ホーム > 特許ランキング > Ｂｙｏｎｄｉｓ Ｂ．Ｖ．
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ シントン・バイオファーマシューティカルズ・ビー．ブイ．の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-08
(54)【発明の名称】抗ｃ－ＭＥＴ抗体及び抗体薬物複合体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240401BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240401BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240401BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240401BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240401BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240401BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240401BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28
C07K19/00 ZNA
A61K39/395 L
A61K39/395 T
A61P35/00
A61P43/00 111
A61K47/68
A61K45/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023561850
(86)(22)【出願日】2022-04-06
(85)【翻訳文提出日】2023-12-04
(86)【国際出願番号】 EP2022059059
(87)【国際公開番号】W WO2022214517
(87)【国際公開日】2022-10-13
(31)【優先権主張番号】21167423.9
(32)【優先日】2021-04-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516205959
【氏名又は名称】ビョンディス・ビー．ブイ．
【氏名又は名称原語表記】Ｂｙｏｎｄｉｓ Ｂ．Ｖ．
【住所又は居所原語表記】Ｍｉｃｒｏｗｅｇ ２２， ＮＬ－６５４５ ＣＭ Ｎｉｊｍｅｇｅｎ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
(74)【代理人】
【識別番号】110003708
【氏名又は名称】弁理士法人鈴榮特許綜合事務所
(72)【発明者】
【氏名】ブロメンレア、マリオン
(72)【発明者】
【氏名】ファン・デル・レー、ミランダ・マリア・コルネリア
(72)【発明者】
【氏名】フロータウス、パトリック・ヘルハルト
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076BB11
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59
4C076FF70
4C084AA19
4C084NA05
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC201
4C084ZC752
4C085AA14
4C085AA26
4C085BB36
4C085BB41
4H045AA11
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、間葉上皮転換因子（ｃ－Ｍｅｔ）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片に関する。本発明は、また、これらの抗ｃ－Ｍｅｔ抗体又は抗原結合断片を含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、抗体、抗原結合断片又はＡＤＣを含む医薬組成物、及びがんの治療におけるそれらの使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
間葉上皮転換因子（ｃ－Ｍｅｔ）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１のアミノ酸配列が配列番号２６で示す配列を含み；
ＨＣ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号２７で示す配列を含み；かつ、
ＨＣ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号２８で示す配列を含む、
ＨＣ可変領域の相補性決定領域ＨＣ ＣＤＲ１～３を有し、
軽鎖（ＬＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１のアミノ酸配列が配列番号２９で示す配列を含み；
ＬＣ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号３０で示す配列を含み；かつ、
ＬＣ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号３１で示す配列を含む、
ＬＣ可変領域の相補性決定領域ＬＣ ＣＤＲ１～３を有する、
抗体又はその抗原結合断片。
【請求項2】
ヒト化抗体又は抗原結合断片である、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項3】
前記ＨＣ可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６で示され、前記ＬＣ可変領域のアミノ酸配列は配列番号２０で示される、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項4】
インタクトなＩｇＧ１抗体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項5】
Ｆａｂ断片である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗原結合断片。
【請求項6】
リンカー、好ましくは切断可能なリンカーを介して細胞傷害性薬物と結合した請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を含む抗体薬物複合体。
【請求項7】
前記細胞傷害性薬物がデュオカルマイシン誘導体である、請求項６に記載の抗体薬物複合体。
【請求項8】
式（ＩＩＩ）【化1】
で表される、請求項６又は７に記載の抗体薬物複合体。
【請求項9】
請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片又は請求項６～８のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体と、１以上の薬学的に許容される添加物を含み、好ましくは凍結乾燥粉末の形態である、医薬組成物。.
【請求項10】
医薬品として使用するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、請求項６～８のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体又は請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
ｃ－Ｍｅｔ陽性ヒト固形腫瘍又はＭＥＴによる造血器腫瘍の治療に使用するための、請求項１０に記載の抗体又は抗原結合断片、抗体薬物複合体又は医薬組成物。
【請求項12】
前記ｃ－Ｍｅｔ陽性ヒト固形腫瘍は、乳がん；脳腫瘍；頭頸部のがん；甲状腺がん；唾液腺がん；軟部肉腫；眼のがん；食道がん；胃がん；小腸がん；結腸直腸がん；尿路上皮細胞がん；卵巣がん；子宮がん；子宮内膜がん；子宮頸がん；肺がん（特に、非小細胞肺がん及び小細胞肺がん）；黒色腫；肝がん；膵臓がん；非黒色腫皮膚がん；前立腺がん；胚細胞がん；及び原発不明がんからなる群から選択される、請求項１１に記載の抗体又は抗原結合断片、抗体薬物複合体又は医薬組成物。
【請求項13】
前記ＭＥＴによる造血器腫瘍は、リンパ系の悪性腫瘍、好ましくは成熟Ｔ及びＮＫ腫瘍である、請求項１１に記載の抗体又は抗原結合断片、抗体薬物複合体又は医薬組成物。
【請求項14】
請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項６～８のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体又は請求項９に記載の医薬組成物と、ｃ－Ｍｅｔ陽性ヒト固形腫瘍の治療に使用するためのｃ－Ｍｅｔ抗原以外のがんに関連する標的に対する治療用抗体、化学療法剤及び／又は抗体薬物複合体の組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、間葉上皮転換因子（ｃ－Ｍｅｔ）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片に関する。また、本発明は、これらの抗ｃ－Ｍｅｔ抗体又は抗原結合断片を含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、前記抗体、抗原結合断片又はＡＤＣを含む医薬組成物、及びがんの治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
肝細胞増殖因子受容体又は間葉上皮転換因子（ＨＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ）は、ＭＥＴがん遺伝子がコードし、さまざまな上皮細胞の表面で発現する受容体型チロシンキナーゼである。ｃ－Ｍｅｔのリガンドは肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）であり、散乱因子（ＳＦ）としても知られており、その血管形成特性及び分裂促進特性が知られている高分子量のポリペプチドである。
【0003】
成熟ヒトｃ－Ｍｅｔの細胞外領域は、1) Ｎ末端の５００残基のフォールディングによって形成され、αサブユニットの全体とβサブユニットの一部を含むセマフォリン（ＳＥＭＡ）ドメイン；2) ４つのジスルフィド結合を含む約５０残基のＰＳＩドメイン（プレキシン、セマフォリン及びインテグリンで見られる）；及び、3) ＰＳＩドメインを膜貫通ヘリックスに連結する４つの免疫グロブリン－プレキシン転写（ＩＰＴ）ドメイン、という３つのドメインで構成される。細胞内では、ｃ－Ｍｅｔは、特徴的な膜近傍配列とカルボキシ末端の配列に隣接したチロシンキナーゼ触媒ドメインを含む。ｃ－Ｍｅｔタンパク質の折り畳まれた構造の内部で、ＳＥＭＡドメインは、７枚の羽根のβプロペラを形成する。
【0004】
ｃ－Ｍｅｔは、さまざまな正常組織で発現する（Human Protein Atlas, www.proteinatlas.orgと我々の調査結果）。これは、胃腸組織（胃、胆嚢、十二指腸、小腸、結腸、直腸）、女性生殖組織（子宮内膜、子宮頸部、膣、胎盤）、泌尿生殖組織（膀胱、尿管、腎臓）で最も顕著に観察され、甲状腺、皮膚、肺、肝臓、乳房及び食道等でも、ある程度観察される。さらに、顕著なｃ－Ｍｅｔ発現が、眼瞼（涙腺、マイボーム腺、皮脂腺、毛根鞘）のみならず、眼（角膜及び水晶体の上皮、輪部、並びに結膜）にも存在する。
【0005】
ｃ－ＭｅｔとＨＧＦの結合は、受容体の二量体化、ヘテロマー化又は多量体化、細胞内領域における複数のチロシン残基のリン酸化、並びに増殖、運動性、遊走及び浸潤に関与するものを含む広範囲の異なる細胞シグナル伝達経路の活性化をもたらす。ｃ－Ｍｅｔは、正常な生理学的条件では、組織の恒常性の制御において重要であるが、（エクソン１４の）変異、遺伝子増幅又はタンパク質の過剰発現による悪性腫瘍の発生と進行にも関与していることは明らかである。ｃ－Ｍｅｔに関連する機構も、（化学）療法、例えば、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、形質転換成長因子－β（ＴＧＦβ）及びヒト表皮成長因子受容体３（ＨＥＲ３）などの細胞増殖の他の調節因子を標的とした治療法に対する耐性に関与しているようである。
【0006】
ヒトｃ－Ｍｅｔシグナル伝達経路は、ヒトのがんにおいて最も頻繁に調節不全が生じる経路の１つである。それは多くの種類の固形腫瘍に関与しており、高いｃ－Ｍｅｔの発現は一般に予後の不良と関連している。このため、ｃ－Ｍｅｔ、ＨＧＦ／ＳＦシグナル伝達経路は、がん治療の標的となっている。
【0007】
低分子から抗体に及ぶ多種多様なｃ－Ｍｅｔ阻害剤が臨床開発中であるが、陽性応答は、例えばＭＥＴ増幅又はエクソン１４変異を有する腫瘍のようなｃ－Ｍｅｔシグナル伝達に依存する腫瘍を有する患者においてのみが見られ、場合によっては治療が患者の状態を悪化させるものもあり、臨床転帰は失望させるようなものであった。
【0008】
認可された低分子ｃ－Ｍｅｔ阻害剤には、チロシンキナーゼ阻害剤類（ＴＫＩ）である、クリゾチニブ（ザーコリ（登録商標）, Pfizer）及びカボザンチニブ（コメトリック（登録商標）, Ipsen Pharma；カボメティクス（登録商標）, Ipsen Pharma）が含まれ、前者は未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）陽性又はＲＯＳ１チロシンキナーゼ陽性の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の治療に使用され、後者はとりわけｃ－Ｍｅｔ及びＶＥＧＦＲ２を標的とし、甲状腺髄様がん及び腎細胞がん（ＲＣＣ）の治療に使用される。
【0009】
がんの治療では、ｃ－Ｍｅｔに対するいかなるアゴニスティックな効果も回避すべきである。そのため、好適な治療用抗体は、ｃ－Ｍｅｔの二量体化と活性化（アゴニスティックな効果）を回避し、内在化及び分解が誘導されるように、ｃ－Ｍｅｔと相互作用する。再生医療で使用するアゴニスト抗体は、計画的に調製することも可能である（例．国際公開第2018/001909号）が、これらの抗体は、しばしば、ｃ－Ｍｅｔシグナル伝達に対してアンタゴニスティックな（すなわち、阻害）効果を有するがんの処置で使用する適切な治療用抗体を探索した時の望ましくない副産物である。
【0010】
したがって、がんの治療に使用する抗ｃ－Ｍｅｔ抗体の設計では、好ましい結合特性、ｃ－Ｍｅｔシグナル伝達の阻害、許容される薬物動態学的及び薬力学的特性の間の微妙なバランスを必要とする。
【0011】
アンタゴニスティックな効果を有するがアゴニスティックな効果を有さない抗体の探索は、複雑な作業である。いくつかの抗体は、例えば、マウスモノクローナル抗体のヒト化の結果として、アンタゴニストからアゴニストに反転する場合もある。
【0012】
がんの治療に使用するｃ－Ｍｅｔを標的とするいくつかの抗体が開発されており、臨床試験が開始された。そのようなｃ－Ｍｅｔ特異的抗体には、従来の抗ｃ－Ｍｅｔ抗体、並びにｃ－Ｍｅｔ及びＥＧＦＲなどの他のシグナル伝達タンパク質の両者を標的とする二重特異性抗体が含まれる。
【0013】
臨床開発に進んだｃ－Ｍｅｔに対するアンタゴニスティックな抗体は、例えば、オナルツズマブ（Genentech、国際公開第2006/015371号）、ARGX-111（Argenx、国際公開第2012/059561号）、エミベツズマブ（LY2875358；Eli Lilly、国際公開第2010/059654号）、SAIT-301（Samsung、米国特許出願公開第2014-0154251号）、テリソツズマブ（抗体ABT-700；Abbott/Abbvie、Wang et al., BMC Cancer 2016, 16, 105-118；国際公開第2017/201204号）、及びSym015（ｃ－Ｍｅｔ ＥＣＤ中の重複しないエピトープに結合する２つの抗ｃ－Ｍｅｔモノクローナル抗体の混合物；Symphogen、国際公開第2016/042412号）である。
【0014】
オナルツズマブは、最初に開発された抗ｃ－Ｍｅｔ抗体であり、ｃ－Ｍｅｔアゴニスト抗体５Ｄ５に由来するヒト化された一価のアンタゴニスト抗ｃ－Ｍｅｔ抗体であった（Spigel et al., J. Clin. Oncol. 2013, 31, 4105-4114；Xiang et al., Clin. Cancer Res. 2013, 19, 5068-5078）。有望な実験結果にもかかわらず、オナルツズマブの開発は、後期臨床試験における臨床的に意味のある有効性の欠如のために終了した（Spigel et al., J. Clin. Oncol. 2014, 32, abstract 8000; NCT01456325）。ヒト化ＩｇＧ４であるエミベツズマブ（LY2875358）は、ステージＩＶのＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣの患者における第２相臨床試験（NCT01900652）の対象であった。この試験では、治療集団における無増悪生存期間（ＰＦＳ）中央値の有意差は観察されなかった（エミベツズマブ＋エルロチニブで９．３月であったのに対し、エルロチニブ単独では９．５月）（Scagliotti et al., J. Thorac. Oncol. 2020, 15, 80-90）。ヒトＩｇＧ１であるARGX-111（NCT02055066）、ヒト化ＩｇＧ１であるABT-700（テリソツズマブ；NCT01472016）及びヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体の混合物であるSym015（NCT02648724）は、臨床のフェーズ１で評価中である。現時点では、治療用に承認された抗ｃ－Ｍｅｔ抗体は存在しない。
