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特表2024-515187核酸の多重化分析及び多重化法のために最適化したオリゴヌクレオチドＴＸプローブ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-05
(54)【発明の名称】核酸の多重化分析及び多重化法のために最適化したオリゴヌクレオチドＴＸプローブ
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6827 20180101AFI20240329BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240329BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6827 Z ZNA
C12N15/09 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023563998
(86)(22)【出願日】2022-04-14
(85)【翻訳文提出日】2023-12-13
(86)【国際出願番号】 EP2022060014
(87)【国際公開番号】W WO2022219122
(87)【国際公開日】2022-10-20
(31)【優先権主張番号】21168819.7
(32)【優先日】2021-04-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523390976
【氏名又は名称】バイオタイプ ゲー・エム・ベー・ハー
【氏名又は名称原語表記】Ｂｉｏｔｙｐｅ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｍｏｒｉｔｚｂｕｒｇｅｒ Ｗｅｇ ６７， ０１１０９ Ｄｒｅｓｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
(74)【代理人】
【識別番号】100114890
【弁理士】
【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト
(74)【代理人】
【識別番号】100098501
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 拓
(74)【代理人】
【識別番号】100116403
【弁理士】
【氏名又は名称】前川 純一
(74)【代理人】
【識別番号】100134315
【弁理士】
【氏名又は名称】永島 秀郎
(74)【代理人】
【識別番号】100162880
【弁理士】
【氏名又は名称】上島 類
(72)【発明者】
【氏名】クリストフ シャンツェンバッハ
(72)【発明者】
【氏名】ジュアン リピンスキー ヌネス
(72)【発明者】
【氏名】ヴェアナー ブラベッツ
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QQ03
4B063QQ05
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR56
4B063QR62
4B063QS16
4B063QS25
4B063QX01
(57)【要約】
本発明は、集合的かつ連続的な反応設定において複数の分子遺伝学的分析物を同時に検出するための、好ましくは完全に自動化された及び／又は多重的な方法、並びに前記方法において使用するための切断可能な加水分解生成物を有する少なくとも１つの分析物特異的オリゴヌクレオチドＴＸプローブを提供する。前記方法により、複数の切断可能な加水分解生成物がヌクレアーゼによってそれぞれのＴＸプローブから特異的に放出される。好ましくはキャピラリー電気泳動での分離ステップに続いて、それぞれの加水分解生成物について明確で他の信号と区別可能な信号が得られる。分離したそれぞれの加水分解生成物は、分子バリアント、例えば複数のＴＸプローブによって特異的に標的とされる一塩基多型（ＳＮＰ）、欠失・挿入多型（ＤＩＰ）又はその他を含むそれぞれの分析物の定性的及び／又は定量的検出を可能にするシグナルをそれぞれもたらす。好ましくは、前記方法は、定性的及び／又は定量的に小さな分子バリアント、例えばＳＮＰを検出するために適している。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下、－ 少なくとも１つの分子遺伝分析物（Ｔ１－ｎ）を含む少なくとも１つの標的配列、
－ 特定の標的配列の増幅に適した少なくとも１つのプライマー（Ｐ１－ｎ）、
－ 少なくとも１つの分析物に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ（「ＴＸプローブ」１－ｎ）であって、少なくとも１つのＴＸプローブが、
－ 少なくとも１つの特異的プライマー（Ｐ１）の相補配列の３’下流に位置する領域内の少なくとも１つの分析物の配列に逆相補的な３’配列、
－ プライマー伸長反応を阻害する分析物に特異的な３’配列の３’末端にある保護基（３’ブロッカー）、
－ ヌクレアーゼ活性に対する耐性を付与し、３’下流のＴＸプローブから切断可能な加水分解生成物を構造的に分割する、ＴＸプローブのハイブリダイズ配列の５’領域にある少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカー
を含む反応混合物を含む集合的かつ連続的な反応装置において少なくとも１つ以上の分子遺伝分析物を検出するための方法であって、切断可能な加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）が、
・ ＴＸプローブの５’末端の少なくとも１つのヌクレオチド、及び
・ リンカーを介して切断可能な加水分解生成物に架橋された標識
を含む少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカー
を含み、以下のステップ、
－ 少なくとも１つの標的配列を少なくとも１つのＴＸプローブ及び少なくとも１つのプライマーと接触させるステップ、
－ 少なくとも１つのプライマーとＴＸプローブの３’配列の双方を同一の標的配列の同一の鎖上のそれぞれの相補配列にハイブリダイズするステップであって、ＴＸプローブがＰ１の３’上流にハイブリダイズするステップ、
－ 鋳型依存性の５’→３’ヌクレアーゼ活性でハイブリダイズしたＴＸプローブを切断して少なくとも１つの切断可能な加水分解生成物を放出するステップ、
－ 電気泳動により加水分解生成物を分離するステップ、及び
－ 放出した加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）を検出するステップであって、それぞれの加水分解生成物が標的配列内の特定の分析物の存在を示すステップ
を含む、前記方法。
【請求項2】
切断可能な加水分解生成物及び放出した加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）が、骨格修飾、非骨格修飾及び／又は人工塩基を含む少なくとも１つのヌクレオチドの少なくとも１つの修飾をさらに含み、－ 骨格修飾が、ヌクレオチドの五炭糖の２’位及び／又は４’位での人工修飾を含み、
－ 非骨格修飾が、ヌクレオチドの５’末端及び／又は３’末端に結合する人工化学修飾を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記非骨格修飾が、ヌクレオチドの３’末端及び／又は５’末端に、又は２つのヌクレオチド間に結合した化学構造であるスペーサーを含み、かつ好ましくはａ） （Ｃn）－ＯＨ［式中、ｎは整数であり、少なくとも３、好ましくは３、６、９又は１２である］のアルキルアルコール、プロパニル（スペーサーＣ３）、ヘキサニル（スペーサーＣ６）、ノナニル（スペーサーＣ９）及びドデカニル（スペーサーＣ１２）を含む（Ｃn）－ＯＨのアルキルアルコール、
ｂ） （Ｃ－Ｏ－Ｃ－Ｃ）n－ＯＨ［式中、ｎは整数であり、少なくとも１である］のグリコールエーテル、好ましくはトリエチレングリコール（スペーサー９）、テトラエチレングリコール（スペーサー１２）、及びヘキサエチレングリコール（スペーサー１８）を含む（Ｃ－Ｏ－Ｃ－Ｃ）n－ＯＨのグリコールエーテル、及び／又は
ｃ） ２’－デオキシリボースの１位にメチレン基を有するテトラヒドロフラン誘導体
から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
複数の分析物に特異的な３’配列（Ｔ１－ｎ）を含む複数のＴＸプローブ（ＴＸプローブ１－ｎ）を使用し、全てのそれぞれの切断可能な加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）は、それぞれ切断可能な加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）の少なくとも１つのヌクレオチドに結合した同一の標識を含み、それぞれが異なるリンカー及び／又は少なくとも１つの異なる修飾を含む、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
複数のＴＸプローブが同一であり、かつ同じ切断可能な加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）からなるが、異なる加水分解生成物を放出して検出する、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
以下、－ 放出したそれぞれの加水分解生成物が、重複、点変異、置換、欠失、挿入、フレームシフト、転座、ｍＲＮＡスプライスバリアント及び／又は他の塩基変異を表す特定の配列の存在を示す、少なくとも１つの分析物内の少なくとも１つの変異
－ ジェノタイピング、
－ コピー数の変動及び／又は
－ 発現レベルの変動
を含む、未修飾配列と比較した少なくとも１つの分析対象内の分子レベルの変動が検出可能である、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
分析物内の一塩基多型（ＳＮＰ）のそれぞれのアレルバリアントが、それぞれ放出した加水分解生成物によって検出される、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
分離をキャピラリー電気泳動によって実施する、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
分析物に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（「ＴＸプローブ」、プローブ１－ｎ）であって、ＴＸプローブが、－ 少なくとも１つのプライマー（Ｐ１）の相補配列の３’下流に位置する領域内の少なくとも１つの分析物の配列に逆相補的な３’配列、
－ プライマー伸長反応を阻害する、分析物に特異的な３’配列の３’末端にある保護基（３’ブロッカー）、
－ ヌクレアーゼ活性に対する耐性を付与し、３’下流のＴＸプローブから切断可能な加水分解生成物を構造的に分割する、ＴＸプローブのハイブリダイズ配列の５’領域にある少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカー
を含み、切断可能な加水分解生成物が、
・ ＴＸ プローブの５’末端の少なくとも１つのヌクレオチド、及び
・ リンカーを介して切断可能な加水分解生成物に架橋させた標識、好ましくは蛍光体
を含む、分析物に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項10】
切断可能な加水分解生成物が、少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカーの５’上流に位置する分析物に非特異的な５’配列（ＦＬＡＰ）を含み、かつ標識が、リンカーを介して－ ＴＸプローブのＦＬＡＰの５’末端（５’リンカー）、又は
－ 少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカーから５’上流の内部ヌクレオチド
に結合されている、請求項９に記載のＴＸプローブ。
【請求項11】
切断可能な加水分解生成物が、骨格修飾、非骨格修飾及び／又は人工塩基を含む少なくとも１つのヌクレオチドの少なくとも１つの修飾を含み、－ 骨格修飾が、ヌクレオチドの五炭糖の２’位及び／又は４’位での人工修飾を含み、
－ 非骨格修飾が、ヌクレオチドの５’末端及び／又は３’末端に結合する人工化学修飾を含む、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項12】
請求項９から１１までのいずれか１項に記載のＴＸプローブから放出させた加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）。
【請求項13】
請求項１から８までのいずれか１項に記載の少なくとも１つ以上の分析物の検出のための方法における、請求項９から１１までのいずれか１項に記載の少なくとも１つの分析物に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（「ＴＸプローブ」、１－ｎ）及び／又は請求項１２に記載の加水分解生成物の使用。
【請求項14】
放出させた加水分解生成物が特定の分析物の存在の確認である、請求項１３に記載の使用。
【請求項15】
少なくとも１つの標識した、又はそれ以上標識した分析物に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（「ＴＸプローブ」、１－ｎ）を含むキットであって、ＴＸプローブが、－ 少なくとも１つの特異的プライマー（Ｐ１）の相補配列の３’下流に位置する領域内の少なくとも１つの分析物の配列に逆相補的な３’配列、
－ プライマー伸長反応を阻害する、分析物に特異的な３’配列の３’末端にある保護基（３’ブロッカー）、
－ ヌクレアーゼ活性に対する耐性を付与し、３’下流のＴＸプローブから切断可能な加水分解生成物を構造的に分割する、ＴＸプローブのハイブリダイズ配列の５’領域にある少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカー
をそれぞれ含み、切断可能な加水分解生成物が、
・ ＴＸ プローブの５’末端の少なくとも１つのヌクレオチド、及び
・ リンカーを介して切断可能な加水分解生成物に架橋させた標識、好ましくは蛍光体
を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、一般に、核酸化学の分野、具体的には、核酸の検出及び定量のための方法に関する。
【0002】
本発明は、集合的かつ連続的な反応設定において複数の分子遺伝学的分析物を同時に検出するための、好ましくは完全に自動化された及び／又は多重的な方法、並びに前記方法において使用するための切断可能な加水分解生成物を有する少なくとも１つの分析物特異的オリゴヌクレオチドＴＸプローブを提供する。前記方法により、複数の切断可能な加水分解生成物がヌクレアーゼによってそれぞれのＴＸプローブから特異的に放出される。好ましくはキャピラリー電気泳動での分離ステップに続いて、それぞれの加水分解生成物について明確で他の信号と区別可能な信号が得られる。分離したそれぞれの加水分解生成物は、分子バリアント、例えば複数のＴＸプローブによって特異的に標的とされる一塩基多型（ＳＮＰ）、欠失・挿入多型（ＤＩＰ）又はその他を含むそれぞれの分析物の定性的及び／又は定量的検出を可能にするシグナルをそれぞれもたらす。好ましくは、前記方法は、定性的及び／又は定量的に小さな分子バリアント、例えばＳＮＰを検出するために適している。
【0003】
核酸の分子診断は、定性的又は定量的な核酸配列バリアントを分析するために使用される技術の集合である（詳細について本明細書における分析物及びバイオマーカーの定義も参照されたい）。これらのバリアントは、現在確立され、統計的に有意な試料サイズで検証され、かつ精選されたデータベースに保存されている参照配列と比較して説明できるようになった。例えば、ヒトの診断において、１０００人超の野生型又は健康な個人が、生理学的状態又は疾患との相関関係が十分に実証されている生殖細胞系列又は体細胞変異を有する患者と比較される。
【0004】
これらのバリアントを分析するために、いくつかの従来技術が確立されている。標準的な定性的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、この分野の専門家に周知である。逆転写ステップと組み合わせて、ＲＮＡを遺伝子型同定及び／又は定量することもできる。ｑＰＣＲ技術は、増幅させた標的ＤＮＡに特異的に結合するｄｓＤＮＡ選択的蛍光色素（例えばＳＹＢＲTMグリーン）又はＦＲＥＴ（Ｆｏｅｒｓｔｅｒ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ；フェルスター共鳴エネルギー移動）プローブを使用するｉｎ ｓｉｔｕ蛍光光学読み取り装置（例えばｑＰＣＲサーモサイクラー）と組み合わせて均一なアッセイで実施できる。ＦＲＥＴプローブ、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＳｃｏｒｐｉｏｎｓTM又はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ（モレキュラービーコン）は、増幅させた標的ＤＮＡに可逆的に結合する一方で、加水分解プローブ（時にＴａｑＭａｎTM（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＧ（Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、ＣＨ）の商標）とも言われる）は、それぞれのＰＣＲサイクル後にＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの固有ヌクレアーゼによって加水分解される。アレル特異的ＦＲＥＴプローブを、種々の蛍光色と組み合わせて、１回のｑＰＣＲでＳＮＰ又は欠失－挿入多型（ＤＩＰ）をある程度区別することもできる。ＦＲＥＴプローブの使用は、増幅させた標的ＤＮＡのための確認ステップをさらに提供し、これは分析又は医療ガイドラインによって品質基準として時に規定される。
【0005】
核酸増幅及びジェノタイピング又は定量化のためのマルチパラメーター又は多重技術は、いくつかの分析及び鑑別診断の用途のために好ましい。同一の臓器（例えば肺、泌尿生殖管、皮膚）の感染症（ウイルス、微生物及び寄生虫）などの同一又は類似の症状を示す症候群性疾患、又は頭蓋異形症もしくは行動の顕著さなどの遺伝性疾患がその例である。他の例は、個別の治療のための癌の層別化、又は種の個体を区別するための高い識別力を必要とする法医学及び父子鑑定である。これらは、１２～２４個の複アレル性ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）又はＳＮＰもしくはＤＩＰ（略称ＩＮＤＥＬ）のような３０超の両アレル性分析マーカーを組み合わせることによってのみ達成できる。これらの程度の多重化を可能にする技術は、例えば、試料の準備から読み取りまでの全てのステップを統合する即時現場（point of need）機器であるカートリッジ装置（例えばＦｉｌｍ Ａｒｒａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社製（Ｍａｒｃｙ－ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ、フランス）；Ｖｉｖａｌｙｔｉｃ、Ｂｏｓｃｈ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨ社製（Ｗａｉｂｌｉｎｇｅｎ、ＤＥ））である。これらの装置の中核技術は、幾何学的多重化と呼ばれ、個々のＰＣＲ又はｑＰＣＲがカートリッジの別々のキャビティで実施されることを意味する。幾何学的多重化ＰＣＲの他のアプローチは、デジタルドロップレット（又はエマルジョン）ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）（例えば、ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．社製（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳ－ＣＡ））、又はエマルジョンＰＣＲを個別のナノリットルキャビティ及び固体ビーズと組み合わせても使用する次世代シークエンシング（ＮＧＳ）装置（Ｉｒｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．社製（Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ））、又は増幅及びジェノタイピングのために個々のＤＮＡ標的を分離するための個別領域を有するＤＮＡチップ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．社製（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳ－ＣＡ））として公知である。ＮＧＳ技術は、高い多重化機能での絶対定量のためにも使用できる。法医科学又は父子鑑定において標準的な広く受け入れられている多重化の他のアプローチは、ワンステップエンドポイント多重ＰＣＲとキャピラリー電気泳動（ＣＥ）とを組み合わせて、異なる長さ及び／又は蛍光色素により増幅産物を分離する。この技術は、この分野のエンドユーザーのニーズにより敏感かつ迅速に対応する。これらの試験において、多重ＰＣＲにおけるのプライマー対のうちの１つのＰＣＲプライマーは、５’末端に共有結合している蛍光色素により標識されている。その後、その反応混合物を定性分析又は半定量分析のためにＣＥ装置に注入する。２５超のＳＴＲ又はＤＩＰは遺伝子型を同定することができ、又は最大３人の犯罪者の法医学的汚れに含まれるＤＮＡ混合物さえも識別できる。ＭＯＤＡＰＬＥＸ装置（本明細書の定義、Ｈｌｏｕｓｅｋら、２０１２を参照）は、該文献において使用されており、多重ｑＰＣＲのアプローチとＣＥとを組み合わせて、１つの反応設定で最大５０のパラメーターのジェノタイピング及び定量化を達成する。
【0006】
標準的なｑＰＣＲの限界は、ＦＲＥＴプローブによるジェノタイピング及び定量化のための多重化の程度が最大６つの診断パラメーターであることである。この程度は、内部増幅制御を、分析又は医療ガイドライン（例えば体該診断装置の設計）に従って品質基準として含める必要がある場合にも推断される。さらに、いくつかの相対定量プロトコルは、追加で実施しなければならない並行反応及び参照標準が必要である。ＮＧＳ及びｄｄＰＣＲは、非常に高価であり、大量の高品質の試料核酸を必要とし、かつＮＧＳの場合はＤＮＡライブラリーの構築のような多段階のプロトコルを必要とし、これは一次データの質の高い選択のための検証済みのバイオインフォマティクス並びに再現性及び安全性を保証するための配列アノテーションを含む一連の自動化ステップにより時間を消費する。カートリッジ装置は、アッセイの開発及び製造において欠点も有し、特にバイオマーカーの開発及び臨床検証研究において必要であるアッセイ設計についての柔軟性が低下する。
【0007】
ＣＥ内での異なるヌクレオチド配列の分離及び検出は、質量、長さ、電荷又はそれらの組み合わせに依存するそれぞれの分子の異なる移動挙動に基づく。従来技術の技術は、不要な人為構造を追加することなく明確で明確なシグナルを実現できないことが課題である。さらに他の課題は、多重度が増加しても不要な人為構造を追加することなく明確で明確なシグナルを達成することである。特に、蛍光標識したプライマーの使用は、増幅ステップ中に、副生成物を促進するプライマー及び増幅産物の複数の予測不可能な相互作用を生じ、したがって個々のパラメーター又は完全な試験の特異性及び感度を低減させる。ＭＯＤＡＰＬＥＸシステムの場合に、ＣＥへの電気運動注入は、部分的な非変性条件下でのみ実施でき、標識したｄｓＤＮＡ配座異性体の追加のシグナルピークを生じうる。ＣＥのこれらの特別な要件は、多重アッセイの開発中にいくつかの反復プライマー最適化ステップによってのみ除外されうる。さらに、多重反応における個々の増幅産物のサイズは、標的核酸配列に応じて、１つのプライマー対の１つのプライマーの５’末端に人工ヌクレオチドを追加することによって最適化しなければならず、これは、異なるアニーリング温度及び／又は非特異的配列相互作用により多重ＰＣＲにおける個々の反応の性能も低下させる。
【0008】
したがって、本発明の１つの目的は、従来技術の前記欠点を考慮した方法を提供すること、及び試料中の（標的配列内の）異なる遺伝子分析物の所望の量（多重度）を同定、分離、検出、及び定量するための改良された方法及びその方法において使用するためのオリゴヌクレオチドＴＸプローブを提供することである。本発明の他の目的は、ＴＸプローブの（本明細書において定義されるような）種々の修飾によって所望の多重度が達成される、前記方法及び前記方法において使用するための前記オリゴヌクレオチドＴＸプローブを提供することである。他の目的は、異なる修飾を有するが同様及び同一の蛍光標識を有する所望の量のＴＸプローブで所望の多重度を可能にし、それによって１つ又は２つのみの蛍光チャネルを有する装置の多重化を可能にすることである。したがって、異なる分析物を示すＴＸプローブの異なる加水分解生成物の明確で明確な検出は、本発明による修飾の適切な組み合わせによって達成される。したがって、本発明の他の目的は、望ましくない人為構造を生じることなく、キャピラリー電気泳動におけるそれぞれの加水分解生成物の異なる移動挙動によって異なる分析物の検出のための多重アプローチを可能にする、異なるＴＸプローブ及び修飾を提供することである。したがって、本発明の他の目的は、試料中の所望の数の分析物及び異なる単一ヌクレオチド多型について、放出した加水分解生成物の異なる移動挙動を可能にする方法を提供することである。さらに、核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性、又は同一であるが別々の活性を有する酵素の混合物によって生じる前記ＴＸプローブの所望の数の加水分解生成物を検出及び定量するための方法を提供することが目的である。そのために、それぞれの標的配列とのハイブリダイゼーション後に５’→３’ヌクレアーゼ活性及び核酸ポリメラーゼ活性により切断又は放出される、検出可能に標識したオリゴヌクレオチドＴＸプローブが提供される。最終的に、完全に自動化され、公知のキャピラリー電気泳動（ＣＥ）装置、例えばＭＯＤＡＰＬＥＸ装置又はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．社製、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ社製、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ社製、Ｓｙｎｔｏｌ，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．社製などの他のシステムのような密閉された相互汚染のないシステムで実施できる、前記方法を提供することが目的である。
