特表 2024-515522 タンパク質又はバイオマス生成のための変異体細菌株及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-10

(54)【発明の名称】タンパク質又はバイオマス生成のための変異体細菌株及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/90 20060101AFI20240403BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240403BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20240403BHJP

   C12P 1/04 20060101ALI20240403BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20240403BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20240403BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20240403BHJP

【ＦＩ】

C12N15/90 100Z

C12N1/21 ZNA

C12P21/00 B

C12P1/04 Z

C12N15/31

C12N1/20 A

C12N15/54

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023560849

(86)(22)【出願日】2022-04-07

(85)【翻訳文提出日】2023-11-01

(86)【国際出願番号】 FI2022050229

(87)【国際公開番号】W WO2022229504

(87)【国際公開日】2022-11-03

(31)【優先権主張番号】20215494

(32)【優先日】2021-04-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】FI

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522120255

【氏名又は名称】ソーラー フーズ オサケユイチア

(74)【代理人】

【識別番号】100145849

【弁理士】

【氏名又は名称】井澤 眞樹子

(72)【発明者】

【氏名】テュッティ ヤムサ

(72)【発明者】

【氏名】ユハ ペッカ ピットカエーネン

(72)【発明者】

【氏名】ローラ サルスヤルヴィ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CA02

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA10

4B064DA11

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BC02

4B065BC03

4B065BC07

4B065BC14

4B065BC20

4B065CA41

4B065CA43

(57)【要約】

本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸の細菌生成を減少させる遺伝子改変を含む、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）属の変異型化学合成独立栄養細菌に関する。更に、本発明は、変異型化学合成独立栄養細菌を使用してタンパク質又はバイオマスを生成するための連続培養方法に関し、当該方法は、細胞へのガス及びミネラルの供給を含む。本発明はまた、これらの方法の生成物、及び例えば食品又は飼料におけるこれらの生成物の使用に関する。
【選択図】
【図３】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細菌株ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５の変異体であって、ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５株と比較して、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の細菌生成を減少させる遺伝子改変を含む、細菌株ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５の変異体。

【請求項2】

前記遺伝子改変が、ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５株と比較して細菌ＰＨＡシンターゼ活性を低下させ、好ましくはＰＨＡシンターゼ活性が１０％未満、５％未満等、例えば２％未満に低下している、請求項１に記載の変異体。

【請求項3】

前記変異体が、ｐｈａＣ１の発現レベル及び／又はｐｈａＣ１酵素の活性を低下させる遺伝子改変を含む、請求項１又は２に記載の変異体。

【請求項4】

前記変異体が、ｐｈａＣ２の発現レベル及び／又はｐｈａＣ２酵素の活性を低下させる遺伝子改変を含む、前記請求項１～３のいずれか一項に記載の変異体。

【請求項5】

前記遺伝子改変が遺伝子破壊である、前記請求項１～４のいずれか一項に記載の変異体。

【請求項6】

前記変異体が、ｐｈａＣ１及びｐｈａＣ２の両方の遺伝子破壊を含む、前記請求項１～５のいずれか一項に記載の変異体。

【請求項7】

前記変異体が、番号ＶＴＴ－Ｅ－２１３５９５で寄託された細菌株である、請求項１～６のいずれか一項に記載の変異体。

【請求項8】

前記変異体が、エネルギー源として水素ガスを使用し、唯一の炭素源として二酸化炭素を使用して増殖する能力を保持している、請求項１～７のいずれか一項に記載の変異体。

【請求項9】

ＰＨＡシンターゼをコードする１つ以上の遺伝子の遺伝子破壊を含む、変異体のキサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）株。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか一項に記載の変異体の細菌を含む、培養物。

【請求項11】

バイオマス生成のための方法であって、前記方法が、請求項１～９のいずれか一項に記載の変異体の細菌を培養することを含む、バイオマス生成のための方法。

【請求項12】

前記変異体の細菌を、エネルギー源としての水素及び無機炭素源と共に連続培養で培養することを含み、前記無機炭素源が二酸化炭素を含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

バイオマス生成のための方法であって、前記方法が、エネルギー源としての水素及び無機炭素源と共に連続培養で変異型化学合成独立栄養細菌株を培養することを含み、前記無機炭素源が二酸化炭素を含み、前記変異型化学合成独立栄養株がＰＨＡシンターゼをコードする１つ以上の遺伝子の遺伝子破壊を含む、バイオマス生成のための方法。

【請求項14】

前記培養物中の溶存酸素が５％～１０％の間で維持される、請求項１２又は１３に記載の方法。

【請求項15】

アンモニウム、尿素、硝酸塩及び／又は窒素ガスが窒素源として使用される、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記培養物中のｐＨが５．５～８．０の間、例えば６．５～７．０の間、６．８等に維持される、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記培養物を、２５℃～４０℃の間、例えば２８℃～３２℃の間、３０℃等の温度で増殖させる、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記培養中に生成されたバイオマスを回収する更なる工程を含み、任意に、前記バイオマスを乾燥させる更なる工程を含む、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

タンパク質の生成のための方法であって、請求項１８に記載の方法、及び前記バイオマスからタンパク質を単離する更なる工程を実施することを含み、前記方法が、タンパク質画分及び非タンパク質成分を含む画分をもたらす、タンパク質の生成のための方法。

【請求項20】

前記バイオマスから、前記タンパク質画分から、又は非タンパク質成分を含む前記画分から、食品又は飼料製品を製造する更なる工程を含む、請求項１８又は１９に記載の方法。

【請求項21】

請求項１１～２０のいずれか一項に記載の方法によって得られる又は得ることができるバイオマス、タンパク質、又は非タンパク質成分等の製品。

【請求項22】

請求項２０に記載の方法によって得られる又は得ることができる、食品又は飼料製品。

【請求項23】

ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５細菌株の遺伝子改変のための方法であって、
ａ）ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５株の細菌、又はＶＴＴ－Ｅ－２１３５９５等のＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５細菌株を使用して生成された遺伝子改変株若しくは突然変異株を提供する工程と、
ｂ）前記細菌に核酸コンストラクトを導入する工程であって、前記核酸コンストラクトが、
ｉ）選択可能なマーカーをコードする配列と、
ｉｉ）任意に、前記細菌ゲノムに組み込まれる更なる配列と、
ｉｉｉ）前記細菌ゲノムとの相同組換えを可能にする隣接配列と、を含む、
工程と、及び
ｃ）前記選択可能なマーカーに基づいて遺伝子改変株を選択する工程と、を含む、ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５細菌株の遺伝子改変のための方法。

【請求項24】

前記選択可能なマーカーが、カナマイシン耐性又はテトラサイクリン耐性等の抗生物質耐性を提供する遺伝子である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

遺伝子改変を含むＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５細菌株の変異体であって、前記遺伝子改変が、カナマイシン耐性又はテトラサイクリン耐性等の抗生物質耐性を提供する選択可能なマーカーによる細菌遺伝子の破壊を含む、遺伝子改変を含むＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５細菌株の変異体。

【請求項26】

請求項２５に記載の変異体を含む、培養物。

【請求項27】

バイオマス生成のための方法であって、前記方法が、請求項２５に記載の変異体細菌を培養することを含む、バイオマス生成のための方法。

【請求項28】

前記変異体細菌を、エネルギー源としての水素及び無機炭素源と共に連続培養で培養することを含み、前記無機炭素源が二酸化炭素を含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

請求項１４～１８のいずれか一項に記載の特徴を更に含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

タンパク質の生成のための方法であって、請求項２７、２８又は２９に記載の方法、及び前記バイオマスからタンパク質を単離する更なる工程を実施することを含み、前記方法が、タンパク質画分及び非タンパク質成分を含む画分をもたらす、タンパク質の生成のための方法。

【請求項31】

前記バイオマスから、前記タンパク質画分から、又は非タンパク質成分を含む前記画分から、食品又は飼料製品を製造する更なる工程を含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

請求項２７～３１のいずれか一項に記載の方法によって得られる又は得ることができるバイオマス、タンパク質、又は非タンパク質成分等の製品。

【請求項33】

請求項３１に記載の方法によって得られる又は得ることができる、食品又は飼料製品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、微生物を用いたタンパク質及び／又は他の高分子の製造に関する。特に、本発明は、ガス及びミネラルが細胞に供給される、細菌を使用してタンパク質又はバイオマスを生成するための新規な細菌株及び連続培養方法に関する。本発明はまた、これらの方法の生成物、及び例えば食品又は飼料におけるこれらの生成物の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

世界人口の増加、気候変動及び水の不足は、伝統的な農業に対する、したがって十分な食料及び飼料の供給に対する脅威をますますもたらしている。よって、タンパク質等の有機分子の代替供給源が研究されている。可能性のある代替物は、単細胞生成、すなわち、微生物を使用したタンパク質及び／又は他の高分子の生成である。
エネルギー源として水素ガス及び唯一の炭素源として二酸化炭素を用いて最小ミネラル培地上で増殖することができる化学合成独立栄養微生物（Ｃｈｅｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）が記載されている。これらの微生物の総説については、例えば、Ｓｈｉｖｅｌｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５２：１９１が参照できる。
特許出願の国際公開第２０１８１４４９６５号は、ガス状基質を高タンパク質バイオマスに変換するための様々な微生物及びバイオプロセスを記載している。
Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ５８５：１－１１は、従属栄養条件及び独立栄養条件下で容易に増殖する水素細菌であるアルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）の変異株を記載している。リブロース－１，５－二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ｒｕｂｉｓｃｏ）活性が変化した変異体は特徴付けられた。
Ｏｈｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９５：５４９－５６１は、耐性バイオマス利用への微生物遺伝子の適用を概説している。
Ｙｕ Ｊｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｉｎｔ Ｊ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｅｎｅｒ ３８：８６８３－８６９０は、水素酸化細菌分離株による二酸化炭素固定を記載している。中程度の酸素濃度（１０ｍｏｌ％）下で５０％という高いエネルギー効率が測定された。

【0003】

しかしながら、様々な化学合成独立栄養微生物は、増殖速度、収量、バイオマス組成、並びにヒトの消費における安全性、味、匂い、口当たり、調理における技術的及び機能的特性等の食品原料として使用されることに関する特性に関して異なる特性を有する。
全ての化学合成独立栄養微生物が十分な増殖速度を有し、十分な収率を提供するわけではなく、全てのプロセスが経済的に実行可能な大規模プロセスに現実的にアップスケールできるわけではない。例えば食品又は飼料用途のための機能性タンパク質の十分な出力を有するためには、大規模に実施することができる適切な生成生物及び適切なプロセスを見出すことが重要である。この必要性は、本発明によって対処される。
窒素制限等の代謝ストレス下では、細菌はポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）と呼ばれる貯蔵ポリマーの形態でエネルギーを貯蔵することがある（Ｒｅｈｍ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，１９９９ Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌ ２５：３－１９）。工業的環境において大型バイオリアクタ内で細菌が増殖すると、ガス交換が不十分になることが多く、ＰＨＡ生産の増加につながる。ＰＨＡはバイオプラスチックとして利用することができるが、ＰＨＡ以外の製品のために細菌を増殖させる場合、その生成は炭素収率を低下させるので望ましくない結果である。この課題も本発明によって対処される。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】国際公開公報 ＷＯ２０１８／１４４９６５号

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｓｈｉｖｅｌｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５２：１９１

【非特許文献2】Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ５８５：１－１１

【非特許文献3】Ｏｈｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９５：５４９－５６１

【非特許文献4】Ｙｕ Ｊｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｉｎｔ Ｊ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｅｎｅｒ ３８：８６８３－８６９０

【非特許文献5】Ｒｅｈｍ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，１９９９ Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌ ２５：３－１９

【発明の概要】

【0006】

本発明者らは、化学合成独立栄養細菌、例えばキサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）属の細菌が、特定の条件下でＰＨＡの形態でエネルギーを貯蔵することを見出した。ｐｈａＣ１遺伝子の遺伝子破壊を含む変異株は、同じ条件下でＰＨＡをほとんど生成しなかったが、バイオマス及び／又はタンパク質の生成のための方法に好ましい特性及び適合性を保持していることが分かった。
第１の主要な態様では、本発明は、細菌株ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５の変異体であって、ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５株と比較して、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の細菌生成を減少させる遺伝子改変を含む、細菌株ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５の変異体に関する。
更なる態様では、本発明は、バイオマス及び／又はタンパク質の生成のための方法であって、当該方法が、エネルギー源としての水素及び無機炭素源と共に連続培養で変異型化学合成独立栄養細菌株を培養することを含み、無機炭素源が二酸化炭素を含み、当該変異型化学合成独立栄養株がＰＨＡシンターゼをコードする１つ以上の遺伝子の遺伝子破壊を含む、バイオマス及び／又はタンパク質の生成のための方法に関する。更なる主要な態様では、本発明は、本発明の方法によって得られる又は得ることができるバルクタンパク質、バイオマス又は非タンパク質細胞若しくは化学成分、及び本発明の方法によって得られる又は得ることができる食品又は飼料製品に関する。
更なる態様では、本発明は、ＰＨＡシンターゼをコードする１つ以上の遺伝子の遺伝子破壊を含む変異型キサントバクター株（ａ ｖａｒｉａｎｔ Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ ｓｔｒａｉｎ）に関する。
本発明はまた、細菌株ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５の遺伝子改変のための方法、及びＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５株の遺伝子改変変異体に関する。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】図１は、ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５として寄託された分離細菌株の化学合成独立栄養２００Ｌ培養中の６００ｎｍで測定された光学密度（黒丸）及び光学密度プローブ読み取り値を示す。

【図2】図２は、異なる窒素源上にＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５として沈着させた分離細菌株の並行化学合成独立栄養２００ｍＬ培養中に６００ｎｍで測定された光学密度を示す。

【図3】図３は、独立栄養条件におけるＳｏＦ１（ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５）（実線）及びＳｏＦ１－２．０（ＶＴＴ Ｅ－２１３５９５）（破線）の増殖曲線を示す。

【発明を実施するための形態】

【0008】

（定義）
本明細書で使用される場合、例えば株に関連して「分離（された）」という用語は、その自然環境から分離されていることを意味する。好ましくは、分離株は純粋であり、すなわち他の株を含まない。
「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、株との関連で本書で使用される場合、参照株に由来する、すなわち参照株を出発点として使用して生成され、当該参照株と比較して遺伝子改変を含む株を指す。遺伝子改変には、点突然変異、並びに遺伝子座全体又はその断片の挿入又は欠失等の破壊が含まれる。変異体は、参照株と比較して、好ましくは１０個未満、例えば５個未満、例えば４、３、２又は１個等の遺伝子改変を有する。好ましくは、変異株のゲノム配列は、参照株のゲノム配列と９０％を超えて、例えば９５％を超えて、例えば９９％を超えて同一である。
本書で使用される場合、「化学合成独立栄養（ｃｈｅｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ）」という用語は、エネルギー源として水素ガスを用い、唯一の炭素源として二酸化炭素を用いて最小ミネラル培地で増殖する能力を指す。
本書で使用される場合、名詞「培養物（ｃｕｌｔｕｒｅ）」は、液体培地中の生細胞の懸濁液を指す。
「バイオマス」という用語は、細菌発酵の分野におけるその通常の意味を有し、細胞材料を指す。
本書で使用される場合、「連続培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）」という用語は、新鮮な培地を培養物に連続的に添加し、細菌培養物を含む培地を本質的に同じ速度で連続的に除去する培養プロセスを指す。

【0009】

（本発明の態様及び実施形態）
ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５株は、フィンランドのナーンタリのバルト海の海岸から分離された。この生物は、限られた酸素条件で、最小限のミネラル培地で、エネルギー源として水素、炭素源として二酸化炭素を用いて、適切なバイオリアクタ条件で増殖することができる。１６Ｓ配列決定及びＩｌｌｕｍｉｎａメタゲノミクス配列決定は、この株がキサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）属のメンバーである可能性が最も高いが、既知の種ではないことを示している。細菌株は、乾燥細胞粉末が高いタンパク質含有量を有し、全ての必須アミノ酸を含有するため、食品及び飼料用途に非常に適している。それはまた、飽和脂肪酸よりも不飽和脂肪酸を多く含有し、高レベルのＢ群ビタミンを含有する。アレルギー又は毒性を引き起こし得るペプチドグリカン及びリポ多糖のレベルは低い。毒性分析を実施すると、その株について遺伝毒性又は細胞毒性は観察されなかった。更に、株は一般に抗生物質に感受性がある。
ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５株（ＳｏＦ１）は、２０１９年６月１１日に、ブダペスト条約に基づく国際寄託当局であるＶＴＴ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ Ｆｉｎｌａｎｄ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １０００，ＦＩ－０２０４４ ＶＴＴ，ＦｉｎｌａｎｄのＶＴＴ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている。株の特性及び株を培養するための方法に関する更なる情報は、本明細書の実施例及び欧州特許出願第１９２０５７８６．７号（参照により本明細書に組み込まれる）に提供されている。

【0010】

本発明は、とりわけ、ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５の変異体、特に、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の細菌生成を減少させる遺伝子改変を含む変異体、並びにより一般的には、ＰＨＡシンターゼをコードする１つ以上の遺伝子の遺伝子破壊を含む株等のポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の生成を減少させた化学合成独立栄養細菌に関する。
本発明者らは、ｐｈａＣ１及び／又はｐｈａＣ２遺伝子座の破壊を含むＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５の遺伝子改変変異体を構築した。ｐｈａＣ１の遺伝子破壊を含む変異体は、２０２１年４月１９日に、ブダペスト条約に基づく国際寄託当局であるＶＴＴ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ Ｆｉｎｌａｎｄ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １０００，ＦＩ－０２０４４ ＶＴＴ，ＦｉｎｌａｎｄのＶＴＴ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている。受託番号は、ＶＴＴ Ｅ－２１３５９５である。株の特徴及び株を培養するための方法に関する更なる情報は、本書の実施例に提供されている。

【0011】

第１の主要な態様では、本発明は、細菌株ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５の変異体であって、ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５株と比較して、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の細菌生成を減少させる遺伝子改変を含む、細菌株ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５の変異体に関する。したがって、本発明は、細菌株ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５の遺伝子改変変異体、すなわち誘導体に関する。言い換えれば、ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５株は、遺伝子改変を含むことを更に特徴とする。
一実施形態では、遺伝子改変は、ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５株と比較して細菌ＰＨＡシンターゼ活性を低下させ、好ましくはＰＨＡシンターゼ活性は、１０％未満、５％未満等、例えば２％未満に低下している。
更なる実施形態では、遺伝子改変は、独立栄養増殖条件下での細菌ＰＨＢ生成を１０％未満、５％未満等、例えば２％未満に減少させる。これは、例えば、本書の実施例５に記載されているようにＰＨＢ乾燥含量を測定することによって決定することができる。
一実施形態では、変異体は、ｐｈａＣ１の発現レベル及び／又はｐｈａＣ１酵素の活性を低下させる遺伝子改変を含む。
別の実施形態では、変異体は、ｐｈａＣ２の発現レベル及び／又はｐｈａＣ２酵素の活性を低下させる遺伝子改変を含む。
一実施形態では、遺伝子改変は、遺伝子又はその一部の挿入及び／又は欠失等の遺伝子破壊である。
一実施形態では、変異体はｐｈａＣ１とｐｈａＣ２の両方の遺伝子破壊を含む。
別の実施形態では、変異体はｐｈａＣ１の遺伝子破壊を含むが、ｐｈａＣ２の遺伝子破壊を含まない。
一実施形態では、変異体は、ｐｈａＣ１遺伝子が破壊されている、ＶＴＴ－Ｅ－２１３５９５の番号で寄託された細菌株である。
好ましい実施形態では、変異体は、エネルギー源として水素ガスを使用し、唯一の炭素源として二酸化炭素を使用して増殖する能力を保持している。
一実施形態では、株がＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５株の変異体である場合、変異体は、配列番号１に示される１６ＳリボソームＲＮＡ、又は配列番号１と最大２０個、例えば１～１０個、１～５個等、例えば配列番号１と１、２若しくは３個のヌクレオチドの相違を有する１６ＳリボソームＲＮＡを含む。

【0012】

配列番号１．ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５株の１６ＳリボソームＲＮＡ配列：

CTTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAGCGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGCCCAGCAATGGGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGGATGTGCCCAATGGTACGGAATAACCCAGGGAAACTTGGACTAATACCGTATGAGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGCCATTGGATCAACCCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCACTTTCGCCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATCACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATCGTTAAGTCAGGGGTGAAATCCTGGAGCTCAACTCCAGAACTGCCCTTGATACTGGCGACCTTGAGTTCGAGAGAGGTTGGTGGAACTGCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGCAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCCAACTGGCTCGATACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATGCTAGCCGTTGGGCAGCTTGCTGTTCAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCTTTGACATGGCAGGACGATTTCCAGAGATGGATCTCTTCCAGCAATGGACCTGCACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCTCTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAGAGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGATGCGAAAGGGCGACCTCTAGCAAATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGTACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGCTTTACCCGAAGGCGCTGCGCTAACCCGCAAGGGAGGCAGGCGACCACGGTAGGGTCAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTT

【0013】

更なる態様では、本発明は、ＰＨＡシンターゼをコードする１つ以上の遺伝子の遺伝子破壊を含む変異型キサントバクター（Ｖａｒｉａｎｔ Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）株に関する。好ましくは、株は、Ｘ．アギリス（Ｘ．ａｇｉｌｉｓ）、Ｘ．アミノキシダンス（Ｘ．ａｍｉｎｏｘｉｄａｎｓ）、Ｘ．オートトロフィカス（Ｘ．ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、Ｘ．フラバス（Ｘ．ｆｌａｖｕｓ）、Ｘ．タゲティディス（Ｘ．ｔａｇｅｔｉｄｉｓ）、Ｘ．ビスコーサス（Ｘ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ）、キサントバクターｓｐ．１２６、キサントバクターｓｐ．９１及びＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５株からなる群から選択される。
一実施形態では、変異型キサントバクター株は、ｐｈａＣ遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０Ａ６Ｃ１ＫＸＫ２）が破壊されている変異型Ｘ．オートトロフィカス株である。
別の実施形態では、変異型キサントバクター株は、ｐｈａＣ遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０Ａ３Ｌ７ＡＪＤ５）が破壊されている変異型Ｘ．タゲティディス株である。
別の実施形態では、変異型キサントバクター株は、ｐｈａＣ１（配列番号６２）と最も高い配列同一性を有する当該株のゲノム中の遺伝子が破壊されているキサントバクター種の変異体である。配列同一性を決定するための方法は、当技術分野で周知である。好ましくは、コードされたタンパク質は、配列番号６２に対して５０％を超える配列同一性、６０％を超える等、例えば７０％を超える、８０％を超える等、例えば９０％を超える、９５％を超える等の配列同一性を有する。
別の実施形態では、変異型キサントバクター株は、ｐｈａＣ１（配列番号６２）と最も高い配列同一性を有するタンパク質をコードする当該株のゲノム中の遺伝子が破壊されている、Ｘ．アギリス、Ｘ．アミノキシダンス、Ｘ．フラバス、Ｘ．ビスコーサス、キサントバクターｓｐ．１２６又はキサントバクターｓｐ．９１の変異体である。例えば、一実施形態では、変異体は、Ｘ．アギリスゲノム中の全遺伝子のうちｐｈａＣ１（配列番号６２）と最も高い配列同一性を有するＸ．アギリスの遺伝子が破壊されているＸ．アギリスの変異体である。
一実施形態では、変異型キサントバクター株は、ＮＣＢＩ ｒｅｆ．ＭＢＢ６３０９０５８．１に記載の遺伝子が破壊されている変異型Ｘ．タゲティディス株である。
一実施形態では、変異型キサントバクター株は、ＮＣＢＩ ｒｅｆ．ＭＢＰ２１４７７２２．１に記載の遺伝子が破壊されている変異型Ｘ．フラバス株である。
一実施形態では、変異型キサントバクター株は、ＮＣＢＩ ｒｅｆ．ＷＰ＿１３８３９８１４７．１に記載の遺伝子が破壊されている変異型Ｘ．オートトロフィカス株である。
一実施形態では、変異型キサントバクター株は、ＮＣＢＩ ｒｅｆ．ＷＰ＿２１０２１０８５８．１に記載の遺伝子が破壊されている変異型Ｘ．タゲティディス株である。
一実施形態では、変異体キサントバクター株は、ＮＣＢＩ ｒｅｆ．ＷＰ＿２０９４８９９６１．１に記載の遺伝子が破壊されている変異型Ｘ．フラバス株である。
一実施形態では、変異型キサントバクター株は、ＮＣＢＩ ｒｅｆ．ＡＢＳ６７２５３．１に記載の遺伝子が破壊されている変異型Ｘ．オートトロフィカスＰｙ２株である。

