特表 2024-515182 薬物で調節可能な転写因子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-05

(54)【発明の名称】薬物で調節可能な転写因子

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/87 20060101AFI20240329BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240329BHJP

   C07K 14/05 20060101ALI20240329BHJP

   C07K 14/035 20060101ALI20240329BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240329BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20240329BHJP

   A61K 31/522 20060101ALI20240329BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240329BHJP

   A61K 31/352 20060101ALI20240329BHJP

   A61K 31/455 20060101ALI20240329BHJP

   A61K 31/05 20060101ALI20240329BHJP

   A61K 31/436 20060101ALI20240329BHJP

   A61K 31/575 20060101ALI20240329BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20240329BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240329BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240329BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240329BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20240329BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20240329BHJP

   C12N 5/0781 20100101ALN20240329BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALN20240329BHJP

   C12N 5/0786 20100101ALN20240329BHJP

   C12N 5/0784 20100101ALN20240329BHJP

   C12N 5/077 20100101ALN20240329BHJP

   C12N 5/0787 20100101ALN20240329BHJP

【ＦＩ】

C12N15/87 Z

C12N5/10 ZNA

C07K14/05

C07K14/035

C12N15/63 Z

C07K14/705

A61K31/522

A61P43/00 105

A61K31/352

A61K31/455

A61K31/05

A61K31/436

A61K31/575

C07K16/00

C07K19/00

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N15/09 100

C12N5/0783

C12N5/0781

C12N5/0735

C12N5/0786

C12N5/0784

C12N5/077

C12N5/0787

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023563951

(86)(22)【出願日】2022-04-19

(85)【翻訳文提出日】2023-11-14

(86)【国際出願番号】 US2022025366

(87)【国際公開番号】W WO2022225943

(87)【国際公開日】2022-10-27

(31)【優先権主張番号】63/176,801

(32)【優先日】2021-04-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/176,848

(32)【優先日】2021-04-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519028678

【氏名又は名称】センティ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(74)【代理人】

【識別番号】100221741

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 直子

(74)【代理人】

【識別番号】100114926

【弁理士】

【氏名又は名称】枝松 義恵

(72)【発明者】

【氏名】ハン ミシェル エリザベス

(72)【発明者】

【氏名】ゴードリー ラッセル モリソン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C086

4C206

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA57Y

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AA83X

4B065AA83Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4C086AA01

4C086AA02

4C086BA08

4C086BC19

4C086CB07

4C086CB22

4C086DA09

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA20

4C086ZB21

4C206AA01

4C206AA02

4C206CA19

4C206MA01

4C206MA04

4C206NA20

4C206ZB21

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA09

4H045CA03

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

同族リガンド（例えば、カフェイン、カンナビノイド、ニコチン、ラパマイシン、又はミフェプリストン）によって活性化され得る合成誘導性転写因子、及び、誘導性転写因子を発現する単離された細胞が、本明細書に提供される。また、誘導性転写因子を使用して目的の遺伝子の転写を調節する方法も提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

誘導性転写因子（ＩＴＦ）を含む操作された細胞であって、
前記ＩＴＦが、
ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の単量体と、
転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の単量体と
を含み、
各単量体が、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドを介してオリゴマー化可能であり、
リガンド誘導オリゴマー化が、前記ＩＴＦを形成し、
前記同族リガンドが、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択され、
任意選択で、前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、
任意選択で、各リガンド結合ドメインが、単一ドメイン抗体を含み、
前記単一ドメイン抗体が、Ｖ_ＨＨを含み、
任意選択で、前記ＩＴＦが、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができる、
操作された細胞。

【請求項2】

ａ．前記Ｖ_ＨＨが、抗カフェインＶ_ＨＨ（ａｃ Ｖ_ＨＨ）であり、
任意選択で、前記抗カフェインＶ_ＨＨ（ａｃ Ｖ_ＨＨ）が、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、かつ／若しくは
任意選択で、前記第１のリガンド結合ドメイン及び前記第２のリガンド結合ドメインの各々が、前記ａｃ Ｖ_ＨＨを含む、又は
ｂ．前記同族リガンドが、カンナビジオール若しくはフィトカンナビノイドであり、前記Ｖ_ＨＨが、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７（それぞれ、ＣＡ－１４、ＤＢ－６、ＤＢ－１１、ＤＢ－１８、及びＤＢ－２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、前記第１若しくは前記第２の結合ドメインのうちの他方が、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７（それぞれ、ＤＢ－６、ＤＢ－１１、ＤＢ－１８、及びＤＢ－２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、
任意選択で、前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、前記第１若しくは前記第２の結合ドメインのうちの他方が、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７（それぞれ、ＤＢ－６、ＤＢ－１１、ＤＢ－１８、及びＤＢ－２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、
任意選択で、前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、前記第１若しくは前記第２の結合ドメインのうちの他方が、配列番号５７（ＤＢ－２１）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含む、又は
ｃ．各リガンド結合ドメインが、抗ニコチン抗体重鎖可変ドメイン（抗Ｎｉｃ ＶＨ）若しくは抗ニコチン抗体軽鎖可変ドメイン（抗Ｎｉｃ ＶＬ）を含み、
任意選択で、前記抗Ｎｉｃ ＶＨが、配列番号５８のアミノ酸配列を含み、前記抗Ｎｉｃ ＶＬが、配列番号５９のアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、前記抗Ｎｉｃ ＶＨを含み、前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの他方が、前記抗Ｎｉｃ ＶＬを含む、
請求項１に記載の操作された細胞。

【請求項3】

誘導性転写因子（ＩＴＦ）を含む操作された細胞であって、
前記ＩＴＦが、
ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の単量体と、
転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の単量体と
を含み、
各単量体が、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドの結合を介してオリゴマー化可能であり、
リガンド誘導オリゴマー化が、前記ＩＴＦを形成し、
前記ＤＮＡ結合ドメインが、モジュラー式でありかつ６つのＺＦモチーフのアレイを含むジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、
前記同族リガンドが、ラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、及びそれらの類似体からなる群から選択され、
任意選択で、前記ＩＴＦが、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができる、
操作された細胞。

【請求項4】

ａ．前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、ＦＫＢＰドメインを含み、前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの他方が、ＦＲＢドメインを含み、
任意選択で、前記ＦＫＢＰが、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記ＦＲＢドメインが、配列番号６１のアミノ酸配列を含む、又は
ｂ．前記第１のリガンド結合ドメインが、前記ＦＫＢＰドメインを含み、前記第２のリガンド結合ドメインが、前記ＦＲＢドメインを含み、
任意選択で、前記ＦＫＢＰが、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記ＦＲＢドメインが、配列番号６１のアミノ酸配列を含む、又は
ｃ．前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、前記ＦＲＢドメインを含み、前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの他方が、前記ＦＫＢＰドメインを含み、
任意選択で、前記ＦＫＢＰが、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記ＦＲＢドメインが、配列番号６１のアミノ酸配列を含む、又は
ｄ．前記第１のリガンド結合ドメインが、前記ＦＲＢドメインを含み、前記第２のリガンド結合ドメインが、前記ＦＫＢＰドメインを含み、
任意選択で、前記ＦＫＢＰが、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記ＦＲＢドメインが、配列番号６１のアミノ酸配列を含む、
請求項３に記載の操作された細胞。

【請求項5】

ａ．前記第１の単量体及び／又は前記第２の単量体が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含み、
任意選択で、前記ＮＬＳが、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／又は
ｂ．前記第２の単量体が、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を更に含み、
任意選択で、前記ＮＥＳが、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
請求項１～４のいずれか一項に記載の操作された細胞。

【請求項6】

誘導性転写因子（ＩＴＦ）を含む操作された細胞であって、
前記ＩＴＦが、ＤＮＡ結合ドメイン、転写エフェクタードメイン、及びリガンド結合ドメインを含み、
前記ＩＴＦが、前記リガンド結合ドメインの同族リガンドとの結合時に核局在化を受け、
細胞核に局在化された場合に、前記ＩＴＦが、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができ、
前記同族リガンドが、ミフェプリストン若しくはその誘導体であり、
任意選択で、前記リガンド結合ドメインが、プロゲステロン受容体ドメインを含み、前記プロゲステロン受容体ドメインが、配列番号６８のアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、
任意選択で、前記ＩＴＦが、前記ＤＮＡ結合ドメインと前記転写エフェクタードメインとの間にペプチドリンカーを更に含み、
任意選択で、前記ＤＮＡ結合ドメインが、前記ＩＴＦ応答性プロモーターに結合し、
任意選択で、前記細胞が、前記目的の遺伝子をコードする外因性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された前記ＩＴＦ応答性プロモーターを含む発現カセットを更に含み、
任意選択で、前記ＩＴＦ応答性プロモーターが、ＩＴＦ結合ドメイン配列及びコアプロモーター配列を含み、
任意選択で、前記コアプロモーター配列が、最小プロモーターを含み、前記最小プロモーターが、ｍｉｎＰ、ｍｉｎＣＭＶ、ＹＢ＿ＴＡＴＡ、ｍｉｎＴＡＴＡ、及びｍｉｎＴＫからなる群から選択される、又は前記コアプロモーター配列が、構成的プロモーターに由来し、前記コアプロモーター配列が、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターに由来する、
操作された細胞。

【請求項7】

ａ．前記ＺＦタンパク質ドメインが、モジュラー設計であり、１つ以上のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）から構成され、
ｂ．前記ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のジンクフィンガーモチーフのアレイを含み、かつ／又は
ｃ．前記ＺＦタンパク質ドメインが、６つのジンクフィンガーモチーフのアレイを含む、
請求項１～６のいずれか一項に記載の操作された細胞。

【請求項8】

ａ．前記転写エフェクタードメインが、転写活性化ドメインを含み、
任意選択で、前記転写活性化ドメインが、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化ドメイン；ＶＰ１６の４つのタンデムコピーを含む活性化ドメイン；ＶＰ６４活性化ドメイン；ＮＦκＢのｐ６５活性化ドメイン；エプスタイン－バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）活性化ドメイン；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ活性化ドメイン（ＶＰＲ活性化ドメイン）を含む三者活性化因子；及びヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメイン（ｐ３００ ＨＡＴコア活性化ドメイン）からなる群から選択される、又は
ｂ．前記転写エフェクタードメインが、転写リプレッサードメインを含み、
任意選択で、前記転写リプレッサードメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；短縮型クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）リプレッサードメイン；スクレラキシス（ＳＣＸ）ＨＬＨドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ１）ＨＬＨドメインの阻害剤、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン含有タンパク質２（ＨＥＲＣ２）Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＳＴ１）ＨＬＨドメイン、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．２（ＮＫＸ２２）ホメオドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ３）ＨＬＨドメインの阻害剤、並びにツイスト関連タンパク質２（ＴＷＳＴ２）ＨＬＨドメイン、並びにＥＥＤリプレッサードメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；ヘアリー関連塩基性ヘリックスループヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（前記モチーフがＷＲＰＷ抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；並びにＨＰ１アルファクロモシャドウ抑制ドメインからなる群から選択される、
請求項１～７のいずれか一項に記載の操作された細胞。

【請求項9】

以下：
第１のプロモーターと、第１の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第１の発現カセットであって、前記第１の単量体が、ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の発現カセットと、
第２のプロモーターと、第２の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第２の発現カセットであって、前記第２の単量体が、転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の発現カセットと
を含む発現系であって、
各単量体が、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドを介してオリゴマー化可能であり、
前記第１及び前記第２の単量体のリガンド誘導オリゴマー化が、誘導性転写因子（ＩＴＦ）を形成し、
前記同族リガンドが、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択され、
任意選択で、前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、
任意選択で、前記ＺＦタンパク質ドメインが、モジュラー設計であり、かつ１つ以上のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）から構成され、
任意選択で、前記ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のジンクフィンガーモチーフのアレイを含み、
任意選択で、前記発現系が、目的の遺伝子に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む第３の発現カセットを更に含み、前記ＩＴＦ応答性プロモーターが、コアプロモーター配列と、第１の操作されたポリペプチドの前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列とを含む、
発現系。

【請求項10】

以下：
第１のプロモーターと、第１の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第１の発現カセットであって、前記第１の単量体が、ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の発現カセットと、
第２のプロモーターと、第２の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第２の発現カセットであって、前記第２の単量体が、転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の発現カセットと
を含む発現系であって、
各単量体が、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドの結合を介してオリゴマー化可能であり、
前記第１及び前記第２の単量体のリガンド誘導オリゴマー化が、誘導性転写因子（ＩＴＦ）を形成し、
前記ＤＮＡ結合ドメインが、モジュラー式でありかつ１０個のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）を含むジンクフィンガータンパク質ドメインを含み、
前記同族リガンドが、ラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、及びそれらの類似体からなる群から選択され、
任意選択で、各リガンド結合ドメインが、ＦＫＢＰドメイン又はＦＲＢドメインを含み、
任意選択で、前記第１の単量体及び／又は前記第２の単量体が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含み、
任意選択で、前記第２の単量体が、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を更に含み、
任意選択で、前記ＩＴＦが、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができ、
任意選択で、前記発現系が、目的の遺伝子に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む第３の発現カセットを更に含み、前記第３のプロモーターが、コアプロモーター配列と、第１の操作されたポリペプチドの前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列とを含む、
発現系。

【請求項11】

第１のプロモーターと、誘導性転写因子（ＩＴＦ）をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第１の発現カセット
を含む発現系であって、
前記ＩＴＦが、ＤＮＡ結合ドメイン、転写エフェクタードメイン、及びリガンド結合ドメインを含み、
前記ＩＴＦが、前記リガンド結合ドメインの同族リガンドとの結合時に核局在化を受け、
細胞核に局在化された場合に、前記ＩＴＦが、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができ、
前記同族リガンドが、ミフェプリストン又はその誘導体であり、
任意選択で、前記リガンド結合ドメインが、プロゲステロン受容体ドメインを含み、
任意選択で、前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、
任意選択で、前記ＺＦタンパク質ドメインが、モジュラー設計であり、１つ以上のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）から構成され、
任意選択で、前記ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のジンクフィンガーモチーフを含み、
任意選択で、前記ＩＴＦが、前記ＤＮＡ結合ドメインと前記転写エフェクタードメインとの間に局在化されたリンカーを更に含み、
任意選択で、前記発現系が、前記目的の遺伝子をコードする外因性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された前記ＩＴＦ応答性プロモーターを含む発現カセットを更に含む、
発現系。

【請求項12】

請求項９～１１のいずれか一項に記載の発現系を含む、操作された細胞。

【請求項13】

ａ．ヒト細胞を含む、かつ／又は
ｂ．幹細胞を含む、かつ／又は
ｃ．免疫細胞を含む、かつ／又は
ｄ．Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及びｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択される、
請求項１～８、又は１２のいずれか一項に記載の操作された細胞。

【請求項14】

目的の遺伝子の転写を調節するための遺伝子スイッチであって、以下：
ａ．請求項１、２、５、８、９、１２、若しくは１３のいずれか一項に記載の操作された細胞、並びに誘導性転写因子（ＩＴＦ）の形成を誘導するために、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択される同族リガンド、又は
ｂ．請求項３～５、８、９、１２、若しくは１３のいずれか一項に記載の操作された細胞、並びにラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、及びそれらの類似体からなる群から選択される同族リガンド、又は
ｃ．請求項６～９、１２、若しくは１３のいずれか一項に記載の操作された細胞、及びミフェプリストン、若しくはその誘導体
を含む、遺伝子スイッチ。

【請求項15】

目的の遺伝子の転写を調節する方法であって、以下：
ａ．誘導性転写因子（ＩＴＦ）の形成を誘導するために、請求項１、２、５、８、９、１２、又は１３のいずれか一項に記載の操作された細胞を、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択される同族リガンドと接触させる工程であって、
任意選択で、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写を前記ＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、前記操作された細胞を培養する工程を更に含み、
任意選択で、前記接触させる工程が、ヒト若しくは動物において行われ、
任意選択で、形質転換された細胞を前記同族リガンドと接触させる工程が、前記同族リガンドの薬理学的用量を前記ヒト若しくは動物に投与することを含む、工程、又は
ｂ．誘導性転写因子（ＩＴＦ）の形成を誘導するために、請求項３～５、８、９、１２、若しくは１３のいずれか一項に記載の操作された細胞を、ラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、及びそれらの類似体からなる群から選択される同族リガンドと接触させる工程であって、
任意選択で、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写を前記ＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、前記操作された細胞を培養する工程を更に含み、
任意選択で、前記操作された細胞が、ヒト若しくは動物中にあり、前記操作された細胞を前記同族リガンドと接触させる工程が、前記ラパマイシンの薬理学的用量を前記ヒト若しくは動物に投与することを含み、
任意選択で、前記第２の単量体の転写エフェクタードメインが、転写活性化ドメインを含み、転写を調節することが、前記目的の遺伝子の転写を活性化することを含むか、若しくは前記第２の単量体の前記転写エフェクタードメインが、転写リプレッサードメインを含み、転写を調節することが、前記目的の遺伝子の転写を抑制することを含む、工程、又は
ｃ．前記誘導性転写因子（ＩＴＦ）の核局在化を誘導するために、請求項６～９、１２、若しくは１３のいずれか一項に記載の操作された細胞を、ミフェプリストン、若しくはその誘導体と接触させる工程であって、
任意選択で、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写を前記ＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、前記操作された細胞を培養する工程を更に含み、
任意選択で、前記操作された細胞が、ヒト若しくは動物中にあり、前記操作された細胞を前記ミフェプリストンと接触させる工程が、前記ミフェプリストンの薬理学的用量を前記ヒト若しくは動物に投与することを含み、
任意選択で、前記転写エフェクタードメインが、転写活性化ドメインを含み、転写を調節することが、前記目的の遺伝子の転写を活性化することを含むか、若しくは前記転写エフェクタードメインが、転写リプレッサードメインを含み、転写を調節することが、前記目的の遺伝子の転写を抑制することを含む、工程
を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月１９日に出願された米国仮出願第６３／１７６，８０１号及び２０２１年４月１９日に出願された米国仮出願第６３／１７６，８４８号の利益及び優先権を主張し、これらの各々は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願には、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出され、その全体が参照により本明細書に援用される配列表が含まれる。２０ＸＸ年、ＸＸ月に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、ＸＸＸＸＸＵＳ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと称され、サイズがＸ，ＸＸＸ，ＸＸＸバイトである。

【0003】

分野
本出願は、同族リガンド（例えば、カフェイン、カンナビノイド、ニコチン、ラパマイシン、又はミフェプリストン）によって活性化され得る合成誘導性転写因子、及び誘導性転写因子を発現する単離された細胞に関する。また、誘導性転写因子を使用して目的の遺伝子の転写を調節する方法も提供される。

【背景技術】

【0004】

背景
現在利用可能な細胞及び遺伝子療法製品は、発現制御を欠く可能性があり、かかる療法を受ける対象において毒性などの安全性の懸念を引き起こし得る。したがって、これらの療法を発現制御及び調節する追加の方法が必要である。

【発明の概要】

【0005】

概要
一態様では、誘導性転写因子（ＩＴＦ）を含む操作された細胞が本明細書に提供され、
ＩＴＦは、
ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の単量体と、
転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の単量体と
を含み、
各単量体は、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドを介してオリゴマー化可能であり、
リガンド誘導オリゴマー化は、ＩＴＦを形成し、
同族リガンドは、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択され、
任意選択で、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、
任意選択で、各リガンド結合ドメインは、単一ドメイン抗体を含み、
単一ドメイン抗体は、Ｖ_ＨＨを含み、
任意選択で、ＩＴＦは、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができる。

【0006】

いくつかの実施形態では、
ａ．Ｖ_ＨＨは、抗カフェインＶ_ＨＨ（ａｃ Ｖ_ＨＨ）であり、
任意選択で、抗カフェインＶ_ＨＨ（ａｃ Ｖ_ＨＨ）は、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、かつ／若しくは
任意選択で、第１のリガンド結合ドメイン及び第２のリガンド結合ドメインの各々は、ａｃ Ｖ_ＨＨを含む、又は
ｂ．同族リガンドは、カンナビジオール若しくはフィトカンナビノイドであり、Ｖ_ＨＨは、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７（それぞれ、ＣＡ－１４、ＤＢ－６、ＤＢ－１１、ＤＢ－１８、及びＤＢ－２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
任意選択で、第１若しくは第２のリガンド結合ドメインのうちの一方は、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、第１若しくは第２の結合ドメインのうちの他方は、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７（それぞれ、ＤＢ－６、ＤＢ－１１、ＤＢ－１８、及びＤＢ－２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、
任意選択で、第１若しくは第２のリガンド結合ドメインのうちの一方は、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、第１若しくは第２の結合ドメインのうちの他方は、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７（それぞれ、ＤＢ－６、ＤＢ－１１、ＤＢ－１８、及びＤＢ－２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、
任意選択で、第１若しくは第２のリガンド結合ドメインのうちの一方は、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、第１若しくは第２の結合ドメインのうちの他方は、配列番号５７（ＤＢ－２１）のアミノ酸配列を含むＶＨＨを含む、又は
ｃ．各リガンド結合ドメインは、抗ニコチン抗体重鎖可変ドメイン（抗Ｎｉｃ ＶＨ）若しくは抗ニコチン抗体軽鎖可変ドメイン（抗Ｎｉｃ ＶＬ）を含み、
任意選択で、抗Ｎｉｃ ＶＨは、配列番号５８のアミノ酸配列を含み、抗Ｎｉｃ ＶＬは、配列番号５９のアミノ酸配列を含み、
任意選択で、第１若しくは第２のリガンド結合ドメインのうちの一方は、抗Ｎｉｃ ＶＨを含み、第１若しくは第２のリガンド結合ドメインのうちの他方は、抗Ｎｉｃ ＶＬを含む。

【0007】

別の態様では、誘導性転写因子（ＩＴＦ）を含む操作された細胞が本明細書に提供され、
ＩＴＦは、
ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の単量体と、
転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の単量体と
を含み、
各単量体は、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドの結合を介してオリゴマー化可能であり、
リガンド誘導オリゴマー化は、ＩＴＦを形成し、
ＤＮＡ結合ドメインは、モジュラー式でありかつ６つのＺＦモチーフのアレイを含むジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、
同族リガンドは、ラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、及びそれらの類似体からなる群から選択され、
任意選択で、ＩＴＦは、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができる。

【0008】

いくつかの実施形態では、
ａ．第１若しくは第２のリガンド結合ドメインのうちの一方は、ＦＫＢＰドメインを含み、第１若しくは第２のリガンド結合ドメインのうちの他方は、ＦＲＢドメインを含み、
任意選択で、ＦＫＢＰは、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、
任意選択で、ＦＲＢドメインは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む、又は
ｂ．第１のリガンド結合ドメインは、ＦＫＢＰドメインを含み、第２のリガンド結合ドメインは、ＦＲＢドメインを含み、
任意選択で、ＦＫＢＰは、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、
任意選択で、ＦＲＢドメインは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む、又は
ｃ．第１若しくは第２のリガンド結合ドメインのうちの一方は、ＦＲＢドメインを含み、第１若しくは第２のリガンド結合ドメインのうちの他方は、ＦＫＢＰドメインを含み、
任意選択で、ＦＫＢＰは、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、
任意選択で、ＦＲＢドメインは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む、又は
ｄ．第１のリガンド結合ドメインは、ＦＲＢドメインを含み、第２のリガンド結合ドメインは、ＦＫＢＰドメインを含み、
任意選択で、ＦＫＢＰは、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、
任意選択で、ＦＲＢドメインは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、
ａ．第１の単量体及び／又は第２の単量体は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含み、
任意選択で、ＮＬＳは、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／又は
b．第２の単量体は、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を更に含み、
任意選択で、ＮＥＳは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0010】

別の態様では、誘導性転写因子（ＩＴＦ）を含む操作された細胞が本明細書に提供され、
ＩＴＦは、ＤＮＡ結合ドメイン、転写エフェクタードメイン、及びリガンド結合ドメインを含み、
ＩＴＦは、リガンド結合ドメインの同族リガンドとの結合時に核局在化を受け、
細胞核に局在化された場合に、ＩＴＦは、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができ、
同族リガンドは、ミフェプリストン若しくはその誘導体であり、
任意選択で、リガンド結合ドメインは、プロゲステロン受容体ドメインを含み、プロゲステロン受容体ドメインは、配列番号６８のアミノ酸配列を含み、
任意選択で、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、
任意選択で、ＩＴＦは、ＤＮＡ結合ドメインと転写エフェクタードメインとの間にペプチドリンカーを更に含み、
任意選択で、ＤＮＡ結合ドメインは、ＩＴＦ応答性プロモーターに結合し、
任意選択で、細胞は、目的の遺伝子をコードする外因性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む発現カセットを更に含み、
任意選択で、ＩＴＦ応答性プロモーターは、ＩＴＦ結合ドメイン配列及びコアプロモーター配列を含み、
任意選択で、コアプロモーター配列は、最小プロモーターを含み、最小プロモーターは、ｍｉｎＰ、ｍｉｎＣＭＶ、ＹＢ＿ＴＡＴＡ、ｍｉｎＴＡＴＡ、及びｍｉｎＴＫからなる群から選択される、又はコアプロモーター配列は、構成的プロモーターに由来し、コアプロモーター配列は、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターに由来する。

【0011】

いくつかの実施形態では、
ａ．ＺＦタンパク質ドメインは、モジュラー設計であり、１つ以上のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）から構成され、
ｂ．ＺＦタンパク質ドメインは、１～１０個のジンクフィンガーモチーフのアレイを含み、かつ／又は
ｃ．ＺＦタンパク質ドメインは、６つのジンクフィンガーモチーフのアレイを含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、
ａ．転写エフェクタードメインは、転写活性化ドメインを含み、
任意選択で、転写活性化ドメインは、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化ドメイン；ＶＰ１６の４つのタンデムコピーを含む活性化ドメイン；ＶＰ６４活性化ドメイン；ＮＦκＢのｐ６５活性化ドメイン；エプスタイン－バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）活性化ドメイン；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ活性化ドメイン（ＶＰＲ活性化ドメイン）を含む三者活性化因子；及びヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメイン（ｐ３００ ＨＡＴコア活性化ドメイン）からなる群から選択される、又は
ｂ．転写エフェクタードメインは、転写リプレッサードメインを含み、
任意選択で、転写リプレッサードメインは、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；短縮型クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）リプレッサードメイン；スクレラキシス（ＳＣＸ）ＨＬＨドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ１）ＨＬＨドメインの阻害剤、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン含有タンパク質２（ＨＥＲＣ２）Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＳＴ１）ＨＬＨドメイン、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．２（ＮＫＸ２２）ホメオドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ３）ＨＬＨドメインの阻害剤、並びにツイスト関連タンパク質２（ＴＷＳＴ２）ＨＬＨドメイン、並びにＥＥＤリプレッサードメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；ヘアリー関連塩基性ヘリックスループヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（モチーフがＷＲＰＷ抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；並びにＨＰ１アルファクロモシャドウ抑制ドメインからなる群から選択される。

【0013】

別の態様では、発現系が本明細書に提供され、発現系は、以下：
第１のプロモーターと、第１の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第１の発現カセットであって、第１の単量体が、ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の発現カセットと；
第２のプロモーターと、第２の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第２の発現カセットであって、第２の単量体が、転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の発現カセットと
を含み、
各単量体が、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドを介してオリゴマー化可能であり、
第１及び第２の単量体のリガンド誘導オリゴマー化は、誘導性転写因子（ＩＴＦ）を形成し、
同族リガンドは、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択され、
任意選択で、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、
任意選択で、ＺＦタンパク質ドメインは、モジュラー設計であり、かつ１つ以上のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）から構成され、
任意選択で、ＺＦタンパク質ドメインは、１～１０個のジンクフィンガーモチーフのアレイを含み、
任意選択で、発現系は、目的の遺伝子に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む第３の発現カセットを更に含み、ＩＴＦ応答性プロモーターは、コアプロモーター配列と、第１の操作されたポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインに結合する配列とを含む。

【0014】

別の態様では、発現系が本明細書に提供され、発現系は、以下：
第１のプロモーターと、第１の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第１の発現カセットであって、第１の単量体が、ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の発現カセットと；
第２のプロモーターと、第２の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第２の発現カセットであって、第２の単量体が、転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の発現カセットと
を含み、
各単量体が、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドの結合を介してオリゴマー化可能であり、
第１及び第２の単量体のリガンド誘導オリゴマー化は、誘導性転写因子（ＩＴＦ）を形成し、
ＤＮＡ結合ドメインは、モジュラー式でありかつ１０個のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）を含むジンクフィンガータンパク質ドメインを含み、
同族リガンドは、ラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、及びそれらの類似体からなる群から選択され、
任意選択で、各リガンド結合ドメインは、ＦＫＢＰドメイン又はＦＲＢドメインを含み、
任意選択で、第１の単量体及び／又は第２の単量体は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含み、
任意選択で、第２の単量体は、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を更に含み、
任意選択で、ＩＴＦは、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができ、
任意選択で、発現系は、目的の遺伝子に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む第３の発現カセットを更に含み、第３のプロモーターは、コアプロモーター配列と、第１の操作されたポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインに結合する配列とを含む。

【0015】

別の態様では、第１のプロモーターと、誘導性転写因子（ＩＴＦ）をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第１の発現カセットを含む発現系が本明細書に提供され、
ＩＴＦは、ＤＮＡ結合ドメイン、転写エフェクタードメイン、及びリガンド結合ドメインを含み、
ＩＴＦは、リガンド結合ドメインの同族リガンドとの結合時に核局在化を受け、
細胞核に局在化された場合に、ＩＴＦは、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができ、
同族リガンドは、ミフェプリストン又はその誘導体であり、
任意選択で、リガンド結合ドメインは、プロゲステロン受容体ドメインを含み、
任意選択で、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、
任意選択で、ＺＦタンパク質ドメインは、モジュラー設計であり、１つ以上のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）から構成され、
任意選択で、ＺＦタンパク質ドメインは、１～１０個のジンクフィンガーモチーフを含み、
任意選択で、ＩＴＦは、ＤＮＡ結合ドメインと転写エフェクタードメインとの間に局在化されたリンカーを更に含み、
任意選択で、発現系は、目的の遺伝子をコードする外因性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む発現カセットを更に含む。

【0016】

別の態様では、上記の態様又は実施形態のうちのいずれかの発現系を含む操作された細胞が本明細書に提供される。

【0017】

ある特定の実施形態では、
ａ．細胞は、ヒト細胞を含む、かつ／又は
ｂ．細胞は、幹細胞を含む、かつ／又は
ｃ．細胞は、免疫細胞を含む、かつ／又は
ｄ．細胞は、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及びｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択される。

【0018】

別の態様では、目的の遺伝子の転写を調節するための遺伝子スイッチが本明細書に提供され、遺伝子スイッチは、
ａ．上記の態様若しくは実施形態のうちのいずれか１つの操作された細胞、並びに誘導性転写因子（ＩＴＦ）の形成を誘導するために、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択される同族リガンド、又は
ｂ．上記の態様若しくは実施形態のうちのいずれか１つの操作された細胞、並びにラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、及びそれらの類似体からなる群から選択される同族リガンド、又は
ｃ．上記の態様又は実施形態のうちのいずれか１つの操作された細胞、及びミフェプリストン、若しくはその誘導体を含む。

【0019】

別の態様では、目的の遺伝子の転写を調節する方法が本明細書に提供され、方法は、
ａ．誘導性転写因子（ＩＴＦ）の形成を誘導するために、上記の態様若しくは実施形態のうちのいずれか１つの操作された細胞を、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択される同族リガンドと接触させる工程であって、
任意選択で、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写をＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、操作された細胞を培養する工程を更に含み、
任意選択で、接触させる工程が、ヒト若しくは動物において行われ、
任意選択で、形質転換された細胞を同族リガンドと接触させる工程が、同族リガンドの薬理学的用量をヒト若しくは動物に投与することを含む、工程、又は
ｂ．誘導性転写因子（ＩＴＦ）の形成を誘導するために、上記の態様若しくは実施形態のうちのいずれか１つの操作された細胞を、ラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、及びそれらの類似体からなる群から選択される同族リガンドと接触させる工程であって、
任意選択で、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写をＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、操作された細胞を培養する工程を更に含み、
任意選択で、操作された細胞が、ヒト若しくは動物中にあり、操作された細胞を同族リガンドと接触させる工程が、ラパマイシンの薬理学的用量をヒト若しくは動物に投与することを含み、
任意選択で、第２の単量体の転写エフェクタードメインが、転写活性化ドメインを含み、転写を調節することが、目的の遺伝子の転写を活性化することを含むか、若しくは第２の単量体の転写エフェクタードメインが、転写リプレッサードメインを含み、転写を調節することが、目的の遺伝子の転写を抑制することを含む、工程、又は
ｃ．誘導性転写因子（ＩＴＦ）の核局在化を誘導するために、上記の態様若しくは実施形態のうちのいずれか１つの操作された細胞を、ミフェプリストン、若しくはその誘導体と接触させる工程であって、
任意選択で、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写をＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、操作された細胞を培養する工程を更に含み、
任意選択で、操作された細胞が、ヒト若しくは動物中にあり、操作された細胞をミフェプリストンと接触させる工程が、ミフェプリストンの薬理学的用量をヒト若しくは動物に投与することを含み、
任意選択で、転写エフェクタードメインが、転写活性化ドメインを含み、転写を調節することが、目的の遺伝子の転写を活性化することを含むか、若しくは転写エフェクタードメインが、転写リプレッサードメインを含み、転写を調節することが、目的の遺伝子の転写を抑制することを含む、工程、を含む。

【0020】

カフェイン、カンナビノイド、ニコチン、及びラパマイシンから選択される同族リガンドによって活性化され得る誘導性転写因子もまた本明細書に提供される。

【0021】

本明細書に記載される誘導性転写因子は、治療用細胞における遺伝子発現を制御するためなど、インビボで使用され得るリガンドによって活性化可能である。

【0022】

いくつかの態様では、本開示は、誘導性転写因子（ＩＴＦ）を含む操作された細胞を提供し、
ＩＴＦは、
（ｉ）ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の単量体と、
（ＩＩ）転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の単量体と
を含み、
各単量体は、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドを介してオリゴマー化可能であり、リガンド誘導オリゴマー化は、ＩＴＦを形成し、同族リガンドは、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択される。

【0023】

いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含む。いくつかの態様では、ＺＦタンパク質ドメインは、モジュラー設計であり、１つ以上のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）から構成される。いくつかの態様では、ＺＦタンパク質ドメインは、１～１０個のＺＦモチーフのアレイを含む。いくつかの態様では、ＺＦタンパク質ドメインは、６つのＺＦモチーフを含む。

【0024】

いくつかの態様では、第１のリガンド結合ドメイン及び第２のリガンド結合ドメインは、同族リガンドの別個のエピトープと結合する。

【0025】

いくつかの態様では、各リガンド結合ドメインは、単一ドメイン抗体を含む。

【0026】

いくつかの態様では、単一ドメイン抗体は、Ｖ_ＨＨを含む。いくつかの態様では、Ｖ_ＨＨは、抗カフェインＶ_ＨＨ（ａｃ Ｖ_ＨＨ）である。いくつかの態様では、抗カフェインＶ_ＨＨ（ａｃＶ_ＨＨ）は、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、第１のリガンド結合ドメイン及び第２のリガンド結合ドメインの各々は、ａｃ Ｖ_ＨＨを含む。

【0027】

いくつかの態様では、同族リガンドは、カンナビジオール又はフィトカンナビノイドであり、Ｖ_ＨＨは、配列番号５３～５７（ＣＡ１４、ＤＢ６、ＤＢ１１、ＤＢ１８、及びＤＢ２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0028】

いくつかの態様では、第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの一方は、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、第１又は第２の結合ドメインのうちの他方は、５４～５７（ＤＢ６、ＤＢ１１、ＤＢ１８、及びＤＢ２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含む。

【0029】

いくつかの態様では、第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの一方は、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、第１又は第２の結合ドメインのうちの他方は、配列番号５４（ＤＢ－２１）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含む。

