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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-08
(54)【発明の名称】核酸の濃縮及び検出
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6827 20180101AFI20240401BHJP
C12Q 1/6874 20180101ALI20240401BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20240401BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20240401BHJP
C12N 15/10 20060101ALN20240401BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20240401BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6827 Z ZNA
C12Q1/6874 Z
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6844 Z
C12N15/10 110Z
C12N15/11 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023564030
(86)(22)【出願日】2022-04-15
(85)【翻訳文提出日】2023-12-15
(86)【国際出願番号】 IB2022000217
(87)【国際公開番号】W WO2022219408
(87)【国際公開日】2022-10-20
(31)【優先権主張番号】2105388.9
(32)【優先日】2021-04-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2111381.6
(32)【優先日】2021-08-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2105405.1
(32)【優先日】2021-04-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523391618
【氏名又は名称】バイオフィデリティー
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】オズボーン，ロバート
(72)【発明者】
【氏名】ストラレク－ヤヌツキーヴィッチ，マグダレーナ
(72)【発明者】
【氏名】バルムフォース，バーナビー
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA17
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ42
4B063QR10
4B063QR32
4B063QR40
4B063QR55
4B063QR82
4B063QS12
4B063QS25
4B063QS32
(57)【要約】
加ピロリン酸分解反応に基づくハイブリダイゼーション捕捉方法が開示される。本発明によれば、試料中の第１の核酸配列と第２の核酸配列の比を上昇させる方法が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料をプローブ及び加ピロリン酸分解反応試薬と接触させること；及び前記第１及び第２の核酸分子に対する前記プローブの差次的相補性に基づいて、第２の核酸分子に対して第１の核酸分子を濃縮または枯渇させることを含む、方法。
【請求項2】
試料中の第２の核酸分子と比較して第１の核酸分子の標的領域に対して相補性が異なるプローブと前記試料を接触させることによって、核酸分子の混合物を含む試料中の第１の核酸分子を濃縮または枯渇させること；加ピロリン酸分解反応を実施すること；及び前記第１の核酸分子を濃縮または枯渇させることを含む、方法。
【請求項3】
試料中の第１の核酸配列と第２の核酸配列との比を上昇させる方法であって：ａ）前記第１及び第２の核酸配列を含む試料を、前記第１及び第２の核酸配列に対して相補性が異なるプローブに曝露すること；ｂ）加ピロリン酸分解反応を行うこと；及びｃ）前記第２の核酸配列に対して前記第１の核酸配列を濃縮または枯渇させることを含む、前記方法。
【請求項4】
試料中の第１の核酸配列と第２の核酸配列との比を上昇させる方法であって、前記試料が少なくとも第１及び第２の配列を含み、以下の工程：ａ．１つ以上の核酸分析物を含む前記試料を、以下：
ｉ．一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記プローブが、前記第１または第２の配列の一方に対してより大きい相補性を有し、他方に対してより小さい相補性を有する、前記一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０を含む第１の反応混合物に導入する工程；
ｂ．工程（ａ）によって産生された前記反応混合物を、以下：
ｉ．加ピロリン酸分解酵素；及び
ｉｉ．ピロリン酸イオン源
を含む第２の反応混合物に導入する工程であって、Ａ０が、前記核酸配列の一方により良好にアニーリングして、Ａ０が前記配列と二本鎖複合体を形成し、Ａ０がその３’末端から３’－５’方向に加ピロリン酸分解される少なくとも部分的に二本鎖の中間生成物を生成し、他方の配列に対してより低い程度でアニーリングする任意のＡ０が、より低い程度で３’－５’方向に加ピロリン酸分解される工程；
ｃ．以下によってアニーリングされたＡ０配列複合体を分離する工程であって：
ｉ．前記複合体の鎖を、加ピロリン酸分解反応の結果として分離すること、または
ｉｉ．反応混合物を、前記複合体のスタンドが分離するのに十分な温度であるが、分離するためにより低い程度にアニーリングされた任意のＡ０のスタンドに必要な温度より低い温度まで加熱する前記工程；及び
ｄ．Ａ０、ひいてはそれにアニーリングされたままでのあらゆる核酸配列を、Ａ０にアニーリングされていない任意の核酸配列から分離する工程を含む、前記方法。
【請求項5】
前記第１及び第２の反応混合物が、工程（ａ）の前記第１の反応混合物が加ピロリン酸分解酵素及びピロリン酸イオン源をさらに含むように組み合わされる、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
工程（ｄ）における前記分離が、工程（ａ）の前または後に固体支持体上へのＡ０の捕捉によって行われる、請求項４または５に記載の方法。
【請求項7】
Ａ０が、前記配列のいずれにも相補的ではない５’テール領域をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記固体支持体上への前記捕捉が、Ａ０とのハイブリダイゼーションの前または後のいずれかにそれを介して前記固体支持体に結合する捕捉部分を含む別のオリゴＣ０へのＡ０の５’テール領域のハイブリダイゼーションによって行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
Ａ０が、それを介して前記固体支持体に結合する捕捉部分をさらに含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項10】
前記捕捉部分がビオチンであり、前記固体支持体がストレプトアビジンを含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項11】
前記固体支持体がビーズである、請求項６～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記ビーズが磁性ビーズまたは常磁性ビーズである、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
１つ以上の洗浄工程が、前記工程のうちの１つ以上の間で行われる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記試料が、核酸分析物のアダプタータグ付きライブラリーである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
工程（ｄ）の後、Ａ０にアニーリングされたままの核酸またはＡ０にアニーリングされていない核酸のいずれかが同定される、請求項４～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記配列が増幅によって同定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記配列がマイクロアレイ分析によって同定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項18】
前記配列がシーケンシングによって同定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項19】
前記配列が次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって同定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
異なる標的配列にアニーリングするように設計された異なる配列をそれぞれ有する複数の異なるプローブオリゴヌクレオチドが使用され、複数の標的配列の濃度が、非標的配列と比較して同時に上昇する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記異なるプローブオリゴヌクレオチドが、ヒト健康の診断、治療またはモニタリングに関連する遺伝的バリアントを含むヒトゲノムの配列にアニーリングする配列を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
工程（ｄ）の後、前記試料分析物中の前記遺伝的バリアントの存在または非存在が、Ａ０にアニーリングし、その後放出されるか、または保持される核酸配列の同定によって推測され、それによって疾患または状態の存在または非存在が推測される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
工程（ｄ）の後、前記試料分析物中の前記遺伝的バリアントの存在または非存在が、Ａ０にアニーリングし、その後放出されるか、または保持される核酸配列の同定によって推測され、それによって疾患または状態の適切な治療が推測される、請求項２１に記載の方法。
【請求項24】
工程（ｄ）の後、前記試料分析物中の前記遺伝的バリアントの存在または非存在が、Ａ０にアニーリングし、その後放出されるか、または保持される核酸配列の同定によって推測され、それによって特定の疾患または状態の治療に対する患者の応答が推測される、請求項２１に記載の方法。
【請求項25】
工程（ｄ）の後、前記試料分析物中の前記遺伝的バリアントの存在または非存在が、Ａ０にアニーリングし、その後放出されるかまたは保持される核酸配列の同定によって推測され、１つ以上の患者治療決定が、前記遺伝的バリアントの存在または非存在に基づいて行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項26】
前記試料がヒトの血液または組織試料である、請求項２１～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
前記疾患ががんである、請求項２２～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
前記がんが、肺がん、結腸がん、胃がん、子宮内膜がん、卵巣がん、肝胆道がん、尿路がん、脳がん、及び皮膚がんからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
ａ）Ａ０が、公知の第１の配列に対して、公知の第２の配列よりも大きな相補性を有する配列を含む、１つ以上のオリゴヌクレオチドＡ０；ｂ）１つ以上の加ピロリン酸分解酵素；及び
ｃ）１つ以上のピロリン酸イオンの供給源を含む、キット。
【請求項30】
加ピロリン酸分解反応後に、前記プローブに対してより大きい相補性を有する標的核酸分子を、前記プローブに対してより小さい相補性を有する核酸分子から分離する標的核酸単離成分をさらに含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項31】
１つ以上の固体支持体をさらに含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項32】
１つ以上の緩衝液をさらに含む、請求項２９～３１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項33】
Ａ０が、公知の第１の配列または公知の第２の配列のいずれにも相補的ではない５’テール領域をさらに含む、請求項２９～３２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項34】
Ａ０が捕捉部分をさらに含む、請求項２９～３３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項35】
捕捉部分を含む１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドＣ０をさらに含み、Ａ０の５’テール領域がＣ０の領域と相補的である、請求項２９～３３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項36】
前記捕捉部分がビオチンであり、前記固体支持体がストレプトアビジンを含む、請求項３４または３５に記載のキット。
【請求項37】
前記固体支持体が、捕捉オリゴヌクレオチドＣ０を含み、Ａ０の５’テール領域がＣ０の領域と相補的である、請求項３１～３６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項38】
前記固体支持体がビーズである、請求項３１～３７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項39】
前記ビーズが磁性ビーズまたは常磁性ビーズである、請求項３８に記載のキット。
【請求項40】
１つ以上のエピジェネティック改変感受性または依存性制限酵素をさらに含む、請求項２９～３９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項41】
１つ以上の制限エンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項２９～４０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項42】
１つ以上のトランスポソームをさらに含む、請求項２９～４１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項43】
Ｃａｓ９をさらに含む、請求項２９～４２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項44】
１つ以上のトランスポザーゼをさらに含む、請求項２９～４３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項45】
１つ以上のリガーゼをさらに含む、請求項２９～４４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項46】
１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項２９～４５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項47】
前記１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドが、加ピロリン酸分解に耐性である、請求項４６に記載のキット。
【請求項48】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬をさらに含む、請求項２９～４７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項49】
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）試薬をさらに含む、請求項２９～４８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項50】
ＤＮＡライブラリー調製キットをさらに含む、請求項２９～４９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項51】
１つ以上の分子プローブをさらに含む、請求項２９～５０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項52】
前記１つ以上の分子プローブが蛍光標識されている、請求項５１に記載のキット。
【請求項53】
クラウディング剤をさらに含む、請求項２９～５２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項54】
界面活性剤をさらに含む、請求項２９～５３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項55】
溶媒をさらに含む、請求項２９～５４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項56】
ホスホヒドロラーゼをさらに含む、請求項２９～５５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項57】
ピロホスファターゼをさらに含む、請求項２９～５６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項58】
Ａ０が、ヒトゲノムの野生型配列に相補的であり、前記野生型配列の変異対立遺伝子に相補的でない配列を有する、請求項２９～５７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項59】
Ａ０が、ヒトゲノムの野生型配列に相補的でなく、前記野生型配列の変異対立遺伝子に相補的である配列を有する、請求項２９～５７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項60】
ＲＮＡのｃＤＮＡへの転写のための構成要素をさらに含む、請求項２９～５９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項61】
請求項２９～６０までのいずれか１項に記載のキットの使用。
【請求項62】
試料中の標的核酸を濃縮または枯渇させるための、請求項２９～６０のいずれか１項に記載のキットの使用。
【請求項63】
反応混合物であって、ａ）試料；
ｂ）加ピロリン酸分解濃度の加ピロリン酸分解試薬；
ｃ）プローブにハイブリダイズした前記試料からの第１の核酸分子であって、前記プローブが第２の核酸よりも前記第１の核酸分子に対して大きい相補性を有する、前記第１の核酸分子；及び
ｄ）前記プローブにハイブリダイズした前記試料からの第２の核酸分子を含む、前記反応混合物。
【請求項64】
反応混合物であって、ａ）試料；
ｂ）加ピロリン酸分解濃度の加ピロリン酸分解試薬；及び
ｃ）前記反応混合物の第１の領域中の第１の核酸分子であって、前記第１の核酸が前記試料中の前記第１の核酸の濃度よりも高い濃度を前記第１の領域で有する、前記第１の核酸分子を含む、前記反応混合物。
【請求項65】
反応混合物であって、ａ）試料；
ｂ）加ピロリン酸分解濃度の加ピロリン酸分解試薬；及び
ｃ）前記反応混合物の第１の領域中の第１の核酸分子であって、前記第１の核酸が前記試料中の前記第１の核酸の濃度よりも低い濃度を前記第１の領域で有する、前記第１の核酸分子を含む、前記反応混合物。
【請求項66】
試料中の第１の核酸配列と第２の核酸配列との比を変化させる方法であって、前記試料が少なくとも第１及び第２の配列を含み、以下の工程：ａ．１つ以上の核酸分析物を含む試料を
ｉ．一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記プローブが、前記第１または第２の配列の一方に対して、他方と比較してより大きい相補性を有する、前記一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０；
ｉｉ．加ピロリン酸分解酵素；及び
ｉｉｉ．ピロリン酸イオン源を含む第１の反応混合物に導入する工程であって、
Ａ０が、前記第１の核酸配列の一方により良好にアニーリングして、Ａ０の３’末端が前記配列と二本鎖複合体を形成し、Ａ０がその３’末端から３’－５’方向に加ピロリン酸分解される少なくとも部分的に二本鎖の中間生成物を生成し、前記第２の配列に対してあまり良好にアニーリングされない任意のＡ０が、より低い程度で３’－５’方向に加ピロリン酸分解される前記工程；
ｂ．前記第１の配列に対してアニーリングする任意の短縮Ａ０配列複合体を選択的に変性させる工程；及び
ｃ．Ａ０、ひいてはＡ０にアニーリングされたままである前記第２の核酸配列を、Ａ０にアニーリングされていない前記第１の核酸配列から分離し、それによって、前記第２の核酸配列に対する前記第１の核酸配列の比を変化させる工程を含む、前記方法。
【請求項67】
前記第１の核酸配列にアニーリングして二本鎖複合体を形成するＡ０が、Ａ０と前記第１の核酸配列との間に安定な二重鎖が存在するには不十分な相補性が残る程度まで加ピロリン酸分解され、Ａ０及び前記核酸配列が変性する、請求項６６に記載の方法。
【請求項68】
前記選択的変性が、前記反応混合物を加熱することを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項69】
前記変性が前記反応物のｐＨを上昇させることを含む、請求項６７～６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項70】
前記変性が、前記反応混合物の塩濃度を低下させることを含む、請求項６７～６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項71】
前記固体支持体上へのＡ０の捕捉が工程（ａ）の前に行われる、請求項６６～７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項72】
前記固体支持体上へのＡ０の捕捉が工程（ａ）の後に行われる、請求項６６～７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項73】
Ａ０が、前記配列のいずれにも相補的ではない５’テール領域をさらに含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項74】
前記固体支持体上への前記捕捉が、Ａ０とのハイブリダイゼーションの前または後のいずれかにそれを介して前記固体支持体に結合する捕捉部分を含む別のオリゴＣ０へのＡ０の５’テール領域のハイブリダイゼーションによって行われる、請求項７３に記載の方法。
【請求項75】
Ａ０が、それを介して前記固体支持体に結合する捕捉部分をさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項76】
前記捕捉部分がビオチンであり、前記固体支持体がストレプトアビジンを含む、請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項77】
前記固体支持体がビーズである、請求項７４～７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項78】
前記ビーズが磁性ビーズまたは常磁性ビーズである、請求項７７に記載の方法。
【請求項79】
前記試料が核酸分析物のライブラリーである、請求項６６～７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項80】
工程（ｃ）の後、Ａ０にアニーリングされたままの核酸が同定される、請求項６６～７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項81】
工程（ｃ）の後、Ａ０にアニーリングされていない核酸が同定される、請求項６６～７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項82】
異なる標的配列にアニーリングするように設計された異なる配列をそれぞれ有する複数の異なるプローブオリゴヌクレオチドＡ０が使用され、複数の標的配列の濃度が、非標的配列と比較して同時に上昇または低下する、請求項６６～８１のいずれか１項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２１年４月１５日に出願された英国特許出願第２１０５４０５．１号、２０２１年４月１５日に出願された第２１０５３８８．９号及び、２０２１年８月６日出願された第２１１１３８１．６号の優先権を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
ファイルサイズが１５，４６４バイトである、２０２２年４月１５日に作成された「４００１８－６０１＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ＿ＳＴ２５」と題する、本明細書と共に提出されたコンピュータ可読配列表の本文は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ファイルサイズが１５，４６４バイトである、２０２２年４月１５日に作成された「４００１８－６０１＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ＿ＳＴ２５」と題する、本明細書と共に提出されたコンピュータ可読配列表の本文は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
野生型分子のプールにおける低頻度バリアントの標的化検出は、がんの早期検出、がんの進行のモニタリング、がん治療の標的化、非侵襲的出生前検査、特定の（新）抗原を標的とするＴ細胞集団のモニタリング、及び臓器移植拒絶の早期警告のために臨床的に重要である。ハイブリダイゼーション捕捉と次世代シーケンシング（ＮＧＳ）との組み合わせは、低頻度バリアントの標的化及び多重検出に最も一般的に適用されている方法であるが、いくつかの最適以下の特徴を有する。一般に、ハイブリダイゼーション捕捉は、目的の標的領域を濃縮するが、バリアント分子は濃縮しない。これにより、シーケンシングリードの大部分がバリアント分子ではなく野生型分子に由来することになる。これは無駄であり、コストがかかり、保存、ライブラリー調製及びシーケンシングからのエラーのバックグラウンドに対してまれなバリアントを検出することを困難にする。これは、約０．１％未満のバリアントの慣用的な検出には不十分な特異性を有するＮＧＳをもたらす。改変されたライブラリー作製方法（例えばデュプレックスシーケンシング）は、特異性を高めることができ、単一分子から正確なシーケンシングデータを得ることができる。残念なことに、二重シーケンシングのような方法（例えば、末端修復を回避するようにライブラリー調製方法を改変することによって、及び分子的ボトルネックを意図的に課すことによって）も、感受性を低下させる。本明細書に記載の方法は、例えば、加ピロリン酸分解（ＰＰＬ）に基づく改変されたハイブリダイゼーション捕捉法を使用して、目的の標的領域内に位置するバリアント分子の濃縮を可能にする。これは両方とも、必要とされるシーケンシングリードの数を減少させるが、ＮＧＳの現在の検出限界を下回る低頻度バリアント分子の多重検出への扉を開くものである。
【発明の概要】
【0004】
いくつかの実施形態では、加ピロリン酸分解反応に基づくハイブリダイゼーション方法が本明細書で提供される。これらの方法は、ヌクレオチド不整合の遮断基を含む一本鎖オリゴヌクレオチド基質または二本鎖基質では効率的に進行しない反応である、加ピロリン酸分解の二本鎖特異性を利用している。
【0005】
例えば、いくつかの実施形態では、試料（例えば、２つ以上の異なる核酸分子を含む）をプローブ及び加ピロリン酸分解反応試薬と接触させることと、第１及び第２の核酸分子に対するプローブの異なる相補性に基づいて、第２の核酸分子に対して第１の核酸分子を濃縮または枯渇させ、第１及び第２の核酸分子にハイブリダイズしたときにプローブの異なるレベルの加ピロリン酸分解をもたらすことを含む方法が本明細書で提供される。
【0006】
例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、第１の核酸分子を、試料中の他の核酸分子と比較して第１の核酸分子上の標的領域に対して相補性が異なるプローブと接触させることによって、核酸分子の混合物を含む試料中の第１の核酸分子を濃縮または枯渇させること；加ピロリン酸分解反応を実施すること；及び第１の核酸分子を濃縮または枯渇させることを含む。いくつかの実施形態では、プローブは、試料中の第２の核酸の対応する標的領域に対して相補的であるよりも、第１の核酸分子の標的領域に対して相補的である。いくつかの実施形態では、プローブは、試料中の第２の核酸の対応する標的領域に対して相補的であるよりも、第１の核酸分子の標的領域に対して相補的でない。いくつかの実施形態では、第１の核酸及び第２の核酸は、配列変異（例えば、点変異、欠失、挿入、多ヌクレオチド変化、融合など）によって異なる。いくつかの実施形態では、プローブは、より大きい相補性の配列の標的領域に完全に相補的であり、より小さい相補性の配列の対応する標的領域に見出される配列変異に対して１つ以上のミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、第１及び第２の核酸分子の両方の標的領域に対する１つ以上のミスマッチを含むが、より低い相補性の核酸の標的領域に対してより多くのミスマッチを含む。特に、プローブは、プローブが、第１の核酸にハイブリダイズするときに、第２の核酸と比較して加ピロリン酸分解の程度が異なるように設計され、加ピロリン酸分解によって生成された異なる反応生成物に基づいて、第２の核酸と比較して第１の核酸の選択的濃縮または枯渇を可能にする。
【0007】
例えば、いくつかの実施形態では、試料中の第１の核酸配列と第２の核酸配列との比を増加または減少させる方法であって：ａ）第１及び第２の核酸配列を含む試料を、第１及び第２の核酸配列に対して相補性が異なるプローブに曝露すること；ｂ）加ピロリン酸分解反応を行うこと；及びｃ）第２の核酸配列に対して第１の核酸配列を濃縮または枯渇させることを含む方法が本明細書で提供される。
【0008】
本発明のいくつかの実施形態では、試料中の第１の核酸配列対第２の核酸配列の比を増加させる方法であって、試料が少なくとも第１及び第２の配列を含み、以下の工程：
ａ．１種以上の核酸分析物を含む試料を
ｉ．第１及び第２の核酸配列に対して差次的相補性を有する一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０（例えば、前記プローブの３’末端は、第１または第２の配列の一方に完全に相補的であるが、他方に不完全に相補的である）を含む第１の反応混合物に導入する工程；
ｂ．工程（ａ）によって製造された反応混合物を、以下
ｉｉ．加ピロリン酸分解酵素；及び
ｉｉｉ．ピロリン酸イオン源を含む第２の反応混合物に導入する工程であって、
Ａ０は、核酸配列の１つにアニーリングして（例えば、完全に）、Ａ０（例えば、Ａ０の３’末端）が前記配列と二本鎖複合体を形成し、Ａ０がその３’末端から３’－５’方向に加ピロリン酸分解される少なくとも部分的に二本鎖の中間生成物を生成し、他方の配列にあまり完全ではなく（例えば、不完全に）アニーリングしたＡ０は、あまり完全ではない（例えば、不完全な）アニーリングにより、３’－５’方向にあまり完全ではない程度に加ピロリン酸分解される、工程；
ｃ．以下によってより完全に（例えば、完全に）アニーリングされたＡ０配列複合体を分離する工程であって：
ｉｖ．前記複合体の鎖を、加ピロリン酸分解反応の結果として分離する（例えば溶融分離する）こと、または
ｖ．反応混合物を、前記複合体の鎖が分離（例えば、溶融分離）するのに十分な温度であるが、分離する（例えば、溶融して分離する）ためにあまり完全にはアニーリングされていない（例えば、不完全に）任意のＡ０の鎖に必要な温度より低い温度まで加熱することにより分離する、工程；及び
ｄ．Ａ０、ひいてはそれにアニーリングされたままでのあらゆる核酸配列を、Ａ０にアニーリングされていない任意の核酸配列から分離する工程を含む、方法が提供される。
ａ．１種以上の核酸分析物を含む試料を
ｉ．第１及び第２の核酸配列に対して差次的相補性を有する一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０（例えば、前記プローブの３’末端は、第１または第２の配列の一方に完全に相補的であるが、他方に不完全に相補的である）を含む第１の反応混合物に導入する工程；
ｂ．工程（ａ）によって製造された反応混合物を、以下
ｉｉ．加ピロリン酸分解酵素；及び
ｉｉｉ．ピロリン酸イオン源を含む第２の反応混合物に導入する工程であって、
Ａ０は、核酸配列の１つにアニーリングして（例えば、完全に）、Ａ０（例えば、Ａ０の３’末端）が前記配列と二本鎖複合体を形成し、Ａ０がその３’末端から３’－５’方向に加ピロリン酸分解される少なくとも部分的に二本鎖の中間生成物を生成し、他方の配列にあまり完全ではなく（例えば、不完全に）アニーリングしたＡ０は、あまり完全ではない（例えば、不完全な）アニーリングにより、３’－５’方向にあまり完全ではない程度に加ピロリン酸分解される、工程；
ｃ．以下によってより完全に（例えば、完全に）アニーリングされたＡ０配列複合体を分離する工程であって：
ｉｖ．前記複合体の鎖を、加ピロリン酸分解反応の結果として分離する（例えば溶融分離する）こと、または
ｖ．反応混合物を、前記複合体の鎖が分離（例えば、溶融分離）するのに十分な温度であるが、分離する（例えば、溶融して分離する）ためにあまり完全にはアニーリングされていない（例えば、不完全に）任意のＡ０の鎖に必要な温度より低い温度まで加熱することにより分離する、工程；及び
ｄ．Ａ０、ひいてはそれにアニーリングされたままでのあらゆる核酸配列を、Ａ０にアニーリングされていない任意の核酸配列から分離する工程を含む、方法が提供される。
【0009】
プローブには、加ピロリン酸分解反応の前または間に除去される１つ以上の成分が提供され得る。例えば、ブロッキング基が除去されるまで、加ピロリン酸分解またはポリメラーゼ反応の開始を防止する非相補的フラップまたは他のブロッキング基をプローブの３’末端に設けてもよい。ブロッキング基は、任意の適切な機構（例えば、酵素的切断、化学反応、温度シフトなど）によって除去することができる。異なる核酸分子にハイブリダイズした場合に、示差的な加ピロリン酸分解産物を提供するプローブの配列は、初期プローブの任意の適切な位置に配置され得る。例えば、ミスマッチ配列は、プローブの３’末端の３’末端塩基に配置され得る。ミスマッチ配列は、３’末端でプローブの内部に配置され得る。ミスマッチ配列は、プローブの中央に配置され得る。ミスマッチ配列は、プローブの５’半分内に配置され得る。
【0010】
プローブの５’末端は、識別子（例えば、試料識別子）として作用する領域（例えば、５’テール）を含み得る。このような配列は、例えば、混合試料から特定の試料または特定の領域から捕捉された分子を１つずつ選択的にプルダウンするために使用される。このような識別子は、複数の異なる標的が同じ試料または同じ反応容器内で反応を受けている多重領域において特定の用途を見出し得る。
【0011】
