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特表2024-515443質量分析によるインスリン様増殖因子Ｉバリアントの同定及び定量
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-10
(54)【発明の名称】質量分析によるインスリン様増殖因子Ｉバリアントの同定及び定量
(51)【国際特許分類】
G01N 27/62 20210101AFI20240403BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20240403BHJP
C07K 1/16 20060101ALI20240403BHJP
C07K 14/65 20060101ALN20240403BHJP
【ＦＩ】
G01N27/62 V
G01N33/68
C07K1/16
C07K14/65
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023556942
(86)(22)【出願日】2022-03-18
(85)【翻訳文提出日】2023-11-14
(86)【国際出願番号】 US2022020906
(87)【国際公開番号】W WO2022198020
(87)【国際公開日】2022-09-22
(31)【優先権主張番号】63/163,502
(32)【優先日】2021-03-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517308264
【氏名又は名称】クエスト ダイアグノスティックス インヴェストメンツ エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】230104019
【弁護士】
【氏名又は名称】大野 聖二
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(74)【代理人】
【識別番号】100204582
【弁理士】
【氏名又は名称】大栗 由美
(72)【発明者】
【氏名】モトリキン，イエフゲン
(72)【発明者】
【氏名】クラーク，ナイジェル
(72)【発明者】
【氏名】マクファール，マイケル，ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】ウー，ゼングル
【テーマコード（参考）】
2G041
2G045
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G041CA01
2G041DA05
2G041DA14
2G041DA18
2G041EA04
2G041FA10
2G041FA11
2G041FA12
2G041GA03
2G041GA08
2G041GA09
2G041HA01
2G045AA25
2G045CA25
2G045CA26
2G045CB01
2G045CB07
2G045DA36
2G045FA33
2G045FB06
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045AA50
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA38
4H045FA74
(57)【要約】
試料中のインスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）バリアントを検出するための方法が提供される。本明細書に提供される方法は、検出されたイオンを使用して、試料中のＩＧＦ１バリアントの存在を決定することを更に対象とする。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中のインスリン様増殖因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）バリアントを検出するための方法であって、ａ．前記試料中のＩＧＦ－Ｉをイオン化して、質量分析によって検出可能な１つ以上のイオンを生成することと、
ｂ．質量分析によって、１０９３．５±０．５、１０８９．８±０．５、１０９５±０．５、１０９７．０９±０．５、１０９８．０９±０．５からなる群から選択される質量電荷比を有するイオンを含む前記イオンのうちの１つ以上を検出することと、
ｃ．前記検出されたイオンを使用して、前記試料中のＩＧＦ１バリアントの存在を決定することと、を含む、方法。
【請求項2】
ｍ／ｚ１０９３．５±０．５の検出が、ＷＴ４又はＰ６６Ｔ１の存在を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ｍ／ｚ１０８９．８±０．５の検出が、Ｐ６６Ａ４、Ｒ５５Ｋ６、又はＲ３６Ｑ６の存在を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
ｍ／ｚ１０９５．８±０．５の検出が、Ａ６７Ｓ４又はＴ２９Ｉ８の存在を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
ｍ／ｚ１０９７．０９±０．５の検出が、Ｓ３４Ｎ２、Ａ７０Ｐ３、Ａ３８Ｖ１、Ｍ５９Ｒ４、又はＡ６７Ｓ１３の存在を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
ｍ／ｚ１０９８．０９±０．５の検出が、Ｓ３４Ｎ９、Ａ７０Ｐ１０、Ａ３８Ｖ８、Ｍ５９Ｒ１１、Ｖ１７／４４Ｍ４、Ｒ５０Ｗ６、Ｔ４Ｍ６、又はＡ６７／７０Ｔ６の存在を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
イオン化前に高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってタンパク質を精製することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記試料が、血漿又は血清を含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連特許出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月１９日に出願された米国仮出願第６３／１６３，５０２号に対する優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年３月１９日に出願された米国仮出願第６３／１６３，５０２号に対する優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、質量分析を使用したインスリン様増殖因子１バリアントの同定及び定量に関する。
【背景技術】
【0003】
ＩＧＦ－Ｉは、インスリンと同様の分子構造を有するホルモンである。これは、肝臓によって産生されるペプチドであり、一本鎖に７０個のアミノ酸を含有し、３つの分子内ジスルフィド架橋を有する。ＩＧＦ－Ｉは、約７，６４９Ｄａの分子量を有し、血清中でタンパク質と高度に結合している。産生は、成長ホルモンによって刺激され、栄養不足、成長ホルモン非感受性、成長ホルモン受容体の欠如、又は下流シグナル伝達経路の不全によって遅延する可能性がある。ＩＧＦ－Ｉは、小児の成長に重要な役割を果たし、成人になっても同化効果を及ぼし続ける。
【0004】
高分解能ＬＣ－ＭＳベースのアプローチは、ほとんどの患者からの検体中のペプチドの定量に有効であるが、多型に起因するアミノ酸置換は、本質的に多型バリアントを「隠す」質量の変化をもたらす可能性がある。より多くのアミノ酸残基を有するより大きなポリペプチドをモニタリングする場合、多型を有する可能性が高くなる。
【0005】
タンパク質の定量は、野生型（ＷＴ）タンパク質の特定の質量電荷比（ｍａｓｓ－ｔｏ－ｃｈａｒｇｅ ｒａｔｉｏ）（ｍ／ｚ）でのピーク強度に基づいているため、ＩＧＦ－１の定量は、ＷＴのみを含み、多型を含まない。例えば、ＩＧＦ－１バリアントの存在は、ヘテロ接合性個体の場合、ＷＴ濃度が循環ＩＧＦ－１の半分のみを表すことを示し得るか、又は野生型ＩＧＦ－１が不在の場合、個体がバリアントについてホモ接合性若しくは２つの異なるバリアントについてヘテロ接合性であることによって説明され得る。いくつかのバリアントは、病原性であることが報告されているが、他のほとんどは、臨床的意義が不明である。この情報は、患者のＩＧＦ－１検査結果を解釈する場合、臨床医にとって重要である。更に、特定の表現型を有する患者にどのようなバリアントが存在するかを知ることは、遺伝子型－表現型の関係及びその臨床的意義の理解を広げるのに役立つ。
【0006】
ＩＧＦ－１バリアントを同定するための効果的な方法が必要である。
【発明の概要】
【0007】
本明細書に提供される方法は、４ｍ／ｚ比を使用することによって１５のＩＧＦ－１バリアントの同時モニタリングを可能にする同位体ピークインデックス（ＩＳＩ）を含む。また、本明細書において、以前に未解決のバリアントの区別を可能にする相対保持時間（ＲＲＴ）パラメータが提供される。また本明細書では、タンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）を利用して、最も一般的なバリアントの対：同重体のＡ６７Ｔ及びＡ７０Ｔを区別する方法が提供される。
【0008】
本明細書に記載の方法は、強化された自動化、ヒューマンエラーを引き起こしやすい詳細な手動計算の回避、及びより多くをモニタリングし、新しいＩＧＦ－１バリアントを発見する能力を含む。このアプローチでは、ＥｘＡＣデータベースから６つのバリアント：Ｐ６６Ａ、Ａ６７Ｓ、Ｓ３４Ｎ、Ａ３８Ｖ、Ａ６７Ｔ、及びＡ７０Ｔが同定され、２つは以前に報告されたＶ４４Ｍ及びＡ６７Ｖバリアントであり、６つは報告されていないバリアント：Ｙ３１Ｈ、Ｓ３３Ｐ、Ｒ５０Ｑ、Ｒ５６Ｋ、Ｔ４１Ｉ、及びＡ６２Ｔであった。本明細書で提供される方法は、患者のＩＧＦ－１状態のプロファイルを含み、ＩＧＦ－１バリアントにおける遺伝子型－表現型の関係を探索するために使用され得る。
【0009】
本明細書に記載の方法は、ＷＴの定量を損なうことなく、４質量／電荷（ｍ／ｚ）比を使用して、群中の１５のＩＧＦ－１バリアントを同時にモニタリングするためのものである。各群内のほとんどのバリアントは、その同位体分布及び相対保持時間によって区別されるが、ＭＳ／ＭＳによる再分析により、Ａ６７ＴとＡ７０Ｔとが区別される。ＬＣ－ＭＳデータの計算及び解釈は、商用機器ソフトウェアを使用して自動化され、オペレータがほとんど介入する必要がない。したがって、結果の解釈におけるヒューマンエラーからワークフローを保護する。
【0010】
いくつかの実施形態では、方法は、目的のバリアントの各々について、以下の質量／電荷（ｍ／ｚ）比を検出することを含む。
【表1】
【0011】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、試料中のインスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）バリアントを検出するための方法であり、本方法は、試料中のＩＧＦ－Ｉをイオン化して、質量分析によって検出可能な１つ以上のイオンを生成することと、質量分析によって、１０９３．５±０．５、１０８９．８±０．５、１０９５±０．５、１０９７．０９±０．５、１０９８．０９±０．５からなる群から選択される質量電荷比を有するイオンを含むイオンのうちの１つ以上を検出することと、検出されたイオンを使用して、試料中のＩＧＦ１バリアントの存在を決定することと、を含む。
【0012】
いくつかの実施形態では、ｍ／ｚ１０９３．５±０．５の検出は、ＷＴ４又はＰ６６Ｔ１の存在を決定する。
【0013】
いくつかの実施形態では、ｍ／ｚ１０８９．８±０．５の検出は、Ｐ６６Ａ４、Ｒ５５Ｋ６、又はＲ３６Ｑ６の存在を決定する。
【0014】
いくつかの実施形態では、ｍ／ｚ１０９５．８±０．５の検出は、Ａ６７Ｓ４又はＴ２９Ｉ８の存在を決定する。
【0015】
いくつかの実施形態では、ｍ／ｚ１０９７．０９±０．５の検出は、Ｓ３４Ｎ２、Ａ７０Ｐ３、Ａ３８Ｖ１、Ｍ５９Ｒ４、又はＡ６７Ｓ１３の存在を決定する。
【0016】
いくつかの実施形態では、ｍ／ｚ１０９８．０９±０．５の検出は、Ｓ３４Ｎ９、Ａ７０Ｐ１０、Ａ３８Ｖ８、Ｍ５９Ｒ１１、Ｖ１７／４４Ｍ４、Ｒ５０Ｗ６、Ｔ４Ｍ６、又はＡ６７／７０Ｔ６の存在を決定する。
【0017】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、イオン化の前に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってタンパク質を精製することを含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、試料は、血漿又は血清を含む。
【0019】
いくつかの実施形態では、試料は、イオン化の前に高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製されてもよい。関連する実施形態では、ＩＧＦ－１及びそのバリアントは、オンライン抽出を装えた多重高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（Ａｒｉａ ＴＬＸ－４）を使用して抽出及び分解される。
【0020】
いくつかの実施形態では、試料は、イオン化の前に固相抽出（ＳＰＥ）によって精製されてもよい。
【0021】
いくつかの実施形態では、質量分析は、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｆｏｃｕｓ Ｈｙｂｒｉｄ四重極オービトラップ機器を含む。
【0022】
いくつかの実施形態では、高分解能／高精度質量分析は、約１０，０００以上、例えば、約１５，０００以上、例えば、約２０，０００以上、例えば、約２５，０００以上の分解能（ＦＷＨＭ）で行われる。いくつかの実施形態では、高分解能／高精度質量分析は、約５０ｐｐｍ以下、例えば、約２０ｐｐｍ以下、例えば、約１０ｐｐｍ以下、例えば、約５ｐｐｍ以下、例えば、約３ｐｐｍ以下の精度で行われる。いくつかの実施形態では、高分解能／高精度質量分析は、約１０，０００以上の分解能（ＦＷＨＭ）及び約５０ｐｐｍ以下の精度で行われる。いくつかの実施形態では、分解能は、約１５，０００超であり、精度は、約２０ｐｐｍ以下である。いくつかの実施形態では、分解能は、約２０，０００以上であり、精度は、約１０ｐｐｍ以下である。好ましくは、分解能は、約２５，０００以上であり、精度は、約５ｐｐｍ以下、例えば、約３ｐｐｍ以下である。
【0023】
いくつかの実施形態では、高分解能／高精度質量分析は、オービトラップ質量分析計、飛行時間（ＴＯＦ）質量分析計、又はフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（フーリエ変換型質量分析計としても知られている）を用いて行われ得る。いくつかの実施形態では、試料は、生体試料、好ましくは血漿又は血清を含んでもよい。
【0024】
いくつかの実施形態では、質量分析によって検出される１つ以上のＩＧＦ－Ｉイオンの量を試料中のＩＧＦ－Ｉタンパク質の量に関連させることは、ヒト又は非ヒトＩＧＦ－Ｉタンパク質（例えば、インタクトな組換えマウス組換えマウスＩＧＦ－Ｉ）などの内部標準との比較を含む。内部標準は、任意選択的に、同位体標識されてもよい。
【0025】
上に列挙された実施形態の特徴は、限定されないが、本発明の方法における使用のために組み合わせることができる。
【0026】
特定の好ましい実施形態では、質量分析は、正イオンモードで行われる。代替的に、質量分析は、負イオンモードで行われる。本明細書に記載の方法において使用される好ましいイオン化技術は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）である。エレクトロスプレーイオン化は、例えば、加熱イオン化源を用いて行われてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、加熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、正イオンモードでの加熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）を含む。
【0027】
好ましい実施形態では、１つ以上の別個に検出可能な内部標準が試料中に提供され、その量はまた、試料中で決定される。これらの実施形態では、目的の分析物と１つ以上の内部標準物との両方の全て又は一部をイオン化して、質量分析計で検出可能な複数のイオンを生成し、各々から生成された１つ以上のイオンを質量分析によって検出する。内部標準は、インタクトな非ヒトＩＧＦ－Ｉ（例えば、同位体標識又は非標識のインタクトな組換えマウスＩＧＦ－Ｉ）、同位体標識されたインタクトなヒトＩＧＦ－Ｉタンパク質からなる群から選択され得る。