【0030】

いくつかの態様では、各リガンド結合ドメインは、抗ニコチン抗体重鎖可変ドメイン（抗Ｎｉｃ ＶＨ）又は抗ニコチン抗体軽鎖可変ドメイン（抗Ｎｉｃ ＶＬ）を含む。

【0031】

いくつかの態様では、抗Ｎｉｃ ＶＨは、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。

【0032】

いくつかの態様では、抗Ｎｉｃ ＶＬは、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。

【0033】

いくつかの態様では、第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの一方は、抗Ｎｉｃ ＶＨを含み、第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの他方は、抗Ｎｉｃ ＶＬを含む。

【0034】

いくつかの態様では、本開示は、誘導性転写因子（ＩＴＦ）を含む操作された細胞を提供し、
ＩＴＦは、
（ｉ）ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の単量体と、
（ｉｉ）転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の単量体と
を含み、
各単量体は、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドの結合を介してオリゴマー化可能であり、リガンド誘導オリゴマー化は、ＩＴＦを形成し、ＤＮＡ結合ドメインは、モジュラー式でありかつ６つのＺＦモチーフのアレイを含むジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、同族リガンドは、ラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、又はそれらの類似体からなる群から選択される。

【0035】

いくつかの態様では、第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの一方は、ＦＫＢＰドメインを含み、第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの他方は、ＦＲＢドメインを含む。

【0036】

いくつかの態様では、ＦＫＢＰは、配列番号６０のアミノ酸配列を含む。

【0037】

いくつかの態様では、ＦＲＢドメインは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。

【0038】

いくつかの態様では、第１のリガンド結合ドメインは、ＦＫＢＰドメインを含み、第２のリガンド結合ドメインは、ＦＲＢドメインを含む。

【0039】

いくつかの態様では、第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの一方は、ＦＲＢドメインを含み、第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの他方は、ＦＫＢＰドメインを含む。

【0040】

いくつかの態様では、第１の単量体及び／又は第２の単量体は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む。

【0041】

いくつかの態様では、ＮＬＳは、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0042】

いくつかの態様では、第２の単量体は、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を更に含む。

【0043】

いくつかの態様では、ＮＥＳは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0044】

いくつかの態様では、ＩＴＦは、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができる。

【0045】

いくつかの態様では、本開示は、
（ｉ）第１のプロモーターと、第１の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第１の発現カセットであって、第１の単量体が、ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の発現カセットと、
（ｉｉ）第２のプロモーターと、第２の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第２の発現カセットであって、第２の単量体が、転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の発現カセットと
を含む発現系を提供し、
各単量体は、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドを介してオリゴマー化可能であり、第１及び第２の単量体のリガンド誘導オリゴマー化は、誘導性転写因子（ＩＴＦ）を形成し、同族リガンドは、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択される。

【0046】

いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含む。

【0047】

いくつかの態様では、ＺＦタンパク質ドメインは、モジュラー設計であり、１つ以上のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）から構成される。

【0048】

いくつかの態様では、ＺＦタンパク質ドメインは、１～１０個のジンクフィンガーモチーフのアレイを含む。

【0049】

いくつかの態様では、ＺＦタンパク質ドメインは、６つのジンクフィンガーモチーフのアレイを含む。

【0050】

いくつかの態様では、各リガンド結合ドメインは、単一ドメイン抗体を含む。

【0051】

いくつかの態様では、単一ドメイン抗体は、Ｖ_ＨＨを含む。

【0052】

いくつかの態様では、Ｖ_ＨＨは、抗カフェインＶ_ＨＨ（ａｃＶ_ＨＨ）である。

【0053】

いくつかの態様では、抗カフェインＶ_ＨＨ（ａｃＶ_ＨＨ）は、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、第１のリガンド結合ドメイン及び第２のリガンド結合ドメインの各々は、ａｃＶ_ＨＨを含む。

【0054】

いくつかの態様では、第１の単量体及び第２の単量体は、カフェインに結合するとホモ二量体を形成することができる。

【0055】

いくつかの態様では、同族リガンドは、カンナビジオール又はフィトカンナビノイドであり、Ｖ_ＨＨは、配列番号５３～５７（ＣＡ１４、ＤＢ６、ＤＢ１１、ＤＢ１８、及びＤＢ２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0056】

いくつかの態様では、第１のリガンド結合ドメインは、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、第２の結合ドメインは、５４～５７（ＤＢ６、ＤＢ１１、ＤＢ１８、及びＤＢ２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含む。

【0057】

いくつかの態様では、第１のリガンド結合ドメインは、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、第２の結合ドメインは、配列番号５４～５７（ＤＢ－２１）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含む。

【0058】

いくつかの態様では、第１の単量体及び第２の単量体は、カンナビジオール又はフィトカンナビノイドに結合するとヘテロ二量体を形成することができる。

【0059】

いくつかの態様では、各リガンド結合ドメインは、抗ニコチン抗体重鎖可変ドメイン（抗Ｎｉｃ ＶＨ）又は抗ニコチン抗体軽鎖可変ドメイン（抗Ｎｉｃ ＶＬ）を含む。

【0060】

いくつかの態様では、抗Ｎｉｃ ＶＨは、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。

【0061】

いくつかの態様では、抗Ｎｉｃ ＶＬは、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。

【0062】

いくつかの態様では、第１のリガンド結合ドメインは、抗Ｎｉｃ ＶＨを含み、第２の結合ドメインは、抗Ｎｉｃ ＶＬを含む。

【0063】

いくつかの態様では、第１のリガンド結合ドメインは、抗Ｎｉｃ ＶＬを含み、第２のリガンド結合ドメインは、抗Ｎｉｃ ＶＨを含む。

【0064】

いくつかの態様では、第１の単量体及び第２の単量体は、ニコチンに結合するとヘテロ二量体を形成することができる。

【0065】

いくつかの態様では、発現系は、目的の遺伝子に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む第３の発現カセットを更に含み、ＩＴＦ応答性プロモーターは、コアプロモーター配列と、第１の操作されたポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインに結合する配列と、を含む。

【0066】

いくつかの態様では、コアプロモーター配列は、最小プロモーターを含む。いくつかの態様では、最小プロモーターは、ｍｉｎＰ、ｍｉｎＣＭＶ、ＹＢ＿ＴＡＴＡ、ｍｉｎＴＡＴＡ、及びｍｉｎＴＫからなる群から選択される。

【0067】

いくつかの態様では、コアプロモーター配列は、構成的プロモーターに由来する。いくつかの態様では、コアプロモーター配列は、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターに由来する。

【0068】

いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列は、１つ以上のＺＦ結合部位を含む。

【0069】

いくつかの態様では、本開示は、
（ｉ）第１のプロモーターと、第１の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第１の発現カセットであって、第１の単量体が、ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の発現カセットと、
（ｉｉ）第２のプロモーターと、第２の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第２の発現カセットであって、第２の単量体が、転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の発現カセットと
を含む発現系を提供し、
各単量体は、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドの結合を介してオリゴマー化可能であり、第１及び第２の単量体のリガンド誘導オリゴマー化は、誘導性転写因子（ＩＴＦ）を形成し、ＤＮＡ結合ドメインは、モジュラー式でありかつ６つのジンクフィンガーモチーフを含むジンクフィンガータンパク質ドメインを含み、同族リガンドは、ラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、及びそれらの類似体からなる群から選択される。

【0070】

いくつかの態様では、各リガンド結合ドメインは、ＦＫＢＰドメイン又はＦＲＢドメインを含む。いくつかの態様では、ＦＫＢＰは、配列番号６０のアミノ酸配列を含む。

【0071】

いくつかの態様では、ＦＲＢドメインは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、第１のリガンド結合ドメインは、ＦＫＢＰドメインを含み、第２のリガンド結合ドメインは、ＦＲＢドメインを含む。いくつかの態様では、第１のリガンド結合ドメインは、ＦＲＢドメインを含み、第２のリガンド結合ドメインは、ＦＫＢＰドメインを含む。

【0072】

いくつかの態様では、第１の単量体及び第２の単量体は、ラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、又はそれらの類似体からなる群から選択されるリガンドに結合するとヘテロ二量体を形成することができる。

【0073】

いくつかの態様では、第１の単量体及び／又は第２の単量体は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む。いくつかの態様では、ＮＬＳは、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0074】

いくつかの態様では、第２の単量体は、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を更に含む。いくつかの態様では、ＮＥＳは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0075】

いくつかの態様では、ＩＴＦは、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができる。

【0076】

いくつかの態様では、第１及び／又は第２のプロモーターは、構成的プロモーター又は調節可能プロモーターである。

【0077】

いくつかの態様では、第１及び／又は第２のプロモーターは、合成プロモーターである。

【0078】

いくつかの態様では、第１のプロモーター、第２のプロモーター、又は第１及び第２のプロモーターの両方は、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａＶ１、ｈＣＡＧＧ、ｈＥＦ１ａＶ２、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターである。

【0079】

いくつかの態様では、発現系は、目的の遺伝子に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む第３の発現カセットを更に含み、第３のプロモーターは、コアプロモーター配列と、第１の操作されたポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインに結合する配列とを含む。いくつかの態様では、コアプロモーター配列は、最小プロモーターを含む。

【0080】

いくつかの態様では、転写エフェクタードメインは、転写活性化ドメインを含む。いくつかの態様では、転写活性化ドメインは、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化ドメイン；ＶＰ１６の４つのタンデムコピーを含む活性化ドメイン；ＶＰ６４活性化ドメイン；ＮＦκＢのｐ６５活性化ドメイン；エプスタイン－バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）活性化ドメイン；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ活性化ドメイン（ＶＰＲ活性化ドメイン）を含む三者活性化因子；及びヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメイン（ｐ３００ ＨＡＴコア活性化ドメイン）からなる群から選択される。

【0081】

いくつかの態様では、転写エフェクタードメインは、転写リプレッサードメインを含む。いくつかの態様では、転写リプレッサードメインは、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）リプレッサードメイン；スクレラキシス（ＳＣＸ）ＨＬＨドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ１）ＨＬＨドメインの阻害剤、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン含有タンパク質２（ＨＥＲＣ２）Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＳＴ１）ＨＬＨドメイン、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．２（ＮＫＸ２２）ホメオドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ３）ＨＬＨドメインの阻害剤、及びツイスト関連タンパク質２（ＴＷＳＴ２）ＨＬＨドメイン、ＥＥＤリプレッサードメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；ヘアリー関連塩基性ヘリックスループヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（モチーフがＷＲＰＷ抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；並びにＨＰ１アルファクロモシャドウ抑制ドメインからなる群から選択される。

【0082】

いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＩＴＦ応答性プロモーターに結合する。

【0083】

いくつかの態様では、第１のプロモーターは、構成的プロモーター、調節可能プロモーター、又は合成プロモーターである。

【0084】

いくつかの態様では、第１のプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａＶ１、ｈＣＡＧＧ、ｈＥＦ１ａＶ２、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターである。

【0085】

いくつかの態様では、発現系は、目的の遺伝子をコードする外因性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む発現カセットを更に含む。

【0086】

いくつかの態様では、ＩＴＦ応答性プロモーターは、ＩＴＦ結合ドメイン配列及びプロモーター配列を含む。

【0087】

いくつかの態様では、プロモーター配列は、ｍｉｎＰ、ＮＦｋＢ応答エレメント、ＣＲＥＢ応答エレメント、ＮＦＡＴ応答エレメント、ＳＲＦ応答エレメント１、ＳＲＦ応答エレメント２、ＡＰ１応答エレメント、ＴＣＦ－ＬＥＦ応答エレメントプロモーター融合体、低酸素応答性エレメント、ＳＭＡＤ結合エレメント、ＳＴＡＴ３結合部位、ｍｉｎＣＭＶ、ＹＢ＿ＴＡＴＡ、ｍｉｎＴＡＴＡ、ｍｉｎＴＫ、誘導因子分子応答性プロモーター、及びそれらのタンデムリピートからなる群から選択されるプロモーターに由来する。

【0088】

いくつかの態様では、ＩＴＦ応答性プロモーターは、最小プロモーターを含む。

【0089】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される発現系を含む操作された細胞を提供する。

【0090】

いくつかの態様では、操作された細胞は、ヒト細胞である。

【0091】

いくつかの態様では、操作された細胞は、幹細胞である。

【0092】

いくつかの態様では、操作された細胞は、免疫細胞である。

【0093】

いくつかの態様では、操作された細胞は、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及びｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択される。

【0094】

いくつかの態様では、本開示は、カフェイン－ＩＴＦを含む操作された細胞と、有効量のカフェインとを含む、目的の遺伝子の転写を調節するための遺伝子スイッチを提供する。

【0095】

いくつかの態様では、本開示は、フィトカンナビノイド－ＩＴＦを含む操作された細胞と、有効量のカンナビジオール（ＣＢＤ）又はフィトカンナビノイドとを含む、目的の遺伝子の転写を調節するための遺伝子スイッチを提供する。

【0096】

いくつかの態様では、本開示は、ニコチン－ＩＴＦを含む操作された細胞と、有効量のニコチンとを含む、目的の遺伝子の転写を調節するための遺伝子スイッチを提供する。

【0097】

いくつかの態様では、本開示は、ラパマイシン－ＩＴＦを含む操作された細胞と、有効量のラパマイシンとを含む、目的の遺伝子の転写を調節するための遺伝子スイッチを提供する。

【0098】

いくつかの態様では、本開示は、目的の遺伝子の転写を調節する方法を提供し、方法は、誘導性転写因子（ＩＴＦ）の形成を誘導するために、カフェイン、フィトカンナビノイド、又はニコチンによって誘導可能なＩＴＦを含む操作された細胞を、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択される同族リガンドと接触させる工程を含む。

【0099】

いくつかの態様では、方法は、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写をＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、操作された細胞を培養する工程を更に含む。

【0100】

いくつかの態様では、接触させる工程は、ヒト又は動物において行われる。

【0101】

いくつかの態様では、形質転換された細胞を同族リガンドと接触させる工程は、同族リガンドの薬理学的用量をヒト又は動物に投与することを含む。

【0102】

いくつかの態様では、同族リガンドは、カフェインを含む。

【0103】

いくつかの態様では、同族リガンドは、カンナビジオール（ＣＢＤ）である。

【0104】

いくつかの態様では、同族リガンドは、ニコチンである。

【0105】

いくつかの態様では、本開示は、誘導性転写因子（ＩＴＦ）の形成を誘導するために、ラパマイシン－ＩＴＦを含む操作された細胞を、ラパマイシンと接触させる工程を含む、目的の遺伝子の転写を調節する方法を提供する。

【0106】

いくつかの態様では、方法は、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写をＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、操作された細胞を培養する工程を更に含む。

【0107】

いくつかの態様では、操作された細胞は、ヒト又は動物中にあり、操作された細胞を同族リガンドと接触させる工程は、ラパマイシンの薬理学的用量をヒト又は動物に投与することを含む。

【0108】

いくつかの態様では、第２の単量体の転写エフェクタードメインは、転写活性化ドメインを含み、転写を調節することは、目的の遺伝子の転写を活性化することを含む。

【0109】

いくつかの態様では、第２の単量体の転写エフェクタードメインは、転写リプレッサードメインを含み、転写を調節することは、目的の遺伝子の転写を抑制することを含む。

【0110】

ミフェプリストンによって活性化され得る誘導性転写因子もまた本明細書に提供される。

【0111】

本明細書に記載される誘導性転写因子は、治療用細胞における遺伝子発現を制御するためなど、インビボで使用され得る。

【0112】

いくつかの態様では、本開示は、誘導性転写因子（ＩＴＦ）を含む操作された細胞を提供し、ＩＴＦは、ＤＮＡ結合ドメイン、転写エフェクタードメイン、及びリガンド結合ドメインを含み、ＩＴＦは、リガンド結合ドメインの同族リガンドとの結合時に核局在化を受け、細胞核に局在化された場合に、ＩＴＦは、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができ、同族リガンドは、ミフェプリストン又はその誘導体である。いくつかの態様では、リガンド結合ドメインは、プロゲステロン受容体ドメインを含む。いくつかの態様では、プロゲステロン受容体ドメインは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。

【0113】

いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含む。いくつかの態様では、ＺＦタンパク質ドメインは、モジュラー設計であり、１つ以上のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）から構成される。いくつかの態様では、ＺＦタンパク質ドメインは、１～１０個のジンクフィンガーモチーフを含む。いくつかの態様では、ＺＦタンパク質ドメインは、６つのジンクフィンガーモチーフを含む。

【0114】

いくつかの態様では、ＩＴＦは、ＤＮＡ結合ドメインと転写エフェクタードメインとの間にペプチドリンカーを更に含む。

【0115】

いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＩＴＦ応答性プロモーターに結合する。いくつかの態様では、ＩＴＦ応答性プロモーターは、ＩＴＦ結合ドメイン配列及びコアプロモーター配列を含む。いくつかの態様では、コアプロモーター配列は、最小プロモーターを含む。いくつかの態様では、最小プロモーターは、ｍｉｎＰ、ｍｉｎＣＭＶ、ＹＢ＿ＴＡＴＡ、ｍｉｎＴＡＴＡ、及びｍｉｎＴＫからなる群から選択される。いくつかの態様では、コアプロモーター配列は、構成的プロモーターに由来する。いくつかの態様では、コアプロモーター配列は、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターに由来する。

【0116】

いくつかの態様では、細胞は、目的の遺伝子をコードする外因性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む発現カセットを更に含む。

【0117】

いくつかの態様では、転写エフェクタードメインは、転写活性化ドメインを含む。いくつかの態様では、転写活性化ドメインは、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化ドメイン；ＶＰ１６の４つのタンデムコピーを含む活性化ドメイン；ＶＰ６４活性化ドメイン；ＮＦκＢのｐ６５活性化ドメイン；エプスタイン－バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）活性化ドメイン；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ活性化ドメイン（ＶＰＲ活性化ドメイン）を含む三者活性化因子；及びヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメイン（ｐ３００ ＨＡＴコア活性化ドメイン）からなる群から選択される。

【0118】

いくつかの態様では、転写エフェクタードメインは、転写リプレッサードメインを含む。いくつかの態様では、転写リプレッサードメインは、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；短縮型クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）リプレッサードメイン；スクレラキシス（ＳＣＸ）ＨＬＨドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ１）ＨＬＨドメインの阻害剤、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン含有タンパク質２（ＨＥＲＣ２）Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＳＴ１）ＨＬＨドメイン、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．２（ＮＫＸ２２）ホメオドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ３）ＨＬＨドメインの阻害剤、並びにツイスト関連タンパク質２（ＴＷＳＴ２）ＨＬＨドメイン、並びにＥＥＤリプレッサードメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；ヘアリー関連塩基性ヘリックスループヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（モチーフがＷＲＰＷ抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；並びにＨＰ１アルファクロモシャドウ抑制ドメインからなる群から選択される。

【0119】

いくつかの態様では、本開示は、第１のプロモーターと、誘導性転写因子（ＩＴＦ）をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第１の発現カセットを含む発現系を提供し、ＩＴＦは、ＤＮＡ結合ドメイン、転写エフェクタードメイン、及びリガンド結合ドメインを含み、ＩＴＦは、リガンド結合ドメインの同族リガンドとの結合時に核局在化を受け、細胞核に局在化された場合に、ＩＴＦは、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができ、同族リガンドは、ミフェプリストン又はその誘導体である。いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＩＴＦ応答性プロモーターに結合する。いくつかの態様では、第１のプロモーターは、構成的プロモーター、調節可能プロモーター、又は合成プロモーターである。いくつかの態様では、第１のプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａＶ１、ｈＣＡＧＧ、ｈＥＦ１ａＶ２、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターである。

【0120】

いくつかの態様では、発現系は、目的の遺伝子をコードする外因性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む発現カセットを更に含む。いくつかの態様では、ＩＴＦ応答性プロモーターは、ＩＴＦ結合ドメイン配列及びコアプロモーター配列を含む。いくつかの態様では、コアプロモーター配列は、最小プロモーターを含む。いくつかの態様では、最小プロモーターは、ｍｉｎＰ、ｍｉｎＣＭＶ、ＹＢ＿ＴＡＴＡ、ｍｉｎＴＡＴＡ、及びｍｉｎＴＫからなる群から選択される。いくつかの態様では、コアプロモーター配列は、構成的プロモーターに由来する。いくつかの態様では、コアプロモーター配列は、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターに由来する。

【0121】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される発現系のうちのいずれかを含む操作された細胞を提供する。

【0122】

いくつかの態様では、操作された細胞は、ヒト細胞を含む。いくつかの態様では、操作された細胞は、幹細胞を含む。いくつかの態様では、操作された細胞は、免疫細胞を含む。いくつかの態様では、細胞は、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及びｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択される。

【0123】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される任意の操作された細胞と、有効量のミフェプリストンとを含む、目的の遺伝子の転写を調節するための遺伝子スイッチを提供する。

【0124】

いくつかの態様では、本開示は、誘導性転写因子（ＩＴＦ）の核局在化を誘導するために、本明細書に記載される任意の操作された細胞をミフェプリストンと接触させる工程を含む、目的のポリペプチドの転写を調節する方法を提供する。いくつかの態様では、方法は、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写をＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、操作された細胞を培養する工程を更に含む。いくつかの態様では、操作された細胞は、ヒト又は動物中にあり、操作された細胞をミフェプリストンと接触させる工程は、ミフェプリストンの薬理学的用量をヒト又は動物に投与することを含む。いくつかの態様では、転写エフェクタードメインは、転写活性化ドメインを含み、転写を調節することは、目的の遺伝子の転写を活性化することを含む。いくつかの態様では、転写エフェクタードメインは、転写リプレッサードメインを含み、転写を調節することは、目的の遺伝子の転写を抑制することを含む。

【図面の簡単な説明】

【0125】

本開示のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明及び添付の図面に関してより良好に理解されるであろう。

【0126】

【図1】誘導性転写因子を発現する細胞に対する、様々な濃度の同族リガンドを用いた処理後のレポーター発現の倍率変化を示す。

【図2】各々が核局在化シグナルを含む第１及び第２の単量体で、カフェイン、ニコチン、又はカンナビノイド誘導性転写因子を発現する細胞について、様々な濃度の同族リガンドを用いた処理後のレポーター発現について陽性の細胞の割合を示す。

【図3】各々が核局在化シグナルを含む第１及び第２の単量体で、カフェイン、ニコチン、又はカンナビノイド誘導性転写因子を発現する細胞について、様々な濃度の同族リガンドを用いた処理後のレポーター発現の平均蛍光強度を示す。

【図4】ミフェプリストン誘導性転写因子を発現する細胞に対する、様々な濃度のミフェプリストンを用いた処理後のレポーター発現の倍率変化を示す。

【発明を実施するための形態】

【0127】

詳細な説明
特許請求の範囲及び明細書で使用される用語は、別段の指定がない限り、以下に記載されるように定義される。

【0128】

「インビボ」という用語は、生体内で生じるプロセスを指す。

【0129】

本明細書で使用される場合、「哺乳動物」という用語は、ヒト及び非ヒトの両方を含み、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、及びブタを含むがこれらに限定されない。

【0130】

２つ以上の核酸又はポリペプチドの配列の文脈における「同一性」パーセントという用語は、最大の一致について比較及び整列するときに、下記の配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ、又は当業者が利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを使用して、又は目視検査により測定される、同じヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定の割合を有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。用途に応じて、「同一性」パーセントは、比較されている配列の領域にわたって、例えば、機能的ドメインにわたって存在し得る、又は代替的に、比較される２つの配列の全長にわたって存在し得る。

【0131】

配列比較については、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用するときに、試験及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列の座標を指定し、配列アルゴリズムのプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。

【0132】

比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似法の検索によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）のコンピュータ化された実行によって、又は目視検査（一般的にＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，以下を参照されたい）によって、実施することができる。

【0133】

配列同一性及び配列類似性パーセントを決定するのに好適であるアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センター（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公開されている。

【0134】

「十分な量」という用語は、所望の効果を生み出すのに十分な量、例えば、細胞内の転写抑制を阻害するのに十分な量を意味する。

【0135】

本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとおり、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。

【0136】

誘導性転写因子
同族リガンドによって誘導され得る活性を有する誘導性転写因子（ＩＴＦ）が本明細書に提供される。ミフェプリストンによって誘導され得る活性を有する誘導性転写因子もまた本明細書に提供される。

【0137】

いくつかの実施形態では、誘導性転写因子は、ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の単量体と；転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の単量体と、を含む。同族リガンドが第１の単量体及び第２の単量体に結合すると、第１及び第２の単量体は、オリゴマー化し（例えば、二量体化し）、第１及び第２の単量体のリガンド誘導オリゴマー化は、ＩＴＦを形成する。いくつかの実施形態では、第１の単量体は、第１の抗体ドメインであり、第２の単量体は、第２の抗体ドメインであり、第１の抗体ドメイン及び第２の抗体ドメインは、オリゴマー化可能である。いくつかの実施形態では、誘導性転写因子は、ＤＮＡ結合ドメイン、転写エフェクタードメイン、及びリガンド結合ドメインを含むポリペプチドである。同族リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、ＩＴＦは、核局在化を受け、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができる。

【0138】

「リガンド結合ドメイン」は、同族リガンドに特異的に結合するポリペプチドドメインを指す。本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」及び「特異的に認識する」という用語は類似しており、ポリペプチド分子（例えば、リガンド結合ドメイン）のリガンド（例えば、カフェイン、カンナビノイド、ニコチン、ラパマイシン、又はミフェプリストン）への結合を指し、そのような結合は当業者によって理解される。例えば、同族リガンドに特異的に結合するリガンド結合ドメインは、例えば、イムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＫｉｎＥｘＡ ３０００機器（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄ．）、又は当該技術分野で既知の他のアッセイによって決定された場合、より低い親和性で他のリガンドに結合し得る。特定の実施形態では、同族リガンドに特異的に結合するリガンド結合ドメインは、リガンド結合ドメインが別のリガンドに非特異的に結合するとき、ＫＡよりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、３０倍、又はそれ以上であるＫＡで同族リガンドに結合することができる。

【0139】

本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ結合ドメイン」は、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡを認識する少なくとも１つの構造モチーフを含むタンパク質ドメインを指す。ＤＮＡ結合ドメインは、特定のＤＮＡ配列（認識配列）を認識する、又はＤＮＡに対する一般的な親和性を有することができる。特異的配列認識が可能であるＤＮＡ結合ドメインの例は、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインである。

【0140】

本明細書で使用される場合、「ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメイン」は、ＤＮＡとのタンデム接触を作製する複数のフィンガー様突起を含む少なくとも１つのモチーフのタンパク質を指す。本明細書で使用される場合、「ジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）」は、一緒に連結される複数のジンクフィンガータンパク質モチーフを指す。各ジンクフィンガーモチーフは、異なる核酸モチーフに結合する。これにより、任意の所望の核酸配列に特異的なＺＦＡが得られる。ＺＦモチーフは、互いに直接的に隣接し得る、又は可動性リンカー配列により隔てられ得る。いくつかの実施形態では、ＺＦＡは、タンデムに配置されたＺＦモチーフのアレイ、ストリング、又は鎖である。ＺＦＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のジンクフィンガーモチーフを有し得る。ＺＦＡは、１～１０、１～１５、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、２～３、２～４、２～５、２～６、２～７、２～８、２～９、２～１０、３～４、３～５、３～６、３～７、３～８、３～９、３～１０、４～５、４～６、４～７、４～８、４～９、４～１０、５～６、５～７、５～８、５～９、５～１０、又は５～１５個のジンクフィンガーモチーフを有し得る。いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、１～１０個のジンクフィンガーモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、６つのジンクフィンガーモチーフを含む。６つのジンクフィンガーモチーフを含む例示的なジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインは、配列番号１として提供される。ＺＦタンパク質ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、又はそれ以上のＺＦＡを有し得る。ＺＦドメインは、１～１０、１～１５、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、２～３、２～４、２～５、２～６、２～７、２～８、２～９、２～１０、３～４、３～５、３～６、３～７、３～８、３～９、３～１０、４～５、４～６、４～７、４～８、４～９、４～１０、５～６、５～７、５～８、５～９、５～１０、５～１５、１０～１５、１０～２０、又は１０～２５個のＺＦＡを有し得る。

【0141】

本明細書で使用される場合、「転写エフェクタードメイン」は、遺伝子のプロモーター領域を標的とするとき、遺伝子の転写を調節することができるポリペプチドドメインを指す。いくつかの実施形態では、転写エフェクタードメインと同じポリペプチド分子内に存在するＤＮＡ結合ドメイン、又は転写エフェクタードメインと同じ四級構造（例えば、オリゴマー化単量体）内に存在するＤＮＡ結合ドメインは、遺伝子のプロモーター領域への標的化を可能にし得る。

【0142】

転写エフェクタードメインは、転写活性化因子ドメインを含み得る。本明細書で使用される場合、「転写活性化因子ドメイン」は、遺伝子のプロモーター領域を標的とするとき、遺伝子の転写のレベルを活性化又は増加させることができるポリペプチドドメインを指す。転写活性化因子の例としては、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化ドメイン；ＶＰ１６の４つのタンデムコピーを含む活性化ドメイン；ＶＰ６４活性化ドメイン；ＮＦκＢのｐ６５活性化ドメイン（「ｐ６５」）；エプスタイン－バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）活性化ドメイン；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ活性化ドメイン（ＶＰＲ活性化ドメイン）を含む三者活性化因子；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＨＳＦ１活性化ドメイン（ＶＰＨ活性化ドメイン）を含む三者活性化因子；並びにヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメイン（ｐ３００ ＨＡＴコア活性化ドメイン）が挙げられる。いくつかの実施形態では、転写活性化因子ドメインは、遺伝子のプロモーター領域を標的とするとき、転写調節因子ドメインの不在下での遺伝子の転写レベルと比較した場合、遺伝子の転写レベルを少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、又は少なくとも５００％増加させることができる。いくつかの実施形態では、転写活性化因子ドメインは、遺伝子のプロモーター領域を標的とするとき、転写調節因子ドメインの不在下での遺伝子の転写レベルと比較した場合、遺伝子の転写レベルを１０％～５０％、１０％～１００％、１０％～１００％、１０％～２００％、１０％～３００％、１０％～４００％、１０％～５００％、５０％～５００％、１００％～５００％、２００％～５００％増加させることができる。

【0143】

転写エフェクタードメインは、転写リプレッサードメインを含み得る。本明細書で使用される場合、「転写リプレッサードメイン」は、遺伝子のプロモーター領域を標的とするとき、遺伝子の転写のレベルを阻害又は減少させることができるポリペプチドドメインを指す。転写リプレッサーの例としては、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）リプレッサードメイン；スクレラキシス（ＳＣＸ）ＨＬＨドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ１）ＨＬＨドメインの阻害剤、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン含有タンパク質２（ＨＥＲＣ２）Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＳＴ１）ＨＬＨドメイン、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．２（ＮＫＸ２２）ホメオドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ３）ＨＬＨドメインの阻害剤、及びツイスト関連タンパク質２（ＴＷＳＴ２）ＨＬＨドメイン、ＥＥＤリプレッサードメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；ヘアリー関連塩基性ヘリックスループヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（モチーフがＷＲＰＷ抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；並びにＨＰ１アルファクロモシャドウ抑制ドメインが挙げられる。

【0144】

いくつかの実施形態では、転写リプレッサードメインは、遺伝子のプロモーター領域を標的とするとき、転写リプレッサードメインの不在下での遺伝子の転写レベルと比較した場合、遺伝子の転写レベルを少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、又は少なくとも５００％減少させることができる。いくつかの実施形態では、転写リプレッサードメインは、遺伝子のプロモーター領域を標的とするとき、転写リプレッサードメインの不在下での遺伝子の転写レベルと比較した場合、遺伝子の転写レベルを１０％～５０％、１０％～１００％、１０％～１００％、１０％～２００％、１０％～３００％、１０％～４００％、１０％～５００％、５０％～５００％、１００％～５００％、２００％～５００％減少させることができる。

【0145】

本明細書で使用される場合、「核局在化シグナル」又は「ＮＬＳ」は、タンパク質配列中に存在するアミノ酸配列モチーフを指し、それはタンパク質を核輸送によって核に輸入するように細胞にシグナル伝達する。ＮＬＳは、典型的には、正に荷電した残基（例えば、リジン又はアルギニン）が豊富な表面曝露された短いアミノ酸配列を含む。ＮＬＳの例としては、配列番号２～４のアミノ酸配列が挙げられる。

【0146】

本明細書で使用される場合、「核輸送シグナル」又は「ＮＥＳ」は、典型的には約１５残基長であり、かつ核輸送を使用して核細孔複合体を通して細胞核から細胞質への輸送のためのタンパク質を標的とする４個の疎水性残基を含むアミノ酸配列モチーフを指す。ＮＥＳの例としては、配列番号５～１４のアミノ酸配列が挙げられる。

【0147】

本明細書に記載されるＩＴＦは、２つのドメインを隔てるペプチドリンカーを含み得る。一般に、任意の２つのドメインは、ペプチドリンカーと一緒に連結することができ、３つ以上のドメインを特徴とするＩＴＦは、２つ以上のリンカーを含み得る。２つのドメインを連結する適切なリンカー配列の選択は、当業者の技術範囲内である。ペプチドリンカーは、ポリペプチドドメインの機能を妨げることなく、２つのポリペプチドドメイン（例えば、誘導性転写因子及びデグロン）を隔てる任意のポリペプチド配列であり得る。ペプチドリンカーの例としては、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１５）、ＫＥＧＳ（配列番号１６）、ＥＧＫ、ＥＡＡＡＫ（配列番号１７）、ＡＡＰＡＫＱＥ（配列番号１８）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＧＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１９、本明細書では「連結されたＭａｘ Ｊｅｎリンカー」又は「ＣｏｎＭＪ」と称される）、ＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＰＡＡＫＡＥＡＰＡＡＡＰＡＡＫＡ（配列番号２０、本明細書では「ｅｃｐｄ」と称される）、及びＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号２１）が挙げられる。

【0148】

「発現カセット」という用語は、標的細胞における特定のポリヌクレオチドの転写を可能にする一連の核酸エレメントを有する、組換え的に又は合成的に産生されたポリヌクレオチドを指す。本明細書に記載される発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片に組み込まれ得る。典型的には、発現ベクターの発現カセット部分は、他の配列の中でも特に、転写される核酸配列及びプロモーターを含む。

【0149】

本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、核酸配列の残りの転写の開始及び速度が制御される核酸配列の制御領域を指す。プロモーターはまた、調節タンパク質及び分子、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子などが結合し得る小領域を含み得る。プロモーターは、構成的、誘導的、抑制的、組織特異的、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現を駆動する又は転写を駆動する。本明細書中では、プロモーターは、それが調節する核酸配列に関係して、正しい機能的位置及び配向にある場合、その配列の転写開始及び／又は発現を制御する（駆動する）ために、「作動可能に連結されている」と考えられる。

【0150】

プロモーターは、所与の遺伝子又は配列のコードセグメントの上流に位置する５’非コード配列を単離することにより得られ得るように、遺伝子又は配列と天然に関連付けられるプロモーターであり得る。そのようなプロモーターは「内因性」として言及され得る。いくつかの実施形態では、コード核酸配列は、組換え又は異種プロモーターの制御下に配置され得るが、それは、その天然の環境においてコード化された配列と通常は関連付けられないプロモーターを指す。かかるプロモーターは、他の遺伝子のプロモーター；任意の他の細胞から単離されたプロモーター；並びに「天然」ではない合成プロモーター又はエンハンサー、例えば、当該技術分野で既知である遺伝子操作の方法を通じて発現を改変する異なる転写調節領域の異なるエレメント及び／又は変異を含むものなどを含み得る。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、配列は、組換えクローニング及び／又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む核酸増幅技術を使用して産生され得る（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号及び米国特許第５，９２８，９０６号を参照されたい）。

【0151】

本明細書で使用される場合、「調節可能プロモーター」は、転写活性を開始／活性化又は阻害／抑制する能力がシグナルによって調節されるプロモーターを指す。シグナルは、内因性若しくは通常は外因性の状態（例えば、光）、化合物（例えば、化学化合物又は非化学化合物）、又はプロモーター活性を調節する（例えば、誘導又は抑制する）ような方法で調節可能プロモーターと接触するタンパク質（例えば、本明細書に記載されるＩＴＦ）であり得る。例えば、ＩＴＦ応答性プロモーターは、ＩＴＦによって調節され得る調節可能プロモーターである。

