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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-08
(54)【発明の名称】免疫調節因子を発現するＣＡＲベクター及びその応用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/867 20060101AFI20240401BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240401BHJP
C12N 15/27 20060101ALI20240401BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240401BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240401BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240401BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240401BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240401BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20240401BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240401BHJP
A61K 38/19 20060101ALI20240401BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240401BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240401BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240401BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240401BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20240401BHJP
C07K 16/30 20060101ALN20240401BHJP
C07K 14/725 20060101ALN20240401BHJP
【ＦＩ】
C12N15/867 Z
C12N15/62 Z
C12N15/27
C12N15/13
C12N15/12
C12N7/01
C12N5/10
C12N5/0783
A61K39/00 H
A61K39/395 N
A61K38/19
A61K35/17
A61P35/00
A61P37/04
A61P43/00 121
C07K19/00
C07K16/30
C07K14/725
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023566450
(86)(22)【出願日】2022-04-29
(85)【翻訳文提出日】2023-12-25
(86)【国際出願番号】 CN2022090106
(87)【国際公開番号】W WO2022228538
(87)【国際公開日】2022-11-03
(31)【優先権主張番号】202110481979.9
(32)【優先日】2021-04-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】512330318
【氏名又は名称】四川大学華西医院
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(72)【発明者】
【氏名】▲楊▼ 寒朔
(72)【発明者】
【氏名】李 ▲チー▼▲チー▼
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA92X
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C084AA02
4C084BA44
4C084CA53
4C084CA56
4C084DA01
4C084MA02
4C084MA66
4C084NA05
4C084ZB022
4C084ZB092
4C084ZB261
4C084ZC751
4C085AA02
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB01
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG01
4C087AA01
4C087AA03
4C087BB37
4C087BB64
4C087BB65
4C087CA04
4C087CA12
4C087MA66
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZB02
4C087ZB09
4C087ZB26
4C087ZC75
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA12
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、生物工学の分野に属し、詳しくは、ＣＡＲ発現ベクター及びその応用に関するものである。ＣＡＲ発現ベクターは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸と、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）をコードする核酸の全長又は断片を含む。本発明により構築されたＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞は、ＧＭ－ＣＳＦを高発現することができ、ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞自体の殺傷活性を直接増強することができるだけでなく、ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞の固形腫瘍の内部への浸潤を促進することもできるとともに、このようなＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞に従来のＣＡＲ－Ｔ細胞よりも強い免疫調節機能を持たせ、内因性抗腫瘍免疫反応を系統的に活性化させ、それによって、より優れた抗固形腫瘍治療効果が得られる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸と、免疫調節因子をコードする核酸とを含むＣＡＲ発現ベクターであって、前記免疫調節因子をコードする前記核酸は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）をコードする核酸の全長又は断片である、ことを特徴とするＣＡＲ発現ベクター。
【請求項2】
