(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-10
(54)【発明の名称】カプセル化微生物組成物およびその製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20240403BHJP
A01N 25/00 20060101ALI20240403BHJP
A01N 63/27 20200101ALI20240403BHJP
A01N 63/20 20200101ALI20240403BHJP
A01P 3/00 20060101ALI20240403BHJP
A01P 7/02 20060101ALI20240403BHJP
A01P 7/04 20060101ALI20240403BHJP
A01P 13/00 20060101ALI20240403BHJP
A01N 25/26 20060101ALI20240403BHJP
A01P 21/00 20060101ALI20240403BHJP
A01G 7/00 20060101ALI20240403BHJP
A01H 5/10 20180101ALI20240403BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 C
A01N25/00 102
A01N63/27
A01N63/20
A01P3/00
A01P7/02
A01P7/04
A01P13/00
A01N25/26
A01P21/00
A01G7/00 604Z
C12N1/20 E
A01H5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023561327
(86)(22)【出願日】2022-04-08
(85)【翻訳文提出日】2023-11-29
(86)【国際出願番号】 US2022023995
(87)【国際公開番号】W WO2022217038
(87)【国際公開日】2022-10-13
(31)【優先権主張番号】63/172,898
(32)【優先日】2021-04-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】501231613
【氏名又は名称】モンサント テクノロジー エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】アンジェム，アディル
(72)【発明者】
【氏名】ブコルツ，トレーシー
(72)【発明者】
【氏名】ファン，ミンヤ
(72)【発明者】
【氏名】ラウ，ミンウーイ
【テーマコード（参考）】
2B030
4B065
4H011
【Ｆターム（参考）】
2B030AA02
2B030AB03
2B030AD06
2B030AD07
2B030CA28
4B065AA01X
4B065AA43X
4B065AA87X
4B065AC20
4B065BD06
4B065BD10
4B065BD22
4B065BD27
4B065BD32
4B065BD36
4B065BD38
4B065BD41
4B065BD50
4B065CA47
4H011AA01
4H011AB01
4H011AB03
4H011AC01
4H011AC04
4H011BA01
4H011BB21
4H011BC06
4H011BC08
4H011BC09
4H011BC18
4H011BC19
4H011DA05
4H011DD03
4H011DH10
4H011DH11
(57)【要約】
例えば、成長を促進し、および／または有害生物防除を提供するために植物種子に施用することができる、安定性が増加したカプセル化微生物組成物、および安定性が増加したそのようなカプセル化微生物組成物を調製するための方法が記載される。この方法は、微生物と少なくとも１つのヒドロゲル、例えばアルギン酸塩とを組み合わせて前駆体混合物を形成するステップと、前駆体混合物を二価カチオン、二価カチオン塩、またはそれらの組み合わせを含む架橋剤で固化して中間微生物組成物を形成するステップと、および中間微生物組成物を乾燥させてカプセル化微生物組成物を形成するステップとを含むことができる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
カプセル化微生物組成物を調製するための方法であって、以下の：（ａ） 微生物と少なくとも１つのヒドロゲルを組み合わせて前駆体混合物を形成するステップであって、前記少なくとも１つのヒドロゲルがアルギン酸塩を含むステップと；
（ｂ） 前記前駆体混合物を二価カチオン、二価カチオン塩、またはそれらの組み合わせを含む架橋剤で固化させて、中間微生物組成物を形成するステップと；および
（ｃ） 前記中間微生物組成物を乾燥させて、約１０％以下の水分含量を有するカプセル化微生物組成物を形成するステップであって、前記乾燥が、約１５℃以上の乾燥温度で、約２５，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２以下の蒸発速度で行われるステップと
を含む、前記方法。
【請求項2】
カプセル化微生物組成物を調製するための方法であって、以下の：（ａ） 微生物と少なくとも１つのヒドロゲルを組み合わせて前駆体混合物を形成するステップであって、前記少なくとも１つのヒドロゲルがアルギン酸塩を含むステップと；
（ｂ） 前記前駆体混合物を二価カチオン、二価カチオン塩、またはそれらの組み合わせを含む架橋剤で固化させて、中間微生物組成物を形成するステップと；および
（ｃ） 前記中間微生物組成物を乾燥させて、約０．５ｇ／ｍＬ以上約１．５ｇ／ｍＬ以下のタップ密度を有するカプセル化微生物組成物を形成するステップと
を含む、前記方法。
【請求項3】
前記アルギン酸塩が、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸バリウム、アルギン酸カルシウム、アルギン酸マグネシウム、アルギン酸ストロンチウム、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記少なくとも１つのヒドロゲルが、カルボキシメチルセルロース、カラギーナン、酢酸フタル酸セルロース、キトサンおよびキトサン誘導体、コラーゲン、ゼラチン、グリコサミノグリカン、グアーガム、アカシアゴム、ヒアルロン酸、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ローカストビーンガム、メチルセルロース、ペクチン、ポリエチレンオキシド、ポリグリコール酸、ポリウレタン、デンプン、加工デンプン、キサンタンガム、またはそれらの組み合わせをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記少なくとも１つのヒドロゲルが、前記前駆体混合物の総重量に基づいて、約５重量％～約５０重量％の量で前記前駆体混合物中に存在する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記前駆体混合物が窒素含有安定剤を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記窒素含有安定剤が、アンモニア、水酸化アンモニウム、尿素、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、ピロリン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、グルテン、加水分解カゼイン、加水分解ホエータンパク質、加水分解エンドウ豆タンパク質、加水分解ダイズタンパク質、麦芽抽出物、粉乳、ホエー粉末、酵母抽出物、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記窒素含有安定剤が、前記前駆体混合物の総重量に基づいて，約５重量％～約５０重量％の量で前記前駆体混合物中に存在する、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記前駆体混合物が糖含有安定剤を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記糖含有安定剤が、二糖類または糖アルコールである、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記糖含有安定剤が、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、トレハロース、スクロース、ラクトース、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記糖含有安定剤が、前記前駆体混合物の総重量に基づいて、約５重量％～約５０重量％の量で前記前駆体混合物中に存在する、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記微生物が芽胞非形成細菌である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記微生物が、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ハーバスピリラム（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ファイトバクター（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ）、シュードアシドボラックス（Ｐｓｅｕｄａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）、ミツアリア（Ｍｉｔｓｕａｒｉａ）、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、クリセオモナス（Ｃｈｒｙｓｅｏｍｏｎａｓ）、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ゼノラブダス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）、フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記微生物が、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、ファイトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ハーバスピリラム・フリシンゲンス（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｅ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記前駆体混合物が、フィラーをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記フィラーが、デンプン、セルロース、バイオ炭、軽石、シリカ、クレイ、ゼオライト、パーライト、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記フィラーが、前記前駆体混合物の総重量に基づいて、約０．１重量％～約９０重量％の量で前記前駆体混合物中に存在する、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記二価カチオンが、バリウムカチオン、カルシウムカチオン、マグネシウムカチオン、ストロンチウムカチオン、コバルトカチオン、ニッケルカチオン、亜鉛カチオン、マンガンカチオン、またはそれらの組み合わせである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記二価カチオン塩が、バリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、ストロンチウム塩、コバルト塩、亜鉛塩、マンガン塩、またはそれらの組み合わせである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記架橋剤が、溶媒をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記固化が、前記前駆体混合物の液滴を前記架橋剤と接触させるステップを含み、および前記中間微生物組成物が、架橋ビーズの形態である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記架橋ビーズが、約１ｍｍ～約２０ｍｍの平均粒径を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記固化が、約１００μｍ～約５００μｍの直径を有する開口部を通して前記前駆体混合物を流し、前記前駆体混合物を前記架橋剤と接触させるステップを含み、および前記中間微生物組成物が架橋マイクロビーズの形態である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記架橋マイクロビーズが、約１００μｍ～約２０ｍｍの平均粒径を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記二価カチオンが、前記カプセル化微生物組成物の総乾燥重量の約０．１％～約１０％の量で存在する、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記固化が、前記前駆体混合物の前記架橋剤との高せん断混合を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記高せん断混合が、少なくとも約３．５ｍ／ｓの先端速度で、少なくとも約５秒間実施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記高せん断混合が、約３．５ｍ／ｓ～約２５ｍ／ｓの先端速度で、約５秒～約２０分間実施される、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記高せん断混合が、約４℃～約３０℃の温度で実施される、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記固化が、前記前駆体混合物を前記架橋剤と組み合わせて、前記中間微生物組成物を形成するステップを含み、前記架橋剤が前記二価カチオン塩を含み、および前記二価カチオン塩が二価カチオン炭酸塩である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記二価カチオン炭酸塩が、炭酸バリウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸ストロンチウム、炭酸コバルト、炭酸ニッケル、炭酸亜鉛、炭酸マンガン、またはそれらの組み合わせである、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記二価カチオン炭酸塩が炭酸カルシウムである、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記固化が、酸性緩衝剤を添加することをさらに含む、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記酸性緩衝剤が、（ｉ）前記架橋剤が前記前駆体混合物と組み合わされる前に、前記前駆体混合物および／または前記架橋剤に；（ｉｉ）前記架橋剤と実質的に同時に前記前駆体混合物に；（ｉｉｉ）前記前駆体混合物および前記架橋剤を含む混合物に；または（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の任意の組み合わせに添加される、請求項３４に記載の使用。