【0015】
ＡＤＣは、ｃ－Ｍｅｔシグナル伝達経路とは関係のない細胞も死滅できるという点で、興味深い代替手段である。ｃ－Ｍｅｔを標的とするＴＫＩ又はモノクローナル抗体の有効性は、ｃ－Ｍｅｔによる腫瘍／ＭＥＴ増幅腫瘍に大きく依存するが、ｃ－Ｍｅｔに対する抗体を含むＡＤＣの有効性は、細胞外でのｃ－Ｍｅｔの発現と内在化、及びＡＤＣ中の抗体と結合した細胞毒性剤に対する感受性に大きく依存する。
【0016】
したがって、がんの治療に使用するＡＤＣに適していると考えられる抗ｃ－Ｍｅｔ抗体は、高い親和性でｃ－Ｍｅｔに結合し、許容される薬物動態特性及び薬力学特性を備えていなければならないが、アゴニスティックな効果を有していてはならない。加えて、それらはｃ－Ｍｅｔの内在化を誘導する必要がある。
【0017】
これまでに説明したように、アンタゴニスティックな効果を有するがアゴニスティックな効果を有さない抗体の探索は、既に複雑な作業であったが、ＡＤＣに適した抗体の場合、二量体化ではなく内在化を引き起こすｃ－Ｍｅｔの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のエピトープが完全に特定されていないことから、その傾向は顕著である。
【0018】
したがって、ＡＤＣでは、有効性は、抗体の結合特性（ｃ－Ｍｅｔに対するアンタゴニスティックな効果についての親和性及び特異性）に依存するだけでなく、ＡＤＣが内在化され、次いで、細胞でプロセシングされる程度にも依存する。細胞では、ＡＤＣは、細胞傷害効果を発揮する生物学的に活性な薬物を放出する。したがって、腫瘍細胞の細胞傷害性薬物に対する感受性も重要である。
【0019】
ｃ－Ｍｅｔに特異的な抗体に基づくＡＤＣには、テリソツズマブベドチン（ＡＢＢＶ－３９９；Abbvie、国際公開第2017/201204号）、ＴＲ１８０１－ＡＤＣ（Tanabe Research, Gymnopoulos et al., Mol. Oncol. 2020, 14, 54-68）、ＳＨＲ－Ａ１４０３（Jiangsu HengRui Medicine Co., Yang et al., Acta, Pharmacologica Sinica 2019, 40, 971-979）及びｈｕｃＭＥＴ－２７－ＡＤＣ（Immunogen Inc.、国際公開第2018/129029号）が含まれる。
【0020】
テリソツズマブベドチンは、切断可能なリンカーを介してモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）と結合したｃ－Ｍｅｔ抗体テリソツズマブ（ＡＢＴ－７００）に基づく。ＴＲ１８０１－ＡＤＣは、ヒト化抗体ｈＤ１２とピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）毒素－リンカーであるテシリンとの部位特異的結合体である。ＳＨＲ－Ａ１４０３は、細胞傷害性微小管阻害剤に結合したｃ－Ｍｅｔに対するヒト化ＩｇＧ２モノクローナル抗体で構成される。免疫原ＡＤＣは、ｈｕｃＭＥＴ－２７とインドリノベンゾジアゼピンＤＮＡアルキル化剤であるＤＧＮ５４９又はＤＭ４との結合体である。
【0021】
前臨床段階におけるいくつかのＡＤＣは有望な結果を示しており、その中のいくつかは臨床試験（NCT02099058、NCT03539536、NCT03859752、NCT03856541）に進んでいるが、延命効果はまだ確定していない。
【0022】
この分野での開発が２０年以上行われているという事実にもかかわらず、ｃ－Ｍｅｔに特異的な抗体によるがんの治療のための市販品はまだ存在しない。複数の臨床候補の開発が中止されており、このことは、ｃ－Ｍｅｔに対するアゴニスティックな効果よりもアンタゴニスティックな効果において十分な特異性を有し、かつ許容される治療可能時間域／治療濃度域（therapeutic window）を有する抗体を見いだすことが決して容易ではないことを示している。
【0023】
しかし、がん進行における重要な役割を考慮すると、ｃ－Ｍｅｔは依然として魅力的な標的であり、所望の選択性、特異性及び有効性、並びに許容される治療可能時間域／治療濃度域を有する治療用抗体及びＡＤＣの必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【0024】
この発明は、ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片及びこれらの抗ｃ－Ｍｅｔ抗体又は抗原結合断片を含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）に関する。
【0025】
第１の側面では、この発明は、重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１のアミノ酸配列が配列番号２６で示す配列を含み；
ＨＣ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号２７で示す配列を含み；かつ、
ＨＣ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号２８で示す配列を含む、
重鎖可変領域の相補性決定領域ＨＣ ＣＤＲ１～３を有し、
軽鎖（ＬＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１のアミノ酸配列が配列番号２９で示す配列を含み；
ＬＣ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号３０で示す配列を含み；かつ、
ＬＣ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号３１で示す配列を含む、
軽鎖可変領域の相補性決定領域ＬＣ ＣＤＲ１～３を有する、
ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片に関する。
ＨＣ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号２７で示す配列を含み；かつ、
ＨＣ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号２８で示す配列を含む、
重鎖可変領域の相補性決定領域ＨＣ ＣＤＲ１～３を有し、
軽鎖（ＬＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１のアミノ酸配列が配列番号２９で示す配列を含み；
ＬＣ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号３０で示す配列を含み；かつ、
ＬＣ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号３１で示す配列を含む、
軽鎖可変領域の相補性決定領域ＬＣ ＣＤＲ１～３を有する、
ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片に関する。
【0026】
第２の側面では、この発明は、リンカーを介して細胞傷害性薬物と結合した抗ｃ－Ｍｅｔ抗体又は抗原結合断片を含むＡＤＣに関する。
【0027】
好ましい態様では、ＡＤＣは、式（ＩＩＩ）
【0028】
【化1】
【0029】
（式中、
ＡｂのＨＣ可変領域は配列番号１６のアミノ酸配列で示され、ＡｂのＬＣ可変領域は配列番号２０のアミノ酸配列で示され；
ＡｂはＩｇＧ１抗体であり；
細胞傷害性薬物は、前記リンカーを介して、（Kabatナンバリングで）ＨＣの４１位における組み換えられたシステインと部位特異的に結合する。）
で表される。
ＡｂのＨＣ可変領域は配列番号１６のアミノ酸配列で示され、ＡｂのＬＣ可変領域は配列番号２０のアミノ酸配列で示され；
ＡｂはＩｇＧ１抗体であり；
細胞傷害性薬物は、前記リンカーを介して、（Kabatナンバリングで）ＨＣの４１位における組み換えられたシステインと部位特異的に結合する。）
で表される。
【0030】
この発明の他の側面は、抗体、抗原結合断片又はＡＤＣを含む医薬組成物と、特に単剤療法又は併用療法でがんを治療する医薬品としてのそれらの使用を含む。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】ｃ－Ｍｅｔ陽性MKN45細胞におけるAlexa Fluor 488（ＡＦ４８８）標識ｍＡｂ３ｂの内在化の定量。(A) IncuCyte（登録商標）S3機器で細胞質に取り込まれた蛍光シグナルの増加を２４時間モニタリングすることで求めた内在化。(B) フローサイトメトリーで測定した内在化の割合。
【図2】ｃ－Ｍｅｔ陽性MKN45細胞に対するＡＤＣ３ｂ及び対応する結合していない抗体ｍＡｂ３ｂの細胞結合。
【図3】ｃ－Ｍｅｔの発現がさまざまなレベルのヒト腫瘍細胞株におけるＡＤＣ３ｂのin vitro細胞毒性。
【図4】ｃ－Ｍｅｔ陽性MKN45細胞と１：１で共培養し、１μｇ／ｍＬのＡＤＣ３ｂ又は結合していない対照ＡＤＣで処理したｃ－Ｍｅｔ陰性Jurkat NucLight Red細胞におけるバイスタンダー細胞毒性。
【図5】雌ces1c KOマウスのｃ－Ｍｅｔ陽性MKN-45腫瘍モデルにおけるキメラＡＤＣ（ＡＤＣ１、ＡＤＣ２、ＡＤＣ３）及び溶媒のみのin vivo有効性。
【図6】雌ces1c KOマウスのｃ－Ｍｅｔ陽性MKN-45腫瘍モデルにおけるヒト化ＡＤＣ及び溶媒のみのin vivo有効性。
【図7】雌ces1c KOマウスのｃ－Ｍｅｔ陽性MKN-45腫瘍モデルにおけるヒト化ＡＤＣ（ＡＤＣ３ａ、ＡＤＣ３ｂ、ＡＤＣ３ｃ）及び溶媒のみのin vivo有効性。
【図8】ＭＥＴが増幅されていない頭頸部がんＰＤＸモデルHNXF1905（Ａ）及び肺がんＰＤＸモデルLXFL1176（Ｂ）におけるＡＤＣ３ｂの有効性。矢印は、マウスのランダム化と投与の時点を示す。
【発明を実施するための形態】
【0032】
抗体及びその抗原結合断片
本発明により、ｃ－Ｍｅｔに対して、いかなるアゴニスティックな効果も示さず、アンタゴニスティックな効果又はニュートラルな効果を示す抗体又は抗体結合断片が提供される。ニュートラルな効果とは、抗体はｃ－Ｍｅｔに結合するものの、その結合がｃ－Ｍｅｔシグナル伝達を刺激しないことを意味する。
本発明により、ｃ－Ｍｅｔに対して、いかなるアゴニスティックな効果も示さず、アンタゴニスティックな効果又はニュートラルな効果を示す抗体又は抗体結合断片が提供される。ニュートラルな効果とは、抗体はｃ－Ｍｅｔに結合するものの、その結合がｃ－Ｍｅｔシグナル伝達を刺激しないことを意味する。
【0033】
この発明は、ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合し、ヒト及びカニクイザル（cyno）の両者のｃ－Ｍｅｔに対して優れた親和性及び良好な有効性を示し、許容される治療可能時間域／治療濃度域（therapeutic window）を提供する、その特定の相補性決定領域（ＣＤＲ）によって特定される抗体又はその抗原結合断片に関する。
【0034】
本発明の抗体又は抗原結合断片は、相補性決定領域（ＣＤＲ）である重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１～３を含むＨＣ可変領域を含み、ＨＣ ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号２６で示す配列を含み、ＨＣ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号２７で示す配列を含み、かつ、ＨＣ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号２８で示す配列を含む。
【0035】
本発明の抗体又は抗原結合断片は、相補性決定領域である軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１～３を含むＬＣ可変領域を更に含み、ＬＣ ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号２９で示す配列を含み、ＬＣ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号３０で示す配列を含み、かつ、ＬＣ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号３１で示す配列を含む。
【0036】
この明細書全体で、用語「抗体」は、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含むモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を指す。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ抗体といったアイソタイプであってもよい。好ましくは、抗体はＩｇＧ抗体、より好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ２抗体である。抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体であってもよい。好ましくは、本発明の抗体はヒト化されている。更により好ましくは、抗体は、ヒト化又はヒトＩｇＧ抗体、より好ましくはヒト化又はヒトＩｇＧ１抗体、最も好ましくはヒト化ＩｇＧ１抗体である。抗体は、κ又はλ軽鎖、好ましくはκ軽鎖を有していてもよく、すなわちヒト化又はヒトＩｇＧ１－κ抗体である。
【0037】
抗体又はその抗原結合断片は、適用可能な場合、(1) 操作された定常領域、すなわち、例えば、半減期を増加させ、リンカー－薬物の結合部位を提供し、及び／又はエフェクター機能を増加若しくは減少させるために、１以上の変異が導入されてもよい定常領域；又は (2) 操作された可変領域、すなわち、リンカー－薬物の結合部位を提供するために、１以上の変異が導入されてもよい可変領域、を含んでいてもよい。抗体又はその抗原結合断片は、組換えによって、合成によって、又は公知の他の適切な方法によって製造してもよい。
【0038】
この明細書全体で、用語「抗原結合断片」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は還元ＩｇＧ（ｒＩｇＧ）断片、一本鎖（ｓｃ）抗体、単一ドメイン（ｓｄ）抗体、ダイアボディ又はミニボディを含む。
【0039】
非ヒト（例．げっ歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体に由来する配列が最小な抗体（例．非ヒト－ヒトキメラ抗体）である。非ヒト抗体をヒト化するさまざまな方法が当技術分野において公知である。例えば、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の可変領域（ＶＲ）中の抗原が結合する結合相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ヒト以外、通常マウス、ラット又はウサギの抗体に由来する。これらの非ヒトＣＤＲは、結合親和性及び特異性といった抗体の機能的特性が少なくとも部分的には保持されるように、ＨＣ及びＬＣの可変領域のヒトのフレームワーク領域（ＦＲ、すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）と組み合わせることができる。ヒトＦＲ中のアミノ酸を、対応する非ヒト種のアミノ酸と交換して、免疫原性は低く保ちながら結合親和性を改善するなど、抗体の性能を更に改良してもよい。このようにしてヒト化された可変領域は、通常、ヒトの定常領域と組み合わされる。非ヒト抗体のヒト化の代表的な方法は、Winterと共同研究者の方法（Jones et al., Nature 1986, 321, 522-525；Riechmann et al., Nature 1988, 332, 323-327；Verhoeyen et al., Science 1988, 239, 1534-1536）である。あるいは、非ヒト抗体は、そのアミノ酸配列を改変して、ヒトにおいて天然に産生される抗体との類似性を高めることによって、ヒト化できる。例えば、非ヒト種のＦＲのアミノ酸は、抗体の結合親和性を保ちながら免疫原性を減少させるために、対応するヒトのアミノ酸と交換される。詳細については、Jones et al., Nature 1986, 321, 522-525；Riechmann et al., Nature 1988, 332, 323-327及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 1992, 2, 593-596を参照。以下の総説とそこで引用されている文献も参照：Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma and Immunol. 1998, 1, 105-115；Harris, Biochem. Soc. Transactions 1995, 23, 1035-1038及びHurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 1994, 5, 428-433。
【0040】