前記キメラ抗原受容体をコードする前記核酸と、前記ＧＭ－ＣＳＦをコードする前記核酸とは、自己切断ペプチドＰ２Ａをコードする配列を介して連結されている、ことを特徴とする請求項１に記載のＣＡＲ発現ベクター。
【請求項3】
前記キメラ抗原受容体をコードする前記核酸は、さらに、腫瘍特異抗原又は腫瘍関連抗原である抗原性標的を標的とする細胞外ドメインと、前記ＣＡＲ構造を固定する膜貫通ドメインと、直列の共刺激分子を含むとともにＣＤ３ζ鎖、４－１ＢＢ及びＧＭ－ＣＳＦを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＣＡＲ発現ベクター。
【請求項4】
前記抗原性標的は、Ｈｅｒ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＣＤ７０、ＭＵＣ１６、ＦＳＨＲ、ＦＲ及びＭｅｓｏからなる群より選択される標的を含む、ことを特徴とする請求項３に記載のＣＡＲ発現ベクター。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載のＣＡＲ発現ベクターを含むレンチウイルスであって、ｐＷＰＸＬｄ、ｐｓＰＡＸ２及び／又はｐＭＤ２．Ｇを含む、ことを特徴とするレンチウイルス。
【請求項6】
請求項１～４のいずれか一項に記載のＣＡＲ発現ベクターを発現する、ことを特徴とするＣＡＲ－Ｔ細胞。
【請求項7】
請求項６に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞の、固形腫瘍を治療するための薬物の調製への応用。
【請求項8】
前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２の分泌を増強することができる、ことを特徴とする請求項７に記載の応用。
【請求項9】
前記ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷活性は、前記ＧＭ－ＣＳＦの発現によって直接増強される、ことを特徴とする請求項７に記載の応用。
【請求項10】
前記ＣＡＲ－Ｔ細胞の浸潤能力は増強され、より多くの前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は前記固形腫瘍の内部へ浸潤して、腫瘍細胞を特異的に殺傷する効力を発揮することができる、ことを特徴とする請求項７に記載の応用。
【請求項11】
前記固形腫瘍の内部への浸潤後、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、免疫調節機能を発揮して腫瘍微小環境を調節することができる、ことを特徴とする請求項１０に記載の応用。
【請求項12】
前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、樹状細胞を活性化して前記固形腫瘍の内部へ動員することによって、内因性Ｔ細胞の抗原特異的腫瘍免疫反応を誘発することができる、ことを特徴とする請求項１１に記載の応用。
【請求項13】
前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍細胞のリンパ節転移を抑制することができる、ことを特徴とする請求項７に記載の応用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［１］．本出願は、２０２１年４月３０日に出願された中国特許出願公開第２０２１１０４８１９７９９号である、「免疫調節因子を発現するＣＡＲベクター及びその応用」という名称の特許出願の優先権を主張する。この優先権発明特許出願の全てが、参照することにより組み込まれる。
【0002】
［２］．本発明は、生物工学の分野に属し、詳しくは、ＣＡＲ発現ベクター及びその応用に関するものである。
【背景技術】
【0003】
［３］．キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、急性Ｂリンパ芽球性白血病等の血液腫瘍の治療では良好な臨床効果を示しているが、固形腫瘍に対する治療効果はよくない。ＣＡＲ構造は、腫瘍抗原を認識するための細胞外ドメイン、ＣＡＲ構造を固定するための膜貫通ドメイン、及びＴ細胞を活性化してシグナルを伝達するための細胞内シグナル伝達ドメインという３つの部分を含む。ＣＡＲ－Ｔ細胞による腫瘍細胞の殺傷は、以下のことに依存する。細胞外一本鎖可変ドメインが、対応する腫瘍関連抗原に特異的に結合し、その後、細胞内シグナル伝達ドメインを通じて下流のシグナル伝達を開始させ、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化及び増殖を引き起こし、そして、ＩＦＮ－γ等のサイトカインを放出することで細胞毒性を発揮する。しかしながら、固形腫瘍を対象とした場合、現在、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞による治療効果はよくない。
【0004】
［４］．第一世代ＣＡＲ構造の細胞内ドメインは、ＣＤ３ξに由来する３つのＩＴＡＭ配列又はＦｃＲγに由来する２つのＩＴＡＭ配列のみを有し、それは、Ｔ細胞活性化の第１シグナルを提供することしかできず、ＩＬ－２を分泌する能力に限界があり、増殖能力も弱く、臨床試験で満足のいく結果は得られていない。第二世代ＣＡＲ構造は、細胞内シグナル配列の後に直列の共刺激分子シグナル伝達ドメインがあり、第一世代ＣＡＲ構造と比較して増殖能力と殺傷能力が増強される。第三世代ＣＡＲ構造の細胞内シグナル伝達ドメインは、より多くの共刺激分子シグナル伝達ドメインを含むが、研究によると、その殺傷活性は有意に増強せず、副作用もより多い。第四世代ＣＡＲ構造は、第二世代ＣＡＲ構造に基づいて新しい機能要素を導入してＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を増強したものであり、例えば、サイトカインＩＬ－１２、ＩＬ－１５又はＩＬ－１８を分泌するＣＡＲ－Ｔ細胞は、その増殖能力と生存能力が増強され、それによって抗腫瘍活性も増強される。
【0005】
［５］．現在、ＣＡＲ－Ｔ細胞の固形腫瘍に対する治療効果がよくない理由は以下の点があると考えられている。固形腫瘍の内部の複雑な環境と異常な血管構造と関係がある。通常、腫瘍血管の漏出や発育不全は、細胞傷害性Ｔ細胞がその中に入らないことを招くことが多い。一方、ＣＡＲ－Ｔ細胞は腫瘍組織への浸潤に関与する走化因子の発現が不足し、固形腫瘍の外部の腫瘍関連線維芽細胞（ＣＡＦ）と血管からなる緻密な物理的バリアがあるため、ＣＡＲ－Ｔ細胞の移動と腫瘍組織内部への浸潤能力が低下する。また、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、腫瘍細胞の免疫監視からの逃避を助け、生体の抗腫瘍反応を抑制し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の浸潤・増殖・生存を抑制可能であり、ＣＡＲ－Ｔ細胞が固形腫瘍に対して効果がない主な原因の一つでもある。従って、腫瘍組織へ効果的に浸潤し、腫瘍免疫抑制微小環境を逆転させることができるＣＡＲ－Ｔ細胞を設計・構築することで、従来の免疫治療の奏効率が低いという問題を克服し、より効果的な抗腫瘍作用をもたらすことができる。
【0006】