本発明の方法を適用することができる分析物／配列は、探索されている標的ポリヌクレオチド配列（複数可）を含む、天然または合成のＤＮＡまたはＲＮＡ分子などの核酸である。いくつかの実施形態では、分析物／配列は、典型的には、それ及び他の生物学的材料を含有する水溶液中に存在し、いくつかの実施形態では、分析物／配列は、試験の目的のために対象ではない他のバックグラウンド核酸分子と共に存在する。いくつかの実施形態では、分析物／配列は、これらの他の核酸成分と比較して少量で存在する。好ましくは、例えば、分析物が細胞材料を含有する生物学的検体に由来する場合、方法の工程（ｉ）を実施する前に、これらの他の核酸及び無関係な生物学的材料の一部または全部が、試料調製技術（例えば、濾過、遠心分離、クロマトグラフィーまたは電気泳動）を使用して除去されているであろう。
【0012】
本発明の組成物及び方法は、環境（例えば、水、土壌、空気など）試料及び生物学的試料を含むがこれらに限定されない任意の種類の試料に対して使用され得る。生物学的試料は、植物、動物、感染性病原体などを含む任意の供給源からのものであり得る。適切には、いくつかの実施形態では、分析物／配列は、血液、血漿、痰、尿、皮膚、生検または外科的切除などの哺乳動物対象（特にヒト患者）から採取された生物学的試料に由来する。いくつかの実施形態では、存在する任意の細胞を破壊することによって分析物／配列が放出されるように、生物学的試料を溶解に供する。他の実施形態では、分析物／配列は、例えば、血液または血漿中を循環する無細胞ＤＮＡのように、試料自体の中に遊離形態で既に存在していてもよい。
【0013】
本発明の組成物及び方法は、目的の分析物の対立遺伝子画分が低い可能性がある、歴史的に困難な試料タイプについて特定の用途を見出す。そのような試料としては、血液、尿、サイトスポンジ収集試料（例えば、食道試料）、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）由来試料、胸水、及び脳脊髄液（ＣＳＦ）が含まれる。
【0014】
いくつかの実施形態において、試料はプールされた試料である。プールされた試料は、プールされた収集物が試験されるバッチにおいて複数の試料を混合することを含む。この手法は、より限られた量のリソースを使用して試験することができる個々の試料の数を増加させる。目的のプールされた試料には、提供された血液試料、農業試料、食品試料、精子試料、及び感染性病原体（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＩＶ、ＨＣＶなど）の存在について試験された生物学的試料が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、プールされた試料は、その生成の性質上、複数の異なる供給源からのプールされた試料を有する環境的に収集された試料（例えば、廃水試料）である。試料のプール化は、試料が互いに希釈するにつれてバリアントの対立遺伝子画分を減少させ得るが、スクリーニングの効率の劇的な増加をもたらし得る。本明細書で提供される技術は、非常に低い対立遺伝子画分での検出を可能にするので、プールされた試料の分析に特によく適している。いくつかの実施形態では、バーコードまたは他の複雑な調製工程を使用せずに各初期試料の画分をプールし、プールされた試料を試験する。陽性結果が得られた場合、プールされていない試料の残りの画分を個別に試験することができる。
【0015】
本明細書に記載の方法と共に用途を見出す組成物（例えば、試薬、キット、反応混合物、機器、ソフトウェア）も本明細書で提供される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を実施するために必要、十分、または有用な１つ以上の試薬を含む組成物がここに提供される。例えば、いくつかの実施形態において、組成物は：１つ以上のオリゴヌクレオチドＡ０を含み、Ａ０は、既知の第１の配列及び既知の第２の配列に差次的に相補的な（例えば、既知の第１の配列に完全に相補的であるが、既知の第２の配列に不完全に相補的である）配列（例えば、３’末端）；１つ以上の加ピロリン酸分解酵素；及びピロリン酸イオンの１つ以上の供給源を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、加ピロリン酸分解反応後に、前記プローブ（例えば、前記プローブの３’末端）により完全に（例えば、完全に）相補的な標的核酸分子を、前記プローブ（例えば、前記プローブの３’末端）にあまり完全ではなく（例えば、不完全に）相補的な核酸分子から分離する標的核酸単離成分をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上の固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上の緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、Ａ０は、既知の第１の配列または既知の第２の配列のいずれにも相補的ではない５’テール領域を含む。いくつかの実施形態では、Ａ０は、捕捉部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、捕捉部分を含み、Ａ０の５’テール領域がＣ０の領域に相補的である１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドＣ０をさらに含む。いくつかの実施形態では、捕捉部分はビオチンであり、固体支持体はストレプトアビジンを含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は、捕捉オリゴヌクレオチドＣ０を含み、Ａ０の５’テール領域はＣ０の領域に対して相補的である。いくつかの実施形態において、固体支持体はビーズ（例えば、磁性ビーズまたは常磁性ビーズ）である。いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上のエピジェネティック改変感受性または依存性制限酵素をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼをさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上のトランスポソームをさらに含む。いくつかの実施形態において、組成物は、Ｃａｓタンパク質（例えばＣａｓ９）を含む。いくつかの実施形態において、組成物は１つ以上のトランスポザーゼをさらに含む。いくつかの実施形態において、組成物は１つ以上のリガーゼをさらに含む。いくつかの実施形態において、組成物は、１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドは、加ピロリン酸分解に耐性である。いくつかの実施形態では、組成物は、増幅（例えば、ＰＣＲ）、シーケンシング（例えば、次世代シーケンシング）または検出反応を行うための試薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上の分子プローブをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の分子プローブは蛍光標識されている。いくつかの実施形態では、Ａ０（例えば、Ａ０の３’末端）は、ヒトゲノムの野生型配列に対してより相補的（例えば、完全に相補的）であり、前記野生型配列の変異対立遺伝子に対してあまり相補的ではない（例えば、不完全に相補的である）。いくつかの実施形態では、Ａ０（例えば、Ａ０の３’末端）は、ヒトゲノムの野生型配列に対してあまり相補的ではなく（例えば、不完全に相補的である）、前記野生型配列の変異対立遺伝子に対してより相補的である（例えば、完全に相補的である）。いくつかの実施形態では、組成物は、ＲＮＡのｃＤＮＡへの転写のための成分をさらに含む。
【0016】
いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書中に記載される方法のいずれかの特定の時点における反応を含む反応混合物である。いくつかの実施形態では、反応混合物は、加ピロリン酸分解の前に存在する。いくつかの実施形態では、反応混合物は、加ピロリン酸分解中に存在する。いくつかの実施形態では、反応混合物は、加ピロリン酸分解後に存在する。いくつかの実施形態では、反応混合物は、本明細書に記載の方法のプローブ／核酸ハイブリダイゼーション複合体を含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、本明細書に記載の方法の捕捉された核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、加ピロリン酸分解反応を受けた試料中に存在した所望の標的核酸の濃度よりも高いまたは低い濃度の所望の標的核酸を含む領域を含む。例えば、いくつかの実施形態では、以下：試料；加ピロリン酸分解濃度（すなわち、加ピロリン酸分解に有利な試薬濃度）の加ピロリン酸分解試薬；配列を有するプローブにハイブリダイズした試料からの第１の核酸分子であって、プローブの識別領域が第１の核酸分子に相補的である、第１の核酸分子；及び前記配列を有するプローブとハイブリダイズした試料由来の第２の核酸分子であって、プローブの識別領域が第２の核酸分子と完全に相補的ではない、第２の核酸分子を含む反応混合物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、試料；加ピロリン酸分解濃度での加ピロリン酸分解試薬；及び反応混合物の第１の領域中の第１の核酸分子であって、試料中の第１の核酸の濃度よりも高いまたは低い濃度を第１の領域中で有する、核酸分子を含む反応混合物が本明細書で提供される。
【0017】
組成物（例えば、キットの使用、反応混合物の使用、試薬の使用、器具の使用、ソフトウェアの使用）の使用も本明細書で提供される。例えば、試料中の標的核酸を濃縮または枯渇させるための組成物の使用が本明細書で提供される。
【0018】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法に用途を見出す装置及び機器が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、装置及び機器は、試料を収集して反応容器に分配する用途を見出す。いくつかの実施形態では、装置及び機器は、方法を実施するための反応チャンバを提供する。いくつかの実施形態では、装置及び機器は、反応物を収容するため、及び／または濃縮された所望の標的核酸を単離するため、または所望の標的核酸を枯渇させるための複数のゾーンまたは領域（例えば、ウェル、チャネルなど）を提供する。いくつかの実施形態では、装置及び機器は、核酸分子を増幅またはシーケンシングする用途を見出す。いくつかの実施形態では、装置及び機器は、核酸分子を検出する用途を見出す。いくつかの実施形態では、装置及び機器は、ユーザから情報を受信または送信する用途を見出す。例えば、装置及び機器は、ユーザ命令を受信するためのユーザインターフェースと、結果をユーザに視覚的に提示するためのディスプレイとを備えることができる。
【0019】
いくつかの実施形態では、コンピューティングデバイスが本明細書で提供される。コンピューティングデバイスは、本明細書に記載の方法を容易にするために機器または装置を制御する用途を見出す。いくつかの実施形態では、コンピューティングデバイスは、データを収集、分析、及び報告する。いくつかの実施形態では、コンピューティングデバイスは、コンピュータプログラムを実行する１つ以上のプロセッサを備える。いくつかの実施形態では、コンピューティングデバイスは、１つ以上のコンピューティング工程を実行するようにプロセッサに指示する命令を含む非一時的コンピュータ可読媒体（例えば、ソフトウェア）を含む。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】ビオチン化プローブがストレプトアビジン被覆常磁性ビーズに予め結合している本発明の一実施形態の概略図である。次いで、ビーズに結合プローブを標的ＤＮＡとハイブリダイズさせ、加ピロリン酸分解を行う。この例では、ビーズ結合プローブは、野生型配列と完全に相補的であり、バリアント配列に対して不完全に相補的／ミスマッチである。野生型配列にハイブリダイズしたプローブは加ピロリン酸分解され、野生型ＤＮＡはビーズから溶液中に放出されるが、バリアント配列にハイブリダイズしたプローブはミスマッチしているため、野生型配列と同程度に加ピロリン酸分解されず、バリアント配列はビーズに結合したままである。次いで、バリアント配列を、一例ではシーケンシングによって同定することができる。
【図2】ビオチン化プローブが標的ＤＮＡにハイブリダイズされ、加ピロリン酸分解を受け、次いでストレプトアビジン常磁性ビーズ上に捕捉される、本発明の一実施形態の概略図である。この例では、プローブは野生型配列と完全に相補的であり、バリアント配列と不完全に相補的／ミスマッチである。野生型配列にハイブリダイズしたプローブは加ピロリン酸分解され、野生型ＤＮＡはプローブから放出されるが、ミスマッチバリアントブリダイズしたプローブは野生型配列と同程度に加ピロリン酸分解されず、したがってバリアント配列はプローブ結合のままである。次に、プローブはストレプトアビジン常磁性ビーズ上に捕捉され、その際、バリアント配列のみがビーズ結合する。次いで、バリアント配列を、一例ではシーケンシングによって同定することができる。
【図3】プローブと標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの前に、標的ＤＮＡがアダプタータグ付け及びＰＣＲによる増幅を受ける、図１に記載されたものによる本発明の一実施形態の概略図である。ハイブリダイゼーション後、プローブは加ピロリン酸分解を受け、アダプタータグ付きバリアント配列はビーズに結合したままである。次いで、ビーズ結合バリアントをＰＣＲによって増幅する。
【図4】標的分子の加ピロリン酸分解依存的放出を示す。Ｃｑ値が低いほど、ビーズから上清に放出された標的配列が多くなる。Ｃｑ値は、加ピロリン酸分解反応が行われるときに濃縮プローブと完全に相補的である標的配列に対してより低い。これは、目的の標的がビーズから放出されたことを示す。加ピロリン酸分解反応を実施するかどうかにかかわらず、ミスマッチ標的配列のＣｑ値に差はなかった。これは、ミスマッチ標的がビーズ上に留まり、上清に放出されなかったことを示す。
【図5】ＥＧＦＲエクソン２０ Ｔ７９０Ｍバリアント。グラフは、Ｔ７９０ＭのＰＰｉ依存性検出を示す。ハイブリダイゼーション工程の温度を６０℃に上昇させることにより、より多くのＴ７９０Ｍバリアント分子を回収する。ハイブリダイゼーション工程の温度を６０℃に上昇させると、ＷＴ（野生型）分子の回収が減少する。所与の条件において、０．２ｆＭのＴ７９０Ｍバリアント分子を検出することができる。
【図6】異なる変異対立遺伝子画分（ＶＡＦ）でのＥＧＦＲエクソン２０ Ｔ７９０Ｍバリアント。０．１％ＶＡＦという低いＰＰｉ依存性検出を示す。図６Ａでは、グラフは０～５０％のＶＡＦからのＴ７９０Ｍバリアントを示す。図６Ｂでは、０．１％ＶＡＦの検出を拡大する。
【図7】０．１％ＶＡＦでのＥＧＦＲエクソン２０ Ｔ７９０Ｍバリアントの検出に対するハイブリダイゼーション緩衝液及びハイブリダイゼーション時間の効果。この特定の実験では、１時間のハイブリダイゼーションでは、目的のバリアントを検出するのに十分ではない。３時間のハイブリダイゼーション工程を使用する場合の最良の性能は、緩衝液２を用いて達成される（実施例３参照）。
【図8】ＥＧＦＲエクソン２０ Ｔ７９０Ｍバリアントの濃縮係数を示す図である。グラフは、０．１及び１％ＶＡＦの濃縮係数、及びハイブリダイゼーション工程中にどの緩衝液が使用されるかに対するその依存性を示す。濃縮係数の増加は、ＰＰｉの存在に依存する。最も高い濃縮係数は、緩衝液２及び緩衝液５で達成される（実施例３参照）。
【発明を実施するための形態】
【0021】
いくつかの実施形態では、本方法は、所望の核酸配列を濃縮または枯渇させる方法として加ピロリン酸分解を使用する。加ピロリン酸分解反応は、ハイブリッド形成された鎖間の相補性に依存し、したがって、ミスマッチの有無にかかわらず鎖のみを消化する。この反応は、相補的である特定の配列を選択的に短縮し、一方で、消化されにくいミスマッチ配列を残す。反応は、短縮された配列にハイブリダイズした分子が回収され、分析されるように行うことができる。あるいは、反応は、より短い配列が分析されるように行うことができる。あるいは、いかなる加ピロリン酸分解も受けていない配列が分析されるように反応を行うことができる。
【0022】
濃縮または枯渇を１回以上繰り返して、目的の配列の試料をさらに濃縮することができる。例えば、いくつかの実施形態では、第１ラウンドと同じ試薬を使用して第１ラウンドが完了した後に、濃縮または枯渇の第２ラウンドが行われる。他の実施形態では、濃縮または除去される標的核酸の異なる配列に対して選択的な異なるプローブが使用される。このアプローチは、濃縮または枯渇される配列が、除去される配列と少なくとも２つの塩基位置が異なる場合に特によく適している。例えば、野生型と比較して２つの多型を含む標的核酸は、第１の多型に基づく１回目の濃縮または枯渇、及び第２の多型に基づく２回目の濃縮または枯渇を受け得る。指数レベルの濃縮または枯渇は、複数回使用することによって達成され得る。いくつかの実施形態では、合成配列が合成配列を含まない配列と比較して濃縮または枯渇の標的となるように、濃縮または枯渇の前に、標的核酸を改変して合成配列（例えば、多型の添加）を生成する。いくつかの実施形態において、２つ以上の核酸を、複数のプローブを使用することによって、任意の所与の反応ラウンドにおいて濃縮または枯渇し得る。いくつかの実施形態において、第２の核酸が１回以上の反応において枯渇し得る間、特定の核酸が濃縮され得る。
【0023】
本発明の一態様では、試料中の第１の核酸配列と第２の核酸配列との比を変化させるための方法であって、試料が少なくとも第１及び第２の配列を含み、以下の工程：
ａ．１種以上の核酸分析物を含む試料を
ｉ．プローブが第１及び第２の配列に差次的に相補的な（例えば、前記プローブの３’末端または他の領域が、第１または第２の配列の一方に対して完全に相補的であるが、他方に対して不完全に相補的である）一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０；
ｉｉ．加ピロリン酸分解酵素；及び
ｉｉｉ．ピロリン酸イオン源を含む第１の反応混合物に導入する工程であって；
Ａ０が、第１の核酸配列に（例えば、完全に）アニーリングして、Ａ０（例えば、Ａ０の３’末端）が、前記配列と二本鎖複合体を形成し、Ａ０が、その３’末端から３’－５’方向に加ピロリン酸分解される少なくとも部分的に二本鎖の中間生成物を生成し、一方、第２の配列にあまり良好にアニーリングしなかった（例えば、不完全に）Ａ０は、前記少ない（例えば、不完全）アニーリングのために、より少ない程度に３’－５’方向に加ピロリン酸分解される、工程；
ｂ．第１の配列に対してより良好に（例えば、完全に）アニーリングされた任意の短縮Ａ０配列複合体を選択的に変性させる工程；及び
ｃ．Ａ０、ひいてはＡ０にアニーリングされたままで第２の核酸配列を、Ａ０にアニーリングされていない第１の核酸配列から分離し、それによって、第２の核酸配列に対する第１の核酸配列の比を変化させる工程を含む、方法が提供される。
ａ．１種以上の核酸分析物を含む試料を
ｉ．プローブが第１及び第２の配列に差次的に相補的な（例えば、前記プローブの３’末端または他の領域が、第１または第２の配列の一方に対して完全に相補的であるが、他方に対して不完全に相補的である）一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０；
ｉｉ．加ピロリン酸分解酵素；及び
ｉｉｉ．ピロリン酸イオン源を含む第１の反応混合物に導入する工程であって；
Ａ０が、第１の核酸配列に（例えば、完全に）アニーリングして、Ａ０（例えば、Ａ０の３’末端）が、前記配列と二本鎖複合体を形成し、Ａ０が、その３’末端から３’－５’方向に加ピロリン酸分解される少なくとも部分的に二本鎖の中間生成物を生成し、一方、第２の配列にあまり良好にアニーリングしなかった（例えば、不完全に）Ａ０は、前記少ない（例えば、不完全）アニーリングのために、より少ない程度に３’－５’方向に加ピロリン酸分解される、工程；
ｂ．第１の配列に対してより良好に（例えば、完全に）アニーリングされた任意の短縮Ａ０配列複合体を選択的に変性させる工程；及び
ｃ．Ａ０、ひいてはＡ０にアニーリングされたままで第２の核酸配列を、Ａ０にアニーリングされていない第１の核酸配列から分離し、それによって、第２の核酸配列に対する第１の核酸配列の比を変化させる工程を含む、方法が提供される。
【0024】
本発明の一態様では、試料中の第１の核酸配列と第２の核酸配列との比を上昇させるための方法であって、試料が少なくとも第１及び第２の配列を含み、以下の工程：
ａ．１種以上の核酸分析物を含む試料を、以下：
ｉ．プローブ（例えば、前記プローブの３’末端または他の領域）が、第１または第２の配列の一方に対してより相補的（例えば、完全に相補的である）であるが、他方に対してあまり相補的でない（例えば、不完全に相補的である）一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０を含む第１の反応混合物に導入する工程；
ｂ．工程（ａ）によって製造された反応混合物を、以下：
ｉｉ．加ピロリン酸分解酵素；及び
ｉｉｉ．ピロリン酸イオン源を含む第２の反応混合物に導入する工程であって、
Ａ０は、核酸配列の１つにアニーリングして（例えば、完全に）、Ａ０（例えば、Ａ０の３’末端）が前記配列と二本鎖複合体を形成し、Ａ０がその３’末端から３’－５’方向に加ピロリン酸分解される少なくとも部分的に二本鎖の中間生成物を生成し、他方の配列にあまり完全ではなく（例えば、不完全に）アニーリングしたＡ０は、上記の低い（例えば、不完全な）アニーリングにより、３’－５’方向にあまり良好ではない程度に加ピロリン酸分解される、工程；
ｃ．以下によってより良好に（例えば、完全に）アニーリングされたＡ０配列複合体を分離する工程であって：
ｉ．前記複合体の鎖を、加ピロリン酸分解反応の結果として分離する（例えば溶融分離する）こと、または
ｉｉ．反応混合物を、前記複合体の鎖が分離（例えば、溶融分離）するのに十分な温度であるが、分離する（例えば、溶融して分離する）ためにあまり良好にはアニーリングされていない（例えば、不完全に）任意のＡ０の鎖に必要な温度より低い温度まで加熱することにより分離する工程；及び
ｄ．Ａ０、ひいてはそれにアニーリングされたままでのあらゆる核酸配列を、Ａ０にアニーリングされていない任意の核酸配列から分離する工程を含む、方法が提供される。
ａ．１種以上の核酸分析物を含む試料を、以下：
ｉ．プローブ（例えば、前記プローブの３’末端または他の領域）が、第１または第２の配列の一方に対してより相補的（例えば、完全に相補的である）であるが、他方に対してあまり相補的でない（例えば、不完全に相補的である）一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０を含む第１の反応混合物に導入する工程；
ｂ．工程（ａ）によって製造された反応混合物を、以下：
ｉｉ．加ピロリン酸分解酵素；及び
ｉｉｉ．ピロリン酸イオン源を含む第２の反応混合物に導入する工程であって、
Ａ０は、核酸配列の１つにアニーリングして（例えば、完全に）、Ａ０（例えば、Ａ０の３’末端）が前記配列と二本鎖複合体を形成し、Ａ０がその３’末端から３’－５’方向に加ピロリン酸分解される少なくとも部分的に二本鎖の中間生成物を生成し、他方の配列にあまり完全ではなく（例えば、不完全に）アニーリングしたＡ０は、上記の低い（例えば、不完全な）アニーリングにより、３’－５’方向にあまり良好ではない程度に加ピロリン酸分解される、工程；
ｃ．以下によってより良好に（例えば、完全に）アニーリングされたＡ０配列複合体を分離する工程であって：
ｉ．前記複合体の鎖を、加ピロリン酸分解反応の結果として分離する（例えば溶融分離する）こと、または
ｉｉ．反応混合物を、前記複合体の鎖が分離（例えば、溶融分離）するのに十分な温度であるが、分離する（例えば、溶融して分離する）ためにあまり良好にはアニーリングされていない（例えば、不完全に）任意のＡ０の鎖に必要な温度より低い温度まで加熱することにより分離する工程；及び
ｄ．Ａ０、ひいてはそれにアニーリングされたままでのあらゆる核酸配列を、Ａ０にアニーリングされていない任意の核酸配列から分離する工程を含む、方法が提供される。
【0025】
いくつかの実施形態では、より良好に（例えば、完全に）アニーリングされた任意のＡ０配列複合体の分離は、より少ない（例えば、不完全）なアニーリングされたＡ０配列複合体よりも良好に（例えば、完全に）アニーリングされたＡ０配列複合体に有利な反応条件を使用することによって起こる。これは、反応混合物の温度の変化及び／または反応混合物のｐＨの変化及び／または反応混合物の塩度の変化の形態をとることができる。
【0026】
いくつかの実施形態において、第１及び第２の反応混合物は、工程（ａ）の第１の反応混合物が加ピロリン酸分解酵素及びピロリン酸イオン源をさらに含むように組み合わされる。
【0027】
いくつかの実施形態では、核酸配列の１つにより良好に（例えば、完全に）アニーリングして二本鎖複合体を形成するＡ０は、二本鎖複合体が分離する（例えば、溶融する）程度まで加ピロリン酸分解され、短縮されたＡ０を核酸配列から分離する。他方の配列にあまり良好にアニーリングされなかった（例えば、不完全にアニーリングされた）Ａ０は、前記配列との二本鎖複合体中に残る。
【0028】
いくつかの実施形態では、反応混合物を加熱して変性させることができる。したがって、より良好に（例えば、完全に）アニーリングされ、したがってより完全に加ピロリン酸分解されたＡ０配列を含む二本鎖複合体は分離し（例えば、溶融して分離し）、一方、あまり良好にアニーリングされず（例えば、不完全にアニーリングされ）、加ピロリン酸分解されなかったＡ０を含む二本鎖複合体は、より多くの相補的な塩基対が残存した結果としてより高い融解温度を有するそのような複合体のため、二本鎖のままである。
【0029】
いくつかの実施形態では、反応混合物のｐＨを上昇させて変性させることができる。したがって、より良好に（例えば、完全に）アニーリングされ、したがってより完全に加ピロリン酸分解されたＡ０配列を含む二本鎖複合体は変性するが、あまり良好にアニーリングされず（例えば、不完全にアニーリングされ）、加ピロリン酸分解されなかったＡ０を含む二本鎖複合体は、このような複合体がより相補的な塩基対を有し、変性するためにさらに高いｐＨを必要とするため、二本鎖のままである。
【0030】
いくつかの実施形態において、反応混合物の塩濃度は低下する。したがって、より良好に（例えば、完全に）アニーリングされ、したがってより完全に加ピロリン酸分解されたＡ０配列を含む二本鎖複合体は変性するが、あまり良好にアニーリングされず（例えば、不完全にアニーリングされ）、加ピロリン酸分解されなかったＡ０を含む二本鎖複合体は、このような複合体がより相補的な塩基対を有し、変性するためにさらにさらに低い塩濃度を必要とするため、二本鎖のままである。
【0031】
いくつかの実施形態では、化学薬剤（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミドなど）を使用して核酸を変性させ、濃縮または枯渇を促進する。
【0032】
いくつかの実施形態では、核酸分子（置換オリゴヌクレオチド）及び酵素またはタンパク質は、別個のハイブリダイズした核酸分子を使用する。
【0033】
いくつかの実施形態において、より良好に（例えば、完全に）アニーリングされたＡ０配列を含む二本鎖複合体の分離が起こる一方で、あまり良好にアニーリングされなかった（例えば、不完全にアニーリングされた）Ａ０を含む二本鎖複合体がハイブリッド化されたままであるように、反応混合物の以下の特徴のうちの２つ以上が変更される：
－反応混合物のｐＨ；
－反応混合物の温度；
－反応混合物の塩濃度；
－化学変性剤の添加。
－反応混合物のｐＨ；
－反応混合物の温度；
－反応混合物の塩濃度；
－化学変性剤の添加。
【0034】
いくつかの実施形態において、固体支持体上へのＡ０の捕捉は、工程（ａ）の前または後に行われる。いくつかの実施形態において、工程（ｄ）における分離は、工程（ａ）の前または後に固体支持体上にＡ０を捕捉することによって行われる。
【0035】
いくつかの実施形態では、Ａ０は、配列のいずれにも相補的ではない５’テール領域をさらに含む。
【0036】
いくつかの実施形態では、２つのプローブが使用され、１つは標的の順方向鎖用であり、１つは逆方向スタンド用である。いくつかの実施形態では、プローブを、それらが互いにハイブリダイズして、加ピロリン酸分解を受けることができる構築物（例えば、それらは互いにハイブリダイズするときに３’突出部を有する）を形成しないように設計することが有益である。
【0037】
いくつかの実施形態において、固体支持体上への捕捉は、Ａ０とのハイブリダイゼーションの前または後のいずれかにそれを介して固体支持体に結合する捕捉部分を含む別のオリゴＣ０へのＡ０の５’テール領域のハイブリダイゼーションによって行われる。
【0038】
いくつかの実施形態において、Ａ０は、それを介して固体支持体に結合する捕捉部分をさらに含む。
【0039】
いくつかの実施形態では、捕捉部分はビオチンであり、固体支持体はストレプトアビジンを含む。
【0040】
いくつかの実施形態において、Ａ０は、その後の捕捉のためにビオチン化ヌクレオチドとの反応において伸長される。
【0041】
いくつかの実施形態において、ジホスホヒドロラーゼ酵素（例えば、アピラーゼ）が、本発明の方法または組成物において提供される。ジホスホヒドロラーゼ酵素は、加ピロリン酸分解反応から放出されたヌクレオチドを加水分解し、最適な加ピロリン酸分解反応条件を維持する。
【0042】
いくつかの実施形態において、無機ピロホスファターゼ酵素が、本発明の方法または組成物において提供される。無機ピロホスファターゼは、加ピロリン酸分解後、及びピロリン酸イオンの存在が望ましくないかまたは準最適であり得る後続の工程の前にピロリン酸イオンを除去する。
【0043】
この技術は、目的の核酸分子を分配または濃縮するための捕捉の使用に限定されない。分子は、例えば、サイズ、電荷、もしくは形状、または他の物理的もしくは化学的特性の違いに基づいて分配または濃縮され得る。いくつかの実施形態では、ある部分が目的の核酸（例えば、クリックケミストリー改変を介して）に付加され、それにより、付加された部分は、目的の核酸に選択可能な識別特性を付与する。
【0044】
いくつかの実施形態において、固体支持体はビーズである。
【0045】
いくつかの実施形態においては、ビーズは、磁性または常磁性ビーズである。
【0046】
いくつかの実施形態において、１つ以上の洗浄工程が、１つ以上の工程の間に行われる。
【0047】
いくつかの実施形態において、洗浄及びハイブリダイゼーション工程は、２５～９５℃の高温で行われる。
【0048】
いくつかの実施形態において、試料は、核酸分析物のアダプタータグ付きライブラリーである。
【0049】
いくつかの実施形態では、工程（ｄ）に続いて、Ａ０にアニーリングされたままの核酸またはＡ０にアニーリングされていない核酸のいずれかが同定される。
【0050】
いくつかの実施形態では、配列は、増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ニッキング及び伸長増幅反応（ＮＥＡＲ）など）によって同定される。
【0051】
いくつかの実施形態では、配列は等温同定によって同定される。
【0052】
いくつかの実施形態では、配列はＰＣＲによって同定される。
【0053】
いくつかの実施形態において、配列は、マイクロアレイ分析によって同定される。
【0054】
いくつかの実施形態では、配列はシーケンシングによって同定される。
【0055】
いくつかの実施形態において、配列は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）（例えば、ブリッジ増幅シーケンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＳＭＲＴシーケンシング（ＰａｃＢｉｏ）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシング、ナノポアシーケンシング、パイロシーケンシングなど）によって同定される。
【0056】
いくつかの実施形態では、それぞれが異なる標的配列にアニーリング（例えば、完全にアニーリング）するように設計された異なる配列（例えば、３’末端配列）を有する複数の異なるプローブオリゴヌクレオチドＡ０が使用され、複数の標的配列の濃度は、非標的配列と比較して同時に増加する。
【0057】
いくつかの実施形態において、異なるプローブオリゴヌクレオチドＡ０は、疾患の存在、治療またはモニタリングに関連する遺伝的バリアントを含むヒトゲノムの配列にアニーリングする（例えば、完全にアニーリング）配列（例えば、３’末端配列）を有する。
【0058】
いくつかの実施形態では、工程（ｄ）の後、試料分析物中の前記遺伝的バリアントの存在または非存在は、Ａ０にアニーリングし、その後放出された核酸配列の同定によって推測され、それによって疾患の存在または非存在が推測される。
【0059】
いくつかの実施形態では、工程（ｄ）の後、試料分析物中の前記遺伝的バリアントの存在または非存在は、Ａ０にアニーリングし、その後放出された核酸配列の同定によって推測され、それによって疾患の適切な治療が推測される。
【0060】
いくつかの実施形態では、工程（ｄ）の後、試料分析物中の前記遺伝的バリアントの存在または非存在は、Ａ０にアニーリングし、その後放出された核酸配列の同定によって推測され、それによって、特定の疾患治療に対する患者の応答が推測される。
【0061】
いくつかの実施形態では、工程（ｄ）の後、試料分析物中の前記遺伝的バリアントの存在または非存在は、Ａ０にアニーリングし、その後放出された核酸配列の同定によって推測され、１つ以上の患者治療決定が、前記遺伝的バリアントの存在または非存在に基づいて行われる。
【0062】
いくつかの実施形態において、試料はヒトの血液または組織試料である。
【0063】
いくつかの実施形態では、疾患は、がんである。
【0064】
いくつかの実施形態において、がんは肺がんである。
【0065】
いくつかの実施形態において、１つ以上のハイブリダイゼーション工程が、１つ以上の工程の間で行われる。
【0066】
いくつかの実施形態では、分析される核酸は、メチル化配列であるか、またはメチル化配列に由来する。この技術は、標的核酸内の任意の特定の位置または複数の位置におけるメチル化状態を区別するために使用される。メチル化配列は、最初に、化学的処理（例えば、酸化、還元、亜硫酸水素塩処理）を使用して、またはメチル化依存性制限酵素もしくは任意の他の適切なアプローチへの曝露、続いて改変配列の濃縮及び／または同定によって改変され得る。
【0067】
いくつかの実施形態では、試料中に存在する核酸配列は、本方法の工程（ａ）の前に亜硫酸水素塩処理される。
【0068】
いくつかの実施形態では、試料中に存在する核酸配列は、本方法の工程（ａ）の後に亜硫酸水素塩処理される。
【0069】
いくつかの実施形態では、試料中に存在する核酸配列は、本方法の工程（ａ）の前にシトシンをウラシルに変換するために酵素的に処理される。
【0070】
いくつかの実施形態では、試料中に存在する核酸配列は、本方法の工程（ａ）の後にシトシンをウラシルに変換するために酵素的に処理される。
【0071】
いくつかの実施形態では、試料中に存在する核酸配列を、本方法の工程（ａ）の前にエピジェネティック依存性／感受性制限酵素に曝露する。
【0072】
いくつかの実施形態では、試料中に存在する核酸配列を、本方法の工程（ａ）の後にエピジェネティック依存性／感受性制限酵素に曝露する。
【0073】
いくつかの実施形態では、試料中に存在するＲＮＡの標的領域は、本方法の工程（ａ）の前にＤＮＡに転写される。
【0074】
いくつかの実施形態では、試料中に存在するＲＮＡの標的領域は、本方法の工程（ａ）の後にＤＮＡに転写される。
【0075】
いくつかの実施形態では、少なくとも第１及び第２の配列を含む試料から目的の標的核酸配列を捕捉する方法であって、以下の工程：
