知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特表2024-515255インスリン製剤及び早産児におけるインスリン製剤の使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-08
(54)【発明の名称】インスリン製剤及び早産児におけるインスリン製剤の使用方法
(51)【国際特許分類】
A61K 38/28 20060101AFI20240401BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20240401BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20240401BHJP
A61K 47/40 20060101ALI20240401BHJP
A61K 47/69 20170101ALI20240401BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240401BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240401BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240401BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20240401BHJP
A61P 5/50 20060101ALI20240401BHJP
A23L 33/17 20160101ALI20240401BHJP
A23C 9/152 20060101ALI20240401BHJP
【ＦＩ】
A61K38/28
A61K47/26
A61K47/02
A61K47/40
A61K47/69
A61P29/00
A61P31/00
A61P43/00 111
A61K9/19
A61P5/50
A23L33/17
A23C9/152
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023561809
(86)(22)【出願日】2022-04-11
(85)【翻訳文提出日】2023-12-04
(86)【国際出願番号】 IL2022050371
(87)【国際公開番号】W WO2022219625
(87)【国際公開日】2022-10-20
(31)【優先権主張番号】63/173,442
(32)【優先日】2021-04-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521516639
【氏名又は名称】エルガン ファーマ リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＥＬＧＡＮ ＰＨＡＲＭＡ ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＮＧＴ３， １３ Ｗａｄｉ Ｅｌ－Ｈａｊ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｎａｚａｒｅｔｈ， Ｉｓｒａｅｌ
(74)【代理人】
【識別番号】110002952
【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】オルシャンスキー ミカル
(72)【発明者】
【氏名】オストロフスキー エレナ
(72)【発明者】
【氏名】ゼルディス スタヴ
【テーマコード（参考）】
4B001
4B018
4C076
4C084
【Ｆターム（参考）】
4B001AC03
4B001AC05
4B001AC06
4B001AC46
4B001BC02
4B001BC04
4B001BC13
4B001EC05
4B001EC06
4B001EC08
4B001EC09
4B018LB07
4B018LB08
4B018LB10
4B018LE03
4B018MD02
4B018MD07
4B018MD08
4B018MD10
4B018MD20
4B018MD31
4B018MD36
4B018MD71
4B018ME14
4B018MF01
4B018MF02
4B018MF06
4B018MF14
4C076BB01
4C076CC04
4C076CC30
4C076CC31
4C076CC40
4C076DD22
4C076DD23
4C076DD40
4C076DD41
4C076DD63
4C076EE06
4C076EE23
4C076EE30
4C076EE39
4C076FF33
4C076FF34
4C076FF67
4C076FF68
4C084AA02
4C084BA01
4C084DB34
4C084MA05
4C084MA52
4C084NA02
4C084NA06
4C084NA10
4C084ZB111
4C084ZB112
4C084ZB351
4C084ZB352
4C084ZC021
4C084ZC022
(57)【要約】
インスリン製剤ならびにインスリン製剤の調製方法及び使用方法。インスリン調製物は、インスリン、オリゴ糖、及び塩化ナトリウムを１：Ａ：Ｂ（それぞれｗ：ｗ：ｗ）の比で含み、Ａ及びＢの範囲はそれぞれ１０００～５０００及び１０～５０である。
【選択図】 図８
【選択図】 図８
【特許請求の範囲】
【請求項1】
乳児用乳汁栄養食（ｉｎｆａｎｔ ｆｅｅｄ）に使用するためのインスリンを調製する方法であって、（ａ）インスリンを塩酸に可溶化させて可溶化インスリンを得ること、及び
（ｂ）前記可溶化インスリンを水で希釈してｐＨを６．９～８．０に調整すること、
を含む、方法。
【請求項2】
（ｃ）シクロデキストリンを溶液（ｂ）に添加してそれによりシクロデキストリンの空隙内に前記インスリンを包接すること、及び（ｄ）ｐＨを６．９～８．０に調整すること、
を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
（ｂ）または（ｄ）の結果物を、塩化ナトリウム溶液及びマルトデキストリン溶液とｐＨ６．７～７．５で混和し、次いで前記ｐＨを６．７～７．６に調整することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記混和の結果物を濾過し、濾液を凍結乾燥してｐＨ６．０～７．６の無晶性粉末を得ることを更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
インスリンを含む乳児用乳汁栄養食を製造する方法であって、請求項４に記載の前記無晶性粉末を前記乳児用乳汁栄養食中で再構成することを含む、方法。
【請求項6】
インスリン、オリゴ糖、及び塩化ナトリウムを１：Ａ：Ｂ（それぞれｗ：ｗ：ｗ）の比で含むインスリン製剤であって、Ａ及びＢの範囲が、それぞれ１０００～１００，０００及び１０～５０である、インスリン製剤。
【請求項7】
シクロデキストリンを更に含む、請求項６に記載のインスリン製剤。
【請求項8】
前記シクロデキストリンの割合が、前記インスリンに対して１０～１０００である、請求項７に記載のインスリン製剤。
【請求項9】
脱イオン水または０．９％塩化ナトリウム溶液中に濃度０．０３ｇ／ｍｌで再構成されるとき、ｐＨが６．０～７．６となる、請求項６に記載のインスリン製剤。
【請求項10】
１グラムの前記インスリン製剤に、２～４０ＩＵが含まれる、請求項６または８に記載のインスリン製剤。
【請求項11】
Ａ２１デスアミドインスリンの含有量が５％未満である、請求項６または８に記載のインスリン製剤。
【請求項12】
総関連物質の含有量が５％未満である、請求項６または８に記載のインスリン製剤。
【請求項13】
最終投与単位（ｆｉｎｉｓｈｅｄ ｄｏｓａｇｅ ｕｎｉｔ）中のインスリン含有量の相対標準偏差が５％以下である、請求項６または８に記載のインスリン製剤。