【0014】

更なる態様では、本発明は、本発明の変異体細菌株を含む培養物に関する。好ましい実施形態では、培養物の体積は、１００ｍＬ以上、例えば１Ｌ以上、例えば１０Ｌ以上、例えば１，０００Ｌ以上、１０，０００Ｌ以上等、例えば５０，０００Ｌ以上、１００，０００Ｌ以上等、例えば２００，０００Ｌ以上である。
更なる態様では、本発明は、バイオマス及び／又はタンパク質の生成のための方法に関し、当該方法は、本発明の変異体細菌株を培養することを含む。一実施形態では、本方法はバイオマスの生成のためのものである。別の実施形態では、本方法は、タンパク質の生成のためのものである。一実施形態では、本方法は、エネルギー源としての水素及び無機炭素源を用いて連続培養で細菌を培養することを含み、無機炭素源は二酸化炭素を含む。更なる実施形態では、本方法はバイオマスの生成のためのものであり、エネルギー源としての水素及び無機炭素源を用いて連続培養で細菌を培養することを含み、無機炭素源は二酸化炭素を含む。本方法の様々な更なる実施形態を本明細書で以下に説明する。

【0015】

更なる主な態様では、本発明は、バイオマス及び／又はタンパク質の生成のための方法であって、当該方法が、エネルギー源としての水素及び無機炭素源と共に連続培養で変異型化学合成独立栄養細菌株を培養することを含み、無機炭素源が二酸化炭素を含み、当該変異型化学合成独立栄養株がＰＨＡシンターゼをコードする１つ以上の遺伝子、好ましくはｐｈａＣ１（配列番号６２）と最も配列同一性が高い遺伝子の遺伝子破壊を含む、バイオマス及び／又はタンパク質の生成のための方法に関する。
一実施形態では、本方法はバイオマスの生成のためのものである。別の実施形態では、本方法は、タンパク質の生成のためのものである。本方法の様々な更なる実施形態を本書で以下に説明する。
一実施形態では、本方法で使用される変異型化学合成独立栄養株は、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）属のものであり、好ましくはＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５株の変異体である。
別の実施形態では、本方法で使用される変異型化学合成独立栄養株は、クプリアビダス・ネカトル（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）種のものである。

【0016】

ゲノム配列によれば、ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５の番号で寄託された株は、二酸化炭素分子がリブロース１，５－ホスフェートの５－炭素鎖に接続されて２分子のグリセレート３－ホスフェートを形成する炭素固定のために最も可能性の高いカルビン・ベンソン・バシャム（Ｃａｌｖｉｎ－Ｂｅｎｓｏｎ－Ｂａｓｓｈａｍ）回路を使用する。
これにより、株は、増殖に必要な他の全ての有機分子を合成することができる。水素からのエネルギーは、ＮＡＤ^＋還元ヒドロゲナーゼ及び／又はＮｉＦｅＳｅヒドロゲナーゼを介して細胞に入る可能性が最も高い。本質的に、これは、水素（Ｈ_２）がＨ＋に酸化され、ＮＡＤ^＋がＮＡＤＨに還元される酸化還元反応である。ＡＴＰに加えて、ＮＡＤＨは、生体内の主要なエネルギー担体の１つである。或いは、いくつかの他のエネルギー当量は、Ｈ_２を使用する別のヒドロゲナーゼ酵素によって低減される。
カルビン・ベンソン・バシャム（Ｃａｌｖｉｎ－Ｂｅｎｓｏｎ－Ｂａｓｓｈａｍ）回路は、ＣＯ_２を固定するためにＡＴＰ及びＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨの形態のエネルギーを必要とする。この株は酸化的リン酸化によってＡＴＰを生成する可能性が最も高く、これは膜を横切るプロトン勾配を生成する４つのタンパク質複合体からなる。プロトン勾配は、主にＮＡＤＨからのエネルギーを使用して生成される。プロトン勾配は、ＡＴＰシンターゼ複合体を駆動してＡＴＰを生成させる。ゲノム配列によれば、株は細菌Ｆ型ＡＴＰシンターゼを有する。

【0017】

方法が株を無機炭素源で培養することを含むと明示される場合、無機炭素源が培養物中の主な炭素源であることが理解されうる。したがって、培養物中に少量の有機炭素源が存在し得るが、培養物の主な代謝及び増殖は、炭素源としての無機炭素源、好ましくは二酸化炭素の利用に基づく。好ましくは、有機物である培養物に供給される炭素の割合は、本方法中に培養物に供給される全炭素の５％未満、例えば１％未満、例えば０．１％未満である。好ましくは、有機炭素源は本方法に供給されない。

【0018】

同様に、本方法がエネルギー源として水素（Ｈ_２）を用いて株を培養することを含むと明示される場合、水素が培養物中の主なエネルギー源であることを理解されうる。したがって、窒素源として供給され得るアンモニア等の培養物中に存在する他の少量のエネルギー源、又は少量の有機化合物が存在し得るが、培養物の主な代謝及び増殖は、エネルギー源としての水素の利用に基づく。本方法全体において、水素は好ましくは水電解によって、すなわち、水を電気で水素ガスと酸素ガスに分解することによって生成される。したがって、水素ガス及び酸素ガスは、近くの電気分解装置からバイオリアクタに供給される。或いは、電極をバイオリアクタの内部に配置して、別々の電気分解装置ではなくバイオリアクタ内で水素及び酸素を生成することができる。

【0019】

二酸化炭素を含む無機炭素源は、例えば一酸化炭素等の他の無機炭素源を含んでもよい。一実施形態では、気体形態の炭素源のみが培養物に提供される。好ましい実施形態では、二酸化炭素が培養物に提供される唯一の無機炭素源であり、実際に唯一の炭素源である。一実施形態では、ガス及びミネラルのみが培養物に供給され、供給されるガス中の二酸化炭素のレベルは、１０％～５０％の間、例えば１５％～４５％の間、２０％～４０％の間等、例えば２５％～３５％の間、２６％～３０％の間等である。

【0020】

別の実施形態では、ガス及びミネラルが培養物に供給され、供給されるガス中の水素（Ｈ_２）のレベルは、３０％～８０％の間、例えば３５％～７５％の間、４０％～７０％の間等、例えば４５％～６５％の間、５０％～６０％の間等である。

【0021】

別の実施形態では、ガス及びミネラルが培養物に供給され、供給されるガス中の酸素（Ｏ_２）のレベルは、１０％～２５％の間、例えば１５％～２０％の間、１６％～１８％の間等である。別の実施形態では、提供される酸素のレベルは、培養物中の溶存酸素のレベルが５％～１０％の間に維持されるようなものである。

【0022】

好ましい実施形態では、ガス及びミネラルのみが培養物に供給され、Ｈ２、ＣＯ_２及びＯ_２を含むガスが供給され、Ｈ_２のパーセンテージは４０％～７０％の間であり、ＣＯ_２のパーセンテージは１８％～２８％の間であり、Ｏ_２のパーセンテージは１２％～２２％の間である。

【0023】

典型的には、本発明の方法は、窒素源の添加を含む。窒素源は、例えば、水酸化アンモニウム、硫酸アンモニウム又は塩化アンモニウム等のアンモニウム塩、アンモニア、尿素又は硝酸塩、例えば硝酸カリウムの形態で提供されてもよい。他の実施形態では、窒素ガス（Ｎ_２）が窒素源として提供される。好ましい実施形態では、窒素源は水酸化アンモニウム、又は硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩である。
一実施形態では、提供される窒素源は、１００ｍｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌの間、２５０ｍｇ／Ｌ～４ｇ／Ｌの間等、例えば０．５ｇ／Ｌ～２ｇ／Ｌの間、０．７５ｇ／Ｌ～１．５ｇ／Ｌの間等の濃度の水酸化アンモニウムである。

【0024】

典型的には、本発明の方法は、アンモニウム、リン酸塩、カリウム、ナトリウム、バナジウム、鉄、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、モリブデン、マンガン、ホウ素、亜鉛、コバルト、セレン、ヨウ素、銅及び／又はニッケルを含有するミネラル等のミネラルの添加を含む。適切なミネラル培地は周知技術であり、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，Ｊａｃｏｂ Ｋ．Ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎ，ｅｄ．，１９９２、例えば８７頁、表４に記載されている。

【0025】

一実施形態では、添加される鉱物は、アンモニア、アンモニウム（例えば、塩化アンモニウム（ＮＨ_４Ｃｌ）、硫酸アンモニウム（（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４））、硝酸塩（例えば、硝酸カリウム（ＫＮＯ_３））、尿素又は有機窒素源；リン酸塩（例えば、リン酸二ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、リン酸カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）、リン酸（Ｈ_３ＰＯ_４）、ジチオリン酸カリウム（Ｋ_３ＰＳ_２Ｏ_２）、オルトリン酸カリウム（Ｋ_３ＰＯ_４）、リン酸二ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ）、リン酸二カリウム（Ｋ_２ＨＰＯ_４）又はリン酸一カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）；硫酸塩；酵母抽出物；キレート鉄（例えばＥＤＴＡ又はクエン酸でキレート化）；カリウム（例えば、リン酸カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）、硝酸カリウム（ＫＮＯ_３）、ヨウ化カリウム（ＫＩ）、臭化カリウム（ＫＢｒ））；並びに他の無機塩、ミネラル、及び微量栄養素（例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ）又は塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）、硫酸カルシウム（ＣａＳＯ_４）又は炭酸カルシウム（ＣａＣＯ_３）、硫酸マンガン（ＭｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ）又は塩化マンガン（ＭｎＣｌ_２）、塩化第二鉄（ＦｅＣｌ_２）、硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ）又は塩化第一鉄（ＦｅＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ）、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）又は炭酸ナトリウム（Ｎａ_２ＣＯ_３）、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ_４）又は塩化亜鉛（ＺｎＣｌ_２）、モリブデン酸アンモニウム（ＮＨ_４ＭｏＯ_４）又はモリブデン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ）、第一銅硫酸塩（ＣｕＳＯ４）又は塩化銅（ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ）、塩化コバルト（ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ）又は硫酸コバルト（ＣｏＳＯ_４）、塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ）、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、ホウ酸（Ｈ_３ＢＯ_３）、塩化ニッケルＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ）又は硫酸ニッケル（ＮｉＳＯ_４）、塩化スズ（ＳｎＣｌ_２・Ｈ_２Ｏ）、塩化バリウム（ＢａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ）、セレン酸銅（ＣｕＳｅＯ_４ ５Ｈ_２Ｏ）、セレン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳｅＯ_４）又は亜セレン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳｅＯ_３）、メタバナジン酸ナトリウム（ＮａＶＯ_３）、クロム塩）のうちの１つ以上を含む。

【0026】

好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＮＨ_４ＯＨ、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、ＮａＶＯ_３・Ｈ_２Ｏ、ＦｅＳＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、ＣａＳＯ_４、Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、ＭｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、Ｈ_３ＢＯ_３、ＣｏＳＯ_４、ＣｕＳＯ_４、ＮｉＳＯ_４のうちの１つ以上又は全ての添加を含む。

【0027】

一実施形態では、細胞に提供される培地は、１ｇ／Ｌ未満の塩化物塩、０．２５ｇ／Ｌ未満の塩化物塩等、例えば０．１ｇ／Ｌ未満の塩化物塩、０．０２５ｇ／Ｌ未満の塩化物塩等、例えば０．０１ｇ／Ｌ未満の塩化物を含む。一実施形態では、塩化物塩は培養物に供給されない。
別の実施形態では、本方法中にビタミンは供給されない、すなわち培養物に提供される培地はビタミンを含有しない。
別の実施形態では、本方法中にアミノ酸は供給されない、すなわち培養物に提供される培地はアミノ酸を含有しない。
別の実施形態では、本方法中に有機化合物は供給されない、すなわち培養物に提供される培地は有機化合物を含まない。
特定の実施形態では、細菌培養物のｐＨは特定のレベルに制御される。特定の実施形態では、ｐＨは、細菌の維持及び／又は増殖及び／又は有機化合物の生成に最適な範囲内に制御される。一実施形態では、培養物中のｐＨは、５．５～８．０の間、例えば６．５～７．０の間、例えば６．８に維持される。
特定の実施形態では、細菌培養物の温度が制御される。特定の実施形態では、温度は、細菌の維持及び／又は増殖及び／又は有機化合物の生成に最適な範囲内に制御される。一実施形態では、培養物を、２５℃～４０℃の間、例えば２８℃～３２℃の間、３０℃等の温度で増殖させる。

【0028】

典型的には、本発明の方法はバイオリアクタ内で行われる。バイオリアクタは、細胞の培養に利用され、細胞の増殖曲線の特定の段階に維持され得る。バイオリアクタの使用は、化学合成独立栄養増殖を培養するための多くの方法において有利である。
一般に、溶存する二酸化炭素、酸素、及び水素等の他のガス、並びに他の溶存する栄養素、微量元素、温度及びｐＨの制御を含む増殖条件の制御は、バイオリアクタ内で促進される。栄養培地並びにガスは、バッチ添加として、又は定期的に、又は検出された枯渇若しくはプログラム設定点に応答して、又は培養物が増殖及び／又は維持されている期間中に連続的にバイオリアクタに添加され得る。
連続培養方法では、栄養培地及びガスがバイオリアクタに連続的に添加される。更に、細菌含有培地は、バイオリアクタから連続的に除去されている。

【0029】

好ましい実施形態では、細菌培養物の体積は、１００ｍＬ以上、１Ｌ以上等、例えば１０Ｌ以上、１００Ｌ以上等、例えば１，０００Ｌ以上、１０，０００Ｌ以上等、例えば５０，０００Ｌ以上、１００，０００Ｌ以上等、例えば２００，０００Ｌ以上である。
一実施形態では、培養物の生産性は、１時間当たり１リットル当たり０．１ｇ超、例えば０．２超、例えば０．３超、０．４超等、例えば０．５超、０．６ｇ超等、例えば０．７超、０．８超等、例えば０．９超、１ｇ超等の細胞乾燥重量である。

【0030】

細菌は、細胞バンクから直接接種するか、又はより小規模の種培養を介して接種することができる。好ましくは、培養物への新鮮な培地の供給及び細菌を含む使用済み培地の除去は、バイオリアクタ内の体積が同じままであるように同じ速度で行われる。
一実施形態では、適切な細胞密度に達する初期相の後、細菌は定常状態又は擬似定常状態で増殖し、５を超える、例えば１０を超える、例えば２０を超える、５０～２００の間等、例えば５０～１００の間のＯＤ６００で対数期を継続的に維持する。
本発明の方法の一実施形態では、細菌株は、０．００１～０．１２ｈ^－１、例えば０．０１～０．１２ｈ^－１、例えば０．０４～０．１２ｈ^－１の増殖速度を有する。
本発明の方法の別の実施形態では、連続相における液体供給速度は、増殖速度の５０～８０％である。

【0031】

キサントバクターは、キサントバクター科のグラム陰性菌の属である。上述のように、一実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養株（すなわち、ＰＨＡシンターゼをコードする１つ以上の遺伝子の遺伝子破壊を含む変異体）は、キサントバクター属のものである。
好ましくは、株は、Ｘ．アギリス、Ｘ．アミノキシダンス、Ｘ．オートトロフィカス、Ｘ．フラバス、Ｘ．タゲティディス、Ｘ．ビスコーサス、キサントバクターｓｐ．１２６、キサントバクターｓｐ．９１及びＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５株からなる群から選択される。
一実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養株は、カルビン・ベンソン・バシャム経路（Ｃａｌｖｉｎ Ｂｅｎｓｏｎ Ｂａｓｓｈａｍ ｐａｔｈｗａｙ）を使用して二酸化炭素を生物に必須の有機化合物、例えばグルコースに変換する株である。
一実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養株は、水素（Ｈ_２）を細胞エネルギー当量に変換するためにＮｉＦｅＳｅ－ヒドロゲナーゼを使用する株である。
一実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養株は、水素（Ｈ_２）を細胞エネルギー当量に変換するためにＮＡＤ^＋還元ヒドロゲナーゼを使用する株である。
一実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養株は、窒素固定が可能である。

【0032】

別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号１に示される１６ＳリボソームＲＮＡ、又は配列番号１と最大２０個、例えば１～１０個、１～５個等、例えば配列番号１と１、２若しくは３個のヌクレオチドの相違を有する１６ＳリボソームＲＮＡを含む。
別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号３に示される配列、又は配列番号３に示される配列と９３％を超える同一性、例えば９５％を超える同一性等、９６％を超える同一性等、例えば９７％を超える同一性、９８％を超える同一性等、例えば９９％を超える配列同一性を有する配列を有するリブロース－１，５－二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ルビスコ）大鎖をコードする遺伝子を含む。
別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号５に示される配列、又は配列番号５に示される配列と８３％を超える配列同一性、例えば８６％を超える同一性、９０％を超える同一性等、例えば９５％を超える同一性等、９６％を超える同一性等、例えば９７％を超える同一性、９８％を超える同一性等、例えば９９％を超える配列同一性を有する配列を有するリブロース－１，５－二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ルビスコ）小鎖をコードする遺伝子を含む。

【0033】

配列番号２：リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ大鎖のヌクレオチド配列：

ATGGGTGCCGAAGCAACCGTCGGGCAGATCACGGACGCCAAGAAGAGATACGCCGCCGGCGTGCTGAAGTACGCCCAGATGGGCTACTGGAACGGCGACTACGTTCCCAAGGACACCGACCTCCTGGCGGTGTTCCGCATCACCCCCCAGGCGGGCGTGGACCCGGTGGAAGCCGCCGCGGCGGTCGCCGGCGAAAGCTCCACCGCTACCTGGACCGTGGTGTGGACCGACCGGCTCACCGCCGCCGACGTCTACCGCGCCAAGGCCTACAAGGTGGAGCCGGTGCCGGGCCAGGAAGGCCAGTATTTCTGCTACATCGCCTATGATCTCGATTTGTTCGAGGAAGGCTCCATCGCCAACCTCACGGCGTCGATCATCGGCAACGTCTTCTCCTTCAAGCCGCTGAAGGCGGCGCGGCTGGAGGACATGCGGCTTCCCGTCGCCTATGTGAAGACCTTCCGCGGCCCGCCCACCGGCATCGTGGTCGAGCGCGAGCGCCTGGACAAGTTCGGCCGCCCCCTTCTGGGCGCCACCACCAAGCCGAAGCTTGGCCTCTCGGGCAAGAATTACGGCCGCGTGGTCTATGAGGCCCTCAAGGGCGGCCTCGACTTCGTGAAGGACGACGAGAACATCAACTCGCAGCCCTTCATGCACTGGCGCGATCGCTTCCTCTATTGCATGGAGGCCGTCAACAAGGCCCAGGCCGAGACCGGCGAGGTGAAGGGGCACTATCTCAACATCACCGCCGGGACCATGGAGGAGATGTACCGCCGCGCCGAGTTCGCCAAGGAACTGGGCTCCGTGGTGGTGATGGTGGATCTCATCATCGGCTGGACCGCCATCCAGTCCATGTCCAACTGGTGCCGCGAGAACGACATGATCCTGCACATGCACCGTGCGGGCCATGGCACCTACACGCGCCAGAAGAGCCACGGCGTCTCCTTCCGCGTCATCGCCAAGTGGCTGCGGCTCGCCGGCGTCGACCACCTGCACACCGGCACCGCCGTGGGCAAGCTGGAAGGCGACCCCATGACCGTGCAGGGCTTCTACAATGTCTGCCGCGAGACGACGACGCAGCAGGACCTCACCCGCGGCCTGTTCTTCGAGCAGGACTGGGGCGGCATCCGCAAGGTGATGCCGGTGGCCTCCGGCGGCATCCATGCGGGCCAGATGCACCAGCTCATCGACCTGTTCGGCGAGGACGTGGTGCTCCAGTTCGGCGGCGGCACCATCGGCCACCCGGACGGCATCCAGGCCGGCGCCACCGCCAACCGCGTGGCGCTGGAAACCATGATCCTCGCCCGCAACGAGGGCCGCGACATCAGGAACGAGGGCCCGGAAATCCTGGTGGAAGCCGCCAAATGGTGCCGTCCGCTGCGCGCGGCGCTCGATACCTGGGGCGAGGTGACCTTCAACTACGCCTCCACCGACACGTCCGATTACGTGCCCACCGCGTCCGTCGCCTGA

【0034】

配列番号３：リブロース二リン酸カルボキシラーゼ大鎖のアミノ酸配列

MGAEATVGQITDAKKRYAAGVLKYAQMGYWNGDYVPKDTDLLAVFRITPQAGVDPVEAAAAVAGESSTATWTVVWTDRLTAADVYRAKAYKVEPVPGQEGQYFCYIAYDLDLFEEGSIANLTASIIGNVFSFKPLKAARLEDMRLPVAYVKTFRGPPTGIVVERERLDKFGRPLLGATTKPKLGLSGKNYGRVVYEALKGGLDFVKDDENINSQPFMHWRDRFLYCMEAVNKAQAETGEVKGHYLNITAGTMEEMYRRAEFAKELGSVVVMVDLIIGWTAIQSMSNWCRENDMILHMHRAGHGTYTRQKSHGVSFRVIAKWLRLAGVDHLHTGTAVGKLEGDPMTVQGFYNVCRETTTQQDLTRGLFFEQDWGGIRKVMPVASGGIHAGQMHQLIDLFGEDVVLQFGGGTIGHPDGIQAGATANRVALETMILARNEGRDIRNEGPEILVEAAKWCRPLRAALDTWGEVTFNYASTDTSDYVPTASVA

【0035】

配列番号４：リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ小鎖のヌクレオチド配列：
ATGCGCATCACCCAAGGCTCCTTCTCCTTCCTGCCGGACCTCACCGACACGCAGATCAAGGCCCAGGTGCAATATTGCCTGGACCAGGGCTGGGCGGTCTCGGTGGAGCACACCGACGATCCCCACCCGCGCAACACCTATTGGGAGATGTGGGGCCCGCCCATGTTCGATCTGCGCGACGCGGCCGGCGTCTTCGGCGAGATCGAAGCCTGCCGGGCCGCCAATCCCGAGCATTATGTGCGGGTGAACGCCTTCGATTCCAGCCGCGGATGGGAGACGATCCGCCTGTCCTTCATCGTTCAGCGGCCCACCGTGGAAGAGGGCTTCCGCCTCGACCGCACCGAAGGCAAGGGCCGCAACCAGAGCTACGCCATGCGCTACCGGGCGCAGTTCGCGCCGCGCTGA

【0036】

配列番号５：リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ小鎖のアミノ酸配列：

MRITQGSFSFLPDLTDTQIKAQVQYCLDQGWAVSVEHTDDPHPRNTYWEMWGPPMFDLRDAAGVFGEIEACRAANPEHYVRVNAFDSSRGWETIRLSFIVQRPTVEEGFRLDRTEGKGRNQSYAMRYRAQFAPR

【0037】

別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号７に示される配列、又は配列番号７に示される配列と７０％を超える配列同一性、８０％を超える同一性等、例えば９０％を超える同一性、９５％を超える同一性等、例えば９６％を超える同一性、９７％を超える同一性等、例えば９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するＮＡＤ^＋還元ヒドロゲナーゼＨｏｘＳサブユニットアルファをコードする遺伝子を含む。
別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号９に示される配列、又は配列番号９に示される配列と７７％を超える配列同一性、８０％を超える同一性等、例えば９０％を超える同一性、９５％を超える同一性等、例えば９６％を超える同一性、９７％を超える同一性等、例えば９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するＮＡＤ^＋還元ヒドロゲナーゼＨｏｘＳサブユニットベータをコードする遺伝子を含む。
別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号１１に示される配列、又は配列番号１１に示される配列と７０％を超える配列同一性、８０％を超える同一性等、例えば９０％を超える同一性、９５％を超える同一性等、例えば９６％を超える同一性、９７％を超える同一性等、例えば９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するＮＡＤ^＋還元ヒドロゲナーゼＨｏｘＳサブユニットガンマをコードする遺伝子を含む。
別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号１３に示される配列、又は配列番号１３に示される配列と７９％を超える配列同一性、８０％を超える同一性等、例えば９０％を超える同一性、９５％を超える同一性等、例えば９６％を超える同一性、９７％を超える同一性等、例えば９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するＮＡＤ^＋還元ヒドロゲナーゼＨｏｘＳサブユニットデルタをコードする遺伝子を含む。

