｎ３修飾化合物で官能化されたこれらのナノ粒子は、本明細書では「ナノ粒子４」または「ＮＰ－４」とさらに称される。
【0102】
－抗体による官能化
ＤＰＢＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）中の抗ＣＤ１９抗体（６４μＬ、１ｍｇ／ｍＬ）に、２６μＬの炭酸塩バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ９．２）を添加した。次いで、滅菌水中のＮ３－ＰＥＧ－マレイミド（２．５６μＬ、１００μｇ／ｍＬ）を抗ＣＤ１９抗体溶液に添加し、撹拌下（４００ｒｐｍ）、２０℃で１時間反応させてアジド抗ＣＤ１９抗体を得た。
ＤＰＢＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）中の抗ＣＤ１９抗体（６４μＬ、１ｍｇ／ｍＬ）に、２６μＬの炭酸塩バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ９．２）を添加した。次いで、滅菌水中のＮ３－ＰＥＧ－マレイミド（２．５６μＬ、１００μｇ／ｍＬ）を抗ＣＤ１９抗体溶液に添加し、撹拌下（４００ｒｐｍ）、２０℃で１時間反応させてアジド抗ＣＤ１９抗体を得た。
【0103】
上記の「酵素遮蔽」の項に従ってポリソルベート８０（８ｍｇ／Ｌ）を含むＭＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ６、２）中で生成された酵素遮蔽ナノ粒子（６００μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）を、炭酸塩バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ９．２）に再懸濁し、続いて撹拌（４００ｒｐｍ）下、２０℃で１時間ＤＢＣＯ－マレイミド（１．８２μＬ、１００μｇ／ｍＬ）と反応させて、ＤＢＣＯ酵素遮蔽ナノ粒子を得た。洗浄工程後、ＤＢＣＯ酵素遮蔽ナノ粒子をＤＰＢＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）に再懸濁し、撹拌下（４００ｒｐｍ）、２０℃で５時間アジド抗ＣＤ１９抗体と反応させた。洗浄工程後、ナノ粒子をＤＰＢＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。抗ＣＤ１９抗体による官能基化後に得られたシリカナノ粒子は、縮合シランを含む保護層によって完全に包埋されたシリカナノ粒子の表面に固定化されている酵素アスパラギナーゼを含み、保護層の表面に固定化されている機能性成分として抗ＣＤ１９抗体をさらに含む。抗ＣＤ１９抗体で官能化されたこれらのナノ粒子は、本明細書では「ナノ粒子５」または「ＮＰ－５」とさらに称される。
【0104】
ナノ粒子の標識化：
上記の「酵素遮蔽」の項に従って生成された酵素遮蔽ナノ粒子を、ポリソルベート８０（８ｍｇ／Ｌ）を含むリン酸バッファー（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）に再懸濁し、Ｃｈｅｌｅｘ（登録商標）で前処理し、ｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－ＤＯＴＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を添加し、撹拌下（４００ｒｐｍ）、２０℃で１時間反応させた。洗浄工程後、ナノ粒子を、ポリソルベート８０（８ｍｇ／Ｌ）を含むＭＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ６．２）に再懸濁した。これらの粒子を、４５℃で１２時間２８００μＣｉの１７７－ルテチウムとインキュベートし、注射前にさらに洗浄する。
上記の「酵素遮蔽」の項に従って生成された酵素遮蔽ナノ粒子を、ポリソルベート８０（８ｍｇ／Ｌ）を含むリン酸バッファー（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）に再懸濁し、Ｃｈｅｌｅｘ（登録商標）で前処理し、ｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－ＤＯＴＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を添加し、撹拌下（４００ｒｐｍ）、２０℃で１時間反応させた。洗浄工程後、ナノ粒子を、ポリソルベート８０（８ｍｇ／Ｌ）を含むＭＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ６．２）に再懸濁した。これらの粒子を、４５℃で１２時間２８００μＣｉの１７７－ルテチウムとインキュベートし、注射前にさらに洗浄する。
【0105】
タンパク質定量：
ＨＳＡの固定収率を、間接的Ｌｏｗｒｙタンパク質定量法を使用して定量した。既知濃度のタンパク質を用いた標準回帰曲線を、ウシ血清アルブミン標準を使用して構築した。ＨＳＡ固定化後の酵素遮蔽ナノ粒子（ＨＳＡ固定化は、上記の「ヒト血清アルブミンを用いた官能化」の項に従って実行した）の上清を採取し、２０ｋｒｃｆで３分間遠心分離した。次いで、１ｍＬのＬｏｗｒｙ溶液を２００μＬの試料および標準物に添加し、ボルテックスし、室温で１５分間インキュベートした。その後、ボルテックスしながらフォリン試薬１Ｎを１００μＬ添加し、室温で３０分間インキュベートした。最後に、Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１リーダーを使用して吸収度を７５０ｎｍで読み取った。