【0028】
他の実施形態では、試料中のインタクトなＩＧＦ－Ｉタンパク質の量は、１つ以上の外部参照標準と比較することによって決定することができる。例示的な外部参照標準には、ブランク血漿又は同位体標識された若しくは標識されていないインタクトなヒト若しくは非ヒトＩＧＦ－Ｉ（例えば、同位体標識された若しくは標識されていないインタクトな組換えマウスＩＧＦ－Ｉ）を添加した血清が含まれる。
【0029】
いくつかの実施形態では、分析物の２つ以上の分子同位体形態からの質量分析ピークを含む同位体シグネチャを使用して、研究対象の分析物の同一性を確認することができる。他の実施形態では、１つ以上の同位体形態からの質量分析ピークを使用して、目的の分析物を定量することができる。いくつかの関連する実施形態では、１つの同位体形態からの単一の質量分析ピークを使用して、目的の分析物を定量することができる。他の関連する実施形態では、複数の同位体ピークを使用して、分析物を定量することができる。複数のピークは、任意の適切な数学的処理にかけることができる。いくつかの数学的処理が当該技術分野で既知であり、複数のピーク下の面積を合計すること、又は複数のピークからの応答を平均化することが含まれるが、これらに限定されない。
【0030】
本明細書で使用される場合、特に明記されない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、複数の参照を含む。したがって、例えば、「タンパク質」への言及は、複数のタンパク質分子を含む。
【0031】
本明細書で使用される場合、「ＩＧＦ－Ｉタンパク質」という用語は、完全長ＩＧＦ－Ｉポリペプチド又はその断片、並びに完全長ＩＧＦ－Ｉバリアントポリペプチド又はその断片を指す。ＩＧＦ－Ｉバリアントとしては、例えば、長いＲ３ ＩＧＦ－Ｉが挙げられ、これは、完全なヒトＩＧＦ－Ｉ配列を含むＩＧＦ－Ｉの８３アミノ酸の類似体であり、３位にＧｌｕ（Ｅ）に対するＡｒｇ（Ｒ）の置換（したがって、Ｒ３）及びＮ末端に１３アミノ酸の伸長ペプチドを含む。ＩＧＦ－Ｉのこの類似体は、ＩＧＦ－Ｉペプチドの生物活性を増加させる目的で生成されている。このアナログの質量は、約９１１１．４ダルトンであり、したがって、約１０１４．１±１、１１４０．７±１、１３０３．５±１、及び１５２０．６±１のｍ／ｚ比を有する多電荷の長いＲ３ ＩＧＦ－Ｉイオンが観察され得る。他のＩＧＦ－Ｉバリアントポリペプチドは、例えば、化学修飾された完全長ＩＧＦ－Ｉポリペプチド又はその断片を含み、当業者によって容易に認識される。例示的な化学修飾としては、１つ以上のジスルフィド架橋の還元又は１つ以上のシスチンのアルキル化が含まれ得る。これらの例示的な化学修飾は、対応する非修飾ＩＧＦ－Ｉポリペプチドの質量と比較して、ＩＧＦ－Ｉバリアントポリペプチドの質量の増加をもたらす。１つ以上のジスルフィド架橋の減少は、分子の質量の比較的わずかな変化をもたらし、得られる質量電荷比は、本明細書に記載の質量電荷比の範囲内にある。非修飾のＩＧＦ－Ｉポリペプチドからの質量偏差をもたらす他の化学修飾も、ＩＧＦ－Ｉタンパク質の意味内に包含される。当業者は、化学修飾によるＩＧＦ－Ｉタンパク質への原子の付加が、質量分析中に質量電荷比の観察される増加をもたらすことを理解する。したがって、化学修飾から生じるＩＧＦ－Ｉタンパク質のバリアントは、ＩＧＦ－Ｉタンパク質の意味内に含まれ、本発明の方法に従って検出可能である。
【0032】
本明細書で使用される場合、ポリペプチドを説明する「インタクト」という用語は、完全長（すなわち、非断片化）ポリペプチドを指す。インタクトなＩＧＦ－Ｉは、例えば、７０個のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、インタクトな長いＲ３ ＩＧＦ－Ｉは、完全なヒトＩＧＦ－Ｉ配列を含むＩＧＦ－Ｉの８３アミノ酸の類似体であり、３位にＧＬｕ（Ｅ）に対するＡｒｇ（Ｒ）の置換（したがって、Ｒ３）及びＮ末端に１３アミノ酸の伸長ペプチドを有する。ＩＧＦ－Ｉのインタクトでない形態（すなわち、断片）もまた、本明細書に記載の方法によって検出することができる。例えば、約１，０００ダルトン以上、例えば、約１５００ダルトン以上、例えば、約２０００ダルトン以上、例えば、約２５００ダルトン以上、例えば、約３０００ダルトン以上、例えば、約４０００ダルトン以上、例えば、約５０００ダルトン以上、例えば、約６０００ダルトン以上、例えば、約７０００ダルトン以上の分子量を有するＩＧＦ－Ｉタンパク質の断片は、本明細書に記載の方法によって検出することができる。
【0033】
「精製」又は「精製すること」という用語は、目的の分析物の検出を妨げ得る試料中の他の成分と比較して、目的の１つ以上の分析物の量を濃縮する手順を指す。必須ではないが、「精製」は、全ての干渉成分、又は目的の分析物以外の全ての材料を完全に除去することができる。様々な手段による試料の精製は、１つ以上の干渉物質、例えば、質量分析による選択された親又は子イオンの検出を干渉し得るか又は干渉し得ない１つ以上の物質の相対的な低減を可能にすることができる。この用語が使用される相対的な低減は、精製される材料中に目的の分析物とともに存在する任意の物質が精製によって完全に除去されることを必要としない。
【0034】
「試料」という用語は、目的の分析物を含み得る任意の試料を指す。本明細書で使用される場合、「体液」という用語は、個体の体から単離され得る任意の流体を意味する。例えば、「体液」は、血液、血漿、血清、胆汁、唾液、尿、涙、汗などを含み得る。好ましい実施形態では、試料は、体液試料、好ましくは血漿又は血清を含む。
【0035】
「固相抽出」又は「ＳＰＥ」という用語は、溶液が通過する固体又はその周りの固体（すなわち、固相）の溶液（すなわち、移動相）に溶解又は懸濁した成分の親和性の結果として、化学混合物が成分へと分離されるプロセスを指す。いくつかの例では、移動相が固相を通過する又は固相の周りを通過するとき、移動相の望ましくない成分は、固相によって保持され得、移動相中の分析物の精製がもたらされる。他の例では、分析物は、固相によって保持され得、移動相の望ましくない成分が固相を通過するか、又は固相の周りを通過することを可能にする。これらの例では、次いで、第２の移動相を使用して、更なる処理又は分析のために、保持された分析物を固相から溶出させる。ＳＰＥは、単一モード機構又は混合モード機構を介して動作することができる。本明細書で使用される場合、ＳＰＥは、例えば、乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）カラムなどの抽出カラム又はカートリッジで行うことができる。混合モード機構は、同じカラムでイオン交換及び疎水性保持を利用する。例えば、混合モードＳＰＥカラムの固相は、強陰イオン交換及び疎水性保持を示し得るか、又は強陽イオン交換及び疎水性保持を示し得る。
【0036】
「クロマトグラフィー」という用語は、液体又はガスによって運ばれる化学混合物が、それらが静止した固相を通って流れるときに、化学物質の差異的な分布の結果として成分に分離されるプロセスを指す。
【0037】
「液体クロマトグラフィー」又は「ＬＣ」という用語は、流体が微細に分割された物質のカラムを通って、又は毛細血管通路を通って均一に滲出するときの、流体溶液の１つ以上の成分の選択的遅延のプロセスを意味する。遅延は、１つ以上の固定相とバルク流体（すなわち、移動相）との間の混合物の成分の分布から生じ、この流体は、固定相に対して移動する。「液体クロマトグラフィー」を用いる分離技術の例としては、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及び乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）（高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）又は高スループット液体クロマトグラフィーとしても知られている）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＳＰＥカラムは、ＬＣカラムと組み合わせて使用することができる。例えば、試料をＴＦＬＣ抽出カラムで精製し、続いて、ＨＰＬＣ分析用カラムで更に精製してもよい。
【0038】
「高性能液体クロマトグラフィー」又は「ＨＰＬＣ」（「高圧液体クロマトグラフィー」としても知られている）という用語は、固定相、典型的には高密度充填カラムを介して加圧下で移動相を強制することによって分離の程度が増加する液体クロマトグラフィーを指す。
【0039】
「乱流液体クロマトグラフィー」又は「ＴＦＬＣ」（高乱流液体クロマトグラフィー又は高スループット液体クロマトグラフィーとしても知られている）という用語は、カラム充填材を通してアッセイされる材料の乱流を、分離を行うための基礎として利用するクロマトグラフィーの形態を指す。ＴＦＬＣは、質量分析による分析の前に、２つの無名の薬物を含有する試料の調製に適用されている。例えば、Ｚｉｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ ８５４：２３－３５（１９９９）を参照されたい；ＴＦＬＣを更に説明する米国特許第５，９６８，３６７号、同第５，９１９，３６８号、同第５，７９５，４６９号、及び同第５，７７２，８７４号も参照されたい。当業者は、「乱流」を理解する。流体がゆっくりと滑らかに流れるとき、その流れは「層流」と呼ばれる。例えば、低流速でＨＰＬＣカラムを通って移動する流体は、層状である。層流では、流体の粒子の動きは秩序立っており、粒子は一般に直線状に移動する。より速い速度では、水の慣性は流体の摩擦力と乱流の結果を克服する。不規則な境界に接触していない流体は、摩擦によって遅くなるか、又は不均一な表面によって偏向した流体を「追い越す」。流体が乱流しているとき、それは渦（ｅｄｄｉｅｓ）及び渦（ｗｈｉｒｌｓ）（又は渦（ｖｏｒｔｉｃｅｓ））を巻いて流れ、流れが層状のときよりも「抗力」が大きくなる。流体の流れが層流又は乱流であるかを判断するのに役立つ多数の参考文献が利用可能である（例えば、Ｔｕｒｂｕｌｅｎｔ Ｆｌｏｗ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，Ｐ．Ｓ．Ｂｅｒｎａｒｄ ＆ Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｌａｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（２０００）、Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｔｕｒｂｕｌｅｎｔ Ｆｌｏｗ，Ｊｅａｎ Ｍａｔｈｉｅｕ ＆ Ｊｕｌｉａｎ Ｓｃｏｔｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１））。
【0040】
「ガスクロマトグラフィー」又は「ＧＣ」という用語は、試料混合物が気化され、（窒素又はヘリウムとしての）キャリアガスの流れに注入され、液体又は粒子固体からなる固定相を含むカラムを通って移動し、固定相に対する化合物の親和性に従ってその成分化合物に分離されるクロマトグラフィーを指す。
【0041】
「オンライン」及び「インライン」という用語は、例えば、「オンライン自動化された方法」又は「オンライン抽出」で使用されるように、オペレータの介入を必要とせずに行われる手順を指す。対照的に、本明細書で使用される「オフライン」という用語は、オペレータの手動の介入を必要とする手順を指す。したがって、試料が沈殿に供され、次いで、上清がオートサンプラーに手動でロードされる場合、沈殿ステップ及びロードステップは、後続のステップからオフラインである。本方法の様々な実施形態では、１つ以上のステップは、オンライン自動化様式で行われ得る。
【0042】
「質量分析」又は「ＭＳ」という用語は、その質量によって化合物を同定するための分析技術を指す。ＭＳは、質量電荷比又は「ｍ／ｚ」に基づいてイオンをフィルタリング、検出、及び測定する方法を指す。ＭＳ技術は、一般に、（１）化合物をイオン化して荷電化合物を形成すること、及び（２）荷電化合物の分子量を検出し、質量電荷比を計算すること、を含む。化合物は、任意の好適な手段によってイオン化及び検出することができる。「質量分析計」は、一般に、イオナイザー及びイオン検出器を含む。一般に、目的の１つ以上の分子がイオン化され、続いて、磁場及び電場の組み合わせにより、イオンが質量（「ｍ」）及び電荷（「ｚ」）に依存する空間内の経路に従う質量分析機器に導入される。例えば、「Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｆｒｏｍ Ｓｕｒｆａｃｅｓ」と題する米国特許第６，２０４，５００号、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」と題する同第６，１０７，６２３号、「ＤＮＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｂａｓｅｄ Ｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」と題する同第６，２６８，１４４号、「Ｓｕｒｆａｃｅ－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ａｎｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｆｏｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎａｌｙｔｅｓ」と題する同第６，１２４，１３７号、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １９９９，２：２６４－７６、及びＭｅｒｃｈａｎｔ ａｎｄ Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２０００，２１：１１６４－６７を参照されたい。
【0043】
本明細書で使用される場合、「高分解能／高精度質量分析」は、固有の化学イオンを確認するのに十分な精度及び精度で荷電種の質量電荷比を測定することができる質量分析器で行われる質量分析を指す。イオンからの個々の同位体ピークが容易に識別可能である場合、イオンに対して固有の化学イオンの確認が可能である。固有の化学イオンを確認するために必要な特定の分解能及び質量精度は、イオンの質量及び電荷状態によって異なる。
【0044】
本明細書で使用される場合、「分解能」又は「分解能（ＦＷＨＭ）」という用語（当該技術分野では「ｍ／Δｍ５０％」としても知られている）は、観察された質量電荷比を５０％最大高さでの質量ピークの幅（半最大値全幅、（Ｆｕｌｌ Ｗｉｄｔｈ Ｈａｌｆ Ｍａｘｉｍｕｍ）「ＦＷＨＭ」）で割ったものを指す。分解能の差の効果を、図１Ａ～Ｃに示し、これは、約１０９３のｍ／ｚを有するイオンの理論的質量スペクトルを示す。図１Ａは、約３０００の分解能を有する質量分析器（従来の四重極質量分析器の典型的な動作条件）からの理論的な質量スペクトルを示す。図１Ａに見られるように、個々の同位体ピークは識別可能ではない。比較すると、図１Ｂは、約１０，０００の分解能を有する質量分析器からの理論的な質量スペクトルを示し、明らかに識別可能な個々の同位体ピークを有する。図１Ｃは、約１２，０００の分解能を有する質量分析器からの理論的な質量スペクトルを示す。この最高分解能では、個々の同位体ピークはベースラインから１％未満の寄与を含む。
【0045】
本明細書で使用される場合、質量分析に関して「固有の化学イオン」は、単一の原子構造を有する単一のイオンを指す。単一のイオンは、単一又は多重に荷電され得る。
【0046】
本明細書で使用される場合、質量分析に関する「精度」（又は「質量精度」）という用語は、調査されたイオンの真のｍ／ｚからの機器応答の潜在的な偏差を指す。精度は、典型的には、百万分率（ｐｐｍ）で表される。質量精度の差の影響を、図２Ａ～Ｄに示す。これらは、１０９３．５２０９４のｍ／ｚでの理論上のピークについて、検出されたｍ／ｚと実際のｍ／ｚとの間の潜在的な差の境界を示す。図２Ａは、１２０ｐｐｍの精度で検出されたｍ／ｚの潜在的な範囲を示す。対照的に、図２Ｂは、５０ｐｐｍの精度で検出されたｍ／ｚの潜在的な範囲を示す。図２Ｃ及び２Ｄは、２０ｐｐｍ及び１０ｐｐｍの精度で検出されたｍ／ｚの更に狭い潜在的な範囲を示す。
【0047】