【0038】

配列番号６：ＮＡＤ^＋還元ヒドロゲナーゼＨｏｘＳサブユニットアルファのヌクレオチド配列：

ATGATGCCATCTGAGCCGCACGGCGCGGGCATGCCGCCCCCACGGGAAGCGGCCGCGGTTCCCACCCCCCAGGAGGTGAGCGCGGTGGTGGCCGAGGTGGTCGCGGATGCCGTGGCATCGGTGGGCGGCGCACGCACCCGGCTCATGGACATCGTCCAGCTGGCCCAGCAGCGTCTCGGCCATCTCTCCGAAGAGACCATGGCGGCCATTGCCGCGCGGCTCGCCATTCCGCCGGTGGAAGTGGCGGACATGGTGTCCTTCTACGCCTTCCTGAACCGCGCGCCCAAGGGCCGCTACCACATCCGCCTGTCGCGCAGCCCCATCTCGCTGATGAAGGGCGCCGAGGCGGTGGCTGCCGCCTTCTGCCAGATCCTCGGCATCGCCATGGGCGAGACCTCGCAGGATGGCGACTTCACCCTGGAATGGACCAACGACATCGGCATGGCCGACCAGGAGCCGGCCGCCCTCGTCAACGGCACGGTGATGACGCAGCTCGCGCCCGGCGATGCGGCCATCATCGTCGGCCGGCTGCGGGCCCATCACGCGCCCAATGCCCTGCCGCTGTTCCCTGGAGCCGGCGTGGCCGGCTCCGGCCTGCCCCATGCCCGGATCCGCCCCAGCCTGGTGATGCCGGGACAGCTTCTGTTCCGCGAGGACCACACGACGCCGGGCGCCGGCATCAAGGCGGCACTCGCCCTCACCCCGGACGAAGTGGTGCAGAAGGTCTCCGCCGCGCGCCTGCGCGGGCGGGGTGGCGCCGGCTTTCCCACCGGTCTCAAATGGAAGCTCTGCCGCCAGTCGCCCGCCACCACCCGCCATGTGATCTGCAATGCGGACGAGGGCGAGCCCGGCACCTTCAAGGATCGCGTGCTGCTCACGCAGGCGCCGCACCTCATGTTCGACGGCATGACCATCGCCGGCTACGCCTTGGGGGCGCGGGAGGGCGTGGTCTATCTGCGCGGCGAGTACGCCTATCTGTGGGAGCCTCTGCATGCGGTCCTGCGCGAGCGCTATGGGCTCGGGCTCGCCGGCGCGAACATCCTGGGACACGCGGGCTTCGACTTCGACATCCGCATCCAGCTGGGCGCCGGCGCCTATATCTGCGGCGAGGAATCCGCGCTGGTGGAATCGCTGGAAGGCAAGCGCGGCTCGCCCCGCGACCGCCCCCCCTTCCCCACCGTGCGCGGCCATCTCCAGCAGCCCACCGCCGTGGACAATGTGGAGACCTTCGCCTGCGCCGCCCGCATCCTGGAGGATGGCGTGGAGGCGTTCGCGGGCATCGGCACGCCCGAATCCGCCGGCACGAAGCTCCTCTCGGTGTCGGGCGATTGCCCGCGCCCCGGCGTGTATGAGGTGCCCTTCGGCCTCACGGTGAACGCGCTGCTCGACCTTGTCGGCGCGCCGGACGCCGCCTTCGTGCAGATGGGTGGGCCGTCCGGCCAATGCGTGGCGCCGAAGGATTACGGCCGCCGCATCGCCTTCGAGGACCTGCCCACCGGCGGCTCGGTGATGGTGTTCGGCCCGGGGCGCGACGTGCTCGCCATGGTGCGCGAGTTCGCGGATTTCTTCGCCGGCGAATCCTGCGGCTGGTGCACGCCCTGCCGGGTGGGCACCACCTTGCTCAAGGAAGAGCTGGACAAGCTCCTCGCCAACCGCGCCACCCTCGCCGACATCCGCGCGCTGGAGACCCTGGCCACGACCGTCTCCCGCACCAGCCGCTGCGGCCTCGGCCAGACGGCGCCCAACCCCATCCTTTCCACCATGCGCAACCTGCCGGAAGCCTATGAGGCGAGGCTGAGGCCCGAAGACTTCCTGCCCTGGGCCTCGCTCGACGAGGCGCTGAAGCCCGCCATCGTCATCCAGGGCCGCGCGCCCGTGCCGGAGGAAGAGGCATGA

【0039】

配列番号７：ＮＡＤ^＋還元ヒドロゲナーゼＨｏｘＳサブユニットアルファのアミノ酸配列：

MMPSEPHGAGMPPPREAAAVPTPQEVSAVVAEVVADAVASVGGARTRLMDIVQLAQQRLGHLSEETMAAIAARLAIPPVEVADMVSFYAFLNRAPKGRYHIRLSRSPISLMKGAEAVAAAFCQILGIAMGETSQDGDFTLEWTNDIGMADQEPAALVNGTVMTQLAPGDAAIIVGRLRAHHAPNALPLFPGAGVAGSGLPHARIRPSLVMPGQLLFREDHTTPGAGIKAALALTPDEVVQKVSAARLRGRGGAGFPTGLKWKLCRQSPATTRHVICNADEGEPGTFKDRVLLTQAPHLMFDGMTIAGYALGAREGVVYLRGEYAYLWEPLHAVLRERYGLGLAGANILGHAGFDFDIRIQLGAGAYICGEESALVESLEGKRGSPRDRPPFPTVRGHLQQPTAVDNVETFACAARILEDGVEAFAGIGTPESAGTKLLSVSGDCPRPGVYEVPFGLTVNALLDLVGAPDAAFVQMGGPSGQCVAPKDYGRRIAFEDLPTGGSVMVFGPGRDVLAMVREFADFFAGESCGWCTPCRVGTTLLKEELDKLLANRATLADIRALETLATTVSRTSRCGLGQTAPNPILSTMRNLPEAYEARLRPEDFLPWASLDEALKPAIVIQGRAPVPEEEA

【0040】

配列番号８：ＮＡＤ^＋還元ヒドロゲナーゼＨｏｘＳサブユニットベータのヌクレオチド配列：

ATGAGCCGGGGATCCCCCGATGCCGGGAAAGACCGCACCATGAGCGCCACCGACGGCACCACCGCCCCCCGCAAGATCGTCATCGATCCGGTGACCCGCGTGGAGGGCCACGGCAAGGTCACCATCCGCCTGGATGAAGCCGGCGCGGTGGAGGATGCGCGTTTCCACATCGTGGAGTTCCGCGGCTTCGAGCGGTTCATCCAGGGCCGGATGTACTGGGAAGTGCCCCTTATCATCCAGCGGCTGTGCGGCATCTGCCCGGTGAGCCACCATCTGGCGGCGGCGAAAGCCATGGACCAGGTGGCGGGCGTGGACCGCGTACCGCCCACCGCCGAGAAACTGCGCCGGCTGATGCATTATGGGCAGGTGCTGCAATCCAACGCTTTGCACATCTTCCACCTCGCCTCGCCCGACCTCCTGTTCGGCTTCGACGCGCCGGCCGAGCAGCGCAACATCATCGCCGTGCTCCAGCGTTATCCGGAGATCGGCAAATGGGCGATCTTCATCAGGAAGTTCGGCCAGGAGGTCATCAAGGCCACCGGCGGGCGCAAGATCCATCCCACCAGCGCCATTCCCGGCGGGGTCAACCAGAACCTCGCCGTGGAGGACCGCGACGCCCTGCGCGCCAAGGTGGGCGAGATCATCAGCTGGTGCATGGCGGCGCTGGACCATCACAAGGCCTATGTGGCGGAAAACCGGGCGCTGCATGACAGCTTCGCCGCCTTCCCCTCCGCCTTCATGAGCCTCGTGGGGCCGGATGGCGGCATGGACCTTTATGACGGCACCCTGCGGGTGATCGATGCCGAGGGCGCCCCCCTCATCGAAGGCGCGCCGCCCGCCTCCTACCGCGACCACCTCATCGAGGAGGTGCGGCCCTGGAGCTATCTGAAATTCCCCCATCTGCGCGCCTTCGGCCGCGACGATGGCTGGTATCGGGTCGGCCCCCTCGCCCAGGTCAATTGCGCCGCGTCCATCGACACGCCCCGCGCCGAGGCGGCCCGGCGGGACTTCATGGCCGAGGGCGGCGGCAAGCCGGTGCATGCCACCCTCGCTTATCACTGGGCGCGGCTCATCGTGCTGGTCCATTGCGCGGAGAAGATCGAACAGCTGCTGTTCGACGACGACCTGCAAGGCTGCGATCTGCGTGCGGAGGGCACCCGGCGCGGGGAAGGCGTCGCCTGGATCGAGGCGCCGCGCGGCACCCTCATCCACCATTACGAGGTGGACGAGAACGACCAGGTGCGCCGCGCCAACCTCATCGTCTCCACCACCCACAATAACGAGGCCATGAACCGCGCCGTGCGGCAGGTGGCGAAGACGGACCTTTCCGGTCGCGAGATCACCGAAGGGCTGCTGAACCATATCGAGGTGGCCATCCGCGCCTTCGACCCCTGCCTGTCCTGCGCCACCCATGCGCTGGGCCAGATGCCGCTGATCGTGACGCTTGAAGATGCCTCCGGCGCAGAGATCGCCCGCGGAGTGAAGGAATGA

【0041】

配列番号９：ＮＡＤ^＋還元ヒドロゲナーゼＨｏｘＳサブユニットベータのアミノ酸配列：

MSRGSPDAGKDRTMSATDGTTAPRKIVIDPVTRVEGHGKVTIRLDEAGAVEDARFHIVEFRGFERFIQGRMYWEVPLIIQRLCGICPVSHHLAAAKAMDQVAGVDRVPPTAEKLRRLMHYGQVLQSNALHIFHLASPDLLFGFDAPAEQRNIIAVLQRYPEIGKWAIFIRKFGQEVIKATGGRKIHPTSAIPGGVNQNLAVEDRDALRAKVGEIISWCMAALDHHKAYVAENRALHDSFAAFPSAFMSLVGPDGGMDLYDGTLRVIDAEGAPLIEGAPPASYRDHLIEEVRPWSYLKFPHLRAFGRDDGWYRVGPLAQVNCAASIDTPRAEAARRDFMAEGGGKPVHATLAYHWARLIVLVHCAEKIEQLLFDDDLQGCDLRAEGTRRGEGVAWIEAPRGTLIHHYEVDENDQVRRANLIVSTTHNNEAMNRAVRQVAKTDLSGREITEGLLNHIEVAIRAFDPCLSCATHALGQMPLIVTLEDASGAEIARGVKE

【0042】

配列番号１０：ＮＡＤ^＋還元ヒドロゲナーゼＨｏｘＳサブユニットガンマのヌクレオチド配列：

ATGAGCGAGACCCCCTTCACCTTTACCGTGGACGGCATCGCGGTCCCGGCCACCCCCGGCCAGAGCGTCATCGAGGCGTGCGATGCGGCGGGCATCTATATCCCGCGCCTGTGCCACCACCCGGACCTGCCGCCGGCGGGCCATTGCCGGGTGTGCACCTGCATCATCGACGGGCGGCCGGCCAGCGCCTGCACCATGCCCGCCGCCAGGGGCATGGTGGTGGAGAACGAGACGCCCGCTTTGCTGGCGGAGCGGCGCACGCTGATCGAGATGCTGTTCGCGGAAGGCAACCATTTCTGCCAGTTCTGCGAGGCGAGCGGCGATTGCGAATTGCAGGCGCTGGGCTACCTGTTCGGCATGGTGGCCCCGCCCTTCCCCCATCTGTGGCCGAAGCGGCCGGTGGATGCCAGCCATCCGGATATCTATATCGACCACAATCGCTGCATCCTGTGCTCGCGCTGCGTGCGCGCCTCGCGCACCCTGGACGGCAAGTCCGTGTTCGGCTTCGAGGGGCGCGGCATCGAGATGCATCTGGCGGTGACCGGCGGGCACCTGGACGACAGCGCCATCGCCGCCGCCGACAGGGCGGTTGAGATGTGCCCGGTGGGCTGCATCGTCCTCAAGCGCACCGGCTACCGCACGCCCTATGGCCGGCGGCGCTACGACGCCGCGCCCATCGGCTCCGACATCACCGCCCGGCGCGGCGGCGCGAAGGACTGA

【0043】

配列番号１１：ＮＡＤ^＋還元ヒドロゲナーゼＨｏｘＳサブユニットガンマのアミノ酸配列：

MSETPFTFTVDGIAVPATPGQSVIEACDAAGIYIPRLCHHPDLPPAGHCRVCTCIIDGRPASACTMPAARGMVVENETPALLAERRTLIEMLFAEGNHFCQFCEASGDCELQALGYLFGMVAPPFPHLWPKRPVDASHPDIYIDHNRCILCSRCVRASRTLDGKSVFGFEGRGIEMHLAVTGGHLDDSAIAAADRAVEMCPVGCIVLKRTGYRTPYGRRRYDAAPIGSDITARRGGAKD

【0044】

配列番号１２：ＮＡＤ^＋還元ヒドロゲナーゼＨｏｘＳサブユニットデルタのヌクレオチド配列：

ATGGCCAAGCCCAAACTCGCCACCTGCGCGCTGGCCGGCTGCTTCGGCTGCCACATGTCCTTCCTGGACATGGACGAGCGCATCGTCGAGCTCATCGACCTGGTGGACCTCGACGTCTCGCCCCTCGACGACAAGAAAAACTTCACCGGCATGGTGGAAATCGGCCTGGTGGAAGGCGGCTGCGCCGACGAGCGCCATGTGAAGGTGCTGCGCGAGTTCCGCGAGAAATCCCGCATCCTGGTGGCGGTGGGCGCCTGCGCCATCACCGGCGGCATCCCGGCATTGCGCAACCTCGCCGGCCTCGACGAATGCCTGAGGGAAGCCTACCTCACCGGCCCCACGGTGGAAGGCGGCGGGCTCATTCCCAACGACCCGGAGCTGCCGCTGCTGCTGGACAAGGTCTATCCGGTGCAGGACTTCGTGAAGATCGACCATTTCCTGCCCGGCTGCCCGCCCTCGGCCGACGCCATCTGGGCGGCTCTGAAGGCGCTGCTGACCGGCACCGAGCCGCATCTGCCCTACCCGCTTTTCAAGTACGAATGA

【0045】

配列番号１３：ＮＡＤ^＋還元ヒドロゲナーゼＨｏｘＳサブユニットデルタのアミノ酸配列：

MAKPKLATCALAGCFGCHMSFLDMDERIVELIDLVDLDVSPLDDKKNFTGMVEIGLVEGGCADERHVKVLREFREKSRILVAVGACAITGGIPALRNLAGLDECLREAYLTGPTVEGGGLIPNDPELPLLLDKVYPVQDFVKIDHFLPGCPPSADAIWAALKALLTGTEPHLPYPLFKYE

【0046】

別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号１５に示される配列、又は配列番号１５に示される配列と８４％を超える配列同一性、例えば９０％を超える同一性、９５％を超える同一性等、例えば９６％を超える同一性、９７％を超える同一性等、例えば９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するＮｉＦｅＳｅヒドロゲナーゼ大サブユニットをコードする遺伝子を含む。
別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号１７に示される配列、又は配列番号１７に示される配列と９０％を超える同一性、９５％を超える同一性等、例えば９６％を超える同一性、９７％を超える同一性等、例えば９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するＮｉＦｅＳｅヒドロゲナーゼ小サブユニットをコードする遺伝子を含む。

【0047】

配列番号１４：ペリプラズム［ＮｉＦｅＳｅ］ヒドロゲナーゼ大サブユニットのヌクレオチド配列：

TCCAGACCCGGGCAACATTGCTCCATGTGCTGGGCACCCTGGCCGGCCGCTGGCCCCATACCCTCGCGCTCCAGCCCGGCGGGGTGACCCGAAGCGCCGACCAGCACGACCGCATGCGCCTGCTCGCGACGCTGAAGGCGGTGCGGGCGGCGCTGGAAGAGACCTTGTTCGGCGCGCCTTTGGAAGAGGTGGCGGCCCTGGACGGCGCCGCCGCCGTGGAGGCCTGGCGCGCCAACGGCCCGGAAGGGGATTTCCGCCTGTTCCTGGAGATCGCCGCCGACCTGGAGCTGGACCGGCTCGGCCGCGCGCACGACCGCTTTCTCTCCTTCGGCGCCTACGCCCAGGACGAGGGGCGCCTTTATGGCGCCGGCACCTTCGAGGCCGGGACGGCGGGAGGGCTCGATCCCAACGCCATCACCGAGGACCACGCCTTCGCCCGCATGGAGGACCGCGCGGCGCCCCATGCGCCCTTTGACGGCTCCACCTTCCCCGATGCCGACGACACCGAGGGCTACACCTGGTGCAAGGCGCCGCGCCTTGCCGGCCTGCCCTTCGAGACCGGCGCCTTCGCCCGGCAGGTGGTGGCGGGCCATCCGCTCGCCCGGGACCTCGTGACGCGGGAAGGCGGCACTGTGCGCAGCCGCGTGGTCGGCCGGCTGCTGGAAACCGCGCGCACCCTGATCGCCATGGAGGGCTGGGTGAAGGAACTGCGGCCCGAAGGGCCCTGGTGCGCCCAGGGCCACCTGCCCCAGGAAGGCCGCGCCTTCGGCCTCACCGAGGCGGCGCGCGGGGCGCTCGGCCACTGGATGGTGGTGGAGAAGGGCCGCATTGCCCGCTACCAGATCATCGCCCCCACCACCTGGAACTTCTCCCCCCGCGACGGCGCGGGCCTGCCCGGCCCGCTGGAGACGGCCCTGGTGGGCGCGCCCGTGCGGCAGGGAGAGACGACGCCCGTGAGCGTGCAGCACATCGTGCGCTCCTTCGACCCGTGCATGGTCTGCACTGTGCATTGA

【0048】

配列番号１５：ペリプラズム［ＮｉＦｅＳｅ］ヒドロゲナーゼ大サブユニットのアミノ酸配列：

MSAETRRLVVGPFNRVEGDLEVRLDVQDGRVQQAFVSSPLFRGFERILEGRDPRDALVIAPRICGICSVSQSHAAALALAGLQGIAPTHDGRIATNLIVAAENVADHLTHFHVFFMPDFARAVYEDRPWFAQAARRFKANQGVSVRRALQTRATLLHVLGTLAGRWPHTLALQPGGVTRSADQHDRMRLLATLKAVRAALEETLFGAPLEEVAALDGAAAVEAWRANGPEGDFRLFLEIAADLELDRLGRAHDRFLSFGAYAQDEGRLYGAGTFEAGTAGGLDPNAITEDHAFARMEDRAAPHAPFDGSTFPDADDTEGYTWCKAPRLAGLPFETGAFARQVVAGHPLARDLVTREGGTVRSRVVGRLLETARTLIAMEGWVKELRPEGPWCAQGHLPQEGRAFGLTEAARGALGHWMVVEKGRIARYQIIAPTTWNFSPRDGAGLPGPLETALVGAPVRQGETTPVSVQHIVRSFDPCMVCTVH

【0049】

配列番号１６：ペリプラズム［ＮｉＦｅＳｅ］ヒドロゲナーゼ小サブユニットのヌクレオチド配列

ACGGGGGAGGAAGCCCGCGCCATCTTCGACGCCATCCTTGCCGGCGTTATCGTCCTCGACGCCCTGTGCGTGGAAGGCGCGCTGCTGCGCGGGCCGAACGGCACCGGGCGCTTCCATGTGCTGGCGGGCACGGACACCCCCACCATCGACTGGGCGCGGCAGCTCGCCGGCATGGCGCGCCACGTGGTGGCGGTGGGCACCTGCGCCGCCTATGGGGGCGTGACGGCGGCGGGCATCAACCCCACCGATGCCTGCGGCCTCCAGTTCGACGGACGCCGGAAGGGTGGGGCGCTGGGGGCGGACTTCCGCTCCCGCTCGGGGCTTCCGGTCATCAATGTGGCCGGCTGCCCCACCCATCCCAACTGGGTGACGGAAACCCTGATGCTGCTCGCCTGCGGCCTGCTGGGCGAGGCCGACCTCGACGTCTATGGCCGCCCGCGCTTCTATGCGGACCTGCTGGTGCATCACGGCTGCCCGCGCAACGAATACTATGAATACAAGGCGAGCGCCGAGAAGATGAGCGACCTCGGCTGCATGATGGAGCATCTGGGCTGCCTCGGCACCCAGGCCCACGCCGACTGCAACACGCGCCTTTGGAATGGCGAGGGCTCGTGCACCCGCGGCGGCTATGCCTGCATCAACTGCACGGCGCCGGAATTCGAGGAGCCGGGCCACGCCTTCCTGGAGACGCCCAAGATCGGCGGCATCCCCATCGGCCTGCCCACCGACATGCCCAAGGCCTGGTTCATCGCCTTGTCCTCCCTCGCCAAGGCGGCGACGCCGGAGCGGCTGCGCAAGAACGCGGTGTCCGACCATGTGGTCACGCCGCCCGCCGTCAAGGACATCAAGCGGCGATGA

【0050】

配列番号１７：ペリプラズム［ＮｉＦｅＳｅ］ヒドロゲナーゼ小サブユニットのアミノ酸配列

MSTPFSVLWLQSGGCGGCTMSLLCAEAPDLATTLDAAGIGFLWHPALSEETGEEARAIFDAILAGVIVLDALCVEGALLRGPNGTGRFHVLAGTDTPTIDWARQLAGMARHVVAVGTCAAYGGVTAAGINPTDACGLQFDGRRKGGALGADFRSRSGLPVINVAGCPTHPNWVTETLMLLACGLLGEADLDVYGRPRFYADLLVHHGCPRNEYYEYKASAEKMSDLGCMMEHLGCLGTQAHADCNTRLWNGEGSCTRGGYACINCTAPEFEEPGHAFLETPKIGGIPIGLPTDMPKAWFIALSSLAKAATPERLRKNAVSDHVVTPPAVKDIKRR

【0051】

別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号１９に示される配列、又は配列番号１９に示される配列と７０％を超える同一性、８０％を超える同一性等、例えば９０％を超える同一性、９５％を超える同一性等、例えば９６％を超える同一性、９７％を超える同一性等、例えば９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するＡＴＰシンターゼガンマ鎖ａｔｐＧ＿１をコードする遺伝子を含む。

【0052】

別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号２１に示される配列、又は配列番号２１に示される配列と７８％を超える同一性、８０％を超える同一性等、例えば９０％を超える同一性、９５％を超える同一性等、例えば９６％を超える同一性、９７％を超える同一性等、例えば９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するＡＴＰシンターゼサブユニットアルファａｔｐＡ＿１をコードする遺伝子を含む。

【0053】

別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号２３に示される配列、又は配列番号２３に示される配列と６２％を超える同一性、例えば７０％を超える同一性、８０％を超える同一性等、例えば９０％を超える同一性、９５％を超える同一性等、例えば９６％を超える同一性、９７％を超える同一性等、例えば９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するＡＴＰシンターゼサブユニットｂ ａｔｐＦ＿１をコードする遺伝子を含む。

【0054】

別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号２５に示される配列、又は配列番号２５に示される配列と９０％を超える同一性、９５％を超える同一性等、例えば９６％を超える同一性、９７％を超える同一性等、例えば９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するＡＴＰシンターゼサブユニットｃ、ナトリウムイオン特異的ａｔｐＥ＿１をコードする遺伝子を含む。

