特表 2024-515370 メタンまたはブタン酸化活性を有する新規タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-09

(54)【発明の名称】メタンまたはブタン酸化活性を有する新規タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/06 20060101AFI20240402BHJP

   C12N 9/04 20060101ALI20240402BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240402BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20240402BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240402BHJP

   C12P 7/16 20060101ALI20240402BHJP

   C12P 7/04 20060101ALI20240402BHJP

【ＦＩ】

C12N9/06 Z ZNA

C12N9/04 Z

C07K19/00

C07K14/47

C12N1/21

C12P7/16

C12P7/04

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023566432

(86)(22)【出願日】2022-04-15

(85)【翻訳文提出日】2023-10-27

(86)【国際出願番号】 KR2022005481

(87)【国際公開番号】W WO2022231184

(87)【国際公開日】2022-11-03

(31)【優先権主張番号】10-2021-0056794

(32)【優先日】2021-04-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518107501

【氏名又は名称】コリア ユニバーシティ リサーチ アンド ビジネス ファウンデーション

【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＢＵＳＩＮＥＳＳ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ

【住所又は居所原語表記】１４５，Ａｎａｍ－ｒｏ，Ｓｅｏｎｇｂｕｋ－ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】100167689

【弁理士】

【氏名又は名称】松本 征二

(72)【発明者】

【氏名】リー， ジー ワン

(72)【発明者】

【氏名】ユー， イェオン フワー

(72)【発明者】

【氏名】チェ， ヨー ビン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AC02

4B064AC04

4B064CA02

4B064CA19

4B064CC24

4B064CD04

4B064DA16

4B065AA01Y

4B065AA26X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA01

4B065CA05

4B065CA24

4B065CA28

4B065CA60

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA89

4H045EA60

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、メタン酸化活性を有するアンモニア酸化酵素活性ドメイン、またはブタン酸化活性を有するブタン酸化酵素活性ドメインが融合したフェリチン単量体が自己集合したタンパク質に関し、メタンまたはブタンを酸化してメタノールまたはブタノールを製造する活性を有するタンパク質、それを発現する微生物、それを活用したメタノールまたはブタノール製造用組成物、メタノールまたはブタノールの製造方法に関する。
【選択図】図５

【特許請求の範囲】

【請求項1】

メタン酸化活性を有するアンモニア酸化酵素活性ドメイン、またはブタン酸化活性を有するブタン酸化酵素活性ドメインが融合したフェリチン単量体が自己集合している、タンパク質。

【請求項2】

前記アンモニア酸化酵素活性ドメインは、ａｍｏＢ１（Ammonia monooxygenase beta subunit_domain 1）およびａｍｏＢ２（Ammonia monooxygenase beta subunit_domain 2）の中から選択される、請求項１に記載のタンパク質。

【請求項3】

前記ａｍｏＢ１は配列番号１のアミノ酸配列からなり、ａｍｏＢ２は配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項２に記載のタンパク質。

【請求項4】

ａｍｏＢ１およびａｍｏＢ２が融合したフェリチン単量体が自己集合している、請求項２に記載のタンパク質。

【請求項5】

ａｍｏＢ１が融合したフェリチン単量体およびａｍｏＢ２が融合したフェリチン単量体が自己集合している、請求項２に記載のタンパク質。

【請求項6】

前記ブタン酸化酵素活性ドメインは、ｂｍｏＢ１（Particulate Butane monooxygenase subunit B_domain 1）およびｂｍｏＢ２（Particulate Butane monooxygenase subunit B_domain 2）の中から選択される、請求項１に記載のタンパク質。

【請求項7】

前記ｂｍｏＢ１は配列番号３のアミノ酸配列からなり、ｂｍｏＢ２は配列番号４のアミノ酸配列からなる、請求項６に記載のタンパク質。

【請求項8】

ｂｍｏＢ１およびｂｍｏＢ２が融合したフェリチン単量体が自己集合している、請求項６に記載のタンパク質。

【請求項9】

ｂｍｏＢ１が融合したフェリチン単量体およびｂｍｏＢ２が融合したフェリチン単量体が自己集合している、請求項６に記載のタンパク質。

【請求項10】

前記フェリチン単量体は、ヒトフェリチン重鎖単量体である、請求項１に記載のタンパク質。

【請求項11】

前記各ドメインは、フェリチン単量体のα－ヘリックスの内部、隣接するα－ヘリックスの間、Ｎ末端、Ｃ末端、ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、Ｎ末端とＡヘリックスの間、およびＥヘリックスとＣ末端の間からなる群より選択されるいずれか１つに融合したものである、請求項１０に記載のタンパク質。