ａ．１種以上の核酸分析物を含む試料を
ｉ．プローブが、第１または第２の配列の一方に相補的（例えば、完全に相補的である）であるが他方にはあまり相補的でない（例えば、不完全に相補的である）配列（例えば、３’末端または他の場所で）を含む一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０を含む第１の反応混合物に導入する工程；
ｂ．工程（ａ）によって製造された反応混合物を、以下：
ｉ．加ピロリン酸分解酵素；及び
ｉｉ．ピロリン酸イオン源を含む第２の反応混合物に導入する工程であって、
Ａ０が、核酸配列の１つにアニーリングして（例えば、完全にアニーリングして）、Ａ０（例えば、Ａ０の３’末端）が前記配列と二本鎖複合体を形成し、Ａ０がその３’末端から３’－５’方向に加ピロリン酸分解される少なくとも部分的に二本鎖の中間生成物を生成し、他方の配列にあまり良好ではない（例えば、不完全に）アニーリングしたＡ０が、あまり良好ではない（例えば、不完全な）アニーリングにより、３’－５’方向にあまり良好ではない程度に加ピロリン酸分解される、工程；
ｃ．以下によってアニーリング（例えば、完全にアニーリング）されたＡ０配列複合体を分離する工程であって：
ｉ．前記複合体の鎖を、加ピロリン酸分解反応の結果として分離する（例えば溶融分離する）こと、または
ｉｉ．反応混合物を、前記複合体の鎖が分離（例えば、溶融分離）するのに十分な温度であるが、分離する（例えば、溶融して分離する）ためにあまり良好ではなく（例えば、不完全に）アニーリングされた任意のＡ０の鎖に必要な温度より低い温度まで加熱することにより分離する工程；及び
ｄ．Ａ０、ひいてはそれにアニーリングされたままでのあらゆる核酸配列を、Ａ０にアニーリングされていない任意の核酸配列から分離する工程を含む、方法が提供される。
ａ．１種以上の核酸分析物を含む試料を
ｉ．プローブが、第１または第２の配列の一方に相補的（例えば、完全に相補的である）であるが他方にはあまり相補的でない（例えば、不完全に相補的である）配列（例えば、３’末端または他の場所で）を含む一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０を含む第１の反応混合物に導入する工程；
ｂ．工程（ａ）によって製造された反応混合物を、以下：
ｉ．加ピロリン酸分解酵素；及び
ｉｉ．ピロリン酸イオン源を含む第２の反応混合物に導入する工程であって、
Ａ０が、核酸配列の１つにアニーリングして（例えば、完全にアニーリングして）、Ａ０（例えば、Ａ０の３’末端）が前記配列と二本鎖複合体を形成し、Ａ０がその３’末端から３’－５’方向に加ピロリン酸分解される少なくとも部分的に二本鎖の中間生成物を生成し、他方の配列にあまり良好ではない（例えば、不完全に）アニーリングしたＡ０が、あまり良好ではない（例えば、不完全な）アニーリングにより、３’－５’方向にあまり良好ではない程度に加ピロリン酸分解される、工程；
ｃ．以下によってアニーリング（例えば、完全にアニーリング）されたＡ０配列複合体を分離する工程であって：
ｉ．前記複合体の鎖を、加ピロリン酸分解反応の結果として分離する（例えば溶融分離する）こと、または
ｉｉ．反応混合物を、前記複合体の鎖が分離（例えば、溶融分離）するのに十分な温度であるが、分離する（例えば、溶融して分離する）ためにあまり良好ではなく（例えば、不完全に）アニーリングされた任意のＡ０の鎖に必要な温度より低い温度まで加熱することにより分離する工程；及び
ｄ．Ａ０、ひいてはそれにアニーリングされたままでのあらゆる核酸配列を、Ａ０にアニーリングされていない任意の核酸配列から分離する工程を含む、方法が提供される。
【0076】
いくつかの実施形態において、固体支持体は、ポリマー及び／または樹脂被覆固体表面である。
【0077】
いくつかの実施形態では、固体支持体はポリスチレン固体支持体である。
【0078】
いくつかの実施形態では、ｎが１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００、５，０００、５，５００、６，０００、６，５００、７，０００、７，５００、８，０００、８，５００、９，０００、９，５００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１２，５００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００またはそれ以上であるか、またはｎがこれらの点のいずれかの間の任意の整数であるか、またはｎがこれらの点のいずれか２つの間で導出可能な任意の範囲内である、ポリマーである、ポリスチレン（Ｃ８Ｈ８）ｎ が利用される。
【0079】
いくつかの実施形態では、ポリスチレン固体支持体は、粒子、微粒子、磁性ビーズ、磁性微粒子、常磁性ビーズ、常磁性微粒子、樹脂、またはポリスチレンポリマーを含む任意の微粒子である。
【0080】
いくつかの実施形態では、ポリスチレン支持体は、以下の官能基：アミン、カルボキシレート、スルホネート、トリメチルアミン及び／またはエポキシドの１つ以上を含むように改変される。
【0081】
いくつかの実施形態において、固体支持体は、磁性ビーズまたは常磁性ビーズである。
【0082】
いくつかの実施形態では、磁性または常磁性ビーズは、前記ビーズの表面積を最大化する形状である。
【0083】
いくつかの実施形態では、磁性または常磁性ビーズは規則的な形状である。
【0084】
いくつかの実施形態では、磁性または常磁性ビーズは不規則な形状である。
【0085】
いくつかの実施形態においては、磁性ビーズまたは常磁性ビーズは、１０００ミクロン、９００ミクロン、８００ミクロン、７００ミクロン、６００ミクロン、５００ミクロン、４００ミクロン、３００ミクロン、２００ミクロン、１００ミクロン、９０ミクロン、８０ミクロン、７０ミクロン、６０ミクロン、５０ミクロン、４０ミクロン、３０ミクロン、２０ミクロン、１０ミクロン、５ミクロン、２．５ミクロン、１ミクロン、０．５ミクロン、０．２５ミクロンまたは０．１ミクロン以下の直径を有する。
【0086】
いくつかの実施形態において、固体支持体は、磁性または常磁性ポリスチレンビーズである。
【0087】
いくつかの実施形態では、磁性または常磁性ポリスチレンビーズは酸化鉄を含む。
【0088】
いくつかの実施形態では、磁性または常磁性ポリスチレンビーズはストレプトアビジン結合している。
【0089】
いくつかの実施形態において、固体支持体は、ストレプトアビジン結合Ｄｙｎａｂｅａｄ（ＲＴＭ）である。
【0090】
いくつかの実施形態において、固体支持体は、デキストラン改変表面である。
【0091】
いくつかの実施形態では、デキストラン改変表面は、粒子、微粒子、磁性または常磁性ビーズ、樹脂またはデキストランポリマーを含む任意の粒子である。
【0092】
いくつかの実施形態では、デキストランポリマーは、１０００～４１００００のおおよその分子量を有する。
【0093】
いくつかの実施形態では、デキストランポリマーは、２５０００～約１０００００のおおよその分子量を有する。
【0094】
いくつかの実施形態では、改変デキストラン表面は、１つ以上の官能基を含むようにさらに改変される。
【0095】
いくつかの実施形態では、デキストラン改変表面は、以下の官能基：アミン、カルボキシレート、スルホネート、トリメチルアミン及び／またはエポキシドの１つ以上を含むように改変される。
【0096】
いくつかの実施形態において、固体支持体は、磁性ビーズまたは常磁性ビーズである。
【0097】
いくつかの実施形態では、磁性または常磁性ビーズは、前記ビーズの表面積を最大化する形状である。
【0098】
いくつかの実施形態では、磁性または常磁性ビーズは規則的な形状である。
【0099】
いくつかの実施形態では、磁性または常磁性ビーズは不規則な形状である。
【0100】
いくつかの実施形態においては、磁性ビーズまたは常磁性ビーズは、１０００ミクロン、９００ミクロン、８００ミクロン、７００ミクロン、６００ミクロン、５００ミクロン、４００ミクロン、３００ミクロン、２００ミクロン、１００ミクロン、９０ミクロン、８０ミクロン、７０ミクロン、６０ミクロン、５０ミクロン、４０ミクロン、３０ミクロン、２０ミクロン、１０ミクロン、５ミクロン、２．５ミクロン、１ミクロン、０．５ミクロン、０．２５ミクロンまたは０．１ミクロン以下の直径を有する。
【0101】
いくつかの実施形態において、磁性ビーズまたは常磁性ビーズは、Ｎａｎｏｍａｇ（登録商標）デキストラン（ＮＤ）；Ｎａｎｏｍａｇ（登録商標）デキストラン－ＳＯ３Ｈ（ＮＤ－ＳＯ３Ｈ）；ＢｉｏＭａｇ（登録商標）デキストラン被覆チャコール；またはＢｉｏＭａｇ（登録商標）Ｐｌｕｓデキストランから選択されるデキストラン磁性ビーズである。
【0102】
いくつかの実施形態において、固体支持体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧ改変表面である。
【0103】
いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧ改変表面は、粒子、微粒子、磁性もしくは常磁性ビーズ、樹脂またはＰＥＧを含む任意の粒子である。
【0104】
本発明のいくつかの実施形態では、ｎが１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００、５，０００、５，５００、６，０００、６，５００、７，０００、７，５００、８，０００、８，５００、９，０００、９，５００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１２，５００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００またはそれ以上であるか、またはｎが、これらの点のいずれかの間の任意の整数であるか、またはｎが、これらの点のいずれか２つの間から導出可能な任意の範囲内にあるポリマーである、ＰＥＧ、（ＣＨ２Ｏ）ｎが利用される。
【0105】
いくつかの実施形態において、利用されるＰＥＧは、ＰＥＧ－２００、ＰＥＧ－３００、ＰＥＧ－４００、ＰＥＧ－６００、ＰＥＧ－１０００、ＰＥＧ－１３００－１６００、ＰＥＧ－１４５０、ＰＥＧ－３０００－３７００、ＰＥＧ－３５００、ＰＥＧ－６０００、ＰＥＧ－８０００またはＰＥＧ－１７５００である。
【0106】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧ改変表面が磁性または常磁性微粒子またはビーズであるいくつかの実施形態では、微粒子またはビーズは、Ｎａｎｏｍａｇ（登録商標）ＰＥＧ－３００（Ｐｌａｉｎ）またはＮａｎｏｍａｇ（登録商標）－Ｄから選択される。
【0107】
いくつかの実施形態において、固体支持体は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）またはＰＶＰ改変表面である。
【0108】
いくつかの実施形態では、ＰＶＰまたはＰＶＰ改変表面は、ＰＶＰを含む粒子、微粒子、磁性または常磁性ビーズ、樹脂または任意の粒子である。
【0109】
本発明のいくつかの実施形態ではｎが１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００、５，０００、５，５００、６，０００、６，５００、７，０００、７，５００、８，０００、８，５００、９，０００、９，５００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１２，５００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００またはそれ以上であるか、またはｎが、これらの点のいずれかの間の任意の整数であるか、またはｎが、これらの点のいずれか２つの間から導出可能な任意の範囲内にあるポリマーであるＰＶＰ、ｎ－ビニルピロリドンが利用される。
【0110】
いくつかの実施形態において、固体支持体は、多糖または多糖改変表面である。
【0111】
いくつかの実施形態では、多糖または多糖改変表面は、多糖を含む粒子、微粒子、磁性または常磁性ビーズ、樹脂または任意の粒子である。
【0112】
いくつかの実施形態では、多糖は、デキストラン、フィコール、グリコーゲン、アラビアガム、キサンタンガム、カラギーナン、アミロース、寒天、アミロペクチン、キシラン及び／またはベータグルカンの１つ以上から選択される。
【0113】
いくつかの実施形態において、固体支持体は、化学樹脂または化学樹脂改変表面である。
【0114】
いくつかの実施形態では、化学樹脂または化学樹脂改質表面は、以下の樹脂：イソシアネート、グリセロール、ピペリジノ－メチル、ポリＤＭＡＰ（ポリマー結合ジメチル４－アミノピリジン）、ＤＩＰＡＭ（ジイソプロピルアミノメチル）、アミノメチル、ポリスチレンアルデヒド、トリス（２－アミノメチル）アミン、モルホリノ－メチル、ＢＯＢＡ（３－ベンジルオキシベンズアルデヒド）、トリフェニル－ホスフィンまたはベンジルチオメチルの１つ以上から選択される。
【0115】
いくつかの実施形態において、捕捉部分は、化学的に切断可能なリンカー、例えば、ジスルフィド、アリルまたはアジドマスクされたヘミアミナルエーテルリンカーを介して固体支持体に共有結合している。
【0116】
いくつかの実施形態において、捕捉部分は、アミド結合またはホスホロチオエート結合を介して固体支持体に共有結合している。
【0117】
オリゴヌクレオチドを固体支持体に共有結合的及び非共有結合的に固定化するための多数の技術が存在することが当業者には理解されることであり、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ（登録商標））により作成された「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｔｔａｃｈｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ」（２０１４）を参照されたい。
【0118】
いくつかの実施形態において、捕捉部分は、オリゴヌクレオチド配列を含み、固体支持体は、相補的配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【0119】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド配列は、融解温度を変化させるために、１つ以上の改変塩基及び／または当業者に公知の他のかかる改変を含む。
【0120】
いくつかの実施形態では、１つ以上の改変塩基及び／または当業者に公知の他のかかる改変の存在は、融解温度の低下をもたらす。
【0121】
いくつかの実施形態では、１つ以上の改変塩基及び／または当業者に公知の他のかかる改変の存在は、融解温度の上昇をもたらす。
【0122】
いくつかの実施形態では、相補的配列の長さは、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０及び２００塩基の間である。
【0123】
いくつかの実施形態では、相補的配列の長さは、１０、２０、３０、４０、５０及び１００塩基の間である。
【0124】
いくつかの実施形態では、相補的配列の長さは、１０～２０、１０～３０、１０～４０及び１０～５０塩基である。
【0125】
いくつかの実施形態では、相補的配列の長さは、１０～２０、１０～３０及び１０～４０塩基である。
【0126】
いくつかの実施形態では、相補的配列の長さは１０～２０及び１０～３０塩基である。
【0127】
いくつかの実施形態において、相補的配列の長さは、１０～２０塩基である。
【0128】
いくつかの実施形態において、捕捉部分は、化学改変を含み、化学改変と固体支持体との間の相互作用を介して固体支持体に結合している。
【0129】
いくつかの実施形態において、化学改変はビオチンであり、固体支持体はストレプトアビジンをさらに含む。
【0130】
いくつかの実施形態において、捕捉されたオリゴヌクレオチド配列は、固体支持体から放出される。
【0131】
いくつかの実施形態において、捕捉されたオリゴヌクレオチド配列は、化学的変性によって固体支持体から放出される。
【0132】
いくつかの実施形態において、化学的変性は、適切な濃度の塩基の使用によって達成される。
【0133】
いくつかの実施形態では、０．１ＭのＮａＯＨを使用することができる。
【0134】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド配列は、ジスルフィドリンカーについてはトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはジチオスレイトール（ＤＴＴ）；パラジウム錯体もしくはアリルリンカー；またはアジドマスクされたヘミアミナルエーテルリンカーについてはＴＣＥＰの添加による化学的リンカーの切断によって固体支持体から放出される。
【0135】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチド配列から非標準的な塩基を除去し、得られた脱塩基部位で切断することによって、固体支持体から放出される。いくつかの実施形態では、非カノニカル塩基はウラシルであり、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼによって除去される。代替の実施形態では、非カノニカル塩基は８－オキソグアニンであり、これはホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）によって除去される。
【0136】
いくつかの実施形態では、捕捉部分はオリゴヌクレオチド領域であり、放出は反応混合物の加熱によって行われる。
【0137】
いくつかの実施形態において、反応混合物は、１～２０分間にわたって３７℃～１００℃に加熱される。
【0138】
いくつかの実施形態において、反応混合物は、１～１５分間にわたって加熱される。
【0139】
いくつかの実施形態において、反応混合物は、１～１０分間にわたって加熱される。
【0140】
いくつかの実施形態において、反応混合物は、１～５分間にわたって加熱される。
【0141】
いくつかの実施形態において、反応混合物は、５分間にわたって加熱される。
【0142】
いくつかの実施形態において、反応混合物は、３７℃～８５℃に加熱される。
【0143】
いくつかの実施形態において、反応混合物は、３７℃～７５℃に加熱される。
【0144】
いくつかの実施形態において、反応混合物は、３７℃～６５℃に加熱される。
【0145】
いくつかの実施形態において、反応混合物は、３７℃～５５℃に加熱される。
【0146】
いくつかの実施形態において、反応混合物は、３７℃～４５℃に加熱される。
【0147】
当技術分野の当業者は、反応混合物が加熱される温度が、相補的オリゴヌクレオチド領域の放出を生じさせるために、前記領域の長さに依存することを理解するであろう。
【0148】
いくつかの実施形態において、放出は、１つ以上のオリゴヌクレオチド配列の切断によって達成される。この切断は、先に、または後に記載される手段のいずれかによって、または当業者に公知の手段のいずれかによって達成することができる。
【0149】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド配列は、化学的に切断される。
【0150】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド配列は、酵素的に切断される。
【0151】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド配列は、制限酵素によって切断される。
【0152】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド配列は、エピジェネティック改変感受性または依存性制限酵素によって切断される。
【0153】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド配列は、メチル化感受性またはメチル化依存性の制限酵素によって切断される。
【0154】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド配列は、メチル化感受性またはヒドロキシメチル化依存性の制限酵素によって切断される。
【0155】
いくつかの実施形態では、バリアントまたは野生型配列の濃縮の前または後に、それらのメチル化状態の検出を可能にするために配列を酵素的または化学的に変換する。当技術分野の当業者は、「濃縮」という用語が、前述または後述のように、標的配列と非標的配列の混合物からの標的配列の選択的単離を指すことを理解するであろう。
【0156】
いくつかの実施形態では、制限酵素はエンドヌクレアーゼである。
【0157】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド配列は、フラップエンドヌクレアーゼによって切断される。
【0158】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド配列は、光切断可能なリンカーを含み、オリゴヌクレオチド配列は、このリンカーの切断によって固体支持体から放出される。
【0159】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド配列は、このリンカーの切断によって固体支持体から放出される。
【0160】
いくつかの実施形態では、消化は、Ａ０が、加ピロリン酸分解酵素が結合するための配列または加ピロリン酸分解反応が継続するための配列との十分な相補性を欠くまで継続する。これは、典型的には、配列とプローブとの間に６から２０の相補的ヌクレオチドが残っている場合に起こる。いくつかの実施形態において、これは、６個～４０個の相補的ヌクレオチドが残存しているときに起こる。
【0161】
理論に拘束されるものではないが、前述または他の箇所に記載されているものに加えて、加ピロリン酸分解反応を停止することができるいくつかの異なる方法がある。
【0162】
加ピロリン酸分解酵素が「先読み」する能力を有する場合、消化はミスマッチまたは塩基改変の３’を停止し得る。このような活性は、古細菌ＤＮＡポリメラーゼにおいて観察されている。
【0163】
いくつかの実施形態では、Ａ０の骨格に改変が存在するために、加ピロリン酸分解反応が停止し得る。
【0164】
この改変は、改変塩基であり得る。塩基は、加ピロリン酸分解に耐性であり得る。
【0165】
この改変は、化学骨格改変であり得る。
【0166】
いくつかの実施形態において、加ピロリン酸分解反応は、Ａ０におけるミスマッチの存在のために停止し得る。このミスマッチの位置は、消化がこの規定された点で停止するように意図的に設計され得る。
【0167】
いくつかの実施形態では、反応混合物の温度を上昇させて、加ピロリン酸分解酵素を熱不活性化することができる。いくつかの実施形態では、温度を上昇させて、プローブ－標的二重鎖を溶融分離させる。
【0168】
いくつかの実施形態では、加ピロリン酸分解酵素の不活性化を引き起こし得る任意の試薬を反応混合物に添加することができる。
【0169】
いくつかの実施形態において、ｐＨ濃度は、加ピロリン酸分解酵素を不活性化するように改変され得る。
【0170】
いくつかの実施形態において、塩濃度は、加ピロリン酸分解酵素を不活性化するように改変され得る。
【0171】
いくつかの実施形態において、界面活性剤濃度は、加ピロリン酸分解酵素を不活性化するように改変され得る。
【0172】
いくつかの実施形態において、イオン濃度は、加ピロリン酸分解酵素を不活性化するように改変され得る。
【0173】
当技術分野の当業者は、酵素触媒反応を停止させることができる多くのさらなる方法があり、上記の開示は本発明の範囲を限定することを意図していないことを理解するであろう。
【0174】
適切には、加ピロリン酸分解は、少なくとも加ピロリン酸分解活性を示すポリメラーゼ及びピロリン酸イオン源の存在下、２０～９０℃の範囲の温度で反応媒体中で行われる。ポリヌクレオチドの消化に適用されるような加ピロリン酸分解反応に関するさらなる情報は、例えばＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４（１９６９）ｐｐ．３０１９－３０２８に見ることができる。
【0175】
いくつかの実施形態では、加ピロリン酸分解工程は、過剰なポリピロリン酸塩源、３個以上のリン原子を含有する化合物を含む適切な供給源の存在によって駆動される。
【0176】
いくつかの実施形態では、加ピロリン酸分解工程は、過剰な改変ピロリン酸塩の供給源の存在によって駆動される。適切な改変ピロリン酸塩としては、架橋酸素の代わりに他の原子もしくは基が置換されたもの、または他の酸素上の置換もしくは改変基を有するピロリン酸塩（またはポリピロリン酸塩）が挙げられる。当技術分野の当業者は、本発明での使用に適した改変ピロリン酸塩の多くのそのような例があり、その非限定的な選択は以下の通りであることを理解するであろう：
【化1】
【0177】
好ましい一実施形態では、ピロリン酸イオン源は、ＰＮＰ、ＰＣＰまたはトリポリリン酸（ＰＰＰｉ）である。
【0178】
さらに、限定するものではないが、加ピロリン酸分解工程で使用するためのピロリン酸イオン源の例は、国際公開第２０１４／１６５２１０号パンフレット及び国際公開第００／４９１８０号パンフレットに見出すことができる。
【0179】
いくつかの実施形態において、過剰な改変ピロリン酸塩の供給源は、Ｙ－Ｈとして表すことができ、式中、Ｙは、一般式（Ｘ－Ｏ）２Ｐ（＝Ｂ）－（Ｚ－Ｐ（＝Ｂ）（Ｏ－Ｘ））ｎ－に対応し、式中、ｎは、１～４の整数であり；各Ｚ－は、－Ｏ－、－ＮＨ－または－ＣＨ２－から独立して選択され；各Ｂは独立してＯまたはＳのいずれかであり；Ｘ基は、独立して、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、アルキル、アルケニルまたは複素環基から選択され、但し、Ｚ及びＢの両方が－Ｏ－に対応し、ｎが１である場合、少なくとも１つのＸ基はＨではない。
【0180】
いくつかの実施形態では、Ｙは、一般式（Ｘ－Ｏ）２Ｐ（＝Ｂ）－（Ｚ－Ｐ（＝Ｂ）（Ｏ－Ｘ））ｎ－（式中、ｎは１、２、３または４である）に対応する。別の実施形態では、Ｙ基は、一般式（Ｘ－Ｏ）２Ｐ（＝Ｏ）－Ｚ－Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ－Ｈ）－（式中、Ｘ基の１つは－Ｈである）に対応する。さらに別の好ましい実施形態では、Ｙは、一般式（Ｘ－Ｏ）２Ｐ（＝Ｏ）－Ｚ－Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ－Ｘ）－－（式中、Ｘ基の少なくとも１つは、メチル、エチル、アリルまたはジメチルアリルから選択される）に対応する。
【0181】
代替の実施形態では、Ｙは、一般式（Ｈ－Ｏ）２Ｐ（＝Ｏ）－Ｚ－Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ－Ｈ）－（式中、Ｚは－ＮＨ－または－ＣＨ２のいずれかである）または（Ｘ－Ｏ）２Ｐ（＝Ｏ）－Ｚ－Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ－Ｘ）－－（式中、Ｘ基はすべて－Ｎａまたは－Ｋのいずれかであり、Ｚは－ＮＨ－または－ＣＨ２－のいずれかである）のいずれかに対応する。
【0182】
別の実施形態では、Ｙは、一般式（Ｈ－Ｏ）２Ｐ（＝Ｂ）－Ｏ－Ｐ（＝Ｂ）（Ｏ－Ｈ）－（式中、各Ｂ基は独立してＯまたはＳのいずれかであり、少なくとも１つはＳである）に対応する。
【0183】
Ｙの好ましい実施形態の具体例としては、式（Ｘ１－Ｏ）（ＨＯ）Ｐ（＝Ｏ）－Ｚ－Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ－Ｘ２）（式中、ＺはＯ、ＮＨまたはＣＨ２であり、（ａ）Ｘ１はγ，γ－ジメチルアリルであり、Ｘ２は－Ｈである、または（ｂ）Ｘ１及びＸ２は両方ともメチルである；または（ｃ）Ｘ１及びＸ２は両方ともエチルである；または（ｄ）Ｘ１はメチルであり、Ｘ２はエチルであり、またはその逆である）のものが挙げられる。
【0184】
当技術分野の当業者は、ＤＮＡを断片化するために使用され得る複数の技術があることを理解するであろう。そのような方法には、超音波処理、ニードル剪断、噴霧、ポイントシンク剪断、圧力セルの通過（フレンチプレス）及び酵素的方法が含まれる。
【0185】
いくつかの実施形態では、断片化は超音波処理によって達成される。
【0186】
いくつかの実施形態では、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（登録商標）（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ，ＮＪ）装置を使用することができる。
【0187】
いくつかの実施形態では、断片化は音響剪断によって達成される。
【0188】
いくつかの実施形態では、Ｃｏｖａｒｉｓ（登録商標）機器（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を使用することができる。
【0189】
いくつかの実施形態では、断片化は噴霧化によって達成される。噴霧は、ネブライザーユニット内の小さな穴を通してＤＮＡを強制的に流し、その結果、収集される微細なミストが形成される。断片サイズは、ＤＮＡを噴霧器に押し込むために使用されるガスの圧力、ＤＮＡ溶液が穴を通過する速度、溶液の粘度、及び温度によって決定される。
【0190】
いくつかの実施形態では、断片化は流体力学的剪断によって達成される。
【0191】
いくつかの実施形態では、Ｄｉｇｉｌａｂ（Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）のＨｙｄｒｏｓｈｅａｒを使用することができる。
【0192】
いくつかの実施形態では、断片化は点シンク剪断によって達成される。
【0193】
いくつかの実施形態では、断片化は、ニードル剪断によって達成される。
【0194】
いくつかの実施形態では、断片化はフレンチプレスの使用によって達成される。
【0195】
いくつかの実施形態において、断片化は酵素的断片化によって達成される。
【0196】
いくつかの実施形態において、断片化は、制限エンドヌクレアーゼ消化によって達成される。
【0197】
いくつかの実施形態において、断片化はトランスポソーム媒介断片化である。
【0198】
いくつかの実施形態において、断片化はＣａｓ９によって達成される。
【0199】
いくつかの実施形態では、断片化は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第１０５７７６４４号に記載されているように、Ｃａｓ９によって達成される。
【0200】
いくつかの実施形態では、１つ以上の異なる断片化技術を使用することができる。
【0201】
いくつかの実施形態では、同じまたは異なる断片化技術のうちの１つ以上を、方法の１つ以上の異なる点で使用することができる。
【0202】
いくつかの実施形態において、配列の断片化及びアダプタータグ付けは、本方法の同じ時間または同じ工程で起こる。そのような一例は、ＩｌｌｕｍｉｎａによるＮｅｘｔｅｒａ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔである。
【0203】
当技術分野の当業者は、アダプタータグ付き配列／ライブラリーを調製するために使用され得る複数の技術が存在することを理解するであろう。
【0204】
いくつかの実施形態では、断片化後、核酸の末端を研磨し、１つ以上のアダプターへのライゲーションの前にＡテール化することができる。
【0205】
いくつかの実施形態では、断片化後、平滑末端ライゲーション反応において、核酸の末端を研磨し、アダプターにライゲーションすることができる。
【0206】
いくつかの実施形態では、断片化後、アダプターを一本鎖ＤＮＡにライゲーションする。
【0207】
いくつかの実施形態では、断片化後、末端トランスフェラーゼ酵素を使用して非鋳型塩基を断片の３’末端に付加し、断片を二本鎖にするためのプライミングのための部位を提供する。
【0208】
いくつかの実施形態では、トポイソメラーゼをＤＮＡリガーゼの代わりに使用することができる。
【0209】
いくつかの実施形態において、ＴＯＰＯクローニングは、アダプターを断片化されたＤＮＡに付加するために使用され得る。
【0210】
いくつかの実施形態では、断片化後、トランスポザーゼを使用して、アダプター配列を核酸に付加することができる。
【0211】
いくつかの実施形態では、断片化後、標準的なトランスポゾンを使用することができるが、オリゴヌクレオチド置換を使用してＹ字型アダプターを作製するように改変することができる。
【0212】
試料がアダプタータグ付きライブラリーであるいくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドを使用して、ライブラリー分子のクロスハイブリダイゼーション（いわゆる「デイジーチェーン化」）を防止する。
【0213】
いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、加ピロリン酸分解に耐性である。この耐性は、前述または後述の通りであり得る。
【0214】
ライブラリーがアダプタータグ付きであり、ＰＣＲ増幅されている場合、二本鎖分子は鎖５’－アダプター１－挿入－アダプター２’－３’及び５’－アダプター２－挿入－アダプター１’－３’を有する。
【0215】
ハイブリダイゼーション中、一方の鎖上の５’－アダプター１－３’配列は、第２の鎖上の５’－アダプター１’－３’配列にハイブリダイズすることができた。同様に、一方の鎖上の５’－アダプター２’－３’配列は、第２の鎖上の５’－アダプター２－３’配列にハイブリダイズすることができる。これらのハイブリダイゼーションイベントは、互いに連鎖することができ、標的分子及び非標的分子の両方を含む、分子のいわゆる「デイジーチェーン」を生成する。
【0216】
加ピロリン酸分解反応との関連において、５’－アダプター１－３’と５’－アダプター１’－３’とのハイブリダイゼーションまたは５’－アダプター２－３’と５’－アダプター２’－３’とのハイブリダイゼーションは両方とも、加ピロリン酸分解を受け得る３’末端を生成する。
【0217】
これに関連して、加ピロリン酸分解は標的分子の３’から塩基を除去し、ＰＣＲ中のその増幅を妨げる可能性がある。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、典型的には、デイジーチェーン接続を緩和するためにハイブリダイゼーション捕捉に使用される。
【0218】
上記の分子に関連して、これらは、アダプター１’に相補的な配列及びアダプター２’に相補的な配列であり得る。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、３’ホスホロチオエート結合の付加によって、またはアダプタータグ付き分子の３’がブロッキングオリゴヌクレオチドと非相補的であることを確実にすることによって、加ピロリン酸分解から保護することができる。別の例では、加ピロリン酸分解を阻害するホスホロチオエート結合を導入するα－チオ－ｄＮＴＰは、加ピロリン酸分解の前にＰＣＲまたはプライマー伸長反応に含めることができる。
【0219】
したがって、前述または後述のブロッキングオリゴヌクレオチドが方法に使用される実施形態が提供される。
【0220】
いくつかの実施形態において、試料は、１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドを含む。
【0221】
いくつかの実施形態において、第１の反応混合物は、１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドを含む。
【0222】
いくつかの実施形態において、第２の反応混合物は、１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドを含む。
【0223】
