特表 2024-515334 Ｔ細胞をＮＫ様細胞にリプログラミングする誘導剤およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-08

(54)【発明の名称】Ｔ細胞をＮＫ様細胞にリプログラミングする誘導剤およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0783 20100101AFI20240401BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240401BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240401BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0783

A61K35/17

A61P37/02

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023567120

(86)(22)【出願日】2021-06-24

(85)【翻訳文提出日】2023-10-31

(86)【国際出願番号】 CN2021102023

(87)【国際公開番号】W WO2022246942

(87)【国際公開日】2022-12-01

(31)【優先権主張番号】202110573668.5

(32)【優先日】2021-05-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523412038

【氏名又は名称】昭泰英基生物医薬（香港）有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】110002860

【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】李 鵬

(72)【発明者】

【氏名】李 揺

(72)【発明者】

【氏名】周 林付

(72)【発明者】

【氏名】湯 朝陽

(72)【発明者】

【氏名】秦 楽

(72)【発明者】

【氏名】姚 瑶

(72)【発明者】

【氏名】胡 朶

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065BC11

4B065BD25

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB64

4C087NA14

4C087ZB02

4C087ZB07

(57)【要約】

本願は、Ｔ細胞をＮＫ様細胞にリプログラミングする誘導剤およびその使用を提供する。前記誘導剤は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、またはヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２阻害剤のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含む。本願は、誘導剤を用いてＴ細胞のメチル化レベルの低下を誘導し、ヒストンの脱アセチル化およびヒストンのメチル化を抑制し、ＮＫ細胞受容体およびサイトカインを発現し、インビトロでＴ細胞をＮＫ様細胞にリプログラミングするという目的を実現し、方法が簡単で、効率が高く、周期が短く、調製されたＮＫ様細胞のインビトロ殺傷効果が顕著であり、細胞免疫治療分野で重要な意義を有する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、またはヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２阻害剤のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含む、
Ｔ細胞をＮＫ様細胞にリプログラミングする誘導剤。

【請求項2】

前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１阻害剤を含み、デシタビンおよび／またはＧＳＫ－３４８４８６２であることが好ましい、
請求項１に記載の誘導剤。

【請求項3】

前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、Ｍｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔ、Ｇｉｖｉｎｏｓｔａｔ、またはＥｎｔｉｎｏｓｔａｔのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含む、
請求項１または２に記載の誘導剤。

【請求項4】

前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤は、Ｔａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔおよび／またはＧＳＫ１２６を含む、
請求項１～３のいずれか１項に記載の誘導剤。

【請求項5】

前記誘導剤は、さらに医薬的に許容される補助剤を含む、
請求項１～４のいずれか１項に記載の誘導剤。

【請求項6】

前記補助剤は、担体、希釈剤、賦形剤、充填剤、粘着剤、湿潤剤、崩壊剤、乳化剤、溶解補助剤、可溶化剤、浸透圧調整剤、界面活性剤、コーティング材、着色剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、抗菌剤、または緩衝剤のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含む、
請求項５に記載の誘導剤。

【請求項7】

活性化されたＴ細胞と請求項１～６のいずれか１項に記載の誘導剤とを共培養し、ＮＫ様細胞を取得することを含む、
Ｔ細胞をＮＫ様細胞にリプログラミングする方法。

【請求項8】

前記誘導剤は、デシタビン、ＧＳＫ－３４８４８６２、Ｍｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔ、Ｇｉｖｉｎｏｓｔａｔ、Ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ、Ｔａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔ、またはＧＳＫ１２６のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含み、
好ましくは、前記デシタビンの終濃度は０．０５～０．５μＭであり、
好ましくは、前記ＧＳＫ－３４８４８６２の終濃度は０．５～８μＭであり、
好ましくは、前記Ｍｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔの終濃度は０．１～０．５μＭであり、
好ましくは、前記Ｇｉｖｉｎｏｓｔａｔの終濃度は０．０５～１μＭであり、
好ましくは、前記Ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔの終濃度は０．０５～１μＭであり、
好ましくは、前記Ｔａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔの終濃度は０．１～５μＭであり、
好ましくは、前記ＧＳＫ１２６の終濃度は０．０５～１μＭである、
請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記共培養の時間は３～１０日間である、
請求項７または８に記載の方法。

【請求項10】

活性化されたＴ細胞に、終濃度０．０５～０．５μＭのデシタビン、終濃度０．５～８μＭのＧＳＫ－３４８４８６２、終濃度０．０５～１μＭのＧＳＫ１２６、終濃度０．１
～０．５μＭのＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔ、終濃度０．０５～１μＭのＧｉｖｉｎｏｓｔａｔ、終濃度０．０５～１μＭのＥｎｔｉｎｏｓｔａｔ、または終濃度０．１～５μＭのＴａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを加え、３～１０日間培養し、毎日に半数の液を交換し、ＮＫ様細胞を取得することを含む、
請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