［６］．要約すると、本発明は、改良された第二世代ＣＡＲ－Ｔ細胞に基づいて、ＧＭ－ＣＳＦを高発現する新規ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞）を構築し、従来の技術の欠点や不足を緩和することができる。
【発明の概要】
【0007】
［７］．上記に鑑み、本発明の目的は、ＣＡＲ発現ベクター及びその応用を提供することにある。
【0008】
［８］．上記の目的を達成するために、本発明の技術的解決策は、以下の通りである。
【0009】
［９］．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸と、免疫調節因子をコードする核酸とを含むＣＡＲ発現ベクターであって、前記免疫調節因子をコードする前記核酸は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）をコードする核酸の全長又は断片である、ことを特徴とするＣＡＲ発現ベクター。
【0010】
［１０］．さらに、前記キメラ抗原受容体をコードする前記核酸と、前記ＧＭ－ＣＳＦをコードする前記核酸とは、自己切断ペプチドＰ２Ａをコードする配列を介して連結されている。
【0011】
［１１］．さらに、前記キメラ抗原受容体をコードする前記核酸は、さらに、腫瘍特異抗原又は腫瘍関連抗原である抗原性標的を標的とする細胞外ドメインと、前記ＣＡＲ構造を固定する膜貫通ドメインと、直列の共刺激分子を含むとともにＣＤ３ζ鎖、４－１ＢＢ及びＧＭ－ＣＳＦを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む。
【0012】
［１２］．さらに、前記抗原性標的は、Ｈｅｒ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＣＤ７０、ＭＵＣ１６、ＦＳＨＲ、ＦＲ及びＭｅｓｏからなる群より選択される標的を含む。上記の標的のうち、実証されたように、標的となるＨｅｒ２は主にＨｅｒ２陽性の乳がん、肺がん、胃がん、卵巣がん、及び肉腫の治療に使用される。標的となるＭｅｓｏは膵臓がん、卵巣がん、及び肺がんの治療に使用される。標的となるＢ７－Ｈ３及びＣＤ７０は黒色腫の治療に使用される。そして、標的となるＭＵＣ１６、ＦＳＨＲ、及びＦＲはいずれも卵巣がんの治療に使用される。標的となるＣｌａｕｄｉｎ１８．２は胃がん、食道胃接合部がん、及び膵臓がんの治療に使用される。
【0013】
［１３］．上記ＣＡＲ発現ベクターを含むレンチウイルスであって、ｐＷＰＸＬｄ、ｐｓＰＡＸ２及び／又はｐＭＤ２．Ｇを含む、ことを特徴とするレンチウイルス。
【0014】
［１４］．上記ＣＡＲ発現ベクターを発現する、ことを特徴とするＣＡＲ－Ｔ細胞。
【0015】
［１５］．上記ＣＡＲ－Ｔ細胞の、固形腫瘍を治療するための薬物の調製への応用。
【0016】
［１６］．好ましくは、前記固形腫瘍は、主に乳がん、卵巣がん、及び肺がんを含むが、これらに限定されるものではない。
【0017】
［１７］．さらに、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２の分泌を増強することができる。
【0018】
［１８］．さらに、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷活性は、前記ＧＭ－ＣＳＦの発現によって直接増強される。
【0019】
［１９］．さらに、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞の浸潤能力は増強され、より多くの前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は前記固形腫瘍の内部へ浸潤して、腫瘍細胞を特異的に殺傷する効力を発揮することができる。
【0020】
［２０］．さらに、前記固形腫瘍の内部への浸潤後、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、免疫調節機能を発揮して腫瘍微小環境を調節することができる。
【0021】
［２１］．さらに、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、樹状細胞を活性化して前記固形腫瘍の内部へ動員することによって、内因性Ｔ細胞の抗原特異的腫瘍免疫反応を誘発することができる。
【0022】
［２２］．さらに、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍細胞のリンパ節転移を抑制することができる。
【0023】
［２３］．本発明で言う「走化」とは、本発明により調製されるＣＡＲ－Ｔ細胞、即ちＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞が、ＤＣ細胞の腫瘍細胞への方向性のある運動を促すことを指す。
【0024】
［２４］．ＤＣ細胞は、生体内のプロフェッショナル抗原提示細胞であり、ＭＨＣ ＩＩ及び共刺激分子を発現し、腫瘍抗原の取り込み・捕捉・処理を行い、その後、リンパ節内へ移動して生体の内因性Ｔ細胞の抗腫瘍免疫反応を活性化することができる。
【発明の効果】
【0025】
［２５］．有益な効果
【0026】
［２６］．ＣＡＲ－Ｔ細胞の固形腫瘍に対する治療効果をさらに増強するために、本発明は、第二世代ＣＡＲ－Ｔ細胞に基づいて、ＧＭ－ＣＳＦを高発現するＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞）を構築した。ＧＭ－ＣＳＦは、重要な免疫調節剤であり、ＧＭ－ＣＳＦは、樹状細胞（ＤＣ）を活性化して動員することでＴ細胞免疫反応を誘発することができ、同時に、顆粒球、マクロファージ、ＮＫ細胞等の他の免疫細胞を活性化することもでき、腫瘍免疫応答の調節において重要な役割を果たす。実験によると、本発明により構築されたＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞は、ＧＭ－ＣＳＦを高発現することができ、ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞自体の殺傷活性と増殖能力を直接増強することができるだけでなく、このようなＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞に従来のＣＡＲ－Ｔ細胞よりも強い免疫調節機能を持たせることもできる。特に、本発明により調製されたＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞は、以下の点で優れた効果を有する。
【0027】
［２７］．１）ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞の卵巣がん細胞に対する殺傷能力は、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞よりも有意に高い。
【0028】
［２８］．２）ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞の卵巣がん細胞に対する殺傷能力は、Ｍｅｓｏ－ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも有意に高い。