【0055】

別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号２７に示される配列、又は配列番号２７に示される配列と８０％を超える同一性、例えば９０％を超える同一性、９５％を超える同一性等、例えば９６％を超える同一性、９７％を超える同一性等、例えば９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するＡＴＰシンターゼサブユニットａ ａｔｐＢ＿１をコードする遺伝子を含む。

【0056】

別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号２９に示される配列、又は配列番号２９に示される配列と７１％を超える同一性、８０％を超える同一性等、例えば９０％を超える同一性、９５％を超える同一性等、例えば９６％を超える同一性、９７％を超える同一性等、例えば９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するＡＴＰシンターゼイプシロン鎖ａｔｐＣ＿１をコードする遺伝子を含む。

【0057】

別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号３１に示される配列、又は配列番号３１に示される配列と８４％を超える同一性、例えば９０％を超える同一性、９５％を超える同一性等、例えば９６％を超える同一性、９７％を超える同一性等、例えば９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するＡＴＰシンターゼサブユニットベータａｔｐＤ＿１をコードする遺伝子を含む。

【0058】

別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号３３に示される配列、又は配列番号３３に示される配列と９７％を超える同一性、例えば９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するＡＴＰシンターゼサブユニットベータａｔｐＤ＿２をコードする遺伝子を含む。

【0059】

別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号３５に示される配列、又は配列番号３５に示される配列と８６％を超える同一性、例えば９０％を超える同一性、９５％を超える同一性等、例えば９６％を超える同一性、９７％を超える同一性等、例えば９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するＡＴＰシンターゼガンマ鎖ａｔｐＧ＿２をコードする遺伝子を含む。

【0060】

別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号３７に示される配列、又は配列番号３７に示される配列と９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するＡＴＰシンターゼサブユニットアルファａｔｐＡ＿２をコードする遺伝子を含む。

【0061】

別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号３９に示される配列、又は配列番号３９に示される配列と８５％を超える同一性、例えば９０％を超える同一性、９５％を超える同一性等、例えば９６％を超える同一性、９７％を超える同一性等、例えば９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するＡＴＰシンターゼサブユニットデルタａｔｐＨをコードする遺伝子を含む。

【0062】

別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号４１に示される配列、又は配列番号４１に示される配列と８７％を超える同一性、例えば９０％を超える同一性、９５％を超える同一性等、例えば９６％を超える同一性、９７％を超える同一性等、例えば９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するＡＴＰシンターゼサブユニットｂ ａｔｐＦ＿２をコードする遺伝子を含む。

【0063】

別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号４３に示される配列、又は配列番号４３に示される配列と８１％を超える同一性、例えば９０％を超える同一性、９５％を超える同一性等、例えば９６％を超える同一性、９７％を超える同一性等、例えば９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するＡＴＰシンターゼサブユニットｂ’ ａｔｐＧ＿３をコードする遺伝子を含む。

【0064】

別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号４５に示される配列、又は配列番号４５に示される配列と９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するＡＴＰシンターゼサブユニットｃ ａｔｐＥ＿２をコードする遺伝子を含む。

【0065】

別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号４７に示される配列、又は配列番号４７に示される配列と９２％を超える同一性、９５％を超える同一性等、例えば９６％を超える同一性、９７％を超える同一性等、例えば９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するＡＴＰシンターゼサブユニットａ aｔｐＢ＿２をコードする遺伝子を含む。

【0066】

別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号４９に示される配列、又は配列番号４９に示される配列と６０％を超える同一性、例えば７０％を超える同一性、８０％を超える同一性等、例えば９０％を超える同一性、９５％を超える同一性等、例えば９６％を超える同一性、９７％を超える同一性等、例えば９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するＡＴＰシンターゼタンパク質Ｉ ａｔｐＩをコードする遺伝子を含む。

【0067】

配列番号１８：ＡＴＰシンターゼガンマ鎖ａｔｐＧ＿１のヌクレオチド配列

GTGACCGAGCGCCTGTCCGACGTCAACGCCCGCATCGCCTCGGTGCGGCAGCTCTCATCGGTCATCACGGCCATGCGGGGCATTGCGGCGGCGCGGGCGCGGGAGGCGCGGGGTCGGCTCGACGGCATCCGCGCCTATGCGCAGACCATCGCCGAGGCCATCGGCCATGTGCTCGCCGTGCTGCCCGAGGAGGCCCGCGCCCGGTCCTCCGGGCACCGGCATCGGGGCCATGCGGTCATCGCCCTGTGCGCGGAGCAGGGCTTTGCCGGCGTCTTCAACGAGCGGGTGCTGGACGAGGCCGCCCGGCTGCTGACCGGCGGGGCGGGGCCGGCCGAGCTGCTGCTGGTGGGCGACCGGGGCCTGATGGTGGCCCGCGAGCGGGGGCTCGATGTCTCCTGGTCGGTGCCCATGGTGGCCCATGCGGGCCAGGCCTCGGCGCTGGCGGACCGCATCAGCGAGGAGCTCTACCGGCGGATCGATGCGGGACGGGTGACGCGGGTGTCGGTGGTGCACGCCGAGCCCGCCGCGTCCGCCGCCATCGAGACGGTGGTGAAAGTGCTGGTGCCGTTCGACTTCGCCCGCTTCCCCCTGGCGCGGGTGGCATCCGCCCCGCTCATGACCATGCCGCCGCCGCGGCTGCTGGCCCAGCTGTCGGAGGAATATGTGTTCGCCGAGCTGTGCGAGGCGCTCACCTTGTCCTTCGCGGCGGAGAACGAGGCCCGCATGCGGGCCATGATCGCCGCCCGCGCCAATGTGGCCGATACCCTGGAGGGCCTCGTCGGCCGCGCCCGGCAGATGCGCCAGGAGGAGATCACCAACGAGATCATCGAGCTGGAAGGCGGCGCCGGCAGCGCCCGGCATGCGGATTGA

【0068】

配列番号１９：ＡＴＰシンターゼガンマ鎖ａｔｐＧ＿１のアミノ酸配列

MTERLSDVNARIASVRQLSSVITAMRGIAAARAREARGRLDGIRAYAQTIAEAIGHVLAVLPEEARARSSGHRHRGHAVIALCAEQGFAGVFNERVLDEAARLLTGGAGPAELLLVGDRGLMVARERGLDVSWSVPMVAHAGQASALADRISEELYRRIDAGRVTRVSVVHAEPAASAAIETVVKVLVPFDFARFPLARVASAPLMTMPPPRLLAQLSEEYVFAELCEALTLSFAAENEARMRAMIAARANVADTLEGLVGRARQMRQEEITNEIIELEGGAGSARHAD

【0069】

配列番号２０：ＡＴＰシンターゼサブユニットアルファａｔｐＡ＿１のヌクレオチド配列

ATGAGCACGGGCGCGCAAGCGAGCGAGGATTGGCTCACCCGGAGCCGGGCGGCCCTGGCCGGGACGCGCCTTTCCCAGCAATCCCAATCGGTGGGCCGGGTGGAGGAGATGGCCGACGGCATCGCCCGCGTCTCCGGCCTGCCGGATGTGCGGCTCGACGAGCTTCTCACCTTCGAGGGCGGCCAGACCGGCTATGCCCTCACCCTCGATCGCACCGAGATCGCCGTGGTGCTGCTGGATGACGCCTCCGGCGTGGAGGCGGGCGCCCGGGTGTTCGGCACCGGCGAGGTGGTGAAGGTGCCGGTGGGGCCGGGGCTGCTGGGCCGCATCGTCGACCCCCTCGGCCGGCCCATGGACCGCTCCGAGCCGGTGGTGGCGCAGGCGCACCATCCCATCGAGCGGCCGGCGCCGGCCATCATCGCCCGCGACCTGGTCTCGCAGCCGGTTCAGACCGGCACGCTGGTGGTGGATGCGCTGTTCTCCCTCGGCCGGGGCCAGCGCGAGCTCATCATCGGCGACCGGGCTACCGGCAAGACCGCCATCGCGGTGGACACCATCATCAGCCAGAAGCATTCGGACATCGTGTGCATCTACGTGGCGGTGGGCCAGCGCGCCGCCGCCGTGGAGCGGGTGGTGGAGGCGGTGCGCGCCCACGGGGCGATCGAGCGCTGCATCTTCGTGGTCGCCTCGGCCGCCGCCTCGCCAGGGCTGCAATGGATCGCGCCGTTCGCCGGCATGACCATGGCGGAATATTTCCGCGACAACGGCCAGCATGCGCTCATCATCATCGATGATCTCACCAAGCATGCGGCCACCCATCGCGAGCTGGCGCTGCTCACCCACGAGCCGCCGGGCCGCGAGGCCTATCCCGGCGACATCTTCTATGTGCACGCCCGCCTTCTGGAGCGGGCCGCCAAGCTCTCCGCCGAGCTGGGCGGTGGCTCGCTCACGGCCCTGCCCATCGCGGAGACGGACGCGGGAAACCTCTCCGCCTATATCCCCACCAACCTCATCTCCATCACCGATGGGCAGATCGTGCTGGATTCGCGGCTGTTCGCGGCCAACCAGCGCCCGGCGGTGGATGTGGGCCTCTCCGTGAGCCGGGTGGGCGGCAAGGCGCAGCATCCCGCGCTTCGGGCCGTGTCCGGGCGCATCCGGCTCGATTATTCCCAGTTCCTGGAGCTGGAAATGTTCACCCGCTTCGGCGGCATCACCGATACCCGCGTGAAGGCGCAGATCACCCGGGGCGAGCGCATCCGCGCGCTGCTCACCCAGCCGCGCTTTTCCACCCTGCGCCTTCAGGACGAGGTGGCGCTGCTGGCCGCGCTGGCGGAGGGGGTGTTCGACACTTTGGCCCCGGGGCTGATGGGCGCCGTGCGTGCCCGCATTCCGGCCCAGCTGGATGCGCAGGTGAAGGACGTGGCCTCGGCCCTCGCCGAGGGCAAGGTGCTGGAGGAGGGCTTGCACGCCCGTCTCGTGGCGGCCGTGCGGGCCGTCGCGGCGGACGTGGCCGCGACCGCGAAGGCCGGGCCGTGA

【0070】

配列番号２１：ＡＴＰシンターゼサブユニットアルファａｔｐＡ＿１のアミノ酸配列

MSTGAQASEDWLTRSRAALAGTRLSQQSQSVGRVEEMADGIARVSGLPDVRLDELLTFEGGQTGYALTLDRTEIAVVLLDDASGVEAGARVFGTGEVVKVPVGPGLLGRIVDPLGRPMDRSEPVVAQAHHPIERPAPAIIARDLVSQPVQTGTLVVDALFSLGRGQRELIIGDRATGKTAIAVDTIISQKHSDIVCIYVAVGQRAAAVERVVEAVRAHGAIERCIFVVASAAASPGLQWIAPFAGMTMAEYFRDNGQHALIIIDDLTKHAATHRELALLTHEPPGREAYPGDIFYVHARLLERAAKLSAELGGGSLTALPIAETDAGNLSAYIPTNLISITDGQIVLDSRLFAANQRPAVDVGLSVSRVGGKAQHPALRAVSGRIRLDYSQFLELEMFTRFGGITDTRVKAQITRGERIRALLTQPRFSTLRLQDEVALLAALAEGVFDTLAPGLMGAVRARIPAQLDAQVKDVASALAEGKVLEEGLHARLVAAVRAVAADVAATAKAGP

【0071】

配列番号２２：ＡＴＰシンターゼサブユニットｂ ａｔｐＦ＿１のヌクレオチド配列

ATGCAGATCGACTGGTGGACGCTGGGCCTGCAGACGGTCAACGTCCTCGTTCTCATCTGGCTCCTGAGCCGCTTCCTGTTCAAGCCGGTGGCGCAGGTCATCGCGCAGCGCCGTGCCGAGATCGAGAAGCTGGTGGAGGATGCGCGCGCCGCCAAGGCCGCCGCCGAGGCCGAGCGGGACACGGCGAAGGCGGAGGAGGCGCGCCTTGCCGCCGAGCGCGGCGCCCGCATGGCGGCGGTCGCCAAGGAGGCGGAGGCGCAGAAGGCGGCATTGCTGGCCGCCGCCAAGACCGAGGCCGAGGCCCTGCACGCGGCCGCGGAAGCGGCCATCGTCCGGGCGCGGGCGAGCGAGGAGGAAGCCGCCGCCGACCGCGCCAGCCGCCTTGCCGTGGACATCGCCGCCAAGCTGCTGGACCGGCTGCCCGACGACGCCCGGGTCGCGGGCTTCATCGATGGCCTCGCCGAGGGGCTTGAAGCCCTGCCCGAGGCGAGCCGGGCGGTGATCGGCGTCGACGGCGCGCCAGTGCGCGTGACGGCCGCGCGCGCCCTTATGCCGGCGGAGGAGGAGGCCTGCCGCACGCGGCTCTCCCAGGCGCTGGGCCGTCCGGTGACGCTGGCCGTGACCATCGACCCCGCCCTCATCGCCGGCCTGGAGATGGAGACGCCCCACGCGGTGGTGCGCAATTCCTTCAAGGCCGATCTCGACCGCGTCACCGCGGCGCTCACCCATCATGGGACCTGA

【0072】

配列番号２３：ＡＴＰシンターゼサブユニットｂ ａｔｐＦ＿１のアミノ酸配列

MQIDWWTLGLQTVNVLVLIWLLSRFLFKPVAQVIAQRRAEIEKLVEDARAAKAAAEAERDTAKAEEARLAAERGARMAAVAKEAEAQKAALLAAAKTEAEALHAAAEAAIVRARASEEEAAADRASRLAVDIAAKLLDRLPDDARVAGFIDGLAEGLEALPEASRAVIGVDGAPVRVTAARALMPAEEEACRTRLSQALGRPVTLAVTIDPALIAGLEMETPHAVVRNSFKADLDRVTAALTHHGT

【0073】

配列番号２４：ＡＴＰシンターゼサブユニットｃ、ナトリウムイオン特異的ａｔｐＥ＿１のヌクレオチド配列

ATGACTGTCGAGATGGTCAGCATCTTCGCGGCGGCGCTCGCCGTCTCCTTCGGCGCCATCGGGCCGGCCCTGGGCGAGGGCCGGGCGGTGGCCGCGGCCATGGACGCCATCGCCCGCCAGCCGGAGGCGGCCGGAACCTTGTCGCGCACGCTCTTCGTCGGCCTCGCCATGATCGAGACCATGGCGATCTACTGCCTGGTGATCGCGCTCCTGGTGCTCTTCGCCAATCCGTTCGTGAAGTGA

【0074】

配列番号２５：ＡＴＰシンターゼサブユニットｃ、ナトリウムイオン特異的ａｔｐＥ＿１のアミノ酸配列

MTVEMVSIFAAALAVSFGAIGPALGEGRAVAAAMDAIARQPEAAGTLSRTLFVGLAMIETMAIYCLVIALLVLFANPFVK

【0075】

配列番号２６：ＡＴＰシンターゼサブユニットａ ａｔｐＢ＿１のヌクレオチド配列

ATGGGCTCGCCGCTGATCCTCGAACCCCTGTTCCATATCGGGCCCGTGCCCATCACCGCGCCGGTGGTGGTCACCTGGCTCATCATGGCCGCCTTCATTGGGCTGGCGCGGCTCATCACCCGGAAGCTTTCCACCGATCCCACCCGGACCCAGGCGGCGGTGGAAACGGTGCTGACCGCCATCGATTCCCAGATCGCCGACACCATGCAGGCCGATCCCGCGCCTTATCGCGCGCTCATCGGCACCATCTTCCTTTATGTGCTGGTGGCCAACTGGTCCTCGCTCATCCCGGGCATCGAGCCGCCCACGGCGCATATCGAGACCGATGCGGCGCTCGCTTTCATCGTGTTCGCCGCCACCATCGGGTTCGGGTTGAAGACAAGGGGTGTGAAGGGCTATCTCGCCACCTTCGCCGAACCCTCCTGGGTGATGATCCCGCTCAATGTGGTGGAGCAGATCACCCGGACCTTCTCGCTCATCGTGCGCCTGTTCGGCAACATCATGAGCGGGGTGTTCGTGGTCGGCATCATCCTGTCCCTCGCCGGGCTGCTGGTGCCCATCCCCCTCATGGCGCTCGATCTCCTGACCGGCGCCGTGCAGGCCTACATCTTCGCGGTGCTGGCCTGCGTGTTCATCGGCGCGGCCATTGGCGAGGCGCCGGCAAAGCCCCAATCGAAGGAGCCAGGGAAAACATCATGA

【0076】

配列番号２７：ＡＴＰシンターゼサブユニットａ ａｔｐＢ＿１のアミノ酸配列

MGSPLILEPLFHIGPVPITAPVVVTWLIMAAFIGLARLITRKLSTDPTRTQAAVETVLTAIDSQIADTMQADPAPYRALIGTIFLYVLVANWSSLIPGIEPPTAHIETDAALAFIVFAATIGFGLKTRGVKGYLATFAEPSWVMIPLNVVEQITRTFSLIVRLFGNIMSGVFVVGIILSLAGLLVPIPLMALDLLTGAVQAYIFAVLACVFIGAAIGEAPAKPQSKEPGKTS

【0077】

配列番号２８：ＡＴＰシンターゼイプシロン鎖ａｔｐＣ＿１のヌクレオチド配列

GTGAGCGCGCCGCTGCACCTCACCATCACCACGCCGGCCGCCGTTCTGGTGGACCGTGCCGACATCGTGGCCCTGCGTGCCGAGGACGAGAGCGGCAGCTTCGGCATCCTGCCCGGCCATGCGGATTTCCTGACCGTTCTGGAGGCCTGCGTGGTGCGCTTCAAGGATGGGGCCGACGGCGTGCATTATTGTGCTCTCAGTGGTGGCGTGCTGTCGGTCGAGGAGGGCCGGCGCATCGCCATCGCCTGCCGTCAGGGCACGGTGAGCGACGACCTGGTCGCCCTGGAAGGGGCGGTGGACGCCATGCGTTCGGCGGAGAGCGATGCCGACAAGCGGGCCCGGGTGGAGCAGATGCGCCTTCATGCCCACGCCGTGCGCCAGCTCCTGCACTATCTGCGGCCCGGCCGGGCCGGCGGCGTGGCGCCGGCCGCCGCGCCGGAGGAGGGGCCGTCATGA

【0078】

配列番号２９：ＡＴＰシンターゼイプシロン鎖ａｔｐＣ＿１のアミノ酸配列

MSAPLHLTITTPAAVLVDRADIVALRAEDESGSFGILPGHADFLTVLEACVVRFKDGADGVHYCALSGGVLSVEEGRRIAIACRQGTVSDDLVALEGAVDAMRSAESDADKRARVEQMRLHAHAVRQLLHYLRPGRAGGVAPAAAPEEGPS

【0079】

配列番号３０：ＡＴＰシンターゼサブユニットベータａｔｐＤ＿１のヌクレオチド配列

ATGGCAGCGGCAGATGAGGAGGCGCAATCGGCCGCCGGCCCCGCCTCGGGCCGGGTGGTGGCCGTGCGCGGCGCGGTGATCGACATCGCCTTTGCCCAGCCTCCGCTGCCGCCGCTGGACGACGCCCTTCTCATCACCGACGGCCGGGGCGGCACGGTGCTGGTGGAGGTGCAGAGCCATATGGATCGGCACACGGTGCGCGCCATCGCCCTTCAGGCCACCACCGGCCTCAGCCGGGGGCTGGAGGCGGCGCGGGTGGGCGGGCCGGTGAAGGTGCCGGTGGGAGACCATGTGCTCGGCCGCCTCCTGGATGTCACCGGCGCCATCGGCGACAAGGGCGGGCCGCTGCCGGCCGACGTGCCCACGCGGCCGATCCACCACGCGCCGCCATCCTTCGCCGCGCAGGGCGGCACGTCCGATCTGTTTCGCACCGGCATCAAGGTCATCGACCTCCTGGCGCCCCTCGCCCAGGGCGGCAAGGCGGCCATGTTCGGCGGGGCCGGCGTGGGCAAGACCGTGCTGGTGATGGAGCTGATCCACGCCATGGTGGCGAGCTACAAGGGCATCTCGGTGTTTGCCGGCGTGGGGGAGCGCTCCCGCGAGGGCCACGAGATGCTGCTGGACATGACCGATTCCGGCGTGCTCGACCGCACCGTTCTGGTCTATGGCCAGATGAACGAGCCCCCCGGGGCCCGCTGGCGGGTGCCCATGACGGCGCTGACCATCGCCGAATATTTCCGCGACGAGAAGCACCAGAACGTCCTGCTGCTGATGGACAACATCTTCCGCTTCGTCCAGGCGGGGGCGGAGGTCTCCGGCCTTTTGGGCCGTCCGCCCTCCCGGGTGGGATACCAGCCGACGCTGGCGAGCGAGGTGGCGGCGCTCCAGGAACGCATCACCTCCGTGGGCGAGGCCTCGGTGACCGCCATCGAGGCGGTCTACGTGCCGGCGGATGACTTCACCGATCCCGCCGTGACCACCATCGCCGCCCACGTGGATTCCATGGTGGTGCTCTCCCGCGCCATGGCGGCGGAGGGCATGTATCCGGCGGTGGACCCCATCTCCTCCTCGTCGGTGCTGCTCGACCCGCTCATCGTGGGGGACGAGCATGCGCGCGTCGCCAACGAGGTGCGCCGGACCATCGAGCATTATCGCGAGCTTCAGGATGTGATCTCGCTGCTGGGCATGGAGGAATTGGGCACCGAGGATCGCCGCATCGTGGAGCGGGCGCGCCGGCTCCAGCGCTTCCTCACCCAGCCCTTCACGGTCACCGAGGCCTTCACCGGCGTGCCCGGCCGCTCGGTGGCCATCGCCGACACCATCGCCGGCTGCAGGATGATCCTGTCCGGCGCCTGCGACGACTGGCAGGAAAGCGCCCTCTACATGGTGGGCACCATCGACGAGGCCCGCCAGAAGGAGGAGGCCGCTCGCGCCAAGGCGGGGCAGGGCGCCCCGGCCGGGACGGCAGCCGAGACGGCGGAGGCCGCCCCGTGA

【0080】

配列番号３１：ＡＴＰシンターゼサブユニットベータａｔｐＤ＿１のアミノ酸配列

MAAADEEAQSAAGPASGRVVAVRGAVIDIAFAQPPLPPLDDALLITDGRGGTVLVEVQSHMDRHTVRAIALQATTGLSRGLEAARVGGPVKVPVGDHVLGRLLDVTGAIGDKGGPLPADVPTRPIHHAPPSFAAQGGTSDLFRTGIKVIDLLAPLAQGGKAAMFGGAGVGKTVLVMELIHAMVASYKGISVFAGVGERSREGHEMLLDMTDSGVLDRTVLVYGQMNEPPGARWRVPMTALTIAEYFRDEKHQNVLLLMDNIFRFVQAGAEVSGLLGRPPSRVGYQPTLASEVAALQERITSVGEASVTAIEAVYVPADDFTDPAVTTIAAHVDSMVVLSRAMAAEGMYPAVDPISSSSVLLDPLIVGDEHARVANEVRRTIEHYRELQDVISLLGMEELGTEDRRIVERARRLQRFLTQPFTVTEAFTGVPGRSVAIADTIAGCRMILSGACDDWQESALYMVGTIDEARQKEEAARAKAGQGAPAGTAAETAEAAP