【0009】
技術水準に対するＴＸプローブの利点は以下である：
（１） 検出されるべき、及び多重ＰＣＲ中に標的の特異的ＴＸプローブから特異的に切断される、切断可能な加水分解生成物の標識した人工化合物が、多重ＰＣＲ及びＣＥ条件下で相互に又は増幅産物にハイブリダイズできないオリゴヌクレオチド配列に配置された１０未満のヌクレオチドを含むこと。
（２） ＴＸプローブが、非常に特異的な加水分解生成物の放出を可能にする新たに定義した内部ヌクレアーゼブロッカーを少なくとも１つ含むこと。
（３） 多重ＰＣＲプライマーが標識されておらず、したがって互いに干渉してＣＥ条件下で標識及び放出させた加水分解生成物の検出を妨げる人為構造を形成しないこと。
（４） ＴＸプローブが注入条件下でｄｓＤＮＡを形成しないため、ＭＯＤＡＰＬＥＸ装置の合計分析時間を簡素化し、短縮することができること。
（５） ＴＸプローブの切断可能な加水分解生成物のセットを、多重化キットを迅速に開発するための汎用ツールボックスとして設計できること。キットの設計を、ＭＯＤＡＰＬＥＸ装置への事前に設計した標準加水分解プローブを備えた公表されているｑＰＣＲモノプレックスのワンステップでの転送によって示した（Ｇａｂｅｒｔら、２００３、実施例７）。
（６） 両アレル性ＳＮＰジェノタイピングの複雑さ、及び試料プールでの集団研究又はＤＮＡ混合物の定量のための相対アレル定量の確度を、同一の蛍光体を有する単一のＴＸプローブに減らすことができること（実施例６）。
（１） 検出されるべき、及び多重ＰＣＲ中に標的の特異的ＴＸプローブから特異的に切断される、切断可能な加水分解生成物の標識した人工化合物が、多重ＰＣＲ及びＣＥ条件下で相互に又は増幅産物にハイブリダイズできないオリゴヌクレオチド配列に配置された１０未満のヌクレオチドを含むこと。
（２） ＴＸプローブが、非常に特異的な加水分解生成物の放出を可能にする新たに定義した内部ヌクレアーゼブロッカーを少なくとも１つ含むこと。
（３） 多重ＰＣＲプライマーが標識されておらず、したがって互いに干渉してＣＥ条件下で標識及び放出させた加水分解生成物の検出を妨げる人為構造を形成しないこと。
（４） ＴＸプローブが注入条件下でｄｓＤＮＡを形成しないため、ＭＯＤＡＰＬＥＸ装置の合計分析時間を簡素化し、短縮することができること。
（５） ＴＸプローブの切断可能な加水分解生成物のセットを、多重化キットを迅速に開発するための汎用ツールボックスとして設計できること。キットの設計を、ＭＯＤＡＰＬＥＸ装置への事前に設計した標準加水分解プローブを備えた公表されているｑＰＣＲモノプレックスのワンステップでの転送によって示した（Ｇａｂｅｒｔら、２００３、実施例７）。
（６） 両アレル性ＳＮＰジェノタイピングの複雑さ、及び試料プールでの集団研究又はＤＮＡ混合物の定量のための相対アレル定量の確度を、同一の蛍光体を有する単一のＴＸプローブに減らすことができること（実施例６）。
【0010】
本発明のＴＸプローブ及び方法は、試料中の標的配列内の個々の分析物の特異的な検出及び定量化に有用であるが、試料中の複数の分析物の検出及び定量化のための多重用途も提供する。本発明の主題は特許請求の範囲において定義される。本発明の概念を、以下の好ましい実施形態において説明するが、これらに限定されるものではない。実施例は本発明の実現可能性を示している。
【0011】
本発明の第一の目的は、以下、
－ 好ましくは対象（ヒト又は動物）からの試料内に存在する、少なくとも１つの分子遺伝分析物（Ｔ１－ｎ）を含む少なくとも１つの標的配列、
－ 特定の標的配列の増幅に適しており、好ましくは遺伝子分析物に特異的である少なくとも１つのプライマー（Ｐ１－ｎ）、好ましくは、ＰＣＲ中に少なくとも１つ以上の標的を増幅するために適している少なくとも２つのプライマー（１つのプライマー対）、
－ 少なくとも１つの分析物、好ましくは分析物内の分子レベルに対する変動に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ（「ＴＸプローブ」、１－ｎ）であって、
－ 少なくとも１つの特異的プライマー（Ｐ１）の相補配列の３’下流に位置する領域内の少なくとも１つの分析物の配列に逆相補的である３’配列であって、好ましくは前記逆相補配列が分析物と（好ましくはアドレス指定配列及び分析物内の分子レベルの変動により）ハイブリダイズし、好ましくは相補配列が少なくとも６（少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、２０、２５又は３０以上ヌクレオチド）、及び他の実施形態において最大３５（最大３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５）ヌクレオチドを含む、３’配列、
－ プライマー伸長反応を阻害する、好ましくは少なくとも２つのプライマー（１つのプライマー対）を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を阻害する分析物に特異的な３’配列の３’末端にある保護基（３’ブロッカーとも言われる）、及び
－ ＴＸプローブのハイブリダイズ配列の５’領域、好ましくはそれぞれの分析物に（好ましくは分析物内のアドレス配列及び／又は分子レベル）にハイブリダイズする少なくとも１つ（及び最後の）ヌクレオチドの３’下流での少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカーであって、前記内部ヌクレアーゼブロッカーが、特に少なくとも１つの修飾を保有するヌクレオチド（内部ヌクレアーゼブロッカー）に、ヌクレアーゼ活性に対する耐性を付与し（実施例１を参照）、かつ切断可能な加水分解生成物を３’下流プローブから構造的に分割し（図１を参照）、切断可能な加水分解生成物（Ｌ１－ｎ；図１（３））が、
・ ＴＸプローブの５’末端の少なくとも１つのヌクレオチド、他の実施形態においては、ＴＸプローブの３’配列に特異的な標的配列の５’末端の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上、好ましくは１つ、２つ、３つ、４つ又は５つ、最も好ましくは１つ、２つ又は３つのヌクレオチド、及び
・ リンカーを介して切断可能な加水分解生成物に架橋され、好ましくは前記で定義したＴＸプローブの５’末端の１つ又は最後のヌクレオチドに連結される標識、好ましくは本明細書において定義される蛍光標識
を含む内部ヌクレアーゼブロッカー
を含む、少なくとも１つのＴＸプローブ
を含有する反応混合物を含む集合的及び連続的な反応装置において、少なくとも１つ以上の分析物の検出、好ましくは少なくとも２０の分析物の同時多重検出のための、好ましくは完全に自動化された方法であって、
以下のステップ、
－ 少なくとも１つの標的配列、好ましくは標的配列内の分析物、分子バリエーション及びアドレス配列と、少なくとも１つのＴＸプローブ及び少なくとも１つのプライマー、好ましくはＰＣＲ中に少なくとも１つ以上の分析物を増幅するために適している少なくとも２つのプライマー（１つのプライマー対）とを接触させるステップ、
－ 少なくとも１つのプライマーＰ１、好ましくは少なくとも２つのプライマーと、ＴＸプローブの３’配列との双方をそのそれぞれの相補配列に同一の標的配列（標的とした分析物の配列）の同一の鎖上でハイブリダイズするステップ、ここでプローブは、Ｐ１の３’上流にハイブリダイズし、又は好ましくは少なくとも２つのプライマーを使用する場合に少なくとも２つのプライマーＰ１とＰ２の配列にハイブリダイズし、好ましくは逆相補体である前記ＴＸプローブの３’配列は、標的配列内の分析物（好ましくはアドレス配列及び分子バリエーション）とハイブリダイズし、
－ 特に、同一の標的の同一の鎖上でそれぞれのＴＸプローブの５’上流にハイブリダイズするそれぞれのプライマーＰ１、好ましくはプライマーＰ１及びＰ２を含むか、又は一方はそれぞれのＴＸプローブの５’上流にハイブリダイズし他方は同一の標的配列の同一の鎖で同一のＴＸプローブの３’下流にハイブリダイズするプライマーＰ１及びＰ２を含む二本鎖を形成するステップ、
－ 特に、保護基による前記ポリメラーゼによって前記ＴＸプローブの３’末端ヌクレオチドが伸長されない伸長反応を可能にする／実施するステップ、
－ 特に、（好ましくは分析物を含む）標的配列を複製するステップ、
－ 鋳型依存の５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する加水分解させたＴＸプローブを切断して、少なくとも１つの切断可能な加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）、特に一本鎖（ｓｓ、又は天然もしくは部分的に非変性のＣＥ条件下でｄｓＤＮＡ形成能力を有さないより一般的なもの）を放出するステップ、特に５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存核酸ポリメラーゼ又は鋳型依存核酸ポリメラーゼ及び本明細書で定義した非依存的エンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）を含む前記で定義した混合物を、加水分解させたＴＣプローブをせずタンするための５’→３’ヌクレアーゼ活性を可能にする条件下で維持する条件下で切断を生じて標識した加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）を放出するステップ、
－ 好ましくはそれぞれ分析物にハイブリダイズさせたＴＸプローブを本明細書において定義した切断部位で切断し、放出させた、好ましくは一本鎖の本明細書において記載した加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）を得るステップ、
－ 特に放出させた加水分解生成物を遊走させるステップ、
－ 電気泳動、好ましくはキャピラリー電気泳動、最も好ましくはＭＯＤＡＰＬＥＸ装置でのＣＥによって好ましくは少なくとも１つ以上の加水分解生成物を分離するステップ、及び
－ それぞれの加水分解生成物が、標的配列内の分析物の存在、好ましくは分析物内の分子バリエーション（ＳＮＰ又はＤＩＰ（略称ＩＮＤＥＬ））の存在を示し、特に、本明細書において記載したそれぞれのプローブ（Ｔ１－ｎ）の逆相補配列によって標的されている、放出させた加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）を、好ましくは蛍光定量的に、最も好ましくはＭＯＤＡＰＬＥＸ装置で検出するステップ
を含む、前記方法である。
－ 好ましくは対象（ヒト又は動物）からの試料内に存在する、少なくとも１つの分子遺伝分析物（Ｔ１－ｎ）を含む少なくとも１つの標的配列、
－ 特定の標的配列の増幅に適しており、好ましくは遺伝子分析物に特異的である少なくとも１つのプライマー（Ｐ１－ｎ）、好ましくは、ＰＣＲ中に少なくとも１つ以上の標的を増幅するために適している少なくとも２つのプライマー（１つのプライマー対）、
－ 少なくとも１つの分析物、好ましくは分析物内の分子レベルに対する変動に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ（「ＴＸプローブ」、１－ｎ）であって、
－ 少なくとも１つの特異的プライマー（Ｐ１）の相補配列の３’下流に位置する領域内の少なくとも１つの分析物の配列に逆相補的である３’配列であって、好ましくは前記逆相補配列が分析物と（好ましくはアドレス指定配列及び分析物内の分子レベルの変動により）ハイブリダイズし、好ましくは相補配列が少なくとも６（少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、２０、２５又は３０以上ヌクレオチド）、及び他の実施形態において最大３５（最大３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５）ヌクレオチドを含む、３’配列、
－ プライマー伸長反応を阻害する、好ましくは少なくとも２つのプライマー（１つのプライマー対）を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を阻害する分析物に特異的な３’配列の３’末端にある保護基（３’ブロッカーとも言われる）、及び
－ ＴＸプローブのハイブリダイズ配列の５’領域、好ましくはそれぞれの分析物に（好ましくは分析物内のアドレス配列及び／又は分子レベル）にハイブリダイズする少なくとも１つ（及び最後の）ヌクレオチドの３’下流での少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカーであって、前記内部ヌクレアーゼブロッカーが、特に少なくとも１つの修飾を保有するヌクレオチド（内部ヌクレアーゼブロッカー）に、ヌクレアーゼ活性に対する耐性を付与し（実施例１を参照）、かつ切断可能な加水分解生成物を３’下流プローブから構造的に分割し（図１を参照）、切断可能な加水分解生成物（Ｌ１－ｎ；図１（３））が、
・ ＴＸプローブの５’末端の少なくとも１つのヌクレオチド、他の実施形態においては、ＴＸプローブの３’配列に特異的な標的配列の５’末端の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上、好ましくは１つ、２つ、３つ、４つ又は５つ、最も好ましくは１つ、２つ又は３つのヌクレオチド、及び
・ リンカーを介して切断可能な加水分解生成物に架橋され、好ましくは前記で定義したＴＸプローブの５’末端の１つ又は最後のヌクレオチドに連結される標識、好ましくは本明細書において定義される蛍光標識
を含む内部ヌクレアーゼブロッカー
を含む、少なくとも１つのＴＸプローブ
を含有する反応混合物を含む集合的及び連続的な反応装置において、少なくとも１つ以上の分析物の検出、好ましくは少なくとも２０の分析物の同時多重検出のための、好ましくは完全に自動化された方法であって、
以下のステップ、
－ 少なくとも１つの標的配列、好ましくは標的配列内の分析物、分子バリエーション及びアドレス配列と、少なくとも１つのＴＸプローブ及び少なくとも１つのプライマー、好ましくはＰＣＲ中に少なくとも１つ以上の分析物を増幅するために適している少なくとも２つのプライマー（１つのプライマー対）とを接触させるステップ、
－ 少なくとも１つのプライマーＰ１、好ましくは少なくとも２つのプライマーと、ＴＸプローブの３’配列との双方をそのそれぞれの相補配列に同一の標的配列（標的とした分析物の配列）の同一の鎖上でハイブリダイズするステップ、ここでプローブは、Ｐ１の３’上流にハイブリダイズし、又は好ましくは少なくとも２つのプライマーを使用する場合に少なくとも２つのプライマーＰ１とＰ２の配列にハイブリダイズし、好ましくは逆相補体である前記ＴＸプローブの３’配列は、標的配列内の分析物（好ましくはアドレス配列及び分子バリエーション）とハイブリダイズし、
－ 特に、同一の標的の同一の鎖上でそれぞれのＴＸプローブの５’上流にハイブリダイズするそれぞれのプライマーＰ１、好ましくはプライマーＰ１及びＰ２を含むか、又は一方はそれぞれのＴＸプローブの５’上流にハイブリダイズし他方は同一の標的配列の同一の鎖で同一のＴＸプローブの３’下流にハイブリダイズするプライマーＰ１及びＰ２を含む二本鎖を形成するステップ、
－ 特に、保護基による前記ポリメラーゼによって前記ＴＸプローブの３’末端ヌクレオチドが伸長されない伸長反応を可能にする／実施するステップ、
－ 特に、（好ましくは分析物を含む）標的配列を複製するステップ、
－ 鋳型依存の５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する加水分解させたＴＸプローブを切断して、少なくとも１つの切断可能な加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）、特に一本鎖（ｓｓ、又は天然もしくは部分的に非変性のＣＥ条件下でｄｓＤＮＡ形成能力を有さないより一般的なもの）を放出するステップ、特に５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存核酸ポリメラーゼ又は鋳型依存核酸ポリメラーゼ及び本明細書で定義した非依存的エンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）を含む前記で定義した混合物を、加水分解させたＴＣプローブをせずタンするための５’→３’ヌクレアーゼ活性を可能にする条件下で維持する条件下で切断を生じて標識した加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）を放出するステップ、
－ 好ましくはそれぞれ分析物にハイブリダイズさせたＴＸプローブを本明細書において定義した切断部位で切断し、放出させた、好ましくは一本鎖の本明細書において記載した加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）を得るステップ、
－ 特に放出させた加水分解生成物を遊走させるステップ、
－ 電気泳動、好ましくはキャピラリー電気泳動、最も好ましくはＭＯＤＡＰＬＥＸ装置でのＣＥによって好ましくは少なくとも１つ以上の加水分解生成物を分離するステップ、及び
－ それぞれの加水分解生成物が、標的配列内の分析物の存在、好ましくは分析物内の分子バリエーション（ＳＮＰ又はＤＩＰ（略称ＩＮＤＥＬ））の存在を示し、特に、本明細書において記載したそれぞれのプローブ（Ｔ１－ｎ）の逆相補配列によって標的されている、放出させた加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）を、好ましくは蛍光定量的に、最も好ましくはＭＯＤＡＰＬＥＸ装置で検出するステップ
を含む、前記方法である。
【0012】
前記方法の他の実施形態は、ＴＸプローブが、ＴＸプローブのハイブリダイズ配列の５’末端から位置１（下流）又は位置２（下流）のいずれかで少なくとも１つのヌクレアーゼブロッカーを含み、それによって本明細書において定義した耐性を付与することである。
【0013】
前記方法は、本明細書において記載した任意の公知のキャピラリー電気泳動（ＣＥ）装置、好ましくはＭＯＤＡＰＬＥＸ装置に適用できる。好ましくは、前記法は、本明細書において定義した「多重」方法であり、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０以上の標的、例えば、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２５０以上の分析物の、好ましくは異なる標的配列内の複数の異なる分析物の同時検出を可能にする。好ましくは、それぞれのＴＸプローブは全て同一の蛍光標識を含む。他の実施形態において、１つの標的配列は１つの分析物を含むが、１つの標的配列は、異なるＴＸプローブで標的した複数の分析物及び／又は分子バリエーションを含んでよい。したがって、それぞれのＴＸプローブは、１つの分析物、好ましくは１つの分子バリエーションに特異的であり、したがって複数のＴＸプローブは同一の標的配列を標的とするが、同一の標的配列内の異なる分析物を標的としてよい。
【0014】
本明細書において記載した本発明の方法は、前記ステップ（接触、ハイブリダイゼーション、二本鎖の形成、伸展（伸長）、切断、複製、分離及び検出）の複数のサイクルを含み、さらに以下：
－ 任意に、少なくとも１つの分析物を含む標的配列を変性するステップ
－ プライマー及び少なくとも１つのＴＸプローブを（一本鎖又は二本鎖の）標的配列及び分析物にアニーリングするステップ、並びに
－ 標的配列にポリメラーゼを重合するステップ
を含んでよい。
－ 任意に、少なくとも１つの分析物を含む標的配列を変性するステップ
－ プライマー及び少なくとも１つのＴＸプローブを（一本鎖又は二本鎖の）標的配列及び分析物にアニーリングするステップ、並びに
－ 標的配列にポリメラーゼを重合するステップ
を含んでよい。
【0015】
本明細書において記載した複製及び増幅反応は、プライマーが標的配列にハイブリダイズし、ポリメラーゼによって伸長されるが、ＴＸプローブは伸長されない条件下で実施される。当業者により認識されるように、かかる反応条件は、対象の標的及びプライマーの組成に応じて変動しうる。複製及び増幅の反応サイクル条件は、プライマーが標的配列に特異的にハイブリダイズして伸長するように選択される。標的に特異的にハイブリダイズするプライマーは、分析される試料中に存在してよい他の核酸と比較して、優先的に標的配列を増幅する。本明細書において記載した方法の一実施形態において、標的配列は、分析物の技術的かつ特異的な検出に必須である分析物及びアドレス配列の周囲の他の領域を含む。ＰＣＲの場合において、特定のＤＮＡ領域の増幅のためのプライマー対は、（必須ではないが）特異性を保証するために少なくとも１つのプライマーを「アドレス配列」に配置するように設計される。したがって、少なくとも１つのプライマー、好ましくは２つのプライマーは、分析物の外側に結合するが、分析物を絶対に囲まなくてはならず、しかし分析物と重なってはいけない。プライマーは、遺伝的バリアントの上流及び下流に結合するが、必ずしも分析対象内にはない。
【0016】
標的配列及びそれぞれのＴＸプローブに応じて、及び記載した方法で放出させた加水分解生成物の特異的シグナルを可能にするために、少なくとも１つのヌクレアーゼブロッカーの適切な位置を、本明細書において定義したように選択する。ＴＸプローブとその切断可能な加水分解生成物を完全にハイブリダイズする場合に、第１のヌクレアーゼブロッカーは、第２のハイブリダイズする５’末端ヌクレオチドにあり、必要に応じて第２のヌクレアーゼブロッカーは、ＴＸプローブの切断可能な生成物の５’末端配列の第３のハイブリダイズするヌクレオチドにあってよい。ヌクレアーゼブロッカーの追加が可能である。切断可能な加水分解生成物が標的配列上の対応する配列に対するＦＬＡＰ（例えば少なくとも１つのヌクレオチド）を含むという条件で、第１のヌクレアーゼブロッカーは、ＴＸプローブの切断可能な加水分解生成物の５’末端配列の第１のハイブリダイズしない５’末端ヌクレオチド（ＦＬＡＰ）にあり、第２のヌクレアーゼブロッカーは、５’末端配列の第３のハイブリダイズするヌクレオチドにある。したがって、個々のＦＬＡＰの望ましくない切断及びしたがって望ましくない人為構造は、本明細書において記載した方法において回避される。特に、本発明による少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカーは、二本鎖ＤＮＡ特異的５’→３’ヌクレアーゼ活性についての、又は本明細書において記載したヌクレアーゼ活性を示し、本明細書において記載した加水分解生成物を放出するためにＴＸプローブを切断するために適している任意の他の酵素についての所望の切断部位を決定する。これらのヌクレアーゼは、本明細書において記載したエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼである。ヌクレアーゼについての切断部位は、少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカーの５’上流、より詳述すれば内部ヌクレアーゼブロッカーの隣の標的配列にハイブリダイズするＴＸプローブの少なくとも１つ、２つ又は３つの、特に最後のヌクレオチドの３’下流にある（図１）。好ましくは、切断部位は、標的配列（好ましくは分析物）にハイブリダイズするＴＸプローブの３’下流の唯一の（かつ最後の）ヌクレオチドの後に特異的に位置する。この場合、ＴＸプローブは本明細書において記載したＦＬＡＰを含み、それは標的配列にハイブリダイズせず、したがって前記で定義した断部位に関連しない。したがって、切断後に、少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカーを含む３’下流配列は加水分解生成物の一部ではないが、標的配列にハイブリダイズする少なくとも１つ、２つ又は３つのヌクレオチド、好ましくは１つが、加水分解生成物の一部になる（図１）。好ましくは、ヌクレアーゼブロッカーは、リン酸ジエステルを介してＴＸプローブの３’下流配列に結合される。ヌクレアーゼブロッカーは、シグナルの特異性のために必須であり、実施例において示した高度に特異的なシグナルは先行技術を考慮すると予想外である。少なくとも２つのヌクレアーゼブロッカーが、切断可能な加水分解生成物の第１及び第３のハイブリダイズする５’末端ヌクレオチドに位置する他の実施形態において、切断部位は、第１のヌクレアーゼブロッカーと第２のヌクレアーゼブロッカーとの間にある。第１のヌクレアーゼブロッカー（第１のヌクレオチドにおける）は、２つの放出生成物への切断可能な加水分解生成物の非特異的切断を回避し、本発明の意味の範囲内で特異的シグナルを確実にする。
【0017】
本発明による内部ヌクレアーゼブロッカーの実現可能性は実施例１に示されており、ＬＮＡを使用して定義した位置でハイブリダイズしたＴＸプローブのヌクレアーゼ活性に対する耐性を付与することに成功した。同様の又は改善した耐性は、ＬＮＡに次いで他の骨格修飾を示すＴＸプローブでも達成された。好ましくは、ＥＮＡ、ＢＮＡ３、ＰＭＯ、ＰＮＡ、オルト－ＴＩＮＡ又はパラ－ＴＩＮＡヌクレオチドである。
【0018】
従来技術のオリゴヌクレオチドプローブは、増幅ステップを含む方法において非特異的シグナルを生じる。これは、従来技術のオリゴヌクレオチドプローブの５’末端がプライマーの１つの３’末端にアニール又は部分的にアニールし、プローブの５’ヌクレオチドがミスマッチとして残り、ポリメラーゼ酵素が潜在的にこれを基質として認識しプローブを切断しうるという事実によるものである。切断したオリゴヌクレオチドプローブは、露出した３’末端ヒドロキシル基を有し、プライマーとして機能することができる。プローブはプライマーに変わり、逆方向プライマー上で伸長する。次のサイクルで、プライマーとなった伸長プローブは、逆方向プライマーの鋳型としてコピーされる。したがって、生じた二本鎖は、プローブ及び逆方向プライマーから生じた全ての配列を有してよいが、標的からは生じない。これを考慮すると、本発明のＴＸプローブは、かかる非特異的増幅を回避し、その結果好ましくはＣＥ内での非特異的シグナルを回避するために骨格修飾及び非骨格修飾及び／又は内部ヌクレアーゼブロッカーを提供する（実施例１）。本発明は、本明細書において記載した明確で特異的なシグナルのための切断可能な加水分解プローブを含む本発明のＴＸプローブの設計のための指示を当業者に提供する。これは、修飾及び／又は内部ヌクレアーゼの本発明の組み合わせによって達成できる。
【0019】