【請求項12】

請求項１～１１のいずれか一項に記載のタンパク質を発現する微生物。

【請求項13】

前記微生物は、フェリチン単量体をコードする遺伝子と、ａｍｏＢ１（Ammonia monooxygenase beta subunit_domain 1）およびａｍｏＢ２（Ammonia monooxygenase beta subunit_domain 2）の中から選択されるアンモニア酸化酵素活性ドメイン、またはｂｍｏＢ１（Particulate Butane monooxygenase subunit B_domain 1）およびｂｍｏＢ２（Particulate Butane monooxygenase subunit B_domain 2）の中から選択されるブタン酸化酵素活性ドメインをコードする遺伝子とを含むベクターが導入されたものである、請求項１２に記載の微生物。

【請求項14】

前記微生物は大腸菌である、請求項１２に記載の微生物。

【請求項15】

請求項１～１１のいずれか一項に記載のタンパク質を含み、前記タンパク質は、アンモニア酸化酵素活性ドメインが融合したものである、メタノール製造用組成物。

【請求項16】

還元剤をさらに含む、請求項１５に記載の組成物。

【請求項17】

前記還元剤はデュロキノールである、請求項１５に記載の組成物。

【請求項18】

請求項１５に記載の組成物をメタンガスと反応させるステップを含む、メタノールの製造方法。

【請求項19】

請求項１～１１のいずれか一項に記載のタンパク質を含み、前記タンパク質は、ブタン酸化酵素活性ドメインが融合したものである、ブタノール製造用組成物。

【請求項20】

前記組成物は還元剤をさらに含む、請求項１９に記載の組成物。

【請求項21】

前記還元剤はデュロキノールである、請求項１９に記載の組成物。

【請求項22】

請求項１９に記載の組成物をブタンガスと反応させるステップを含む、ブタノールの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、メタンまたはブタン酸化活性を有する新規タンパク質に関する。

【背景技術】

【0002】

メタン酸化細菌（methanotrophs）由来のメタン酸化酵素（Methane monooxygenase，MMO）は、常温常圧の穏やかな条件下でメタンガスを含む様々な炭化水素（Ｃ１－Ｃ８）の酸化反応を触媒して高付加価値の産物を生産できる非常に有用なバイオ触媒であり、これを活用するバイオプロセスの開発に世界的な関心が集中されている。

【0003】

また、類似系列の酵素として、ニトロソモナス・ユーロピア（Nitrosomonas europaea）由来のアンモニア酸化酵素（Ammonia monoxygenase，AMO）、ノカルディオイデス属（Nocardioides sp.）ＣＦ８株（strain CF8）由来のブタン酸化酵素（Butane monooxygenase, BMO）などが、メタン酸化酵素と類似した機序で広い範囲の炭化水素（ＡＭＯ：Ｃ１－Ｃ１０鎖状／ハロゲン化炭化水素、単／多環状芳香族炭化水素、ＢＭＯ：Ｃ２－Ｃ１０鎖状／ハロゲン化炭化水素、一部の芳香族炭化水素）に対して酸化反応を触媒できる有用なバイオ触媒であるが、現在までに３Ｄ構造、活性ドメインの究明、反応メカニズム、基質特異性などの基礎研究が非常に不十分である。

【0004】

現在、メタンおよびブタンガスの化学プロセスによるメタノールおよびブタノールの生産は工程が複雑で副産物（二酸化炭素、シンガス（syngas）など）による環境汚染の誘発、低反応転化率、高温、高圧の反応条件に起因する高エネルギー消費など、技術面、環境面、経済面で多くの問題を抱えている。特に、メタンガスは、高価な輸送、貯蔵コストに起因する経済性の低下、および流出時の深刻な温室効果の誘発などの問題により、地元のガス田に容易に連携できる小規模バイオプラントを用いたメタノールの生産が技術面、経済面で非常に有利である。

【0005】

バイオプロセスの開発努力により、メタノール以外の他の高付加産物を生産するためのメタン酸化細菌および様々な炭化水素物質分解細菌（hydrocarbon degrading bacteria）の代謝工学的な菌株の改良が試みられているが、遺伝工学的ツールの活用の限界、菌株の難培養性による問題などがあり、メタン酸化酵素などを大量生産するために産業用菌株を用いて異種発現することは、水溶性タンパク質の発現が難しく、酵素複合体の精密な相互作用が求められるなどの高い技術的難易度のため産業的活用の成功事例がない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、優れたメタンまたはブタン酸化能を有するタンパク質を提供することを目的とする。