ＣＤＲは、Kabat（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, NIH publication no. 91-3242, pp. 662, 680, 689 (1991)）、Chothia（Chothia et al., Nature 1989, 342, 877-883）又はＩＭＧＴ（Lefranc, The Immunologist 1999, 7, 132-136）の方法で決定できる。これらの方法は、ＩＭＧＴの方法で決定した配列番号１～２０示す配列に下線を付したＣＤＲによって、及び、配列番号２６～３１に示すKabatの方法で決定したＣＤＲ配列によって示されるように、長さがわずかに異なるＣＤＲをもたらす。
【0041】
ある態様では、この発明は、ＨＣ ＣＤＲ １～３及びＬＣ ＣＤＲ １～３を含むヒト化抗体又はその抗原結合断片に関し、
ＨＣ ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号２６で示す配列を含み；
ＨＣ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号２７で示す配列を含み；かつ、
ＨＣ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号２８で示す配列を含み、
ＬＣ ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号２９で示す配列を含み；
ＬＣ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号３０で示す配列を含み；かつ、
ＬＣ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号３１で示す配列を含む。
ＨＣ ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号２６で示す配列を含み；
ＨＣ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号２７で示す配列を含み；かつ、
ＨＣ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号２８で示す配列を含み、
ＬＣ ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号２９で示す配列を含み；
ＬＣ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号３０で示す配列を含み；かつ、
ＬＣ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号３１で示す配列を含む。
【0042】
好ましい態様では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、配列番号１６で示されるＨＣ可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号２０で示されるＬＣ可変領域のアミノ酸配列を含む。
【0043】
ある態様では、本発明の抗体は、インタクトなＩｇＧ抗体、より好ましくはＩｇＧ１抗体である。
【0044】
他の態様では、本発明の抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２断片、より好ましくはＦａｂ断片である。
【0045】
本発明の抗体は、その高い特異性とヒト及びカニクイザル両者のｃ－Ｍｅｔに対する優れた親和性、そして、in vitro又はin vivoのいずれにおいてもアゴニスティックな効果を発揮しない点のため、治療用途に特に適している。
【0046】
抗体薬物複合体
この発明は、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を更に提供し、本発明の抗体又は抗原結合断片は、リンカーを介して、低分子細胞傷害性薬物などの細胞傷害性薬物に結合している。リンカーと細胞傷害性薬物が結合している部分は、リンカー－薬物（部分）である。
この発明は、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を更に提供し、本発明の抗体又は抗原結合断片は、リンカーを介して、低分子細胞傷害性薬物などの細胞傷害性薬物に結合している。リンカーと細胞傷害性薬物が結合している部分は、リンカー－薬物（部分）である。
【0047】
リンカーの構造は、リンカーが低分子の細胞傷害性薬物とたやすく化学的に結合できるもので、得られたリンカー－薬物に、例えば本発明の抗体又は抗原結合断片のような別の物質を容易に結合させて抗体薬物複合体を形成できるような構造である。リンカーの選択は、血中では複合体の安定性に影響を及ぼし、低分子薬物の放出では、その放出形態に影響を及ぼす。適切なリンカーは、例えば、Ducry et al., Bioconjugate Chem. 2010, 21, 5-13、King and Wagner, Bioconjugate Chem. 2014, 25, 825-839、Gordon et al., Bioconjugate Chem. 2015, 26, 2198-2215、Tsuchikama and An（DOI: 10.1007/s13238-016-0323-0）、Polakis（DOI: 10.1124/pr.114.009373）、Bargh et al.（DOI: 10.1039/c8cs00676h）、国際公開第2011/133039号、同第2015/177360号及び同第2018/069375号に記載されている。リンカーは、切断可能又は切断不可能であってもよい。切断可能なリンカーは、例えば、リソソームプロテアーゼに、又は酸性ｐＨ若しくは高い還元電位に曝露された場合に切断される部分を含む。適切な切断可能リンカーは当該技術分野において公知であり、例えば、ジ、トリ又はテトラペプチド、すなわち、２、３又は４個のアミノ酸残基からなるペプチドを含む。さらに、切断可能なリンカーは、ω-アミノ-アミノカルボニル環化スペーサー（Saari et al., J. Med. Chem., 1990, 33, 97-101参照）のような自壊部分、又は－ＮＨ－ＣＨ２－Ｏ－部分を含んでいてもよい。リンカーの切断により、ＡＤＣ中の薬物が送達された周囲で利用できるようになる。切断不可能なリンカーも、例えば、複合体中のポリペプチドがリソソーム内で分解された場合、ＡＤＣから薬物（の誘導体）を効果的に放出できる。切断不可能なリンカーには、例えば、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル(シクロヘキサン)-1-カルボキシレート及びマレイミドカプロン酸並びにそれらのアナログが含まれる。
【0048】
この発明では、切断可能なリンカー又は切断不可能なリンカーのいずれかを使用してもよい。好ましくは、リンカーは、システイン残基のチオール基と反応できる化学基、通常、マレイミド又はハロアセチル基を有する。より好ましくは、リンカーは切断可能なリンカーである。
【0049】
本発明の抗体又は抗原結合断片と結合した細胞傷害性薬物は、がんの治療に適している。適切な細胞傷害性薬物の例には、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、メイタンシノイド（例．ＤＭ１又はＤＭ４）、アウリスタチン（例．ＭＭＡＥ又はＭＭＡＦ）誘導体が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、細胞傷害性薬物はデュオカルマイシン誘導体である。
【0050】
デュオカルマイシン類は、ストレプトマイセス種の培養液から初めて単離されたもので、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ及びＣＣ－１０６５を含む抗腫瘍抗生物質の一種である。これらの非常に強力な薬物は、副溝においてアデニンのＮ３位を選択的にアルキル化するという、アポトーシスで終了する一連の事象を開始する能力から、その生物学的活性を引き出しているとされている。
【0051】
国際公開第2011/133039号は、デュオカルマイシン誘導体ＣＣ－１０６５を含む一連のリンカー－薬物を開示する。この発明で使用できるデュオカルマイシン誘導体は、１８２～１９７ページに開示されている。これらのリンカー－薬物の多くの化学合成は、国際公開第2011/133039号の実施例１～１２に記載されている。
【0052】
好ましい態様では、この発明は、リンカー－薬物が、本発明の抗体又は抗原結合断片のシステイン残基を介して結合するＡＤＣに関する。
【0053】
ある態様では、この発明は、式（Ｉ）
（式中、
Ａｂは本発明の抗体又は抗原結合断片であり；
ｎは０～３の整数であり；
ｍは１～６の平均ＤＡＲを表し；
Ｒ１は、
からなる群から選択され；
ｙは１～１６の整数であり；
Ｒ２は、
からなる群から選択される。）
で表されるＡＤＣに関する。
【化2】
Ａｂは本発明の抗体又は抗原結合断片であり；
ｎは０～３の整数であり；
ｍは１～６の平均ＤＡＲを表し；
Ｒ１は、
【化3】
ｙは１～１６の整数であり；
Ｒ２は、
【化4】
で表されるＡＤＣに関する。
【0054】
この明細書に示す構造式では、ｎは０～３の整数を表し、ｍは１～６の平均薬物抗体比（ＤＡＲ）を表す。ＤＡＲ及び薬物負荷分布は、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）又は逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）により決定できることは、当該技術分野において周知である。ＨＩＣは、平均ＤＡＲの決定に特に適している。
【0055】
特別な態様では、この発明は前記式（Ｉ）で表されるＡＤＣに関し、式中、ｎは０又は１であり、ｍは１～６、好ましくは１～４、より好ましくは１～２、最も好ましくは１．５～２の平均ＤＡＲを表し、Ｒ１は、
からなる群から選択され；
ｙは１～１６、好ましくは１～４の整数であり；Ｒ２は、
である。
【化5】
ｙは１～１６、好ましくは１～４の整数であり；Ｒ２は、
【化6】
【0056】
特定の態様では、この発明は前記式（Ｉ）で表されるＡＤＣに関し、式中、ｎは０又は１であり、ｍは１．５～２の平均ＤＡＲを表し、Ｒ１は
であり；
ｙは１～４であり；
Ｒ２は
である。
【化7】
ｙは１～４であり；
Ｒ２は
【化8】
【0057】
好ましい態様では、ＡＤＣは、式（ＩＩ）
で表される化合物であり、式中、Ａｂは本発明の抗体又は抗原結合断片で、１～４は、化合物の平均ＤＡＲを示す。
【化9】
【0058】
とりわけ好ましい態様では、ＡＤＣは、式（ＩＩＩ）
で表される化合物であり、Ａｂは本発明の抗体又は抗原結合断片で、１．５～２は、化合物の平均ＤＡＲを示す。
【化10】
【0059】
本発明のＡＤＣは、野生型であっても、部位特異的であってもよく、以下に例示するような当該技術分野における公知の方法で製造できる。
【0060】
野生型のＡＤＣは、例えば、抗体のリジンε－アミノ基を介して、リンカー－薬物と抗体又はその抗原結合断片を結合させることによって製造してもよく、好ましくは、活性化エステルなどのアミン反応性基を含むリンカー－薬物を使用し、活性化エステルを抗体又はその抗原結合断片と接触させることで、ＡＤＣが得られる。あるいは、野生型のＡＤＣは、当該技術分野において公知の方法及び条件（例えば、Doronina et al., Bioconjugate Chem. 2006, 17, 114-124を参照）により、鎖間ジスルフィド結合の還元によって生成したシステインの側鎖の遊離チオールを利用してリンカー－薬物を結合させることによって製造できる。この製造方法は、溶媒に曝露された鎖間ジスルフィドの部分的な還元と、得られたチオールの、マイケル受容体含有リンカー－薬物（例．マレイミド含有リンカー－薬物、α-ハロ酢酸アミド又はエステル）のよる修飾を含む。このシステイン結合戦略では、還元されたジスルフィドにつき、最大で２つのリンカー－薬物が得られる。ほとんどのヒトＩｇＧ分子は、溶媒に曝露されたジスルフィド結合を４つ有し、したがって、１抗体あたり０～８個のリンカー－薬物が可能である。１抗体あたりのリンカー－薬物の正確な数は、ジスルフィドの還元の程度とその後の結合反応で使用するリンカー－薬物のモル当量数によって決まる。４つ全てのジスルフィド結合の完全な還元により、１抗体あたり８つのリンカー－薬物を有する均一な構築物が得られ、部分的な還元では、通常、１抗体あたり０、２、４、６又は８つのリンカー－薬物を有する不均一な混合物を生じる。
【0061】
部位特異的なＡＤＣは、好ましくは、抗体又はその抗原結合断片の適切な位置にある組み換えられたシステイン残基の側鎖を介して、リンカー－薬物と抗体又はその抗原結合断片を結合させることによって製造される。組み換えられたシステインは、通常、システイン又はグルタチオンのような他のチオールでキャップされて、ジスルフィドを形成する。これらのキャップされた残基は、リンカー－薬物と結合させる前に、キャップを外す必要がある。組換えられた残基とリンカー－薬物の結合は、(1) 天然の鎖間ジスルフィドと変異体のジスルフィドの両者を還元し、次いで、ＣｕＳＯ４若しくはデヒドロアスコルビン酸などの穏やかな酸化剤を使用して天然の鎖間システインを再酸化し、その後、キャップされていない組み換えられたシステインとリンカー－薬物を標準的な方法で結合させることにより、又は、(2) 高い割合で鎖間ジスルフィド結合よりも変異体ジスルフィドを還元する穏やかな還元剤を使用し、その後、キャップされていない組み換えられたシステインとリンカー－薬物を標準的な方法で結合させることにより、達成される。最適な条件下では、（ｍＡｂ又は断片のＨＣ又はＬＣ中に１つのシステインが組み込まれた場合）１つの抗体又はその抗原結合断片あたり２つのリンカー－薬物が結合する（すなわち、薬物対抗体比ＤＡＲは２である）。リンカー－薬物を部位特異的に結合させる適切な方法は、例えば、国際公開第2015/177360号（還元及び再酸化の方法を記載）、国際公開第2017/137628号（穏やかな還元剤を使用する方法を記載）、及び国際公開第2018/215427号（還元された鎖間システインとキャップされていない組み換えられたシステインを結合する方法を記載）に記載されている。
【0062】
この発明では、用語「組み換えられたシステイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖中のシステイン以外のアミノ酸がシステインに置換されたものを意味する。当業者に知られているように、置換は、例えば、部位特異的変異によって、アミノ酸レベル又はＤＮＡレベルで行うことができる。
【0063】
ある態様では、この発明は、リンカー－薬物が、本発明の抗体又は抗原結合断片と、重鎖又は軽鎖の可変領域又は定常領域に導入された組み換えられたシステイン残基を介して部位特異的に結合したＡＤＣに関する。
【0064】
好ましい態様では、この発明は、リンカー－薬物が、本発明の抗体又は抗原結合断片と、前記抗体又は抗原結合断片のＨＣ可変領域の４０、４１及び８９位（Kabatナンバリング）、並びにＬＣ可変領域の４０及び４１位（Kabatナンバリング）から選択される１以上の位置における組み換えられたシステインを介して、部位特異的に結合したＡＤＣに関する。好ましくは、前記組み換えられたシステインは、ＨＣの４１位又はＬＣの４０若しくは４１位にあり、より好ましくはＨＣの４１位にある。
【0065】
特定の態様では、ＡｂのＨＣ可変領域は配列番号１６のアミノ酸配列で示され、ＡｂのＬＣ可変領域は配列番号２０のアミノ酸配列で示される。好ましくは、ＡＤＣは、式（ＩＩＩ）で表されるＡＤＣである。より好ましくは、細胞傷害性薬物は、リンカーを介して、ＡｂのＨＣの４１位（Kabatナンバリング）の組み換えられたシステインと部位特異的に結合する。更により好ましくは、ＡｂはＩｇＧ１抗体である。最も好ましくは、Ａｂはκ軽鎖を有するＩｇＧ１抗体である。
【0066】
配列番号１６で示されるＨＣ可変領域及び配列番号２０で示されるＬＣ可変領域を含み、vc-seco-ＤＵＢＡ薬物が、ＨＣ４１位の組み換えられたシステインを介して部位特異的に結合しているＡＤＣの毒性プロファイルは、多くのさまざまな正常組織がｃ－Ｍｅｔを発現していることを考慮すると、カニクイザルにおいて著しく好ましかった。ｃ－Ｍｅｔの広範な発現にもかかわらず、このＡＤＣの忍容性は驚くほど高い。ＡＤＣの重篤な毒性が発現しない最大投与量（ＨＮＳＴＤ）は、３週間に１回の１５ｍｇ／ｋｇと推定される。
【0067】
医薬組成物
本発明は、さらに、これまでに説明した抗ｃ－Ｍｅｔ抗体若しくはその抗原結合断片又は抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣと１以上の薬学的に許容される添加物を含む医薬組成物に関する。ｍＡｂ、断片及び（モノクローナル）ＡＤＣといった治療用タンパク質の一般的な医薬製剤は、静脈注入前に（水への）溶解（すなわち再構成）を必要とする凍結乾燥ケーキ（凍結乾燥粉末）、又は使用前に解凍を必要とする凍結（水）溶液の形態をとる。
本発明は、さらに、これまでに説明した抗ｃ－Ｍｅｔ抗体若しくはその抗原結合断片又は抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣと１以上の薬学的に許容される添加物を含む医薬組成物に関する。ｍＡｂ、断片及び（モノクローナル）ＡＤＣといった治療用タンパク質の一般的な医薬製剤は、静脈注入前に（水への）溶解（すなわち再構成）を必要とする凍結乾燥ケーキ（凍結乾燥粉末）、又は使用前に解凍を必要とする凍結（水）溶液の形態をとる。
【0068】