ＮＫ細胞受容体およびＴ細胞受容体を発現し、
好ましくは、前記ＮＫ細胞受容体は、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫＧ２Ｄのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含む、
請求項７～１０のいずれか１項に記載の方法で調製されたＮＫ様細胞。

【請求項12】

請求項１１に記載のＮＫ様細胞を含む医薬組成物であって、
好ましくは、前記医薬組成物は、さらに医薬的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含む、
医薬組成物。

【請求項13】

請求項１～６のいずれか１項に記載の誘導剤、請求項１１に記載のＮＫ様細胞、または請求項１２に記載の医薬組成物の、細胞免疫治療薬の調製における使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、生物医薬技術分野に属し、Ｔ細胞をＮＫ様細胞にリプログラミングする誘導剤およびその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ＮＫ細胞は、天然免疫システムの重要な構成部分であり、活性化することなく異常細胞を殺傷することができ、且つ、殺傷効果に組織適合性複合体（ＭＨＣ）の制限性がない。ＮＫ細胞は、人体内の最も有効で、活力が最も強い免疫細胞の１つであり、ＮＫｐ４６等のＮＫ細胞受容体（ＮＣＲ）によりウイルスおよびウイルス感染細胞を識別し、複数種のウイルスの免疫応答反応に関与する。しかし、人体内に自然に存在するＮＫ細胞の数および再生能力が限られているため、細胞の由来は、ＮＫ細胞の腫瘍治療への応用を制限する主な障害となる。Ｔ細胞の表面のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、ウイルス感染細胞または外来抗原を識別して反応する。ＮＫ様細胞は、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫＧ２Ｄ等のＮＣＲ受容体を発現できるだけでなく、機能が完全なＴＣＲ受容体を発現することもでき、Ｔ細胞とＮＫ細胞の機能を併有する。ＮＫ様細胞は、正常なＮＫ細胞よりも強い殺傷活性および広い抗腫瘍効果を有するとともに、インビトロ条件で大量に増殖することもでき、インビトロで増殖したＮＫ様細胞は、インビボで３週間以上生存し続けることができる。Ｔ細胞をＮＫ様細胞にリプログラミングし、腫瘍および関連疾患の免疫治療に全く新しい細胞源を提供し、腫瘍細胞免疫治療の発展を大きく推進する。

【0003】

現在、Ｔ細胞のリプログラミング方法は、主にトランスジェニック手段に基づき、レンチウイルストランスフェクション、ＰＢシステムエレクトロトランスフェクション、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９システムノックアウト等を含むが、これらの方法に多くの欠陥があり、例えば、レンチウイルストランスフェクション方式は処理周期が長く、プロセスが煩雑であり、エレクトロトランスフェクション方式は、大量の初代Ｔ細胞を損失し、効率が低く、遺伝子の過剰発現またはノックアウト過程にオフターゲットの確率があり、且つ、以上の３種の方式は、いずれも規模化応用を実現しにくく、依然としてインビトロでＮＫ細胞を大規模に取得する効果を根本的に実現することができない。

【0004】

化合物薬物に基づいてインビトロでＴ細胞のリプログラミングを実現してＮＫ様細胞を大規模に調製できるか否かは、従来技術において、まだ関連する研究報道がない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本願は、Ｔ細胞をＮＫ様細胞にリプログラミングする誘導剤およびその使用を提供し、誘導剤を用いてＴ細胞を処理することにより、Ｔ細胞の脱メチル化レベルを低減させ、ヒストンのアセチル化およびメチル化のプロセスが抑制され、且つＮＫ細胞の表面受容体を発現し、サイトカインを分泌し、インビトロでＴ細胞をＮＫ様細胞にリプログラミングするという目的を実現する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

態様１において、本願は、
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、またはヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２阻害剤のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含む、
Ｔ細胞をＮＫ様細胞にリプログラミングする誘導剤を提供する。

【0007】

本願において、低分子薬物ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤を用いてＴ細胞を処理し、Ｔ細胞にＮＫ細胞受容体を発現させ、インビトロでＴ細胞をＮＫ様細胞にリプログラミングするという目的を実現する。

【0008】

好ましくは、前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１阻害剤を含み、デシタビンおよび／またはＧＳＫ－３４８４８６２であることが好ましい。