いくつかの実施形態において、１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドが、工程（ｂ）の前に第１の反応混合物に導入される。
【0224】
いくつかの実施形態において、本方法のシーケンシングは、Ｍａｘａｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔシーケンシングである。
【0225】
いくつかの実施形態において、本方法のシーケンシングはＳａｎｇｅｒシーケンシングである。
【0226】
いくつかの実施形態において、本方法のシーケンシングはショットガンシーケンシングである。
【0227】
いくつかの実施形態において、本方法のシーケンシングは一分子リアルタイムシーケンシングである。
【0228】
いくつかの実施形態において、本方法のシーケンシングはイオン半導体シーケンシングである。
【0229】
いくつかの実施形態において、本方法のシーケンシングはパイロシーケンシングである。
【0230】
いくつかの実施形態において、本方法のシーケンシングは合成によるシーケンシングである。
【0231】
いくつかの実施形態において、本方法のシーケンシングはコンビナトリアルプローブアンカー合成（ｃＰＡＳ）である。
【0232】
いくつかの実施形態において、本方法シーケンシングはライゲーションによるシーケンシングである。
【0233】
いくつかの実施形態において、本方法のシーケンシングはナノポアシーケンシングである。
【0234】
いくつかの実施形態において、方法のシーケンシングはＧｅｎａｐＳｙｓシーケンシングである。
【0235】
いくつかの実施形態において、シーケンシングは次世代シーケンシング（ＮＧＳ）である。
【0236】
いくつかの実施形態では、患者に由来する試料中の１つ以上の特異的核酸配列の存在または非存在を検出するための、本方法の任意の前述または後述の実施形態の使用を含む、患者をスクリーニングする方法が提供される。
【0237】
当技術分野の当業者は、そのようなスクリーニングが移植レシピエント患者をモニタリングするのに有用であることを理解するであろう。
【0238】
当業者は、そのようなスクリーニングが、患者試料中の１つ以上の核酸配列のレベルによってその治療状態を確認することができる１つ以上の状態について治療を受けている患者をモニタリングするのに有用であることを理解するであろう。
【0239】
例えば、１つ以上のがんの治療を受けている患者の治療状態は、その血液中の１つ以上の核酸配列のレベル及び／または１つ以上の特定のバリアントの存在及び／または非存在によって確認することができる。高レベルの循環腫瘍核酸配列及び／または１つ以上の特定のバリアントの存在及び／または非存在を使用して、特定の治療が所望の効果を有するかどうかを推定することができる。したがって、患者に由来する試料中の特異的核酸配列及び／またはそれらのそれぞれのレベルの存在または非存在によってそのような成功を推測することができる、特定の治療の成功または非成功をモニタリングするための方法が提供される。
【0240】
いくつかの実施形態では、疾患の再発を検出するために寛解状態の患者をモニタリングする方法が提供される。
【0241】
いくつかの実施形態では、がんを含むがこれに限定されない１つ以上の疾患状態の存在を検出するために、名目上健康な人々をスクリーニングする方法が提供される。
【0242】
いくつかの実施形態では、１つ以上の疾患状態と診断された患者における１つ以上の遺伝子マーカーの存在及び／または非存在を検出し、１つ以上のマーカーの存在及び／または非存在を使用して、どの治療を受けるべきかを決定する方法が提供される。
【0243】
いくつかの実施形態では、患者に由来する試料中の１つ以上の特異的核酸配列の存在または非存在を検出するための方法の任意の前述または後述の実施形態の使用を含む、患者の１つ以上のがんを診断及び／またはモニタリングする方法が提供される。
【0244】
当技術分野の当業者は、１つ以上の特異的核酸配列が個体（例えば、シーケンシングなどの識別方法によって、組織生検または外科的切除から識別される）に特異的であり得、そのような場合、個々の患者に特異的なパネルが使用され得ることを理解するであろう。
【0245】
当技術分野の当業者は、いくつかの実施形態では、パネルが、ヒトゲノムの既知のホットスポット領域、所与のがんタイプにおいて再帰的に変異しているホットスポット領域をカバーすることをさらに理解するであろう。
【0246】
いくつかの実施形態では、患者に由来する試料中の１つ以上の特異的核酸配列の存在または非存在を検出するための方法の任意の以前またはその後に記載された実施形態の使用を含む非侵襲的出生前検査（ＮＩＰＴ）のための方法であって、患者が妊娠患者である方法が提供される。いくつかの実施形態では、試料は、妊娠中の患者の血液の血漿及び／または血清である。いくつかの実施形態において、本明細書中に提供される方法は、そのような試料に関連する共通のＳＮＰのパネルを使用して、試料の胎児分率を濃縮及び／または定量するために用いられる。
【0247】
いくつかの実施形態では、患者を治療する方法であって、以下の工程：
－患者に由来する試料中の１つ以上の特異的核酸配列の非存在または存在を検出するために、本発明の前述または後述の実施形態のいずれかを実施する工程；
－前記配列の存在または非存在に基づいて１つ以上の治療決定を行う工程を含む、方法が提供される。
－患者に由来する試料中の１つ以上の特異的核酸配列の非存在または存在を検出するために、本発明の前述または後述の実施形態のいずれかを実施する工程；
－前記配列の存在または非存在に基づいて１つ以上の治療決定を行う工程を含む、方法が提供される。
【0248】
いくつかの実施形態では、治療決定は、特定の治療の開始である。
【0249】
いくつかの実施形態では、治療決定は、特定の治療の中止である。
【0250】
いくつかの実施形態では、治療決定は、特定の治療の用量の増加である。
【0251】
いくつかの実施形態では、治療決定は、特定の治療の用量の減少である。
【0252】
いくつかの実施形態では、治療決定は、特定の治療の投与頻度の増加である。
【0253】
いくつかの実施形態では、治療決定は、特定の治療の投与頻度の減少である。
【0254】
いくつかの実施形態では、治療決定は、既存の治療レジメンに追加の薬物を追加することである。
【0255】
いくつかの実施形態では、治療決定は、既存の治療レジメンからの薬物の除去である。
【0256】
本発明の一態様では、本発明の方法を実行するための装置が提供される。
【0257】
いくつかの実施形態では、本方法の工程（ａ）～（ｃ）を実行するための装置が提供される。
【0258】
いくつかの実施形態では、本方法の工程（ａ）～（ｂ）を実行するための装置が提供される。
【0259】
本発明の一態様では、１つ以上の実施形態において先にまたは後に記載されるような１つ以上のオリゴヌクレオチド、酵素、試薬または成分を含むキットが提供される。
【0260】
いくつかの実施形態では、
－１つ以上のオリゴヌクレオチドＡ０（Ａ０は、
・既知の第１の配列と相補的（例えば、完全に相補的である）であるが既知の第２の配列とは相補的でない（例えば、不完全に相補的である）配列（例えば、Ａ０の３’末端または他の場所）を含む；）
－１つ以上の加ピロリン酸分解酵素；及び
－１つ以上のピロリン酸イオンの供給源を含むキットが提供される。
－１つ以上のオリゴヌクレオチドＡ０（Ａ０は、
・既知の第１の配列と相補的（例えば、完全に相補的である）であるが既知の第２の配列とは相補的でない（例えば、不完全に相補的である）配列（例えば、Ａ０の３’末端または他の場所）を含む；）
－１つ以上の加ピロリン酸分解酵素；及び
－１つ以上のピロリン酸イオンの供給源を含むキットが提供される。
【0261】
いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の固体支持体をさらに含む。これらの固体支持体は、前述または後述の通りであり得る。
【0262】
いくつかの実施形態において、キットは１つ以上の緩衝液をさらに含む。これらの緩衝液は、前述または後述の通りであり得る。
【0263】
いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上のクロウイング剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、硫酸デキストランなど）をさらに含む。
【0264】
いくつかの実施形態において、キットは、１つ以上の界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ＴＷＥＥＮ２０など）をさらに含む。
【0265】
いくつかの実施形態において、キットは、１つ以上の溶媒（例えば、ホルムアミド、エチレンカーボネートなど）をさらに含む。
【0266】
いくつかの実施形態では、キットはホスホヒドロラーゼ（例えば、アピラーゼ）をさらに含む。
【0267】
いくつかの実施形態において、キットはピロホスファターゼ（例えば、熱安定性無機ピロホスファターゼ（ＴＩＰＰ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））をさらに含む。
【0268】
いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、反復配列とハイブリッド形成する添加剤を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、Ｃ０ｔ－１ ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、リボソームＲＮＡを遮断するオリゴヌクレオチドなどを含み得る。
【0269】
いくつかの実施形態では、Ａ０は、既知の第１の配列または既知の第２の配列のいずれにも相補的ではない５’テール領域をさらに含む。Ａ０は、前述または後述の通りであり得る。
【0270】
いくつかの実施形態において、Ａ０は捕捉部分をさらに含む。
【0271】
いくつかの実施形態において、キットは、先にまたは続いて記載されるように、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチド（Ｃ０）をさらに含む。
【0272】
いくつかの実施形態では、キットは、捕捉部分を含み、Ａ０の５’テール領域がＣ０の領域に相補的である１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドＣ０をさらに含む。
【0273】
いくつかの実施形態では、捕捉部分はビオチンであり、固体支持体はストレプトアビジンを含む。
【0274】
いくつかの実施形態では、固体支持体は、捕捉オリゴヌクレオチドＣ０を含み、Ａ０の５’テール領域はＣ０の領域に対して相補的である。
【0275】
いくつかの実施形態において、固体支持体はビーズである。
【0276】
いくつかの実施形態においては、ビーズは、磁性または常磁性ビーズである。
【0277】
いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上のエピジェネティック改変感受性または依存性制限酵素をさらに含む。
【0278】
いくつかの実施形態において、キットは１つ以上のトランスポソームをさらに含む。
【0279】
いくつかの実施形態において、キットはＣａｓ９をさらに含む。
【0280】
いくつかの実施形態において、キットは１つ以上のトランスポザーゼをさらに含む。
【0281】
いくつかの実施形態において、キットは１つ以上のリガーゼをさらに含む。
【0282】
いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の金属イオンをさらに含む。
【0283】
いくつかの実施形態において、キットは、１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【0284】
いくつかの実施形態において、１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドは、加ピロリン酸分解に耐性である。
【0285】
いくつかの実施形態では、キットは等温増幅試薬をさらに含む。
【0286】
いくつかの実施形態では、キットはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ、緩衝液）をさらに含む。
【0287】
いくつかの実施形態では、キットはシーケンシング試薬をさらに含む。
【0288】
いくつかの実施形態において、キットは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）試薬（例えば、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝液）をさらに含む。
【0289】
いくつかの実施形態では、キットは、ＤＮＡライブラリー調製キット（例えば、所望により、ポリメラーゼ、リガーゼ、アダプター、ｄＮＴＰ、緩衝液を含有する）をさらに含む。
【0290】
いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の分子プローブをさらに含む。
【0291】
いくつかの実施形態において、キットは、蛍光標識された１つ以上の分子プローブをさらに含む。
【0292】
いくつかの実施形態では、Ａ０の領域（例えば、３’末端）は、ヒトゲノムの野生型配列に対してより相補的であり（例えば、完全に相補的である）、前記野生型配列の変異対立遺伝子に対してあまり相補的ではない（例えば、不完全に相補的である）。
【0293】
いくつかの実施形態では、Ａ０の領域（例えば、３’末端）は、ヒトゲノムの野生型配列に対してあまり相補的でなく（例えば、不完全に相補的である）、前記野生型配列の変異対立遺伝子に対してより相補的である（例えば、完全に相補的である）。
【0294】
いくつかの実施形態では、キットは、ＲＮＡのｃＤＮＡへの転写のための１つ以上の成分をさらに含む。
【0295】
いくつかの実施形態において、キットは、先に記載され、あるいは後に記載され、あるいは当技術分野の当業者に公知の他の方法で、シーケンシングのためのアダプタータグ付きライブラリーを調製するための１つ以上のキットをさらに含む。
【0296】
いくつかの実施形態では、キットは、前または後に記載されるか、または当技術分野の当業者に公知の他の方法で、核酸の断片化のための１つ以上の成分をさらに含む。
【0297】
いくつかの実施形態では、キットは、当業者に以前または後に記載されるか、または当技術分野の当業者に公知の他の方法で、核酸の物理的断片化のための１つ以上の装置をさらに含む。
【0298】
いくつかの実施形態では、キットは、あるいは前または後に記載されるか、または当技術分野の当業者に公知の他の方法で、核酸の酵素的断片化のための１つ以上の成分をさらに含む。
【0299】
いくつかの実施形態では、キットは、核酸の物理的断片化のための１つ以上の成分及び核酸の酵素的断片化のための１つ以上の成分をさらに含む。
【0300】
いくつかの実施形態では、前述または後述するように、複数のＡ０を含むキットが提供される。
【0301】
いくつかの実施形態では、それぞれが個々の変異に完全に相補的な配列（例えば、３’末端）を有する１～１，０００，０００個の個々のＡ０プローブを含むキットが提供され、同じ配列（例えば、３’末端または他の場所）は前記変異の野生型配列に不完全に相補的である。いくつかの実施形態において、１個～１００，０００個の個々のＡ０プローブを含むキットが提供される。いくつかの実施形態において、１個～１０，０００個の個々のＡ０プローブを含むキットが提供される。いくつかの実施形態において、１個～１，０００個の個々のＡ０プローブを含むキットが提供される。
【0302】
いくつかの実施形態では、それぞれが個々の変異に不完全に相補的な配列（例えば、３’末端または他の箇所）を有する１～１，０００，０００個の個々のＡ０プローブを含むキットが提供され、同じ配列（例えば、３’末端または他の場所）は前記変異の野生型配列に完全に相補的である。いくつかの実施形態において、１個～１００，０００個の個々のＡ０プローブを含むキットが提供される。いくつかの実施形態において、１個～１０，０００個の個々のＡ０プローブを含むキットが提供される。いくつかの実施形態において、１個～１，０００個の個々のＡ０プローブを含むキットが提供される。
【0303】
いくつかの実施形態において、上記または下記に記載されるように複数の捕捉オリゴヌクレオチド（Ｃ０）を含むキットが提供される。
【0304】
いくつかの実施形態では、前述または後述するように、複数の固体支持体を含むキットが提供される。
【0305】
いくつかの実施形態では、既知の配列と完全に相補的な配列を（例えば、それらの３’末端において）有する複数のＡ０を含むパネルが提供される。
【0306】
いくつかの実施形態では、既知の配列と不完全に相補的な配列を（例えば、それらの３’末端において）有する複数のＡ０を含むパネルが提供される。
【0307】
いくつかの実施形態では、所与のがん型またはがん型の範囲内の既知のバリアントに完全に相補的な配列を（例えば、それらの３’末端において）有する複数のＡ０を含むパネルが提供される。
【0308】
いくつかの実施形態では、所与のがん型またはがん型の範囲内の公知のバリアントに不完全に相補的な配列を（例えば、それらの３’末端において）有する複数のＡ０を含むパネルであって、（例えば、それらの３’末端における）配列が野生型配列に完全に相補的であるパネルが提供される。
【0309】
いくつかの実施形態では、複数のＡ０を含むパネルが提供され、その一部は、所与のがん型またはがん型の範囲の既知のバリアントに完全に相補的であるが、他は不完全に相補的である配列を（例えば、それらの３’末端において）有する。
【0310】
いくつかの実施形態において、パネルは、前述または後述のように、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチド（Ｃ０）をさらに含む。
【0311】
いくつかの実施形態では、パネルは、前述または後述のように１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【0312】
多型（例えば、変異）は、以前またはその後に記載または公知の任意の多型（例えば、変異）から選択され得る。
【0313】
したがって、当技術分野の当業者は、本発明の範囲内に、以前またはその後に記載または公知の１つ以上の疾患状態についてのがん原遺伝子、がん遺伝子または遺伝子マーカーのいずれかに対する１つ以上の多型（例えば、変異）の検出に有用であり得るパネルが含まれることを理解するであろう。
当技術分野の当業者は、本発明の範囲内に、１つ以上の疾患状態についての遺伝子マーカーの存在もしくは非存在を決定する際に使用され得るか、または例えば腫瘍インフォームドモニタリングのための所与の患者、組織もしくは細胞に特異的なより多くのバリアントの検出に有用であり得るパネルが含まれることをさらに理解するであろう。
当技術分野の当業者は、本発明の範囲内に、１つ以上の疾患状態についての遺伝子マーカーの存在もしくは非存在を決定する際に使用され得るか、または例えば腫瘍インフォームドモニタリングのための所与の患者、組織もしくは細胞に特異的なより多くのバリアントの検出に有用であり得るパネルが含まれることをさらに理解するであろう。
【0314】
当技術分野の当業者は、本発明の範囲内には、まだ知られていないが、それにもかかわらず、存在、非存在、または１つ以上の疾患状態の判定に使用することができる１つ以上のバリアントの検出に有用であり得るパネルが含まれることをさらに理解するであろう。例えば、多くの異なるがん型に対する既知の変異シグネチャーが存在し、これらは、ＣｐＧジヌクレオチドでの過剰なＣ＞Ｔなどの変異誘発の優先モードである。パネルは、発生するこれらのタイプの事象を検出するように設計されたプローブを含み得る。
【0315】
いくつかの実施形態では、パネルは、それぞれが標的変異を含む特定の標的領域に相補的であり得る配列を（例えば、それらの３’末端において）有する１～１，０００，０００個の個々のプローブ分子を含む。
【0316】
いくつかの実施形態では、パネルは、それぞれが標的変異を含む特定の標的領域に相補的であり得る配列を（例えば、それらの３’末端において）有する１０，０００～１，０００，０００個の個々のプローブ分子を含む。
【0317】
いくつかの実施形態では、パネルは、それぞれが標的変異を含む特定の標的領域に相補的であり得る配列を（例えば、それらの３’末端において）有する１００，０００～１，０００，０００個の個々のプローブ分子を含む。
【0318】
いくつかの実施形態では、パネルは、それぞれが標的変異を含む特定の標的領域に相補的であり得る配列を（例えば、それらの３’末端において）有する２００，０００～１，０００，０００個の個々のプローブ分子を含む。
【0319】
いくつかの実施形態では、パネルは、それぞれが標的変異を含む特定の標的領域に相補的であり得る配列を（例えば、それらの３’末端において）有する１０，０００～１００，０００個の個々のプローブ分子を含む。
【0320】
いくつかの実施形態では、パネルは、それぞれが標的変異を含む特定の標的領域に相補的であり得る配列を（例えば、それらの３’末端において）有する１，０００～１００，０００個の個々のプローブ分子を含む。
【0321】
いくつかの実施形態では、パネルは、それぞれが標的変異を含む特定の標的領域に相補的であり得る配列を（例えば、それらの３’末端において）有する１，０００～１０，０００個の個々のプローブ分子を含む。
【0322】
いくつかの実施形態では、パネルは、それぞれが標的変異を含む特定の標的領域に相補的であり得る配列を（例えば、それらの３’末端において）有する５００～１０，０００個の個々のプローブ分子を含む。
【0323】
いくつかの実施形態では、パネルは、それぞれが標的変異を含む特定の標的領域に相補的であり得る配列を（例えば、それらの３’末端において）有する５００～１，０００個の個々のプローブ分子を含む。
【0324】
いくつかの実施形態では、パネルは、それぞれが特定の標的変異に相補的な５～５００個の個々のプローブ分子を含む。いくつかの実施形態では、パネルは、それぞれが特定の標的変異に相補的な５～４００個の個々のプローブ分子を含む。いくつかの実施形態では、パネルは、それぞれが特定の標的変異に相補的な５～３００個の個々のプローブ分子を含む。いくつかの実施形態では、パネルは、それぞれが特定の標的変異に相補的な５～２００個の個々のプローブ分子を含む。いくつかの実施形態では、パネルは、それぞれが特定の標的変異に相補的な５～１００個の個々のプローブ分子を含む。いくつかの実施形態では、パネルは、それぞれが特定の標的変異に相補的な５～５０個の個々のプローブ分子を含む。
【0325】
いくつかの実施形態では、同じ変異に特異的な複数のプローブ分子が存在し得る。いくつかの実施形態では、パネルの各変異に特異的なプローブ分子は１つのみであり得る。
【0326】
いくつかの実施形態では、１つ以上のプローブがＥＧＦＲ変異に相補的であり、１つ以上のプローブがＫＲＡＳ変異に相補的であり、１つ以上のプローブがＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２変異に相補的であり、１つ以上のプローブがＥＭＬ４－ＡＬＫ変異に相補的であり、１つ以上のプローブがＲＯＳ１変異に相補的であり、１つ以上のプローブがＲＥＴ変異に相補的であり、１つ以上のプローブがＭＥＴ変異に相補的である、複数のプローブ分子を含むパネルが提供される。
【0327】
いくつかの実施形態では、１つ以上のプローブがＥＧＦＲ変異に相補的であってもよく、１つ以上のプローブがＫＲＡＳ変異に相補的であってもよく、１つ以上のプローブがＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２変異に相補的であってもよく、１つ以上のプローブがＥＭＬ４－ＡＬＫ変異に相補的であってもよく、１つ以上のプローブがＲＯＳ１変異に相補的であってもよく、１つ以上のプローブがＲＥＴ変異に相補的であってもよく、１つ以上のプローブがＭＥＴ変異に相補的であってもよい、複数のプローブ分子を含むパネルが提供される。
【0328】
いくつかの実施形態では、１つ以上のＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２、ＥＭＬ４－ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ＭＥＴ変異に選択的なプローブパネルが提供される。
【0329】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ変異に対して選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
【0330】
いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳ変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
【0331】
いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
【0332】
いくつかの実施形態では、ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
【0333】
いくつかの実施形態では、ＥＭＬ４－ＡＬＫ変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
【0334】
いくつかの実施形態では、ＲＯＳ１変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
【0335】
いくつかの実施形態では、ＲＥＴ変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
【0336】
いくつかの実施形態では、ＮＴＲＫ変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
【0337】
いくつかの実施形態では、ＲＯＳ１変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
【0338】
いくつかの実施形態において、ＭＥＴエクソン１４変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
【0339】
いくつかの実施形態では、１つ以上のコード配列（ＣＤＳ）に対して選択的な複数のプローブ分子を含むパネルが提供される。
【0340】
いくつかの実施形態では、前述のパネルの１つ以上を使用して１つ以上の変異を検出する方法が提供される。
【0341】
いくつかの実施形態では、前述のパネルの１つ以上を使用して、１つまたは１つ以上の変異の有無を検出する方法が提供される。
【0342】
いくつかの実施形態では、前または後に記載され得るパネルを、前または後に記載され得る１つ以上の試薬と組み合わせて含むキットが提供される。
【0343】
当技術分野の当業者は、用語「ＤＮＡ」及び「核酸」が、本出願において互換的に使用されることを理解するであろう。したがって、「ＤＮＡ」に言及する実施形態の開示は、「ＤＮＡ」が「核酸」で置き換えられている実施形態を包含及び開示すると理解することができる。当技術分野の当業者であれば、「ＤＮＡ」に言及する実施形態は、「ＤＮＡ」が「ＲＮＡ」に置き換えられる実施形態を包含及び開示すると理解することができることを理解するであろう。
【0344】
本発明をいくつかの実施形態を参照して例として説明したが、本発明は開示された実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲から逸脱することなく代替の実施形態を構築することができることが当業者によってさらに理解されるであろう。
【0345】
本明細書で使用される場合、「磁性微粒子」は、磁場によって引き付けられる磁気応答性微粒子である。本発明の方法で使用され得る磁性微粒子は、磁性金属酸化物コアを含み、これは一般に、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡに結合することができる表面を形成するポリマーコートによって囲まれている。磁性金属酸化物コアは、好ましくは酸化鉄であり、鉄はＦｅ２＋とＦｅ３＋の混合物である。好ましいＦｅ２＋／Ｆｅ３＋比は、好ましくは２／１であるが、約０．５／１から約４／１まで変化し得る。
【0346】
バイオインフォマティクスアプローチは、シーケンシングデータを分析するために使用される。いくつかの実施形態では、特定のバリアントの存在または非存在がコールされる。他の実施形態では、複数のバリアントからのデータを組み合わせて、腫瘍ＤＮＡの有無の確率的推定値を導出する。
【0347】
例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングデータ解析は、ｂｃｌ２ｆａｓｔｑなどのツールを使用したＢＣＬファイルのＦＡＳＴＱフォーマットへの変換及び逆多重化を含む。いくつかの実施形態においてシーケンシングリードは分子識別子を含む。この場合、分子識別子をシーケンシング決定リードから抽出し、ＦＡＳＴＱヘッダに付加し、シーケンシングリードを切り出すことができる。いくつかの実施形態では、非カノニカル塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴではない）を有するバーコードをフィルタリングすることができる。次いで、得られたリードを、ｂｗａ ｍｅｍなどのツールを使用して、－Ｃオプションを使用してアライメントし、バーコード配列をアライメントに付加することができる。
【0348】
次いで、アライメントを座標によってソートし、重複リードをマークし、ｂｉｏｂａｍｂａｍ２ ｂａｍｓｏｒｍａｄｕｐ及びｂａｍｍａｒｋｄｕｐｌｉｃａｔｅｓｏｐｔを使用して、リード座標、ｍａｔｅ座標及び光学重複補助タグでリードにアノテーション付加を行うことができる。リードは、適切な対としてマークされていない場合、または光学的複製、補足、ＱＣ不合格、マッピングされていないもしくは二次アラインメントとしてマークされている場合、フィルタリングすることができる。次いで、各リードは、参照名、ソートされたリード及びメイト断片化ブレークポイント、フォワード及びリバースリードバーコード、及びリード鎖からなる補助タグでマークされ得る。
【0349】
いくつかの実施形態では、シーケンシングデータは、補助タグデータを使用しないバリアントコーリングアルゴリズムを使用して分析される。この場合、シーケンシングデータの解析は、２つのモデルの下でデータを観測する確率を比較する。第１は、シーケンシングアーチファクトの分布を指定するヌルモデルである。第２は、真のバリアントを可能にするモデルである。この場合、代替モデルの下の確率がヌルモデルの確率を超える場合、バリアントがコールされる。いくつかの実施形態では、事前に特徴付けられた試料のパネルは、（第１のモデル）の誤差分布をモデル化するのに有用であり得る。
【0350】
いくつかの実施形態では、補助タグを使用して、同じ入力分子及び／または同じ入力分子の同じ鎖に由来する可能性が高いリードを識別することができる。いくつかの実施形態において、コンセンサスベースの品質スコアは、同じ補助タグを共有するリードから導き出すことができる。
【0351】
いくつかの実施形態では、変形は、畳み込みニューラルネットワークなどの人工知能アルゴリズムを使用して識別される。
【0352】
いくつかの実施形態では、シーケンシングデータをさらにフィルタリングしてアーチファクトを除去することができる。例示的なフィルターは、所与のシーケンシングリード上に存在するミスマッチの数；アライメントスコア及び次善のアライメントスコア；ベース品質スコアまたはコンセンサスベース品質スコア；所与のバリアント部位をカバーするリードの最小数；シーケンシングリード内のバリアントの位置；リードが５’クリップされているかどうか；リードが不適切なペアであるかどうか；リードがインデルを含むかどうか；ならびに所与のバリアントのバリアント対立遺伝子画分を含む。いくつかの実施形態では、共通のＳＮＰを含むか、またはアライメントアーチファクトを起こしやすいゲノムの領域がフィルタリングされる。当業者に知られている他の多くのフィルターがある。
【0353】
いくつかの実施形態において、対照試料は、バリアントを除くためにシーケンシングされる。例えば、口腔上皮または他の組織源からのＤＮＡをシーケンシングして、生殖系列バリアントを除去することができる。別の実施形態では、バフィーコートまたは白血球ＤＮＡをシーケンシングして、クローン造血に由来する体細胞変異を除去することができる。
【0354】
本発明の組成物、方法及びキットは、多様な範囲の用途及び設定において用途が見出される。いくつかの実施形態において、それらは、配列が試料において検出されることが望まれる任意の方法論において用途が見出される。いくつかの実施形態において、それらは、複雑な試料中の少数（例えば、稀）配列を検出したいという要望がある任意の方法論において用途が見出される。上記の例示的な使用に加えて、いくつかの追加の例示的な使用が以下に提供される。
いくつかの実施形態では、組成物、方法及びキットは、感染症の分析及び治療に用途を見出す。この技術は、試料中に存在し得る低頻度変異の検出に特に価値がある。例えば、本技術は、治療耐性（例えば、抗生物質耐性、抗ウイルス耐性など）感染症（例えば、ＨＩＶ、結核など）に関連する低頻度変異の検出に使用される。この技術は、シーケンシングのための細菌またはウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡの選択的プルダウンにおける使用がさらに見出される。
いくつかの実施形態では、組成物、方法及びキットは、感染症の分析及び治療に用途を見出す。この技術は、試料中に存在し得る低頻度変異の検出に特に価値がある。例えば、本技術は、治療耐性（例えば、抗生物質耐性、抗ウイルス耐性など）感染症（例えば、ＨＩＶ、結核など）に関連する低頻度変異の検出に使用される。この技術は、シーケンシングのための細菌またはウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡの選択的プルダウンにおける使用がさらに見出される。
【0355】
上記のように、本技術は、複雑な試料中の分析物の分析及び／または濃縮に特によく適している。研究及び臨床的関心が高まっている１つの分野は、本技術がシーケンシングまたは他の分析のための所望の細菌ＤＮＡのはるかに高い特異性選択を提供するための用途を見出す微生物叢分析である。
【0356】
この技術はまた、多くの異なる試料のハイスループット分析ならびに多重分析にも使用される。これらの利点は、法医学分析、父親／母親検査、疾患分析（例えば、がん、感染性疾患）、薬物感受性検査、農業及び食品検査（例えば、選択的育種を支援するため、微量の汚染物質を特定するため）を含む、多種多様な遺伝子型判定用途に用途を見出す。
【0357】
本技術は、合成核酸（例えば、ＤＮＡ）エラー訂正に使用される。合成核酸は、研究、診断及び臨床適応症に使用される。多くの場合、意図しないまたは望ましくない配列を有する核酸分子の使用を回避または最小化することが重要である。この技術は、望ましくない分子からの所望の分子の同定及び単離に使用される。
【0358】
核酸編集は、研究、合成生物学、及び臨床応用における重要なプロセスとして浮上している。例えば、核酸のＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ編集及び関連するプロセスが重要なプロセスとして浮上している。これらの編集技術の多くは、意図された編集生成物、未編集生成物、及び意図されていない編集生成物を含む分子の混合集団をもたらす。本明細書で提供される技術は、意図された編集製品の識別、選択、及び分離を容易にする。
【0359】
この技術は、環境モニタリングにも使用される。農業用途に加えて、この技術は、微量の目的の分析物を含み得る環境試料の分析に特によく適している。このような試料としては、限定するわけではないが、天然種及び侵襲種の生物の分析、侵襲種の早期検出、空気及び水汚染、ならびに太古ＤＮＡ分析が挙げられる。試料の種類には、土壌、水、雪、糞便、粘液、配偶子、脱皮した皮膚、死体、毛髪及び空気が含まれるが、これらに限定されない。