【請求項14】
請求項６に記載のインスリン製剤を含む、乳児用乳汁栄養食。
【請求項15】
早産児における壊死性腸炎／大腸炎／全腸炎を予防する方法であって、前記早産児に請求項１４に記載の乳児用乳汁栄養食を投与することを含む、方法。
【請求項16】
早産児における壊死性腸炎／大腸炎／全腸炎の有病率及び重症度を低減させる方法であって、前記早産児に請求項１４に記載の乳児用乳汁栄養食を投与することを含む、方法。
【請求項17】
早産児における遅発型敗血症の有病率を低減させる方法であって、前記早産児に請求項１４に記載の乳児用乳汁栄養食を投与することを含む、方法。
【請求項18】
早産児における胃腸管の炎症を低減させる方法であって、前記早産児に請求項１４に記載の乳児用乳汁栄養食を投与することを含む、方法。
【請求項19】
早産児における有害事象、生命を脅かす事象、及び致死性合併症の有病率及び重症度を低減させる方法であって、前記早産児に請求項１４に記載の乳児用乳汁栄養食を投与することを含む、方法。
【請求項20】
早産児における胃腸管の透過性を低減させる方法であって、前記早産児に請求項１４に記載の乳児用乳汁栄養食を投与すること、及び
ラクトース／ラクツロース比を測定すること、
を含む、方法。
【請求項21】
早産児における腸内微生物叢の迅速な成熟を増大させる方法であって、前記早産児に請求項１４に記載の乳児用乳汁栄養食を投与すること、ならびに
Proteobacteria門の低減ならびにFirmicutes門及びClostridiaceae科の増加を測定すること、
を含む、方法。
【請求項22】
前記乳児用乳汁栄養食が、０．１～４ＩＵ／ｍｌのインスリンを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
早産児における遅発型敗血症を予防する方法であって、前記早産児に請求項１４に記載の乳児用乳汁栄養食を投与することを含む、方法。
【請求項24】
前記乳児用乳汁栄養食が、０．１～４ＩＵ／ｍｌのインスリンを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項25】
早産児が一次医療から退院するまでの時間を短縮する方法であって、前記早産児に請求項１４に記載の乳児用乳汁栄養食を投与することを含む、方法。
【請求項26】
前記短縮が、未治療の早産児と比較して少なくとも５％である、請求項２５に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０２１年４月１１日に出願された米国仮特許出願第６３／１７３，４４２号明細書の優先権を主張するものであり、この仮特許出願の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、２０２１年４月１１日に出願された米国仮特許出願第６３／１７３，４４２号明細書の優先権を主張するものであり、この仮特許出願の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【0002】
本発明は、乳児用乳汁栄養食（ｉｎｆａｎｔ ｆｅｅｄ）に使用するために製剤化されたインスリン製剤に関する。本発明の実施形態は、インスリン及びインスリンを含む乳児用乳汁栄養食を調製する方法、ならびに遅発型敗血症または壊死性腸炎／大腸炎／全腸炎などの早産児障害を予防するまたはその重症度を低減させる際のインスリン含有乳児用乳汁栄養食の使用方法に関する。
【背景技術】
【0003】
妊娠第３７週より前に出産した場合、出産は未熟出産または早産とみなされる。子宮内での最後の数週間は、健全な体重増加及び種々の生命維持に必要な器官の十分な発達にとって極めて重要である。
【0004】
人乳は、乳児に対する健康上の利益が立証されていることから、早産児を含む全ての乳児に対する最適な乳汁栄養として認識されている。
【0005】
人乳には相当数のホルモン及び成長因子が含まれており、これらのホルモンの一部（例えば、インスリン、インスリン様成長因子１、ＩＧＦ－１、上皮成長因子）が経口投与後に小腸に影響を及ぼすことが研究から示されている。
【0006】
早産児用調合乳にインスリンを添加することによって発育が良好になり、腸管の成熟が促進されることも、研究から示されている［Shulman, R. J., 2002；Archives of Disease in Childhood-Fetal and Neonatal Edition, 86(2), F131-F133］。
【0007】
インスリン含有乳児用乳汁栄養製剤についてはこれまでに報告されているものの、乳児が未熟児として出生した場合、消化系が十分に発達していない可能性があり、その結果、これらの早産児の多くが栄養失調に直接的または間接的に関連する摂食困難及び摂食障害を経験する。
【0008】
生後７２時間以降に発病する敗血症と定義される遅発型敗血症（ＬＯＳ）は、新生児集中治療室における主な死因である。早産児のＬＯＳ発生率は、生後１２０日間は２０～３８％の間で変動し、死亡率の範囲は１３～１９％である。
【0009】
壊死性腸炎（ＮＥＣ）は、主に未熟児の腸を冒す疾患である。細菌が腸壁に侵入することにより、局所感染及び炎症が引き起こされ、最終的には腸壁が破壊されるおそれがある。早産児の約７％が壊死性腸炎を発症し、罹患児のうち約２５％が死亡する。
【0010】
本発明を実践に移す際に、本発明者らは、乳児用乳汁栄養食（調合乳または母乳）に可溶化可能なインスリン製剤を製剤化し、かかる製剤を使用してＬＯＳ及びＮＥＣを予防するまたはその重症度を低減させることができることを初めて示した。
【発明の概要】
【0011】
本発明の一態様によれば、乳児用乳汁栄養食に使用するためのインスリンを調製する方法であって、インスリンを塩酸に可溶化させて可溶化インスリンを得ること、及び可溶化インスリンを水で希釈してｐＨを６．９～８．０に調整すること、を含む方法が提供される。
【0012】
本発明の実施形態によれば、本方法は、シクロデキストリンを溶液（ｂ）に添加してそれによりシクロデキストリンの空隙内にインスリンを包接すること、及びｐＨを６．９～８．０に調整すること、を更に含む。
【0013】
本発明の実施形態によれば、本方法は、（ｂ）または（ｄ）の結果物を塩化ナトリウム溶液及びマルトデキストリン溶液と混和して、ｐＨを６．７～７．６に調整することを更に含む。
【0014】
本発明の実施形態によれば、組成物は、水中油型ナノ液滴エマルションと組み合わされており、このナノ液滴にはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０が含まれている。
【0015】
本発明の実施形態によれば、本方法は、混和の結果物を濾過し、濾液を凍結乾燥してｐＨ６．０～７．６の無晶性粉末を得ることを更に含む。
【0016】
本発明の別の態様によれば、インスリンを含む乳児用乳汁栄養食を製造する方法であって、本明細書に記載の無晶性粉末を乳児用乳汁栄養食中で再構成することを含む方法が提供される。
【0017】
本発明の別の態様によれば、インスリン、オリゴ糖、及び塩化ナトリウムを１：Ａ：Ｂ（それぞれｗ：ｗ：ｗ）の比で含むインスリン製剤が提供され、ここで、Ａ及びＢの範囲は、それぞれ１０００～１００，０００及び１０～５０である。
【0018】
本発明の実施形態によれば、本インスリン製剤は、脱イオン水または０．９％塩化ナトリウム溶液中に濃度０．０３ｇ／ｍｌで再構成されるとき、ｐＨは６．０～７．６となる。
【0019】
本発明の実施形態によれば、本インスリン製剤は、シクロデキストリンを更に含む。
【0020】
本発明の実施形態によれば、シクロデキストリンの割合は、インスリンに対して１０～１０００である。
【0021】
本発明の実施形態によれば、１グラムの本インスリン製剤に、２～４０ＩＵが含まれる。