ＨＳＡの固定収率を、間接的Ｌｏｗｒｙタンパク質定量法を使用して定量した。既知濃度のタンパク質を用いた標準回帰曲線を、ウシ血清アルブミン標準を使用して構築した。ＨＳＡ固定化後の酵素遮蔽ナノ粒子（ＨＳＡ固定化は、上記の「ヒト血清アルブミンを用いた官能化」の項に従って実行した）の上清を採取し、２０ｋｒｃｆで３分間遠心分離した。次いで、１ｍＬのＬｏｗｒｙ溶液を２００μＬの試料および標準物に添加し、ボルテックスし、室温で１５分間インキュベートした。その後、ボルテックスしながらフォリン試薬１Ｎを１００μＬ添加し、室温で３０分間インキュベートした。最後に、Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１リーダーを使用して吸収度を７５０ｎｍで読み取った。
【0106】
アスパラギナーゼ活性アッセイ：
遊離アスパラギナーゼまたは遮蔽ナノ粒子－アスパラギナーゼ（０．１～１μｇ／ｍＬ）を、リン酸バッファー（０．５Ｍ、ｐＨ７．４）、アルブミン（４０ｍｇ／ｍＬ）または全血中の１０ｍＭ Ｌ－アスパラギンと２００μＬの最終容量まで混合し、酵素反応のために３７℃で３０分間インキュベートした。反応を５０μｌの１．５Ｍトリクロロ酢酸で停止させ、遠心分離した。２００マイクロリットルの混合物上清を等容積の蒸留水と混合した後、１００μＬのネスラー試薬を添加した。吸収度を４３６ｎｍで測定した。ネスラー試薬によって得られたアンモニアの標準曲線に基づいて酵素活性を定量した。
遊離アスパラギナーゼまたは遮蔽ナノ粒子－アスパラギナーゼ（０．１～１μｇ／ｍＬ）を、リン酸バッファー（０．５Ｍ、ｐＨ７．４）、アルブミン（４０ｍｇ／ｍＬ）または全血中の１０ｍＭ Ｌ－アスパラギンと２００μＬの最終容量まで混合し、酵素反応のために３７℃で３０分間インキュベートした。反応を５０μｌの１．５Ｍトリクロロ酢酸で停止させ、遠心分離した。２００マイクロリットルの混合物上清を等容積の蒸留水と混合した後、１００μＬのネスラー試薬を添加した。吸収度を４３６ｎｍで測定した。ネスラー試薬によって得られたアンモニアの標準曲線に基づいて酵素活性を定量した。
【0107】
ＥＬＩＳＡ手順：
アミン反応性プレートのウェルを、室温（ＲＴ）で２時間、１００μｌのＰＢＳ中、０～５０μｇ／ｍｌの遮蔽ナノ粒子－アスパラギナーゼまたは遊離アスパラギナーゼでコーティングした。次いで、ＮＨＳ機能を、エタノールアミン（１００ｍＭ、ｐＨ７）を使用して室温で３０分間クエンチし、ＰＢＳ中５％ミルクを用いて室温で１時間ウェルをブロックした。抗体希釈バッファー（ＰＢＳ－ミルク１％、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０）中の抗アスパラギナーゼ抗体（１μｇ／ｍＬ）とＲＴで２時間のインキュベーション後、抗体希釈バッファー中のＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：１０，０００）をＲＴで１時間添加した。最後に、５０μｌ（ＴＭＢ）を３０分間添加することによって反応を可視化した。５０μｌのＨ２ＳＯ４ ２Ｍで反応を停止し、吸収度を４５０ｎｍで読み取った。各工程後、プレートを洗浄バッファー（０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ）で５回洗浄した。
アミン反応性プレートのウェルを、室温（ＲＴ）で２時間、１００μｌのＰＢＳ中、０～５０μｇ／ｍｌの遮蔽ナノ粒子－アスパラギナーゼまたは遊離アスパラギナーゼでコーティングした。次いで、ＮＨＳ機能を、エタノールアミン（１００ｍＭ、ｐＨ７）を使用して室温で３０分間クエンチし、ＰＢＳ中５％ミルクを用いて室温で１時間ウェルをブロックした。抗体希釈バッファー（ＰＢＳ－ミルク１％、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０）中の抗アスパラギナーゼ抗体（１μｇ／ｍＬ）とＲＴで２時間のインキュベーション後、抗体希釈バッファー中のＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：１０，０００）をＲＴで１時間添加した。最後に、５０μｌ（ＴＭＢ）を３０分間添加することによって反応を可視化した。５０μｌのＨ２ＳＯ４ ２Ｍで反応を停止し、吸収度を４５０ｎｍで読み取った。各工程後、プレートを洗浄バッファー（０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ）で５回洗浄した。
【0108】
プロナーゼに対する遮蔽ナノ粒子－アスパラギナーゼ保護：
遊離アスパラギナーゼ、部分的に遮蔽されたアスパラギナーゼまたは遮蔽ナノ粒子－アスパラギナーゼ（１５～２０μｇ／ｍｌ）を、１０μｇ／ｍｌのプロナーゼで処理し、リン酸バッファー（０．５Ｍ、ｐＨ７．４）中で３００ｒｐｍでの振盪下、３７℃で異なる時間（１～１９時間）インキュベートした。インキュベーション後、酵素活性を前述のように測定した。「部分的に遮蔽されたアスパラギナーゼ」は、国際公開第２０１５／０１４８８８号パンフレットに記載されているように生成されたナノ粒子に対応し、酵素アスパラギナーゼの約２５％が保護層によって包埋される。「遮蔽ナノ粒子－アスパラギナーゼ」は、国際公開第２０１５／０１４８８８号パンフレットに記載されているように生成されたナノ粒子に対応し、酵素アスパラギナーゼは、保護層によって完全に包埋される。