【0360】
本技術は、特定の試料からの核酸の所望のサブセットを他のサブセットから単離するのに使用される。例えば、この技術は、葉緑体ゲノム及びミトコンドリアゲノムの単離及び分析に使用される。
【0361】
本技術は、操作された細胞及び天然の細胞の細胞株スクリーニングに使用される。そのような細胞株としては、細胞培養物（初代及び不死化）、幹細胞（胚性、人工多能性、脱分化など）、細胞療法を目的とした分化細胞、研究または臨床用途のためのエクスビボ改変細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）、及び遺伝子操作された細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【0362】
この技術は、損傷を受けていない核酸または所望の核酸から損傷を受けた核酸または他の望ましくない核酸を除去するための用途が見出される。例えば、本技術は、メチル化分析前に試料から損傷ＤＮＡを除去するために使用され得る。
【0363】
この技術は、対象への投与前の細胞（例えば、胚、卵、精子）、リポソーム、エキソソーム、核酸ベクター（例えば、遺伝子治療ベクター）などの着床前スクリーニングに使用される。
【0364】
この技術は、薬物毒性スクリーニングに使用される。この技術は、特定の薬物の使用に関連し得るＤＮＡ損傷、変異の生成、メチル化変化などの同定に特によく適している。
【0365】
この技術は、核酸のフラグメントミクス分析に使用される。例えば、特定の配列を関連する相関情報（例えば、起源組織、がんなどの疾患との関連など）と関連付けるブレークポイント上に存在するか、またはブレークポイントとアライメントされるプローブが使用され得る。
【0366】
本技術は、核酸の複雑性の低減が望まれる任意の用途に使用され得る。例えば、本技術は、全ゲノム複雑性低減のために使用され得る。いくつかのこのような実施形態では、制限酵素消化または他の核酸断片化プロセスが使用され、その後、既知の末端配列と一致するプローブを使用して切断された分子のみを取り出す工程が続く。
【0367】
この技術は、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）の評価に有用である。反復ヌクレオチド（例えば、ＧＴ／ＣＡリピート）の存在、数または性質が異なる標的核酸分子は、試料中で濃縮及び／または同定される。ＭＳＩは、結腸がん、胃がん、子宮内膜がん、卵巣がん、肝胆道がん、尿路がん、脳がん、及び皮膚がんを含むがこれらに限定されない多くの疾患及び状態に関連している。
【0368】
この技術は、腫瘍変異負荷（ＴＭＢ）の評価にも使用される。ＴＭＢは、用途の中でもとりわけ、免疫チェックポイント療法のための予測バイオマーカーとして浮上している。現在、次世代の全エクソームシーケンシングが、ＴＭＢを評価するために使用されるか、または遺伝子のサブセットの配列を提供する遺伝子パネルが評価される。本明細書で提供される技術を使用することにより、より感度が高く、著しく低コストで負担のかかるＴＭＢ評価が可能になる。
【0369】
この技術は、ハプロタイピングに用途が見出される。遺伝子型ではなくハプロタイプとして報告されるゲノム情報は、個別化医療ならびに多種多様な研究用途にとってますます重要である。ハプロタイプは、単一ヌクレオチドバリアントなどのあまり複雑でないバリアントよりも特異的であり、予後診断、腫瘍の分析、及び移植のための組織の分類にも応用されている。現在、シーケンシングは、分子ハプロタイピングの最も一般的な形態である。シーケンシング技術のエラー率は、正確な情報を得るための障害となる。本明細書で提供される技術は、効率的で非常に正確なハプロ撮影を可能にする。
【0370】
本技術が任意の所望の配列または目的を濃縮する能力は、本技術が既存の核酸方法論を増強することを可能にする。例えば、多くの核酸シーケンシングアプローチは、標的核酸中に反復配列領域が存在する場合に困難を伴う。本明細書で提供される技術は、反復領域の除去を可能にし、そのようなシーケンシング反応をより正確かつ効率的なものにする。
【実施例】
【0371】
実施例１：目的の標的配列の加ピロリン酸分解依存性放出
１．ビーズ調製
試料あたり１ｕｌのビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１カタログ６５６０１）を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに入れた。最大１００ｕＬのビーズを１ｍＬのブロッキング溶液でブロッキングすることができる。
次いで、チューブを磁石上に置き、続いて保存緩衝液を除去した。次いで、チューブに１ｍＬのブロッキング緩衝液（１ｕｇ／ｍＬ ｔＲＮＡを含む１×ＰＢＳ）を添加し、続いて室温（ＲＴ）で３０分間回転させた（４０ｒｐｍ）。
１．ビーズ調製
試料あたり１ｕｌのビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１カタログ６５６０１）を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに入れた。最大１００ｕＬのビーズを１ｍＬのブロッキング溶液でブロッキングすることができる。
次いで、チューブを磁石上に置き、続いて保存緩衝液を除去した。次いで、チューブに１ｍＬのブロッキング緩衝液（１ｕｇ／ｍＬ ｔＲＮＡを含む１×ＰＢＳ）を添加し、続いて室温（ＲＴ）で３０分間回転させた（４０ｒｐｍ）。
【0372】
２．オリゴヌクレオチドアニーリング
１×ＡＢ緩衝液（トリスＨＣｌ ｐＨ＝７．５ １ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＬ、ＥＤＴＡ ０．２ｍＭ）中のオリゴヌクレオチドの希釈液を調製した。
プローブＡ０ ２０ｎＭ
２０ｎＭの完全に相補的なオリゴヌクレオチド２０ｎＭまたはミスマッチのオリゴヌクレオチド
最大５０ｕＬ
１×ＡＢ緩衝液（トリスＨＣｌ ｐＨ＝７．５ １ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＬ、ＥＤＴＡ ０．２ｍＭ）中のオリゴヌクレオチドの希釈液を調製した。
プローブＡ０ ２０ｎＭ
２０ｎＭの完全に相補的なオリゴヌクレオチド２０ｎＭまたはミスマッチのオリゴヌクレオチド
最大５０ｕＬ
【0373】
次いで、得られた混合物を９５℃で５分間インキュベートし、次いで、室温までゆっくり冷却させた。
【0374】
オリゴヌクレオチド混合物を冷却した後、混合物を１０００倍に希釈した。
【0375】
プローブＡ０（配列番号１）：
５’－／５Ｂｉｏｓｇ／ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＣＣＴＴＡＴＡＣＡＣＣＧＴＧＣＣＧＡＡＣＧＣＡＣＣＧＧＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧ－３’
（ここで、／５Ｂｉｏｓｇ／は、５’末端のビオチンを表す）
５’－／５Ｂｉｏｓｇ／ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＣＣＴＴＡＴＡＣＡＣＣＧＴＧＣＣＧＡＡＣＧＣＡＣＣＧＧＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧ－３’
（ここで、／５Ｂｉｏｓｇ／は、５’末端のビオチンを表す）
【0376】
完全に相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号２）：
５’－ＣＣＣＡＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＣＴＴＧＡＧＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＧＴＴＣＧＧＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＡＡＧＧＴＡＡＧＧＴＣＣＣ－３’
５’－ＣＣＣＡＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＣＴＴＧＡＧＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＧＴＴＣＧＧＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＡＡＧＧＴＡＡＧＧＴＣＣＣ－３’
【0377】
ミスマッチオリゴヌクレオチド（配列番号３）：
５’－ＣＣＣＡＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＣＴＴＧＡＧＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＧＴＧＣＧＴＴＣＧＧＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＡＡＧＧＴＡＡＧＧＴＣＣＣ－３’
５’－ＣＣＣＡＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＣＴＴＧＡＧＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＧＴＧＣＧＴＴＣＧＧＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＡＡＧＧＴＡＡＧＧＴＣＣＣ－３’
【0378】
３．ビーズへのオリゴヌクレオチドの付着
ブロッキングしたビーズを２０００×ｇのミニ遠心機で５秒間スピンダウンし、磁石の上に置き、次いで吸引によってブロッキング溶液を除去した。次いで、チューブに、１μＬのビーズごとに１０μＬの２×Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５ ４０ｍＭ、ＮａＣｌ １Ｍ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．０２％）を添加した。
ブロッキングしたビーズを２０００×ｇのミニ遠心機で５秒間スピンダウンし、磁石の上に置き、次いで吸引によってブロッキング溶液を除去した。次いで、チューブに、１μＬのビーズごとに１０μＬの２×Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５ ４０ｍＭ、ＮａＣｌ １Ｍ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．０２％）を添加した。
【0379】
ビーズ／オリゴマー及び緩衝液の比は、以下の通りであった：
２ｘＢｉｎｄｉｎｇ緩衝液 ４０ｕＬ
ビーズ１０μＬ
１０００倍に希釈したアニーリングオリゴヌクレオチド ５０μＬ。
２ｘＢｉｎｄｉｎｇ緩衝液 ４０ｕＬ
ビーズ１０μＬ
１０００倍に希釈したアニーリングオリゴヌクレオチド ５０μＬ。
【0380】
次に、チューブを室温で３０分間回転（４０ｒｐｍ）させた。
【0381】
４．洗浄工程
次いで、ビーズを１×洗浄緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５ ２０ｍＭ、ＮａＣｌ ０．５Ｍ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．１％）１００ｕＬで１回洗浄した。
次いで、ビーズを１×洗浄緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５ ２０ｍＭ、ＮａＣｌ ０．５Ｍ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．１％）１００ｕＬで１回洗浄した。
【0382】
５．ビーズ洗浄緩衝液の０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを含む１００ｕＬの１×ＢＦＦ６緩衝液への交換
０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを含む１×ＢＦＦ６組成物
酢酸トリスｐＨ＝７．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ３０ｍＭ
酢酸マグネシウム １７．１２５ｍＭ
ＴＷＥＥＮ２０ ０．０１％
０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを含む１×ＢＦＦ６組成物
酢酸トリスｐＨ＝７．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ３０ｍＭ
酢酸マグネシウム １７．１２５ｍＭ
ＴＷＥＥＮ２０ ０．０１％
【0383】
６．加ピロリン酸分解
次いで、１ｘＢＦＦ６ ０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ緩衝液を除去し、ＰＰＬ混合物（４℃で保存）をビーズに添加した。
ＰＰＬ混合物は、以下から構成されていた：
０．１％のＴＷＥＥＮ２０を含む１×ＢＦＦ６
１０Ｕ／ｍＬ Ｋｌｅｎｏｗ（ｅｘｏ－）
２Ｕ／ｍＬアピラーゼ
０．５ｍＭ ＰＰｉ
総体積１０ｕＬ
得られた混合物を４５℃で３０分間インキュベートした。
次いで、１ｘＢＦＦ６ ０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ緩衝液を除去し、ＰＰＬ混合物（４℃で保存）をビーズに添加した。
ＰＰＬ混合物は、以下から構成されていた：
０．１％のＴＷＥＥＮ２０を含む１×ＢＦＦ６
１０Ｕ／ｍＬ Ｋｌｅｎｏｗ（ｅｘｏ－）
２Ｕ／ｍＬアピラーゼ
０．５ｍＭ ＰＰｉ
総体積１０ｕＬ
得られた混合物を４５℃で３０分間インキュベートした。
【0384】
７．ＰＰｉの不活性化
ＴＩＰＰ混合物２．５ｕＬを不活化ＰＰｉに添加した。
ＴＩＰＰ混合物は、以下から構成されていた：
０．１％のＴＷＥＥＮ２０を含む１×ＢＦＦ６
ＴＩＰＰ １６Ｕ／ｍＬ
ポイント６からの混合物１０ｕＬ。
総体積１２．５ｕＬ
得られた混合物を３７℃で５分間インキュベートした。
ＴＩＰＰ混合物２．５ｕＬを不活化ＰＰｉに添加した。
ＴＩＰＰ混合物は、以下から構成されていた：
０．１％のＴＷＥＥＮ２０を含む１×ＢＦＦ６
ＴＩＰＰ １６Ｕ／ｍＬ
ポイント６からの混合物１０ｕＬ。
総体積１２．５ｕＬ
得られた混合物を３７℃で５分間インキュベートした。
【0385】
８．目的の標的の放出及び検出
ポイント７からの混合物を６０℃まで５分間加熱した。上清から磁性ビーズを分離するために、混合物を含むチューブを６０℃に設定したホットプレートに置いた磁気ラックに移した。
ポイント７からの混合物を６０℃まで５分間加熱した。上清から磁性ビーズを分離するために、混合物を含むチューブを６０℃に設定したホットプレートに置いた磁気ラックに移した。
【0386】
透明な上清２ｕＬを、以下から構成される検出混合物に添加した：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
０．４ｍＭ ｄＮＴＰ
０．２ｕＭプライマー混合物
２０Ｕ／ｍＬ Ｑ５Ｕ ＤＮＡポリメラーゼ
１０Ｕ／ｍＬ ＵＤＧ
１ｘ ＳｙｂｒＧｒｅｅｎＩ
総体積：１２．５ｕＬ
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
０．４ｍＭ ｄＮＴＰ
０．２ｕＭプライマー混合物
２０Ｕ／ｍＬ Ｑ５Ｕ ＤＮＡポリメラーゼ
１０Ｕ／ｍＬ ＵＤＧ
１ｘ ＳｙｂｒＧｒｅｅｎＩ
総体積：１２．５ｕＬ
【0387】
Ｑ５緩衝液
Ｑ５緩衝液組成物は、公開されていない。
Ｑ５緩衝液組成物は、公開されていない。
【0388】
プライマー混合物：
Ｆｗｄ（配列番号４）：５’－Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊ＡＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＣＴＴＧＡＧＧＡＴＣＴＴＧ－３’
Ｒｅｖ（配列番号５）：５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＧＧＡＣＣＴＴＡＣＣＴＴＡＴＡＣＡＣＣＧＴＧＣＣＧ－３’
（式中、＊はホスホロチオエート結合を表し、／５Ｐｈｏｓ／は５’末端ホスフェートを表す）
Ｆｗｄ（配列番号４）：５’－Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊ＡＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＣＴＴＧＡＧＧＡＴＣＴＴＧ－３’
Ｒｅｖ（配列番号５）：５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＧＧＡＣＣＴＴＡＣＣＴＴＡＴＡＣＡＣＣＧＴＧＣＣＧ－３’
（式中、＊はホスホロチオエート結合を表し、／５Ｐｈｏｓ／は５’末端ホスフェートを表す）
【0389】
次いで、得られた混合物を、以下に示すようにインキュベートした：
３７℃、１分間
５５℃、１０分間
９８℃、１分間
（９８℃、１０秒間
６３℃、１５秒間
７２℃、１５秒間）×５０
７２℃、５分間
４℃休止
３７℃、１分間
５５℃、１０分間
９８℃、１分間
（９８℃、１０秒間
６３℃、１５秒間
７２℃、１５秒間）×５０
７２℃、５分間
４℃休止
【0390】
蛍光読み取り値をｆａｍチャネル内の各サイクルの後に取得した。結果を図４に見ることができる。
【0391】
実施例２：目的の標的配列の加ピロリン酸分解依存的濃縮
１．ビーズ調製
試料あたり１ｕｌのビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１カタログ６５６０１）を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに入れた。最大１００ｕＬのビーズを１ｍＬのブロッキング緩衝液でブロッキングすることができる。チューブを磁石上に置き、続いて保存緩衝液を除去した。ブロッキング緩衝液１ｍＬ（１ｕｇ／ｍＬ ｔＲＮＡを含む１×ＰＢＳ、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ ０．１％）をチューブに添加し、続いて室温（ＲＴ）で３０分間回転させた（４０ｒｐｍ）。
１．ビーズ調製
試料あたり１ｕｌのビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１カタログ６５６０１）を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに入れた。最大１００ｕＬのビーズを１ｍＬのブロッキング緩衝液でブロッキングすることができる。チューブを磁石上に置き、続いて保存緩衝液を除去した。ブロッキング緩衝液１ｍＬ（１ｕｇ／ｍＬ ｔＲＮＡを含む１×ＰＢＳ、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ ０．１％）をチューブに添加し、続いて室温（ＲＴ）で３０分間回転させた（４０ｒｐｍ）。
【0392】
２．１％ ＭＡＦ及び１０％ ＭＡＦ試料調製
１％ ＭＡＦ：１００ｎＭの野生型オリゴヌクレオチドを１ｎＭの変異体オリゴヌクレオチドと１００μＬの最終体積で混合した。
１０％ ＭＡＦ：１００ｎＭの野生型オリゴヌクレオチドを１０ｎＭの変異体オリゴヌクレオチドと１００μＬの最終体積で混合した。
１％ ＭＡＦ：１００ｎＭの野生型オリゴヌクレオチドを１ｎＭの変異体オリゴヌクレオチドと１００μＬの最終体積で混合した。
１０％ ＭＡＦ：１００ｎＭの野生型オリゴヌクレオチドを１０ｎＭの変異体オリゴヌクレオチドと１００μＬの最終体積で混合した。
【0393】
野生型オリゴヌクレオチド（配列番号６）：
５’－ＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴ－３’
５’－ＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴ－３’
【0394】
変異体オリゴヌクレオチド（配列番号７）：
５’－Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊ＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧＧＣＴＣＡＴＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧ－３’
（式中、＊はホスホロチオエート結合を表す。）
５’－Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊ＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧＧＣＴＣＡＴＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧ－３’
（式中、＊はホスホロチオエート結合を表す。）
【0395】
３．オリゴヌクレオチドアニーリング
１×ＡＢ緩衝液（トリスＨＣｌ ｐＨ＝７．５ １ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、ＥＤＴＡ ０．２ｍＭ）中のオリゴヌクレオチドの希釈液を調製した。
プローブＡ０ ２０ｎＭ
１％ ＭＡＦまたは１０％ ＭＡＦ試料 １０ｕＬ
ヌクレアーゼフリー水を用いて最大５０ｕＬを構成した。
次いで、得られた混合物を９５℃で５分間インキュベートし、次いで、室温までゆっくり冷却させた。
オリゴヌクレオチド混合物を冷却した後、混合物を１０００倍に希釈した。
１×ＡＢ緩衝液（トリスＨＣｌ ｐＨ＝７．５ １ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、ＥＤＴＡ ０．２ｍＭ）中のオリゴヌクレオチドの希釈液を調製した。
プローブＡ０ ２０ｎＭ
１％ ＭＡＦまたは１０％ ＭＡＦ試料 １０ｕＬ
ヌクレアーゼフリー水を用いて最大５０ｕＬを構成した。
次いで、得られた混合物を９５℃で５分間インキュベートし、次いで、室温までゆっくり冷却させた。
オリゴヌクレオチド混合物を冷却した後、混合物を１０００倍に希釈した。
【0396】
プローブＡ０（配列番号８）：
５’－／５Ｂｉｏｓｇ／ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧ－３’
（ここで、／５Ｂｉｏｓｇ／は、５’末端のビオチンを表す）
５’－／５Ｂｉｏｓｇ／ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧ－３’
（ここで、／５Ｂｉｏｓｇ／は、５’末端のビオチンを表す）
【0397】
４．標的プレビーズ調製物のｄＰＣＲ定量化
アニーリングした混合物及び希釈した混合物中の野生型オリゴヌクレオチド及び変異体オリゴヌクレオチドの濃度を、ｄＰＣＲを用いて定量化した。１％ ＭＡＦ及び１０％ ＭＡＦ試料（ポイント３から得た）の１０００倍希釈をさらに２０倍希釈し、続いて１：１の段階希釈を６回行い、基準曲線を作成した。
アニーリングした混合物及び希釈した混合物中の野生型オリゴヌクレオチド及び変異体オリゴヌクレオチドの濃度を、ｄＰＣＲを用いて定量化した。１％ ＭＡＦ及び１０％ ＭＡＦ試料（ポイント３から得た）の１０００倍希釈をさらに２０倍希釈し、続いて１：１の段階希釈を６回行い、基準曲線を作成した。
【0398】
ｄＰＣＲ混合物は、以下から構成されていた：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
０．４ｍＭ ｄＮＴＰ
０．２μＭプライマー混合物
２０Ｕ／ｍＬ Ｑ５Ｕポリメラーゼ
１０Ｕ／ｍＬ ＵＤＧ
２×ＥｖａＧｒｅｅｎ
０．０００３μｇ／ｍＬ Ａｌｅｘａ ７００
０．２％ＴＷＥＥＮ２０
４μＬ ＤＮＡテンプレート
総容量：１２μＬ
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
０．４ｍＭ ｄＮＴＰ
０．２μＭプライマー混合物
２０Ｕ／ｍＬ Ｑ５Ｕポリメラーゼ
１０Ｕ／ｍＬ ＵＤＧ
２×ＥｖａＧｒｅｅｎ
０．０００３μｇ／ｍＬ Ａｌｅｘａ ７００
０．２％ＴＷＥＥＮ２０
４μＬ ＤＮＡテンプレート
総容量：１２μＬ
【0399】
Ｑ５緩衝液
Ｑ５緩衝液組成物は、公開されていない。
Ｑ５緩衝液組成物は、公開されていない。
【0400】
プライマー混合物：
ＦＷＤ（配列番号９）：５’－Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧ－３’
ＲＥＶ（配列番号１０）：５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＡＴＴＧＴＣＴＴＴＧＴＧＴＴＣＣＣＧＧＡ－３’
または
ＦＷＤ（配列番号１１）：５’－Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊ＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧ－３’
ＲＥＶ（配列番号１２）：５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴ－３’
（式中、＊はホスホロチオエート結合を表し、／５Ｐｈｏｓ／は５’末端ホスフェートを表し、異なるプライマー混合物を野生型及び変異体オリゴヌクレオチドの定量に使用した。）
ＦＷＤ（配列番号９）：５’－Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧ－３’
ＲＥＶ（配列番号１０）：５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＡＴＴＧＴＣＴＴＴＧＴＧＴＴＣＣＣＧＧＡ－３’
または
ＦＷＤ（配列番号１１）：５’－Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊ＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧ－３’
ＲＥＶ（配列番号１２）：５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴ－３’
（式中、＊はホスホロチオエート結合を表し、／５Ｐｈｏｓ／は５’末端ホスフェートを表し、異なるプライマー混合物を野生型及び変異体オリゴヌクレオチドの定量に使用した。）
【0401】
次いで、得られた混合物を、以下に示すようにインキュベートした：
３７℃、１分間
５５℃、１０分間
９８℃、１分間
（９８℃、１０秒間
６３℃、１５秒間
７２℃ １５秒）×３０
７２℃、５分間
３５℃、休止
３７℃、１分間
５５℃、１０分間
９８℃、１分間
（９８℃、１０秒間
６３℃、１５秒間
７２℃ １５秒）×３０
７２℃、５分間
３５℃、休止
【0402】
インキュベーション後に蛍光読取りを行い、ｄＰＣＲメーカーソフトウェアを種々のオリゴマーの定量に使用した。
【0403】
５．ビーズへのオリゴヌクレオチドの付着
ブロッキングしたビーズを２０００×ｇのミニ遠心機で５秒間スピンダウンし、磁石の上に置き、引き続いて吸引によってブロッキング溶液を除去した。ビーズ１μＬごとに１０ｕＬの２×結合緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５ ４０ｍＭ、ＮａＣｌ １Ｍ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．０２％）をチューブに添加した。
ブロッキングしたビーズを２０００×ｇのミニ遠心機で５秒間スピンダウンし、磁石の上に置き、引き続いて吸引によってブロッキング溶液を除去した。ビーズ１μＬごとに１０ｕＬの２×結合緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５ ４０ｍＭ、ＮａＣｌ １Ｍ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．０２％）をチューブに添加した。
【0404】
ビーズ／オリゴマー及び緩衝液の比は、以下の通りであった：
２ｘＢｉｎｄｉｎｇ緩衝液 ４０μＬ
ビーズ１０μＬ
（ポイント３から）１０００倍希釈した５０μＬのアニーリングしたオリゴヌクレオチド。
次に、チューブを室温で３０分間回転（４０ｒｐｍ）させた。
２ｘＢｉｎｄｉｎｇ緩衝液 ４０μＬ
ビーズ１０μＬ
（ポイント３から）１０００倍希釈した５０μＬのアニーリングしたオリゴヌクレオチド。
次に、チューブを室温で３０分間回転（４０ｒｐｍ）させた。
【0405】
６．洗浄工程
次いで、ビーズを１×洗浄緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５ ２０ｍＭ、ＮａＣｌ ０．５Ｍ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．１％）１００μＬで１回洗浄した。
次いで、ビーズを１×洗浄緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５ ２０ｍＭ、ＮａＣｌ ０．５Ｍ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．１％）１００μＬで１回洗浄した。
【0406】
７．ビーズ洗浄緩衝液を０．０１％ ＴＷＥＥＮ２０を含む１×ＢＦＦ６緩衝液１００μＬに交換する
０．０１％ ＴＷＥＥＮ２０を含む１×ＢＦＦ６組成物
酢酸トリスｐＨ＝７．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ３０ｍＭ
酢酸マグネシウム １７．１２５ｍＭ
ＴＷＥＥＮ２０ ０．０１％
０．０１％ ＴＷＥＥＮ２０を含む１×ＢＦＦ６組成物
酢酸トリスｐＨ＝７．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ３０ｍＭ
酢酸マグネシウム １７．１２５ｍＭ
ＴＷＥＥＮ２０ ０．０１％
【0407】
８．加ピロリン酸分解
次いで、１×ＢＦＦ６ ０．０１％ ＴＷＥＥＮ２０緩衝液を除去し、ＰＰＬ混合物（４℃で保存）をビーズに添加した。
ＰＰＬ混合物は、以下から構成されていた：
０．１％ ＴＷＥＥＮ２０を含む１×ＢＦＦ６
２０Ｕ／ｍＬ Ｋｌｅｎｏｗ（ｅｘｏ－）
２Ｕ／ｍＬアピラーゼ
０．５ｍＭ ＰＰｉ
総体積２０μＬ
得られた混合物を４０℃で１分間インキュベートした。
次いで、１×ＢＦＦ６ ０．０１％ ＴＷＥＥＮ２０緩衝液を除去し、ＰＰＬ混合物（４℃で保存）をビーズに添加した。
ＰＰＬ混合物は、以下から構成されていた：
０．１％ ＴＷＥＥＮ２０を含む１×ＢＦＦ６
２０Ｕ／ｍＬ Ｋｌｅｎｏｗ（ｅｘｏ－）
２Ｕ／ｍＬアピラーゼ
０．５ｍＭ ＰＰｉ
総体積２０μＬ
得られた混合物を４０℃で１分間インキュベートした。
【0408】
０．１％ ＴＷＥＥＮ２０を含む１×ＢＦＦ６組成物
酢酸トリスｐＨ＝７．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ３０ｍＭ
酢酸マグネシウム １７．１２５ｍＭ
ＴＷＥＥＮ２０ ０．１％
酢酸トリスｐＨ＝７．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ３０ｍＭ
酢酸マグネシウム １７．１２５ｍＭ
ＴＷＥＥＮ２０ ０．１％
【0409】
９．ＰＰｉの不活性化
ＴＩＰＰ混合物５μＬを添加してＰＰｉを不活性化した。
ＴＩＰＰ混合物は、以下から構成されていた：
０．１％ ＴＷＥＥＮ２０を含む１×ＢＦＦ６
ＴＩＰＰ １６Ｕ／ｍＬ
ポイント８からの混合物２０μＬ。
総体積２５μＬ
得られた混合物を３７℃で５分間インキュベートした。
ＴＩＰＰ混合物５μＬを添加してＰＰｉを不活性化した。
ＴＩＰＰ混合物は、以下から構成されていた：
０．１％ ＴＷＥＥＮ２０を含む１×ＢＦＦ６
ＴＩＰＰ １６Ｕ／ｍＬ
ポイント８からの混合物２０μＬ。
総体積２５μＬ
得られた混合物を３７℃で５分間インキュベートした。
【0410】
１０．目的の標的の放出及び検出
ポイント９からの混合物を６０℃まで１０分間加熱した。上清から磁性ビーズを分離するために、混合物を含むチューブを６０℃に設定したホットプレートに置いた磁気ラックに移した。
ポイント９からの混合物を６０℃まで１０分間加熱した。上清から磁性ビーズを分離するために、混合物を含むチューブを６０℃に設定したホットプレートに置いた磁気ラックに移した。
【0411】
１１．ビーズから放出された標的のｄＰＣＲ定量化
次いで、上清中の野生型オリゴヌクレオチド及び変異オリゴヌクレオチドの濃度をｄＰＣＲを用いて定量化した。
次いで、上清中の野生型オリゴヌクレオチド及び変異オリゴヌクレオチドの濃度をｄＰＣＲを用いて定量化した。
【0412】
透明な上清４μｕＬを、以下から構成される検出混合物に添加した：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
０．４ｍＭ ｄＮＴＰ
０．２μＭプライマー混合物
２０Ｕ／ｍＬ Ｑ５Ｕ ＤＮＡポリメラーゼ
１０Ｕ／ｍＬ ＵＤＧ
２×ＥｖａＧｒｅｅｎ
０．０００３μｇ／ｍＬ Ａｌｅｘａ ７００ ０．０００３μｇ／ｍＬ
０．２％ ＴＷＥＥＮ２０
総容量：１２μＬ
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
０．４ｍＭ ｄＮＴＰ
０．２μＭプライマー混合物
２０Ｕ／ｍＬ Ｑ５Ｕ ＤＮＡポリメラーゼ
１０Ｕ／ｍＬ ＵＤＧ
２×ＥｖａＧｒｅｅｎ
０．０００３μｇ／ｍＬ Ａｌｅｘａ ７００ ０．０００３μｇ／ｍＬ
０．２％ ＴＷＥＥＮ２０
総容量：１２μＬ
【0413】
Ｑ５緩衝液
Ｑ５緩衝液組成物は、公開されていない。
Ｑ５緩衝液組成物は、公開されていない。
【0414】
プライマー混合物：
ＦＷＤ（配列番号９）：５’－Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧ－３’
ＲＥＶ（配列番号１０）：５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＡＴＴＧＴＣＴＴＴＧＴＧＴＴＣＣＣＧＧＡ－３’
または
ＦＷＤ（配列番号１１）：５’－Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊ＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧ－３’
ＲＥＶ（配列番号１２）：５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴ－３’
（式中、＊はホスホロチオエート結合を表し、／５Ｐｈｏｓ／は５’末端ホスフェートを表し、異なるプライマー混合物を野生型及び変異体オリゴヌクレオチドの定量に使用した。）
ＦＷＤ（配列番号９）：５’－Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧ－３’
ＲＥＶ（配列番号１０）：５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＡＴＴＧＴＣＴＴＴＧＴＧＴＴＣＣＣＧＧＡ－３’
または
ＦＷＤ（配列番号１１）：５’－Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊ＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧ－３’
ＲＥＶ（配列番号１２）：５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴ－３’
（式中、＊はホスホロチオエート結合を表し、／５Ｐｈｏｓ／は５’末端ホスフェートを表し、異なるプライマー混合物を野生型及び変異体オリゴヌクレオチドの定量に使用した。）
【0415】
次いで、得られた混合物を、以下に示すようにインキュベートした：
３７℃、１分間
５５℃、１０分間
９８℃、１分間
（９８℃、１０秒間
６３℃、１５秒間
７２℃ １５秒）×３０
７２℃、５分間
３５℃、休止
３７℃、１分間
５５℃、１０分間
９８℃、１分間
（９８℃、１０秒間
６３℃、１５秒間
７２℃ １５秒）×３０
７２℃、５分間
３５℃、休止
【0416】