【0152】

本明細書で使用される場合、「誘導性プロモーター」は、転写活性を開始又は活性化する能力がシグナルによって調節されるプロモーターを指す。シグナルは、内因性若しくは通常は外因性の状態（例えば、光）、化合物（例えば、化学化合物又は非化学化合物）、又は誘導性プロモーターから転写活性を活性化するような方法で誘導性プロモーターと接触するタンパク質（例えば、本明細書に記載される転写活性化ドメインを含むＩＴＦ）であり得る。例えば、ＩＴＦ応答性プロモーターは、ＩＴＦによって活性化可能な誘導性プロモーターであり得る。

【0153】

本明細書で使用される場合、「抑制可能プロモーター」は、転写活性を阻害又は抑制する能力がシグナルによって調節されるプロモーターを指す。シグナルは、内因性若しくは通常は外因性の状態（例えば、光）、化合物（例えば、化学化合物又は非化学化合物）、又は抑制可能プロモーターから転写活性を抑制することにおいて活性となるような方法で抑制可能プロモーターと接触するタンパク質（例えば、本明細書に記載される転写リプレッサードメインを含むＩＴＦ）であり得る。例えば、ＩＴＦ応答性プロモーターは、ＩＴＦによって抑制可能である抑制可能プロモーターであり得る。

【0154】

本明細書で使用される場合、プロモーターは、そのシグナルの存在においてプロモーターからの転写が活性化、不活化、増加、又は減少する場合に、シグナル「に応答性」である、又はシグナル「により調節される（ｍｏｄｕｌａｔｅｄ）」、又はシグナル「により調節される（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）」。いくつかの実施形態では、プロモーターは、応答エレメントを含む。「応答エレメント」は、プロモーター領域内のＤＮＡの短い配列であり、それは、プロモーターから遺伝子発現を調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）（調節する（ｒｅｇｕｌａｔｅ））特定の分子（例えば、転写因子）に結合する。本開示に従って使用され得る応答エレメントは、限定されるものではないが、フロレチン調整可能制御要素（ＰＥＡＣＥ）、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、インターフェロンガンマ活性化配列（ＧＡＳ）（Ｄｅｃｋｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．１９９７ Ｍａｒ；１７（３）：１２１－３４、参照により本明細書に組み込まれる）、インターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）（Ｈａｎ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００４ Ａｐｒ ９；２７９（１５）：１５６５２－６１、参照により本明細書に組み込まれる）、ＮＦ－カッパＢ応答エレメント（Ｗａｎｇ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１２；２（４）：８２４－８３９、参照により本明細書に組み込まれる）、及びＳＴＡＴ３応答エレメント（Ｚｈａｎｇ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｊ ｏｆ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９６；２７１：９５０３－９５０９、参照により本明細書に組み込まれる）を含む。他の応答エレメントが本明細書によって包含される。応答エレメントはまた、その同族結合分子に対する応答エレメントの感受性を一般的に増加させるために、タンデムリピート（例えば、応答エレメントをコードする同じヌクレオチド配列の連続リピート）を含むことができる。タンデムリピートは、２×、３×、４×、５×などとラベル付けして、存在するリピートの数を表示することができる。

【0155】

調節可能プロモーター（例えば、誘導性プロモーター及び抑制可能プロモーター）の非限定的な例は、表１に列挙され、それは、プロモーター及び転写因子の設計を示し、並びに転写因子（ＴＦ）及び導入遺伝子転写（Ｔ）に向かう誘導因子分子の効果が示されている（Ｂ、結合；Ｄ、解離；ｎ．ｄ．、未決定）（Ａ、活性化；ＤＡ、非活性化；ＤＲ、脱抑制）（Ｈｏｒｎｅｒ，Ｍ．＆Ｗｅｂｅｒ，Ｗ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８６（２０１２）２０７８４－２０９６ｍ、及びその中で引用される参考文献を参照されたい）。調節可能プロモーターの構成要素の非限定的な例には、表２に示されるものが挙げられる。

【0156】

（表１）

【0157】

（表２）

【0158】

本明細書で使用される場合、「構成的プロモーター」は、連続的又は制御されていない転写活性を一般的に可能にするプロモーターを指す。

【0159】

構成的プロモーターの他の非限定的な例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、伸長因子１－アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーターとＥＦ１ａバリアントｈＥＦ１ａＶ１及びｈＥＦ１ａＶ２、伸長因子（ＥＦＳ）プロモーター、ＭＮＤプロモーター（骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを伴う修飾ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲのＵ３領域を含む合成プロモーター）、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、並びにユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターが挙げられる。構成的プロモーター核酸配列の例を表３に示す。

【0160】

（表３）

【0161】

オリゴマー化可能な抗体ドメインを含み、かつ／又はカフェイン、カンナビノイド、若しくはニコチンによって誘導可能な転写因子
いくつかの実施形態では、本開示は、オリゴマー化可能な抗体ドメインを含み、かつ／又はカフェイン、カンナビノイド（例えば、カンナビジオールなどのフィトカンナビノイド）、ニコチン、若しくはそれらの誘導体によって誘導可能である、誘導性転写因子（ＩＴＦ）を提供する。

【0162】

いくつかの実施形態では、ＩＴＦは、ＤＮＡ結合ドメインと、第１の抗体又はその断片を含む第１のリガンド結合ドメインと、を含む第１の単量体と；転写エフェクタードメインと、第２の抗体又はその断片を含む第２のリガンド結合ドメインと、を含む第２の単量体と、を含む。カフェイン、カンナビノイド（例えば、カンナビジオールなどのフィトカンナビノイド）、及びニコチンから選択される同族リガンドに結合すると、第１の抗体又はその断片、及び第２の抗体又はその断片は、オリゴマー化（例えば、二量体化）し、第１及び第２の抗体又はその断片のリガンド誘導オリゴマー化は、誘導性転写因子を形成する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗体又はその断片は、ＶＨ抗体ドメイン、ＶＬ抗体ドメイン、及び単一ドメイン抗体から選択される。

【0163】

いくつかの実施形態では、ＩＴＦは、カフェイン、カンナビノイド、又はニコチンによって誘導可能であり、ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の単量体と；転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の単量体と、を含む。カフェイン、カンナビノイド（例えば、カンナビジオールなどのフィトカンナビノイド）、及びニコチンから選択される同族リガンドに結合すると、第１の単量体及び第２の単量体は、オリゴマー化（例えば、二量体化）し、第１及び第２の単量体のリガンド誘導オリゴマー化は、誘導性転写因子を形成する。

【0164】

いくつかの実施形態では、同族リガンドは、カフェイン又はその誘導体である。カフェインは、メチルキサンチンクラスの中枢神経系（ＣＮＳ）刺激剤である。カフェインは、米国食品医薬品局によって、一般に安全と認められている（ＧＲＡＳ）ものとして分類されている。成人に対する１日当たり１０グラムを超える毒性用量は、１日当たり５００ミリグラム未満の典型的な用量よりもはるかに高い。いくつかの実施形態では、同族リガンドは、カフェインであり、第１のリガンド結合ドメイン及び第２のリガンド結合ドメインは各々、カフェインに特異的に結合する。

【0165】

いくつかの実施形態では、同族リガンドは、カンナビノイドである。いくつかの実施形態では、第１のリガンド結合ドメイン及び第２のリガンド結合ドメインはそれぞれ、カンナビノイド（例えば、カンナビジオールなどのフィトカンナビノイド）に特異的に結合する。本明細書で使用される場合、「カンナビノイド」は、身体の様々な部分で発現され、かつ気分、食欲、記憶、及び免疫応答の調節に関与する、カンナビノイド受容体に作用する任意の化合物を指す。カンナビノイドには、エンドカンナビノイド、合成カンナビノイド、及びフィトカンナビノイドが含まれる。エンドカンナビノイドは、哺乳類の身体によって天然に産生され、アナンダミド（Ｎ－アラキドノイルエタノールアミド）及び２－アラキドノイルグリセロール（２－ＡＧ）を含む。「合成カンナビノイド」は、カンナビノイド受容体と相互作用するが、自然界で産生されることは知られていない化合物を指す。合成カンナビノイドの例としては、ＪＷＨ－０１８、ＪＷＨ－０７３、ＪＷＨ－３９８、ＪＷＨ－２５０、ＣＰ ４７，４９７、及びＨＵ－２１０が挙げられる。「フィトカンナビノイド」は、植物によって天然に産生されるカンナビノイドを指す。フィトカンナビノイドには、カンナビス植物（例えば、テトラヒドロカンナビノール、カンナビジオール、カンナビクロメン、及びカンナビゲロール）によって生成されるカンナビノイド、並びにベータ－カリオフィレン（カンナビス、黒コショウ、及びクローブを含む植物によって産生される）などの追加のタイプの植物によって生成されるカンナビノイド、及びジインドリルメタン（ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、及び芽キャベツを含むアブラナ科野菜によって生成される）が含まれる。いくつかの実施形態では、カンナビノイドは、フィトカンナビノイドである。いくつかの実施形態では、フィトカンナビノイドは、カンナビジオールである。カンナビジオール（「ＣＢＤ」とも称される）は、疼痛、不眠症、及び不安を含む様々な病気を治療するために使用される、非精神活性性カンナビス由来カンナビノイドである。ＣＢＤの典型的な用量は、２ｍｇ～５０ｍｇの範囲である。カンナビスの花は、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）として知られる分子を産生し、熱活性化に伴い脱カルボン酸化されてカンナビジオールを形成する。いくつかの実施形態では、フィトカンナビノイドは、カンナビジオール及びカンナビジオール酸から選択される。いくつかの実施形態では、同族リガンドは、カンナビノイド（例えば、ＣＢＤなどのフィトカンナビノイド）であり、第１のリガンド結合ドメイン及び第２のリガンド結合ドメインはそれぞれ、カンナビノイド（例えば、ＣＢＤなどのフィトカンナビノイド）に特異的に結合する。

【0166】

いくつかの実施形態では、同族リガンドは、ニコチン又はその誘導体である。ニコチンはキラルアルカロイドであり、ナス科の植物（最も主にたばこ及びＤｕｂｏｉｓｉａ ｈｏｐｗｏｏｄｉｉ中にある）で天然に産生され、刺激剤として娯楽的に広く使用されている。紙巻きたばこ中に存在するニコチンの典型的な用量は、約１０ｍｇ～約１２ｍｇであり、紙巻きたばこの喫煙中に約１ｍｇ～１．５ｍｇのニコチンが吸入される。いくつかの実施形態では、同族リガンドはニコチンであり、第１のリガンド結合ドメイン及び第２のリガンド結合ドメインはそれぞれ、ニコチンに特異的に結合する。

【0167】

実施形態では、第１のリガンド結合ドメインは、第１の抗体又はその断片を含み、第２のリガンド結合ドメインは、第２の抗体又はその断片を含み、第１の抗体又はその断片及び第２の抗体又はその断片は、同族リガンドの存在下でオリゴマー化（例えば、二量体化）することができる。

【0168】

いくつかの実施形態では、第１のリガンド結合ドメイン及び第２のリガンド結合ドメインはそれぞれ、単一ドメイン抗体を含む。本明細書で使用される場合、「単一ドメイン抗体」（ナノボディとしても知られる）は、ラクダ科動物（ラクダ及びラマ由来のＶ_ＨＨ）及び軟骨魚（サメ由来のＶ_ＮＡＲ）に存在するものなど、重鎖のみの抗体に由来する抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、Ｖ_ＨＨである。いくつかの実施形態では、第１のリガンド結合ドメインは、第１の単一ドメイン抗体を含み、第２のリガンド結合ドメインは、第２のドメイン抗体を含み、第１の単一ドメイン抗体及び第２の単一ドメイン抗体は、リガンドの存在下で二量体化することができる。

【0169】

いくつかの実施形態では、ＩＴＦは、カフェイン誘導性転写因子である。いくつかの実施形態では、Ｖ_ＨＨは、抗カフェインＶ_ＨＨ（本明細書では「ａｃＶ_ＨＨ」とも称される）である。「抗カフェインＶ_ＨＨ」は、カフェインに特異的に結合する抗原結合ドメインを有するラクダ科単一ドメイン抗体を指す。

【0170】

いくつかの態様では、抗カフェインＶ_ＨＨは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のリガンド結合ドメインは、第１の抗カフェインＶ_ＨＨ（ａｃＶ_ＨＨ）を含み、第２のリガンド結合ドメインは、第２の抗カフェインＶ_ＨＨ（ａｃＶ_ＨＨ）を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗カフェインＶ_ＨＨは含む。いくつかの実施形態では、第１の単量体及び第２の単量体はそれぞれ、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗カフェインＶ_ＨＨ及び第２の抗カフェインＶ_ＨＨは、同一のアミノ酸配列を有し（又は少なくとも９５％、９６％、９６％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を共有する）、カフェインの存在下で二量体化することができ、それによって、第１の単量体及び第２の単量体を二量体化させる。

【0171】

いくつかの実施形態では、ＩＴＦは、カンナビノイド誘導性転写因子である。いくつかの実施形態では、同族リガンドは、カンナビノイド（例えば、ＣＢＤなどのフィトカンナビノイド）であり、第１のリガンド結合ドメイン及び第２のリガンド結合ドメインは、単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、Ｖ_ＨＨである。いくつかの実施形態では、Ｖ_ＨＨは、抗ＣＢＤ Ｖ_ＨＨである。抗ＣＢＤ Ｖ_ＨＨの例としては、ＣＡ１４（配列番号５３）、ＤＢ６（配列番号５４）、ＤＢ１１（配列番号５５）、ＤＢ１８（配列番号５６）、及びＤＢ２１（配列番号５７）が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｖ_ＨＨは、配列番号５３～５７から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の又はリガンド結合ドメインのうちの一方は、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含み、第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの他方は、配列番号５４～５７（それぞれ、ＤＢ６、ＤＢ１１、ＤＢ１８、及びＤＢ２１）から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの１つは、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含み、第１又は第２のリガンド結合ドメインの他方は、配列番号５７（ＤＢ２１）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗ＣＢＤ Ｖ_ＨＨ及び第２の抗ＣＢＤ Ｖ_ＨＨは、非同一であり、ＣＢＤの存在下で二量体化することができる。

【0172】

いくつかの実施形態では、第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの一方は、抗体重鎖（ＶＨ）を含み、第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの他方は、抗体軽鎖（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬは、同族リガンドの存在下で二量体化することができる。

【0173】

いくつかの実施形態では、ＩＴＦは、ニコチン誘導性転写因子である。いくつかの実施形態では、同族リガンドは、ニコチンであり、第１のリガンド結合ドメイン及び第２のリガンド結合ドメインはそれぞれ、抗ニコチン抗体重鎖可変ドメイン（抗Ｎｉｃ ＶＨ）又は抗ニコチン抗体軽鎖可変ドメイン（抗Ｎｉｃ ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、抗Ｎｉｃ ＶＨは、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗Ｎｉｃ ＶＬは、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの一方は、抗Ｎｉｃ ＶＨを含み、第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの他方は、抗Ｎｉｃ ＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗Ｎｉｃ ＶＨ及び抗Ｎｉｃ ＶＬは、ニコチンの存在下で二量体化し、それによって、第１の単量体及び第２の単量体を二量体化させる。

【0174】

いくつかの実施形態では、カフェイン、カンナビノイド、又はニコチンによって誘導可能なＩＴＦのＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含む。

【0175】

いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、モジュラー設計であり、少なくとも１個のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）で構成される。

【0176】

いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、１～１０個のジンクフィンガーモチーフのアレイを含む。いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、６つのジンクフィンガーモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。

【0177】

いくつかの実施形態では、カフェイン、カンナビノイド、又はニコチンによって誘導可能なＩＴＦの転写エフェクタードメインは、転写活性化因子ドメインである。いくつかの実施形態では、転写活性化因子ドメインは、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化ドメイン；ＶＰ１６の４つのタンデムコピーを含む活性化ドメイン；ＶＰ６４活性化ドメイン；ＮＦκＢのｐ６５活性化ドメイン；エプスタイン－バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）活性化ドメイン；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ活性化ドメイン（ＶＰＲ活性化ドメイン）を含む三者活性化因子；及びヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメイン（ｐ３００ ＨＡＴコア活性化ドメイン）から選択される。

【0178】

いくつかの実施形態では、カフェイン、カンナビノイド、又はニコチンによって誘導可能なＩＴＦの転写エフェクタードメインは、転写リプレッサードメインである。いくつかの実施形態では、転写リプレッサードメインは、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；短縮型クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）リプレッサードメイン；スクレラキシス（ＳＣＸ）ＨＬＨドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ１）ＨＬＨドメインの阻害剤、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン含有タンパク質２（ＨＥＲＣ２）Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＳＴ１）ＨＬＨドメイン、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．２（ＮＫＸ２２）ホメオドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ３）ＨＬＨドメインの阻害剤、並びにツイスト関連タンパク質２（ＴＷＳＴ２）ＨＬＨドメイン、並びにＥＥＤリプレッサードメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；ヘアリー関連塩基性ヘリックスループヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（モチーフがＷＲＰＷ抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；並びにＨＰ１アルファクロモシャドウ抑制ドメインから選択される。

【0179】

いくつかの実施形態では、誘導性カフェイン、カンナビノイド、又はニコチンであるＩＴＦの第１の単量体及び／又は第２の単量体は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号２～４から選択される配列のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。

【0180】

いくつかの実施形態では、カフェイン、カンナビノイド、又はニコチンによって誘導可能なＩＴＦの第１の単量体は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。

【0181】

いくつかの実施形態では、カフェイン、カンナビノイド、又はニコチンによって誘導可能なＩＴＦの第１の単量体は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み、ラパマイシン又はその誘導体若しくは類似体によって誘導可能なＩＴＦの第２の単量体は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。

【0182】

いくつかの実施形態では、カフェイン、カンナビノイド、又はニコチンによって誘導可能なＩＴＦの第２の単量体は、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＮＥＳは、配列番号５～１４から選択される配列のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＥＳは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。

【0183】

いくつかの実施形態では、カフェイン、カンナビノイド、又はニコチンによって誘導可能なＩＴＦの第１の単量体は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み、ラパマイシン又はその誘導体若しくは類似体によって誘導可能なＩＴＦの第２の単量体は、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を含む。

【0184】

いくつかの実施形態では、カフェイン、カンナビノイド、又はニコチンによって誘導可能なＩＴＦの第１の単量体は、ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを隔てるペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、第１のリガンド結合ドメインに対しＮ末端側である。いくつかの実施形態では、第１のリガンド結合ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対しＮ末端側である。

【0185】

いくつかの実施形態では、カフェイン、カンナビノイド、又はニコチンによって誘導可能なＩＴＦの第２の単量体は、転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを隔てるペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、転写エフェクタードメインは、第２のリガンド結合ドメインに対しＮ末端側である。いくつかの実施形態では、第２のリガンド結合ドメインは、転写エフェクタードメインに対しＮ末端側である。

【0186】

カフェイン、カンナビノイド、又はニコチンによって誘導可能なＩＴＦが、第１及び第２の単量体のリガンド誘導オリゴマー化によって形成される場合、ＩＴＦは、目的の遺伝子の転写を調節することができる。第１及び第２の単量体のオリゴマー化産物は、オリゴマーの四級タンパク質構造がＤＮＡ結合ドメイン及び転写エフェクタードメインの両方を含むため、機能的ＩＴＦをもたらす。

【0187】

ミフェプリストンによって誘発される転写因子
いくつかの実施形態では、本開示は、ミフェプリストン又はその誘導体（すなわち、ミフェプリストン誘導性ＩＴＦ又は「ミフェプリストン－ＩＴＦ」）によって誘導可能な誘導性転写因子（ＩＴＦ）を提供する。ミフェプリストン－ＩＴＦは、ＤＮＡ結合ドメイン、転写エフェクタードメイン、及びリガンド結合ドメインを含む。同族リガンド（例えば、ミフェプリストン又はその誘導体）に結合すると、ＩＴＦは核局在化を受ける。細胞核に局在化された場合に、ＩＴＦは、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができる。

【0188】

ミフェプリストン（ＲＵ４８６としても知られる）は、中絶を誘発するために、またクッシング病を有する患者における高血糖症を治療するために臨床的に使用される抗プロゲステロン及び抗グルココルチコステロイド薬剤である。ミフェプリストン経口錠剤は、２００ｍｇ及び３００ｍｇの用量で入手可能である。

【0189】

いくつかの実施形態では、ミフェプリストン－ＩＴＦのリガンド結合ドメインは、プロゲステロン受容体ドメインを含む。プロゲステロン受容体（ＮＲ３Ｃ３又は核受容体サブファミリー３、グループＣ、メンバー３としても知られる）は、ホルモンプロゲステロンによって活性化される核受容体である。プロゲステロン受容体配列の例は、配列番号６８として提供される。いくつかの実施形態では、ミフェプリストン－ＩＴＦのリガンド結合ドメインは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。

【0190】

いくつかの実施形態では、ミフェプリストン－ＩＴＦのＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含む。

【0191】

いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、モジュラー設計であり、ジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）で構成される。

【0192】

いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、１～１０個のＺＦＡを含む。いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、少なくとも１個のＺＦＡを含む。いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、少なくとも２個のＺＦＡを含む。いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、少なくとも３個のＺＦＡを含む。いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、少なくとも４個のＺＦＡを含む。いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、少なくとも５個のＺＦＡを含む。いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、少なくとも１０個のＺＦＡを含む。いくつかの実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。

【0193】

いくつかの実施形態では、ミフェプリストン－ＩＴＦの転写エフェクタードメインは、転写活性化因子ドメインである。いくつかの実施形態では、転写活性化因子ドメインは、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化ドメイン；ＶＰ１６の４つのタンデムコピーを含む活性化ドメイン；ＶＰ６４活性化ドメイン；ＮＦκＢのｐ６５活性化ドメイン；エプスタイン－バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）活性化ドメイン；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ活性化ドメイン（ＶＰＲ活性化ドメイン）を含む三者活性化因子；及びヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメイン（ｐ３００ ＨＡＴコア活性化ドメイン）から選択される。

【0194】

いくつかの実施形態では、ミフェプリストン－ＩＴＦの転写エフェクタードメインは、転写リプレッサードメインである。いくつかの実施形態では、転写リプレッサードメインは、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；短縮型クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）リプレッサードメイン；スクレラキシス（ＳＣＸ）ＨＬＨドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ１）ＨＬＨドメインの阻害剤、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン含有タンパク質２（ＨＥＲＣ２）Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＳＴ１）ＨＬＨドメイン、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．２（ＮＫＸ２２）ホメオドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ３）ＨＬＨドメインの阻害剤、並びにツイスト関連タンパク質２（ＴＷＳＴ２）ＨＬＨドメイン、並びにＥＥＤリプレッサードメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；ヘアリー関連塩基性ヘリックスループヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（モチーフがＷＲＰＷ抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；並びにＨＰ１アルファクロモシャドウ抑制ドメインから選択される。

【0195】

いくつかの実施形態では、ミフェプリストン－ＩＴＦは、ＤＮＡ結合ドメインと転写エフェクタードメインとの間に局在化されたペプチドリンカーを含む。

【0196】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、転写エフェクタードメインに対しＮ末端側である。いくつかの実施形態では、ミフェプリストン－ＩＴＦは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＤＮＡ結合ドメイン、リガンド結合ドメイン（例えば、プロゲステロン受容体ドメイン）、及び転写エフェクタードメインを含む。

【0197】

いくつかの実施形態では、転写エフェクタードメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対しＮ末端側である。いくつかの実施形態では、ミフェプリストン－ＩＴＦは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、転写エフェクタードメイン、リガンド結合ドメイン（例えば、プロゲステロン受容体ドメイン、及びＤＮＡ結合ドメインを含む。

【0198】

ミフェプリストン－ＩＴＦが、同族リガンド（すなわち、ミフェプリストン又はその誘導体）と接触すると、ＩＴＦは、目的の遺伝子の転写を調節することができる核に転座する。

【0199】

いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＩＴＦ応答性プロモーターは、ＩＴＦ結合ドメイン配列及びコアプロモーター配列を含む。

【0200】

オリゴマー化可能な抗体ドメインを含み、かつ／又はカフェイン、カンナビノイド（例えば、カンナビジオールなどのフィトカンナビノイド）、オリゴマー化可能な抗体又はその断片によって形成されるニコチンＩＴＦによって誘導可能なＩＴＦを産生するための発現系
ＤＮＡ結合ドメイン、同族リガンドに結合する第１の抗体又はその断片を含む、第１の単量体と；転写エフェクタードメインと、同族リガンドに結合する第２の抗体又はその断片と、を含む第２の単量体と、を含む誘導性転写因子（ＩＴＦ）を産生するための発現系もまた提供され、第１の抗体又はその断片及び第２の抗体又はその断片は、同族リガンドの存在下でオリゴマー化（例えば、二量体化）することができる。

【0201】

いくつかの実施形態では、ＩＴＦを産生するための発現系は、第１のプロモーターと、第１の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第１の発現カセットと；第２のプロモーターと、第２の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第２の発現カセットと、を含む。

【0202】

いくつかの実施形態では、第１のプロモーター及び／又は第２のプロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、第１のプロモーター及び／又は第２のプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａＶ１、ｈＣＡＧＧ、ｈＥＦ１ａＶ２、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂから選択される構成的プロモーターである。

【0203】

いくつかの実施形態では、第１のプロモーター及び／又は第２のプロモーターは、調節可能プロモーターである。

【0204】

いくつかの実施形態では、第１のプロモーター及び／又は第２のプロモーターは、合成プロモーターである。

【0205】

カフェイン、カンナビノイド、又はニコチンによって誘導可能なＩＴＦを産生するための発現系
本明細書に記載されるカフェイン、カンナビノイド、又はニコチンによって誘導可能な誘導性転写因子（ＩＴＦ）を産生するための発現系もまた提供される。

【0206】

いくつかの実施形態では、カフェイン、カンナビノイド、又はニコチンによって誘導可能な誘導性転写因子（ＩＴＦ）を産生するための発現系は、第１のプロモーターと、本明細書に記載される第１の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第１の発現カセット；及び第２のプロモーターと、本明細書に記載される第２の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第２の発現カセットを含む。

【0207】

いくつかの実施形態では、第１のプロモーター及び／又は第２のプロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、第１のプロモーター及び／又は第２のプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａＶ１、ｈＣＡＧＧ、ｈＥＦ１ａＶ２、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂから選択される構成的プロモーターである。

【0208】

いくつかの実施形態では、第１のプロモーター及び／又は第２のプロモーターは、調節可能プロモーターである。

【0209】

いくつかの実施形態では、第１のプロモーター及び／又は第２のプロモーターは、合成プロモーターである。

【0210】

６つのジンクフィンガーモチーフのアレイを有するＺＦドメインを含む転写因子
いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）６つのジンクフィンガーモチーフのアレイを含むＺＦドメイン、及び（ｉｉ）第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の単量体と；（ｉ）転写エフェクタードメイン、及び（ｉｉ）第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の単量体と、を含むＩＴＦを提供し、第１及び第２のリガンド結合ドメインは、同族リガンドの存在下でオリゴマー化（例えば、二量体化）することができる。

【0211】

いくつかの実施形態では、６つのジンクフィンガーモチーフのアレイを含むＺＦドメインを含むＩＴＦは、ラパマイシン又はその誘導体若しくは類似体（本明細書では、「ラパマイシン誘導性転写因子」又は「ラパマイシン－ＩＴＦ」と称される）によって誘導可能である。ラパマイシン－ＩＴＦは、ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む第１の単量体、並びに転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む第２の単量体を含む。ラパマイシン－ＩＴＦのＤＮＡ結合ドメインは、モジュラー式でありかつ１０個のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）を含むジンクフィンガー（ＺＦＡ）タンパク質ドメインを含む。ラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、及びＦＫ１０１２から選択される同族リガンド、並びにその誘導体及び類似体に結合すると、第１の単量体及び第２の単量体は、オリゴマー化可能である。第１及び第２の単量体のリガンド誘導オリゴマー化は、ラパマイシン－ＩＴＦを形成し、これは、目的の遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター中のＺＦタンパク質結合部位に結合し、目的の遺伝子の転写を調節することができる。

【0212】

「ラパマイシン又はその誘導体若しくは類似体」は、ラパマイシンの哺乳類標的（ｍＴＯＲ）を遮断する免疫抑制性マクロライドを指す。ラパマイシン並びにその誘導体及び類似体は、抗増殖活性を有し、抗真菌活性及び／又は抗がん活性を有する。ラパマイシン誘導体又は類似体の例としては、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、及びＦＫ１０１２が挙げられる。

【0213】

いくつかの実施形態では、ラパマイシン－ＩＴＦは、それぞれラパマイシン又はその誘導体若しくは類似体に結合する第１のリガンド結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ラパマイシン－ＩＴＦの第１の単量体及び第２の単量体は、ラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、及びＦＫ１０１２、又はそれらの導体若しくは類似体から選択されるリガンドに結合すると二量体を形成することができる。

【0214】

いくつかの実施形態では、ラパマイシン－ＩＴＦの第１のリガンド結合ドメイン又は第２のリガンド結合ドメインのうちの一方は、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）を含み、第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの他方は、ラパマイシン（ｍＴＯＲ）キナーゼの哺乳類標的のＦＫＢＰ－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインを含む。ＦＫＢＰ（ＦＫＢ１２としても知られる）は、高親和性（Ｋｄ＝０．２ｎＭ）でラパマイシンに結合し、ＦＫＢＰ－ラパマイシン複合体は、ＦＲＰと会合することができ、したがって、ＦＫＢＰ－ラパマイシン－ＦＲＢ複合体を形成することができる。例示的なＦＫＢＰは、配列番号６０として提供される。例示的なＦＲＢは、配列番号６１として提供される。いくつかの実施形態では、第１のリガンド結合ドメイン又は第２のリガンド結合ドメインのうちの一方は、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの他方は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。

【0215】

いくつかの実施形態では、ラパマイシン－ＩＴＦのＺＦタンパク質ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。

【0216】

いくつかの実施形態では、ラパマイシン－ＩＴＦの転写エフェクタードメインは、転写活性化因子ドメインである。いくつかの実施形態では、転写活性化因子ドメインは、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化ドメイン；ＶＰ１６の４つのタンデムコピーを含む活性化ドメイン；ＶＰ６４活性化ドメイン；ＮＦκＢのｐ６５活性化ドメイン；エプスタイン－バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）活性化ドメイン；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ活性化ドメイン（ＶＰＲ活性化ドメイン）を含む三者活性化因子；及びヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメイン（ｐ３００ ＨＡＴコア活性化ドメイン）から選択される。

【0217】

いくつかの実施形態では、ラパマイシン－ＩＴＦの転写エフェクタードメインは、転写リプレッサードメインである。いくつかの実施形態では、転写リプレッサードメインは、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；短縮型クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）リプレッサードメイン；スクレラキシス（ＳＣＸ）ＨＬＨドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ１）ＨＬＨドメインの阻害剤、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン含有タンパク質２（ＨＥＲＣ２）Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＳＴ１）ＨＬＨドメイン、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．２（ＮＫＸ２２）ホメオドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ３）ＨＬＨドメインの阻害剤、並びにツイスト関連タンパク質２（ＴＷＳＴ２）ＨＬＨドメイン、並びにＥＥＤリプレッサードメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；ヘアリー関連塩基性ヘリックスループヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（モチーフがＷＲＰＷ抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；並びにＨＰ１アルファクロモシャドウ抑制ドメインから選択される。

【0218】

いくつかの実施形態では、ラパマイシン－ＩＴＦの第１の単量体及び／又は第２の単量体は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号５～７から選択される配列のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。

【0219】

いくつかの実施形態では、ラパマイシン－ＩＴＦの第１の単量体は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ラパマイシン－ＩＴＦの第１の単量体は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み、ラパマイシン又はその誘導体若しくは類似体によって誘導されるＩＴＦの第２の単量体は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。

【0220】

いくつかの実施形態では、ラパマイシン－ＩＴＦの第２の単量体は、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＮＥＳは、配列番号８～１７から選択される配列のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＥＳは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。

【0221】

いくつかの実施形態では、ラパマイシン－ＩＴＦの第１の単量体は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み、ラパマイシン又はその誘導体若しくは類似体によって誘導されるＩＴＦの第２の単量体は、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を含む。

【0222】

いくつかの実施形態では、ラパマイシン－ＩＴＦの第１の単量体は、ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを隔てるペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、第１のリガンド結合ドメインに対しＮ末端側である。いくつかの実施形態では、第１のリガンド結合ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対しＮ末端側である。

【0223】

いくつかの実施形態では、ラパマイシン－ＩＴＦの第２の単量体は、転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを隔てるペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、転写エフェクタードメインは、第２のリガンド結合ドメインに対しＮ末端側である。いくつかの実施形態では、第２のリガンド結合ドメインは、転写エフェクタードメインに対しＮ末端側である。

【0224】

ラパマイシン－ＩＴＦが、第１及び第２の単量体のリガンド誘導オリゴマー化によって形成される場合、ＩＴＦは、目的の遺伝子の転写を調節することができる。第１及び第２の単量体のオリゴマー化産物は、オリゴマーの四級タンパク質構造がＤＮＡ結合ドメイン及び転写エフェクタードメインの両方を含むため、機能的ＩＴＦをもたらす。

【0225】

６つのジンクフィンガーモチーフのアレイを有するＺＦドメインを含むオリゴマー化可能なＩＴＦを産生するための発現系
（ｉ）６つのジンクフィンガーモチーフのアレイを含むＺＦドメイン、及び（ｉｉ）第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の単量体と；（ｉ）転写エフェクタードメイン、及び（ｉｉ）第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の単量体と、を含むＩＴＦを産生するための発現系もまた提供され、第１及び第２のリガンド結合ドメインは、同族リガンドの存在下でオリゴマー化（例えば、二量体化）することができる。いくつかの実施形態では、同族リガンドは、ラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、又はそれらの類似体から選択され、発現系は、本明細書に記載されるラパマイシン誘導性転写因子（ラパマイシン－ＩＴＦ）を産生するためのものである。

【0226】

いくつかの実施形態では、発現系は、第１のプロモーターと、本明細書に記載されるラパマイシン－ＩＴＦの第１の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第１の発現カセットと；第２のプロモーターと、本明細書に記載されるラパマイシン－ＩＴＦの第２の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第２の発現カセットと、を含む。

【0227】

いくつかの実施形態では、第１のプロモーター及び／又は第２のプロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、第１のプロモーター及び／又は第２のプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａＶ１、ｈＣＡＧＧ、ｈＥＦ１ａＶ２、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂから選択される構成的プロモーターである。

【0228】

いくつかの実施形態では、第１のプロモーター及び又は第２のプロモーターは、誘導性プロモーターである。

【0229】

いくつかの実施形態では、第１のプロモーター及び／又は第２のプロモーターは、合成プロモーターである。

【0230】

ミフェプリストン－ＩＴＦを産生するための発現系
本明細書に記載されるミフェプリストン誘導性転写因子（ミフェプリストン－ＩＴＦ）を産生するための発現系もまた提供される。

【0231】

いくつかの実施形態では、発現系は、第１のプロモーターと、本明細書に記載されるミフェプリストン－ＩＴＦをコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む、第１の発現カセットを含む。

【0232】

いくつかの実施形態では、第１のプロモーター及び／又は第２のプロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、第１のプロモーター及び／又は第２のプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａＶ１、ｈＣＡＧＧ、ｈＥＦ１ａＶ２、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂから選択される構成的プロモーターである。

【0233】

いくつかの実施形態では、第１のプロモーター及び又は第２のプロモーターは、誘導性プロモーターである。

【0234】

いくつかの実施形態では、第１のプロモーター及び／又は第２のプロモーターは、合成プロモーターである。

【0235】

いくつかの実施形態では、発現系は、目的の遺伝子に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む第２の発現カセットを更に含み、ＩＴＦ応答性プロモーターは、コアプロモーター配列と、ミフェプリストン－ＩＴＦのＤＮＡ結合ドメインに結合する配列と、を含む。いくつかの実施形態では、コアプロモーター配列は、最小プロモーターを含む。