【0009】

本願において、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １、ＤＮＭＴ１）は、人体の最も重要なメチルトランスフェラーゼであり、さらに細胞周期の調節及び腫瘍抑制遺伝子の発現の制御の能力を有する。デシタビン（ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ、ＤＡＣ）は、シトシン類似物であり、特異的なメチルトランスフェラーゼ阻害剤に属し、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼと共有結合して酵素活性を抑制し、ＤＮＡを脱メチル化させ、癌抑制遺伝子を再発現させることができる。ＧＳＫ－３４８４８６２は、別のＤＮＭＴ１非共有阻害剤であり、ＤＮＡの低メチル化を誘導することにより抗癌作用を果たす。

【0010】

本願において、デシタビンおよび／またはＧＳＫ－３４８４８６２を用いてＴ細胞のメチル化レベルの低下を誘導し、ＮＫ細胞を発現して関連分子を殺傷し、インビトロでＴ細胞をＮＫ様細胞にリプログラミングするという目的を実現する。

【0011】

好ましくは、前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、Ｍｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔ、Ｇｉｖｉｎｏｓｔａｔ、またはＥｎｔｉｎｏｓｔａｔのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含む。

【0012】

ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）は、染色体の構造修飾および遺伝子発現の制御で重要な作用を果たし、ヌクレオソームの弛緩を抑制することにより、各転写因子及び協同転写因子とＤＮＡサイトとの結合を抑制することができ、他のクロマチンモジュレーターと相互作用し、エピジェネティックス過程を調節することができる。Ｍｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔ、Ｇｉｖｉｎｏｓｔａｔ（ＩＴＦ２３５７）およびＥｎｔｉｎｏｓｔａｔ（ＭＳ－２７５）は、いずれもＨＤＡＣの新規の異質選択性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）阻害剤である。

【0013】

好ましくは、前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤は、Ｔａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔおよび／またはＧＳＫ１２６を含む。

【0014】

ヒストンメチルトランスフェラーゼＺｅｓｔｅ相同タンパク質２エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ ｚｅｓｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇ ２、ＥＺＨ２）は、ポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）の酵素触媒サブユニットであり、ヌクレオソームのヒストンＨ３の２７位のリシン（Ｈ３Ｋ２７）をメチル化修飾することにより、下流の標的遺伝子のサイレンシングを引き起こし、細胞アポトーシス、細胞周期および細胞分化等の重要な生物学的過程で重要な作用を果たす。Ｔａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔは、経口ＥＺＨ２低分子阻害剤であり、ＧＳＫ１２６（ＧＳＫ２８１６１２６）は、新規な選択性酵素活性阻害剤である。

【0015】

好ましくは、前記誘導剤は、さらに医薬的に許容される補助剤を含む。

【0016】

好ましくは、前記補助剤は、担体、希釈剤、賦形剤、充填剤、粘着剤、湿潤剤、崩壊剤、乳化剤、溶解補助剤、可溶化剤、浸透圧調整剤、界面活性剤、コーティング材、着色剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、抗菌剤、または緩衝剤のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含む。

【0017】

態様２において、本願は、
活性化されたＴ細胞と態様１に記載の誘導剤とを共培養し、ＮＫ様細胞を取得することを含む、
Ｔ細胞をＮＫ様細胞にリプログラミングする方法を提供する。

【0018】

好ましくは、前記誘導剤は、デシタビン、ＧＳＫ－３４８４８６２、Ｍｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔ、Ｇｉｖｉｎｏｓｔａｔ、Ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ、Ｔａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔ、またはＧＳＫ１２６のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含む。

【0019】

好ましくは、前記デシタビンの終濃度は０．０５～０．５μＭであり、例えば、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、または０．５μＭであってもよい。

【0020】

好ましくは、前記ＧＳＫ－３４８４８６２の終濃度は０．５～８μＭであり、例えば、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、または８μＭであってもよい。

【0021】

好ましくは、前記Ｍｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔの終濃度は０．１～０．５μＭであり、例えば、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、または０．５μＭであってもよい。

【0022】

好ましくは、前記Ｇｉｖｉｎｏｓｔａｔの終濃度は０．０５～１μＭであり、例えば、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、または１μＭであってもよい。

【0023】

好ましくは、前記Ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔの終濃度は０．０５～１μＭであり、例えば、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、または１μＭであってもよい。

【0024】

好ましくは、前記Ｔａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔの終濃度は０．１～５μＭであり、例えば、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、または５μＭであってもよい。

【0025】

好ましくは、前記ＧＳＫ１２６の終濃度は０．０５～１μＭであり、例えば、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、または１μＭであってもよい。