【0007】

本発明は、前記タンパク質を発現する微生物を提供することを目的とする。

【0008】

本発明は、前記タンパク質または微生物を含むメタノールまたはブタノール製造用組成物を提供することを目的とする。

【0009】

本発明は、前記タンパク質または微生物を用いたメタノールまたはブタノールの製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

１．メタン酸化活性を有するアンモニア酸化酵素活性ドメイン、またはブタン酸化活性を有するブタン酸化酵素活性ドメインが融合したフェリチン単量体が自己集合している、タンパク質。

【0011】

２．前記項目１において、前記アンモニア酸化酵素活性ドメインは、ａｍｏＢ１（Ammonia monooxygenase beta subunit_domain 1）およびａｍｏＢ２（Ammonia monooxygenase beta subunit_domain 2）の中から選択される、タンパク質。

【0012】

３．前記項目２において、前記ａｍｏＢ１は、配列番号１のアミノ酸配列からなり、ａｍｏＢ２は、配列番号２のアミノ酸配列からなる、タンパク質。

【0013】

４．前記項目２において、ａｍｏＢ１およびａｍｏＢ２が融合したフェリチン単量体が自己集合している、タンパク質。

【0014】

５．前記項目２において、ａｍｏＢ１が融合したフェリチン単量体およびａｍｏＢ２が融合したフェリチン単量体が自己集合している、タンパク質。

【0015】

６．前記項目１において、前記ブタン酸化酵素活性ドメインは、ｂｍｏＢ１（Particulate Butane monooxygenase subunit B_domain 1）およびｂｍｏＢ２（Particulate Butane monooxygenase subunit B_domain 2）の中から選択される、タンパク質。

【0016】

７．前記項目６において、前記ｂｍｏＢ１は、配列番号３のアミノ酸配列からなり、ｂｍｏＢ２は、配列番号４のアミノ酸配列からなる、タンパク質。

【0017】

８．前記項目６において、ｂｍｏＢ１およびｂｍｏＢ２が融合したフェリチン単量体が自己集合している、タンパク質。

【0018】

９．前記項目６において、ｂｍｏＢ１が融合したフェリチン単量体およびｂｍｏＢ２が融合したフェリチン単量体が自己集合している、タンパク質。

【0019】

１０．前記項目１において、前記フェリチン単量体は、ヒトフェリチン重鎖単量体である、タンパク質。

【0020】

１１．前記項目１０において、前記各ドメインは、フェリチン単量体のα－ヘリックスの内部、隣接するα－ヘリックスの間、Ｎ末端、Ｃ末端、ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、Ｎ末端とＡヘリックスの間、およびＥヘリックスとＣ末端の間からなる群より選択されるいずれか１つに融合したものである、タンパク質。

【0021】

１２．前記項目１～１１のいずれかに記載のタンパク質を発現する微生物。

【0022】

１３．前記項目１２において、前記微生物は、フェリチン単量体をコードする遺伝子と、ａｍｏＢ１（Ammonia monooxygenase beta subunit_domain 1）およびａｍｏＢ２（Ammonia monooxygenase beta subunit_domain 2）の中から選択されるメタン酸化酵素活性ドメイン、またはｂｍｏＢ１（Particulate Butane monooxygenase subunit B_domain 1）およびｂｍｏＢ２（Particulate Butane monooxygenase subunit B_domain 2）の中から選択されるブタン酸化酵素活性ドメインをコードする遺伝子とを含むベクターが導入されたものである、微生物。

【0023】

１４．前記項目１２において、前記微生物は大腸菌である、微生物。

【0024】

１５．前記項目１～１１のいずれかに記載のタンパク質を含み、前記タンパク質は、アンモニア酸化酵素活性ドメインが融合したものである、メタノール製造用組成物。

【0025】

１６．前記項目１５において、還元剤をさらに含む、組成物。

【0026】

１７．前記項目１５において、前記還元剤は、デュロキノール（duroquinol）である、組成物。

【0027】

１８．前記項目１５に記載の組成物をメタンガスと反応させるステップを含む、メタノールの製造方法。

【0028】

１９．前記項目１～１１のいずれかに記載のタンパク質を含み、前記タンパク質は、ブタン酸化酵素活性ドメインが融合したものである、ブタノール製造用組成物。

【0029】

２０．前記項目１９において、前記組成物は、還元剤をさらに含む、組成物。

【0030】

２１．前記項目１９において、前記還元剤は、デュロキノール（duroquinol）である、組成物。

【0031】

２２．前記項目１９に記載の組成物をブタンガスと反応させるステップを含む、ブタノールの製造方法。

【発明の効果】

【0032】

本発明のタンパク質は、メタンまたはブタン酸化活性を有する。

【0033】

本発明のタンパク質は、メタンまたはブタン酸化活性を有するドメインを多数含み、その活性が高い。

【0034】

本発明の組成物および方法は、メタノールまたはブタノールを高収率で製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】図１は、実施例で使用する各ベクターの概略図である。