【0022】
本発明の別の態様によれば、本インスリン製剤を含む乳児用乳汁栄養食が提供される。
【0023】
本発明の別の態様によれば、早産児における壊死性腸炎／大腸炎／全腸炎を予防する方法であって、早産児に乳児用乳汁栄養食を投与することを含む方法が提供される。
【0024】
本発明の別の態様によれば、早産児における壊死性腸炎／大腸炎／全腸炎の有病率及び重症度を低減させる方法であって、早産児に乳児用乳汁栄養食を投与することを含む方法が提供される。
【0025】
本発明の別の態様によれば、早産児における遅発型敗血症の有病率を低減させる方法であって、早産児に乳児用乳汁栄養食を投与することを含む方法が提供される。
【0026】
本発明の別の態様によれば、早産児における胃腸管の炎症を低減させる方法であって、早産児に乳児用乳汁栄養食を投与することを含む方法が提供される。
【0027】
本発明の別の態様によれば、早産児における有害事象、生命を脅かす事象、及び致死性合併症の有病率及び重症度を低減させる方法であって、早産児に乳児用乳汁栄養食を投与することを含む方法が提供される。
【0028】
本発明の別の態様によれば、早産児における胃腸管（ＧＩ管）の透過性を低減させる方法であって、早産児に乳児用乳汁栄養食を投与すること、及びラクトース／ラクツロース比を測定すること、を含む方法が提供される。
【0029】
本発明の別の態様によれば、早産児における腸内微生物叢の迅速な成熟を増大させる方法であって、早産児に乳児用乳汁栄養食を投与すること、ならびにProteobacteria門の低減ならびにFirmicutes門及びClostridiaceae科の増加を測定すること、を含む方法が提供される。
【0030】
本発明の実施形態によれば、乳児用乳汁栄養食には、０．０１～４ＩＵ／ｍｌが含まれる。
【0031】
本発明の別の態様によれば、早産児における遅発型敗血症を予防する方法であって、早産児に乳児用乳汁栄養食を投与することを含む方法が提供される。
【0032】
本発明の別の態様によれば、早産児の一次医療からの退院時間を短縮する方法であって、早産児に本明細書に開示される乳児用乳汁栄養食を投与することを含む方法が提供される。
【0033】
別途定義されていない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法及び材料を本発明の実践または試験に使用することができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。矛盾が生じる場合には、定義を含めて本明細書が優先される。加えて、材料、方法、及び実施例は、例示に過ぎず、限定することを意図したものではない。
【0034】
本発明は、本明細書において、添付図面を参照して単なる例として説明される。これより、具体的に図面を詳細に参照するが、示される特質は、単に、例としてのものであり、かつ本発明の好ましい実施形態を例示的に考察する目的のものであり、本発明の原理及び概念的側面の最も有用で容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示されていることを強調する。この点に関して、本発明の基本的な理解に必要とされる以上に詳細に本発明の構造の詳細を示す試みは行われておらず、当業者には、本発明のいくつかの形態がどのようにして実際に具体化され得るかが、説明を図面と併せて読むことにより明らかになる。
【0035】
図面は以下のとおりである。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】本発明の製剤Ｉ～ＩＶの典型的なクロマトグラムである。
【図2】本発明の製剤Ｖ～ＶＩの典型的なクロマトグラムである。
【図3】本発明の製剤ＩＶ～Ｖ中のＤＨＡ及びコエンザイムＱ１０の典型的なクロマトグラムである。
【図4】群ごとの静脈栄養（ＰＮ）離脱の確率（カプラン・マイヤー生存曲線）を図示する。
【図5】群ごとの１日あたりの平均ＰＮ摂取を図示しており、プラセボと比較した治療群、特に０．３ＩＵ／ｋｇ／日での経腸インスリン製剤の明らかな利益を示している（総摂取中のＰＮ低減率として示される）。
【図6】群ごとの総栄養中の経腸栄養のパーセンテージを図示する。
【図8】本発明の製剤Ｉ～ＩＶの無晶性構造を示す走査型電子顕微鏡写真である。
【図9】本発明の製剤Ｉ～ＩＶの熱重量分析（ＴＧＡ）及び示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を示すグラフである。
【図10】本発明の製剤Ｉ～ＩＶの熱重量分析（ＴＧＡ）及び示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を示すグラフである。
【図11】本発明の製剤Ｉ～ＩＶの固体ＮＭＲスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【0037】
本発明は、乳児用乳汁栄養食に使用することができるインスリン製剤に関するものである。具体的には、本発明は、遅発型敗血症または壊死性腸炎／大腸炎／全腸炎などの早産児障害を予防するまたはその重症度を低減させるために使用することができる。
【0038】
本発明の原理及び作用は、図面及び付随する説明を参照することにより、より良く理解され得るであろう。
【0039】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明に記載されるまたは実施例によって例証される詳細にその適用が限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であるか、または種々の方法で実践もしくは実行することができる。また、本明細書で用いられる術語及び専門用語は、説明を目的としたものであり、限定するものとみなされるべきではないことを理解されたい。
【0040】
インスリン含有乳児用乳汁栄養食は、当該技術分野で公知であり、早産児の吸収不良の治療に提案されている。
【0041】
本発明者らは、母乳または調合乳などの乳児用乳汁栄養食での使用を目的とした種々のインスリン製剤の実験中に、インスリンが乳児用乳汁栄養食に可溶化されると重合及び凝集する傾向を示し、このため、得られる乳汁栄養調合乳中のインスリンの利用可能性が低減することを認識した。乳児用乳汁栄養食を激しく混合することでこの問題をある程度解決することができるが、本発明者らは、これを最適解には及ばないとみなし、乳児用乳汁栄養食におけるインスリンの溶解度の改善に着手した。
【0042】
したがって、本発明の一態様によれば、乳児用乳汁栄養食（例えば、母乳または調合乳）に容易に溶解可能であり、かつ長期間にわたり凝集することなく乳汁栄養食中で安定性（構造的及び機能的な）を示すインスリン製剤が提供される。
【0043】
本発明の調製物は、インスリン（例えば、ヒト組換え体）、炭水化物（例えば、マルトデキストリンなどのオリゴ糖）、及び塩化ナトリウムを１：Ａ：Ｂ（それぞれｗ：ｗ：ｗ）の比で含み、ここで、Ａ及びＢの範囲は、それぞれ１０００～１００，０００及び１０～５０である。１グラムの本インスリン製剤に、２～４０ＩＵが含まれ得る。本インスリン製剤には更に、シクロデキストリンがインスリンに対して１０～１０００の比で含まれ得る。炭水化物、例えば、単糖類（例えば、グルコース）、二糖類（例えば、ラクトース、マルトース）、オリゴ糖類（デキストリン（例えば、マルトデキストリン）、シクロデキストリン（例えば、ヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリン（ＨＰｂＣＤ））、及び多糖類などは、安定剤、充填剤、及び凍結防止剤として使用される。緩衝剤（例えば、リン酸ナトリウム塩またはリン酸カリウム塩）も、組成物に添加され得る。
【0044】