【0236】

ＩＴＦ応答性プロモーターを含む発現系
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される発現系は、目的の遺伝子に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む発現カセットを更に含み、ＩＴＦ応答性プロモーターは、コアプロモーター配列と、ＩＴＦのＤＮＡ結合ドメインに結合する配列と、を含む。

【0237】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＩＴＦは、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写を調節することができる。本明細書で使用される場合、「ＩＴＦ応答性プロモーター」は、本明細書に記載されるＩＴＦによって特異的に認識され、かつＩＴＦの同族リガンドの存在によって制御され得る、合成調節可能プロモーターを指す。

【0238】

いくつかの実施形態では、ＩＴＦ応答性プロモーターは、コアプロモーター配列と、本明細書に記載される誘導性転写因子（ＩＴＦ）によって特異的に認識されるＩＴＦ結合ドメインと、を含む。本明細書で使用される場合、「コアプロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩと相互作用し、かつ転写を開始するのに十分であるプロモーター配列を含むプロモーターの一部を指す。

【0239】

ＩＴＦ結合ドメインは、ＩＴＦのＤＮＡ結合ドメインに結合し、１つ以上のジンクフィンガー結合部位を含み得る。

【0240】

結合ドメインは、１つ以上のジンクフィンガー結合部位を含み得る。ジンクフィンガー結合部位は、ジンクフィンガータンパク質ドメイン（例えば、配列番号１のジンクフィンガータンパク質ドメイン）に結合することができるポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、ＩＴＦのＺＦタンパク質ドメインは、６つのジンクフィンガーモチーフのアレイを含み、ＩＴＦ応答性プロモーターのＩＴＦ結合ドメインは、６つのジンクフィンガーモチーフに対して少なくとも１つの結合部位を含む。結合ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上のジンクフィンガー結合部位を含み得る。例示的なジンクフィンガー結合部位は、ＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧ（配列番号６２）を含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、１つのジンクフィンガー結合部位を含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、２つ以上のジンクフィンガー結合部位を含む。ジンクフィンガー結合部位は、ＤＮＡリンカーによって隔てられ得る。ＤＮＡリンカーは、いくつかの実施形態では、５～４０、５～３０、１０～４０、１０～３０塩基対の長さであり得る。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、２つのジンクフィンガー結合部位を含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、３つのジンクフィンガー結合部位を含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、４つのジンクフィンガー結合部位を含む。ジンクフィンガー結合部位を含む例示的な結合ドメインを、配列：
ｃｇｇｇｔｔｔｃｇｔａａｃａａｔｃｇｃａｔｇａｇｇａｔｔｃｇｃａａｃｇｃｃｔｔｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃｔｃｃｃｇｔｃｔｃａｇｔａａａｇｇｔｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃａａｔｃｇｇａｃｔｇｃｃｔｔｃｇｔａｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃｇｔａｔｃａｇｔｃｇｃｃｔｃｇｇａａｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧ（配列番号６３）
に示す。配列番号６３の結合ドメインは、それぞれが配列番号１のジンクフィンガータンパク質ドメインに結合する４つの結合部位を含み、結合部位の各々はＤＮＡリンカーによって隔てられている。

【0241】

いくつかの実施形態では、コアプロモーター配列は、最小プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、コアプロモーター配列は、ｍｉｎＰ、ｍｉｎＣＭＶ、ＹＢ＿ＴＡＴＡ、及びｍｉｎＴＫから選択されるプロモーターを含む。

【0242】

いくつかの実施形態では、コアプロモーター配列は、構成的プロモーター配列に由来するコアプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、コアプロモーター配列は、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂから選択される構成的プロモーターに由来する。

【0243】

いくつかの実施形態では、コアプロモーター配列は、
ＴＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＧＧＧＧＣＣＡ（配列番号６４）
を含む。

【0244】

例示的なＩＴＦ応答性プロモーターは、配列：
ｃｇｇｇｔｔｔｃｇｔａａｃａａｔｃｇｃａｔｇａｇｇａｔｔｃｇｃａａｃｇｃｃｔｔｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃｔｃｃｃｇｔｃｔｃａｇｔａａａｇｇｔｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃａａｔｃｇｇａｃｔｇｃｃｔｔｃｇｔａｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃｇｔａｔｃａｇｔｃｇｃｃｔｃｇｇａａｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃａｔｔｃｇｔａａｇａｇｇｃｔｃａｃｔｃｔｃｃｃｔｔａｃａｃｇｇａｇｔｇｇａｔａＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＧＧＧＧＣＣＡ（配列番号６５）
を含む。

【0245】

いくつかの実施形態では、カフェイン、カンナビノイド、又はニコチンによって誘導可能なＩＴＦを産生するための発現系は、目的の遺伝子に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む第３の発現カセットを更に含み、ＩＴＦ応答性プロモーターは、コアプロモーター配列と、ＩＴＦのＤＮＡ結合ドメインに結合する配列と、を含む。

【0246】

いくつかの実施形態では、ラパマイシン誘導性転写因子を産生するための発現系は、目的の遺伝子に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む第３の発現カセットを更に含み、ＩＴＦ応答性プロモーターは、コアプロモーター配列と、ＩＴＦのＤＮＡ結合ドメインに結合する配列と、を含む。

【0247】

いくつかの実施形態では、ミフェプリストン誘導性転写因子を産生するための発現系は、目的の遺伝子に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む第２の発現カセットを更に含み、ＩＴＦ応答性プロモーターは、コアプロモーター配列と、ＩＴＦのＤＮＡ結合ドメインに結合する配列と、を含む。

【0248】

単離されたポリヌクレオチド分子及び異種構築物
本明細書に記載される発現系の１つ以上の構成要素を含む単離されたポリヌクレオチド分子及び異種構築物もまた本明細書に提供される。

【0249】

「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然環境から取り出されたＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸分子を指す。例えば、異種構築物中に含有される、本明細書に記載されるＩＴＦをコードするポリヌクレオチドは、単離されたとみなされる。単離されたポリヌクレオチドの更なる例としては、異種宿主細胞中で維持される組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された（部分的又は実質的に）ポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたポリヌクレオチドはまた、通常、ポリヌクレオチド分子を含む細胞中に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、ポリヌクレオチド分子は、染色体外又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。

【0250】

単離されたポリヌクレオチド分子には、ｃＤＮＡポリヌクレオチド、ＲＮＡポリヌクレオチド、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡなど）、ｍＲＮＡポリヌクレオチド、環状プラスミド、直線状ＤＮＡ断片、ベクター、ミニサークル、ｓｓＤＮＡ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）、及びオリゴヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。

【0251】

いくつかの実施形態では、単離されたポリヌクレオチド分子は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びネイキッドプラスミド（直鎖状又は環状）から選択される。

【0252】

本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドによって、ポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たり最大５個の点変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることが意図される。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの最大５％が、欠失若しくは別のヌクレオチドで置換されてもよい、又は参照配列中の総ヌクレオチドの最大５％のヌクレオチド数が参照配列に挿入されてもよい。参照配列のこれらの改変は、参照ヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端位置、又はそれらの末端位置の間のどこかで発生してもよく、参照配列中の残基の間で個々に、又は参照配列内の１つ以上の連続基中のいずれかに散在する。実用的な問題として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるかどうかは、既知のコンピュータプログラムを使用して従来的に決定することができる。

【0253】

「操作されたポリヌクレオチド」は、自然界では発生しないポリヌクレオチドである。しかしながら、操作されたポリヌクレオチドは、全体として非天然発生型である一方で、それは、自然界で発生するヌクレオチド配列を含み得ることが理解されるべきある。いくつかの実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、異なる生物からの（例えば、異なる種からの）ヌクレオチド配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、マウスヌクレオチド配列、細菌ヌクレオチド配列、ヒトヌクレオチド配列、及び／又はウイルスヌクレオチド配列を含む。「操作されたポリヌクレオチド」という用語は、組換え核酸及び合成核酸を含む。「組換えポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド分子を連結することにより構築され、かついくつかの実施形態では、生細胞中で複製することができる分子を指す。「合成ポリヌクレオチド」は、増幅される、又は化学的に若しくは他の手段により合成される分子を指す。合成ポリヌクレオチドは、化学的に修飾された、又は他の方法で修飾されたものを含むが、天然発生型ヌクレオチド分子と塩基対合することができる。修飾は、１つ以上の修飾されたヌクレオチド間連結及び非天然核酸を含むが、これらに限定されない。修飾は、米国特許第６，６７３，６１１号及び米国出願公開第２００４／００１９００１号において更に詳細に記載されており、それらの各々が、それらの全体が参照により組み込まれる。修飾されたヌクレオチド間連結は、ホスホロジチオエート又はホスホロチオエート連結であり得る。非天然核酸は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ又は「モルホリノ」）、及びトレオース核酸（ＴＮＡ）であり得る。非天然核酸は、国際出願第１９９８／０３９３５２号、米国出願公開 第２０１３／０１５６８４９号、及び米国特許第６，６７０，４６１号；第５，５３９，０８２号；第５，１８５，４４４号において更に詳細に記載されており、各々が、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。組換えポリヌクレオチド及び合成ポリヌクレオチドはまた、前述のうちのいずれかの複製からもたらされる分子を含む。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、単一の分子（例えば、同じプラスミド又は他のベクター中に含まれる）により、又は複数の異なる分子（例えば、複数の異なる独立して複製する分子）によりコードされ得る。

【0254】

本開示の操作されたポリヌクレオチドは、標準的な分子生物学方法（例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２０１２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）を使用して産生され得る。いくつかの実施形態では、操作された核酸構築物は、ＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）クローニング（例えば、Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３４３－３４５，２００９、及びＧｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，９０１－９０３，２０１０を参照されたく、それらの各々が、参照により本明細書に組み込まれる）を使用して産生される。ＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）は、典型的には、単一チューブ反応において３つの酵素活性を使用する：５’エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼのＹ伸長活性、及びＤＮＡリガーゼ活性。５’エキソヌクレアーゼ活性は、５’末端配列を噛み返し、アニーリングのために相補配列を露出させる。ポリメラーゼ活性は次に、アニーリングされた領域上のギャップを埋める。ＤＮＡリガーゼは次に、ニックを密閉し、ＤＮＡ断片を一緒に共有結合的に連結させる。隣接する断片の重複する配列は、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙにおいて使用されるものよりもはるかに長く、したがって、正しい組み立ての高いパーセンテージがもたらされる。いくつかの実施形態では、操作された核酸構築物は、ＩＮ－ＦＵＳＩＯＮ（登録商標）クローニング（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して産生される。

【0255】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチド分子は、異種構築物に含まれる。「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、「異種構築物」と同義であり、標的細胞中の構築物と作動可能に関連する１つ以上の遺伝子の発現を導入及び方向付けするために使用されるポリヌクレオチド分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としての構築物、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。いくつかの実施形態では、異種構築物は、レンチウイルスベクターを含む。

【0256】

いくつかの実施形態では、カフェイン、カンナビノイド、又はニコチンによって誘導可能なＩＴＦの第１の単量体をコードするポリヌクレオチド分子を含む、第１の発現カセットと；カフェイン、カンナビノイド、又はニコチンによって誘導可能なＩＴＦの第２の単量体をコードするポリヌクレオチド分子を含む、第１の発現カセットを含む第２の異種構築物と、を含む、第１の異種構築物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ラパマイシン誘導性転写因子（ラパマイシン－ＩＴＦ）の第１の単量体をコードするポリヌクレオチド分子を含む、第１の発現カセットと；ラパマイシン誘導性転写因子（ラパマイシン－ＩＴＦ）の第２の単量体をコードするポリヌクレオチド分子を含む、第１の発現カセットを含む第２の異種構築物と、を含む、第１の異種構築物が本明細書に提供される。

【0257】

いくつかの実施形態では、ミフェプリストン誘導性転写因子（ミフェプリストン－ＩＴＦ）をコードするポリヌクレオチド分子を含む発現カセットを含む異種構築物が本明細書に提供される。

【0258】

いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリヌクレオチド又は異種構築物は、複数のポリペプチドを産生するように構成される。例えば、ポリヌクレオチドは、２つの異なるポリペプチド（例えば、ＩＴＦ及び第２のポリペプチド）を産生するように構成され得る。

【0259】

いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリヌクレオチド又は異種構築物は、複数のポリペプチドを産生するように構成される。例えば、ポリヌクレオチドは、２つの異なるポリペプチド（例えば、ラパマイシン－ＩＴＦ又はカフェイン、カンナビノイド、若しくはニコチンによって誘導可能なＩＴＦの第１の単量体及び第２の単量体）を産生するように構成され得る。ポリヌクレオチド分子は、ＩＴＦの第１の単量体及び第２の単量体を産生するように構成されてもよく、両方の単量体は同じプロモーターの制御下にある。

【0260】

いくつかの実施形態では、操作された核酸は、マルチシストロニックであってもよく、すなわち、２つ以上の別個のポリペプチド（例えば、ラパマイシン－ＩＴＦ又はカフェイン、カンナビノイド、ニコチン、若しくはミフェプリストンによって誘導可能なＩＴＦの第１の単量体及び第２の単量体）は、単一の転写物から産生され得る。操作された核酸は、様々なリンカーの使用によりマルチシストロニックであってもよく、例えば、第１の外因性ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド配列は、５’から３’方向に、第１の遺伝子：リンカー：第２の遺伝子など、第２の外因性ポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列に連結され得る。リンカーポリヌクレオチド配列は、Ｔ２Ａなどの１つ以上の２Ａリボソームスキッピングエレメントをコードし得る。他の２Ａリボソームスキッピングエレメントには、Ｅ２Ａ、Ｐ２Ａ、及びＦ２Ａが含まれるが、これらに限定されない。２Ａリボソームスキッピングエレメントによって、第１及び第２の遺伝子によりコードされる別々のポリペプチドの産生が翻訳中に可能になる。リンカーは、切断可能なリンカーポリペプチド配列、例えばフューリン切断部位又はＴＥＶ切断部位などをコードすることができ、それにおいて、発現に続いて、切断可能なリンカーポリペプチドは、第一及び第二の遺伝子によりコードされる別々のポリペプチドが産生されるように切断される。切断可能リンカーは、切断を更に促進する、ポリペプチド配列、例えば、可動性リンカー（例えば、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ配列）などを含むことができる。

【0261】

リンカーは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードすることができ、第一及び第二の遺伝子によりコードされる別々のポリペプチドが、翻訳中に産生されるようにする。リンカーは、スプライスアクセプター、例えばウイルススプライスアクセプターなどをコードすることができる。

【0262】

リンカーは、２Ａリボソームスキッピング、それに続く、２Ａ残基の完全な除去を可能にするフューリン部位の更なる切断を通じて別々のポリペプチドを産生することができるリンカー、例えばフューリン－２Ａリンカーなどの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、リンカーの組み合わせは、フューリン配列、可動性リンカー、及び２Ａリンカーを含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、リンカーは、フューリン－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－２Ａ融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、リンカーは、フューリン－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｔ２Ａ融合ポリペプチドである。

【0263】

一般に、マルチシストロニック系は、任意の数又は組み合わせのリンカーを使用して、任意の数の遺伝子又はその部分を発現することができる（例えば、操作された核酸は、第１、第２、及び第３のエフェクター分子によってコードされる別個のポリペプチドが産生されるように、各々がリンカーによって隔てられた第１、第２、及び第３のエフェクター分子をコードすることができる）。

【0264】

本明細書で使用される場合、「リンカー」は、第１のポリペプチド配列及び第２のポリペプチド配列を連結するペプチドリンカーを指し得る、又は上に記載されるマルチシストロニックリンカーを指し得る。

【0265】

いくつかの実施形態では、プロモーター；カフェイン、カンナビノイド、又はニコチンによって誘導可能なＩＴＦの第１の単量体をコードする第１のポリヌクレオチド配列；カフェイン、カンナビノイド、又はニコチンによって誘導可能なＩＴＦの第２の単量体をコードする第２のポリヌクレオチド配列；及び第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間の切断可能なリンカーを含むマルチシストロニック発現カセットを含む異種構築物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、プロモーター；ラパマイシン誘導性転写因子の第１の単量体をコードする第１のポリヌクレオチド配列；ラパマイシン誘導性転写因子の第２の単量体をコードする第２のポリヌクレオチド配列；及び第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間の切断可能なリンカーを含むマルチシストロニック発現カセットを含む異種構築物が本明細書に提供される。

【0266】

いくつかの実施形態では、本開示の操作された核酸は、転写後調節エレメント（ＰＲＥ）を含む。ＰＲＥは、三次ＲＮＡ構造の安定性と３’末端形成を可能にすることで遺伝子発現を強化することができる。ＰＲＥの非限定的な例としては、Ｂ型肝炎ウイルスＰＲＥ（ＨＰＲＥ）及びウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥ（ＷＰＲＥ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥは、ＷＰＲＥエレメントのアルファ、ベータ、及びガンマ構成要素を含む。いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥは、ＷＰＲＥエレメントのアルファ構成要素を含む。ＷＰＲＥ配列の例としては、配列番号６６及び配列番号６７が挙げられる。

【0267】

操作された細胞
本明細書に記載される誘導性転写因子（ＩＴＦ）を発現する、又は本開示の１つ以上の発現系若しくは異種構築物を含む、細胞、及び細胞を産生する方法もまた提供される。これらの細胞は、本明細書で「操作された細胞」と称される。典型的には、１つ以上の操作された核酸を含むこれらの細胞は、自然界では発生しない。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上の操作されたポリヌクレオチドを組換え的に発現する単離された細胞である。いくつかの実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、１つ以上のベクター又は細胞のゲノム由来の選択された遺伝子座から発現される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチドを含むように操作される。

【0268】

本開示の操作された細胞は、細胞のゲノムに組み込まれた操作されたポリヌクレオチドを含み得る。操作された細胞は、例えば、プラスミド又はｍＲＮＡなどの一過性発現系で操作された、細胞のゲノムに組み込まれることなく発現が可能である、操作されたポリヌクレオチドを含み得る。

【0269】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＩＴＦを含む操作された細胞が提供される。いくつかの実施形態では、細胞は、目的の遺伝子をコードする外因性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された、本明細書に記載されるＩＴＦ応答性プロモーターを含む発現カセットを更に含む。

【0270】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるカフェイン又はその誘導体（すなわち、カフェイン誘導性転写因子又は「カフェイン－ＩＴＦ」）によって誘導可能なＩＴＦを含む操作された細胞が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるカフェイン－ＩＴＦの第１及び第２の単量体をコードする発現系を含む操作された細胞が提供される。

【0271】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるカンナビノイド（すなわち、カンナビノイド誘導性転写因子又は「カンナビノイド－ＩＴＦ」）によって誘導可能なＩＴＦを含む操作された細胞が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるカンナビノイド－ＩＴＦの第１及び第２の単量体をコードする発現系を含む操作された細胞が提供される。

【0272】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン又はその誘導体（すなわち、ニコチン誘導性転写因子又は「ニコチン－ＩＴＦ」）によって誘導可能なＩＴＦを含む操作された細胞が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン－ＩＴＦの第１及び第２の単量体をコードする発現系を含む操作された細胞が提供される。

【0273】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるラパマイシン又はその誘導体若しくはアナログ（すなわち、ラパマイシン誘導性転写因子又は「ラパマイシン－ＩＴＦ」）によって誘導可能なＩＴＦを含む操作された細胞が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるラパマイシン－ＩＴＦの第１及び第２の単量体をコードする発現系を含む操作された細胞が提供される。

【0274】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるミフェプリストン又はその誘導体（すなわち、ミフェプリストン誘導性転写因子又は「ミフェプリストン－ＩＴＦ」）によって誘導可能なＩＴＦを含む操作された細胞が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるミフェプリストン－ＩＴＦをコードする発現系を含む操作された細胞が提供される。

【0275】

本開示の操作された細胞は、ヒト細胞であり得る。操作された細胞は、ヒト初代細胞であり得る。操作された初代細胞は、任意の体細胞であり得る。操作された初代細胞は、任意の幹細胞であり得る。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、対象由来である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、対象に関して同種異系である。

【0276】

本開示の操作された細胞は、対象、例えば、がんを有することが知られている、又は疑われる対象から単離することができる。細胞単離方法は当業者に既知であり、細胞表面マーカー発現に基づくソーティング技術、例えば、ＦＡＣＳソーティング、ポジティブ単離技術、及びネガティブ単離、磁気単離、並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。操作された細胞は、治療が施されている対象に関して同種であり得る。同種改変細胞は、治療が施されている対象にＨＬＡ適合させることができる。操作された細胞は、培養細胞、例えばエクスビボ培養細胞などであり得る。操作された細胞は、エクスビボ培養細胞、例えば対象から単離された初代細胞などであり得る。培養細胞は、１つ以上のサイトカインと培養することができる。

【0277】

いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、以下から選択される：Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、又はガンマデルタＴ細胞）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球細胞、マスト細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ（例えば、Ｍ１マクロファージ又はＭ２マクロファージ）、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ニューロン、乏突起膠細胞、星状膠細胞、プラコード由来細胞、シュワン細胞、心筋細胞、内皮細胞、結節細胞、ミクログリア細胞、肝細胞、胆管細胞、ベータ細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及びｉＰＳＣ由来細胞。

【0278】

いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、又はガンマ－デルタＴ細胞）である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、調節性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、Ｂ細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、自然リンパ球細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、マスト細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、好酸球である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、好塩基球である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、好中球である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、骨髄細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、マクロファージ、例えば、Ｍ１マクロファージ又はＭ２マクロファージである）。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、単球である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、樹状細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、赤血球である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、血小板細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、ニューロンである。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、ミクログリア細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、乏突起膠細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、星状膠細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、プラコード由来細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、シュワン細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、心筋細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、内皮細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、結節細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、ミクログリア細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、肝細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、胆管細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、ベータ細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、ＥＳＣ由来細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、ｉＰＳＣ由来細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、自家である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、同種異系である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ１６＋細胞、及び／又はＣＤ４＋細胞である。

【0279】

いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、腺癌細胞、膀胱腫瘍細胞、脳腫瘍細胞（例えば、グリオーマ細胞又はグリオブラストーマ細胞）、乳房腫瘍細胞、頸部腫瘍細胞、大腸腫瘍細胞、食道腫瘍細胞、神経膠腫細胞、腎臓腫瘍細胞、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、メラノーマ細胞、中皮腫細胞、卵巣腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、皮膚腫瘍細胞、甲状腺腫瘍細胞、及び子宮腫瘍細胞から選択される腫瘍細胞である。

【0280】

本開示の操作された細胞を培養することを含む方法もまた提供される。本明細書中に記載される、操作された細胞を培養する方法は、公知である。当業者は、培養条件が、目的の特定の操作された細胞に依存することを認識するであろう。当業者は、培養条件が、操作された細胞の特定の下流の使用、例えば、対象への、操作された細胞のその後の投与のための特定の培養条件に依存することを認識するであろう。

【0281】

細胞を操作する方法
本明細書に記載される任意のポリヌクレオチド分子又は構築物を有する細胞を操作するための組成物及び方法もまた本明細書に提供される。

【0282】

一般に、細胞は、本開示の１つ以上のポリヌクレオチドの導入（すなわち、送達）により操作される。送達方法は、ウイルス媒介性送達、脂質媒介性トランスフェクション、ナノ粒子送達、エレクトロポレーション、超音波処理、及び物理的手段による細胞膜変形を含むが、これらに限定されない。当業者は、送達方法の選択が、操作しようとする特定の細胞型に依存し得ることを理解するであろう。

【0283】

ウイルス媒介性送達
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームを使用して、細胞を操作することができる。一般的に、ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、宿主細胞へ導入する（すなわち、送達する）ことにより細胞を操作する。例えば、ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、本明細書に記載される操作された核酸のうちのいずれかを導入することにより細胞を操作することができる。ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは核酸であり得るが、そのようなものとして、操作された核酸はまた、操作されたウイルス由来の核酸を包含し得る。そのような操作されたウイルス由来の核酸はまた、組換えウイルス又は操作されたウイルスと称され得る。

【0284】

ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、同じ核酸内に２つ以上の操作された核酸、遺伝子、又は導入遺伝子をコードし得る。例えば、操作されたウイルス由来の核酸、例えば、組換えウイルス又は操作されたウイルスは、１つ以上のエフェクター分子をコードする本明細書に記載される操作された核酸のいずれかを含むがこれらに限定されない１つ以上の導入遺伝子をコードし得る。１つ以上のエフェクター分子をコードする１つ以上の導入遺伝子を、１つ以上のエフェクター分子を発現するように構成することができる。ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、１つ以上の導入遺伝子（例えば、１つ以上のエフェクター分子をコードする導入遺伝子）に加えて、シス作用エレメント又はシス作用遺伝子と呼ばれる１つ以上の遺伝子、例えば、ウイルス感染性及び／又はウイルス産生に必要なウイルス遺伝子（例えば、キャプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、ウイルスポリメラーゼ、ウイルス転写酵素など）をコードし得る。

【0285】

ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、２つ以上のウイルスベクター、例えば、本明細書に記載され、トランス作用性エレメント又は遺伝子と称される、操作された核酸、遺伝子、又は導入遺伝子をコードする別々のウイルスベクターなどを含むことができる。例えば、ヘルパー依存性ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、１つ以上のエフェクター分子をコードするベクターに加えて、１つ以上の追加の別個のベクター上にウイルス感染性及び／又はウイルス産生に必要な追加の遺伝子を提供することができる。２つ以上のエフェクター分子を産生するように構成された操作された核酸を送達する１つのベクターなど、１つのウイルスベクターが複数の操作された核酸を送達することができる。１つ以上のエフェクター分子を産生するように構成された１つ以上の操作された核酸を送達する２つ以上のベクターなどの２つ以上のウイルスベクターが２つ以上の操作された核酸を送達することができる。使用されるウイルスベクターの数は、上で言及されるウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームのパッケージング容量に依存し得るが、当業者は、適した数のウイルスベクターを選択することができる。

【0286】

一般に、ウイルスベクターベースの系のいずれも、エフェクター分子などの分子のインビトロ産生のために使用することができ、又は、例えば、１つ以上のエフェクター分子をコードする操作された核酸を送達するために、インビボ及びエクスビボ遺伝子療法手順に使用することができる。適したウイルスベクターベースの系の選択は、様々な要因、例えばカーゴ／ペイロードのサイズ、ウイルス系の免疫原性、目的の標的細胞、遺伝子発現の強度及びタイミング、及び当業者により認識される他の要因などに依存する。

【0287】

ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、ＲＮＡベースのウイルス又はＤＮＡベースのウイルスであり得る。例示的なウイルスベクターベースの送達プラットフォームには、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、インディアナベシクロウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、粘液腫ウイルス、レオウイルス、ムンプスウイルス、マラバウイルス、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、肝炎ウイルス、風疹ウイルス、デングウイルス、チクングニアウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、モルビリウイルス、レンチウイルス、複製レトロウイルス、ラブドウイルス、セネカバレーウイルス、シンドビスウイルス、及びそれらの任意のバリアント又は誘導体が含まれるが、これらに限定されない。他の例示的なウイルスベクターベースの送達プラットフォームが、当該技術分野において記載されており、例えばワクシニア、鶏痘、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｔａｔｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００４）１０，６１６－６２９を参照されたい）、又はレンチウイルスなどであり、これらに限定されないが、特定の細胞型又は受容体を標的化するように設計された第二、第三又はハイブリッド第二／第三世代レンチウイルス及び任意の世代の組換えレンチウイルスを含む（例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（２０１１）２３９（１）：４５－６１、Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｂａｓｉｃ ｔｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（２０１２）４４３（３）：６０３－１８、Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｓｐｌｉｃｉｎｇ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｒｏｎ ｌｏｓｓ ｍａｘｉｍｉｚｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１５）４３（１）：６８２－６９０、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｌｆ－Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２（１２）：９８７３－９８８０を参照されたい）。

【0288】

この配列は、細胞内コンパートメントを標的化する１つ以上の配列で先行されてもよい。宿主細胞への導入（すなわち、送達）時に、感染細胞（すなわち、操作された細胞）は、本明細書に記載されるようにＩＴＦを発現することができる。免疫化プロトコルにおいて有用なワクシニアベクター及び方法が、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号において記載されている。別のベクターはＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６－４６０ （１９９１））において記載されている。操作された核酸の導入（すなわち、送達）のために有用な多種多様な他のベクター、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉベクター、及び同様のものが、本明細書の記載から当業者に明らかであろう。

【0289】

ウイルスベクター系送達プラットフォームは、腫瘍細胞を標的とするウイルスであってもよく、本明細書では腫瘍溶解性ウイルスと呼ばれる。腫瘍溶解性ウイルスの例としては、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性麻疹ウイルス、腫瘍溶解性インフルエンザウイルス、腫瘍溶解性インディアナベシクロウイルス、腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、腫瘍溶解性ポリオウイルス、腫瘍溶解性粘液腫ウイルス、腫瘍溶解性レオウイルス、腫瘍溶解性ムンプスウイルス、腫瘍溶解性マラバウイルス、腫瘍溶解性狂犬病ウイルス、腫瘍溶解性ロタウイルス、腫瘍溶解性肝炎ウイルス、腫瘍溶解性風疹ウイルス、腫瘍溶解性デングウイルス、腫瘍溶解性チクングニアウイルス、腫瘍溶解性呼吸器合胞体ウイルス、腫瘍溶解性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、腫瘍溶解性モルビリウイルス、腫瘍溶解性レンチウイルス、腫瘍溶解性複製レトロウイルス、腫瘍溶解性ラブドウイルス、腫瘍溶解性セネカバレーウイルス、腫瘍溶解性シンドビスウイルス、及びそれらの任意のバリアント又は誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される腫瘍溶解性ウイルスのいずれも、１つ以上のＩＴＦ又はＩＴＦ単量体をコードするもう１つの導入遺伝子（例えば、操作された核酸）を含む組換え腫瘍溶解性ウイルスであり得る。１つ以上のＩＴＦ又はＩＴＦ単量体をコードする導入遺伝子は、１つ以上のＩＴＦ又はＩＴＦ単量体を発現するように構成され得る。

【0290】

いくつかの実施形態では、ウイルスは、レンチウイルス、レトロウイルス、腫瘍溶解性ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及びウイルス様粒子（ＶＬＰ）から選択される。

【0291】

ウイルスベクター系送達プラットフォームは、レトロウイルスベースであり得る。一般的に、レトロウイルスベクターは、６～１０ｋｂまでの外来配列についてのパッケージング能力を伴う、シス作用性の長い末端反復で構成されている。最小のシス作用性ＬＴＲは、ベクターの複製とパッケージングに十分であり、その後、１つ以上の操作された核酸（例えば、１つ以上のＩＴＦ又はＩＴＦ単量体をコードする導入遺伝子）を標的細胞に組み込んで、永続的な導入遺伝子の発現を提供するために使用される。レトロウイルスベースの送達系には、マウス白血病、ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びそれらの組み合わせに基づく送達系を含むが、これらに限定されない（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１－２７３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５－１６４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８－５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４－２３７８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ，Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０－２２２４（１９９１）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照されたい）。他のレトロウイルス系は、Ｐｈｏｅｎｉｘレトロウイルス系を含む。

【0292】

ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、レンチウイルスベースであり得る。一般的に、レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入させる又は感染させることができ、典型的には、高いウイルス力価を産生するレトロウイルスベクターである。レンチウイルスベースの送達プラットフォームは、ＨＩＶベース、例えばＶｉｒａＰｏｗｅｒ系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）又はｐＬｅｎｔｉ系（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）などであり得る。レンチウイルスベースの送達プラットフォームは、ＳＩＶ又はＦＩＶベースであり得る。他の例示的なレンチウイルスベースの送達プラットフォームが、米国特許第７，３１１，９０７号、第７，２６２，０４９号、第７，２５０，２９９号、第７，２２６，７８０号、第７，２２０，５７８号、第７，２１１，２４７号、第７，１６０，７２１号、第７，０７８，０３１号、第７，０７０，９９３号、第７，０５６，６９９号、第６，９５５，９１９号において更に詳細に記載されており、各々が、参照により全ての目的のために本明細書に組み込まれる。

【0293】

ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、アデノウイルスベースであり得る。一般的に、アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を要求せず、高い力価及び発現のレベルを達成し、比較的単純な系において大量に産生することができる。一般的に、アデノウイルスは、感染細胞内での導入遺伝子の一過性発現のために使用することができる。なぜなら、アデノウイルスは、典型的には、宿主のゲノム中に組み込まれないためである。アデノウイルスベースの送達プラットフォームが、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２５４３ ２５４９，１９９４、Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：５１５ ５２４，１９９９、Ｌｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ ９２：７７００ ７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：１０８８ １０９７，１９９９、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４、及びＷＯ９５／００６５５においてより詳細に記載されており、各々が、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。他の例示的なアデノウイルスベースの送達プラットフォームが、米国特許第５５８５３６２号、第６，０８３，７１６号、第７，３７１，５７０号、第７，３４８，１７８号、第７，３２３，１７７号、第７，３１９，０３３号、第７，３１８，９１９号、及び第７，３０６，７９３号並びに国際特許出願第９６／１３５９７号においてより詳細に記載されており、各々が、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0294】

ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースであり得る。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して、操作された核酸（例えば、本明細書に記載される操作された核酸のいずれか）で細胞を形質導入してもよい。ＡＡＶ系は、ＩＴＦ若しくはＩＴＦ単量体のインビトロ産生に使用され得る、又はインビボ及びエクスビボ遺伝子療法手順、例えば、１つ以上のＩＴＦ若しくはＩＴＦ単量体をコードする操作された核酸のインビボ送達に使用され得る（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８－４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号、第５，４３６，１４６号、第６，６３２，６７０号、第６，６４２，０５１号、第７，０７８，３８７号、第７，３１４，９１２号、第６，４９８，２４４号、第７，９０６，１１１号、米国特許公開第２００３／０１３８７７２号、第２００７／００３６７６０号、及び第２００９／０１９７３３８号、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７８（１２）：６３８１－６３８８（２００４年６月）、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１００（１０）：６０８１－６０８６（２００３年５月１３日）、並びに国際特許出願第２０１０／１３８２６３号及び第 ９３／２４６４１号、Ｋｏｔｉｎ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照されたく、各々が、全ての目的のために、参照により本明細書に組み込まれる）。組換えＡＡＶベクターを構築するための例示的な方法が、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６６４７０（１９８４）、及びＳａｍｕｉｓｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８（１９８９）において更に詳細に記載されており、各々が、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。一般的に、ＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．Ｒｈ１０、ＡＡＶ１１、及びそれらのバリアントのいずれか１つに対応するアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む。

【0295】

ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）プラットフォームであり得る。一般的に、ＶＬＰは、ウイルス構造タンパク質を産生し、結果として得られたウイルス粒子を精製することにより構築される。次に、精製後、カーゴ／ペイロード（例えば、本明細書に記載される、操作された核酸のいずれか）を、精製した粒子内にエクスビボでカプセル化する。したがって、ＶＬＰの産生によって、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸及びカーゴ／ペイロードをコードする核酸の分離が維持される。ＶＬＰ産生において使用されるウイルス構造タンパク質は、哺乳動物、酵母、昆虫、細菌、又はインビボ翻訳発現の系を含む、様々な発現系において産生することができる。精製されたウイルス粒子を、当業者に既知の方法を使用して、所望のカーゴの存在下で変性及び再形成して、ＶＬＰを産生することができる。ＶＬＰの産生は、Ｓｅｏｗ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００９ Ｍａｙ；１７（５）：７６７－７７７）においてより詳細に記載されており、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0296】

ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、ある範囲の細胞を標的化する（すなわち、感染させる）、狭いサブセットの細胞を標的化する、又は特定の細胞を標的化するように操作することができる。一般的に、ウイルスベクターベースの送達プラットフォーム用に選ばれたエンベロープタンパク質によって、ウイルスの向性が決定される。ウイルスベクターベースの送達プラットフォームにおいて使用されるウイルスは、目的の特定の細胞を標的化するようにシュードタイプ化することができる。ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、汎親和性であり、ある範囲の細胞に感染することができる。例えば、汎親和性ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、ＶＳＶ－Ｇエンベロープを含むことができる。ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、両種指向性であり、哺乳動物細胞に感染することができる。したがって、当業者は、所望の細胞型を標的化するための適した向性、シュードタイプ、及び／又はエンベロープタンパク質を選択することができる。