概して、医薬組成物は、凍結乾燥ケーキの形態で提供される。この発明の（凍結乾燥前の）医薬組成物に配合するのに適切な薬学的に許容される添加物には、緩衝溶液（例．水中のクエン酸塩、ヒスチジン又はコハク酸塩含有塩）、凍結乾燥保護剤（例．スクロース、トレハロース）、浸透圧調節剤（例．塩化ナトリウム）、界面活性剤（例．ポリソルベート）、及び増量剤（例．マンニトール、グリシン）が含まれる。凍結乾燥タンパク質製剤に使用する添加物は、凍結乾燥中及び保存中にタンパク質の変性を防止する能力によって選択される。一例として、無菌又は滅菌注射用水（ＢＷＦＩ又はＳＷＦＩ）で再構成する、カドサイラ（登録商標）（Roche）の滅菌凍結乾燥粉末単回製剤は、２０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブエムタンシン、０．０２％w/vのポリソルベート２０、１０ｍＭのコハク酸ナトリウム及び６％w/vのスクロースを含有し、ｐＨは５．０である。
【0069】
医薬用途
別の側面では、この発明は、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体若しくはその抗原結合断片、ＡＤＣ又は、特にがんを治療する医薬品として使用するためのこれまでに説明した医薬組成物を提供する。
別の側面では、この発明は、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体若しくはその抗原結合断片、ＡＤＣ又は、特にがんを治療する医薬品として使用するためのこれまでに説明した医薬組成物を提供する。
【0070】
この発明では、がんは、好ましくはｃ－Ｍｅｔを発現する腫瘍である。このような腫瘍は、ｃ－Ｍｅｔ陽性固形腫瘍又はＭＥＴによる造血器腫瘍であってもよい。これまでに説明した、この発明で治療できる固形腫瘍又は造血器腫瘍の例には、乳がん；脳腫瘍（例．多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）又は髄芽腫）；頭頸部のがん；甲状腺がん；唾液腺がん（例．耳下腺がん）；副腎がん（例．神経芽細胞腫、傍神経節腫又は褐色細胞腫）；骨のがん（例．骨肉腫）；軟部肉腫（ＳＴＳ）；眼のがん（例．ブドウ膜黒色腫）；食道がん；胃がん（ＧＣ）；小腸がん；結腸直腸がん（ＣＲＣ）；尿路上皮細胞がん（例．膀胱がん、陰茎がん、尿管がん又は腎がん）；卵巣がん；子宮がん（例．子宮内膜がん）；膣がん、外陰がん及び子宮頸がん；肺がん（特に、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）及び小細胞肺がん（ＳＣＬＣ））；黒色腫；中皮腫（特に悪性の胸膜中皮腫及び腹部中皮腫）；肝がん（例．肝細胞がん（ＨＣＣ））；膵臓がん；皮膚がん（例．基底細胞腫、扁平上皮がん又は隆起性皮膚線維肉腫）；精巣がん；前立腺がん；胚細胞がん；原発不明がん（ＣＵＰ）；及びリンパ系の悪性腫瘍（例．成熟Ｔ及びＮＫ腫瘍）又は骨髄性の悪性腫瘍（多発性骨髄腫）が含まれる可能性があるが、これらに限定されるものではない。
【0071】
ある態様では、この発明は、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片、ＡＤＣ、又は、ｃ－Ｍｅｔ陽性ヒト固形腫瘍若しくはＭＥＴによる造血器腫瘍の治療に使用するためのこれまでに説明した医薬組成物に関する。
【0072】
好ましい態様では、この発明は、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体若しくはその抗原結合断片、ＡＤＣ、又はこれまでに説明した医薬組成物、特に、乳がん；脳腫瘍；頭頸部のがん；甲状腺がん；唾液腺がん；軟部肉腫（ＳＴＳ）；眼のがん；食道がん；胃がん（ＧＣ）；小腸がん；結腸直腸がん（ＣＲＣ）；尿路上皮細胞がん（ＵＣＣ）；卵巣がん；子宮がん；子宮内膜がん；子宮頸がん；肺がん（特に、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）及び小細胞肺がん（ＳＣＬＣ））；黒色腫；肝がん；膵臓がん；非黒色腫皮膚がん；前立腺がん；胚細胞がん；及び原発不明がん（ＣＵＰ）からなる群から選択されるｃ－Ｍｅｔ陽性ヒト固形腫の治療に使用するための、デュオカルマイシン誘導体リンカー－薬物を含むＡＤＣに関する。
【0073】
より好ましい態様では、この発明は、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体若しくはその抗原結合断片、ＡＤＣ、又はこれまでに説明した医薬組成物、特に、乳がん；多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）；髄芽腫；頭頸部のがん；甲状腺乳頭がん；唾液腺がん；軟部肉腫（ＳＴＳ）；ブドウ膜黒色腫；食道がん；胃がん（ＧＣ）；小腸がん；結腸直腸がん（ＣＲＣ）；尿路上皮細胞がん（ＵＣＣ）；膀胱がん；尿路がん；陰茎がん；乳頭状腎細胞がん（ＰＲＣＣ）；淡明細胞型腎細胞がん（ＣＣＲＣＣ）；非明細胞型腎細胞がん；腎芽腫；卵巣がん；子宮がん；子宮内膜がん；子宮頸がん；非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）；小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）；黒色腫；肝細胞がん（ＨＣＣ）；膵臓がん；非黒色腫皮膚がん；前立腺がん；胚細胞がん；原発不明がん（ＣＵＰ）からなる群から選択されるｃ－Ｍｅｔ陽性ヒト固形腫の治療に使用するための、デュオカルマイシン誘導体リンカー－薬物を含むＡＤＣに関する。
【0074】
更に好ましい態様では、この発明は、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体若しくはその抗原結合断片，ＡＤＣ、又はこれまでに説明した医薬組成物、特に、ＭＥＴによる造血器腫瘍の治療に使用するための、デュオカルマイシン誘導体リンカー－薬物を含むＡＤＣに関し、ＭＥＴによる造血器腫瘍は、リンパ系又は骨髄性の悪性腫瘍、より好ましくは成熟Ｔ及びＮＫ腫瘍又は多発性骨髄腫である。
【0075】
これまでに説明した抗ｃ－Ｍｅｔ抗体若しくはその抗原結合断片、ＡＤＣ又は医薬組成物は、この明細書で説明した医薬品の製造に使用するためのものであってもよい。これまでに説明した抗ｃ－Ｍｅｔ抗体若しくはその抗原結合断片、ＡＤＣ又は医薬組成物は、好ましくは、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体若しくはその抗原結合断片、ＡＤＣ又は医薬組成物が、治療有効量で、対象に、特に治療を必要とする対象に投与される治療方法のためのものである。したがって、選択的に、又は他の態様と組み合わせて、ある態様では、この発明は、がんの治療用の医薬品を製造するための、これまでに説明した抗ｃ－Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片、ＡＤＣ又は医薬組成物の使用に関する。この発明で治療されるがんの限定するものではない例は、これまでの説明を参照されたい。
【0076】
選択的に、又は他の態様と組み合わせて、ある態様では、この発明は、がんの治療方法に関し、当該方法は、その治療を必要とする対象に、治療有効量のこれまでに説明した抗ｃ－Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片、ＡＤＣ又は医薬組成物を投与することを含む。この発明で治療されるがんの限定するものではない例は、これまでの説明を参照されたい。
【0077】
これまでに説明した抗ｃ－Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片、ＡＤＣ又は医薬組成物は、対象に投与するためのものである。これまでに説明した抗ｃ－Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片、ＡＤＣ又は医薬組成物は、必要とする対象に有効量の組成物を投与することによって、これまでに説明した治療方法で使用できる。この明細書では、用語「対象」は、哺乳動物として分類される全ての動物を指し、霊長類及びヒトが含まれるが、これらに限定されるものではない。対象は、好ましくはヒトである。「治療有効量」という表現は、所望の応答をもたらすのに、又は症状若しくは徴候を改善するのに十分な量を意味する。特定の対象に対する治療有効量は、症状、対象の全身の状態、投与の方法、経路及び用量、並びに副作用の重症度などの要因に応じて変化させてもよい。
【0078】
この発明は、また、逐次又は同時に投与する、これまでに説明した抗ｃ－Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片、抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣ又は医薬組成物と、１以上の他の治療剤の組合せの使用に関する。
【0079】
適切な化学療法剤には、ナイトロジェンマスタード類、ヒドロキシウレア、ニトロソウレア類、テトラジン類（例．テモゾロミド）及びアジリジン類（例．マイトマイシン）といったアルキル化剤；ＰＡＲＰ阻害剤、ＡＴＲ及びＡＴＭ阻害剤、ＣＨＫ１及びＣＨＫ２阻害剤、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、ＷＥＥ１阻害剤といったＤＮＡ損傷応答を妨げる薬物；葉酸拮抗薬（例．ペメトレキセド）、フルオロピリミジン類（例．ゲムシタビン）、デオキシヌクレオシド類似体、チオプリン類といった代謝拮抗薬；ビンカアルカロイド及びタキサン類といった抗微小管薬；トポイソメラーゼＩ及びＩＩ阻害剤；アントラサイクリン類及びブレオマイシン類といった細胞傷害性抗生物質；デシタビンやアザシチジンなどのＤＮＡメチル化阻害剤；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤；オールトランスレチノイン酸；並びに三酸化ヒ素が含まれる。適切な放射線治療薬には、メタヨードベンジルグアニジン（ＭＩＢＧ）（１３１Ｉ）、リン酸ナトリウム（３２Ｐ）、塩化ラジウム（２２３Ｒａ）、塩化ストロンチウム（８９Ｓｒ）及びエチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸（ＥＤＴＭＰ）サマリウム（１５３Ｓｍ）などの放射性同位体が含まれる。ホルモン療法薬として使用される適切な薬剤には、アロマターゼ阻害剤及びＧｎＲＨ類似体などのホルモン合成阻害剤；選択的エストロゲン受容体モジュレーター（例．タモキシフェン及びフルベストラント）などのホルモン受容体アンタゴニスト、及び、ビカルタミド、エンザルタミド、フルタミドといった抗アンドロゲン薬；アビラテロンなどのＣＹＰ１７Ａ１阻害剤；並びにソマトスタチン類似体が含まれる。
【0080】
標的治療薬は、腫瘍形成と増殖に関与する特定のタンパク質を阻害する治療薬で、低分子薬；治療用抗体などのタンパク質；ペプチド及びペプチド誘導体；又は、ＡＤＣなどのタンパク質と低分子のハイブリッドの場合もある。標的低分子薬の例には、エベロリムス、テムシロリムス、ラパマイシンなどのｍＴｏｒ阻害剤；イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブなどのキナーゼ阻害剤；ソラフェニブやレゴラフェニブなどのＶＥＧＦ阻害剤；ゲフィチニブ、ラパチニブ、エルロチニブなどのＥＧＦＲ／ＨＥＲ２阻害剤；及び、パルボシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブなどのＣＤＫ４／６阻害剤が含まれる。ペプチド又はペプチド誘導体を標的とする治療薬の例には、ボルテゾミブ及びカルフィルゾミブなどのプロテアソーム阻害剤が含まれる。
【0081】
適切な抗炎症剤には、D-ペニシラミン、アザチオプリン及び6-メルカプトプリン、シクロスポリン、抗ＴＮＦ生物製剤（例．インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ又はセルトリズマブペゴル）、レフルノミド、アバタセプト、トシリズマブ、アナキンラ、ウステキヌマブ、リツキシマブ、ダラツムマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ、セクキヌマブ、アプレミラスト、アシトレチン、及びＪＡＫ阻害剤（例．トファシチニブ、バリシチニブ又はウパダシチニブ）が含まれる。
【0082】
免疫療法剤には、サイトカイン（ＩＬ２及びＩＦＮα）；免疫調節イミド薬（例．サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド又はイミキモド）；治療用がんワクチン（例．タリモジンラヘルパレプベク）；及び細胞ベースの免疫療法剤（例．樹状細胞ワクチン、養子Ｔ細胞又はキメラ抗原受容体改変Ｔ細胞）といった免疫応答を誘導、増強又は抑制する薬剤と、細胞膜に結合するリガンドに結合した場合に、そのＦｃ領域を介して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘発できる治療用抗体が含まれる。
【0083】
ある態様では、この発明は、逐次又は同時に投与する、これまでに説明した抗ｃ－Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片、抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣ又は医薬組成物と、これまでに説明したヒト固形腫瘍又は造血器腫瘍の治療のためのｃ－Ｍｅｔ抗原以外のがんに関連する標的に対する治療用抗体、化学療法剤及び／又はＡＤＣの組合せの使用に関する。
【0084】
この発明の抗ｃ－Ｍｅｔ抗体若しくはその抗原結合断片又はＡＤＣの治療有効量は、約０．０１～約１５ｍｇ／ｋｇ体重、具体的には約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、より具体的には約０．３～約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。この後者の範囲は、抗体又はＡＤＣの２０～８００ｍｇの一定の用量にほぼ対応する。本発明の化合物は、毎週、隔週、３週間ごと、毎月又は６週間ごとに投与できる。適切な治療方法は、疾患の重篤度、患者の年齢、投与する化合物、及び治療する医師が考慮する他の要因に依存する。
【0085】
本発明では、治療は、好ましくは、がんを予防すること、回復させること、治癒すること、寛解させること、及び／又は遅延させることである。これは、がんの少なくとも１つの症状の程度が軽減されたこと、及び／又は、がんに関連するパラメータが少なくとも改善されたことを意味してもよい。
【0086】
一般的な定義
この明細書と特許請求の範囲において、動詞「含む（comprise）」及びその活用形は、その単語に続く項目が含まれることを意味する非限定的な意味で使用される、言及していない項目が除かれるわけではない。加えて、不定冠詞「１つ（a、an）」による要素への言及は、当該要素が１つであることを文脈が明確に要求しない限り、複数の要素が存在する可能性を除外しない。したがって、不定冠詞「１つ（a、an）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
この明細書と特許請求の範囲において、動詞「含む（comprise）」及びその活用形は、その単語に続く項目が含まれることを意味する非限定的な意味で使用される、言及していない項目が除かれるわけではない。加えて、不定冠詞「１つ（a、an）」による要素への言及は、当該要素が１つであることを文脈が明確に要求しない限り、複数の要素が存在する可能性を除外しない。したがって、不定冠詞「１つ（a、an）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【0087】
単語「約」又は「およそ」は、数値と共に使用する場合（例．約１０）、好ましくは、その数値の±１％であってもよいことを意味する。
【0088】
この明細書で引用する全ての特許及び文献は、その全体が参照としてこの明細書に組み込まれる。
【0089】
以下の実施例は、例示することのみを目的として提供しており、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【0090】
ＡＤＣを特徴付けるための疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
ＨＩＣによる分析のために、５～１０μＬの試料（１ｍｇ／ｍＬ）を、TSKgel Butyl-NPRカラム（直径４．６ｍｍ×長さ３．５ｃｍ、Tosoh Bioscience、カタログ番号１４９４７）に注入した。溶出方法は、緩衝液Ａ（２５ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．９５）１００％から、緩衝液Ｂ（２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．９５、２０％イソプロパノール）１００％への直線勾配を用いて、０．４ｍＬ／分で２０分間かけた。ＰＤＡ検出器及びEmpowerソフトウェアを備えたWaters Acquity H-Class ＵＰＬＣシステムを使用した。２１４ｎｍで吸光度を測定し、ＡＤＣの保持時間を求めた。