【請求項36】
前記混合物が、約４～約６．５のｐＨを有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記組み合わせることが、約５分以上および／または約４℃以上の温度で実施される、請求項３１～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
前記組み合わせることが、約５分間～約４８時間および／または約４℃～約４０℃の温度で実施される、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記組み合わせることが、前記前駆体混合物を前記架橋剤と混合することを含む、請求項３１～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記二価カチオンが、前記カプセル化微生物組成物の総乾燥重量の約０．００１％～約２５％に相当する量で存在する、請求項２７～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記中間微生物組成物を基材に適用するステップをさらに含み、前記中間微生物組成物が前記基材上のフィルムの形態である、請求項２７～４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
前記フィルムが、約１ｍｍ～約１ｃｍの厚さを有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記乾燥温度が、約１５℃～約６０℃である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
乾燥時間が約１５分以上である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
前記乾燥時間が約１５分～約２００時間である、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
前記蒸発速度が、約１５，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２以下である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
前記蒸発速度が、約１０，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２以下である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項48】
前記蒸発速度が、約５，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２以下である、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用。
【請求項49】
前記蒸発速度が、約１ｇ／ｈｒ／ｍ２～約５００ｇ／ｈｒ／ｍ２である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
前記カプセル化微生物組成物を処理して、カプセル化微生物粒子を形成するステップをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
約２００μｍ以下の平均粒径を有するようにカプセル化微生物粒子の大きさを減少させるステップをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項52】
前記カプセル化微生物粒子の大きさを減少させるステップが、前記カプセル化微生物粒子を粉砕するステップを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記カプセル化微生物組成物が、約５％以下の水分含量を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
前記カプセル化微生物組成物が、２５℃および６５％相対湿度（ＲＨ）で、４週間、８週間、または１２週間後に、２ｌｏｇ未満の、グラムあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｇ）の損失を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項55】
前記カプセル化微生物組成物が、２５℃および６５％相対湿度（ＲＨ）で、４週間、８週間または１２週間後に、１ｌｏｇ未満の、グラムあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｇ）の損失を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項56】
前記カプセル化微生物組成物を、植物種子、植物、植物の一部、および植物環境の１つ以上に施用することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
前記植物種子が、保護剤、除草剤、殺有害生物剤、殺菌剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
前記植物種子が、野菜種子、果実種子、穀物種子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５６または請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
少なくとも１つの疎水性添加剤を前記微生物および前記少なくとも１つのヒドロゲルと組み合わせて、前記前駆体混合物を形成するステップをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項60】
前記中間微生物組成物を乾燥させて、前記カプセル化微生物組成物を形成するステップが、前記中間微生物組成物を空気乾燥させるステップ、前記中間微生物組成物を真空乾燥させるステップ、および／または流動床で前記中間微生物組成物を乾燥させるステップのうちの１つ以上を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項61】
カプセル化微生物組成物を調製するための方法であって、該方法が：（ａ） 微生物と少なくとも１つのヒドロゲルを組み合わせて、前駆体混合物を形成するステップであって、前記少なくとも１つのヒドロゲルがアルギン酸塩を含むステップと；
（ｂ） 前記前駆体混合物を架橋剤で固化して、架橋ビーズの形態で中間微生物組成物を形成するステップであって、前記固化が前記前駆体混合物の液滴を架橋剤と接触させるステップを含み、前記架橋剤が二価カチオン、二価カチオン塩、またはそれらの組み合わせを含むステップと；および
（ｃ） 前記中間微生物組成物を乾燥させて、約１０％以下の水分含量を有するカプセル化微生物組成物を形成するステップと
を含む、前記方法。
【請求項62】
カプセル化微生物組成物を調製するための方法であって、該方法が：（ａ） 微生物と少なくとも１つのヒドロゲルを組み合わせて、前駆体混合物を形成するステップであって、前記少なくとも１つのヒドロゲルがアルギン酸塩を含むステップと；
（ｂ） 前記前駆体混合物を架橋剤で固化して、架橋マイクロビーズの形態で中間微生物組成物を形成するステップであって、前記固化が、前記前駆体混合物を約１００μｍ～約５００μｍの直径を有する開口部を通して流し、前記前駆体混合物を前記架橋剤と接触させるステップを含み、および前記架橋剤が二価カチオン、二価カチオン塩、またはそれらの組み合わせを含むステップと；および
（ｃ） 前記中間微生物組成物を乾燥させて、約１０％以下の水分含量を有する前記カプセル化微生物組成物を形成するステップと
を含む、前記方法。
【請求項63】
カプセル化微生物組成物を調製するための方法であって、該方法が：（ａ） 微生物と少なくとも１つのヒドロゲルとを組み合わせて、前駆体混合物を形成するステップであって、前記少なくとも１つのヒドロゲルがアルギン酸塩を含むステップと；
（ｂ） 前記前駆体混合物を架橋剤で固化して、中間微生物組成物を形成するステップであって、前記固化が、前記前駆体混合物を前記架橋剤と高せん断混合するステップを含み、および前記架橋剤が、二価カチオン、二価カチオン塩、またはそれらの組み合わせを含むステップと；および
（ｃ） 前記中間微生物組成物を乾燥させて、約１０％以下の水分含量を有する前記カプセル化微生物組成物を形成するステップと
を含む、前記方法。
【請求項64】
カプセル化微生物組成物を調製するための方法であって、該方法が：（ａ） 微生物と少なくとも１つのヒドロゲルを組み合わせて、前駆体混合物を形成するステップであって、前記少なくとも１つのヒドロゲルがアルギン酸塩を含むステップと；
（ｂ） 前記前駆体混合物を、二価カチオン塩を含む架橋剤で固化して、中間微生物組成物を形成するステップであって、前記固化が、前記前駆体混合物を前記架橋剤と組み合わせるステップを含み、および前記二価カチオン塩が二価カチオン炭酸塩であるステップと；および
（ｃ） 前記中間微生物組成物を乾燥させて、約１０％以下の水分含量を有する前記カプセル化微生物組成物を形成するステップと
を含む、前記方法。
【請求項65】
カプセル化微生物組成物であって：二価カチオンと一緒に結合された少なくとも１つのヒドロゲルを含むポリマーマトリックス中に埋め込まれた微生物を含み、ここで、前記少なくとも１つのヒドロゲルがアルギン酸塩を含み；および前記カプセル化微生物組成物が約１０％以下の水分含量を有する、前記組成物。
【請求項66】
カプセル化微生物組成物であって：二価カチオンと一緒に結合した少なくとも１つのヒドロゲルを含むポリマーマトリックス中に埋め込まれた微生物を含み、ここで、前記少なくとも１つのヒドロゲルがアルギン酸塩を含み；および前記カプセル化微生物組成物が、約０．５ｇ／ｍＬ以上約１．５ｇ／ｍＬ以下のタップ密度を有する、前記組成物。
【請求項67】
前記アルギン酸塩が、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸バリウム、アルギン酸カルシウム、アルギン酸マグネシウム、アルギン酸ストロンチウム、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６５または請求項６６に記載の組成物。
【請求項68】
前記少なくとも１つのヒドロゲルが、カルボキシメチルセルロース、カラギーナン、酢酸フタル酸セルロース、キトサンおよびキトサン誘導体、コラーゲン、ゼラチン、グリコサミノグリカン、グアーガム、アカシアゴム、ヒアルロン酸、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ローカストビーンガム、メチルセルロース、ペクチン、ポリエチレンオキシド、ポリグリコール酸、ポリウレタン、デンプン、加工デンプン、キサンタンガム、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項６５～６７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項69】
前記少なくとも１つのヒドロゲルが、前記組成物の総重量に基づいて、約５重量％～約５０重量％の量で存在する、請求項６５～６８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項70】
前記ポリマーマトリックスが窒素含有安定剤をさらに含む、請求項６５～６９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項71】
前記窒素含有安定剤が、アンモニア、水酸化アンモニウム、尿素、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、ピロリン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、グルテン、加水分解カゼイン、加水分解ホエータンパク質、加水分解エンドウ豆タンパク質、加水分解ダイズタンパク質、麦芽抽出物、粉乳、ホエー粉末、酵母抽出物、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７０に記載の組成物。