遊離アスパラギナーゼ、部分的に遮蔽されたアスパラギナーゼまたは遮蔽ナノ粒子－アスパラギナーゼ（１５～２０μｇ／ｍｌ）を、１０μｇ／ｍｌのプロナーゼで処理し、リン酸バッファー（０．５Ｍ、ｐＨ７．４）中で３００ｒｐｍでの振盪下、３７℃で異なる時間（１～１９時間）インキュベートした。インキュベーション後、酵素活性を前述のように測定した。「部分的に遮蔽されたアスパラギナーゼ」は、国際公開第２０１５／０１４８８８号パンフレットに記載されているように生成されたナノ粒子に対応し、酵素アスパラギナーゼの約２５％が保護層によって包埋される。「遮蔽ナノ粒子－アスパラギナーゼ」は、国際公開第２０１５／０１４８８８号パンフレットに記載されているように生成されたナノ粒子に対応し、酵素アスパラギナーゼは、保護層によって完全に包埋される。
【0109】
細胞培養：
ヒト肝細胞がん細胞株ＨｅｐＧ２をＣＬＳから入手した（３００１９８）。細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０中で３７℃および５％ＣＯ２で培養した。すべての培地および試薬は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ＰＡＮＣ－１（ヒト膵臓がん細胞株）およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ヒト乳がん細胞株）細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１％非必須アミノ酸および１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で培養した。ＪＨＨ５（ヒト肝細胞がん細胞株）細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１％非必須アミノ酸および１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ中で培養した。ＲＡＪＩ（ヒトバーキットリンパ腫細胞株）細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１％非必須アミノ酸および１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ中で培養した。
ヒト肝細胞がん細胞株ＨｅｐＧ２をＣＬＳから入手した（３００１９８）。細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０中で３７℃および５％ＣＯ２で培養した。すべての培地および試薬は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ＰＡＮＣ－１（ヒト膵臓がん細胞株）およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ヒト乳がん細胞株）細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１％非必須アミノ酸および１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で培養した。ＪＨＨ５（ヒト肝細胞がん細胞株）細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１％非必須アミノ酸および１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ中で培養した。ＲＡＪＩ（ヒトバーキットリンパ腫細胞株）細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１％非必須アミノ酸および１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ中で培養した。
【0110】
細胞傷害性アッセイ：
ＨｅｐＧ２細胞株を２×１０４細胞／ウェルの密度で９６ウェル平底細胞培養プレートに播種した。２４時間後、培養培地を交換し、細胞を漸増濃度のナノ粒子（０～１０００μｇ／ｍＬ）またはジギトニン（３０μｇ／ｍＬ）で４８時間処理した。細胞を含まないナノ粒子の複製物をブランクとして使用した。
ＨｅｐＧ２細胞株を２×１０４細胞／ウェルの密度で９６ウェル平底細胞培養プレートに播種した。２４時間後、培養培地を交換し、細胞を漸増濃度のナノ粒子（０～１０００μｇ／ｍＬ）またはジギトニン（３０μｇ／ｍＬ）で４８時間処理した。細胞を含まないナノ粒子の複製物をブランクとして使用した。
【0111】
ＬＤＨ活性アッセイを、市販のキットを使用して実行した。試薬を製造業者の指示に従って調製した。ポジティブコントロールを０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００で処理し、室温で１０分間インキュベートした。次いで、プレートを４５０ｇで５分間遠心分離した。５０マイクロリットルの細胞上清をアッセイプレートに移し、等容積の混合検出キット試薬と混合した。２０分間のインキュベーション後、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１マルチモードマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して４９０ｎｍで吸収度を測定した。
【0112】
最後に、ＬＤＨ漏出を細胞傷害性のパーセンテージ［（試料吸収度－無細胞試料ブランク）／（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘポジティブコントロール吸収度－培地対照吸収度）］として表した。
【0113】
溶血アッセイ：