【0297】

脂質構造体送達系
本開示の操作された核酸（例えば、ラパマイシン－ＩＴＦ、又はカフェイン、カンナビノイド、若しくはニコチンによって誘導可能なＩＴＦの第１及び第２の単量体をコードするポリヌクレオチド分子、あるいはミフェプリストン－ＩＴＦをコードするポリヌクレオチド分子）は、脂質媒介性送達系を使用して細胞に導入され得る。一般的に、脂質媒介性送達系は、内部コンパートメントを包む外部脂質膜で構成される構造を使用する。脂質ベースの構造体の例は、限定されないが、脂質ベースのナノ粒子、リポソーム、ミセル、エキソソーム、小胞、細胞外小胞、細胞、又は組織を含む。脂質構造体送達系は、インビトロ、インビボ、又はエクスビボで、カーゴ／ペイロード（例えば、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれか）を送達することができる。

【0298】

脂質ベースのナノ粒子は、限定されないが、単層リポソーム、多層リポソーム、及び脂質調製物を含むことができる。本明細書で使用される場合、「リポソーム」は、所望のカーゴ、例えば、操作された核酸、例えば、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれかなどを、脂質シェル又は脂質凝集体内に封入することにより形成される脂質媒体のインビトロ調製物を包含する一般名である。リポソームは、一般的にリン脂質を含む二分子膜を伴う小胞構造、及び一般的に水性組成物を含む内部媒質を有するとして特徴付けられ得る。リポソームは、限定されないが、エマルジョン、発泡体、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、層状層及び同様のものを含む。リポソームは単層リポソームであり得る。リポソームは多層リポソームであり得る。リポソームは多胞性リポソームであり得る。リポソームは、正に荷電し得る、負に荷電し得る、又は中性に荷電し得る。特定の実施形態では、リポソームは中性に荷電している。リポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成することができ、それは、一般的に、中性及び負に荷電したリン脂質並びにステロール、例えばコレステロールなどを含む。脂質の選択は、一般的に、所望の目的、例えば、インビボ送達についての基準、例えばリポソームのサイズ、酸の不安定性、及び血流中でのリポソームの安定性などの考慮により導かれる。多様な方法が、リポソームを調製するために利用可能であり、例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９；４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号、及び第５，０１９，３６９号において記載されているとおりであり、各々が、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0299】

多層リポソームが、一般的に、リン脂質を含む脂質を過剰の水溶液中に懸濁した場合に自発的に産生されて、複数の脂質層が水性媒質により分離されるようになる。水及び溶解された溶質は、脂質成分の自己再構成後に、脂質二重層の間の閉じた構造中に封入される。所望のカーゴ（例えば、ポリペプチド、核酸、小分子薬、操作された核酸、例えば、本明細書中に記載される操作された核酸のいずれかなど、ウイルスベクター、ウイルスベースの送達系など）を、リポソームの水性内部中にカプセル化するか、リポソーム及びポリペプチド／核酸の両方に会合する連結分子を介してリポソームに付着させるか、リポソームの脂質二重層内に散在させるか、リポソーム中に封入するか、リポソームと複合体を形成させる、又は、そうでなければ、リポソームと会合させることができ、それを標的実体に送達できるようにする。親油性分子又は親油性領域を伴う分子がまた、脂質二重層中に溶解し得る又はそれと会合し得る。

【0300】

本実施形態に従って使用されるリポソームは、当業者に公知であり得るように、異なる方法により作製することができる。リポソームの調製は、ＷＯ２０１６／２０１３２３、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８５／０１１６１及びＰＣＴ／ＵＳ８９／０５０４０、並びに米国特許第４，７２８，５７８号、第４，７２８，５７５号、第４，７３７，３２３号、第４，５３３，２５４号、第４，１６２，２８２号、第４，３１０，５０５号、及び第４，９２１，７０６号において更に詳細に記載されており、各々が、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0301】

リポソームはカチオン性リポソームであり得る。カチオン性リポソームの例は、米国特許第５，９６２，０１６号；第５，０３０，４５３号；第６，６８０，０６８号、米国出願第２００４／０２０８９２１号、並びに国際特許出願第０３／０１５７５７Ａ１号、第０４／０２９２１３Ａ２号、及び第０２／１００４３５Ａ１号において更に詳細に記載されており、各々が、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0302】

脂質媒介性遺伝子送達方法は、例えば、ＷＯ９６／１８３７２；ＷＯ９３／２４６４０；Ｍａｎｎｉｎｏ＆Ｇｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）：６８２－６９１（１９８８）；米国特許第５，２７９，８３３号Ｒｏｓｅ 米国特許第５，２７９，８３３号；ＷＯ９１／０６３０９；及びＦｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３－７４１４ （１９８７）において記載されており、各々が、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0303】

エキソソームは、エンドサイトーシス起源の小さな膜小胞であり、それは、多小胞体と原形質膜との融合後に細胞外環境中に放出される。エキソソームのサイズは、直径３０～１００ｎｍの間の範囲である。それらの表面は、ドナー細胞の細胞膜からの脂質二重層からなり、それらは、エキソソームを産生した細胞からのサイトゾルを含み、表面上に親細胞からの膜タンパク質を示す。核酸の送達のために有用なエキソソームは、当業者に公知であり、例えば、米国特許第９，８８９，２１０号においてより詳細に記載されているエキソソームであり、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0304】

本明細書で使用される場合、「細胞外小胞」又は「ＥＶ」という用語は、内部空間を封入する膜を含む細胞由来の小胞を指す。一般的に、細胞外小胞は、それらが由来する細胞よりも小さな直径を有する全ての膜結合小胞を含む。一般的に、細胞外小胞は、直径２０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲であり、細胞外小胞の外面上に呈される内部空間内で、及び／又は膜にわたるかのいずれかの、様々な高分子カーゴを含み得る。カーゴは、核酸（例えば、本明細書に記載される、操作された核酸のいずれか）、タンパク質、炭水化物、脂質、小分子、及び／又はそれらの組み合わせを含み得る。例として、限定されないが、細胞外小胞は、アポトーシス小体、細胞の断片、直接又は間接操作（例えば、連続的な押し出し又はアルカリ溶液での処理による）による細胞から由来する小胞、小胞化オルガネラ、及び生細胞により産生される小胞（例えば、直接的な原形質膜の出芽又は後期エンドソームと原形質膜との融合による）を含む。細胞外小胞は、生存若しくは死滅生物、外植された組織若しくは器官、及び／又は培養細胞に由来し得る。

【0305】

本明細書で使用される場合、「エキソソーム」という用語は、内部空間を取り囲む膜を含み、直接的な原形質膜の出芽又は後期エンドソームと原形質膜との融合により細胞から産生される細胞由来の小さな（直径２０～３００ｎｍ、より好ましくは直径４０～２００ｎｍの）小胞を指す。エキソソームは、脂質又は脂肪酸及びポリペプチドを含み、任意選択で、ペイロード（例えば、治療薬剤）、レシーバ（例えば、標的化部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、又はＤＮＡ、例えば、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれかなど）、糖（例えば、単糖、多糖、又はグリカン）、又は他の分子を含む。エキソソームは、産生細胞から由来し、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、又はそれらの組み合わせに基づいて産生細胞から単離することができる。エキソソームは、細胞外小胞の一種である。一般的に、エキソソーム産生／生合成は、産生細胞の破壊をもたらさない。エキソソーム及びエキソソームの調製は、ＷＯ２０１６／２０１３２３において更に詳細に記載されており、それは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0306】

本明細書で使用される場合、「ナノ小胞」という用語（また、「マイクロ小胞」と称される）は、内部空間を取り囲む膜を含み、直接又は間接操作により細胞から産生される、細胞由来の小さな（直径２０～２５０ｎｍ、より好ましくは直径３０～１５０ｎｍの間の）小胞を指し、当該ナノ小胞は、当該操作を伴うことなく、当該産生細胞により産生されないようにする。一般的に、ナノ小胞は、細胞外小胞の亜種である。産生細胞の適した操作は、連続押出し、アルカリ溶液での処理、超音波処理、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。ナノ小胞の産生は、いくつかの例では、当該産生細胞の破壊をもたらし得る。好ましくは、ナノ小胞の集団は、原形質膜からの直接出芽又は後期エンドソームと原形質膜との融合により産生細胞に由来する小胞を実質的に含まない。ナノ小胞は、脂質又は脂肪酸及びポリペプチドを含み、任意選択で、ペイロード（例えば、治療薬剤）、レシーバ（例えば、標的化部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、又はＤＮＡ、例えば、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれかなど）、糖（例えば、単糖、多糖、又はグリカン）、又は他の分子を含む。ナノ小胞は、一度、それが当該操作に従って産生細胞から誘導されると、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、又はそれらの組み合わせに基づいて産生細胞から単離され得る。

【0307】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、一般的に、脂質の両親媒性の性質に依存して膜及び小胞様の構造を形成する合成脂質構造である（Ｒｉｌｅｙ ２０１７）。一般的に、これらの小胞は、標的細胞の膜中に吸収され、カーゴをサイトゾル中に放出することにより、カーゴ／ペイロード、例えば、本明細書中に記載される、操作された核酸又はウイルス系のいずれかなどを送達する。ＬＮＰ形成において使用される脂質は、カチオン性、アニオン性、又は中性であり得る。脂質は、合成又は天然由来、いくつかの例では生分解性であり得る。脂質は、脂肪、コレステロール、リン脂質、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲート（ＰＥＧ化脂質）を含む脂質コンジュゲート、ワックス、油、グリセリド、及び脂溶性ビタミンを含み得る。脂質組成物は、一般的に、材料の定義された混合物、例えばカチオン性、中性、アニオン性、及び両親媒性脂質などを含む。いくつかの例では、特定の脂質を含めて、ＬＮＰ凝集を防止する、脂質酸化を防止する、又は追加部分の付着を促進する機能的な化学基を提供する。脂質組成は、全体的なＬＮＰサイズ及び安定性に影響し得る。一例では、脂質組成物は、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＭＣ３）又はＭＣ３様分子を含む。ＭＣ３及びＭＣ３様脂質組成物は、１つ以上の他の脂質、例えばＰＥＧ又はＰＥＧコンジュゲート脂質、ステロール、又は中性脂質などを含むように製剤化することができる。加えて、ＬＮＰを更に操作又は機能化して、特定の細胞型の標的化を促進することができる。ＬＮＰ設計における別の考慮事項は、標的化効率と細胞傷害性のバランスである。

【0308】

ミセルは、一般的に、単鎖脂質を使用して形成される球状の合成脂質構造であり、ここで、単鎖脂質の親水性の頭部が外層又は膜を形成し、単鎖脂質の疎水性の尾部がミセル中心を形成する。ミセルは、典型的には、脂質単層のみを含む脂質構造を指す。ミセルは、Ｑｕａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１７ Ｊｕｌ ５；２５（７）：１５０１－１５１３）に更に詳細に記載されており、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0309】

核酸ベクター、例えば、血清に直接曝露された発現ベクターなどは、血清ヌクレアーゼによる核酸の分解又は遊離核酸による免疫系のオフターゲット刺激を含む、いくつかの望ましくない結果を有し得る。同様に、血清に直接曝露されたウイルス送達系は、望ましくない免疫応答及び／又はウイルス送達系の中和を誘発し得る。したがって、操作された核酸及び／又はウイルス送達系のカプセル化を使用して、分解を回避する一方で、また、潜在的なオフターゲットの影響を回避することができる。特定の例では、操作された核酸及び／又はウイルス送達系は、送達媒体内、例えばＬＮＰの水性内部内に完全にカプセル化される。ＬＮＰ内での操作された核酸及び／又はウイルス送達系のカプセル化は、当業者に周知の技術、例えば、マイクロ流体混合及びマイクロ流体液滴生成デバイス上で行われる液滴生成などにより行うことができる。そのようなデバイスは、限定されないが、標準的なＴジャンクションデバイス又はフローフォーカシングデバイスを含む。一例では、所望の脂質製剤、例えばＭＣ３又はＭＣ３様含有組成物が、操作された核酸又はウイルス送達系及び任意の他の所望の薬剤と並行して液滴生成デバイスに提供され、送達ベクター及び所望の薬剤を、ＭＣ３又はＭＣ３様ベースのＬＮＰの内部内に完全にカプセル化するようにする。一例では、液滴生成デバイスは、産生されるＬＮＰのサイズ範囲及びサイズ分布を制御することができる。例えば、ＬＮＰは、直径１～１０００ナノメートルの範囲のサイズ、例えば、１、１０、５０、１００、５００、又は１０００ナノメートルを有し得る。液滴生成に続いて、カーゴ／ペイロードをカプセル化する送達ビヒクル（例えば、操作された核酸及び／又はウイルス送達系）を更に処理又は操作して、投与用にそれらを調製することができる。

【0310】

ナノ粒子送達
ナノ材料は、操作された核酸（例えば、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子）を送達するために使用され得る。ナノ材料媒体は、重要なことに、非免疫原性材料で作ることができ、一般的に、その送達ベクター自体に対する免疫を誘発することを回避することができる。これらの材料は、限定されないが、脂質（以前に記載されたとおり）、無機ナノ材料、及び他の高分子材料を含む。ナノ材料粒子は、Ｒｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ－Ａ Ｒｅｖｉｅｗ．Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１７，７（５），９４）において更に詳細に記載されており、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0311】

ゲノム編集系
ゲノム編集系を使用して、操作された核酸、例えば、本開示のＩＴＦ又はＩＴＦの単量体コードするポリヌクレオチドをコードするように宿主ゲノムを操作することができる。一般的に、「ゲノム編集系」は、外来性遺伝子を宿主細胞のゲノム中に組み込むための任意の系を指す。ゲノム編集系には、トランスポゾン系、ヌクレアーゼゲノム編集系、及びウイルスベクターベースの送達プラットフォームが含まれるが、これらに限定されない。

【0312】

トランスポゾンシステムを使用して、操作された核酸、例えば、本開示の操作された核酸を宿主ゲノムに組み込むことができる。トランスポゾンは、一般的に、カーゴ／ペイロード核酸及びトランスポザーゼに隣接する末端逆位反復（ＴＩＲ）を含む。トランスポゾン系は、ＴＩＲ隣接カーゴを伴って、シスにおいて又はトランスにおいてトランスポゾンを提供することができる。トランスポゾン系は、レトロトランスポゾン系又はＤＮＡトランスポゾン系であり得る。一般的に、トランスポゾン系は、カーゴ／ペイロード（例えば、操作された核酸）をランダムに宿主ゲノム中に組み込む。トランスポゾン系の例は、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒトランスポゾンスーパーファミリーのトランスポゾン、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系などを使用した系を含み、Ｈｕｄｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１７ Ａｕｇ；５２（４）：３５５－３８０）、並びに米国特許第６，４８９，４５８号、第６，６１３，７５２号、及び第７，９８５，７３９号において更に詳細に記載されており、それらの各々が、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。トランスポゾン系の別の例は、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系を含み、米国特許第６，２１８，１８５号及び第６，９６２，８１０号において更に詳細に記載されており、それらの各々が、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0313】

ヌクレアーゼゲノム編集系を使用して、操作された核酸、例えば、本開示の単離されたポリヌクレオチド又は異種構築物をコードするように宿主ゲノムを操作することができる。理論によって拘束されることを望むものではないが、一般的に、外来性遺伝子を導入するために使用されるヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集系は、細胞の天然ＤＮＡ修復機構、特に相同組換え（ＨＲ）修復経路を利用する。簡単には、ゲノムＤＮＡへの損傷（典型的には二本鎖切断）に続いて、細胞は、損傷を修復するためのＤＮＡ合成時に、その５’と３’の両方の末端に同一又は実質的に同一の配列を有する別のＤＮＡ供給源をテンプレートとして使用することにより、損傷を解消することができる。天然の状況では、ＨＤＲは、細胞中に存在する他の染色体をテンプレートとして使用することができる。遺伝子編集系では、外因性ポリヌクレオチドを細胞に導入し、相同組換えテンプレート（ＨＲＴ又はＨＲテンプレート）として使用する。一般的に、ＨＲＴ（例えば、遺伝子又は遺伝子の一部）内の５’及び３’相補的末端の間に含まれる損傷を伴う、染色体に本来は見出されない任意の追加の外来性配列を、テンプレート化されたＨＤＲ中に所与のゲノム遺伝子座中に組み入れる（すなわち、「組み込む」）ことができる。したがって、所与のゲノム遺伝子座の典型的なＨＲテンプレートは、内因性ゲノム標的遺伝子座の第１の領域と同一のヌクレオチド配列、内因性ゲノム標的遺伝子座の第２の領域と同一のヌクレオチド配列、及びカーゴ／ペイロード核酸（例えば、本明細書に記載される操作された核酸のいずれか、例えば、１つ以上のＩＴＦ又はＩＴＦ単量体をコードする操作された核酸のいずれか）をコードするヌクレオチド配列を有する。

【0314】

いくつかの例では、ＨＲテンプレートは直線状であり得る。直線状ＨＲテンプレートの例は、限定されないが、直線化したプラスミドベクター、ｓｓＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＰＣＲ増幅ＤＮＡを含む。特定の例では、ＨＲテンプレートは環状であり得る、例えばプラスミドなど。環状テンプレートは、スーパーコイル状のテンプレートを含み得る。

【0315】

ＨＲテンプレートの５’及び３’末端で見出される同一又は実質的に同一の配列は、導入される外来性配列に関して、一般的にアーム（ＨＲアーム）として言及される。ＨＲアームは、内因性ゲノム標的遺伝子座の領域と同一（すなわち、１００％同一）であり得る。ＨＲアームは、一部の例では、内因性ゲノム標的遺伝子座の領域と実質的に同一であり得る。実質的に同一のＨＲアームを使用することができる一方で、ＨＲアームが同一であることが有利であり得るが、なぜなら、ＨＤＲ経路の効率は、１００％未満の同一性を有するＨＲアームにより影響され得るためである。

【0316】

各ＨＲアーム、すなわち、５’及び３’ＨＲアームは、同じサイズ又は異なるサイズであり得る。各ＨＲアームはそれぞれ、５０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００塩基以上の長さであり得る。ＨＲアームは、一般的に、任意の長さとすることができるが、実際的な考慮事項、例えば全体的な編集効率に対するＨＲアームの長さ及び全体的なテンプレートサイズの影響なども考慮に入れることができる。ＨＲアームは、切断部位に直に隣接する内因性ゲノム標的遺伝子座の領域と同一、又は実質的に同一であり得る。各ＨＲアームは、切断部位に直に隣接する内因性ゲノム標的遺伝子座の領域と同一、又は実質的に同一であり得る。各ＨＲアームは、切断部位からある特定の距離内、例えば、互いに１塩基対、１０塩基対以下、５０塩基対以下、又は１００塩基対以下などにある内因性ゲノム標的遺伝子座の領域と同一、又は実質的に同一であり得る。

【0317】

ヌクレアーゼゲノム編集系は、様々なヌクレアーゼを使用して、これらに限定されないが、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ又はその誘導体、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又はその誘導体、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）又はその誘導体、及びホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）又はその誘導体を含む、標的ゲノム遺伝子座を切断することができる。

【0318】

ＣＲＩＳＰＲ媒介性遺伝子編集系を使用して、本明細書に記載されるＩＴＦ又はＩＴＦ単量体の１つ以上をコードする操作された核酸など、操作された核酸をコードするように宿主ゲノムを操作することができる。ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｍ．Ａｄｌｉ（“Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｔｏｏｌ ｋｉｔ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ”Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ；ｖｏｌｕｍｅ ９（２０１８），Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１９１１）において更に詳細に記載されており、それが教示する全てについて、参照により本明細書に組み込まれる。一般的に、ＣＲＩＳＰＲ媒介性の遺伝子編集系は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ及び特定の標的配列に切断を方向付けるＲＮＡを含む。例示的なＣＲＩＳＰＲ媒介性の遺伝子編集系は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ並びにＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）ドメイン及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）ドメインを有するＲＮＡで構成されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系である。ｃｒＲＮＡは、典型的には、２つのＲＮＡドメイン：塩基対ハイブリダイゼーションを通じて標的配列（「定義されたヌクレオチド配列」）、例えば、ゲノム配列に特異性を方向付けるガイドＲＮＡ配列（ｇＲＮＡ）；及びｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡドメインを有する。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）と相互作用し、それにより、ゲノム遺伝子座への動員を促進することができる。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡポリヌクレオチドは、別々のポリヌクレオチドであり得る。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡポリヌクレオチドは、単一のポリヌクレオチドであり得るが、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）としても言及される。Ｃａｓ９系を本明細書中に例証する一方で、他のＣＲＩＳＰＲ系を使用することができ、例えばＣｐｆ１系などである。ヌクレアーゼは、その誘導体、例えば、Ｃａｓ９機能性変異体など、例えば、Ｃａｓ９酵素により典型的に産生される完全な二本鎖切断とは対照的に、一般的に、定義されたヌクレオチド配列の一本鎖のみの切断を媒介するＣａｓ９「ニッカーゼ」変異体を含み得る。

【0319】

一般的に、ＣＲＩＳＰＲ系の成分は、互いに相互作用してリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成し、配列特異的な切断を媒介する。一部のＣＲＩＳＰＲ系では、各成分を別々に産生し、使用して、ＲＮＰ複合体を形成することができる。一部のＣＲＩＳＰＲ系では、各成分をインビトロで別々に産生し、インビトロで互いに接触させて（すなわち、「複合体化させて」）ＲＮＰ複合体を形成することができる。インビトロで産生されたＲＮＰを次に、細胞のサイトゾル及び／又は核、例えば、Ｔ細胞のサイトゾル及び／又は核中に導入（すなわち、「送達」）することができる。インビトロで産生されたＲＮＰ複合体は、様々な手段、限定されないが、エレクトロポレーション、脂質媒介性トランスフェクション、物理的手段による細胞膜変形、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、及び超音波処理を含む、により細胞に送達することができる。特定の例では、インビトロで産生されたＲＮＰ複合体を、Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ／Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（登録商標）エレクトロポレーションベースの送達系（Ｌｏｎｚａ（登録商標））を使用して細胞に送達することができる。他のエレクトロポレーション系は、限定されないが、ＭａｘＣｙｔｅエレクトロポレーション系、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳエレクトロポレーション系、Ｎｅｏｎエレクトロポレーション系、及びＢＴＸエレクトロポレーション系を含む。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９は、当該技術分野において既知の様々なタンパク質産生技術を使用して、インビトロで産生（すなわち、合成及び精製）することができる。ＣＲＩＳＰＲ系ＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡは、当業者に公知の様々なＲＮＡ生成技術、例えば、インビトロ転写又は化学合成などを使用して、インビトロで産生（すなわち、合成及び精製）することができる。

【0320】

インビトロで産生されたＲＮＰ複合体は、ヌクレアーゼとｇＲＮＡの異なる比率で複合体化することができる。インビトロで産生されたＲＮＰ複合体はまた、ＣＲＩＳＰＲ媒介性の編集系において異なる量で使用することができる。例えば、編集されることが望まれる細胞の数に依存して、加えられるＲＮＰの総量を調整することができ、例えば、反応において多数の細胞を編集する場合に加えられるＲＮＰ複合体の量における低下などである。

【0321】

一部のＣＲＩＳＰＲ系では、各成分（例えば、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡ）は、ポリヌクレオチドにより別々にコードされ、各ポリヌクレオチドは一緒に又は別々に細胞に導入することができる。一部のＣＲＩＳＰＲ系では、各成分は、単一のポリヌクレオチド（すなわち、マルチプロモーター又はマルチシストロンベクター、以下の例示的なマルチシストロン系の説明を参照されたい）によりコードされ、細胞に導入することができる。細胞内での各ポリヌクレオチドにコードされたＣＲＩＳＰＲ成分の発現（例えば、ヌクレアーゼの翻訳及びＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡの転写）後、ＲＮＰ複合体を細胞内で形成させることができ、次に、部位特異的切断に方向付けることができる。

【0322】

一部のＲＮＰは、核中へのＲＮＰの送達を促進する部分を有するように操作することができる。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメインを有し得るが、Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体が、細胞のサイトゾル中に送達される場合、又はＣａｓ９の翻訳及びその後のＲＮＰ形成後に、ＮＬＳは、核中へのＣａｓ９ ＲＮＰの更なる輸送を促進することができる。

【0323】

本明細書に記載される細胞は、非ウイルス方法を使用して操作することができ、例えば、本明細書に記載されるヌクレアーゼ及び／又はＣＲＩＳＰＲ媒介性の遺伝子編集系は、非ウイルス方法を使用して細胞に送達することができる。本明細書に記載される細胞は、ウイルス方法を使用して操作することができ、例えば、本明細書に記載されるヌクレアーゼ及び／又はＣＲＩＳＰＲ媒介性の遺伝子編集系は、ウイルス方法、例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、又は本明細書に記載される他のウイルスベースの送達方法のいずれかを使用して細胞に送達することができる。

【0324】

一部のＣＲＩＳＰＲ系では、２つ以上のＣＲＩＳＰＲ組成物を提供することができ、各々が、同じ遺伝子又は一般的なゲノム遺伝子座を、２つ以上の標的ヌクレオチド配列で別々に標的化するようにする。例えば、２つの別々のＣＲＩＳＰＲ組成物を提供して、互いの特定の距離内の２つの異なる標的ヌクレオチド配列での切断に方向付けることができる。一部のＣＲＩＳＰＲ系では、２つ以上のＣＲＩＳＰＲ組成物を提供することができ、各々が、同じ遺伝子又は一般的なゲノム遺伝子座の逆ストランドを別々に標的化するようにする。例えば、２つの別々のＣＲＩＳＰＲ「ニッカーゼ」組成物を提供して、逆ストランド上の同じ遺伝子又は一般的なゲノム遺伝子座で切断に方向付けることができる。

【0325】

一般的に、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲ媒介性の編集系の特色を、他のヌクレアーゼベースのゲノム編集系に適用することができる。ＴＡＬＥＮは、操作された部位特異的ヌクレアーゼであって、それは、ＴＡＬＥ（転写アクチベーター様エフェクター）のＤＮＡ結合ドメイン及び制限エンドヌクレアーゼＦｏｋｌの触媒ドメインで構成される。ＤＮＡ結合ドメインの単量体の高度に可変的な残基領域中に存在するアミノ酸を変化させることにより、異なる人工ＴＡＬＥＮを作製して様々なヌクレオチド配列を標的化することができる。ＤＮＡ結合ドメインによって、その後、ヌクレアーゼが標的配列に方向付けられ、二本鎖切断が作製される。ＴＡＬＥＮベースの系は、米国通し番号第１２／９６５，５９０号；米国特許第８，４５０，４７１号；米国特許第８，４４０，４３１号；米国特許第８，４４０，４３２号；米国特許第１０，１７２，８８０号；及び米国通し番号第１３／７３８，３８１号において更に詳細に記載されており、それらの全てが、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。ＺＦＮベースの編集系は、米国特許第６，４５３，２４２号、第６，５３４，２６１号、第６，５９９，６９２号、第６，５０３，７１７号、第６，６８９，５５８号、第７，０３０，２１５号、第６，７９４，１３６号、第７，０６７，３１７号、第７，２６２，０５４号、第７，０７０，９３４号、第７，３６１，６３５号、第７，２５３，２７３号、及び米国特許公開第２００５／００６４４７４号、第２００７／０２１８５２８号、第２００５／０２６７０６１号において更に詳細に記載されており、全てが、それらの全体において、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0326】

他の操作送達系
操作された核酸（例えば、本明細書に記載される、ＩＴＦ又はＩＴＦの単量体をコードするポリヌクレオチド分子）を細胞又は他の標的レシピエント実体、例えば、本明細書に記載される脂質構造のいずれかなどに導入するための様々な追加の手段。

【0327】

エレクトロポレーションを使用して、ポリヌクレオチドをレシピエント実体に送達することができる。エレクトロポレーションは、電界を適用して、標的細胞又は実体の外膜又はシェルを一時的に透過させることを通じて、カーゴ／ペイロードを標的細胞又は実体の内部コンパートメント中に内在化させる方法である。一般的に、この方法は、目的のカーゴ（例えば、本明細書に記載される、操作された核酸のいずれか）を含む溶液中の２つの電極の間に細胞又は標的実体を配置することを含む。細胞の脂質膜を次に、一過性の設定電圧を適用することにより破壊、すなわち、透過させ、それによって、カーゴが、実体の内部、例えば、細胞の細胞質に進入することが可能になる。細胞の例では、細胞の大部分ではないが、少なくとも一部は生存可能なままである。細胞及び他の実体を、インビトロ、インビボ、又はエクスビボでエレクトロポレーションすることができる。エレクトロポレーション条件（例えば、細胞の数、カーゴの濃度、回復条件、電圧、時間、容量、パルスタイプ、パルス長、容積、キュベット長、エレクトロポレーション溶液の組成など）は、これらに限定されないが、細胞又は他のレシピエント実体の種類、送達されるカーゴ、所望の内在化の効率、及び所望の生存率を含むいくつかの要因に依存して変動する。そのような基準の最適化は、当業者の技術の範囲内である。様々なデバイス及びプロトコルをエレクトロポレーションのために使用することができる。例としては、Ｎｅｏｎ（登録商標）トランスフェクション系、ＭａｘＣｙｔｅ（登録商標）Ｆｌｏｗ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（商標）、Ｌｏｎｚａ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）系、及びＢｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）エレクトロポレーション系が挙げられるが、これらに限定されない。

【0328】

操作された核酸（例えば、本明細書に記載されるＩＴＦ又はＩＴＦの単量体をコードするポリヌクレオチド分子）を細胞又は他の標的レシピエント実体に導入するための他の手段は、超音波処理、遺伝子銃、流体力学的注射、及び物理的手段による細胞膜変形を含むが、これらに限定されない。

【0329】

操作されたｍＲＮＡ、例えば、ネイキッドプラスミド又はｍＲＮＡなどをインビボで送達するための組成物及び方法が、Ｋｏｗａｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１９ Ａｐｒ １０；２７（４）：７１０－７２８）及びＫａｃｚｍａｒｅｋ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄ．２０１７；９：６０）において詳細に記載されており、各々が、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0330】

遺伝子スイッチ
（ｉ）本明細書に記載されるＩＴＦを含む単離された細胞、及び（ｉｉ）同族リガンドを含む、遺伝子スイッチもまた提供される。いくつかの態様では、単離された細胞は、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子を更に含む。

【0331】

いくつかの実施形態では、遺伝子スイッチは、（ｉ）カフェイン誘導性転写因子を含む単離された細胞、及び（ｉｉ）カフェインを含む。

【0332】

いくつかの実施形態では、遺伝子スイッチは、（ｉ）カンナビノイド誘導性転写因子を含む単離された細胞、及び（ｉｉ）カンナビノイドを含む。いくつかの実施形態では、カンナビノイドは、フィトカンナビノイドである。いくつかの実施形態では、カンナビノイドは、カンナビジオールである。

【0333】

いくつかの実施形態では、遺伝子スイッチは、（ｉ）ニコチン誘導性転写因子を含む単離された細胞、及び（ｉｉ）ニコチンを含む。

【0334】

いくつかの実施形態では、遺伝子スイッチは、（ｉ）ラパマイシン誘導性転写因子を含む単離された細胞、及び（ｉｉ）ラパマイシン又はその類似体若しくは誘導体を含む。

【0335】

いくつかの実施形態では、遺伝子スイッチは、（ｉ）ミフェプリストン誘導性転写因子を含む単離された細胞、及び（ｉｉ）ミフェプリストン又はその誘導体を含む。

【0336】

使用方法
本明細書に記載されるＩＴＦを使用する方法も、本開示によって包含される。いくつかの態様では、方法は、目的の遺伝子の転写を調節することを含む。

【0337】

いくつかの態様では、転写を調節する方法が本明細書に提供され、方法は、誘導性転写因子（ＩＴＦ）の形成を誘導するために、本明細書に記載されるカフェイン、カンナビノイド、又はニコチンによって誘導可能な誘導性転写因子の第１の単量体及び第２の単量体を発現する単離された細胞を、カフェイン、カンナビノイド、及びニコチンから選択される同族リガンドと接触させることと、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写を活性化されたＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、単離された細胞を培養することとを含む。

【0338】

いくつかの態様では、転写を調節する方法が本明細書に提供され、方法は、誘導性転写因子（ＩＴＦ）の形成を誘導するために、本明細書に記載されるラパマイシン誘導性転写因子の第１の単量体及び第２の単量体を発現する単離された細胞を、ラパマイシン又はその誘導体若しくは類似体を含む同族リガンドと接触させることと、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写を活性化されたＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、単離された細胞を培養することとを含む。

【0339】

いくつかの態様では、転写を調節する方法が本明細書に提供され、方法は、誘導性転写因子（ＩＴＦ）の核局在化を誘導するために、ミフェプリストン誘導性転写因子を発現する単離された細胞をミフェプリストンと接触させることと、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写をＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、単離された細胞を培養することとを含む。

【0340】

いくつかの実施形態では、転写を調節する方法は、転写を活性化する方法である。そのような実施形態では、誘導性転写因子の転写エフェクタードメインは、転写活性化ドメインであってもよい。

【0341】

いくつかの実施形態では、転写を調節する方法は、転写を抑制する方法である。そのような実施形態では、誘導性転写因子の転写エフェクタードメインは、転写リプレッサードメインであってもよい。

【0342】

いくつかの態様では、疾患の治療方法もまた、本開示によって包含される。当該方法は、上に記載される有効量の、誘導性転写因子をコードする操作されたポリヌクレオチド、又は誘導性転写因子をコードするポリヌクレオチド分子を含む単離された細胞を対象に投与することを含む。いくつかの態様では、治療を必要とする対象においてそれを行う方法が本明細書に提供され、方法は、本明細書に開示される治療有効用量の操作された細胞、単離された細胞、又は組成物のうちのいずれかを投与することを含む。

【0343】

インビボ方法
いくつかの態様では、本明細書に提供される方法はまた、例えば、対象に、（ｉ）本明細書に記載されるＩＴＦを産生するように操作された細胞、及び（ｉｉ）同族リガンド（例えば、カフェイン、カンナビノイド、ニコチン、ラパマイシン、又はミフェプリストン）を送達することによって、インビボで目的の遺伝子の転写を調節することを含む。

【0344】

いくつかの実施形態では、対象は、ヒト又は動物であり、形質転換された細胞を同族リガンドと接触させることは、同族リガンドの薬理学的用量をヒト又は動物に投与することを含む。

【0345】

いくつかの態様では、本明細書で提供される方法はまた、本明細書に記載される操作された細胞を産生することができる、例えば、本明細書に記載される発現系又はポリヌクレオチド分子のうちのいずれかをインビボで細胞に送達することができる、組成物をインビボで送達することを含む。そのような組成物は、ウイルス媒介性送達プラットフォームのうちのいずれか、脂質構造体送達系のうちのいずれか、ナノ粒子送達系のうちのいずれか、ゲノム編集系のうちのいずれか、又は細胞をインビボで操作することができる、本明細書に記載される他の操作送達系のうちのいずれかを含む。

【0346】

本明細書に提供される方法はまた、本明細書に記載される誘導性転写因子（及びいくつかの実施形態では、誘導性転写因子によって調節される遺伝子）のうちのいずれかを産生することができる組成物をインビボで送達することを含む。誘導性転写因子（及びいくつかの実施形態では、誘導性転写因子によって調節される遺伝子）のインビボ産生が可能な組成物には、本明細書に記載される操作された核酸のうちのいずれかが含まれるが、これらに限定されない。誘導性転写因子（及びいくつかの実施形態では、誘導性転写因子によって調節される遺伝子）のインビボ産生が可能な組成物は、ネイキッドｍＲＮＡ又はネイキッドプラスミドであり得る。

【0347】

医薬組成物
本開示の誘導性転写因子、発現系、及び細胞は、医薬組成物中で製剤化され得る。これらの組成物は、１つ以上の操作された核酸又は操作された細胞に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、又は当業者に周知の他の材料を含み得る。そのような材料は無毒性でなければならず、活性成分の有効性を妨げてはならない。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば、経口、静脈内、皮膚又は皮下、鼻、筋肉内、腹腔内の経路に依存し得る。

