特表 2024-515290 癌治療用アデノウイルス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-08

(54)【発明の名称】癌治療用アデノウイルス

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/31 20060101AFI20240401BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20240401BHJP

   A61K 35/768 20150101ALI20240401BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240401BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240401BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240401BHJP

   C12N 15/34 20060101ALI20240401BHJP

【ＦＩ】

C12N15/31

A61K35/761

A61K35/768

A61P35/00

A61P35/02

C12N7/01 ZNA

C12N15/34

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023562882

(86)(22)【出願日】2022-04-21

(85)【翻訳文提出日】2023-10-19

(86)【国際出願番号】 SE2022050389

(87)【国際公開番号】W WO2022225441

(87)【国際公開日】2022-10-27

(31)【優先権主張番号】2150511-0

(32)【優先日】2021-04-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522408647

【氏名又は名称】エリセラ セラピューティクス アクチエボラグ

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ユー，ディ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

(57)【要約】

本発明は、ヘリコバクターピロリ好中球活性化蛋白質（ＮＡＰ）をコードする核酸配列および／またはＮＡＰの免疫学的に同等な断片をコードする核酸配列ならびに対象において免疫応答を誘導可能な免疫調節因子をコードする核酸配列を含むアデノウイルスに関する。このアデノウイルスは、腫瘍増殖の遅延および生存の延長に関して臨床効果を増強する。
【選択図】図８

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヘリコバクターピロリ好中球活性化蛋白質（ＮＡＰ）をコードする核酸配列および／またはＮＡＰの免疫学的に同等な断片をコードする核酸配列；
および
対象において免疫応答を誘導可能な免疫調節因子をコードする核酸配列、
を含むアデノウイルスであって、
ここで該ＮＡＰの免疫学的に同等な断片がＮＡＰの少なくとも２０アミノ酸残基の少なくとも１種類のポリペプチドドメインを含む断片である、
アデノウイルス。

【請求項2】

請求項１のアデノウイルスであって、ここで該免疫調節因子が、該対象において樹状細胞（ＤＣ）成熟、Ｔ細胞活性化および／またはＮＫ細胞活性化を誘導可能な、アデノウイルス。

【請求項3】

請求項２のアデノウイルスであって、ここで該免疫調節因子が、該対象においてＤＣ成熟、Ｔ細胞活性化およびＮＫ細胞活性化を誘導可能な、アデノウイルス。

【請求項4】

請求項２または３のアデノウイルスであって、ここで該免疫調節因子が、樹状細胞による分化８０（ＣＤ８０）、ＣＤ４０、ＣＤ８６およびＣ－Ｃケモカイン受容体７型（ＣＣＲ７）のクラスターの発現を誘導可能な、アデノウイルス。

【請求項5】

請求項２～４のいずれか１項に記載されるアデノウイルスであって、ここで該免疫調節因子が、ＣＤ４＋ Ｔ細胞活性化および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導可能な、アデノウイルス。

【請求項6】

請求項５のアデノウイルスであって、ここで該免疫調節因子が、ＣＤ４＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞による分化６９（ＣＤ６９）およびＣＤ１０７ａのクラスターの発現を誘導可能な、アデノウイルス。

【請求項7】

請求項２～６のいずれか１項に記載されるアデノウイルスであって、ここで該免疫調節因子が、ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞の活性化を誘導可能な、アデノウイルス。

【請求項8】

請求項７のアデノウイルスであって、ここで該免疫調節因子が、ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞による分化６９（ＣＤ６９）およびＣＤ１０７ａのクラスターの発現を誘導可能な、アデノウイルス。

【請求項9】

請求項１～８のいずれかに記載されるアデノウイルスであって、ここで該免疫調節因子が腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）メンバーである、アデノウイルス。

【請求項10】

請求項９のアデノウイルスであって、ここで該ＴＮＦＳＦメンバーが、ＴＮＦＳＦ１、ＴＮＦＳＦ２、ＴＮＦＳＦ４、ＴＮＦＳＦ５、ＴＮＦＳＦ７、ＴＮＦＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１８およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、アデノウイルス。

【請求項11】

請求項１０のアデノウイルスであって、ここで該ＴＮＦＳＦメンバーが、ＴＮＦＳＦ５、ＴＮＦＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１８およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、アデノウイルス。

【請求項12】

請求項１１のアデノウイルスであって、ここで該ＴＮＦＳＦメンバーが、ＴＮＦＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１８およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、アデノウイルス。

【請求項13】

請求項１～１２のいずれかに記載されるアデノウイルスであって、ここで該ＮＡＰの免疫学的に同等な断片が、ＮＡＰの少なくとも３０アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも４０アミノ酸残基の少なくとも１種類のポリペプチドドメインを含む断片である、アデノウイルス。

【請求項14】

請求項１～１３のいずれかに記載されるアデノウイルスであって、ここで該ＮＡＰの免疫学的に同等な断片が、配列番号：１１～１４から成る群から選択される、アデノウイルス。

【請求項15】

請求項１～１４のいずれかに記載されるアデノウイルスであって、ＮＡＰおよび／またはＮＡＰの免疫学的に同等な断片をコードする核酸配列と該免疫調節因子をコードする核酸配列との間に位置する自己開裂ペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、アデノウイルス。

【請求項16】

請求項１５のアデノウイルスであって、ここで該自己開裂ペプチドが、配列番号：１６～２３から成る群から選択される、アデノウイルス。

【請求項17】

請求項１～１６のいずれかに記載されるアデノウイルスであって、ここで該アデノウイルスが腫瘍溶解性アデノウイルスである、アデノウイルス。

【請求項18】

請求項１７のアデノウイルスであって、ここで該腫瘍溶解性アデノウイルスが、野生型Ｅ１Ａ蛋白質と比較して、より低いＲｂ蛋白質結合能を有する変異Ｅ１Ａ蛋白質をコードする変異アデノウイルス初期領域１Ａ（Ｅ１Ａ）遺伝子を含む、アデノウイルス。

【請求項19】

請求項１８のアデノウイルスであって、ここで該変異Ｅ１Ａ遺伝子が、野生型Ｅ１Ａ遺伝子のヌクレオチド９１９～９４３に相当する２４ｂｐの欠失を含む、アデノウイルス。

【請求項20】

請求項１８または１９のアデノウイルスであって、ここで該変異Ｅ１Ａ蛋白質が、野生型Ｅ１Ａ蛋白質の１２１～１２８のアミノ酸を欠如する、アデノウイルス。

【請求項21】

請求項１～２０のいずれかに記載されるアデノウイルスであって、ここで
１９ｋＤａのアデノウイルスＥ１Ｂ蛋白質および５５ｋＤａのアデノウイルスＥ１Ｂ蛋白質をコードする核酸配列の一方が、ＮＡＰをコードする核酸配列および／またはＮＡＰの免疫学的に同等な断片をコードする核酸配列で置換され；
および
１９ｋＤａのアデノウイルスＥ１Ｂ蛋白質および５５ｋＤａのアデノウイルスＥ１Ｂ蛋白質をコードする核酸配列の他方が、該免疫調節因子をコードする核酸配列で置換されている、アデノウイルス。

【請求項22】

請求項１～２１のいずれかに記載されるアデノウイルスであって、ここで該アデノウイルスがヒトアデノウイルス５型である、アデノウイルス。

【請求項23】

請求項１～２２のいずれかに記載されるアデノウイルスであって、治療薬剤として用いられるアデノウイルス。

【請求項24】

請求項１～２２のいずれかに記載されるアデノウイルスであって、癌治療に用いられるアデノウイルス。

【請求項25】

請求項２４の用途のアデノウイルスであって、ここで該癌が、癌腫（膵癌、乳癌、肺癌、肝臓癌、または腎臓癌など）；肉腫（骨肉腫または脂肪肉腫など）；リンパ腫（非ホジキンリンパ腫またはホジキンリンパ腫など）；白血病（急性白血病または慢性白血病など）；精上皮腫；胚細胞腫；未分化胚細胞腫；および芽細胞腫（膠芽細胞腫または神経芽細胞腫など）から成る群から選択される、アデノウイルス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は一般に、アデノウイルス、特に癌治療に有用な組換えアデノウイルスに関するものである。

【背景技術】

【0002】

現在の癌治療は主に、化学療法、放射線療法および／または外科手術に基づくものである。初期段階の癌では治癒率が上昇するが、多くの進行癌は治療不能である；その理由は、外科的根治が不可能である、または放射線療法または化学療法では、正常細胞に対する毒性のために、実施の際に線量または用量が限定されるためである。

【0003】

従来の癌治療の代替として、あるいは補完するものとして、腫瘍溶解性ウイルスを利用するウイルス療法が提案されている。ウイルス療法では、腫瘍細胞で選択的に複製および増殖することができる腫瘍溶解性ウイルスが用いられる。これにより、これらの腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞に選択的に感染してそれを溶解させる；放出子孫ウイルス粒子は隣接する腫瘍細胞に再感染し、さらに一部は血流に入って転移腫瘍細胞に感染する。

【0004】

腫瘍溶解性ウイルスを用いるウイルス療法は、２種類の主要な要件を満たす必要がある：すなわち、選択性および効力である。正常細胞における複製に必要なウイルス機能であって、腫瘍細胞での複製には不要なウイルス機能を除去すること、腫瘍選択的プロモーターを用いることにより、複製を開始するウイルス遺伝子を制御すること、および宿主細胞の感染に関与するウイルスカプシド蛋白質を修飾することなど、腫瘍細胞に対する選択性を獲得する方略として異なる複数の提案がある。