【請求項72】
前記窒素含有安定剤が、前記組成物の総重量に基づいて，約５重量％～約５０重量％の量で存在する、請求項７０または請求項７１に記載の組成物。
【請求項73】
前記ポリマーマトリックスが糖含有安定剤をさらに含む、請求項６５～７２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項74】
前記糖含有安定剤が、二糖類または糖アルコールである、請求項７３に記載の組成物。
【請求項75】
前記糖含有安定剤が、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、トレハロース、スクロース、ラクトース、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７３または請求項７４に記載の組成物。
【請求項76】
前記糖含有安定剤が、前記組成物の総重量に基づいて、約５重量％～約５０重量％の量で存在する、請求項７３～７５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項77】
前記微生物が芽胞非形成細菌である、請求項６５～７６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項78】
前記微生物が、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ハーバスピリラム（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ファイトバクター（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ）、シュードアシドボラックス（Ｐｓｅｕｄａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）、ミツアリア（Ｍｉｔｓｕａｒｉａ）、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、クリセオモナス（Ｃｈｒｙｓｅｏｍｏｎａｓ）、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ゼノラブダス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）、フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６５～７７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項79】
前記微生物が、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ファイトバクター（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ）、ハーバスピリラム（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ミツアリア（Ｍｉｔｓｕａｒｉａ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６５～７８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項80】
前記微生物が、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、ファイトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ハーバスピリラム・フリシンゲンス（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｅ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６５～７９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項81】
前記二価カチオンが、バリウムカチオン、カルシウムカチオン、マグネシウムカチオン、ストロンチウムカチオン、コバルトカチオン、ニッケルカチオン、亜鉛カチオン、マンガンカチオンまたはそれらの組み合わせである、請求項６５～８０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項82】
前記ポリマーマトリックスが、フィラーをさらに含む、請求項６５～８１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項83】
前記フィラーが、デンプン、セルロース、バイオ炭、軽石、シリカ、クレイ、ゼオライト、パーライト、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８２に記載の組成物。
【請求項84】
前記フィラーが、組成物の総重量に基づいて、約０．１重量％～約９０重量％の量で存在する、請求項８２または請求項８３に記載の組成物。
【請求項85】
前記カプセル化微生物組成物が、約３００μｍ以下の粒径を有する粒子の形態である、請求項６５～８４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項86】
前記カプセル化微生物組成物が、約５％以下の水分含量を有する、請求項６５～８５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項87】
前記カプセル化微生物組成物が、２５℃および６５％相対湿度（ＲＨ）で、４週間、８週間または１２週間後に、２ｌｏｇ未満の、グラムあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｇ）の損失を有する、請求項６５～８６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項88】
前記カプセル化微生物組成物が、２５℃および６５％相対湿度（ＲＨ）で、４週間、８週間または１２週間後に、１ｌｏｇ未満の、グラムあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｇ）の損失を有する、請求項６５～８７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項89】
前記ポリマーマトリックスが、少なくとも１つの疎水性添加剤をさらに含む、請求項６５～８８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項90】
種子組成物であって：植物種子；および
前記植物種子の表面の少なくとも一部に存在する、請求項６５～８９のいずれか一項に記載のカプセル化微生物組成物
を含む、前記種子組成物。
【請求項91】
前記植物種子が、保護剤、除草剤、殺有害生物剤、殺菌剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項９０に記載の種子組成物。
【請求項92】
前記植物種子が、野菜種子、果実種子、穀物種子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９０または請求項９１に記載の種子組成物。
【請求項93】
前記植物種子が、キャノーラ種子、トウモロコシ種子、ダイズ種子、コムギ種子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９０または請求項９１に記載の種子組成物。
【請求項94】
疎水性コーティングをさらに含む、請求項９０～９３のいずれか一項に記載の種子組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月９日に出願された米国仮特許出願第６３／１７２，８９８号の利益および優先権を主張し、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本開示は一般に、植物種子処理などの施用のための安定性が増加したカプセル化微生物組成物に関する。本開示はさらに、一般に、安定性が増加したそのようなカプセル化微生物組成物を調製する方法、およびカプセル化微生物組成物を植物種子に施用する方法に関する。
本出願は、２０２１年４月９日に出願された米国仮特許出願第６３／１７２，８９８号の利益および優先権を主張し、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本開示は一般に、植物種子処理などの施用のための安定性が増加したカプセル化微生物組成物に関する。本開示はさらに、一般に、安定性が増加したそのようなカプセル化微生物組成物を調製する方法、およびカプセル化微生物組成物を植物種子に施用する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
背景
このセクションは、必ずしも従来技術ではない本開示に関連する背景情報を提供する。
このセクションは、必ずしも従来技術ではない本開示に関連する背景情報を提供する。
【0003】
植物を取り囲む微生物相は、細菌、真菌、酵母、および藻類を含む非常に多様である。植物マイクロバイオームを構成する微生物（Ｍｉｃｒｏｂｅｓ）（微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）とも呼ばれる）は、種子、植物、土壌、花粉媒介者および他の動物、ならびに環境を含む様々な供給源に由来する。これらの微生物のいくつかはそれらの植物宿主に有益であり、植物成長および作物生産性を促進することができるが、一方、他のものは病原体と呼ばれることが多い病気の原因物質である。植物の形質を改善するための農業、園芸、林業および環境管理における微生物剤の使用に対する関心が高まっている。一般に根圏および根面として知られている、植物の根を取り囲む土壌のゾーンに存在することが知られている多くの微生物が、植物の成長を促進する能力について注目されている。さらに、微生物は例えば、植物病原体に対抗することおよび／または植物成長を改善することによって、農業生産性および効率を増加させるための生物学的防除剤として使用することができることが示されている。いくつかの微生物は、分子窒素の固定、土壌栄養素（例えば、鉄、リン、硫黄など）の動員、植物ホルモンおよびビタミンの合成、ならびに土壌有機物を増加させることができる土壌中の植物物質の分解などの多くの機構を通して、それらの宿主の適応能力を増強することができる。植物種子および／または土壌に特定の有益な微生物を接種することによって、植物に、有害生物を防除し、および／またはそれらの成長および発育を増強する重要な栄養素または有益な因子を供給することができる。しかしながら、微生物は典型的には、植物の健康および形質にプラスの影響を及ぼすために生存可能なままである必要があり、貯蔵または環境において、または植物もしくは植物種子上で安定でない場合がある。
【発明の概要】
【0004】
したがって、例えば、種子処理製剤、コーティングおよび／またはバイオ肥料または他の農業用途、例えば長期貯蔵および後の使用のために組み込むことができる、そのような有益な微生物を含む改善された方法および組成物が必要とされている。しかしながら、微生物の貯蔵、輸送および植物または植物種子への施用の間の、特に様々な温度および湿度での、微生物の生存率、構造および機能の保存は、困難であることが証明されている。生物学的材料を安定化するための方法および組成物が開発されてきたが、農業用途のために、細菌または真菌などの微生物を製剤化するための改善された組成物および方法が依然として必要とされている。実際、多くの芽胞非形成細菌および真菌株は貯蔵および製剤条件に特に感受性であり、既存の製剤アプローチおよび戦略を用いた貯蔵および農業用途の間、生存可能なままではない場合がある。したがって、生物学的材料の輸送および貯蔵中に遭遇するような、様々な温度および湿度での長期間にわたる広範囲の生物学的材料の貯蔵のためのより安定な組成物を製造するための方法がさらに必要とされている。別の態様では、植物、植物部分または種子への施用の前後で安定かつ活性を維持する微生物含有組成物が必要とされている。
概要
概要
【0005】
このセクションは本開示の一般的な概要を提供するものであり、その全範囲またはその特徴の全ての包括的な開示ではない。
【0006】
新規で有用なカプセル化微生物組成物およびその製造方法は、添付の特許請求の範囲に記載されている。例示的な実施形態はまた、当業者が特許請求される主題を作製および使用することを可能にするために提供される。
【0007】
一態様において、カプセル化微生物組成物を調製するための方法が記載される。この方法は一般に、微生物と少なくとも１つのヒドロゲルとを組み合わせて前駆体混合物を形成するステップと、前駆体混合物を架橋剤で固化して中間微生物組成物を形成するステップと、および中間微生物組成物を乾燥してカプセル化微生物組成物を形成するステップとを含む。カプセル化微生物組成物は、約１０％以下または約５％以下の水分含量を有することができる。少なくとも１つのヒドロゲルは一般に、アルギン酸塩を含み、架橋剤は一般に、二価カチオン、二価カチオン塩、またはそれらの組み合わせを含む。乾燥は、約１５℃以上の乾燥温度で、約２５，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２以下の蒸発速度で行うことができる。
【0008】
別の態様において、カプセル化微生物組成物を調製するための方法が記載される。この方法は一般に、微生物と少なくとも１つのヒドロゲルとを組み合わせて前駆体混合物を形成するステップと、前駆体混合物を架橋剤で固化して中間微生物組成物を形成するステップと、および中間微生物組成物を乾燥してカプセル化微生物組成物を形成するステップとを含む。少なくとも１つのヒドロゲルは一般に、アルギン酸塩を含み、架橋剤は一般に、二価カチオン、二価カチオン塩、またはそれらの組み合わせを含む。カプセル化微生物組成物は、約０．５ｇ／ｍＬ以上～約１．５ｇ／ｍＬ以下のタップ密度を有することができる。