ＨＩＣによる分析のために、５～１０μＬの試料（１ｍｇ／ｍＬ）を、TSKgel Butyl-NPRカラム（直径４．６ｍｍ×長さ３．５ｃｍ、Tosoh Bioscience、カタログ番号１４９４７）に注入した。溶出方法は、緩衝液Ａ（２５ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．９５）１００％から、緩衝液Ｂ（２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．９５、２０％イソプロパノール）１００％への直線勾配を用いて、０．４ｍＬ／分で２０分間かけた。ＰＤＡ検出器及びEmpowerソフトウェアを備えたWaters Acquity H-Class ＵＰＬＣシステムを使用した。２１４ｎｍで吸光度を測定し、ＡＤＣの保持時間を求めた。
【0091】
ＡＤＣを特徴付けるためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ＳＥＣによる分析のために、５μＬの試料（１ｍｇ／ｍＬ）を、TSKgel SWXL Guardカラム（７μｍ、直径６．０ｍｍ×長さ４．０ｃｍ、Tosoh Bioscience、カタログ番号０８５４３）を連結したTSKgel G3000SWXLカラム（５μｍ、直径７．８ｍｍ×長さ３０ｃｍ、Tosoh Bioscience、カタログ番号０８５４１）に注入した。溶出方法は、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５を用いて、０．６ｍＬ／分で３０分間かけた。カラムの温度を２５℃に維持した。ＰＤＡ検出器及びEmpowerソフトウェアを備えたWaters Acquity H-Class ＵＰＬＣシステムを使用した。２１４ｎｍで吸光度を測定し、ＨＭＷを定量した。
ＳＥＣによる分析のために、５μＬの試料（１ｍｇ／ｍＬ）を、TSKgel SWXL Guardカラム（７μｍ、直径６．０ｍｍ×長さ４．０ｃｍ、Tosoh Bioscience、カタログ番号０８５４３）を連結したTSKgel G3000SWXLカラム（５μｍ、直径７．８ｍｍ×長さ３０ｃｍ、Tosoh Bioscience、カタログ番号０８５４１）に注入した。溶出方法は、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５を用いて、０．６ｍＬ／分で３０分間かけた。カラムの温度を２５℃に維持した。ＰＤＡ検出器及びEmpowerソフトウェアを備えたWaters Acquity H-Class ＵＰＬＣシステムを使用した。２１４ｎｍで吸光度を測定し、ＨＭＷを定量した。
【0092】
免疫化プロトコルと選択
マウスを組換えヒトＨＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＥＣＤ－Ｆｃ融合タンパク質で繰り返し免疫した。Ｂ細胞を脾臓から回収して、５７個のハイブリドーマを調製するために使用した。これらのハイブリドーマは、Ｂ細胞とマウス骨髄腫細胞（受託番号CVCL_J288）を使用し、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン培地）での選択工程を行う、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介細胞融合によって調製した。ｃ－Ｍｅｔ－Ｆｃを固定化したLuminexビーズアッセイにより、不死化した抗体分泌ハイブリドーマ培養物の上清を、ＩｇＧ産生、抗体アイソタイプ及びＨＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔへの特異的な結合について分析した。
マウスを組換えヒトＨＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＥＣＤ－Ｆｃ融合タンパク質で繰り返し免疫した。Ｂ細胞を脾臓から回収して、５７個のハイブリドーマを調製するために使用した。これらのハイブリドーマは、Ｂ細胞とマウス骨髄腫細胞（受託番号CVCL_J288）を使用し、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン培地）での選択工程を行う、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介細胞融合によって調製した。ｃ－Ｍｅｔ－Ｆｃを固定化したLuminexビーズアッセイにより、不死化した抗体分泌ハイブリドーマ培養物の上清を、ＩｇＧ産生、抗体アイソタイプ及びＨＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔへの特異的な結合について分析した。
【0093】
機能的なマウス抗体のスクリーニング
抗体の存在下又は非存在下において、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）によるＨｅｐＧ２細胞の刺激を分析することにより、抗体の機能を決定した。イムノブロット分析では、ＨＧＦ誘導ｃ－Ｍｅｔ及びプロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）リン酸化に拮抗し、ＨｅｐＧ２フローサイトメトリーで陽性の抗体を特定できた。ニュートラルな特性又はアンタゴニスティックな特性に基づいて、最初の５７個のハイブリドーマのうち１１個のみを選択し、配列決定した。陽性対照として、アゴニストのハイブリドーマを１種選択し、配列決定した。アミノ酸配列のいくつかを、より生殖系列に似た配列に変異させて、まれで、潜在的に不安定で、低発現の抗体鎖配列を回避した。コドン最適化の前に、ＶＬドメインの隣接領域における１以上のアミノ酸残基を、国際ImMunoGeneTics（IMGT）データベース（Scaviner et al., Exp. Clin. Immunogenetics 1999, 16.4, 234-240）の既知の生殖系列配列のアミノ酸残基で置換した。生殖系列化とも呼ばれる生殖系列配列へのこの復帰変異の工程を、それぞれフレームワーク１又はＪセグメント、マウスＩＧＫＶ－ＦＲ１又はＩＧＫＪの一部であるＶＬドメイン配列のいくつかで行った。１１個の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び１３個の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を得た。
抗体の存在下又は非存在下において、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）によるＨｅｐＧ２細胞の刺激を分析することにより、抗体の機能を決定した。イムノブロット分析では、ＨＧＦ誘導ｃ－Ｍｅｔ及びプロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）リン酸化に拮抗し、ＨｅｐＧ２フローサイトメトリーで陽性の抗体を特定できた。ニュートラルな特性又はアンタゴニスティックな特性に基づいて、最初の５７個のハイブリドーマのうち１１個のみを選択し、配列決定した。陽性対照として、アゴニストのハイブリドーマを１種選択し、配列決定した。アミノ酸配列のいくつかを、より生殖系列に似た配列に変異させて、まれで、潜在的に不安定で、低発現の抗体鎖配列を回避した。コドン最適化の前に、ＶＬドメインの隣接領域における１以上のアミノ酸残基を、国際ImMunoGeneTics（IMGT）データベース（Scaviner et al., Exp. Clin. Immunogenetics 1999, 16.4, 234-240）の既知の生殖系列配列のアミノ酸残基で置換した。生殖系列化とも呼ばれる生殖系列配列へのこの復帰変異の工程を、それぞれフレームワーク１又はＪセグメント、マウスＩＧＫＶ－ＦＲ１又はＩＧＫＪの一部であるＶＬドメイン配列のいくつかで行った。１１個の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び１３個の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を得た。
【0094】
アミノ酸配列に基づいて、対応するＤＮＡコード配列を、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化し、合成し、ヒトのＩｇＧ１サブクラスの定常部分をコードするＤＮＡ配列（ＨＣ 配列番号２２、ＬＣ 配列番号２３）に融合した。Expi293F細胞で発現させたプラスミドをコードする抗体配列を使用する導入遺伝子の発現により、１４個のキメラ抗体のバッチを調製した。プロテインＡアフィニティー精製により、抗体を細胞上清から精製した。
【0095】
細胞表面で発現した全長のヒト及びカニクイザル（cyno）ｃ－Ｍｅｔに対する、キメラ抗体の親和性を試験した。このために、抗体結合実験で使用する前に、全長のヒト及びカニクイザルｃ－Ｍｅｔ受容体をコードするプラスミドベクターをExpiCHO-S細胞に一過性でトランスフェクトし、製造業者の指示に従って培養した。標準的なプラスミド骨格として、ヒトＣＭＶプロモーターを有する全長のヒト又はカニクイザルｃ－Ｍｅｔ抗原コード配列（それぞれ、アクセッション番号P08581（配列番号２４）及びA0A2K5UM05（配列番号２５））を含む、市販の哺乳動物発現ベクターpcDNA3.4（ThermoFisher Scientific）を使用した。
【0096】
ヒト化
ＣＤＲ移植により、ヒト化抗体を調製した。２種のアンタゴニスティックなクローン及び３種のニュートラルなクローンのＣＤＲを、ＩＭＧＴ（Lefranc and Marie-Paule. Immunologist 1999, 7.4, 132-136）及びKabatのナンバリングシステムからのＣＤＲ定義を使用して特定した。マウスＶＨドメインを使用し、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムによってヒトＩｇＧ配列のオンライン公開データベースを検索し、候補となるヒト可変ドメインを特定した。各可変ドメインについて、フレームワークの相同性、主要フレームワーク残基の存在、標準ループ構造及び免疫原性といった基準で、５つの候補を選択した。抗体のＶＬドメインに対して、同じ手順を繰り返した。全てのヒト化ＶＨバリアントを全てのヒト化ＶＬバリアントと組み合わせて、各抗体について２５種のヒト化バリアント、すなわち、合計１２５個を得た。
ＣＤＲ移植により、ヒト化抗体を調製した。２種のアンタゴニスティックなクローン及び３種のニュートラルなクローンのＣＤＲを、ＩＭＧＴ（Lefranc and Marie-Paule. Immunologist 1999, 7.4, 132-136）及びKabatのナンバリングシステムからのＣＤＲ定義を使用して特定した。マウスＶＨドメインを使用し、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムによってヒトＩｇＧ配列のオンライン公開データベースを検索し、候補となるヒト可変ドメインを特定した。各可変ドメインについて、フレームワークの相同性、主要フレームワーク残基の存在、標準ループ構造及び免疫原性といった基準で、５つの候補を選択した。抗体のＶＬドメインに対して、同じ手順を繰り返した。全てのヒト化ＶＨバリアントを全てのヒト化ＶＬバリアントと組み合わせて、各抗体について２５種のヒト化バリアント、すなわち、合計１２５個を得た。
【0097】
重鎖４１Ｃ（ＨＣ－４１Ｃ）変異を有するヒト化バリアントを以下の方法で合成し、ヒト又はカニクイザルｃ－Ｍｅｔを発現するExpiCHO-S細胞を使用して、それらのヒト及びカニクイザルｃ－Ｍｅｔに対する親和性を測定した。
【0098】
抗体及びｃ－Ｍｅｔ抗原の導入遺伝子の発現
a) ｃＤＮＡ構築物及び発現ベクターの調製
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のマウスアミノ酸配列を、Ｎ末端でＨＡＶＴ２０リーダー配列（配列番号２１）に、Ｃ末端でヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号２２）に、それぞれ連結した。得られたキメラアミノ酸配列をｃＤＮＡ配列に逆翻訳し、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化した。
a) ｃＤＮＡ構築物及び発現ベクターの調製
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のマウスアミノ酸配列を、Ｎ末端でＨＡＶＴ２０リーダー配列（配列番号２１）に、Ｃ末端でヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号２２）に、それぞれ連結した。得られたキメラアミノ酸配列をｃＤＮＡ配列に逆翻訳し、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化した。
【0099】
同様に、軽鎖（ＬＣ）構築物のキメラｃＤＮＡ配列は、適切な分泌シグナルの配列（ＨＡＶＴ２０リーダー配列も）、マウスアミノ酸配列の軽鎖可変領域（ＶＬ）、及びヒトＩｇＧκ軽鎖定常領域（配列番号２３）を連結し、得られたアミノ酸配列をヒト細胞での発現のためにコドン最適化したｃＤＮＡ配列に逆翻訳することで得た。
【0100】
ＨＣ－４１Ｃ変異を有するヒト化バリアントのＬＣ及びＨＣをコードするｃＤＮＡ配列を、同様の方法で得た。ＨＣ及びＬＣ配列を、Ｎ末端でＨＡＶＴ２０リーダー配列（配列番号２１）に、Ｃ末端でヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号２２）又はヒトＩｇＧκ軽鎖定常領域（配列番号２３）に連結した。
【0101】
b) ベクター構築とクローニング戦略
抗体鎖とｃ－Ｍｅｔ抗原の発現のために、CMV:BGHpA発現カセットを含む市販（ThermoFisher Scientific）の哺乳動物発現ベクターpcDNA3.4を使用した。ＨＣ、ＬＣ又は抗原のｃＤＮＡを、制限部位ＡｓｃＩ及びＮｈｅＩで、pcDNA3.4ベクターに連結した。ＨＣ、ＬＣ又はｃ－Ｍｅｔ発現カセットのいずれかを含む最終的なベクター（それぞれ、CMV:HC:BGHpA及びCMV:LC-BGHpA）を、大腸菌NEB 5-α細胞の形質転換に使用した。トランスフェクション用の最終発現ベクターの大規模調製は、Maxiprepキット又はMegaprepキット（Qiagen）を使用した。
抗体鎖とｃ－Ｍｅｔ抗原の発現のために、CMV:BGHpA発現カセットを含む市販（ThermoFisher Scientific）の哺乳動物発現ベクターpcDNA3.4を使用した。ＨＣ、ＬＣ又は抗原のｃＤＮＡを、制限部位ＡｓｃＩ及びＮｈｅＩで、pcDNA3.4ベクターに連結した。ＨＣ、ＬＣ又はｃ－Ｍｅｔ発現カセットのいずれかを含む最終的なベクター（それぞれ、CMV:HC:BGHpA及びCMV:LC-BGHpA）を、大腸菌NEB 5-α細胞の形質転換に使用した。トランスフェクション用の最終発現ベクターの大規模調製は、Maxiprepキット又はMegaprepキット（Qiagen）を使用した。
【0102】
c) 哺乳動物細胞における抗体の一過性の発現
市販のExpi293F細胞（ThermoFisher Scientific）を、ExpiFectamineトランスフェクション剤を使用し、以下のような製造業者の指示に従って、発現ベクターでトランスフェクトした：７５×１０７個の細胞を３００ｍＬのFortiCHO培地に播種し、３００μｇの発現ベクターを８００μＬのExpiFectamineトランスフェクション剤と合わせ、細胞に添加した。トランスフェクションの１日後、１．５ｍＬのエンハンサー１及び１５ｍＬのエンハンサー２を培養物に添加した。トランスフェクションの６日後、細胞培養上清を、４，０００ｇで１５分間の遠心分離によって収集し、清澄化した収集物をＰＥＳボトルフィルター／ＭＦ７５フィルター（Nalgene）でろ過した。
市販のExpi293F細胞（ThermoFisher Scientific）を、ExpiFectamineトランスフェクション剤を使用し、以下のような製造業者の指示に従って、発現ベクターでトランスフェクトした：７５×１０７個の細胞を３００ｍＬのFortiCHO培地に播種し、３００μｇの発現ベクターを８００μＬのExpiFectamineトランスフェクション剤と合わせ、細胞に添加した。トランスフェクションの１日後、１．５ｍＬのエンハンサー１及び１５ｍＬのエンハンサー２を培養物に添加した。トランスフェクションの６日後、細胞培養上清を、４，０００ｇで１５分間の遠心分離によって収集し、清澄化した収集物をＰＥＳボトルフィルター／ＭＦ７５フィルター（Nalgene）でろ過した。
【0103】
d) 哺乳動物細胞におけるｃ－Ｍｅｔの一過性の発現
市販のExpiCHO-S細胞（ThermoFisher Scientific）を、ExpiFectamineCHOトランスフェクション剤を使用し、以下のような製造業者の指示に従って、発現ベクターをトランスフェクトした：１．２×１０９個の細胞を２００ｍＬのExpiCHO発現培地に播種し、２００μｇの発現ベクターを６４０μＬのExpiFectamineCHOトランスフェクション剤と合わせ、細胞に添加した。トランスフェクションの１日後、細胞培養物を用量依存的な細胞結合分析に使用した。
市販のExpiCHO-S細胞（ThermoFisher Scientific）を、ExpiFectamineCHOトランスフェクション剤を使用し、以下のような製造業者の指示に従って、発現ベクターをトランスフェクトした：１．２×１０９個の細胞を２００ｍＬのExpiCHO発現培地に播種し、２００μｇの発現ベクターを６４０μＬのExpiFectamineCHOトランスフェクション剤と合わせ、細胞に添加した。トランスフェクションの１日後、細胞培養物を用量依存的な細胞結合分析に使用した。
【0104】
細胞結合実験
キメラ抗体