【0005】

しかし、腫瘍溶解性ウイルスによって開始する抗腫瘍免疫応答は、一般的に臨床症状に良好な治療効果をもたらすには不充分である、すなわち、効力が低すぎると考えられる。このような状況であるため、腫瘍溶解性ウイルスの効力増強を目的として、腫瘍溶解性ウイルスのゲノムに治療遺伝子を挿入することが示唆されているのである。当該技術分野において、上記のような治療遺伝子として様々なものが提案されているが、その例としては、例えば、バイスタンダー効果を有するプロドラッグの活性化、腫瘍に対する免疫系の活性化、アポトーシスの誘導、および血管形成阻害などに関するものが挙げられる。

【0006】

Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎら、「神経内分泌腫瘍に対して治療効果を有するヘリコバクターピロリ好中球活性化蛋白質を分泌する感染増強性腫瘍溶解性アデノウイルス（Ａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ－ｅｎｈａｎｃｅｄ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｔｕｍｏｒｓ）」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ （２０１３） ２１（１１）： ２００８－２０１８、およびＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎら、「ベクターにコードされるヘリコバクターピロリ好中球活性化蛋白質は、Ｔｈ１分極化を伴う樹状細胞の成熟および遊走改善を促進する（Ｖｅｃｔｏｒ－ｅｎｃｏｄｅｄ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ Ｔｈ１ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）」、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （２０１４） １９３（５）：２２８７－２２９６；これら２つの文献は、分泌性好中球活性化蛋白質（ＮＡＰ）を有する複製選択的感染増強性アデノウイルスについて開示している。ＮＡＰアデノウイルスは、マウスにおいて樹状細胞 （ＤＣ）の成熟および遊走を促進し、生存中央値を改善した。Ｚｈａｎｇら、「ＨＣＣにおいて、可溶性融合蛋白質ＰＤ－１／ＣＤ１３７Ｌを発現する組み換えアデノウイルスはＣＤ８＋ Ｔ細胞のサプレッションを阻害する（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＤ－１／ＣＤ１３７Ｌ ｓｕｂｖｅｒｔｓ ｔｈｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＨＣＣ）」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ （２０１９） ２７（１１）：１９０６－１９１８は、組換えアデノウイルスが腫瘍再移植に対する腫瘍特異的全身性保護を誘導したことを開示している。

【0007】

腫瘍溶解性ウイルスの効力を改善する必要性が依然として存在するのである。

【発明の概要】

【0008】

本発明の一般的な目標は、癌治療において治療効果を有するアデノウイルスを提供することである。

【0009】

この目的およびその他の目的は、本明細書に開示の実施態様によって達成される。

【0010】

本発明は独立形式請求項において規定される。本発明のさらなる実施態様は従属形式請求項において規定される。

【0011】

本発明の一局面は、ヘリコバクターピロリ好中球活性化蛋白質（ＮＡＰ）をコードする核酸配列および／またはＮＡＰの免疫学的に同等な断片をコードする核酸配列を含むアデノウイルスに関するものである。ＮＡＰの免疫学的に同等な断片は、ＮＡＰの少なくとも２０アミノ酸残基の少なくとも１種類のポリペプチドドメインを含む断片である。該アデノウイルスはまた、対象において免疫応答を誘導可能な免疫調節因子をコードする核酸配列を含む。

【0012】

本発明のさらなる局面は、治療薬剤として癌治療に用いる上記のアデノウイルスに関するものである。

【0013】

実施態様の組換えアデノウイルスは、腫瘍増殖を有意に阻害すること、および腫瘍移植後の対象の生存を大幅に延長することに関して治療効果が増強されている。この治療効果増強は、ＮＡＰおよび／またはその免疫学的に同等な断片ならびに免疫調節因子を共発現するアデノウイルスを工学的に作成することによって達成される。ＮＡＰと免疫調節因子の組み合わせによって、該アデノウイルスが癌細胞の免疫原性細胞死を誘導することを可能にし、さらに癌に罹患した対象に投与した場合、樹状細胞の誘導性成熟ならびにＴ細胞およびＮＫ細胞の活性化を可能にした。

【0014】

実施態様ならびにさらなるその目的および利点については、添付図面と併せて以下の説明を参照することによって最良の理解が得られるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】実施例に用いたアデノウイルス構築物を模式的に示すものであり、その遺伝子配置および遺伝子部位を示している。

【図2】異なる感染多重度（ＭＯＩ）で各種の組換えアデノウイルスに感染させた後のＰａｎｃ０１細胞およびＭｉａＰａＣａ－２細胞の相対細胞生存率を示している。細胞生存率は、感染から４日後（感染後＝ｄ．ｐ．ｉ）に測定し、非感染対照細胞に対する割合（％）で示す。

【図3】Ｐａｎｃ０１細胞およびＭｉａＰａＣａ－２細胞における組換えウイルスの複製を示す。異なるウイルスを用いてＭＯＩ＝５０で細胞に形質導入した。形質導入後０、１、２、および３日目に、ウイルスゲノムＤＮＡを単離し、リアルタイムＰＣＲを用いて定量した。数値は、標準曲線に基づいて算出されたウイルスゲノムコピー数を示している。データは、三重試料の平均±標準偏差（ＳＤ）で表したものである。

【図4】Ｐａｎｃ０１細胞およびＭｉａＰａＣａ－２細胞への形質導入から２日後における導入遺伝子ＴＮＦＳＦ９またはＴＮＦＳＦ１８の発現レベルを示す。発現レベルは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として報告された。

【図5】ウイルス形質導入から２日後のカルレティキュリン（ＣＲＴ）の細胞表面への露出およびＡＴＰの放出を示す。ＣＲＴはフローサイトメトリーで測定しＭＦＩで表した；ＡＴＰはＡＴＰ測定キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて測定しアーティフィシャル（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ）単位（ａ．ｕ．）で示された。

【図6】未成熟ＤＣをウイルス－形質導入細胞と共に１８時間共培養した後に、フローサイトメトリーで分析しＭＦＩで表したヒト樹状細胞（ＤＣ）成熟マーカー（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＣＲ７）の発現レベルを示す。

【図7A】異なるウイルスで腫瘍内処置してから３日後に、フローサイトメトリーで分析しＭＦＩで表した腫瘍浸潤性ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、およびＣＤ５６＋ ＮＫ細胞の成熟マーカー（ＣＤ６９およびＣＤ１０７ａ）の発現レベルを示す。

【図7B】異なるウイルス処置マウスから回収した脾細胞、およびＰａｎｃ０２細胞で再刺激した脾細胞のＩＦＮ－γ放出を示す。

【図8】異なるアデノウイルスで処置した後の皮下Ｐａｎｃ０２腫瘍増殖およびマウス生存を示す。

【図9】免疫不全マウスにおける皮下Ｐａｎｃ０１腫瘍（ヒト異種移植片）増殖および処置後のマウス生存を示す。

【図10】マウスにおける皮下ＮＳＸ２腫瘍増殖および処置後のマウス生存を示す。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明は一般に、アデノウイルス、特に癌治療に有用な組換えアデノウイルスに関するものである。

【0017】

実施態様の組換えアデノウイルスは、腫瘍増殖を有意に阻害すること、および腫瘍移植後の対象の生存を大幅に延長することに関して治療効果が増強されている。この治療効果増強は、アデノウイルスを対象に投与した場合に該対象において免疫応答を誘導可能な免疫調節因子をコードする核酸配列と組み合わせて、ヘリコバクターピロリ好中球活性化蛋白質（ＮＡＰ）をコードする核酸配列および／またはＮＡＰの免疫学的に同等な断片をコードする核酸配列を含むアデノウイルスを工学的に作成することによって達成される。したがって、アデノウイルスは、ＮＡＰおよび／またはその免疫学的に同等な断片、ならびに免疫調節因子をコードする核酸配列を含む組換え体または工学的改変ウイルスである。

【0018】

ＮＡＰをコードする核酸配列を含むアデノウイルスは、「背景技術」の節において言及しているように公知である。しかし、本明細書中に提示されるような実験データ（図８）は、ＮＡＰをコードする核酸配列を含むアデノウイルスであって、免疫調節因子をコードする核酸配列は含まないアデノウイルスは、僅かに腫瘍増殖を阻害し得るが、腫瘍移植後の対象における有意な生存延長をもたらさないことを示している。

【0019】

しかし、ＮＡＰまたはその免疫学的に同等な断片を、別の免疫調節因子と組み合わせることによって、該アデノウイルスの治療効果を有意に改善した（図８）。ウイルスでＮＡＰおよび他の異種遺伝子を共発現することによって、対象に投与した場合に該異種遺伝子の遺伝子産物に対する抗体応答が増強し、それによってそのような抗体応答が遺伝子産物の機能を妨害または阻害することが示されている（Ｉａｎｋｏｖら、「麻疹ウイルスが発現するヘリコバクターピロリ好中球活性化蛋白質は、不良免疫原の免疫原性を有意に増強する（Ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｏｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ）」、Ｖａｃｃｉｎｅ （２０１３） ３１（４２）： ４７９５－４８０１）ので、上記は非常に意外であった。したがって、アデノウイルスにおいて免疫調節因子と共にＮＡＰおよび／またはその免疫学的に活性な断片を共発現させることにより、それを対象に投与した場合には、該対象において該免疫調節因子に対する抗体応答を引き起こすことが予想されるであろう。次いで、該免疫調節因子に対して起こる抗体応答は、該対象において該免疫調節因子の作用を阻害しブロックすると予想される；すなわち、該免疫調節因子によって誘導されるような免疫応答誘導を、該対象において少なくとも有意に妨害または阻害することが予想される。