本発明による方法の好ましい実施形態において、前記方法は、癌疾患、例えば、白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＬ、ＡＭＬ、ＣＭＬ又は任意の固形腫瘍（例えば、肺、肝臓、腎臓、膵臓、前立腺、乳房、子宮）を含む造血器癌の検出のため、好ましくは前記癌に特異的な分子バリエーション（ＳＮＰ又はＤＩＰ（略称ＩＮＤＥＬ））の検出、並びに生物及び病原体、例えば異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの鑑別診断の検出のためのものであるが、ただし、これらに制限されない。本発明の方法は、これらに制限されないが、癌の検出に適していることは、実施例７及び本明細書において記載した表３のＴＸプローブに示されている。
【0020】
本発明の他の態様は、切断可能な加水分解生成物（図１）及び放出した加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）が、少なくとも１つのヌクレオチド、特に骨格修飾、非骨格修飾及び／又は人工塩基を含むＴＸプローブの５’末端の少なくとも１つのヌクレオチドの塩基、糖環及び／又は官能基の少なくとも１つの修飾をさらに含む、前記した方法であり、ここで
－ 骨格修飾は、ヌクレオチドの五炭糖の２’位及び／又は４’位での人工修飾を含み、
－ 非骨格修飾は、ヌクレオチドの５’末端及び／又は３’末端に結合する人工化学修飾を含む。
－ 骨格修飾は、ヌクレオチドの五炭糖の２’位及び／又は４’位での人工修飾を含み、
－ 非骨格修飾は、ヌクレオチドの５’末端及び／又は３’末端に結合する人工化学修飾を含む。
【0021】
さらなる態様は、本明細書において記載した本発明の方法及び／又はＴＸプローブであり、ここで、非骨格修飾、特にＴＸプローブの５’末端の少なくとも１つのヌクレオチドの骨格修飾が、ヌクレオチドの３’末端及び／又は５’末端に、又は２つのヌクレオチド間に結合した化学構造であるスペーサーを含み、かつ好ましくは
ａ） （Ｃn）－ＯＨ［式中、ｎは整数であり、少なくとも３、好ましくは３、６、９又は１２である］のアルキルアルコール、プロパニル（スペーサーＣ３）、ヘキサニル（スペーサーＣ６）、ノナニル（スペーサーＣ９）及びドデカニル（スペーサーＣ１２）を含む（Ｃn）－ＯＨのアルキルアルコール、
ｂ） （Ｃ－Ｏ－Ｃ－Ｃ）n－ＯＨ［式中、ｎは整数であり、少なくとも１である］のグリコールエーテル、好ましくはトリエチレングリコール（スペーサー９）、テトラエチレングリコール（スペーサー１２）、及びヘキサエチレングリコール（スペーサー１８）を含む（Ｃ－Ｏ－Ｃ－Ｃ）n－ＯＨのグリコールエーテル、及び／又は
ｃ） ２’－デオキシリボースの１位にメチレン基を有するテトラヒドロフラン誘導体
から選択される。
ａ） （Ｃn）－ＯＨ［式中、ｎは整数であり、少なくとも３、好ましくは３、６、９又は１２である］のアルキルアルコール、プロパニル（スペーサーＣ３）、ヘキサニル（スペーサーＣ６）、ノナニル（スペーサーＣ９）及びドデカニル（スペーサーＣ１２）を含む（Ｃn）－ＯＨのアルキルアルコール、
ｂ） （Ｃ－Ｏ－Ｃ－Ｃ）n－ＯＨ［式中、ｎは整数であり、少なくとも１である］のグリコールエーテル、好ましくはトリエチレングリコール（スペーサー９）、テトラエチレングリコール（スペーサー１２）、及びヘキサエチレングリコール（スペーサー１８）を含む（Ｃ－Ｏ－Ｃ－Ｃ）n－ＯＨのグリコールエーテル、及び／又は
ｃ） ２’－デオキシリボースの１位にメチレン基を有するテトラヒドロフラン誘導体
から選択される。
【0022】
前述の修飾及び／又はそれらの組み合わせのそれぞれは、本発明によって包含され、それぞれ本発明の意味の範囲内で特定の分析物を表す特定のシグナルを生じる。本発明によるそれぞれのＴＸプローブのそれぞれの切断可能な加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）は、本明細書において定義した１つ以上のスペーサー及び／又は修飾を含んでよい。本発明による方法の多重アプローチにおいて、所望の量の異なるＴＸプローブは、所望の量の異なるＴＸプローブと異なるスペーサー及び／又は修飾を有してよい。前記多重アプローチにおける他の実施形態において、全てのＴＸプローブは、同一の蛍光標識で標識され、スペーサー及び／又はリンカー及び／又は他の骨格／非骨格修飾である前記修飾により異なる。放出された全ての加水分解生成物はそれぞれキャピラリー電気泳動（ＣＥ）における他と区別可能な個別のシグナルによって、好ましくは、例えば図４、図５又は図６に示したように適切なＣＥ装置、好ましくはＭＯＤＡＰＬＥＸ装置内のＣＥにおけるそれぞれのピーク（曲線）として検出可能である。ＴＸプローブを修飾するための本発明によるスペーサーの実現可能性及び放出された加水分解生成物の移動を実施例３に示し、スペーサー１８、スペーサーＣ１２、ｄスペーサー及びスペーサーＣ３を使用して、ＣＥ内でのそれぞれのスペーサーについて明確で特異的なシグナルを得ることに成功した。結果として、それらを同一の加水分解生成物（配列、リンカー及び標識）と組み合わせると、区別できるスペーサーにより、異なる明確で特異的なシグナルが得られる。
【0023】
本発明の方法のさらなる態様において、リンカーは、切断可能な加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）に、好ましくはＴＸプローブの切断可能な加水分解生成物の少なくとも１つのヌクレオチドに修飾及び／又は標識を導入するためのカップリング反応から生じる化学構造である。ＴＸプローブを修飾するための本発明によるリンカーの実現可能性及び放出された加水分解生成物の移動を実施例４に示し、ＮＨＳエステル又はクリックケミストリー（ＡＣＨ）を介した最も効率的なカップリングケミストリーを使用して、ＣＥ内で明確で特異的なシグナルを得ることに成功した。結果として、それらを同一の加水分解生成物（配列、スペーサー及び標識）と組み合わせると、区別できるリンカーにより、異なる明確で特異的なシグナルが得られる。好ましくは、特異性及び／又は多重度を高めるために、前記リンカーを本明細書において記載したスペーサーと組み合わせてよい。
【0024】
種々の修飾、スペーサー及び／又は種々のリンカーの適切な組み合わせは、多重度を増加させ、好ましくは、本発明の意味の範囲内の特定の分析物のそれぞれの程度を表す特定のシグナルの多重度を増加させる。本発明の方法及び本発明のＴＸプローブの他の実施形態において、ＴＸプローブの切断可能な加水分解生成物の同一の、好ましくは蛍光性の標識及び同一の長さ及び同一の配列を維持しながら、修飾及び／又はリンカーを組み合わせる。同一の配列であるが本発明による異なる蛍光体、リンカー及び修飾を有する加水分解生成物からなる本発明のＴＸプローブの実現可能性を実施例５に示す（図６、表２）。それぞれ特徴的な移動挙動を示す種々の放出された加水分解生成物は、それぞれのＴＸプローブ及び加水分解生成物の設計により、それぞれのＣＥ内の明確で特異的なシグナルを検出したことをうまく示している。結果として、それらを同一の加水分解生成物と組み合わせると、本発明に従って非常に高い多重度が得られ、さらにそれを高めることができる。
【0025】
本発明によるそれぞれのＴＸプローブのそれぞれの切断可能な加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）は、本明細書において定義した１つ以上の骨格修飾又は非骨格修飾を含んでよく、好ましくは特異的シグナルを生じる。本発明による方法の多重アプローチにおいて、所望の量の異なるＴＸプローブは、所望の量の異なるＴＸプローブと異なる修飾を有してよい。前記多重アプローチにおける他の実施形態において、全てのＴＸプローブが同一の蛍光標識で標識され、前記修飾が骨格修飾、非骨格修飾及び／又はリンカーであるために異なり、ここで、放出された全ての加水分解生成物はキャピラリー電気泳動における他と区別可能な個別のシグナルによって、好ましくは、例えば図４、図５又は図６に示したように適切なＣＥ装置、好ましくはＭＯＤＡＰＬＥＸ装置内のＣＥにおけるそれぞれのピーク（曲線）として検出可能である。
【0026】
本発明によるリンカーも他の修飾も、ＤＮＡポリメラーゼ又はエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼの活性に影響を及ぼさないことは、当業者には明らかである。
【0027】
前記方法の他の態様において、複数の分析物である特異的３’配列（Ｔ１－ｎ）を有する複数のＴＸプローブ（プローブ１－ｎ）が使用され、好ましくはＴＸプローブ及びそれぞれの切断可能な加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）が分析物に対応し、全てのそれぞれの切断可能な加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）は、それぞれ切断可能な加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）の少なくとも１つのヌクレオチドに結合した同一の標識を含み、それぞれが異なるリンカー及び／又は少なくとも１つの異なる修飾を含む。少なくとも１つのヌクレオチドは同一又は異なっていてよく、１超のヌクレオチドであってよい。
【0028】
本明細書において記載した方法の他の態様において、複数のＴＸプローブは同一であり、同じ切断可能な加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）からなるが、特に分析物を含む標的配列へのハイブリダイゼーション後、ヌクレアーゼによって異なる加水分解生成物が放出され（図１Ｂ）、かつ好ましくはＣＥにおいて、それぞれ別個の明確なシグナルによって検出される。それぞれのＴＸプローブ、特に切断可能な加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）は、全て、同一の配列、ヌクレアーゼブロッカー、リンカー及び／又は修飾からなる。標識は同一であるか又は異なっていてよい。標的配列へのハイブリダイゼーション後に、ヌクレアーゼは、本明細書において記載した所望の切断部位で切断する。それにより、分析物、好ましくはＳＮＰ内の分子バリエーションにより、異なる（少なくとも２つの）加水分解生成物が放出され（図１Ｂ）、本明細書において記載した方法で分離及び検出される。本発明のこの実施形態において、少なくとも１つ、２つ、３つ又はそれ以上の分子バリエーションが検出可能である。
【0029】
好ましくは、放出された複数の加水分解生成物は、全て分離され、同一のものはそれぞれのシグナルによって検出され、特にそれぞれのシグナルは、特有の分析物、好ましくは分析物内の分子バリエーションを表す一定量の同一の加水分解生成物を表す。ここで、それぞれのシグナルは、好ましくはキャピラリー電気泳動内で、最も好ましくは適切なＣＥ装置、例えばＭＯＤＡＰＬＥＸ装置内で、明確で特異的なピーク（曲線）によって表される。好ましい実施形態において、「明確で特異的なシグナル」は、望ましくない人為構造を含まない加水分解生成物のみが検出され、それらの望ましくない人為構造が生じないことを意味する。本明細書において記載した方法及び本明細書において記載した本発明のＴＸプローブから放出された加水分解生成物の使用によって得られるシグナルの特異性は、ヌクレアーゼブロッカーによって得られる。ヌクレアーゼブロッカーは、実施例において示すように、高度に特異的なシグナルに不可欠である。本明細書において示した結果は、従来技術を考慮して予想外である。
【0030】
本発明の方法の他の態様において、複数の切断可能な加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）（多重度）は、少なくとも同じ切断可能な加水分解生成物（同一の配列、修飾及び／又はスペーサー＝任意のものを有する）を、異なる標識、好ましくは異なる蛍光体と組み合わせることによって増加させることができる。これは、本明細書において記載したか又は当業者に公知の異なる蛍光体を有する少なくとも２０の同一の加水分解生成物の区別を可能にする。好ましくは、「多重」は、好ましくは少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０又はそれ以上の標的、例えば少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２５０又はそれ以上の標的の異なる標的配列内の、複数の異なる分析物の検出を示す。
【0031】
本発明の方法の他の態様において、切断可能な加水分解生成物の長さを変えることによって多重化を増加させることができ、ここで加水分解生成物は、同じ標識、リンカー及び／又は修飾にもかかわらず、長さにより電気泳動において異なる移動挙動を引き起こす１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個のヌクレオチドを含む。多重化の程度は、本明細書において記載した異なる標識、異なるプローブ長及び／又は異なる修飾及び／又はリンカーによってさらに高めることができる。
【0032】
本発明の方法及び本発明の加水分解生成物を含む本発明のＴＸプローブに従って、最初に放出された加水分解生成物Ｌ１は、第１の分析物、好ましくは第１の分析物Ｔ１内の第１の分子バリエーションの存在を示し、Ｌ２は、同一の集合的連続反応における第２の分析物Ｔ２の存在を示す。同じことがＬｎ及びＴｎに当てはまり、ｎはそれぞれ、少なくとも２、１０、２０、２５、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００から少なくとも２０００までの整数である。したがって、本発明による方法は、ＴＸプローブとそれぞれ切断された加水分解生成物が、好ましくは本発明の連続反応装置で同時に、それぞれ同量の特定の異なる分析物を表す少なくとも２、１０、２０、２５、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００から少なくとも２０００までの特異的で明確なシグナルの検出（定性的及び／又は定量的）を可能にする。好ましくは、１つの標的配列は１つの分析物を含むが、他の実施形態において１つの標的配列は２つ以上の分析物を含んでよい。
【0033】
本発明による方法の他の態様において、未修飾配列と比較した、好ましくは少なくとも１つの標的配列内の、少なくとも１つの分析物、好ましくは少なくとも１つの未修飾分析物の分子レベルでのバリエーション（同義語「分子バリエーション又はバリアント」）が検出可能であり、好ましくは同定され、特に相対的又は絶対的に定量化され、
－ 少なくとも１つの分析物内の少なくとも１つの突然変異、ここで放出された各加水分解生成物は、複製、点変異、置換、欠失、挿入、フレームシフト、転座、ｍＲＮＡスプライスバリアント及び／又は他の塩基バリエーション（例えばＤＮＡメチル化又はＤＮＡヒドロキシメチル化）を表す特定の配列の存在を示し
－ ジェノタイピング、
－ コピー数の変動及び／又は
－ 発現レベルの変動
を含む。同一の標的配列内のさらなる変異は、異なる分析物を定義し、かつそれぞれの量の特定のＴＸプローブによって検出される。
－ 少なくとも１つの分析物内の少なくとも１つの突然変異、ここで放出された各加水分解生成物は、複製、点変異、置換、欠失、挿入、フレームシフト、転座、ｍＲＮＡスプライスバリアント及び／又は他の塩基バリエーション（例えばＤＮＡメチル化又はＤＮＡヒドロキシメチル化）を表す特定の配列の存在を示し
－ ジェノタイピング、
－ コピー数の変動及び／又は
－ 発現レベルの変動
を含む。同一の標的配列内のさらなる変異は、異なる分析物を定義し、かつそれぞれの量の特定のＴＸプローブによって検出される。
【0034】
分子レベルでの「バリエーション」（又は分子バリアント）は、分析されるべき標的配列、好ましくはＲＮＡ又はＤＮＡが、他の公知の配列と比較して分子偏差を示すことを意味する。分子レベルでの前記バリエーションは、この意味において「未修飾」である標準配列、コントロール配列又は比較配列と比較して同定及び検出されてよい。例えば、「未修飾」は親の遺伝子型であり、分子バリエーションが次世代で同定されるべきであるが、その他の比較も「未修飾」配列として使用されてよい。
【0035】
本発明の方法の他の態様において、分析物内の、又は好ましくは少なくとも１つ以上の分析物内の標的配列内の、一塩基多型（ＳＮＰ）のそれぞれのアレルバリアントは、（それぞれのＴＸプローブの）放出されたそれぞれの加水分解生成物によって検出され、好ましくは、それぞれのアレルバリアントは、放出されたそれぞれの加水分解生成物によって検出され、それぞれ別個のシグナルによって分離及び定量される。ここで、それぞれのシグナルは、好ましくは望ましくない人為構造のない、ＣＥにおける明確なピーク（曲線）として表される。好ましくは、それぞれのＳＮＰは、前記一塩基多型（ＳＮＰ）のない分析物と比較して区別できる１つの別個のシグナルによって検出可能である。かかるＳＮＰは、定性的に、好ましくは定量的に分離及び検出されうる。好ましい実施形態において、かかるＳＮＰは、本明細書において記載した１つの同一のＴＸプローブの使用によって分析されうる。実施例６（図７）は、本発明の方法及び本発明によるＴＸプローブを使用したＳＮＰの検出の実現可能性を示す。同様のことがＤＩＰ（ＩＮＤＥＬと同義）に当てはまる。
【0036】
ＤＮＡ一塩基多型（ＳＮＰ、時に一塩基バリアント、ＳＮＶとも言う）は、一般に全ての生物及びウイルスにおいて観察される。最大４つの異なるヌクレオチドがＳＮＰの多様性を定義してよいが、ＤＮＡ複製中にヌクレオチドのトランスバージョンが良好に修復されるという事実により、両アレル性ＳＮＰがより頻繁に観察される。ＳＮＰは、耐性、疾患又はその他の生物学的機能の変化のような表現型変化を付与するコード領域で生じうる。さらに、それらは、遺伝コードの変性により沈黙しているか、又は進化中に非コード領域又は未知の機能の領域に蓄積しうる。この普遍性が、種々の用途を提供する。分子バイオマーカーとしてのそれらの影響に加えて、それらは、ゲノムワイド関連研究（ＧＷＡＳ）のために使用でき、進化研究（分子分類学又は疫学）の基礎であるか、又は法医学、考古学、動植物の育種において個々の存在を区別するために適用される。
【0037】
これらの適用分野の多くは、複雑な混合物中のアレル頻度の定量化のための正確な方法を必要とする。一例として、同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後のドナー白血球及び患者白血球の比率を定義するキメラモニタリングがある。他の例は、非変異間質細胞及び造血細胞（血管新生及び免疫応答）も含まれてよい複雑な固形生検内の腫瘍細胞のパーセンテージを定量化することである。さらに、検査試料のプールは、費用及び時間を安全にするために、ＧＷＡＳ及び他のスクリーニング適用、例えば疫学において有利である。リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、これらの問題に対処する最先端技術でる。しかしながら、ＳＮＰアレルを識別及び定量するために、異なるアニーリング温度及び／又は異なる蛍光体を有する異なるプローブを適用する必要がある。さらに、標準化のために参照反応を適用する必要がある。プライマー、プローブ及び反応条件（成分の濃度及びサイクル条件）の設計及び検証は、（同等の増幅効率及びプローブ切断効率を得るために）時間を消費する最適化ステップを必要とし、適用される機器の多重化能力は低い。代わりに、デジタルエンドポイントＰＣＲ又は次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技術のような非常に時間を消費し費用がかかるデジタルジェノタイピングアプローチのみが適用されうる。
【0038】
本発明に基づいて、これらの欠点は、同一の蛍光体で標識した単一のＴＸプローブを適用して、一般的な反応条件を使用する１回のＰＣＲで異なるＳＮＰ又はＤＩＰのアレルを遺伝子型同定及び定量することによって解消されうる。
【0039】
本発明による方法の好ましい実施形態において、分離は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって、好ましくは適切なＣＥ装置内でのＣＥによって、最も好ましくはＭＯＤＡＰＬＥＸ装置内で実施される。この方法を分離した装置（例えばＰＣＲを独立して分離）で実施できるが、この方法はソフトウェアによって制御される単一の装置で実施されることが好ましい。最も好ましくは、本明細書において記載した方法は、ＰＣＲ及び分離を実施する完全に密閉された滅菌システム、例えばＭＯＤＡＰＬＥＸ装置内で実施される。本発明によるＭ適切な単一のＣＥ装置、例えばＭＯＤＡＰＬＥＸ装置の利点は、方法及びＴＸプローブ及びその使用に起因するものに加えて、相互汚染の回避、高品質の試験試料の維持、検査室スタッフによる手動介入、本明細書において記載した方法の望ましい条件のプログラミング、方法の進行及びシグナルの発生の監視の最小限化又は排除である。
【0040】
本明細書において記載した方法のために必要である全ての化学添加剤及びＣＥ装置の手段が当技術分野で周知であることは、当業者には明らかである。
【0041】
本発明による加水分解生成物の分離中の移動は、例えば
・ ５’末端に結合する標識、好ましくは蛍光体を変化させる（実施例２及び５）、
・ 移動速度に影響を与える５’修飾因子（ヌクレオチド、スペーサーなど）を挿入する（実施例３及び５）、
・ 蛍光体を５’末端に結合することによりリンカーを変える（実施例４及び５）、
・ 蛍光体が結合するヌクレオチドを変える（実施例５）、
異なるＴＸプローブ設計（図１）の使用により制御することができる。
・ ５’末端に結合する標識、好ましくは蛍光体を変化させる（実施例２及び５）、
・ 移動速度に影響を与える５’修飾因子（ヌクレオチド、スペーサーなど）を挿入する（実施例３及び５）、
・ 蛍光体を５’末端に結合することによりリンカーを変える（実施例４及び５）、
・ 蛍光体が結合するヌクレオチドを変える（実施例５）、
異なるＴＸプローブ設計（図１）の使用により制御することができる。
【0042】
実施例７は、ＴａｑＭａｎTMアッセイのための従来技術のプローブでさえ、本発明のＴＸプローブに容易に変換でき（表３）、一方で変換されたＴＸプローブの得られた感度及び特異性が、元のプローブについて記載されたものと同様に良好であったことを示す。したがって、本発明は、新規のＴＸプローブを提供するだけでなく、従来技術のプローブが本発明に従ってどのように変換され、ＣＥ装置、好ましくはＣＥ ＭＯＤＡＰＬＥＸ装置において使用されるかについての明確で可能な教示も提供する。実施例７は、得られた効果が予想外であったため、本発明による方法及びＴＸプローブの実現可能性及び発明性を証明する。
【0043】
本発明の他の目的は、分析物に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（「ＴＸプローブ」、プローブ１－ｎ）であり、ここでＴＸプローブは、
－ 少なくとも１つの特異的プライマー（Ｐ１）の相補配列の３’下流に位置する領域内の少なくとも１つの分析物の配列に逆相補的であるか又は他の実施形態において第１のプライマーＰ１と第２のプライマーＰ２との間に位置する領域内の少なくとも１つの分析物の配列に対して逆相補的である３’配列、
－ 標的配列に特異的な３’配列の３’末端にある保護基（３’ブロッカー）、及び
－ 特に少なくとも１つの修飾（内部ヌクレアーゼブロッカー）を保有するヌクレオチドに、ヌクレアーゼ活性に対する耐性を付与し、切断可能な加水分解生成物を３’下流プローブから構造的に分割する、（特に分析物、好ましくはアドレス配列及び分子バリエーションにハイブリダイズする５’配列における、より好ましくは、前記配列は、分析物にハイブリダイズする少なくとも１つの（そして最後の）ヌクレオチドの３’下流にある；他の実施形態において）ＴＸプローブのハイブリダイズ配列の５’領域における少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカーであって、切断可能な加水分解生成物、好ましくはエンド／エキソヌクレアーゼから選択されるヌクレアーゼによって切断可能な加水分解生成物が、
・ ＴＸプローブの５’末端の少なくとも１つのヌクレオチド、及び
・ リンカーを介して切断可能な加水分解生成物に架橋された標識、好ましくは蛍光体
を含む、少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカー
を含む。
－ 少なくとも１つの特異的プライマー（Ｐ１）の相補配列の３’下流に位置する領域内の少なくとも１つの分析物の配列に逆相補的であるか又は他の実施形態において第１のプライマーＰ１と第２のプライマーＰ２との間に位置する領域内の少なくとも１つの分析物の配列に対して逆相補的である３’配列、
－ 標的配列に特異的な３’配列の３’末端にある保護基（３’ブロッカー）、及び
－ 特に少なくとも１つの修飾（内部ヌクレアーゼブロッカー）を保有するヌクレオチドに、ヌクレアーゼ活性に対する耐性を付与し、切断可能な加水分解生成物を３’下流プローブから構造的に分割する、（特に分析物、好ましくはアドレス配列及び分子バリエーションにハイブリダイズする５’配列における、より好ましくは、前記配列は、分析物にハイブリダイズする少なくとも１つの（そして最後の）ヌクレオチドの３’下流にある；他の実施形態において）ＴＸプローブのハイブリダイズ配列の５’領域における少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカーであって、切断可能な加水分解生成物、好ましくはエンド／エキソヌクレアーゼから選択されるヌクレアーゼによって切断可能な加水分解生成物が、
・ ＴＸプローブの５’末端の少なくとも１つのヌクレオチド、及び
・ リンカーを介して切断可能な加水分解生成物に架橋された標識、好ましくは蛍光体
を含む、少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカー
を含む。
【0044】
ＴＸプローブ（及びその使用、及び本発明のキットに含まれるもの）の他の実施形態において、内部ヌクレアーゼブロッカーを保有する少なくとも１つの（そして最後の）ヌクレオチドは、本発明の意味の範囲内で前記バリエーションのない「未修飾」配列と比較して、分析物内の分子バリエーションの特定の位置にハイブリダイズする。
【0045】
記載したＴＸプローブの実施形態において、それは、分析物及び（分析物の技術的かつ特異的な検出に必須である）アドレス配列の周りの他の領域を含む標的配列内の分析物を標的とするように設計され、少なくとも１つのプライマーの場合に、特異性を保証するために（ただし必須ではない）、前記プライマーは「アドレス配列」に配置される。したがって、少なくとも１つのプライマー、好ましくは２つのプライマーは、分析物の外側に結合するが、分析物を絶対に囲まなくてはならず、しかし分析物と重なってはいけない。プライマーは、遺伝的バリアントの上流及び下流に結合するが、必ずしも分析対象内にはない。