【0081】

配列番号３２：ＡＴＰシンターゼサブユニットベータａｔｐＤ＿２のヌクレオチド配列

ATGGCGAACAAGGTCGGACGCATCACCCAGATCATCGGCGCCGTCGTCGACGTGCAGTTCGACGGGCATCTGCCGGCGATTCTCAACGCGATCGAGACCACCAACCAGGGCAACCGGCTGGTGCTCGAAGTGGCTCAGCATCTCGGCGAGAACACCGTGCGCTGCATCGCCATGGATGCCACTGAAGGCCTGGTGCGTGGCCAGGAGGTGGCCGACACCGATGCGCCCATCCAGGTGCCCGTGGGCGCCGCCACCCTCGGCCGCATCATGAACGTGATCGGCGAGCCGGTGGACGAGCTGGGCCCCATCGAGGGCGAAGCGCTGCGCGGCATCCATCAGCCGGCCCCCTCCTATGCGGAGCAGGCCACGGAAGCTGAGATCCTCGTCACCGGCATCAAGGTGGTGGATCTGCTGGCGCCCTATTCCAAGGGCGGCAAGGTGGGCCTGTTCGGCGGCGCCGGCGTGGGCAAGACCGTGCTCATCATGGAGCTGATCAACAACGTGGCCAAGGCGCACGGCGGCTATTCCGTGTTCGCCGGCGTGGGTGAGCGCACCCGCGAGGGCAACGACCTCTACCACGAGATGATCGAGTCCAACGTGAACAAGGACCCGCACGAGAACAATGGCTCGGCGGCCGGTTCCAAGTGCGCCCTGGTCTATGGCCAGATGAACGAGCCGCCCGGCGCCCGCGCCCGCGTGGCCCTCACCGGCCTCACCGTCGCCGAGCATTTCCGCGACCAGGGCCAGGACGTGCTGTTCTTCGTGGACAACATCTTCCGCTTCACCCAGGCGGGCTCCGAGGTGTCGGCGCTTCTCGGCCGCATCCCCTCGGCGGTGGGCTACCAGCCGACGCTGGCCACCGACATGGGCCAGCTGCAGGAGCGCATCACCACCACCACCAAGGGCTCCATCACCTCGGTGCAGGCCATCTACGTGCCGGCGGACGATCTGACCGATCCGGCGCCGGCCGCCTCCTTCGCCCATCTGGACGCCACCACGGTGCTGTCGCGCTCCATCGCGGAGAAGGGCATCTACCCGGCGGTGGATCCGCTGGACTCCACCTCGCGCATGCTGTCTCCCGCCATCCTCGGCGACGAGCACTACAACACCGCGCGCCAGGTGCAGCAGACCCTGCAGCGCTACAAGGCGCTCCAGGACATCATCGCCATCCTGGGCATGGACGAACTCTCCGAAGAGGACAAGCTCACCGTGGCCCGCGCCCGCAAGATCGAGCGCTTCCTCTCCCAGCCCTTCCACGTGGCCGAGGTGTTCACCGGTTCGCCCGGCAAGCTGGTCGACCTCGCCGACACCATCAAGGGCTTCAAGGGCCTGGTGGACGGCAAGTACGACTACCTGCCCGAGCAGGCCTTCTACATGGTGGGCACCATCGAAGAAGCCATCGAGAAGGGCAAGAAGCTGGCGGCCGAGGCGGCCTGA

【0082】

配列番号３３：ＡＴＰシンターゼサブユニットベータａｔｐＤ＿２のアミノ酸配列

MANKVGRITQIIGAVVDVQFDGHLPAILNAIETTNQGNRLVLEVAQHLGENTVRCIAMDATEGLVRGQEVADTDAPIQVPVGAATLGRIMNVIGEPVDELGPIEGEALRGIHQPAPSYAEQATEAEILVTGIKVVDLLAPYSKGGKVGLFGGAGVGKTVLIMELINNVAKAHGGYSVFAGVGERTREGNDLYHEMIESNVNKDPHENNGSAAGSKCALVYGQMNEPPGARARVALTGLTVAEHFRDQGQDVLFFVDNIFRFTQAGSEVSALLGRIPSAVGYQPTLATDMGQLQERITTTTKGSITSVQAIYVPADDLTDPAPAASFAHLDATTVLSRSIAEKGIYPAVDPLDSTSRMLSPAILGDEHYNTARQVQQTLQRYKALQDIIAILGMDELSEEDKLTVARARKIERFLSQPFHVAEVFTGSPGKLVDLADTIKGFKGLVDGKYDYLPEQAFYMVGTIEEAIEKGKKLAAEAA

【0083】

配列番号３４：ＡＴＰシンターゼガンマ鎖ａｔｐＧ＿２のヌクレオチド配列

ATGGCGAGTCTGAAGGACCTGAGAAACCGCATTGCCTCGGTGAAGGCGACGCAGAAGATCACCAAGGCGATGCAGATGGTCGCCGCGGCGAAGCTGCGTCGCGCCCAGGCGGCGGCTGAAGCGGCCCGTCCCTATGCGGAACGCATGGAGACGGTGCTCGGAAATCTTGCCTCCGGCATGGTGGTGGGCGCGCAGGCGCCTGTTCTCATGACCGGGACGGGCAAGAGCGACACCCACCTGCTGCTGGTGTGCACCGGCGAGCGCGGCCTGTGCGGCGCCTTCAACTCGTCCATCGTGCGCTTCGCCCGCGAGCGGGCGCAGCTGCTGCTGGCCGAGGGCAAGAAGGTGAAAATCCTGTGCGTGGGCCGCAAGGGCCACGAGCAGCTGCGCCGCATCTACCCGGACAACATCATCGACGTGGTGGACCTGCGCGCGGTGCGCAACATCGGCTTCAAGGAGGCCGACGCCATCGCCCGCAAGGTGCTGGCCCTGCTCGATGAAGGCGCATTCGACGTCTGCACGCTCTTCTACTCCCACTTCAGGAGCGTGATCGCCCAGGTGCCGACGGCCCAGCAGCTCATTCCGGCCACCTTCGACGAGCGGCCGGCCGTCGCCGATGCGCCGGTCTATGAATATGAGCCGGAGGAGGAGGAGATCCTCGCCGAGCTGCTGCCGCGCAACGTGGCGGTGCAGATCTTCAAGGCCCTCCTCGAGAACCAGGCTTCTTTCTATGGCTCCCAGATGAGCGCCATGGACAACGCCACGCGCAATGCGGGCGAGATGATCAAGAAGCAGACGCTCACCTACAACCGTACCCGCCAGGCCATGATCACGAAGGAACTCATCGAGATCATCTCCGGCGCCGAGGCCGTCTGA

【0084】

配列番号３５：ＡＴＰシンターゼガンマ鎖ａｔｐＧ＿２のアミノ酸配列

MASLKDLRNRIASVKATQKITKAMQMVAAAKLRRAQAAAEAARPYAERMETVLGNLASGMVVGAQAPVLMTGTGKSDTHLLLVCTGERGLCGAFNSSIVRFARERAQLLLAEGKKVKILCVGRKGHEQLRRIYPDNIIDVVDLRAVRNIGFKEADAIARKVLALLDEGAFDVCTLFYSHFRSVIAQVPTAQQLIPATFDERPAVADAPVYEYEPEEEEILAELLPRNVAVQIFKALLENQASFYGSQMSAMDNATRNAGEMIKKQTLTYNRTRQAMITKELIEIISGAEAV

【0085】

配列番号３６：ＡＴＰシンターゼサブユニットアルファａｔｐＡ＿２のヌクレオチド配列

ATGGACATTCGAGCCGCTGAAATCTCTGCCATCCTGAAAGAGCAGATCCAGAATTTCGGCCAGGAGGCGGAAGTCTCCGAGGTGGGTCAGGTTCTGTCCGTGGGTGACGGCATCGCGCGCGTCTACGGCCTCGACAACGTCCAGGCGGGCGAGATGGTCGAGTTCGAGAACGGCACGCGCGGCATGGCGCTGAACCTCGAGCTCGACAATGTCGGCATCGTGATCTTCGGTTCCGACCGCGAGATCAAGGAAGGCCAGACCGTCAAGCGGACCGGCGCCATCGTGGACGCCCCCGTCGGCAAGGGCCTGCTCGGCCGCGTCGTGGACGCTCTCGGCAACCCGATCGACGGCAAGGGCCCGATCATGTTCACCGAGCGTCGCCGGGTCGACGTGAAGGCGCCGGGCATCATCCCGCGCAAGTCGGTGCACGAGCCCATGCAGACCGGCCTGAAGGCCATCGATGCGCTCATCCCCATCGGCCGCGGCCAGCGCGAGCTCATCATCGGCGACCGCCAGACCGGCAAGACCGCCGTGGCGCTCGACTCGATCCTGAACCAGAAGCCCATCAACCAGGGCGACGACGAGAAGGCCAAGCTCTACTGCGTCTATGTCGCGGTGGGCCAGAAGCGTTCCACTGTCGCGCAGTTCGTGAAGGTGCTCGAGGAGCACGGCGCGCTGGAATATTCCATCGTCGTCGCCGCCACCGCCTCGGACGCGGCCCCCATGCAGTTCCTGGCGCCGTTCACCGGCACCGCCATGGGCGAGTATTTCCGCGACAACGGCATGCACGCCCTCATCATCCATGATGACCTGTCCAAGCAGGCCGTGGCCTACCGCCAGATGTCGCTGCTGCTGCGCCGCCCGCCGGGCCGCGAGGCCTATCCCGGCGATGTGTTCTACCTGCACTCCCGCCTCTTGGAGCGCGCCGCCAAGCTCAATGACGAGCACGGCGCCGGCTCGCTGACCGCCCTGCCGGTGATCGAGACCCAGGCCAACGACGTGTCGGCCTACATCCCGACCAACGTGATCTCCATCACCGACGGTCAGATCTTCCTTGAATCCGATCTGTTCTACCAGGGCATCCGCCCGGCGGTGAACGTGGGCCTGTCGGTGTCGCGCGTGGGCTCTTCGGCCCAGATCAAGGCGATGAAGCAGGTGGCCGGCAAGATCAAGGGCGAGCTCGCCCAGTATCGCGAGCTGGCGGCCTTCGCCCAGTTCGGTTCGGACCTGGACGCGGCCACCCAGAAGCTGCTGAACCGCGGCGCCCGCCTCACCGAGCTGCTGAAGCAGAGCCAGTTCTCGCCCCTCAAGGTGGAGGAGCAGGTGGCGGTGATCTATGCCGGCACCAATGGCTATCTCGATCCGCTGCCGGTCTCCAAGGTGCGCGAGTTCGAGCAGGGTCTGCTCCTGTCGCTGCGCTCGCAGCATCCGGAGATCCTGGACGCCATCCGCACGTCCAAGGAGCTTTCCAAGGACACCGCCGAGAAGCTGACGAAGGCCATCGACGCCTTCGCCAAGAGCTTCTCCTGA

【0086】

配列番号３７：ＡＴＰシンターゼサブユニットアルファａｔｐＡ＿２のアミノ酸配列

MDIRAAEISAILKEQIQNFGQEAEVSEVGQVLSVGDGIARVYGLDNVQAGEMVEFENGTRGMALNLELDNVGIVIFGSDREIKEGQTVKRTGAIVDAPVGKGLLGRVVDALGNPIDGKGPIMFTERRRVDVKAPGIIPRKSVHEPMQTGLKAIDALIPIGRGQRELIIGDRQTGKTAVALDSILNQKPINQGDDEKAKLYCVYVAVGQKRSTVAQFVKVLEEHGALEYSIVVAATASDAAPMQFLAPFTGTAMGEYFRDNGMHALIIHDDLSKQAVAYRQMSLLLRRPPGREAYPGDVFYLHSRLLERAAKLNDEHGAGSLTALPVIETQANDVSAYIPTNVISITDGQIFLESDLFYQGIRPAVNVGLSVSRVGSSAQIKAMKQVAGKIKGELAQYRELAAFAQFGSDLDAATQKLLNRGARLTELLKQSQFSPLKVEEQVAVIYAGTNGYLDPLPVSKVREFEQGLLLSLRSQHPEILDAIRTSKELSKDTAEKLTKAIDAFAKSFS

【0087】

配列番号３８：ＡＴＰシンターゼサブユニットデルタｐＨのヌクレオチド配列

GTGGCGGAAACGATCGTGTCAGGCATGGCGGGACGCTATGCGACCGCGCTGTTCGAGCTGGCGGACGAAGCCGGTGCCATCGATTCCGTCCAGGCGGATCTTGATCGCCTGTCCGGCCTTCTGGCCGAGAGCGCGGATCTGGCGCGGCTGGTCAAGAGCCCGGTCTTCACCGCCGAGCAGCAGCTCGGCGCGATGGCGGCCATTCTCGATCAAGCAGGCATTTCCGGCCTTGCGGGCAAATTCGTGAAGCTGGTGGCGCAGAACCGCCGCCTGTTCGCACTGCCGCGCATGATTGCCGAATACGCCGTCCTGGTGGCCCGGAAGAAGGGCGAGACCTCGGCGAGCGTGACCGTTGCCACCCCCCTGAGCGATGAGCATCTGGCCACGCTCAAGGCGGCCCTGGCTGAAAAGACCGGCAAGGACGTGAAGCTCGACGTCACCGTCGATCCGTCCATCCTCGGTGGTCTCATCGTGAAGCTCGGCTCGCGCATGGTCGATGCTTCCCTGAAGACCAAACTCAATTCTATCCGGCATGCGATGAAAGAGGTCCGCTGA

【0088】

配列番号３９：ＡＴＰシンターゼサブユニットデルタａｔｐＨのアミノ酸配列

MAETIVSGMAGRYATALFELADEAGAIDSVQADLDRLSGLLAESADLARLVKSPVFTAEQQLGAMAAILDQAGISGLAGKFVKLVAQNRRLFALPRMIAEYAVLVARKKGETSASVTVATPLSDEHLATLKAALAEKTGKDVKLDVTVDPSILGGLIVKLGSRMVDASLKTKLNSIRHAMKEVR

【0089】

配列番号４０：ＡＴＰシンターゼサブユニットｂ ａｔｐＦ＿２のヌクレオチド配列

ATGACCGAAATGGAACTGGCTGAGCTCTGGGTCGCCATCGCCTTCCTGGTTTTCGTAGGCCTCCTGATCTATGCGGGCGCCCACCGCGCCATCGTCTCCGCCCTGGATTCCCGCGGCTCGCGCATCGCCTCGGAACTGGAGGAGGCCCGTCGGCTCAAGGAAGAGGCCCAGAAGCTGGTGGCCGAATTCAAGCGCAAGCAGCGCGAGGCCGAGGCCGAGGCCGAATCCATCGTCACCGGCGCCAAGGCCGAGGCCGAGCGCCTCGCCGCCGAGGCCAAGGCGAAGATCGAGGATTTCGTCACCCGCCGCACCAAGATGGCCGAGGACAAGATCGCCCAGGCCGAGCATCAGGCTCTGGCGGACGTGAAGTCCATCGCCGCCGAGGCGGCGGCCAAGGCGGCCGAGGTGATCCTCGGCGCCCAGGCCACCGGCGCGGTGGCGGAGCGTCTGCTGTCGGGCGCCATCTCCGAGGTCAAGACCAAGCTCAACTGA

【0090】

配列番号４１：ＡＴＰシンターゼサブユニットｂ ａｔｐＦ＿２のアミノ酸配列

MTEMELAELWVAIAFLVFVGLLIYAGAHRAIVSALDSRGSRIASELEEARRLKEEAQKLVAEFKRKQREAEAEAESIVTGAKAEAERLAAEAKAKIEDFVTRRTKMAEDKIAQAEHQALADVKSIAAEAAAKAAEVILGAQATGAVAERLLSGAISEVKTKLN

【0091】

配列番号４２：ＡＴＰシンターゼサブユニットｂ’ ａｔｐＧ＿３のヌクレオチド配列

ATGATGATTGCATGGAAGCGGACCTTCGCAGTCGTGACCTTCGGGGCCGCCCTGATGGCCATGCCCGTCGCGGGCGTGGTCGCAGCTGAGACTTCTCCCGCTCCGGCGGCAGTGGCGCAGGCCGATCATGCGGTGCCCACCGAGGCGGCCGGCCAGGGCACCGCCGATGCGGCCCATGCCGCCGCGCCGGGCGAGGCCGCCCATGGTGGCGCGGCCAAGCACGAAACCCATTTCCCGCCCTTCGACGGCACCACCTTCGCCTCCCAGTTGCTGTGGCTCGCCGTCACCTTCGGCCTGCTTTACTACCTCATGAGCAAGGTCACGCTGCCGCGCATCGGCCGCATCCTGGAAGAGCGCCACGACCGCATCGCCGATGATCTGGAGGAAGCCTCCAAGCATCGCGCCGAGAGCGAGGCCGCCCAGCGGGCCTATGAGAAGGCGCTGAGCGAGGCCCGCGCGAAGGCCCATTCCATCGCCGCGGAAACCCGCGACCGCCTTGCCGCCCACGCCGACACCAACCGCAAGGCGCTGGAGAGCGAGCTCACCGCCAAGCTGCAGGCGGCCGAGGAGCGCATCGCCACCACCAAGAGCGAAGCCCTCACCCATGTGCGCGGCATCGCGGTGGACGCCACCCAATCCATCGTCTCCACCCTCATCGGTGTCGCGCCCGCGGCGGCCGACGTGGAAAAAGCGGTGGACGGCGCCCTGTCCCAGCACGGCCAGGCCTGA

【0092】

配列番号４３：ＡＴＰシンターゼサブユニットｂ’ ａｔｐＧ＿３のアミノ酸配列

MMIAWKRTFAVVTFGAALMAMPVAGVVAAETSPAPAAVAQADHAVPTEAAGQGTADAAHAAAPGEAAHGGAAKHETHFPPFDGTTFASQLLWLAVTFGLLYYLMSKVTLPRIGRILEERHDRIADDLEEASKHRAESEAAQRAYEKALSEARAKAHSIAAETRDRLAAHADTNRKALESELTAKLQAAEERIATTKSEALTHVRGIAVDATQSIVSTLIGVAPAAADVEKAVDGALSQHGQA

【0093】

配列番号４４：ＡＴＰシンターゼサブユニットｃ ａｔｐＥ＿２のヌクレオチド配列

ATGGAAGCGGAAGCTGGAAAGTTCATCGGTGCCGGCCTCGCCTGCCTCGGCATGGGTCTCGCTGGCGTCGGCGTCGGTAACATCTTCGGTAACTTCCTCTCCGGCGCCCTGCGCAACCCGTCCGCTGCCGACGGCCAGTTCGCCCGCGCCTTCATCGGCGCCGCCCTCGCGGAAGGTCTCGGCATCTTCTCGCTGGTCGTTGCGCTCGTCCTGCTGTTCGTGGCCTGA

【0094】

配列番号４５：ＡＴＰシンターゼサブユニットｃ ａｔｐＥ＿２のアミノ酸配列

MEAEAGKFIGAGLACLGMGLAGVGVGNIFGNFLSGALRNPSAADGQFARAFIGAALAEGLGIFSLVVALVLLFVA

【0095】

配列番号４６：ＡＴＰシンターゼサブユニットａ ａｔｐＢ＿２のヌクレオチド配列
SEQ ID NO: 46:

ATGACCGTCGATCCGATCCACCAGTTCGAGATCAAGCGCTACGTGGATCTGCTGAACGTCGGCGGTGTCCAGTTCTCCTTCACCAACGCAACGGTGTTCATGATTGGCATCGTCCTGGTGATTTTCTTCTTCCTGACTTTCGCGACACGCGGTCGCACCCTTGTGCCGGGCCGGATGCAGTCGGCGGCGGAGCTGAGCTACGAGTTCATCGCCAAGATGGTGCGCGACGCGGCCGGCAGCGAGGGAATGGTGTTCTTTCCCTTCGTCTTCTCGCTCTTCATGTTCGTGCTGGTGGCGAACGTATTGGGGCTCATCCCCTACACCTTCACGGTGACCGCCCACCTCATCGTCACCGCCGCCCTGGCGGCGACGGTGATCCTCACCGTCATCATCTACGGCTTCGTGCGGCACGGCACCCACTTCCTGCACCTGTTCGTGCCGTCGGGCGTGCCGGGCTTCCTCCTGCCCTTCCTCGTGGTGATCGAGGTGGTGTCGTTCCTGTCGCGGCCCATCAGCCTCTCGCTGCGTCTGTTCGCCAACATGCTGGCGGGCCACATCGCCCTCAAGGTGTTCGCCTTCTTCGTCGTGGGACTGGCCTCGGCCGGCGCGATCGGCTGGTTCGGCGCCACCCTGCCCTTCTTCATGATCGTGGCGCTCACCGCGCTGGAGCTGCTGGTGGCGGTGCTGCAGGCCTACGTGTTCGCGGTGCTGACCTCGATCTACCTCAACGACGCCATCCATCCCGGCCACTGA

【0096】

配列番号４７：ＡＴＰシンターゼサブユニットａ ａｔｐＢ＿２のアミノ酸配列

MTVDPIHQFEIKRYVDLLNVGGVQFSFTNATVFMIGIVLVIFFFLTFATRGRTLVPGRMQSAAELSYEFIAKMVRDAAGSEGMVFFPFVFSLFMFVLVANVLGLIPYTFTVTAHLIVTAALAATVILTVIIYGFVRHGTHFLHLFVPSGVPGFLLPFLVVIEVVSFLSRPISLSLRLFANMLAGHIALKVFAFFVVGLASAGAIGWFGATLPFFMIVALTALELLVAVLQAYVFAVLTSIYLNDAIHPGH

【0097】

配列番号４８：ＡＴＰシンターゼタンパク質Ｉ ａｔｐＩのヌクレオチド配列

ATGTCCGAGCCGAATGATCCATCCCGCAGGGACGGTGCGAAGGCGAAAGACGAGACGCAGGACTCCCGGCCCGGTGAGGCGGATCTTGCTCGGCGCCTCGATGCGCTCGGCACCTCCATCGGTCAGGTCAAGTCCAGAAGCGGGGAGCCCGCGGCGACGCCGCGCAAGGACACCTCCTCGGCCTCCGGCGCGGCCCTGGCGTTTCGGCTGGGCGCCGAGTTTGTTTCAGGCGTGCTGGTGGGCTCGCTCATCGGCTACGGGTTGGATTATGCGTTTGCGATTTCGCCCTGGGGGCTGATCGCCTTCACGCTGATCGGCTTTGCCGCCGGCGTCCTGAACATGCTGCGCGTGGCGAACAGCGATGCCAAGCGCCACAGCGCGGACAGGTGA

【0098】

配列番号４９：ＡＴＰシンターゼタンパク質Ｉ ａｔｐＩのアミノ酸配列

MSEPNDPSRRDGAKAKDETQDSRPGEADLARRLDALGTSIGQVKSRSGEPAATPRKDTSSASGAALAFRLGAEFVSGVLVGSLIGYGLDYAFAISPWGLIAFTLIGFAAGVLNMLRVANSDAKRHSADR

【0099】

別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号５１に示される配列、又は配列番号５１に示される配列と６０％を超える同一性、例えば７０％を超える同一性、９２％を超える同一性等、９５％を超える同一性等、例えば９６％を超える同一性、９７％を超える同一性等、例えば９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するニトロゲナーゼモリブデン－鉄タンパク質アルファ鎖ｎｉｆＤ＿１をコードする遺伝子を含む。
別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号５３に示される配列、又は配列番号５３に示される配列と６０％を超える同一性、例えば９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するニトロゲナーゼモリブデン－鉄タンパク質アルファ鎖ｎｉｆＤ＿２をコードする遺伝子を含む。
別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号５５に示される配列、又は配列番号５５に示される配列と８７％を超える同一性、例えば９０％を超える同一性等、９５％を超える同一性等、例えば９６％を超える同一性、９７％を超える同一性等、例えば９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するニトロゲナーゼモリブデン－鉄タンパク質ベータ鎖ｎｉｆＫ＿１をコードする遺伝子を含む。
別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号５７に示される配列、又は配列番号５７に示される配列と９５％を超える同一性、例えば９６％を超える同一性、９７％を超える同一性等、例えば９８％を超える配列同一性、９９％を超える配列同一性等を有する配列を有するニトロゲナーゼモリブデン－鉄タンパク質ベータ鎖ｎｉｆＫ＿２をコードする遺伝子を含む。
別の実施形態では、本発明の方法で使用される変異型化学合成独立栄養細菌株は、配列番号５９に示される配列、又は配列番号５９に示される配列に対して９８．５％を超える配列同一性を有する配列を有するニトロゲナーゼ鉄タンパク質ｎｉｆＨをコードする遺伝子を含む。