１４種の野生型キメラ抗ｃ－Ｍｅｔ抗体と１４種のＨＣ－４１Ｃキメラ抗ｃ－Ｍｅｔ抗体の細胞結合を、ヒトｃ－Ｍｅｔ陽性腫瘍細胞株MKN45、NCI-H596及びPC3、アカゲザルｃ－Ｍｅｔ陽性腫瘍細胞株4MBr-5、並びにヒトｃ－Ｍｅｔ陰性腫瘍細胞株MDA-MB-175-VIIで実験した。アッセイ時に約９０％コンフルエントの細胞を使用し、５～１０分間、トリプシン－バーセン（登録商標）（ＥＤＴＡ）（Lonza）で剥離し、洗浄し、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ １×、０．１％v/wＢＳＡ、０．０２％v/vアジ化ナトリウム（ＮａＮ３））で濃度を１×１０６細胞／ｍＬに調整した。表面抗原の変化と内在化を防止するために、氷冷試薬／溶液を４℃で使用して、９６ウェル丸底マイクロタイタープレート中で染色した。９６ウェルプレートにウェルあたり１００，０００細胞（１００μＬ／ウェル）加え、３００× ｇで３分間遠心分離した。ＨＧＦとのプレインキュベーション（パラクリン細胞株のみ）の場合、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中の５０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＨＧＦに再懸濁（５０μＬ／ウェル）し、４℃で３０分間インキュベートした後、１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。上清を捨て、細胞を５０μＬの各抗体で３０分間染色した。氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で連続希釈した。細胞を３００× ｇで３分間の遠心分離によって２回洗浄し、６０００倍希釈した二次Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ断片特異的）抗体ＡＰＣコンジュゲート（Jackson ImmunoResearch）５０μＬに再懸濁した。氷上で３０分間インキュベートした後、細胞を再度２回洗浄し、ＦＡＣＳ分析のために１５０μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。データを分析するために、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を得た。
キメラ抗体
１４種の野生型キメラ抗ｃ－Ｍｅｔ抗体と１４種のＨＣ－４１Ｃキメラ抗ｃ－Ｍｅｔ抗体の細胞結合を、ヒトｃ－Ｍｅｔ陽性腫瘍細胞株MKN45、NCI-H596及びPC3、アカゲザルｃ－Ｍｅｔ陽性腫瘍細胞株4MBr-5、並びにヒトｃ－Ｍｅｔ陰性腫瘍細胞株MDA-MB-175-VIIで実験した。アッセイ時に約９０％コンフルエントの細胞を使用し、５～１０分間、トリプシン－バーセン（登録商標）（ＥＤＴＡ）（Lonza）で剥離し、洗浄し、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ １×、０．１％v/wＢＳＡ、０．０２％v/vアジ化ナトリウム（ＮａＮ３））で濃度を１×１０６細胞／ｍＬに調整した。表面抗原の変化と内在化を防止するために、氷冷試薬／溶液を４℃で使用して、９６ウェル丸底マイクロタイタープレート中で染色した。９６ウェルプレートにウェルあたり１００，０００細胞（１００μＬ／ウェル）加え、３００× ｇで３分間遠心分離した。ＨＧＦとのプレインキュベーション（パラクリン細胞株のみ）の場合、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中の５０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＨＧＦに再懸濁（５０μＬ／ウェル）し、４℃で３０分間インキュベートした後、１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。上清を捨て、細胞を５０μＬの各抗体で３０分間染色した。氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で連続希釈した。細胞を３００× ｇで３分間の遠心分離によって２回洗浄し、６０００倍希釈した二次Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ断片特異的）抗体ＡＰＣコンジュゲート（Jackson ImmunoResearch）５０μＬに再懸濁した。氷上で３０分間インキュベートした後、細胞を再度２回洗浄し、ＦＡＣＳ分析のために１５０μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。データを分析するために、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を得た。
【0105】
全てのキメラ抗体は、試験を行った細胞株においてヒトｃ－Ｍｅｔと良好に結合した。５種のキメラ抗体のみが、4MBr-5細胞株においてアカゲザルｃ－Ｍｅｔと良好に結合した。予想したとおり、野生型キメラ抗体とそのＨＣ－４１Ｃ対応物との間に、結合特性に差はなかった。いずれの抗体も、ｃ－Ｍｅｔ陰性細胞株とは結合せず、全ての抗体がｃ－Ｍｅｔ受容体を特異的に認識することが示された。ヒトのｃ－Ｍｅｔ及びアカゲザルのｃ－Ｍｅｔ、両者に対する高い親和性に基づいて、３種の野生型キメラ抗体とその対応するＨＣ－４１Ｃキメラ抗体を、更なる開発のために選択した（表１を参照）。パラクリン細胞株では、ＨＧＦは６種の選択されたキメラ抗体のＥＣ５０値を変化させ、これは、ＨＧＦがこれらの抗体の結合と競合することを示した。この効果は、２種の非選択的キメラ抗体とそのＨＣ－４１Ｃ対応物ではみられなかった。
【0106】
【表1】
【0107】
【表2】
【0108】
ハイブリドーマＨｙｂ１及びＨｙｂ２は最初に試験（in vitro）され、アンタゴニストとして分類された（表２）が、対応するキメラ抗体wt/41C-chi-mAb1及びwt/41C-chi-mAb2は、in vitroで（NCI-H596細胞における増殖刺激実験において）部分アゴニストであると評価された。この観点から、３種のwt/41CキメラｍＡｂを全てヒト化し、更に実験したが、wt/41C-chi-mAb3が、がんの適応症を処置するＡＤＣとして更に開発するのに最も好ましいキメラ抗ｃ－Ｍｅｔ抗体である。
【0109】
ヒト化抗体
合計７５種のヒト化抗ｃ－Ｍｅｔ抗体（選択した３種のキメラ抗体由来）の細胞結合を、ヒトｃ－Ｍｅｔ陽性腫瘍細胞株MKN45、NCI-H596及びPC-3、アカゲザルｃ－Ｍｅｔ陽性腫瘍細胞株4MBr-5、並びにヒトｃ－Ｍｅｔ陰性腫瘍細胞株MDA-MB-175-VIIで実験した。アッセイ時に約９０％コンフルエントの細胞を使用し、５～１０分間、トリプシン－バーセン（登録商標）（ＥＤＴＡ）（Lonza）で剥離し、洗浄し、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ １×、０．１％v/wＢＳＡ、０．０２％v/vアジ化ナトリウム（ＮａＮ３））で濃度を１×１０６細胞／ｍＬに調整した。表面抗原の変化と内在化を防止するために、氷冷試薬／溶液を４℃で使用して、９６ウェル丸底マイクロタイタープレート中で染色した。９６ウェルプレートにウェルあたり１００，０００細胞（１００μＬ／ウェル）加え、３００× ｇで３分間遠心分離した。ＨＧＦとのプレインキュベーションの場合、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中の５０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＨＧＦに再懸濁（５０μＬ／ウェル）し、４℃で３０分間インキュベートした後、１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。上清を捨て、細胞を５０μＬの各抗体で３０分間染色した。氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で連続希釈を行った。細胞を３００× ｇで３分間の遠心分離によって２回洗浄し、６０００倍希釈した二次Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ断片特異的）抗体ＡＰＣコンジュゲート（Jackson ImmunoResearch）５０μＬに再懸濁した。氷上で３０分間インキュベートした後、細胞を再度２回洗浄し、ＦＡＣＳ分析のために１５０μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。データを分析するために、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を得た。
合計７５種のヒト化抗ｃ－Ｍｅｔ抗体（選択した３種のキメラ抗体由来）の細胞結合を、ヒトｃ－Ｍｅｔ陽性腫瘍細胞株MKN45、NCI-H596及びPC-3、アカゲザルｃ－Ｍｅｔ陽性腫瘍細胞株4MBr-5、並びにヒトｃ－Ｍｅｔ陰性腫瘍細胞株MDA-MB-175-VIIで実験した。アッセイ時に約９０％コンフルエントの細胞を使用し、５～１０分間、トリプシン－バーセン（登録商標）（ＥＤＴＡ）（Lonza）で剥離し、洗浄し、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ １×、０．１％v/wＢＳＡ、０．０２％v/vアジ化ナトリウム（ＮａＮ３））で濃度を１×１０６細胞／ｍＬに調整した。表面抗原の変化と内在化を防止するために、氷冷試薬／溶液を４℃で使用して、９６ウェル丸底マイクロタイタープレート中で染色した。９６ウェルプレートにウェルあたり１００，０００細胞（１００μＬ／ウェル）加え、３００× ｇで３分間遠心分離した。ＨＧＦとのプレインキュベーションの場合、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中の５０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＨＧＦに再懸濁（５０μＬ／ウェル）し、４℃で３０分間インキュベートした後、１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。上清を捨て、細胞を５０μＬの各抗体で３０分間染色した。氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で連続希釈を行った。細胞を３００× ｇで３分間の遠心分離によって２回洗浄し、６０００倍希釈した二次Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ断片特異的）抗体ＡＰＣコンジュゲート（Jackson ImmunoResearch）５０μＬに再懸濁した。氷上で３０分間インキュベートした後、細胞を再度２回洗浄し、ＦＡＣＳ分析のために１５０μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。データを分析するために、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を得た。
【0110】
いずれのヒト化抗体も、ｃ－Ｍｅｔ陰性細胞株を結合しなかった。wt/41C-chi-mAb2及びwt/41C-chi-mAb3に由来する全てのヒト化抗体は、試験を行った細胞株でヒトｃ－Ｍｅｔ及びアカゲザルｃ－Ｍｅｔの両者に対して良好に結合したのに対して、wt/41C-chi-mAb1に由来する２５種のヒト化抗体のうち良好に結合したのは５種のみであった。wt/41C-chi-mAb2に由来するヒト化抗体の良好な結合特性にもかかわらず、ＨＩＣでは、２５種のヒト化抗体のうち２０種の疎水性が劇的に増加した。抗体を含む生物学的化合物では、疎水性が高いほど（動物モデルでは）血液中から迅速に除去されるので、この疎水性の増加は望ましくない結果である。wt/41C-chi-mAb1に由来する２５種のヒト化抗体のうちの１４種でも、同様の結果が得られた。wt/41C-chi-mAb3のヒト化は、結合特性又は疎水性に影響を与えないようであった。
【0111】
更に開発するために選択した９種のＨＣ－４１Ｃヒト化抗体（表３）の細胞結合のＥＣ５０値を、表４に示す。表４におけるパラクリン細胞株が示す結果から、ＨＧＦはヒト化抗体のＥＣ５０値を変化させ、これは、ＨＧＦがこれらの抗体の結合と競合することを示した。
【0112】
ヒトｃ－Ｍｅｔ抗原発現MKN45細胞、NCI-H596細胞及びPC-3細胞、並びにアカゲザルｃ－Ｍｅｔ抗原発現4MBr-5細胞で測定した（キメラ抗体wt/41C-chi-mAb1に由来する）ヒト化ｍＡｂ１ａの細胞結合（ＥＣ５０）は、それぞれ、０．１６μｇ／ｍＬ（９５％ ＣＩ：０．１２～０．２１μｇ／ｍＬ）、０．０４μｇ／ｍＬ（９５％ ＣＩ：０．００６～０．２２５μｇ／ｍＬ）、０．０８μｇ／ｍＬ（９５％ ＣＩ：０．０２～０．２５μｇ／ｍＬ）及び０．０７μｇ／ｍＬ（９５％ ＣＩ：０．０５～０．０９μｇ／ｍＬ）であった。ＨＧＦ結合は、パラクリン細胞株の細胞結合を１．１～２．５倍変化させた。
【0113】
ヒトｃ－Ｍｅｔ抗原発現MKN45細胞、NCI-H596細胞及びPC-3細胞、並びにアカゲザルｃ－Ｍｅｔ抗原発現4MBr-5細胞で測定した（キメラ抗体wt/41C-chi-mAb2に由来する）ヒト化ｍＡｂ２ａ、ｍＡｂ２ｂ及びｍＡｂ２ｃの細胞結合（ＥＣ５０）は、それぞれ０．０９～０．１４μｇ／ｍＬ、０．０２～０．０４μｇ／ｍＬ、０．０３～０．０５μｇ／ｍＬ、及び０．０６～０．０９μｇ／ｍＬであった。ＨＧＦ結合は、パラクリン細胞株の細胞結合を１．２～４．０倍変化させた。
【0114】
ヒトｃ－Ｍｅｔ抗原発現MKN45細胞、NCI-H596細胞及びPC-3細胞、並びにアカゲザルｃ－Ｍｅｔ抗原発現4MBr-5細胞で測定した（キメラ抗体wt/41C-chi-mAb3に由来する）ヒト化ｍＡｂ３ａ、ｍＡｂ３ｂ、ｍＡｂ３ｃ、ｍＡｂ３ｄ及びｍＡｂ３ｅの細胞結合（ＥＣ５０）は、それぞれ、０．０５～０．０７μｇ／ｍＬ、０．０２～０．０３μｇ／ｍＬ、０．０３～０．０３μｇ／ｍＬ、及び０．０２～０．０４μｇ／ｍＬであった。ＨＧＦ結合は、パラクリン細胞株の細胞結合を０．８～７．５倍変化させた。
【0115】
【表3】
【0116】
【表4-1】
【表4-2】
【0117】
結合していない抗体ｍＡｂ３ｂと、ヒト及びカニクイザルｃ－Ｍｅｔ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の結合親和性の実測値（ＫＤ－ｏｂｓ）を表５に示す。この低いＫＤ－ｏｂｓ（０．０１ｎＭ）は、ヒト又はカニクイザルｃ－Ｍｅｔ ＥＣＤのいずれかと抗体との間の親和性が高いことを示す。
【0118】
結合分析を、表面プラズモン共鳴装置（Biacore（登録商標）T200 system、GE Life Sciences）により３７℃で行った。フローセル１及び２にビオチン補足試薬を２μＬ／分で３００秒間注入することで、ビオチン化ヒトｃ－Ｍｅｔ又はカニクイザルｃ－Ｍｅｔを、ビオチン化分子の捕捉に適したCAPchip（Sensor Chip CAP、GE Life Sciences）の表面に捕捉した。ランニング緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．００５％v/vポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Surfactant P20）を含む、２５℃の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４））で希釈したビオチン化ｃ－Ｍｅｔ抗原を、さまざまな接触時間で注入して、５μＬ／分のさまざまな捕捉レベルを取得した。ｃ－Ｍｅｔバリアントの希釈と接触時間は、約２０ＲＵの捕捉レベルを目標として推定した。１分間のベースラインの後、解離時間を９００秒とし、ｍＡｂ３ｂ試料を、３０μＬ／ｍＬで５段階の漸増濃度（０．０３７ｎＭ、０．１１ｎＭ、０．３３ｎＭ、１ｎＭ及び３ｎＭ）で、６０秒間、注入した。相互作用のＲｍａｘは、５～１０ＲＵであった。再生は、６Ｍグアニジン－塩酸、０．２５Ｍ ＮａＯＨ溶液で行った（流量３０μＬ／分で１２０秒）。得られたセンサーグラムに対し、ブランク参照フローチャネル及びランニング緩衝液注入のシグナルを差し引くダブルブランクサブトラクションを行った。センサーグラムは、Biacore（登録商標）T200評価ソフトウェア（v3.1）で作成した。センサーグラムを１：１ラングミュア結合モデルにフィッテングさせ、次いで、適合の良好性（χ２）、適合の独自性（Ｕ値）について、目視検査及び生物学的関連性によって評価した。
【0119】
【表5】
【0120】
内在化実験