ヒト血液試料を、Ｂａｓｅｌ（Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅｚｅｎｔｒｕｍ ＳＲＫ ｂｅｉｄｅｒ Ｂａｓｅｌ）の献血センターで健康な成人ボランティアから新たに入手した。抗凝固剤としてリチウムヘパリンを含有するバキュテーナーチューブに血液を採取した。溶血測定のために、希釈した全血（１０±２ｍｇ／ｍＬの総血中ヘモグロビンを含有する）を、３７℃で３時間、漸増濃度のナノ粒子（０～１０００μｇ／ｍＬ）に曝露し、３０分ごとにチューブを混合した。トリトン（１０ｍｇ／ｍＬ）およびＰＢＳをそれぞれポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして使用した。曝露後、血液懸濁液を遠心分離し（８００ｇ、１５分）、ＣＨＲ試薬（シアン化物を含有するＤｒａｂｋｉｎ溶液）を添加して、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１マルチモードマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して５４０ｎｍで分光光度的に上清中のヘモグロビンの安定形態を検出した。
ヒト血液試料を、Ｂａｓｅｌ（Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅｚｅｎｔｒｕｍ ＳＲＫ ｂｅｉｄｅｒ Ｂａｓｅｌ）の献血センターで健康な成人ボランティアから新たに入手した。抗凝固剤としてリチウムヘパリンを含有するバキュテーナーチューブに血液を採取した。溶血測定のために、希釈した全血（１０±２ｍｇ／ｍＬの総血中ヘモグロビンを含有する）を、３７℃で３時間、漸増濃度のナノ粒子（０～１０００μｇ／ｍＬ）に曝露し、３０分ごとにチューブを混合した。トリトン（１０ｍｇ／ｍＬ）およびＰＢＳをそれぞれポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして使用した。曝露後、血液懸濁液を遠心分離し（８００ｇ、１５分）、ＣＨＲ試薬（シアン化物を含有するＤｒａｂｋｉｎ溶液）を添加して、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１マルチモードマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して５４０ｎｍで分光光度的に上清中のヘモグロビンの安定形態を検出した。
【0114】
溶血時に放出されたヘモグロビンの量を、Ｄｒａｂｋｉｎの試薬の較正曲線および市販のヒトヘモグロビンからの品質管理を使用して分析した。
【0115】
生体内分布：
Ｓｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙラットまたはＣＤ－１マウスに、５０ｍｇ／ｋｇの１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－ナノ粒子を側尾静脈内または眼窩後部に静脈内注射した。終了時点で、ケタミン塩酸塩（５０ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン塩酸塩（１０ｍｇ／ｋｇ）との混合物の腹腔内注射によって動物を麻酔し、次いで、それらを心内穿刺による失血によって動物を迅速に屠殺した。
Ｓｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙラットまたはＣＤ－１マウスに、５０ｍｇ／ｋｇの１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－ナノ粒子を側尾静脈内または眼窩後部に静脈内注射した。終了時点で、ケタミン塩酸塩（５０ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン塩酸塩（１０ｍｇ／ｋｇ）との混合物の腹腔内注射によって動物を麻酔し、次いで、それらを心内穿刺による失血によって動物を迅速に屠殺した。
【0116】
目的の器官を切除し、生理的血清ですすぎ、精密天秤を使用して秤量した。組織放射能のカウントは、ルテチウム－１７７放射性核種（効率：１３．８％；ＬＬＯＱ：５００ｃｐｍ）について較正された自動ガンマカウンター（Ｗａｌｌａｃｅ Ｗｉｚａｒｄ２４７０－Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で実行した。サンプリングした組織中の放射能を、組織１グラム当たりのＩＤのパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）として表した。
【0117】
抗腫瘍効果アッセイ：
細胞を、５×１０４細胞／ウェルの密度で９６ウェル平底細胞培養プレートに播種した。２４時間後、培地を交換し、細胞を漸増濃度の遊離アスパラギナーゼ、ＮＰ－１、不活性化ＮＰ－１、ＮＰ－２、不活性化ＮＰ－２またはＮＰ－５（０～２０００ｍＵ／ｍＬ）で４８時間処理した。細胞単層を培地ですすぎ、ＭＴＴ（３－［４，５－ジメチルチアゾール－２－イル］－２，５－ジフェニルテトラゾリウム臭化物）溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加した。細胞培養物を３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション期間中に生成されたホルマザン結晶をＤＭＳＯに溶解した。完全な可溶化後、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１マルチモードマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して５７０ｎｍおよび６８０ｎｍ（参照波長）で吸収度を測定した。最後に、ＭＴＴ結果を生存率のパーセンテージとして表した：［（試料吸収度－無細胞試料ブランク）×１００／（未処理試料吸収度－無細胞試料ブランク）］。無処理対照細胞の生存率を任意に１００％とした。