【0020】

しかし、本明細書中に提示されるような実験データは、アデノウイルスにおけるＮＡＰおよび免疫調節因子の共発現が、該免疫調節因子の免疫応答誘導性機能に負の影響を与えることがなかったことを示している。治療効果の増強に加え、非常に明確に、ＮＡＰおよび／またはその免疫学的に活性な断片ならびに免疫調節因子の共発現は、癌細胞の免疫原性細胞死（ＩＣＤ）を誘導した。

【0021】

ＩＣＤは免疫原性アポトーシスともよばれ、免疫応答の制御性活性化によって引き起こされる細胞死の一形態である。この細胞死はアポトーシス性の形態を特徴とし、膜完全性が維持される。癌細胞の免疫原性細胞死は、樹状細胞（ＤＣ）の活性化およびその結果として起こる特異的Ｔ細胞応答の活性化によって、効果的な抗腫瘍免疫応答を誘起する。したがって、本発明のアデノウイルスによるＩＣＤの誘導は、該アデノウイルスが抗腫瘍療法に非常に効果的であることを意味している。

【0022】

さらに、ＮＡＰ、および／またはその免疫学的に活性な断片、ならびに免疫調節因子を共発現する本発明のアデノウイルスは、ＤＣ成熟およびＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞を含むＴ細胞の活性化、ならびにＣＤ５６＋ ＮＫ細胞を含むナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化を誘導した。さらに、処置した対象の内在性脾細胞もまた腫瘍細胞に反応し、有意な量のインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）を放出したことからも分かるように、本発明のアデノウイルスによる治療は免疫記憶の生成を引き起こした。

【0023】

本発明のアデノウイルスにおけるＮＡＰおよび／またはその免疫学的に活性な断片ならびに免疫調節因子の共発現は、形質導入癌細胞における該免疫調節因子の発現に負の影響を与えなかった。さらに、該アデノウイルスは、癌細胞中で効率的に複製し癌細胞を特異的に殺滅することが可能であった。

【0024】

他で特段に定義されるのでない限り、本明細書で用いられるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解される意味を有するものである。以下の参考文献は、本発明で用いる用語の多くについて一般的定義を提供するものである：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、「微生物学分子生物学辞典（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ）」第３版、改訂版、２００７、ＩＳＢＮ： ９７８０４７００３５４５０； Ｗａｌｋｅｒ、「ケンブリッジ科学技術辞典（Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９９０、ＩＳＢＮ： ９７８０５２１３９４４１３； Ｒｉｅｇｅｒら、「遺伝学の用語：古典的および分子論的用語（Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ： Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）」第５版、１９９１、ＩＳＢＮ： ９７８３５４０５２０５４２； Ｈａｌｅ、「ハーパーコリンズ生物学辞典（ＨａｒｐｅｒＣｏｌｌｉｎｓ ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９１、ＩＳＢＮ： ９７８００６４６１０１５５； Ｌｅｗｉｎ、「遺伝子ＸＩＩ（Ｇｅｎｅ ＸＩＩ）」、２０１７、ＩＳＢＮ： ９７８－１－２８４１－０４４９－３； Ｋｎｉｐｅら、フィールズ・ウイルス学（Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」第６版、２０１３、ＩＳＢＮ： ９７８－１－４５１１－０５６３－６。明瞭のために、本明細書では以下の定義を用いる。

【0025】

用語「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ホスホジエステル結合を介して連結される関連する天然構造のバリアントおよび／またはその合成非天然類似体、関連する天然構造のバリアントおよび／またはその合成非天然類似体などの、ヌクレオチドで構成されるポリマーを指す。そのような核酸配列またはヌクレオチド配列の例としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列およびリボ核酸（ＲＮＡ）配列が挙げられる。特定の一実施態様においては、核酸配列またはヌクレオチド配列はＤＮＡ配列である。

【0026】

本発明の一局面は、ヘリコバクターピロリ好中球活性化蛋白質（ＮＡＰ）をコードする核酸配列および／またはＮＡＰの免疫学的に同等な断片をコードする核酸配列を含むアデノウイルスに関する。該アデノウイルスはまた、対象において免疫応答を誘導可能な免疫調節因子をコードする核酸配列を含む。

【0027】

それによって該アデノウイルスは、免疫調節因子に加え、ＮＡＰおよび／またはその免疫学的に同等な断片を共発現することが可能である。したがって、該免疫調節因子は、ＮＡＰまたはＮＡＰの免疫学的に活性な断片とは異なるものである。

【0028】

該アデノウイルスを対象に投与した場合に、該免疫調節因子は、該対象において免疫応答を誘導することができる。一実施態様においては、該免疫調節因子はＤＣ成熟を誘導することができる。分化８０（ＣＤ８０）（Ｂ７－１ともよばれる）、ＣＤ４０、ＣＤ８６（Ｂ７－２ともよばれる）、およびＣ－Ｃケモカイン受容体型７（ＣＣＲ７）のクラスターを含む成熟マーカーおよび活性化マーカーの表面発現亢進によって示唆されるように、共培養した本発明のアデノウイルスを形質導入した癌細胞は、ＤＣを成熟させ活性化することが可能であった。

【0029】

別の一実施態様においては、該免疫調節因子は、Ｔ細胞活性化、特にＣＤ４＋ Ｔ細胞活性化、ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化、またはＣＤ４＋ Ｔ細胞活性化とＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化の両方を誘導可能である。癌細胞を移植し本発明のアデノウイルスで処置した対象においては、腫瘍浸潤性であるＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴ細胞の活性化が増強した。表面マーカーＣＤ６９およびＣＤ１０７ａ（リソソーム関連膜蛋白質１（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＬＡＭＰ－１）またはリソソーム関連膜蛋白質１（ｌｙｓｏｓｏｍｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １）ともよばれる）の上方制御によって示されるように、該アデノウイルス処置によって、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴ細胞の活性化が起こったのである。

【0030】

さらなる一実施態様においては、該免疫調節因子は、ＮＫ細胞活性化、特にＣＤ５６＋ ＮＫ細胞活性化を誘導することができる。癌細胞を移植し本発明のアデノウイルスで処置した対象においては、腫瘍浸潤性ＮＫ細胞の活性化が増強された。表面マーカーＣＤ６９およびＣＤ１０７ａの上方制御によって示されるように、該アデノウイルス処置によって、これらのＮＫ細胞の活性化が起こる。

【0031】

好ましい実施態様においては、該免疫調節因子はＤＣ成熟およびＴ細胞活性化を誘導することができる；対象において、ＤＣ成熟およびＮＫ細胞活性化を誘導することができる、あるいはＴ細胞活性化およびＮＫ細胞活性化を誘導することができる。現在好ましい一実施態様においては、該免疫調節因子は対象においてＤＣ成熟、Ｔ細胞活性化およびＮＫ細胞活性化を誘導することができる。

【0032】

一実施態様においては、該免疫調節因子は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）のメンバーである。

【0033】

ＴＮＦＳＦは、ＴＮＦ相同性ドメインを含み三量体を形成するＩＩ型膜貫通蛋白質の蛋白質スーパーファミリーである。ＴＮＦＳＦのメンバーは、細胞外蛋白質分解性切断によって細胞膜から放出され、サイトカインとして機能し得る。これらの蛋白質は、専ら免疫細胞によって発現され、免疫応答および炎症のみならず、増殖、分化、アポトーシスおよび胚発生をも含む様々な細胞機能を制御する。

【0034】

一実施態様においては、ＴＮＦＳＦメンバーは、ＴＮＦＳＦ１、ＴＮＦＳＦ２、ＴＮＦＳＦ４、ＴＮＦＳＦ５、ＴＮＦＳＦ７、ＴＮＦＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１８、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される。

【0035】

ＴＮＦＳＦ１は、リンホトキシン－アルファ（ＬＴ－α）またはＴＮＦ－ベータ（ＴＮＦ－β）ともよばれ、腫瘍細胞に対する抗増殖活性を示し、腫瘍細胞において細胞破壊を引き起こす。ＴＮＦＳＦ１は、炎症の誘導および抗ウイルス性応答、２次的なリンパ系臓器の発生、および細胞の生存、増殖、分化およびアポトーシスの制御に関与する。

【0036】

ＴＮＦＳＦ２は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ－α、カヘキシン（ｃａｃｈｅｘｉｎ）またはカケクチンともよばれ、免疫細胞の制御、発熱の誘導、悪液質、炎症およびアポトーシスにおいて役割を担っている。ＴＮＦＳＦ２はまた腫瘍形成を阻害する。

【0037】

ＴＮＦＳＦ４はまた、ＯＸ４０リガンド、ＣＤ２５２、Ｇｐ３４またはＣＤ１３４Ｌともよばれ、Ｔ細胞共刺激によってＴ細胞免疫応答の活性化を誘導する。

【0038】

ＴＮＦＳＦ５はまた、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ともよばれ、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化することによって適応免疫応答を制御する。