【0026】

好ましくは、前記共培養の時間は３～１０日間であり、例えば、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、または１０日間であってもよく、５日間であることが好ましい。

【0027】

好ましくは、前記Ｔ細胞をＮＫ様細胞にリプログラミングする方法は、
活性化されたＴ細胞に、終濃度０．０５～０．５μＭのデシタビンまたは終濃度０．５～８μＭのＧＳＫ－３４８４８６２、終濃度０．０５～１μＭのＧＳＫ１２６、終濃度０．１～０．５μＭのＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔ、終濃度０．０５～１μＭのＧｉｖｉｎｏｓｔａｔ、終濃度０．０５～１μＭのＥｎｔｉｎｏｓｔａｔまたは終濃度０．１～５μＭのＴａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを加え、３～１０日間培養し、毎日に半数の液を交換し、ＮＫ様細胞を取得することを含む。

【0028】

態様３において、本願は、ＮＫ細胞受容体およびＴ細胞受容体を発現する態様２に記載の方法で調製されたＮＫ様細胞を提供する。

【0029】

好ましくは、前記ＮＫ細胞受容体は、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫＧ２Ｄのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含む。

【0030】

態様４において、本願は、態様３に記載のＮＫ様細胞を含む医薬組成物を提供する。

【0031】

好ましくは、前記医薬組成物は、さらに医薬的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含む。

【0032】

態様５において、本願は、態様１に記載の誘導剤、態様３に記載のＮＫ様細胞、または態様４に記載の医薬組成物の、細胞免疫治療薬の調製における使用を提供する。

【発明の効果】

【0033】

従来技術と比べ、本願は、以下のような有益な効果を有する。

【0034】

（１）本願は、低分子薬物ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、またはヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２阻害剤のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを用いてＴ細胞を処理し、Ｔ細胞にＮＫ細胞受容体を発現させ、インビトロでＴ細胞をＮＫ様細胞にリプログラミングするという目的を実現する。

【0035】

（２）本願は、上記誘導剤を用いて誘導されたリプログラミングＴ細胞は、ＮＫ細胞受容体ＮＫｐ４６およびＮＫｐ３０を著しく高発現し、インビトロ殺傷効果が顕著であり、安定したＴ細胞とＮＫ細胞の二重機能を有し、前記リプログラミングＴ細胞は、ＩＦＮ－γおよびグランザイムＢ等のサイトカインを分泌し、免疫効果を生じることもできる。

【0036】

（３）本願のＮＫ様細胞の調製方法は、プロセスが簡単で、リプログラミング効率が高く、Ｔ細胞のインビトロリプログラミング周期を著しく短縮し、初代Ｔ細胞の利用率を高め、大規模なプロセス普及に適し、細胞免疫治療分野で重要な意義を有する。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1A】ＤＭＳＯで処理されたＴ細胞のうちのＣＤ４ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図1B】ＤＡＣによって誘導されたＴ細胞のうちのＣＤ４ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図2A】ＤＭＳＯで処理されたＴ細胞のうちのＣＤ８ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図2B】ＤＡＣによって誘導されたＴ細胞のうちのＣＤ８ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図3A】ＤＭＳＯで処理されたＴ細胞のうちのＣＤ４ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図3B】ＧＳＫ－３４８４８６２によって誘導されたＴ細胞のうちのＣＤ４ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図4A】ＤＭＳＯで処理されたＴ細胞のうちのＣＤ８ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図4B】ＧＳＫ－３４８４８６２によって誘導されたＴ細胞のうちのＣＤ８ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図5A】ＤＭＳＯで処理されたＴ細胞のうちのＣＤ４ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図5B】ＤＡＣとＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって共同誘導されたＴ細胞のうちのＣＤ４ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図6A】ＤＭＳＯで処理されたＴ細胞のうちのＣＤ８ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図6B】ＤＡＣとＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって共同誘導されたＴ細胞のうちのＣＤ８ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図7A】ＤＭＳＯで処理されたＴ細胞のうちのＣＤ４ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図7B】ＧＳＫ－３４８４８６２とＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって共同誘導されたＴ細胞のうちのＣＤ４ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図8A】ＤＭＳＯで処理されたＴ細胞のうちのＣＤ８ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図8B】ＧＳＫ－３４８４８６２とＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって共同誘導されたＴ細胞のうちのＣＤ８ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図9A】ＤＭＳＯで処理されたＴ細胞のうちのＣＤ４ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図9B】ＧＳＫ－３４８４８６２によって誘導されたＴ細胞のうちのＣＤ４ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図10A】ＤＭＳＯで処理されたＴ細胞のうちのＣＤ８ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図10B】ＧＳＫ－３４８４８６２によって誘導されたＴ細胞のうちのＣＤ８ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図11A】Ｔａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔで処理されたＴ細胞のうちのＣＤ４ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図11B】ＧＳＫ１２６によって誘導されたＴ細胞のうちのＣＤ４ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図12A】Ｔａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔで処理されたＴ細胞のうちのＣＤ８ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図12B】ＧＳＫ１２６によって誘導されたＴ細胞のうちのＣＤ８ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図13A】ＴａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔとＧＳＫ－３４８４８６２によって共同誘導されたＴ細胞のうちのＣＤ４ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図13B】ＧＳＫ１２６とＧＳＫ－３４８４８６２によって共同誘導されたＴ細胞のうちのＣＤ４ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図14A】ＴａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔとＧＳＫ－３４８４８６２によって共同誘導されたＴ細胞のうちのＣＤ８ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図14B】ＧＳＫ１２６とＧＳＫ－３４８４８６２によって共同誘導されたＴ細胞のうちのＣＤ８ Ｔ細胞によるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現状況の図である。