製剤は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）とコエンザイムＱ１０とを含むナノ液滴を有する水中油型ナノエマルションと組み合わせることができる。
【0045】
製剤は、粉末形態であってもよく、脱イオン水または０．９％塩化ナトリウム溶液中に濃度０．０３ｇ／ｍｌで再構成されるとき、ｐＨが６．０～７．６となる。
【0046】
本発明者らは、ｐＨ６．９～８．０でインスリンを前処理し、ｐＨ６．７～７．６で炭水化物と混和し、凍結乾燥することにより、ヒト母乳に溶解しやすい無晶性インスリン粉末（図８）が得られ、これにより先行技術のインスリン製剤に関する前述の制約が克服されることを見出した。
【0047】
本発明のインスリン製剤は、主に充填剤（例えば、マルトデキストリン）で構成される無晶性構造中にインスリンが組み込まれた無晶性粉末である。調製物の含水量は６．５％以下であり得、脱イオン水中に濃度０．１ｇ／ｍｌで再構成される場合の容積モル浸透圧濃度は約１１０～１２０ｍｏｓｍ／ｋｇであり、脱イオン水または０．９％塩化ナトリウム溶液中に濃度０．０３ｇ／ｍｌで再構成される場合、ｐＨは６．０～７．６である。熱重量分析（ＴＧＡ）及び示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって得られる典型的なサーモグラム曲線を図９～１０に示す。本発明の製剤の固体ＮＭＲスペクトルを図１１に示す。
【0048】
本明細書に言及されているように、本発明のインスリン製剤は、粉末（または液体）として、例えば人乳などの乳児用乳汁栄養食に添加され得る。人乳は、新鮮な均質化された母親の母乳またはドナー母乳である。
【0049】
粉末形態の場合、本発明のインスリン製剤は、乳児用乳汁栄養食中に最終インスリン濃度０．１～８ＩＵ／ｍｌで再構成され得る。
【0050】
本発明の製剤は、粉末として包装され、長期間（数日／数ヶ月）にわたり保管され得る。
【0051】
包装は、例えば、乾燥形態の本発明の製剤が充填されたガラスバイアルまたはアルミニウム小袋であり得る。包装物には、０．１～１．０グラムの粉末形態の製剤を含めることができ、グラムあたり０．２～４０ＩＵのインスリンが含まれる。包装単位のヘッドスペースは、空気または不活性ガス（例えば、窒素）であり得る。
【0052】
包装により、水蒸気透過率（ＭＶＴＲ）が約０．１ｇ／ｍ２／２４時間未満、かつ酸素透過率（ＯＴＲ）が約０．１ｃｍ３／ｍ２／２４時間未満の湿気バリア及び／または酸素バリアが付与され得る。
【0053】
本明細書に開示されるように包装された場合、本発明の製剤は、非常に安定しており、約２℃～約８℃で最大２４ヶ月間保管された場合に、インスリン活性が約１～１０％を超えて減少せずに長期間保管され得る。更に、包装された製剤の含水量は、約２℃～約８℃で２４ヶ月間保管された場合、典型的には約４．５～６．５重量％以下である。
【0054】
本インスリン製剤は、脱イオン水または０．９％塩化ナトリウム溶液中で再構成することができ、得られた溶液を乳児用乳汁栄養食（母親自身の乳汁、ドナー母乳、調合乳など）に添加して、粉末製剤用の上記インスリンの濃度を得ることができる。
【0055】
本明細書で説明され、実施例の項で実証されるように、本発明のインスリン製剤及び本発明のインスリン製剤を含有する乳汁栄養食は、早産児の静脈栄養からの離脱を促進し、かつ全体的な有害事象ならびに壊死性大腸炎（ＮＥＣ）及び遅発型敗血症（ＬＯＳ）を含む特定の対象症状を実質的に低減させるために使用され得る。
【0056】
したがって、本発明の別の態様によれば、必要とする対象（例えば、早産児）においてＬＯＳを予防するまたはそのリスク及び重症度を低減させる方法が提供される。本方法は、本発明の薬剤と混合した治療有効量の乳児用乳汁栄養食を、必要とする対象に投与することによって行われる。かかる投与は、経口または栄養管を介したものであり得る。
【0057】
したがって、本発明の更に別の態様によれば、必要とする対象（例えば、早産児）においてＮＥＣを予防するまたはそのリスク及び重症度を低減させる方法が提供される。本方法は、本発明の薬剤と混合した治療有効量の乳児用乳汁栄養食を、必要とする対象に投与することによって行われる。かかる投与は、経口または栄養管を介したものであり得る。
【0058】
「治療有効量」という用語は、有効成分、または有効成分を含む乳汁栄養食の用量であって、有効成分を必要とする治療効果がもたらされる用量を意味する。
【0059】
本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」という語句は、ヒト乳児を指す。ヒト乳児は、任意の年齢（例えば、正期産児もしくは早産児）またはいずれかの性別であり得る。必要とする対象は、在胎齢２４～３７週で出生した早産児、または低出生体重満期産児、または子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）児、または在胎不当過小児であり得る。
【0060】
本発明者らによって確立された典型的な投与レジメンは、例えば、１日１～１２回の経口投与に分けて、乳児用乳汁栄養食１～３ｍｌに混合された粉末０．１～１ｇを使用した連続経腸投与またはボーラス摂取により投与され得る。
【0061】
以下の実施例の項に記載されているように、本発明のレジメンにより、０．３ＩＵ／ｋｇ／日の用量群においてプラセボと比較してＮＥＣ症例が減少した。壊死性腸炎（Ｂｅｌｌ分類２期または３期）は、低用量群で乳児７名（６％）に、高用量群で乳児４名（５％）に、及びプラセボ群で乳児１０名（１０％）に発生した。最も虚弱な集団（在胎齢２６～２８週の層）を観察した場合、その差異は更により顕著であり、治療群では被験者の４．３％がＮＥＣを有していたのに対し、プラセボ群では１９．６％であった。感染症（敗血症及び他の感染症を含む）を経験した乳児のパーセンテージには、群間で有意義な差異があった。試験集団全体を観察した場合、総発生率は、０．０６ＩＵ／ｋｇ／日の用量群で３０％、０．３ＩＵ／ｋｇ／日の用量群で３４．７％、及びプラセボ群で４２．９％であった。
【0062】
本発明のレジメンを使用した別の試験で実施された糖吸収試験（ＳＡＴ）による腸管透過性及びラクターゼ活性の同時評価では、治療群において腸管透過性が低下し（胃腸（ＧＩ）の迅速な成熟を示し）、かつラクターゼ活性が高くなる傾向が示された。
【0063】
本試験の有効性は、実施例４に示される結果によって実証されるように、（自宅または二次施設への）退院までの時間によっても実証される。その中に示されているように、早産児が一次医療から退院するまでの時間は、未治療の早産児（対照）と比較して少なくとも５％短縮される。これは予想より少なくとも５日早い退院と言い換えられる。
【0064】
腸管微生物叢の初期の相違に関して、プラセボと比較して２用量の経腸インスリン投与の有効性を評価することを目的とした、別の試験が実施された。この試験では、治療群とプラセボ群との間でＧＩ微生物叢に有意差があることが示された。治療終了時、高インスリン用量の微生物多様性がプラセボ群よりも低いことが示された（ｐ＝０．０１９２）。インスリンは、Firmicutes門を増加させ、Proteobacteria門を減少させる。経腸インスリン投与により、Proteobacteria門が低減し、Firmicutes門及びClostridiaceae科が増加した。これらの結果は、本発明の製剤及びレジメンが腸内微生物叢の迅速な成熟を促進することを示している。この試験で得られたProteobacteria門の減少及びFirmicutes門の増加は、ＮＥＣのリスクが低い乳児でこれまでに認められた変化である。
【0065】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は±１０％を指す。