【0039】

ＴＮＦＳＦ７はまた、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ２７Ｌ）またはＣＤ７０ともよばれ、Ｂ細胞活性化およびＴ細胞恒常性を制御する。

【0040】

ＴＮＦＳＦ９はまた、ＣＤ１３７リガンドまたは４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）ともよばれ、ＡＰＣ上に存在し、活性化Ｔ細胞上に発現するＣＤ１３７（４－１ＢＢともよばれる）に結合する。

【0041】

ＴＮＦＳＦ１４はまた、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ２５８またはＨＶＥＭＬともよばれ、Ｂ細胞活性化およびＴ細胞恒常性を制御する。

【0042】

ＴＮＦＳ１８はまた、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体関連蛋白質（ＧＩＴＲ）リガンド（ＧＩＴＲＬ）、活性化誘導性ＴＮＦＲメンバーリガンド（ＡＩＴＲＬ）またはＴＬ－６ともよばれ、受容体ＴＮＦ受容体スーパーファミリー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）（ＧＩＴＲまたはＡＩＴＲともよばれる）のリガンドとなるサイトカインである。ＴＮＦＳ１８は、Ｔ細胞生存を調節し、Ｔ細胞と内皮細胞との間の相互作用に重要であると考えられる。

【0043】

一実施態様においては、該免疫調節因子は膜結合性免疫調節因子である。そのような場合には、本発明のアデノウイルスに感染した癌細胞に発現する免疫調節因子は、好ましくは感染癌細胞の細胞膜に結合する。膜結合した免疫調節因子は、対象において、癌細胞のウイルス感染部位、すなわち、癌細胞または腫瘍の部位に局所免疫応答を誘導することができる。そのような膜結合した免疫調節因子は一般的に可溶性免疫調節因子よりも好ましい；その理由は、可溶性免疫調節因子は癌細胞の当該部位から移動して離れ、それによって対象の所望部位における免疫応答誘導に対する有効性が低下するためである。

【0044】

一実施態様においては、該アデノウイルスは、１種類のＴＮＦＳＦメンバー、好ましくは上記の群から選択されるＴＮＦＳＦメンバーをコードするヌクレオチド配列を含む。そのような場合に、該アデノウイルスは単一ＴＮＦＳＦ蛋白質を発現する。別の一実施態様においては、該アデノウイルスは、複数、すなわち、少なくとも２種類の異なるＴＮＦＳＦメンバーをコードする単一のヌクレオチド配列、または異なる各ＴＮＦＳＦメンバーをコードする複数のヌクレオチド配列を含む。

【0045】

好ましい一実施態様においては、該ＴＮＦＳＦメンバーは、ＴＮＦＳＦ５、ＴＮＦＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１８、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される。

【0046】

より好ましい一実施態様においては、該ＴＮＦＳＦメンバーは、ＴＮＦＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１８、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される。

【0047】

一実施態様においては、該アデノウイルスは、ＴＮＦＳＦ９をコードする核酸配列を含む。別の一実施態様においては、該アデノウイルスは、ＴＮＦＳＦ１８をコードする核酸配列を含む。さらなる一実施態様においては、該アデノウイルスは、ＴＮＦＳＦ９をコードする核酸配列およびＴＮＦＳＦ１８をコードする核酸配列、またはＴＮＦＳＦ９およびＴＮＦＳＦ１８をコードする核酸配列を含む。

【0048】

ヘリコバクターピロリ好中球活性化蛋白質、あるいは略してＮＡＰまたはＨＰ－ＮＡＰは、ヘリコバクターピロリ菌感染において毒性因子として作用する十二量体蛋白質である。１２個の単量体サブユニットから成り、各サブユニットは４つのαヘリックスで構成される。ＮＡＰの表面は高度に正に荷電し、ヒト白血球（ＷＢＣ；白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）とも表記される）と相互作用し活性化することができる。

【0049】

ＮＡＰは、ヘリコバクターピロリ菌感染において炎症組織への好中球遊走に重要な役割を果たす。ＮＡＰは、β２インテグリンの表面発現を上方制御することによって、内皮に結合する好中球および単球の強力な結合ならびに好中球および単球の溢出を促進する。またＮＡＰは、反応性酸素種（ＲＯＳ）およびミエロペルオキシダーゼを産生することに関して好中球を活性化し得る。ＮＡＰは、ＴＮＦ－αおよびインターロイキン８（ＩＬ－８）（ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド８（ＣＸＣＬ８）ともよばれる）などの他の炎症性サイトカインの分泌をも活性化し、それによって血管細胞接着分子（Ｖ－ＣＡＭ）、細胞間接着分子（Ｉ－ＣＡＭ）などの接着分子の発現ならびに内皮細胞によるＩＬ－８の分泌を誘導する。さらに、ＮＡＰは、好中球によるＩＬ－８、マクロファージ炎症性蛋白質１アルファ（ＭＩＰ－１α）およびＭＩＰ－１β（ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド４（ＣＣＬ４）ともよばれる）などの複数のサイトカインおよびケモカインの発現分泌をも誘導し得る。これらのサイトカインおよびケモカインはさらに、走化性によって好中球を炎症部位へ誘引する。

【0050】

ＮＡＰは、ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ－２）作用薬であり、好中球および単球に対して走化性であり、またインビトロおよびインビボの両方でＤＣを成熟させ得る。ＮＡＰは、Ｔｈ１分極化サイトカインであるＩＬ－１２およびＩＬ－２３の分泌を刺激することもできる。ＮＡＰは、ＨＬＡ－抗原Ｄ関連（ＨＬＡ－ＤＲ）、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を上方制御することによって、単球を刺激してＤＣに分化成熟させる。ＮＡＰは、細胞傷害性Ｔ細胞の補助およびＮＫ細胞活性化に極めて重要な免疫制御機能をも有している。ＮＡＰは、Ｔ細胞による高レベルＩＦＮ－γ分泌および低レベルＩＬ－４分泌を誘導することができ、これもまたＴｈ１分極化応答を示唆している。これは、ヘリコバクターピロリ菌に感染したヒトが強いＴｈ１分極応答を示すとの報告に整合する。

【0051】

一実施態様においては、ＮＡＰは、好ましくは以下の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、またはその配列から成る：
ＭＫＴＦＥＩＬＫＨＬＱＡＤＡＩＶＬＦＭＫＶＨＮＦＨＷＮＶＫＧＴＤＦＦＮＶＨＫＡＴＥＥＩＹＥＥＦＡＤＭＦＤＤＬＡＥＲＩＶＱＬＧＨＨＰＬＶＴＬＳＥＡＩＫＬＴＲＶＫＥＥＴＫＴＳＦＨＳＫＤＩＦＫＥＩＬＥＤＹＫＹＬＥＫＥＦＫＥＬＳＮＴＡＥＫＥＧＤＫＶＴＶＴＹＡＤＤＱＬＡＫＬＱＫＳＩＷＭＬＱＡＨＬＡ （配列番号：３）
ＭＫＴＦＥＩＬＫＨＬＱＡＤＡＩＶＬＦＭＫＶＨＮＦＨＷＮＶＫＧＴＤＦＦＮＶＨＫＡＴＥＥＩＹＥＥＦＡＤＭＦＤＤＬＡＥＲＩＶＱＬＧＨＨＰＬＶＴＬＳＥＡＩＫＬＴＲＶＫＥＥＴＫＴＳＦＨＳＫＤＩＦＫＥＩＬＥＤＹＫＨＬＥＫＥＦＫＥＬＳＮＴＡＥＫＥＧＤＫＶＴＶＴＹＡＤＤＱＬＡＫＬＱＫＳＩＷＭＬＱＡＨＬＡ （配列番号：４）
ＭＫＴＦＥＩＬＫＨＬＱＡＤＡＩＶＬＦＭＫＶＨＮＦＨＷＮＶＫＧＴＤＦＦＮＶＨＫＡＴＥＥＩＹＥＥＦＡＤＭＦＤＤＬＡＥＲＩＶＱＬＧＨＨＰＬＶＴＬＳＥＡＬＫＬＴＲＶＫＥＥＴＫＴＳＦＨＳＫＤＩＦＫＥＩＬＥＤＹＫＹＬＥＫＥＦＫＥＬＳＮＴＡＥＫＥＧＤＫＶＴＶＴＹＡＤＤＱＬＡＫＬＱＫＳＩＷＭＬＱＡＨＬＡ （配列番号：５）
ＭＫＴＦＥＩＬＫＨＬＱＡＤＡＩＶＬＦＭＫＶＨＮＦＨＷＮＶＫＧＴＤＦＦＮＶＨＫＡＴＥＥＩＹＥＥＦＡＤＭＦＤＤＬＡＥＲＩＶＱＬＧＨＨＰＬＶＴＬＳＥＡＬＫＬＴＲＶＫＥＥＴＫＴＳＦＨＳＫＤＩＦＫＥＩＬＥＤＹＫＨＬＥＫＥＦＫＥＬＳＮＴＡＥＫＥＧＤＫＶＴＶＴＹＡＤＤＱＬＡＫＬＱＫＳＩＷＭＬＱＡＨＬＡ （配列番号：６）
ＭＫＴＦＥＩＬＫＨＬＱＡＤＡＩＶＬＦＭＫＶＨＮＦＨＷＮＶＫＧＴＤＦＦＮＶＨＫＡＴＥＥＩＹＥＧＦＡＤＭＦＤＤＬＡＥＲＩＶＱＬＧＨＨＰＬＶＴＬＳＥＡＩＫＬＴＲＶＫＥＥＴＫＴＳＦＨＳＫＤＩＦＫＥＩＬＥＤＹＫＹＬＥＫＥＦＫＥＬＳＮＴＡＥＫＥＧＤＫＶＴＶＴＹＡＤＤＱＬＡＫＬＱＫＳＩＷＭＬＱＡＨＬＡ （配列番号：７）
ＭＫＴＦＥＩＬＫＨＬＱＡＤＡＩＶＬＦＭＫＶＨＮＦＨＷＮＶＫＧＴＤＦＦＮＶＨＫＡＴＥＥＩＹＥＧＦＡＤＭＦＤＤＬＡＥＲＩＶＱＬＧＨＨＰＬＶＴＬＳＥＡＬＫＬＴＲＶＫＥＥＴＫＴＳＦＨＳＫＤＩＦＫＥＩＬＥＤＹＫＹＬＥＫＥＦＫＥＬＳＮＴＡＥＫＥＧＤＫＶＴＶＴＹＡＤＤＱＬＡＫＬＱＫＳＩＷＭＬＱＡＨＬＡ （配列番号：８）
ＭＫＴＦＥＩＬＫＨＬＱＡＤＡＩＶＬＦＭＫＶＨＮＦＨＷＮＶＫＧＴＤＦＦＮＶＨＫＡＴＥＥＩＹＥＧＦＡＤＭＦＤＤＬＡＥＲＩＶＱＬＧＨＨＰＬＶＴＬＳＥＡＩＫＬＴＲＶＫＥＥＴＫＴＳＦＨＳＫＤＩＦＫＥＩＬＥＤＹＫＨＬＥＫＥＦＫＥＬＳＮＴＡＥＫＥＧＤＫＶＴＶＴＹＡＤＤＱＬＡＫＬＱＫＳＩＷＭＬＱＡＨＬＡ （配列番号：９）
ＭＫＴＦＥＩＬＫＨＬＱＡＤＡＩＶＬＦＭＫＶＨＮＦＨＷＮＶＫＧＴＤＦＦＮＶＨＫＡＴＥＥＩＹＥＧＦＡＤＭＦＤＤＬＡＥＲＩＶＱＬＧＨＨＰＬＶＴＬＳＥＡＬＫＬＴＲＶＫＥＥＴＫＴＳＦＨＳＫＤＩＦＫＥＩＬＥＤＹＫＨＬＥＫＥＦＫＥＬＳＮＴＡＥＫＥＧＤＫＶＴＶＴＹＡＤＤＱＬＡＫＬＱＫＳＩＷＭＬＱＡＨＬＡ （配列番号：１０）