【0009】
アルギン酸塩は、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸バリウム、アルギン酸カルシウム、アルギン酸マグネシウム、アルギン酸ストロンチウム、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
【0010】
少なくとも１つのヒドロゲルは、カルボキシメチルセルロース、カラギーナン、酢酸フタル酸セルロース、キトサンおよびキトサン誘導体、コラーゲン、ゼラチン、グリコサミノグリカン、グアーガム、アカシアガム、ヒアルロン酸、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ローカストビーンガム、メチルセルロース、ペクチン、ポリエチレンオキシド、ポリグリコール酸、ポリウレタン、デンプン、加工デンプン、キサンタンガム、またはそれらの組み合わせをさらに含み得る。
【0011】
少なくとも１つのヒドロゲルは、前駆体混合物の総重量に基づいて約５重量％～約５０重量％の量で前駆体混合物中に存在し得る。
【0012】
前駆体混合物は、窒素含有安定剤、糖含有安定剤、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。含窒素安定剤としては、アンモニア、水酸化アンモニウム、尿素、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、ピロリン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、グルテン、加水分解カゼイン、加水分解ホエータンパク質、加水分解エンドウ豆タンパク質、加水分解ダイズタンパク質、麦芽抽出物、粉乳、ホエー粉末、酵母抽出物、およびこれらの組み合わせが挙げられる。糖含有安定剤としては、例えば、二糖類、糖アルコール、またはこれらの組み合わせが挙げられる。例えば、糖含有安定剤は、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、トレハロース、スクロース、ラクトース、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
【0013】
窒素含有安定剤および糖含有安定剤はそれぞれ、前駆体混合物の総重量に基づいて約５重量％～約５０重量％の量で前駆体混合物中に存在し得る。
【0014】
微生物は、芽胞非形成細菌であり得る。例えば、微生物は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ））、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）（例えば、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ））、ハーバスピリラム（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）（例えば、ハーバスピリラム・フリシンゲンス（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｅ）、ハーバスピリラム・セロペディカエ（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅ）、ハーバスピリラム・ルブリスバルビカンス（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｉｓｕｂａｌｂｉｃａｎｓ）など）、ファイトバクター（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、ファイトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ファイトバクター・ウルシンギイ（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｓｉｎｇｉｉ）、ファイトバクター・パルマエ（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｌｍａｅ）など）、シュードアシドボラックス（Ｐｓｅｕｄａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）（例えば、シュードアシドボラックス・インターメディウス（Ｐｓｅｕｄａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ））、ミツアリア（Ｍｉｔｓｕａｒｉａ）、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、クリセオモナス（Ｃｈｒｙｓｅｏｍｏｎａｓ）、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ゼノラブダス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）、フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
【0015】
前駆体混合物は、デンプン、セルロース、バイオ炭、軽石、シリカ、クレイ、ゼオライト、パーライト、またはそれらの組み合わせなどのフィラーをさらに含んでもよい。
【0016】
フィラーは、前駆体混合物の総重量に基づいて約０．１重量％～約９０重量％の量で前駆体混合物中に存在し得る。
【0017】
二価カチオンは、バリウムカチオン、カルシウムカチオン、マグネシウムカチオン、ストロンチウムカチオン、コバルトカチオン、ニッケルカチオン、亜鉛カチオン、マンガンカチオン、またはそれらの組み合わせであってもよい。二価カチオン塩は、バリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、ストロンチウム塩、コバルト塩、亜鉛塩、マンガン塩、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【0018】
架橋剤は、溶媒をさらに含むことができる。
【0019】
固化は、前駆体混合物の液滴を架橋剤と接触させて、例えば、約１ｍｍ～約２０ｍｍの平均粒径を有する架橋ビーズの形態の中間微生物組成物を形成するステップを含んでもよい。
【0020】
追加的にまたは代替的に、固化は、例えば、約１００μｍ～約５００μｍの直径を有する開口部を通して前駆体混合物を流すステップと、および前駆体混合物を架橋剤と接触させて、例えば、約１００μｍ～約２０ｍｍの平均粒径を有する架橋マイクロビーズの形態の中間微生物組成物を形成するステップとを含み得る。
【0021】
二価カチオンは、カプセル化微生物組成物の総乾燥重量の約０．１％～１０％の量で存在し得る。
【0022】
追加的にまたは代替的に、固化は、前駆体混合物と架橋剤との高せん断混合を含むことができる。例えば、高せん断混合は、少なくとも約３．５ｍ／ｓ（例えば、約３．５ｍ／ｓ～約２５ｍ／ｓ）の先端速度で少なくとも約５秒間（例えば、約５秒～約２０分）および約４℃～約３０℃の温度で実施され得る。
【0023】
追加的または代替的に、固化は、前駆体混合物を架橋剤と組み合わせて中間微生物組成物を形成するステップを含んでもよく、ここで、架橋剤は、二価カチオン塩を含み、二価カチオン塩は、二価カチオン炭酸塩、例えば炭酸バリウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸ストロンチウム、炭酸コバルト、炭酸ニッケル、炭酸亜鉛、炭酸マンガン、またはそれらの組み合わせ、特に炭酸カルシウムを含む。二価カチオンは、カプセル化微生物組成物の総乾燥重量の約０．００１％～約２５％に相当する量で存在し得る。
【0024】
固化は、酸性緩衝液を添加することをさらに含んでもよい。例えば、酸性緩衝剤は、（ｉ）架橋剤が前駆体混合物と組み合わされる前に前駆体混合物および／または架橋剤に；（ｉｉ）架橋剤と共に前駆体混合物に実質的に同時に；（ｉｉｉ）前駆体混合物および架橋剤を含む混合物に；または（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の任意の組み合わせに添加され得る。混合物は、約４～約６．５のｐＨを有し得る。
【0025】
組み合わせるステップは、約５分以上（例えば、約５分～約４８時間）および／または約４℃以上（例えば、約４℃～約４０℃）の温度で行うことができる。
【0026】
組み合わせるステップは、前駆体混合物を架橋剤と混合することを含んでもよい。
【0027】
本方法は、中間微生物組成物を基材に適用するステップをさらに含んでもよく、例えば、中間微生物組成物は、基材上にフィルムの形態である。フィルムは、約１ｍｍ～約１ｃｍの厚さを有することができる。
【0028】
本方法において、乾燥温度は、約１５℃～約６０℃であってもよく、および／または乾燥時間は約１５分以上（例えば、約１５分～約２００時間）であってもよい。
【0029】
蒸発速度は、約１５，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２以下、約１０，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２以下、約５，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２以下、または約１ｇ／ｈｒ／ｍ２～約５００ｇ／ｈｒ／ｍ２、約５０ｇ／ｈｒ／ｍ２～約５００ｇ／ｈｒ／ｍ２、約１ｇ／ｈｒ／ｍ２～約２５０ｇ／ｈｒ／ｍ２または約１ｇ／ｈｒ／ｍ～約１００ｇ／ｈｒ／ｍ２であってもよい。
【0030】
本方法は、カプセル化微生物粒子を形成するためにカプセル化微生物組成物を処理するステップと、および／またはカプセル化微生物粒子のサイズを、例えば、カプセル化微生物粒子を粉砕することによって、約２００μｍ以下の平均粒径を有するように縮小するステップとをさらに含み得る。
【0031】
カプセル化微生物組成物は、２５℃および６５％の相対湿度（ＲＨ）で、４週間、８週間、または１２週間後に、グラムあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｇ）の２ｌｏｇ未満の損失または１ｌｏｇ未満の損失を有し得る。
【0032】
本方法は、カプセル化微生物組成物を：植物種子、植物、植物の一部、および植物環境、のうちの１つ以上に施用することをさらに含み得る。植物種子は、保護剤、除草剤、殺有害生物剤（ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ）、殺菌剤、またはそれらの組み合わせをさらに含み得る。植物種子としては、例えば、野菜種子、果実種子、穀物種子、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【0033】
本方法は、少なくとも１つの疎水性添加剤を微生物および少なくとも１つのヒドロゲルと組み合わせて、前駆体混合物を形成するステップをさらに含み得る。
【0034】
本方法は、中間微生物組成物を空気乾燥させるステップ、中間微生物組成物を真空乾燥させるステップ、および／または流動床中で中間微生物組成物を乾燥させるステップのうちの１つ以上によって、中間微生物組成物を乾燥させて、カプセル化微生物組成物を形成するステップをさらに含み得る。
【0035】
さらなる態様において、カプセル化微生物組成物を調製するための別の方法が記載される。本方法は一般に、微生物と少なくとも１つのヒドロゲルとを組み合わせて前駆体混合物を形成するステップと、前駆体混合物を架橋剤で固化して架橋ビーズの形態の中間微生物組成物を形成するステップと、および中間微生物組成物を乾燥してカプセル化微生物組成物を形成するステップとを含む。固化は一般に、前駆体混合物の液滴を架橋剤と接触させるステップを含む。カプセル化微生物組成物は、約１０％以下の水分含量を有することができる。少なくとも１つのヒドロゲルは一般に、アルギン酸塩を含み、架橋剤は一般に、二価カチオン、二価カチオン塩、またはそれらの組み合わせを含む。
【0036】
さらなる態様において、カプセル化微生物組成物を調製するための別の方法が記載される。本方法は一般に、微生物と少なくとも１つのヒドロゲルとを組み合わせて前駆体混合物を形成するステップと、前駆体混合物を架橋剤で固化して架橋マイクロビーズの形態の中間微生物組成物を形成するステップと、および中間微生物組成物を乾燥してカプセル化微生物組成物を形成するステップとを含む。固化は一般に、約１００μｍ～約５００μｍの直径を有する開口部を通して前駆体混合物を流し、前駆体混合物を架橋剤と接触させるステップを含む。カプセル化微生物組成物は、約１０％以下の水分含量を有することができる。少なくとも１つのヒドロゲルは一般に、アルギン酸塩を含み、架橋剤は一般に、二価カチオン、二価カチオン塩、またはそれらの組み合わせを含む。
【0037】
さらなる態様において、カプセル化微生物組成物を調製するための別の方法が記載される。本方法は一般に、微生物と少なくとも１つのヒドロゲルとを組み合わせて前駆体混合物を形成するステップと、前駆体混合物を架橋剤で固化して中間微生物組成物を形成するステップと、および中間微生物組成物を乾燥してカプセル化微生物組成物を形成するステップとを含む。固化は一般に、前駆体混合物を架橋剤と高せん断混合するステップを含む。カプセル化微生物組成物は、約１０％以下の水分含量を有することができる。少なくとも１つのヒドロゲルは一般に、アルギン酸塩を含み、架橋剤は一般に、二価カチオン、二価カチオン塩、またはそれらの組み合わせを含む。
【0038】