本発明の高分解能／高精度質量分析法は、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、５０，０００、１００，０００、又は更にそれ以上のＦＷＨＭで質量分析を行うことができる機器で実施してもよい。同様に、本発明の方法は、５０ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、１５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、５ｐｐｍ、３ｐｐｍ未満、又は更にそれ以下の精度で質量分析を行うことができる機器で実施してもよい。これらの性能特性が可能な機器には、特定のオービトラップ質量分析器、飛行時間（「ＴＯＦ」）質量分析器、又はフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析器を組み込むことができる。好ましい実施形態では、本方法は、オービトラップ質量分析器又はＴＯＦ質量分析器を含む機器を用いて行われる。
【0048】
「オービトラップ」という用語は、外側のバレル状電極及び同軸内側電極からなるイオントラップを説明する。イオンは、電極間の電界に接線方向に注入され、イオンが同軸内側電極を周回するとき、イオンと電極との間の静電相互作用が遠心力によってバランスが保たれるため捕捉される。イオンが同軸内側電極を周回するとき、捕捉されたイオンの軌道経路は、イオンの質量電荷比に対して高調波周波数で中央電極の軸に沿って振動する。軌道振動周波数の検出により、オービトラップを高精度（最小１～２ｐｐｍ）及び高分解能（ＦＷＨＭ）（最大約２００，０００）の質量分析器として使用することができる。オービトラップに基づく質量分析器は、米国特許第６，９９５，３６４号に詳細に記載されている（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。様々な分析物の定性及び定量分析について、オービトラップ分析器の使用が報告されている。例えば、米国特許出願公開第２００８／０１１８９３２号（２００７年１１月９日出願）、Ｂｒｅｄｅｈｏｅｆｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，２００８，２２：４７７－４８５、Ｌｅ Ｂｒｅｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，２００８，２２：３１３０－３６、Ｔｈｅｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００８，２７：３５－５０、Ｔｈｏｍａｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，２００８，４３：９０８－１５、Ｓｃｈｅｎｋ，ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００８，１：４１、及びＯｌｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００７，４：７０９－１２を参照されたい。
【0049】
「負イオンモードで動作する」という用語は、負イオンが生成され検出される質量分析法を指す。本明細書で使用される「正イオンモードで動作する」という用語は、正イオンが生成及び検出される質量分析法を指す。
【0050】
「イオン化」又は「イオン化させること」という用語は、１つ以上の電子単位に等しい正味の電荷を有するイオンを生成するプロセスを指す。負イオンは、１つ以上の電子単位の正味の負電荷を有するものであり、正イオンは、１つ以上の電子単位の正味の正電荷を有するものである。
【0051】
「選択的イオンモニタリング」という用語は、比較的狭い質量範囲内、典型的には、約１質量単位以下のイオンのみが検出される質量分析装置の検出モードである。
【0052】
「選択反応モニタリング」としても知られている「多重反応モード」は、前駆イオン及び１つ以上の断片イオンが選択的に検出される質量分析機器の検出モードである。
【0053】
「定量下限（ｌｏｗｅｒ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、「定量下限（ｌｏｗｅｒ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ）」、又は「ＬＬＯＱ」という用語は、測定が定量的に意味を持つようになる点を指す。このＬＬＯＱでの分析物の応答は、２０％未満の相対標準偏差（ＲＳＤ％）及び８５％～１１５％の精度で、同定可能、離散的、及び再現可能である。
【0054】
「検出限界」又は「ＬＯＤ」という用語は、測定値がその測定に関連する不確かさよりも大きくなる点である。ＬＯＤは、０濃度での平均のＲＳＤの４倍として定義される。
【0055】
試料からの２つ以上の分析物の量を同時に検出することに適用される「同時」という用語は、同じ試料注入からの試料中の２つ以上の分析物の量を反映するデータを取得することを意味する。各分析物についてのデータは、用いられる機器技術に応じて、順次又は並行して取得することができる。例えば、インタクトなＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩタンパク質などの２つの分析物を含有する単一の試料がＨＰＬＣカラムに注入されてもよく、次いで、各分析物が次々に溶出され、その結果、分析物が質量分析計に順次導入されてもよい。これらの２つの分析物の各々の量を決定することは、両方の分析物がＨＰＬＣへの同じ試料の注入から生じるため、本明細書における目的のために同時に行われる。
【0056】
体液試料中の分析物の「量」は、一般に、試料の体積で検出可能な分析物の質量を反映する絶対値を指す。しかしながら、量はまた、別の分析物の量と比較した相対量を企図する。例えば、試料中の分析物の量は、試料中に通常存在する分析物の対照レベル又は正常レベルよりも大きい量であり得る。
【0057】
イオンの質量の測定を含まない定量測定に関連して本明細書で使用される「約」という用語は、示された値プラス又はマイナス１０％を指す。質量分析機器は、所与の分析物の質量を決定する際にわずかに変化し得る。イオンの質量又はイオンの質量電荷比の文脈で「約」という用語は、＋／－０．５０原子質量単位を指す。
【0058】
上記の本発明の概要は非限定的であり、本発明の他の特徴及び利点は、本発明の以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【0059】
【図1】同位体ピークインデックスが同位体ピーク相対強度と結びついているＩＰｉ概念の原理を示す。どのような電荷状態でも、ＩＧＦ－１ ＷＴ及び全てのバリアントは、このインデックス強度分布に従う。ＩＰｒＩは、ＷＴ ＩＧＦ－１の定量に使用されるように、ＩＰ４ピークの強度に対して計算される。
【図2-1】２人の異なる患者からの検体についてのＶＧ４ピークを含有するＬＣ－ＭＳデータを示す。Ａ：患者１のＷＴ４のＥＩＣ、Ｂ：患者１のＶＧ４のＥＩＣ、Ｃ：患者１のバリアント同位体エンベロープ、長方形はＩＰ６がＶＧ４で検出されたことを示す。
【図2-2】２人の異なる患者からの検体についてのＶＧ４ピークを含有するＬＣ－ＭＳデータを示す。Ｄ：患者２のＷＴ４のＥＩＣ、Ｅ：患者２のＶＧ４のＥＩＣ、Ｆ：患者２のバリアント同位体エンベロープ、長方形はＩＰ４がＶＧ４で検出されたことを示す。
【図3-1】自動化されたＩＧＦ－１バリアントの検出を示す。レポートは、ＴｒａｃｅＦｉｎｄｅｒ５．０Ｃｌｉｎｉｃａｌで生成される。バリアントレポートには、ＩＧＦ－１バリアントを含むことが疑われる検体のみが表示される。ＩＧＦ－１定量レポートは、ホモ接合性バリアントの疑いをマークする。
【図3-2】自動化されたＩＧＦ－１バリアントの検出を示す。レポートは、ＴｒａｃｅＦｉｎｄｅｒ５．０Ｃｌｉｎｉｃａｌで生成される。バリアントレポートには、ＩＧＦ－１バリアントを含むことが疑われる検体のみが表示される。ＩＧＦ－１定量レポートは、ホモ接合性バリアントの疑いをマークする。
【図4】抽出及び分析ポンプのためのＬＣ勾配を示す。移動相Ａは、０．１％ギ酸を含む水であり、移動相Ｂは、０．１％ギ酸を含む２０％イソプロピルアルコール、８０％アセトニトリルである。
【図5】様々なエネルギーのインソースＣＩＤ（ＳＩＤ）及びＨＣＤとのＳＩＭスキャンの比較を示す。赤い長方形は、最高の感度を示す。
【図6】ＶＧ２からの未知のバリアントを示す。ＶＧ２のｍ／ｚのピークは、ＩＰ１０又はＩＰ１１のいずれかに対応し、そのグループからの任意の既知のバリアント（ＩＰ４又はＩＰ８のいずれか）と一致しなかった。ＤＮＡ配列決定は、バリアントＳ３３Ｐを明らかにし、Ｓ３３Ｐ１０の計算値ｍ／ｚ１０９５．８１３０と一致する（ＶＧ２のｍ／ｚとは６ｐｐｍ異なる）。
【図7】患者検体Ａ及びＷＴにおけるＷＴ及びバリアントＡ６７Ｔ、並びに患者検体ＢにおけるバリアントＡ７０Ｔの存在を示す、タンデムＭＳ／ＭＳ後の選択されたｙイオンの抽出されたイオンクロマトグラムを示す。
【図8-1】ＩＧＦ－１バリアントの同時ＩＧＦ－１定量及び検出を示す。ＭＳ実験は、低ＮＣＥ（１０）及び高ＮＣＥ（３０）を有する２サイクルのワイドアイソレーションウインドウＰＲＭスキャンとして設計されている。低エネルギースキャンを使用してＩＧＦ－１を検出及び定量することができ、一方、高エネルギースキャンを使用して、Ａ６７ＴとＡ７０Ｔのバリアントを区別するために再利用されたｙイオンを抽出することができる。定量的なピーク当たりのスキャンの数は、この場合１３である。これは、より速い機器又はより低い検出器解像度を用いて更に増やすことができる。
【図8-2】ＩＧＦ－１バリアントの同時ＩＧＦ－１定量及び検出を示す。ＭＳ実験は、低ＮＣＥ（１０）及び高ＮＣＥ（３０）を有する２サイクルのワイドアイソレーションウインドウＰＲＭスキャンとして設計されている。低エネルギースキャンを使用してＩＧＦ－１を検出及び定量することができ、一方、高エネルギースキャンを使用して、Ａ６７ＴとＡ７０Ｔのバリアントを区別するために再利用されたｙイオンを抽出することができる。定量的なピーク当たりのスキャンの数は、この場合１３である。これは、より速い機器又はより低い検出器解像度を用いて更に増やすことができる。
【図9】ＩＧＦ－１アッセイの定量限界及び検出限界を示す。濃度（ｘ軸）及びＳＤ（ｙ軸）の値は、ｎｇ／ｍＬである。
【図10】ＩＧＦ－２アッセイの定量限界及び検出限界を示す。濃度（ｘ軸）及びＳＤ（ｙ軸）の値は、ｎｇ／ｍＬである。
【図11】ＬＣ－ＭＳ対ＲＩＡのＩＧＦ－１アッセイ分割試料の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【0060】
本発明の方法で使用するための好適な試験試料は、目的の分析物を含有し得る任意の試験試料を含む。いくつかの好ましい実施形態では、試料は生体試料であり、すなわち、動物、細胞培養物、臓器培養物などの任意の生体源から得られる試料である。特定の好ましい実施形態では、試料は、哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマなど）から得られる。特に好ましい哺乳動物は、霊長類であり、最も好ましくは男性又は女性のヒトである。好ましい試料は、血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、又は組織試料などの体液、好ましくは血漿及び血清を含む。かかる試料は、例えば、患者、すなわち、疾患又は状態の診断、予後、又は治療のために臨床環境における生存者、男性、又は女性から入手することができる。
【0061】
本発明の実施形態で使用するための既知の濃度を有する精度管理（ＱＣ）プールは、好ましくは、意図された試料マトリックスと同様のマトリックスを使用して調製される。
【0062】
質量分析のための試料調製
質量分析の準備において、ＩＧＦ－Ｉタンパク質は、例えば、固相抽出（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）（ＳＰＥ）、ＬＣ、濾過、遠心分離、薄層クロマトグラフィー（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＴＬＣ）、キャピラリー電気泳動を含む電気泳動、免疫親和性分離を含む親和性分離、酢酸エチル若しくはメタノール抽出を含む抽出方法、並びにカオトロピック剤の使用、又は上記の任意の組み合わせなどを含む、当該技術分野で既知の様々な方法によって、試料中の１つ以上の他の成分（例えば、他のタンパク質）に対して濃縮され得る。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィー、及び／又はＳＰＥ、及び／又はタンパク質沈殿を組み合わせて使用することができる。
質量分析の準備において、ＩＧＦ－Ｉタンパク質は、例えば、固相抽出（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）（ＳＰＥ）、ＬＣ、濾過、遠心分離、薄層クロマトグラフィー（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＴＬＣ）、キャピラリー電気泳動を含む電気泳動、免疫親和性分離を含む親和性分離、酢酸エチル若しくはメタノール抽出を含む抽出方法、並びにカオトロピック剤の使用、又は上記の任意の組み合わせなどを含む、当該技術分野で既知の様々な方法によって、試料中の１つ以上の他の成分（例えば、他のタンパク質）に対して濃縮され得る。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィー、及び／又はＳＰＥ、及び／又はタンパク質沈殿を組み合わせて使用することができる。
【0063】
タンパク質沈殿は、試験試料、特に血清又は血漿などの生体試料を調製する１つの方法である。タンパク質精製方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｐｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ ２００３，７８５：２６３－２７５には、本発明の方法における使用に好適なタンパク質沈殿技術が記載されている。タンパク質沈殿を使用して、試料からタンパク質の大部分を除去し、上清中のＩＧＦ－Ｉ及び／又はＩＧＦ－ＩＩタンパク質を残すことができる。試料を遠心分離して、液体上清を沈殿したタンパク質から分離することができ、代替的に試料を濾過して、沈殿したタンパク質を除去することができる。次いで、得られた上清又は濾液を質量分析、又は代替的に固相抽出及び／若しくは液体クロマトグラフィー、並びにその後の質量分析に直接適用することができる。特定の実施形態では、タンパク質沈殿物（例えば、酸性エタノールタンパク質沈殿物）を使用すると、質量分析又はＨＰＬＣ及び質量分析の前のＴＦＬＣ、ＳＰＥ、又は他のオンライン抽出の必要性がなくなる可能性がある。
【0064】
好ましい実施形態では、試料から天然のインタクトなＩＧＦ－Ｉ及び／又はＩＧＦ－ＩＩを抽出するために、液－液抽出方法（酸エタノール抽出など）が使用される。これらの実施形態では、１０μｌ～５００μｌ（例えば、２５μｌ～２５０μｌ、例えば、約１００μｌ）の試料が、抽出溶媒の一部に添加される。抽出溶媒の量は、試料体積に見合っており、使用する抽出溶媒に応じて変動し得るが、好ましくは、約５０μｌ～１０００μｌである。試料／溶媒混合物を混合し、遠心分離し、（使用される溶媒に応じて）上清又は有機相の一部が更なる分析のために取り出される。溶媒は、例えば、窒素流下で取り出された部分から除去され得、残渣は、液体－液体抽出に使用したものとは異なる溶媒中で再構成される。次いで、得られた溶液の少なくとも一部を、質量分析の前に、ＳＰＥ及び／又はＬＣなどの追加の処理ステップに供することができる。
【0065】
質量分析の前に使用され得る試料精製の別の方法は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）である。ＨＰＬＣを含む液体クロマトグラフィーの特定の方法は、比較的遅い層流技術に依存している。従来のＨＰＬＣ分析は、カラムを通る試料の層流が試料から目的の分析物を分離するための基礎であるカラム充填材に依存する。当業者は、そのようなカラムでの分離が拡散プロセスであり、ＩＧＦ－Ｉ及び／又はＩＧＦ－ＩＩを用いた使用に好適なＨＰＬＣ、機器、及びカラムを含むＬＣを選択することができることを理解するであろう。クロマトグラフィーカラムは、典型的には、化学部分の分離（すなわち、分画）を容易にするための媒体（すなわち、充填材）を含む。媒体は、微粒子を含んでもよく、又は多孔質チャネルを有するモノリシック材料を含んでもよい。媒体の表面は、典型的には、様々な化学部分と相互作用して化学部分の分離を容易にする結合表面を含む。１つの好適な結合表面は、アルキル結合表面又はシアノ結合表面などの疎水性結合表面である。アルキル結合表面は、Ｃ－４、Ｃ－８、Ｃ－１２、又はＣ－１８結合アルキル基を含み得る。好ましい実施形態では、カラムは、Ｃ－１８アルキル結合カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＯｎｙｘモノリシックＣ－１８カラムなど）である。クロマトグラフィーカラムは、試料を受け入れるための入口ポートと、分画試料を含む溶出液を排出するための出口ポートと、を含む。試料は、入口ポートに直接又はＳＰＥカラム（例えば、オンラインＳＰＥガードカートリッジ又はＴＦＬＣカラム）から供給されてもよい。