【0052】

ＮＡＰの免疫学的に同等な断片は、ＮＡＰの少なくとも２０アミノ酸残基（連続する少なくとも２０アミノ酸残基など）、好ましくは少なくとも３０アミノ酸残基（連続する少なくとも３０アミノ酸残基など）、およびより好ましくは少なくとも４０アミノ酸残基（連続する少なくとも４０アミノ酸残基など）の少なくとも１種類のポリペプチドドメインを含む断片である。

【0053】

ＮＡＰの免疫学的に同等な断片の非限定的具体例としては、以下が挙げられる：
配列番号：３－１０のアミノ酸番号：５－４０に対応する、
ＥＩＬＫＨＬＱＡＤＡＩＶＬＦＭＫＶＨＮＦＨＷＮＶＫＧＴＤＦＦＮＶＨＫＡＴ （配列番号：１１）
配列番号：３－１０のアミノ酸番号１１０－１４４に対応する、
ＮＴＡＥＫＥＧＤＫＶＴＶＴＹＡＤＤＱＬＡＫＬＱＫＳＩＷＭＬＱＡＨＬＡ （配列番号：１２）
配列番号：５－６のアミノ酸番号３９－７４に対応する、
ＡＴＥＥＩＹＥＥＦＡＤＭＦＤＤＬＡＥＲＩＶＱＬＧＨＨＰＬＶＴＬＳＥＡＬＫ （配列番号：１３）
配列番号：５、１０のアミノ酸番号７５－１１０に対応する、
ＬＴＲＶＫＥＥＴＫＴＳＦＨＳＫＤＩＦＫＥＩＬＥＤＹＫＨＬＥＫＥＦＫＥＬＳ （配列番号：１４）

【0054】

ＮＡＰの免疫学的に同等な断片に関するさらなる情報がＥＰ１７６７２１４Ｂ１に記載されており、その第３２段落「ヘリコバクターピロリが誘導する胃浸潤物に由来するＨＰ－ＮＡＰ特異的Ｔ細胞によって認識されるＨＰ－ＮＡＰの優性Ｔ細胞エピトープの定義」に開示されているＨＰ－ＮＡＰの免疫学的に同等な断片についての説明は、参照として本明細書に組み入れられる。

【0055】

一実施態様においては、該アデノウイルスは、単一ＮＡＰをコードする核酸配列、複数の異なるＮＡＰをコードする核酸配列、ＮＡＰの単一の免疫学的活性断片をコードする核酸配列、ＮＡＰの複数の異なる免疫学的活性断片をコードする核酸配列、または少なくとも１つのＮＡＰをコードする少なくとも１種類の核酸配列およびＮＡＰの少なくとも１種類の免疫学的に活性な断片をコードする少なくとも１種類の核酸配列を含む。

【0056】

一実施態様において、該アデノウイルスは、ＮＡＰをコードする核酸配列および／またはＮＡＰの免疫学的に活性な断片と該免疫調節因子をコードする核酸配列との間に配置される自己開裂ペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。

【0057】

本明細書中の「自己開裂ペプチド」は、細胞において蛋白質の翻訳中にリボソームスキッピングを誘発することができるペプチドである。見かけの開裂は、自己開裂ペプチドのＣ末端に位置するプロリン（Ｐ）とグリシン（Ｇ）との間のペプチド結合におけるリボソームスキッピングによって起こるが、その結果、自己開裂ペプチドの上流に位置するペプチドまたは蛋白質は、そのＣ末端に余分なアミノ酸を含み、自己開裂ペプチドの下流に位置するペプチドまたは蛋白質は、そのＮ末端に余分のプロリンを含むようになる。

【0058】

一実施態様においては、該自己開裂ペプチドは自己開裂性２Ａペプチドであり、これは２Ａペプチドともよばれる。そのような自己開裂性２Ａペプチドは、ＤｘＥｘＮＰＧＰ（配列番号：１５）のコア配列モチーフを含む。一実施態様においては、自己開裂性２Ａペプチドは、ゾーシーアシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）、ブタテッショウウイルス－１の２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス２Ａペプチド（Ｅ２Ａ）および口蹄疫ウイルス２Ａ（Ｆ２Ａ）から成る群から選択される。一実施態様においては、Ｔ２Ａはアミノ酸配列：
ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号：１６）またはＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号：１７）から成る。一実施態様においては、Ｐ２Ａはアミノ酸配列：
ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号：１８）またはＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号：１９）から成る。一実施態様においては、Ｅ２Ａはアミノ酸配列：
ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号：２０）またはＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号：２１）から成る。一実施態様においては、Ｆ２Ａはアミノ酸配列：
ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号：２２）またはＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号：２３）から成る。

【0059】

ＮＡＰおよび／またはその免疫学的に同等な断片をコードする核酸配列と該免疫調節因子をコードする核酸配列との間に自己開裂ペプチドをコードする核酸配列を含むことによって、ＮＡＰおよび／またはその免疫学的に同等な断片ならびに該免疫調節因子は、互いに独立に、およびアデノウイルスゲノムの他の蛋白質とは独立に、その正確な翻訳および折りたたみが促進されるのである。

【0060】

一実施態様においては、該アデノウイルスは腫瘍溶解性アデノウイルスである。腫瘍溶解性アデノウイルスは、癌細胞で選択的に複製可能なアデノウイルスである。そのような腫瘍溶解性アデノウイルスは、癌細胞で選択的に複製され、すなわち、腫瘍親和性を有しており、好ましくは癌細胞を溶解可能である；すなわち、腫瘍溶解可能である。

【0061】

一実施態様においては、該アデノウイルスは、腫瘍溶解性となるように工学的に改変される、すなわち、癌細胞で選択的に複製するように改変される。好ましい一実施態様においては、該腫瘍溶解性アデノウイルスは、野生型Ｅ１Ａ蛋白質と比較してより低いＲｂ結合能を有する変異Ｅ１Ａ蛋白質をコードする変異アデノウイルス初期領域１Ａ（Ｅ１Ａ）遺伝子を含む。

【0062】

アデノウイルスのＥ１Ａ蛋白質は、感染した宿主細胞の細胞内Ｒｂ蛋白質に結合する。Ｅ１Ａ蛋白質の細胞内Ｒｂ蛋白質への結合によって、Ｅ２Ｆが放出されるが、これによって、Ｅ２（ウイルス複製に関与する蛋白質をコードする）、Ｅ３（宿主の抗ウイルス性免疫応答を阻害する蛋白質をコードする）、およびＥ４（ウイルスリボ核酸（ＲＮＡ）輸送に関与する蛋白質をコードする）などの他のウイルス遺伝子および細胞周期を活性化する細胞遺伝子の転写が活性化する。