ｍＡｂ３ｂの内在化を、ヒトｃ－Ｍｅｔ陽性腫瘍細胞株MKN45、NCI-H441及びPC-3で調査した。細胞（９６ウェルの丸底マイクロタイタープレートの各ウェルに１００，０００細胞）を、１０μｇ／ｍＬのｍＡｂ３ｂ又は適切な結合していない対照抗体５０μＬと共に４℃で３０分間インキュベートした。１０％熱不活性化（ＨＩ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Gibco）及び８０Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Lonza）を添加したＲＰＭＩ（Lonza）からなる氷冷完全増殖培地（ＣＧＭ）で洗浄した後、細胞を、Alexa Fluor 488（ＡＦ４８８）標識Ｆａｂ断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：６００希釈）（Jackson Immunoresearch）５０μＬと共に４℃で３０分間インキュベートした。氷冷ＣＧＭで洗浄した後、細胞を、予め温めたＣＧＭ １５０μＬに再懸濁し、各時点（０ｈ、０．５ｈ、１ｈ、３ｈ、２４ｈ）で１つずつ、ポリプロピレンチューブに移し、３７℃の水浴に入れて内在化を開始させた。指定の時間のインキュベーション後、細胞を、０．１％v/w ＢＳＡ（Sigma）及び０．０２％アジ化ナトリウム溶液（Sigma）を添加した１× ＰＢＳ（Lonza）からなる氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、内在化を停止させた。５０μＬの抗Alexa Fluor 488ウサギＩｇＧ抗体（氷冷ＦＡＣＳ緩衝液中で１：３０希釈）（Molecular Probes, Life Technologies）を用い４℃で１０分間クエンチした後、残存する表面の発現を可視化した。測定前に、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液１００μＬを更に添加した。同一のクエンチしていないチューブについて、各時点での全蛍光を求めた。フローサイトメトリー（BD FACSVerse, Franklin Lakes, NJ）で蛍光強度を求め、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）として示した。以下の式を用いて内在化の割合を計算することで、内在化を定量した。
内在化率（％）＝１－（Ｎ１－Ｑ１）／Ｎ１－（Ｎ１＊Ｑ０／Ｎ０）＊１００％
Ｎ１＝各時点におけるクエンチしていないＭＦＩ
Ｑ１＝各時点におけるクエンチしたＭＦＩ
Ｑ０＝時点０におけるクエンチしたＭＦＩ
Ｎ０＝時点０におけるクエンチしていないＭＦＩ
ｍＡｂ３ｂの内在化を、ヒトｃ－Ｍｅｔ陽性腫瘍細胞株MKN45、NCI-H441及びPC-3で調査した。細胞（９６ウェルの丸底マイクロタイタープレートの各ウェルに１００，０００細胞）を、１０μｇ／ｍＬのｍＡｂ３ｂ又は適切な結合していない対照抗体５０μＬと共に４℃で３０分間インキュベートした。１０％熱不活性化（ＨＩ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Gibco）及び８０Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Lonza）を添加したＲＰＭＩ（Lonza）からなる氷冷完全増殖培地（ＣＧＭ）で洗浄した後、細胞を、Alexa Fluor 488（ＡＦ４８８）標識Ｆａｂ断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：６００希釈）（Jackson Immunoresearch）５０μＬと共に４℃で３０分間インキュベートした。氷冷ＣＧＭで洗浄した後、細胞を、予め温めたＣＧＭ １５０μＬに再懸濁し、各時点（０ｈ、０．５ｈ、１ｈ、３ｈ、２４ｈ）で１つずつ、ポリプロピレンチューブに移し、３７℃の水浴に入れて内在化を開始させた。指定の時間のインキュベーション後、細胞を、０．１％v/w ＢＳＡ（Sigma）及び０．０２％アジ化ナトリウム溶液（Sigma）を添加した１× ＰＢＳ（Lonza）からなる氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、内在化を停止させた。５０μＬの抗Alexa Fluor 488ウサギＩｇＧ抗体（氷冷ＦＡＣＳ緩衝液中で１：３０希釈）（Molecular Probes, Life Technologies）を用い４℃で１０分間クエンチした後、残存する表面の発現を可視化した。測定前に、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液１００μＬを更に添加した。同一のクエンチしていないチューブについて、各時点での全蛍光を求めた。フローサイトメトリー（BD FACSVerse, Franklin Lakes, NJ）で蛍光強度を求め、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）として示した。以下の式を用いて内在化の割合を計算することで、内在化を定量した。
内在化率（％）＝１－（Ｎ１－Ｑ１）／Ｎ１－（Ｎ１＊Ｑ０／Ｎ０）＊１００％
Ｎ１＝各時点におけるクエンチしていないＭＦＩ
Ｑ１＝各時点におけるクエンチしたＭＦＩ
Ｑ０＝時点０におけるクエンチしたＭＦＩ
Ｎ０＝時点０におけるクエンチしていないＭＦＩ
【0121】
この方法の限界は、細胞表面に結合したＡＦ４８８標識ｍＡｂのクエンチが不完全なことである。これは、結合したＡＦ４８８色素では、ＡＦ４８８色素の最大消光が多くても９０％以下であることを記載した供給業者の説明と一致する。
【0122】
図１ＢでMKN45細胞が示すように、各細胞株のｍＡｂ３ｂで効率的な内在化が示され、２４時間で内在化が最大となった。
【0123】
MKN45細胞で、ｍＡｂ３ｂの内在化のリアルタイムモニタリングを行った。完全増殖培地中の細胞（18,750細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播種した（５０μＬ／ウェル）。３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした後、ヒトFabFluor-pH赤色蛍光色素（Sartorius）を有する３μｇ／ｍＬの標識前のｍＡｂ３ｂを細胞に添加した（全体積１００μＬ／ウェル）。内在化のリアルタイム生細胞分析は、４８時間の間、３０分ごとにIncuCyte（登録商標）S3機器でプレートを撮像し、１ウェルあたり２枚の画像について、１０倍対物レンズで位相と赤色蛍光をスキャンすることで評価した。IncuCyte（登録商標）S3ソフトウェアのCell-by-Cell adherentモジュールを使用して、赤色蛍光面積及び総細胞面積をマスクして計数し、その（FabFluor赤色面積／MKN45面積）を時間に対してプロットした（図１Ａ）。FabFluorの強度は、リソソームへのｐＨ依存性経路の間に増加し、ｐＨ４．７で最も高い蛍光を示す。
【0124】
部位特異的結合及び野生型結合のプロトコル
部分的に還元した内因性のジスルフィドを介した結合の一般的な結合プロトコル（野生型（ｗｔ）結合）
抗体の溶液（４．２ｍＭヒスチジン、５０ｍＭトレハロース、ｐＨ６中の５～１０ｍｇ／ｍＬ）をＥＤＴＡ（２５ｍＭの水溶液）で希釈（４％v/v）した。ＴＲＩＳ（１Ｍの水溶液、ｐＨ８）を使用してｐＨを約７．４に調整し、次いで、ＴＣＥＰ（１０ｍＭの水溶液、抗体及び所望のＤＡＲに応じ１～３当量）を加え、得られた混合物を室温で１～３時間インキュベートした。ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）を加え、続いてリンカー－薬物の溶液（１０ｍＭのＤＭＡ溶液）を加えた。最終的なＤＭＡの濃度は５～１０％であった。得られた混合物を、遮光下、室温で１～１６時間インキュベートした。過剰のリンカー－薬物を除去するために、活性炭を加え、混合物を室温で１時間インキュベートした。０．２μｍのＰＥＳフィルターを使用して活性炭を除去し、得られたＡＤＣを、Vivaspin遠心濃縮器（分子量カットオフ３０ｋＤａ、ＰＥＳ）を使用して、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、ｐＨ６中で製剤化した。最後に、０．２２μｍのＰＥＳフィルターを用いてＡＤＣ溶液を滅菌ろ過した。
部分的に還元した内因性のジスルフィドを介した結合の一般的な結合プロトコル（野生型（ｗｔ）結合）
抗体の溶液（４．２ｍＭヒスチジン、５０ｍＭトレハロース、ｐＨ６中の５～１０ｍｇ／ｍＬ）をＥＤＴＡ（２５ｍＭの水溶液）で希釈（４％v/v）した。ＴＲＩＳ（１Ｍの水溶液、ｐＨ８）を使用してｐＨを約７．４に調整し、次いで、ＴＣＥＰ（１０ｍＭの水溶液、抗体及び所望のＤＡＲに応じ１～３当量）を加え、得られた混合物を室温で１～３時間インキュベートした。ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）を加え、続いてリンカー－薬物の溶液（１０ｍＭのＤＭＡ溶液）を加えた。最終的なＤＭＡの濃度は５～１０％であった。得られた混合物を、遮光下、室温で１～１６時間インキュベートした。過剰のリンカー－薬物を除去するために、活性炭を加え、混合物を室温で１時間インキュベートした。０．２μｍのＰＥＳフィルターを使用して活性炭を除去し、得られたＡＤＣを、Vivaspin遠心濃縮器（分子量カットオフ３０ｋＤａ、ＰＥＳ）を使用して、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、ｐＨ６中で製剤化した。最後に、０．２２μｍのＰＥＳフィルターを用いてＡＤＣ溶液を滅菌ろ過した。
【0125】
一般的な部位特異的結合プロトコル
部位特異的結合体を、プロトコルＡ又はプロトコルＢの手順により合成した。
1) プロトコルＡ
システイン組換え抗体の溶液（４．２ｍＭヒスチジン、５０ｍＭトレハロース、ｐＨ６中の５～１０ｍｇ／ｍＬ）をＥＤＴＡ（２５ｍＭの水溶液）で希釈（４％v/v）した。ＴＲＩＳ（１Ｍの水溶液、ｐＨ８）を使用してｐＨを約７．４に調整し、次いで、ＴＣＥＰ（１０ｍＭの水溶液、２０当量）を加え、得られた混合物を室温で１～３時間インキュベートした。過剰なＴＣＥＰを、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、ｐＨ６を使用して、PD-10脱塩カラム又は遠心濃縮器（Vivaspinフィルター、分子量カットオフ３０ｋＤａ、ＰＥＳ）で除去した。
部位特異的結合体を、プロトコルＡ又はプロトコルＢの手順により合成した。
1) プロトコルＡ
システイン組換え抗体の溶液（４．２ｍＭヒスチジン、５０ｍＭトレハロース、ｐＨ６中の５～１０ｍｇ／ｍＬ）をＥＤＴＡ（２５ｍＭの水溶液）で希釈（４％v/v）した。ＴＲＩＳ（１Ｍの水溶液、ｐＨ８）を使用してｐＨを約７．４に調整し、次いで、ＴＣＥＰ（１０ｍＭの水溶液、２０当量）を加え、得られた混合物を室温で１～３時間インキュベートした。過剰なＴＣＥＰを、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、ｐＨ６を使用して、PD-10脱塩カラム又は遠心濃縮器（Vivaspinフィルター、分子量カットオフ３０ｋＤａ、ＰＥＳ）で除去した。
【0126】
得られた抗体溶液のｐＨを、ＴＲＩＳ（１Ｍの水溶液、ｐＨ８）を用いて約７．４に上昇させ、次いで、デヒドロアスコルビン酸（１０ｍＭの水溶液、２０当量）を加え、得られた混合物を室温で１～２時間インキュベートした。室温又は３７℃で、ＤＭＡ、続いてリンカー－薬物の溶液（１０ｍＭのＤＭＡ溶液）を加えた。最終的なＤＭＡの濃度は５～１０％であった。得られた混合物を、遮光下、室温又は３７℃で１～１６時間インキュベートした。過剰のリンカー－薬物を除去するために、活性炭を加え、混合物を室温で１時間インキュベートした。０．２μｍのＰＥＳフィルターを使用して活性炭を除去し、得られたＡＤＣを、Vivaspin遠心濃縮器（分子量カットオフ３０ｋＤａ、ＰＥＳ）を使用して、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、ｐＨ６中で製剤化した。最後に、０．２２μｍのＰＥＳフィルターを用いてＡＤＣ溶液を滅菌ろ過した。
【0127】
2) プロトコルＢ
システイン組換え抗体の溶液（５００μＬ、１５ｍＭヒスチジン、５０ｍＭスクロース、０．０１％ポリソルベート－２０、ｐＨ６中に４０ｍｇ／ｍＬ）を１００ｍＭヒスチジン（ｐＨ５、１３００μＬ）で希釈した。2-(ジフェニルホスフィノ)ベンゼンスルホン酸（ｄｉＰＰＢＳ）（４２６μＬ、１０ｍＭの水溶液、３２当量）を加え、得られた混合物を室温で１６～２４時間インキュベートした。過剰のｄｉＰＰＢＳを、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、ｐＨ６を使用して、遠心濃縮器（Vivaspinフィルター、分子量カットオフ３０ｋＤａ、ＰＥＳ）で除去した。
システイン組換え抗体の溶液（５００μＬ、１５ｍＭヒスチジン、５０ｍＭスクロース、０．０１％ポリソルベート－２０、ｐＨ６中に４０ｍｇ／ｍＬ）を１００ｍＭヒスチジン（ｐＨ５、１３００μＬ）で希釈した。2-(ジフェニルホスフィノ)ベンゼンスルホン酸（ｄｉＰＰＢＳ）（４２６μＬ、１０ｍＭの水溶液、３２当量）を加え、得られた混合物を室温で１６～２４時間インキュベートした。過剰のｄｉＰＰＢＳを、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、ｐＨ６を使用して、遠心濃縮器（Vivaspinフィルター、分子量カットオフ３０ｋＤａ、ＰＥＳ）で除去した。
【0128】
得られた抗体溶液のｐＨを、ＴＲＩＳ（１Ｍの水溶液、ｐＨ８）を用いて約７．４に上昇させた。室温又は３７℃で、ＤＭＡ、続いてリンカー－薬物の溶液（１０ｍＭのＤＭＡ溶液）を加えた。最終的なＤＭＡの濃度は５～１０％であった。得られた混合物を、遮光下、室温又は３７℃で１～１６時間インキュベートした。過剰のリンカー－薬物を除去するために、活性炭を加え、混合物を室温で１時間インキュベートした。０．２μｍのＰＥＳフィルターを使用して活性炭を除去し、得られたＡＤＣを、Vivaspin遠心濃縮器（分子量カットオフ３０ｋＤａ、ＰＥＳ）を使用して、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、ｐＨ６中で製剤化した。最後に、０．２２μｍのＰＥＳフィルターを用いてＡＤＣ溶液を滅菌ろ過した。
【0129】
ｍＡｂ３ｂの部位特異的結合プロトコル
ｍＡｂ３ｂの溶液（１００ｍＭヒスチジン、ｐＨ５中の１０～１２ｍｇ／ｍＬ）に、ｄｉＰＰＢＳ（１０ｍＭの水溶液、１６～３２当量）を加え、得られた混合物を室温で一晩インキュベートした。過剰のｄｉＰＰＢＳを、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、ｐＨ６を使用して、Vivaspin遠心分離濃縮器（カットオフ分子量３０ｋＤａ、ＰＥＳ）で除去した。ＤＭＡを加え、リンカー－薬物の溶液（１０ｍＭのＤＭＡ溶液）を加えた。最終的なＤＭＡの濃度は１０％であった。得られた混合物を、遮光下、室温で一晩インキュベートした。過剰のリンカー－薬物を除去するために活性炭を加え、混合物を室温で１時間インキュベートした。０．２μｍのＰＥＳフィルターを使用して活性炭を除去し、得られたＡＤＣを、Vivaspin遠心分離濃縮器（カットオフ分子量３０ｋＤａ、ＰＥＳ）を使用して、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、ｐＨ６中で製剤化した。最後に、０．２２μｍのＰＥＳフィルターを用いてＡＤＣ溶液を滅菌ろ過した。
ｍＡｂ３ｂの溶液（１００ｍＭヒスチジン、ｐＨ５中の１０～１２ｍｇ／ｍＬ）に、ｄｉＰＰＢＳ（１０ｍＭの水溶液、１６～３２当量）を加え、得られた混合物を室温で一晩インキュベートした。過剰のｄｉＰＰＢＳを、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、ｐＨ６を使用して、Vivaspin遠心分離濃縮器（カットオフ分子量３０ｋＤａ、ＰＥＳ）で除去した。ＤＭＡを加え、リンカー－薬物の溶液（１０ｍＭのＤＭＡ溶液）を加えた。最終的なＤＭＡの濃度は１０％であった。得られた混合物を、遮光下、室温で一晩インキュベートした。過剰のリンカー－薬物を除去するために活性炭を加え、混合物を室温で１時間インキュベートした。０．２μｍのＰＥＳフィルターを使用して活性炭を除去し、得られたＡＤＣを、Vivaspin遠心分離濃縮器（カットオフ分子量３０ｋＤａ、ＰＥＳ）を使用して、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、ｐＨ６中で製剤化した。最後に、０．２２μｍのＰＥＳフィルターを用いてＡＤＣ溶液を滅菌ろ過した。
【0130】
ＡＤＣのin vitro細胞毒性
図２において抗体ｍＡｂ３ｂ及び抗体薬物複合体ＡＤＣ３ｂが示すように、ｃ－Ｍｅｔ発現MKN45細胞に対する結合親和性は、結合していない抗体及びＡＤＣで同等であった（２回の二重で行った実験の平均±標準誤差）。したがって、ＡＤＣの抗原結合特性は、結合しているデュオカルマイシン誘導体リンカー－薬物の影響を受けなかった。
図２において抗体ｍＡｂ３ｂ及び抗体薬物複合体ＡＤＣ３ｂが示すように、ｃ－Ｍｅｔ発現MKN45細胞に対する結合親和性は、結合していない抗体及びＡＤＣで同等であった（２回の二重で行った実験の平均±標準誤差）。したがって、ＡＤＣの抗原結合特性は、結合しているデュオカルマイシン誘導体リンカー－薬物の影響を受けなかった。
【0131】
キメラ及びヒト化抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣ（表６）のin vitro細胞毒性を、ｃ－Ｍｅｔの発現がさまざまなレベルのヒト腫瘍細胞株で決定した。完全増殖培地中の細胞を、以下の細胞密度で、９６ウェルプレートに播種（９０又は８０μＬ／ウェル）し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした：ウェルあたり２５００個のMKN-45細胞、１０００個のPC-3細胞、２５００個のNCI-H596細胞及び５０００個のMDA-MB-175-VII細胞。一晩インキュベートした後、１０μＬのＡＤＣ、又は１０μＬのＡＤＣと１０μＬのＨＧＦ（５００ｎｇ／ｍＬ）を加えた。培地を使用してＡＤＣの段階希釈物を調製した。６日後に、CellTiter-Glo（登録商標）（ＣＴＧ）発光アッセイキット（Promega Corporation, Madison, WI）を使用して、製造業者の指示に従い、細胞生存率を評価した。ＡＤＣそれぞれの濃度における発光の実測値を、未処理細胞（増殖培地のみ）の平均値で割り、１００をかけることで、生存率を計算した。