【0066】
一実施形態では、試料は、入口ポートでＬＣカラムに適用され、溶媒又は溶媒混合液で溶出され、出口ポートで排出され得る。目的の分析物を溶出するために異なる溶媒モードを選択することができる。例えば、液体クロマトグラフィーは、勾配モード、アイソクラティックモード、又は多型（すなわち、混合）モードを使用して行うことができる。クロマトグラフィー中、材料の分離は、溶出液の選択（「移動相」としても知られている）、溶出モード、勾配条件、温度などの変数によって影響を受ける。
【0067】
特定の実施形態では、分析物は、１つ以上の他の材料が保持されない一方で、目的の分析物がカラム充填材によって可逆的に保持される条件下で、試料をカラムに適用することによって精製することができる。これらの実施形態では、目的の分析物がカラムによって保持される第１の移動相条件を採用することができ、その後、保持されなかった材料を洗い流して、保持された材料をカラムから取り出すための第２の移動相条件を採用することができる。代替的に、分析物は、目的の分析物が１つ以上の他の材料と比較して差次的な速度で溶出する移動相条件下でカラムに試料を適用することによって精製することができる。そのような手順は、試料の１つ以上の他の成分と比較して、１つ以上の目的の分析物の量を濃縮することができる。
【0068】
いくつかの実施形態では、ＨＰＬＣは、アルキル結合分析用カラムクロマトグラフィーシステムを用いて行われる。特定の実施形態では、Ｃ－１８分析用カラム（例えば、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＯｎｙｘモノリシックＣ１８、又は同等物）が使用される。特定の実施形態では、ＨＰＬＣ及び／又はＴＦＬＣは、移動相Ａとして水中ＨＰＬＣグレード０．２％ギ酸、及び移動相Ｂとしてアセトニトリル中０．２％ギ酸を使用して行われる。
【0069】
バルブ及びコネクター配管を慎重に選択することによって、２つ以上のクロマトグラフィーカラムを、必要に応じて材料が手動ステップを必要とせずに次から次へと通過するように、接続することができる。好ましい実施形態では、バルブ及び配管の選択は、必要なステップを実行するように事前にプログラムされたコンピュータによって制御される。最も好ましくは、クロマトグラフィーシステムはまた、かかるオンライン様式で検出器システム（例えば、ＭＳシステム）に接続される。したがって、オペレータは、試料のトレイをオートサンプラーに配置することができ、残りの動作は、コンピュータ制御下で実行され、選択された全ての試料の精製及び分析をもたらす。
【0070】
いくつかの実施形態では、ＴＦＬＣは、質量分析の前にＩＧＦ－Ｉタンパク質又は断片を精製するために使用され得る。そのような実施形態では、試料は、分析物を捕捉するＴＦＬＣカラムを使用して抽出され、次いで、イオン化前に第２のＴＦＬＣカラム又は分析用ＨＰＬＣカラム上で溶出及びクロマトグラフィー処理され得る。例えば、ＴＦＬＣ抽出カラムによる試料抽出は、大きな粒径（５０μｍ）の充填カラムで達成され得る。次に、このカラムから溶出された試料を、質量分析の前に更に精製するためにＨＰＬＣ分析用カラムに移してもよい。これらのクロマトグラフィー手順に関与するステップは、自動化された様式で連結され得るため、分析物の精製中、オペレータが関与する必要性を最小限に抑えることができる。この機能により、時間とコストを節約し、オペレータエラーの可能性を排除することができる。
【0071】
いくつかの実施形態では、タンパク質沈殿は、血清からの酸性エタノール抽出によって達成され、得られた溶液は、ＳＰＥに供され、好ましくは、Ｃ－１８抽出カラム（例えば、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｏｎｙｘ Ｃ－１８ガードカートリッジ又は同等物）を用いてオンラインで行われる。次いで、ＳＰＥカラムからの溶出液を、質量分析の前に、オンライン様式でＨＰＬＣカラムなどの分析用ＬＣカラムに適用してもよい。
【0072】
質量分析による検出及び定量
質量分析は、質量分析計を使用して行われ、質量分析計は、試料をイオン化し、更なる分析のために荷電分子を生成するためのイオン源を含む。様々な実施形態では、ＩＧＦ－Ｉ及び／又はＩＧＦ－ＩＩタンパク質は、当業者に既知の任意の好適な方法によってイオン化され得る。例えば、試料のイオン化は、電子イオン化、化学イオン化、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、光子イオン化、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、光イオン化、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）、高速原子衝撃（ＦＡＢ）、液体二次イオン化（ＬＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電界イオン化、電界脱離、サーモスプレーイオン化／プラズマスプレーイオン化、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）、及び粒子ビームイオン化によって行われ得る。当業者は、イオン化方法の選択が、測定される分析物、試料の種類、検出器の種類、ポジティブモード対ネガティブモードの選択などに基づいて決定され得ることを理解するであろう。用いる特定のイオン化の方法及び条件に応じて、ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩタンパク質は、いくつかの異なる電荷状態にイオン化され得る。イオン化源は、生成される電荷状態の分散を最小限に抑えるように選択され得る。いくつかの実施形態では、ＥＳＩ（任意選択的に加熱型）がイオン化源として使用され、イオン化条件は、観察された多価ＩＧＦ－Ｉ及び／又はＩＧＦ－ＩＩタンパク質イオンの分散を最小限に抑えるように最適化される。
質量分析は、質量分析計を使用して行われ、質量分析計は、試料をイオン化し、更なる分析のために荷電分子を生成するためのイオン源を含む。様々な実施形態では、ＩＧＦ－Ｉ及び／又はＩＧＦ－ＩＩタンパク質は、当業者に既知の任意の好適な方法によってイオン化され得る。例えば、試料のイオン化は、電子イオン化、化学イオン化、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、光子イオン化、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、光イオン化、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）、高速原子衝撃（ＦＡＢ）、液体二次イオン化（ＬＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電界イオン化、電界脱離、サーモスプレーイオン化／プラズマスプレーイオン化、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）、及び粒子ビームイオン化によって行われ得る。当業者は、イオン化方法の選択が、測定される分析物、試料の種類、検出器の種類、ポジティブモード対ネガティブモードの選択などに基づいて決定され得ることを理解するであろう。用いる特定のイオン化の方法及び条件に応じて、ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩタンパク質は、いくつかの異なる電荷状態にイオン化され得る。イオン化源は、生成される電荷状態の分散を最小限に抑えるように選択され得る。いくつかの実施形態では、ＥＳＩ（任意選択的に加熱型）がイオン化源として使用され、イオン化条件は、観察された多価ＩＧＦ－Ｉ及び／又はＩＧＦ－ＩＩタンパク質イオンの分散を最小限に抑えるように最適化される。
【0073】
ＩＧＦ－Ｉ及び／又はＩＧＦ－ＩＩタンパク質は、ポジティブモード又はネガティブモードでイオン化され得る。好ましい実施形態では、１つ以上のＩＧＦ－Ｉ及び／又はＩＧＦ－ＩＩタンパク質は、ポジティブモードでイオン化される。いくつかの実施形態では、インタクトな多価ＩＧＦ－Ｉイオンは、約８５０．８±２、９５７．１±２、１０９３．７±２、及び１２７５．８±２の範囲内のｍ／ｚ比で生成される。いくつかの実施形態では、インタクトな多価ＩＧＦ－ＩＩイオンは、約９３４．６９±２、１０６８．０７±２、１２４５．９２±２、及び１４９４．８９±２の範囲内のｍ／ｚ比で生成される。これらの範囲内の生成された多価イオンの大部分は、示されたｍ／ｚ±１などのより狭いサブ範囲内であり得る。
【0074】
質量分析技術では、一般に、試料がイオン化された後、それによって生成された正又は負に荷電したイオンを分析して、質量電荷比（ｍ／ｚ）を決定することができる。ｍ／ｚを決定するための様々な分析器としては、四重極分析器、イオントラップ分析器、及び飛行時間分析器、並びにオービトラップ分析器が挙げられる。本発明の方法によれば、高分解能／高精度質量分析は、ＩＧＦ－Ｉ及び／又はＩＧＦ－ＩＩタンパク質の定量分析に使用される。すなわち、質量分析は、目的のイオンについて約５０ｐｐｍ以下の精度で、少なくとも１０，０００の分解能（ＦＷＨＭ）を示すことができる質量分析計を用いて行われる。好ましくは、質量分析計は、２０，０００以上の分解能（ＦＷＨＭ）及び約２０ｐｐｍ以下の精度、例えば、２５，０００以上の分解能（ＦＷＨＭ）及び約５ｐｐｍ以下の精度、例えば、２５，０００以上の分解能（ＦＷＨＭ）及び約３ｐｐｍ以下の精度を示す。ＩＧＦ－Ｉ及び／又はＩＧＦ－ＩＩタンパク質のイオンに必要なレベルの性能を示すことができる３つの例示的な質量分析計は、オービトラップ質量分析器、特定のＴＯＦ質量分析器、又はフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析器を含むものである。
【0075】
炭素、酸素、及び窒素などの生物活性分子に見出される元素は、いくつかの異なる同位体形態で自然に存在する。例えば、ほとんどの炭素は１２Ｃとして存在するが、天然に存在する全ての炭素の約１％が１３Ｃとして存在する。したがって、天然に存在する炭素を含有する分子の一部は、少なくとも１つの１３Ｃ原子を含有するであろう。分子中の天然に存在する元素同位体の包含は、複数の分子同位体形態を生じる。分子同位体形態の質量の差は、少なくとも１原子質量単位（ａｍｕ）である。これは、元素同位体が少なくとも１つの中性子（１つの中性子の質量≒１ａｍｕ）分異なるためである。分子同位体形態がイオン化されて複数の荷電状態になると、質量分析の検出が質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づくため、同位体形態間の質量区別を識別することが困難になる場合がある。例えば、質量が１ａｍｕだけ異なる２つの同位体形態であって、両方とも５＋状態にイオン化されている同位体形態は、それらのｍ／ｚの差がわずか０．２（５つの電荷状態当たり１ａｍｕの差）であることを示す。高分解能／高精度質量分析計は、多価イオン（電荷が±５、±６、±７、±８、±９、又はそれ以上のイオンなど）の同位体形態を識別することができる。
【0076】
天然に存在する元素同位体のために、典型的には、全ての分子イオンについて複数の同位体形態が存在する（それらの各々は、十分に感度の高い質量分析機器で分析した場合、別個に検出可能な分光ピークを生じ得る）。複数の同位体形態のｍ／ｚ比及び相対存在量は、分子イオンの同位体シグネチャをまとめて含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の分子同位体形態についてのｍ／ｚ比及び相対存在量を利用して、調査中の分子イオンの同一性を確認することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の同位体形態からの質量分析ピークは、分子イオンを定量するために使用される。いくつかの関連する実施形態では、１つの同位体形態からの単一の質量分析ピークを使用して、分子イオンを定量する。他の関連する実施形態では、複数の同位体ピークを使用して、分子イオンを定量する。これらの後の実施形態では、複数の同位体ピークは、任意の適切な数学的処理を受けることができる。いくつかの数学的処理が当該技術分野で既知であり、複数のピーク下の面積を合計すること、又は複数のピークからの応答を平均化することが含まれるが、これらに限定されない。
【0077】
質量分析技術では、一般に、イオンは、いくつかの検出モードを使用して検出することができる。例えば、選択したイオンを検出することができ、すなわち、選択イオンモニタリングモード（ＳＩＭ）を使用して検出することができ、又は代替的に、イオンをスキャンモードを使用して検出することができる。スキャンモードで動作する場合、質量分析計は、典型的には、ユーザにイオンスキャン、すなわち、所与の範囲（例えば、１００～１０００ａｍｕ）にわたる特定の質量／電荷を有する各イオンの相対存在量を提供する。更に、特定のイオントラップ又はトリプル四重極機器などの複数の質量分析事象が可能な機器を使用する場合、衝突誘起解離又は中性損失から生じる質量遷移（ｍａｓｓ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）をモニタリングすることができる（例えば、多重反応モニタリング（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）（ＭＲＭ）又は選択反応モニタリング（ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）（ＳＲＭ））。
【0078】
分析物のアッセイ（すなわち、質量スペクトル）の結果は、当該技術分野で既知の多数の方法によって、元の試料中の分析物の量に関連し得る。例えば、サンプリング及び分析パラメータが慎重に制御されている場合、所与のイオンの相対存在量は、その相対存在量を元の分子の絶対量に変換する表と比較され得る。代替的に、内部標準又は外部標準は、試料、及びそれらの標準から生成されたイオンに基づいて構築された標準曲線で実行され得る。そのような標準曲線を使用して、所与のイオンの相対存在量は、元の分子の絶対量に変換され得る。特定の好ましい実施形態では、１つ以上の標準を使用して、ＩＧＦ－Ｉ及び／又はＩＧＦ－ＩＩタンパク質の量を計算するための標準曲線を生成する。そのような標準曲線を生成及び使用する方法は、当該技術分野で周知であり、当業者は、適切な内部標準を選択することができる。例えば、好ましい実施形態では、同位体標識された若しくは標識されていないインタクトな非ヒトＩＧＦ－Ｉ及び／若しくはＩＧＦ－ＩＩ（例えば、組換えマウスＩＧＦ－Ｉ及び／若しくはＩＧＦ－ＩＩ）、又は同位体標識されたインタクトなヒトＩＧＦ－Ｉ及び／若しくはＩＧＦ－ＩＩを、標準として使用することができる。イオンの量を元の分子の量に関連付けるための多くの他の方法は、当業者に周知であろう。
【0079】
本明細書で使用される場合、「同位体標識」は、質量分析技術によって分析した場合、標識されていない分子と比較して、標識された分子において質量シフトを生じさせる。好適な標識の例としては、重水素（２Ｈ）、１３Ｃ、及び１５Ｎが挙げられる。同位体標識は、分子内の１つ以上の位置に組み込むことができ、１種類以上の同位体標識を、同じ同位体標識分子に対して使用することができる。
【0080】
本方法の１つ以上のステップは、自動化された機械を使用して行うことができる。特定の実施形態では、１つ以上の精製ステップがオンラインで行われ、より好ましくは、精製ステップ及び質量分析ステップの全てがオンラインで行われてもよい。
【0081】
いくつかの実施形態では、試料中のインタクトなＩＧＦ－Ｉ及び／又はＩＧＦ－ＩＩは、以下のようにＭＳを使用して検出及び／又は定量される。試料は、液体クロマトグラフィー、好ましくはＨＰＬＣに供され、クロマトグラフィーカラムからの液体溶媒の流れは、ＥＳＩイオン化源の加熱ネブライザーインターフェイスに入り、溶媒／分析物混合物は、インターフェイスの加熱荷電チューブ内で蒸気に変換される。溶媒に含まれる分析物（例えば、インタクトなＩＧＦ－Ｉ及び／又はＩＧＦ－ＩＩ）は、溶媒／分析物混合物に大きな電圧を印加することによってイオン化される。分析物がインターフェイスの荷電チューブを出ると、溶媒／分析物混合物が噴霧され、溶媒が蒸発し、分析物イオンが様々な荷電状態になる。次いで、イオンのうちの１つ以上の強度について定量データが収集される。次いで、１つ以上のイオンのシグナル強度の定量データが収集され、試料中のインタクトなＩＧＦ－Ｉ及び／又はＩＧＦ－ＩＩの量に関連付けられる。
【0082】