【0066】
本発明の更なる目的、利点、及び新規特徴は、以下の実施例を考察することで当業者には明らかとなるであろうが、以下の実施例は限定することを意図したものではない。
【実施例】
【0067】
これより以下の実施例を参照するが、これらの実施例は、上記の説明とともに本発明を非限定的な形で例示するものである。
【0068】
実施例１
インスリン及び乳児用乳汁栄養製剤
インスリン製剤を調製し、早産児の治療における有効性を（乳児用乳汁栄養食中で）試験した。
インスリン及び乳児用乳汁栄養製剤
インスリン製剤を調製し、早産児の治療における有効性を（乳児用乳汁栄養食中で）試験した。
【0069】
製剤Ｉ
有効成分はインスリン、可溶化剤は塩化ナトリウム、ならびに充填剤及び安定剤はオリゴ糖（例えば、マルトデキストリン）。最終製品は、ガラスバイアルに充填した凍結乾燥粉末である。再構成した溶液の力価は、希釈剤の容量によって調節する。
有効成分はインスリン、可溶化剤は塩化ナトリウム、ならびに充填剤及び安定剤はオリゴ糖（例えば、マルトデキストリン）。最終製品は、ガラスバイアルに充填した凍結乾燥粉末である。再構成した溶液の力価は、希釈剤の容量によって調節する。
【0070】
【表1】
【0071】
材料及び方法
２４．５ＩＵ／ｍｌのｒｈ－インスリン溶液を次のように調製した。インスリン１３ｍｇを０．１Ｎの塩酸１ｍｌに可溶化させ、水で１５ｍｌまで希釈し、０．１Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを７．６に調整した。
２４．５ＩＵ／ｍｌのｒｈ－インスリン溶液を次のように調製した。インスリン１３ｍｇを０．１Ｎの塩酸１ｍｌに可溶化させ、水で１５ｍｌまで希釈し、０．１Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを７．６に調整した。
【0072】
製剤の混和：
４０グラムのマルトデキストリンを水１００ｍｌに溶解し、得られた溶液のｐＨを７．２に調整した。６％の塩化ナトリウム溶液２ｍｌ及びインスリン溶液４ｍｌを製剤混合物に添加し、ｐＨを７．０に調整した。
４０グラムのマルトデキストリンを水１００ｍｌに溶解し、得られた溶液のｐＨを７．２に調整した。６％の塩化ナトリウム溶液２ｍｌ及びインスリン溶液４ｍｌを製剤混合物に添加し、ｐＨを７．０に調整した。
【0073】
得られたバルクを０．２２μｍのＰＥＳメンブレンに通して濾過し、ガラスバイアルに充填して（充填容量１．７ｍｌ）、凍結乾燥した。
【0074】
凍結乾燥粉末を含む各バイアルには、１．２５ＩＵのｒｈ－インスリン、５１０ｍｇのマルトデキストリン、及び１．５ｍｇの塩化ナトリウムが含まれていた。
【0075】
製剤ＩＩ
有効成分はインスリン、包接剤はシクロデキストリン（例えば、ヒドロキシプロピルベータ－シクロデキストリン）、可溶化剤は塩化ナトリウム、ならびに充填剤及び安定剤はオリゴ糖（例えば、マルトデキストリン）。最終製品は、ガラスバイアルに充填した凍結乾燥粉末である。再構成した溶液の力価は、希釈剤の容量によって調節する。
有効成分はインスリン、包接剤はシクロデキストリン（例えば、ヒドロキシプロピルベータ－シクロデキストリン）、可溶化剤は塩化ナトリウム、ならびに充填剤及び安定剤はオリゴ糖（例えば、マルトデキストリン）。最終製品は、ガラスバイアルに充填した凍結乾燥粉末である。再構成した溶液の力価は、希釈剤の容量によって調節する。
【0076】
【表2】
【0077】
材料及び方法
ｒｈ－インスリン溶液６２ＩＵ／ｍｌを次のように調製した。インスリン８５．６ｍｇを０．１Ｎの塩酸５ｍｌに可溶化させ、水３０ｍｌで希釈し、０．１Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを７．２に調整した。
ｒｈ－インスリン溶液６２ＩＵ／ｍｌを次のように調製した。インスリン８５．６ｍｇを０．１Ｎの塩酸５ｍｌに可溶化させ、水３０ｍｌで希釈し、０．１Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを７．２に調整した。
【0078】
製剤の混和：
マルトデキストリン２００グラムを水６００ｇに溶解し、得られた溶液のｐＨを７．３に調整した。水６０ｍｌに予め溶解させた塩化ナトリウム２ｇ及びインスリン溶液を製剤混合物に添加し、ｐＨを７．０に調整し、バルク容量が１Ｌになるまで追加分の水を添加した。
マルトデキストリン２００グラムを水６００ｇに溶解し、得られた溶液のｐＨを７．３に調整した。水６０ｍｌに予め溶解させた塩化ナトリウム２ｇ及びインスリン溶液を製剤混合物に添加し、ｐＨを７．０に調整し、バルク容量が１Ｌになるまで追加分の水を添加した。
【0079】
得られたバルクを０．２２μｍのＰＥＳメンブレンに通して濾過し、ガラスバイアルに充填して（充填容量０．５ｍｌ）、凍結乾燥した。
【0080】
凍結乾燥粉末を含む各バイアルには、ｒｈ－インスリン１．２ＩＵ、マルトデキストリン１００ｍｇ、及び塩化ナトリウム１．０ｍｇが含まれていた。
【0081】
製剤ＩＩＩ
ｒｈ－インスリン溶液２４３ＩＵ／ｍｌを次のように調製した。インスリン８４．４ｍｇを０．１Ｎの塩酸１ｍｌに可溶化させ、水で１０ｍｌまで希釈し、０．１Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを８．１に調整した。
ｒｈ－インスリン溶液２４３ＩＵ／ｍｌを次のように調製した。インスリン８４．４ｍｇを０．１Ｎの塩酸１ｍｌに可溶化させ、水で１０ｍｌまで希釈し、０．１Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを８．１に調整した。
【0082】
製剤の混和：
マルトデキストリン３０グラムを水６０ｍｌに溶解し、得られた溶液のｐＨを７．１に調整した。７．５％塩化ナトリウム溶液２．７ｍｌ及びインスリン溶液１ｍｌを製剤混合物に添加し、ｐＨを７．３に調整し、バルク容量が１００ｇになるまで追加分の水を添加した。
マルトデキストリン３０グラムを水６０ｍｌに溶解し、得られた溶液のｐＨを７．１に調整した。７．５％塩化ナトリウム溶液２．７ｍｌ及びインスリン溶液１ｍｌを製剤混合物に添加し、ｐＨを７．３に調整し、バルク容量が１００ｇになるまで追加分の水を添加した。
【0083】
得られたバルクを０．２２μｍのＰＥＳメンブレンに通して濾過し、ガラスバイアルに充填して（充填容量０．５ｍｌ）、凍結乾燥した。
【0084】
凍結乾燥粉末を含む各バイアルには、１．４ＩＵのｒｈ－インスリン、１７２ｍｇのマルトデキストリン、及び１．２ｍｇの塩化ナトリウムが含まれていた。
【0085】
製剤ＩＶ
本実施例では、液体バルク９ｋｇ（凍結乾燥粉末０．９ｋｇ）を商業規模で製造した製剤について説明する。有効成分としてインスリン、可溶化剤として塩化ナトリウム、ならびに充填剤及び安定剤としてオリゴ糖（例えば、マルトデキストリン）。最終製品は、ガラスバイアルに充填した凍結乾燥粉末である。再構成した溶液の力価は、希釈剤の容量によって調節する。
本実施例では、液体バルク９ｋｇ（凍結乾燥粉末０．９ｋｇ）を商業規模で製造した製剤について説明する。有効成分としてインスリン、可溶化剤として塩化ナトリウム、ならびに充填剤及び安定剤としてオリゴ糖（例えば、マルトデキストリン）。最終製品は、ガラスバイアルに充填した凍結乾燥粉末である。再構成した溶液の力価は、希釈剤の容量によって調節する。
【0086】
【表3】
【0087】
材料及び方法
３３ＩＵ／ｍｌのｒｈ－インスリン溶液を次のように調製した。インスリン０．３９ｇを０．１Ｎの塩酸２０ｇに可溶化させ、注射用水３００ｇで希釈し、次いで０．１Ｎの水酸化ナトリウム２０ｇで中和した。０．１Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを７．２に調整した。