細胞を、５×１０４細胞／ウェルの密度で９６ウェル平底細胞培養プレートに播種した。２４時間後、培地を交換し、細胞を漸増濃度の遊離アスパラギナーゼ、ＮＰ－１、不活性化ＮＰ－１、ＮＰ－２、不活性化ＮＰ－２またはＮＰ－５（０～２０００ｍＵ／ｍＬ）で４８時間処理した。細胞単層を培地ですすぎ、ＭＴＴ（３－［４，５－ジメチルチアゾール－２－イル］－２，５－ジフェニルテトラゾリウム臭化物）溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加した。細胞培養物を３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション期間中に生成されたホルマザン結晶をＤＭＳＯに溶解した。完全な可溶化後、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１マルチモードマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して５７０ｎｍおよび６８０ｎｍ（参照波長）で吸収度を測定した。最後に、ＭＴＴ結果を生存率のパーセンテージとして表した：［（試料吸収度－無細胞試料ブランク）×１００／（未処理試料吸収度－無細胞試料ブランク）］。無処理対照細胞の生存率を任意に１００％とした。
【0118】
ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）に対する増殖アッセイ：
Ｆｉｃｏｌｌ勾配による分離後、健常ドナー由来のＰＢＭＣを、製造業者の指示に従って、３７℃で１０分間、１μＭ ＣＦＳＥで直ちに標識し、ＰＢＳで洗浄した。標識細胞を、漸増濃度のＮＰ－１もしくはＮＰ－２（０～１０００ｕｇ／ｍＬ）を有する完全培地またはポジティブコントロールとしてのＰＨＡ（１０ｕｇ／ｍＬ）で７２時間培養した。すべての実験において、ＣＦＳＥ希釈をフローサイトメトリーによって分析した。
Ｆｉｃｏｌｌ勾配による分離後、健常ドナー由来のＰＢＭＣを、製造業者の指示に従って、３７℃で１０分間、１μＭ ＣＦＳＥで直ちに標識し、ＰＢＳで洗浄した。標識細胞を、漸増濃度のＮＰ－１もしくはＮＰ－２（０～１０００ｕｇ／ｍＬ）を有する完全培地またはポジティブコントロールとしてのＰＨＡ（１０ｕｇ／ｍＬ）で７２時間培養した。すべての実験において、ＣＦＳＥ希釈をフローサイトメトリーによって分析した。
【0119】
がん細胞標的化：
蛍光性ＮＰ－１および蛍光性（ｆｌｕｒｏｒｅｓｃｅｎｔ）ＮＰ－５（５０μｇ）を、ＰＢＳ－ＦＢＳ１％中、氷上で３０分間、ＲＡＪＩ細胞とインキュベートした。洗浄およびＰＢＳ中での再懸濁後、ＲＡＪＩ細胞上のナノ粒子の結合をフローサイトメトリーによって評価し、ソフトウェアＦｌｏｗＪｏを使用して分析した。
蛍光性ＮＰ－１および蛍光性（ｆｌｕｒｏｒｅｓｃｅｎｔ）ＮＰ－５（５０μｇ）を、ＰＢＳ－ＦＢＳ１％中、氷上で３０分間、ＲＡＪＩ細胞とインキュベートした。洗浄およびＰＢＳ中での再懸濁後、ＲＡＪＩ細胞上のナノ粒子の結合をフローサイトメトリーによって評価し、ソフトウェアＦｌｏｗＪｏを使用して分析した。
【0120】
結果：
実施例１：ＰＥＧ官能化
遮蔽ナノ粒子（ナノ粒子１、ＮＰ－１）の表面にＰＥＧを取り込む能力を評価するために、シラン－ＰＥＧ－ＦＩＴＣ（ＮＰ－２）が使用されている。図２に示されるように、遮蔽ナノ粒子ＮＰ－１（それぞれ６５１８対３４３）と比較して、反応したナノ粒子（ナノ粒子－ＰＥＧ－ＦＩＴＣ、ＮＰ－２）に対する重縮合の反応後の蛍光の増加は、ナノ粒子の表面でのＰＥＧ－ＦＩＴＣの固定化を実証する。この結果は、ＰＥＧでナノ粒子を官能化する戦略を検証する。
実施例１：ＰＥＧ官能化
遮蔽ナノ粒子（ナノ粒子１、ＮＰ－１）の表面にＰＥＧを取り込む能力を評価するために、シラン－ＰＥＧ－ＦＩＴＣ（ＮＰ－２）が使用されている。図２に示されるように、遮蔽ナノ粒子ＮＰ－１（それぞれ６５１８対３４３）と比較して、反応したナノ粒子（ナノ粒子－ＰＥＧ－ＦＩＴＣ、ＮＰ－２）に対する重縮合の反応後の蛍光の増加は、ナノ粒子の表面でのＰＥＧ－ＦＩＴＣの固定化を実証する。この結果は、ＰＥＧでナノ粒子を官能化する戦略を検証する。
【0121】
実施例２：アルブミン官能化
ＨＳＡによる遮蔽ナノ粒子（ナノ粒子１、ＮＰ－１）の表面官能化を、ＨＳＡとの反応後のナノ粒子（ナノ粒子３）の上清中のタンパク質定量化によって評価した。ナノ粒子の表面でのＨＳＡの固定化を示す図３に示されるように、ナノ粒子の上清中のタンパク質濃度は、ＨＳＡの初期溶液と比較して劇的に減少した（それぞれ０．１対２０μｇ／ｍＬ）。この結果は、タンパク質で遮蔽ナノ粒子を官能化する能力を示す。
ＨＳＡによる遮蔽ナノ粒子（ナノ粒子１、ＮＰ－１）の表面官能化を、ＨＳＡとの反応後のナノ粒子（ナノ粒子３）の上清中のタンパク質定量化によって評価した。ナノ粒子の表面でのＨＳＡの固定化を示す図３に示されるように、ナノ粒子の上清中のタンパク質濃度は、ＨＳＡの初期溶液と比較して劇的に減少した（それぞれ０．１対２０μｇ／ｍＬ）。この結果は、タンパク質で遮蔽ナノ粒子を官能化する能力を示す。
【0122】
実施例３：クリックケミストリー官能化
クリックケミストリーを使用して遮蔽ナノ粒子（ナノ粒子１、ＮＰ－１）の表面官能化を評価するために、エチニル修飾ナノ粒子をアジド－ＦＩＴＣ（Ｎ３－ＦＩＴＣ）と反応させて、ナノ粒子４を得た。図４に示される反応後の遊離Ｎ３－ＦＩＴＣとナノ粒子との蛍光強度の比較は、蛍光偏光の増加を示す（それぞれ８４対２３８）。この結果は、クリックケミストリーによるナノ粒子の表面でのＮ３－ＦＩＴＣの固定化を実証し、さらなるアジド修飾化合物でナノ粒子を官能化するこのプロセスを検証する。