【0348】

個体に投与されるものが、細胞、ポリペプチド、核酸、小分子、又は本開示による他の薬学的に有用な化合物であるかどうかに関わらず、投与は、好ましくは「治療有効量」又は「予防有効量」（場合によっては、予防は治療とみなされることもあるが）であり、これは個体に利益を示すのに十分である。投与される実際の量、並びに投与の速度及び時間経過は、治療されている疾患の性質及び重症度に依存するであろう。治療の処方、例えば、投与量の決定などは、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、通常、治療されるべき障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、及び開業医に既知である他の要因を考慮する。上記の技術及びプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ），１９８０に見出される。

【0349】

組成物は、治療すべき状態に応じて、単独で、又は他の治療と組み合わせて、同時投与又は逐次投与することができる。

【0350】

列挙される実施形態
１．
誘導性転写因子（ＩＴＦ）を含む操作された細胞であって、
ＩＴＦが、
ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の単量体と、
転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の単量体と
を含み、
各単量体が、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドを介してオリゴマー化可能であり、
リガンド誘導オリゴマー化が、ＩＴＦを形成し、
同族リガンドが、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択される、
操作された細胞。
２．
ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含む、実施形態１に記載の操作された細胞。
３．
ＺＦタンパク質ドメインが、モジュラー設計であり、１つ以上のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）から構成される、実施形態２に記載の操作された細胞。
４．
ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のジンクフィンガーモチーフのアレイを含む、実施形態３に記載の操作された細胞。
５．
ＺＦタンパク質ドメインが、６つのジンクフィンガーモチーフのアレイを含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載の操作された細胞。
６．
各リガンド結合ドメインが、単一ドメイン抗体を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載の操作された細胞。
７．
単一ドメイン抗体が、Ｖ_ＨＨを含む、実施形態６に記載の操作された細胞。
８．
Ｖ_ＨＨが、抗カフェインＶ_ＨＨ（ａｃ Ｖ_ＨＨ）である、実施形態７に記載の操作された細胞。
９．
抗カフェインＶ_ＨＨ（ａｃ Ｖ_ＨＨ）が、配列番号５２のアミノ酸配列を含む、実施形態８に記載の操作された細胞。
１０．
第１のリガンド結合ドメイン及び第２のリガンド結合ドメインの各々が、ａｃ Ｖ_ＨＨを含む、実施形態８又は実施形態９に記載の操作された細胞。
１１．
同族リガンドが、カンナビジオール又はフィトカンナビノイドであり、Ｖ_ＨＨが、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７（それぞれ、ＣＡ－１４、ＤＢ－６、ＤＢ－１１、ＤＢ－１８、及びＤＢ－２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態７に記載の操作された細胞。
１２．
第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、第１若しくは第２の結合ドメインのうちの他方が、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７（それぞれ、ＤＢ－６、ＤＢ－１１、ＤＢ－１８、及びＤＢ－２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含む、実施形態１２に記載の操作された細胞。
１３．
第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、第１又は第２の結合ドメインのうちの他方が、配列番号５７（ＤＢ－２１）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含む、実施形態１２に記載の操作された細胞。
１４．
各リガンド結合ドメインが、抗ニコチン抗体重鎖可変ドメイン（抗Ｎｉｃ ＶＨ）又は抗ニコチン抗体軽鎖可変ドメイン（抗Ｎｉｃ ＶＬ）を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１５．
抗Ｎｉｃ ＶＨが、配列番号５８のアミノ酸配列を含む、実施形態１４に記載の操作された細胞。
１６．
抗Ｎｉｃ ＶＬが、配列番号５９のアミノ酸配列を含む、実施形態１４又は実施形態１５に記載の操作された細胞。
１７．
第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、抗Ｎｉｃ ＶＨを含み、第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの他方が、抗Ｎｉｃ ＶＬを含む、実施形態１４～１６のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１８．
誘導性転写因子（ＩＴＦ）を含む操作された細胞であって、
ＩＴＦが、
ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の単量体と、
転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の単量体と
を含み、
各単量体が、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドの結合を介してオリゴマー化可能であり、
リガンド誘導オリゴマー化が、ＩＴＦを形成し、
ＤＮＡ結合ドメインが、モジュラー式でありかつ６つのＺＦモチーフのアレイを含むジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、
同族リガンドが、ラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、及びそれらの類似体からなる群から選択される、
操作された細胞。
１９．
第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、ＦＫＢＰドメインを含み、第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの他方が、ＦＲＢドメインを含む、実施形態１８に記載の操作された細胞。
２０．
ＦＫＢＰが、配列番号６０のアミノ酸配列を含む、実施形態１９に記載の操作された細胞。
２１．
ＦＲＢドメインが、配列番号６１のアミノ酸配列を含む、実施形態１９又は実施形態２０に記載の操作された細胞。
２２．
第１のリガンド結合ドメインが、ＦＫＢＰドメインを含み、第２のリガンド結合ドメインが、ＦＲＢドメインを含む、実施形態１９～２１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
２３．
第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、ＦＲＢドメインを含み、第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの他方が、ＦＫＢＰドメインを含む、実施形態１９～２２のいずれか１つに記載の操作された細胞。
２４．
第１の単量体及び／又は第２の単量体が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の操作された細胞。
２５．
ＮＬＳが、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態２４に記載の操作された細胞。
２６．
第２の単量体が、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を更に含む、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の操作された細胞。
２７．
ＮＥＳが、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態２６に記載の操作された細胞。
２８．
ＩＴＦが、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができる、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の操作された細胞。
２９．
以下：
第１のプロモーターと、第１の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第１の発現カセットであって、第１の単量体が、ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の発現カセットと、
第２のプロモーターと第２の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第２の発現カセットであって、第２の単量体が、転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の発現カセットと
を含む発現系であって、
各単量体が、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドを介してオリゴマー化可能であり、
第１及び第２の単量体のリガンド誘導オリゴマー化が、誘導性転写因子（ＩＴＦ）を形成し、
同族リガンドが、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択される、
発現系。
３０．
ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含む、実施形態２９に記載の発現系。
３１．
ＺＦタンパク質ドメインが、モジュラー設計であり、かつ１つ以上のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）から構成される、実施形態３０に記載の発現系。
３２．
ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のジンクフィンガーモチーフのアレイを含む、実施形態３１に記載の発現系。
３３．
ＺＦタンパク質ドメインが、６つのジンクフィンガーモチーフのアレイを含む、実施形態２９～３２のいずれか１つに記載の発現系。
３４．
各リガンド結合ドメインが、単一ドメイン抗体を含む、実施形態２９～３３のいずれか１つに記載の発現系。
３５．
単一ドメイン抗体が、Ｖ_ＨＨを含む、実施形態３４に記載の発現系。
３６．
Ｖ_ＨＨが、抗カフェインＶ_ＨＨ（ａｃ Ｖ_ＨＨ）である、実施形態３５に記載の発現系。
３７．
抗カフェインＶ_ＨＨ（ａｃＶ_ＨＨ）が、配列番号５２のアミノ酸配列を含む、実施形態３６に記載の発現系。
３８．
第１のリガンド結合ドメイン及び第２のリガンド結合ドメインの各々が、ａｃ Ｖ_ＨＨを含む、実施形態３６又は実施形態３７に記載の発現系。
３９．
第１の単量体及び第２の単量体が、カフェインに結合するとホモ二量体を形成することができる、実施形態３８に記載の発現系。
４０．
同族リガンドが、カンナビジオール又はフィトカンナビノイドであり、Ｖ_ＨＨが、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び５７（それぞれ、ＣＡ１４、ＤＢ６、ＤＢ１１、ＤＢ１８、及びＤＢ２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３５に記載の発現系。
４１．
第１のリガンド結合ドメインが、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、第２の結合ドメインが、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び５７（それぞれ、ＤＢ６、ＤＢ１１、ＤＢ１８、及びＤＢ２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含む、実施形態４０に記載の発現系。
４２．
第１のリガンド結合ドメインが、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、第２の結合ドメインが、配列番号５７（ＤＢ－２１）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含む、実施形態４０に記載の発現系。
４３．
第１の単量体及び第２の単量体が、カンナビジオール又はフィトカンナビノイドに結合するとヘテロ二量体を形成することができる、実施形態４０～４２のいずれか１つに記載の発現系。
４４．
各リガンド結合ドメインが、抗ニコチン抗体重鎖可変ドメイン（抗Ｎｉｃ ＶＨ）又は抗ニコチン抗体軽鎖可変ドメイン（抗Ｎｉｃ ＶＬ）を含む、実施形態２９～３３のいずれか１つに記載の操作された発現系。
４５．
抗Ｎｉｃ ＶＨが、配列番号５８のアミノ酸配列を含む、実施形態４４に記載の発現系。
４６．
抗Ｎｉｃ ＶＬが、配列番号５９のアミノ酸配列を含む、実施形態４４又は４５に記載の発現系。
４７．
第１のリガンド結合ドメインが、抗Ｎｉｃ ＶＨを含み、第２の結合ドメインが、抗Ｎｉｃ ＶＬを含む、実施形態４４～４６のいずれか１つに記載の発現系。
４８．
第１のリガンド結合ドメインが、抗Ｎｉｃ ＶＬを含み、第２のリガンド結合ドメインが、抗Ｎｉｃ ＶＨを含む、実施形態４４～４６のいずれか１つに記載の発現系。
４９．
第１の単量体及び第２の単量体が、ニコチンに結合するとヘテロ二量体を形成することができる、実施形態４４～４８のいずれか１つに記載の発現系。
５０．
目的の遺伝子に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む第３の発現カセットを更に含み、ＩＴＦ応答性プロモーターが、コアプロモーター配列と第１の操作されたポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインに結合する配列とを含む、実施形態２９～４９のいずれか１つに記載の発現系。
５１．
コアプロモーター配列が、最小プロモーターを含む、実施形態５０に記載の発現系。
５２．
ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列が、１つ以上のＺＦ結合部位を含む、実施形態５０又は実施形態５１に記載の発現系。
５３．
ＺＦタンパク質ドメインが、６つのジンクフィンガーモチーフのアレイを含み、ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列が、６つのジンクフィンガーモチーフに対して少なくとも１つの結合部位を含む、実施形態５２に記載の発現系。
５４．
以下：
第１のプロモーターと、第１の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第１の発現カセットであって、第１の単量体が、ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の発現カセットと、
第２のプロモーターと、第２の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第２の発現カセットであって、第２の単量体が、転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の発現カセットと
を含む発現系であって、
各単量体が、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドの結合を介してオリゴマー化可能であり、
第１及び第２の単量体のリガンド誘導オリゴマー化が、誘導性転写因子（ＩＴＦ）を形成し、
ＤＮＡ結合ドメインが、モジュラー式でありかつ１０個のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）を含むジンクフィンガータンパク質ドメインを含み、
同族リガンドが、ラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、及びそれらの類似体からなる群から選択される、
発現系。
５５．
各リガンド結合ドメインが、ＦＫＢＰドメイン又はＦＲＢドメインを含む、実施形態５４に記載の発現系。
５６．
ＦＫＢＰが、配列番号６０のアミノ酸配列を含む、実施形態５５に記載の発現系。
５７．
ＦＲＢドメインが、配列番号６１のアミノ酸配列を含む、実施形態５５又は実施形態５６に記載の発現系。
５８．
第１のリガンド結合ドメインが、ＦＫＢＰドメインを含み、第２のリガンド結合ドメインが、ＦＲＢドメインを含む、実施形態５５～５７のいずれか１つに記載の発現系。
５９．
第１のリガンド結合ドメインが、ＦＲＢドメインを含み、第２のリガンド結合ドメインが、ＦＫＢＰドメインを含む、実施形態５５～５７のいずれか１つに記載の発現系。
６０．
第１の単量体及び第２の単量体が、ラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、又はそれらの類似体からなる群から選択されるリガンドに結合するとヘテロ二量体を形成することができる、実施形態５５～５９のいずれか１つに記載の発現系。
６１．
第１の単量体及び／又は第２の単量体が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、実施形態２９～６０のいずれか１つに記載の発現系。
６２．
ＮＬＳが、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態６１に記載の発現系。
６３．
第２の単量体が、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を更に含む、実施形態２９～６２のいずれか１つに記載の発現系。
６４．
ＮＥＳが、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態６３に記載の発現系。
６５．
ＩＴＦが、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができる、実施形態２９～６４のいずれか１つに記載の発現系。
６６．
第１及び／又は第２のプロモーターが、構成的プロモーター又は調節可能プロモーターである、実施形態２９～６５のいずれか１つに記載の発現系。
６７．
第１及び／又は第２のプロモーターが、合成プロモーターである、実施形態２９～６６のいずれか１つに記載の発現系。
６８．
第１のプロモーター及び／又は第２のプロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａＶ１、ｈＣＡＧＧ、ｈＥＦ１ａＶ２、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターである、実施形態２９～６５のいずれか１つに記載の発現系。
６９．
目的の遺伝子に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む第３の発現カセットを更に含み、第３のプロモーターが、コアプロモーター配列と第１の操作されたポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインに結合する配列とを含む、実施形態２９～６８のいずれか１つに記載の発現系。
７０．
コアプロモーター配列が、最小プロモーターを含む、実施形態６９に記載の発現系。
７１．
最小プロモーターが、ｍｉｎＰ、ｍｉｎＣＭＶ、ＹＢ＿ＴＡＴＡ、ｍｉｎＴＡＴＡ、及びｍｉｎＴＫからなる群から選択される、実施形態７０に記載の発現系。
７２．
コアプロモーター配列が、構成的プロモーターに由来する、実施形態６９に記載の発現系。
７３．
コアプロモーター配列が、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターに由来する、実施形態７２に記載の発現系。
７４．
転写エフェクタードメインが、転写活性化ドメインを含む、実施形態２９～７３のいずれか１つに記載の発現系。
７５．
転写活性化ドメインが、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化ドメイン；ＶＰ１６の４つのタンデムコピーを含む活性化ドメイン；ＶＰ６４活性化ドメイン；ＮＦκＢのｐ６５活性化ドメイン；エプスタイン－バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）活性化ドメイン；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ活性化ドメイン（ＶＰＲ活性化ドメイン）を含む三者活性化因子；及びヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメイン（ｐ３００ ＨＡＴコア活性化ドメイン）からなる群から選択される、実施形態７４に記載の発現系。
７６．
転写エフェクタードメインが、転写リプレッサードメインを含む、実施形態２９～７３のいずれか１つに記載の発現系。
７７．
転写リプレッサードメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）リプレッサードメイン；スクレラキシス（ＳＣＸ）ＨＬＨドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ１）ＨＬＨドメインの阻害剤、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン含有タンパク質２（ＨＥＲＣ２）Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＳＴ１）ＨＬＨドメイン、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．２（ＮＫＸ２２）ホメオドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ３）ＨＬＨドメインの阻害剤、及びツイスト関連タンパク質２（ＴＷＳＴ２）ＨＬＨドメイン、ＥＥＤリプレッサードメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；ヘアリー関連塩基性ヘリックスループヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（モチーフがＷＲＰＷ抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；並びにＨＰ１アルファクロモシャドウ抑制ドメインからなる群から選択される、実施形態７６に記載の発現系。
７８．
ＤＮＡ結合ドメインが、ＩＴＦ応答性プロモーターに結合する、実施形態２９～７７のいずれか１つに記載の発現系。
７９．
実施形態２９～５３のいずれか１つに記載の発現系を含む、操作された細胞。
８０．
実施形態５４～７０のいずれか１つに記載の発現系を含む、操作された細胞。
８１．
ヒト細胞を含む、実施形態１～２８、７９、又は８０のいずれか１つに記載の操作された細胞。
８２．
幹細胞を含む、実施形態１～２８又は７９～８１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
８３．
免疫細胞を含む、実施形態１～２８又は７９～８１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
８４．
Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及びｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択される、実施形態１～２８又は７９～８１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
８５．
目的の遺伝子の転写を調節するための遺伝子スイッチであって、
実施形態８～１０のいずれか１つに記載の操作された細胞と、
有効量のカフェインと
を含む、遺伝子スイッチ。
８６．
目的の遺伝子の転写を調節するための遺伝子スイッチであって、
実施形態１１～１３のいずれか１つに記載の操作された細胞と、
有効量のカンナビジオール（ＣＢＤ）又はフィトカンナビノイドと
を含む、遺伝子スイッチ。
８７．
目的の遺伝子の転写を調節するための遺伝子スイッチであって、
実施形態１４～１７のいずれか１つに記載の操作された細胞と、
有効量のニコチンと
を含む、遺伝子スイッチ。
８８．
目的の遺伝子の転写を調節するための遺伝子スイッチであって、
実施形態１８～２３のいずれか１つに記載の操作された細胞と、
有効量のラパマイシンと
を含む、遺伝子スイッチ。
８９．
目的の遺伝子の転写を調節する方法であって、
誘導性転写因子（ＩＴＦ）の形成を誘導するために、実施形態８１に記載の操作された細胞を、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択される同族リガンドと接触させる工程
を含む、方法。
９０．
ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写をＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、操作された細胞を培養する工程
を更に含む、実施形態８９に記載の方法。
９１．
接触させる工程が、ヒト又は動物において行われる、実施形態８９に記載の方法。
９２．
形質転換された細胞を同族リガンドと接触させる工程が、同族リガンドの薬理学的用量をヒト又は動物に投与することを含む、実施形態９１に記載の方法。
９３．
同族リガンドが、カフェインを含む、実施形態８９～９２のいずれか１つに記載の方法。
９４．
同族リガンドが、カンナビジオール（ＣＢＤ）である、実施形態８９～９２のいずれか１つに記載の方法。
９５．
同族リガンドが、ニコチンである、実施形態８９～９２のいずれか１つに記載の方法。
９６．
目的の遺伝子の転写を調節する方法であって、
誘導性転写因子（ＩＴＦ）の形成を誘導するために、実施形態８０に記載の操作された細胞をラパマイシンと接触させる工程
を含む、方法。
９７．
ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写をＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、操作された細胞を培養する工程
を更に含む、実施形態９６に記載の方法。
９８．
操作された細胞が、ヒト又は動物中にあり、操作された細胞を同族リガンドと接触させる工程が、ラパマイシンの薬理学的用量をヒト又は動物に投与することを含む、実施形態９６に記載の方法。
９９．
第２の単量体の転写エフェクタードメインが、転写活性化ドメインを含み、転写を調節することが、目的の遺伝子の転写を活性化することを含む、実施形態９６～９８のいずれか１つに記載の方法。
１００．
第２の単量体の転写エフェクタードメインが、転写リプレッサードメインを含み、転写を調節することが、目的の遺伝子の転写を抑制することを含む、実施形態９６～９９のいずれか１つに記載の方法。
１０１．
誘導性転写因子（ＩＴＦ）を含む操作された細胞であって、
ＩＴＦが、ＤＮＡ結合ドメイン、転写エフェクタードメイン、及びリガンド結合ドメインを含み、
ＩＴＦが、リガンド結合ドメインの同族リガンドとの結合時に核局在化を受け、
細胞核に局在化された場合に、ＩＴＦが、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができ、
同族リガンドが、ミフェプリストン又はその誘導体である、
操作された細胞。
１０２．
リガンド結合ドメインが、プロゲステロン受容体ドメインを含む、実施形態１０１に記載の操作された細胞。
１０３．
プロゲステロン受容体ドメインが、配列番号６８のアミノ酸配列を含む、実施形態１０２に記載の操作された細胞。
１０４．
ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含む、実施形態１０１～１０３のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１０５．
ＺＦタンパク質ドメインが、モジュラー設計であり、１つ以上のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）から構成される、実施形態１０４に記載の操作された細胞。
１０６．
ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のジンクフィンガーモチーフを含む、実施形態１０５に記載の操作された細胞。
１０７．
ＺＦタンパク質ドメインが、６つのジンクフィンガーモチーフを含む、実施形態１０４～１０６のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１０８．
ＩＴＦが、ＤＮＡ結合ドメインと転写エフェクタードメインとの間にペプチドリンカーを更に含む、実施形態１０１～１０７のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１０９．
ＤＮＡ結合ドメインが、ＩＴＦ応答性プロモーターに結合する、実施形態１０１～１０８のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１１０．
ＩＴＦ応答性プロモーターが、ＩＴＦ結合ドメイン配列及びコアプロモーター配列を含む、実施形態１０１～１０９のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１１１．
コアプロモーター配列が、最小プロモーターを含む、実施形態１１０に記載の操作された細胞。
１１２．
最小プロモーターが、ｍｉｎＰ、ｍｉｎＣＭＶ、ＹＢ＿ＴＡＴＡ、ｍｉｎＴＡＴＡ、及びｍｉｎＴＫからなる群から選択される、実施形態１１１に記載の操作された細胞。
１１３．
コアプロモーター配列が、構成的プロモーターに由来する、実施形態１１０に記載の操作された細胞。
１１４．
コアプロモーター配列が、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターに由来する、実施形態１１３に記載の操作された細胞。
１１５．
目的の遺伝子をコードする外因性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む発現カセット
を更に含む、実施形態１０１～１１４のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１１６．
転写エフェクタードメインが、転写活性化ドメインを含む、実施形態１０１～１１５のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１１７．
転写活性化ドメインが、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化ドメイン；ＶＰ１６の４つのタンデムコピーを含む活性化ドメイン；ＶＰ６４活性化ドメイン；ＮＦκＢのｐ６５活性化ドメイン；エプスタイン－バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）活性化ドメイン；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ活性化ドメイン（ＶＰＲ活性化ドメイン）を含む三者活性化因子；及びヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメイン（ｐ３００ ＨＡＴコア活性化ドメイン）からなる群から選択される、実施形態１１６に記載の操作された細胞。
１１８．
転写エフェクタードメインが、転写リプレッサードメインを含む、実施形態１０１～１１５のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１１９．
転写リプレッサードメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；短縮型クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）リプレッサードメイン；スクレラキシス（ＳＣＸ）ＨＬＨドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ１）ＨＬＨドメインの阻害剤、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン含有タンパク質２（ＨＥＲＣ２）Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＳＴ１）ＨＬＨドメイン、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．２（ＮＫＸ２２）ホメオドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ３）ＨＬＨドメインの阻害剤、並びにツイスト関連タンパク質２（ＴＷＳＴ２）ＨＬＨドメイン、並びにＥＥＤリプレッサードメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；ヘアリー関連塩基性ヘリックスループヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（モチーフがＷＲＰＷ抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；並びにＨＰ１アルファクロモシャドウ抑制ドメインからなる群から選択される、実施形態１１８に記載の操作された細胞。
１２０．
第１のプロモーターと、誘導性転写因子（ＩＴＦ）をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第１の発現カセット
を含む発現系であって、
ＩＴＦが、ＤＮＡ結合ドメイン、転写エフェクタードメイン、及びリガンド結合ドメインを含み、
ＩＴＦが、リガンド結合ドメインの同族リガンドとの結合時に核局在化を受け、
細胞核に局在化された場合に、ＩＴＦが、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができ、
同族リガンドが、ミフェプリストン又はその誘導体である、
発現系。
１２１．
リガンド結合ドメインが、プロゲステロン受容体ドメインを含む、実施形態１２０に記載の発現系。
１２２．
プロゲステロン受容体ドメインが、配列番号６８のアミノ酸配列を含む、実施形態１２１に記載の発現系。
１２３．
ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含む、実施形態１２０～１２２のいずれか１つに記載の発現系。
１２４．
ＺＦタンパク質ドメインが、モジュラー設計であり、１つ以上のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）から構成される、実施形態１２３に記載の発現系。
１２５．
ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のジンクフィンガーモチーフを含む、実施形態１２４に記載の発現系。
１２６．
ＺＦタンパク質ドメインが、６つのジンクフィンガーモチーフを含む、実施形態１２０～１２５のいずれか１つに記載の発現系。
１２７．
ＩＴＦが、ＤＮＡ結合ドメインと転写エフェクタードメインとの間に局在化されたリンカーを更に含む、実施形態１２０～１２６のいずれか１つに記載の発現系。
１２８．
転写エフェクタードメインが、転写活性化ドメインを含む、実施形態１２０～１２７のいずれか１つに記載の発現系。
１２９．
転写活性化ドメインが、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化ドメイン；ＶＰ１６の４つのタンデムコピーを含む活性化ドメイン；ＶＰ６４活性化ドメイン；ＮＦκＢのｐ６５活性化ドメイン；エプスタイン－バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）活性化ドメイン；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ活性化ドメイン（ＶＰＲ活性化ドメイン）を含む三者活性化因子；及びヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメイン（ｐ３００ ＨＡＴコア活性化ドメイン）からなる群から選択される、実施形態１２８に記載の発現系。
１３０．
転写エフェクタードメインが、転写リプレッサードメインを含む、実施形態１２０～１２７のいずれか１つに記載の発現系。
１３１．
転写リプレッサードメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）リプレッサードメイン；スクレラキシス（ＳＣＸ）ＨＬＨドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ１）ＨＬＨドメインの阻害剤、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン含有タンパク質２（ＨＥＲＣ２）Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＳＴ１）ＨＬＨドメイン、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．２（ＮＫＸ２２）ホメオドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ３）ＨＬＨドメインの阻害剤、及びツイスト関連タンパク質２（ＴＷＳＴ２）ＨＬＨドメイン、ＥＥＤリプレッサードメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；ヘアリー関連塩基性ヘリックスループヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（モチーフがＷＲＰＷ抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；並びにＨＰ１アルファクロモシャドウ抑制ドメインからなる群から選択される、実施形態１３０に記載の発現系。
１３２．
ＤＮＡ結合ドメインが、ＩＴＦ応答性プロモーターに結合する、実施形態１２０～１３１のいずれか１つに記載の発現系。
１３３．
第１のプロモーターが、構成的プロモーター、調節可能プロモーター、又は合成プロモーターである、実施形態１２０～１３２のいずれか１つに記載の発現系。
１３４．
第１のプロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａＶ１、ｈＣＡＧＧ、ｈＥＦ１ａＶ２、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターである、実施形態１３３に記載の発現系。
１３５．
目的の遺伝子をコードする外因性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む発現カセット
を更に含む、実施形態１２０～１３４のいずれか１つに記載の発現系。
１３６．
ＩＴＦ応答性プロモーターが、ＩＴＦ結合ドメイン配列及びコアプロモーター配列を含む、実施形態１３５に記載の発現系。
１３７．
コアプロモーター配列が、最小プロモーターを含む、実施形態１３６に記載の発現系。
１３８．
最小プロモーターが、ｍｉｎＰ、ｍｉｎＣＭＶ、ＹＢ＿ＴＡＴＡ、ｍｉｎＴＡＴＡ、及びｍｉｎＴＫからなる群から選択される、実施形態１３７に記載の発現系。
１３９．
コアプロモーター配列が、構成的プロモーターに由来する、実施形態１３８に記載の発現系。
１４０．
コアプロモーター配列が、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターに由来する、実施形態１３９に記載の発現系。
１４１．
実施形態１２０～１４０のいずれか１つの発現系を含む操作された細胞。
１４２．
ヒト細胞を含む、実施形態１０１～１１９又は１４１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１４３．
幹細胞を含む、実施形態１０１～１１９、１４１、又は１４２のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１４４．
免疫細胞を含む、実施形態１～１１９、１４１、又は１４２のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１４５．
Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及びｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択される、実施形態１０１～１１９、１４１、又は１４２のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１４６．
目的の遺伝子の転写を調節するための遺伝子スイッチであって、
実施形態１０１～１１９又は１４１～１４５のいずれか１つに記載の操作された細胞と、
有効量のミフェプリストンと
を含む、遺伝子スイッチ。
１４７．
目的のポリペプチドの転写を調節する方法であって、
誘導性転写因子（ＩＴＦ）の核局在化を誘導するために、実施形態１０１～１１９又は１４２～１４６のいずれか１つに記載の操作された細胞をミフェプリストンと接触させる工程
を含む、方法。
１４８．
ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写をＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、操作された細胞を培養する工程
を更に含む、実施形態１４７に記載の方法。
１４９．
操作された細胞が、ヒト又は動物中にあり、操作された細胞をミフェプリストンと接触させる工程が、ミフェプリストンの薬理学的用量をヒト又は動物に投与することを含む、実施形態１４７に記載の方法。
１５０．
転写エフェクタードメインが、転写活性化ドメインを含み、転写を調節することが、目的の遺伝子の転写を活性化することを含む、実施形態１４７～１４９のいずれか１つに記載の方法。
１５１．
転写エフェクタードメインが、転写リプレッサードメインを含み、転写を調節することが、目的の遺伝子の転写を抑制することを含む、実施形態１４７～１４９のいずれか１つに記載の方法。

【実施例】

【0351】

以下は、本開示を実行するための特定の実施形態の実施例である。実施例は、あくまで例示の目的で示されるものにすぎず、本開示の範囲をいかなる意味においても限定することを意図しない。努力が、使用される数（例えば、量、温度など）に関する正確さを確実にするためになされてきたが、しかし、一部の実験誤差及び偏差が、無論、許容されるべきである。

【0352】

本開示の実施では、別途指示のない限り、当業者の技術の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ手法、及び薬理学の従来の方法が用いられるであろう。そのような手法は、文献で完全に説明される。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）、Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．、最新の追加版）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）、Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３^ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照されたい。

【0353】

実施例１：薬剤誘導転写因子による転写調節
形質導入アッセイを実施して、カフェイン、ラパマイシン、ＣＢＤ、又はニコチンによって活性化された誘導性転写因子に応答するｍＣｈｅｒｒｙ発現を評価した。

【0354】

材料及び方法
Ｕ８７－ＭＧ細胞を、最小プロモーターであるＹＢＴＡＴＡに連結されたＺＦ１０に結合する４×ＺＦ結合部位から構成される合成ＩＴＦ応答性プロモーター（配列番号６５）をコードするレンチウイルスで形質導入した。プロモーターは、ｍＣｈｅｒｒｙの発現を駆動する。この細胞株は、「レポーター細胞」と称された。カフェイン誘導性転写因子構築物は、抗カフェインＶ_ＨＨ （「ａＣａｆｆ」）、配列番号１のジンクフィンガータンパク質ドメイン（ＺＦ１０）、配列番号２の核局在化シグナル、切断可能なリンカー、及び青色蛍光タンパク質タグから構成される第１の単量体構築物（構築物１）、並びに配列番号５の核外輸送シグナル（ＮＥＳ）、ＶＰＲ転写活性化ドメイン、抗カフェインＶ_ＨＨ（「ａＣａｆｆ」）、切断可能なリンカー、及び緑色蛍光タンパク質タグから構成される第２の単量体構築物（構築物２）を含んでいた。ラパマイシン誘導性転写因子構築物は、ＦＫＢＰドメイン、配列番号１のジンクフィンガータンパク質ドメイン、配列番号２の核局在化シグナル、切断可能なリンカー、及び青色蛍光タンパク質タグ（構築物１）から構成される第１の単量体構築物（構築物３）、並びに配列番号５の核外輸送シグナル（ＮＥＳ）、ＶＰＲ転写活性化ドメイン、ＦＲＢドメイン、切断可能なリンカー、及び緑色蛍光タンパク質タグから構成される第２の単量体構築物（構築物４）を含んでいた。カンナビノイド誘導性転写因子構築物は、第１の抗ＣＢＤ Ｖ_ＨＨ（ＣＡ－１４）、配列番号１のジンクフィンガータンパク質ドメイン、配列番号２の核局在化シグナル、切断可能なリンカー、及び青色蛍光タンパク質タグから構成される第１の単量体構築物（構築物５）、並びに配列番号５の核外輸送シグナル（ＮＥＳ）、ＶＰＲ転写活性化ドメイン、第１の抗ＣＢＤ Ｖ_ＨＨとオリゴマー化可能な第２の抗ＣＢＤ Ｖ_ＨＨ（ＤＢ－２１）、切断可能なリンカー、及び緑色蛍光タンパク質タグから構成される第２の単量体構築物（構築物６）を含んでいた。ニコチン誘導性転写因子構築物は、抗ニコチンＶＨ、配列番号１のジンクフィンガータンパク質ドメイン、配列番号２の核局在化シグナル、切断可能なリンカー、及び青色蛍光タンパク質タグから構成される第１の単量体構築物（構築物７）、並びに配列番号５の核外輸送シグナル（ＮＥＳ）、ＶＰＲ転写活性化ドメイン、第１の構築物の抗ニコチンＶＨとオリゴマー化可能な抗ニコチンＶＬ、切断可能なリンカー、及び緑色蛍光タンパク質タグから構成される第２の単量体構築物（構築物８）を含んでいた。

【0355】

１日目に、レポーター細胞を、表４に示されるＤＮＡ構築物をコードするレンチウイルスで形質導入した。

【0356】

（表４）レポーター細胞の形質導入に使用される構築物

【0357】

２日目に、カフェイン、ラパマイシン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、及びニコチンによって調節される転写調節についてアッセイするために、細胞群Ａ～Ｄ、及び対照細胞群（非形質導入）を、表５に示されるように、カフェイン、ラパマイシン、ＣＢＤ、又はニコチン薬物処理を伴う４８ウェルプレートに分割した。細胞集団Ｅを後日薬物処理のために凍結した。

【0358】

（表５）アッセイ条件

【0359】

４日目に、培地を４８ウェルプレートから除去し、細胞をトリプシン処理し、次いで、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）緩衝液及びＳｙｔｏｘ Ｒｅｄ（ＡＰＣチャネル中の蛍光）生存性色素中に再懸濁した。細胞をフローサイトメーター上で実行し、細胞についてはＦＳＣ／ＳＳＣ、生細胞についてはＦＳＣ／Ｓｙｔｏｘ Ｒｅｄ、形質導入された細胞については緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）／青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）＋によってゲーティングした。ｍＣｈｅｒｒｙ幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）を各濃度で測定し、図１に示されるように、細胞群Ａ～Ｄ及び対照細胞群については薬物なしに正規化した。

【0360】

結果
図１に示されるように、ラパマイシン調節転写調節系は両方とも、濃度依存的様式で薬物の存在下でｍＣｈｅｒｒｙ発現を誘導した。

【0361】

実施例２：２つの核局在化シグナルを含む転写調節系
形質導入アッセイを行って、各々が核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む第１の単量体及び第２の単量体を用いた、カフェイン、ＣＢＤ、及びニコチン誘導性転写因子の転写調節活性を評価した。

【0362】

材料及び方法
４ｘＺＦ１０－１ ＢＳ＿ｍｉｎＹＢＴＡＴＡ：ｍＣｈｅｒｒｙベクターで形質導入されたＵ８７ＭＧ細胞（「レポーター細胞」と称される）を、０日目に、６ウェルプレート中６ｅ５／細胞で播種した。

【0363】

カフェイン誘導性転写因子構築物を設計し、抗カフェインＶ_ＨＨ （「ａＣａｆｆ」）、配列番号１のジンクフィンガータンパク質ドメイン（「ＺＦ１０」）、配列番号２の３Ｘ ＦＬＡＧタグ付き核局在化シグナル（ＮＬＳ）、切断可能なリンカー、及び青色蛍光タンパク質タグ（ＢＦＰ）から構成される第１の単量体構築物（構築物１０）、並びに配列番号２の３Ｘ ＦＬＡＧタグ付きＮＬＳ、ＶＰＲ転写活性化ドメイン、抗カフェインＶ_ＨＨ（「ａＣａｆｆ」）、切断可能なリンカー、及び緑色蛍光タンパク質タグ（ＧＦＰ）から構成される第２の単量体構築物（構築物１１）を含んでいた。ニコチン誘導性転写因子構築物を設計し、抗ニコチンＶＨ、配列番号１のジンクフィンガータンパク質ドメイン、配列番号２のＮＬＳ、切断可能なリンカー、及びＢＦＰタグから構成される第１の単量体構築物（構築物１２）、並びに配列番号２の３Ｘ ＦＬＡＧタグ付き核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ＶＰＲ転写活性化ドメイン、第１の構築物の抗ニコチンＶＨとオリゴマー化可能な抗ニコチンＶＬ、切断可能なリンカー、及びＧＦＰタグから構成される第２の単量体構築物（構築物１３）を含んでいた。カンナビノイド誘導性転写因子構築物は、第１の抗ＣＢＤ Ｖ_ＨＨ（ＣＡ－１４）、配列番号１のジンクフィンガータンパク質ドメイン、配列番号２の核局在化シグナル、切断可能なリンカー、及びＢＦＰタグから構成される第１の単量体構築物（構築物１４）、並びに配列番号２の３Ｘ ＦＬＡＧタグ付き核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ＶＰＲ転写活性化ドメイン、第１の抗ＣＢＤ Ｖ_ＨＨとオリゴマー化可能な第２の抗ＣＢＤ Ｖ_ＨＨ（ＤＢ－２１）、切断可能なリンカー、及びＧＦＰタグから構成される第２の単量体構築物（構築物１５）を含んでいた。