インタクトなＩＧＦ－Ｉの場合、様々な電荷状態のイオンは、約８５０．８±２（９＋）、９５７．１±２（８＋）、１０９３．７±２（７＋）、及び１２７５．８±２（６＋）の範囲内のｍ／ｚで観察され得る。いくつかの実施形態では、約１０９３．７±２の範囲内のｍ／ｚを有する１つ以上のＩＧＦ－Ｉイオンからのデータが収集され、定量に使用される。このｍ／ｚ範囲内の例示的なイオンとしては、約１０９１．９±０．１、１０９２．８±０．１、１０９２．９±０．１、１０９３．１±０．１、１０９３．２±０．１、１０９３．４±０．１、１０９３．５±０．１、１０９３．７±０．１、１０９３．８±０．１、１０９３．９±０．１、１０９４．１±０．１、１０９４．２±０．１、１０９４．４±０．１、１０９４．５±０．１、１０９４．７±０．１、及び１０９５．４±０．１のｍ／ｚを有するＩＧＦ－Ｉイオンが挙げられる。このリストは、限定することを意図するものではない。図３に示すスペクトルに示されるように、他の多くのイオンが本発明の方法における使用に好適であり得る（これは、約８２８．０５０９±２、８５０．７３７３±２、８７１．８７３０±２、９２０．５５４４±２、９３９．６９３０±２、９５６．９５３２±２、９７５．４５７６±２、１０３４．８１２８±２、１０５１．６３３７±２、１０７３．９３３５±２、１０９３．６５９７±２、１１１４．５２１９±２、１２０７．９４０１±２、１２２６．５７０５±２、１２５２．５８７１±２、及び１２７５．６０１９±２のｍ／ｚでの同位体イオン群の検出を示している）。しかしながら、上記のように、これらの範囲内の個々の同位体のイオンは、主に、示されたｍ／ｚ±１の範囲内に収まる。また、このレベルの精度では、任意のイオンについて観察された質量は、機器の変動のためにわずかに（例えば、±０．１）変化し得る。
【0083】
インタクトなＩＧＦ－ＩＩの場合、様々な電荷状態のイオンは、約９３４．６９±２（８＋）、１０６８．０７±２（７＋）、１２４５．９２±２（６＋）、及び１４９４．８９±２（５＋）の範囲内のｍ／ｚで観察され得る。いくつかの実施形態では、約１０６８．０７±２の範囲内のｍ／ｚを有する１つ以上のＩＧＦ－ＩＩイオンからのデータが収集され、定量に使用される。このｍ／ｚ範囲内の例示的なイオンとしては、約１０６７．３６±０．１、１０６７．５１±０．１、１０６７．６５±０．１、１０６７．８０±０．１、１０６７．９４±０．１、１０６８．０８±０．１、１０６８．２３±０．１、１０６８．３７±０．１、１０６８．５１±０．１、１０６８．６５±０．１、１０６８．８０±０．１、１０６８．９４±０．１、及び１０６９．０８±０．１のｍ／ｚを有するＩＧＦ－ＩＩイオンが挙げられる。いくつかの実施形態では、１つ以上のＩＧＦ－ＩＩイオンは、約１０６７．９４±０．１及び１０６８．０８±０．１のｍ／ｚを有するＩＧＦ－ＩＩイオンからなる群から選択される。このリストは、限定することを意図するものではなく、他のイオンも、本方法における使用に好適であり得る。
【0084】
いくつかの実施形態では、高分解能／高精度質量分析計の使用により、単一のイオンの単一の同位体形態からのピークのシグナル強度（例えば、図４に示される約１０９３．６６のｍ／ｚでの単一のＩＧＦ－Ｉイオンピーク、又は図１２に示される約１０６７．８０のｍ／ｚでの単一のＩＧＦ－ＩＩピーク）を、データ取得のために選択することが可能になり得る。代替的に、単一イオンの１つ以上の同位体形態（例えば、図４及び１２に示される１つ以上のＩＧＦ－Ｉ又はＩＧＦ－ＩＩの同位体形態）からのシグナル強度又は狭いｍ／ｚ範囲にわたるシグナル強度（例えば、約１０９３．７±１のｍ／ｚ範囲についての全てのＩＧＦ－Ｉシグナル強度、又は約１０６８．２±１のｍ／ｚ範囲についての全てのＩＧＦ－ＩＩシグナル強度）の定量データを収集し、試料中のインタクトなＩＧＦ－Ｉ及び／又はＩＧＦ－ＩＩの量に関連付けることができる。
【0085】
いくつかの実施形態では、シグナル強度の定量データは、少なくとも２つの異なる電荷状態からの１つ以上のＩＧＦ－Ｉイオン及び／又はＩＧＦ－ＩＩイオンについて収集される。次いで、これらのイオンの強度は、試料中のインタクトなＩＧＦ－Ｉ及び／又はＩＧＦ－ＩＩの定量的評価に使用され得る。例えば、ＩＧＦ－Ｉは、８＋電荷状態の１つ以上のＩＧＦ－Ｉイオン（すなわち、約９５７．１±２のｍ／ｚ範囲内のＩＧＦ－Ｉイオン）及び７＋電荷状態の１つ以上のＩＧＦ－Ｉイオン（すなわち、１０９３．７±２のｍ／ｚ範囲内のＩＧＦ－Ｉイオン）からのシグナル強度を用いて定量され得る。２つ以上のイオンのシグナル強度の定量データが収集される実施形態では、強度は、試料中のインタクトなＩＧＦ－Ｉ及び／又はＩＧＦ－ＩＩの定量的評価のために、当該技術分野で既知の任意の数学的方法（例えば、合計、又は曲線下面積の平均化）によって組み合わされ得る。
【0086】
イオンが検出器と衝突すると、電子のパルスが生成され、それが、デジタルシグナルに変換される。取得されたデータは、コンピュータに中継され、収集されたイオンのカウントを時間に対してプロットする。得られた質量クロマトグラムは、従来のＨＰＬＣ－ＭＳ法で生成されたクロマトグラムと同様である。特定のイオンに対応するピーク下面積又はかかるピークの振幅は、測定され、目的の分析物の量に相関し得る。特定の実施形態では、ピークの曲線下面積又は振幅を測定して、ＩＧＦ－Ｉ及び／又はＩＧＦ－ＩＩタンパク質若しくは断片の量を決定する。上に記載のように、所与のイオンの相対存在量は、内部分子標準の１つ以上のイオンのピークに基づいて較正標準曲線を使用して、元の分析物の絶対量に変換され得る。
【0087】
いくつかの実施形態では、ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩは、同時に定量される。これらの実施形態では、各ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩは、各々、上に提供された方法のうちのいずれかによって定量され得る。
【0088】
特定の好ましい実施形態では、ＩＧＦ－Ｉの定量下限（ＬＬＯＱ）は、約１５．０ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｄＬの範囲内（境界値を含む）、好ましくは約１５．０ｎｇ／ｄＬ～１００ｎｇ／ｍＬの範囲内（境界値を含む）、好ましくは約１５．０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲内（境界値を含む）、好ましくは約１５．０ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬの範囲内（境界値を含む）、好ましくは約１５．０ｎｇ／ｍＬ～１５ｎｇ／ｍＬの範囲内（境界値を含む）、好ましくは約１５．０ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬの範囲内（境界値を含む）、好ましくは約１５．０ｎｇ／ｍＬである。
【0089】
特定の好ましい実施形態では、ＩＧＦ－ＩＩの定量下限（ＬＬＯＱ）は、約３０．０ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｄＬの範囲内（境界値を含む）、好ましくは約３０．０ｎｇ／ｄＬ～１００ｎｇ／ｍＬの範囲内（境界値を含む）、好ましくは約３０．０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲内（境界値を含む）、好ましくは約３０．０ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬの範囲内（境界値を含む）、好ましくは約３０．０ｎｇ／ｍＬ～１５ｎｇ／ｍＬの範囲内（境界値を含む）、好ましくは約３０．０ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬの範囲内（境界値を含む）、好ましくは約３０．０ｎｇ／ｍＬである。
【0090】
特定の好ましい実施形態では、ＩＧＦ－Ｉの検出限界（ＬＯＤ）は、約４．９ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬの範囲内（境界値を含む）、好ましくは約４．９ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの範囲内（境界値を含む）、好ましくは約４．９ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲内（境界値を含む）、好ましくは約４．９ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬの範囲内（境界値を含む）、好ましくは約４．９ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬの範囲内（境界値を含む）、好ましくは約４．９ｎｇ／ｍＬである。
【0091】
特定の好ましい実施形態では、ＩＧＦ－ＩＩの検出限界（ＬＯＤ）は、約８．２ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬの範囲内（境界値を含む）、好ましくは約８．２ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの範囲内（境界値を含む）、好ましくは約８．２ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲内（境界値を含む）、好ましくは約８．２ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬの範囲内（境界値を含む）、好ましくは約８．２ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは約８．２ｎｇ／ｍＬである。
【0092】
以下の実施例は、本発明を説明するために役立つ。これらの実施例は、本方法の範囲を限定することを決して意図したものではない。特に、以下の実施例は、特定の内部標準を使用した質量分析によるＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩタンパク質又は断片の定量を示す。示された内部標準の使用は、いかなる形でも限定することを意図するものではない。当業者によって容易に決定される任意の適切な化学種を、内部標準として使用することができる。
【実施例】
【0093】
実施例１：質量分析によるＩＧＦ－１バリアントの同定
検体の供給源
検体はもともとＬＣ－ＭＳによるインタクトなＩＧＦ－１の定量のためにＱｕｅｓｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓに提出され、更なる解析の前に非特定化された。ＩＲＢスポンサープロトコル番号は、ＢＲ１３－００２であり、ＩＲＢプロトコル番号は、２０１２１９４０である。
検体の供給源
検体はもともとＬＣ－ＭＳによるインタクトなＩＧＦ－１の定量のためにＱｕｅｓｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓに提出され、更なる解析の前に非特定化された。ＩＲＢスポンサープロトコル番号は、ＢＲ１３－００２であり、ＩＲＢプロトコル番号は、２０１２１９４０である。
【0094】
バリアントデータベース
患者検体中のＩＧＦ－１バリアントを見つけるために、本発明者らは、エクソームアグリゲーションコンソーシアム（Ｅｘｏｍｅ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）データベース、ＥｘＡＣ（１４）（２／６／２０１９にアクセス、補足表２に）を使用した。これには、臨床的意義が不明な１３のバリアントを含む、現在知られている全てのバリアント：Ｔ４Ｍ、Ｖ１７Ｍ、Ｔ２９Ｉ、Ｓ３４Ｎ、Ａ３８Ｖ、Ｒ５５Ｋ、Ｍ５９Ｒ、Ｐ６６Ａ、Ｐ６６Ｔ、Ａ６７Ｓ、Ａ６７Ｔ、Ａ７０Ｐ、Ａ７０Ｔ、及び以前に報告された３つの病原性バリアント：Ｖ４４Ｍ、Ｒ５０Ｗ、及びＲ３６Ｑが含まれている。
患者検体中のＩＧＦ－１バリアントを見つけるために、本発明者らは、エクソームアグリゲーションコンソーシアム（Ｅｘｏｍｅ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）データベース、ＥｘＡＣ（１４）（２／６／２０１９にアクセス、補足表２に）を使用した。これには、臨床的意義が不明な１３のバリアントを含む、現在知られている全てのバリアント：Ｔ４Ｍ、Ｖ１７Ｍ、Ｔ２９Ｉ、Ｓ３４Ｎ、Ａ３８Ｖ、Ｒ５５Ｋ、Ｍ５９Ｒ、Ｐ６６Ａ、Ｐ６６Ｔ、Ａ６７Ｓ、Ａ６７Ｔ、Ａ７０Ｐ、Ａ７０Ｔ、及び以前に報告された３つの病原性バリアント：Ｖ４４Ｍ、Ｒ５０Ｗ、及びＲ３６Ｑが含まれている。
【0095】
試料調製及びＬＣ－ＭＳ
患者試料は、Ｂｙｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ（３）によって以前に記載されている方法の改変を使用して調製した。簡潔に述べると、１００μＬの患者血清、品質管理（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、及びキャリブレーター（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）を解凍し、ボルテックスし、ディープウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移した。その後、１０μＬの内部標準（１５Ｎ標識ＩＧＦ－１、ＰｒｏＳｐｅｃ）及び４００μＬの酸性化エタノール溶液（８７．５％のＥｔＯＨ、１２．５％の１Ｎ ＨＣｌ）の混合物を添加し、試料を激しく混合し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、試料を遠心分離し（１０℃で１０分間５，５００ＲＣＦ）、３５０μＬの上清を６０μＬの１．５Ｍ Ｔｒｉｓ塩基と混合した。試料を－２０℃で６０分間冷却して、更なるタンパク質沈殿物を生成した後、以前の設定で遠心分離した。
患者試料は、Ｂｙｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ（３）によって以前に記載されている方法の改変を使用して調製した。簡潔に述べると、１００μＬの患者血清、品質管理（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、及びキャリブレーター（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）を解凍し、ボルテックスし、ディープウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移した。その後、１０μＬの内部標準（１５Ｎ標識ＩＧＦ－１、ＰｒｏＳｐｅｃ）及び４００μＬの酸性化エタノール溶液（８７．５％のＥｔＯＨ、１２．５％の１Ｎ ＨＣｌ）の混合物を添加し、試料を激しく混合し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、試料を遠心分離し（１０℃で１０分間５，５００ＲＣＦ）、３５０μＬの上清を６０μＬの１．５Ｍ Ｔｒｉｓ塩基と混合した。試料を－２０℃で６０分間冷却して、更なるタンパク質沈殿物を生成した後、以前の設定で遠心分離した。
【0096】
遠心分離後、ＩＧＦ－１及びそのバリアントを、０．１％ギ酸を含む水（移動相Ａ）及び０．１％ギ酸を含むアセトニトリル（移動相Ｂ）の勾配（補足図１）を使用して、オンライン抽出（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を備えた多重高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（Ａｒｉａ ＴＬＸ－４）を使用して分離した。抽出カラムは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ Ｏｎｙｘ Ｃ１８ガードカートリッジであり、分析用カラムは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８ ５０×４．６ｍｍ、１００Åポアサイズであった。質量分析は、加熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）源を装備し、ＳＩＭスキャンモードと比較して約２倍の感度を有する正の全イオン断片化（ＡＩＦ）モードで動作するＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｆｏｃｕｓ Ｈｙｂｒｉｄ四重極オービトラップ機器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行った（補足図２及び補足表１）。以下のＭＳパラメータを使用した。解像度７０，０００、スキャン範囲１，０６０～１，１１０Ｄａ、正規化衝突エネルギー：１０、自動ゲイン制御（ＡＧＣ）：２ｅ４、最大注入時間（ＩＴ）：自動。Ａ６７Ｔ／Ａ７０Ｔ対の決定の場合、質量分析計は、３５，０００の分解能、単離ウインドウ２．０ｍ／ｚ、ＮＣＥ３０、固定第１質量１５０Ｄａ、ＡＧＣ：２ｅ４、ＭａｘＩＴ：２５０ｍｓ及び１マイクロスキャン。