【0046】
前記内部ヌクレアーゼブロッカーは、好ましくは、ＬＮＡ（実施例１）、ＥＮＡ、ＢＮＡ３、ＰＭＯ、ＰＮＡ、オルト－ＴＩＮＡ又はパラ－ＴＩＮＡヌクレオチドである。ＴＸプローブの他の実施形態は、少なくとも１つのヌクレアーゼブロッカーが、特に分析物にハイブリダイズする、ＴＸプローブのハイブリダイズ配列の５’末端から位置１（下流）又は位置２（下流）のいずれかであり、それによって本明細書において定義した耐性を付与することである。実施例８及び実施例９は、ＬＮＡ及び他のブロッカーの使用も示す。
【0047】
本発明によるＴＸプローブのいくつかの実施形態が図９に示されているが、その設計はそれらの構造に制限されない。標識、好ましくは蛍光体（同義語蛍光標識）は、ＴＸプローブの５’末端、又は１つの内部ヌクレオチド及び／又は（内部）リンカーに結合されてよい。本明細書に記載されるように、リンカーは、標識をＴＸプローブと結合し、ここで蛍光体のアジド基がリンカー剤の官能基との結合反応に加わる。
【0048】
ＴＸプローブのヌクレオチド配列は、少なくとも６～３５（及び６～３５の間の任意の整数）のヌクレオチドを含む。加水分解生成物は、少なくとも１、２、３又はそれ以上のヌクレオチド、好ましくは１、２、３、４、５又は６、より好ましくは１、２又は３のヌクレオチドからなり、本発明による１、２又はそれ以上の修飾を含んでよい。
【0049】
Ｇａｂｅｒｔらで公開されているような選択されたＴａｑＭａｎTMプローブ配列（そこに開示されている全ての配列は参照をもって含まれる）を、図１に示し、実施例７に記載したように本発明の「ＴＸプローブ」に変換した。本発明による他の修飾を、本発明に包含される他のＴａｑＭａｎTMプローブ配列に適用できる。したがって、本発明の他の態様は、本明細書において記載した少なくとも１つの修飾を含むＴＸプローブの製造方法である。好ましくは、前記方法において、ＴａｑＭａｎTMプローブは、好ましくはＧａｂｅｒｔらに記載されている遊離体（educt）（出発物質）であり、本明細書において記載したように修飾され、本発明によるＴＸプローブが得られる。
【0050】
本発明の他の態様は、ＴＸプローブであって、切断可能な加水分解生成物が、少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカー、好ましくはＬＮＡ、ＥＮＡ、ＢＮＡ３、ＰＭＯ、ＰＮＡ、オルト－ＴＩＮＡ又はパラ－ＴＩＮＡヌクレオチドの５’上流に位置する分析物に非特異的な５’配列（ＦＬＡＰ）を含み、かつ標識が、リンカーを介して
－ プローブのＦＬＡＰの５’末端（５’リンカー）、又は
－ 少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカーから５’上流の内部ヌクレオチド
に結合されている、ＴＸプローブである。
－ プローブのＦＬＡＰの５’末端（５’リンカー）、又は
－ 少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカーから５’上流の内部ヌクレオチド
に結合されている、ＴＸプローブである。
【0051】
ＦＬＡＰ配列は、１～２０ヌクレオチド、好ましくは１～１５、１～１０、１～５ヌクレオチドの非ハイブリダイズ（ミスマッチ）５’オーバーハングであるか、又は１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個の非ハイブリダイズヌクレオチドを含んでよい。少なくとも１つ以上のヌクレオチドは、本明細書において記載した修飾を含んでよい。最大２０ヌクレオチドのＦＬＡＰは、ヌクレアーゼ、好ましくはＦＥＮの活性を増加する。ＦＬＡＰは、切断可能な加水分解生成物の特定の設計、又は本明細書において記載したＳＮＰ検出の特定の実施形態を考慮したミスマッチの結果によるものであってよい。
【0052】
所望の複数のＴＸプローブの使用により、標的配列内（１つ以上の標的配列内）の対応する複数の分析物（好ましくは分子バリエーション）が、本明細書において記載した方法で検出され、これにより、対応する加水分解生成物が、好ましくはＣＥ装置内で放出、分離及び検出される。これは、本明細書において記載されるように検出される全ての所望の分析物（好ましくは分子バリエーション）のために、例えば癌疾患、例えば、白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＬ、ＡＭＬ、ＣＭＬ又は任意の固形腫瘍（例えば、肺、肝臓、腎臓、膵臓、前立腺、乳房、子宮）を含む造血器癌、並びに生物及び病原体、例えば異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの鑑別診断の検出のために適用可能であるが、ただしこれに制限されない。
【0053】
本発明によるＴＸプローブの他の態様において、切断可能な加水分解生成物、特にＴＸプローブの切断可能な加水分解生成物（図９に示す）は、特に骨格修飾、非骨格修飾、及び／又は人工塩基を含む塩基、糖環及び／又は官能基で少なくとも１つのヌクレオチドの少なくとも１つの修飾を含み、ここで、
－ 骨格修飾は、ヌクレオチドの五炭糖の２’位及び／又は４’位での人工修飾を含み、
－ 非骨格修飾は、ヌクレオチドの５’末端及び／又は３’末端に結合する人工的な化学修飾を含む。
－ 骨格修飾は、ヌクレオチドの五炭糖の２’位及び／又は４’位での人工修飾を含み、
－ 非骨格修飾は、ヌクレオチドの５’末端及び／又は３’末端に結合する人工的な化学修飾を含む。
【0054】
本発明によるＴＸプローブの修飾は、好ましくはスペーサーであり、リンカーとＴＸプローブの５’末端での少なくとも１つの（内部又は末端）ヌクレオチド（例えば、図９ｄ、９ｇ）との間で結合されてよく、これは、標的配列内、又はリンカーとＦＬＡＰの５’末端との間で分析物にハイブリダイズする（図９ｅ）。図９において示した実施形態は、２個又は３個（又はそれ以上）のヌクレオチドを有するＴＸプローブにも適用可能であり、少なくとも１つの修飾は、本明細書において記載したように、第１、第２又は第３のヌクレオチドにあってよい。２つ以上の修飾を組み合わせる場合に、それらは前記ヌクレオチドのいずれか１つにあってよい。一実施形態において、スペーサーは、ホスホジエステル結合と隣接するアルキルアルコール又はグリコールエーテルを含み、少なくともヌクレオチド又は２つのヌクレオチドの間の又は５’リンカーの３’末端及び／又は５’末端に結合する。好ましくは、スペーサーはＦＥＮのＦＬＡＰ、内部ヌクレオチド及び／又は５’末端ヌクレオチドに結合する。１超のヌクレオチドを含むＴＸプローブの他の実施形態が本明細書において記載されている。
【0055】
本発明の他の目的は、本発明によるＴＸプローブから、好ましくは本発明による方法で、好ましくは本明細書において記載したヌクレアーゼ活性（エキソ又はエンドヌクレアーゼ）によって放出させた加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）である。ＴＸプローブ及び放出された加水分解生成物は、核酸の検出及び定量のための他の方法において使用されうる。本発明のさらなる態様は、本発明によるＴＸプローブの製造方法である。放出された加水分解生成物は、分析物の存在を証明し、加水分解生成物は、好ましくは密閉かつ無菌及び／又は自動化した同一の装置内で、本発明による方法によって生成されてよく、又は第１の装置で生成され、第２の装置で分離及び検出を独立して実施してよい。本発明に従って、前記方法を完全に１つの装置内で実施することが好ましく、より好ましくは密閉及び無菌装置で、さらにより好ましくは本明細書において記載した自動化方法を可能にする装置で実施する。しかしながら、１つ以上の任意の装置は、本発明によるＴＸプローブを使用することによって、所望の検出及び好ましくは別個のシグナルによる検出の視覚化を可能にする。好ましくは、シグナルはキャピラリー電気泳動のピーク（曲線）である。最も好ましくは、この方法はＭＯＤＡＰＬＥＸ装置で実施される。
【0056】
本発明の他の目的は、本発明による少なくとも１つの分析物に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（「ＴＸプローブ」、１－ｎ）の使用及び／又は本明細書において記載した少なくとも１つ以上の分析物の検出方法における本発明による加水分解生成物の使用である。
【0057】
本発明による使用の他の態様において、特にＣＥ内、好ましくはＭＯＤＡＰＬＥＸ装置のＣＥ内で検出される、放出された、特に標識された加水分解生成物は、特定の分析物の存在の確認となる。検出された配列は、分析物内のプローブの３’配列に対する逆相補配列を表し、好ましくは特定の分子バリエーションを表す。したがって、ＴＸプローブ及び切断可能な加水分解生成物は、前記加水分解生成物がそれぞれの分析物について、好ましくは分析物内の特定の分子バリエーションについて明確で特異的なシグナルを可能にするように設計される。
【0058】
本発明の他の目的は、少なくとも１つの標識した又は１超の標識した分析物に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（「ＴＸプローブ」、プローブ１－ｎ）を含むキットであり、ここでそれぞれのＴＸプローブは、
－ 少なくとも１つの特異的プライマー（Ｐ１）の相補配列の３’下流に位置する領域内の少なくとも１つの分析物の配列に逆相補的であるか又は少なくとも２つのプライマーＰ１及びＰ２の間に位置する３’配列、
－ プライマー伸長反応を阻害する、好ましくは少なくとも２つのプライマーの使用によりポリメラーゼ連鎖反応を阻害する、分析物に特異的な３’配列の３’末端にある保護基（３’ブロッカー）、及び
－ 特に少なくとも１つの修飾（内部ヌクレアーゼブロッカー）を保有するヌクレオチドに、ヌクレアーゼ活性に対する耐性を付与し、切断可能な加水分解生成物を３’下流プローブから構造的に分割する、（特に分析物、好ましくはアドレス配列及び分子バリエーションにハイブリダイズする５’配列における、より好ましくは、前記配列は、分析物にハイブリダイズする少なくとも１つの（そして最後の）ヌクレオチドの３’下流にある）ＴＸプローブのハイブリダイズ配列の５’領域における少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカーであって、切断可能な加水分解生成物、好ましくはエンド／エキソヌクレアーゼから選択されるヌクレアーゼによって切断可能な加水分解生成物が、
・ ＴＸプローブの５’末端の少なくとも１つのヌクレオチド、及び
・ リンカーを介して切断可能な加水分解生成物に架橋されたラベル、好ましくは蛍光体
を含む、少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカー
を含む。
－ 少なくとも１つの特異的プライマー（Ｐ１）の相補配列の３’下流に位置する領域内の少なくとも１つの分析物の配列に逆相補的であるか又は少なくとも２つのプライマーＰ１及びＰ２の間に位置する３’配列、
－ プライマー伸長反応を阻害する、好ましくは少なくとも２つのプライマーの使用によりポリメラーゼ連鎖反応を阻害する、分析物に特異的な３’配列の３’末端にある保護基（３’ブロッカー）、及び
－ 特に少なくとも１つの修飾（内部ヌクレアーゼブロッカー）を保有するヌクレオチドに、ヌクレアーゼ活性に対する耐性を付与し、切断可能な加水分解生成物を３’下流プローブから構造的に分割する、（特に分析物、好ましくはアドレス配列及び分子バリエーションにハイブリダイズする５’配列における、より好ましくは、前記配列は、分析物にハイブリダイズする少なくとも１つの（そして最後の）ヌクレオチドの３’下流にある）ＴＸプローブのハイブリダイズ配列の５’領域における少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカーであって、切断可能な加水分解生成物、好ましくはエンド／エキソヌクレアーゼから選択されるヌクレアーゼによって切断可能な加水分解生成物が、
・ ＴＸプローブの５’末端の少なくとも１つのヌクレオチド、及び
・ リンカーを介して切断可能な加水分解生成物に架橋されたラベル、好ましくは蛍光体
を含む、少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカー
を含む。
【0059】
前記キットは、さらに任意に、特異的な標的配列の増幅に適している少なくとも１つの特異的プライマー（Ｐ１－ｎ）、好ましくは、ＰＣＲ中に少なくとも１つ以上の標的を増幅し、かつ本明細書において記載した領域にハイブリダイズするために適している少なくとも２つのプライマー（１つのプライマー対）をさらに含む。前記キットは、伸長反応、好ましくはＰＣＲ、最も好ましくは本発明による方法に必要な全ての薬剤、緩衝液及び／又は添加剤を含んでよい。前記キットの他の態様は、ＴＸプローブが、特に標的配列にハイブリダイズする、ＴＸプローブのハイブリダイズ配列の５’末端から位置１（下流）又は位置２（下流）のいずれかの少なくとも１つのヌクレアーゼブロッカーであり、それによって本明細書において定義した耐性を付与することを含む。前記内部ヌクレアーゼブロッカーは、好ましくは、ＬＮＡ（実施例１）、ＥＮＡ、ＢＮＡ３、ＰＭＯ又はＰＮＡである。
【0060】
定義
分析物は、一般的に、測定可能な特性を有する試料の構成要素として定義される（ＩＳＯ １８１１３－１：２００９）。核酸の分子診断は、核酸配列バリアント（例えば、アレルのジェノタイピング、例えば一塩基多型、欠失挿入多型、逆位、染色体間の転座、ＲＮＡのスプライスバリアント、短いタンデムリピートのような反復配列）、エピジェネティックな修飾（例えばＣｐＧメチル化又はヒドロキシメチル化）、転写後バリアント（例えば、ＲＮＡ編集及び選択的スプライシング、並びにポリアデニル化、ＡＤＰリボシル化、アデニンからイノシンへの変換、リボヌクレアーゼ分解などによるＲＮＡの成熟）又は定義したＤＮＡ配列の量的変更（例えばコピー数の変化）もしくはＲＮＡ配列の量的変更（例えば遺伝子発現におけるｍＲＮＡ）を分析するために使用される技術の集合である。核酸配列バリアントは、参照ゲノム内でのその位置を定義し、したがって複雑なゲノム又は異なる生物のＤＮＡ混合物における特異性（例えばマイクロバイオーム、環境標本の分析）を定義する、定常の核酸配列の特有な伸展に囲まれている。本明細書においてアドレス配列として定義される最大３５ｂｐの定常ＤＮＡ（constant DNA）は、精製されたＤＮＡの複雑な試験試料内の固有のＤＮＡバリアントの存在を分析するための核酸プライマー及び／又はプローブを定義するためには（配列の複雑さ及び検出技術の特殊性に応じて）ほぼ十分である。これらの特徴を考慮すると、任意の核酸配列バリアント（同義語「分子バリエーション」）、エピジェネティックな修飾、又は少なくとも１つの固有のアドレス配列を有する定量的核酸変化は、特定の分子遺伝分析物（同義語「分析物」）を定義する。
分析物は、一般的に、測定可能な特性を有する試料の構成要素として定義される（ＩＳＯ １８１１３－１：２００９）。核酸の分子診断は、核酸配列バリアント（例えば、アレルのジェノタイピング、例えば一塩基多型、欠失挿入多型、逆位、染色体間の転座、ＲＮＡのスプライスバリアント、短いタンデムリピートのような反復配列）、エピジェネティックな修飾（例えばＣｐＧメチル化又はヒドロキシメチル化）、転写後バリアント（例えば、ＲＮＡ編集及び選択的スプライシング、並びにポリアデニル化、ＡＤＰリボシル化、アデニンからイノシンへの変換、リボヌクレアーゼ分解などによるＲＮＡの成熟）又は定義したＤＮＡ配列の量的変更（例えばコピー数の変化）もしくはＲＮＡ配列の量的変更（例えば遺伝子発現におけるｍＲＮＡ）を分析するために使用される技術の集合である。核酸配列バリアントは、参照ゲノム内でのその位置を定義し、したがって複雑なゲノム又は異なる生物のＤＮＡ混合物における特異性（例えばマイクロバイオーム、環境標本の分析）を定義する、定常の核酸配列の特有な伸展に囲まれている。本明細書においてアドレス配列として定義される最大３５ｂｐの定常ＤＮＡ（constant DNA）は、精製されたＤＮＡの複雑な試験試料内の固有のＤＮＡバリアントの存在を分析するための核酸プライマー及び／又はプローブを定義するためには（配列の複雑さ及び検出技術の特殊性に応じて）ほぼ十分である。これらの特徴を考慮すると、任意の核酸配列バリアント（同義語「分子バリエーション」）、エピジェネティックな修飾、又は少なくとも１つの固有のアドレス配列を有する定量的核酸変化は、特定の分子遺伝分析物（同義語「分析物」）を定義する。
【0061】
標的核酸（又は標的配列）は、特定の技術を適用する分子遺伝学的分析物の検出のために必要である全ての情報を含む核酸配列である。これは、分子バリアント（配列及び／又は量的バリアント）、アドレス指定配列、及び配列増幅（例えばポリメラーゼ連鎖反応の場合にプライマー結合部位、ループ媒介等温増幅の場合にアクセサリープライマー結合部位）又は選択的濃縮及び／又はプローブハイブリダイゼーションによる検出のような技術的理由のために重要な全てのさらなる配列情報を包含する。
【0062】
バイオマーカーは科学的妥当性を有する分析物であり、「分析物の科学的妥当性」とは分析物と生物学的状態との関連を意味する。バイオマーカーは、例えば、病原体の検出、環境又はバイオプロセス条件の評価、食品品質検査、植物及び動物の育種、法医学、獣医学及び人間の医学に使用される。体外診断医療機器の場合に、それらは、人間（又は患者）の正常又は病原性の生物学的プロセスの指標として作用する。また、治療上の発明に対する薬理学的反応の評価も可能である。医療バイオマーカーは、疾患に関連する特定の身体的特徴又は体における生物学的に生じた測定可能な変化を示す（Ｃａｒｉｎｉら、２０１９）。臨床バイオマーカーの科学的妥当性は、広範な臨床探索及び検証試験において示されなければならない。さらに、分析前（例えば、患者のコンディショニング、サンプリング、試料の保管及び輸送、試験試料の調製）及び分析条件（適用される核酸増幅及び検出技術の能力）は、バイオマーカーの科学的妥当性、並びに診断アッセイの堅牢性及び再現性に大きな影響を与えることを言及すべきである。
【0063】
試験試料は、分析反応に直接適用される分析前プロセスの最終生成物として定義される。これは、マトリックス化学物質と一緒に混合物中に目的の分析物が含まれており、その組成及び濃度は検体の組成（次の定義を参照）及び精製ステップによって異なる。マトリックス化学物質は、分析物又はバイオマーカーの分析を損なう可能性がある（マトリックス効果）。試験試料は、目的の分析物又はバイオマーカー及び／又はコントロール（ネガティブコントロールとして水又は核酸を含まない試料緩衝液、スパイクイン参照標準を含むポジティブコントロール、及び／又は内部増幅コントロール）を含む。試験試料は、検体及び一次試料と区別する必要がある。
【0064】
検体は、分析物もしくはバイオマーカー、又は人工バーコード配列（例えば、追跡管理適用のために使用される）を含む生物学的量を有する考えられる任意の原料物質を含む。臨床診断の現場において、検体（生体からの生検、又は死後解剖された剖検とも呼ばれる）は、全体に適用されると想定される１つ以上の量又は特性の検査、研究又は分析のために採取された体液又は組織の別々の部分である（ＩＳＯ１８１１３－１：２００９及びＩＳＯ２１４７４－１：２０１９）。
【0065】
一次試料（又はそのサブ試料）は、検査を目的として、検査室に送る又は検査室で受け取られる試料から調製した試料である（ＩＳＯ２１４７４－１：２０１９）。
【0066】
オリゴヌクレオチド合成は、定義した配列を有する核酸の短いフラグメント（許容可能な収率で典型的に６～１２０塩基）の化学合成である。天然の核酸は、ホスホジエステルによって５’から３’が架橋されているリボース（ＲＮＡの場合）又は２－デオキシリボース（ＤＮＡの場合）の骨格、及び１’位でヌクレオチド塩基のアデニン、シトシン、グアニン、チミン及びウラシル（ＲＮＡにおいてチミンの代わり）からなる。オリゴヌクレオチド合成は、核酸鋳型依存性ヌクレオチジルトランスフェラーゼによる酵素合成とは逆に、成長鎖の５’末端へのヌクレオチド残基の段階的付加（３’から５’方向）によって実施される。現在、オリゴヌクレオチド合成の好ましい技術は、ホスホラミダイト法及び保護した２’－デオキシヌクレオシド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ及びｄＴ）又はリボヌクレオシド（Ａ、Ｃ、Ｇ及びＵ）に由来するホスホラミダイト構成要素を使用した固相合成及び自動化に基づく（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ ２００５；Ａｂｒａｍｏｖａ ２０１３）。最近では、可溶性合成の再流行を支持している（Ｌｏｅｎｎｂｅｒｇ ２０１７）。
【0067】
（合成）ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの修飾は、糖骨格自体の１つ以上の位置、骨格の１つ以上の官能基、ヌクレオチド塩基に対する任意の化学的な人工的変更を含み、糖環の置換及び／又はヌクレオチド塩基の置換、又は特に後述するような前記修飾の任意の組み合わせを包含する。
【0068】
本発明で定義される（合成）ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド又は核酸類似体の骨格修飾は、五炭糖（リボース又はデオキシリボース）の２’位及び／又は４’位での人工修飾を含む：オリゴヌクレオチドの骨格は、内部ヌクレオチド結合及び／又は糖部分を示す。架橋核酸（ＢＮＡ）において、糖環は、架橋又は第三の環構造を介して修飾される。ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸）、ＢＮＡ３（２’－Ｏ，４’－アミノエチレン架橋核酸）、及びＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ロックド核酸）、２’酸素と４’炭素を接続する追加の架橋で修飾されたリボース部分）はよく確立された例であるが、他のものも利用できる。他の中性骨格は、例えばホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）又はペプチド核酸（ＰＮＡ）修飾を使用する。内部架橋を形成している骨格修飾は、「架橋骨格修飾」の群にまとめられ、本明細書において列挙したものとは異なってよい。
前記骨格修飾は、ヌクレアーゼに対する耐性を付与することが公知であり、標的核酸とのプライマー及びプローブの二重鎖安定性を高めてよい。２’糖位をメチル基及びメトキシエチル基で修飾することも可能である。２’位での修飾は、オリゴヌクレオチド二本鎖では十分に許容される。
前記骨格修飾は、ヌクレアーゼに対する耐性を付与することが公知であり、標的核酸とのプライマー及びプローブの二重鎖安定性を高めてよい。２’糖位をメチル基及びメトキシエチル基で修飾することも可能である。２’位での修飾は、オリゴヌクレオチド二本鎖では十分に許容される。
【0069】
合成ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの非骨格修飾は、オリゴヌクレオチドの末端（５’又は３’）に又は内部ヌクレオチド塩基に結合される人工的な化学修飾である。これは、オリゴヌクレオチドの固相合成中に、５’末端で又は特別に修飾させたホスホルアミダイト構成要素を内部的に使用して、又は３’末端で、特別に修飾させた固体支持体材料、例えば制御細孔ガラス（ＣＰＧ）又はマクロ多孔質ポリスチレン（ＭＰＰＳ）でオリゴヌクレオチド合成サイクルを開始することによって実施できる。代わりに、反応性化学基（例えばチオール、アミノ、カルボキシル、末端アルキン）は、固相合成中に非ヌクレオシドホスホラミダイトによって導入するか、又は合成後の処理ステップ（自動合成及び支持体からの切断が完了した後）によって結合させて、種々の化学カップリング反応のために利用できるようにすることができる。リン酸基の１つ又は２つの非架橋酸素原子が硫黄で置換され、それぞれホロチオエート（ＰＴＯ）又はホスホロジチオエート（ｄｉＰＴＯ）が生じうる。ホスホジエステルの非荷電類似体であるアルキルホスホネート又はアリールホスホネートにおいて、ホスフェート基の非架橋酸素原子は、アルキル基又はアリール基で置き換えられている。かかる非骨格修飾は、特に少なくとも１つの修飾を保有するヌクレオチドに、ヌクレアーゼ活性に対する耐性を付与する。
【0070】
本発明において定義したスペーサーは、非骨格修飾のサブグループであり、ヌクレオチドの３’末端及び／又は５’末端に、又は２つのヌクレオチド間に結合する化学構造として定義される（図９）。スペーサーは、
ａ） （Ｃn）－ＯＨ［式中、ｎは整数であり、少なくとも３、好ましくは３、６、９又は１２である］のアルキルアルコール、プロパニル（スペーサーＣ３）、ヘキサニル（スペーサーＣ６）、ノナニル（スペーサーＣ９）及びドデカニル（スペーサーＣ１２）を含む（Ｃn）－ＯＨのアルキルアルコール、
ｂ） （－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－）n－ＯＨ［式中、ｎは整数であり、少なくとも１である］のグリコールエーテル、好ましくはトリエチレングリコール（スペーサー９）、テトラエチレングリコール（スペーサー１２）、及びヘキサエチレングリコール（スペーサー１８）を含む（－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－）n－ＯＨのグリコールエーテル、及び／又は
ｃ） 脱塩基フラン、脱塩基スペーサー又はｄスペーサーとしても公知である、２’－デオキシリボースの１位にメチレン基を有するテトラヒドロフラン誘導体
を含む。
前記化学構造は、最も適したスペーサーを表すいくつかの例にすぎないが、他のスペーサーも可能であり、それらの例は前記定義に包含される。スペーサーは、ホスホラミダイト合成中に結合され、２つのホスホジエステル結合又は他の骨格修飾をもたらすものに隣接する。次の５’構成要素は、従来のヌクレオチド、非従来のヌクレオチド、追加のスペーサー、又は蛍光体を有するリンカーであってよい。
ａ） （Ｃn）－ＯＨ［式中、ｎは整数であり、少なくとも３、好ましくは３、６、９又は１２である］のアルキルアルコール、プロパニル（スペーサーＣ３）、ヘキサニル（スペーサーＣ６）、ノナニル（スペーサーＣ９）及びドデカニル（スペーサーＣ１２）を含む（Ｃn）－ＯＨのアルキルアルコール、
ｂ） （－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－）n－ＯＨ［式中、ｎは整数であり、少なくとも１である］のグリコールエーテル、好ましくはトリエチレングリコール（スペーサー９）、テトラエチレングリコール（スペーサー１２）、及びヘキサエチレングリコール（スペーサー１８）を含む（－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－）n－ＯＨのグリコールエーテル、及び／又は