【図2】図２は、実施例で製造されたｃＡＭＯ、ＡＭＯ－、ＢＭＯ－ｍｉｍｉｃｓを含む組換えタンパク質の発現率および細胞質溶解度の分析結果である。

【図3】図３は、実施例で製造されたｃＡＭＯ、ＡＭＯ－、ＢＭＯ－ｍｉｍｉｃｓを含む組換えタンパク質が自己集合体を形成することを確認したものである。

【図4】図４ａ～ｃは、ｃＡＭＯ組換えタンパク質のＸ線吸収端近傍構造（X-ray absorption near－edge structure、XANES）、広域Ｘ線吸収微細構造（Extended X-ray absorption fine structure、EXAFS）及び電子常磁性共鳴（Electron paramagnetic resonance、EPR）スペクトルの分析結果である。

【図5】図５は、実施例で製造されたｃＡＭＯ、ＡＭＯ－、ＢＭＯ－ｍｉｍｉｃｓを含む組換えタンパク質のメタンおよびブタンガス酸化活性を確認したものである。

【図6】図６は、実施例で製造されたｃＡＭＯの^１３Ｃ－メタンガス酸化活性を確認したものである。

【発明を実施するための形態】

【0036】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0037】

本発明は、メタン酸化活性を有するアンモニア酸化酵素活性ドメイン、またはブタン酸化活性を有するブタン酸化酵素活性ドメインが融合したフェリチン単量体が自己集合したタンパク質に関するものである。

【0038】

アンモニア酸化酵素活性ドメインは、メタンを酸化させる活性を有するものであれば制限なく用いることができ、例えば、ａｍｏＢ１（Ammonia monooxygenase beta subunit_domain 1）およびａｍｏＢ２（Ammonia monooxygenase beta subunit_domain 2）などを用いることができる。具体的には、ａｍｏＢ１としては配列番号１のアミノ酸を含むものを、ａｍｏＢ２としては配列番号２のアミノ酸配列を含むものを用いることができる。

【0039】

ブタン酸化酵素活性ドメインは、ブタン酸化活性を有するものであれば制限なく用いることができ、例えば、ｂｍｏＢ１（Particulate Butane monooxygenase subunit B_domain 1）およびｂｍｏＢ２（Particulate Butane monooxygenase subunit B_domain 2）などを用いることができる。具体的には、ｂｍｏＢ１としては配列番号３のアミノ酸を含むものを、ｂｍｏＢ２としては配列番号４のアミノ酸配列を含むものを用いることができる。

【0040】

本発明のタンパク質において、各ドメインは、１つのフェリチン単量体内に全て融合したものであっても、各フェリチン単量体にそれぞれ融合したものであっても、これらが混合されたものであってもよい。

【0041】

つまり、本発明のタンパク質において、２つのアンモニア酸化酵素活性ドメインまたはブタン酸化酵素活性ドメインが１つのフェリチン単量体内に融合したものであってもよく、フェリチン単量体ごとに１つのドメインが融合したものであってもよい。

【0042】

本発明のタンパク質は、ＦＡＤ（flavin adenine dinucleotide）結合ドメインを含む電子伝達ドメインがさらに融合したものであってもよい。

【0043】

メタンは、下記数学式１の反応によって酸化してメタノールを形成できるが、本発明のタンパク質は、メタン酸化活性ドメインと、ＦＡＤ（flavin adenine dinucleotide）結合ドメインを含む電子伝達ドメインとが融合したフェリチン単量体が自己集合したものであり、還元剤であるＮＡＤＨを用いてメタン酸化反応を行うことができ、特に、インビボ（in vivo）で反応時に体内のＮＡＤＨを活用することができる。このため、別の還元剤の使用が不要である。

【0044】

［数学式１］
ＣＨ_４＋Ｏ_２＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ^＋→ ＣＨ_３ＯＨ＋ＮＡＤ（Ｐ）^＋＋Ｈ_２Ｏ

【0045】

電子伝達ドメインは、ＦＡＤ（flavin adenine dinucleotide）結合ドメインを含む。

【0046】

ＦＡＤ結合ドメインは、ｓＭＭＯ（soluble MMO（Methane monooxygenase））由来のものであってもよく、具体的には、その構成要素の１つであるＭＭＯＲのＦＡＤ結合ドメインであってもよい。