３３ＩＵ／ｍｌのｒｈ－インスリン溶液を次のように調製した。インスリン０．３９ｇを０．１Ｎの塩酸２０ｇに可溶化させ、注射用水３００ｇで希釈し、次いで０．１Ｎの水酸化ナトリウム２０ｇで中和した。０．１Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを７．２に調整した。
【0088】
製剤の混和：
マルトデキストリン８５６グラム及び塩化ナトリウム８．６グラムを水６８５４グラムに溶解させ、得られた溶液のｐＨを７．２に調整した。インスリン溶液を混和混合物に添加し、得られた製剤の重量を最大９．０ｋｇに調整して、ｐＨを７．０に調整した。
マルトデキストリン８５６グラム及び塩化ナトリウム８．６グラムを水６８５４グラムに溶解させ、得られた溶液のｐＨを７．２に調整した。インスリン溶液を混和混合物に添加し、得られた製剤の重量を最大９．０ｋｇに調整して、ｐＨを７．０に調整した。
【0089】
得られたバルクを０．２２μｍのＰＥＳメンブレンに通して濾過し、ガラスバイアルに充填して（充填容量１ｇ）、凍結乾燥した。
【0090】
凍結乾燥粉末を含む各バイアルには、１ＩＵのｒｈ－インスリン、９９ｍｇのマルトデキストリン、及び１ｍｇの塩化ナトリウムが含まれていた。
【0091】
得られた乾燥粉末の分析特性は、インスリン（インスリン＋Ａ２１デスアミドインスリン）の含有量が１．１３ＩＵ／バイアル、Ａ２１デスアミドインスリンの含有量が０．５％（面積パーセントによる）、他の総関連物質の含有量が０．１％（面積パーセントによる）、バイアルあたりのインスリン含有量の相対標準偏差（均一性）が０．９％、含水量が０．８％、ｐＨが６．７、粉末を水で再構成する時間が５分未満である。
【0092】
製剤Ｖ
溶媒置換法を使用してＤＨＡ及びコエンザイムＱ１０のエマルションを形成し、ｒｈ－インスリン及び凍結防止剤（例えば、デキストリン、シクロデキストリン）を添加し、濾過して凍結乾燥することにより、本製剤を製造した。
溶媒置換法を使用してＤＨＡ及びコエンザイムＱ１０のエマルションを形成し、ｒｈ－インスリン及び凍結防止剤（例えば、デキストリン、シクロデキストリン）を添加し、濾過して凍結乾燥することにより、本製剤を製造した。
【0093】
【表4】
【0094】
材料及び方法
４０ＩＵ／ｍｌのｒｈ－インスリン溶液を次のように調製した。インスリン２７．５ｍｇを０．１Ｎの塩酸２ｍｌに可溶化させ、水１８ｍｌで希釈し、０．１Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを７．２に調整した。
４０ＩＵ／ｍｌのｒｈ－インスリン溶液を次のように調製した。インスリン２７．５ｍｇを０．１Ｎの塩酸２ｍｌに可溶化させ、水１８ｍｌで希釈し、０．１Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを７．２に調整した。
【0095】
水中油型ナノエマルション（平均液滴サイズ１２０ｎｍ）を次のように調製した。コエンザイムＱ１０ ６９０ｍｇ、ＤＨＡエチルエステル１５３３ｍｇ、チロキサポール３００ｍｇ、及びＬｉｐｏｉｄ Ｅ８０ ３００ｍｇをエタノール５６ｍｌに溶解した。２１Ｇ針を介して混合物を０．１％のＰＶＡ水溶液３００ｍｌに滴加し、室温にて３５０ＲＰＭで連続的に混合した。得られたエマルションを更に１０分間混合し、０．１％ＰＶＡ溶液で希釈し、Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ ＭＷＣＯ３０，０００メンブレンを使用したタンジェンシャルフロー濾過により有機溶媒を除去した。
【0096】
得られたエマルション１６０ｍｌにマルトデキストリン１０グラムを溶解し、次いでインスリン溶液と混合した。最終バルクの容量を３００ｍｌにし、ｐＨを６．９に調整した。エマルションを０．２２ｕｍのＰＥＳメンブレンに通して濾過し、ガラスバイアルに充填して（充填容量１ｍｌ／バイアル）、凍結乾燥した。各バイアルには、ｒｈ－インスリン１．２ＩＵ、ＤＨＡ２．５ｍｇ、及びコエンザイムＱ１０ １．１ｍｇが含まれている。再構成した粉末中の液滴粒子の平均サイズは２９５ｎｍである。
【0097】
製剤ＶＩ
製剤工程は製剤Ｖの工程と同一である。
製剤工程は製剤Ｖの工程と同一である。
【0098】
【表5】
【0099】
材料及び方法
４０ＩＵ／ｍｌのｒｈ－インスリン溶液を次のように調製した。インスリン２７．２ｍｇを０．１Ｎの塩酸２ｍｌに可溶化させ、水１８ｍｌで希釈し、０．１Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを７．２に調整した。
４０ＩＵ／ｍｌのｒｈ－インスリン溶液を次のように調製した。インスリン２７．２ｍｇを０．１Ｎの塩酸２ｍｌに可溶化させ、水１８ｍｌで希釈し、０．１Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを７．２に調整した。
【0100】
水中油型ナノエマルション（平均液滴サイズ１２０ｎｍ）を、製剤ＩＶについて記載したとおりに調製した。
【0101】
得られたエマルション１６０ｍｌにヒドロキシプロピルベータシクロデキストリン１０グラムを溶解し、次いでインスリン溶液と混合した。最終バルクの容量を３２７ｍｌにし、ｐＨを６．９に調整した。エマルションを０．２２μｍのＰＥＳメンブレンに通して濾過し、ガラスバイアルに充填して（充填容量１ｍｌ／バイアル）、凍結乾燥した。各バイアルには、１．２ＩＵのｒｈ－インスリン、２．５ｍｇのＤＨＡ、及び１．１ｍｇのコエンザイムＱ１０が含まれている。再構成した粉末中の液滴粒子の平均サイズは１４３ｎｍである。
【0102】
実施例２
製剤Ｉ～ＩＶの試験
ｒｈ－インスリンの含有量を、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｇｏｌｄ－Ｃ１８カラム（３×５０ｍｍ、３μｍ）で、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で酸性化させた水相及び有機相（アセトニトリル）で構成される移動相による勾配溶出を用いて、逆相高速液体クロマトグラフィー法により決定した。流量は０．３ｍｌ／分、２０５ｎｍでのＵＶ検出。製剤Ｉ～ＩＶの典型的なクロマトグラムを図１に示す。
製剤Ｉ～ＩＶの試験
ｒｈ－インスリンの含有量を、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｇｏｌｄ－Ｃ１８カラム（３×５０ｍｍ、３μｍ）で、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で酸性化させた水相及び有機相（アセトニトリル）で構成される移動相による勾配溶出を用いて、逆相高速液体クロマトグラフィー法により決定した。流量は０．３ｍｌ／分、２０５ｎｍでのＵＶ検出。製剤Ｉ～ＩＶの典型的なクロマトグラムを図１に示す。
【0103】
製剤Ｖ～ＶＩの試験
ｒｈ－インスリン、ＤＨＡ、及びコエンザイムＱ１０の含有量を、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｇｏｌｄ－Ｃ１８カラム（３×５０ｍｍ、３μｍ）で、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で酸性化させた水相及び有機相（アセトニトリル：メタノール：２－プロパノールの７５：１５：１０混合物）で構成される移動相による勾配溶出を用いて、逆相高速液体クロマトグラフィー法により決定した。流量は０．６ｍｌ／分、インスリンは２０５ｎｍ、ＤＨＡ及びコエンザイムＱ１０は２１４ｎｍでのＵＶ検出。製剤Ｖ～ＶＩの典型的なクロマトグラムを図２に示す。製剤Ｖ～ＶＩ中のＤＨＡ及びコエンザイムＱ１０の決定に関する典型的なクロマトグラムを図３に示す。