インキュベーション後に蛍光読取りを行い、ｄＰＣＲメーカーソフトウェアを種々のオリゴマーの定量に使用した。
【0417】
オリゴヌクレオチドの定量化の結果を以下の表に示す。
【表1】
【0418】
実施例３：ＥＧＦＲエクソン２０ Ｔ７９０Ｍバリアントの分析
１．ビーズの調製
ａ．ビーズブロッキング工程
－試料１個あたり１μＬのビーズを採取し、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１カタログ６５００１）に入れる。最大１００μＬのビーズをブロッキング溶液１ｍＬでブロッキングすることができる。
－ビーズを含むチューブを磁石に置き、ビーズが分離し、溶液が透明になるまで待つ。
－保存緩衝液を除去する。
－ビーズを含むチューブに１ｍＬのブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、１μｇ／ｍＬ
ｔ－ＲＮＡ）を添加する。
－ＲＴで１５ｒｐｍで３０分間回転させる。
１．ビーズの調製
ａ．ビーズブロッキング工程
－試料１個あたり１μＬのビーズを採取し、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１カタログ６５００１）に入れる。最大１００μＬのビーズをブロッキング溶液１ｍＬでブロッキングすることができる。
－ビーズを含むチューブを磁石に置き、ビーズが分離し、溶液が透明になるまで待つ。
－保存緩衝液を除去する。
－ビーズを含むチューブに１ｍＬのブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、１μｇ／ｍＬ
ｔ－ＲＮＡ）を添加する。
－ＲＴで１５ｒｐｍで３０分間回転させる。
【0419】
ｂ．緩衝液交換
－ビーズをスピンダウンし、磁石に置く。ビーズが分離し、溶液が透明になるまで待つ。
－ブロッキング溶液を除去する。
－１μＬのビーズごとに２×Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５ ４０ｍＭ、ＮａＣｌ １Ｍ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．０２％）を１０μＬ添加する。
－ビーズを５秒間ボルテックス処理により混合する。
－ビーズをスピンダウンし、磁石に置く。ビーズが分離し、溶液が透明になるまで待つ。
－ブロッキング溶液を除去する。
－１μＬのビーズごとに２×Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５ ４０ｍＭ、ＮａＣｌ １Ｍ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．０２％）を１０μＬ添加する。
－ビーズを５秒間ボルテックス処理により混合する。
【0420】
２．オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション
－１×ＳＳＣ緩衝液中のオリゴヌクレオチドの希釈を調製する（５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ）
－プローブオリゴヌクレオチド２ｐＭ
－ＷＴまたは変異体オリゴヌクレオチド０．２／２ｆＭ
－ビーズ１μＬあたり５０μＬのオリゴヌクレオチドを調製した。
－９５℃で５分間及び５０／６０℃で７２時間インキュベートする。
－１×ＳＳＣ緩衝液中のオリゴヌクレオチドの希釈を調製する（５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ）
－プローブオリゴヌクレオチド２ｐＭ
－ＷＴまたは変異体オリゴヌクレオチド０．２／２ｆＭ
－ビーズ１μＬあたり５０μＬのオリゴヌクレオチドを調製した。
－９５℃で５分間及び５０／６０℃で７２時間インキュベートする。
【0421】
プローブオリゴヌクレオチド（配列番号１３）：
５’－／５Ｂｉｏｓｇ／ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧ－３’
ＷＴオリゴヌクレオチド（配列番号１４）：
５’－ＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＴ－３’
変異体オリゴヌクレオチド（配列番号１５）：
５’－ＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧＧＣＴＣＡＴＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＴ－３’
（／５Ｂｉｏｓｇは、５’末端のビオチンを表す。）
５’－／５Ｂｉｏｓｇ／ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧ－３’
ＷＴオリゴヌクレオチド（配列番号１４）：
５’－ＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＴ－３’
変異体オリゴヌクレオチド（配列番号１５）：
５’－ＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧＧＣＴＣＡＴＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＴ－３’
（／５Ｂｉｏｓｇは、５’末端のビオチンを表す。）
【0422】
３．ビーズへのオリゴヌクレオチドの付着
－ビーズ及びオリゴヌクレオチドを以下の比で混合する：
２ｘＢｉｎｄｉｎｇ緩衝液 ４０ｕＬ
工程１からのビーズ１０μＬ
工程２からのオリゴヌクレオチド５０μＬ
－ＲＴで１５ｒｐｍで３０分間回転させる。
－ビーズ及びオリゴヌクレオチドを以下の比で混合する：
２ｘＢｉｎｄｉｎｇ緩衝液 ４０ｕＬ
工程１からのビーズ１０μＬ
工程２からのオリゴヌクレオチド５０μＬ
－ＲＴで１５ｒｐｍで３０分間回転させる。
【0423】
４．ビーズ洗浄
－付着工程が完了した後－試料をスピンダウンし、磁石に試料を置いて７分間待つ。
－１００μＬの上清の８０μＬを除去し、１×洗浄緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５ ２０ｍＭ、ＮａＣｌ ０．５Ｍ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．１％）１００μＬを添加する。
－試料を１０秒間にわたってボルテックスし、スピンダウンする。
－試料を磁石に置いて２分間待つ。
－１２０μＬの上清の９０μＬを除去し、１ｘ洗浄緩衝液１００μＬを添加する。
－試料位置を磁石上で変えることによって試料を混合する（１０回）。２分間待つ。
－上清全体を除去し、１×洗浄緩衝液１００μＬを添加する。
－試料位置を磁石上で変えることによって試料を混合する（１０回）。２分間待つ。
－上清全体を除去し、磁石から試料を取り出し、１００μＬの１×ＢＦＦ６緩衝液（トリス酢酸ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ、酢酸カリウム３０ｍＭ、酢酸マグネシウム１７．１２５ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．０１％）を添加する。
－試料をスピンダウンさせ、磁石に試料を載せ、２分間待つ。
－１×ＢＦＦ６緩衝液を除去する。
－付着工程が完了した後－試料をスピンダウンし、磁石に試料を置いて７分間待つ。
－１００μＬの上清の８０μＬを除去し、１×洗浄緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５ ２０ｍＭ、ＮａＣｌ ０．５Ｍ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．１％）１００μＬを添加する。
－試料を１０秒間にわたってボルテックスし、スピンダウンする。
－試料を磁石に置いて２分間待つ。
－１２０μＬの上清の９０μＬを除去し、１ｘ洗浄緩衝液１００μＬを添加する。
－試料位置を磁石上で変えることによって試料を混合する（１０回）。２分間待つ。
－上清全体を除去し、１×洗浄緩衝液１００μＬを添加する。
－試料位置を磁石上で変えることによって試料を混合する（１０回）。２分間待つ。
－上清全体を除去し、磁石から試料を取り出し、１００μＬの１×ＢＦＦ６緩衝液（トリス酢酸ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ、酢酸カリウム３０ｍＭ、酢酸マグネシウム１７．１２５ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．０１％）を添加する。
－試料をスピンダウンさせ、磁石に試料を載せ、２分間待つ。
－１×ＢＦＦ６緩衝液を除去する。
【0424】
５．ＰＰＬ反応
－４℃に保たれたビーズにＰＰＬ混合物を添加する。ＰＰＬは以下の組成を有する：
１×ＢＦＦ６－０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０
２０Ｕ／ｍＬ Ｋｌｅｎｏｗ（ｅｘｏ－）
２Ｕ／ｍＬアピラーゼ
＋／－０．０５ｍＭ ＰＰｉ
総体積：２０μＬ
－４０°Ｃで１０分間インキュベートし、４℃で休止する。
－４℃に保たれたビーズにＰＰＬ混合物を添加する。ＰＰＬは以下の組成を有する：
１×ＢＦＦ６－０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０
２０Ｕ／ｍＬ Ｋｌｅｎｏｗ（ｅｘｏ－）
２Ｕ／ｍＬアピラーゼ
＋／－０．０５ｍＭ ＰＰｉ
総体積：２０μＬ
－４０°Ｃで１０分間インキュベートし、４℃で休止する。
【0425】
６．ＴＩＰＰ反応
－ＰＰＬ反応が４℃に達したら、以下を有するＴＩＰＰ混合物５μＬを添加する：
１×ＢＦＦ６－０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０
１６Ｕ／ｍＬ ＴＩＰＰ
工程５からの混合物２０μＬ。
総体積：２５μＬ
－３７℃で５分間、６０℃で１０分間、６０℃休止でインキュベートする
－ＰＰＬ反応が４℃に達したら、以下を有するＴＩＰＰ混合物５μＬを添加する：
１×ＢＦＦ６－０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０
１６Ｕ／ｍＬ ＴＩＰＰ
工程５からの混合物２０μＬ。
総体積：２５μＬ
－３７℃で５分間、６０℃で１０分間、６０℃休止でインキュベートする
【0426】
７．予備増幅
－工程６からの試料を、ホットプレート上に保たれた磁石に載せ、６０℃まで加熱する。
－ビーズが分離された後に、２μＬの上清を取り、以下の混合物に添加する：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
ｄＮＴＰ ０．４ｍＭ
プライマー混合物１ ０．１μＭ
Ｑ５Ｕポリメラーゼ２０Ｕ／ｍＬ
ＵＤＧ １０Ｕ／ｍＬ
総体積：１２．５μＬ
Ｑ５Ｕ緩衝液：
プライマー混合物１は、以下を有する。
フォワードプライマー（配列番号１６）：５’－ＡＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＣＴＴＧＧＡＴＡＴＴＣＴＣＧＡＣＡＣ－３’
リバースプライマー（配列番号１７）：５’－ＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣ－３’
－試料をサーモサイクラーに入れ、１０５℃で蓋をしてインキュベートする。
１．ＵＤＧ ３７℃、１分間
２．変性開始温度９８℃、１分間
３．変性９８℃、１０秒間
４．アニーリング６３℃、１５秒間
５．伸長７２℃、１５秒間
６．最終伸長、７２℃、５分間
７．冷却、４℃維持
－工程３～５を１２回繰り返す
－工程６からの試料を、ホットプレート上に保たれた磁石に載せ、６０℃まで加熱する。
－ビーズが分離された後に、２μＬの上清を取り、以下の混合物に添加する：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
ｄＮＴＰ ０．４ｍＭ
プライマー混合物１ ０．１μＭ
Ｑ５Ｕポリメラーゼ２０Ｕ／ｍＬ
ＵＤＧ １０Ｕ／ｍＬ
総体積：１２．５μＬ
Ｑ５Ｕ緩衝液：
プライマー混合物１は、以下を有する。
フォワードプライマー（配列番号１６）：５’－ＡＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＣＴＴＧＧＡＴＡＴＴＣＴＣＧＡＣＡＣ－３’
リバースプライマー（配列番号１７）：５’－ＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣ－３’
－試料をサーモサイクラーに入れ、１０５℃で蓋をしてインキュベートする。
１．ＵＤＧ ３７℃、１分間
２．変性開始温度９８℃、１分間
３．変性９８℃、１０秒間
４．アニーリング６３℃、１５秒間
５．伸長７２℃、１５秒間
６．最終伸長、７２℃、５分間
７．冷却、４℃維持
－工程３～５を１２回繰り返す
【0427】
８．ｄＰＣＲ定量化
－工程７からの予備増幅が終了した後、工程７からの混合物２μＬを、以下を含有する反応物に添加する：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
ｄＮＴＰ ０．４ｍＭ
プライマー混合物２または３ ０．２μＭ
Ｑ５Ｕポリメラーゼ２０Ｕ／ｍＬ
ＥｖａＧｒｅｅｎ色素２ｘ
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００色素０．０００３μｇ／μＬ
ＴＷＥＥＮ２０ ０．２％
総体積：１２μＬ
プライマー混合物２は、以下を有する。
フォワードプライマー（配列番号１８）：
５’－ＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＡＴＴＧＴＣＴＴＴＧＴＧＴＴＣＣＣＧＧＡＣ－３’
リバースプライマー（配列番号１９）：
５’－ＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧ－３’
プライマー混合物３は、以下を有する。
フォワードプライマー（配列番号２０）：５’－ＡＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧ－３’
リバースプライマー（配列番号２１）：５’－ＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴ－３’
－１０５℃で蓋をしたＱＩＡｃｕｉｔｙ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍに試料を置く
１．変性開始温度９８℃、１分間
２．変性９８℃、１０秒間
３．アニーリング６３℃、１５秒間
４．伸長７２℃、１５秒間
５．最終伸長、７２℃、５分間
６．３５℃に冷却、１分間
－工程２～４を３０回繰り返す
－露光時間がそれぞれ６００ｍｓ及び７００ｍｓであり、かつゲイン６及び８である緑色チャネル及び黄色チャネルのパーティションの画像を取得する。このような実験から得られたデータを図５に示す。
－工程７からの予備増幅が終了した後、工程７からの混合物２μＬを、以下を含有する反応物に添加する：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
ｄＮＴＰ ０．４ｍＭ
プライマー混合物２または３ ０．２μＭ
Ｑ５Ｕポリメラーゼ２０Ｕ／ｍＬ
ＥｖａＧｒｅｅｎ色素２ｘ
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００色素０．０００３μｇ／μＬ
ＴＷＥＥＮ２０ ０．２％
総体積：１２μＬ
プライマー混合物２は、以下を有する。
フォワードプライマー（配列番号１８）：
５’－ＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＡＴＴＧＴＣＴＴＴＧＴＧＴＴＣＣＣＧＧＡＣ－３’
リバースプライマー（配列番号１９）：
５’－ＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧ－３’
プライマー混合物３は、以下を有する。
フォワードプライマー（配列番号２０）：５’－ＡＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧ－３’
リバースプライマー（配列番号２１）：５’－ＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴ－３’
－１０５℃で蓋をしたＱＩＡｃｕｉｔｙ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍに試料を置く
１．変性開始温度９８℃、１分間
２．変性９８℃、１０秒間
３．アニーリング６３℃、１５秒間
４．伸長７２℃、１５秒間
５．最終伸長、７２℃、５分間
６．３５℃に冷却、１分間
－工程２～４を３０回繰り返す
－露光時間がそれぞれ６００ｍｓ及び７００ｍｓであり、かつゲイン６及び８である緑色チャネル及び黄色チャネルのパーティションの画像を取得する。このような実験から得られたデータを図５に示す。
【0428】
実施例４：異なる変異対立遺伝子画分（ＶＡＦ）でのＥＧＦＲエクソン２０ Ｔ７９０Ｍバリアントの検出
１．ビーズの調製
ビーズブロッキング工程
－試料１個あたり１μＬのビーズを採取し、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１カタログ６５００１）に入れる。最大１００μＬのビーズをブロッキング溶液１ｍＬでブロッキングすることができる。
－ビーズを含むチューブを磁石に置き、ビーズが分離し、溶液が透明になるまで待つ。
－保存緩衝液を除去する。
－ビーズを含むチューブにブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、１μｇ／ｍＬ ｔ－ＲＮＡ）１ｍＬを添加する。
－ＲＴで１５ｒｐｍで３０分間回転させる。
緩衝液交換
－ビーズをスピンダウンし、磁石に置く。ビーズが分離し、溶液が透明になるまで待つ。
－ブロッキング溶液を除去する。
－１μＬのビーズごとに２×Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５ ４０ｍＭ、ＮａＣｌ １Ｍ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．０２％）を１０μＬ添加する。
－ビーズを５秒間ボルテックス処理により混合する。
１．ビーズの調製
ビーズブロッキング工程
－試料１個あたり１μＬのビーズを採取し、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１カタログ６５００１）に入れる。最大１００μＬのビーズをブロッキング溶液１ｍＬでブロッキングすることができる。
－ビーズを含むチューブを磁石に置き、ビーズが分離し、溶液が透明になるまで待つ。
－保存緩衝液を除去する。
－ビーズを含むチューブにブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、１μｇ／ｍＬ ｔ－ＲＮＡ）１ｍＬを添加する。
－ＲＴで１５ｒｐｍで３０分間回転させる。
緩衝液交換
－ビーズをスピンダウンし、磁石に置く。ビーズが分離し、溶液が透明になるまで待つ。
－ブロッキング溶液を除去する。
－１μＬのビーズごとに２×Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５ ４０ｍＭ、ＮａＣｌ １Ｍ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．０２％）を１０μＬ添加する。
－ビーズを５秒間ボルテックス処理により混合する。
【0429】
２．オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション
－１×ＳＳＣ緩衝液中のオリゴヌクレオチドの希釈を調製する（５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ）
－プローブオリゴヌクレオチド２ｐＭ
ＷＴ ０～２００ｆＭ
変異体オリゴヌクレオチド０．２～１００ｆＭ
－ビーズ１μＬあたり５０μＬのオリゴヌクレオチドを調製した。
－９５℃で５分間及び６０℃で７２時間インキュベートする。
プローブオリゴヌクレオチド（配列番号１３）：
５’－／５Ｂｉｏｓｇ／ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧ－３’
ＷＴオリゴヌクレオチド（配列番号１４）：
５’－ＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＴ－３’
変異体オリゴヌクレオチド（配列番号１５）：
５’－ＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧＧＣＴＣＡＴＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＴ－３’
（／５Ｂｉｏｓｇは、５’末端のビオチンを表す。）
－１×ＳＳＣ緩衝液中のオリゴヌクレオチドの希釈を調製する（５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ）
－プローブオリゴヌクレオチド２ｐＭ
ＷＴ ０～２００ｆＭ
変異体オリゴヌクレオチド０．２～１００ｆＭ
－ビーズ１μＬあたり５０μＬのオリゴヌクレオチドを調製した。
－９５℃で５分間及び６０℃で７２時間インキュベートする。
プローブオリゴヌクレオチド（配列番号１３）：
５’－／５Ｂｉｏｓｇ／ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧ－３’
ＷＴオリゴヌクレオチド（配列番号１４）：
５’－ＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＴ－３’
変異体オリゴヌクレオチド（配列番号１５）：
５’－ＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧＧＣＴＣＡＴＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＴ－３’
（／５Ｂｉｏｓｇは、５’末端のビオチンを表す。）
【0430】
３．ビーズへのオリゴヌクレオチドの付着
－ビーズ及びオリゴヌクレオチドを以下の比で混合する：
２ｘＢｉｎｄｉｎｇ緩衝液 ４０ｕＬ
工程１からのビーズ１０μＬ
工程２からのオリゴヌクレオチド５０μＬ
－ＲＴで１５ｒｐｍで３０分間回転させる。
－ビーズ及びオリゴヌクレオチドを以下の比で混合する：
２ｘＢｉｎｄｉｎｇ緩衝液 ４０ｕＬ
工程１からのビーズ１０μＬ
工程２からのオリゴヌクレオチド５０μＬ
－ＲＴで１５ｒｐｍで３０分間回転させる。
【0431】
４．ビーズ洗浄
－付着工程が完了した後－試料をスピンダウンし、磁石に試料を置いて７分間待つ。
－１００μＬの上清の８０μＬを除去し、１×洗浄緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５ ２０ｍＭ、ＮａＣｌ ０．５Ｍ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．１％）１００μＬを添加する。
－試料を１０秒間にわたってボルテックスし、スピンダウンする。
－試料を磁石に置いて２分間待つ。
－１２０μＬの上清の９０μＬを除去し、１ｘ洗浄緩衝液１００μＬを添加する。
－試料位置を磁石上で変えることによって試料を混合する（１０回）。２分間待つ。
－上清全体を除去し、１×洗浄緩衝液１００μＬを添加する。
－試料位置を磁石上で変えることによって試料を混合する（１０回）。２分間待つ。
－上清全体を除去し、磁石から試料を取り出し、１００μＬの１×ＢＦＦ６緩衝液（トリス酢酸ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ、酢酸カリウム３０ｍＭ、酢酸マグネシウム１７．１２５ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．０１％）を添加する。
－試料をスピンダウンさせ、磁石に試料を載せ、２分間待つ。
－１×ＢＦＦ６緩衝液を除去する。
－付着工程が完了した後－試料をスピンダウンし、磁石に試料を置いて７分間待つ。
－１００μＬの上清の８０μＬを除去し、１×洗浄緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５ ２０ｍＭ、ＮａＣｌ ０．５Ｍ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．１％）１００μＬを添加する。
－試料を１０秒間にわたってボルテックスし、スピンダウンする。
－試料を磁石に置いて２分間待つ。
－１２０μＬの上清の９０μＬを除去し、１ｘ洗浄緩衝液１００μＬを添加する。
－試料位置を磁石上で変えることによって試料を混合する（１０回）。２分間待つ。
－上清全体を除去し、１×洗浄緩衝液１００μＬを添加する。
－試料位置を磁石上で変えることによって試料を混合する（１０回）。２分間待つ。
－上清全体を除去し、磁石から試料を取り出し、１００μＬの１×ＢＦＦ６緩衝液（トリス酢酸ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ、酢酸カリウム３０ｍＭ、酢酸マグネシウム１７．１２５ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．０１％）を添加する。
－試料をスピンダウンさせ、磁石に試料を載せ、２分間待つ。
－１×ＢＦＦ６緩衝液を除去する。
【0432】
５．ＰＰＬ反応
－４℃に保たれたビーズにＰＰＬ混合物を添加する。ＰＰＬは以下の組成を有する：
１×ＢＦＦ６－０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０
２０Ｕ／ｍＬ Ｋｌｅｎｏｗ（ｅｘｏ－）
２Ｕ／ｍＬアピラーゼ
＋／－０．０５ｍＭ ＰＰｉ
総体積：２０μＬ
－４０℃で１０分間インキュベートし、４℃で休止する。
－４℃に保たれたビーズにＰＰＬ混合物を添加する。ＰＰＬは以下の組成を有する：
１×ＢＦＦ６－０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０
２０Ｕ／ｍＬ Ｋｌｅｎｏｗ（ｅｘｏ－）
２Ｕ／ｍＬアピラーゼ
＋／－０．０５ｍＭ ＰＰｉ
総体積：２０μＬ
－４０℃で１０分間インキュベートし、４℃で休止する。
【0433】
６．ＴＩＰＰ反応
－ＰＰＬ反応が４℃に達したら、以下を有するＴＩＰＰ混合物５μＬを添加する：
１×ＢＦＦ６－０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０
１６Ｕ／ｍＬ ＴＩＰＰ
工程５からの混合物２０μＬ。
総体積：２５μＬ
－３７℃で５分間、６０℃で１０分間、６０℃休止でインキュベートする
－ＰＰＬ反応が４℃に達したら、以下を有するＴＩＰＰ混合物５μＬを添加する：
１×ＢＦＦ６－０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０
１６Ｕ／ｍＬ ＴＩＰＰ
工程５からの混合物２０μＬ。
総体積：２５μＬ
－３７℃で５分間、６０℃で１０分間、６０℃休止でインキュベートする
【0434】
７．予備増幅
－工程６からの試料を、ホットプレート上に保たれた磁石に載せ、６０℃まで加熱する。
－ビーズが分離された後に、２μＬの上清を取り、以下の混合物に添加する：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
ｄＮＴＰ ０．４ｍＭ
プライマー混合物１ ０．１μＭ
Ｑ５Ｕポリメラーゼ２０Ｕ／ｍＬ
ＵＤＧ １０Ｕ／ｍＬ
総体積：１２．５μＬ
Ｑ５Ｕ緩衝液：
プライマー混合物１は、以下を有する。
フォワードプライマー（配列番号１６）：５’－ＡＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＣＴＴＧＧＡＴＡＴＴＣＴＣＧＡＣＡＣ－３’
リバースプライマー（配列番号１７）：５’－ＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣ－３’
－試料をサーモサイクラーに入れ、１０５℃で蓋をしてインキュベートする。
１．ＵＤＧ３７℃、１分間
２．変性開始温度９８℃、１分間
３．変性９８℃、１０秒間
４．アニーリング６３℃、１５秒間
５．伸長７２℃、１５秒間
６．最終伸長、７２℃、５分間
７．冷却、４℃維持
－工程３～５を１２回繰り返す
－工程６からの試料を、ホットプレート上に保たれた磁石に載せ、６０℃まで加熱する。
－ビーズが分離された後に、２μＬの上清を取り、以下の混合物に添加する：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
ｄＮＴＰ ０．４ｍＭ
プライマー混合物１ ０．１μＭ
Ｑ５Ｕポリメラーゼ２０Ｕ／ｍＬ
ＵＤＧ １０Ｕ／ｍＬ
総体積：１２．５μＬ
Ｑ５Ｕ緩衝液：
プライマー混合物１は、以下を有する。
フォワードプライマー（配列番号１６）：５’－ＡＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＣＴＴＧＧＡＴＡＴＴＣＴＣＧＡＣＡＣ－３’
リバースプライマー（配列番号１７）：５’－ＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣ－３’
－試料をサーモサイクラーに入れ、１０５℃で蓋をしてインキュベートする。
１．ＵＤＧ３７℃、１分間
２．変性開始温度９８℃、１分間
３．変性９８℃、１０秒間
４．アニーリング６３℃、１５秒間
５．伸長７２℃、１５秒間
６．最終伸長、７２℃、５分間
７．冷却、４℃維持
－工程３～５を１２回繰り返す
【0435】
８．ｄＰＣＲ定量化
－工程７からの予備増幅が終了した後、工程７からの混合物２μＬを、以下を含有する反応物に添加する：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
ｄＮＴＰ ０．４ｍＭ
プライマー混合物２または３ ０．２μＭ
Ｑ５Ｕポリメラーゼ２０Ｕ／ｍＬ
ＥｖａＧｒｅｅｎ色素２ｘ
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００色素０．０００３μｇ／μＬ
ＴＷＥＥＮ２０ ０．２％
総体積：１２μＬ
プライマー混合物２は、以下を有する。
フォワードプライマー（配列番号１８）：
５’－ＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＡＴＴＧＴＣＴＴＴＧＴＧＴＴＣＣＣＧＧＡＣ－３’
リバースプライマー（配列番号１９）：
５’－ＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧ－３’
プライマー混合物３は、以下を有する。
フォワードプライマー（配列番号２０）：５’－ＡＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧ－３’
リバースプライマー（配列番号２１）：５’－ＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴ－３’
－１０５℃で蓋をしたＱＩＡｃｕｉｔｙ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍに試料を置く
１．変性開始温度９８℃、１分間
２．変性９８℃、１０秒間
３．アニーリング６３℃、１５秒間
４．伸長７２℃、１５秒間
５．最終伸長、７２℃、５分間
６．３５℃に冷却、１分間
－工程２～４を３０回繰り返す
－露光時間がそれぞれ６００ｍｓ及び７００ｍｓであり、かつゲイン６及び８である緑色チャネル及び黄色チャネルのパーティションの画像を取得する。このような実験から得られたデータを図６に示す。
－工程７からの予備増幅が終了した後、工程７からの混合物２μＬを、以下を含有する反応物に添加する：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
ｄＮＴＰ ０．４ｍＭ
プライマー混合物２または３ ０．２μＭ
Ｑ５Ｕポリメラーゼ２０Ｕ／ｍＬ
ＥｖａＧｒｅｅｎ色素２ｘ
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００色素０．０００３μｇ／μＬ
ＴＷＥＥＮ２０ ０．２％
総体積：１２μＬ
プライマー混合物２は、以下を有する。
フォワードプライマー（配列番号１８）：
５’－ＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＡＴＴＧＴＣＴＴＴＧＴＧＴＴＣＣＣＧＧＡＣ－３’
リバースプライマー（配列番号１９）：
５’－ＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧ－３’
プライマー混合物３は、以下を有する。
フォワードプライマー（配列番号２０）：５’－ＡＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧ－３’
リバースプライマー（配列番号２１）：５’－ＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴ－３’
－１０５℃で蓋をしたＱＩＡｃｕｉｔｙ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍに試料を置く
１．変性開始温度９８℃、１分間
２．変性９８℃、１０秒間
３．アニーリング６３℃、１５秒間
４．伸長７２℃、１５秒間
５．最終伸長、７２℃、５分間
６．３５℃に冷却、１分間
－工程２～４を３０回繰り返す
－露光時間がそれぞれ６００ｍｓ及び７００ｍｓであり、かつゲイン６及び８である緑色チャネル及び黄色チャネルのパーティションの画像を取得する。このような実験から得られたデータを図６に示す。
【0436】
実施例５：０．１％ＶＡＦでのＥＧＦＲエクソン２０ Ｔ７９０Ｍバリアントの検出に対するハイブリダイゼーション緩衝液及びハイブリダイゼーション時間の効果。
１．ビーズの調製
ａ．ビーズブロッキング工程
－試料１個あたり１μＬのビーズを採取し、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１カタログ６５００１）に入れる。最大１００μＬのビーズをブロッキング溶液１ｍＬでブロッキングすることができる。
－ビーズを含むチューブを磁石に置き、ビーズが分離し、溶液が透明になるまで待つ。
－保存緩衝液を除去する。
－ビーズを含むチューブにブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、１μｇ／ｍＬ ｔ－ＲＮＡ）１ｍＬを添加する。
－ＲＴで１５ｒｐｍで３０分間回転させる。
１．ビーズの調製
ａ．ビーズブロッキング工程
－試料１個あたり１μＬのビーズを採取し、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１カタログ６５００１）に入れる。最大１００μＬのビーズをブロッキング溶液１ｍＬでブロッキングすることができる。
－ビーズを含むチューブを磁石に置き、ビーズが分離し、溶液が透明になるまで待つ。
－保存緩衝液を除去する。
－ビーズを含むチューブにブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、１μｇ／ｍＬ ｔ－ＲＮＡ）１ｍＬを添加する。
－ＲＴで１５ｒｐｍで３０分間回転させる。
【0437】
ｂ．緩衝液交換
－ビーズをスピンダウンし、磁石に置く。ビーズが分離し、溶液が透明になるまで待つ。
－ブロッキング溶液を除去する。
－１μＬのビーズごとに２×Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５ ４０ｍＭ、ＮａＣｌ １Ｍ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．０２％）を１０μＬ添加する。
－ビーズを５秒間ボルテックス処理により混合する。
－ビーズをスピンダウンし、磁石に置く。ビーズが分離し、溶液が透明になるまで待つ。
－ブロッキング溶液を除去する。