ｃ） 脱塩基フラン、脱塩基スペーサー又はｄスペーサーとしても公知である、２’－デオキシリボースの１位にメチレン基を有するテトラヒドロフラン誘導体
を含む。
前記化学構造は、最も適したスペーサーを表すいくつかの例にすぎないが、他のスペーサーも可能であり、それらの例は前記定義に包含される。スペーサーは、ホスホラミダイト合成中に結合され、２つのホスホジエステル結合又は他の骨格修飾をもたらすものに隣接する。次の５’構成要素は、従来のヌクレオチド、非従来のヌクレオチド、追加のスペーサー、又は蛍光体を有するリンカーであってよい。
【0071】
天然の２’－デオキシヌクレオシド又はリボヌクレオシドの対応物を置換する修飾塩基又は人工塩基は、Ｈ結合を介した他の塩基との内部相互作用により核酸二本鎖の安定性を高める非主鎖修飾のサブグループである。修飾塩基は、２－アミノ－デオキシアデノシン（２－アミノ－ｄＡ）、５－メチル－デオキシシチジン（５－Ｍｅ－ｄＣ）、アミノエチル－フェノキサジン－デオキシシチジン（ＡＰ－ｄＣ、Ｇ－Ｃｌａｍｐ）、Ｃ－５プロピニル－デオキシシチジン（ｐｄＣ）、及びＣ－５プロピニル－デオキシウリジン（ｐｄＵ）を含む。さらに、ｏＴＩＮＡ｛オルトツイスト挿入核酸；（Ｓ）－１－Ｏ－［２－（１－ピレニルエチニル）フェニルメチル］グリセロール｝及び（Ｓ）－１－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリフェニルメチル）－３－Ｏ－（１－ピレニルメチル）グリセロールインターカレート擬似ヌクレオチド（ＩＰＮ）、又は３’マイナーグローブバインダー（ＭＧＢ、国際公開第１９９６０３２４９６号）は、ＤＮＡ二重鎖安定剤及び／又はポリメラーゼブロッカーとして機能する。
【0072】
内部ヌクレアーゼブロッカー（内部ブロッカー又はヌクレアーゼブロッカーと同義）は、ヌクレアーゼ活性、特にヌクレアーゼに対する前記ヌクレオチドの耐性を不与する少なくとも１つの人工修飾を有するヌクレオチドとして定義される。言い換えれば、本明細書において記載した特定の修飾は、修飾の位置でヌクレアーゼをブロックする機能を果たし、それによりハイブリダイズ配列の少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカーの５’上流にあるヌクレアーゼの切断部位を規定する。第１のヌクレアーゼブロッカーの下流への第２（又はそれ以上）のヌクレアーゼブロッカーの追加は、本明細書において記載した方法において、切断部位を変化しないが、望ましくない人為構造が減少する。本発明の切断可能な加水分解生成物が本明細書において記載したＦＬＡＰを含む場合に、ヌクレアーゼブロッカーはＦＬＡＰに位置してよく、第２の内部ヌクレアーゼブロッカーは、本明細書において記載した切断可能な生成物の５’末端配列の少なくとも１つのハイブリダイズヌクレオチドの３’下流に位置する（図１Ａを参照）。適した修飾は主鎖修飾であり、より好ましくは、前記で定義した糖主鎖の２’位での修飾である。最も好ましくは、これらは２’－Ｏ－メチル及び２’－Ｏ－メトキシエチルである。前記で定義した非骨格修飾、好ましくはリン酸基の１つ又は２つの非架橋酸素原子が、硫黄、アルキル基及び／又はアリール基によって置換されているリン酸基の修飾は、ヌクレアーゼ活性に対する、特に特にヌクレアーゼに対する耐性を付与する。最終的に、ヌクレアーゼ活性に対する耐性を付与するヌクレオチドの任意の人為的修飾又は前述した修飾の２つ以上の組み合わせは、本発明の意味の範囲内で内部ヌクレアーゼブロッカーとして機能する。好ましくは、内部ヌクレアーゼブロッカーは、架橋核酸又は挿入核酸、例えばそれぞれＬＮＡ、ＴＩＮＡ、又は本明細書において記載したかもしくは従来技術において公知の他のものである。
【0073】
少なくとも１つの内部ブロッカーは、異なる機能を有する。それはシグナルの特異性に寄与するか、又は特異性にあらゆる影響を与えずにシグナルのストリンジェンシーに寄与する。本発明の方法内でＴＸプローブの切断可能な生成物の特定の設計のために選択された標識、好ましくはフルオロフォアに応じて、達成されたシグナル（ピーク）は明確かつ明瞭であり（望ましくない人為構造がない）、したがって本発明の意味の範囲内で特異的であるが、ラベルに応じて弱い又は薄暗い低い移動人為構造を伴ってよい。かかる場合に、ＴＸプローブの切断可能な加水分解生成物内で少なくとも２つ又は３つのヌクレアーゼブロッカーを組み合わせることが好ましい。第１のものは、本明細書において記載されており、図１Ａに示される位置を有し、第２及び第３のものは、図１Ａにおける前述した位置のすぐ下流に位置することができる。内部ブロッカーは、切断部位の上流にあるフラップされた（ミスマッチな）ヌクレオチドと結合することによってより高度な多重化も促進する。シグナルの特異性（さらなる定義を参照）のために、最初のフラップされたヌクレオチド（切断部位のすぐ上流の位置）は内部ヌクレアーゼブロッカーを含む。ブロックされたフラップ位置を超えたフラップヌクレオチドの追加は、切断可能な加水分解生成物のサイズ及びその移動を厳密に制御できる。これにより、ＴＸ技術を支持できる多重度を高めることが可能である。
【0074】
ＴＸプローブの少なくとも１つの修飾及び／又は内部ヌクレアーゼブロッカーの目的は、規定の加水分解生成物が、規定の切断部位で本明細書において記載したヌクレアーゼ活性を示す酵素によってＴＸプローブから放出され、複数のＴＸプローブを組み合わせるために適している本発明の方法における使用に適していることを確実にすることである。
【0075】
リンカーはカップリング反応によって生じる：本明細書において定義したカップリング反応は、骨格、非骨格修飾及び／又は標識をプローブ、特にヌクレオチドに導入するために使用され、固相ホスホラミダイト合成及び／又はオリゴヌクレオチドの合成後処理ステップ（例えば、固体支持体からの放出、無機塩基又はアミンによるアルカリ脱保護、ＨＰＬＣ）に適合する任意の化学反応である。十分に確立された化学反応の小計選択は、（ａ）活性化有機酸［酸無水物、酸塩化物、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル］又はイソチオシアネートとアミノ基との反応、（ｂ）ヒドラジド基又はアミノオキシ基とアルデヒド基との反応、（ｃ）ヨードアセトアミド又はマレイミド（２，５－ピロールジオン）とチオール基との反応、（ｄ）シアノベンゾチアゾールとシステイン基との反応、（ｅ）金属イオン触媒（例えば銅イオン）を使用しない又は使用するクリックケミストリー（アジド－アルキン付加環化；Ｅｌ－Ｓａｇｈｅｅｒ及びＢｒｏｗｎ、２０１２）、及び（ｆ）レトロ（又は逆）ディールス・アルダー（ｒＤＡ）反応（例えばテトラジン－トランス－シクロオクテン又はテトラジン－ノルボルネンの反応対）である。異なるカップリング反応は、本願明細書においてリンカーと呼ばれ、（オリゴ）ヌクレオチドとその修飾の間、又はヌクレオチドと標識、好ましくは蛍光体の間で化学構造が生じる。反応性ホスホルアミダイト試薬として現在入手可能なリンカーは、例えば、
２－（３－アミノプロピル）－１，３－ジヒドロキシプロパンホスホルアミダイト
２，２－ジ（ｅ－アミノプロピル）－１，３－ジヒドロキシプロパンホスホルアミダイト
３－アミノ－１，２－ジヒドロキシプロパンホスホルアミダイト
６－アミノ－１，２－ジヒドロキシヘキサンホスホルアミダイト
である。
２－（３－アミノプロピル）－１，３－ジヒドロキシプロパンホスホルアミダイト
２，２－ジ（ｅ－アミノプロピル）－１，３－ジヒドロキシプロパンホスホルアミダイト
３－アミノ－１，２－ジヒドロキシプロパンホスホルアミダイト
６－アミノ－１，２－ジヒドロキシヘキサンホスホルアミダイト
である。
【0076】
ラベルは、光励起時に発光する蛍光化合物である蛍光体（又は蛍光標識）又は試料内の特定の配列（分析物、標的配列及び／又はバイオマーカー）の存在を検出するための標識及び検出反応に適した他の任意の化合物を含む。診断測定装置内での蛍光体の適用可能性は、その検出ユニットの光学設定（光源及び光学フィルター）に応じて異なる。他の化合物は、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテンなどを含む。通常、標識はリンカーを介してヌクレオチドの５’リン酸基に結合される。代わりに、２’位が蛍光体の結合に広く使用されている。
【0077】
本明細書内で使用されるＭＯＤＡＰＬＥＸ装置（Ｈｌｏｕｓｅｋら、２０１２）は、２つの方法ｉ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び同時にｉｉ）キャピラリー電気泳動（ＣＥ）を組み合わせたリアルタイム多重核酸分析のための閉鎖システムである。Ｍｏｄａｐｌｅｘの実行中、目的の遺伝子標的をＰＣＲ反応で増幅させる。ＰＣＲ反応は乱されずに継続するが、増幅させたＤＮＡフラグメントは同時に動電的にキャピラリーゲルに注入される。このゲルで、ＤＮＡフラグメントをサイズごとに分離し、定量的に検出する。このプロセスをそれぞれＰＣＲサイクル後に繰り返す。このようにしてリアルタイムデータが生成され、したがって最大５０個の標的の同時定量を可能にする。ＭＯＤＡＰＬＥＸ装置は、それぞれ励起波長４８８ｎｍ及び６３６＋／－８ｎｍ並びに発光フィルター５３５＋／－３５ｎｍ及び６７５＋／－２５ｎｍを有する２つの異なる光学チャネル１（青）及び２（赤）で蛍光シグナルを検出する。２つのチャネルは、実施例２及び図３に示すように、蛍光体ＦＡＭ／フルオレセイン（５２０ｎｍで最大発光）及びＴＹＥ６６５（６６５ｎｍで最大発光、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＵＳ－ＩＡ）の所有物）の発光によって校正される。ＭＯＤＡＰＬＥＸ装置のチャネル１及びチャネル２について代わりの蛍光体の例を以下に示す：
【化1】
【0078】
しかしながら、他の蛍光体及びチャネル１及びチャネル２の組み合わせが可能である。他のシアニンは、ＣＹ３、ＣＹ３．５、ＣＹ５、ＣＹ５．５、ＣＹ７；ローダミン及び誘導体、例えばＴｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｒ６Ｇ、Ｒ１１０、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ；フルオレセイン及び誘導体、例えば５－ブロモメチルフルオレセイン、２’，７’－ジメトキシ－４’，５’－ジクロロ－６－カルボキシローダミン（ＪＯＥ）、６－カルボキシルフルオレセイン（６－ＦＡＭ）、１，２’，４’，１，４，－テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４－ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ、ＩＡＥＤＡＮＳ、ベンゾフェノキサジン、７－Ｍｅ２Ｎ－クマリン－４－アセテート、７－ＯＨ－４－ＣＨ３－クマリン－３－アセテート、７－ＮＨ２－４－ＣＨ３－クマリン－３－アセテート（ＡＭＣＡ）、モノブロモビマン、ピレントリスルホネート，例えばＣａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅｍ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、及びモノブロモリメチルアンモニオビマンを含む。蛍光色素の追加の例は、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｉ及びＳｐｅｎｔ ＭＹ（２０１０）、及びその更新版に提供されており、これらはそれぞれ参照をもって組み込まれる。蛍光色素は、一般的に、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ、ＵＳ－ＯＲ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＵＳ－ＮＪ）、Ａｔｔｏ－Ｔｅｃ ＧｍｂＨ（Ｓｉｅｇｅｎ、ＤＥ）、Ｄｙｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨ（Ｊｅｎａ、ＤＥ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＵＳ－ＣＡ）などを含む種々の業者から容易に入手できる。蛍光色素及びその誘導体は、本明細書において記載した方法において特に好ましい。本発明によるＴＸプローブの適切な設計は、それぞれの蛍光チャネルについての電気泳動図の全範囲の使用を可能にする適した標識、好ましくは蛍光体を含む。本発明のＴＸプローブの使用によって得られる電気泳動図の範囲は、使用したＣＥ装置の検出範囲に依存する。本明細書において使用したＭＯＤＡＰＬＥＸ装置の範囲は最大４５０ｂｐであるが、本明細書において記載したＴＸ技術は、５００ｂｐ超の範囲のＣＥ装置、好ましくはＭＯＤＡＰＬＥＸ装置にも適用可能である。これらの実施形態について、本明細書において記載したＴＸプローブ及び修飾の組み合わせをそれに応じて設計できる。実施例２において、ＴＸプローブ配列及び修飾を有する加水分解生成物は同一であり、前記範囲を可能にした。
【0079】
核酸増幅技術（ＮＡＴ）は、核酸、特に本発明による標的配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ複製のための酵素的方法をいう。本発明に従って、標的配列は、反復複製反応、好ましくは熱サイクルを必要とするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の複製反応において増幅される。ＰＣＲは当業者に周知である。ＲＮＡは、逆転写酵素によって相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換された後に増幅されうる。欧州特許第０５０６８８９号明細書、欧州特許第０６３２１３４号明細書、欧州特許第１１５２０６２号明細書、国際公開第２０１４０２３３１８号は、単一反応チューブ内でＲＮＡを増幅するためのリアルタイム逆転写酵素ＰＣＲのためのさらに異なる技術を開示している。他のＮＡＴは等温的に処理する（ｉＮＡＴ）。ＬＡＭＰ（ループ媒介等温増幅）、ＨＤＡ（ヘリカーゼ依存性増幅）、ＲＰＡ（リコンビナーゼポリメラーゼ増幅）、ＳＩＢＡ（ストランド侵入ベース増幅）、ＲＣＡ（ローリングサークル増幅）がＤＮＡ等温増幅についての例である。最終的に、リアルタイムＮＡＳＢＡ（核酸配列ベースの増幅）は、加水分解プローブと組み合わせたＲＮＡの直接増幅のためのｉＮＡＴを記載する（Ｋｅｉｇｔｈｌｅｙら、２００５）。
【0080】
多重ＮＡＴ又は一般的に多重試験（多重アプローチと同義）は、理想的に１つの反応内で、それぞれの試験試料で同時に複数の分析物又はバイオマーカーを調査又は検出するアッセイの能力を表す。多重アッセイは、時間、費用及び情報量の面で利点があり、したがってシングルプレックスアッセイよりも信頼性の高い結果が得られる（「モノプレックス」と「シングルプレックス」は同義）。さらに、手作業の手順が少なくなり、試料の取り違え又は相互汚染のリスクが軽減される。好ましくは、「多重」（多重化と同義）は、好ましくは少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０又はそれ以上の標的、例えば少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２５０、又はそれ以上の標的の異なる標的配列内での、複数の異なる分析物の検出を指す。好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも３０である。
【0081】
本明細書において定義した核酸電気泳動は、電場内の質量及び電荷の組み合わせによって核酸増幅産物を分離する技術である。負に帯電した核酸フラグメントは、水性緩衝液により接続した一対の電極の陰極側に適用される。分子の分離は、ゼリー状の粘稠度を有するアガロース又はアクリルアミドのようなポリマー（架橋又は直鎖、例えばパフォーマンス最適化ポリマーＰＯＰTM－７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳ－ＭＡ）をふるい分けることによって改善される。フラットゲル及びキャピラリーゲル電気泳動（ＣＥ）装置は、ゲルポーターの設定に関して区別できるが、一方でＣＥ装置は自動化のためにより便利である。さらに、ＰＣＲ増幅産物は、いわゆる天然の条件を適用して二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）として分離することも、尿素や熱又はそれらの組み合わせのような変性剤の存在下で一本鎖（ｓｓＤＮＡ）として分離することもできる。
【0082】
本明細書において使用されるＭＯＤＡＰＬＥＸ装置（Ｈｌｏｕｓｅｋら、２０１２）は、ＰＣＲサーモサイクラーと変性キャピラリー電気泳動（ＣＥ）システムを組み合わせて、ＤＮＡ配列標的の多重増幅及びＤＮＡ分析物又はバイオマーカーの定量を同時に可能にする自動システムである。本発明を支持し、１～６チャネルを有する異なる光検出ユニット（ＭＯＤＡＰＬＥＸ検出器特性については蛍光体の定義を参照）を有するＣＥ装置の他の例は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３５００／３５００ｘＬ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳｅｑＳｔｕｄｉｏ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．（Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳ－ＭＡ））、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｙｓｔｅｍｓ ＲａｐｉｄＨＩＴ ＩＤ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＣＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳ－ＷＩ））、Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣＥＱTM８０００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＵＳ－ＣＡ）、ＱＩＡｘｃｅｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ（Ｈｉｌｄｅｎ、ＤＥ））、Ｎａｎｏｆｏｒ（登録商標）０５Ｍ（Ｓｙｎｔｏｌ（Ｍｏｓｃｏｗ、ＲＵ））及びＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＵＳ－ＣＡ）からの多様核酸フラグメント分析器、例えばＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ、ＺＡＧ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｆｅｍｔｏ Ｐｕｌｓｅ Ｓｙｓｔｅｍである。
【0083】
本明細書において使用したＭＯＤＡＰＬＥＸ標準物質は、多重セットアップにおける少なくとも１つの蛍光チャネルにおけるキャピラリー電気泳動で検出される少なくとも１つ、好ましくは２つ以上の非増幅性サイズ標準であり、対象の分析物又はバイオマーカーとは無関係である（無関係又は人工的な鋳型及びプライマー）。それらは、長さ１～５ヌクレオチドの短いＤＮＡフラグメントにより構成され、５’末端に蛍光体が結合しているが、内部ヌクレオチドに結合することもできる。これらは、ＭＯＤＡＰＬＥＸ機器の分析ソフトウェアによる増幅産物の検出の範囲を定義する。本発明の記載した実施例において、ＭＯＤＡＰＬＥＸサイズ標準Ｍｉｘ（Ｂｉｏｔｙｐｅ ＧｍｂＨ、ＤＥ）を１倍の最終濃度で使用した。これは、ＰＣＲサイクルを通じてシグナル強度が一定である５つのサイズの標準からなる。増幅コントロール（ＡＣ）標準物質は、人工鋳型（ヒトＤＮＡとは無関係）、対応するＰＣＲプライマー対、及び対応するＴＸプローブからなる。ＡＣプラス３つの非増幅サイズ標準は、６－ＦＡＭチャネル（青チャネル）で実施し、２つの標準物質はＴＹＥ６６５蛍光チャネル（赤チャネル）で実行する。計算上の長さのサイズは、青チャネルで１１４．５ｂｐ、１６９．１８ｂｐ及び２７７．５ｂｐ、赤チャネルで１５０．７ｂｐ及び４４０．４ｂｐであった。ＡＣの計算上の長さは５８．６ｂｐである。しかしながら、見かけ上の長さは、アッセイ分析に影響を与えることなく最大５ｂｐまでわずかに異なってよい。ＡＣ標準物質は、鋳型に依存しないＰＣＲコントロールとしても機能し、全ての試料、ネガティブコントロール及びポジティブコントロールのウェルに追加しなければならない。代わりに、ＰＣＲセットアップに標準物質を使用して適切なエンドポイント濃度をスパイクしてよい。この場合、他のマーカーを鋳型に依存しないＰＣＲコントロールとして使用する必要がある。ＭＯＤＡＰＬＥＸ標準物質間の領域は、対象の増幅産物の標的、アレル又はプロフィール要求の領域に細分化できる。しかしながら、正確な増幅産物のサイズの要求は不可能である。
【0084】
本明細書において移動時間は、本発明に従って標識した核酸である標識した分析物がそれぞれのＰＣＲサイクルでの動電学的注入後に検出点に到達するまでにかかる時間として定義される。ＭＯＤＡＰＬＥＸは、移動時間の単位として「スキャン」を使用し、が約６．６６Ｈｚの検出器のスキャン速度により、約１５０ミリ秒に相当する。移動時間は、標準物質システム成分の公知の移動長とそれぞれの移動時間とを関連付ける線形フィットを実施することによって移動長に変換できる（ＭＯＤＡＰＬＥＸ標準物質の定義を参照）。
【0085】
ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）は、ＤＮＡ二重らせんのフォーク型の不対５’末端（５’－ＦＬＡＰ）の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を切断する構造特異的及び鎖特異的なエンドヌクレアーゼである（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖら、１９９３）。ヌクレアーゼは、最初の５’－ハイブリダイズヌクレオチドの後で切断することが好ましいが、この切断部位に限定されない。５’フラップヌクレオチドの２番目、３番目、４番目及び５番目のハイブリダイズヌクレオチドの後で切断することもできる。したがって、加水分解反応は、主にサイズｎ＋１の加水分解生成物を生じるが、ｎ＋２、ｎ＋３、ｎ＋４、ｎ＋５及びｎ、ｎ－１、ｎ－２、ｎ－３、ｎ－４などの加水分解生成物も生じ、一方で最小フラグメントサイズは１つである。本明細書に記載した修飾の組み合わせにより、本明細書において規定した所望の切断部位、それによるヌクレアーゼの活性を決定し、指示することができる。ＦＥＮは、全ての生物、さらにはウイルスにも存在し（Ｍｉｔｓｕｂｏｕら、２０１４）、さらなる酵素と連動して、特にＤＮＡ複製中に、複製フォークの残りの鎖にあるいわゆる岡崎フラグメント（ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド）を放出する（ＤＮＡ修復機能）。真正細菌のＦＥＮは、Ｐｏｌ １型（Ｐｏｌ Ａと同義）のＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて単一のタンパク質単位を形成する（例えば大腸菌（Escherichia coli）、テルムス・アクアティクス（Thermus aquaticus）、サーマス・サーモフィラス（T. Thermophilus）、アクウィフェクス菌種（Aquifex spp.）のＰｏｌ １）。これまでに記載されている古細菌（アーケオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）、ピロコッカス菌種（Pyrococcus spp.）、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ（Methanocaldococcus jannaschii）、メタノサーモバクター・サーモオートトロフィカム（Methanothermobacter Thermoautotrophicum）及び真核生物のＦＥＮ（例えばヒト（Homo sapiens））は自律タンパク質を示す。好ましくは、熱安定性酵素が本明細書において使用される。
【0086】
加水分解（切断）生成物。ヌクレアーゼ、好ましくはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）のＦＥＮ活性によって加水分解される、標的配列に完全にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの５’末端ヌクレオチド。得られた加水分解フラグメント（「加水分解（切断）生成物」と同義）は、常に３’－ＯＨ基とリンカーを介して結合した蛍光体を有する少なくとも１つのヌクレオチド（従来型又は非従来型）からなる。さらに、標的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズしなかった場合（フラップヌクレオチド）、追加のヌクレオチドを含むこともできるさらなる修飾を含みうる。ＦＥＮによる加水分解の前に、「加水分解（切断）生成物」又は加水分解フラグメントは、以下で定義したＴＸプローブの一部である。ＴＸプローブが標的核酸のＤＮＡ鎖にハイブリダイズ又はアニールした後、ＴＸプローブを加水分解し、切断し、又はＴＸプローブから放出させる。本明細書において記載した本発明の好ましい実施形態において、それぞれの加水分解生成物は、本明細書において定義した、好ましくはキャピラリー電気泳動中の分離時にピーク（曲線）をもたらす独特の移動パターンを示すか、又はそれによって特徴付けられる。
【0087】
本発明に従って、シグナルの特異性は、それぞれの標的配列にハイブリダイズするそれぞれのＴＸプローブから放出されたそれぞれの加水分解生成物について、キャピラリー電気泳動において明確で明確なピーク（曲線）が１つだけ得られ、電気泳動図で表されることを意味する。電気泳動図は、本発明の方法で電気泳動を使用した場合に生成されるピーク及び曲線によって表される加水分解及び分離された加水分解生成物の記録又は視覚化である。好ましくは、明確で特異的なピークは、ＣＥ装置、例えばＭＯＤＡＰＬＥＸ装置によって得られる曲線である（例えば、図２、図４又は図６を参照）。本明細書において記載した方法及び本明細書において記載した本発明のＴＸプローブから放出された加水分解生成物の使用によって得られるシグナルの特異性は、本明細書において記載した修飾及びヌクレアーゼブロッカーによって得られる。好ましい実施形態において、「明確で特異的なシグナル」は、望ましくない人為構造を含まない加水分解生成物のみが検出され、それらの望ましくない人為構造が生じないことを意味する。ターゲット配列に依存して、特にＴＸプローブの切断可能な加水分解生成物の５’末端がハイブリダイズするターゲット配列の３’末端のヌクレオチドに依存して、１つのヌクレアーゼブロッカー及び／又は修飾は、特定のシグナルを得るためには十分ではない可能性がある。したがって、かかる標的配列の場合、ＴＸプローブの切断可能な生成物は、本発明による特異的シグナルを確実にするために、少なくとも２つ、３つ又はそれ以上、好ましくは２つ又は３つのヌクレアーゼブロッカー及び／又は修飾を含む。