【0047】

電子伝達ドメインは、ＦＡＤ結合ドメインを含むものであり、これはＦＡＤ結合ドメインのみからなっていてもよく、ＭＭＯＲにおいてＦＡＤ結合ドメイン以外に追加の部分をさらに含んでもよく、ＦＡＤ結合ドメイン以外に２Ｆｅ－２Ｓドメインの少なくとも一部をさらに含んでもよく、ＦＡＤ結合ドメインおよび２Ｆｅ－２Ｓドメインを含んでもよい。例えば、電子伝達ドメインとしては、配列番号５のアミノ酸配列を含むものを用いることができる。

【0048】

本発明のタンパク質において、フェリチン単量体としては様々な生物に由来するフェリチンを用いることができ、脊椎動物の場合は重鎖または軽鎖単量体を用いることができる。例えば、ヒトフェリチン重鎖を用いることができる。

【0049】

フェリチン単量体において、自己集合したタンパク質でその機能を果たすことができれば、各ドメインの結合位置は限定されず、例えば、α－ヘリックスの内部、隣接するα－ヘリックスの間、Ｎ末端、Ｃ末端、ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、Ｎ末端とＡヘリックスの間、およびＥヘリックスとＣ末端の間からなる群より選択されるいずれか１つに融合されてもよく、タンパク質から外部に表出されてその機能を容易に発揮するという点から、好ましくはＣ末端に融合されてもよい。

【0050】

本発明のタンパク質において、フェリチン単量体と各ドメインとの間には、リンカーをさらに含むことができる。

【0051】

リンカーとしては、当分野で公知のものを制限なく用いることができ、例えば、Ｓ１（Ｇ３ＳＧ３ＴＧ３ＳＧ３）、Ｓ２（ＧＫＬＧＧＧ）などを用いることができる。

【0052】

本発明のタンパク質は、例えば、フェリチン単量体をコードする遺伝子と、ａｍｏＢ１（Ammonia monooxygenase beta subunit_domain 1）およびａｍｏＢ２（Ammonia monooxygenase beta subunit_domain 2）の中から選択されるアンモニア酸化酵素活性ドメイン、またはｂｍｏＢ１（Particulate Butane monooxygenase subunit B_domain 1）およびｂｍｏＢ２（Particulate Butane monooxygenase subunit B_domain 2）の中から選択されるブタン酸化酵素活性ドメインをコードする遺伝子とを含むベクターを生物体に形質転換させ、その生物体から得られるものであるが、これに限定されるものではない。

【0053】

本発明のタンパク質は、微生物内でのｓｏｌｕｂｌｅ ｆｏｒｍへの発現率が高く、生合成時の製造収率が高い。

【0054】

また、本発明は、前記タンパク質を発現する微生物に関するものである。

【0055】

本発明の微生物は、フェリチン単量体をコードする遺伝子と、ａｍｏＢ１（Ammonia monooxygenase beta subunit_domain 1）およびａｍｏＢ２（Ammonia monooxygenase beta subunit_domain 2）の中から選択されるアンモニア酸化酵素活性ドメイン、またはｂｍｏＢ１（Particulate Butane monooxygenase subunit B_domain 1）およびｂｍｏＢ２（Particulate Butane monooxygenase subunit B_domain 2）の中から選択されるブタン酸化酵素活性ドメインをコードする遺伝子とを含むベクターが導入され、前記タンパク質を発現するものであってもよい。

【0056】

本発明のタンパク質において、各ドメインは、１つのフェリチン単量体内に全て融合されたものであっても、各フェリチン単量体にそれぞれ融合されたものであっても、これらが混合されたものであってもよい。このため、前記アンモニア酸化酵素活性ドメイン、またはブタン酸化酵素活性ドメインをコードする遺伝子は、１つのベクターに含まれてもよく、２つのベクターにそれぞれ含まれてもよい。

【0057】

ベクターとしては、当分野で公知の発現ベクターを用いることができ、例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクター（Stratagene）、Ｔ７発現ベクター（Invitrogen）、ｐＥＴベクター（Novagen）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0058】

ベクターは、タンパク質の発現のためのプロモーター、分離／精製のためのタグ、形質転換マーカーなど、当分野で公知の追加の構成要素をさらに含むことができる。

【0059】

微生物としては、前記ベクターを導入して前記タンパク質を発現できるものであれば、その種類を限定せず、例えば大腸菌を用いることができる。

【0060】

本発明の微生物は前記タンパク質を発現するので、メタンの酸化によるメタノールの製造に用いることができる。本発明の微生物を用いる場合には、メタノールを生成するための別の還元剤の添加が不要である。