ｒｈ－インスリン、ＤＨＡ、及びコエンザイムＱ１０の含有量を、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｇｏｌｄ－Ｃ１８カラム（３×５０ｍｍ、３μｍ）で、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で酸性化させた水相及び有機相（アセトニトリル：メタノール：２－プロパノールの７５：１５：１０混合物）で構成される移動相による勾配溶出を用いて、逆相高速液体クロマトグラフィー法により決定した。流量は０．６ｍｌ／分、インスリンは２０５ｎｍ、ＤＨＡ及びコエンザイムＱ１０は２１４ｎｍでのＵＶ検出。製剤Ｖ～ＶＩの典型的なクロマトグラムを図２に示す。製剤Ｖ～ＶＩ中のＤＨＡ及びコエンザイムＱ１０の決定に関する典型的なクロマトグラムを図３に示す。
【0104】
実施例３
乳児用乳汁栄養食の溶解度
ヒト母乳のｐＨ範囲における本発明の製剤の溶解度を評価するために、試験を設計した。マルトデキストリン、塩化ナトリウム、及びインスリン（１ＩＵ）を含有する３つの乾燥試料を以下のように調製した。
乳児用乳汁栄養食の溶解度
ヒト母乳のｐＨ範囲における本発明の製剤の溶解度を評価するために、試験を設計した。マルトデキストリン、塩化ナトリウム、及びインスリン（１ＩＵ）を含有する３つの乾燥試料を以下のように調製した。
【0105】
試料１は、マルトデキストリン、塩化ナトリウム、及びインスリンの溶液を固体マルトデキストリン粒子上に噴霧し、続いて３５℃で乾燥することにより調製した、結晶性熱乾燥粉末である。乾燥粉末をマルトデキストリンと１：３で混合し、最終ｐＨは６．３であった。
【0106】
試料２は、実施例１、製剤Ｉ～ＩＩＩに記載したとおりにｐＨ７．０で調製し、無晶性粉末として提示する、本発明の製剤の１つの変形である。
【0107】
試料３は、乾燥成分（マルトデキストリン、塩化ナトリウム、及びインスリン）の物理的混合物であり、前処理を一切行わずに乾燥ブレンドしたものである。
【0108】
一定量の各製剤（インスリン１ＩＵに相当）を、０．１Ｍのリン酸緩衝液１．８ｍｌ中にてｐＨ６．３、６．７、及び７．２で再構成し、目視検査した。
【0109】
結果から、試料２（本発明の製剤）が母乳の広いｐＨ範囲（６．３～７．２）で溶解しやすく、参照緩衝液と同程度の透明溶液が得られることが示された。試料１（熱乾燥製剤）及び試料３（乾燥成分の物理的ブレンド、前処理なし）は、試験したｐＨ範囲で部分的に可溶であり、混濁溶液が得られた。
【0110】
試験試料の溶解プロファイルを、次の媒体：０．０１ＮのＨＣｌ、二重脱イオン水（ｄｏｕｂｌｅ ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ）、及び０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．３及び７．４）中で、ＨＰＬＣを使用して評価した。
【0111】
各試料について、水中及びリン酸緩衝液中の溶解率を、０．０１ＮのＨＣｌ中で決定したインスリンの量と比較して算出した。得られた溶解結果（以下の表６）は、本発明の組成物が乳児用調合乳のｐＨ範囲において溶解性が高いことを示している。
【0112】
【表6】
【0113】
加えて、試料１及び試料２を牛乳（ｐＨ６．８９、脂肪含有量３％）中で再構成した。結果は緩衝液による再生試験（ｂｕｆｆｅｒ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｔｅｓｔ）の観察結果と一致した。試料１は、乳汁中で部分的にしか再構成されないため、目に見える凝塊が生じ、この凝塊は、再構成された薬剤の通り道である経鼻胃管に付着するまたはそれを遮断するおそれがある。試料２は乳汁中で完全に再構成され、均質混合物が得られた。
【0114】
実施例４
早産児試験－有効性
早産児における経腸ｒｈ－インスリン製剤の有効性及び安全性を評価するために、試験を設計した。スクリーニング手順後、妊娠２６週～最大３２週に出生し、出生時体重が少なくとも５００ｇである適格乳児を、３つの治療群のうちの１つに１：１：１の比で無作為に割り当てた。
早産児試験－有効性
早産児における経腸ｒｈ－インスリン製剤の有効性及び安全性を評価するために、試験を設計した。スクリーニング手順後、妊娠２６週～最大３２週に出生し、出生時体重が少なくとも５００ｇである適格乳児を、３つの治療群のうちの１つに１：１：１の比で無作為に割り当てた。
【0115】
少なくとも６時間の生後齢から出生後１２０時間までの時点で、治療を開始した。自身の母親の乳汁（ＯＭＭ）のみを授乳された乳児の治療期間は、出生から最初の７２時間以内に開始された。
【0116】
治療期間を、投与初日（１日目）から最大２８日間、または２８日よりも短い場合は一次病院からの退院までと定義した。
【0117】
試験した製剤を０．３ＩＵ／Ｋｇ／日で最大２８日間投与した。投与前に、主にヒト母乳、ドナー母乳、生理食塩水、または半生理食塩水中で粉末を再構成した。
【0118】
結果
乳児は一次病院から自宅または二次施設のいずれかに退院した。退院までの時間を解析する際、１）募集した一次病院（ｐｒｉｍａｒｙ ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｈｏｓｐｉｔａｌ）からの退院の解析（二次病院に転院した被験者と自宅に退院した被験者との別個の比較）、及び２）（一次病院または二次病院のいずれかから）自宅への退院という２つの解析が提示される。
乳児は一次病院から自宅または二次施設のいずれかに退院した。退院までの時間を解析する際、１）募集した一次病院（ｐｒｉｍａｒｙ ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｈｏｓｐｉｔａｌ）からの退院の解析（二次病院に転院した被験者と自宅に退院した被験者との別個の比較）、及び２）（一次病院または二次病院のいずれかから）自宅への退院という２つの解析が提示される。
【0119】
一次病院から退院するまでの時間
乳児は、主に地域に応じて、一次病院から自宅または二次病院のいずれかに退院した。ＩＴＴ解析では、各乳児の解析目標は１つであり、それによって各アーム及び層を比較した。両方の治療アームで、プラセボと比較して退院までの時間が著しく短く、健康状態の安定までの時間がより早いことが実証された。
乳児は、主に地域に応じて、一次病院から自宅または二次病院のいずれかに退院した。ＩＴＴ解析では、各乳児の解析目標は１つであり、それによって各アーム及び層を比較した。両方の治療アームで、プラセボと比較して退院までの時間が著しく短く、健康状態の安定までの時間がより早いことが実証された。
【0120】
退院（自宅または二次病院へのいずれか）までの日数の中央値は、プラセボ［中央値＝４９．５日］と比較して、０．３ＩＵ／Ｋｇを含むインスリン製剤群で最低であり［中央値＝４２．０日、Ｐ＝０．０５５］、０．０４０６ＩＵ／Ｋｇを含むインスリン製剤群がそれに続いた［中央値＝４３．０日、ｐ＝０．０４＊］。
【0121】
二次施設への退院までの時間
一部の病院では、乳児が安定し、直ちに生命を脅かす状態から脱した後、乳児を二次施設に退院させる。乳児は二次施設に退院し、数週間後に自宅に退院する。本治験では、中央値及びプラセボとの差異が示すように、０．３ＩＵ／Ｋｇを含むインスリン製剤群の被験者は、プラセボ群の患者よりも早く二次施設に退院した（以下の表７）。
一部の病院では、乳児が安定し、直ちに生命を脅かす状態から脱した後、乳児を二次施設に退院させる。乳児は二次施設に退院し、数週間後に自宅に退院する。本治験では、中央値及びプラセボとの差異が示すように、０．３ＩＵ／Ｋｇを含むインスリン製剤群の被験者は、プラセボ群の患者よりも早く二次施設に退院した（以下の表７）。
【0122】
【表7】
【0123】
自宅への退院までの時間