クリックケミストリーを使用して遮蔽ナノ粒子（ナノ粒子１、ＮＰ－１）の表面官能化を評価するために、エチニル修飾ナノ粒子をアジド－ＦＩＴＣ（Ｎ３－ＦＩＴＣ）と反応させて、ナノ粒子４を得た。図４に示される反応後の遊離Ｎ３－ＦＩＴＣとナノ粒子との蛍光強度の比較は、蛍光偏光の増加を示す（それぞれ８４対２３８）。この結果は、クリックケミストリーによるナノ粒子の表面でのＮ３－ＦＩＴＣの固定化を実証し、さらなるアジド修飾化合物でナノ粒子を官能化するこのプロセスを検証する。
【0123】
実施例４：アスパラギナーゼ活性アッセイ：遊離酵素と比較した、国際公開第２０１５／０１４８８８号パンフレットに記載されているように生成されたナノ粒子の安定性
遮蔽ナノ粒子（ナノ粒子１、ＮＰ－１）に対する生体触媒活性の安定性を、ネスラー反応を使用して評価し、３７℃で１３週間にわたって遊離酵素と比較した。図５に示される結果は、遊離酵素と比較してＮＰ－１に対する酵素活性の半減期の増加を示し（それぞれ７４日間対１０日間）、ＮＰ－１に対する生体触媒活性の安定化に対するオルガノシランの保護層の利点を強調している。
遮蔽ナノ粒子（ナノ粒子１、ＮＰ－１）に対する生体触媒活性の安定性を、ネスラー反応を使用して評価し、３７℃で１３週間にわたって遊離酵素と比較した。図５に示される結果は、遊離酵素と比較してＮＰ－１に対する酵素活性の半減期の増加を示し（それぞれ７４日間対１０日間）、ＮＰ－１に対する生体触媒活性の安定化に対するオルガノシランの保護層の利点を強調している。
【0124】
実施例５：国際公開第２０１５／０１４８８８号パンフレットに記載されているように生体液中で生成されたナノ粒子のアスパラギナーゼ活性アッセイ
ヒト血清アルブミン（４０ｍｇ／ｍＬ）および全血中のＮＰ－１の酵素活性を、ネスラー反応を用いて測定し、リン酸バッファー中の酵素活性と比較した。図６に示される結果は、生体液中のＮＰ－１の持続的な酵素活性を示す。
ヒト血清アルブミン（４０ｍｇ／ｍＬ）および全血中のＮＰ－１の酵素活性を、ネスラー反応を用いて測定し、リン酸バッファー中の酵素活性と比較した。図６に示される結果は、生体液中のＮＰ－１の持続的な酵素活性を示す。
【0125】
実施例６：ＥＬＩＳＡ：国際公開第２０１５／０１４８８８号パンフレットに記載されているように生成されたナノ粒子の抗アスパラギナーゼ抗体応答
ＮＰ－１上の遮蔽酵素への抗体アクセスをＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）によって評価した。それらの発達の異なる段階におけるナノ粒子および最終ＮＰ－１を抗アスパラギナーゼ抗体とインキュベートした。ナノ粒子前駆体（固定化酵素および部分的に遮蔽された酵素）の場合、抗アスパラギナーゼ抗体の有意な結合が観察される。しかしながら、図７に示されるように、アスパラギナーゼが完全に遮蔽されると（ＮＰ－１）、抗アスパラギナーゼ抗体による酵素の認識が劇的に低下する。この抗体認識の欠如は、ＮＰ－１上の酵素への抗体アクセスの防止を実証する。
ＮＰ－１上の遮蔽酵素への抗体アクセスをＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）によって評価した。それらの発達の異なる段階におけるナノ粒子および最終ＮＰ－１を抗アスパラギナーゼ抗体とインキュベートした。ナノ粒子前駆体（固定化酵素および部分的に遮蔽された酵素）の場合、抗アスパラギナーゼ抗体の有意な結合が観察される。しかしながら、図７に示されるように、アスパラギナーゼが完全に遮蔽されると（ＮＰ－１）、抗アスパラギナーゼ抗体による酵素の認識が劇的に低下する。この抗体認識の欠如は、ＮＰ－１上の酵素への抗体アクセスの防止を実証する。
【0126】
実施例７：アスパラギナーゼ活性アッセイ：国際公開第２０１５／０１４８８８号パンフレットに記載されているように生成されたナノ粒子のプロナーゼに対する保護
外部ストレスに対するＮＰ－１の耐性を評価するために、遊離酵素、部分的に遮蔽された酵素および完全に遮蔽された酵素（ＮＰ－１）を２０時間プロテアーゼに曝露し、ネスラー反応を使用して残りの酵素活性を評価した。予想通り、プロナーゼとのインキュベーション後、遊離アスパラギナーゼについては活性が測定されず、図８に示されるように、部分的に遮蔽された酵素については活性の８５％の喪失が測定された。ナノ粒子１の場合、生体触媒活性の２５％の喪失が報告され、固定化および遮蔽酵素の利用可能性がプロテアーゼ消化を妨げたことが示唆された。
外部ストレスに対するＮＰ－１の耐性を評価するために、遊離酵素、部分的に遮蔽された酵素および完全に遮蔽された酵素（ＮＰ－１）を２０時間プロテアーゼに曝露し、ネスラー反応を使用して残りの酵素活性を評価した。予想通り、プロナーゼとのインキュベーション後、遊離アスパラギナーゼについては活性が測定されず、図８に示されるように、部分的に遮蔽された酵素については活性の８５％の喪失が測定された。ナノ粒子１の場合、生体触媒活性の２５％の喪失が報告され、固定化および遮蔽酵素の利用可能性がプロテアーゼ消化を妨げたことが示唆された。
【0127】
実施例８：細胞毒性アッセイ：国際公開第２０１５／０１４８８８号パンフレットに記載されているように生成された酵素不活性化ナノ粒子のＬＤＨ－４８時間
ナノ粒子の生体適合性を評価するために、肝細胞がん細胞（ＨｅｐＧ２）を漸増濃度の酵素不活性化ＮＰ－１（５～１０００μｇ／ｍＬ）で４８時間処理した。細胞損傷を、上清中の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出の測定によって評価した。図９に示される結果は、ＮＰ－１がＨｅｐＧ２細胞の生存率に影響を及ぼさないことを示している。