【0100】

配列番号５０：ニトロゲナーゼモリブデン－鉄タンパク質アルファ鎖ｎｉｆＤ＿１のヌクレオチド配列

ATGAGTTCGCTCTCCGCCACTATTCAACAGGTCTTCAACGAGCCGGGCTGCGCGAAGAACCAGAATAAGTCCGAGGCGGAGAAGAAGAAGGGCTGCACCAAGCAGCTGCAACCCGGCGGAGCGGCCGGCGGCTGCGCGTTCGACGGCGCGAAGATCGCGCTCCAGCCCTTGACCGACGTCGCCCACCTGGTGCACGGCCCCATCGCCTGCGAAGGCAATTCCTGGGACAATCGTGGCGCCAAGTCCTCCGGCTCGAACATCTGGCGCACCGGCTTCACCACGGACATCAACGAAACCGACGTGGTGTTCGGCGGCGAGAAGCGTCTGTTCAAGTCCATCAAGGAAATCATCGAGAAGTACGACCCGCCGGCCGTCTTCGTCTATCAGACCTGCGTCCCCGCCATGATCGGCGACGACATCGACGCGGTGTGCAAGGCGGCCAGGGAGAAGTTCGGAAAGCCGGTGATCCCGATCAATTCCCCCGGCTTCGTGGGGCCGAAGAATCTCGGCAACAAGCTCGCCGGCGAGGCGCTCCTCGACCATGTGATCGGCACCGAGGAGCCCGATTACACGACGGCCTACGACATCAACATCATCGGCGAATACAATCTCTCCGGCGAGTTGTGGCAGGTGAAGCCGCTGCTGGACGAGCTGGGCATCCGCATCCTCGCCTGCATCTCCGGCGACGGGAAGTACAAGGATGTGGCGTCCTCCCACCGCGCCAAGGCGGCGATGATGGTGTGCTCCAAGGCCATGATCAACGTGGCCCGCAAGATGGAGGAGCGCTACGACATCCCCTTCTTCGAAGGCTCCTTCTACGGCATCGAGGATAGCTCCGATTCCCTGCGCGAGATTGCGCGCATGCTCATCGAGAAGGGCGCCGATCCGGAGCTGATGGACCGCACCGAGGCGCTGATTGAGCGGGAAGAGAAGAAGGCGTGGGACGCCATCGCCGCCTACAAGCCCCGCTTCAAGGACAAGAAGGTGCTGCTCATCACCGGCGGCGTGAAATCCTGGTCGGTGGTGGCAGCGCTCCAGGAAGCCGGCCTCGAACTGGTGGGCACCTCGGTGAAGAAGTCCACCAAGGAGGACAAGGAGCGCATCAAGGAACTGATGGGCCAGGACGCCCACATGATCGACGACATGACGCCCCGCGAAATGTACAAGATGCTGAAGGACGCCAAGGCGGACATCATGCTCTCGGGCGGGCGCTCGCAATTCATCGCGCTCAAGGCCGCCATGCCCTGGCTCGACATCAACCAGGAGCGCCACCACGCCTATATGGGCTATGTGGGCATGGTGAAGCTGGTCGAGGAGATCGACAAGGCGCTCTACAATCCCGTGTGGGAACAGGTGCGCAAGCCCGCCCCGTGGGAAAATCCGGAAGACACCTGGCAGGCCCGTGCGCTCGCCGAAATGGAGGCGGAGGCCGCCGCGCTCGCCGCCGATCCGGTGCGCGCGGAAGAGGTGCGCCGGTCCAAGAAGATCTGCAATTGCAAGAGCGTCGACCTCGGAACCATTGAGGACGCCATCAAGGCTCACGCGCTGACCACCGTGGAGGGTGTGCGAGAGCACACCAATGCCTCGGGAGGCTGCGGAGCCTGCAGCGGGCGGATCGAGGAGATCTTCGAGGCCGTGGGCGTTGTCGCCGCCCCGCCTCCCGCGGAGGCCGCCCCGTCTCCGCAGGAGATCGCGCCCGATCCGCTCGCTGCGGAGGAAAAGCGCCGCGCCAAGAAGGCCTGCGGCTGCAAGGAGGTAGCGGTCGGCACCATTGAGGATGCCATCCGCGCCAAGGGTCTGCGAAACATCGCGGAGGTGCGTGCGGCCACCGATGCCAACACCGGCTGCGGCAATTGCCAGGAGCGGGTGGAGGGCATCCTCGACCGGGTTCTCGCCGAGGCGGCCTCAGAACTCCAGGCGGCGGAATAG

【0101】

配列番号５１：ニトロゲナーゼモリブデン－鉄タンパク質アルファ鎖ｎｉｆＤ＿１のアミノ酸配列

MSSLSATIQQVFNEPGCAKNQNKSEAEKKKGCTKQLQPGGAAGGCAFDGAKIALQPLTDVAHLVHGPIACEGNSWDNRGAKSSGSNIWRTGFTTDINETDVVFGGEKRLFKSIKEIIEKYDPPAVFVYQTCVPAMIGDDIDAVCKAAREKFGKPVIPINSPGFVGPKNLGNKLAGEALLDHVIGTEEPDYTTAYDINIIGEYNLSGELWQVKPLLDELGIRILACISGDGKYKDVASSHRAKAAMMVCSKAMINVARKMEERYDIPFFEGSFYGIEDSSDSLREIARMLIEKGADPELMDRTEALIEREEKKAWDAIAAYKPRFKDKKVLLITGGVKSWSVVAALQEAGLELVGTSVKKSTKEDKERIKELMGQDAHMIDDMTPREMYKMLKDAKADIMLSGGRSQFIALKAAMPWLDINQERHHAYMGYVGMVKLVEEIDKALYNPVWEQVRKPAPWENPEDTWQARALAEMEAEAAALAADPVRAEEVRRSKKICNCKSVDLGTIEDAIKAHALTTVEGVREHTNASGGCGACSGRIEEIFEAVGVVAAPPPAEAAPSPQEIAPDPLAAEEKRRAKKACGCKEVAVGTIEDAIRAKGLRNIAEVRAATDANTGCGNCQERVEGILDRVLAEAASELQAAE

【0102】

配列番号５２：ニトロゲナーゼモリブデン－鉄タンパク質アルファ鎖ｎｉｆＤ＿２のヌクレオチド配列

ATGAGTGTCGCACAGTCCCAGAGCGTCGCCGAGATCAAGGCGCGCAACAAGGAACTCATCGAAGAGGTCCTCAAGGTCTATCCCGAGAAGACCGCCAAGCGCCGCGCCAAGCACCTGAACGTCCACGAAGCCGGCAAGTCCGACTGCGGCGTGAAGTCCAACATCAAGTCCATCCCGGGCGTGATGACCATCCGCGGTTGCGCTTATGCCGGCTCCAAGGGTGTGGTGTGGGGTCCCATCAAGGACATGATCCACATCTCCCACGGCCCGGTGGGCTGCGGCCAGTATAGCTGGGCCGCCCGCCGCAACTACTATATCGGCACGACCGGCATCGACACCTTCGTGACGATGCAGTTCACCTCCGACTTCCAGGAGAAGGACATCGTCTTCGGCGGCGACAAGAAGCTCGCCAAGATCATGGACGAGATCCAGGAGCTGTTCCCGCTGAACAACGGCATCACCGTTCAGTCCGAGTGCCCCATCGGCCTCATCGGCGACGACATCGAGGCCGTCTCCAAGCAGAAGTCCAAGGAGTATGAGGGCAAGACCATCGTGCCGGTGCGCTGCGAGGGCTTCCGCGGCGTGTCCCAGTCCCTGGGCCACCACATCGCCAACGACGCCATCCGCGATTGGGTGTTCGACAAGATCGCGCCCGACGCCGAGCCGCGCTTTGAGCCGACCCCGTACGACGTCGCCATCATCGGCGACTACAATATCGGTGGTGACGCCTGGTCGTCCCGTATCCTCCTGGAGGAGATGGGCCTGCGCGTGATCGCCCAGTGGTCCGGCGACGGTTCGCTCGCTGAGCTGGAGGCCACCCCGAAGGCCAAGCTCAACGTGCTGCACTGCTACCGCTCCATGAACTACATCTCGCGCCACATGGAAGAGAAGTACGGTATCCCGTGGTGCGAGTACAACTTCTTCGGTCCTTCCAAGATCGCCGAGTCCCTGCGCAAGATCGCCAGCTACTTCGACGACAAGATCAAGGAAGGCGCGGAGCGCGTCATCGCCAAGTATCAGCCGCTCATGGATGCGGTGATCGCGAAGTATCGTCCCCGCCTCGAGGGCAAGACCGTGATGCTGTACGTGGGCGGCCTGCGTCCCCGTCACGTCATCGGCGCCTACGAGGACCTGGGCATGGAAGTGGTCGGCACGGGCTACGAGTTCGCCCATAACGACGACTACCAGCGCACCGCCCAGCACTACGTCAAGGATGGCACCATCATCTATGACGACGTGACCGGCTACGAGTTCGAGAAGTTCGTCGAGAAGATCCAGCCGGACCTGGTCGGTTCGGGCATCAAGGAAAAGTACGTCTTCCAGAAGATGGGCGTGCCGTTCCGCCAGATGCACTCCTGGGACTACTCGGGCCCGTACCACGGCTATGACGGCTTCGCGATCTTCGCGCGCGACATGGACATGGCCATCAACAGCCCCGTGTGGAAGATGACCCAGGCTCCGTGGAAGAGCGTCCCCAAGCCGACGATGCTCGCGGCTGAATGA

【0103】

配列番号５３：ニトロゲナーゼモリブデン－鉄タンパク質アルファ鎖ｎｉｆＤ＿２のアミノ酸配列

MSVAQSQSVAEIKARNKELIEEVLKVYPEKTAKRRAKHLNVHEAGKSDCGVKSNIKSIPGVMTIRGCAYAGSKGVVWGPIKDMIHISHGPVGCGQYSWAARRNYYIGTTGIDTFVTMQFTSDFQEKDIVFGGDKKLAKIMDEIQELFPLNNGITVQSECPIGLIGDDIEAVSKQKSKEYEGKTIVPVRCEGFRGVSQSLGHHIANDAIRDWVFDKIAPDAEPRFEPTPYDVAIIGDYNIGGDAWSSRILLEEMGLRVIAQWSGDGSLAELEATPKAKLNVLHCYRSMNYISRHMEEKYGIPWCEYNFFGPSKIAESLRKIASYFDDKIKEGAERVIAKYQPLMDAVIAKYRPRLEGKTVMLYVGGLRPRHVIGAYEDLGMEVVGTGYEFAHNDDYQRTAQHYVKDGTIIYDDVTGYEFEKFVEKIQPDLVGSGIKEKYVFQKMGVPFRQMHSWDYSGPYHGYDGFAIFARDMDMAINSPVWKMTQAPWKSVPKPTMLAAE

【0104】

配列番号５４：ニトロゲナーゼモリブデン－鉄タンパク質ベータ鎖ｎｉｆＫ＿１のヌクレオチド配列

ATGGCCACCGTTTCCGTCTCCAAGAAGGCCTGCGCGGTCAACCCCCTCAAGATGAGCCAGCCGGTGGGCGGCGCGCTCGCCTTCATGGGCGTGCGCAAGGCCATGCCGCTGCTGCACGGCTCGCAGGGCTGCACCTCCTTCGGCCTGGTGCTGTTCGTGCGCCACTTCAAGGAAGCCATCCCCATGCAGACCACCGCCATGAGCGAGGTGGCGACGGTTCTGGGCGGCCTTGAGAATGTGGAGCAGGCCATTCTCAACATCTACAATCGCACCAAGCCGGAGATCATCGGCATCTGCTCCACCGGCGTCACCGAGACCAAGGGCGATGATGTCGACGGCTACATCAAGCTGATCCGGGACAAGTATCCCCAGCTGGCCGACTTCCCGCTGGTCTATGTCTCCACCCCCGATTTCAAGGACGCCTTCCAGGACGGTTGGGAGAAGACCGTGGCGAAGATGGTGGAGGCGCTGGTGAAGCCCGCCGCCGACAAGCAGAAGGACAAGACCCGCGTCAACGTCCTGCCCGGCTGCCACCTCACGCCCGGCGATCTGGATGAGATGCGGACCATCTTCGAGGATTTCGGGCTCACACCCTATTTCCTGCCGGATCTGGCCGGCTCGCTGGATGGGCATATCCCCGAGGACTTCTCGCCCACCACCATCGGCGGCATCGGCATCGATGAGATCGCCACCATGGGCGAGGCGGCCCACACCATCTGCATCGGCGCGCAGATGCGCCGGGCGGGCGAGGCCATGGAGAAGAAGACCGGCATTCCCTTCAAGCTGTTCGAGCGCCTGTGCGGCCTGGAGGCGAACGACGCCTTCATCATGCACCTGTCGCAGATCTCCGGCCGGCCGGTGCCGGTGAAGTATCGCCGGCAGCGGGGCCAGCTGGTGGATGCCATGCTGGACGGCCACTTCCATCTGGGCGGTCGCAAGGTGGCCATGGGGGCGGAGCCGGACCTGCTCTACGACGTGGGCTCCTTCCTGCACGAGATGGGCGCCCACATCCTTTCCGCGGTCACCACCACCCAGTCGCCGGTGCTGGCGCGCCTGCCTGCCGAGGAGGTGCTTATCGGCGACCTGGAGGATCTGGAGACCCAGGCGAAGGCGCGCGGATGCGATCTCCTGCTCACCCATTCCCATGGGCGCCAGGCGGCGGAGCGCCTCCACATCCCCTTCTACCGGATCGGCATTCCCATGTTTGACCGGCTGGGGGCGGGGCATCTGTTGTCGGTGGGCTATCGCGGCACCCGCGACCTCATCTTCCATCTCGCCAACCTTGTGATCGCCGACCACGAGGAAAATCACGAGCCGACGCCCGACACCTGGGCCACCGGCCATGGCGAGCATGCCGCCGCCCCCACTTCCCATTGA

【0105】

配列番号５５：ニトロゲナーゼモリブデン－鉄タンパク質ベータ鎖ｎｉｆＫ＿１のアミノ酸配列

MATVSVSKKACAVNPLKMSQPVGGALAFMGVRKAMPLLHGSQGCTSFGLVLFVRHFKEAIPMQTTAMSEVATVLGGLENVEQAILNIYNRTKPEIIGICSTGVTETKGDDVDGYIKLIRDKYPQLADFPLVYVSTPDFKDAFQDGWEKTVAKMVEALVKPAADKQKDKTRVNVLPGCHLTPGDLDEMRTIFEDFGLTPYFLPDLAGSLDGHIPEDFSPTTIGGIGIDEIATMGEAAHTICIGAQMRRAGEAMEKKTGIPFKLFERLCGLEANDAFIMHLSQISGRPVPVKYRRQRGQLVDAMLDGHFHLGGRKVAMGAEPDLLYDVGSFLHEMGAHILSAVTTTQSPVLARLPAEEVLIGDLEDLETQAKARGCDLLLTHSHGRQAAERLHIPFYRIGIPMFDRLGAGHLLSVGYRGTRDLIFHLANLVIADHEENHEPTPDTWATGHGEHAAAPTSH

【0106】

配列番号５６：ニトロゲナーゼモリブデン－鉄タンパク質ベータ鎖ｎｉｆＫ＿２のヌクレオチド配列

ATGCCACAAAATGCTGACAATGTGCTCGATCACTTCGAGCTCTTCCGTGGTCCCGAATACCAGCAGATGCTGGCCAATAAGAAAAAGATGTTCGAGAACCCCCGCGATCCGGCCGAAGTCGAGCGCGTGCGGGAATGGGCGAAGACTCCTGAATACAAGGAGCTGAACTTCGCCCGCGAGGCGCTCACCGTGAATCCGGCCAAGGCTTGTCAGCCGCTGGGCGCGGTGTTCGTCGCCGTCGGCTTCGAGAGCACGATCCCCTTCGTGCACGGCTCGCAGGGTTGCGTCGCGTATTACCGCTCGCACCTCTCCCGCCACTTCAAGGAGCCGTCCTCCTGCGTCTCCTCGTCCATGACCGAGGATGCGGCGGTGTTCGGCGGCCTCAACAACATGATTGACGGCCTCGCCAACACCTACAACATGTACAAGCCGAAGATGATCGCCGTCTCCACCACCTGCATGGCGGAAGTCATCGGCGACGATCTGAACGCCTTCATCAAGACCGCGAAGGAAAAGGGCTCGGTTCCGGCCGAATACGACGTGCCCTTCGCCCACACCCCGGCGTTCGTCGGCAGCCATGTCACCGGCTACGACAATGCGCTCAAGGGCATCCTCGAGCACTTCTGGGACGGCAAGGCCGGCACCGCGCCGAAGCTGGAGCGCGTTCCCAACGAGAAGATCAACTTCATCGGCGGCTTCGACGGCTACACCGTCGGCAACACTCGCGAAGTGAAGCGCATCTTCGAGGCGTTCGGCGCCGATTACACCATCCTCGCCGACAATTCCGAAGTGTTCGACACCCCGACCGACGGCGAGTTCCGCATGTATGACGGCGGCACGACCCTGGAGGACGCGGCGAACGCGGTGCACGCCAAGGCCACCATCTCCATGCAGGAATACTGCACGGAGAAGACCCTGCCCATGATCGCCGGTCATGGCCAGGACGTGGTCGCCCTCAACCACCCCGTGGGCGTGGGCGGCACCGACAAGTTCCTCATGGAGATCGCCCGCCTCACCGGCAAGGAGATCCCCGAGGAGCTGACCCGCGAGCGCGGCCGTCTCGTGGACGCTATCGCGGACTCTTCCGCGCACATCCACGGCAAGAAGTTCGCCATCTACGGCGATCCGGATCTGTGCCTGGGCCTCGCCGCGTTCCTGCTGGAGCTGGGCGCCGAGCCGACCCATGTGCTGGCCACCAACGGCACCAAGAAGTGGGCCGAGAAGGTTCAGGAACTGTTCGACTCTTCGCCGTTCGGCGCCAACTGCAAGGTCTATCCCGGCAAGGACCTGTGGCACATGCGCTCGCTCCTGTTCGTGGAGCCGGTGGATTTCATCATCGGCAACACCTACGGCAAGTATCTCGAGCGCGACACGGGCACCCCGCTGATCCGTATCGGCTTCCCGGTGTTCGACCGTCACCACCACCACCGCCGTCCGGTGTGGGGCTATCAGGGCGGCATGAACGTCCTGATCACGATCCTCGACAAGATCTTTGACGAGATCGACCGCAACACCAACGTGCCGGCCAAGACCGACTACTCGTTCGACATCATTCGTTGA

【0107】

配列番号５７：ニトロゲナーゼモリブデン－鉄タンパク質ベータ鎖ｎｉｆＫ＿２のアミノ酸配列

MPQNADNVLDHFELFRGPEYQQMLANKKKMFENPRDPAEVERVREWAKTPEYKELNFAREALTVNPAKACQPLGAVFVAVGFESTIPFVHGSQGCVAYYRSHLSRHFKEPSSCVSSSMTEDAAVFGGLNNMIDGLANTYNMYKPKMIAVSTTCMAEVIGDDLNAFIKTAKEKGSVPAEYDVPFAHTPAFVGSHVTGYDNALKGILEHFWDGKAGTAPKLERVPNEKINFIGGFDGYTVGNTREVKRIFEAFGADYTILADNSEVFDTPTDGEFRMYDGGTTLEDAANAVHAKATISMQEYCTEKTLPMIAGHGQDVVALNHPVGVGGTDKFLMEIARLTGKEIPEELTRERGRLVDAIADSSAHIHGKKFAIYGDPDLCLGLAAFLLELGAEPTHVLATNGTKKWAEKVQELFDSSPFGANCKVYPGKDLWHMRSLLFVEPVDFIIGNTYGKYLERDTGTPLIRIGFPVFDRHHHHRRPVWGYQGGMNVLITILDKIFDEIDRNTNVPAKTDYSFDIIR

【0108】

配列番号５８：ニトロゲナーゼ鉄タンパク質ｎｉｆＨのヌクレオチド配列

GTGGAGTCCGGTGGTCCTGAGCCGGGCGTGGGCTGCGCCGGCCGCGGCGTGATCACCTCCATCAACTTCCTGGAGGAGAACGGCGCCTACGAGGACATCGACTATGTGTCCTACGACGTGCTGGGCGACGTGGTGTGCGGCGGCTTCGCCATGCCCATCCGCGAGAACAAGGCGCAGGAAATCTACATCGTGATGTCCGGCGAGATGATGGCCATGTATGCGGCCAACAACATCTCCAAGGGCATCCTGAAGTATGCCAATTCCGGCGGCGTGCGCCTGGGCGGGCTGGTCTGCAACGAGCGCCAGACCGACAAGGAGCTGGAGCTGGCGGAGGCTCTGGCGAAGAAGCTCGGCACCGAGCTGATCTACTTCGTGCCGCGCGACAACATCGTGCAGCATGCCGAGCTGCGCCGCATGACAGTGATCGAGTATGCGCCCGATTCCGCCCAGGCCCAGCACTACCGGAACCTGGCCGAGAAGGTGCACGCCAACAAGGGCAACGGCATCATCCCGACCCCGATCACCATGGACGAGCTGGAAGACATGCTCATGGAGCACGGCATCATGAAGGCCGTGGACGAGAGCCAGATCGGCAAGACCGCCGCCGAGCTCGCCGTCTGA

【0109】

配列番号５９：ニトロゲナーゼ鉄タンパク質ｎｉｆＨのアミノ酸配列

MESGGPEPGVGCAGRGVITSINFLEENGAYEDIDYVSYDVLGDVVCGGFAMPIRENKAQEIYIVMSGEMMAMYAANNISKGILKYANSGGVRLGGLVCNERQTDKELELAEALAKKLGTELIYFVPRDNIVQHAELRRMTVIEYAPDSAQAQHYRNLAEKVHANKGNGIIPTPITMDELEDMLMEHGIMKAVDESQIGKTAAELAV

【0110】

（ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５及びその変異体、例えばＶＴＴ－Ｅ－２１３５９５株の遺伝子改変）

上記のように、更なる主要な態様では、本発明は、細菌株ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５又はその変異体の遺伝子改変のための一般的な方法、及びＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５株の遺伝子改変変異体に関する。これらの方法は、本書の実施例５に例示されている。
したがって、一態様では、本発明は、ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５細菌株の遺伝子改変のための方法であって、
ａ）ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５株の細菌、又はＶＴＴ－Ｅ－２１３５９５等のＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５細菌株を使用して生成された遺伝子改変株若しくは突然変異株を提供する工程と、
ｂ）前記細菌に核酸コンストラクトを導入する工程であって、前記核酸コンストラクトが、
ｉ）選択可能なマーカーをコードする配列と、
ｉｉ）任意に、前記細菌ゲノムに組み込まれる更なる配列と、
ｉｉｉ）前記細菌ゲノムとの相同組換えを可能にする隣接配列と、を含む、
工程と、及び
ｃ）選択可能なマーカーに基づいて、当該核酸コンストラクトが細菌ゲノムに組み込まれている遺伝子改変株を選択する工程、を含む、ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５細菌株の遺伝子改変のための方法に関する。
一実施形態では、核酸コンストラクトはプラスミドである。
いくつかの実施形態では、選択可能なマーカーは、カナマイシン耐性又はテトラサイクリン耐性等の抗生物質耐性を提供する遺伝子であり、工程ｃ）は、抗生物質の存在下で細菌を増殖させることによって行われる。
別の実施形態では、選択可能なマーカーは、蛍光タンパク質をコードする遺伝子であり、工程ｃ）は、蛍光に基づいて行われる。
隣接配列は、典型的には、核酸コンストラクトの部位特異的組込みを可能にするために細菌ゲノム中の配列と完全に同一である。
一実施形態では、本方法は、挿入によって遺伝子を破壊するために使用される。したがって、隣接配列は、核酸コンストラクトの組込み時に、細菌ゲノム中の内因性遺伝子が破壊され、したがって不活性化されるように選択される。
別の実施形態では、本方法は、異種遺伝子若しくは突然変異遺伝子等の遺伝子、又は遺伝子の複数のコピーを細菌ゲノムに挿入するために使用される。
更なる態様では、本発明は、遺伝子改変を含むＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５細菌株の変異体であって、当該遺伝子改変が、カナマイシン耐性又はテトラサイクリン耐性等の抗生物質耐性を提供する選択可能なマーカーによる細菌遺伝子の破壊を含む、遺伝子改変を含むＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５細菌株の変異体に関する。そのような変異体は、本書、例えば実施例５に例示されている。本発明はまた、そのような変異体を含む培養物、及びバイオマス生成のための方法に関し、当該方法は、そのような変異体を培養することを含む。本方法は、本明細書で上述した更なる特徴のいずれかを有し得る。