さらなる態様において、カプセル化微生物組成物を調製するための別の方法が記載される。本方法は一般に、微生物と、アルギン酸塩を含む少なくとも１つのヒドロゲルとを組み合わせて前駆体混合物を形成するステップと、前駆体混合物を、二価カチオン塩を含む架橋剤で固化して中間微生物組成物を形成するステップと、および中間微生物組成物を乾燥させてカプセル化微生物組成物を形成するステップとを含む。固化は一般に、前駆体混合物を架橋剤と組み合わせるステップを含み、二価カチオン塩は、二価カチオン炭酸塩であり得る。カプセル化微生物組成物は、約１０％以下の水分含量を有することができる。
【0039】
別の態様において、カプセル化微生物組成物が記載される。本カプセル化微生物組成物は一般に、二価カチオンと一緒に結合された少なくとも１つのヒドロゲルを含むポリマーマトリックス中に埋め込まれた微生物を含む。少なくとも１つのヒドロゲルは一般に、アルギン酸塩を含む。カプセル化微生物粒子組成物は、約１０％以下または約５％以下の水分含量を有することができる。
【0040】
別の態様において、カプセル化微生物組成物が記載される。本カプセル化微生物組成物は一般に、二価カチオンと一緒に結合された少なくとも１つのヒドロゲルを含むポリマーマトリックス中に埋め込まれた微生物を含む。少なくとも１つのヒドロゲルは一般に、アルギン酸塩を含む。カプセル化微生物粒子組成物は、約０．５ｇ／ｍＬ以上～約１．５ｇ／ｍＬ以下のタップ密度を有することができる。
【0041】
アルギン酸塩は、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸バリウム、アルギン酸カルシウム、アルギン酸マグネシウム、アルギン酸ストロンチウム、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
【0042】
少なくとも１つのヒドロゲルは、カルボキシメチルセルロース、カラギーナン、酢酸フタル酸セルロース、キトサンおよびキトサン誘導体、コラーゲン、ゼラチン、グリコサミノグリカン、グアーガム、アカシアガム、ヒアルロン酸、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ローカストビーンガム、メチルセルロース、ペクチン、ポリエチレンオキシド、ポリグリコール酸、ポリウレタン、デンプン、加工デンプン、キサンタンガム、またはそれらの組み合わせをさらに含み得る。
【0043】
少なくとも１つのヒドロゲルは、組成物の総重量に基づいて約５重量％～約５０重量％の量で組成物中に存在し得る。
【0044】
ポリマーマトリックスは、窒素含有安定剤、糖含有安定剤、またはそれらの組み合わせをさらに含んでもよい。窒素含有安定剤としては、アンモニア、水酸化アンモニウム、尿素、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、ピロリン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、グルテン、加水分解カゼイン、加水分解ホエータンパク質、加水分解エンドウ豆タンパク質、加水分解ダイズタンパク質、麦芽抽出物、粉乳、ホエー粉末、酵母抽出物、およびこれらの組み合わせが挙げられる。糖含有安定剤としては、例えば、二糖類、糖アルコール、またはこれらの組み合わせが挙げられる。例えば、糖含有安定剤は、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、トレハロース、スクロース、ラクトース、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
【0045】
窒素含有安定剤および糖含有安定剤はそれぞれ、組成物の総重量に基づいて、約５重量％～約５０重量％の量で組成物中に存在し得る。
【0046】
微生物は、芽胞非形成細菌であり得る。例えば、微生物は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ））、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）（例えば、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ））、ヘルバスピリラム（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）（例えば、ハーバスピリラム・フリジンセン（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｅ）、ハーバスピリラム・セロペディカエ（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅ）、ハーバスピリラム・ルブリスバルビカンス（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｉｓｕｂａｌｂｉｃａｎｓ）など）、ファイトバクター（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、ファイトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ファイトバクター・ウルシンギイ（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｓｉｎｇｉｉ）、ファイトバクター・パルマエ（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｌｍａｅ）など）、シュードアシドボラックス（Ｐｓｅｕｄａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）（例えば、シュードアシドボラックス・インターメディウス（Ｐｓｅｕｄａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ））、ミツアリア（Ｍｉｔｓｕａｒｉａ）、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、クリセオモナス（Ｃｈｒｙｓｅｏｍｏｎａｓ）、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ゼノラブダス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）、フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
【0047】
ポリマーマトリックスは、デンプン、セルロース、バイオ炭、軽石、シリカ、クレイ、ゼオライト、パーライト、またはそれらの組み合わせなどのフィラーをさらに含んでもよい。
【0048】
フィラーは、組成物の総重量に基づいて、約０．１重量％～約９０重量％の量で組成物中に存在し得る。
【0049】
二価カチオンは、バリウムカチオン、カルシウムカチオン、マグネシウムカチオン、ストロンチウムカチオン、コバルトカチオン、ニッケルカチオン、亜鉛カチオン、マンガンカチオン、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【0050】
カプセル化微生物組成物は例えば、約３００μｍ以下の粒径を有する粒子の形態であってもよい。
【0051】
カプセル化微生物組成物は、２５℃および６５％の相対湿度（ＲＨ）で、４週間、８週間または１２週間後に、グラムあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｇ）の２ｌｏｇ未満の損失または１ｌｏｇ未満の損失を有し得る。
【0052】
ポリマーマトリックスは、少なくとも１つの疎水性添加剤をさらに含んでもよい。
【0053】
別の態様において、種子組成物が記載される。種子組成物は一般に、植物種子と、植物種子の表面の少なくとも一部分上に存在する本明細書に記載されているカプセル化微生物組成物とを含む。植物種子としては、例えば、野菜種子、果実種子、穀物種子、およびこれらの組み合わせが挙げられる。植物種子のさらなる例としては、キャノーラ種子、トウモロコシ種子、ダイズ種子、コムギ種子、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【0054】
植物種子には、保護剤、除草剤、殺有害生物剤、殺菌剤、またはそれらの組み合わせがさらに含まれ得る。
【0055】
種子組成物は、疎水性コーティングをさらに含んでもよい。
【0056】
さらなる適用可能領域は、本明細書の記載から明らかになるのであろう。この概要における説明および特定の実施例は例示のみを目的とするものであり、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
図面の簡単な説明
本明細書で説明される図面は、選択された実施形態の例示のみを目的とし、全ての可能な実装形態ではなく、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
図面の簡単な説明
本明細書で説明される図面は、選択された実施形態の例示のみを目的とし、全ての可能な実装形態ではなく、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【0057】
【図1】図１（ＦＩＧ．１）は、２５℃および６５％の相対湿度（ＲＨ）でのアルギン酸塩カプセル化シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ビーズの種子上の安定性を示す；
【図6】図６（ＦＩＧ．６）は、２５℃および６５％のＲＨでの様々な塩化カルシウム濃度でのせん断混合法によって調製されたアルギン酸塩カプセル化シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の種子上の安定性を示す；
【図7】図７（ＦＩＧ．７）は、２５℃および６５％のＲＨでの追加のヒドロゲルまたはバイオ炭とのせん断混合法によって調製されたアルギン酸塩カプセル化シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の種子上の安定性を示す；
【図12】図１２（ＦＩＧ．１２）は、異なる添加剤が含まれている、アルギン酸塩カプセル化ファイトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）の動的水蒸気収着（ＤＶＳ）データを示す；
【図13】図１３（ＦＩＧ．１３）は、ファイトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）の安定性に対する、異なる添加剤を用いたアルギン酸塩カプセル化の影響を示す；
【発明を実施するための形態】
【0058】
例示的な実施形態の詳細な説明
例示的な実施形態の以下の説明は、当業者が添付の特許請求の範囲に記載される主題を作成および使用することを可能にする情報を提供するが、当技術分野で既に周知の特定の詳細を省略することがある。したがって、以下の詳細な説明は例示として解釈されるべきであり、限定として解釈されるべきではない。そうは言っても、例示的な実施形態は、添付の図面を参照してより完全に説明されることになる。
例示的な実施形態の以下の説明は、当業者が添付の特許請求の範囲に記載される主題を作成および使用することを可能にする情報を提供するが、当技術分野で既に周知の特定の詳細を省略することがある。したがって、以下の詳細な説明は例示として解釈されるべきであり、限定として解釈されるべきではない。そうは言っても、例示的な実施形態は、添付の図面を参照してより完全に説明されることになる。
【0059】
例えば、成長を促進し、および／または有害生物防除を提供するために植物種子に施用することができる、安定性が増加したカプセル化微生物組成物、および安定性が増加したそのようなカプセル化微生物組成物を調製するための方法が、本明細書に記載される。組成物は、二価カチオンと一緒に結合したアルギン酸塩などの少なくとも１つのヒドロゲルを含むポリマーマトリックス中に埋め込まれた微生物、例えば、芽胞非形成細菌、を含むことができる。組成物は、一般的に（または相対的に）より低い水分含量、例えば約１０％未満；一般的に（または相対的に）例えば約０．５ｇ／ｍＬ～約１．５ｇ／ｍＬの増加したタップ密度；および／または約２００μｍ以下（例えば約１５０μｍ以下、約１００μｍ以下などを含む）の平均粒径などを有することができる。典型的には、カプセル化微生物組成物は、噴霧乾燥ステップなどの速乾ステップを含むプロセスによって製造されてきている。しかしながら、これらの従来の組成物は、長期貯蔵安定性を維持することが困難である。驚くべきことに、安定性が増加したカプセル化微生物組成物は、より遅い乾燥ステップを含む本明細書に記載されている方法によって、例えば、以下でより十分に議論されるように、より低い温度でより遅い蒸発速度を利用することによって、達成され得ることが発見された。
Ｉ．カプセル化微生物組成物
Ｉ．カプセル化微生物組成物
【0060】
カプセル化微生物組成物が本明細書に提供される。組成物は、二価カチオンと一緒に結合した少なくとも１つのヒドロゲルを含むポリマーマトリックス中に埋め込まれた微生物を含むことができる。組成物は有利には、より低い水分含量を有し、それらを、例えば、植物種子施用および処理のための長期貯蔵により適したものにする増大した安定性を有する。
【0061】
任意の実施形態において、カプセル化微生物組成物は、種子から離れて（または種子を外して）形成され得、例えば、種子への施用前に（例えば、種子のための種子処理の一部としてなど）粉末などとして貯蔵され得る。例えば、粉末形態で、微生物組成物は乾燥粉末として、または適切な溶媒、例えば、ポリエチレングリコールなどの水混和性溶媒中に分散された粉末として施用され得る。あるいは、任意の実施形態において、カプセル化微生物組成物は、種子に直接施用され、および／または、例えば、種子上の処理として、種子上に形成され得る。
Ａ．微生物
Ａ．微生物
【0062】