【0097】
ＭＳデータ解析及び可視化
ＬＣ－ＭＳデータをＴｈｅｒｍｏ ＴｒａｃｅＦｉｎｄｅｒ５．０ Ｃｌｉｎｉｃａｌによって解析し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｘｃａｌｉｂｕｒ ｖ．４．２のＱｕａｌ Ｂｒｏｗｓｅｒで可視化した。
ＬＣ－ＭＳデータをＴｈｅｒｍｏ ＴｒａｃｅＦｉｎｄｅｒ５．０ Ｃｌｉｎｉｃａｌによって解析し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｘｃａｌｉｂｕｒ ｖ．４．２のＱｕａｌ Ｂｒｏｗｓｅｒで可視化した。
【0098】
ＤＮＡ配列決定による確認
非特定化された血清検体廃棄物からのＤＮＡ抽出を、Ａｐｏｓｔｌｅ ＭｉｎｉＭａｘ（商標）高効率単離キット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて行った。抽出されたＤＮＡを使用して、ＩＧＦ－１遺伝子のエクソン４領域（Ｂｕｉｌｄ ＧＲＣｈ３８でＣｈｒ１２：１０２４１９５０９－１０２４１９６９０）及びエクソン３領域（Ｂｕｉｌｄ ＧＲＣｈ３８でＣｈｒ１２：１０２４７５５８２－１０２４７５８５５）を配列決定した。プライマー設計では、一般的なＳＮＰ位置（＞１％の母集団ＭＡＦ）を除外した。配列決定は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１サイクル配列決定キット及びＡＢＩ３５００遺伝子アナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者の説明書に従って使用して行った。
非特定化された血清検体廃棄物からのＤＮＡ抽出を、Ａｐｏｓｔｌｅ ＭｉｎｉＭａｘ（商標）高効率単離キット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて行った。抽出されたＤＮＡを使用して、ＩＧＦ－１遺伝子のエクソン４領域（Ｂｕｉｌｄ ＧＲＣｈ３８でＣｈｒ１２：１０２４１９５０９－１０２４１９６９０）及びエクソン３領域（Ｂｕｉｌｄ ＧＲＣｈ３８でＣｈｒ１２：１０２４７５５８２－１０２４７５８５５）を配列決定した。プライマー設計では、一般的なＳＮＰ位置（＞１％の母集団ＭＡＦ）を除外した。配列決定は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１サイクル配列決定キット及びＡＢＩ３５００遺伝子アナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者の説明書に従って使用して行った。
【0099】
結果及び考察
同位体ピークインデックス（ＩＰｉ）及び相対保持時間（ｒＲＴ）の概念を使用して、ＩＧＦ－１バリアントの検出のプロセスを開発し、自動化した。最も一般的なバリアントＡ６７ＴとＡ７０Ｔのペアを区別するために、タンデム質量分析を使用する。
同位体ピークインデックス（ＩＰｉ）及び相対保持時間（ｒＲＴ）の概念を使用して、ＩＧＦ－１バリアントの検出のプロセスを開発し、自動化した。最も一般的なバリアントＡ６７ＴとＡ７０Ｔのペアを区別するために、タンデム質量分析を使用する。
【0100】
同位体ピークインデックス（ＩＰｉ）
天然の非還元形態（Ｃ３３１Ｈ５１３Ｎ９４Ｏ１０１Ｓ７）のＷＴ ＩＧＦ－１の元素組成及びその既知のバリアントに基づいて、ポリペプチドの観察された電荷状態の各々についての同位体エンベロープにおけるピークは、それらの正確なｍ／ｚ及びピーク強度の分布の観点から正確に予測することができる。
天然の非還元形態（Ｃ３３１Ｈ５１３Ｎ９４Ｏ１０１Ｓ７）のＷＴ ＩＧＦ－１の元素組成及びその既知のバリアントに基づいて、ポリペプチドの観察された電荷状態の各々についての同位体エンベロープにおけるピークは、それらの正確なｍ／ｚ及びピーク強度の分布の観点から正確に予測することができる。
【0101】
以前の研究では、同位体エンベロープ内のピークの命名法を簡単に説明した（１２）。本明細書では、「同位体ピークインデックス（ＩＰｉ）」及び「同位体ピーク相対強度（ＩＰｒＩ）」の概念を更に発展させる（図１）。ＩＧＦ－１及びバリアントの同位体エンベロープは、それらの単同位体ｍ／ｚ及び電荷状態にかかわらず、このインデックス強度分布に従う。
【0102】
ＩＰｉは、同位体エンベロープのピークの数値インデックスであり、下付き文字に示され、ゼロから始まる。単同位体ピークは、ＩＰ０（「同位体ピークゼロ」又は「ＩＰゼロ」と読む）として指定され、その後の重同位体ピークは、ＩＰ１～ＩＰ１３として識別される。この命名法は、ＷＴ及び全てのバリアントの同位体エンベロープに適用される。例えば、Ｖ４４ＭバリアントのＩＰ０は、Ｖ４４Ｍ０として指定され、Ｖ４４Ｍバリアントの同位体エンベロープ内の単同位体ピークを表す。ＷＴ ＩＧＦ－１のルーチン検出及び定量中、ＩＰ４は、ラベルＷＴ４の下で使用される。
【0103】
ＩＰｒＩは、同位体エンベロープ内のピークの強度の分布である。特定のパターンは、ＩＧＦ－１バリアントにおいて非常に類似している分子の元素組成にのみ依存し、したがって、ＩＰｒＩは、ＷＴ及び全てのバリアントについて類似しているべきである。図１におけるピーク相対強度の分布は、実際の患者検体から平均化され、ＷＴ ＩＧＦ－１の定量に使用されるＩＰ４ピークの強度と比較して計算される。ＩＧＦ－１同一性を確かめるために「定量イオン（ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ）」同位体に隣接する「確認イオン（ｑｕａｌｉｆｉｅｒ）」同位体の相対強度を使用することは、臨床分野でＩＰｒＩを使用する実用的な例である（７）。
【0104】
全てのＩＧＦ－１バリアントをモニタリングすることは困難であり、制限がある。Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｆｏｃｕｓ機器のオービトラップ質量分析器の質量分解能（２００ｍ／ｚで７０，０００）は、同位体エンベロープ内の同位体ピークを認識するのに十分である（ＭＨ７
＋７の場合、０．１４ｍ／ｚの差）。任意のＭＳアプローチの制限は、同位体バリアントＡ６７ＴとＡ７０Ｔ、並びにＶ１７ＭとＶ４４Ｍとを区別することができないことである。更に、現在の機器分解能では、非常に近い単同位体ｍ／ｚ（±１０ｐｐｍ）を有するバリアント：Ｒ５５Ｋ及びＲ３６Ｑ；Ｒ５０Ｗ、Ｔ４Ｍ、及びＡ６７／７０Ｔを分解することができない。最後に、全てのＰ６６Ｔ同位体ピークは、ＷＴ ＩＧＦ－１同位体エンベロープからの干渉を有するため、Ｐ６６Ｔバリアントの同位体エンベロープは、ＷＴ ＩＧＦ－１と重複しており、ルーチン解析では検出することができない。
【0105】
全てのバリアントの理論的同位体エンベロープに基づいて、以下のようにバリアントの元素組成の違いに基づいて、ＷＴ ＩＧＦに対する正確なｍ／ｚシフトを計算することによって分解することができないピークを同定した。単同位体ピークの正確な質量を、まず、非還元ジスルフィド結合を有する全てのバリアントにおいて、ＭＨ７
＋７について計算した（補足表３）。次いで、次の１３のバリアント同位体について正確なｍ／ｚを表に入力し、全てのｍ／ｚ値を最小値から最大値まで並べ替えることによって再グループ化した（同位体ピークマスターテーブル、補足表４）。＜１０ｐｐｍの隣接するｍ／ｚ差が同定され、互いに分解することができないが、他の群のピークから分解することができるピークとしてグループ化した。合計で、５ｍ／ｚ値（オレンジ色のセル、補足表４）を選択して、ＷＴ及び４つのバリアント群（ＶＧ、表１）をモニタリングした。
【0106】
いくつかのバリアントの同位体ピークは、２つのバリアント群（ＶＧ３及びＶＧ４）に属し、それらのＩＰｒＩは、それらの同定のための更なる信頼性を提供する（表１）。例えば、Ｓ３４Ｎ２（ＶＧ３）の抽出されたイオンクロマトグラム（ＥＩＣ）は、ＩＧＦ－１の同位体エンベロープにおけるその相対強度に従って、Ｓ３４Ｎ４のものの５７％であると予想される（図１を参照されたい）。しかしながら、ＶＧ４では、Ｓ３４Ｎ９は、ＷＴのわずか２５％、Ｓ３４Ｎ２の面積の約半分になると予想される。ＥＩＣにおけるこの差を使用して、Ｓ３４Ｎを他のバリアントと区別することができる。ＶＧ４からＶＧ３に切り替えることで、Ｓ３４Ｎの検出感度を２倍に高めることができる。同じことは、感度がＶＧ４でより高いＡ３８Ｖを除いて、ＶＧ３からの他のバリアントにも当てはまる。
【0107】
本発明者らの方法では、全てのバリアントが、わずか４ｍ／ｚ比でモニタリングされる（表１）。これらのｍ／ｚ比のいずれかにおけるピークの存在は、所与のＶＧに属するバリアントが存在することを示す。例えば、図２は、２人の異なる患者からの検体についてのＶＧ４ピークを含むＬＣ－ＭＳデータを示す。患者１からの検体では、ＩＰ６がＶＧ４のｍ／ｚとして検出されたため、ＩＰｉ概念は、患者１がＲ５０Ｗ、Ｔ４Ｍ、Ａ６７Ｔ、又はＡ７０Ｔバリアントを有するに違いないと予測する（表１）。同様に、患者２の検体では、ＩＰ４がＶＧ４のｍ／ｚとして検出されたため、Ｖ１７Ｍ又はＶ４４Ｍバリアントのいずれかを有するはずである。ＤＮＡ配列決定により、患者１がＡ７０Ｔを有し、患者２がＶ４４Ｍを有することを確認した。したがって、バリアントを区別するためのアプローチとしてのＩＰｉの妥当性を提供する。ほとんどのバリアントは、ＩＰｉアプローチのみを使用して、すなわち、それらの質量スペクトルにおけるピークの同位体分布にのみ基づいて、区別することができる。
【0108】
このアプローチは標的化されるが、新しいバリアントの発見につながる可能性もある。ＶＧ２のメンバーが検出された患者検体からのＬＣ－ＭＳデータを詳細に検査すると、ＩＰｉがＶＧ２の２つのバリアント：Ａ６７Ｓ（ＩＰ４）又はＴ２９Ｉ（ＩＰ８）のいずれにも一致しないことが明らかになった。代わりに、そのピークは、ＩＰ１０又はＩＰ１１のいずれかに対応した（補足図３）。ＤＮＡ配列決定により、Ｓ３３Ｐ１０の計算値ｍ／ｚ１０９５．８１３０と一致するが（ＶＧ２のｍ／ｚとは６ｐｐｍ異なる、補足表４）、ＥｘＡＣデータベースでは一致しないバリアントＳ３３Ｐが明らかになった。したがって、新しいバリアントの発見のためのアプローチとしてのＩＰｉを検証した。
【0109】
相対保持時間（ｒＲＴ）
本発明者らの予備研究は、いくつかのＩＧＦ－１バリアントがＷＴと共溶出しないことを示す。ＷＴのＲＴとバリアントのＲＴとの間のこの差は、相対保持時間（ｒＲＴ）と呼ばれ、バリアント間を区別するために使用することができる。ＩＰｉ概念を使用して、異なるＶＧにバリアントを予測及び割り当て、それらの観察されたｒＲＴを比較し、ＤＮＡ配列決定によってそれらの同一性を確認することによって、本発明者らは、バリアントの区別及び発見のためのツールとしてのｒＲＴを検証した（表２）。
本発明者らの予備研究は、いくつかのＩＧＦ－１バリアントがＷＴと共溶出しないことを示す。ＷＴのＲＴとバリアントのＲＴとの間のこの差は、相対保持時間（ｒＲＴ）と呼ばれ、バリアント間を区別するために使用することができる。ＩＰｉ概念を使用して、異なるＶＧにバリアントを予測及び割り当て、それらの観察されたｒＲＴを比較し、ＤＮＡ配列決定によってそれらの同一性を確認することによって、本発明者らは、バリアントの区別及び発見のためのツールとしてのｒＲＴを検証した（表２）。
【0110】
例えば、ＷＴ４及びＶＧ４のＥＩＣは、２つの検体からの既知のＩＧＦ－１バリアントのｒＲＴのわずかな差を示す。したがって、ＷＴ（図２Ａ）と共溶出するバリアントＡ７０Ｔ（図２Ｂ）と、ＷＴ（図２Ｄ）より後に溶出するＶ４４Ｍ（図２Ｅ）とが区別される。
【0111】
特に、いくつかのＶＧでは、ＩＰｉは、単一のバリアントを予測したが、ｒＲＴは、新しいＩＧＦ－１バリアントの存在を明らかにした（表２）。例えば、ＶＧ３のｍ／ｚでＩＰ１を有し得る既知のバリアント（Ａ３８Ｖ）は１つだけ存在し、これは、ＷＴと共溶出するはずである。しかしながら、ＩＰ１バリアントがＷＴよりもわずかに遅れて溶出する検体を発見した。ＤＮＡ配列決定は、共溶出するバリアントがＡ３８Ｖであることを確認した。しかし、後で溶出するバリアントはＡ６７Ｖであり、これは、ＥｘＡＣデータベースにはないバリアント（すなわち、同じアミノ酸置換を有するが、異なる位置にあるバリアント）であった（表２）。同様に、ＶＧ１におけるＩＰ４の場合、患者検体中に、報告されていないＹ３１Ｈバリアントを見出した。これは、Ｐ６６Ａ（補足表２）と比較して、計算値ｍ／ｚの差がほんの１．５ｐｐｍであり、ＷＴよりもわずかに早く溶出する（表２）。また、ＶＧ１では、ｒＲＴは、ＤＮＡ配列決定によって同定された新しいバリアントＲ５０Ｑ又はＲ５６Ｋの存在を示した。これらの新しいバリアントのいずれも、既知のバリアントのように同一のアミノ酸置換を有していたが、異なる位置にあった（表２）。これらの例は、ｒＲＴがバリアントの同定及び新たなバリアントの発見のためのツールであることの検証を提供する。
【0112】
タンデム質量分析
ＥｘＡＣデータベースでは、Ａ６７Ｔ及びＡ７０Ｔの発生頻度が最も高い（合計９３％、補足表１、ＥｘＡＣブラウザーから作成）。これらは、ＭＳ／ＭＳによる再分析時に、ｙ３断片イオンのｍ／ｚの差により互いに区別され、ｙ５断片イオンのｍ／ｚの差によりＷＴと区別され得る（補足表５）。本発明者らのワークフローでは、ｍ／ｚ１０９３．５２１５（ＷＴ４）及び１０９８．０９６９（ＶＧ４）の包含リストを備えた並列反応モニタリング（ＰＲＭ）を用いる。
ＥｘＡＣデータベースでは、Ａ６７Ｔ及びＡ７０Ｔの発生頻度が最も高い（合計９３％、補足表１、ＥｘＡＣブラウザーから作成）。これらは、ＭＳ／ＭＳによる再分析時に、ｙ３断片イオンのｍ／ｚの差により互いに区別され、ｙ５断片イオンのｍ／ｚの差によりＷＴと区別され得る（補足表５）。本発明者らのワークフローでは、ｍ／ｚ１０９３．５２１５（ＷＴ４）及び１０９８．０９６９（ＶＧ４）の包含リストを備えた並列反応モニタリング（ＰＲＭ）を用いる。
【0113】
本発明者らは、Ａ６７Ｔ、Ａ７０Ｔ、Ｔ４Ｍ、又はＲ５０Ｗバリアントの存在を示すＶＧ４のＩＰ６が検出された検体を使用して、このアプローチを検証した。例えば、２つの患者検体を再分析すると、ＭＳ／ＭＳスペクトルは、ｙイオンを明らかにし、患者がそれぞれ、ＷＴとＡ６７Ｔバリアント（患者Ａ）及びＷＴとＡ７０Ｔバリアント（患者Ｂ）についてヘテロ接合性であることを確認する（補足図４）。合計で、本発明者らは、ＭＳ／ＭＳが、試験した２８検体（Ａ６７Ｔバリアントを含む９検体及びＡ７０Ｔバリアントを含む１９検体）において、ＤＮＡ配列決定結果と一致することを確認した。
【0114】
ＭＳ及びＭＳ／ＭＳスキャンを交互に用いることによって、１回の実行でＡ６７Ｔ及びＡ７０Ｔを検出できる可能性があるが（補足図５）、このワークフローは、クロマトグラフィーのピークにわたるＭＳスキャンの数がより少ないため、ＩＧＦ－１の定量が損なわれないことを証明する必要がある。更に、最も豊富な多型Ａ６７／７０Ｔが患者検体の０．２％のみに存在することを考えると、このワークフローを正当化するのは困難な可能性がある（補足表２）。
【0115】
自動バリアント検出
ＩＧＦ－１バリアントの検出を自動化し、ルーチンのＩＧＦ－１定量ワークフローに組み込んだ。質量抽出許容値を２０ｐｐｍに設定して、全てのスペクトルをＴｈｅｒｍｏ ＴｒａｃｅＦｉｎｄｅｒ５．０ Ｃｌｉｎｉｃａｌで解析した。以下の化合物について検体スペクトルを検索するために、ＴｒａｃｅＦｉｎｄｅｒ Ｍａｓｔｅｒメソッドを設定した：ＷＴ４（確認イオンとしてＷＴ３及びＷＴ５を追加）、内部標準（ＩＳＴＤ５）、及び内部標準として指定された４つのバリアントグループに対応するｍ／ｚ。ソフトウェアは、２つのレポートを生成した。
ＩＧＦ－１バリアントの検出を自動化し、ルーチンのＩＧＦ－１定量ワークフローに組み込んだ。質量抽出許容値を２０ｐｐｍに設定して、全てのスペクトルをＴｈｅｒｍｏ ＴｒａｃｅＦｉｎｄｅｒ５．０ Ｃｌｉｎｉｃａｌで解析した。以下の化合物について検体スペクトルを検索するために、ＴｒａｃｅＦｉｎｄｅｒ Ｍａｓｔｅｒメソッドを設定した：ＷＴ４（確認イオンとしてＷＴ３及びＷＴ５を追加）、内部標準（ＩＳＴＤ５）、及び内部標準として指定された４つのバリアントグループに対応するｍ／ｚ。ソフトウェアは、２つのレポートを生成した。
【0116】
バリアントレポートの場合、ＴｒａｃｅＦｉｎｄｅｒのレポートタイプは、以下のフィルターストリングを使用して、バッチとして設定した：
ＡＮＤ（ｑｕａｎｒｅｓｕｌｔｓ．ｓａｍｐｌｅＴｙｐｅ＝“Ｓｐｅｃｉｍｅｎ”，ｑｕａｎｒｅｓｕｌｔｓ．ｔｏｔａｌＡｒｅａ＜＞“Ｎ／Ｆ”，ｑｕａｎｒｅｓｕｌｔｓ．ｐｅａｋＡｒｅａ＞３０００００，ｃｏｍｐｏｕｎｄ．ｃｏｍｐｏｕｎｄｎａｍｅ＜＞“ＩＧＦ－１”，Ｃｏｍｐｏｕｎｄ．ＣｏｍｐｏｕｎｄＮａｍｅ＜＞“ＩＳＴＤ”）