【0132】
結果を表７に示す。予想されたように、結合していない対照ＡＤＣ（リツキシマブ－vc-seco-ＤＵＢＡ）は、高濃度においてのみｃ－Ｍｅｔ発現腫瘍細胞の増殖に影響を及ぼした。全ての抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣは、ｃ－Ｍｅｔ陰性ヒト腫瘍細胞株であるMDA-MB-175-VIIに対して不活性（ＩＣ５０＞１０ｎＭ）であった。
【0133】
さまざまな細胞株で、ＨＣ－４１Ｃヒト化抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣの効果に有意な差はなかった。ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）は、PC-3細胞に対する細胞毒性に影響を及ぼさなかった。ＨＧＦで刺激されたNCI-H596細胞における有効性は、ＨＧＦで刺激されていないNCI-H596細胞と同じレベルであった。５０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦで刺激されたNCI-H596細胞では、ＨＧＦを含まない細胞と比較して、増殖が誘導された。ＨＧＦは細胞毒性を誘導しなかった。
【0134】
【表6】
【0135】
【表7】
【0136】
別の実験で、ＡＤＣ３ｂのin vitro細胞傷害性を、ｃ－Ｍｅｔの発現がさまざまなレベルのヒト腫瘍細胞株で決定した。完全増殖培地中の細胞を、以下の細胞密度で、３８４ウェルプレートに播種（４５μＬ／ウェル）し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした：ウェルあたり６５０個のMKN-45細胞、６００個のEBC-1細胞、２５０個のPC-3細胞、４００個のKP-4細胞、２０００個のNCI-H441細胞、２５００個のHep-G2細胞、４０００個のA2780細胞、１５００個のHCC-1954細胞及び６００個のJurkat NucLight Red細胞。一晩インキュベーションした後、５μＬのＡＤＣ３ｂを加えた。培地を使用してＡＤＣの段階希釈物を調製した。６日後に、蛍光ベースのPrestoBlue（登録商標）Cell Viability Reagent（Invitrogen, ThermoFisher Scientific, USA）及び蛍光ベースのCyQUANT（登録商標）Cell Proliferation Assay（Invitrogen, ThermoFisher Scientific, USA）を使用して、製造業者の指示に従い、細胞生存率を評価した。各ＡＤＣの濃度における発光の実測値を、未処理細胞（増殖培地のみ）の平均値で割り、１００をかけることで、生存率を計算した。
【0137】
いずれの方法においても、ＡＤＣ３ｂは、ｃ－Ｍｅｔ発現が高い、中程度及び低いヒト腫瘍細胞株において細胞傷害性を誘導することが示された（図３は、CyQUANT（登録商標）細胞増殖アッセイの結果を示す）。細胞生存率を、図３に、２回の三重で行った実験の平均±標準誤差として表す。結合していない対照では、細胞毒性は観察されなかった。ｃ－Ｍｅｔ陰性A2780細胞（細胞あたり約３５個のｃＭｅｔ抗原結合部位）又はJurkat NucLight Red細胞（ｃ－Ｍｅｔ抗原結合部位なし）のＡＤＣ３ｂでは、細胞毒性は観察されなかった。
【0138】
ＡＤＣのバイスタンダー細胞毒性
バイスタンダー細胞毒性を、ｃ－Ｍｅｔ陽性MKN45細胞と１：１で共培養したｃ－Ｍｅｔ陰性Jurkat NucLight Red細胞で決定した。各細胞型（比１：１）の５０００細胞／ウェルを、それぞれの培地に入れ、事前にポリ-L-オルニチン（０．１ｍｇ／ｍＬ、Sigma）で被覆した９６ウェルプレートに加えた。３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした後、１μｇ／ｍＬのＡＤＣ３ｂ又は結合していない対照ＡＤＣ（リツキシマブ－vc-seco-ＤＵＢＡ）１０μＬを加えた。共培養したｃ－Ｍｅｔ陰性Jurkat NucLight Red細胞の増殖の生細胞分析は、６日間、６時間ごとにIncuCyte（登録商標）S3機器でプレートを撮像し、１ウェルあたり４枚の画像について、１０倍対物レンズで位相と蛍光をスキャンすることで評価した。
バイスタンダー細胞毒性を、ｃ－Ｍｅｔ陽性MKN45細胞と１：１で共培養したｃ－Ｍｅｔ陰性Jurkat NucLight Red細胞で決定した。各細胞型（比１：１）の５０００細胞／ウェルを、それぞれの培地に入れ、事前にポリ-L-オルニチン（０．１ｍｇ／ｍＬ、Sigma）で被覆した９６ウェルプレートに加えた。３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした後、１μｇ／ｍＬのＡＤＣ３ｂ又は結合していない対照ＡＤＣ（リツキシマブ－vc-seco-ＤＵＢＡ）１０μＬを加えた。共培養したｃ－Ｍｅｔ陰性Jurkat NucLight Red細胞の増殖の生細胞分析は、６日間、６時間ごとにIncuCyte（登録商標）S3機器でプレートを撮像し、１ウェルあたり４枚の画像について、１０倍対物レンズで位相と蛍光をスキャンすることで評価した。
【0139】
ＡＤＣ３ｂは、ｃ－Ｍｅｔを発現しない隣接細胞でバイスタンダー殺傷効果を誘導できる（図４）。
【0140】
雌ces1c KOマウスの胃MKN-45腫瘍皮下異種移植モデルにおけるin vivoキメラ抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の評価
キメラ抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣのin vivoでの有効性を、B6.Ces1ctm1.1 Loc.Foxn1nuマウスのMKN-45（胃腺癌）細胞株異種移植モデルで評価した。このマウスはCes1c遺伝子のエクソン５を欠き、酵素の機能が消失している。この細胞株ではＭＥＴ遺伝子が増幅され；免疫組織化学染色により、細胞表面におけるｃ－Ｍｅｔの高発現が確認された。
キメラ抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣのin vivoでの有効性を、B6.Ces1ctm1.1 Loc.Foxn1nuマウスのMKN-45（胃腺癌）細胞株異種移植モデルで評価した。このマウスはCes1c遺伝子のエクソン５を欠き、酵素の機能が消失している。この細胞株ではＭＥＴ遺伝子が増幅され；免疫組織化学染色により、細胞表面におけるｃ－Ｍｅｔの高発現が確認された。
【0141】
３０Ｇ針付きシリンジを使用して、１：１のＰＢＳ：マトリゲル、２００μＬ中の５×１０６個のMKN-45腫瘍細胞を、全てのマウスの左脇腹の皮下に注射することで、腫瘍を誘導した。動物の体重を週に３回測定した。原発腫瘍をキャリパーで測定し、腫瘍体積を式Ｗ２×Ｌ／２（Ｌ＝腫瘍の長さ、Ｗ＝腫瘍の垂直幅、Ｌ＞Ｗ）で計算した。原発腫瘍が約１００ｍｍ３に達した後、動物を、腫瘍体積に従い処置群全体で無作為化し、同日又は翌日に、１０ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ１（ＤＡＲ１．５）、ＡＤＣ２（ＤＡＲ１．７）又はＡＤＣ３（ＤＡＲ１．１）を単回注射した。移植の当日又は翌日にマウスに投与した。
【0142】
図５に示すように、試験を行った３種全てのキメラＡＤＣの抗腫瘍活性は有意であった。
【0143】
雌ces1c KOマウスの胃MKN-45腫瘍皮下異種移植モデルにおけるin vivoヒト化抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の評価
ヒト化抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣのin vivoでの有効性を、B6.Ces1ctm1.1 Loc.Foxn1nuマウスのMKN-45（胃腺癌）細胞株異種移植モデルで、これまでに説明したプロトコルにより評価した。
ヒト化抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣのin vivoでの有効性を、B6.Ces1ctm1.1 Loc.Foxn1nuマウスのMKN-45（胃腺癌）細胞株異種移植モデルで、これまでに説明したプロトコルにより評価した。
【0144】
原発腫瘍が約１００ｍｍ３に達した後、動物を、腫瘍体積に従い処置群全体で無作為化し、無作為化当日又は翌日に、ＡＤＣ１に由来するＡＤＣ１ａ、ＡＤＣ２に由来するＡＤＣ２ａ，ＡＤＣ２ｂ及びＡＤＣ２ｃ、並びに、ＡＤＣ３に由来するＡＤＣ３ａ，ＡＤＣ３ｂ，ＡＤＣ３ｃ，ＡＤＣ３ｄ及びＡＤＣ３ｅを単回注射した。
【0145】
図６に示すように、ＡＤＣ３で使用されたキメラｍＡｂに由来するヒト化抗体を有するＡＤＣの抗腫瘍活性が、最も高かった。
【0146】
患者由来乳がん異種移植モデルMAXF574におけるヒト化抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の抗腫瘍有効性の評価
３種のヒト化抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣ（ＡＤＣ３ａ、ＡＤＣ３ｂ、ＡＤＣ３ｃ）のin vivoでの有効性を、B6-Ces1ctm1.1 Loc.CB17 Prkdcscidマウス系統における患者由来浸潤性乳管がんMAXF574の異種移植モデルで評価した。このマウスは、Ces1c遺伝子のエクソン５を欠き、酵素の機能が消失している。この腫瘍ではＭＥＴ遺伝子は増幅されず；免疫組織化学的染色により、細胞表面におけるｃ－Ｍｅｔの中程度から高度の発現が確認された。
３種のヒト化抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣ（ＡＤＣ３ａ、ＡＤＣ３ｂ、ＡＤＣ３ｃ）のin vivoでの有効性を、B6-Ces1ctm1.1 Loc.CB17 Prkdcscidマウス系統における患者由来浸潤性乳管がんMAXF574の異種移植モデルで評価した。このマウスは、Ces1c遺伝子のエクソン５を欠き、酵素の機能が消失している。この腫瘍ではＭＥＴ遺伝子は増幅されず；免疫組織化学的染色により、細胞表面におけるｃ－Ｍｅｔの中程度から高度の発現が確認された。
【0147】
腫瘍断片を、ヌードマウスで連続継代した異種移植片から得た。ドナーマウスから取り出した後、腫瘍を断片化（エッジ長３～４ｍｍ）し、１０％のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＰＢＳに入れた。レシピエント動物をイソフルランの吸入により麻酔し、側腹部の片側の皮下に腫瘍片を移植した。腫瘍の増殖を週に２回モニターした。腫瘍体積を、デジタルキャリパーによる二次元測定で求めた。腫瘍体積は、式（ｌ×ｗ２）×０．５（ｌ＝腫瘍の長さ、ｗ＝腫瘍の幅（ｍｍ））で計算した。移植した腫瘍の体積が目標とする８０～２５０ｍｍ３に近づいたとき、群の腫瘍体積の中央値及び平均値が同等になるように、マウスを処置群全体で無作為化した。同日又は翌日に、３ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ３ａ、ＡＤＣ３ｂ又はＡＤＣ３ｃを、マウスに単回注射した。溶媒のみ及び結合していない対照ＡＤＣを含めた。図７に示されるように、結合していない対照ＡＤＣは、ある程度の抗腫瘍活性を示し、これはバイスタンダー活性を示している。３種の抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣは、付加的な標的媒介抗腫瘍活性を示した。検討した３種のＡＤＣの中で、ＡＤＣ３ｂの抗腫瘍活性が最も高かった。
【0148】
患者由来のがん（LXFL1176（肺）及びHNXF1905（頭頸部））異種移植モデルにおけるＡＤＣ３ｂの用量応答実験
用量応答実験を、２種の患者由来異種移植モデル：1) リンパ節転移に由来する大細胞がんのLXFL1176、及び 2) 眼窩上領域に由来する原発性扁平上皮がんのHNXF1905、で行った。これまでに説明したプロトコルにより、腫瘍の外植片をB6-Ces1ctm1.1 Loc.CB17 Prkdcscidマウスに移植した。ＭＥＴ遺伝子は、いずれの腫瘍内でも増幅されていない；免疫組織化学染色により、LXFL1176モデルでは細胞表面におけるｃ－Ｍｅｔの高発現が確認され、HNXF1905モデルでは中等度の発現が確認された。
用量応答実験を、２種の患者由来異種移植モデル：1) リンパ節転移に由来する大細胞がんのLXFL1176、及び 2) 眼窩上領域に由来する原発性扁平上皮がんのHNXF1905、で行った。これまでに説明したプロトコルにより、腫瘍の外植片をB6-Ces1ctm1.1 Loc.CB17 Prkdcscidマウスに移植した。ＭＥＴ遺伝子は、いずれの腫瘍内でも増幅されていない；免疫組織化学染色により、LXFL1176モデルでは細胞表面におけるｃ－Ｍｅｔの高発現が確認され、HNXF1905モデルでは中等度の発現が確認された。
【0149】
無作為化の当日又は翌日に、マウスに、０．３、１、３又は１０ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ３ｂを単回注射した。溶媒のみ及び結合していないアイソタイプ対照ＡＤＣを含めた。結合していない対照ＡＤＣは、抗腫瘍活性をほとんど又は全く示さず、このことは、これらのモデルでは、バイスタンダー活性がほとんどないことを示している。いずれのモデルでも、用量依存的な抗腫瘍活性が実証された。頭頸部がんＰＤＸモデルHNXF1905におけるＡＤＣ３ｂの有効性を図８Ａに示し、肺がんＰＤＸモデルLXFL1176における有効性を図８Ｂに示す。
【0150】
カニクイザルにおけるin vivo毒性実験
ＡＤＣ３ｂのin vivo毒性を、オス及びメスのカニクイザルで評価した。サル（１群につき雄５匹＋雌５匹）にＡＤＣ３ｂを投与（５、１５又は２５ｍｇ／ｋｇを３週間に１回、静脈内注入）した。
ＡＤＣ３ｂのin vivo毒性を、オス及びメスのカニクイザルで評価した。サル（１群につき雄５匹＋雌５匹）にＡＤＣ３ｂを投与（５、１５又は２５ｍｇ／ｋｇを３週間に１回、静脈内注入）した。
【0151】
カニクイザルでの４サイクルの重要な毒性及びＰＫ試験におけるＡＤＣ３ｂの毒性プロファイルは、多くのさまざまな正常組織がｃ－Ｍｅｔを発現していることを考慮すると、著しく軽度であった。カニクイザル及びヒトｃ－ＭｅｔへのＡＤＣ３ｂの結合は、（これまでに示したように）同等である。これらの正常な組織ではｃ－Ｍｅｔリン酸化が観察されないので、これらの組織ではｃ－Ｍｅｔは活性化されないことに留意すべきである。ｃ－Ｍｅｔは広範に発現しているにもかかわらず、ＡＤＣ３ｂの忍容性は驚くべきものである。ＡＤＣ３ｂの重篤な毒性が発現しない最大投与量（ＨＮＳＴＤ）は、３週間に１回の１５ｍｇ／ｋｇと推定される。ＡＤＣの毒性効果の多くが標的を発現する（正常な）組織において観察される（Masson Hinrichs and Dixit, AAPS J. 2015, 17, 1055-1064）ことを考慮すると、ｃ－Ｍｅｔを標的とするＡＤＣであるＡＤＣ３ｂの忍容性が非常に優れていることは驚くべきことである。
【0152】
in vivo ＰＫＰＤ実験
腫瘍を有するCES1c KO SCIDマウスにおいて、抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣであるＡＤＣ３ｂの薬物動態／薬力学実験を行った。このマウスは、Ces1c遺伝子のエクソン５を欠き、酵素の機能が消失している。更なる薬物動態データは、カニクイザルにおけるＡＤＣ３ｂの毒性実験から得た。
腫瘍を有するCES1c KO SCIDマウスにおいて、抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣであるＡＤＣ３ｂの薬物動態／薬力学実験を行った。このマウスは、Ces1c遺伝子のエクソン５を欠き、酵素の機能が消失している。更なる薬物動態データは、カニクイザルにおけるＡＤＣ３ｂの毒性実験から得た。
【0153】
マウスにＡＤＣ３ｂを投与（０．３、１、３又は１０ｍｇ／ｋｇ、静脈内（i.v.）ボーラス注射）し、投与の１、４８、１６８、３３６、５０４時間後に血漿を採取した。サルにＡＤＣ３ｂを投与（５、１５又は２５ｍｇ／ｋｇ、静脈内注入）し、１、６、２４、４８、９６、１９２、３６０、５０４時間で血漿を採取した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳに基づくアッセイにより総抗体を定量し、リガンド結合アッセイにより結合した抗体を定量した。結合した抗体のアッセイは、少なくとも１つのリンカー－薬物を有するＡＤＣを捕捉する。表８、９（マウス）及び１０（サル）に示す結果は、ＡＤＣが非常に安定であり、半減期が長く、ゆっくりと除去されることを示す。
【0154】
【表8】
【0155】
【表9】
【0156】
【表10】
【0157】
【化11】
【0158】
【化12】
【0159】
【化13-1】
【化13-2】
【0160】
【化14-1】
【化14-2】
【図1】
【図2】
【図3】
【図3-1】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】