【図15A】ＧＳＫ－３４８４８６２によって誘導された、ＤＡＣによって誘導された、Ｍｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって誘導された、ＧＳＫ－３４８４８６２およびＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって共同誘導された、ＤＡＣおよびＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって共同誘導されたＴ細胞、およびＤＭＳＯで処理されたＴ細胞のＫ５６２に対するインビトロ殺傷結果の図である。

【図15B】ＧＳＫ－３４８４８６２によって誘導された、Ｔａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔによって誘導された、ＧＳＫ１２６によって誘導された、ＧＳＫ－３４８４８６２およびＴａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔによって共同誘導された、ＧＳＫ－３４８４８６２およびＧＳＫ１２６によって共同誘導されたＴ細胞、およびＤＭＳＯで処理されたＴ細胞のＫ５６２に対するインビトロ殺傷結果の図である。

【図16A】ＤＡＣによって誘導されたＴ細胞とＫ５６２を共培養してＩＦＮ－γを分泌するレベルの結果図である。

【図16B】ＤＡＣによって誘導されたＴ細胞とＫ５６２を共培養してグランザイムＢを分泌するレベルの結果図である。

【図17A】ＧＳＫ－３４８４８６２によって誘導されたＴ細胞とＫ５６２を共培養してＩＦＮ－γを分泌するレベルの結果図である。

【図17B】ＧＳＫ－３４８４８６２によって誘導されたＴ細胞とＫ５６２を共培養してグランザイムＢを分泌するレベルの結果図である。

【図18A】ＤＡＣとＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって共同誘導されたＴ細胞とＫ５６２を共培養してＩＦＮ－γを分泌するレベルの結果図である。

【図18B】ＤＡＣとＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって共同誘導されたＴ細胞とＫ５６２を共培養してグランザイムＢを分泌するレベルの結果図である。

【図19A】ＧＳＫ－３４８４８６２とＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって共同誘導されたＴ細胞とＫ５６２を共培養してＩＦＮ－γを分泌するレベルの結果図である。

【図19B】ＧＳＫ－３４８４８６２とＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって共同誘導されたＴ細胞とＫ５６２を共培養してグランザイムＢを分泌するレベルの結果図である。

【発明を実施するための形態】

【0038】

本願で使用される技術手段およびその効果を更に説明するために、以下、実施例および図面を参照しながら本願について更に説明する。ここで説明する具体的な実施例は、本願を解釈するためのものに過ぎず、本願を限定するものではないことが理解できる。

【0039】

実施例で具体的な技術または条件が明記されていない場合、本分野内の文献で説明された技術または条件に、あるいは製品の説明書に従って行う。使用される試薬または機器についてメーカーが明記されていないものは、いずれも正規のルートから購入できる通常の製品である。

【0040】

材料：
臍帯血は、広東省臍帯血造血幹細胞バンクに由来し、
Ｐａｎ Ｔ細胞分離キットは、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カナダ）から購入され、
Ｔｒａｎｓａｃｔは、ミルテニーバイオテク株式会社から購入され、
デシタビンは、Ｓｅｌｌｅｃｋ（中国、上海セレックバイオテック株式会社）から購入され、
ＧＳＫ－３４８４８６２、ＧＳＫ１２６、Ｍｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔ、Ｇｉｖｉｎｏｓｔａｔ、ＥｎｔｉｎｏｓｔａｔおよびＴａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔは、ＭＣＥ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ）社から購入され、
ＣＤ３ ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＤ４ ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＣＤ８ ＦＩＴＣ、ＮＫｐ３０ ＰＥおよびＮＫｐ４６ ＡＰＣは、いずれもＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（米国）から購入され、
Ｋ５６２細胞は、ＡＴＣＣに由来し、
ＥＬＩＳＡ検出試薬は、Ｄａｋｅｗｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ有限公司から購入された。