【0029】
［２９］．３）ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞は、黒色腫の成長を有意に抑制し、実験動物の生存期間を有意に延長することができる。
【0030】
［３０］．４）ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞が腫瘍細胞に接触する前後に分泌する免疫調節因子ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－２は、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞よりも有意に高い。
【0031】
［３１］．５）ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞は、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞よりも強い固形腫瘍組織への浸潤能力を有し、固形腫瘍の内部への浸潤後、より強い抗腫瘍効果を発揮する。
【0032】
［３２］．６）ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞は、腫瘍細胞のリンパ節転移を抑制する。
【0033】
［３３］．要約すると、本発明は、腫瘍微小環境を再構築して逆転させ、Ｔ細胞活性を直接又は補助的に増強し、固形腫瘍の治療に新しい戦略を提供することができる。
【0034】
［３４］．本発明の実施形態又は従来の技術における技術的解決策をより明確に説明するために、以下、実施形態又は従来の技術の説明で使用される添付の図面を簡単に紹介する。
【図面の簡単な説明】
【0035】
【図4】［３８］．図４は、Ｍｅｓｏ－ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞のＳＫ－ＯＶ３－Ｍｅｓｏに対する殺傷効率がＭｅｓｏ－ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも有意に高く、且、殺傷効率がエフェクター：標的比の増加とともに増強したことを示す図である。
【図6】［４０］．図６は、エフェクター：標的比が５：１の時にＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞から分泌されたＩＦＮ－γが従来のＣＡＲ－Ｔ細胞の４．５倍であり、異なるエフェクター：標的比でＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞が腫瘍細胞に接触した時に分泌されたＩＦＮ－γがいずれも従来のＣＡＲ－Ｔ細胞よりも有意に高かったことを示す図である。
【図9】［４３］．図９は、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞がＢ１６Ｆ１０－Ｈｅｒ２皮下移植黒色腫の成長を有意に抑制する作用がなく、マウスの生存期間を延長することもできなかったが、ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞治療を受けることでマウスの皮下移植黒色腫の成長を有意に抑制することができたことを示す図である。
【図11】［４５］．図１１は、マウスが治療を受けた２４日目に、マウスの腫瘍とリンパ節を分離して単細胞懸濁液として調製した後、フローサイトメトリーによって検出された、マウスの腫瘍とリンパ節内のＣＡＲ－Ｔ細胞の割合を示す図である。
【図12】［４６］．図１２は、さらに検出されたＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞のヒト腫瘍組織への浸潤能力を示す図であり、ＮＳＧマウスの腹腔内腫瘍の治療後２８日目に、腹腔内の残存腫瘍を採取して免疫蛍光染色を行うことで検出されたＣＤ３＋Ｔ細胞の浸潤能力を示す図である。
【図13】［４７］．図１３は、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞治療群ではＣＤ４５．２＋免疫細胞がわずか５％を占め、ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞治療群ではマウスの腫瘍の内部への免疫細胞の浸潤能力が従来のＣＡＲ－Ｔ細胞治療群よりも有意に良好であったことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0036】
［５１］．本発明の実施形態の目的、技術的解決策及び利点をより明確にするために、以下、本発明の実施形態における技術的解決策を添付図面と共に明確かつ完全に説明する。なお、記載した実施形態は、本発明の実施形態の一部であり、その全てではないことは明らかである。本発明における実施形態に基づき、当業者が創意工夫をすることなく得られる他のすべての実施形態は、本発明の保護範囲に含まれる。
【0037】
［５２］．注意すべきことは、ここにおいて、「含む」、「包含する」、又はそれらの任意の他の変形語という用語は、非排他的な包含をカバーすることを意図しているということである。したがって、一連の要素を含むプロセス、方法、物品、又は装置は、それらの要素だけでなく、明示的に列挙されていない他の要素、又はそのようなプロセス、方法、物品、又は装置に固有の要素も含む。さらなる限定がない場合は、「一つの……を含む」という語句によって限定される要素は、その要素を含むプロセス、方法、物品、又は装置における追加の同一要素の存在を排除しない。
【0038】
［５３］．例えば、本明細書で使用される「約」という用語は、典型的には記載された値の＋／－５％、より典型的には該当値の＋／－４％、より典型的には該当値の＋／－３％、より典型的には該当値の＋／－２％、さらに典型的には該当値の＋／－１％、さらに典型的には該当値の＋／－０．５％として表示される。
【0039】
［５４］．本明細書では、特定の実施形態をある範囲内の形式で開示することができる。この「ある範囲内」の説明は、ただ便宜や簡潔さを図るためのものであり、開示された範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけでなく、すべての可能な部分範囲を具体的に開示したと見なされるべきである。例えば、１から６の範囲の説明は、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６、など、及びこの範囲内の１、２、３、４、５、及び６などの個々の番号を具体的に開示したと見なされるべきである。上記のルールは、範囲の幅に関係なく適用される。
【実施例1】
【0040】
［５５］．実施例１
【0041】
［５６］．１．細胞培養
【0042】
［５７］．ルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を発現するヒト卵巣がん細胞株（ＳＫ－ＯＶ３－Ｌｕｃ）、及びＨｅｒ２タンパク質を過剰発現するマウス黒色腫細胞株（Ｂ１６Ｆ１０－Ｈｅｒ２）を、四川大学生物治療国家重点実験室により保存し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２、及び通常酸素条件下で培養した。
【0043】