【0061】

また、本発明は、前述のタンパク質または前述の微生物を含むメタノール製造用組成物またはブタノール製造用組成物に関するものである。

【0062】

前述のメタン酸化活性を有するアンモニア酸化酵素活性ドメインが融合したフェリチン単量体が自己集合したタンパク質はメタン酸化活性を有し、ブタン酸化酵素活性ドメインが融合したフェリチン単量体が自己集合したタンパク質はブタン酸化活性を有し、前述の微生物は前記タンパク質を発現する。このため、本発明の組成物はこれを含むことでメタンまたはブタンを酸化して、メタノールまたはブタノールを製造することができる。

【0063】

メタノールまたはブタノールの製造は、前記組成物にメタンガスまたはブタンガスを処理することによって行うことができる。

【0064】

本発明の組成物は、メタンまたはブタンの酸化に使用される還元剤をさらに含むことができる。還元剤は、例えばデュロキノール（duroquinol）であってもよい。

【0065】

また、本発明は、前述の組成物をメタンガスまたはブタンガスと反応させるステップを含むメタノールまたはブタノールの製造方法に関するものである。

【0066】

本発明による組成物をメタンガスまたはブタンガスと反応させてメタンまたはブタンを酸化することによってメタノールまたはブタノールを製造することができ、これは前述の組成物にメタンガスまたはブタンガスを注入して酵素反応を進めることによって行うことができる。

【0067】

メタノールまたはブタノールの製造条件は特に限定されず、例えば、前述のタンパク質または微生物が適正活性を示す温度、ｐＨなどで行うことができる。

【0068】

実施例
１．タンパク質生合成のための発現ベクターの製造
下記表１に示すベクター模式図に従い、ＰＣＲによってｃｈｉｍｅｒｉｃ ＡＭＯ（ＡＭＯ（ａｍｏＢ１）＋ｓＭＭＯ（ＭＭＯＲ_Ｆ））、ＡＭＯ－ｍｉｍｉｃｓ（ＡＭＯ－ｍ１～ＡＭＯ－ｍ２）、ＢＭＯ－ｍｉｍｉｃｓ（ＢＭＯ－ｍ１～ＢＭＯ－ｍ２）を製造した。製造したすべてのプラスミド発現ベクターは、アガロースゲルで精製した後、完全なＤＮＡシークエンシングによって配列を確認した。

【0069】

このようにして製造されたＰＣＲ産物を順次にｐＴ７－７、ｐＥＴ２８ａ発現用ベクターに挿入し、それぞれのタンパク質を発現できる発現ベクターを構成した。

【0070】

各タンパク質の発現用ベクターは、ｐＴ７－ｃＡＭＯ－Ｂ１、ｐＥＴ２８ａ－ｃＡＭＯ－Ｂ２、ｐＥＴ２８ａ－ＡＭＯ－ｍ１－Ｂ１、ｐＴ７－ＡＭＯ－ｍ１－Ｂ２、ｐＴ７－ＡＭＯ－ｍ２、ｐＴ７－ＢＭＯ－ｍ１、ｐＥＴ２８ａ－ＢＭＯ－ｍ２－Ｂ１、ｐＴ７－ＢＭＯ－ｍ２－Ｂ２で行った（図１）。

【0071】

【表1】

【0072】

使用する各タンパク質（ドメイン）の配列は、下記表２に示す通りである。

【0073】

【表2】

【0074】

２．組換えタンパク質の生合成および精製
大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）［Ｆ^－ｏｍｐＴｈｓｄＳ_Ｂ（ｒＢ^－ｍＢ^－）］、ｐＧｒｏＢＬ２１（ＤＥ３）［Ｆ^－ｏｍｐＴｈｓｄＳ_Ｂ（ｒＢ^－ｍＢ^－）］を前記で製造された発現ベクターでそれぞれ形質転換した。ＡＭＯ－ｍｉｍｉｃｓとＢＭＯ－ｍ１を除くｃＡＭＯ、ＢＭＯ－ｍ２は、大腸菌株ＢＬ２１に２つの発現ベクターを同時に形質転換し、アンピシリンとカナマイシンに抵抗性のある形質転換体を選択した。形質転換された大腸菌を５０ｍＬのＬＢ（Luria－Bertani）培地（１００ｍｇ Ｌ^－１アンピシリンと１００ｍｇ Ｌ^－１カナマイシン、０．４ｍＭ ＣｕＳＯ_４を含有）を含有するフラスコ（２５０ｍＬ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ ｆｌａｓｋｓ、３７℃、１５０ｒｐｍ）で培養した。