【0041】

実施例１ ヒト臍帯血の初代Ｔ細胞の分離およびインビトロ培養
本実施例は、Ｆｉｃｏｌｌ－ｈｙｐａｑｕｅ（フィコール－ハイペイク）密度勾配遠心分離法で臍帯血から単核細胞（ＵＣＢＭＣ）を分離し、４×１０^７個のＣＤ３陽性ＵＣＢＭＣを一晩培養し、細胞密度が２×１０^６／ｍＬであり、残りのＵＣＢＭＣを凍結保存し、Ｐａｎ Ｔ細胞分離キットを用いてＴ細胞分取を行い、しばらく培養して４×１０^７個
以上のＣＤ３陽性Ｔ細胞を取得し、生存率≧７０％であり、細菌、真菌、マイコプラズマ等の外来微生物による汚染がなかった。

【0042】

実施例２ 低分子薬物でＴ細胞のリプログラミングを誘導した
（１）Ｔｒａｎｓａｃｔで３６時間活性化したＴ細胞を取り、３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、ＩＭＤＭ＋５％ＦＢＳ＋１％二重抗生物質（１００×ペニシリン－ストレプトマイシンの混合溶液）＋ＩＬ２（３００ Ｕ）を用いてＴ細胞を再懸濁し、Ｔ細胞密度を（２～３）×１０^５個／ｍＬに調整した。

【0043】

（２）再懸濁したＴ細胞に各グループの低分子阻害剤薬物をそれぞれ加え、各薬物の添加の終濃度は表１に示す。毎日に半数の液を交換し、液交換後の体積に基づいて新しい薬物を追加し、初回投与をＤａｙ０とし、Ｄａｙ５まで継続的に投与すると、３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離して液交換し、その後、ＩＭＤＭ＋５％ＦＢＳ＋１％二重抗生物質（１００×ペニシリン－ストレプトマイシンの混合溶液）で培養し続けた。

【0044】

【表1】

【0045】

実施例３ フローサイトメトリー法でリプログラミングＴ細胞の表現型を検出した
（１）ＤＡＣによって誘導された後、ＧＳＫ－３４８４８６２によって誘導された後、ＤＡＣとＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって共同誘導された後、およびＧＳＫ－３４８４８６２とＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって共同誘導された後のＤａｙ６のＴ細胞および未処理のＴ細胞をそれぞれ２００μＬ取り、４００ｇで４ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを捨てた後、５０μＬのリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）を加えて細胞を再懸濁し、その後、ＣＤ３
ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＤ４ ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＣＤ８ ＦＩＴＣ、ＮＫｐ３０ ＰＥおよびＮＫｐ４６ ＡＰＣをそれぞれ０．５μＬ加え、４℃において遮光下で３０ｍｉｎインキュベートし、５００μＬのＰＢＳを加えて抗体を希釈し、４００ｇで４ｍｉｎ遠心分離し、上清を慎重に捨て、３００μＬのＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、フローチューブに移し、装置で検出した。

【0046】

（２）ＢＤ－ｆｌｏｗｃｙｔｏ分析ソフトウェアを用いてデータ分析を行い、チューブ毎に１００００個の細胞を収集し、ＮＫｐ３０の著しい増加の現れおよびＮＫｐ４６陽性の細胞群の現れをリプログラミングが成功したマークとし、陽性Ｔ細胞の百分率を計算し
た。

【0047】

図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａおよび図２Ｂに示すように、ＤＡＣ誘導グループ内のＣＤ４ Ｔ細胞におけるＮＫｐ３０の発現率は約８３．２％であったが、ＤＭＳＯグループ内のＣＤ４ Ｔ細胞ＮＫｐ３０の発現率は約７．７４％であり、デシタビン誘導グループ内のＣＤ８ Ｔ細胞ＮＫｐ４６の発現率は約１１．２％であり、ＮＫｐ３０の発現率は約６０．５％であったが、ＤＭＳＯグループ内のＣＤ８ Ｔ細胞ＮＫｐ４６の発現率は約０．２６％で、ＮＫｐ３０の発現率は約１２．２％であった。デシタビンはＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６を発現するようにＴ細胞を誘導することができることを示した。