特定のシグナルを可能にするかかる標的配列に適した解決法の１つは、ＴＸプローブの切断可能な加水分解生成物の５’末端配列の第２の５’末端ヌクレオチドに第１のヌクレアーゼブロッカーを使用し、５’末端配列の第３のハイブリダイズするヌクレオチドに第２のヌクレアーゼブロッカーを使用することであり、ここで、前記切断可能な加水分解生成物及びＴＸプローブは、標的配列上のその相補配列に完全にハイブリダイズする。他の実施形態において、切断可能な加水分解生成物は本明細書に記載のＦＬＡＰを含み、第１のヌクレアーゼブロッカーはＦＬＡＰに位置し、第２のヌクレアーゼブロッカーは本明細書において記載した切断可能な生成物の５’末端配列の少なくとも１つのハイブリダイズヌクレオチドの３’上流に位置し（図１Ａを参照）、例えば、最初のヌクレアーゼブロッカーは、ＦＬＡＰ（＝切断可能な加水分解生成物の第１の非ハイブリダイズヌクレオチド）である１つの非ハイブリダイズヌクレオチドにあり、第２の内部ヌクレアーゼブロッカーは、切断可能な加水分解生成物の第３のハイブリダイズヌクレオチドにある（図１Ｂを参照）。
特定のシグナルを可能にするかかる標的配列に適した解決法の１つは、ＴＸプローブの切断可能な加水分解生成物の５’末端配列の第２の５’末端ヌクレオチドに第１のヌクレアーゼブロッカーを使用し、５’末端配列の第３のハイブリダイズするヌクレオチドに第２のヌクレアーゼブロッカーを使用することであり、ここで、前記切断可能な加水分解生成物及びＴＸプローブは、標的配列上のその相補配列に完全にハイブリダイズする。他の実施形態において、切断可能な加水分解生成物は本明細書に記載のＦＬＡＰを含み、第１のヌクレアーゼブロッカーはＦＬＡＰに位置し、第２のヌクレアーゼブロッカーは本明細書において記載した切断可能な生成物の５’末端配列の少なくとも１つのハイブリダイズヌクレオチドの３’上流に位置し（図１Ａを参照）、例えば、最初のヌクレアーゼブロッカーは、ＦＬＡＰ（＝切断可能な加水分解生成物の第１の非ハイブリダイズヌクレオチド）である１つの非ハイブリダイズヌクレオチドにあり、第２の内部ヌクレアーゼブロッカーは、切断可能な加水分解生成物の第３のハイブリダイズヌクレオチドにある（図１Ｂを参照）。
【0088】
本発明によるオリゴヌクレオチドプローブ（「ＴＸプローブ」、図１も参照）（ＴＸプローブとも呼ばれる）は、オリゴヌクレオチド（好ましくは最小長５ヌクレオチド）を含み、その配列は、標的核酸の相補的核酸、好ましくはＤＮＡ鎖に特異的にハイブリダイズし（図１．（２））、さらに以下：
－ 本明細書において記載した３’末端のＰＣＲブロッカー（保護基と同義）、
－ 本明細書において記載した内部ヌクレアーゼブロッカー、及び
－ ヌクレアーゼ、好ましくはＦＥＮによって放出される（切断可能な）加水分解生成物（図１、（３））であって、本明細書において記載した切断可能な加水分解生成物は、内部ヌクレアーゼブロッカーの５’末端上流に位置し、
－ その３’末端で、ホスホジエステル結合を介して内部ブロッカーに結合した少なくとも１つの標的特異的（相補的）ヌクレオチド（標的配列の鎖に相補的）を含み、
－ 標的配列及び／又は標的配列にハイブリダイズしない、本明細書において記載した少なくとも１つの修飾をさらに含んでもよく、
－ リンカーを介して切断可能な加水分解生成物、少なくとも１つの修飾又は少なくとも１つの標的特異的（相補的）ヌクレオチドのいずれかに架橋された標識、好ましくは蛍光体（例えば、本明細書において記載したＭＯＤＡＰＬＥＸ装置又はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍにおいて使用するための）であり、標識は、核酸電気泳動装置、好ましくはＭＯＤＡＰＬＥＸ装置の検出ユニットによって定量することができる
（切断可能な）加水分解生成物。本発明の一実施形態において、切断可能な加水分解生成物は標識を含まないが（例えば、ＡｇｉｌｅｎｔのＣＥ／ＭＳシステムで使用するため）、検出可能かつ定量可能である。この実施形態おいて、ゲルは挿入色素、例えばＳＹＢＲグリーンを含む。
－ 本明細書において記載した３’末端のＰＣＲブロッカー（保護基と同義）、
－ 本明細書において記載した内部ヌクレアーゼブロッカー、及び
－ ヌクレアーゼ、好ましくはＦＥＮによって放出される（切断可能な）加水分解生成物（図１、（３））であって、本明細書において記載した切断可能な加水分解生成物は、内部ヌクレアーゼブロッカーの５’末端上流に位置し、
－ その３’末端で、ホスホジエステル結合を介して内部ブロッカーに結合した少なくとも１つの標的特異的（相補的）ヌクレオチド（標的配列の鎖に相補的）を含み、
－ 標的配列及び／又は標的配列にハイブリダイズしない、本明細書において記載した少なくとも１つの修飾をさらに含んでもよく、
－ リンカーを介して切断可能な加水分解生成物、少なくとも１つの修飾又は少なくとも１つの標的特異的（相補的）ヌクレオチドのいずれかに架橋された標識、好ましくは蛍光体（例えば、本明細書において記載したＭＯＤＡＰＬＥＸ装置又はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍにおいて使用するための）であり、標識は、核酸電気泳動装置、好ましくはＭＯＤＡＰＬＥＸ装置の検出ユニットによって定量することができる
（切断可能な）加水分解生成物。本発明の一実施形態において、切断可能な加水分解生成物は標識を含まないが（例えば、ＡｇｉｌｅｎｔのＣＥ／ＭＳシステムで使用するため）、検出可能かつ定量可能である。この実施形態おいて、ゲルは挿入色素、例えばＳＹＢＲグリーンを含む。
【0089】
ＴＸプローブの機能は、試験試料中の少なくとも１つの分析物の検出を可能にし、特定のシグナルを生じるために切断可能な加水分解生成物を提供することである。したがって、放出された加水分解生成物は、それぞれのＴＸプローブが標的上のその相補配列に特異的にハイブリダイズしたことを確認し、前記加水分解生成物のピーク（曲線）による移動パターンを通じて特異的なハイブリダイゼーションの視覚化を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【0090】
【図1】ＴＸプローブ（１）及び標的ＤＮＡへのハイブリダイゼーション後の加水分解生成物（３）。
【図2】キャピラリー電気泳動装置による検出における加水分解生成物の特異性を改善するためのプローブ内の内部ヌクレアーゼブロッカーの同定。
【図3】蛍光標識されたフラグメントの移動を、ＭＯＤＡＰＬＥＸ機器で測定した。
【図4】標識した加水分解フラグメントの移動特性における修飾因子スペーサーの影響。
【図5】標識した加水分解フラグメントの移動特性におけるリンカーの影響。
【図6】蛍光色素、リンカー、修飾因子、ヌクレオチドの異なる組み合わせによって生じるＴＸシグネチャーの例。
【図7】両アレルＳＮＰを遺伝子型同定及び定量のための単一プローブの使用。
【図8】Ｍｏｄａｐｌｅｘ上のＡＭＬ融合転写物を検出するために、公開されている一重配列（Ｇａｂｅｒｔら、２００３）の組み合わせを使用した多重化の例。
【図9】異なるＴＸプローブ設計の概略構造。
【図10】キャピラリー電気泳動装置による検出における加水分解生成物の特異性を改善するためのＬＮＡを使用しＦＬＡＰを使用しない特異的なプローブ設計。
【図11】キャピラリー電気泳動装置による検出における加水分解生成物の特異性を改善するためのＬＮＡを使用しＦＬＡＰを使用しない特異的なプローブ設計。
【図12】キャピラリー電気泳動装置による検出における加水分解生成物の特異性を提供するプローブ内の代わりの内部ヌクレアーゼブロッカーの試験。
【図13】異なるキャピラリー電気泳動技術での単一増幅産物アッセイによって生じたＴＸシグネチャーの例。
【0091】
図面の説明
図１：ＴＸプローブ（１）及び標的ＤＮＡへのハイブリダイゼーション後の加水分解生成物（３）。Ａ） ＴＸプローブ（１）は、配列が標的核酸（２）のＤＮＡ鎖に特異的にハイブリダイズし、以下の修飾：３’末端にＰＣＲブロッカー（白い上向き三角形）、及び内部ヌクレアーゼブロッカーの上流の５’末端に位置する加水分解生成物（白い四角、（４））を含む、一本鎖オリゴヌクレオチド（一連の「Ｔ」によりで表す）からなる。加水分解生成物は、ホスホジエステル結合（Ｔ）を介して内部ブロッカーに結合した少なくとも１つの標的ＤＮＡ特異的ヌクレオチドを保持する。さらに、標的核酸にハイブリダイズしない修飾（白い円）及び／又はリンカー（ジグザグ線）を介して架橋された蛍光色素分子（白いひし形）からなってよく、核酸電気泳動装置の検出部により定量することができる。Ｂ） 加水分解生成物の他の実施形態は、内部ヌクレアーゼブロッカーを含む位置の上流にハイブリダイズする２つのヌクレオチドを含む。かかる構成において、１つのヌクレオチド加水分解生成物（１）と２つのヌクレオチド加水分解生成物（２）の２つの切断生成物を同時に生成できる。双方の加水分解生成物の相対比率を使用して、異なるアレルの存在を同時に定量できる。そのために、５’から３’方向の最初のヌクレオチドが一塩基多型の位置と一致している必要がある。
図１：ＴＸプローブ（１）及び標的ＤＮＡへのハイブリダイゼーション後の加水分解生成物（３）。Ａ） ＴＸプローブ（１）は、配列が標的核酸（２）のＤＮＡ鎖に特異的にハイブリダイズし、以下の修飾：３’末端にＰＣＲブロッカー（白い上向き三角形）、及び内部ヌクレアーゼブロッカーの上流の５’末端に位置する加水分解生成物（白い四角、（４））を含む、一本鎖オリゴヌクレオチド（一連の「Ｔ」によりで表す）からなる。加水分解生成物は、ホスホジエステル結合（Ｔ）を介して内部ブロッカーに結合した少なくとも１つの標的ＤＮＡ特異的ヌクレオチドを保持する。さらに、標的核酸にハイブリダイズしない修飾（白い円）及び／又はリンカー（ジグザグ線）を介して架橋された蛍光色素分子（白いひし形）からなってよく、核酸電気泳動装置の検出部により定量することができる。Ｂ） 加水分解生成物の他の実施形態は、内部ヌクレアーゼブロッカーを含む位置の上流にハイブリダイズする２つのヌクレオチドを含む。かかる構成において、１つのヌクレオチド加水分解生成物（１）と２つのヌクレオチド加水分解生成物（２）の２つの切断生成物を同時に生成できる。双方の加水分解生成物の相対比率を使用して、異なるアレルの存在を同時に定量できる。そのために、５’から３’方向の最初のヌクレオチドが一塩基多型の位置と一致している必要がある。
【0092】
図２：キャピラリー電気泳動装置による検出における加水分解生成物の特異性を改善するためのプローブ内の内部ヌクレアーゼブロッカーの同定。Ａ） 未修飾ＴＸプローブ（配列番号３、３’－修飾：スペーサーＣ３、５’－修飾：６－ＦＡＭ）の加水分解生成物のスキャンでの移動時間を示す電気泳動図（定義における移動時間を参照）。２つのフラグメント、１つのヌクレオチド（１ｎｔ）及び２つのヌクレオチドフラグメント（２ｎｔ）を生成及び検出した（１ｎｔ及び２ｎｔの加水分解ピーク、それぞれ明るい灰色と暗い灰色で影付けされている）。Ｂ） Ａ）に示したのと同じ５’及び３’修飾を有し、さらに５’末端から２位と３位でＰＴＯでブロックされたＴＸプローブの加水分解生成物。この構成により、いくつかのＰＴＯ由来のピーク（白いピーク（１）及び（２））を生じた。Ｃ） Ａ）で示したものと同じ５’及び３’修飾を有し、５’末端から２番目の位置で１つのＬＮＡでさらにブロックされたＴＸプローブの加水分解生成物。５’－ＦＬＡＰを含まない完全にアニーリングされたヌクレオチド配列。１つのヌクレオチドのフラグメントのみを生成及び検出する。Ｄ） Ａ）に示したものと同じ５’及び３’修飾を有し、さらに５’末端から１位と３位で２つのＬＮＡでブロックされたＴＸプローブ。１位は不一致の位置を含む。２つのヌクレオチドを含む単一フラグメントのみが生成及び検出される（例として表２、参考文献４及び５を参照）。実施例１において最後のＰＣＲサイクル後に生じた電気泳動図を示す。ＭＯＤＡＰＬＥＸサイズ標準ミックスを使用したが、この図において青いチャネルの標準物質ピークが１つだけ示されている（計算長１１４．５ｂｐ、対角線の塗りつぶし）。
【0093】
図３：蛍光標識されたフラグメントの移動を、ＭＯＤＡＰＬＥＸ機器で測定した。内部ブロッカーを有さないプローブ（配列番号３；３’－修飾：スペーサーＣ３、５’－修飾：蛍光体）を実施例２に記載したように加水分解し、いくつかの短い蛍光体標識フラグメント（約＜１０ｎｔ）を生じた。これらのフラグメントは変則的に移動するが、より長いフラグメントはサイズに応じて直線的に移動する。青いチャネルで流れる加水分解生成物は黒い実線で表され、赤いチャネルで流れる加水分解生成物は破線で表される。６－ＦＡＭ（ダイヤモンド）のような蛍光体は比較的速く移動し、５’－ＦＬＡＰを移動修飾子として使用して生成できる分解可能な加水分解生成物の数が制限される。かかる制限は、ゆっくりと移動するＡｔｔｏ４８８（四角）、ＴＹＥ６６５（丸）又はＡｔｔｏ６４３（三角）のような蛍光体によって克服でき、ＭＯＤＡＰＬＥＸの使用可能な範囲が約４００ｎｔに拡大する。
【0094】
図４：標識した加水分解フラグメントの移動特性における修飾因子スペーサーの影響。本発明の表２、参考文献１７、１８、１９及び２１に記載したように、５’末端をスペーサーで修飾し、実施例３の部門において記載したように加水分解した、異なるＴＸプローブ（配列番号３、３’修飾：スペーサーＣ３）の移動時間［スキャン］（定義した移動時間を参照）を示す電気泳動図。問題の加水分解生成物は、Ｃ５－アミノリンカーによってＡｔｔｏ６４３に結合させたチミン（Ｔ）を含む単一ヌクレオチド（１－ｎｔ）である。追加のスペーサー修飾子がないと、単一ヌクレオチド（１－ｎｔ）の加水分解生成物は約３５０ヌクレオチドで移動する（影付きのピークは１－ｎｔを示す）。ｄＳｐａｃｅｒ（図４、２と示したピーク、本発明の表２、参考文献１８）、スペーサー１８（図４、４と示したピーク、本発明の表２、参考文献２１）、スペーサーＣ１２（図４、３と示したピーク、本発明の表２、参考文献１９）、又は５’末端のスペーサーＣ３（図４、１と示したピーク、本発明の表２、参考文献１７）の追加は、加水分解生成物をそれぞれ約２４７ｎｔ、１９０ｎｔ、１７９ｎｔ、及び１７１ｎｔで移動させる。加水分解生成物は、電気泳動図下で示した異なるスペーサーを含む。ＭＯＤＡＰＬＥＸサイズ標準ミックスを使用したが、この図では赤いチャネルの標準物質ピークが１つだけ示されている（計算値１５０．７ｂｐ、対角線の塗りつぶし、計算値）。
【0095】
図５：標識した加水分解フラグメントの移動特性におけるリンカーの影響。異なるリンカーを介して５’末端に結合している蛍光体６－ＦＡＭを、実施例４の部門に記載したように加水分解したＴＸプローブ（配列番号３；３’－修飾：スペーサーＣ３）の移動時間［スキャン］（定義した移動時間を参照）を示す電気泳動図。異なるリンカーによって６－ＦＡＭに接続された、チミジン（Ｔ）を含むヌクレオチド加水分解生成物の移動：１，２，３トリアゾールリンカー（図５、ピーク３）、プロリノールリンカー（図５、ピーク２）又はヘキサニルリンカー（図５、ピーク１）を介して結合したＴは、それぞれ約１６３ｎｔ、１０６ｎｔ、及び８８ｎｔで移動する。縞模様のピークはＭＯＤＡＰＬＥＸ標準物質ピークと増幅コントロール（ＡＣ）に対応し、すべて青いチャネルにある。Ｃａｌ１はＡＣ（５８．６ｂｐ）に、ｃａｌ２及びｃａｌ３はサイズ標準（算出した長さ１１４．５ｂｐ及び１６９．１８ｂｐ）に対応する。
【0096】
図６：蛍光色素、リンカー、修飾因子、ヌクレオチドの異なる組み合わせによって生じるＴＸシグネチャーの例：ＴＸプローブ（配列番号３～６、３’修飾：スペーサーＣ３）を、実施例５の部門に記載したように加水分解した。Ａ）青いチャネル、Ｂ）赤いチャネル。詳細な配合については表２を参照できる。破線の電気泳動ピークは、Ｍｏｄａｐｌｅｘ標準物質に対応する。ＭＯＤＡＰＬＥＸサイズ標準ミックスを使用し、全てのサイズ標準を表示する（定義を参照）。
【0097】
図７：両アレルＳＮＰを遺伝子型同定及び定量のための単一プローブの使用。ＴＸプローブ（配列番号９；３’－修飾：スペーサーＣ３、５’－修飾：６－ＦＡＭ）を、実施例６の部門に記載したうに加水分解した。ゲノムヒト野生型ＤＮＡを、インサートとして配列番号１０～１１を含む変異組換えプラスミドＤＮＡの異なる量でスパイクした。ＭＯＤＡＰＬＥＸ測定を実施し、図において測定値（ｙ軸）を野生型と変異体の比率（ｘ軸）に対してプロットする。シグナル強度の相対パーセンテージを定量化し、アレル頻度の定量化のための検量線として使用できる。
【0098】
図８：Ｍｏｄａｐｌｅｘ上のＡＭＬ融合転写物を検出するために、公開されている一重配列（Ｇａｂｅｒｔら、２００３）の組み合わせを使用した多重化の例。ＴＸプローブの移動時間［スキャン］（定義した移動時間を参照）を示す電気泳動図を、表３に列挙されている修正を適用することによって、実施例７の部門に記載したように生成した。Ａ）青いチャネルで取得した全てのシグナルのエンドポイント電気泳動図、Ｂ）３９サイクル後の赤いチャネルでの電気泳動図。Ｃ）及びＤ）は、エンドポイント電気泳動図上で番号付けしたそれぞれのピークに対応する増幅曲線である。オリゴヌクレオチド及び標的は表３を参照できる。得られたアッセイは特異的であり、革新的なＴＸ技術を使用して、公開されている一重アッセイから派生した多重アッセイを生成する方法を簡単に要約している。影付きのピークは、実施例７において記載した標準物質のピークに対応する。
【0099】
図９：異なるＴＸプローブ設計の概略構造。概略図において、ＴＸプローブ（濃い灰色のＴＴＴ）が標的配列（薄い灰色のＴＴＴ）にハイブリダイズする。（Ｆ）は、本明細書において定義したリンカー（ジグザグ線）を介して架橋した標識、好ましくは蛍光体を表す。リンカーは、内部リンカー（ｃ）、ｆ）、及びｇ））又は５’末端リンカー（ａ）、ｂ）、ｄ）、ｅ））であってよい。（Ｓ）はスペーサーを表し、（Ｍ）は標的配列にハイブリダイズしない他の骨格修飾又は非骨格修飾を表す。ヌクレアーゼブロッカーの位置を黒いＴにより表し、３’ブロッカー（ポリメラーゼ）を示す。切断可能な加水分解生成物は、ホスホジエステル結合（Ｔ）を介して内部ヌクレアーゼブロッカーに結合した少なくとも１つの標的特異的ヌクレオチド（図示した）又は複数のもの（図示せず）を保有する。ヌクレアーゼブロッカーは、ハイブリダイズ配列の５’末端から下流の１位にあるが（図示した）、２位又は３位又は１位及び３位にあってよい（図示せず）。示したＴＸプローブは１０ヌクレオチドからなるが、９個、８個、７個又は６個で十分であり、１０超のヌクレオチドも本発明の範囲内である。
【0100】
図１０：キャピラリー電気泳動装置による検出における加水分解生成物の特異性を改善するためのＬＮＡを使用しＦＬＡＰを使用しない特異的なプローブ設計。実施例８において記載した得られた加水分解生成物の［スキャン］における移動時間を示す電気泳動図。Ａ）５’末端から位置１で１つのＬＮＡでブロックした前記ＴＸプローブの加水分解生成物。１つのフラグメント、３ヌクレオチドのフラグメント（３）を生じ、検出した。第２のかすかなフラグメントである２ヌクレオチドのフラグメント（２）も同様に検出される。Ｂ）５’末端から位置２で１つのＬＮＡでブロックした前記ＴＸプローブの加水分解生成物。この構成により、１つのフラグメント、１ヌクレオチドフラグメント（１）を生じ、検出した。Ｃ）５’末端から位置２及び３でＬＮＡでブロックした前記ＴＸプローブの加水分解生成物。この構成により、１つのフラグメント、１ヌクレオチドフラグメント（１）を生じ、検出した。Ｄ）５’末端から位置３で１つのＬＮＡでブロックした前記ＴＸプローブの加水分解生成物。この構成により、１ヌクレオチド（１）のフラグメント及び２ヌクレオチド（２）のフラグメントの２つのフラグメントを生じ、検出した。Ｅ）５’末端から位置３及び４でＬＮＡでブロックした前記ＴＸプローブの加水分解生成物。この構成により、１ヌクレオチド（１）のフラグメント及び２ヌクレオチド（２）のフラグメントの２つのフラグメントを生じ、検出した。Ｆ）５’末端から位置１及び３でＬＮＡでブロックした前記ＴＸプローブの加水分解生成物。この構成により、１つのフラグメント、２ヌクレオチド（２）フラグメントを生じ、検出した。それぞれの電気泳動図は、それぞれの円がヌクレオチドの位置を表す概略図（中央）を有する。円は、一致／アニーリングされたヌクレオチドを表す。ヌクレオチドがＬＮＡの場合に、図式内の位置を灰色で塗りつぶす。ＭＯＤＡＰＬＥＸサイズ標準ミックスを使用したが、この図において青いチャネルの標準物質ピークが１つだけ示されており、計算した長さは１１４．５ｂｐ（ｃａｌ１）である。
【0101】
図１１：キャピラリー電気泳動装置による検出における加水分解生成物の特異性を改善するためのＬＮＡを使用しＦＬＡＰを使用しない特異的なプローブ設計。実施例８において記載した得られた加水分解生成物の［スキャン］における移動時間を示す電気泳動図。Ａ）５’末端から位置１で１つのＬＮＡでブロックしたＦＬＡＰを有するＴＸプローブの加水分解生成物。２つのフラグメント、２ヌクレオチド（２）及び３ヌクレオチドのフラグメント（３）を生じ、検出した。Ｂ）５’末端から位置２で１つのＬＮＡでブロックしたＦＬＡＰを有するＴＸプローブの加水分解生成物。この構成により、１ヌクレオチド（１）のフラグメント及び３ヌクレオチド（３）のフラグメントの２つのフラグメントを生じ、検出した。Ｃ）５’末端から位置３で１つのＬＮＡでブロックしたＦＬＡＰを有するＴＸプローブの加水分解生成物。この構成により、わずかな１ヌクレオチド（１）のフラグメント及び２ヌクレオチド（２）のフラグメントの２つのフラグメントを生じ、検出した。Ｄ）５’末端から位置１及び３でＬＮＡでブロックしたＦＬＡＰを有するＴＸプローブの加水分解生成物。この構成により、１つのフラグメント、２ヌクレオチド（２）フラグメントを生じ、検出した。Ｅ）５’末端から位置１、３及び４でＬＮＡでブロックしたＦＬＡＰを有するＴＸプローブの加水分解生成物。この構成により、１つのフラグメント、２ヌクレオチド（２）フラグメントを生じ、検出した。それぞれの電気泳動図は、それぞれの円がヌクレオチドの位置を表す概略図（中央）を有する。丸は一致／アニーリングしたヌクレオチドを表し、ひし形はミスマッチ／フラップしたヌクレオチド位置を表す。ヌクレオチドがＬＮＡの場合に、図式内の位置を灰色で塗りつぶす。ＭＯＤＡＰＬＥＸサイズ標準ミックスを使用したが、この図において青いチャネルの標準物質ピークが１つだけ示されており、計算した長さは１１４．５ｂｐ（ｃａｌ１）である。
【0102】
図１２：キャピラリー電気泳動装置による検出における加水分解生成物の特異性を提供するプローブ内の代わりの内部ヌクレアーゼブロッカーの試験。実施例９において記載した得られた加水分解生成物の［スキャン］における移動時間を示す電気泳動図。Ａ）５’末端から位置２で１つのＬＮＡでブロックしたＴＸプローブの加水分解生成物。１つのフラグメント、１ヌクレオチドのフラグメント（１）を生じ、検出した。Ｂ）ＴＸプローブの加水分解生成物であるが、５’末端から位置２で２’－Ｏメトキシエチル－５－メチル－シチジン（２’－Ｏ－ＭＯＥ－ｒＭｅＣ）を使用してブロックした。この構成により、１つのヌクレオチド（１）及び３つのヌクレオチド（３）のフラグメントを検出した。ＭＯＤＡＰＬＥＸサイズ標準ミックスを使用したが、この図において青いチャネルの標準物質ピーク（１１４．５ｂｐ、ｃａｌ１）が１つだけ示されている。
【0103】
図１３：異なるキャピラリー電気泳動技術での単一増幅産物アッセイによって生じたＴＸシグネチャーの例。実施例１０において記載した得られた加水分解生成物の［スキャン］における移動時間を示す電気泳動図。全てのシグナルを、Ａ）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）３５００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＵＳ－ＣＡ）及びＢ）Ｍｏｄａｐｌｅｘの青いチャネルで得た。ＭＯＤＡＰＬＥＸは電気泳動図の横軸に別の用語（移動時間）を使用するが、双方の装置（ＭＯＤＡＰＬＥＸ及び３５００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ）は、蛍光標識したヌクレオチドの移動を示し、相対蛍光を介してその量を示す電気泳動図を生成する。双方の装置は、同じ加水分解生成物と使用した標準物質を表す明瞭で明確なピークの比較可能な電気泳動図を提供する。
【0104】
【数1-1】
【数1-2】
【0105】
実施例
材料及び方法
ヒト検体及び真菌参照株からのＤＮＡ精製：末梢静脈全血からのヒト検体を、ＷＭＡ－Ｗｏｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（Ｆｅｒｎｅｙ－Ｖｏｌｔａｉｒｅ、ＦＲ）の現在のヘルシンキ宣言に従ってインフォームドコンセントを得たボランティアから入手した。ヒト検体からのＤＮＡを、メーカーの仕様書に従ってＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ、ＤＥ）で調製した。真菌参照株を、ＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｉ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ及びＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ＤＥ）又はＣＢＳ－Ｔｈｅ Ｄｕｔｃｈ Ｃｅｎｔｒａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｅｎｔｒｅ （Ｕｔｒｅｃｈｔ、ＮＬ）から入手した。酵母細胞を、クロラムフェニコール（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｍｕｅｎｃｈｅｎ、ＤＥ）を含むサブローグルコース寒天上で２５℃で培養した。細胞を滅菌スパチュラで回収し、滅菌リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）に再懸濁した。ＤＮＡ精製を、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ、ＤＥ）を製造元の仕様書に従って使用し、以下の変更を加えて実施した：試料を細胞破壊用にメーカーのＡＴＬ緩衝液及びプロテイナーゼＫと混合し、５０℃で少なくとも１２時間インキュベートした。
材料及び方法