－１μＬのビーズごとに２×Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５ ４０ｍＭ、ＮａＣｌ １Ｍ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．０２％）を１０μＬ添加する。
－ビーズを５秒間ボルテックス処理により混合する。
【0438】
２．オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション
－オリゴヌクレオチドの希釈物を以下の中で調製する：
緩衝液１：１×ＳＳＣ緩衝液（５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５×ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）または
緩衝液２：ＵＬＴＲＡｈｙｂ（商標）Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ番号ＡＭ８６７０）または
緩衝液３：１ｘＳＳＣ＋ＤＳ緩衝液（５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ、５％硫酸デキストラン）
－プローブオリゴヌクレオチド２ｐＭ
ＷＴオリゴヌクレオチド混合物 １９８ｆＭ
変異体オリゴヌクレオチド混合物２ｆＭ
ゲノムＤＮＡ３８０ｎｇ
－ビーズ１μＬあたり５０μＬのオリゴヌクレオチドを調製する。
－９５℃で５分間及び６０℃で１／３時間インキュベートする。
プローブオリゴヌクレオチド（配列番号１２）：
５’－／５Ｂｉｏｓｇ／ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧ－３’
（／５Ｂｉｏｓｇは、５’末端のビオチンを表す。）
ＷＴオリゴヌクレオチド混合物は、以下を有する：
フォワード鎖１（配列番号２２）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＡＴＴＡＣＣＧＡＣＧＡＡＡＡＣＧＧＣＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＣＣＧＣＡＡＧＡＣＴＧＴＡＡＣＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖２（配列番号２３）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＡＣＧＣＧＴＧＧＴＴＡＣＡＧＴＣＴＴＧＣＧＧＴＴＣＣＣＧＧＡＣＡＴＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＧＴＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＧＴＴＴＴＣＧＴＣＧＧＴＡＡＴＴＡＣＣＡＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖２（配列番号２４）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＡＴＧＡＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＴＣＡＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＧＴＴＣＧＧＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＡＡＧＧＴＡＡＧＧＴＣＣＣＡＡＴＡＴＴＧＡＡＡＣＣＣＡＣＧＧＣＡＴＧＧＴＧＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖２（配列番号２５）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＣＡＣＣＡＴＧＣＣＧＴＧＧＧＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＧＧＧＡＣＣＴＴＡＣＣＴＴＡＴＡＣＡＣＣＧＴＧＣＣＧＡＡＣＧＣＡＣＣＧＧＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＴＧＡＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＡＧＣＣＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖３（配列番号２６）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＣＡＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＧＡＡＴＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＧＣＡＣＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖３（配列番号２７）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＧＴＧＣＴＣＣＣＣＣＧＣＣＡＡＴＴＣＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＧＣＡＣＣＣＡＧＣＡＧＴＴＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＡＡＡＴＣＴＧＴＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＧＧＣＴＧＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖４（配列番号２８）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＣＡＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＡＧＴＧＡＡＡＴＣＴＣＧＡＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＧＴＴＴＧＡＡＣＡＧＴＴＣＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＧＣＡＧＣＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖４（配列番号２９）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＧＡＴＧＧＧＡＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＧＴＡＧＣＴＡＧＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＴＧＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴＴＴＣＡＣＴＴＣＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖５（配列番号３０）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＡＧＧＣＧＣＴＧＴＴＴＧＧＴＣＴＣＴＴＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＣＡＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＧＡＡＴＣＡＴＴＡＧＣＧＧＴＡＧＣＧＡＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖５（配列番号３１）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＴＣＧＣＴＡＣＣＧＣＴＡＡＴＧＡＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＣＡＴＡＴＧＧＧＧＡＧＣＣＣＡＣＡＣＣＡＧＣＣＡＴＣＡＣＧＴＡＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＣＴＡＡＧＡＧＡＣＣＡＡＡＣＡＧＣＧＣＣＴＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖６（配列番号３２）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＡＧＣＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＣＣＡＴＣＡＴＣＴＣＴＧＣＧＧＴＧＧＴＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＣＴＴＧＧＧＧＧＴＧＧＴＣＴＴＴＧＧＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＡＣＴＣＡＴＴＧＡＡＧＧＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖６（配列番号３３）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴＴＣＡＡＴＧＡＧＴＧＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＴＧＣＣＡＡＣＣＡＣＣＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣＡＡＣＡＣＴＡＣＣＧＧＣＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖７（配列番号３４）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＡＧＡＡＣＧＣＡＧＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣＡＧＣＴＡＡＴＴＣＡＧＡＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＡＴＴＧＣＧＡＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖７（配列番号３５）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＴＣＧＣＡＡＴＴＡＡＡＣＣＡＣＡＴＧＣＴＣＣＡＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＧＣＣＡＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖８（配列番号３６）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＣＣＴＴＧＧＴＣＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＧＧＣＴＡＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＴＣＣＡＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＧＣＡＧＣＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖８（配列番号３７）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＣＴＴＧＧＡＴＡＴＴＣＴＣＧＡＣＡＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＡＧＴＧＣＡＡＴＧＡＧＧＧＡＣＣＡＧＴＡＧＣＣＡＣＴＴＣＣＴＣＴＡＡＡＴＧＡＣＣＡＡＧＧＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
変異体オリゴヌクレオチド混合物は以下を有する：
フォワード鎖１（配列番号３８）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＧＡＴＴＴＣＣＧＴＧＣＧＴＣＴＧＡＡＴＧＣＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＣＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＡＴＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖１（配列番号３９）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＡＴＧＣＴＧＣＣＧＴＡＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧＧＴＴＣＣＣＧＧＡＣＡＴＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＡＴＴＣＡＧＡＣＧＣＡＣＧＧＡＡＡＴＣＡＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖２（配列番号４０）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＴＴＧＡＡＡＡＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＧＴＧＣＧＴＴＣＧＧＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＡＡＧＧＴＡＡＧＧＴＣＣＣＴＣＴＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧＣＣＡＡＴＡＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖２（配列番号４１）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＴＡＴＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧＡＧＧＧＡＣＣＴＴＡＣＣＴＴＡＴＡＣＡＣＣＧＴＧＣＣＧＡＡＣＧＣＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＴＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＴＴＴＴＣＡＡＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖３（配列番号４２）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＣＧＧＴＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＧＴＧＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＣＡＡＡＴＴＣＴＧＧＧＡＴＣＴＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖３（配列番号４３）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＡＧＡＴＣＣＣＡＧＡＡＴＴＴＧＣＡＣＣＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＧＣＡＣＣＣＡＧＣＡＧＴＴＴＧＧＣＡＣＧＣＣＣＡＡＡＡＴＣＴＧＴＧＡＴＣＡＣＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＣＧＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖４（配列番号４４）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＣＡＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＧＣＡＧＣＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＡＧＡＧＡＡＡＴＣＴＣＧＡＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＧＴＴＴＧＡＡＣＡＧＴＴＧＴＣＧＣＡＴＡＴＣＡＡＴＡＡＧＣＧＧＡＧＧＡＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖４（配列番号４５）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣＧＡＣＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＧＡＴＧＧＧＡＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＴＴＣＴＣＴＧＴＡＧＣＴＡＧＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖５（配列番号４６）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＧＧＣＴＡＧＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＡＴＧＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＧＧＣＧＧＣＴＡＡＡＧＴＡＴＣＡＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖５（配列番号４７）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＴＧＡＴＡＣＴＴＴＡＧＣＣＧＣＣＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＣＡＴＡＴＧＧＧＧＡＧＣＣＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＣＡＣＧＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＣＡＴＣＡＧＡＡＴＧＣＣＡＣＴＡＧＣＣＡＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖６（配列番号４８）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＧＣＡＡＴＧＡＧＧＡＣＣＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＴＧＴＣＣＡＴＣＡＴＣＴＣＴＧＣＧＧＴＧＧＡＡＧＧＣＡＴＴＣＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＣＴＴＧＧＧＧＧＴＧＧＴＣＴＴＴＧＧＴＧＧＡＡＴＡＴＴＡＡＣＡＣＧＧＧＣＧＴＧＣＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖６（配列番号４９）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＧＣＡＣＧＣＣＣＧＴＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＣＡＣＣＡＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＴＧＣＣＴＴＣＣＡＣＣＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＡＣＡＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＧＧＴＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖７（配列番号５０）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＧＧＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣＡＧＣＴＡＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖７（配列番号５１）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＡＣＧＴＣＡＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣＡＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＣＣＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＣＣＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖８（配列番号５２）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＣＴＣＡＧＧＡＡＧＡＡＣＧＣＴＧＧＴＡＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＴＣＣＡＴＣＧＡＡＧＴＡＣＡＴＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖８（配列番号５３）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＣＡＣＣＧＣＴＡＣＡＣＡＴＧＴＡＣＴＴＣＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＣＴＴＧＧＡＴＡＴＴＣＴＣＧＡＣＡＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＣＧＡＧＧＡＧＴＡＣＡＧＴＧＣＡＡＴＧＡＧＧＧＡＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＣＧＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
－オリゴヌクレオチドの希釈物を以下の中で調製する：
緩衝液１：１×ＳＳＣ緩衝液（５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５×ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）または
緩衝液２：ＵＬＴＲＡｈｙｂ（商標）Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ番号ＡＭ８６７０）または
緩衝液３：１ｘＳＳＣ＋ＤＳ緩衝液（５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ、５％硫酸デキストラン）
－プローブオリゴヌクレオチド２ｐＭ
ＷＴオリゴヌクレオチド混合物 １９８ｆＭ
変異体オリゴヌクレオチド混合物２ｆＭ
ゲノムＤＮＡ３８０ｎｇ
－ビーズ１μＬあたり５０μＬのオリゴヌクレオチドを調製する。
－９５℃で５分間及び６０℃で１／３時間インキュベートする。
プローブオリゴヌクレオチド（配列番号１２）：
５’－／５Ｂｉｏｓｇ／ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧ－３’
（／５Ｂｉｏｓｇは、５’末端のビオチンを表す。）
ＷＴオリゴヌクレオチド混合物は、以下を有する：
フォワード鎖１（配列番号２２）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＡＴＴＡＣＣＧＡＣＧＡＡＡＡＣＧＧＣＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＣＣＧＣＡＡＧＡＣＴＧＴＡＡＣＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖２（配列番号２３）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＡＣＧＣＧＴＧＧＴＴＡＣＡＧＴＣＴＴＧＣＧＧＴＴＣＣＣＧＧＡＣＡＴＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＧＴＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＧＴＴＴＴＣＧＴＣＧＧＴＡＡＴＴＡＣＣＡＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖２（配列番号２４）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＡＴＧＡＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＴＣＡＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＧＴＴＣＧＧＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＡＡＧＧＴＡＡＧＧＴＣＣＣＡＡＴＡＴＴＧＡＡＡＣＣＣＡＣＧＧＣＡＴＧＧＴＧＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖２（配列番号２５）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＣＡＣＣＡＴＧＣＣＧＴＧＧＧＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＧＧＧＡＣＣＴＴＡＣＣＴＴＡＴＡＣＡＣＣＧＴＧＣＣＧＡＡＣＧＣＡＣＣＧＧＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＴＧＡＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＡＧＣＣＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖３（配列番号２６）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＣＡＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＧＡＡＴＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＧＣＡＣＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖３（配列番号２７）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＧＴＧＣＴＣＣＣＣＣＧＣＣＡＡＴＴＣＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＧＣＡＣＣＣＡＧＣＡＧＴＴＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＡＡＡＴＣＴＧＴＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＧＧＣＴＧＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖４（配列番号２８）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＣＡＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＡＧＴＧＡＡＡＴＣＴＣＧＡＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＧＴＴＴＧＡＡＣＡＧＴＴＣＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＧＣＡＧＣＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖４（配列番号２９）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＧＡＴＧＧＧＡＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＧＴＡＧＣＴＡＧＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＴＧＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴＴＴＣＡＣＴＴＣＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖５（配列番号３０）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＡＧＧＣＧＣＴＧＴＴＴＧＧＴＣＴＣＴＴＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＣＡＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＧＡＡＴＣＡＴＴＡＧＣＧＧＴＡＧＣＧＡＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖５（配列番号３１）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＴＣＧＣＴＡＣＣＧＣＴＡＡＴＧＡＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＣＡＴＡＴＧＧＧＧＡＧＣＣＣＡＣＡＣＣＡＧＣＣＡＴＣＡＣＧＴＡＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＣＴＡＡＧＡＧＡＣＣＡＡＡＣＡＧＣＧＣＣＴＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖６（配列番号３２）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＡＧＣＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＣＣＡＴＣＡＴＣＴＣＴＧＣＧＧＴＧＧＴＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＣＴＴＧＧＧＧＧＴＧＧＴＣＴＴＴＧＧＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＡＣＴＣＡＴＴＧＡＡＧＧＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖６（配列番号３３）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴＴＣＡＡＴＧＡＧＴＧＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＴＧＣＣＡＡＣＣＡＣＣＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣＡＡＣＡＣＴＡＣＣＧＧＣＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖７（配列番号３４）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＡＧＡＡＣＧＣＡＧＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣＡＧＣＴＡＡＴＴＣＡＧＡＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＡＴＴＧＣＧＡＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖７（配列番号３５）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＴＣＧＣＡＡＴＴＡＡＡＣＣＡＣＡＴＧＣＴＣＣＡＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＧＣＣＡＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖８（配列番号３６）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＣＣＴＴＧＧＴＣＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＧＧＣＴＡＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＴＣＣＡＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＧＣＡＧＣＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖８（配列番号３７）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＣＴＴＧＧＡＴＡＴＴＣＴＣＧＡＣＡＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＡＧＴＧＣＡＡＴＧＡＧＧＧＡＣＣＡＧＴＡＧＣＣＡＣＴＴＣＣＴＣＴＡＡＡＴＧＡＣＣＡＡＧＧＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
変異体オリゴヌクレオチド混合物は以下を有する：