【0048】

図３Ａ、図３Ｂ、図４Ａおよび図４Ｂに示すように、ＧＳＫ－３４８４８６２誘導グループ内のＣＤ４ Ｔ細胞ＮＫｐ４６の発現率は約５．１６％であり、ＮＫｐ３０の発現率は約８１．４％であったが、ＤＭＳＯグループ内のＣＤ４ Ｔ細胞ＮＫｐ３０の発現率は約７．７４％であり、ＧＳＫ－３４８４８６２誘導グループ内のＣＤ８ Ｔ細胞ＮＫｐ４６の発現率は約２１．４％であり、ＮＫｐ３０の発現率は約５０．８％であったが、ＤＭＳＯグループ内のＣＤ８ Ｔ細胞ＮＫｐ４６の発現率は約０．２６％であり、ＮＫｐ３０の発現率は約１２．２％であった。ＧＳＫ－３４８４８６２はＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６を発現するようにＴ細胞を誘導することができることを示した。

【0049】

図５Ａ、図５Ｂ、図６Ａおよび図６Ｂに示すように、ＤＭＳＯによって誘導されたＴ細胞と比べ、ＤＡＣとＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって共同誘導されたＴ細胞のうちのＣＤ４ Ｔ細胞におけるＮＫｐ３０の発現量は７．８４％であったが、ＮＫｐ４６はほとんど発現せず、また、ＤＡＣとＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって共同誘導されたＴ細胞のうちのＣＤ８ Ｔ細胞におけるＮＫｐ３０の発現量は２０．４％であったが、ＮＫｐ４６もほとんど発現しなかった。

【0050】

図７Ａ、図７Ｂ、図８Ａおよび図８Ｂに示すように、ＧＳＫ－３４８４８６２とＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって共同誘導されたＴ細胞のうちのＣＤ４ Ｔ細胞におけるＮＫｐ３０の発現量は５９．５％であり、ＮＫｐ４６の発現量は１３．４％であったが、ＣＤ８細胞におけるＮＫｐ３０の発現量は４９．６％で、ＮＫｐ４６の発現量は３７．２％であり、ＤＡＣとＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔの共同誘導の結果と比べ、ＧＳＫ－３４８４８６２とＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって誘導されたＴ細胞におけるＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の発現レベルはいずれも明らかに上昇することを示した。

【0051】

また、ＧＳＫ－３４８４８６２によって誘導された後、Ｔａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔによって誘導された後、ＧＳＫ１２６によって誘導された後、ＴａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔとＧＳＫ－３４８４８６２によって共同誘導された後、およびＧＳＫ－３４８４８６２とＧＳＫ１２６によって共同誘導された後のＤａｙ５のＴ細胞および未処理のＴ細胞に対して同じ操作を行い、フローサイトメトリー法によりリプログラミングＴ細胞の表現型を同定し、結果は、図９Ａ、図９Ｂ、図１０Ａ、図１０Ｂ、図１１Ａ、図１１Ｂ、図１２Ａ、図１２Ｂ、図１３Ａ、図１３Ｂ、図１４Ａおよび図１４Ｂに示す。図から分かるように、ＤＭＳＯと比べ、単一の阻害剤によって誘導されたＴ細胞のうちのＣＤ４およびＣＤ８のＮＫｐ４６およびＮＫｐ３０は、いずれも明らかに発現し、更に、ＧＳＫ－３４８４８６２とＴａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔおよびＧＳＫ１２６とを併用した後、誘導されたＴ細胞のうちのＣＤ４およびＣＤ８のＮＫＰ４６の発現量はいずれも明らかに上昇し、以上の結果は、単一の阻害剤（Ｔａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔ、ＧＳＫ１２６、ＧＳＫ－３４８４８６２）、または二重阻害剤（Ｔａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔ＋ｇＳＫ－３４８４８６２、ＧＳＫ－３４８４８６２＋ＧＳＫ１２６）の併用はいずれもＴ細胞のＮＫ様細胞へのリプログラミングを誘導できることを示した。

【0052】

実施例４ 低分子薬物によって誘導されたリプログラミングＴ細胞のインビトロ殺傷の検出
（１）ＧＳＫ－３４８４８６２によって誘導された、ＤＡＣによって誘導された、Ｍｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって誘導された、ＧＳＫ－３４８４８６２およびＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって共同誘導された、ＤＡＣおよびＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって共同誘導されたＴ細胞と、ＤＭＳＯで処理されたＴ細胞とをそれぞれ用い、異なるＥ：Ｔ（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ：Ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ）（１６：１、８：１、４：１、２：１、１：１、１：２、１：４）に従って１×１０^４個のＫ５６２細胞（ヒト慢性骨髄性白血病細胞）と混合し、９６ウェル細胞培養プレートに加え、グループ毎に３つのウェルを設け、且つ、腫瘍細胞を単独で加えたグループをポジティブコントロールとして設け、２５０×ｇで５ｍｉｎ遠心分離した後、３７℃、５％のＣＯ_２インキュベータに置いて２４時間共培養した。