これにより、ＩＧＦ－１バリアントを含むことが疑われる検体のリスト（図３、パネルＡ）が生成される。示された実施例では、検体は、ＶＧ４バリアントを含むことが疑われる。次いで、バリアントの存在に関する情報は、臨床検査情報システム（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＬＩＳ）の標準的なコメントを介して医師に報告される。
ＡＮＤ（ｑｕａｎｒｅｓｕｌｔｓ．ｓａｍｐｌｅＴｙｐｅ＝“Ｓｐｅｃｉｍｅｎ”，ｑｕａｎｒｅｓｕｌｔｓ．ｔｏｔａｌＡｒｅａ＜＞“Ｎ／Ｆ”，ｑｕａｎｒｅｓｕｌｔｓ．ｐｅａｋＡｒｅａ＞３０００００，ｃｏｍｐｏｕｎｄ．ｃｏｍｐｏｕｎｄｎａｍｅ＜＞“ＩＧＦ－１”，Ｃｏｍｐｏｕｎｄ．ＣｏｍｐｏｕｎｄＮａｍｅ＜＞“ＩＳＴＤ”）
これにより、ＩＧＦ－１バリアントを含むことが疑われる検体のリスト（図３、パネルＡ）が生成される。示された実施例では、検体は、ＶＧ４バリアントを含むことが疑われる。次いで、バリアントの存在に関する情報は、臨床検査情報システム（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＬＩＳ）の標準的なコメントを介して医師に報告される。
【0117】
質量分析データに基づいて、希少なヘテロ接合性ＩＧＦ－１バリアントが、この検体で検出された。このバリアントのレベルは、上記の報告されたＩＧＦ－１結果には含まれておらず、予想される値よりも低い可能性があることを説明する。バリアントのレベルは、野生型ＩＧＦ－１タンパク質について報告された値と同じであることが予想される。このＩＧＦ－１バリアントの臨床的意義は、依然として不明である。バリアントの存在を確認するために、追加のＤＮＡ配列決定が推奨される。
【0118】
ＩＰｉ及びｒＲＴの概念を使用して、バリアントの同一性を予測し、次いで、Ａ６７Ｔ／Ａ７０Ｔ対の場合、ＤＮＡ配列決定又はタンデム質量分析で確認することができる。
【0119】
ＩＧＦ－１の定量レポートは、ＷＴの検出及び定量に関連する情報を示すように設計されている（図３、パネルＢ）。ＴｒａｃｅＦｉｎｄｅｒのレポートタイプは、複合カスタム数式＜ｃｏｍｐｏｕｎｄ．ｃｏｍｐｏｕｎｄＴｙｐｅ＝“ｅＴａｒｇｅｔＣｏｍｐｏｕｎｄ”＞として設定される。これに加えて、レポートは、以下のセル数式
ＩＦ（ＡＮＤ（ｓａｍｐｌｅ．ｓａｍｐｌｅｔｙｐｅ＝“Ｓｐｅｃｉｍｅｎ”，ｑｕａｎｒｅｓｕｌｔｓ．ｐｅａｋｓｆｏｕｎｄ＝ＦＡＬＳＥ），“ＰＯＳＳＩＢＬＥ ＨＯＭＯ ＶＡＲ”，ＩＦ（ＡＮＤ（ｓａｍｐｌｅ．ｓａｍｐｌｅｔｙｐｅ＝“Ｓｐｅｃｉｍｅｎ”，ｑｕａｎｒｅｓｕｌｔｓ．ｐｅａｋｓｆｏｕｎｄ＝ＴＲＵＥ），ＩＦ（ｑｕａｎｒｅｓｕｌｔｓ．ｃａｌｃａｍｏｕｎｔ－ｃｏｍｐｏｕｎｄ．ｌｏｑ＜０，“ＰＯＳＳＩＢＬＥ ＨＯＭＯ ＶＡＲ”，“”），“”））を使用して、
ホモ接合性ＩＧＦ－１バリアントを含むことが疑われる検体を標識する。この場合、結果は手動で検査され、バリアントのレベルは、ＷＴ ＩＧＦ－１較正曲線に基づいて推定され、ＬＩＳシステムにおける標準的なコメントを介して医師に報告される（定量値は例として使用される）。
ＩＦ（ＡＮＤ（ｓａｍｐｌｅ．ｓａｍｐｌｅｔｙｐｅ＝“Ｓｐｅｃｉｍｅｎ”，ｑｕａｎｒｅｓｕｌｔｓ．ｐｅａｋｓｆｏｕｎｄ＝ＦＡＬＳＥ），“ＰＯＳＳＩＢＬＥ ＨＯＭＯ ＶＡＲ”，ＩＦ（ＡＮＤ（ｓａｍｐｌｅ．ｓａｍｐｌｅｔｙｐｅ＝“Ｓｐｅｃｉｍｅｎ”，ｑｕａｎｒｅｓｕｌｔｓ．ｐｅａｋｓｆｏｕｎｄ＝ＴＲＵＥ），ＩＦ（ｑｕａｎｒｅｓｕｌｔｓ．ｃａｌｃａｍｏｕｎｔ－ｃｏｍｐｏｕｎｄ．ｌｏｑ＜０，“ＰＯＳＳＩＢＬＥ ＨＯＭＯ ＶＡＲ”，“”），“”））を使用して、
ホモ接合性ＩＧＦ－１バリアントを含むことが疑われる検体を標識する。この場合、結果は手動で検査され、バリアントのレベルは、ＷＴ ＩＧＦ－１較正曲線に基づいて推定され、ＬＩＳシステムにおける標準的なコメントを介して医師に報告される（定量値は例として使用される）。
【0120】
質量分析データに基づいて、希少なホモ接合性ＩＧＦ－１バリアントが、この検体で検出された。バリアントのレベルは、上記の報告されたＩＧＦ－１結果には含まれていなかった。これは、全てのＩＧＦ－１がバリアントタンパク質の形態で産生されるため、報告されたＩＧＦ－１濃度を説明する。バリアントの推定濃度は、７５ｎｇ／ｍＬである。このバリアントの臨床的意義は、依然として不明である。バリアントの存在を確認するために、追加のＤＮＡ配列決定が推奨される。
【0121】
臨床応用
本発明者らは、臨床検査室で高分解能ＬＣ－ＭＳ法を使用した、堅牢な高スループットのＩＧＦ－１バリアントの検出及び発見を開発した。バリアントを区別及び発見するための個々の方法ＩＰｉ、ｒＲＴ、及びＭＳ／ＭＳを、ＤＮＡ配列決定によって検証した。ＩＧＦ－１バリアントを同時にモニタリング及び同定するという本発明者らのアプローチは、臨床検査室における他の方法と比較して、大幅に改善されている。市販の機器ソフトウェアによるＬＣ－ＭＳデータの自動解釈は、ヒューマンエラーのリスクを低減する。
本発明者らは、臨床検査室で高分解能ＬＣ－ＭＳ法を使用した、堅牢な高スループットのＩＧＦ－１バリアントの検出及び発見を開発した。バリアントを区別及び発見するための個々の方法ＩＰｉ、ｒＲＴ、及びＭＳ／ＭＳを、ＤＮＡ配列決定によって検証した。ＩＧＦ－１バリアントを同時にモニタリング及び同定するという本発明者らのアプローチは、臨床検査室における他の方法と比較して、大幅に改善されている。市販の機器ソフトウェアによるＬＣ－ＭＳデータの自動解釈は、ヒューマンエラーのリスクを低減する。
【0122】
アプローチの開発及び検証中に、ＥｘＡＣデータベースから６つのバリアントＰ６６Ａ、Ａ６７Ｓ、Ｓ３４Ｎ、Ａ３８Ｖ、Ａ６７Ｔ、Ａ７０Ｔ、並びに２つの以前に報告されたバリアントＶ４４Ｍ及びＡ６７Ｖを同定した。更に、このアプローチは、以前に報告されていない６つのバリアントＹ３１Ｈ、Ｓ３３Ｐ、Ｒ５０Ｑ、Ｒ５６Ｋ、Ｔ４１Ｉ、及びＡ６２Ｔを発見した。多数の新しい発見を考慮すると、ＩＧＦ－１バリアントの現在の知識は限られており、ＩＧＦ－１バリアントの世界はより広大であることが明らかになる。
【0123】
本発明者らは、本発明者らの方法論が、ポリペプチド及びタンパク質の自動定量、並びに臨床検査室におけるそれらの多型バリアントの効率的な検出のための高分解能ＬＣ－ＭＳアプローチに、より一般的に適用される可能性があると予想する。ＩＧＦ－１の場合、本方法は、臨床医に患者のＩＧＦ－１状態のより多くのプロファイルを提供する機会、並びに遺伝子型－表現型の関係を更に探求する機会を提供する。
【0124】
将来的には、モニタリングされたＩＧＦ－１バリアントのリストには、新たに報告されたものが含まれる。また、Ｐ６６Ｔ、Ａ６７Ｓ、及びＡ６７ＶバリアントをＤＮＡ配列決定なしに確認するためのＭＳ／ＭＳ戦略を開発することも可能である。質量分析計及びそのスキャン速度における現在の改善を考慮すると、平行したＷＴ ＩＧＦ－１のＭＳ定量及びそのバリアントのいくつかのＭＳ／ＭＳ検証は、臨床検査室で可能になる可能性がある。
【0125】
このアプローチを多数の検体からのデータに適用することによって、将来の研究では、一般集団と臨床集団との間の異なるＩＧＦ－１バリアントの発生頻度を比較することを目指す。発生頻度の不一致は、バリアントが病原性又は病原性の可能性があることを意味する可能性があり、したがって、診断及び患者ケアに情報を提供する。
【表2】
【表3】
【0126】
各バリアントグループ内で、ＩＰｉ概念を検出された各バリアントに適用した。ＩＰｉ予測後、ｒＲＴを同定し、未分解バリアント内で比較した。ｒＲＴにより、Ｒ５６ＫバリアントからのＲ５０Ｑの分離、並びにＡ６７ＶからのＡ３８Ｖの分離がもたらされた。また、Ｙ３１Ｈ、Ｓ３３Ｐ、及びＡ６２Ｔバリアントの発見がもたらされた。
【0127】
表３．キャリブレーター及びＱＣに示されているように、様々なエネルギーのインソースＣＩＤ（ＳＩＤ）及びＨＣＤとのＳＩＭスキャンの比較の概要。結果は、１０ＮＣＥのＨＣＤを適用した最初のキャリブレーター及び内部標準（黄色で強調されたセル）に対する応答の顕著な増加を示す。
【表4】
【表5】
【表6】
【0128】
電荷状態＋７及び非還元ジスルフィド結合における全てのＩＧＦ－１バリアント及びそれらの同位体ピークの理論的に正確なｍ／ｚ。
【表7】
【0129】
全てのバリアントの理論上のｍ／ｚ値を、最小値から最大値まで並べ替えた。次いで、＜１０ｐｐｍ（ピンク色のセル）の隣接するｍ／ｚ差を同定し、互いに分解することができないが、他の群のピークから分解することができるピークとしてグループ化した。合計で、５ｍ／ｚ値（オレンジ色のセル）を選択して、ＷＴ及び４つのバリアント群をモニタリングした。
【表8】
【0130】
実施例２：質量分析によるＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２の感度定量
方法．試料は、同位体標識された内部標準を含有する酸性化エタノール溶液を添加し、冷凍庫に６０分間置くことによって調製される。遠心分離後、上清を回収し、分析物を抽出し、オンライン抽出を備えた多重高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムによって分離する。検出は、ＥＳＩ源を備え、正の全イオン断片化（ＡＩＦ）モードで動作するイオントラップオービトラップ質量分析計によって行われる。内部標準に対する分析物応答の比率は、較正曲線を構築し、患者試料中のＩＧＦ－１又はＩＧＦ－２を定量するために使用される。
方法．試料は、同位体標識された内部標準を含有する酸性化エタノール溶液を添加し、冷凍庫に６０分間置くことによって調製される。遠心分離後、上清を回収し、分析物を抽出し、オンライン抽出を備えた多重高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムによって分離する。検出は、ＥＳＩ源を備え、正の全イオン断片化（ＡＩＦ）モードで動作するイオントラップオービトラップ質量分析計によって行われる。内部標準に対する分析物応答の比率は、較正曲線を構築し、患者試料中のＩＧＦ－１又はＩＧＦ－２を定量するために使用される。
【表9】
【0131】
精密研究．定義：アッセイ内での試料の再現性
従来技術：許容基準：ＳＤ＜ＴＥａ／３；ＳＤ及びＣＶ（％）に基づいて各プロセスのシグマが＞３．０でなければならない。
従来技術：許容基準：ＳＤ＜ＴＥａ／３；ＳＤ及びＣＶ（％）に基づいて各プロセスのシグマが＞３．０でなければならない。
【0132】
高度な技術：許容基準は、測定を監督する医療及び科学ディレクターによって決定される。許容基準は、データに基づいて、合理的かつ裏付け可能でなければならない。
【0133】
実行内での精度．許容基準：ＳＤは、許容ＳＤ（ｗｒ）未満又は≦ＴＥａ／４でなければならない。
【0134】
アッセイ内精度は、測定内での品質管理プールの再現性として定義される。全てのレベルのＱＣを分析して、平均、ＳＤ、及び変動係数（％ＣＶ）を決定した。各レベルを５回の実行にわたって１回の実行当たり５回測定し、合計２５回反復した。分析物の要約データを以下に示す。元のデータを以下の表に列挙する。
【表10】
【表11】
【0135】
結果は、ヒト血清中のＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２の検出について許容基準が満たされたことを示す。
【0136】
総合精度．許容基準：総合ＳＤ≧１／２ＴＥａの場合は許容できない、又は総合ＳＤが定義された最大ＳＤ又はＣＶ未満でなければならない。
【0137】
測定間精度は、アッセイ間の試料の再現性として定義される。全てのレベルのＱＣを分析して、平均、ＳＤ、及び変動係数（％ＣＶ）を決定した。各レベルを２０日間にわたって１日当たり２回測定し、合計４０回反復した。分析物からの要約データを以下に示す。元のデータを以下の表に列挙する。
【表12】
【表13】
【0138】
結果は、ヒト血清中のＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２の検出について許容基準が満たされたことを示す。
【0139】
ブランク限界（ＬＯＢ）．ＬＯＢは、ゼロキャリブレーターの平均＋２ＳＤとして決定した。ＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２のＬＯＢは、それぞれ、１．６２１ｎｇ／ｍＬ及び１０．１６２ｎｇ／ｍＬである。
【0140】
検出限界（ＬＯＤ）．ＬＯＤは、ゼロキャリブレーターの平均＋４ＳＤとして決定した。ＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２のＬＯＤは、それぞれ、２．４４６ｎｇ／ｍＬ及び１２．２７６ｎｇ／ｍＬである。
【0141】
定量限界（ＬＯＱ）．許容基準：ＳＤ＜ＴＥａ／３の最低濃度
処理尿に添加したメタノール中の標準キャリブレーター材料を使用して調製した３つのプールを試験して、ＬＯＱを決定した。各プールは、５回の実行にわたって１回の実行当たり５回測定した。ＬＯＱは、ＳＤ＜ＴＥａ／３の最低濃度によって決定した。検出限界の要約データを以下に示す。ＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２のＬＯＱは、それぞれ、７．７９４ｎｇ／ｍＬ及び３１．９８３ｎｇ／ｍＬである。
処理尿に添加したメタノール中の標準キャリブレーター材料を使用して調製した３つのプールを試験して、ＬＯＱを決定した。各プールは、５回の実行にわたって１回の実行当たり５回測定した。ＬＯＱは、ＳＤ＜ＴＥａ／３の最低濃度によって決定した。検出限界の要約データを以下に示す。ＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２のＬＯＱは、それぞれ、７．７９４ｎｇ／ｍＬ及び３１．９８３ｎｇ／ｍＬである。
【表14】
【表15】
【0142】
較正の検証．許容基準：観察された値の平均は、ＴＥａ／４以下で予想される範囲から逸脱していなければならない。
【0143】
アッセイの線形性は、２つの異なるキャリブレーターロットの結果を分析することによって決定した。キャリブレーターロットを新たに調製し、現在使用しているキャリブレーター（以前の調製）に対して不明なものとして試験した。標的化した濃度と観察された濃度との間の差を分析した。データに対して行われた統計は、許容される性能を示す。
【0144】
ＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２の分析測定範囲（ＡＭＲ）は、それぞれ、７．８～２，０００ｎｇ／ｍＬ及び３１．３～２，０００ｎｇ／ｍＬである。
【0145】
報告範囲（ｒｅｐｏｒｔａｂｌｅ ｒａｎｇｅ）（ＲＲ）。ＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２の臨床報告範囲（ＣＲＲ）は、それぞれ、７．８～２，０００ｎｇ／ｍＬ及び３１．３～２，０００ｎｇ／ｍＬである。
【0146】
既知の濃度のＩＧＦ－１を有する６つの患者試料を、処理血清で２、４、８、及び１６倍に希釈した。２、４、及び８倍希釈レベルでの回収率は、回収誤差の１００±２０％以内であった。
【0147】
既知の濃度のＩＧＦ－２を有する６つの患者試料を、処理血清で２、４、８、及び１６倍に希釈した。各希釈レベルでの全ての回収は、回収誤差の１００±２０％以内であった。
【0148】
回収試験．許容基準：完全な回収の欠如（回収量から追加量を差し引いたもの）による誤差は、各個々の測定値について≦ＴＥａでなければならない。
【0149】
添加回収試験を実施して、アッセイ内の任意のマトリックス効果を評価した。ＩＧＦ－１塩基回収試料（合計６つ）を、２００ｕＬの処理血清と４００ｕＬの各試料とを組み合わせることによって調製した。添加した試料は、２，０００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ－１のストック溶液２００ｕＬを、４００ｕＬの各試料に添加することによって調製した。結果は、許容可能な精度範囲内にある。
【0150】
ＩＧＦ－２塩基回収試料（合計６つ）を、１００ｕＬの処理血清と１００ｕＬの各試料とを組み合わせることによって調製した。添加した試料は、２，０００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ－２のストック溶液１００ｕＬを、１００ｕＬの各試料に添加することによって調製した。結果は、許容可能な精度範囲内にある。
【0151】
分割試料比較試験．許容基準：平均の差の絶対値は、ＴＥａ／４未満でなければならない。
【0152】