「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」という用語は、細菌、古細菌、ウイルス、真菌、プリオン、原生動物、藻類、および寄生虫を含むがこれらに限定されない、任意の種またはタイプの微生物を指す。本明細書で使用される「微生物」という用語は、個々の微生物、および任意の数の微生物を含む組み合わせまたは調製物の両方を包含することが意図される。用語「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」および「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」は、本明細書において互換的に使用される。「細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）」および「細菌（ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）」という用語は、単細胞原核生物微生物を指す。この用語は、マイコプラズマを含む、細菌と考えられる全ての微生物を包含することが意図される。球菌、桿菌、スピロヘータ、スフェロプラスト、プロトプラストなどを含む、あらゆる形態の細菌が本明細書に包含される。この用語はまた、グラム陰性およびグラム陽性細菌、ならびに芽胞形成細菌および芽胞非形成細菌を含む。「真菌（ｆｕｎｇｕｓ）」または「真菌（ｆｕｎｇｉ）」という用語は、カビ、酵母、およびキノコなどの真菌界由来の真核微生物を指す。
【0063】
任意の実施形態において、微生物は、芽胞非形成細菌、芽胞形成細菌の栄養細胞を含む芽胞形成細菌、真菌、またはそれらの組み合わせであり得る。例えば、任意の実施形態において、本明細書における微生物は、任意の細菌、真菌、またはそれらの組み合わせの栄養細胞を含み得る。さらに、微生物は、芽胞形成細菌の栄養細胞であってもよく、この場合、芽胞形成細菌は、製剤される培養細胞が全てまたは部分的に栄養細胞であるように、芽胞形成の完全な欠如または部分的な芽胞形成をもたらす方法で培養されている。
【0064】
細菌微生物の例としては以下の属の細菌が挙げられるが、これらに限定されない：アクロモバクタ―（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アンペロミセス（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ）、オーレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ボーベリア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クリセオモナス（Ｃｈｒｙｓｅｏｍｏｎａｓ）、コルディテプス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、デバリオミセス（Ｄａｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、デルフチア（Ｄｅｌｆｔｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エクソフィアラ（Ｅｘｏｐｈｉｌｉａ）、グリオクラディウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）、ハーバスピリラム（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マリアンナエア（Ｍａｒｉａｎｎａｅａ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃｕｓ）、ミツアリア（Ｍｉｔｓｕａｒｉａ）、ペキロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、パエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、ファイトバクター（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、シュードアシドボラックス（Ｐｓｅｕｄａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ゼノラブダス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）、およびそれらの組み合わせ。例えば、微生物は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ハーバスピリラム（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ファイトバクター（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ）、シュードアシドボラックス（Ｐｓｅｕｄａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）、ミツアリア（Ｍｉｔｓｕａｒｉａ）、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、クリセオモナス（Ｃｈｒｙｓｅｏｍｏｎａｓ）、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ゼノラブダス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）、フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される細菌であり得る。
【0065】
任意の実施形態において、微生物は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｅｎｕｓ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｇｅｎｕｓ）、ファイトバクター属（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ ｇｅｎｕｓ）、またはそれらの組み合わせに属する細菌であり得る。シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）の例としては、これらに限定されないが、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）グループ（例えば、Ｐ．エルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｐ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、Ｐ．アンギリセプチカ（Ｐ．ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａ）、など）、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏａｐｈｉｓ）グループ（例えば、Ｐ．アウランティアカ（Ｐ．ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、Ｐ．アウレファシエンス（Ｐ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、Ｐ．クロロラフィス（Ｐ．ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、など）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）グループ（例えば、Ｐ．アゾトフォルマンス（Ｐ．ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｎｓ）、Ｐ．ミグラエ（Ｐ．ｍｉｇｕｌａｅ）、など）、シュードモナス・ペルツシノゲナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｅｒｔｕｃｉｎｏｇｅｎａ）グループ（例えば、Ｐ．デニトリフィカンス（Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、Ｐ．ペルツシノゲナ（Ｐ．ｐｅｒｔｕｃｉｎｏｇｅｎａ））、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）グループ（例えば、Ｐ．クレモリコロラタ（Ｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｃｏｌｏｒａｔａ）、Ｐ．エントモフィラ（Ｐ．ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、Ｐ．フルバ（Ｐ．ｆｕｌｖａ）、など）、シュードモナス・スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）グループ（例えば、Ｐ．バレアリカ（Ｐ．ｂａｌｅａｒｉｃａ）、Ｐ．ルテオラ（Ｐ．ｌｕｔｅｏｌａ）、Ｐ．スタッツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ））、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）グループ（例えば、Ｐ．アミグダリ（Ｐ．ａｍｙｇｄａｌｉ）、Ｐ．アベルラナエ（Ｐ．ａｖｅｌｌａｎａｅ）、Ｐ．カリカパパヤエ（Ｐ．ｃａｒｉｃａｐａｐａｙａｅ））の種、およびそれらの組み合わせが挙げられる。ブラディリゾビウム種（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）の例としては、これらに限定されないが、ブラディリゾビウム・アラキディス（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ａｒａｃｈｉｄｉｓ）、ブラディリゾビウム・ベタエ（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｂｅｔａｅ）、ブラディリゾビウム・カナリエンス（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃａｎａｒｉｅｎｓｅ）、ブラディリゾビウム・ジアゾエフフィシエンス（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｄｉａｚｏｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、ブラディリゾビウム・エリトロファレイ（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｒｙｔｈｒｏｐｈｌｅｉ）、ブラディリゾビウム・フェリリグニ（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｆｅｒｒｉｌｉｇｎｉ）、ブラディリゾビウム・イセンセ（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｉｃｅｎｓｅ）、ブラディリゾビウム・インゲ（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｉｎｇａｅ）、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、ブラディリゾビウム・カバンゲンセ（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｋａｖａｎｇｅｎｓｅ）、ブラディリゾビウム・オリゴトロフィカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ブラディリゾビウム・レタメ（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒｅｔａｍａｅ）、ブラディリゾビウム・ビリジフツリ（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｒｉｄｉｆｕｔｕｒｉ）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。ファイトバクター種（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓ）の例としては、これらに限定されないが、ファイトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ファイトバクター・ウルシンギイ（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｓｉｎｇｉｉ）、ファイトバクター・パルマエ（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｌｍａｅ）、ファイトバクター・マスシリエンセス（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅｓ）の種、およびそれらの組み合わせの種が挙げられる。ハーバスピリラム種（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）の例としては、これらに限定されないが、ハーバスピリラム・フリシンゲンス（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｅ）、ハーバスピリラム・セロペディカエ（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅ）、ハーバスピリラム・ルブリスバルビカンス（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｉｓｕｂａｌｂｉｃａｎｓ）の種、およびこれらの組み合わせの種が挙げられる。いくつかの実施形態において、微生物は、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、ファイトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ハーバスピリラム・フリシンゲンス（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｅ）、またはそれらの組み合わせであり得る。