【0053】

（２）２４時間後に、９６ウェル細胞培養プレートに１００μＬ／ウェルでルシフェラーゼ基質（１×）を加え、細胞を再懸濁して均一に混合した直後に、多機能マイクロプレートリーダーによりＲＬＵ（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）を測定し、測定時間を０．１秒とし、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の定量的な殺傷効率の評価方法の殺傷割合の計算式は、以下のとおりである。
［数１］
１００％×（対照ウェルの読取値－実験ウェルの読取値）／対照ウェルの読取値（細胞を加えないブランクグループの読取値は無視できる）

【0054】

結果は、図１５Ａに示すように、ＧＳＫ－３４８４８６２によって誘導された、ＤＡＣによって誘導された、Ｍｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって誘導された、ＧＳＫ－３４８４８６２およびＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって共同誘導された、ＤＡＣとＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって共同誘導されたＴ細胞は、いずれもヒト慢性骨髄性白血病細胞を効果的に殺傷することができる。

【0055】

また、同じ方法に従い、ＧＳＫ－３４８４８６２によって誘導された、Ｔａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔによって誘導された、ＧＳＫ１２６によって誘導された、ＧＳＫ－３４８４８６２およびＴａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔによって共同誘導された、ＧＳＫ－３４８４８６２およびＧＳＫ１２６によって共同誘導されたＴ細胞とをそれぞれ用い、且つ対照としてＤＭＳＯで処理されたＴ細胞を用いて、リプログラミングＴ細胞のＫ５６２細胞に対する殺傷能力を検出し、結果は、図１５Ｂに示す。結果は、ＧＳＫ－３４８４８６２によって誘導された、Ｔａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔによって誘導された、ＧＳＫ１２６によって誘導された、ＧＳＫ－３４８４８６２およびＴａｚｅｍｅｔｏｓｔａｔによって共同誘導された、ＧＳＫ－３４８４８６２およびＧＳＫ１２６によって共同誘導されたＴ細胞は、いずれもヒト慢性骨髄性白血病細胞を効果的に殺傷することができることを示した。

【0056】

実施例５ 低分子薬物によって誘導されたリプログラミングＴ細胞のサイトカインに対する分泌
ＤＡＣによって誘導されたＴ細胞と、ＧＳＫ－３４８４８６２によって誘導されたＴ細胞と、ＤＡＣとＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって共同誘導されたＴ細胞と、ＧＳＫ－３４８４８６２とＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって共同誘導されたＴ細胞と、ＤＭＳＯで処理されたＴ細胞とを、それぞれヒト慢性骨髄性白血病細胞Ｋ５６２と４８ｈ共培養し、ＥＬＩＳＡで上澄み中のサイトカインＩＦＮ－γおよびグランザイムＢの発現レベルを検出した。

【0057】

結果は、図１６Ａ、図１６Ｂ、図１７Ａ、図１７Ｂ、図１８Ａ、図１８Ｂ、図１９Ａおよび図１９Ｂに示すように、ＤＡＣによって誘導されたＴ細胞、ＧＳＫ－３４８４８６２
によって誘導されたＴ細胞、ＤＡＣとＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって共同誘導されたＴ細胞、およびＧＳＫ－３４８４８６２とＭｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔによって共同誘導されたＴ細胞はいずれも免疫効果を生じることができることを示した。

【0058】

上述をまとめ、本願は、デシタビンおよび／またはＧＳＫ－３４８４８６２を用いてＴ細胞をＮＫ様細胞に誘導し、方法が簡単で、効率が高く、周期が短く、大規模調製に適し、得られたＮＫ様細胞のインビトロ殺傷効果が顕著であり、安定したＴ細胞とＮＫ細胞の二重機能を有し、細胞免疫治療分野で重要な応用の見通しを有する。

【0059】

本願は、上記実施例により本願の詳細方法を説明したが、本願は上記詳細方法に限定するものではなく、すなわち、本願は上記詳細方法に依存して実施しなければならないものではないと、出願人より声明する。当業者であれば、本願に対するいかなる改良、本願の製品の各原料に対する等価的な置換および補助成分の追加、具体的な形態の選択等は、全て本願の保護範囲および開示範囲内に含まれることを理解すべきである。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図17A】

【図17B】

【図18A】

【図18B】

【図19A】

【図19B】

【国際調査報告】