ナノ粒子の生体適合性を評価するために、肝細胞がん細胞（ＨｅｐＧ２）を漸増濃度の酵素不活性化ＮＰ－１（５～１０００μｇ／ｍＬ）で４８時間処理した。細胞損傷を、上清中の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出の測定によって評価した。図９に示される結果は、ＮＰ－１がＨｅｐＧ２細胞の生存率に影響を及ぼさないことを示している。
【0128】
実施例９：国際公開第２０１５／０１４８８８号パンフレットに記載されているように生成されたナノ粒子の溶血アッセイ
ＮＰ－１の潜在的溶血活性を評価するために、漸増量の酵素不活性化ＮＰ－１を３７℃で３時間全血に添加した。インキュベーション後、図１０に示すように、いずれの条件でも溶血は観察されず、ＮＰ－１の生体適合性を指摘した。
ＮＰ－１の潜在的溶血活性を評価するために、漸増量の酵素不活性化ＮＰ－１を３７℃で３時間全血に添加した。インキュベーション後、図１０に示すように、いずれの条件でも溶血は観察されず、ＮＰ－１の生体適合性を指摘した。
【0129】
実施例１０：体内分布（比較実験）
組織生体内分布に対する遮蔽ナノ粒子の官能化の影響を評価するために、ルテチウム－１７７－放射性標識－ＤＯＴＡ（１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ）遮蔽ナノ粒子（ＮＰ－１－Ｄ）（図１１Ａ／Ｃ）およびペグ化遮蔽ナノ粒子（ＮＰ－２－Ｄ）（図１１Ｂ／Ｄ）を５０ｍｇ／ｋｇで動物に注射した。組織および血液の放射能を異なる時点（０～７日）で実行した。結果は、ナノ粒子が注射の１０分後に血流から急速に取り除かれたことを示している（図１１Ａ／Ｂ）。しかしながら、ペグ化ナノ粒子（ＮＰ－２－Ｄ）の量は、血液循環中の非修飾のナノ粒子（ＮＰ－１－Ｄ）よりも１０倍多いようである。両方の場合において、肝臓および脾臓が、血液からの１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－ナノ粒子の除去の主要な部位であった（図１１Ｃ／Ｄ）。ナノ粒子の両方の製剤の％ＩＤ／ｇの比較は、生物体におけるペグ化ナノ粒子（ＮＰ－２－Ｄ）の保持がＮＰ－１－Ｄよりも高いことを示す。全体として、これらのｉｎ ｖｉｖｏデータは、ＰＥＧによるナノ粒子の表面修飾が生物学的答えの調節を可能にすることを明らかにし、それらの表面を調節することによって注入されたナノ粒子の運命を制御する可能性を示唆する。
組織生体内分布に対する遮蔽ナノ粒子の官能化の影響を評価するために、ルテチウム－１７７－放射性標識－ＤＯＴＡ（１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ）遮蔽ナノ粒子（ＮＰ－１－Ｄ）（図１１Ａ／Ｃ）およびペグ化遮蔽ナノ粒子（ＮＰ－２－Ｄ）（図１１Ｂ／Ｄ）を５０ｍｇ／ｋｇで動物に注射した。組織および血液の放射能を異なる時点（０～７日）で実行した。結果は、ナノ粒子が注射の１０分後に血流から急速に取り除かれたことを示している（図１１Ａ／Ｂ）。しかしながら、ペグ化ナノ粒子（ＮＰ－２－Ｄ）の量は、血液循環中の非修飾のナノ粒子（ＮＰ－１－Ｄ）よりも１０倍多いようである。両方の場合において、肝臓および脾臓が、血液からの１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－ナノ粒子の除去の主要な部位であった（図１１Ｃ／Ｄ）。ナノ粒子の両方の製剤の％ＩＤ／ｇの比較は、生物体におけるペグ化ナノ粒子（ＮＰ－２－Ｄ）の保持がＮＰ－１－Ｄよりも高いことを示す。全体として、これらのｉｎ ｖｉｖｏデータは、ＰＥＧによるナノ粒子の表面修飾が生物学的答えの調節を可能にすることを明らかにし、それらの表面を調節することによって注入されたナノ粒子の運命を制御する可能性を示唆する。
【0130】
実施例１１：ＮＰ－２の抗腫瘍効果
ＮＰ－２の抗腫瘍効果を評価するために、生存率アッセイを異なるヒトがん細胞に対して実行した。細胞を、漸増濃度のＮＰ－２もしくは遊離アスパラギナーゼ（１～２０００ｍＵ／ｍＬ）またはネガティブコントロールとしての等量の不活性化ＮＰ－２に曝露した。図１２Ａは、３つのがん細胞株における遊離アスパラギナーゼと比較したＮＰ－２のより効率的な抗腫瘍効果を示す。アスパラギナーゼは、腫瘍環境においてアスパラギンを枯渇させることによってその抗腫瘍効果を発揮する。ＮＰ－２および遊離アスパラギナーゼの抗腫瘍効果において観察された差異を説明するために、本発明者らは、これらの２つの化合物の酵素活性を評価した。驚くべきことに、結果は、試験した範囲でＮＰ－２と比較して遊離酵素のより高い酵素活性を示し（図１２Ｂ）、これは化合物の抗腫瘍活性と逆相関している。この結果は、ＮＰ－２などの官能化ナノ粒子の抗腫瘍効果の増強が、官能化ナノ粒子によって誘導される長期の代謝制限に関連すると思われることを示している。
ＮＰ－２の抗腫瘍効果を評価するために、生存率アッセイを異なるヒトがん細胞に対して実行した。細胞を、漸増濃度のＮＰ－２もしくは遊離アスパラギナーゼ（１～２０００ｍＵ／ｍＬ）またはネガティブコントロールとしての等量の不活性化ＮＰ－２に曝露した。図１２Ａは、３つのがん細胞株における遊離アスパラギナーゼと比較したＮＰ－２のより効率的な抗腫瘍効果を示す。アスパラギナーゼは、腫瘍環境においてアスパラギンを枯渇させることによってその抗腫瘍効果を発揮する。ＮＰ－２および遊離アスパラギナーゼの抗腫瘍効果において観察された差異を説明するために、本発明者らは、これらの２つの化合物の酵素活性を評価した。驚くべきことに、結果は、試験した範囲でＮＰ－２と比較して遊離酵素のより高い酵素活性を示し（図１２Ｂ）、これは化合物の抗腫瘍活性と逆相関している。この結果は、ＮＰ－２などの官能化ナノ粒子の抗腫瘍効果の増強が、官能化ナノ粒子によって誘導される長期の代謝制限に関連すると思われることを示している。