【0066】
追加的または代替的に、微生物は真菌であってもよい。真菌の例としては、それらに限定されないが、ムスコドル種（Ｍｕｓｃｏｄｏｒ ｓｐｅｃｉｅｓ）、アスケルソニア・アレイロディス（Ａｓｃｈｅｒｓｏｎｉａ ａｌｅｙｒｏｄｉｓ）、ボーベリア・バシアーナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ）（「ホワイトムスカリン」）、ボーベリア・ブロンニアティ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂｒｏｎｇｎｉａｒｔｉｉ）、クラドスポリウム・ヘルバルム（Ｃｈｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｈｅｒｂａｒｕｍ）、コルディセプス・クラブラタ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｃｌａｖｕｌａｔａ）、コルディセプス・エントモルヒザ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｅｎｔｏｍｏｒｒｈｉｚａ）、コルディセプス・ファシス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｆａｃｉｓ）、コルディセプス・グラシリス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｇｒａｃｉｌｉｓ）、コルディセプス・メロランタ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｅｌｏｌａｎｔｈａｅ）、コルディセプス・ミリタリス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）、コルディセプス・ミルメコフィラ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｙｒｍｅｃｏｐｈｉｌａ）、コルジセプス・ラベネリイ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｒａｖｅｎｅｌｉｉ）、コルジセプス・シネンシス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、コルジセプス・スフェコセファラ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｐｈｅｃｏｃｅｐｈａｌａ）、コルジセプス・サブセシリス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｕｂｓｅｓｓｉｌｉｓ）、コルジセプス・ウニラテラリス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｕｎｉｌａｔｅｒａｌｉｓ）、コルジセプス・バリアビリス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、コルジセプス・ワシントネンシス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎｅｎｓｉｓ）、クリシノマイセス・クラボスポラス（Ｃｕｌｉｃｉｎｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｏｓｐｏｒｕｓ）、エントモファガ・グリリ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ ｇｒｙｌｌｉ）、エントモファガ・マイマイガ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ ｍａｉｍａｉｇａ）、エントモファガ・ムスカ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ ｍｕｓｃａｅ）、エントモファガ・プラキシブリ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ ｐｒａｘｉｂｕｌｌｉ）、エントモフトラ・プルテラ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ ｐｌｕｔｅｌｌａｅ）、フザリウム・ラテリチウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｌａｔｅｒｉｔｉｕｍ）、ヒルステラ・シトルホルミス（Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ ｃｉｔｒｉｆｏｒｍｉｓ）、ヒルステラ・トムプセニ（Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ ｔｈｏｍｐｓｏｎｉ）、コッキョウビョウキン（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）（「グリーンムスカリン」）、メタリジウム・フラビリデ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ ｆｌａｖｉｒｉｄｅ）、マスコドール・アルバス（Ｍｕｓｃｏｄｏｒ ａｌｂｕｓ）、ネオジギテスフロリダナ（Ｎｅｏｚｙｇｉｔｅｓｆｌｏｒｉｄａｎａ）、ノムラエア・リレー（Ｎｏｍｕｒａｅａ ｒｉｌｅｙｉ）、ぺシロマイセス・ファリノサス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｆａｒｉｎｏｓｕｓ）、ペキロマイセス・フモソロセウス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｆｕｍｏｓｏｒｏｓｅｕｓ）、パンドラ・ネオアフィディス（Ｐａｎｄｏｒａ ｎｅｏａｐｈｉｄｉｓ）、トリポクラディウム・シリンドロスポルム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒｕｍ）、バーチシリウム・レカニ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｅｃａｎｉｉ）、ゾーフトラ・ラジカンス（Ｚｏｏｐｈｔｈｏｒａ ｒａｄｉｃａｎｓ）、マイコルヒザル種（ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えば、ラッカリア・ビカラー（Ｌａｃｃａｒｉａ ｂｉｃｏｌｏｒ）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
Ｂ．ヒドロゲル
Ｂ．ヒドロゲル
【0067】
様々な態様では、少なくとも１つのヒドロゲルは、親水性ポリマー、多糖類、ガム、樹脂、加水分解タンパク質、またはそれらの組み合わせを含むことができる。好適なヒドロゲルの例としては、これらに限定されないが、アルギン酸塩、カルボキシメチルセルロース、カラギーナン、酢酸フタル酸セルロース、キトサンおよびキトサン誘導体、コラーゲン、ゼラチン、グリコサミノグリカン、グアーガム、アカシアゴム、ヒアルロン酸、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ローカストビーンガム、メチルセルロース、ペクチン、ポリエチレンオキシド、ポリグリコール酸、ポリウレタン、デンプン、加工デンプン、キサンタンガム、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【0068】
任意の実施形態において、少なくとも１つのヒドロゲルは、アルギン酸塩を含むことができる。例えば、アルギン酸塩は、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸バリウム、アルギン酸カルシウム、アルギン酸マグネシウム、アルギン酸ストロンチウム、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
【0069】
任意の実施形態において、少なくとも１つのヒドロゲルは、本明細書に記載されるアルギン酸塩、ならびにカルボキシメチルセルロース、カラギーナン、酢酸フタル酸セルロース、キトサンおよびキトサン誘導体、コラーゲン、ゼラチン、グリコサミノグリカン、グアーガム、アカシアゴム、ヒアルロン酸、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ローカストビーンガム、メチルセルロース、ペクチン、ポリエチレンオキシド、ポリグリコール酸、ポリウレタン、デンプン、加工デンプン、キサンタンガム、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるさらなるヒドロゲルを含むことができる。
【0070】
少なくとも１つのヒドロゲルは、組成物の総重量に基づいて、約２．５重量％以上、約５重量％以上、約１０重量％以上、約２０重量％以下、約６０重量％以下、約５０重量％以下、約４０重量％以下、または約３０重量％以下、または約５重量％～約６０重量％、約５重量％～約５０重量％、約５重量％～約４０重量％、約５重量％～約３０重量％、約５重量％および約２０重量％、約１０重量％～約６０重量％、約１０重量％～約５０重量％、約１０重量％～約４０重量％、約１０重量％～約３０重量％、または約１０重量％および約２０重量％などの量で組成物中に存在し得る。任意の実施形態において、少なくとも１つのヒドロゲルは、組成物の総重量に基づいて、例えば、約５重量％～約５０重量％の量で組成物中に存在し得る。
Ｃ．二価カチオン
Ｃ．二価カチオン
【0071】
好適な二価カチオンとしては、ヒドロゲルを架橋することができる金属二価カチオンが挙げられる。好適な二価カチオンの非限定的な実例としては、バリウム（Ｂａ２＋）カチオン、カルシウム（Ｃａ２＋）カチオン、マグネシウム（Ｍｇ２＋）カチオン、ストロンチウム（Ｓｒ２＋）カチオン、コバルト（Ｃｏ２＋）カチオン、ニッケル（Ｎｉ２＋）カチオン、亜鉛（Ｚｎ２＋）が挙げられる。任意の実施形態において、二価カチオンは例えば、カルシウムカチオンであってもよい。
Ｄ．安定剤
Ｄ．安定剤
【0072】
任意の実施形態において、ポリマーマトリックスは、１つ以上の安定剤をさらに含み得る。例えば、安定剤は、窒素含有安定剤、糖含有安定剤、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【0073】
好適な窒素含有安定剤の例としては、これらに限定されないが、アンモニア、水酸化アンモニウム、尿素、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、ピロリン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、グルテン、加水分解カゼイン、加水分解ホエータンパク質、加水分解エンドウ豆タンパク質、加水分解ダイズタンパク質、麦芽抽出物、粉乳、ホエー粉末、酵母抽出物、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【0074】
好適な糖含有安定剤の例としては、これらに限定されないが、二糖類、糖アルコール、およびこれらの組み合わせが挙げられる。例えば、糖含有安定剤は、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、トレハロース、スクロース、ラクトース、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
【0075】
安定剤、例えば、窒素含有安定剤および糖含有安定剤は、単独でまたは組み合わせて、組成物の総重量に基づいて、約２．５重量％以上、約５重量％以上、約１０重量％以上、約２０重量％以上、約６０重量％以下、約５０重量％以下、約４０重量％以下、または約３０重量％以下、または約５重量％～約６０重量％、約５重量％～約５０重量％、約５重量％～約４０重量％、約５重量％～約３０重量％、約５重量％および約２０重量％、約１０重量％～約６０重量％、約１０重量％～約５０重量％、１０重量％～約４０重量％、約１０重量％～約３０重量％、または約１０重量％および約２０重量％などの量で組成物中に存在し得る。任意の実施形態において、窒素含有安定剤および糖含有安定剤は、単独でまたは組み合わせて、組成物の総重量に基づいて、例えば、約５重量％～約５０重量％の量で組成物中に存在し得る。
Ｅ．追加の成分
Ｅ．追加の成分
【0076】
任意の実施形態において、ポリマーマトリックスは、フィラー（不活性担体とも呼ばれる）をさらに含んでもよい。フィラーの例としては、これらに限定されないが、デンプン、加工デンプン、マルトデキストリン、ガム、珪藻土、ローム、セルロース、バイオ炭、軽石、シリカ、ケイ酸塩、タルク、カオリン、石灰石、ライン、チョーク、クレイ（例えば、メクタイト、ヘクトライト、ベントナイト、モンモリロナイト、セライト、イライト、およびそれらの組み合わせ）、ドロマイト、ゼオライト、パーライト、およびそれらの組み合わせが挙げられる。任意の実施形態において、フィラーは、バイオ炭を含んでもよい。用語「バイオ炭」は、無酸素または嫌気条件下でバイオマスの熱分解から形成される炭素質固体を指す。
【0077】