［５８］．２．ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞の調製
【0044】
［５９］．２．１ＣＡＲ－ｈＧＭ発現ベクターの構築と検証
【0045】
［６０］．Ｈｅｒ２－ＣＡＲとｈＧＭ－ＣＳＦを自己切断ペプチドＰ２Ａで連結し、ｈＧＭ－ＣＳＦを高発現するＨｅｒ２－ＣＡＲ－ｈＧＭ発現ベクター（ｐＷＰＸＬｄ－Ｈｅｒ２－ＣＡＲ－ｈＧＭ－ＣＳＦ）を構築した（図１）。ｐＷＰＸＬｄ－Ｈｅｒ２－ＣＡＲ－ＥＧＦＰベクターを鋳型としてＨｅｒ２－ＣＡＲ－Ｐ２Ａ断片を増幅し、ｐＷＰＸＬｄ－ｈＧＭ－ＣＳＦベクターを鋳型としてｈＧＭ－ＣＳＦ断片を増幅した。制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩを用いてベクターｐＷＰＸＬｄを切断して線形化した。相同組換え法を用いて断片Ｈｅｒ２－ＣＡＲとｈＧＭ－ＣＳＦを線形化ベクターｐＷＰＸＬｄに連結した。
【0046】
［６１］．２.２レンチウイルスのパッケージング
【0047】
［６２］．レンチウイルスの3つのプラスミドシステムを用いてレンチウイルスのパッケージングを行った。プラスミドトランスフェクション法としてリン酸カルシウム－ＤＮＡ共沈法を用いた。ヘルパープラスミドとしてｐｓＰＡＸ２とｐＭＤ２．Ｇを用いた。パッケージング細胞として２９３Ｔ細胞を用いた。トランスフェクション４８時間後と７２時間後にウイルス上清を採取し、０．２２μｍのディスポーザブルシリンジフィルター（ＰＥＳ膜）を用いてウイルス上清をろ過し、ろ過したウイルス液を超高速遠心分離機を用いて濃縮した後、分注して－８０℃の冷蔵庫で凍結保存した。
【0048】
［６３］．２．３ヒトＴ細胞の活性化と感染
【0049】
［６４］．１）Ｆｉｃｏｌｌを用いて末梢血単核リンパ球を分離した。
【0050】
［６５］．２）末梢血単核リンパ球数に基づいて、適量のＨｕｍａｎ Ｔ－Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ磁気ビーズを取り出し、５ｍＬのＤＰＢＳを用いて磁気ビーズを１回洗浄し、Ｔ細胞完全培地を用いて再懸濁した。末梢血単核リンパ球懸濁液を洗浄した磁気ビーズと均一混合し、Ｔ７５培養フラスコに入れ、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【0051】
［６６］．３）ウイルス力価に基づいてウイルスの使用量を計算し、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎを用いて感染効率を増強し、感染７２時間後にフローサイトメトリーを用いて各群のＣＡＲ－Ｔ細胞（従来のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む）の発現能力を検出した。
【0052】
［６７］．２．４マウスＴ細胞の活性化と感染
【0053】
［６８］．１）マウスリンパ節からリンパ節細胞を分離した。
【0054】
［６９］．２）末梢血単核リンパ球数に基づいて、適量のＨｕｍａｎ Ｔ－Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ磁気ビーズを取り出し、５ｍＬのＤＰＢＳを用いて磁気ビーズを１回洗浄し、Ｔ細胞完全培地を用いて再懸濁した。末梢血単核リンパ球懸濁液を洗浄した磁気ビーズと均一混合し、Ｔ７５培養フラスコに入れ、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【0055】
［７０］．３）ウイルス力価に基づいてウイルスの使用量を計算し、ｐｏｌｙｂｒｅｎｅを用いて感染効率を増強し、感染７２時間後にフローサイトメトリーを用いて各群のＣＡＲ－Ｔ細胞（従来のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む）の発現能力を検出した。
【0056】
［７１］．２．５ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞を培養した。
【0057】
［７２］．３．サイトカインの検出
【0058】
［７３］．ＩＬ－２、ＩＦＮγ、及びＧＭ－ＣＳＦを含むサイトカインの分泌能力は、いずれもＥＬＩＳＡ法によって測定された。試料は、ＣＡＲ－Ｔ細胞培養物の上清、又はＣＡＲ－Ｔ細胞が腫瘍細胞を殺傷した後の培養物の上清に由来した。
【0059】
［７４］．４．殺傷活性の検出
【0060】
［７５］．インビトロ殺傷活性は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）細胞毒性測定キットを用いて測定された。具体的な手順は以下の通りである。
【0061】
［７６］．１）成長状態が良好な腫瘍細胞を採取し、トリプシン消化して計数し、Ｘ－ＶＩＶＯ培地を用いて腫瘍細胞を最終濃度５×１０５個／ｍＬに再懸濁した。
【0062】
［７７］．２）成長状態が良好なＣＡＲ－Ｔ細胞を採取し、軽く吹き散らして計数し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を捨て、Ｘ－ＶＩＶＯ培地を用いてＣＡＲ－Ｔ細胞を最終濃度１０６個／ｍＬに再懸濁した。
【0063】
［７８］．３）異なるエフェクター：標的比１：１、２．５：１、５：１、１０：１を設定した。腫瘍細胞は、いずれも１ウェルあたり１０４個で計算した。エフェクター：標的比ごとに次の６群：ＭＯＣＫ Ｔ（エフェクター細胞自然放出群）、ＭＯＣＫ Ｔ ＋ Ｔｕｍｏｒ（試験群）、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞 ＋ Ｔｕｍｏｒ、ＣＡＲ－ＧＭ－ＣＳＦ－Ｔ、及びＣＡＲ－ＧＭ－ＣＳＦ－Ｔ ＋ Ｔｕｍｏｒを設置し、各群に３つのウェルを設置した。同時に、空白培地群、腫瘍細胞自然放出群、及び腫瘍細胞最大放出群を設置し、１ウェルあたりの最終体積は２００μＬとした。
【0064】
［７９］．４）殺傷２４時間後、顕微鏡で各群の細胞の殺傷能力を観察した。
【0065】
［８０］．５）９６ウェル細胞培養プレートを取り出し、腫瘍細胞最大放出群に対して１ウェルあたり２０μＬ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１０Ｘ）を加え、３７℃で４５分間インキュベートした。
【0066】
［８１］．６）インキュベーション終了後、９６ウェル細胞培養プレートを横型遠心分離機で、室温、２５０ｇで４分間遠心分離した。
【0067】
［８２］．７）各ウェルからそれぞれ５０μＬの上清を採取して新しい９６ウェルプレートに入れ、その後のＬＤＨ放出検出に使用した。
【0068】
［８３］．８）各ウェルに５０μＬのＬＤＨ検出反応液を加え、室温で光を避けて３０分間インキュベートした。
【0069】
［８４］．９）インキュベーション終了後、各ウェルに５０μＬの停止液を加えた。
【0070】
［８５］．１０）反応終了後、１時間以内にマイクロプレートリーダーを用いて４９０ｎｍの吸光度を読み取った。
【0071】
【数1】
【0072】
［８７］．５．卵巣がん腹腔内異種移植モデルの治療
【0073】
［８８］．５．１動物の飼育
【0074】