【0063】

Ｅ１Ａ蛋白質が細胞内Ｒｂ蛋白質に結合することを阻害する、または完全に妨害するなど、結合を弱めることによって、アデノウイルスを癌細胞選択的または腫瘍細胞選択的なウイルスにする。したがって、変異Ｅ１Ａ蛋白質をコードする変異Ｅ１Ａ遺伝子を含むアデノウイルスは、癌細胞中での複製が可能であり、癌細胞を溶解させることができるが、健康または正常な細胞、すなわち非癌細胞では複製および溶解は起こらない。

【0064】

一実施態様においては、該変異Ｅ１Ａ遺伝子は、野生型Ｅ１Ａ遺伝子のヌクレオチド９１９～９４３に対応する２４塩基対（ｂｐ）の欠失を含む。この２４ｂｐの欠失は、ヌクレオチドｃｔｔａｃｃｔｇｃｃａｇｇａｇｇｃｔｇｇｃｔｔｔ（配列番号：２４）に対応する。これらの２４ヌクレオチドは、Ｅ１Ａ蛋白質のアミノ酸１２１～１２８をコードする。したがって、該変異Ｅ１Ａ蛋白質は野生型Ｅ１Ａ蛋白質のＬＴＣＨＥＡＣＦ（配列番号：２５）に対応するアミノ酸１２１～１２８を欠如する。

【0065】

一実施態様においては、該アデノウイルスは、１９ｋＤａのアデノウイルスＥ１Ｂ蛋白質をコードする核酸配列および５５ｋＤａのアデノウイルスＥ１Ｂ蛋白質をコードする核酸配列を欠如する。

【0066】

一実施態様においては、１９ｋＤａのアデノウイルスＥ１Ｂ蛋白質および５５ｋＤａのアデノウイルスＥ１Ｂ蛋白質をコードする核酸配列の一方が、ＮＡＰをコードする核酸配列および／またはＮＡＰの免疫学的に同等な断片をコードする核酸配列で置換され、１９ｋＤａのアデノウイルスＥ１Ｂ蛋白質および５５ｋＤａのアデノウイルスＥ１Ｂ蛋白質をコードする核酸配列の他方が、該免疫調節因子をコードする核酸配列で置換される。

【0067】

したがって、好ましい一実施態様においては、１９－ｋＤａのＥ１Ｂ蛋白質および５５－ｋＤａのアデノウイルスＥ１Ｂ蛋白質をコードするアデノウイルスの核酸配列は、ＮＡＰおよび／またはその免疫学的に同等な断片、および該免疫調節因子をコードする核酸配列で置換される。

【0068】

一実施態様においては、該アデノウイルスは、図１に示すような、該免疫調節因子をコードする核酸配列、それに後続する自己開裂ペプチドをコードする核酸配列、およびそれらに後続するＮＡＰおよび／またはその免疫学的に活性な断片をコードする核酸配列を含む。別の一実施態様においては、該アデノウイルスは、ＮＡＰおよび／またはその免疫学的に活性な断片をコードする核酸配列、それに後続する自己開裂ペプチドをコードする核酸配列およびそれらに後続する該免疫調節因子をコードする核酸配列を含む。

【0069】

一実施態様においては、該アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス５型、好ましくは腫瘍溶解性ヒトアデノウイルス５型である。

【0070】

ヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）はＣ群に属し、３６キロベースの直鎖状デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）をパッケージする蛋白質二十面体カプシドによって形成されるウイルスである。成人ではＡｄ５感染は通常無症候性であり、他方、小児では普通感冒および結膜炎を引き起こす。一般的に、Ａｄ５は上皮細胞に感染するが、この上皮細胞は、自然感染の経過では気管支上皮の細胞である。カプシド１２頂点のアンテナとして伸長するウイルス蛋白質である繊維が、細胞間接着に関与する細胞蛋白質であるコックサッキー＝アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）と相互作用することにより、Ａｄ５は細胞に侵入する。ウイルスＤＮＡが細胞核に到達すると、ウイルスの初期遺伝子（Ｅ１～Ｅ４）は、規則正しく順番に転写を開始する。発現する第１のウイルス遺伝子は、初期領域１Ａ（Ｅ１Ａ）の遺伝子である。Ｅ１Ａは細胞内蛋白質Ｒｂに結合して、Ｅ２Ｆを放出するが、Ｅ２Ｆは、Ｅ２（ウイルス複製に関与する蛋白質をコードする）、Ｅ３（宿主の抗ウイルス性免疫応答を阻害する蛋白質をコードする）、およびＥ４（ウイルスリボ核酸（ＲＮＡ）輸送に関与する蛋白質をコードする）などの他のウイルス遺伝子ならびに細胞周期を活性化する細胞遺伝子の転写を活性化する。さらに、Ｅ１Ｂはｐ５３に結合して、細胞周期を活性化し、感染細胞のアポトーシスを妨害する。初期遺伝子の発現によってウイルスＤＮＡが複製し、ＤＮＡ複製が起こると、その主要後期プロモーターが活性化して、カプシド形成構造蛋白質をコードする全てのＲＮＡを差次的スプライシングで生成するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写を指令する。

【0071】

本発明の他の一局面は、治療薬剤として用いる実施態様にしたがうアデノウイルスに関する。

【0072】

本発明のさらなる一局面は、癌治療に用いる実施態様にしたがうアデノウイルスに関する。

【0073】

本発明の関連する一局面では、癌治療の治療薬剤の製造のための本実施態様にしたがうアデノウイルスの用途を定義する。

【0074】

本発明はさらに癌治療の方法に関する。該方法は、有効量の本実施態様にしたがうアデノウイルスを、癌に罹患した対象に投与することを含む。

【0075】

本明細書中の「治療する」または「治療」は、当該技術分野においては充分理解されていることであり、臨床的結果を含む有益な、あるいは所望の結果を得るためのアプローチを意味している。有益な、あるいは所望の臨床結果は、例えば、１種類以上の症状または病態の緩和または改善、癌疾患の程度の軽減、癌疾患の安定化状態、すなわち、悪化の予防、癌疾患の広がりの予防、疾患進行の遅延または緩徐化、癌の病状の改善または緩和、癌疾患再発の低減、および寛解を含み得る。「治療する」または「治療」はまた、治療を全く受けない場合の予想生存と比較して生存を延長させ得る。本明細書中の「癌治療」は、対象において癌を阻害することおよび予防的処置をも含む。

【0076】

本明細書中の「予防する」または「予防」は、当該技術分野においては充分理解されていることであり、癌疾患の発症を先に延ばす、または遅延させることを含む、癌疾患または病態の発症リスクを低下させる、または取り除くアプローチを意味する。例えば、癌疾患を発症する素因（遺伝的または遺伝性の素因によるものなど）のある患者は、癌予防、癌疾患リスクの低下、癌疾患発症の遅延および／または緩徐化において、本実施態様のアデノウイルスの投与することの恩恵を受け得る。

【0077】

癌または癌疾患は、好ましくは癌腫（膵癌、乳癌、肺癌、肝臓癌、または腎臓癌など）；肉腫（骨肉腫または脂肪肉腫など）；リンパ腫（非ホジキンリンパ腫またはホジキンリンパ腫など）；白血病（急性白血病または慢性白血病など）；精上皮腫；胚細胞腫；未分化胚細胞腫；および芽細胞腫（膠芽細胞腫または神経芽細胞腫など）から成る群から選択される。特定の一実施態様においては、該癌は膵癌などの癌腫である。

【0078】

該患者は好ましくはヒト患者である。しかし、該実施態様はまた獣医学的応用も可能である；すなわち、例えば、霊長類、サル、類人猿、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、マウス、ラットおよびモルモットを含む非ヒト哺乳動物などの非ヒト患者への応用も可能である。

【0079】

該アデノウイルスは、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内または腫瘍内投与を含む各種の経路で、該患者に投与するのであってもよい。

【0080】

該アデノウイルスは、典型的には、該アデノウイルスを含む医薬組成物の形態で投与される。該医薬組成物は、１種類以上の薬学的に許容可能な担体、ビヒクルおよび／または添加剤をさらに含んでいてもよい。そのような薬学的に許容可能な担体、ビヒクルおよび添加剤の非限定的な例としては、注射溶液（食塩水または緩衝液性注射溶液など）が挙げられる。

【0081】

好ましい該医薬組成物は有効量のアデノウイルスを含む。本明細書中の「有効量」は、所望の結果を達成するのに必要な用量および期間において有効な量を指す。例えば、腫瘍増殖の阻害に関しては、有効量は、細胞を投与せずに得られる応答と比較して、例えば、寛解を誘導する、腫瘍負荷を軽減する、および／または腫瘍の広がりまたは増殖を予防する量である。有効量は、患者の病状、年齢、性別、体重などの因子によって異なり得る。