【0111】

（下流処理）
一実施形態では、本発明の方法は、培養中に生成されたバイオマスを回収する更なる工程を含む。バイオマスは、例えば、沈降（重力に基づく沈下）、濾過、遠心分離又は凝集によって回収され得る。凝集は、凝集剤の添加を必要とし得る。遠心分離は、例えば、連続流遠心分離機を使用して実施され得る。
一実施形態では、回収されたバイオマスはその後乾燥される。乾燥は、例えば、遠心分離、ドラム乾燥、蒸発、凍結乾燥、加熱、噴霧乾燥、真空乾燥及び／又は真空濾過を含む周知の方法を使用して行うことができる。乾燥バイオマスは、その後、製品、例えば食品若しくは飼料製品、又は飼料若しくは食品原料に使用することができる。
別の実施形態では、回収したバイオマスの細胞を溶解する。溶解物は、いくつかの実施形態では、不溶性画分と可溶性画分とに分離され得、これらのいずれか又は両方は、その後濃縮又は乾燥され得、そしてその後、製品、例えば食品又は飼料製品に使用され得る。

【0112】

一実施形態では、バイオマスが回収され、当該バイオマスからタンパク質が単離され、タンパク質画分及び非タンパク質成分を含む画分が得られる。したがって、一実施形態では、本方法は、タンパク質の生成のためのものであり、そのＶＴＴ－Ｅ－２１３５９５株を培養する工程、続いてバイオマスを回収する工程、及び当該バイオマスからタンパク質を単離する更なる工程を含む。
別の実施形態では、本方法は、タンパク質の生成のためのものであり、エネルギー源としての水素及び無機炭素源を用いて連続培養で変異型化学合成独立栄養細菌株、例えばキサントバクター属を培養することであって、無機炭素源が二酸化炭素を含む、培養することを含み、バイオマスを回収する工程、及び当該バイオマスからタンパク質を単離する更なる工程が続く。
タンパク質単離の方法に応じて、得られた画分は、より純粋であってもよく、又はより純粋でなくてもよい。したがって、「タンパク質画分」という用語は、タンパク質が濃縮された画分を意味する。タンパク質画分は、依然として有意な量の他の成分を含み得、また有意な量のタンパク質が「非タンパク質成分を含む画分」になり得る。
タンパク質の単離は、任意の適切な方法を使用して実施され得る。例えば、一実施形態では、タンパク質は、細胞を機械的に破壊し、１つ以上の濾過工程、例えば孔径が減少する複数のフィルターによる連続濾過によって細胞残屑からタンパク質を分離することによって単離される。機械的破壊は、任意の適切な方法、例えばボールミル粉砕、超音波処理、均質化、高圧均質化、機械的剪断等を使用して行うことができる。
得られた濾過されたタンパク質画分はタンパク質が濃縮されるが、更に他のより小さな成分も含有する。タンパク質は、任意に、任意の適切な方法を使用して、この画分から更に精製されてもよい。
別の実施形態では、エタノール抽出とそれに続く１つ以上の濾過工程を行うことによってタンパク質画分を単離する。そのような方法は、例えば、ダイズタンパク質の調製から知られている（例えば、Ｂｅｒｋ ＦＡＯ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．９７（１９９２）による “Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｄｉｂｌｅ ｆｌｏｕｒｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｒｏｍ ｓｏｙｂｅａｎｓ”の第５章”Ｓｏｙｂｅａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ”を参照されたい）。得られたタンパク質画分は、タンパク質が濃縮されるが、依然として他の成分も含有する。タンパク質は、任意に、任意の適切な方法を使用して、この画分から更に精製されてもよい。
一実施形態では、本発明の方法は、本発明の方法から得られたタンパク質画分を加水分解してアミノ酸及び小型ペプチドを得る更なる工程を含む。

【0113】

本発明の方法の一実施形態では、本方法は、当該バイオマス、当該タンパク質画分又は非タンパク質成分を含む当該画分から食品又は飼料製品を製造する更なる工程を含む。当該更なる工程は、当該バイオマス、タンパク質画分又は非タンパク質成分を含む画分を、食品又は飼料製品の製造中に添加することによって、食品又は飼料製品に組み込むことを単に含んでいてもよい。他の実施形態では、バイオマス又はその画分の更なる精製又は修飾は、食品又は飼料製品への組込みの過程で行われる。
更なる態様では、本発明は、本発明による方法によって得られる又は得ることができる、バイオマス、タンパク質、又は非タンパク質成分等の製品に関する。
一実施形態では、本発明の方法から得られる製品は、４０％を超えるタンパク質、例えば４０％～９９％の間のタンパク質、例えば４０％～９０％の間のタンパク質、例えば４０％～６０％の間のタンパク質を含む。
特定の実施形態では、製品は、２５％～７５％の間のタンパク質、０％～２０％の間の脂質及び５％～４０％の間の炭水化物を含む。更なる実施形態では、製品は、４０％～６０％の間のタンパク質、０％～１５％の間の脂質及び１０％～２５％の間の炭水化物を含む。なお更なる実施形態では、本発明の方法から得られる生成物は、４５％～５５％の間のタンパク質、５％～１０％の間の脂質及び１０％～２０％の間の炭水化物を含む。

【0114】

上述のように、更なる態様における本発明は、本発明による方法によって得られる又は得ることができる食品又は飼料製品に関する。本書で使用される場合、「食品」及び「飼料」という用語は、加工食品等の従来の食品及び飼料製品だけでなく、食品及び飼料サプリメント、例えばプロテインバー、粉末又はシェイク、肉代用品、食品原料、プロバイオティクス、プレバイオティクス、栄養補助食品等の関連製品も含むことを意図している。特定の実施形態では、当該バイオマス、当該タンパク質画分又は非タンパク質成分を含む当該画分は、ベジタリアン又はビーガン食品の製造に利用される。
更なる態様では、本発明は、ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５株の細菌又はその変異体、本明細書に記載の変異体等、例えばＶＴＴ Ｅ－２１３５９５株を使用した医薬品、生物活性化合物、栄養補助食品、酸化防止剤及び／又はビタミンの製造に関する。生物活性化合物、栄養補助食品、酸化防止剤、ビタミンは、当技術分野で公知の方法を使用してバイオマスから抽出することができる。
したがって、更なる実施形態では、本発明は、生物活性化合物、栄養補助食品、抗酸化剤、ビタミン等の化合物を、当該バイオマス又は培養液から単離、例えば抽出する更なる工程を含む、本書に記載のバイオマスの生成のための方法に関する。更なる実施形態では、本発明は、医薬品又は栄養補助食品としてのこれらの化合物の使用に関する。一実施形態では、抽出された化合物はベータ－カロテン（プロビタミンＡ）である。別の実施形態では、抽出された化合物はユビキノンＱ１０である。別の実施形態では、抽出された化合物は、ヘム鉄、例えばチトクロムＣの形態である。別の実施形態では、抽出された化合物はビタミンＢ１２である。
本発明を、以下の非限定的な例を用いて更に説明する。

【実施例】

【0115】

実施例１ 化学合成独立栄養増殖が可能な細菌株の単離
土壌及び海水を含有する５０ｍＬの試料を、フィンランドのナーンタリのバルト海の海岸から滅菌ファルコンチューブに収集した。滅菌三角フラスコ中で、土壌試料の一部を１０ｍＬのミネラル培地と混合した。培地は、水道水中で調製した１ｇ／Ｌ ＮＨ_４ＯＨ、０．２３ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．２９ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、０．００５ｇ／Ｌ ＮａＶＯ_３・Ｈ_２Ｏ、０．２ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ ＣａＳＯ_４、０．０００１５ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、０．００５ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ_４、０．０００５ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．００１５ｇ／Ｌ Ｈ_３ＢＯ_３、０．００１ｇ／Ｌ ＣｏＳＯ_４、０．００００５ｇ／Ｌ ＣｕＳＯ_４及び０．０００１ｇ／Ｌ ＮｉＳＯ_４からなっている。
土壌及び培地の懸濁液を、ガス混合物：１５０ｍＬ／分のＮ_２、１８ｍＬ／分のＨ_２、３ｍＬ／分のＯ_２及び６ｍＬ／分のＣＯ_２で連続的にフラッシュした密閉スチールボックス内の＋３０℃の温度の振盪インキュベータ内でインキュベートした。１ｍＬの懸濁液を採取し、これを滅菌状態で三角フラスコ内の９ｍＬの培地に添加し、次いでインキュベーションボックスに戻すことによって、培養を７日間隔でリフレッシュした。４回目の希釈後、懸濁液中に目立った土は残っていなかった。バイオリアクタ培養用のバイオマスを増殖させるために、細胞懸濁液の体積を１００ｍＬに増加させた。懸濁液の光学密度（ＯＤ_６００）は、１５容器２００ｍＬ並列バイオリアクタシステム（Ｍｅｄｉｃｅｌ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ、Ｍｅｄｉｃｅｌ Ｏｙ、フィンランド）中の１９０ｍＬのミネラル培地に接種した場合、１．５３であった。培養条件は、８００ｒｐｍの撹拌、＋３０℃の温度であり、ｐＨを６．８に設定し、１Ｍ ＮａＯＨで制御した。１４ｍＬ／分のＨ_２、３ｍＬ／分のＯ_２及び６ｍＬ／分のＣＯ_２からなるガス混合物を用いてスパージャを通してガスを供給した。
リアクタのヘッドスペースを３００ｍＬ／分の空気でフラッシュした。連続培養に６ｍＬ／時のミネラル培地を供給し、容量を２００ｍＬで一定に保ちながらキャピラリーを介して細胞懸濁液をリアクタから取り出した。リアクタから取り出した細胞懸濁液を＋４℃で保存した。毎日自動的にバイオリアクタから試料を採取し、６００ｎｍでの吸光度を測定して増殖を監視した。４９８時間のバイオリアクタ培養後、試料を無菌的に取り出し、懸濁液を希釈し、上記ミネラル及び２％細菌寒天を含有する寒天ミネラル培地プレートに播種した。プレートを、三角フラスコについて上記したのと同じ条件でインキュベートした。
次いで、コロニーを寒天プレートから採取し、１つのコロニー中の１つの生物を単離するために新しい寒天プレートにストリークした。これを２回繰り返した。単一コロニーを採取し、９６ウェルマイクロタイタープレート中の２００μＬの培地に懸濁した。懸濁液を＋３０℃の温度でインキュベートし、ＥｎｚｙＳｃｒｅｅｎ気密ボックス内で６２５ｒｐｍで振盪し、これを１５０ｍＬ／分のＮ_２、１８ｍＬ／分のＨ_２、３ｍＬ／分のＯ_２及び６ｍＬ／分のＣＯ_２で連続的にフラッシュした。１つのウェルからの懸濁液を三角フラスコに移し、新鮮な培地を補充した。バイオリアクタ培養を行うのに十分なバイオマスが存在するまで、体積を増加させた。生物をＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５としてＶＴＴ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託した。

【0116】

試料の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列決定は、試料が１つの生物のみを含有することを実証した。同じ試料をＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ配列決定に使用して、１×１５０ｂｐのメタゲノムショットガン配列を得た。Ｕｎｉｃｙｃｌｅｒ（Ｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ，２０１７ ＰＬｏＳ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ １３：ｅ１００５５９５）を使用して、１０１個のコンティグからなるメタゲノム配列に対してデノボアセンブリ（ｄｅ ｎｏｖｏ ａｓｓｅｍｂｌｙ）を作製した。全ゲノム長は４，８４６，７３９ｂｐであり、ＧＣ含有量は６７．９％であった。
遺伝子予測及び機能的注釈を、Ｐｒｏｋｋａ（Ｓｅｅｍａｎｎ，２０１４ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０：２０６８）を使用して行った。ゲノムアノテーションにより、４，４２９個の遺伝子が生成された。Ｒｏａｒｙパンゲノムアラインメント（Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ，２０１５ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３１：３６９１）は、キサントバクター種間でＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５をグループ化した。したがって、この株はキサントバクターｓｐ．として同定され、最も近いゲノムはキサントバクター・タゲティディス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ ｔａｇｅｔｉｄｉｓ）であった。オルソロガス断片（ＯｒｔｈｏＡＮＩ）のみを考慮した平均ヌクレオチド同一性のアラインメントに基づく計算（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，２０１６ Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６６：１１００）は、キサントバクター・タゲティディス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ ｔａｇｅｔｉｄｉｓ）（ＡＴＣＣ ７００３１４；ＧＣＦ＿００３６６７４４５．１）に対して８０．４％の最良の一致を与えたが、提案された種境界カットオフは９５～９６％である（例えば、Ｃｈｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８ Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，６８：４６１－４６６を参照）。
キサントバクター・オートトロフィカスＰｙ２は７９．６％の一致を与えたが、キサントバクター ｓｐ．９１の場合の一致は７９．０％であった。したがって、ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５として寄託された分離細菌株は、系統：プロテオバクテリア；クラス：アルファプロテオバクテリア；及び目：リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）に属すると結論付けることができた。最も可能性の高い科はキサントバクター科であり、キサントバクター属である。ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５細菌株は、いずれの既知の種にも明確に割り当てることができなかった。

【0117】

推定抗菌剤耐性遺伝子の検索を行った。ＡＢＲｉｃａｔｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｔｓｅｅｍａｎｎ／ａｂｒｉｃａｔｅ）ツールを用い、ｂｌａｓｔｎ又はｂｌａｓｔｐを使用して、Ａｒｇ－Ａｎｎｏｔ、ＮＣＢＩ、ＲｅｓＦｉｎｄｅｒ、ｅｃＯＨ、Ｍｅｇａｒｅｓ及びＶＦＤＢデータベースに対してゲノムを検索した。ヌクレオチド及びタンパク質レベルの両方で、同一性及びカバレッジの両方に対して５０％の閾値を設定した。２つの推定抗菌剤耐性遺伝子のみが同定された。これらの２つの遺伝子は、抗生物質耐性に関連するアミノ酸変化を含有せず、したがって耐性表現型は予想されない。

【0118】

実施例２ 分離細菌株のパイロット培養及び分析
ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５として寄託された分離細菌株を、従来の２００リットル撹拌タンクバイオリアクタ（ＭＰＦ－Ｕ，Ｍａｒｕｂｉｓｈｉ Ｌｔｄ、日本）で培養した。混合は、４００ｒｐｍで回転するラシュトン型インペラを用いて行った。培養中の温度を＋３０℃に維持した。ソフトウェア制御により８Ｍ ＮａＯＨ又は３．６Ｍ Ｈ_３ＰＯ_４を添加することによって、ｐＨを６．８±０．２に維持した。
培養培地は、水道水中で調製した１ｇ／Ｌ ＮＨ_４ＯＨ、０．２３ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．２９ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、０．００５ｇ／Ｌ ＮａＶＯ_３・Ｈ_２Ｏ、０．２ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ ＣａＳＯ_４、０．０００１５ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、０．００５ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ_４、０．０００５ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．００１５ｇ／Ｌ Ｈ_３ＢＯ_３、０．００１ｇ／Ｌ ＣｏＳＯ_４、０．００００５ｇ／Ｌ ＣｕＳＯ_４及び０．０００１ｇ／Ｌ ＮｉＳＯ_４を含んでいた。
１．８～１０．５Ｌ／分の水素ガス、０．６～２．５Ｌ／分の酸素ガス及び１．８～５Ｌ／分の二酸化炭素ガスを含有する混合物を、エネルギー及び炭素の主な供給源として常に供給した。ガス混合物の組成を調整することにより、溶存酸素レベルを７．２±０．５％に維持した。培養のための接種材料を実施例１に記載のように調製した。手動で試料を採取し、６００ｎｍでの吸光度（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ２１００ ｐｒｏ ＵＶ／可視分光光度計、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｌｔｄ．、英国）を測定することによって細胞密度を光学密度として分析することにより、及び１０５℃で一晩オーブンで乾燥させることによって細胞乾燥重量（ＣＤＷ）を測定することにより、増殖を監視した。ｉｎ ｓｉｔｕ吸光度プローブ（Ｔｒｕｃｅｌｌ ２、Ｆｉｎｅｓｓｅ Ｌｔｄ．、ＵＳＡ）を用いて光学密度も監視した。培養の増殖曲線を図１に示す。
バッチ相での最大増殖速度は０．０６ｈ^－１であった。最大細胞密度は９２時間で４．５ｇ＿ＣＤＷ／Ｌであった。９２時間の培養後、０．０１ｈ^－１の希釈率で上記のような新鮮な培養培地の供給を開始した。連続供給の間、細胞密度は平均２．９ｇ＿ＣＤＷ／Ｌであった。培養液は常に冷却された（＋１０℃）タンクに回収し、そこから３００リットルバッチで連続型遠心分離機（ＢＴＰＸ－２０５、Ａｌｆａ－Ｌａｖａｌ ＡＢ、スウェーデン）に供給した。セパレータから収集した細胞含有スラリーを、大気圧二重ドラム乾燥機（Ｂｕｆｌｏｖａｋ ６ｘ８ ＡＤＤＤ、Ｈｅｂｅｌｅｒ ｐｒｏｃｅｓｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｌｌｃ．、米国）に供給し、４バールの蒸気及び３．５ｒｐｍで回転するドラムで加熱した。これにより、約９６％の乾物含量を有する乾燥細胞粉末が得られた。
乾燥細胞粉末の分析結果を、一般組成については表１、アミノ酸組成については表２、脂肪酸組成については表３、ビタミン含有量については表４に示す。分析は、乾燥細胞粉末が全ての必須アミノ酸を含む高いタンパク質含有量を有することを実証する。それはまた、飽和脂肪酸よりも不飽和脂肪酸を多く含有し、多くのＢ群ビタミンを含有する。ペプチドグリカン含有量はわずか０．００２ｍｇ／ｇ＿ＣＤＷであり、リポ多糖含有量は０．０１ｍｇ／ｇ＿ＣＤＷであった。これらの濃度は可能な限り小さいことが有益であろう。比較すると、同時に分析した市販の乳酸菌調製物では、ペプチドグリカン含有量は０．２４４ｍｇ／ｇ＿ＤＷであり、リポ多糖含有量は０．０１５ｍｇ／ｇ＿ＤＷであった。細胞毒性及び遺伝毒性アッセイを、培養の上清試料を使用して行った。ＨｅｐＧ２又はＨｅＬａ２２９ヒト細胞株に対する細胞傷害性は観察されなかった。大腸菌ＷＰ２ ｔｒｐ－又はＣＭ８７１ ｕｖｒＡ ｒｅｃＡ ｌｅｘＡ株に対する遺伝毒性は観察されなかった。

【0119】

【表1】

表１ ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５として寄託された分離細菌株の乾燥細胞粉末の分析結果

【0120】

【表2】

表２．ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５として寄託された分離細菌株の乾燥細胞粉末のアミノ酸組成

【0121】

【表3】

表３ ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５として寄託された分離細菌株の乾燥細胞粉末の脂肪酸組成。

【0122】

【表4】

表４ ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５として寄託された分離細菌株の乾燥細胞粉末のビタミン含有量。

【0123】

実施例３ 異なる窒素源での分離細菌株の培養。
ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５として寄託された分離細菌株を、１５容器並列バイオリアクタシステムで２００ｍＬ容量（Ｍｅｄｉｃｅｌ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ、Ｍｅｄｉｃｅｌ Ｏｙ、フィンランド）で培養した。混合は、８００ｒｐｍで回転するラシュトン型インペラを用いて行った。培養中の温度を＋３０℃に維持した。１Ｍ ＮａＯＨを添加することによってｐＨを６．８に維持した。培養培地は、水道水中で調製した、０．２３ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．２９ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、０．００５ｇ／Ｌ ＮａＶＯ_３・Ｈ_２Ｏ、０．２ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ ＣａＳＯ_４、０．０００１５ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、０．００５ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ_４、０．０００５ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．００１５ｇ／Ｌ Ｈ_３ＢＯ_３、０．００１ｇ／Ｌ ＣｏＳＯ_４、０．００００５ｇ／Ｌ ＣｕＳＯ_４及び０．０００１ｇ／Ｌ ＮｉＳＯ_４を含んでいた。
更に、窒素源を、４つの培養物が１８．７ｍＭのＮＨ_４ＯＨを含有し、４つの培養物が９．３４ｍＭの尿素（ＯＣ（ＮＨ_２）_２）を含有し、４つの培養物が１８．７ｍＭの硝酸カリウム（ＫＮＯ_３）を含有するように培養物において変化させ、３つの培養物を培地中に窒素源なしで放置した。２２ｍＬ／分の水素ガス、３．２ｍＬ／分の空気及び６．４ｍＬ／分の二酸化炭素ガスを含有する混合物を、エネルギー及び炭素の主な供給源として常に供給した。したがって、空気を用いて、全ての栽培に窒素ガスも供給した。試料を自動的に採取し、６００ｎｍでの吸光度（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ２１００ ｐｒｏ ＵＶ／可視分光光度計、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｌｔｄ．、英国）を測定することによって細胞密度を光学密度として分析することにより、増殖を監視した。
培養の増殖曲線を図２に示す。アンモニア及び尿素での増殖は同等であった。硝酸塩又は窒素ガスでの増殖は、アンモニア又は尿素での増殖よりも明らかに遅かった。培養の終わりに向かって、硝酸塩での増殖は、唯一の窒素源としての窒素ガスでの増殖よりも良好であった。それにもかかわらず、窒素ガスが唯一の窒素源であった培養でも増殖があり、ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５として寄託された分離細菌株が窒素固定が可能であることを実証した。

【0124】

実施例４ 抗生物質感受性の特性評価
ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５として寄託された分離細菌株について、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、シプロフロキサシン、コリスチン及びホスホマイシンの抗生物質感受性を、ＣＬＳＩ Ｍ０７－Ａ１１１規格（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｈａｔ ｇｒｏｗ ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ，１１ｔｈ ｅｄ．ＣＬＳＩ ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍ０７，２０１８）に従い、アンピシリン、シプロフロキサシン及びコリスチンについては手製の微量希釈プレートで、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン及びテトラサイクリンについてはブロス微量希釈法を使用してＶｅｔＭＩＣ Ｌａｃｔ－１プレート（ＳＶＡ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ウプサラ、スウェーデン）で、並びにホスホマイシンについては寒天希釈法を使用して、陽イオン調整ミューラーヒントンブロス培地（ＬａｂＭ、ＬＡＢ１１４、陽イオンＭｇ^２＋及びＣａ^２＋を別々に添加）を使用して、＋３５±２℃で４８±１時間、好気的条件で分析した。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ ２５９２２を品質管理株として使用し、これを＋３５±２℃で１８±２時間好気的条件でインキュベートした。株の抗生物質感受性の結果を表５に示す。単離細菌株は、一般に抗生物質に感受性があることが分かった。ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン及びテトラサイクリンについては、ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）値は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ ２５９２２より低いか又は同等であったが、アンピシリン、シプロフロキサシン、コリスチン及びホスホマイシンについてはＭＩＣ値はＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５の方が高かった。

【0125】

【表5】

表５．ＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５株及び大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２に対する抗生物質の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ、μｇ／ｍｌ）値

【0126】

実施例５ ｐｈａＣノックアウト株の構築

液体１Ｌ当たりの培地組成

ＤＳＭ８１－ＬＯ４（ＤＳＭ）
ＫＨ_２ＰＯ_４ ２．３ｇ
Ｎａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ２．９ｇ
Ｎａ_２ＳＯ_４ ５．４５ｇ
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ^＊ １．１９ｇ
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ
ＣａＳＯ_４・２Ｈ_２Ｏ １１．７ｍｇ
ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ ４．４ｍｇ
ＮａＶＯ_３ ５ｍｇ
ＮａＨＣＯ_３ ０．５ｇ
クエン酸アンモニウム鉄（ＩＩＩ） ５ｍｇ
ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ｍｇ
Ｈ_３ＢＯ_３ １．５ｍｇ
ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ １ｍｇ
ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ５０μｇ
ＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ０．１ｍｇ
Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．１５ｍｇ
リボフラビン ０．５ｍｇ
チアミン－ＨＣｌ・２Ｈ_２Ｏ ２．５ｍｇ
ニコチン酸 ２．５ｍｇ
ピリドキシン－ＨＣｌ ２．５ｍｇ
Ｃａ－パントテン酸 ２．５ｍｇ
ビオチン ５μｇ
葉酸 １０μｇ
ビタミンＢ_１２ ５０μｇ
＊ＧＣ－ＭＳ分析用に変更