ＲＩＡ対現在のＡｇｉｌｅｎｔ ＴＯＦ ＬＣ－ＭＳ。ＩＧＦ－１の定量のために放射免疫測定法（ＲＩＡ）と現在のＡｇｉｌｅｎｔ ＴＯＦ ＬＣ－ＭＳ技術を比較する、分割試料比較試験を行った。１００人の患者からの試料を分割し、Ａｒｉａ ＴＸ－４システム上でＬＣ－ＭＳ法を用いて分析した。試料を、Ｅｓｏｔｅｒｉｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃａｌａｂａｓａｓ，ＣＡ）でＲＩＡ法を使用して同時にアッセイした。（試験コード＃５００２８２、酸：アルコール抽出後のＲＩＡの遮断）。データを、Ｄｅｍｉｎｇ回帰によって解析した（ｎ＝１００、ｍ＝１．０３９±０．０１５７２、ｂ＝－１１．５５±５．６７３）。ＬＣ－ＭＳ法は、ＲＩＡと非常に一致することが見出された。
【0153】
ＨＰＬＣ－ＭＳ法の比較．ＬＣ－ＭＳによるＩＧＦ－１の分割試料比較を、現在のＡｇｉｌｅｎｔ ＴＯＦと提案されたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｆｏｃｕｓ ＨＰＬＣ－ＭＳ法との間で行った。１９７の患者試料（ｎ＝１９７）を試験した。線形回帰は、１．０２６６ｘ＋０．５７、ｒ２＝０．９８６１であった。結果は、ヒト血清中のＩＧＦ－１の定量について許容基準が満たされたことを示す。
【0154】
ＬＣ－ＭＳによるＩＧＦ－２の分割試料比較を、現在のＨＰＬＣ－ＭＳ法と提案されたＨＰＬＣ－ＭＳ法との間で行った。２１４の患者試料（ｎ＝１４４）を試験した。線形回帰は、０．９３２７ｘ＋３８．１７、ｒ２＝０．９１３２であった。
【0155】
測定の不確かさ．定義：特定の測定の結果が確実である程度。複数の決定の平均＋／－１．９６＊ＳＤによって決定される所与の数の周りの９５パーセンタイル信頼区間として表される。
【0156】
修正又は未修正のＦＤＡ認可又は承認試験の場合、測定の不確かさは、各ＱＣレベルを１日当たり５回、５日間別個に測定することによって決定される。５日間よりも短い期間にわたってＭＵ試験を完了する必要がある場合、５つのＱＣ値の各セットを別個に実行し、最終的な精度試験に記録された短縮された時間枠を確認する必要がある。
【0157】
ＭＵ信頼区間は、アッセイ検証計算機テンプレートの精度シートを使用して計算される。平均及び標準偏差を計算することによってデータを解析し、次いで、ＳＤに１．９６を乗じ、これを平均に加算又は減算することによってＭＵを計算する。
【0158】
ヒト血清中のＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２の各ＱＣレベルの信頼区間を以下の表に示す。
【表16】
【表17】
【0159】
検体の安定性．許容基準：ベースライン値と時間／温度試料値との間の差（％）がその分析物について≦ＴＥａである限り、試料は安定しているとみなされる。血清プールは、臨床相関部門から入手し、事前にアリコートされ、セットアップの準備ができていた。
【0160】
様々な温度でのＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２の回収率を試験するために、各々について１０試料を評価した。各プールから、表７～１１に示された時間、様々な温度でアリコートをインキュベートした。安定性試験プールが適切なインキュベーション時間に達した場合、全ての試験プールが一緒にアッセイされるアッセイ日まで、－９０℃～－６０℃の冷凍庫に入れる。
【0161】
凍結／融解安定性．ヒト血清中のＩＧＦ－１物質の凍結／融解の回収率について、６つの試料を評価した。次いで、全てのプールをアリコートし、－９０℃～－６０℃で保管した。各プールからの６つのアリコートは、異なる数の凍結／融解サイクル（０～５）に供された。表７ａのデータは、試験した全てのプールについて、最初の凍結／融解（サイクル「０」）から５回の凍結／融解サイクルを追加しても、ヒト血清中のＩＧＦ－１の許容可能なレベルの活性が保持されたことを示す。最初の凍結／融解サイクル（サイクル「０」）は、回収プロセス中に全ての検体が受ける凍結／融解を表す。患者試料中のＩＧＦ－２の回収率を、最大５回の凍結／融解サイクルにわたって同様の方法で行った。
【0162】
ＩＧＦ－１患者試料は、少なくとも６回の凍結／融解サイクルで安定である。ＩＧＦ－２患者試料は、少なくとも５回の凍結／融解サイクルで安定である。
【0163】
冷蔵安定性（２．０℃～８．０℃）．データは、ヒト血清が少なくとも７日間、冷蔵温度で許容レベルのＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２活性を保持したことを示す。
【0164】
周囲安定性（１８．０℃～２５．０℃）．データは、ヒト血清が、それぞれ、少なくとも２日間及び少なくとも７日間、室温で許容レベルのＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２活性を保持したことを示す。
【0165】
凍結安定性（－３０．０℃～－１０．０℃）．データは、ヒト血清が、それぞれ、少なくとも２ヶ月間及び少なくとも２１日間、凍結温度で許容レベルのＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２活性を保持したことを示す。
【0166】
凍結安定性：超低温（－９０．０℃～－６０．０℃）．データは、ヒト血清が、それぞれ、少なくとも３ヶ月間及び少なくとも３４日間、室温で許容レベルのＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２活性を保持したことを示す。
【0167】
干渉試験．許容基準：潜在的な干渉物質による平均差は、許容可能とみなされるには、≦ＴＥａ／４でなければならない。
【0168】
溶血干渉．アッセイにおける溶血の効果を、溶血したＲＢＣを低濃度、中濃度、及び高濃度で３つの患者試料（１００ｕＬ）に添加して、軽度、中等度、及び重度（ｇｒｏｓｓ）の溶血を表すことによって評価した。
【0169】
ＩＧＦ－１の場合、平均回収率は、軽度、中等度、及び重度の溶血について、それぞれ８２．４％、７２．４％、及び６３．９％であった。軽度の溶血は、血清アッセイにおいてＩＧＦ－１と干渉しないが、中等度及び重度の溶血試料は許容できない。
【0170】
ＩＧＦ－２の平均回収率は、軽度、中等度、及び重度の溶血について、それぞれ１１１．９％、１１９．６％、及び１３０．１％であった。軽度及び中等度の溶血についての平均回収率は許容範囲内であるが、個々の値は許容範囲内ではない。溶血は、全てのレベルで血清アッセイにおけるＩＧＦ－２と干渉する。あらゆる程度の溶血を伴う試料も許容されない。
【0171】
脂肪血症の干渉．アッセイにおける脂肪血症の効果を、軽度、中等度、及び重度の脂肪血症を表す、低濃度、中濃度、及び高濃度のＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（２０％、エマルション）を３つの患者試料（１００ｕＬ）に添加することによって評価した。
【0172】
ＩＧＦ－１の場合、平均回収率は、軽度、中等度、及び重度の脂肪血症について、それぞれ１０２．８％、９７．０％、及び９６．８％であった。脂肪血症は、血清アッセイにおいてＩＧＦ－１と干渉しない。あらゆる程度の脂肪血症を伴う試料も許容される。
【0173】
ＩＧＦ－２の場合、平均回収率は、軽度、中等度、及び重度の脂肪血症について、それぞれ１０５．１％、１０８．６％、及び１２２．５％であった。脂肪血症は、軽度及び中等度のレベルで血清アッセイにおいてＩＧＦ－２と干渉しない。重度の脂肪血症を伴う試料は許容されない。
【0174】
ビリルビンの干渉．アッセイにおける黄疸の効果を、軽度、中等度、及び重度の黄疸を表す、低濃度、中濃度、及び高濃度のビリルビン粉末を３つの患者試料（１００ｕＬ）に添加することによって評価した。
【0175】
ＩＧＦ－１の場合、平均回収率は、軽度、中等度、及び重度の黄疸について、それぞれ１０２．８％、９９．０％、及び９８．９％であった。黄疸は、血清アッセイにおいてＩＧＦ－１と干渉しない。あらゆる程度の黄疸を伴う試料も許容される。
【0176】
ＩＧＦ－２の平均回収率は、軽度、中等度、及び重度の黄疸について、それぞれ９９．７％、１０２．０％、及び１０６．０％であった。黄疸は、血清アッセイにおいてＩＧＦ－２と干渉しない。あらゆる程度の黄疸を伴う試料も許容される。
【0177】
分析特異性．ＩＧＦ－１結合タンパク質の干渉も、以下の化合物：ＩＧＦ結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、ＩＧＦ結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ２）及びＩＧＦ結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）を含有する混合物を使用して試験した。
【0178】
６つの患者試料を採取し、ベースラインを確立するために実行した。次いで、当量（２００ｕＬ）の各試料及び結合タンパク質（８００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦＢＰ１、２，０００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦＢＰ２、及び１０，０００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦＢＰ３）を組み合わせ、試験して、ＩＧＦ－１の回収率を計算した。これらの後、結合タンパク質の混合物（以前と同じ濃度）の６つの溶液を実行した。結果は、回収率が１００±２０％以内であり、ヒト血清中のＩＧＦ－１の定量について許容基準が満たされたことを示す。試料回収率は、干渉が存在しなかったことを示した。
【0179】
１つの患者試料を採取し、ベースラインを確立するために実行した。次いで、当量（２００ｕＬ）の各試料及び結合タンパク質（８００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦＢＰ１、２，０００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦＢＰ２、及び１０，０００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦＢＰ３）を組み合わせ、試験して、ＩＧＦ－２の回収率を計算した。これらの後、結合タンパク質の混合物（以前と同じ濃度）の溶液を実行した。結果は、回収率が１００±２０％以内であり、ヒト血清中のＩＧＦ－２の定量について許容基準が満たされたことを示す。試料回収率は、干渉が存在しなかったことを示した。注記：結合タンパク質溶液中のＩＧＦ－２の低いシグナルは、マトリックスとして使用した処理血清中に存在する低量のＩＧＦ－２によって説明することができる。
【0180】
イオン抑制試験．この試験の目的は、勾配の過程で、又はマトリックス成分の注入時、イオン抑制効果又はイオン増強効果が観察されるかどうかを決定することであった。これを評価するために、患者試料（６人の男性及び６人の女性）の取得中に、同位体標識された内部標準（Ｎ１５標識ＩＧＦ－１）の、カラム後の「Ｔ」注入を行った。この実験では、総イオン計数（ＴＩＣ）は、目的の分析物の溶出時間中に２０％未満の変化を示した。試験は、アッセイが試験に合格し、ＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２の両方についてイオン抑制が観察されなかったことを示す。
【0181】
キャリーオーバー．高濃度の標準（２，０００ｎｇ／ｍＬ）の８回の反復の直後に、ブランク血清の１２回の反復を試験し、各ＬＣカラム（４チャネルＡｒｉａ ＬＣシステムの各々に対応する）でキャリーオーバーを評価した。低キャリブレーターの反復は、ヒト血清中のＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２の両方についてキャリーオーバーを示さなかった。
【0182】
基準範囲（ＲＩ）
【表18】
【表19】
【表20】
【表21】
【表22】
【0183】
ＩＧＦ－２の参照範囲
成人、男性及び女性 ２６７～６１６ｎｇ／ｍＬ
小児、男性及び女性（２～１８歳） ２６０～６３０ｎｇ／ｍＬ
検体の種類／代替的な検体の種類。ＩＧＦ－１アッセイは、レッドトップ（ｒｅｄ ｔｏｐ）（ゲルなし）チューブに採取されたヒト血清について検証される。ＳＳＴチューブからのＩＧＦ－１とレッドトップチューブとの比較を完了した。ＳＳＴチューブは、許容基準を満たした。
成人、男性及び女性 ２６７～６１６ｎｇ／ｍＬ
小児、男性及び女性（２～１８歳） ２６０～６３０ｎｇ／ｍＬ
検体の種類／代替的な検体の種類。ＩＧＦ－１アッセイは、レッドトップ（ｒｅｄ ｔｏｐ）（ゲルなし）チューブに採取されたヒト血清について検証される。ＳＳＴチューブからのＩＧＦ－１とレッドトップチューブとの比較を完了した。ＳＳＴチューブは、許容基準を満たした。
【0184】
ＩＧＦ－２アッセイは、レッドトップチューブに採取されたヒト血清について検証される。レッドトップ試料とＳＳＴ試料を対にした４０人の対象を収集し、ＩＧＦ－２について分析した。ＳＳＴ血清とレッドトップ血清を比較した。試料チューブの種類間で顕著な差は観察されなかった。ＳＳＴチューブは、許容基準を満たした。
【表23】
【0185】
血漿試料は、自動ピペッティングシステムに適合しない粘度を示すことが以前に指摘されていた。このため、血漿試料は、ＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２アッセイには許容されない。
【0186】
臨床的有用性．ＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２の測定は、成長障害の診断において有用である。小人症は、血清ＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２のレベルの低下と関連しているが、先端巨大症は、血清ＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２のレベルが高くなる。
【0187】
偏差．ＩＧＦ－２アッセイ分割試料比較では、１点ＳＥ（２０．２１）＞ＴＥａ／４（２０．０３）があるが、＜ＴＥａ／３（２６．７０）である。これらの比較では、ＴＥａ／４未満のＳＥが好ましく、ＴＥａ／３未満のＳＥが許容される。
【0188】
結論．この検証試験は審査されており、本方法の性能は患者の検査に許容できると考えられる。
【表24】
【0189】
本明細書で言及又は引用される文献、特許、及び特許出願、並びに他の全ての文書及び電子的に入手可能な情報の内容は、各個々の刊行物が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されるのと同じ程度に、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。出願人らは、任意のそのような文献、特許、特許出願、又は他の物理的文書及び電子的文書からのありとあらゆる資料及び情報を本出願に物理的に組み込む権利を留保する。
【0190】
本明細書に例示的に記載された方法は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素又は複数の要素、限定又は複数の限定がなくても好適に実施することができる。したがって、例えば、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、広義かつ限定されずに、読み取られるべきである。加えて、本明細書で使用されている用語及び表現は、限定ではなく、説明の用語として使用されており、そのような用語及び表現の使用において、示され、説明された特徴又はその一部のいずれかの同等物を除外する意図はない。特許請求される発明の範囲内で様々な修正が可能であると認識される。したがって、本発明は好ましい実施形態及び任意選択的な特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示され、そこに具現化された本発明の修正及び変形は、当業者によって利用され得、かかる修正及び変形は、本発明の範囲内であるとみなされると理解されるべきである。
【0191】
本発明は、本明細書において広範かつ包括的に説明されている。包括的な開示に含まれる、より狭い種及び亜属の群の各々も、本方法の一部を形成する。これは、除去された材料が本明細書に具体的に列挙されているかどうかにかかわらず、その属から任意の主題を除去する但し書き又は負の制限を伴う本方法の包括的な記載を含む。
【0192】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。加えて、本方法の特徴又は態様がマーカッシュ群の観点から記載される場合、当業者は、本発明が、それによってマーカッシュ群のいずれかの個々のメンバー又はメンバーの亜群の観点からも記載されることを認識するであろう。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
【図11】
【国際調査報告】