【0082】

実施例
実施例１：アデノウイルスの構築
材料と方法
アデノウイルスプラスミドおよびウイルス
組換えアデノウイルスゲノムの工学的改変にはｐＡｄＥａｓｙシステムを用いた。野生型アデノウイルスゲノムに対応する配列を含むＤＮＡ構築物を合成したが、そのＥ１Ａコード配列は変異型で、２４ｂｐの欠失を有する（Ｅ１ａ－Δ２４）（Ｆｕｅｙｏ、Ｊら、「Ｒｂ経路を標的とする変異体腫瘍溶解性アデノウイルスは、インビボで抗神経膠腫効果を発揮する（Ａ ｍｕｔａｎｔ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｒｂ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ａｎｔｉ－ｇｌｉｏｍａ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｖｉｖｏ）」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ （２０００） １９（１）： ２－１２）；また、天然のｐ１９Ｋおよびｐ５５Ｋのコード配列は、ＴＮＦＳＦ９（ＳＦ９）またはＴＮＦＳＦ１８（ＳＦ１８）のコード配列、ゾーシーアシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）の自己開裂２Ａペプチド、およびヘリコバクターピロリ菌の好中球活性化蛋白質（ＮＡＰ）で置換した。ヒトおよびマウスのＴＮＦＳＦ９またはＴＮＦＳＦ１８の両方を構築し、実験条件に合わせて用いた（すなわち、ヒト細胞株にはヒト遺伝子を用い、他方、マウスモデルではマウス遺伝子を用いた）。これらの構築物を空のｐＳｈｕｔｔｌｅにクローン化してｐＳｈ（Ｏ９Ｂ）およびｐＳｈ（Ｏ１８Ｂ）を作成した。ｐＳｈｕｔｔｌｅプラスミドをさらにｐＡｄＥａｓｙｆ３５で組み換え、ｐＡｄ（Ｏ９Ｂ）およびｐＡｄ（Ｏ１８Ｂ）を作成した；これらを、腫瘍溶解性ウイルスＡｄ（Ｏ９Ｂ）およびＡｄ（Ｏ１８Ｂ）の作成に用いた。同様の方法で、非複製アデノウイルスＡｄ（Ｌｕｃ）を作成し陰性対照として用いた。さらに、２種類の対照ウイルスを同様の方法で作成した；そのうちのＡｄ（Ｏ）は、２４ｂｐの欠失を有する変異Ｅ１Ａを含むが導入遺伝子発現を欠くものであり、他方、Ａｄ（ＯＢ）は、２４ｂｐの欠失を有する変異Ｅ１Ａを含み、導入遺伝子発現としてＮＡＰのみを有するものであった。

【0083】

細胞株および培養条件
ヒト胚性網膜芽細胞腫９１１細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ、ライデン、オランダ）は、加湿恒温器（５％ＣＯ_２、３７℃）で培養した。この細胞株は、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＥＳＴ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）Ｇｌｕｔａｍａｘで維持した。用いた材料はいずれも、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。

【0084】

ウイルス産生および増幅
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の添加により、９０％コンフルエントの９１１細胞を１２μｇのＰａｃＩ消化ｐＡｄ５（Ｅ１ＡＤ２４－Ａ－Ｂ）ＤＮＡで形質導入した後に、組換えアデノウイルスが産生された。５日以内にほぼ半分の細胞が丸い核を呈し剥離が起こったので、細胞変性効果（ＣＰＥ）は明らかであった。この形質導入細胞を６日目に回収して、凍結／解凍サイクルを反復することにより細胞溶解し細胞質ウイルス粒子を放出させた。９１１細胞の順次形質導入サイクルにより、アデノウイルス力価は増加した。４℃で２５，０００回／分（ｒｐｍ）のＣｓＣｌ勾配超遠心分離を２時間行ってウイルスを精製し、保存液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２および４％ｗ／ｖスクロース）で透析した。精製したウイルスを分注して－８０℃で保存した。

【0085】

結果
全てのウイルスＤＮＡを構築しウイルスを高力価で生産することができる。ウイルス構築物、それらの名称およびゲノム配置を図１に示す。導入遺伝子（Ｌｕｃ、ＳＦ９、ＳＦ１８、ＮＡＰ）および変異（Ｅ１ａ－Δ２４）が示されており、ゲノム中の各修飾位置は野生型ゲノム配置に準拠して示されている。

【0086】

実施例２：ＮＡＰと共にＴＮＦＳＦ９またはＴＮＦＳＦ１８を共発現する腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞を特異的に殺滅し効率的に複製した
細胞株および培養条件
ヒト膵癌細胞株Ｐａｎｃ０１（ＡＴＣＣ、米国から購入した）、およびＭｉａＰａＣａ－２（ＡＴＣＣ、米国から購入した）を加湿恒温器（５％ＣＯ_２、３７℃）で培養した。これらの細胞株は、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１００ Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＥＳＴ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）Ｇｌｕｔａｍａｘで維持した。用いた材料はいずれも、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。

【0087】

ＭＴＳ殺滅アッセイ
Ｐａｎｃ０１細胞およびＭｉａＰａＣａ－２細胞（１ｘ１０^４細胞）に、異なるウイルスにより感染多重度（ＭＯＩ）０．１～１０００で形質導入し（対応する数／容積２００μＬの培地で細胞とウイルスを混合）、９６穴プレートに播種した；５日後にアラマーブルー（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ）化合物で細胞生存率を測定した。細胞生存率は、非処理対照細胞と比較した生細胞の割合（％）として算定した。結果を独立した３回の実験の平均値で表す。

【0088】

対照ウイルスＡｄ（Ｌｕｃ）は細胞殺滅を全く示さなかったが、工学的に改変したＡｄ（Ｏ９Ｂ）およびＡｄ（Ｏ１８Ｂ）は両方とも、Ａｄ（Ｏ）およびＡｄ（ＯＢ）と比較して同程度の細胞殺滅能を示した；このことは、付加的導入遺伝子、すなわちＴＮＦＳＦ９またはＴＮＦＳＦ１８の挿入が、ウイルス殺滅能に負の影響を与えないことを示している（図２）。

【0089】

複製アッセイ
異なるウイルスをＭＯＩ＝５０で用いて、Ｐａｎｃ０１細胞およびＭｉａＰａＣａ－２細胞（１ｘ１０^４細胞）に形質導入し、細胞を９６穴プレートに播種した。Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｖｉｒａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄキット（Ｒｏｃｈｅ）を用い、異なる時点で細胞からウイルスＤＮＡを抽出し、アデノウイルス特異的プライマー（順方向プライマー：ＣＡＴＣＡＧＧＴＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＣＧＧ（配列番号：１）、逆方向プライマー：ＧＡＡＧＣＧＣＴＧＴＡＴＧＴＴＧＴＴＣＴＧ（配列番号：２））を用いて定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を実施した。

【0090】

対照ウイルスＡｄ（Ｌｕｃ）はいずれの細胞株でも複製することはなかったが、組換えウイルスＡｄ（Ｏ９Ｂ）およびＡｄ（Ｏ１８Ｂ）は、両方の細胞株において複製した（図３）。Ｐａｎｃ０１細胞株では、ウイルスＡｄ（Ｏ）およびＡｄ（ＯＢ）と比較して、いずれかの導入遺伝子（ＴＮＦＳＦ９またはＴＮＦＳＦ１８）の挿入によりウイルス複製の増加が実際に認められた。ＭｉａＰａＣａ－２細胞株では、全ての腫瘍溶解性ウイルスに関して複製は同程度であった。

【0091】

実施例３：ＮＡＰと共にＴＮＦＳＦ９またはＴＮＦＳＦ１８を共発現しても、導入遺伝子発現に対しては負の影響を与えなかった
導入遺伝子発現
各種のウイルスをＭＯＩ＝５０で用いて、Ｐａｎｃ０１細胞およびＭｉａＰａＣａ－２細胞（１ｘ１０^６細胞）に形質導入し、細胞を６穴プレートに播種した。ＴＮＦＳＦ９またはＴＮＦＳＦ１８の導入遺伝子発現は、形質導入から２日後にフローサイトメトリーで判定した。

【0092】

予想通り、対照ウイルスで形質導入した細胞はいずれも導入遺伝子ＴＮＦＳＦ９を発現せず、またＴＮＦＳＦ１８も発現しなかった。しかし、Ａｄ（Ｏ９Ｂ）ウイルスで形質導入した細胞では、ＴＮＦＳＦ９を高レベルで発現し、Ａｄ（Ｏ１８Ｂ）ウイルスで形質導入した細胞では、ＴＮＦＳＦ１８を高レベルで発現した（図４）。これらのデータは、ＮＡＰと共にＴＮＦＳＦ９またはＴＮＦＳＦ１８のいずれかを共発現させても、ＴＮＦＳＦ９またはＴＮＦＳＦ１８の発現には負の影響を与えないことを示している。

【0093】

実施例４：ＮＡＰと共にＴＮＦＳＦ９またはＴＮＦＳＦ１８を共発現することによって、免疫原性細胞死の誘導が起こる
異なるウイルスをＭＯＩ＝５０で用いて、Ｐａｎｃ０１細胞およびＭｉａＰａＣａ－２細胞（５ｘ１０^５細胞）に形質導入し、細胞を４８穴プレートに播種した。上記の実施例で導入遺伝子の確認が成されたので、これ以降は、ＮＡＰと共に導入遺伝子ＴＮＦＳＦ９またはＴＦＮＳＦ１８を共発現する腫瘍溶解性ウイルス、すなわち、Ａｄ（Ｏ９Ｂ）およびＡｄ（Ｏ１８Ｂ）のみを試験した。形質導入から４８時間後に、フローサイトメトリーにて細胞表面カルレティキュリン（ＣＲＴ）レベルを観察し、またＡＴＰ測定キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて上清中のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）放出を測定することにより、免疫原性細胞死（ＩＣＤ）を調べた。