ヒト検体及び真菌参照株からのＤＮＡ精製：末梢静脈全血からのヒト検体を、ＷＭＡ－Ｗｏｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（Ｆｅｒｎｅｙ－Ｖｏｌｔａｉｒｅ、ＦＲ）の現在のヘルシンキ宣言に従ってインフォームドコンセントを得たボランティアから入手した。ヒト検体からのＤＮＡを、メーカーの仕様書に従ってＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ、ＤＥ）で調製した。真菌参照株を、ＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｉ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ及びＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ＤＥ）又はＣＢＳ－Ｔｈｅ Ｄｕｔｃｈ Ｃｅｎｔｒａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｅｎｔｒｅ （Ｕｔｒｅｃｈｔ、ＮＬ）から入手した。酵母細胞を、クロラムフェニコール（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｍｕｅｎｃｈｅｎ、ＤＥ）を含むサブローグルコース寒天上で２５℃で培養した。細胞を滅菌スパチュラで回収し、滅菌リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）に再懸濁した。ＤＮＡ精製を、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ、ＤＥ）を製造元の仕様書に従って使用し、以下の変更を加えて実施した：試料を細胞破壊用にメーカーのＡＴＬ緩衝液及びプロテイナーゼＫと混合し、５０℃で少なくとも１２時間インキュベートした。
【0106】
精製した全てのＤＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳ－ＣＡ）を使用したＵＶ－ＶＩＳ分光法によって定量した。
【0107】
ＰＣＲプライマー、プローブ、ユニバーサル標的配列及びプラスミドの設計及び合成：ヒトＤＮＡの一部（配列番号１０、ジーンバンクアクセッション番号ＮＧ＿０３２９０３の一部）又はアスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）のｒＤＮＡ遺伝子配列（配列番号１２、ジーンバンクアクセッション番号ＮＣ＿００７１９７の一部）を標的配列として選択した。実施例７のために使用したプラスミドインサートの標的配列は、Ｇａｂｅｒｔら（２００３）であった。ＰＣＲプライマー及びＴＸプローブ（表１）を、ソフトウェアＧｅｎｅｉｏｕｓ１０．２．６（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ Ｌｔｄ．、Ａｕｃｋｌａｎｄ、ＮＺ）及びＭｆｏｌｄ（Ｚｕｋｅｒ ２００３）を使用して設計した。全てのオリゴヌクレオチドを、市販の製造業者からＨＰＬＣ精製した品質で入手した。実施例７のプラスミドを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄａｒｍｓｔａｄ、ＤＥ）で合成構築物として注文した。
【0108】
【表1】
【0109】
Ｍｏｄａｐｌｅｘ（登録商標）システムの標準ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の設定：標準ＰＣＲを最終容量２５μＬで実施し、１倍量のＭｏｄａｐｌｅｘ Ｂｕｆｆｅｒ ３（Ｂｉｏｔｙｐｅ ＧｍｂＨ、Ｄｒｅｓｄｅｎ、ＤＥ）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２２．５ユニットＭｕｌｔｉ Ｔａｑ２ ＤＮＡポリメラーゼ（ホットスタート機能付き；Ｂｉｏｔｙｐｅ ＧｍｂＨ）、Ａ．フミガーツスの染色体ＤＮＡ１０～５０ｐｇヒトＤＮＡ２．５～２５０ｎｇ、又は標的配列、０．３μＭ ＰＣＲプライマー、及び０．３μＭプローブを含む７～７６０００コピーの人工合成プラスミドを含んだ（ＤＮＡ配列は表１及び表２を参照）。マルチウェルプレートをアルミニウムシーリングフィルム（Ｂｉｏｔｙｐｅ）で密封し、プレートアダプターを備えたベンチトップ遠心分離機を使用して遠心分離した。その後、シールを静かに外し、４０μＬのミネラルオイル（Ｍｅｒｃｋ－ＳＩＧＭＡ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ＤＥ）をそれぞれのウェルに適用した。
【0110】
ＭＯＤＡＰＬＥＸシステムを使用したキャピラリー電気泳動と組み合わせたＰＣＲサイクル：分析器は、ＰＣＲサーモサイクラー、自動サンプラー、キャピラリーゲル電気泳動装置、及び２つの分析チャネルを有する蛍光検出器からなるモジュール式装置である（米国特許第７４４５８９３号明細書、米国特許第７０８１３３９号明細書、米国特許第７６７４５８２号明細書、米国特許第８１８２９９５号明細書；Ｈｌｏｕｓｅｋら、２０１２）。分析装置は製造元の試薬を使用し、その説明書に従って完全に操作した。
【0111】
ＰＣＲを製造業者の化学物質で設定し、ＰＣＲプライマー及びプローブの最終濃度は標準的なＰＣＲによって記載されたものと一致した。ＰＣＲプログラムは、９６℃で２分間のホットスタート活性化、その後６２℃で４５秒、７２℃で４５秒及び９８℃で５秒の１６サイクル、並びにＣＥ分離のための１２回の注入を含む６２℃で４５秒、７２℃で２２０秒及び９６℃で１０秒の２３サイクルから構成した。キャピラリーゲル電気泳動によるリアルタイム分析を、１７サイクル目から３９サイクル目まで（２サイクルごと）、動電学的注入（１０．０００Ｖ、１５秒）による７２℃での伸長相で１２回実施した。検出ユニットは、相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表した蛍光を記録し、記録した移動時間に基づいて電気泳動図を出力として提供する（図２、図４～図６を参照）。リアルタイムＰＣＲ増幅曲線を、異なるＰＣＲサイクルで記録した全ての電気泳動図から構築する（図８Ｃ及び図８Ｄの挿入）。双方の分析チャネルに存在する非増幅内部キャリブレーター（前記定義を参照：ＭＯＤＡＰＬＥＸサイズ標準ミックス）を、加水分解フラグメントの移動長を計算するためにそれぞれのアッセイで使用する。特に説明がない限り、材料及び方法を本発明の全ての実施例のために使用した。
【0112】
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）３５００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＵＳ－ＣＡ）を使用したキャピラリーゲル電気泳動：分析器を、メーカーの仕様に従い、次の調整を行って３５００ＰＯＰ－７ポリマー（パフォーマンス最適化ポリマー）と共に使用した：装置のスペクトル較正を、仮想フィルターセットＡｎｙ５Ｄｙｅ及びマトリックス２５標準ＢＴ５（青、緑、黄、赤、オレンジの蛍光色素６ＦＡＭ、ＢＴＧ、ＢＴＹ、ＢＴＲ、ＢＴＯ）（Ｂｉｏｔｙｐｅ ＧｍｂＨ、Ｄｒｅｓｄｅｎ、ＤＥ）を組み合わせて使用して実施した。本発明のＴＸプローブを含む本発明の連続反応装置で実行される１つのアッセイを、Ｍｏｄａｐｌｅｘシステムで実施した。ＰＣＲ産物のアリコート又はその希釈液を、それぞれ、１２μＬ ＨｉＤｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＵＳ－ＣＡ）及び０．５μＬサイズ標準ＳＳＴ－ＢＴＯ（Ｂｉｏｔｙｐｅ ＧｍｂＨ、Ｄｒｅｓｄｅｎ、ＤＥ）と混合し、９５℃で３分間インキュベートし、その後、界面動電注入（１００００Ｖ、５秒）まで装置の自動サンプラー内で室温で保管した。分析器の分析ユニットは、図１３に例示したように、塩基対［ｂｐ］での相対移動長（横軸）にわたる相対蛍光単位（縦軸）の電気泳動図を記録する。
【0113】
実施例１：キャピラリー電気泳動装置による検出における加水分解生成物の特異性を改善するためのプローブ内の内部ヌクレアーゼブロッカーの同定
標準ＰＣＲを、プライマーである配列番号１及び配列番号２で標的配列番号１２（１０ｐｇ）並びに５’－６－ＦＡＭ及び３’－スペーサーＣ３修飾を有する異なるＴＸプローブ（配列番号３）に対してセットアップした。ＴＸプローブの切断は、ＭＯＤＡＰＬＥＸ－ＣＥのいくつかのピークを明らかにした（図２Ａの１－ｎｔ及び２－ｎｔの加水分解ピークを参照）。この現象は、標的に多くのシグナルピークがあり（多重化能力が低下）、さらに加水分解パターンがプローブに依存するため、システムを使用できなくする（ピーク強度がプローブごとに異なり、プローブが配列に基づいて異なる方法で加水分解されることが示唆される）。古典的なヌクレアーゼ阻害修飾ＰＴＯ（Ａｒｅｚｉら、２００３）は、化学合成中にＰＴＯ結合ごとに２つのオリゴヌクレオチド立体異性体を生成するが、目的のスペクトル範囲内に多くの非特異的で非増幅的なバンドを生成するため、適切ではなかった（図２Ｂを参照）。したがって、ヌクレオチド類似体「ロックド核酸」（ＬＮＡ）は、（ｉ）ヌクレアーゼ活性を遅延させ、（ｉｉ）アニーリング温度を上昇させる（Ｏｗｃｚａｒｚｙら、２０１１）という試験に成功した（図２Ｃ～Ｄ）。
標準ＰＣＲを、プライマーである配列番号１及び配列番号２で標的配列番号１２（１０ｐｇ）並びに５’－６－ＦＡＭ及び３’－スペーサーＣ３修飾を有する異なるＴＸプローブ（配列番号３）に対してセットアップした。ＴＸプローブの切断は、ＭＯＤＡＰＬＥＸ－ＣＥのいくつかのピークを明らかにした（図２Ａの１－ｎｔ及び２－ｎｔの加水分解ピークを参照）。この現象は、標的に多くのシグナルピークがあり（多重化能力が低下）、さらに加水分解パターンがプローブに依存するため、システムを使用できなくする（ピーク強度がプローブごとに異なり、プローブが配列に基づいて異なる方法で加水分解されることが示唆される）。古典的なヌクレアーゼ阻害修飾ＰＴＯ（Ａｒｅｚｉら、２００３）は、化学合成中にＰＴＯ結合ごとに２つのオリゴヌクレオチド立体異性体を生成するが、目的のスペクトル範囲内に多くの非特異的で非増幅的なバンドを生成するため、適切ではなかった（図２Ｂを参照）。したがって、ヌクレオチド類似体「ロックド核酸」（ＬＮＡ）は、（ｉ）ヌクレアーゼ活性を遅延させ、（ｉｉ）アニーリング温度を上昇させる（Ｏｗｃｚａｒｚｙら、２０１１）という試験に成功した（図２Ｃ～Ｄ）。
【0114】
いくつかのＬＮＡパターンを試験した（例えば１番目の位置のみ、又は３番目の位置のみのＬＮＡ）。単一の１ｎｔ加水分解フラグメントのコンディショニングは、５’末端から２番目の位置をブロックする必要があった（図２Ｃ）。これは、ほとんどの蛍光体製剤について十分であった。２ｎｔ加水分解フラグメントのコンディショニングは、５’末端から１番目と３番目の位置の双方がＬＮＡであることが必要であった（図２Ｄ）。最初のヌクレオチドは、標的配列に対して非ハイブリダイズ（ＦＬＡＰ－２ｎｔピーク）である必要もあった。このＬＮＡパターニングを、２ヌクレオチドより長い加水分解フラグメントの生成に使用できる。
【0115】
実施例２：４００ｂｐまでの検出範囲の拡大
標準ＰＣＲを、プライマー配列番号１～２、及び５’蛍光体と３’スペーサーＣ３修飾を有する異なるＴＸプローブ（配列番号３）を使用して、標的配列番号１２（１０ｐｇ）に対してセットアップし、ここで、ＴＸプローブは蛍光体のみが異なった。本明細書において定義した移動長を実施例１で表したように決定した。ＴＸプローブ（配列番号３）の切断は、ＭＯＤＡＰＬＥＸ－ＣＥのいくつかのピークを明らかにした（図２Ａの１－ｎｔ及び２－ｎｔの加水分解ピークを参照）。ＭＯＤＡＰＬＥＸ機器のために検証した２つの蛍光体、フルオレセイン（６－ＦＡＭ）及びＴＹＥ６６５は、高多重化システムを構築するためには不十分である。したがって、同様の吸光スペクトル及び発光スペクトルを有する多くの追加の蛍光体を試験した。図３は、蛍光体ポートフォリオの拡大の背後にある利点を示す：それぞれの蛍光体が有する異なる移動特性を利用することにより、それぞれの蛍光チャネルの電気泳動図の全範囲をカバーする効果的な多重化を概念化できる。これは、６－ＦＡＭによって提供される短い範囲が与える青いチャネルのために特に重要であった。Ａｔｔｏ４８８はさらに使用範囲を広げることができた。
標準ＰＣＲを、プライマー配列番号１～２、及び５’蛍光体と３’スペーサーＣ３修飾を有する異なるＴＸプローブ（配列番号３）を使用して、標的配列番号１２（１０ｐｇ）に対してセットアップし、ここで、ＴＸプローブは蛍光体のみが異なった。本明細書において定義した移動長を実施例１で表したように決定した。ＴＸプローブ（配列番号３）の切断は、ＭＯＤＡＰＬＥＸ－ＣＥのいくつかのピークを明らかにした（図２Ａの１－ｎｔ及び２－ｎｔの加水分解ピークを参照）。ＭＯＤＡＰＬＥＸ機器のために検証した２つの蛍光体、フルオレセイン（６－ＦＡＭ）及びＴＹＥ６６５は、高多重化システムを構築するためには不十分である。したがって、同様の吸光スペクトル及び発光スペクトルを有する多くの追加の蛍光体を試験した。図３は、蛍光体ポートフォリオの拡大の背後にある利点を示す：それぞれの蛍光体が有する異なる移動特性を利用することにより、それぞれの蛍光チャネルの電気泳動図の全範囲をカバーする効果的な多重化を概念化できる。これは、６－ＦＡＭによって提供される短い範囲が与える青いチャネルのために特に重要であった。Ａｔｔｏ４８８はさらに使用範囲を広げることができた。
【0116】
実施例３：ＴＸアッセイの多重化機能の拡張 － 修飾子の効果
「材料と方法」において記載したように、標的配列番号１２（１０ｐｇ）に対してプライマー配列番号１～２及びスペーサーで官能化された５’末端に連結された５’Ａｔｔｏ６４３を有する異なるＴＸプローブ（配列番号３）を使用して標準ＰＣＲを設定した。この表２、参考文献１７、１８、１９、及び２１に記載されているとおり、及び３’－スペーサーＣ３修飾。移動長を実施例１で表したように決定した。新規の電気泳動シグネチャーは、特定の蛍光体と修飾剤、例えばスペーサーを組み合わせたり（図４）、蛍光体の結合化学を変更したり（図５）することによっても作成できる。炭酸鎖の長さ又は組成が異なるスペーサー部分により、加水分解フラグメントの移動が速くなる（図４）。実施例３において、Ａｔｔｏ６４３と結合した従来技術のブロックされていないオリゴプローブ（図４Ａ）を参照として使用した（灰色のピーク１－ｎｔ又は２－ｎｔ）。１ヌクレオチド（１－ｎｔ）のピークは、２ヌクレオチド（２－ｎｔ）のピークよりも長い長さで移動する。破線のピークはＭＯＤＡＰＬＥＸキャリブレーター（ｃａｌ）に対応する。本発明のＴＸプローブから切断したスペーサー１８を有する加水分解生成物（ピーク（４）、図４）は、全体のフラグメント移動にヌクレオチドの約０．５倍寄与し、本発明のＴＸプローブから切断したスペーサーＣ１２を有する加水分解生成物（ピーク（３）、図４）は、ヌクレオチドとほぼ同じ寄与をする一方で、本発明のＴＸプローブから切断したｄＳｐａｃｅｒ（ピーク（２）、図４）又はスペーサーＣ３（ピーク（１）、図４）を有する加水分解生成物は、ヌクレオチド以上に寄与する。
「材料と方法」において記載したように、標的配列番号１２（１０ｐｇ）に対してプライマー配列番号１～２及びスペーサーで官能化された５’末端に連結された５’Ａｔｔｏ６４３を有する異なるＴＸプローブ（配列番号３）を使用して標準ＰＣＲを設定した。この表２、参考文献１７、１８、１９、及び２１に記載されているとおり、及び３’－スペーサーＣ３修飾。移動長を実施例１で表したように決定した。新規の電気泳動シグネチャーは、特定の蛍光体と修飾剤、例えばスペーサーを組み合わせたり（図４）、蛍光体の結合化学を変更したり（図５）することによっても作成できる。炭酸鎖の長さ又は組成が異なるスペーサー部分により、加水分解フラグメントの移動が速くなる（図４）。実施例３において、Ａｔｔｏ６４３と結合した従来技術のブロックされていないオリゴプローブ（図４Ａ）を参照として使用した（灰色のピーク１－ｎｔ又は２－ｎｔ）。１ヌクレオチド（１－ｎｔ）のピークは、２ヌクレオチド（２－ｎｔ）のピークよりも長い長さで移動する。破線のピークはＭＯＤＡＰＬＥＸキャリブレーター（ｃａｌ）に対応する。本発明のＴＸプローブから切断したスペーサー１８を有する加水分解生成物（ピーク（４）、図４）は、全体のフラグメント移動にヌクレオチドの約０．５倍寄与し、本発明のＴＸプローブから切断したスペーサーＣ１２を有する加水分解生成物（ピーク（３）、図４）は、ヌクレオチドとほぼ同じ寄与をする一方で、本発明のＴＸプローブから切断したｄＳｐａｃｅｒ（ピーク（２）、図４）又はスペーサーＣ３（ピーク（１）、図４）を有する加水分解生成物は、ヌクレオチド以上に寄与する。
【0117】
実施例４：ＴＸアッセイの多重化機能の拡張 － リンカー効果
標準ＰＣＲを、標的配列番号１２（１０ｐｇ）に対してプライマーである配列番号１～配列番号２及び５’－６－ＦＡＭ及び３’－スペーサーＣ３修飾を有する異なるＴＸプローブ（配列番号３）を用いてセットアップした。定義において記載したように、較正に使用したＭＯＤＡＰＬＥＸサイズ標準混合物に加えて、増幅コントロール（ＡＣ）も使用した。ほとんどの蛍光体を異なる方法により結合でき、その結果異なるリンカーが得られるか、又は異なる構成要素として既に入手可能である。移動長を実施例１で表したように決定した。最も一般的で最も効率的なカップリング化学は、この実施例で使用したＮＨＳエステル又はクリック化学（ＡＣＨ）を介したカップリングである。通常、オリゴヌクレオチドの精製を改善するか又は複数の修飾を可能にするために、種々の化学反応を使用する。さらに、得られた分子の移動度は異なり、システムの多重度を増加できた（図５）。
標準ＰＣＲを、標的配列番号１２（１０ｐｇ）に対してプライマーである配列番号１～配列番号２及び５’－６－ＦＡＭ及び３’－スペーサーＣ３修飾を有する異なるＴＸプローブ（配列番号３）を用いてセットアップした。定義において記載したように、較正に使用したＭＯＤＡＰＬＥＸサイズ標準混合物に加えて、増幅コントロール（ＡＣ）も使用した。ほとんどの蛍光体を異なる方法により結合でき、その結果異なるリンカーが得られるか、又は異なる構成要素として既に入手可能である。移動長を実施例１で表したように決定した。最も一般的で最も効率的なカップリング化学は、この実施例で使用したＮＨＳエステル又はクリック化学（ＡＣＨ）を介したカップリングである。通常、オリゴヌクレオチドの精製を改善するか又は複数の修飾を可能にするために、種々の化学反応を使用する。さらに、得られた分子の移動度は異なり、システムの多重度を増加できた（図５）。
【0118】
実施例５：ＴＸシグネチャーの例
標準ＰＣＲを、標的配列番号１２（１０ｐｇ）に対して、プライマーである配列番号１～配列番号２及び５’－６－ＦＡＭ及び３’－スペーサーＣ３修飾を有する異なるＴＸプローブ（配列番号３～６）を用いてセットアップした。移動長を実施例１で表したように決定した。蛍光体、リンカー、修飾因子、加水分解性ヌクレオチドの組み合わせは、ＬＮＡを使用したポリメラーゼブロッキングパターンと共に、個々のＰＣＲ産物をそれぞれ表す固有の電気泳動シグネチャーの生成を可能にし、ＣＥ機器で定性的又は定量的に追跡できる（図６）。
標準ＰＣＲを、標的配列番号１２（１０ｐｇ）に対して、プライマーである配列番号１～配列番号２及び５’－６－ＦＡＭ及び３’－スペーサーＣ３修飾を有する異なるＴＸプローブ（配列番号３～６）を用いてセットアップした。移動長を実施例１で表したように決定した。蛍光体、リンカー、修飾因子、加水分解性ヌクレオチドの組み合わせは、ＬＮＡを使用したポリメラーゼブロッキングパターンと共に、個々のＰＣＲ産物をそれぞれ表す固有の電気泳動シグネチャーの生成を可能にし、ＣＥ機器で定性的又は定量的に追跡できる（図６）。
【0119】
【表2】
【0120】
例として、表２と表３を組み合わせて読み取る方法は次のとおりである：配列番号４０（表３）の元の配列から出発し、Ｍｏｄ参考番号５（表２）の修飾を組み合わせた修飾配列は、［Ｔ］ＡＣＣＴＣＡＧＣＴＣＣＧＣＧＧＡＡＧＴＴＧＣ（下線＝ＬＮＡ、［ ］＝ＦＬＡＰ）である。又は、配列番号３７（表３）の元の配列から出発し、Ｍｏｄ参考番号７（表２）の修飾を組み合わせた修飾配列は、ＴＣＣＣＡＡＴＧＧＧＣＡＴＧＧＣＧＴＧＣである。
【0121】
実施例６：両アレルＳＮＰを遺伝子型同定及び定量のための単一プローブの使用
本発明によるモデルシステムは、他の実施形態において、この例に示されるようなＳＮＰの検出を可能にする。この実施形態において、切断可能な加水分解生成物は、ＴＸプローブの５’末端の最初のヌクレオチドにある少なくとも１つのヌクレアーゼブロッカーに隣接する２つの（第１及び第２の）ヌクレオチドからなり（図１Ｂ）、３つのヌクレオチドは、ＳＮＰを有する標的配列の相補配列とハイブリダイズする。標的配列上のＳＮＰは、切断可能な加水分解生成物の第１のヌクレオチドに相補的な位置にある。したがって、同じ切断可能な加水分解生成物は、同じように前記ＳＮＰのない標的配列にハイブリダイズしないが、最初のヌクレオチドはミスマッチのためにハイブリダイズせず、その特定の場合には、それは本発明の意味の範囲内でＦＬＡＰとなるであろう。
本発明によるモデルシステムは、他の実施形態において、この例に示されるようなＳＮＰの検出を可能にする。この実施形態において、切断可能な加水分解生成物は、ＴＸプローブの５’末端の最初のヌクレオチドにある少なくとも１つのヌクレアーゼブロッカーに隣接する２つの（第１及び第２の）ヌクレオチドからなり（図１Ｂ）、３つのヌクレオチドは、ＳＮＰを有する標的配列の相補配列とハイブリダイズする。標的配列上のＳＮＰは、切断可能な加水分解生成物の第１のヌクレオチドに相補的な位置にある。したがって、同じ切断可能な加水分解生成物は、同じように前記ＳＮＰのない標的配列にハイブリダイズしないが、最初のヌクレオチドはミスマッチのためにハイブリダイズせず、その特定の場合には、それは本発明の意味の範囲内でＦＬＡＰとなるであろう。
【0122】
ここで、システムは、標準的なＰＣＲ（「材料と方法」の部門を参照）で、合計７６０００コピーの標的として配列番号１０と配列番号１１の異なる混合物を含み、これらは１ つのＳＮＰが異なる（表１で強調されているＣ対Ａ）。移動長を実施例１で表したように決定した。プラスミド鋳型の混合物は、配列番号１１に対する配列番号１０のパーセンテージが０％から１００％の間で変動するようなものであった（試験した最高感度は１％であった）。配列番号７及び配列番号８をＰＣＲプライマーとして使用し、配列番号９をＴＸプローブとして使用し、以下の修飾を追加した（表２には示されていない）：５’－６－ＦＡＭ、プロリノールリンカー、３’－スペーサーＣ３、及びＴＸプローブの５’末端から数えてＳＮＰを保有する標的配列にハイブリダイズする２つのヌクレオチドの後の３番目の位置にある内部ヌクレアーゼブロッカーＬＮＡ。本発明に従って放出した加水分解生成物は、５’－６－ＦＡＭで標識した単一及びジヌクレオチドフラグメントからなり（図１Ｂ）、存在するアレル／バリアントに応じて異なる割合で存在する。図７は、Ｒ２係数０．９９９９、式ｙ＝－０．２６７８×３＋０．６５６９×２－１．２２６８×＋０．８６８９による多項式回帰を示す。この設計により、制御や標準化反応が少なくなり、測定の確度（真実性及び精度）の改善が得られた。ＭＯＤＡＰＬＥＸ装置のキャピラリー電気泳動と組み合わせると、３０超の高度な多重化が得られる。
【0123】
実施例７：さらなるアッセイの最適化を行わない多重化における公開した一重ｑＰＣＲの検出
公開されているＴａｑＭａｎTMアッセイを、記載した発明によってＭＯＤＡＰＬＥＸプラットフォームに容易に転送できる。移動長を実施例１で表したように決定した。例として、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に関与する融合転写産物を検出するためにＧａｂｅｒｔら（２００３）によって設計された９つの一重ｑＰＣＲ（表３も参照）を多重化ＰＣＲで組み合わせ、ＭＯＤＡＰＬＥＸで実行した（図８）。Ｇａｂｅｒｔら（２００３）で発表された、この出版物で使用されているがＢｅｉｌｌａｒｄら（２００３）で発表されたＡＢＬコントロールを含む選択されたＴａｑＭａｎTMプローブ配列（そこに開示されている全ての配列は参照により含まれる）を、異なる修飾を有する本発明の「ＴＸプローブ」（表３）に変換した（図１）。同じ又は他の本発明の修飾を、本発明に包含される他のＴａｑＭａｎ ＴＭプローブ配列に適用できる。この実施例で使用した実験条件は、ＭＯＤＡＰＬＥＸ Ｂｕｆｆｅｒ３、３単位のＨｏｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｒａｂｂｉｔ、Ｂｅｒｌｉｎ、ＤＥ）、及び５ｍＭ ＭｇＣｌ２からなった。全てのオリゴヌクレオチド濃度を０．２μＭに維持した。キャリブレーターとして、６－ＦＡＭチャネル（青いチャネル）の４つのサイズ標準とＴＹＥ６６５蛍光チャネル（赤いチャネル）の３つのサイズ標準からなる、前述のＭＯＤＡＰＬＥＸサイズ標準ミックスの拡張セットを使用した。計算した長さのサイズは、青いチャネルで５０ｂｐ（ｃａｌ１）、１１４．５ｂｐ（ｃａｌ３）、１６９．１８ｂｐ（ｃａｌ４）及び２７７．５ｂｐ（ｃａｌ５）、赤いチャネルで１５０．７ｂｐ（ｃａｌ６）、１９６．４ｂｐ（ｃａｌ７）及び４４０．４ｂｐ（ｃａｌ８）であった（図８）。使用したＡＣの計算上の長さは５８．６ｂｐであった（ｃａｌ２）。それぞれの融合転写産物の配列（表３）をインサートとして、及びバックグラウンドとして１００ｎｇのヒトｃＤＮＡを含むプラスミドの等量混合物（コピー数０～７６０００コピー、試験した最低量は７．６）を鋳型として使用した。プラスミド混合物を用いない対照実験は結果が得られなかった（データは示されていない）。プラスミドコピー数７６０００、ＰＣＲサイクル３９で多重化で実施したＭＯＤＡＰＬＥＸ反応を図７に示す。示したように、ＴＸプローブの使用により、Ｇａｂｅｒｔら（２００３）に記載されているように、ＴａｑＭａｎTMプローブを使用した良好なアッセイを実行した。したがって、本発明によるＴＸプローブは、さらなる最適化ステップなしで、予想外にも感度及び特異性の要件を満たしている。