【0075】

ＡＭＯ－ｍ１は、ｐＧｒｏ７／ＢＬ２１に２つの発現ベクターを同時に形質転換し、アンピシリンとカナマイシン、クロラムフェニコールに抵抗性のある形質転換体を選択した。形質転換された大腸菌を５０ｍＬのＬＢ（Luria－Bertani）培地（１００ｍｇ Ｌ^－１アンピシリンと１００ｍｇ Ｌ^－１カナマイシン、２０ｍｇ Ｌ^－１クロラムフェニコール、０．５ｇ Ｌ^－１アラビノースと０．４ｍＭ ＣｕＳＯ_４を含有）を含有するフラスコ（２５０ｍＬ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ ｆｌａｓｋｓ、３７℃、１５０ｒｐｍ）で培養した。

【0076】

ＡＭＯ－ｍ２、ＢＭＯ－ｍ１は、ＢＬ２１に発現ベクターを形質転換し、アンピシリンに抵抗性のある形質転換体を選択した。形質転換された大腸菌を５０ｍＬのＬＢ（Luria－Bertani）培地（１００ｍｇ Ｌ^－１アンピシリン、０．４ｍＭ ＣｕＳＯ_４を含有）を含有するフラスコ（２５０ｍＬ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ ｆｌａｓｋｓ、３７℃、１５０ｒｐｍ）で培養した。

【0077】

培地濁度（Ｏ．Ｄ．_６００）が約０．６に達したとき、ＩＰＴＧ（Isopropyl－β－D－thiogalactopyranosid）（１ｍＭ）を添加して遺伝子の発現を誘導した。２０℃で１４時間培養後、培養した大腸菌を５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して菌体沈殿物を回収した後、５ｍＬの破砕溶液（５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波破砕機（Branson Ultrasonics Corp．、Danbury、CT、USA）を用いて破砕した。破砕後、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄み液と不溶性凝集体を分離した。

【0078】

分離した上澄み液をまず組換えタンパク質に融合発現されたヒスチジンとニッケルとの結合を用いたＮｉ^２＋－ＮＴＡアフィニティー（affinity）クロマトグラフィーを行った後、組換えタンパク質を濃縮し、バッファー交換を行うことにより、精製された組換えタンパク質を得た。各ステップの詳細は以下の通りである。

【0079】

１）Ｎｉ^２＋－ＮＴＡアフィニティー・クロマトグラフィー
組換えタンパク質を精製するために、前述の方法と同様にして培養した大腸菌を回収し、その細胞ペレットを５ｍＬの破砕溶液（５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）に再浮遊し、超音波破砕機を用いて細胞を破砕した。破砕した細胞液を１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してその上澄み液のみを分離した後、各組換えタンパク質をＮｉ^２＋－ＮＴＡカラム（Quiagen、Hilden、Germany）を用いてそれぞれ分離した（洗浄バッファー：５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０／溶出バッファー：５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）。

【0080】

２）濃縮とバッファ交換
Ｎｉ^２＋－ＮＴＡアフィニティー・クロマトグラフィーを経て溶出した２ｍＬの組換えタンパク質を超遠心ろ過器（ultracentrifugal filter、Amicon Ultra 100K、Millipore、Billerica、MA）に入れ、カラムの上に１ｍｌの溶液が残るまで５，０００ｒｐｍで遠心分離を行った。その後、トリス（Tris）バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）でバッファー交換を行った。

【0081】

３．製造されたｃＡＭＯ、ＡＭＯ－、ＢＭＯ－ｍｉｍｉｃｓを含む組換えタンパク質の発現率および細胞質溶解度の分析
前記プロセスを経た後、精製された組換えタンパク質の発現率および細胞質溶解度をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。組換えタンパク質の破砕された細胞液を遠心分離して得られた上澄み液（soluble fraction, sol）と不溶性凝集体（insoluble fraction, insol）、精製された組換えタンパク質に対して、１２％トリス－グリシン・プレキャストゲル（Tris－glycine precast gel、Invitrogen、California、U.S.A.）を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。そして、ゲルをクマシーブルー染色溶液で染色し、染色されたタンパク質バンドに対して、デンシトメーター（densitometer、GS－800 Calibrated Densitometer、Bio－Rad、California、U.S.A.）により各組換えタンパク質の発現率および細胞質溶解度を分析した（図２）。