［８９］．１）この部分の動物実験に用いた動物として、ＢＩＯＣＹＴＯＧＥＮが独自に開発したＢ－ＮＤＧ（登録商標）マウス（ＮＯＤ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１／Ｂｃｇｅｎ）を用いた。このマウスは、ＮＯＤ－ｓｃｉｄを遺伝的背景とし、ＩＬ２ｒｇ遺伝子がノックアウトされ、Ｔ、Ｂ、ＮＫ細胞が欠損し、ヒト由来細胞や組織移植に適していた。
【0075】
［９０］．２）体重１８～２０ｇの５～６週齢の雌性Ｂ－ＮＤＧマウスを購入し、購入後、四川大学生物治療国家重点実験室のＳＰＦグレード動物施設で飼育した。
【0076】
［９１］．３）Ｂ－ＮＤＧマウスの飼育期間中、室温は２５℃に維持され、実験期間中、食事と水は自由に摂取させた。
【0077】
［９２］．５．２卵巣がん腹腔内異種移植モデルの構築
【0078】
［９３］．１）成長状態が良好なＳＫ－ＯＶ３－Ｌｕｃ細胞を採取し、トリプシン消化して計数した後、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄し、無血清ＤＭＥＭ培地を用いて細胞を最終濃度１０６個／ｍＬに再懸濁した。
【0079】
［９４］．２）マウスを捕獲し、１匹のマウスにつき２００μＬの細胞懸濁液を腹腔内に注射してＳＫ－ＯＶ３－Ｌｕｃ細胞を接種した。
【0080】
［９５］．３）マウスの体重を定期的にモニターした。
【0081】
［９６］．５．３卵巣がん腹腔内異種移植モデルの治療
【0082】
［９７］．１）接種後６日目に、各マウスに対してインビボイメージングを行った。イメージングの蛍光値に基づいてマウスを６匹ずつの３群：ＰＢＳ群、Ｈｅｒ２－ＣＡＲ群、及びＨｅｒ２－ＣＡＲ－ＧＭ－ＣＳＦ群に分けた。
【0083】
［９８］．２）接種後７日目に、成長状態が良好でＣＡＲ陽性率が５０％を超えたＨｅｒ２－ＣＡＲ－Ｔ細胞とＨｅｒ２－ＣＡＲ－ＧＭ－ＣＳＦ－Ｔ細胞を収集し、Ｘ－ＶＩＶＯ培地を用いて最終濃度１０６個／ｍＬに再懸濁した。
【0084】
［９９］．３）上記ＣＡＲ－Ｔ細胞懸濁液をそれぞれ１００μＬ吸引し、腹腔内に注射して各マウスを治療した。
【0085】
［１００］．５．４卵巣がん腹腔内異種移植モデルに対する治療効果の検出
【0086】
［１０１］．１）マウスの治療後、インビボイメージング検出を週１回行った。
【0087】
［１０２］．２）マウスの精神状態、活動レベル、毛の光沢、及び食欲を定期的にモニターし、副作用の有無を観察した。マウスの体重を検出した。
【0088】
［１０３］．３）モニタリング終了後、マウスを麻酔して頸椎脱臼で殺した。腹腔内の残存腫瘍を採取して免疫蛍光染色を行い、ＣＡＲ－Ｔ細胞の浸潤能力を検出した。
【0089】
［１０４］．６．皮下黒色腫異種移植モデルの治療
【0090】
［１０５］．６．１動物の飼育
【0091】
［１０６］．（１）この部分の動物実験に用いたＣ５７ＢＬ／６ ＣＤ４５．１は、本実験室による品種保存に由来し、Ｃ５７ＢＬ／６ ＣＤ４５．２は四川大学実験動物センターから購入された。
【0092】
［１０７］．（２）体重１８～２０ｇの５～６週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６ ＣＤ４５．２マウスを購入し、購入後、四川大学のＳＰＦグレード動物施設で飼育した。
【0093】
［１０８］．（３）マウスの飼育期間中、室温は２５℃に維持され、実験期間中、食事と水は自由に摂取させた。
【0094】
［１０９］．６．２Ｈｅｒ２タンパク質を過剰発現する皮下黒色腫異種移植モデルの構築
【0095】
［１１０］．（１）モデルの構築にはＣ５７ＢＬ／６ ＣＤ４５．２マウスを使用した。マウスの購入後、１週間の環境適応で皮下黒色腫異種移植モデルの構築に使用できた。
【0096】
［１１１］．（２）成長状態が良好なＢ１６Ｆ１０－Ｈｅｒ２細胞を採取し、トリプシン消化して計数した後、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄し、無血清ＤＭＥＭ培地を用いて細胞を最終濃度５×１０６個／ｍLに再懸濁した。
【0097】
［１１２］．（３）上記腫瘍細胞懸濁液を１００μＬ採取し、筋肉層を突き破らないように注意しながら、マウスの右側胸部に皮下注射した。
【0098】
［１１３］．６．３皮下黒色腫異種移植モデルの治療
【0099】
［１１４］．（１）シクロホスファミド（ＣＰＡ）２００ｍｇを生理食塩水５ｍＬに溶解し、０．２２μｍのディスポーザブルシリンジフィルターでろ過した後、分注して－２０℃の冷蔵庫で予備として凍結保存した。
【0100】
［１１５］．（２）接種後１０日目に、各担腫瘍マウスにシクロホスファミドを２００ｍｇ／ｋｇの使用量で注射し、腹腔内投与した。
【0101】
［１１６］．（３）接種後１２日目に、移植腫瘍体積を測定し、腫瘍体積に基づいてマウスを１５匹ずつの３群：ＰＢＳ群、Ｈｅｒ２－ＣＡＲ群、及びＨｅｒ２－ＣＡＲ－ＧＭ－ＣＳＦ群に分けた。
【0102】
［１１７］．（４）接種後１３日目に、成長状態が良好な、Ｃ５７ＢＬ／６ ＣＤ４５．１マウスリンパ球から調製されたＨｅｒ２－ＣＡＲ－Ｔ細胞とＨｅｒ２－ＣＡＲ－ＧＭ－ＣＳＦ－Ｔ細胞を収集し、１６４０培地を用いて最終濃度３×１０７個／ｍＬに再懸濁した。
【0103】
［１１８］．（５）上記ＣＡＲ－Ｔ細胞懸濁液をそれぞれ１００μＬ吸引し、尾静脈に注射して各マウスを治療した。
【0104】
［１１９］．皮下黒色腫異種移植モデルに対する治療効果の検出
【0105】
［１２０］．（１）マウスに３日に１回腫瘍体積モニタリングを行い、ノギスを用いて腫瘍の縦径と横径の大きさを測定して記録し、皮下移植黒色腫の最長径と最短径を測定し、腫瘍体積＝０．５２×長さ×幅×幅という式に従って腫瘍体積を計算し、腫瘍成長曲線をプロットした。
【0106】
［１２１］．（２）マウスの精神状態、活動レベル、毛の光沢、及び食欲を定期的にモニターし、副作用の有無を観察した。マウスの体重を検出した。生存期間曲線をプロットした。
【0107】
［１２２］．（３）治療２１日後、一部のマウスを麻酔して頸椎脱臼で殺した。マウスの脾臓、腫瘍流入領域リンパ節、リンパ節、及び腫瘍を分離し、それぞれＨＥ染色及びフローサイトメトリーを行った。
【実施例2】
【0108】
［１２３］．実施例２
【0109】
［１２４］．実験結果
【0110】
［１２５］．１．ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞のＧＭ－ＣＳＦ分泌能力の増強
【0111】
［１２６］．従来のＣＡＲ－Ｔ細胞はＭＯＣＫ Ｔ細胞が活性化前に分泌したＧＭ－ＣＳＦと有意差はなかったが、予想通り、ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞から分泌されたＧＭ－ＣＳＦは従来のＣＡＲ－Ｔ細胞よりも有意に高かった（Ｐ＜０．００１）（図２）。
【0112】
［１２７］．２．ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞の殺傷活性の増強
【0113】