【0127】

溶原ブロス（ＬＢ）
酵母抽出物 ５ｇ
トリプトン １０ｇ
ＮａＣｌ １０ｇ
寒天（プレート用） １５ｇ

【0128】

超最適ブロス（ＳＯＢ）
トリプトン ２０ｇ
酵母抽出物 ５ｇ
ＮａＣｌ ０．５８ｇ
ＫＣｌ ０．１８ｇ
ＭｇＣｌ_２ ０．９５ｇ
ＭｇＳＯ_４ １．２０ｇ

【0129】

エタノールを含む超最適ブロス（ＳＯＢＥ）
エタノール５．８ｍＬ／ＳＯＢ １Ｌ

【0130】

トリプシンダイズ寒天（ＴＳＡ）
ＢＢＬ（商標）Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ（商標）ダイズ寒天（ＢＤ）４０ｇ

【0131】

培養方法
従属栄養増殖条件における全てのＳｏＦ１培養物を、１００ｍＭのエタノールを補充した１０ｍＬ体積の超最適ブロス（ＳＯＢＥ）中、３０℃で２２０ｒｐｍの振盪で培養した。独立栄養条件での全てのＳｏＦ１培養物を、１３６ｒｐｍで振盪しながら、従属栄養増殖条件と同じ温度及び体積でＤＳＭ８１－ＬＯ４培地（ＤＳＭ）中で培養した。独立栄養条件におけるガス組成は以下の通りであった：４４％ＣＯ_２、２６％Ｎ_２、２２％Ｈ_２、７％Ｏ_２、及び１％の他のガス。

【0132】

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株
使用した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株及びそれらの関連する特徴を表６に要約する。全ての株を溶原性ブロス（ＬＢ）上で増殖させた。抗生物質を以下の濃度で使用した：１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ＡＭＰ）、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン（ＫＡＮ）及び１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（ＴＥＴ）。

【0133】

【表6】

表６ 使用した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株

【0134】

プラスミド構築
実施例１に記載されるＶＴＴ－Ｅ－１９３５８５株の細菌ゲノムの配列決定により、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）シンターゼをコードする他のキサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐｐ．から見出されるｐｈａＣ遺伝子と相同性を有する遺伝子ｐｈａＣ１（配列番号６０、配列番号６２に示されるタンパク質をコードする）及びｐｈａＣ２（配列番号６１、配列番号６３に示されるタンパク質をコードする）を同定した。

【0135】

ＳｏＦ１のゲノム中のｐｈａＣ１及びｐｈａＣ２遺伝子の欠失を標的とする２つのプラスミドを構築した（表７）。ｐｈａＣ１及びｐｈａＣ２の隣接する１０００ｂｐｓの左（ＬＨＡ）及び右（ＲＨＡ）の相同アームを、オリゴ（８オリゴ）を含むＳｏＦ１のゲノムＤＮＡから増幅した。両方のプラスミドを、ＧｉｂｓｏｎアセンブリによりｐＵＣ５７から構築した。カナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔ）及び可動領域（ｍｏｂ）配列は、Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇｈ ｅｔ ａｌ．１９９３ Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７５：６０９７－６１０４に記載されているプラスミドで使用されるものと同じであった。

【0136】

【表7】

表７ 構築されたプラスミドの概要

【0137】

ノックアウト株構築

プラスミドをコンジュゲーション又はエレクトロポレーションによりＳｏＦ１に移した。改変ＳｏＦ１株の選択に使用した抗生物質濃度は、２０μｇ／ｍＬのＫＡＮ及び１０μｇ／ｍＬのＴＥＴであった。

【0138】

コンジュゲーションのために、ＳｏＦ１の液体培養物（ＬＣ）を上記のような独立栄養条件で２～３日間増殖させて、０．７～１のＯＤに達した。プラスミドあり及びなしの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７－１及びＪＭ１０９（ＤＥ３）のオーバーナイト（Ｏ／Ｎ）ＬＣを、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で増殖させた。翌日、新しいＬＣをＯ／Ｎ培養物から接種し、指数期（ＯＤ ０．３～０．６）まで増殖させた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を５９００ｒｐｍ ３０秒で遠心分離し、洗浄し、１体積の０．９％ＮａＣｌに再懸濁した。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びＳｏＦ１細胞をＯＤ比１：１５で混合し、ＤＳＭ培地を１ｍＬまで添加した。ＳｏＦ１と混合したプラスミドなしのＳ１７－１を陰性対照として使用し、Ｓ１７－１含有プラスミドを有するＪＭ１０９（ＤＥ３）を陽性対照として使用した。混合物を０．２２μｍ ＧＶのＤｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）メンブレンフィルター（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、米国）で真空濾過した。フィルターを予熱したＴＳＡプレート上に置き、細胞を寒天とは反対側に向け、独立栄養条件でＯ／Ｎインキュベートした。翌日、フィルターを１ｍＬの０．９％ ＮａＣｌで洗浄し、ボルテックスし、４０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、フィルターを除去した後、細胞を再懸濁した。細胞を連続希釈液で選択プレートに播種し、適切な条件で増殖させた。コンジュゲートＪＭ１０９（ＤＥ３）対照を、選択のために４０μｇ／ｍＬのナリジクス酸を含有するＴＳＡプレートに播種し、３７℃ Ｏ／Ｎでインキュベートした。コンジュゲートＳｏＦ１培養物を、ＫＡＮを含有するＤＳＭプレートに播種し、独立栄養条件でおよそ１週間インキュベートした。
ＳｏＦ１プレート上にコロニーが出現した後、それらを新鮮なＤＳＭ ＫＡＮプレートに再適用し、独立栄養条件で更に１週間インキュベートした。これらのプレートからの単一コロニーをＴＳＡプレートにタップし、従属栄養条件で３０℃で増殖させた。ＴＳＡプレート上での増殖が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖をもたらす場合、コロニーを選択的ＤＳＭプレートに再度適用した。

【0139】

エレクトロポレーションのため、ＳｏＦ１のＬＣを独立栄養条件で２～３日間培養して０．７～１．５のＯＤに達した。細胞をＦａｌｃｏｎチューブに形質転換し、氷上で１５～３０分間冷却した。細胞を４℃、４０００ｒｐｍで５～１０分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを１体積の氷冷二重蒸留Ｈ_２Ｏに再懸濁した。遠心分離を繰り返し、上清を廃棄した。１体積の氷冷１０％グリセロールで洗浄を繰り返した。細胞を氷冷１０％グリセロールに再懸濁して、約２・１０^１０細胞／ｍＬの濃度にした。細胞を電気形質転換に直ちに使用した。４０μＬの細胞を１μＬのプラスミドと混合し、氷上で１０分間インキュベートした。細胞を氷上でエレクトロポレーションキュベットに形質転換した。キュベットを、２５μＶ静電容量及び４００Ω又は６００Ωの抵抗を有する２．５ｋＶの単一の電気パルスに供した。予め温めた（３０℃）１ｍＬのＳＯＢＥを直ちに添加し、溶液をファルコンチューブに移し、独立栄養条件でＯ／Ｎインキュベートした。インキュベーション後、細胞を複数の希釈液を含むＴＳＡ選択プレートに播種し、従属栄養条件でインキュベートした。

【0140】

コンジュゲーション又はエレクトロポレーションによる形質転換の後、成功した形質転換体をコロニーＰＣＲでスクリーニングし、最終濃度３％のジメチルスルホキシドを標準的なＰＣＲ混合物に添加した。構築したＳｏＦ１株を表８に要約する。

【0141】

【表8】

表８ 構築したＳｏＦ１変異株。

【0142】

ＰＨＢ含有量分析
野生型（ＷＴ）株ＳｏＦ１及びノックアウト株ＳｏＦ１－２．０のＰＨＢ含有量を、ガスクロマトグラフィー－質量分析（ＧＣ－ＭＳ）で分析した。両株を、様々な窒素濃度（１８．０、１３．５、９．０及び４．５ｍＭの窒素）の５ｍＬの培養体積において上記の独立栄養条件、及び従属栄養条件で増殖させた。独立栄養条件で増殖させた培養物から培養物を接種して、０．１の出発ＯＤを得た。最も早くて接種から１週間後に分析を行った。
各試料１～３ｍＬを遠心分離し、ペレットを－２０℃で保存した。ペレットを解凍し、再蒸留Ｈ_２Ｏで２回洗浄し、２４～４８時間凍結乾燥させた。各試料１０ｍｇをクロロホルム１ｍＬ、硫酸１５０μＬ、内部標準（３－ヒドロキシ酪酸）２０μＬ、メタノール８３０μＬを含む溶液中で１００℃で１４０分間加熱してメタノリシスを行った。３－ヒドロキシ酪酸を参照試料と同様に処理した。試料を室温まで冷却した後、水０．５ｍＬで水溶性粒子を除去した。ガスクロマトグラフィー系（７８９０、Ａｇｉｌｅｎｔ）及びＨＰ－ＦＦＡＰカラム（１９０９１ Ｆ－１０２、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してクロロホルム相を分析した。

【0143】

結果
ＧＣ－ＭＳによれば、ＰＨＢはＳｏＦ１－２．０株ではほとんど生成されなかったが、ＷＴ ＳｏＦ１では、独立栄養条件で増殖させた場合、ＰＨＢ乾燥含量は１５～３０％であった（表９）。従属栄養条件で増殖させた場合、ＳｏＦ１又はＳｏＦ１－２．０ではＰＨＢはほとんど生成されなかった

【0144】

【表9】

表９．ＧＣ－ＭＳを介して決定された、独立栄養条件における異なる窒素濃度で独立栄養条件で、及び従属栄養条件（ＳＯＢＥ）で増殖させたＷＴ ＳｏＦ１及びＳｏＦ１－２．０のＰＨＢ含有量。

【0145】

ＳｏＦ１及びＳｏＦ１－２．０の独立栄養増殖曲線を図３に示す。ＳｏＦ１－２．０は、ＳｏＦ１と比較して増殖速度がわずかに低い。

【0146】

ｐｈａＣ１ ＤＮＡ配列（配列番号６０）：

ATGTCCGCAGCCGAGGAAACGTCCACGCACGCTGAATTGAGGCTCCCGCAGGATGGGGTGGAGCATGACGTCGCGGCCGCCGAGGCCGCGGTGGACCGGTCCGCCGGGGAGCCGTCGGGAACGCAGGCGTCCGCCGCGCCCGCCGAGGCGGCGCCGTCTTCCGCTCCTGTTTCCGCTGCTGCCGGAGAAACGCAGCCACAGGACGATACCCCGCCGCAGGACCCGTCTTCCCTGTCGGACGGTCCAGGCCTGTCGCCGCCCGTGACCCAGCCCGGCGCGGCGTCCGGCGACTTCGGCGGGCCCGAGGCCATGGGCGACGCCTTCATGCCGCCTGTGCCGGAAGAGCCCATGGAGGGGATGGCCCCCGCGCCGGCAATCTCCGCGGCGCCCGCCTCGGTGCCGTCTGCCGGCTGGCCGGAGGATGCGCCTTCGGCACTGCTCGATGCGGTGGATGCGTCCGGGGACCTGCCGGCTGCCGCGGAGGGCGCGGCCACGGCGCCGGAGCCCATTTTCCGCGAGCTGCCCATGACGGCGGCGCCCGCCGCACCTGCCATCGCGAACATTCTCGAGCCGGTGGCCGAGGCTCTGTCCGCGCTCGGGGCGGTGGCCGTCTCCCGGCCCCAGGTCCAGCGCGAATTCCGCGCGGCGCCCGAACACCCCCCCATGCCCAGGATGGCGCCCCCTCAGGCGGCGCCAGAACCGGCCCCTGCCGTTCCGCCCAAACCTGAAGCTGCCAAACCTGAAGCTGCCAAACCTGAAGCCGCCAAGCCTGAAGCTGCCAAGCCTGAAGTTGCCAAGCCGGACGCCGCCGCGCCGGACGCCGCGAAATCTTCGGGCAAGGCGGAGCGTCCGTCCGGCGCCGGGGACGGCTCTGGAACGTCGGGCGTGAACATGGAGGCCTTCTCCCGCAACCTCGCCCGTCTGGTGGAAGAGGGCGGCAAGGCCATGGCCGCCTATCTGAGCCCACGGGAGCAGGGCAAGACCGACGATCTCGCCGATGACATCGCCGATGCCATGAAGACCGTGGGCCAGGTGGTGGAATACTGGGTCGCCGATCCCCAGCGCACGGTGGAGGCGCAGTCCCGCCTCATGGGCGGCTATCTCTCGGTCTGGGCCAACACCCTGAAGCGCCTGGCAGGCGAGGAGGCCACGCCGGTGGCCGCCCCCGACCCGAAGGATGCCCGCTTCAAGGATGCCGGCTGGAACGACAGCCCCATGTTCGATGCCCTCAAGCAGGCCTATCTGGTCACCTCGGACTGGGCGCAGAACATGGTGGACGAGGCCAAGGGCCTCGATCCCCACACCAAGCACAAGGCGGAGTTCCTGGTGCGGCAGATCGCCAACGCCATCTCGCCCTCCAACTTCGTCCTCACCAATCCCGAGCTCATCCGCGAGACCCTGCACTCGTCGGGCGAGAATCTGGTGAAGGGCATGCAGAACCTCACCGCGGATCTGATGGCGGGGCAGGGCACGCTGAAGATCCGCCAGACGGATCTTTCCGCCTTCGAGGTGGGCCGCAACCTCGCCACCACGCCGGGCAAGGTGATCTTCGAAAACGAGCTGATGCAGCTCATCCAGTACGAGCCGACCACCGAGACGGTGAAGAAGACGCCGGTGCTCATCGTCCCGCCCTGGATCAACAAGTTCTACATCCTCGACCTGACGGCGGAAAAATCCTTGATCAAGTGGCTGGTGAGCCAGGGACTGACGGTCTTCACCATCTCCTGGGTCAATCCCGACGGGCGCCTCGCCGCCAAGGGCTTCGACGATTACATGCGCGACGGCATCATGGCCGCCCTCGACGCGGTGGCGGTGGCCTCCGGCGAGCGGCGGGCCCATGCGGTGGGCTATTGCGTGGGCGGCACGCTGCTGGCCACCACGCTCGCTTACATGGCCGCCACCGGGGATGACCGCATCGCCAGCGCCACCTTCCTCACCACCCAGATCGACTTCACCCATGCGGGCGATCTGAAGGTGTTCGTGGACGAAAGCCAGCTCGCCACCATCGAGCGCAAGATGAAGGAGATGGGGTATCTGGAAGGCTCGAAGATGGCCTCCGCCTTCAACATGCTGCGCTCCAACGACCTGATCTGGCCCTATGTGGTGAACAACTACATGAAGGGCAAGGCGCCGTTTCCGTTCGACCTGCTGTTCTGGAATTCGGATTCCACCCGCATGCCGGCGGCGAACCATTCCTATTATCTGCGCAACTGCTACCTCACCAACAATATCGCCCGGGGTCTGGCGGAGCTGGCCGGCCTCAAGATCGATGTCACCAAGGTGTCGATCCCAGTCTATTCGCTGGCGACGCGGGAAGACCACATCGCCCCGGCCAACTCGGTCTATATCGGGGCAAATCTCCTGTCCGGCCCGGTGCGCTACGTGCTGGCGGGCTCGGGCCACATCGCCGGGGTGGTGAACCCGCCGGCCAAGATGAAGTATCAGTACTGGGCCGACGGCCCGGTGGGGCCGAGCTACGAGGCCTGGCTGGCCGGGGCGCAGGAGCACAAGGGCTCCTGGTGGCCGGACTGGTTCAACTGGTTCTCCTTCAACCATCCCGAGGAGGTGCCGGCGCGCGCCATCGGCGGCGGCCGCCTCGCCCCCATCGAGGACGCACCCGGGCGCTATGTGAAGGAGCGGTCGTAG

【0147】

ｐｈａＣ２ ＤＮＡ配列（配列番号６１）：

ATGGAAGCGCGAAAGATGCCCGTTTCACCCCCCTCCTCCGCCACCATCCTGCCCCTGCCCGTCTCGGCCGCTCCCCCTTCGACGGCGCCCGCCGCGTCCCTGCCGGCGACGGCCTCCAGCTCCACCAACAAGGCCAGCCCCTCAGCCTTCCCCGCCGCCTGGGCGCGTTCCTTCGCCCTGCCCGGCCTGCCCGCCTTCCTGTGCCCGGACGAGGAGGATTTCGAGGAGGGTTCGGGGCCGGCCGCCTTCCATGCGGTGGACCGGGCGGCGGCGGCCTTGGTGGCCCGCACCACCCAGGGGCTCTCGCCCGCCGCCCTCACCCTCGCTTACATGGATTGGGCGATGCATCTGGCAGCGGCGCCGGGCAAGCAGGCGGAGCTGGCGGTGAAGGCCACGCGCAAGGCGGCGCGCTTCTGGGCCTATGTGCTCGCCTCCACCCTCGACCGCACCCAGGCGCCCTGCATCGCGCCCCTGGTGGGCGACGAACGGTTTTCCGCCCCGGCCTGGCAGGACTGGCCCTACCGCTTCTGGTACCAGGCCTTTCTGCTCAATCAGCAATGGTGGCACAACGCCACTCATGGCGTGCCGGGCGTGGCGCCGCACAATCAGGACGTGGTGGCCTTCGCCGCCCGGCAGGTCCTGGACATGTTCTCCCCCTCCAACTCGCCCCTCACCAATCCCGAGGTGGTGAAGAAGGCGCGCCAGACGCTAGGGGCCAATTTCGTCCAGGGCGCGCGCAACTTCATGGAGGACCAGTCGCGCAAAACCACCGGCCGCCCGCCCGTGGGCGCGGAGGCGTTCACTCCCGGCAAGGAGGTGGCCATCACCCCCGGCGAGGTGATCTACCGCAACCATCTCATCGAGCTGATCCAATACCGGGCGACCACCCCTGACGTGCATGCGGAGCCGATCCTCATCGTGCCCGCCTGGATCATGAAATATTACATCCTCGACCTGTCGCCCGATAACTCCCTGATCCGCTACCTGGTGGACAAGGGGCACACGGTCTTCTGCATCTCCTGGCGCAATGTGAACGCGGAGGACCGCGATCTCGGCTTCGAGGACTATCGCAAGATGGGCATCATGGCGGCCCTCGACGCGGTGAACGCGGTGGTGCCGAACCAGAAGGTGCATGCGGTGGGTTATTGCCTGGGCGGCACGCTGCTCTCCATCGCCGCCGCCGCCATGGCGCGGGTGGTCGACGACCGGCTGGGCTCCGTCACCCTGTTCGCCGCCCAGACCGACTTCACCGAGCCCGGCGAACTGCAGCTCTTCGTGGACCCGAGCGAGCTTTATGCCCTGGAAAGCCTCATGTGGGACCAGGGCTATCTCGGCGCCCGGCAGATGGCCGGCGCGTTCGAGATGCTGCGCTCCAACGACCTCGTCTGGTCGCGCATGGTGCGCGACTATCTCATGGGCGAGCGCGCACCCATGAACGACCTCATGGCCTGGAACGCAGATGCCACCCGCATGCCCTATCGCATGCATTCCCAGTATCTGCGCAACCTGTTCCTCGACAACGAGCTGGCCGTGGGCCGTTACATGGTGGAGGGCCGGCCGGTGTCGCTGCAGAACATCCGCGTCCCGCTGTTCGTGGTGGGCACGGAGCGGGACCACGTGGCGCCGTGGAAGTCGGTCTACAAGATCCACCAGCTCACCGACACGGACGTGACCTTCGTCCTCGCCTCCGGCGGGCACAATGCGGGCATCGTCTCCGAGCCCGGCCACAAGCACCGGCACTATCGCATCCACGACACCAAATTGGGCGAGATGCATGTGAGCCCGGAGGAATGGATGGAGGCGAACCGGTCGCAGGACGGGTCCTGGTGGCCGGCCTGGGAGGCATGGCTCGCCGGCCAGTCCTCCGGCCGCATCGGCCTGCCGCCTCTGGGCGCGCCCGGCTACGAGGTGCTGGGCCCGGCGCCCGGCACCTATGTGATGCAAAGGTGA

【0148】

ｐｈａＣ１アミノ酸配列（配列番号６２）：

MSAAEETSTHAELRLPQDGVEHDVAAAEAAVDRSAGEPSGTQASAAPAEAAPSSAPVSAAAGETQPQDDTPPQDPSSLSDGPGLSPPVTQPGAASGDFGGPEAMGDAFMPPVPEEPMEGMAPAPAISAAPASVPSAGWPEDAPSALLDAVDASGDLPAAAEGAATAPEPIFRELPMTAAPAAPAIANILEPVAEALSALGAVAVSRPQVQREFRAAPEHPPMPRMAPPQAAPEPAPAVPPKPEAAKPEAAKPEAAKPEAAKPEVAKPDAAAPDAAKSSGKAERPSGAGDGSGTSGVNMEAFSRNLARLVEEGGKAMAAYLSPREQGKTDDLADDIADAMKTVGQVVEYWVADPQRTVEAQSRLMGGYLSVWANTLKRLAGEEATPVAAPDPKDARFKDAGWNDSPMFDALKQAYLVTSDWAQNMVDEAKGLDPHTKHKAEFLVRQIANAISPSNFVLTNPELIRETLHSSGENLVKGMQNLTADLMAGQGTLKIRQTDLSAFEVGRNLATTPGKVIFENELMQLIQYEPTTETVKKTPVLIVPPWINKFYILDLTAEKSLIKWLVSQGLTVFTISWVNPDGRLAAKGFDDYMRDGIMAALDAVAVASGERRAHAVGYCVGGTLLATTLAYMAATGDDRIASATFLTTQIDFTHAGDLKVFVDESQLATIERKMKEMGYLEGSKMASAFNMLRSNDLIWPYVVNNYMKGKAPFPFDLLFWNSDSTRMPAANHSYYLRNCYLTNNIARGLAELAGLKIDVTKVSIPVYSLATREDHIAPANSVYIGANLLSGPVRYVLAGSGHIAGVVNPPAKMKYQYWADGPVGPSYEAWLAGAQEHKGSWWPDWFNWFSFNHPEEVPARAIGGGRLAPIEDAPGRYVKERS

【0149】

ｐｈａＣ２アミノ酸配列（配列番号６３）：

MEARKMPVSPPSSATILPLPVSAAPPSTAPAASLPATASSSTNKASPSAFPAAWARSFALPGLPAFLCPDEEDFEEGSGPAAFHAVDRAAAALVARTTQGLSPAALTLAYMDWAMHLAAAPGKQAELAVKATRKAARFWAYVLASTLDRTQAPCIAPLVGDERFSAPAWQDWPYRFWYQAFLLNQQWWHNATHGVPGVAPHNQDVVAFAARQVLDMFSPSNSPLTNPEVVKKARQTLGANFVQGARNFMEDQSRKTTGRPPVGAEAFTPGKEVAITPGEVIYRNHLIELIQYRATTPDVHAEPILIVPAWIMKYYILDLSPDNSLIRYLVDKGHTVFCISWRNVNAEDRDLGFEDYRKMGIMAALDAVNAVVPNQKVHAVGYCLGGTLLSIAAAAMARVVDDRLGSVTLFAAQTDFTEPGELQLFVDPSELYALESLMWDQGYLGARQMAGAFEMLRSNDLVWSRMVRDYLMGERAPMNDLMAWNADATRMPYRMHSQYLRNLFLDNELAVGRYMVEGRPVSLQNIRVPLFVVGTERDHVAPWKSVYKIHQLTDTDVTFVLASGGHNAGIVSEPGHKHRHYRIHDTKLGEMHVSPEEWMEANRSQDGSWWPAWEAWLAGQSSGRIGLPPLGAPGYEVLGPAPGTYVMQR

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

2024515522000001.app

【国際調査報告】