【0082】

４．製造されたｃＡＭＯ、ＡＭＯ－、ＢＭＯ－ｍｉｍｉｃｓを含む組換えタンパク質の構造の分析
前記プロセスを経た後、精製された組換えタンパク質の構造を分析するために透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて撮影を行った。タンパク質の染色画像を得るために、自然乾燥サンプルを含む電子顕微鏡グリッドを、２％（ｗ／ｖ）水性ウラニルアセテート溶液と共に１時間室温でインキュベートした。タンパク質画像を２００ｋＶで作動するＴｅｃｎａｉ ２０（FEI、Hillsboro、Oreon、U.S.A.）電子顕微鏡を用いて観察したところ、球状のナノ粒子が形成されていることを確認した。さらに、ＤＬＳ（dynamic light scattering）分析により、ｃＡＭＯは２７．９±４．７ｎｍ、ＡＭＯ－ｍ１は２９．８±１．３ｎｍ、ＡＭＯ－ｍ２は２６．５±１．１ｎｍ、ＢＭＯ－ｍ１は１７．６±４．９ｎｍ、ＢＭＯ－ｍ２は１５．２±４．０ｎｍの大きさを有する球状のナノ粒子を形成することを確認した（図３）。

【0083】

製造されたｃＡＭＯ組換えタンパク質の構造を分析するために、Ｘ線吸収分光法（X－ray absorption spectroscopy、XAS）および電子常磁性共鳴（Electron paramagnetic resonance、EPR）スペクトル分析を行った。タンパク質のＸ線吸収端近傍構造（X-ray absorption near－edge structure、XANES）、広域Ｘ線吸収微細構造（Extended X-ray absorption fine structure、EXAFS）およびＥＰＲ分析のために、トリス（Tris）バッファーで溶媒交換されたサンプルを－８０℃で３時間事前冷凍し、事前冷凍したサンプルは凍結乾燥機（FDU－2100、DRC－1000、EYELA）を用いて－１１０℃で凍結乾燥した。ＸＡＳ分析は、Ａｉｃｈｉ Ｓｙｎｃｈｒｏｎｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（Aichi）のＸＡＦＳビームライン（BL11S2）により測定した。ｃＡＭＯ ＥＸＡＦＳの分析結果、活性部位に存在する銅イオンと周辺リガンドの距離情報を確認し、メタン酸化反応が進行したサンプルの場合は、反応が進行していないサンプルと比較して、リガンドの距離が異なっており、一つのピーク（～２．２Å）が追加に観察されることを確認した。ＸＡＮＥＳ分析により、１、２価の銅イオン（Ｃｕ（Ｉ）、Ｃｕ（ＩＩ））が混在していることを確認した。さらに、ＥＰＲ分析により、２価の銅イオンがｖａｌｅｎｃｅ－ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｓｔａｔｅで存在することを確認した（図４ａ－ｃ）。

【0084】

５．製造されたｃＡＭＯ、ＡＭＯ－、ＢＭＯ－ｍｉｍｉｃｓを含む組換えタンパク質のメタンおよびブタンガス酸化活性の証明
精製された組換えタンパク質のメタンおよびブタンガス酸化活性を検証するために、２０ｍＬのｓｅｐｔａ－ｓｅａｌｅｄ ｖｉａｌ（catalogue no. 5182-0837、Agilent）に還元剤のＮＡＤＨ（０．２ｍＭ）またはデュロキノール（０．３５ｍＭ）を含む１ｍＬの組換えタンパク質溶液を注入した。組換えタンパク質によるメタンおよびブタン酸化反応のために、１９ｍＬのヘッドスペース（headspace）の空気を注射器によって除去し、１５ｍＬのメタンまたはブタンガスと４ｍＬの空気を注入した。その後、すぐにバイアルを３０℃のインキュベーターで最大２４時間まで酵素反応を行った。そして、酵素反応により発生する酸化生成物であるメタノールまたはブタノールの量をガスクロマトグラフィー（7890B GC、Agilent）により測定し、累積生産量を計算した（図５）。

【0085】

ｃＡＭＯの^１３Ｃ－メタンガス酸化活性を検証するために、前述のメタン酸化反応と同様の方法で酵素反応を行う一方、メタンガスを^１３Ｃ－メタンガスで置換して行った。核磁気共鳴（Nuclear magnetic resonance、NMR）分析のために、反応が終わった５つのバイアルを８０℃で１５分間加熱した後、ヘッドスペース（headspace）の気体１９ｍｌを、十分に冷却したエタノール６００μｌに注射器を用いて直接注入した。その後、６０μｌのエタノール－ｄ_６を加えて、ＮＭＲチューブ（NORS55007、Sigma Aldrich）に移し、ｃＡＭＯ酵素反応によって生成された（発生する酸化生成物である）^１３Ｃ－メタノールをＮＭＲ分析によって確認した（図６）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図5】

【図6】

【配列表】

2024515370000001.app

【国際調査報告】