［１２８］．Ｈｅｒ２－ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞は、Ｈｅｒ２タンパク質を天然に発現するＳＫ－ＯＶ３細胞に対する殺傷効率がＨｅｒ２－ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも有意に高く、且、殺傷効率がエフェクター：標的比の増加とともに増強した。Ｈｅｒ２－ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞は、エフェクター：標的比が１：１の時に、ＳＫ－ＯＶ３に対する殺傷効率が３０％に達することができ、Ｈｅｒ２－ＣＡＲ－Ｔ細胞群よりも有意に高かった（Ｐ＜０．００１）。Ｈｅｒ２－ＣＡＲ－Ｔ細胞群は、エフェクター：標的比が２．５：１の時に、殺傷効率が３０％にしか達することができなかった。Ｈｅｒ２－ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞は、エフェクター：標的比が５：１の時に、殺傷効率が８０％に近く、Ｈｅｒ２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷効率よりも有意に６０％高かった（図３）。
【0114】
［１２９］．Ｍｅｓｏを標的としたＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ（Ｍｅｓｏ－ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ）細胞の標的陽性腫瘍細胞に対する殺傷効率を検出した。
【0115】
［１３０］．Ｍｅｓｏ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ペンシルバニア大学とノバルティス社によって開発されたＭｅｓｏを標的としたＣＡＲ－Ｔ細胞療法である。また、Ｍｅｓｏ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ノバルティス社が固形腫瘍向けに発売した最初のＣＡＲ－Ｔ細胞製品でもあり、適応症は、卵巣がん、肺がん、及び膵臓がんを含む。
【0116】
［１３１］．その結果、Ｍｅｓｏ－ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞は、ＳＫ－ＯＶ３－Ｍｅｓｏに対する殺傷効率がＭｅｓｏ－ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも有意に高く、且、殺傷効率がエフェクター：標的比の増加とともに増強したことが示された（図４）。以上の結果から、ＣＡＲ－ＧＭ－ＣＳＦの高発現が、標的Ｍｅｓｏに対して有効であるだけでなく、異なる標的を持つＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ殺傷効率を増強できたことが示された。
【0117】
［１３２］．３．ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞が腫瘍細胞を殺傷する時の、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－２の分泌能力の増強
【0118】
［１３３］．ＣＡＲ－Ｔ細胞が腫瘍細胞を殺傷する時の上清中のサイトカインの分泌を検出した。ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞が腫瘍細胞に接触して活性化された時、ＧＭ－ＣＳＦの分泌能力が上昇し、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞よりもＧＭ－ＣＳＦの分泌能力が強かった（Ｐ＜０．０１）（図５）。エフェクター：標的比が５：１の時にＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞から分泌されたＩＦＮ－γがＣＡＲ－Ｔ細胞の４．５倍であり、異なるエフェクター：標的比でＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞が腫瘍細胞に接触した時に分泌されたＩＦＮ－γがいずれもＣＡＲ－Ｔ細胞よりも有意に高かった（Ｐ＜０．００１）（図６）。加えて、異なるエフェクター：標的比でＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞が腫瘍細胞を殺傷した時に分泌されたＩＬ－２もいずれも有意に増強した（図７）。
【0119】
［１３４］．４．ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞の卵巣がんに対する治療効果の増強
【0120】
［１３５］．従来のＣＡＲ－Ｔ細胞は、マウスの腫瘍成長を抑制することができた。治療後１４日目に、１匹のマウスの腫瘍が退縮したが、２１日目に、そのマウスの腫瘍が再発した。一方、ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞治療を受けた１４日目に、２匹のマウスの腫瘍が完全に退縮したとともに、１匹のマウスの腫瘍が基本的に退縮したが、２１日目になっても、退縮した２匹のマウスの腫瘍が再発せず、残りの３匹のマウスの腫瘍量が非常に小さく、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞で治療したマウスの腫瘍よりも有意に小さかった（図８）。以上の結果から、ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞が従来のＣＡＲ－Ｔ細胞よりも有意な生体内抗腫瘍効果を有したことが示された。
【0121】
［１３６］．５．免疫系が健全なマウスにおけるＨｅｒ２高発現の皮下移植黒色腫に対するＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞の効果の増強
【0122】
［１３７］．ＣＡＲ－Ｔ細胞がＢ１６Ｆ１０－Ｈｅｒ２皮下移植黒色腫の成長を有意に抑制する作用がなく、マウスの生存期間を延長することもできなかったが、ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞治療を受けることでマウスの皮下移植黒色腫の成長を有意に抑制することができた（Ｐ＜０．０５）（図９）。マウスの生存期間を有意に延長した（図１０）。
【0123】
［１３８］．６．ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞の固形腫瘍の内部への浸潤能力の増強
【0124】
［１３９］．マウスが治療を受けた２４日目に、マウスの腫瘍とリンパ節を分離して単細胞懸濁液として調製した後、フローサイトメトリーによってマウスの腫瘍とリンパ節内のＣＡＲ－Ｔ細胞の割合を検出した。その結果、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞治療群では腫瘍におけるＣＡＲ＋Ｔ細胞がＣＤ３＋Ｔ細胞の１．２％を占めたが、ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞治療群では腫瘍におけるＣＡＲ＋Ｔ細胞がＣＤ３＋Ｔ細胞の２．４％を占め、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞治療群の２倍であり、その差が統計学的に有意であったことが示された（Ｐ＜０．０１）。腫瘍流入領域リンパ節におけるＣＡＲ＋Ｔ細胞の割合を分析しても同様の結果が得られた。従来のＣＡＲ－Ｔ細胞治療群では腫瘍流入領域リンパ節におけるＣＡＲ＋Ｔ細胞がわずかＣＤ３＋Ｔ細胞の０．０４％を占めたが、ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞治療群ではマウスの腫瘍流入領域リンパ節におけるＣＡＲ＋Ｔ細胞がＣＤ３＋Ｔ細胞の０．４％を占め、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞治療群の１０倍であり、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞治療群よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０１）（図１１）。