【0094】

非腫瘍溶解性対照ウイルスＡｄ（Ｌｕｃ）は、未処理細胞と比較してＩＣＤに関する何らの徴候も誘発しなかった；ＣＲＴレベルの増加もＡＴＰ放出の増加も起こらなかった。他方、腫瘍溶解性ウイルスで形質導入した全細胞が、高レベルＣＲＴを示し、またＡＴＰを高レベルで放出した（図５）；このことは、形質導入細胞でＩＣＤが起こったことを示している。

【0095】

実施例５：ＮＡＰと共にＴＮＦＳＦ９またはＴＮＦＳＦ１８を共発現することによって、樹状細胞成熟が誘導された
異なるウイルスをＭＯＩ＝５０で用いて、Ｐａｎｃ０１細胞およびＭｉａＰａＣａ－２細胞（５ｘ１０^５）に形質導入し、細胞を４８穴プレートに播種した。形質導入から４８時間後に、異なるドナーに由来する未成熟樹状細胞（ＤＣ）を共培養に添加し、１８時間後にＤＣ活性化マーカー（分化８０（ＣＤ８０）、ＣＤ４０、ＣＤ８６、Ｃ－Ｃケモカイン受容体７型（ＣＣＲ７）のクラスター）の表面発現レベルを測定することにより、ＤＣ成熟を調べた。結果を独立した３回の実験の平均値で表す。

【0096】

図６に示される、成熟／活性化マーカー（ＣＤ８０、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＣＲ７）の表面発現亢進から分かるように、組換え腫瘍溶解性ウイルスＡｄ（Ｏ９Ｂ）またはＡｄ（Ｏ１８Ｂ）による細胞形質導入は、共培養においてＤＣを成熟および活性化させることが可能であった。ＮＡＰと共に導入遺伝子ＴＮＦＳＦ９またはＴＮＦＳＦ１８を共発現させることにより、ＤＣの成熟および活性化を誘導することが可能であった。

【0097】

実施例６：ＮＡＰと共にＴＮＦＳＦ９またはＴＮＦＳＦ１８を共発現する腫瘍溶解性ウイルスは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の活性化を誘導し、細胞傷害性機能を発揮した
Ｐａｎｃ０２細胞（１００μｌのダルベッコのリン酸緩衝性生理食塩水（ＤＰＢＳ）中１ｘ１０^６細胞）を、６～８週齢のメスＣ５７Ｂｌ／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｓｉｌｋｅｂｏｒｇ、デンマーク）の右後ろ脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。これらのマウスにおいて、腫瘍接種から１２日後に腫瘍が触知可能（サイズ約５０ｍｍ^３）な場合に、ＰＢＳ（５０μｌ）または各種のウイルス（５０μｌのＰＢＳ中１×１０^１１ウイルス粒子（ＶＰ））を用いて腫瘍内（ｉ．ｔ．）処置した。腫瘍浸潤性ＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞の両方、およびＮＫ細胞の活性化を処置から３後日に調べた。さらに、ウイルス処置後に脾細胞を単離して、Ｐａｎｃ０２に混合し、上清へのＩＦＮ－γ放出を調べた。

【0098】

対照ウイルス処置では、Ｔ細胞もＮＫ細胞も活性化しなかった。他方、表面マーカーＣＤ６９およびＣＤ１０７ａの上方制御（図７Ａ）から分かるように、Ａｄ（Ｏ９Ｂ）処置およびＡｄ（Ｏ１８Ｂ）処置はいずれもＴ細胞およびＮＫ細胞を活性化した。さらに、腫瘍細胞に反応してかなりの量のＩＦＮ－γを放出した内在性脾細胞によって示されるように、Ａｄ（Ｏ９Ｂ）処置およびＡｄ（Ｏ１８Ｂ）処置はまたメモリーを生成させた（図７Ｂ）。

【0099】

実施例７：ＮＡＰと共にＴＮＦＳＦ９またはＴＮＦＳＦ１８を共発現する腫瘍溶解性ウイルスによって、治療効果の増強が起こった
Ｐａｎｃ０２細胞（１００μｌのＤＰＢＳ中１ｘ１０^６細胞）を、６～８週齢のメスＣ５７Ｂｌ／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｓｉｌｋｅｂｏｒｇ、デンマーク）の右後ろ脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。これらのマウスにおいて、腫瘍接種から７、１０、および１２日後に腫瘍が触知可能（サイズ約５０ｍｍ^３）な場合に、ＰＢＳ（５０μｌ）または各種のウイルス（５０μｌのＰＢＳ中１×１０^１１ＶＰ）を用いて腫瘍内（ｉ．ｔ．）処置した。

【0100】

別の一組の実験では、Ｐａｎｃ０１細胞（ＤＰＢＳとマトリゲルの１：１混合物１００μｌ中に、５ｘ１０^６細胞）を、６～８週齢のメス無胸腺ヌードマウス（ＪＡＮＶＩＥＲ Ｌａｂｓ、フランス）の右後ろ脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。これらのマウスにおいて、腫瘍接種から７、１０、および１２日後に腫瘍が触知可能（サイズ約５０ｍｍ^３）な場合に、ＰＢＳ（５０μｌ）または各種のウイルス（５０μｌのＰＢＳ中１×１０^１１ＶＰ）を用いて腫瘍内（ｉ．ｔ．）処置した。

【0101】

腫瘍容積が試験のエンドポイント容積（ＥＰＶ、１０００ｍｍ^３）を超えるまで、これらの動物の腫瘍増殖について個別的にモニターを行った。腫瘍のサイズは、楕円体容積の公式：
腫瘍容積 ＝ （長さ ｘ 幅^２ ｘ π）／６
を用いて算出した。

【0102】

各マウスについて終点（ＴＴＥ）に至るまでの時間を：
ＴＴＥ ＝ ［ｌｏｇ（ＥＰＶ） － ｂ］／ｍ
として計算した；ここで定数ｂは、時間の線形回帰によって得られた直線の切片であり、ｍは傾きである。ＥＰＶを超過した最初の測定腫瘍容積から成るｌｏｇ変換腫瘍増殖データセット、およびＥＰＶに到達直前に３回連続測定した腫瘍容積。生存曲線はカプラン＝マイヤー法を用いてＴＴＥ値に基づいて作成し、ログランク（マンテル＝コックス）検定を用いて比較を行った。

【0103】

Ｐａｎｃ０２モデルおよびＰａｎｃ０１異種移植片モデルの両方において、腫瘍溶解性ウイルスＡｄ（Ｏ）およびＡｄ（ＯＢ）は、腫瘍増殖を僅かに阻害し、マウスの生存を僅かに延長することが可能であった（図８および９）。他方、Ａｄ（Ｏ９Ｂ）およびＡｄ（Ｏ１８Ｂ）は、（Ｐａｎｃ０２モデルにおいてのみ）腫瘍増殖を大幅に遅延させ、マウスの生存を延長した（図８および９）。Ｐａｎｃ０２モデルのデータは、ＮＡＰと共にＴＮＦＳＦ９またはＴＮＦＳＦ１８を共発現することによって、宿主免疫応答を有意に活性化し、治療的抗腫瘍効果を達成したことを示している。Ｐａｎｃ０１モデルのデータは、ＮＡＰとＴＮＦＳＦ９の共発現は強力な抗腫瘍効果をもたらし、特にこのヒト異種移植片モデルではアデノウイルス複製が許容性であることを示している。

【0104】

実施例８：ＮＡＰと共に免疫原ＧＤ２ミモトープを共発現する腫瘍溶解性ウイルスは、治療効果を増強しなかった
ＮＸＳ２細胞（１００μｌのＤＰＢＳ中に、１ｘ１０^６細胞）を、６～８週齢のメスＡ／Ｊマウス（Ｅｎｖｉｇｏ、オランダ）の右後ろ脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。これらのマウスにおいて、腫瘍接種から７日後に腫瘍が触知可能（サイズ約５０ｍｍ^３）な場合に、ＰＢＳ（５０μｌ）または各種の工学的に作成した腫瘍溶解性セムリキ森林熱ウイルス（５０μｌのＰＢＳ中１×１０^１１ＶＰ）を用いて腫瘍内（ｉ．ｔ．）処置した。

【0105】

動物のモニターリング、腫瘍サイズ測定、および生存曲線の作成は、実施例７に記載する方法で実施した。

【0106】

腫瘍溶解性ウイルスはいずれも、腫瘍増殖を有意に阻害しマウスの生存を延長した（図１０）。他方、Ａ７７４－ＮＡＰＧＤ２におけるＮＡＰと免疫原ＧＤ２ミモトープの共発現は、単一因子（ＧＤ２またはＮＡＰ）を発現する腫瘍溶解性ウイルスと比較して、腫瘍増殖阻害もこれらマウスの生存延長も引き起こさなかった（図１０）。これらのデータは、免疫調節因子とＮＡＰとを共発現することによって得られる相乗効果が、免疫原と共にＮＡＰを共発現する場合には起こらないことを示唆している。

【0107】

上記の実施態様は、本発明の少数の具体例であることを理解されたい。本発明の範囲を逸脱することなく、実施態様に様々な変更、組み合わせおよび変形を加え得ることは、当業者であれば理解するであろう。特に、異なる実施態様において、技術的に可能な他の構成を用いて異なる部分の解決策を組み合わせることが可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【手続補正書】

【提出日】2023-12-19

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2024515290000001.app

【国際調査報告】