【0131】
実施例１２：ＰＢＭＣ増殖（比較実験）
国際公開第２０１５／０１４８８８号パンフレットに記載されているナノ粒子（ＮＰ－１）および本発明によるナノ粒子（上記の「ＰＥＧによる官能化」の項に記載されているＮＰ－２）の免疫安全性を、ヒトリンパ球増殖を誘導するナノ粒子の能力を測定することによって評価した。新鮮分離した（Ｆｒｅｓｈｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ）ＰＢＭＣをＣＦＳＥで標識し、ナノ粒子を含まない完全培地（ネガティブコントロール、未処理条件）、漸増濃度のＮＰ－１およびＮＰ－２（１００～１０００ｕｇ／ｍＬ）、またはＰＨＡ（ポジティブコントロール）に７２時間曝露した。リンパ球の増殖をフローサイトメトリーによって評価した。図１３は、ＮＰ－１によって誘導されたリンパ球増殖を示し、ＮＰ－１によって誘導された免疫応答（リンパ球増殖）を実証するが、ＮＰ－２は、リンパ球増殖を促進しない（未処理条件と比較して）。この結果は、免疫安全性に関して国際公開第２０１５／０１４８８８号パンフレットに記載されているナノ粒子と比較して、本発明のナノ粒子の驚くべき顕著な利益を実証する。
国際公開第２０１５／０１４８８８号パンフレットに記載されているナノ粒子（ＮＰ－１）および本発明によるナノ粒子（上記の「ＰＥＧによる官能化」の項に記載されているＮＰ－２）の免疫安全性を、ヒトリンパ球増殖を誘導するナノ粒子の能力を測定することによって評価した。新鮮分離した（Ｆｒｅｓｈｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ）ＰＢＭＣをＣＦＳＥで標識し、ナノ粒子を含まない完全培地（ネガティブコントロール、未処理条件）、漸増濃度のＮＰ－１およびＮＰ－２（１００～１０００ｕｇ／ｍＬ）、またはＰＨＡ（ポジティブコントロール）に７２時間曝露した。リンパ球の増殖をフローサイトメトリーによって評価した。図１３は、ＮＰ－１によって誘導されたリンパ球増殖を示し、ＮＰ－１によって誘導された免疫応答（リンパ球増殖）を実証するが、ＮＰ－２は、リンパ球増殖を促進しない（未処理条件と比較して）。この結果は、免疫安全性に関して国際公開第２０１５／０１４８８８号パンフレットに記載されているナノ粒子と比較して、本発明のナノ粒子の驚くべき顕著な利益を実証する。
【0132】
実施例１３：ＮＰ－５の抗腫瘍効果（比較実験）
官能化ナノ粒子によるがん細胞の特異的な標的化およびそれらの治療用途を評価するために、抗ＣＤ１９抗体をナノ粒子の表面に固定化された。蛍光性ＮＰ－５をＲＡＪＩ細胞と共インキュベーションした後、がん細胞に対するそれらの結合をフローサイトメトリーによって評価した。結果は、抗ＣＤ１９抗体によるナノ粒子の官能化ががん細胞の標的化を誘導するが、非修飾のナノ粒子（ＮＰ－１）は、細胞と相互作用しないことを示す（図１４Ａ）。この相互作用の治療的影響を生存率アッセイによって評価した。ＲＡＪＩ細胞を、３７℃で１５分間、漸増濃度のＮＰ－５、ＮＰ－１または不活性化ＮＰ－１（２００～２０００ｍＵ／ｍＬ）に曝露し、次いで、未結合ナノ粒子を洗浄によって除去した。生存率アッセイを、ポジティブコントロールとして遊離アスパラギナーゼを用いて４８時間実行した。図１４Ｂは、ＮＰ－５の抗腫瘍効果を示すが、非官能化ナノ粒子（ＮＰ－１）は、いかなる細胞毒性も誘発せず、これは、ＮＰ－１がこのアッセイにおいて細胞生存率に対する効果を有するはずの活性アスパラギナーゼを担持するので予想外であった。さらに、ＮＰ－５は、遊離アスパラギナーゼと比較して、ＲＡＪＩ細胞に対してより効率的な抗腫瘍効果を示す。全体として、これらの結果は、ナノ粒子の表面官能化によって促進されたがん細胞の特異的標的化が、がん細胞とナノ粒子との間の強い相互作用を可能にし、驚くほど増強された抗腫瘍効果をもたらすことを実証している。
官能化ナノ粒子によるがん細胞の特異的な標的化およびそれらの治療用途を評価するために、抗ＣＤ１９抗体をナノ粒子の表面に固定化された。蛍光性ＮＰ－５をＲＡＪＩ細胞と共インキュベーションした後、がん細胞に対するそれらの結合をフローサイトメトリーによって評価した。結果は、抗ＣＤ１９抗体によるナノ粒子の官能化ががん細胞の標的化を誘導するが、非修飾のナノ粒子（ＮＰ－１）は、細胞と相互作用しないことを示す（図１４Ａ）。この相互作用の治療的影響を生存率アッセイによって評価した。ＲＡＪＩ細胞を、３７℃で１５分間、漸増濃度のＮＰ－５、ＮＰ－１または不活性化ＮＰ－１（２００～２０００ｍＵ／ｍＬ）に曝露し、次いで、未結合ナノ粒子を洗浄によって除去した。生存率アッセイを、ポジティブコントロールとして遊離アスパラギナーゼを用いて４８時間実行した。図１４Ｂは、ＮＰ－５の抗腫瘍効果を示すが、非官能化ナノ粒子（ＮＰ－１）は、いかなる細胞毒性も誘発せず、これは、ＮＰ－１がこのアッセイにおいて細胞生存率に対する効果を有するはずの活性アスパラギナーゼを担持するので予想外であった。さらに、ＮＰ－５は、遊離アスパラギナーゼと比較して、ＲＡＪＩ細胞に対してより効率的な抗腫瘍効果を示す。全体として、これらの結果は、ナノ粒子の表面官能化によって促進されたがん細胞の特異的標的化が、がん細胞とナノ粒子との間の強い相互作用を可能にし、驚くほど増強された抗腫瘍効果をもたらすことを実証している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A-B】
【図11A-B】
【図11C-D】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14】
【国際調査報告】