【0364】

１日目に、レポーター細胞を、表６に示されるＤＮＡ構築物をコードするレンチウイルスで共形質導入した。

【0365】

（表６）レポーター細胞の形質導入に使用される構築物

【0366】

２日目に、各細胞群Ｆ～Ｈの細胞を分割し、１０ｕＭ、１ｕＭ、０．１ｕＭ、又は０ｕＭの薬物（群Ｆについてはカフェイン、群Ｇについてはニコチン、又は群ＨについてはＣＢＤ）で処理した。

【0367】

５日目に、フローサイトメトリーを行い、細胞をＧＦＰ／ＢＦＰ陽性細胞上でゲーティングし、ｍＣｈｅｒｒｙ発現について評価した。ｍＣｈｅｒｒｙ発現を分析し、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞のパーセントとして（図２）、及びｍＣｈｅｒｒｙの平均蛍光強度によってプロットした（図３）。

【0368】

結果
図２及び図３に示されるように、１０ｕＭ及び１ｕＭの濃度でのニコチン処理は、第１の単量体及び第２の単量体中のＮＬＳを含むニコチン誘導性転写因子を発現する細胞において、濃度依存性レポーター発現を誘導した。

【0369】

実施例３：薬剤誘導転写因子による転写調節
形質導入アッセイを実施して、ミフェプリストンによって活性化された誘導性転写因子に応答するｍＣｈｅｒｒｙ発現を評価した。

【0370】

材料及び方法
Ｕ８７－ＭＧ細胞を、最小プロモーターであるＹＢＴＡＴＡに連結されたＺＦ１０に結合する４×ＺＦ結合部位を含む合成ＩＴＦ応答性プロモーター（配列番号６５）をコードするレンチウイルスで形質導入した。プロモーターは、ｍＣｈｅｒｒｙの発現を駆動する。この細胞株は、「レポーター細胞」と称された。ミフェプリストン誘導性転写因子構築物は、（Ｎ末端からＣ末端に）配列番号１のジンクフィンガータンパク質ドメイン（「ＺＦ１０」）、配列番号６８のプロゲステロン受容体ドメイン、配列番号７０のｐ６５転写活性化因子ドメイン、配列番号７２の切断可能なリンカー（Ｅ２Ａ－Ｔ２Ａ）、及び配列番号７４の青色蛍光タンパク質タグ（ＢＦＰ）を含む。１日目に、レポーター細胞を、ミフェプリストン誘導性転写因子構築物をコードするレンチウイルスで形質導入した。

【0371】

ミフェプリストン調節転写調節についてアッセイするために、細胞群Ｅを解凍し、４日後、細胞を４８ウェルプレートに分割し、０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭ、又は１００００ｎＭのミフェプリストンで処理した。細胞を解凍した６日後、細胞をトリプシン処理し、次いで、ＦＡＣＳ緩衝液及びＳｙｔｏｘ Ｒｅｄ（ＡＰＣチャネル中の蛍光）生存性色素中に再懸濁した。細胞ｍＣｈｅｒｒｙ幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）を各濃度で測定し、図４に示されるように薬物なしに正規化した。

【0372】

結果
図４に示されるように、ミフェプリストン調節転写調節系は、濃度依存的様式で、薬物の存在下でｍＣｈｅｒｒｙ発現を誘導した。
（表１４）配列

【0373】

本開示は、好ましい実施形態及び様々な代替的な実施形態を参照して特異的に示され、説明されているが、本開示及び添付の請求項の趣旨及び範囲から逸脱することなく、形態及び詳細の様々な変更が、その中に行うことができることは、当業者によって理解されるであろう。

【0374】

参照による組み込み
本出願に引用された公開文献、特許、特許出願、及び他の文献は全て、あたかも各個別の公開文献、特許、特許出願、又は他の文献があらゆる目的のために参照により組み込まれるように個別に示されるのと同じ範囲まで、あらゆる目的のために、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。

【0375】

均等物
様々な特定の実施形態が図示及び記載されてきたが、上記明細書は制限的ではない。本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができることが理解されるであろう。多くの変型は、本明細書の範囲を考慮すれば当業者に明らかとなるであろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【手続補正書】

【提出日】2024-03-01

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

誘導性転写因子（ＩＴＦ）を含む操作された細胞であって、
前記ＩＴＦが、
ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の単量体と、
転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の単量体と
を含み、
各単量体が、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドを介してオリゴマー化可能であり、
リガンド誘導オリゴマー化が、前記ＩＴＦを形成し、
前記同族リガンドが、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択され、
任意選択で、前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、
任意選択で、各リガンド結合ドメインが、単一ドメイン抗体を含み、
前記単一ドメイン抗体が、Ｖ_ＨＨを含み、
任意選択で、前記ＩＴＦが、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができる、
操作された細胞。

【請求項2】

ａ．前記Ｖ_ＨＨが、抗カフェインＶ_ＨＨ（ａｃ Ｖ_ＨＨ）であり、
任意選択で、前記抗カフェインＶ_ＨＨ（ａｃ Ｖ_ＨＨ）が、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、かつ／若しくは
任意選択で、前記第１のリガンド結合ドメイン及び前記第２のリガンド結合ドメインの各々が、前記ａｃ Ｖ_ＨＨを含む、又は
ｂ．前記同族リガンドが、カンナビジオール若しくはフィトカンナビノイドであり、前記Ｖ_ＨＨが、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７（それぞれ、ＣＡ－１４、ＤＢ－６、ＤＢ－１１、ＤＢ－１８、及びＤＢ－２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、前記第１若しくは前記第２の結合ドメインのうちの他方が、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７（それぞれ、ＤＢ－６、ＤＢ－１１、ＤＢ－１８、及びＤＢ－２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、
任意選択で、前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、前記第１若しくは前記第２の結合ドメインのうちの他方が、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７（それぞれ、ＤＢ－６、ＤＢ－１１、ＤＢ－１８、及びＤＢ－２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、
任意選択で、前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、前記第１若しくは前記第２の結合ドメインのうちの他方が、配列番号５７（ＤＢ－２１）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含む、又は
ｃ．各リガンド結合ドメインが、抗ニコチン抗体重鎖可変ドメイン（抗Ｎｉｃ ＶＨ）若しくは抗ニコチン抗体軽鎖可変ドメイン（抗Ｎｉｃ ＶＬ）を含み、
任意選択で、前記抗Ｎｉｃ ＶＨが、配列番号５８のアミノ酸配列を含み、前記抗Ｎｉｃ ＶＬが、配列番号５９のアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、前記抗Ｎｉｃ ＶＨを含み、前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの他方が、前記抗Ｎｉｃ ＶＬを含む、
請求項１に記載の操作された細胞。

【請求項3】

誘導性転写因子（ＩＴＦ）を含む操作された細胞であって、
前記ＩＴＦが、
ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の単量体と、
転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の単量体と
を含み、
各単量体が、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドの結合を介してオリゴマー化可能であり、
リガンド誘導オリゴマー化が、前記ＩＴＦを形成し、
前記ＤＮＡ結合ドメインが、モジュラー式でありかつ６つのＺＦモチーフのアレイを含むジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、
前記同族リガンドが、ラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、及びそれらの類似体からなる群から選択され、
任意選択で、前記ＩＴＦが、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができる、
操作された細胞。

【請求項4】

ａ．前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、ＦＫＢＰドメインを含み、前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの他方が、ＦＲＢドメインを含み、
任意選択で、前記ＦＫＢＰが、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記ＦＲＢドメインが、配列番号６１のアミノ酸配列を含む、又は
ｂ．前記第１のリガンド結合ドメインが、前記ＦＫＢＰドメインを含み、前記第２のリガンド結合ドメインが、前記ＦＲＢドメインを含み、
任意選択で、前記ＦＫＢＰが、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記ＦＲＢドメインが、配列番号６１のアミノ酸配列を含む、又は
ｃ．前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、前記ＦＲＢドメインを含み、前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの他方が、前記ＦＫＢＰドメインを含み、
任意選択で、前記ＦＫＢＰが、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記ＦＲＢドメインが、配列番号６１のアミノ酸配列を含む、又は
ｄ．前記第１のリガンド結合ドメインが、前記ＦＲＢドメインを含み、前記第２のリガンド結合ドメインが、前記ＦＫＢＰドメインを含み、
任意選択で、前記ＦＫＢＰが、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記ＦＲＢドメインが、配列番号６１のアミノ酸配列を含む、
請求項３に記載の操作された細胞。

【請求項5】

ａ．前記第１の単量体及び／又は前記第２の単量体が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含み、
任意選択で、前記ＮＬＳが、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／又は
ｂ．前記第２の単量体が、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を更に含み、
任意選択で、前記ＮＥＳが、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
請求項１～４のいずれか一項に記載の操作された細胞。

【請求項6】

誘導性転写因子（ＩＴＦ）を含む操作された細胞であって、
前記ＩＴＦが、ＤＮＡ結合ドメイン、転写エフェクタードメイン、及びリガンド結合ドメインを含み、
前記ＩＴＦが、前記リガンド結合ドメインの同族リガンドとの結合時に核局在化を受け、
細胞核に局在化された場合に、前記ＩＴＦが、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができ、
前記同族リガンドが、ミフェプリストン若しくはその誘導体であり、
任意選択で、前記リガンド結合ドメインが、プロゲステロン受容体ドメインを含み、前記プロゲステロン受容体ドメインが、配列番号６８のアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、
任意選択で、前記ＩＴＦが、前記ＤＮＡ結合ドメインと前記転写エフェクタードメインとの間にペプチドリンカーを更に含み、
任意選択で、前記ＤＮＡ結合ドメインが、前記ＩＴＦ応答性プロモーターに結合し、
任意選択で、前記細胞が、前記目的の遺伝子をコードする外因性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された前記ＩＴＦ応答性プロモーターを含む発現カセットを更に含み、
任意選択で、前記ＩＴＦ応答性プロモーターが、ＩＴＦ結合ドメイン配列及びコアプロモーター配列を含み、
任意選択で、前記コアプロモーター配列が、最小プロモーターを含み、前記最小プロモーターが、ｍｉｎＰ、ｍｉｎＣＭＶ、ＹＢ＿ＴＡＴＡ、ｍｉｎＴＡＴＡ、及びｍｉｎＴＫからなる群から選択される、又は前記コアプロモーター配列が、構成的プロモーターに由来し、前記コアプロモーター配列が、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターに由来する、
操作された細胞。

【請求項7】

ａ．前記ＺＦタンパク質ドメインが、モジュラー設計であり、１つ以上のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）から構成され、
ｂ．前記ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のジンクフィンガーモチーフのアレイを含み、かつ／又は
ｃ．前記ＺＦタンパク質ドメインが、６つのジンクフィンガーモチーフのアレイを含む、
請求項１～６のいずれか一項に記載の操作された細胞。

【請求項8】

ａ．前記転写エフェクタードメインが、転写活性化ドメインを含み、
任意選択で、前記転写活性化ドメインが、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化ドメイン；ＶＰ１６の４つのタンデムコピーを含む活性化ドメイン；ＶＰ６４活性化ドメイン；ＮＦκＢのｐ６５活性化ドメイン；エプスタイン－バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）活性化ドメイン；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ活性化ドメイン（ＶＰＲ活性化ドメイン）を含む三者活性化因子；及びヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメイン（ｐ３００ ＨＡＴコア活性化ドメイン）からなる群から選択される、又は
ｂ．前記転写エフェクタードメインが、転写リプレッサードメインを含み、
任意選択で、前記転写リプレッサードメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；短縮型クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）リプレッサードメイン；スクレラキシス（ＳＣＸ）ＨＬＨドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ１）ＨＬＨドメインの阻害剤、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン含有タンパク質２（ＨＥＲＣ２）Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＳＴ１）ＨＬＨドメイン、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．２（ＮＫＸ２２）ホメオドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ３）ＨＬＨドメインの阻害剤、並びにツイスト関連タンパク質２（ＴＷＳＴ２）ＨＬＨドメイン、並びにＥＥＤリプレッサードメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；ヘアリー関連塩基性ヘリックスループヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（配列番号７６）（前記モチーフがＷＲＰＷ（配列番号７６）抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；並びにＨＰ１アルファクロモシャドウ抑制ドメインからなる群から選択される、
請求項１～７のいずれか一項に記載の操作された細胞。

【請求項9】

以下：
第１のプロモーターと、第１の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第１の発現カセットであって、前記第１の単量体が、ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の発現カセットと、
第２のプロモーターと、第２の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第２の発現カセットであって、前記第２の単量体が、転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の発現カセットと
を含む発現系であって、
各単量体が、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドを介してオリゴマー化可能であり、
前記第１及び前記第２の単量体のリガンド誘導オリゴマー化が、誘導性転写因子（ＩＴＦ）を形成し、
前記同族リガンドが、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択され、
任意選択で、前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、
任意選択で、前記ＺＦタンパク質ドメインが、モジュラー設計であり、かつ１つ以上のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）から構成され、
任意選択で、前記ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のジンクフィンガーモチーフのアレイを含み、
任意選択で、前記発現系が、目的の遺伝子に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む第３の発現カセットを更に含み、前記ＩＴＦ応答性プロモーターが、コアプロモーター配列と、第１の操作されたポリペプチドの前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列とを含む、
発現系。

【請求項10】

以下：
第１のプロモーターと、第１の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第１の発現カセットであって、前記第１の単量体が、ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の発現カセットと、
第２のプロモーターと、第２の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第２の発現カセットであって、前記第２の単量体が、転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の発現カセットと
を含む発現系であって、
各単量体が、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドの結合を介してオリゴマー化可能であり、
前記第１及び前記第２の単量体のリガンド誘導オリゴマー化が、誘導性転写因子（ＩＴＦ）を形成し、
前記ＤＮＡ結合ドメインが、モジュラー式でありかつ１０個のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）を含むジンクフィンガータンパク質ドメインを含み、
前記同族リガンドが、ラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、及びそれらの類似体からなる群から選択され、
任意選択で、各リガンド結合ドメインが、ＦＫＢＰドメイン又はＦＲＢドメインを含み、
任意選択で、前記第１の単量体及び／又は前記第２の単量体が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含み、
任意選択で、前記第２の単量体が、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を更に含み、
任意選択で、前記ＩＴＦが、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができ、
任意選択で、前記発現系が、目的の遺伝子に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む第３の発現カセットを更に含み、前記第３のプロモーターが、コアプロモーター配列と、第１の操作されたポリペプチドの前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列とを含む、
発現系。

【請求項11】

第１のプロモーターと、誘導性転写因子（ＩＴＦ）をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第１の発現カセット
を含む発現系であって、
前記ＩＴＦが、ＤＮＡ結合ドメイン、転写エフェクタードメイン、及びリガンド結合ドメインを含み、
前記ＩＴＦが、前記リガンド結合ドメインの同族リガンドとの結合時に核局在化を受け、
細胞核に局在化された場合に、前記ＩＴＦが、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができ、
前記同族リガンドが、ミフェプリストン又はその誘導体であり、
任意選択で、前記リガンド結合ドメインが、プロゲステロン受容体ドメインを含み、
任意選択で、前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、
任意選択で、前記ＺＦタンパク質ドメインが、モジュラー設計であり、１つ以上のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）から構成され、
任意選択で、前記ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のジンクフィンガーモチーフを含み、
任意選択で、前記ＩＴＦが、前記ＤＮＡ結合ドメインと前記転写エフェクタードメインとの間に局在化されたリンカーを更に含み、
任意選択で、前記発現系が、前記目的の遺伝子をコードする外因性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された前記ＩＴＦ応答性プロモーターを含む発現カセットを更に含む、
発現系。

【請求項12】

請求項９～１１のいずれか一項に記載の発現系を含む、操作された細胞。

【請求項13】

ａ．ヒト細胞を含む、かつ／又は
ｂ．幹細胞を含む、かつ／又は
ｃ．免疫細胞を含む、かつ／又は
ｄ．Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及びｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択される、
請求項１～８、又は１２のいずれか一項に記載の操作された細胞。

【請求項14】

目的の遺伝子の転写を調節するための遺伝子スイッチであって、以下：
ａ．請求項１、２、５、８、９、１２、若しくは１３のいずれか一項に記載の操作された細胞、並びに誘導性転写因子（ＩＴＦ）の形成を誘導するために、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択される同族リガンド、又は
ｂ．請求項３～５、８、９、１２、若しくは１３のいずれか一項に記載の操作された細胞、並びにラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、及びそれらの類似体からなる群から選択される同族リガンド、又は
ｃ．請求項６～９、１２、若しくは１３のいずれか一項に記載の操作された細胞、及びミフェプリストン、若しくはその誘導体
を含む、遺伝子スイッチ。

【請求項15】

目的の遺伝子の転写を調節する方法であって、以下：
ａ．誘導性転写因子（ＩＴＦ）の形成を誘導するために、請求項１、２、５、８、９、１２、又は１３のいずれか一項に記載の操作された細胞を、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択される同族リガンドと接触させる工程であって、
任意選択で、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写を前記ＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、前記操作された細胞を培養する工程を更に含み、
任意選択で、前記接触させる工程が、ヒト若しくは動物において行われ、
任意選択で、形質転換された細胞を前記同族リガンドと接触させる工程が、前記同族リガンドの薬理学的用量を前記ヒト若しくは動物に投与することを含む、工程、又は
ｂ．誘導性転写因子（ＩＴＦ）の形成を誘導するために、請求項３～５、８、９、１２、若しくは１３のいずれか一項に記載の操作された細胞を、ラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、及びそれらの類似体からなる群から選択される同族リガンドと接触させる工程であって、
任意選択で、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写を前記ＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、前記操作された細胞を培養する工程を更に含み、
任意選択で、前記操作された細胞が、ヒト若しくは動物中にあり、前記操作された細胞を前記同族リガンドと接触させる工程が、前記ラパマイシンの薬理学的用量を前記ヒト若しくは動物に投与することを含み、
任意選択で、前記第２の単量体の転写エフェクタードメインが、転写活性化ドメインを含み、転写を調節することが、前記目的の遺伝子の転写を活性化することを含むか、若しくは前記第２の単量体の前記転写エフェクタードメインが、転写リプレッサードメインを含み、転写を調節することが、前記目的の遺伝子の転写を抑制することを含む、工程、又は
ｃ．前記誘導性転写因子（ＩＴＦ）の核局在化を誘導するために、請求項６～９、１２、若しくは１３のいずれか一項に記載の操作された細胞を、ミフェプリストン、若しくはその誘導体と接触させる工程であって、
任意選択で、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写を前記ＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、前記操作された細胞を培養する工程を更に含み、
任意選択で、前記操作された細胞が、ヒト若しくは動物中にあり、前記操作された細胞を前記ミフェプリストンと接触させる工程が、前記ミフェプリストンの薬理学的用量を前記ヒト若しくは動物に投与することを含み、
任意選択で、前記転写エフェクタードメインが、転写活性化ドメインを含み、転写を調節することが、前記目的の遺伝子の転写を活性化することを含むか、若しくは前記転写エフェクタードメインが、転写リプレッサードメインを含み、転写を調節することが、前記目的の遺伝子の転写を抑制することを含む、工程
を含む、方法。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0012】

いくつかの実施形態では、
ａ．転写エフェクタードメインは、転写活性化ドメインを含み、
任意選択で、転写活性化ドメインは、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化ドメイン；ＶＰ１６の４つのタンデムコピーを含む活性化ドメイン；ＶＰ６４活性化ドメイン；ＮＦκＢのｐ６５活性化ドメイン；エプスタイン－バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）活性化ドメイン；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ活性化ドメイン（ＶＰＲ活性化ドメイン）を含む三者活性化因子；及びヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメイン（ｐ３００ ＨＡＴコア活性化ドメイン）からなる群から選択される、又は
ｂ．転写エフェクタードメインは、転写リプレッサードメインを含み、
任意選択で、転写リプレッサードメインは、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；短縮型クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）リプレッサードメイン；スクレラキシス（ＳＣＸ）ＨＬＨドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ１）ＨＬＨドメインの阻害剤、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン含有タンパク質２（ＨＥＲＣ２）Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＳＴ１）ＨＬＨドメイン、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．２（ＮＫＸ２２）ホメオドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ３）ＨＬＨドメインの阻害剤、並びにツイスト関連タンパク質２（ＴＷＳＴ２）ＨＬＨドメイン、並びにＥＥＤリプレッサードメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；ヘアリー関連塩基性ヘリックスループヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（配列番号７６）（モチーフがＷＲＰＷ（配列番号７６）抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；並びにＨＰ１アルファクロモシャドウ抑制ドメインからなる群から選択される。

【手続補正3】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0081】

いくつかの態様では、転写エフェクタードメインは、転写リプレッサードメインを含む。いくつかの態様では、転写リプレッサードメインは、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）リプレッサードメイン；スクレラキシス（ＳＣＸ）ＨＬＨドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ１）ＨＬＨドメインの阻害剤、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン含有タンパク質２（ＨＥＲＣ２）Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＳＴ１）ＨＬＨドメイン、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．２（ＮＫＸ２２）ホメオドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ３）ＨＬＨドメインの阻害剤、及びツイスト関連タンパク質２（ＴＷＳＴ２）ＨＬＨドメイン、ＥＥＤリプレッサードメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；ヘアリー関連塩基性ヘリックスループヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（配列番号７６）（モチーフがＷＲＰＷ（配列番号７６）抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；並びにＨＰ１アルファクロモシャドウ抑制ドメインからなる群から選択される。

【手続補正4】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１１８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0118】

いくつかの態様では、転写エフェクタードメインは、転写リプレッサードメインを含む。いくつかの態様では、転写リプレッサードメインは、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；短縮型クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）リプレッサードメイン；スクレラキシス（ＳＣＸ）ＨＬＨドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ１）ＨＬＨドメインの阻害剤、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン含有タンパク質２（ＨＥＲＣ２）Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＳＴ１）ＨＬＨドメイン、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．２（ＮＫＸ２２）ホメオドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ３）ＨＬＨドメインの阻害剤、並びにツイスト関連タンパク質２（ＴＷＳＴ２）ＨＬＨドメイン、並びにＥＥＤリプレッサードメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；ヘアリー関連塩基性ヘリックスループヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（配列番号７６）（モチーフがＷＲＰＷ（配列番号７６）抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；並びにＨＰ１アルファクロモシャドウ抑制ドメインからなる群から選択される。

【手続補正5】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１２４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0124】

いくつかの態様では、本開示は、誘導性転写因子（ＩＴＦ）の核局在化を誘導するために、本明細書に記載される任意の操作された細胞をミフェプリストンと接触させる工程を含む、目的のポリペプチドの転写を調節する方法を提供する。いくつかの態様では、方法は、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写をＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、操作された細胞を培養する工程を更に含む。いくつかの態様では、操作された細胞は、ヒト又は動物中にあり、操作された細胞をミフェプリストンと接触させる工程は、ミフェプリストンの薬理学的用量をヒト又は動物に投与することを含む。いくつかの態様では、転写エフェクタードメインは、転写活性化ドメインを含み、転写を調節することは、目的の遺伝子の転写を活性化することを含む。いくつかの態様では、転写エフェクタードメインは、転写リプレッサードメインを含み、転写を調節することは、目的の遺伝子の転写を抑制することを含む。
[本発明１００１]
誘導性転写因子（ＩＴＦ）を含む操作された細胞であって、
前記ＩＴＦが、
ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の単量体と、
転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の単量体と
を含み、
各単量体が、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドを介してオリゴマー化可能であり、
リガンド誘導オリゴマー化が、前記ＩＴＦを形成し、
前記同族リガンドが、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択され、
任意選択で、前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、
任意選択で、各リガンド結合ドメインが、単一ドメイン抗体を含み、
前記単一ドメイン抗体が、Ｖ _Ｈ Ｈを含み、
任意選択で、前記ＩＴＦが、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができる、
操作された細胞。
[本発明１００２]
ａ．前記Ｖ _Ｈ Ｈが、抗カフェインＶ _Ｈ Ｈ（ａｃ Ｖ _Ｈ Ｈ）であり、
任意選択で、前記抗カフェインＶ _Ｈ Ｈ（ａｃ Ｖ _Ｈ Ｈ）が、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、かつ／若しくは
任意選択で、前記第１のリガンド結合ドメイン及び前記第２のリガンド結合ドメインの各々が、前記ａｃ Ｖ _Ｈ Ｈを含む、又は
ｂ．前記同族リガンドが、カンナビジオール若しくはフィトカンナビノイドであり、前記Ｖ _Ｈ Ｈが、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７（それぞれ、ＣＡ－１４、ＤＢ－６、ＤＢ－１１、ＤＢ－１８、及びＤＢ－２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含むＶ _Ｈ Ｈを含み、前記第１若しくは前記第２の結合ドメインのうちの他方が、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７（それぞれ、ＤＢ－６、ＤＢ－１１、ＤＢ－１８、及びＤＢ－２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶ _Ｈ Ｈを含み、
任意選択で、前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含むＶ _Ｈ Ｈを含み、前記第１若しくは前記第２の結合ドメインのうちの他方が、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７（それぞれ、ＤＢ－６、ＤＢ－１１、ＤＢ－１８、及びＤＢ－２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶ _Ｈ Ｈを含み、
任意選択で、前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含むＶ _Ｈ Ｈを含み、前記第１若しくは前記第２の結合ドメインのうちの他方が、配列番号５７（ＤＢ－２１）のアミノ酸配列を含むＶ _Ｈ Ｈを含む、又は
ｃ．各リガンド結合ドメインが、抗ニコチン抗体重鎖可変ドメイン（抗Ｎｉｃ ＶＨ）若しくは抗ニコチン抗体軽鎖可変ドメイン（抗Ｎｉｃ ＶＬ）を含み、
任意選択で、前記抗Ｎｉｃ ＶＨが、配列番号５８のアミノ酸配列を含み、前記抗Ｎｉｃ ＶＬが、配列番号５９のアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、前記抗Ｎｉｃ ＶＨを含み、前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの他方が、前記抗Ｎｉｃ ＶＬを含む、
本発明１００１の操作された細胞。
[本発明１００３]
誘導性転写因子（ＩＴＦ）を含む操作された細胞であって、
前記ＩＴＦが、
ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の単量体と、
転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の単量体と
を含み、
各単量体が、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドの結合を介してオリゴマー化可能であり、
リガンド誘導オリゴマー化が、前記ＩＴＦを形成し、
前記ＤＮＡ結合ドメインが、モジュラー式でありかつ６つのＺＦモチーフのアレイを含むジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、
前記同族リガンドが、ラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、及びそれらの類似体からなる群から選択され、
任意選択で、前記ＩＴＦが、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができる、
操作された細胞。
[本発明１００４]
ａ．前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、ＦＫＢＰドメインを含み、前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの他方が、ＦＲＢドメインを含み、
任意選択で、前記ＦＫＢＰが、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記ＦＲＢドメインが、配列番号６１のアミノ酸配列を含む、又は
ｂ．前記第１のリガンド結合ドメインが、前記ＦＫＢＰドメインを含み、前記第２のリガンド結合ドメインが、前記ＦＲＢドメインを含み、
任意選択で、前記ＦＫＢＰが、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記ＦＲＢドメインが、配列番号６１のアミノ酸配列を含む、又は
ｃ．前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、前記ＦＲＢドメインを含み、前記第１若しくは前記第２のリガンド結合ドメインのうちの他方が、前記ＦＫＢＰドメインを含み、
任意選択で、前記ＦＫＢＰが、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記ＦＲＢドメインが、配列番号６１のアミノ酸配列を含む、又は
ｄ．前記第１のリガンド結合ドメインが、前記ＦＲＢドメインを含み、前記第２のリガンド結合ドメインが、前記ＦＫＢＰドメインを含み、
任意選択で、前記ＦＫＢＰが、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記ＦＲＢドメインが、配列番号６１のアミノ酸配列を含む、
本発明１００３の操作された細胞。
[本発明１００５]
ａ．前記第１の単量体及び／又は前記第２の単量体が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含み、
任意選択で、前記ＮＬＳが、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／又は
ｂ．前記第２の単量体が、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を更に含み、
任意選択で、前記ＮＥＳが、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
本発明１００１～１００４のいずれかの操作された細胞。
[本発明１００６]
誘導性転写因子（ＩＴＦ）を含む操作された細胞であって、
前記ＩＴＦが、ＤＮＡ結合ドメイン、転写エフェクタードメイン、及びリガンド結合ドメインを含み、
前記ＩＴＦが、前記リガンド結合ドメインの同族リガンドとの結合時に核局在化を受け、
細胞核に局在化された場合に、前記ＩＴＦが、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができ、
前記同族リガンドが、ミフェプリストン若しくはその誘導体であり、
任意選択で、前記リガンド結合ドメインが、プロゲステロン受容体ドメインを含み、前記プロゲステロン受容体ドメインが、配列番号６８のアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、
任意選択で、前記ＩＴＦが、前記ＤＮＡ結合ドメインと前記転写エフェクタードメインとの間にペプチドリンカーを更に含み、
任意選択で、前記ＤＮＡ結合ドメインが、前記ＩＴＦ応答性プロモーターに結合し、
任意選択で、前記細胞が、前記目的の遺伝子をコードする外因性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された前記ＩＴＦ応答性プロモーターを含む発現カセットを更に含み、
任意選択で、前記ＩＴＦ応答性プロモーターが、ＩＴＦ結合ドメイン配列及びコアプロモーター配列を含み、
任意選択で、前記コアプロモーター配列が、最小プロモーターを含み、前記最小プロモーターが、ｍｉｎＰ、ｍｉｎＣＭＶ、ＹＢ＿ＴＡＴＡ、ｍｉｎＴＡＴＡ、及びｍｉｎＴＫからなる群から選択される、又は前記コアプロモーター配列が、構成的プロモーターに由来し、前記コアプロモーター配列が、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターに由来する、
操作された細胞。
[本発明１００７]
ａ．前記ＺＦタンパク質ドメインが、モジュラー設計であり、１つ以上のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）から構成され、
ｂ．前記ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のジンクフィンガーモチーフのアレイを含み、かつ／又は
ｃ．前記ＺＦタンパク質ドメインが、６つのジンクフィンガーモチーフのアレイを含む、
本発明１００１～１００６のいずれかの操作された細胞。
[本発明１００８]
ａ．前記転写エフェクタードメインが、転写活性化ドメインを含み、
任意選択で、前記転写活性化ドメインが、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化ドメイン；ＶＰ１６の４つのタンデムコピーを含む活性化ドメイン；ＶＰ６４活性化ドメイン；ＮＦκＢのｐ６５活性化ドメイン；エプスタイン－バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）活性化ドメイン；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ活性化ドメイン（ＶＰＲ活性化ドメイン）を含む三者活性化因子；及びヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメイン（ｐ３００ ＨＡＴコア活性化ドメイン）からなる群から選択される、又は
ｂ．前記転写エフェクタードメインが、転写リプレッサードメインを含み、
任意選択で、前記転写リプレッサードメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；短縮型クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）リプレッサードメイン；スクレラキシス（ＳＣＸ）ＨＬＨドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ１）ＨＬＨドメインの阻害剤、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン含有タンパク質２（ＨＥＲＣ２）Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＳＴ１）ＨＬＨドメイン、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．２（ＮＫＸ２２）ホメオドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ３）ＨＬＨドメインの阻害剤、並びにツイスト関連タンパク質２（ＴＷＳＴ２）ＨＬＨドメイン、並びにＥＥＤリプレッサードメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；ヘアリー関連塩基性ヘリックスループヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（前記モチーフがＷＲＰＷ抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；並びにＨＰ１アルファクロモシャドウ抑制ドメインからなる群から選択される、
本発明１００１～１００７のいずれかの操作された細胞。
[本発明１００９]
以下：
第１のプロモーターと、第１の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第１の発現カセットであって、前記第１の単量体が、ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の発現カセットと、
第２のプロモーターと、第２の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第２の発現カセットであって、前記第２の単量体が、転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の発現カセットと
を含む発現系であって、
各単量体が、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドを介してオリゴマー化可能であり、
前記第１及び前記第２の単量体のリガンド誘導オリゴマー化が、誘導性転写因子（ＩＴＦ）を形成し、
前記同族リガンドが、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択され、
任意選択で、前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、
任意選択で、前記ＺＦタンパク質ドメインが、モジュラー設計であり、かつ１つ以上のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）から構成され、
任意選択で、前記ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のジンクフィンガーモチーフのアレイを含み、
任意選択で、前記発現系が、目的の遺伝子に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む第３の発現カセットを更に含み、前記ＩＴＦ応答性プロモーターが、コアプロモーター配列と、第１の操作されたポリペプチドの前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列とを含む、
発現系。
[本発明１０１０]
以下：
第１のプロモーターと、第１の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第１の発現カセットであって、前記第１の単量体が、ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の発現カセットと、
第２のプロモーターと、第２の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第２の発現カセットであって、前記第２の単量体が、転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の発現カセットと
を含む発現系であって、
各単量体が、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドの結合を介してオリゴマー化可能であり、
前記第１及び前記第２の単量体のリガンド誘導オリゴマー化が、誘導性転写因子（ＩＴＦ）を形成し、
前記ＤＮＡ結合ドメインが、モジュラー式でありかつ１０個のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）を含むジンクフィンガータンパク質ドメインを含み、
前記同族リガンドが、ラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、及びそれらの類似体からなる群から選択され、
任意選択で、各リガンド結合ドメインが、ＦＫＢＰドメイン又はＦＲＢドメインを含み、
任意選択で、前記第１の単量体及び／又は前記第２の単量体が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含み、
任意選択で、前記第２の単量体が、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を更に含み、
任意選択で、前記ＩＴＦが、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができ、
任意選択で、前記発現系が、目的の遺伝子に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む第３の発現カセットを更に含み、前記第３のプロモーターが、コアプロモーター配列と、第１の操作されたポリペプチドの前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列とを含む、
発現系。
[本発明１０１１]
第１のプロモーターと、誘導性転写因子（ＩＴＦ）をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第１の発現カセット
を含む発現系であって、
前記ＩＴＦが、ＤＮＡ結合ドメイン、転写エフェクタードメイン、及びリガンド結合ドメインを含み、
前記ＩＴＦが、前記リガンド結合ドメインの同族リガンドとの結合時に核局在化を受け、
細胞核に局在化された場合に、前記ＩＴＦが、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができ、
前記同族リガンドが、ミフェプリストン又はその誘導体であり、
任意選択で、前記リガンド結合ドメインが、プロゲステロン受容体ドメインを含み、
任意選択で、前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、
任意選択で、前記ＺＦタンパク質ドメインが、モジュラー設計であり、１つ以上のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）から構成され、
任意選択で、前記ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のジンクフィンガーモチーフを含み、
任意選択で、前記ＩＴＦが、前記ＤＮＡ結合ドメインと前記転写エフェクタードメインとの間に局在化されたリンカーを更に含み、
任意選択で、前記発現系が、前記目的の遺伝子をコードする外因性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された前記ＩＴＦ応答性プロモーターを含む発現カセットを更に含む、
発現系。
[本発明１０１２]
本発明１００９～１０１１のいずれかの発現系を含む、操作された細胞。
[本発明１０１３]
ａ．ヒト細胞を含む、かつ／又は
ｂ．幹細胞を含む、かつ／又は
ｃ．免疫細胞を含む、かつ／又は
ｄ．Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及びｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択される、
本発明１００１～１００８、又は１０１２のいずれかの操作された細胞。
[本発明１０１４]
目的の遺伝子の転写を調節するための遺伝子スイッチであって、以下：
ａ．本発明１００１、１００２、１００５、１００８、１００９、１０１２、若しくは１０１３のいずれかの操作された細胞、並びに誘導性転写因子（ＩＴＦ）の形成を誘導するために、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択される同族リガンド、又は
ｂ．本発明１００３～１００５、１００８、１００９、１０１２、若しくは１０１３のいずれかの操作された細胞、並びにラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、及びそれらの類似体からなる群から選択される同族リガンド、又は
ｃ．本発明１００６～１００９、１０１２、若しくは１０１３のいずれかの操作された細胞、及びミフェプリストン、若しくはその誘導体
を含む、遺伝子スイッチ。
[本発明１０１５]
目的の遺伝子の転写を調節する方法であって、以下：
ａ．誘導性転写因子（ＩＴＦ）の形成を誘導するために、本発明１００１、１００２、１００５、１００８、１００９、１０１２、又は１０１３のいずれかの操作された細胞を、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択される同族リガンドと接触させる工程であって、
任意選択で、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写を前記ＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、前記操作された細胞を培養する工程を更に含み、
任意選択で、前記接触させる工程が、ヒト若しくは動物において行われ、
任意選択で、形質転換された細胞を前記同族リガンドと接触させる工程が、前記同族リガンドの薬理学的用量を前記ヒト若しくは動物に投与することを含む、工程、又は
ｂ．誘導性転写因子（ＩＴＦ）の形成を誘導するために、本発明１００３～１００５、１００８、１００９、１０１２、若しくは１０１３のいずれかの操作された細胞を、ラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、及びそれらの類似体からなる群から選択される同族リガンドと接触させる工程であって、
任意選択で、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写を前記ＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、前記操作された細胞を培養する工程を更に含み、
任意選択で、前記操作された細胞が、ヒト若しくは動物中にあり、前記操作された細胞を前記同族リガンドと接触させる工程が、前記ラパマイシンの薬理学的用量を前記ヒト若しくは動物に投与することを含み、
任意選択で、前記第２の単量体の転写エフェクタードメインが、転写活性化ドメインを含み、転写を調節することが、前記目的の遺伝子の転写を活性化することを含むか、若しくは前記第２の単量体の前記転写エフェクタードメインが、転写リプレッサードメインを含み、転写を調節することが、前記目的の遺伝子の転写を抑制することを含む、工程、又は
ｃ．前記誘導性転写因子（ＩＴＦ）の核局在化を誘導するために、本発明１００６～１００９、１０１２、若しくは１０１３のいずれかの操作された細胞を、ミフェプリストン、若しくはその誘導体と接触させる工程であって、
任意選択で、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写を前記ＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、前記操作された細胞を培養する工程を更に含み、
任意選択で、前記操作された細胞が、ヒト若しくは動物中にあり、前記操作された細胞を前記ミフェプリストンと接触させる工程が、前記ミフェプリストンの薬理学的用量を前記ヒト若しくは動物に投与することを含み、
任意選択で、前記転写エフェクタードメインが、転写活性化ドメインを含み、転写を調節することが、前記目的の遺伝子の転写を活性化することを含むか、若しくは前記転写エフェクタードメインが、転写リプレッサードメインを含み、転写を調節することが、前記目的の遺伝子の転写を抑制することを含む、工程
を含む、方法。