【0125】
［１４０］．ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞のヒト腫瘍組織への浸潤能力をさらに検出するために、ＮＳＧマウスの腹腔内腫瘍の治療後２８日目に、腹腔内の残存腫瘍を採取して免疫蛍光染色を行うことでＣＤ３＋Ｔ細胞の浸潤能力を検出した。その結果、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療を受けたマウスの腫瘍におけるヒト由来ＣＤ３＋Ｔ細胞が腫瘍の辺縁部にのみ凝集し、腫瘍におけるＴ細胞が少なかったことが示された。また、ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞治療を受けたマウスの腫瘍におけるヒト由来ＣＤ３＋Ｔ細胞が腫瘍の内部へ浸潤することができ、腫瘍の内部組織におけるＣＤ３＋Ｔ細胞が有意に増加したことから、ＧＭ－ＣＳＦの高発現がＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷活性を増強するほか、ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍の内部への浸潤能力を増強できたことも示された（図１２）。以上の結果から、ＧＭ－ＣＳＦの高発現がＣＡＲ－Ｔ細胞の浸潤能力を増強し、ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞がより効果的に腫瘍とリンパ節に内に入ってその機能を発揮できたことが示された。
【0126】
［１４１］．７．ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞による内因性Ｔ細胞の活性化
【0127】
［１４２］．マウスの腫瘍細胞の中でＣＤ４５．２＋内因性免疫細胞を分析し、内因性免疫細胞の浸潤能力を分析した。その結果、ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞治療群ではマウスの腫瘍におけるＣＤ４５．２＋免疫細胞が８％を占めたが、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療群ではＣＤ４５．２＋免疫細胞がわずか５％であったことから、ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞治療群ではマウスの腫瘍の内部への免疫細胞の浸潤能力がＣＡＲ－Ｔ細胞治療群よりも有意に良好であったことが示された（Ｐ＜０．０５）（図１３）。
【0128】
［１４３］．ＣＤ４５．２＋内因性免疫細胞の中でＣＤ３＋Ｔリンパ球を分析した。その結果、ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞治療群ではマウスの腫瘍におけるＣＤ３＋Ｔリンパ球がＣＤ４５．２＋細胞の１１％を占めたが、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療群ではＣＤ３＋Ｔリンパ球がわずか５％を占めたことから、ＧＭ－ＣＳＦの高発現が、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療を受けたマウスの腫瘍における内因性ＣＤ３＋Ｔ細胞の割合を有意に増加したことが示された（Ｐ＜０．０１）（図１４）。
【0129】
［１４４］．８．ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞によるＤＣ細胞の腫瘍への走化
【0130】
［１４５］．ＣＤ４５．２＋細胞の中でＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞を分析した。次に、この部分の細胞の中からＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｈｉＤＣ細胞を分析した。その結果、ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞治療群では腫瘍におけるＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｈｉＤＣ細胞の占める割合が、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞治療群よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０１）（図１５）ことから、ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞治療群では腫瘍における成熟ＤＣ細胞がより多かったことが示された。
【0131】
［１４６］．９．ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞による腫瘍細胞のリンパ節転移の抑制
【0132】
［１４７］．Ｂ１６Ｆ１０はマウス黒色腫高転移細胞株である。本発明のチームは、ＣＡＲ－Ｔ細胞とＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞を用いてＢ１６Ｆ１０－Ｈｅｒ２皮下移植黒色腫モデルを治療した。流入領域リンパ節のＨＥ染色結果から、ＰＢＳ治療群では大量のメラニン斑が認められ、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療群では少量のメラニン斑が認められ、ＣＡＲ－ＧＭ－Ｔ細胞治療群では大量のリンパ球が認められたがメラニン斑がなかったことが示された。以上の結果から、治療を受けなかったマウスでは大量の腫瘍細胞がリンパ節に転移し、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療が腫瘍細胞の転移の一部を抑制でき、ＧＭ－ＣＳＦの高発現がＣＡＲ－Ｔ細胞による腫瘍細胞のリンパ節転移の抑制能力を増強できたことが示された（図１６）。
【0133】
［１４８］．以上、本発明の実施形態を添付図面と共に説明したが、本発明は、単に模式的なものであって限定するものではなく、本発明の目的及び請求項によって保護される範囲から逸脱することなく、当業者が本発明に触発されて作り得る多くの形態があり、それらは全て本発明の保護範囲に入るものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【国際調査報告】