フォワード鎖１（配列番号３８）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＧＡＴＴＴＣＣＧＴＧＣＧＴＣＴＧＡＡＴＧＣＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＣＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＡＴＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖１（配列番号３９）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＡＴＧＣＴＧＣＣＧＴＡＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧＧＴＴＣＣＣＧＧＡＣＡＴＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＡＴＴＣＡＧＡＣＧＣＡＣＧＧＡＡＡＴＣＡＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖２（配列番号４０）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＴＴＧＡＡＡＡＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＧＴＧＣＧＴＴＣＧＧＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＡＡＧＧＴＡＡＧＧＴＣＣＣＴＣＴＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧＣＣＡＡＴＡＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖２（配列番号４１）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＴＡＴＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧＡＧＧＧＡＣＣＴＴＡＣＣＴＴＡＴＡＣＡＣＣＧＴＧＣＣＧＡＡＣＧＣＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＴＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＴＴＴＴＣＡＡＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖３（配列番号４２）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＣＧＧＴＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＧＴＧＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＣＡＡＡＴＴＣＴＧＧＧＡＴＣＴＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖３（配列番号４３）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＡＧＡＴＣＣＣＡＧＡＡＴＴＴＧＣＡＣＣＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＧＣＡＣＣＣＡＧＣＡＧＴＴＴＧＧＣＡＣＧＣＣＣＡＡＡＡＴＣＴＧＴＧＡＴＣＡＣＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＣＧＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖４（配列番号４４）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＣＡＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＧＣＡＧＣＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＡＧＡＧＡＡＡＴＣＴＣＧＡＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＧＴＴＴＧＡＡＣＡＧＴＴＧＴＣＧＣＡＴＡＴＣＡＡＴＡＡＧＣＧＧＡＧＧＡＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖４（配列番号４５）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣＧＡＣＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＧＡＴＧＧＧＡＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＴＴＣＴＣＴＧＴＡＧＣＴＡＧＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖５（配列番号４６）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＧＧＣＴＡＧＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＡＴＧＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＧＧＣＧＧＣＴＡＡＡＧＴＡＴＣＡＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖５（配列番号４７）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＴＧＡＴＡＣＴＴＴＡＧＣＣＧＣＣＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＣＡＴＡＴＧＧＧＧＡＧＣＣＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＣＡＣＧＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＣＡＴＣＡＧＡＡＴＧＣＣＡＣＴＡＧＣＣＡＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖６（配列番号４８）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＧＣＡＡＴＧＡＧＧＡＣＣＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＴＧＴＣＣＡＴＣＡＴＣＴＣＴＧＣＧＧＴＧＧＡＡＧＧＣＡＴＴＣＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＣＴＴＧＧＧＧＧＴＧＧＴＣＴＴＴＧＧＴＧＧＡＡＴＡＴＴＡＡＣＡＣＧＧＧＣＧＴＧＣＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖６（配列番号４９）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＧＣＡＣＧＣＣＣＧＴＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＣＡＣＣＡＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＴＧＣＣＴＴＣＣＡＣＣＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＡＣＡＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＧＧＴＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖７（配列番号５０）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＧＧＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣＡＧＣＴＡＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖７（配列番号５１）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＡＣＧＴＣＡＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣＡＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＣＣＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＣＣＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
フォワード鎖８（配列番号５２）：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＣＴＣＡＧＧＡＡＧＡＡＣＧＣＴＧＧＴＡＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＴＣＣＡＴＣＧＡＡＧＴＡＣＡＴＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’
リバース鎖８（配列番号５３）：
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＣＡＣＣＧＣＴＡＣＡＣＡＴＧＴＡＣＴＴＣＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＣＴＴＧＧＡＴＡＴＴＣＴＣＧＡＣＡＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＣＧＡＧＧＡＧＴＡＣＡＧＴＧＣＡＡＴＧＡＧＧＧＡＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＣＧＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’
【0439】
３．ビーズへのオリゴヌクレオチドの付着
－ビーズ及びオリゴヌクレオチドを以下の比で混合する：
２ｘＢｉｎｄｉｎｇ緩衝液 ４０ｕＬ
工程１からのビーズ１０μＬ
工程２からのオリゴヌクレオチド５０μＬ
－ＲＴで１５ｒｐｍで３０分間回転させる。
－ビーズ及びオリゴヌクレオチドを以下の比で混合する：
２ｘＢｉｎｄｉｎｇ緩衝液 ４０ｕＬ
工程１からのビーズ１０μＬ
工程２からのオリゴヌクレオチド５０μＬ
－ＲＴで１５ｒｐｍで３０分間回転させる。
【0440】
４．ビーズ洗浄
－付着工程が完了した後－試料をスピンダウンし、磁石に試料を置いて７分間待つ。
－１００μＬの上清の８０μＬを除去し、１×洗浄緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５ ２０ｍＭ、ＮａＣｌ ０．５Ｍ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．１％）１００μＬを添加する。
－試料を１０秒間にわたってボルテックスし、スピンダウンする。
－試料を磁石に置いて２分間待つ。
－１２０μＬの上清の９０μＬを除去し、１ｘ洗浄緩衝液１００μＬを添加する。
－試料位置を磁石上で変えることによって試料を混合する（１０回）。２分間待つ。
－上清全体を除去し、１×洗浄緩衝液１００μＬを添加する。
－試料位置を磁石上で変えることによって試料を混合する（１０回）。２分間待つ。
－上清全体を除去し、磁石から試料を取り出し、１００μＬの１×ＢＦＦ６緩衝液（トリス酢酸ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ、酢酸カリウム３０ｍＭ、酢酸マグネシウム１７．１２５ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．０１％）を添加する。
－試料をスピンダウンさせ、磁石に試料を載せ、２分間待つ。
－１×ＢＦＦ６緩衝液を除去する。
－付着工程が完了した後－試料をスピンダウンし、磁石に試料を置いて７分間待つ。
－１００μＬの上清の８０μＬを除去し、１×洗浄緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５ ２０ｍＭ、ＮａＣｌ ０．５Ｍ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．１％）１００μＬを添加する。
－試料を１０秒間にわたってボルテックスし、スピンダウンする。
－試料を磁石に置いて２分間待つ。
－１２０μＬの上清の９０μＬを除去し、１ｘ洗浄緩衝液１００μＬを添加する。
－試料位置を磁石上で変えることによって試料を混合する（１０回）。２分間待つ。
－上清全体を除去し、１×洗浄緩衝液１００μＬを添加する。
－試料位置を磁石上で変えることによって試料を混合する（１０回）。２分間待つ。
－上清全体を除去し、磁石から試料を取り出し、１００μＬの１×ＢＦＦ６緩衝液（トリス酢酸ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ、酢酸カリウム３０ｍＭ、酢酸マグネシウム１７．１２５ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．０１％）を添加する。
－試料をスピンダウンさせ、磁石に試料を載せ、２分間待つ。
－１×ＢＦＦ６緩衝液を除去する。
【0441】
５．ＰＰＬ反応
－４℃に保たれたビーズにＰＰＬ混合物を添加する。ＰＰＬは、以下の組成からなる：
１×ＢＦＦ６－０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０
２０Ｕ／ｍＬ Ｋｌｅｎｏｗ（ｅｘｏ－）
２Ｕ／ｍＬアピラーゼ
０．０５ｍＭ ＰＰｉ
総体積：２０μＬ
－４０℃で１０分間インキュベートし、４℃で休止する。
－４℃に保たれたビーズにＰＰＬ混合物を添加する。ＰＰＬは、以下の組成からなる：
１×ＢＦＦ６－０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０
２０Ｕ／ｍＬ Ｋｌｅｎｏｗ（ｅｘｏ－）
２Ｕ／ｍＬアピラーゼ
０．０５ｍＭ ＰＰｉ
総体積：２０μＬ
－４０℃で１０分間インキュベートし、４℃で休止する。
【0442】
６．ＴＩＰＰ反応
－ＰＰＬ反応が４℃に達したら、以下を有するＴＩＰＰ混合物５μＬを添加する：
１×ＢＦＦ６－０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０
１６Ｕ／ｍＬ ＴＩＰＰ
工程５からの混合物２０μＬ。
総体積：２５μＬ
－３７℃で５分間、６０℃で１０分間、６０℃休止でインキュベートする
－ＰＰＬ反応が４℃に達したら、以下を有するＴＩＰＰ混合物５μＬを添加する：
１×ＢＦＦ６－０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０
１６Ｕ／ｍＬ ＴＩＰＰ
工程５からの混合物２０μＬ。
総体積：２５μＬ
－３７℃で５分間、６０℃で１０分間、６０℃休止でインキュベートする
【0443】
７．予備増幅
－工程６からの試料を、ホットプレート上に保たれた磁石に載せ、６０℃まで加熱する。
－ビーズが分離された後に、２μＬの上清を取り、以下の混合物に添加する：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
ｄＮＴＰ ０．４ｍＭ
プライマー混合物４ ０．１μＭ
Ｑ５Ｕポリメラーゼ２０Ｕ／ｍＬ
ＵＤＧ １０Ｕ／ｍＬ
総体積：１２．５μＬ
Ｑ５Ｕ緩衝液：
プライマー混合物４は、以下を有する：
フォワードプライマー（配列番号５４）：５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ－３’
リバースプライマー（配列番号５５）：５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ－３’
－試料をサーモサイクラーに入れ、１０５℃で蓋をしてインキュベートする。
１．ＵＤＧ３７℃、１分間
２．変性開始温度９８℃、１分間
３．変性９８℃、１０秒間
４．アニーリング６３℃、１５秒間
５．伸長７２℃、１５秒間
６．最終伸長、７２℃、５分間
７．冷却、４℃維持
－工程３～５を１２回繰り返す
－工程６からの試料を、ホットプレート上に保たれた磁石に載せ、６０℃まで加熱する。
－ビーズが分離された後に、２μＬの上清を取り、以下の混合物に添加する：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
ｄＮＴＰ ０．４ｍＭ
プライマー混合物４ ０．１μＭ
Ｑ５Ｕポリメラーゼ２０Ｕ／ｍＬ
ＵＤＧ １０Ｕ／ｍＬ
総体積：１２．５μＬ
Ｑ５Ｕ緩衝液：
プライマー混合物４は、以下を有する：
フォワードプライマー（配列番号５４）：５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ－３’
リバースプライマー（配列番号５５）：５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ－３’
－試料をサーモサイクラーに入れ、１０５℃で蓋をしてインキュベートする。
１．ＵＤＧ３７℃、１分間
２．変性開始温度９８℃、１分間
３．変性９８℃、１０秒間
４．アニーリング６３℃、１５秒間
５．伸長７２℃、１５秒間
６．最終伸長、７２℃、５分間
７．冷却、４℃維持
－工程３～５を１２回繰り返す
【0444】
８．ｄＰＣＲ定量化
－工程７からの予備増幅が終了した後、工程７からの混合物２μＬを、以下を含有する反応物に添加する：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
ｄＮＴＰ ０．４ｍＭ
プライマー混合物５または６ ０．２μＭ
Ｑ５Ｕポリメラーゼ２０Ｕ／ｍＬ
ＥｖａＧｒｅｅｎ色素２ｘ
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００色素０．０００３μｇ／μＬ
ＴＷＥＥＮ２０ ０．２％
総体積：１２μＬ
プライマー混合物５は、以下を有する：
フォワードプライマー（配列番号５６）：５’－ＴＧＧＴＡＡＴＴＡＣＣＧＡＣＧＡＡＡＡＣＧＧＣ－３’
リバースプライマー（配列番号５７）：５’－ＡＣＧＣＧＴＧＧＴＴＡＣＡＧＴＣＴＴＧＣＧ－３’
プライマー混合物６は以下を有する：
フォワードプライマー（配列番号５８）：５’－ＴＧＡＴＴＴＣＣＧＴＧＣＧＴＣＴＧＡＡＴＧＣ－３’
リバースプライマー（配列番号５９）：５’－ＡＴＧＣＴＧＣＣＧＴＡＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ－３’
－１０５℃で蓋をしたＱＩＡｃｕｉｔｙ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍに試料を置く
１．変性開始温度９８℃、１分間
２．変性９８℃、１０秒間
３．アニーリング６３℃、１５秒間
４．伸長７２℃、１５秒間
５．最終伸長、７２℃、５分間
６．３５℃に冷却、１分間
－工程２～４を３０回繰り返す
－露光時間がそれぞれ６００ｍｓ及び７００ｍｓであり、かつゲイン６及び８である緑色チャネル及び黄色チャネルのパーティションの画像を取得する。このような実験から得られたデータを図７に示す。
－工程７からの予備増幅が終了した後、工程７からの混合物２μＬを、以下を含有する反応物に添加する：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
ｄＮＴＰ ０．４ｍＭ
プライマー混合物５または６ ０．２μＭ
Ｑ５Ｕポリメラーゼ２０Ｕ／ｍＬ
ＥｖａＧｒｅｅｎ色素２ｘ
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００色素０．０００３μｇ／μＬ
ＴＷＥＥＮ２０ ０．２％
総体積：１２μＬ
プライマー混合物５は、以下を有する：
フォワードプライマー（配列番号５６）：５’－ＴＧＧＴＡＡＴＴＡＣＣＧＡＣＧＡＡＡＡＣＧＧＣ－３’
リバースプライマー（配列番号５７）：５’－ＡＣＧＣＧＴＧＧＴＴＡＣＡＧＴＣＴＴＧＣＧ－３’
プライマー混合物６は以下を有する：
フォワードプライマー（配列番号５８）：５’－ＴＧＡＴＴＴＣＣＧＴＧＣＧＴＣＴＧＡＡＴＧＣ－３’
リバースプライマー（配列番号５９）：５’－ＡＴＧＣＴＧＣＣＧＴＡＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ－３’
－１０５℃で蓋をしたＱＩＡｃｕｉｔｙ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍに試料を置く
１．変性開始温度９８℃、１分間
２．変性９８℃、１０秒間
３．アニーリング６３℃、１５秒間
４．伸長７２℃、１５秒間
５．最終伸長、７２℃、５分間
６．３５℃に冷却、１分間
－工程２～４を３０回繰り返す
－露光時間がそれぞれ６００ｍｓ及び７００ｍｓであり、かつゲイン６及び８である緑色チャネル及び黄色チャネルのパーティションの画像を取得する。このような実験から得られたデータを図７に示す。
【0445】
実施例６：ＥＧＦＲエクソン２０ Ｔ７９０Ｍバリアントの濃縮係数。
１．ビーズの調製
ａ．ビーズブロッキング工程
－試料１個あたり１μＬのビーズを採取し、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１カタログ６５００１）に入れる。最大１００μＬのビーズをブロッキング溶液１ｍＬでブロッキングすることができる。
－ビーズを含むチューブを磁石に置き、ビーズが分離し、溶液が透明になるまで待つ。
－保存緩衝液を除去する。
－ビーズを含むチューブにブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、１μｇ／ｍＬ ｔ－ＲＮＡ）１ｍＬを添加する。
－ＲＴで１５ｒｐｍで３０分間回転させる。
１．ビーズの調製
ａ．ビーズブロッキング工程
－試料１個あたり１μＬのビーズを採取し、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１カタログ６５００１）に入れる。最大１００μＬのビーズをブロッキング溶液１ｍＬでブロッキングすることができる。
－ビーズを含むチューブを磁石に置き、ビーズが分離し、溶液が透明になるまで待つ。
－保存緩衝液を除去する。
－ビーズを含むチューブにブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、１μｇ／ｍＬ ｔ－ＲＮＡ）１ｍＬを添加する。
－ＲＴで１５ｒｐｍで３０分間回転させる。
【0446】
ｂ．緩衝液交換
－ビーズをスピンダウンし、磁石に置く。ビーズが分離し、溶液が透明になるまで待つ。
－ブロッキング溶液を除去する。
－１μＬのビーズごとに２×Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５ ４０ｍＭ、ＮａＣｌ １Ｍ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．０２％）を１０μＬ添加する。
－ビーズを５秒間ボルテックス処理により混合する。
－ビーズをスピンダウンし、磁石に置く。ビーズが分離し、溶液が透明になるまで待つ。
－ブロッキング溶液を除去する。
－１μＬのビーズごとに２×Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５ ４０ｍＭ、ＮａＣｌ １Ｍ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．０２％）を１０μＬ添加する。
－ビーズを５秒間ボルテックス処理により混合する。
【0447】
２．オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション
－オリゴヌクレオチドの希釈物を以下の中で調製する：
緩衝液１：１×ＳＳＣ緩衝液（５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５×ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）または
緩衝液２：ＵＬＴＲＡｈｙｂ（商標）Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号ＡＭ８６７０）または
緩衝液３：ＵＬＴＲＡｈｙｂ（商標）－Ｏｌｉｇｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号ＡＭ８６６３）または
緩衝液４：１×ＳＳＣ＋１０％ホルミド緩衝液（５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、１０％ホルミド）、または
緩衝液５：１×ＳＳＣ＋２５％ホルミド緩衝液（５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、２５％ホルミド）、または
緩衝液６：１×ＳＳＣ＋４８％ホルミド緩衝液（５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、４８％ホルミド）
－プローブオリゴヌクレオチド２ｐＭ
ＷＴオリゴヌクレオチド混合物 １９８／１９９．８ｆＭ
変異体オリゴヌクレオチド混合物２／０．２ｆＭ
ゲノムＤＮＡ３８０ｎｇ
－ビーズ１μＬあたり５０μＬのオリゴヌクレオチドを調製する。
－９５℃で５分間及び６０℃で１／３時間インキュベートする。
ＷＴオリゴヌクレオチド混合物は、配列番号２２～３７を有する。
変異体オリゴヌクレオチド混合物は配列番号３８～５３を有する。
－オリゴヌクレオチドの希釈物を以下の中で調製する：
緩衝液１：１×ＳＳＣ緩衝液（５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５×ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）または
緩衝液２：ＵＬＴＲＡｈｙｂ（商標）Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号ＡＭ８６７０）または
緩衝液３：ＵＬＴＲＡｈｙｂ（商標）－Ｏｌｉｇｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号ＡＭ８６６３）または
緩衝液４：１×ＳＳＣ＋１０％ホルミド緩衝液（５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、１０％ホルミド）、または
緩衝液５：１×ＳＳＣ＋２５％ホルミド緩衝液（５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、２５％ホルミド）、または
緩衝液６：１×ＳＳＣ＋４８％ホルミド緩衝液（５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、４８％ホルミド）
－プローブオリゴヌクレオチド２ｐＭ
ＷＴオリゴヌクレオチド混合物 １９８／１９９．８ｆＭ
変異体オリゴヌクレオチド混合物２／０．２ｆＭ
ゲノムＤＮＡ３８０ｎｇ
－ビーズ１μＬあたり５０μＬのオリゴヌクレオチドを調製する。
－９５℃で５分間及び６０℃で１／３時間インキュベートする。
ＷＴオリゴヌクレオチド混合物は、配列番号２２～３７を有する。
変異体オリゴヌクレオチド混合物は配列番号３８～５３を有する。
【0448】
３．ビーズへのオリゴヌクレオチドの付着
－ビーズ及びオリゴヌクレオチドを以下の比で混合する：
２ｘＢｉｎｄｉｎｇ緩衝液 ４０ｕＬ
工程１からのビーズ１０μＬ
工程２からのオリゴヌクレオチド５０μＬ
－ＲＴで１５ｒｐｍで３０分間回転させる。
－ビーズ及びオリゴヌクレオチドを以下の比で混合する：
２ｘＢｉｎｄｉｎｇ緩衝液 ４０ｕＬ
工程１からのビーズ１０μＬ
工程２からのオリゴヌクレオチド５０μＬ
－ＲＴで１５ｒｐｍで３０分間回転させる。
【0449】
４．ビーズ洗浄
－付着工程が完了した後－試料をスピンダウンし、磁石に試料を置いて７分間待つ。
－１００μＬの上清の８０μＬを除去し、１×洗浄緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５ ２０ｍＭ、ＮａＣｌ ０．５Ｍ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．１％）１００μＬを添加する。
－試料を１０秒間にわたってボルテックスし、スピンダウンする。
－試料を磁石に置いて２分間待つ。
－１２０μＬの上清の９０μＬを除去し、１ｘ洗浄緩衝液１００μＬを添加する。
－試料位置を磁石上で変えることによって試料を混合する（１０回）。２分間待つ。
－上清全体を除去し、１×洗浄緩衝液１００μＬを添加する。
－試料位置を磁石上で変えることによって試料を混合する（１０回）。２分間待つ。
－上清全体を除去し、磁石から試料を取り出し、１００μＬの１×ＢＦＦ６緩衝液（トリス酢酸ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ、酢酸カリウム３０ｍＭ、酢酸マグネシウム１７．１２５ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．０１％）を添加する。
－試料をスピンダウンさせ、磁石に試料を載せ、２分間待つ。
－１×ＢＦＦ６緩衝液を除去する。
－付着工程が完了した後－試料をスピンダウンし、磁石に試料を置いて７分間待つ。
－１００μＬの上清の８０μＬを除去し、１×洗浄緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５ ２０ｍＭ、ＮａＣｌ ０．５Ｍ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．１％）１００μＬを添加する。
－試料を１０秒間にわたってボルテックスし、スピンダウンする。
－試料を磁石に置いて２分間待つ。
－１２０μＬの上清の９０μＬを除去し、１ｘ洗浄緩衝液１００μＬを添加する。
－試料位置を磁石上で変えることによって試料を混合する（１０回）。２分間待つ。
－上清全体を除去し、１×洗浄緩衝液１００μＬを添加する。
－試料位置を磁石上で変えることによって試料を混合する（１０回）。２分間待つ。
－上清全体を除去し、磁石から試料を取り出し、１００μＬの１×ＢＦＦ６緩衝液（トリス酢酸ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ、酢酸カリウム３０ｍＭ、酢酸マグネシウム１７．１２５ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０ ０．０１％）を添加する。
－試料をスピンダウンさせ、磁石に試料を載せ、２分間待つ。
－１×ＢＦＦ６緩衝液を除去する。
【0450】
５．ＰＰＬ反応
－４℃に保たれたビーズにＰＰＬ混合物を添加する。ＰＰＬは、以下の組成からなる：
１×ＢＦＦ６－０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０
２０Ｕ／ｍＬ Ｋｌｅｎｏｗ（ｅｘｏ－）
２Ｕ／ｍＬアピラーゼ
０．０５ｍＭ ＰＰｉ
総体積：２０μＬ
－４０℃で１０分間インキュベートし、４℃で休止する。
－４℃に保たれたビーズにＰＰＬ混合物を添加する。ＰＰＬは、以下の組成からなる：
１×ＢＦＦ６－０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０
２０Ｕ／ｍＬ Ｋｌｅｎｏｗ（ｅｘｏ－）
２Ｕ／ｍＬアピラーゼ
０．０５ｍＭ ＰＰｉ
総体積：２０μＬ
－４０℃で１０分間インキュベートし、４℃で休止する。
【0451】
６．ＴＩＰＰ反応
－ＰＰＬ反応が４℃に達したら、以下を有するＴＩＰＰ混合物５μＬを添加する：
１×ＢＦＦ６－０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０
１６Ｕ／ｍＬ ＴＩＰＰ
工程５からの混合物２０μＬ。
総体積：２５μＬ
－３７℃で５分間、６０℃で１０分間、６０℃休止でインキュベートする
－ＰＰＬ反応が４℃に達したら、以下を有するＴＩＰＰ混合物５μＬを添加する：
１×ＢＦＦ６－０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０
１６Ｕ／ｍＬ ＴＩＰＰ
工程５からの混合物２０μＬ。
総体積：２５μＬ
－３７℃で５分間、６０℃で１０分間、６０℃休止でインキュベートする
【0452】
７．予備増幅
－工程６からの試料を、ホットプレート上に保たれた磁石に載せ、６０℃まで加熱する。
－ビーズが分離された後に、２μＬの上清を取り、以下の混合物に添加する：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
ｄＮＴＰ ０．４ｍＭ
プライマー混合物４ ０．１μＭ
Ｑ５Ｕポリメラーゼ２０Ｕ／ｍＬ
ＵＤＧ １０Ｕ／ｍＬ
総体積：１２．５μＬ
Ｑ５Ｕ緩衝液：
プライマー混合物４は、以下から構成される：
フォワードプライマー（配列番号５４）：５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ－３’
リバースプライマー（配列番号５５）：５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ－３’
－試料をサーモサイクラーに入れ、１０５℃で蓋をしてインキュベートする。
１．ＵＤＧ３７℃、１分間
２．変性開始温度９８℃、１分間
３．変性９８℃、１０秒間
４．アニーリング６３℃、１５秒間
５．伸長７２℃、１５秒間
６．最終伸長、７２℃、５分間
７．冷却、４℃維持
－工程３～５を１２回繰り返す
－工程６からの試料を、ホットプレート上に保たれた磁石に載せ、６０℃まで加熱する。
－ビーズが分離された後に、２μＬの上清を取り、以下の混合物に添加する：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
ｄＮＴＰ ０．４ｍＭ
プライマー混合物４ ０．１μＭ
Ｑ５Ｕポリメラーゼ２０Ｕ／ｍＬ
ＵＤＧ １０Ｕ／ｍＬ
総体積：１２．５μＬ
Ｑ５Ｕ緩衝液：
プライマー混合物４は、以下から構成される：
フォワードプライマー（配列番号５４）：５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ－３’
リバースプライマー（配列番号５５）：５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ－３’
－試料をサーモサイクラーに入れ、１０５℃で蓋をしてインキュベートする。
１．ＵＤＧ３７℃、１分間
２．変性開始温度９８℃、１分間
３．変性９８℃、１０秒間
４．アニーリング６３℃、１５秒間
５．伸長７２℃、１５秒間
６．最終伸長、７２℃、５分間
７．冷却、４℃維持
－工程３～５を１２回繰り返す
【0453】
８．ｄＰＣＲ定量化
－工程７からの予備増幅が終了した後、工程７からの混合物２μＬを、以下を含有する反応物に添加する：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
ｄＮＴＰ ０．４ｍＭ
プライマー混合物５または６ ０．２μＭ
Ｑ５Ｕポリメラーゼ２０Ｕ／ｍＬ
ＥｖａＧｒｅｅｎ色素２ｘ
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００色素０．０００３μｇ／μＬ
ＴＷＥＥＮ２０ ０．２％
総体積：１２μＬ
プライマー混合物５は、以下を有する：
フォワードプライマー（配列番号５６）：５’－ＴＧＧＴＡＡＴＴＡＣＣＧＡＣＧＡＡＡＡＣＧＧＣ－３’
リバースプライマー（配列番号５７）５’－ＡＣＧＣＧＴＧＧＴＴＡＣＡＧＴＣＴＴＧＣＧ－３’
プライマー混合物６は以下を有する：
フォワードプライマー（配列番号５８）：５’－ＴＧＡＴＴＴＣＣＧＴＧＣＧＴＣＴＧＡＡＴＧＣ－３’
リバースプライマー（配列番号５９）：５’－ＡＴＧＣＴＧＣＣＧＴＡＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ－３’
－１０５℃で蓋をしたＱＩＡｃｕｉｔｙ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍに試料を置く
１．変性開始温度９８℃、１分間
２．変性９８℃、１０秒間
３．アニーリング６３℃、１５秒間
４．伸長７２℃、１５秒間
５．最終伸長、７２℃、５分間
６．３５℃に冷却、１分間
－工程２～４を３０回繰り返す
－露光時間がそれぞれ６００ｍｓ及び７００ｍｓであり、かつゲイン６及び８である緑色チャネル及び黄色チャネルのパーティションの画像を取得する。このような実験から得られたデータを図８に示す。
－工程７からの予備増幅が終了した後、工程７からの混合物２μＬを、以下を含有する反応物に添加する：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
ｄＮＴＰ ０．４ｍＭ
プライマー混合物５または６ ０．２μＭ
Ｑ５Ｕポリメラーゼ２０Ｕ／ｍＬ
ＥｖａＧｒｅｅｎ色素２ｘ
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００色素０．０００３μｇ／μＬ
ＴＷＥＥＮ２０ ０．２％
総体積：１２μＬ
プライマー混合物５は、以下を有する：
フォワードプライマー（配列番号５６）：５’－ＴＧＧＴＡＡＴＴＡＣＣＧＡＣＧＡＡＡＡＣＧＧＣ－３’
リバースプライマー（配列番号５７）５’－ＡＣＧＣＧＴＧＧＴＴＡＣＡＧＴＣＴＴＧＣＧ－３’
プライマー混合物６は以下を有する：
フォワードプライマー（配列番号５８）：５’－ＴＧＡＴＴＴＣＣＧＴＧＣＧＴＣＴＧＡＡＴＧＣ－３’
リバースプライマー（配列番号５９）：５’－ＡＴＧＣＴＧＣＣＧＴＡＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ－３’
－１０５℃で蓋をしたＱＩＡｃｕｉｔｙ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍに試料を置く
１．変性開始温度９８℃、１分間
２．変性９８℃、１０秒間
３．アニーリング６３℃、１５秒間
４．伸長７２℃、１５秒間
５．最終伸長、７２℃、５分間
６．３５℃に冷却、１分間
－工程２～４を３０回繰り返す
－露光時間がそれぞれ６００ｍｓ及び７００ｍｓであり、かつゲイン６及び８である緑色チャネル及び黄色チャネルのパーティションの画像を取得する。このような実験から得られたデータを図８に示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】