【手続補正6】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１４３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0143】

転写エフェクタードメインは、転写リプレッサードメインを含み得る。本明細書で使用される場合、「転写リプレッサードメイン」は、遺伝子のプロモーター領域を標的とするとき、遺伝子の転写のレベルを阻害又は減少させることができるポリペプチドドメインを指す。転写リプレッサーの例としては、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）リプレッサードメイン；スクレラキシス（ＳＣＸ）ＨＬＨドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ１）ＨＬＨドメインの阻害剤、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン含有タンパク質２（ＨＥＲＣ２）Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＳＴ１）ＨＬＨドメイン、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．２（ＮＫＸ２２）ホメオドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ３）ＨＬＨドメインの阻害剤、及びツイスト関連タンパク質２（ＴＷＳＴ２）ＨＬＨドメイン、ＥＥＤリプレッサードメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；ヘアリー関連塩基性ヘリックスループヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（配列番号７６）（モチーフがＷＲＰＷ（配列番号７６）抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；並びにＨＰ１アルファクロモシャドウ抑制ドメインが挙げられる。

【手続補正7】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１７８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0178】

いくつかの実施形態では、カフェイン、カンナビノイド、又はニコチンによって誘導可能なＩＴＦの転写エフェクタードメインは、転写リプレッサードメインである。いくつかの実施形態では、転写リプレッサードメインは、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；短縮型クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）リプレッサードメイン；スクレラキシス（ＳＣＸ）ＨＬＨドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ１）ＨＬＨドメインの阻害剤、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン含有タンパク質２（ＨＥＲＣ２）Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＳＴ１）ＨＬＨドメイン、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．２（ＮＫＸ２２）ホメオドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ３）ＨＬＨドメインの阻害剤、並びにツイスト関連タンパク質２（ＴＷＳＴ２）ＨＬＨドメイン、並びにＥＥＤリプレッサードメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；ヘアリー関連塩基性ヘリックスループヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（配列番号７６）（モチーフがＷＲＰＷ（配列番号７６）抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；並びにＨＰ１アルファクロモシャドウ抑制ドメインから選択される。

【手続補正8】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１９４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0194】

いくつかの実施形態では、ミフェプリストン－ＩＴＦの転写エフェクタードメインは、転写リプレッサードメインである。いくつかの実施形態では、転写リプレッサードメインは、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；短縮型クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）リプレッサードメイン；スクレラキシス（ＳＣＸ）ＨＬＨドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ１）ＨＬＨドメインの阻害剤、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン含有タンパク質２（ＨＥＲＣ２）Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＳＴ１）ＨＬＨドメイン、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．２（ＮＫＸ２２）ホメオドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ３）ＨＬＨドメインの阻害剤、並びにツイスト関連タンパク質２（ＴＷＳＴ２）ＨＬＨドメイン、並びにＥＥＤリプレッサードメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；ヘアリー関連塩基性ヘリックスループヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（配列番号７６）（モチーフがＷＲＰＷ（配列番号７６）抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；並びにＨＰ１アルファクロモシャドウ抑制ドメインから選択される。

【手続補正9】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２１７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0217】

いくつかの実施形態では、ラパマイシン－ＩＴＦの転写エフェクタードメインは、転写リプレッサードメインである。いくつかの実施形態では、転写リプレッサードメインは、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；短縮型クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）リプレッサードメイン；スクレラキシス（ＳＣＸ）ＨＬＨドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ１）ＨＬＨドメインの阻害剤、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン含有タンパク質２（ＨＥＲＣ２）Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＳＴ１）ＨＬＨドメイン、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．２（ＮＫＸ２２）ホメオドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ３）ＨＬＨドメインの阻害剤、並びにツイスト関連タンパク質２（ＴＷＳＴ２）ＨＬＨドメイン、並びにＥＥＤリプレッサードメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；ヘアリー関連塩基性ヘリックスループヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（配列番号７６）（モチーフがＷＲＰＷ（配列番号７６）抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；並びにＨＰ１アルファクロモシャドウ抑制ドメインから選択される。

【手続補正10】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０３５０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0350】

列挙される実施形態
１．
誘導性転写因子（ＩＴＦ）を含む操作された細胞であって、
ＩＴＦが、
ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の単量体と、
転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の単量体と
を含み、
各単量体が、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドを介してオリゴマー化可能であり、
リガンド誘導オリゴマー化が、ＩＴＦを形成し、
同族リガンドが、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択される、
操作された細胞。
２．
ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含む、実施形態１に記載の操作された細胞。
３．
ＺＦタンパク質ドメインが、モジュラー設計であり、１つ以上のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）から構成される、実施形態２に記載の操作された細胞。
４．
ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のジンクフィンガーモチーフのアレイを含む、実施形態３に記載の操作された細胞。
５．
ＺＦタンパク質ドメインが、６つのジンクフィンガーモチーフのアレイを含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載の操作された細胞。
６．
各リガンド結合ドメインが、単一ドメイン抗体を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載の操作された細胞。
７．
単一ドメイン抗体が、Ｖ_ＨＨを含む、実施形態６に記載の操作された細胞。
８．
Ｖ_ＨＨが、抗カフェインＶ_ＨＨ（ａｃ Ｖ_ＨＨ）である、実施形態７に記載の操作された細胞。
９．
抗カフェインＶ_ＨＨ（ａｃ Ｖ_ＨＨ）が、配列番号５２のアミノ酸配列を含む、実施形態８に記載の操作された細胞。
１０．
第１のリガンド結合ドメイン及び第２のリガンド結合ドメインの各々が、ａｃ Ｖ_ＨＨを含む、実施形態８又は実施形態９に記載の操作された細胞。
１１．
同族リガンドが、カンナビジオール又はフィトカンナビノイドであり、Ｖ_ＨＨが、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７（それぞれ、ＣＡ－１４、ＤＢ－６、ＤＢ－１１、ＤＢ－１８、及びＤＢ－２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態７に記載の操作された細胞。
１２．
第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、第１若しくは第２の結合ドメインのうちの他方が、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７（それぞれ、ＤＢ－６、ＤＢ－１１、ＤＢ－１８、及びＤＢ－２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含む、実施形態１２に記載の操作された細胞。
１３．
第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、第１又は第２の結合ドメインのうちの他方が、配列番号５７（ＤＢ－２１）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含む、実施形態１２に記載の操作された細胞。
１４．
各リガンド結合ドメインが、抗ニコチン抗体重鎖可変ドメイン（抗Ｎｉｃ ＶＨ）又は抗ニコチン抗体軽鎖可変ドメイン（抗Ｎｉｃ ＶＬ）を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１５．
抗Ｎｉｃ ＶＨが、配列番号５８のアミノ酸配列を含む、実施形態１４に記載の操作された細胞。
１６．
抗Ｎｉｃ ＶＬが、配列番号５９のアミノ酸配列を含む、実施形態１４又は実施形態１５に記載の操作された細胞。
１７．
第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、抗Ｎｉｃ ＶＨを含み、第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの他方が、抗Ｎｉｃ ＶＬを含む、実施形態１４～１６のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１８．
誘導性転写因子（ＩＴＦ）を含む操作された細胞であって、
ＩＴＦが、
ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の単量体と、
転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の単量体と
を含み、
各単量体が、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドの結合を介してオリゴマー化可能であり、
リガンド誘導オリゴマー化が、ＩＴＦを形成し、
ＤＮＡ結合ドメインが、モジュラー式でありかつ６つのＺＦモチーフのアレイを含むジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、
同族リガンドが、ラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、及びそれらの類似体からなる群から選択される、
操作された細胞。
１９．
第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、ＦＫＢＰドメインを含み、第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの他方が、ＦＲＢドメインを含む、実施形態１８に記載の操作された細胞。
２０．
ＦＫＢＰが、配列番号６０のアミノ酸配列を含む、実施形態１９に記載の操作された細胞。
２１．
ＦＲＢドメインが、配列番号６１のアミノ酸配列を含む、実施形態１９又は実施形態２０に記載の操作された細胞。
２２．
第１のリガンド結合ドメインが、ＦＫＢＰドメインを含み、第２のリガンド結合ドメインが、ＦＲＢドメインを含む、実施形態１９～２１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
２３．
第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの一方が、ＦＲＢドメインを含み、第１又は第２のリガンド結合ドメインのうちの他方が、ＦＫＢＰドメインを含む、実施形態１９～２２のいずれか１つに記載の操作された細胞。
２４．
第１の単量体及び／又は第２の単量体が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の操作された細胞。
２５．
ＮＬＳが、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態２４に記載の操作された細胞。
２６．
第２の単量体が、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を更に含む、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の操作された細胞。
２７．
ＮＥＳが、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態２６に記載の操作された細胞。
２８．
ＩＴＦが、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができる、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の操作された細胞。
２９．
以下：
第１のプロモーターと、第１の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第１の発現カセットであって、第１の単量体が、ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の発現カセットと、
第２のプロモーターと第２の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第２の発現カセットであって、第２の単量体が、転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の発現カセットと
を含む発現系であって、
各単量体が、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドを介してオリゴマー化可能であり、
第１及び第２の単量体のリガンド誘導オリゴマー化が、誘導性転写因子（ＩＴＦ）を形成し、
同族リガンドが、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択される、
発現系。
３０．
ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含む、実施形態２９に記載の発現系。
３１．
ＺＦタンパク質ドメインが、モジュラー設計であり、かつ１つ以上のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）から構成される、実施形態３０に記載の発現系。
３２．
ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のジンクフィンガーモチーフのアレイを含む、実施形態３１に記載の発現系。
３３．
ＺＦタンパク質ドメインが、６つのジンクフィンガーモチーフのアレイを含む、実施形態２９～３２のいずれか１つに記載の発現系。
３４．
各リガンド結合ドメインが、単一ドメイン抗体を含む、実施形態２９～３３のいずれか１つに記載の発現系。
３５．
単一ドメイン抗体が、Ｖ_ＨＨを含む、実施形態３４に記載の発現系。
３６．
Ｖ_ＨＨが、抗カフェインＶ_ＨＨ（ａｃ Ｖ_ＨＨ）である、実施形態３５に記載の発現系。
３７．
抗カフェインＶ_ＨＨ（ａｃＶ_ＨＨ）が、配列番号５２のアミノ酸配列を含む、実施形態３６に記載の発現系。
３８．
第１のリガンド結合ドメイン及び第２のリガンド結合ドメインの各々が、ａｃ Ｖ_ＨＨを含む、実施形態３６又は実施形態３７に記載の発現系。
３９．
第１の単量体及び第２の単量体が、カフェインに結合するとホモ二量体を形成することができる、実施形態３８に記載の発現系。
４０．
同族リガンドが、カンナビジオール又はフィトカンナビノイドであり、Ｖ_ＨＨが、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び５７（それぞれ、ＣＡ１４、ＤＢ６、ＤＢ１１、ＤＢ１８、及びＤＢ２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３５に記載の発現系。
４１．
第１のリガンド結合ドメインが、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、第２の結合ドメインが、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び５７（それぞれ、ＤＢ６、ＤＢ１１、ＤＢ１８、及びＤＢ２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含む、実施形態４０に記載の発現系。
４２．
第１のリガンド結合ドメインが、配列番号５３（ＣＡ－１４）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含み、第２の結合ドメインが、配列番号５７（ＤＢ－２１）のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＨを含む、実施形態４０に記載の発現系。
４３．
第１の単量体及び第２の単量体が、カンナビジオール又はフィトカンナビノイドに結合するとヘテロ二量体を形成することができる、実施形態４０～４２のいずれか１つに記載の発現系。
４４．
各リガンド結合ドメインが、抗ニコチン抗体重鎖可変ドメイン（抗Ｎｉｃ ＶＨ）又は抗ニコチン抗体軽鎖可変ドメイン（抗Ｎｉｃ ＶＬ）を含む、実施形態２９～３３のいずれか１つに記載の操作された発現系。
４５．
抗Ｎｉｃ ＶＨが、配列番号５８のアミノ酸配列を含む、実施形態４４に記載の発現系。
４６．
抗Ｎｉｃ ＶＬが、配列番号５９のアミノ酸配列を含む、実施形態４４又は４５に記載の発現系。
４７．
第１のリガンド結合ドメインが、抗Ｎｉｃ ＶＨを含み、第２の結合ドメインが、抗Ｎｉｃ ＶＬを含む、実施形態４４～４６のいずれか１つに記載の発現系。
４８．
第１のリガンド結合ドメインが、抗Ｎｉｃ ＶＬを含み、第２のリガンド結合ドメインが、抗Ｎｉｃ ＶＨを含む、実施形態４４～４６のいずれか１つに記載の発現系。
４９．
第１の単量体及び第２の単量体が、ニコチンに結合するとヘテロ二量体を形成することができる、実施形態４４～４８のいずれか１つに記載の発現系。
５０．
目的の遺伝子に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む第３の発現カセットを更に含み、ＩＴＦ応答性プロモーターが、コアプロモーター配列と第１の操作されたポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインに結合する配列とを含む、実施形態２９～４９のいずれか１つに記載の発現系。
５１．
コアプロモーター配列が、最小プロモーターを含む、実施形態５０に記載の発現系。
５２．
ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列が、１つ以上のＺＦ結合部位を含む、実施形態５０又は実施形態５１に記載の発現系。
５３．
ＺＦタンパク質ドメインが、６つのジンクフィンガーモチーフのアレイを含み、ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列が、６つのジンクフィンガーモチーフに対して少なくとも１つの結合部位を含む、実施形態５２に記載の発現系。
５４．
以下：
第１のプロモーターと、第１の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第１の発現カセットであって、第１の単量体が、ＤＮＡ結合ドメイン及び第１のリガンド結合ドメインを含む、第１の発現カセットと、
第２のプロモーターと、第２の単量体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第２の発現カセットであって、第２の単量体が、転写エフェクタードメイン及び第２のリガンド結合ドメインを含む、第２の発現カセットと
を含む発現系であって、
各単量体が、各リガンド結合ドメインに結合する同族リガンドの結合を介してオリゴマー化可能であり、
第１及び第２の単量体のリガンド誘導オリゴマー化が、誘導性転写因子（ＩＴＦ）を形成し、
ＤＮＡ結合ドメインが、モジュラー式でありかつ１０個のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）を含むジンクフィンガータンパク質ドメインを含み、
同族リガンドが、ラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、及びそれらの類似体からなる群から選択される、
発現系。
５５．
各リガンド結合ドメインが、ＦＫＢＰドメイン又はＦＲＢドメインを含む、実施形態５４に記載の発現系。
５６．
ＦＫＢＰが、配列番号６０のアミノ酸配列を含む、実施形態５５に記載の発現系。
５７．
ＦＲＢドメインが、配列番号６１のアミノ酸配列を含む、実施形態５５又は実施形態５６に記載の発現系。
５８．
第１のリガンド結合ドメインが、ＦＫＢＰドメインを含み、第２のリガンド結合ドメインが、ＦＲＢドメインを含む、実施形態５５～５７のいずれか１つに記載の発現系。
５９．
第１のリガンド結合ドメインが、ＦＲＢドメインを含み、第２のリガンド結合ドメインが、ＦＫＢＰドメインを含む、実施形態５５～５７のいずれか１つに記載の発現系。
６０．
第１の単量体及び第２の単量体が、ラパマイシン、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、ＦＫ１０１２、それらの誘導体、又はそれらの類似体からなる群から選択されるリガンドに結合するとヘテロ二量体を形成することができる、実施形態５５～５９のいずれか１つに記載の発現系。
６１．
第１の単量体及び／又は第２の単量体が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、実施形態２９～６０のいずれか１つに記載の発現系。
６２．
ＮＬＳが、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態６１に記載の発現系。
６３．
第２の単量体が、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を更に含む、実施形態２９～６２のいずれか１つに記載の発現系。
６４．
ＮＥＳが、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態６３に記載の発現系。
６５．
ＩＴＦが、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができる、実施形態２９～６４のいずれか１つに記載の発現系。
６６．
第１及び／又は第２のプロモーターが、構成的プロモーター又は調節可能プロモーターである、実施形態２９～６５のいずれか１つに記載の発現系。
６７．
第１及び／又は第２のプロモーターが、合成プロモーターである、実施形態２９～６６のいずれか１つに記載の発現系。
６８．
第１のプロモーター及び／又は第２のプロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａＶ１、ｈＣＡＧＧ、ｈＥＦ１ａＶ２、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターである、実施形態２９～６５のいずれか１つに記載の発現系。
６９．
目的の遺伝子に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む第３の発現カセットを更に含み、第３のプロモーターが、コアプロモーター配列と第１の操作されたポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインに結合する配列とを含む、実施形態２９～６８のいずれか１つに記載の発現系。
７０．
コアプロモーター配列が、最小プロモーターを含む、実施形態６９に記載の発現系。
７１．
最小プロモーターが、ｍｉｎＰ、ｍｉｎＣＭＶ、ＹＢ＿ＴＡＴＡ、ｍｉｎＴＡＴＡ、及びｍｉｎＴＫからなる群から選択される、実施形態７０に記載の発現系。
７２．
コアプロモーター配列が、構成的プロモーターに由来する、実施形態６９に記載の発現系。
７３．
コアプロモーター配列が、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターに由来する、実施形態７２に記載の発現系。
７４．
転写エフェクタードメインが、転写活性化ドメインを含む、実施形態２９～７３のいずれか１つに記載の発現系。
７５．
転写活性化ドメインが、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化ドメイン；ＶＰ１６の４つのタンデムコピーを含む活性化ドメイン；ＶＰ６４活性化ドメイン；ＮＦκＢのｐ６５活性化ドメイン；エプスタイン－バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）活性化ドメイン；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ活性化ドメイン（ＶＰＲ活性化ドメイン）を含む三者活性化因子；及びヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメイン（ｐ３００ ＨＡＴコア活性化ドメイン）からなる群から選択される、実施形態７４に記載の発現系。
７６．
転写エフェクタードメインが、転写リプレッサードメインを含む、実施形態２９～７３のいずれか１つに記載の発現系。
７７．
転写リプレッサードメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）リプレッサードメイン；スクレラキシス（ＳＣＸ）ＨＬＨドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ１）ＨＬＨドメインの阻害剤、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン含有タンパク質２（ＨＥＲＣ２）Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＳＴ１）ＨＬＨドメイン、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．２（ＮＫＸ２２）ホメオドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ３）ＨＬＨドメインの阻害剤、及びツイスト関連タンパク質２（ＴＷＳＴ２）ＨＬＨドメイン、ＥＥＤリプレッサードメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；ヘアリー関連塩基性ヘリックスループヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（配列番号７６）（モチーフがＷＲＰＷ（配列番号７６）抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；並びにＨＰ１アルファクロモシャドウ抑制ドメインからなる群から選択される、実施形態７６に記載の発現系。
７８．
ＤＮＡ結合ドメインが、ＩＴＦ応答性プロモーターに結合する、実施形態２９～７７のいずれか１つに記載の発現系。
７９．
実施形態２９～５３のいずれか１つに記載の発現系を含む、操作された細胞。
８０．
実施形態５４～７０のいずれか１つに記載の発現系を含む、操作された細胞。
８１．
ヒト細胞を含む、実施形態１～２８、７９、又は８０のいずれか１つに記載の操作された細胞。
８２．
幹細胞を含む、実施形態１～２８又は７９～８１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
８３．
免疫細胞を含む、実施形態１～２８又は７９～８１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
８４．
Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及びｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択される、実施形態１～２８又は７９～８１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
８５．
目的の遺伝子の転写を調節するための遺伝子スイッチであって、
実施形態８～１０のいずれか１つに記載の操作された細胞と、
有効量のカフェインと
を含む、遺伝子スイッチ。
８６．
目的の遺伝子の転写を調節するための遺伝子スイッチであって、
実施形態１１～１３のいずれか１つに記載の操作された細胞と、
有効量のカンナビジオール（ＣＢＤ）又はフィトカンナビノイドと
を含む、遺伝子スイッチ。
８７．
目的の遺伝子の転写を調節するための遺伝子スイッチであって、
実施形態１４～１７のいずれか１つに記載の操作された細胞と、
有効量のニコチンと
を含む、遺伝子スイッチ。
８８．
目的の遺伝子の転写を調節するための遺伝子スイッチであって、
実施形態１８～２３のいずれか１つに記載の操作された細胞と、
有効量のラパマイシンと
を含む、遺伝子スイッチ。
８９．
目的の遺伝子の転写を調節する方法であって、
誘導性転写因子（ＩＴＦ）の形成を誘導するために、実施形態８１に記載の操作された細胞を、カフェイン、カンナビジオール（ＣＢＤ）、フィトカンナビノイド、及びニコチンからなる群から選択される同族リガンドと接触させる工程
を含む、方法。
９０．
ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写をＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、操作された細胞を培養する工程
を更に含む、実施形態８９に記載の方法。
９１．
接触させる工程が、ヒト又は動物において行われる、実施形態８９に記載の方法。
９２．
形質転換された細胞を同族リガンドと接触させる工程が、同族リガンドの薬理学的用量をヒト又は動物に投与することを含む、実施形態９１に記載の方法。
９３．
同族リガンドが、カフェインを含む、実施形態８９～９２のいずれか１つに記載の方法。
９４．
同族リガンドが、カンナビジオール（ＣＢＤ）である、実施形態８９～９２のいずれか１つに記載の方法。
９５．
同族リガンドが、ニコチンである、実施形態８９～９２のいずれか１つに記載の方法。
９６．
目的の遺伝子の転写を調節する方法であって、
誘導性転写因子（ＩＴＦ）の形成を誘導するために、実施形態８０に記載の操作された細胞をラパマイシンと接触させる工程
を含む、方法。
９７．
ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写をＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、操作された細胞を培養する工程
を更に含む、実施形態９６に記載の方法。
９８．
操作された細胞が、ヒト又は動物中にあり、操作された細胞を同族リガンドと接触させる工程が、ラパマイシンの薬理学的用量をヒト又は動物に投与することを含む、実施形態９６に記載の方法。
９９．
第２の単量体の転写エフェクタードメインが、転写活性化ドメインを含み、転写を調節することが、目的の遺伝子の転写を活性化することを含む、実施形態９６～９８のいずれか１つに記載の方法。
１００．
第２の単量体の転写エフェクタードメインが、転写リプレッサードメインを含み、転写を調節することが、目的の遺伝子の転写を抑制することを含む、実施形態９６～９９のいずれか１つに記載の方法。
１０１．
誘導性転写因子（ＩＴＦ）を含む操作された細胞であって、
ＩＴＦが、ＤＮＡ結合ドメイン、転写エフェクタードメイン、及びリガンド結合ドメインを含み、
ＩＴＦが、リガンド結合ドメインの同族リガンドとの結合時に核局在化を受け、
細胞核に局在化された場合に、ＩＴＦが、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができ、
同族リガンドが、ミフェプリストン又はその誘導体である、
操作された細胞。
１０２．
リガンド結合ドメインが、プロゲステロン受容体ドメインを含む、実施形態１０１に記載の操作された細胞。
１０３．
プロゲステロン受容体ドメインが、配列番号６８のアミノ酸配列を含む、実施形態１０２に記載の操作された細胞。
１０４．
ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含む、実施形態１０１～１０３のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１０５．
ＺＦタンパク質ドメインが、モジュラー設計であり、１つ以上のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）から構成される、実施形態１０４に記載の操作された細胞。
１０６．
ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のジンクフィンガーモチーフを含む、実施形態１０５に記載の操作された細胞。
１０７．
ＺＦタンパク質ドメインが、６つのジンクフィンガーモチーフを含む、実施形態１０４～１０６のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１０８．
ＩＴＦが、ＤＮＡ結合ドメインと転写エフェクタードメインとの間にペプチドリンカーを更に含む、実施形態１０１～１０７のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１０９．
ＤＮＡ結合ドメインが、ＩＴＦ応答性プロモーターに結合する、実施形態１０１～１０８のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１１０．
ＩＴＦ応答性プロモーターが、ＩＴＦ結合ドメイン配列及びコアプロモーター配列を含む、実施形態１０１～１０９のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１１１．
コアプロモーター配列が、最小プロモーターを含む、実施形態１１０に記載の操作された細胞。
１１２．
最小プロモーターが、ｍｉｎＰ、ｍｉｎＣＭＶ、ＹＢ＿ＴＡＴＡ、ｍｉｎＴＡＴＡ、及びｍｉｎＴＫからなる群から選択される、実施形態１１１に記載の操作された細胞。
１１３．
コアプロモーター配列が、構成的プロモーターに由来する、実施形態１１０に記載の操作された細胞。
１１４．
コアプロモーター配列が、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターに由来する、実施形態１１３に記載の操作された細胞。
１１５．
目的の遺伝子をコードする外因性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む発現カセット
を更に含む、実施形態１０１～１１４のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１１６．
転写エフェクタードメインが、転写活性化ドメインを含む、実施形態１０１～１１５のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１１７．
転写活性化ドメインが、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化ドメイン；ＶＰ１６の４つのタンデムコピーを含む活性化ドメイン；ＶＰ６４活性化ドメイン；ＮＦκＢのｐ６５活性化ドメイン；エプスタイン－バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）活性化ドメイン；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ活性化ドメイン（ＶＰＲ活性化ドメイン）を含む三者活性化因子；及びヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメイン（ｐ３００ ＨＡＴコア活性化ドメイン）からなる群から選択される、実施形態１１６に記載の操作された細胞。
１１８．
転写エフェクタードメインが、転写リプレッサードメインを含む、実施形態１０１～１１５のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１１９．
転写リプレッサードメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；短縮型クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）リプレッサードメイン；スクレラキシス（ＳＣＸ）ＨＬＨドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ１）ＨＬＨドメインの阻害剤、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン含有タンパク質２（ＨＥＲＣ２）Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＳＴ１）ＨＬＨドメイン、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．２（ＮＫＸ２２）ホメオドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ３）ＨＬＨドメインの阻害剤、並びにツイスト関連タンパク質２（ＴＷＳＴ２）ＨＬＨドメイン、並びにＥＥＤリプレッサードメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；ヘアリー関連塩基性ヘリックスループヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（配列番号７６）（モチーフがＷＲＰＷ（配列番号７６）抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；並びにＨＰ１アルファクロモシャドウ抑制ドメインからなる群から選択される、実施形態１１８に記載の操作された細胞。
１２０．
第１のプロモーターと、誘導性転写因子（ＩＴＦ）をコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、を含む第１の発現カセット
を含む発現系であって、
ＩＴＦが、ＤＮＡ結合ドメイン、転写エフェクタードメイン、及びリガンド結合ドメインを含み、
ＩＴＦが、リガンド結合ドメインの同族リガンドとの結合時に核局在化を受け、
細胞核に局在化された場合に、ＩＴＦが、ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子の転写を調節することができ、
同族リガンドが、ミフェプリストン又はその誘導体である、
発現系。
１２１．
リガンド結合ドメインが、プロゲステロン受容体ドメインを含む、実施形態１２０に記載の発現系。
１２２．
プロゲステロン受容体ドメインが、配列番号６８のアミノ酸配列を含む、実施形態１２１に記載の発現系。
１２３．
ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含む、実施形態１２０～１２２のいずれか１つに記載の発現系。
１２４．
ＺＦタンパク質ドメインが、モジュラー設計であり、１つ以上のジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）から構成される、実施形態１２３に記載の発現系。
１２５．
ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のジンクフィンガーモチーフを含む、実施形態１２４に記載の発現系。
１２６．
ＺＦタンパク質ドメインが、６つのジンクフィンガーモチーフを含む、実施形態１２０～１２５のいずれか１つに記載の発現系。
１２７．
ＩＴＦが、ＤＮＡ結合ドメインと転写エフェクタードメインとの間に局在化されたリンカーを更に含む、実施形態１２０～１２６のいずれか１つに記載の発現系。
１２８．
転写エフェクタードメインが、転写活性化ドメインを含む、実施形態１２０～１２７のいずれか１つに記載の発現系。
１２９．
転写活性化ドメインが、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化ドメイン；ＶＰ１６の４つのタンデムコピーを含む活性化ドメイン；ＶＰ６４活性化ドメイン；ＮＦκＢのｐ６５活性化ドメイン；エプスタイン－バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）活性化ドメイン；ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ活性化ドメイン（ＶＰＲ活性化ドメイン）を含む三者活性化因子；及びヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメイン（ｐ３００ ＨＡＴコア活性化ドメイン）からなる群から選択される、実施形態１２８に記載の発現系。
１３０．
転写エフェクタードメインが、転写リプレッサードメインを含む、実施形態１２０～１２７のいずれか１つに記載の発現系。
１３１．
転写リプレッサードメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン；ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）リプレッサードメイン；スクレラキシス（ＳＣＸ）ＨＬＨドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ１）ＨＬＨドメインの阻害剤、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン含有タンパク質２（ＨＥＲＣ２）Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＳＴ１）ＨＬＨドメイン、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．２（ＮＫＸ２２）ホメオドメイン、ＤＮＡ結合１（ＩＤ３）ＨＬＨドメインの阻害剤、及びツイスト関連タンパク質２（ＴＷＳＴ２）ＨＬＨドメイン、ＥＥＤリプレッサードメイン；リプレッサーエレメントサイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）抑制ドメイン；ヘアリー関連塩基性ヘリックスループヘリックスリプレッサータンパク質のＷＲＰＷモチーフ（配列番号７６）（モチーフがＷＲＰＷ（配列番号７６）抑制ドメインとして知られる）；ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）抑制ドメイン；並びにＨＰ１アルファクロモシャドウ抑制ドメインからなる群から選択される、実施形態１３０に記載の発現系。
１３２．
ＤＮＡ結合ドメインが、ＩＴＦ応答性プロモーターに結合する、実施形態１２０～１３１のいずれか１つに記載の発現系。
１３３．
第１のプロモーターが、構成的プロモーター、調節可能プロモーター、又は合成プロモーターである、実施形態１２０～１３２のいずれか１つに記載の発現系。
１３４．
第１のプロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａＶ１、ｈＣＡＧＧ、ｈＥＦ１ａＶ２、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターである、実施形態１３３に記載の発現系。
１３５．
目的の遺伝子をコードする外因性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたＩＴＦ応答性プロモーターを含む発現カセット
を更に含む、実施形態１２０～１３４のいずれか１つに記載の発現系。
１３６．
ＩＴＦ応答性プロモーターが、ＩＴＦ結合ドメイン配列及びコアプロモーター配列を含む、実施形態１３５に記載の発現系。
１３７．
コアプロモーター配列が、最小プロモーターを含む、実施形態１３６に記載の発現系。
１３８．
最小プロモーターが、ｍｉｎＰ、ｍｉｎＣＭＶ、ＹＢ＿ＴＡＴＡ、ｍｉｎＴＡＴＡ、及びｍｉｎＴＫからなる群から選択される、実施形態１３７に記載の発現系。
１３９．
コアプロモーター配列が、構成的プロモーターに由来する、実施形態１３８に記載の発現系。
１４０．
コアプロモーター配列が、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、及びｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターに由来する、実施形態１３９に記載の発現系。
１４１．
実施形態１２０～１４０のいずれか１つの発現系を含む操作された細胞。
１４２．
ヒト細胞を含む、実施形態１０１～１１９又は１４１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１４３．
幹細胞を含む、実施形態１０１～１１９、１４１、又は１４２のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１４４．
免疫細胞を含む、実施形態１～１１９、１４１、又は１４２のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１４５．
Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及びｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択される、実施形態１０１～１１９、１４１、又は１４２のいずれか１つに記載の操作された細胞。
１４６．
目的の遺伝子の転写を調節するための遺伝子スイッチであって、
実施形態１０１～１１９又は１４１～１４５のいずれか１つに記載の操作された細胞と、
有効量のミフェプリストンと
を含む、遺伝子スイッチ。
１４７．
目的のポリペプチドの転写を調節する方法であって、
誘導性転写因子（ＩＴＦ）の核局在化を誘導するために、実施形態１０１～１１９又は１４２～１４６のいずれか１つに記載の操作された細胞をミフェプリストンと接触させる工程
を含む、方法。
１４８．
ＩＴＦ応答性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写をＩＴＦが調節することを可能にするのに十分な期間、操作された細胞を培養する工程
を更に含む、実施形態１４７に記載の方法。
１４９．
操作された細胞が、ヒト又は動物中にあり、操作された細胞をミフェプリストンと接触させる工程が、ミフェプリストンの薬理学的用量をヒト又は動物に投与することを含む、実施形態１４７に記載の方法。
１５０．
転写エフェクタードメインが、転写活性化ドメインを含み、転写を調節することが、目的の遺伝子の転写を活性化することを含む、実施形態１４７～１４９のいずれか１つに記載の方法。
１５１．
転写エフェクタードメインが、転写リプレッサードメインを含み、転写を調節することが、目的の遺伝子の転写を抑制することを含む、実施形態１４７～１４９のいずれか１つに記載の方法。

【手続補正11】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０３７２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0372】

結果
図４に示されるように、ミフェプリストン調節転写調節系は、濃度依存的様式で、薬物の存在下でｍＣｈｅｒｒｙ発現を誘導した。
（表１４）配列

【手続補正12】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2024515182000001.app

【国際調査報告】