実施した別の種類の解析では、一次病院から直接退院したかまたは二次施設／ユニットの後に退院したかにかかわらず、全ての乳児の自宅への退院までの時間を評価した。この解析では、退院までの時間の短縮に関して同様の傾向が示されたが、主要解析である「一次病院からの退院」と比較してはるかに大きな変動性が示された。
実施した別の種類の解析では、一次病院から直接退院したかまたは二次施設／ユニットの後に退院したかにかかわらず、全ての乳児の自宅への退院までの時間を評価した。この解析では、退院までの時間の短縮に関して同様の傾向が示されたが、主要解析である「一次病院からの退院」と比較してはるかに大きな変動性が示された。
【0124】
０．０６ＩＵ／Ｋｇを含むインスリン製剤による治療により、プラセボと比較して、自宅への退院までの日数が有意に少なくなった［中央値＝４８．０日対プラセボの中央値＝６０．０日、Ｐ＝０．０２５＊］。０．３ＩＵ／Ｋｇを含むインスリン製剤による治療により、自宅への退院までの日数の中央値は５５．０日となった［プラセボに対してｐ＝０．２７］。
【0125】
両方の治療アームを合わせて解析した場合、治療群の退院は、プラセボ［中央値＝６０日］と比較して早かった［中央値＝５２日、ｐ＝０．０４６＊］。
【0126】
ＰＮ離脱までの時間
静脈栄養（ＰＮ）離脱までの時間について、０．３ＩＵ／ｋｇ／日の濃度でインスリン補充乳汁栄養食を与えた群において、プラセボと比較して統計学的有意差が認められた（６日対８日、ｐ＝０．００９６＊＊）。
静脈栄養（ＰＮ）離脱までの時間について、０．３ＩＵ／ｋｇ／日の濃度でインスリン補充乳汁栄養食を与えた群において、プラセボと比較して統計学的有意差が認められた（６日対８日、ｐ＝０．００９６＊＊）。
【0127】
在胎齢群別にＰＮ離脱までの時間を評価すると、在胎齢がより高い集団（２９～３２週）では、ＰＮ離脱までの時間も０．３ＩＵ／ｋｇ／日群中でより短かった（４日対６日）。結果を以下の表８～１０に要約し、図４にグラフで示す。図４は群ごとのＰＮ離脱の確率を示している（カプラン・マイヤー生存曲線）。
【0128】
【表8】
【0129】
【表9】
【0130】
【表10】
【0131】
本試験の別の重要な評価項目は、乳児の総摂取中のＰＮのパーセンテージ、及びＰＮ摂取のパーセンテージの経時的な漸減である。
【0132】
図５は、群ごとの１日あたりの平均ＰＮ摂取を示しており、総摂取中のＰＮ低減率において、プラセボと比較した治療群、特に経腸ｒｈ－インスリン製剤０．３ＩＵ／ｋｇ／日の明らかな利点を示している。
【0133】
【0134】
実施例５
早産児試験－ＮＥＣ及びＬＯＳ
壊死性大腸炎（ＮＥＣ）及び遅発型敗血症（ＬＯＳ）などの有害事象についても、試験集団を観察した。
早産児試験－ＮＥＣ及びＬＯＳ
壊死性大腸炎（ＮＥＣ）及び遅発型敗血症（ＬＯＳ）などの有害事象についても、試験集団を観察した。
【0135】
壊死性大腸炎（ＮＥＣ）
群間で、ＮＥＣを経験する乳児のパーセンテージに有意義な差異があった。試験集団全体を観察した場合、総発生率は０．０６ＩＵ／ｋｇ／日の用量群で６．３％、０．３ＩＵ／ｋｇ／日の用量群で４．３％、及びプラセボ群で１０．２％であり、０．３ＩＵ／ｋｇ／日の用量群のＮＥＣ症例はプラセボと比較して６０％の減少に至った。
群間で、ＮＥＣを経験する乳児のパーセンテージに有意義な差異があった。試験集団全体を観察した場合、総発生率は０．０６ＩＵ／ｋｇ／日の用量群で６．３％、０．３ＩＵ／ｋｇ／日の用量群で４．３％、及びプラセボ群で１０．２％であり、０．３ＩＵ／ｋｇ／日の用量群のＮＥＣ症例はプラセボと比較して６０％の減少に至った。
【0136】
在胎齢がより低い、ＮＥＣがより蔓延している試験集団（ＧＡが２６～２８週）を観察した場合、差異は更により明らかとなり、０．０６ＩＵ／ｋｇ／日の用量群では１２．２％、０．３ＩＵ／ｋｇ／日の用量群では４．３％、及びプラセボ群では１９．６％であり、０．３ＩＵ／ｋｇ／日の用量群のＮＥＣ症例はプラセボと比較して８０％近くの減少に至った。
【0137】
ノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス法を使用してＮＥＣの発生率と重症度の両方を比較する統計解析を実施したところ、２６～２８ ＧＡ群で有意義な統計学的差異が示された（ｐ＝０．０７７）。本試験の結果を以下の表１１及び１２に示す。
【0138】
【表11】
【0139】
【表12】
【0140】
感染症、ＮＥＣ、及び死亡のうちの１つの発生に関する不良アウトカムの複合を算出し、群間で比較し、以下の表１３に示す。
【0141】
【表13】
【0142】
治療群では、これらの対象有害事象のうちの１つを経験する被験者のパーセンテージが著しく低いことが判明した。割合は、経腸Ｒｈインスリン製剤０．０６ＩＵ／ｋｇ／日の用量群で３４．５％、経腸Ｒｈインスリン製剤０．３ＩＵ／ｋｇ／日の用量群で３５．８％、及びプラセボ群で５０％であった。割合のペアワイズ比較を実施したところ、経腸Ｒｈインスリン製剤０．０６ＩＵ／ｋｇ／日とプラセボとの間の差異はｐ＝０．０３４、経腸Ｒｈインスリン製剤０．３ＩＵ／ｋｇ／日とプラセボとの間の差異はｐ＝０．０６５であった（以下の表１４を参照されたい）。
【0143】
【表14】
【0144】
遅発型敗血症（ＬＯＳ）
感染症（敗血症及び他の感染症を含む）を経験した乳児のパーセンテージには、群間で有意義な差異があった。試験集団全体を観察した場合、総発生率は、０．０６ＩＵ／ｋｇ／日の用量群で３０％、０．３ＩＵ／ｋｇ／日の用量群で３４．７％、及びプラセボ群で４２．９％であった。
感染症（敗血症及び他の感染症を含む）を経験した乳児のパーセンテージには、群間で有意義な差異があった。試験集団全体を観察した場合、総発生率は、０．０６ＩＵ／ｋｇ／日の用量群で３０％、０．３ＩＵ／ｋｇ／日の用量群で３４．７％、及びプラセボ群で４２．９％であった。
【0145】
具体的には、臨床的にまたは培養により立証された敗血症の割合を測定したところ、治療群はプラセボと比較して割合が低かった。発生率は、０．０６ＩＵ／ｋｇ／日の用量群で１２％、０．３ＩＵ／ｋｇ／日の用量群で１１％、及びプラセボ群で１５％であった（遅発型敗血症の発生率がほぼ３０％低減）。
【0146】
明確にするために別個の実施形態の文脈で説明される本発明の特定の特徴は、単一の実施形態で組み合わせて提供され得ることを理解されたい。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で説明される本発明の種々の特徴はまた、別個にまたは任意の好適な副次的組み合わせで提供され得る。
【0147】
本発明をその具体的な実施形態とともに説明してきたが、多くの代替例、修正例、及び変形例が当業者には明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広範な範囲内に入る全てのかかる代替例、修正例、及び変形例が包含されることを意図する。
【0148】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも各個別の刊行物、特許、または特許出願が、参照される際に、参照により本明細書に組み込まれると具体的かつ個別に述べられているかのようにその全体が参照により本明細書に援用されることが、出願人（ら）の意図するところである。加えて、本出願におけるあらゆる参照文献の引用または特定は、かかる参照文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものとして解釈されてはならない。セクション見出しが使用されている限りにおいて、それらは必ずしも限定するものとして解釈されるべきではない。加えて、本出願のあらゆる優先権書類（複数可）は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【国際調査報告】