公開されているＴａｑＭａｎTMアッセイを、記載した発明によってＭＯＤＡＰＬＥＸプラットフォームに容易に転送できる。移動長を実施例１で表したように決定した。例として、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に関与する融合転写産物を検出するためにＧａｂｅｒｔら（２００３）によって設計された９つの一重ｑＰＣＲ（表３も参照）を多重化ＰＣＲで組み合わせ、ＭＯＤＡＰＬＥＸで実行した（図８）。Ｇａｂｅｒｔら（２００３）で発表された、この出版物で使用されているがＢｅｉｌｌａｒｄら（２００３）で発表されたＡＢＬコントロールを含む選択されたＴａｑＭａｎTMプローブ配列（そこに開示されている全ての配列は参照により含まれる）を、異なる修飾を有する本発明の「ＴＸプローブ」（表３）に変換した（図１）。同じ又は他の本発明の修飾を、本発明に包含される他のＴａｑＭａｎ ＴＭプローブ配列に適用できる。この実施例で使用した実験条件は、ＭＯＤＡＰＬＥＸ Ｂｕｆｆｅｒ３、３単位のＨｏｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｒａｂｂｉｔ、Ｂｅｒｌｉｎ、ＤＥ）、及び５ｍＭ ＭｇＣｌ２からなった。全てのオリゴヌクレオチド濃度を０．２μＭに維持した。キャリブレーターとして、６－ＦＡＭチャネル（青いチャネル）の４つのサイズ標準とＴＹＥ６６５蛍光チャネル（赤いチャネル）の３つのサイズ標準からなる、前述のＭＯＤＡＰＬＥＸサイズ標準ミックスの拡張セットを使用した。計算した長さのサイズは、青いチャネルで５０ｂｐ（ｃａｌ１）、１１４．５ｂｐ（ｃａｌ３）、１６９．１８ｂｐ（ｃａｌ４）及び２７７．５ｂｐ（ｃａｌ５）、赤いチャネルで１５０．７ｂｐ（ｃａｌ６）、１９６．４ｂｐ（ｃａｌ７）及び４４０．４ｂｐ（ｃａｌ８）であった（図８）。使用したＡＣの計算上の長さは５８．６ｂｐであった（ｃａｌ２）。それぞれの融合転写産物の配列（表３）をインサートとして、及びバックグラウンドとして１００ｎｇのヒトｃＤＮＡを含むプラスミドの等量混合物（コピー数０～７６０００コピー、試験した最低量は７．６）を鋳型として使用した。プラスミド混合物を用いない対照実験は結果が得られなかった（データは示されていない）。プラスミドコピー数７６０００、ＰＣＲサイクル３９で多重化で実施したＭＯＤＡＰＬＥＸ反応を図７に示す。示したように、ＴＸプローブの使用により、Ｇａｂｅｒｔら（２００３）に記載されているように、ＴａｑＭａｎTMプローブを使用した良好なアッセイを実行した。したがって、本発明によるＴＸプローブは、さらなる最適化ステップなしで、予想外にも感度及び特異性の要件を満たしている。
【0124】
実施例８：キャピラリー電気泳動装置による検出における加水分解生成物の特異性を改善するためのＬＮＡを使用する特異的なプローブ設計
標準ＰＣＲを、プライマー配列番号７及び配列番号８を有する標的配列番号１０及び配列番号１１（双方とも７６０００コピー）、並びに５’－６－ＦＡＭ及び３’－スペーサーＣ３修飾を有する全て配列番号９を有する異なるＴＸプローブに対して個別にセットアップした。したがって、実施例１、４及び５における記載と同じ修飾を他のＴＸプローブと組み合わせて使用した。電気泳動図を、最後のＰＣＲサイクル後に達せられた加水分解生成物の検出によって生成した（図１０及び１１）。配列番号１０の存在下において（図１０）、ＴＸプローブは完全にアニールするが、配列番号１１（図１１）の存在下では、５’末端から数えて最初のヌクレオチドが不一致となり、ＦＬＡＰを形成する。１つ又は複数のＬＮＡを使用した。
標準ＰＣＲを、プライマー配列番号７及び配列番号８を有する標的配列番号１０及び配列番号１１（双方とも７６０００コピー）、並びに５’－６－ＦＡＭ及び３’－スペーサーＣ３修飾を有する全て配列番号９を有する異なるＴＸプローブに対して個別にセットアップした。したがって、実施例１、４及び５における記載と同じ修飾を他のＴＸプローブと組み合わせて使用した。電気泳動図を、最後のＰＣＲサイクル後に達せられた加水分解生成物の検出によって生成した（図１０及び１１）。配列番号１０の存在下において（図１０）、ＴＸプローブは完全にアニールするが、配列番号１１（図１１）の存在下では、５’末端から数えて最初のヌクレオチドが不一致となり、ＦＬＡＰを形成する。１つ又は複数のＬＮＡを使用した。
【0125】
生じた加水分解生成物の種類は、ＬＮＡが５’末端でどのように配置されているかによって異なる。ＴＸプローブ上のいくつかのＬＮＡ構成を試験し、加水分解生成物を特定した（図１０～１１）。ＬＮＡによる位置のブロックは、酵素を異なる加水分解点にリダイレクトすることと同等である。図１０Ｆの例において、５’から数えて１番目の位置にＬＮＡがあるが、３番目の位置のＬＮＡは、ポリメラーゼによる２番目の位置の消化を促進する。
【0126】
本発明において、ＦＬＡＰの非存在下で５’末端から数えて２番目の位置（図１０Ｂ）、及びＦＬＡＰの存在下では５’末端から数えて１番目と３番目の位置（図１１Ｄ）をブロックすることが記載されており、双方とも実施例１に記載されている。この設計の要件を満たすために、少なくとも１つの内部ブロッカーが必要です。しかしながら、図１０Ｃ、Ｅ及び図１１Ｅの例は、切断部位の下流で複数のブロッカー（この場合は２つ）を使用した場合、生じたシグナルの完全性及び特異性を維持することを示している。複数の内部ブロッカーの背後にある使いやすさは、特定の状況での実現可能性を示す。１つは、他のオリゴヌクレオチド位置を加水分解できる可能性がある強化された活性を持つポリメラーゼを使用する場合で、その結果、他の加水分解フラグメント（４つ以上のヌクレオチド加水分解フラグメント）が望ましくなく生じる。もう１つは、強力な蛍光色素により電気泳動図において望ましくない加水分解生成物が可視化されるため、加水分解反応をより適切に制御する必要がある場合である。
【0127】
得られた結果が、適用したＬＮＡ構造に基づいて期待される結果から逸脱する例が多数ある：図１０Ａにおいて、５’末端から数えて１番目の位置がブロックされているが、最も強度の高いシグナルは、２ヌクレオチドの加水分解フラグメントではなく、３ヌクレオチド（３）の加水分解フラグメントに相当し、図１０Ｆにおいて、１番目及び３番目の位置がブロックされているが、その抑制が予想されるにもかかわらず、２ヌクレオチド（２）の加水分解フラグメントが生じる。したがって、ここで示した結果は、最先端技術を考慮すると非常に驚くべきものです。
【0128】
特定の加水分解位置へのアクセスをさらに容易にするために、ＦＬＡＰ（非ハイブリダイズ５’末端ヌクレオチド）を導入した（図１１）。図１１Ｄの例では、ＦＬＡＰが位置１に導入されており、したがって、図１０Ｆと比較して２ヌクレオチド（２）加水分解フラグメントの増加に寄与していることに注目されたい。例の図１１Ｄにおけるパターンでは、たとえプローブの１番目の位置がミスマッチであっても、１番目と３番目の位置でＬＮＡを利用して２ヌクレオチド（２）の加水分解フラグメントを生成していることに注目されたい。その理由を理解するために、図１１Ｃの例では、単一ヌクレオチド（１）の加水分解フラグメントが、わずかではあるものの依然として検出できることが見出せる。
【0129】
Ｍｏｄａｐｌｅｘについて、機器の感度が高いため、適切なピークの割り当て、検出、定量化（Ｃｔ計算）のためにシグナルの厳密性が非常に重要である。言い換えれば、適切なＬＮＡパターニングの重要性を過小評価してはならない。
【0130】
最終的に、本発明は、標的配列及びそれぞれのＴＸプローブに依存して、放出した加水分解生成物の特異的シグナルが可能である方法を提供する。これは、本明細書において記載した少なくとも１つのヌクレアーゼブロッカーを適切に配置することによって達せられる。これは、ブロッカーの選択的な配置の実現可能性及び独創性を証明する。特に、ＴＸプローブが２つのブロッカーを含む実施形態についてデータが提供される。より具体的には、ＴＸプローブの切断可能産物の５’末端配列の最初のハイブリダイズする５’末端ヌクレオチドに第１のヌクレアーゼブロッカー、及び３番目のハイブリダイズするヌクレオチドに第２のヌクレアーゼブロッカーを含む、完全にハイブリダイズする切断可能な加水分解生成物を有するＴＸプローブについて、ＴＸプローブと、標的配列上の対応する配列に対するＦＬＡＰ及びＸプローブの切断可能な加水分解生成物の５’末端配列の最初の非ハイブリダイズ５’末端ヌクレオチド（ＦＬＡＰ）にある第１のヌクレアーゼブロッカーと３番目のハイブリダイズするヌクレオチドにある第２のヌクレアーゼブロッカーを含む切断可能な加水分解生成物とを比較する。驚くべきことに、個々のＦＬＡＰの望ましくない切断、したがって望ましくない人為構造を回避する。
【0131】
実施例９：キャピラリー電気泳動装置による検出における加水分解生成物の特異性を提供するプローブ内の代わりの内部ヌクレアーゼブロッカーの試験
標準ＰＣＲを、プライマーである配列番号１及び配列番号２で標的配列番号１２（１０ｐｇ）並びに５’－６－ＦＡＭ及び３’－スペーサーＣ３修飾を有する異なるＴＸプローブ（配列番号３）に対してセットアップした。全ての内部ヌクレアーゼブロッカーを、プローブの５’末端から数えて２番目の位置に配置した（図１２）。単一ヌクレオチド、２ヌクレオチド、及び３ヌクレオチドの加水分解フラグメントを、図においてそれぞれ１、２、及び３として強調表示する。参照内部ヌクレアーゼブロッカーは、単一ヌクレオチド（１）の加水分解ピークを生成するＬＮＡ（図１２Ａ）であった。メトキシエチル基による２’－糖位の他の骨格修飾の例として、２’－Ｏメトキシエチル－５－メチル－シチジン（２’－Ｏ－ＭＯＥ－ｒＭｅＣ、図１２Ｂ）を使用した。２’－Ｏ－ＭＯＥ－ｒＭｅＣの使用（図１２Ｂ）は、２ヌクレオチド加水分解の生成を抑制した。しかしながら、ＬＮＡは、３ヌクレオチド（３）加水分解フラグメントの生成も無効にする（図１２Ａ）。２’－Ｏ－ＭＯＥ－ｒＭｅＣがこの位置に耐性を付与するために適した２’－糖修飾であり、そのためこの種のブロッキングを達成することが技術的に実現可能であることを示す。前記ＴＸプローブ設計を追加の適した２’－糖修飾及び／又は他の糖修飾と、及び／又はＬＮＡと組み合わせることも適しており、同様に実現可能である。
標準ＰＣＲを、プライマーである配列番号１及び配列番号２で標的配列番号１２（１０ｐｇ）並びに５’－６－ＦＡＭ及び３’－スペーサーＣ３修飾を有する異なるＴＸプローブ（配列番号３）に対してセットアップした。全ての内部ヌクレアーゼブロッカーを、プローブの５’末端から数えて２番目の位置に配置した（図１２）。単一ヌクレオチド、２ヌクレオチド、及び３ヌクレオチドの加水分解フラグメントを、図においてそれぞれ１、２、及び３として強調表示する。参照内部ヌクレアーゼブロッカーは、単一ヌクレオチド（１）の加水分解ピークを生成するＬＮＡ（図１２Ａ）であった。メトキシエチル基による２’－糖位の他の骨格修飾の例として、２’－Ｏメトキシエチル－５－メチル－シチジン（２’－Ｏ－ＭＯＥ－ｒＭｅＣ、図１２Ｂ）を使用した。２’－Ｏ－ＭＯＥ－ｒＭｅＣの使用（図１２Ｂ）は、２ヌクレオチド加水分解の生成を抑制した。しかしながら、ＬＮＡは、３ヌクレオチド（３）加水分解フラグメントの生成も無効にする（図１２Ａ）。２’－Ｏ－ＭＯＥ－ｒＭｅＣがこの位置に耐性を付与するために適した２’－糖修飾であり、そのためこの種のブロッキングを達成することが技術的に実現可能であることを示す。前記ＴＸプローブ設計を追加の適した２’－糖修飾及び／又は他の糖修飾と、及び／又はＬＮＡと組み合わせることも適しており、同様に実現可能である。
【0132】
実施例１０：異なるキャピラリー電気泳動技術での単一増幅産物アッセイによって生じたＴＸシグネチャーの例
この実施例は、本発明のＴＸプローブを含む本発明の連続反応セットアップが、Ｍｏｄａｐｌｅｘ以外のＣＥデバイスとともに使用できることを示す。他の例として、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）の小サブユニット（１６Ｓ）リボソームＤＮＡを検出するために、それぞれが異なる加水分解生成物によって生成される１１の明確なシグナルを生じるアッセイ（表４）を設計した（配列番号５５、Ｎｉｅｒｍａｎ ＷＣら）。この例を生成するための実行可能な多重化アッセイを作成することにおいて費用が高く時間のかかる最適化ステップを回避するために、２つのプライマー（配列番号４２及び４３）によって生成した単一の増幅産物（配列番号５５）からなるＰＣＲ反応を作成した。増幅産物は、１１個の異なるＴＸプローブの結合を可能にするために十分な長さである必要があり、それぞれのＴＸプローブは異なる加水分解生成物を生成する（表５）。表５に列挙したオリゴヌクレオチドを、本発明によるＰＣＲにおいて合し、Ｍｏｄａｐｌｅｘ上で実行した。
この実施例は、本発明のＴＸプローブを含む本発明の連続反応セットアップが、Ｍｏｄａｐｌｅｘ以外のＣＥデバイスとともに使用できることを示す。他の例として、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）の小サブユニット（１６Ｓ）リボソームＤＮＡを検出するために、それぞれが異なる加水分解生成物によって生成される１１の明確なシグナルを生じるアッセイ（表４）を設計した（配列番号５５、Ｎｉｅｒｍａｎ ＷＣら）。この例を生成するための実行可能な多重化アッセイを作成することにおいて費用が高く時間のかかる最適化ステップを回避するために、２つのプライマー（配列番号４２及び４３）によって生成した単一の増幅産物（配列番号５５）からなるＰＣＲ反応を作成した。増幅産物は、１１個の異なるＴＸプローブの結合を可能にするために十分な長さである必要があり、それぞれのＴＸプローブは異なる加水分解生成物を生成する（表５）。表５に列挙したオリゴヌクレオチドを、本発明によるＰＣＲにおいて合し、Ｍｏｄａｐｌｅｘ上で実行した。
【0133】
その後、プレートを他の非定量的キャピラリー電気泳動装置であるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）３５００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒで操作した。図１３において、得られたエンドポイント電気泳動図を比較のために表示する：上の図１３Ａは３５００Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒで得られ、下の図１３ＢはＭｏｄａｐｌｅｘを用いて得られたものである。３５００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを、キャリブレーターシステムＭａｔｒｉｘ Ｓｔａｎｄａｒｄ ＢＴ５ ｍｕｌｔｉ（００－１０４２１－００２５、Ｂｉｏｔｙｐｅ）で操作したが、ＭｏｄａｐｌｅｘはＭＯＤＡＰＬＥＸサイズ標準ミックス（定義）に記載した青いチャネルのサイズ標準のみを使用した。Ｍｏｄａｐｌｅｘは、ｘ軸に移動時間を示す電気泳動図を示すが、内部較正システムのおかげで、定義において記載したように、これらを移動長に簡単に変換できる（図１３Ｂの二重軸を参照）。較正システムは機器ごとに異なるため、出力の長さも異なる。標準サイズの標準長の代わりに１１４．５ｂｐ、１６９．１８ｂｐ、及び２７７．５ｂｐ、８３ｂｐ、１１６ｂｐ、及び２８４ｂｐをそれぞれｃａｌ１、ｃａｌ２、ｃａｌ３の代わりに使用する場合（表５）、３５００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒによって登録したものと同様の移行長をＭｏｄａｐｌｅｘで取得できる。この実施例で使用したＭｏｄａｐｌｅｘ実験条件は、ＭＯＤＡＰＬＥＸ Ｂｕｆｆｅｒ３、３単位のＨｏｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｒａｂｂｉｔ、Ｂｅｒｌｉｎ、ＤＥ）、及び５ｍＭ ＭｇＣｌ２からなった。す全てのオリゴヌクレオチド濃度を０．２μＭに維持した。鋳型は、抽出したアスペルギルス・フミガーツスのゲノムＤＮＡ（配列番号５５）１０ｐｇとして使用した。表５に列挙したそれぞれのプローブは、個別のシグナルを生じた。双方の電気泳動図において得られたピークは同様の移動パターンを示し、それぞれの加水分解生成物の同定を可能にする。ピーク強度の違いは、機器の較正の違いから生じる。加水分解フラグメントの分離にはいくつかの要因も影響する。緩衝液の組成は電気浸透流を制御し、したがって加水分解フラグメントの移動を制御するため、重要な要素であることが公知である。さらに、ホルムアミドを、３５００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒでは使用するが、Ｍｏｄａｐｌｅｘでは使用しない。技術とキャピラリー電気泳動法との間には大きな違いがあるにもかかわらず、本発明の方法を使用することにより、電気泳動サインの同数の明瞭で明確なシグナルが観察される。これは、同じ概念、すなわち本発明による同じＴＸプローブ設計及び方法が実現可能であり、さらなる修正や調整を行うことなく別個のプラットフォームに直接首尾よく適用できることを意味する。
【0134】
【表3-1】
【表3-2】
【0135】
上記の標的及び染色体異常は、Ｇａｂｅｒｔら（２３２０頁、表１及び２３２１頁）に記載されているものに対応しており、元のＴａｑｍａｎTMプローブ及びプライマーも同様に記載されている。Ｇａｂｅｒｔらの開示全体は、参照をもって本明細書に組み込まれる。
【0136】
【表4】
【0137】
【表5】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-12-13
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下、－ 少なくとも１つの分子遺伝分析物（Ｔ１－ｎ）を含む少なくとも１つの標的配列、
－ 特定の標的配列の増幅に適した少なくとも１つのプライマー（Ｐ１－ｎ）、
－ 少なくとも１つの分析物に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ（「ＴＸプローブ」１－ｎ）であって、少なくとも１つのＴＸプローブが、
－ 少なくとも１つの特異的プライマー（Ｐ１）の相補配列の３’下流に位置する領域内の少なくとも１つの分析物の配列に逆相補的な３’配列、
－ プライマー伸長反応を阻害する分析物に特異的な３’配列の３’末端にある保護基（３’ブロッカー）、
－ ヌクレアーゼ活性に対する耐性を付与し、３’下流のＴＸプローブから切断可能な加水分解生成物を構造的に分割する、ＴＸプローブのハイブリダイズ配列の５’領域にある少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカー
を含む反応混合物を含む集合的かつ連続的な反応装置において少なくとも１つ以上の分子遺伝分析物を検出するための方法であって、切断可能な加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）が、
・ ＴＸプローブの５’末端の少なくとも１つのヌクレオチド、及び
・ リンカーを介して切断可能な加水分解生成物に架橋された標識
を含む少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカー
を含み、以下のステップ、
－ 少なくとも１つの標的配列を少なくとも１つのＴＸプローブ及び少なくとも１つのプライマーと接触させるステップ、
－ 少なくとも１つのプライマーとＴＸプローブの３’配列の双方を同一の標的配列の同一の鎖上のそれぞれの相補配列にハイブリダイズするステップであって、ＴＸプローブがＰ１の３’上流にハイブリダイズするステップ、
－ 鋳型依存性の５’→３’ヌクレアーゼ活性でハイブリダイズしたＴＸプローブを切断して少なくとも１つの切断可能な加水分解生成物を放出するステップ、
－ 電気泳動により加水分解生成物を分離するステップ、及び
－ 放出した加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）を検出するステップであって、それぞれの加水分解生成物が標的配列内の特定の分析物の存在を示すステップ
を含む、前記方法。
【請求項2】
切断可能な加水分解生成物及び放出した加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）が、骨格修飾、非骨格修飾及び／又は人工塩基を含む少なくとも１つのヌクレオチドの少なくとも１つの修飾をさらに含み、－ 骨格修飾が、ヌクレオチドの五炭糖の２’位及び／又は４’位での人工修飾を含み、
－ 非骨格修飾が、ヌクレオチドの５’末端及び／又は３’末端に結合する人工化学修飾を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記非骨格修飾が、ヌクレオチドの３’末端及び／又は５’末端に、又は２つのヌクレオチド間に結合した化学構造であるスペーサーを含み、かつ好ましくはａ） （Ｃn）－ＯＨ［式中、ｎは整数であり、少なくとも３、好ましくは３、６、９又は１２である］のアルキルアルコール、プロパニル（スペーサーＣ３）、ヘキサニル（スペーサーＣ６）、ノナニル（スペーサーＣ９）及びドデカニル（スペーサーＣ１２）を含む（Ｃn）－ＯＨのアルキルアルコール、
ｂ） （Ｃ－Ｏ－Ｃ－Ｃ）n－ＯＨ［式中、ｎは整数であり、少なくとも１である］のグリコールエーテル、好ましくはトリエチレングリコール（スペーサー９）、テトラエチレングリコール（スペーサー１２）、及びヘキサエチレングリコール（スペーサー１８）を含む（Ｃ－Ｏ－Ｃ－Ｃ）n－ＯＨのグリコールエーテル、及び／又は
ｃ） ２’－デオキシリボースの１位にメチレン基を有するテトラヒドロフラン誘導体
から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
複数の分析物に特異的な３’配列（Ｔ１－ｎ）を含む複数のＴＸプローブ（ＴＸプローブ１－ｎ）を使用し、全てのそれぞれの切断可能な加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）は、それぞれ切断可能な加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）の少なくとも１つのヌクレオチドに結合した同一の標識を含み、それぞれが異なるリンカー及び／又は少なくとも１つの異なる修飾を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
複数のＴＸプローブが同一であり、かつ同じ切断可能な加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）からなるが、異なる加水分解生成物を放出して検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
以下、－ 放出したそれぞれの加水分解生成物が、重複、点変異、置換、欠失、挿入、フレームシフト、転座、ｍＲＮＡスプライスバリアント及び／又は他の塩基変異を表す特定の配列の存在を示す、少なくとも１つの分析物内の少なくとも１つの変異
－ ジェノタイピング、
－ コピー数の変動及び／又は
－ 発現レベルの変動
を含む、未修飾配列と比較した少なくとも１つの分析対象内の分子レベルの変動が検出可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
分析物内の一塩基多型（ＳＮＰ）のそれぞれのアレルバリアントが、それぞれ放出した加水分解生成物によって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
分離をキャピラリー電気泳動によって実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
分析物に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（「ＴＸプローブ」、プローブ１－ｎ）であって、ＴＸプローブが、－ 少なくとも１つのプライマー（Ｐ１）の相補配列の３’下流に位置する領域内の少なくとも１つの分析物の配列に逆相補的な３’配列、
－ プライマー伸長反応を阻害する、分析物に特異的な３’配列の３’末端にある保護基（３’ブロッカー）、
－ ヌクレアーゼ活性に対する耐性を付与し、３’下流のＴＸプローブから切断可能な加水分解生成物を構造的に分割する、ＴＸプローブのハイブリダイズ配列の５’領域にある少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカー
を含み、切断可能な加水分解生成物が、
・ ＴＸ プローブの５’末端の少なくとも１つのヌクレオチド、及び
・ リンカーを介して切断可能な加水分解生成物に架橋させた標識、好ましくは蛍光体
を含み、少なくとも１つのヌクレアーゼブロッカーが、ハイブリダイズ配列の５’末端から位置１（下流）又は位置２（下流）のいずれかにある、分析物に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項10】
切断可能な加水分解生成物が、少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカーの５’上流に位置する分析物に非特異的な５’配列（ＦＬＡＰ）を含み、かつ標識が、リンカーを介して－ ＴＸプローブのＦＬＡＰの５’末端（５’リンカー）、又は
－ 少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカーから５’上流の内部ヌクレオチド
に結合されている、請求項９に記載のＴＸプローブ。
【請求項11】
切断可能な加水分解生成物が、骨格修飾、非骨格修飾及び／又は人工塩基を含む少なくとも１つのヌクレオチドの少なくとも１つの修飾を含み、－ 骨格修飾が、ヌクレオチドの五炭糖の２’位及び／又は４’位での人工修飾を含み、
－ 非骨格修飾が、ヌクレオチドの５’末端及び／又は３’末端に結合する人工化学修飾を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
請求項９に記載のＴＸプローブから放出させた加水分解生成物（Ｌ１－ｎ）。
【請求項13】
請求項１から８までのいずれか１項に記載の少なくとも１つ以上の分析物の検出のための方法における、請求項９から１１までのいずれか１項に記載の少なくとも１つの分析物に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（「ＴＸプローブ」、１－ｎ）及び／又は請求項１２に記載の加水分解生成物の使用。
【請求項14】
放出させた加水分解生成物が特定の分析物の存在の確認である、請求項１３に記載の使用。
【請求項15】
少なくとも１つの標識した、又はそれ以上標識した分析物に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（「ＴＸプローブ」、１－ｎ）を含むキットであって、ＴＸプローブが、－ 少なくとも１つの特異的プライマー（Ｐ１）の相補配列の３’下流に位置する領域内の少なくとも１つの分析物の配列に逆相補的な３’配列、
－ プライマー伸長反応を阻害する、分析物に特異的な３’配列の３’末端にある保護基（３’ブロッカー）、及び
－ ヌクレアーゼ活性に対する耐性を付与し、３’下流のＴＸプローブから切断可能な加水分解生成物を構造的に分割する、ＴＸプローブのハイブリダイズ配列の５’領域にある少なくとも１つの内部ヌクレアーゼブロッカー
をそれぞれ含み、切断可能な加水分解生成物が、
・ ＴＸ プローブの５’末端の少なくとも１つのヌクレオチド、及び
・ リンカーを介して切断可能な加水分解生成物に架橋させた標識、好ましくは蛍光体
を含み、少なくとも１つのヌクレアーゼブロッカーが、ハイブリダイズ配列の５’末端から位置１（下流）又は位置２（下流）のいずれかにある、前記キット。
【国際調査報告】