フィラーは、組成物の総重量に基づいて、約０．１重量％以上、約１重量％以上、約２．５重量％以上、約５重量％以上、約１０重量％以上、約２０重量％以上、約３０重量％以上、約４０重量％以上、約５０重量％以上、約９５重量％以下、約９０重量％以下、約８０重量％以下、約７０重量％以下、または約６０重量％以下、または約０．１重量％～約９５重量％、約０．１重量％～約９０重量％、約０．１重量％～約８０重量％、約０．１重量％～約７０重量％、約０．１重量％～約６０重量％、約０．１重量％～約５０重量％、約０．１重量％～約４０重量％、約０．１重量％～約３０重量％、約０．１重量％～約２０重量％、約０．１重量％～約１０重量％、約０．１重量％～約５重量％、約０．１重量％～約２．５重量％、約１０重量％～約９５重量％、約１０重量％～約９０重量％、約１０重量％～約８０重量％、約１０重量％～約７０重量％、約１０重量％～約６０重量％、約１０重量％～約５０重量％、約１０重量％～約４０重量％、約１０重量％～約３０重量％、約１０重量％～約２０重量％、約５０重量％～約９５重量％、約５０重量％～約９０重量％、約５０重量％～約８０重量％、約５０重量％～約７０重量％、または約５０重量％～約６０重量％などの量で組成物中に存在することができる。任意の実施形態において、フィラーは、組成物の総重量に基づいて、例えば、約０．１重量％～約９０重量％の量で組成物中に存在し得る。
【0078】
追加的または代替的に、組成物は，界面活性剤、分散剤、乳化剤、湿潤剤、アジュバント、可溶化剤、浸透促進剤、保護コロイド、接着剤、増粘剤、保湿剤、忌避剤、誘引剤、摂食刺激剤、相溶化剤、凍結防止剤、消泡剤、着色剤、粘着付与剤、結合剤、および／または疎水性添加剤などであるが、これらに限定されない、１つ以上の追加の成分（または添加剤）を任意に含み得る。特に、任意の実施形態において、追加の成分は、１つ以上の疎水性添加剤を含んでもよく、したがって、組成物は、疎水性、水溶性および／または分散性、微生物適合性、フィルム形成性、および／または乾燥時の水分バリアなどである１つ以上の疎水性添加剤を含んでもよい。このような実施形態において、１つ以上の疎水性添加剤が例えば、シルクフィブロイン溶液、ワックスベースの分散剤、エチルセルロースもしくは他の変性セルロースの分散剤、アルカリ化セラック溶液、変性キトサン溶液、ポリビニルアルコール、変性アクリレートもしくはメタクリレートベースの溶液、またはそれらの組合せを含み得る。加えて、そのような実施形態において、１つ以上の疎水性添加剤は、組成物の種子上の安定性を（例えば、組成物のマトリックスによる水分取り込みを低減、制限、阻害などすることによって）増強、延長、などし得る。
Ｆ．組成物特性
Ｆ．組成物特性
【0079】
上記のように、組成物は、有利には、増加した安定性を示すことができる。例えば、組成物の増加した安定性は、例えば、上昇した温度および上昇した相対湿度（ＲＨ）で、長期間後、組成物中に存在する微生物の持続的生存能力によって実証することができる。組成物中の微生物のこの持続的生存能力は例えば、組成物が種子、植物、または植物の一部に施用された後の、ある範囲の温度および相対湿度での期間後のグラム当たりの微生物コロニー形成単位（ＣＦＵ／ｇ）の最小限の損失によって実証することができる。例えば、カプセル化微生物組成物は、ＣＦＵ／ｇの約４ｌｏｇ以下の損失、ＣＦＵ／ｇの約３ｌｏｇ以下の損失、ＣＦＵ／ｇの約２ｌｏｇ以下の損失、またはＣＦＵ／ｇの約１ｌｏｇ以下の損失を示すことができる。微生物のこの測定された損失ＣＦＵ／ｇは、種子、植物、もしくは植物の一部への組成物の施用から約１週間、約４週間後、約６週間後、約８週間後、約１０週間後、約１２週間後、約１６週間後、約２０週間後、または約２４週間後、または約１週間～約２４週間、約１週間～約２０週間、約１週間～約１６週間、約１週間～約１２週間、約１週間～約８週間、約１週間～約４週間、約４週間～約２４週間、約４週間～約２０週間、約４週間～約１６週間、約４週間～約１２週間、または約４週間～約８週間などに測定され得、および／または生じ得る。追加的または代替的に、微生物のこの測定された損失ＣＦＵ／ｇは、約１５℃以上、約２０℃以上、約２５℃以上、約４０℃以下、約３５℃以下、約３０℃以下、または約１５℃～約４０℃、約１５℃～約３５℃、約１５℃～約３０℃、約１５℃～約２５℃、または約１５℃～約２０℃などの温度（例えば、周囲温度、組成物温度など）で測定され得、かつ／または生じ得る。追加的または代替的に、微生物のこの測定された損失ＣＦＵ／ｇは、約５０％以上、約６０％以上、約６５％以上、約９０％以下、約８０％以下、約７０％以下、または約５０％～約９０％、約５０％～約８０％、約５０％～約７０％、または約５０％～約６５％などのＲＨで測定され得、および／または生じ得る。特に、カプセル化微生物組成物は、２５℃および６５％の相対湿度（ＲＨ）で４週間、８週間または１２週間後に、コロニー形成単位／ｇ（ＣＦＵ／ｇ）の２ｌｏｇ未満または１ｌｏｇ未満の損失を有し得る。
【0080】
さらに、組成物は、より低い水分含量を有し得る。例えば、組成物は、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、または約０．１％以下、または約０．１％～約２５％、約０．１％～約２０％、約０．１％～約１５％、約０．１％～約１０％、約０．１％～約５％、または約０．１％～約１％などの水分含量を有し得る。組成物の水分含量は、赤外線（ＩＲ）水分分析器を用いて測定することができる。例えば、試料の水分含量を測定するために、試料の開始重量を記録することができ、その後、ハロゲンランプまたは他の赤外線放射器が試料を加熱および乾燥させることができ、一方、統合された天秤が試料重量を継続的に記録する。試料もはや重量を失わない場合、ＩＲ水分分析器は停止し、水分含量は当業者によって理解されるように、重量の総損失に基づいて計算することができる。
【0081】
任意の実施形態において、組成物は、約１μｍ以上、約１０μｍ以上、約２５μｍ以上、約５０μｍ以上、約１００μｍ以上、約１５０μｍ以上、約２００μｍ以上、約２５０μｍ以上、約３００μｍ以上、約２０ｍｍ以下、約１ｍｍ以下、約５００μｍ以下、約３００μｍ以下、約２００μｍ以下、約１００μｍ以下、約７５μｍ以下、約５０μｍ以下、約２５μｍ以下、約１０μｍ以下、約５μｍ以下、または約２５μｍ～約２０ｍｍ、約２５μｍ～約１ｍｍ、約２５μｍ～約５００μｍ、約２５μｍ～約３００μｍ、約２５μｍ～約２００μｍ、約２５μｍ～約１５０μｍ、約２５μｍ～約１００μｍ、約２５μｍ～約５０μｍ、約５０μｍ～約３００μｍ、約５０μｍ～約２００μｍ、約５０μｍ～約１５０μｍ、約５０μｍ～約１００μｍなどの平均粒径を有する粒子として存在し得る。
【0082】
任意の実施形態において、組成物は、約１×１０８ＣＦＵ／グラム以上、約３×１０８ＣＦＵ／グラム以上、約５×１０８ＣＦＵ／グラム以上、約８×１０８ＣＦＵ／グラム以上、約１×１０９ＣＦＵ／グラム以上、約１×１０１０ＣＦＵ／グラム以下、約８×１０９ＣＦＵ／グラム以下、約５×１０９以下、または約３×１０９ＣＦＵ／グラム以下、または約１×１０８ＣＦＵ／グラム～約１×１０１０ＣＦＵ／グラム、約１×１０８ＣＦＵ／グラム～約８×１０９ＣＦＵ／グラム、約１×１０８ＣＦＵ／グラム～約５×１０９ＣＦＵ／グラム、約１×１０８ＣＦＵ／グラム～約３×１０９ＣＦＵ／グラム、約１×１０８ＣＦＵ／グラム～約１×１０９ＣＦＵ／グラム、約１×１０８ＣＦＵ／グラム～約８×１０８ＣＦＵ／グラム、約１×１０８ＣＦＵ／グラム～約５×１０８ＣＦＵ／グラム、または約１×１０８ＣＦＵ／グラム～約３×１０８ＣＦＵ／グラムを含み得る。
【0083】
さらに、組成物は、一般的に（または比較的）より高いタップ密度（例えば、従来の形成された組成物（例えば、従来の噴霧乾燥技術を使用して形成された組成物など）と比較して）を有し得る。本明細書で使用される場合、タップ密度は、組成物を含有する容器を機械的にタップした後に達成される増加した嵩密度を指し得る。例えば、組成物の初期体積または質量を決定することができ、次いで、組成物を保持する容器を機械的にタッピングすることができる（例えば、容器および組成物を上昇させ、それ自体の質量、特定の距離などの下でそれを落下させることによって）。次いで、タッピングの各々の後に、さらなる体積または質量変化がほとんどまたはまったく（または最小限に）観察されなくなるまで、組成物のさらなる体積または質量読取り値を再度決定することができる。本明細書の組成物のそのようなより高いタップ密度は、組成物の水分取り込みの減少に関連し、それに対応することがあることなどが見出された。例えば、組成物は、約０．５ｇ／ｍＬ以上、約０．６ｇ／ｍＬ以上、約０．７ｇ／ｍＬ以上、約０．８ｇ／ｍＬ以上、約１．５ｇ／ｍＬ以下、約１．４ｇ／ｍＬ以下、約１．３ｇ／ｍＬ以下、約１．２ｇ／ｍＬ以下、約１．１ｇ／ｍＬ以下、約１ｇ／ｍＬ以下、または約０．９ｇ／ｍＬ以下；または約０．５ｇ／ｍＬ以上～約１．５ｇ／ｍＬ以下、約０．５ｇ／ｍＬ以上～約１．４ｇ／ｍＬ以下、約０．５ｇ／ｍＬ以上～約１．３ｇ／ｍＬ、約０．５ｇ／ｍＬ以上～約１．２ｇ／ｍＬ以下、約０．７ｇ／ｍＬ以上～約１．５ｇ／ｍＬ以下、約０．７ｇ／ｍＬ以上～約１．２ｇ／ｍＬ以下、約０．７ｇ／ｍＬ以上～約１．１ｇ／ｍＬ以下等のタップ密度を有することができる。
ＩＩ．種子組成物
ＩＩ．種子組成物
【0084】
植物種子組成物も本明細書において提供され、それは、植物種子と、例えば、種子上のコーティングとして、植物種子の表面の少なくとも一部分上に存在する本明細書に記載されているカプセル化微生物組成物とを含む。任意の実施形態において、カプセル化微生物組成物は、種子処理として（または種子処理の一部として）製剤化され得る。種子は、種子に種子処理製品を正確に、安全に、かつ効率的に施用するように設計および製造された処理施用装置の使用を通して、混合、噴霧、またはそれらの組み合わせの従来の方法を使用して、本明細書に記載されているカプセル化微生物組成物の１つ以上の層で実質的に均一に被覆され得ることが、本明細書において企図される。そのような装置は、ロータリーコータ、ドラムコータ、流動床技術、噴流床、回転ミスト、またはそれらの組み合わせなどの様々なタイプのコーティング技術を使用する。したがって、任意の実施形態において、カプセル化微生物組成物は例えば、液体形態で、回転する「アトマイザー」ディスクまたはスプレーノズル（またはカプセル化微生物組成物の異なる成分にそれぞれ関連付けられた複数のスプレーノズル、例えば、種子上で形成される場合）のいずれかを介して、種子に施用され得、これはスプレーパターンを通って移動することにつれて、種子上に組成物を均一に分配する。好ましくは、その後、種子は追加の処理の分布および乾燥を達成するために、追加の期間、混合またはタンブリングされる。種子は、発芽および出芽の均一性を増加させるために、カプセル化微生物組成物でコーティングする前に、プライミングされてもよく、またはプライミングされなくてもよい。代替の実施形態において、乾燥粉末製剤が移動する種子上に計量され（例えば、施用され、等）、完全に分配されるまで混合されてもよい。
【0085】
追加的または代替的に、カプセル化微生物組成物を含む植物種子および／または種子処理は、活性炭、栄養素（肥料）、および製品の発芽および品質を改善することができる他の薬剤、またはそれらの組み合わせなどの、選択的除草剤の有害な効果から種子を保護することができる保護剤をさらに含有する可能性がある。
【0086】
カプセル化微生物組成物を含む種子処理製剤に様々な添加剤を添加することができる。結合剤は添加されてもよく、好ましくはコーティングされる種子に植物毒性効果を及ぼすことなく、天然または合成であり得る接着性ポリマーから構成されるものを含む。結合剤は、ポリ酢酸ビニル、ポリ酢酸ビニルコポリマー、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルコールコポリマー、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含むセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、加工デンプン、デキストリン、マルトデキストリン、アルギン酸塩およびキトサンを含む多糖類、脂肪、油、ゼラチンおよびゼインを含むタンパク質、アラビアゴム、シェラック、塩化ビニリデンおよび塩化ビニリデンコポリマー、リグノスルホン酸カルシウム、アクリルコポリマー、ポリビニルアクリレート、ポリエチレンオキシド、アクリルアミドポリマーおよびコポリマー、ポリヒドロキシエチルアクリレート、メチルアクリルアミドモノマー、およびポリクロロプレン、またはそれらの組み合わせから選択され得る。
【0087】
ニトロソに分類される有機発色団；ニトロ；モノアゾ、ビスアゾおよびポリアゾを含むアゾ；アクリジン、アントラキノン、アジン、ジフェニルメタン、インダミン、インドフェノール、メチン、オキサジン、フタロシアニン、チアジン、チアゾール、トリアリールメタン、キサンテン；またはそれらの組み合わせなどの様々な着色剤のいずれかを含めることができる。添加され得る他の添加剤としては、鉄、マンガン、ホウ素、銅、コバルト、モリブデン、亜鉛の塩、またはそれらの組み合わせなどの微量栄養素が挙げられる。ポリマーまたは他のダスト制御剤を適用して、種子表面上に処理を保持することができる。
【0088】
追加的または代替的に、コーティングは、接着層をさらに含んでもよい。好適な接着剤の例としては限定されるものではないが、ポリ酢酸ビニル、ポリ酢酸ビニルコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルコールコポリマー、セルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、およびヒドロキシメチルプロピルセルロース、デキストリン、アルギン酸塩、糖類、糖蜜、ポリビニルピロリドン、多糖類、タンパク質、脂肪、油、アラビアゴム、ゼラチン、シロップ、デンプン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【0089】
分散剤、界面活性剤、ならびに栄養素および緩衝剤成分などの様々な添加剤も、種子上および／または種子処理製剤中に含めることができる。他の従来の種子処理添加剤としては、これらに限定されないが、コーティング剤、湿潤剤、緩衝剤、および多糖類が挙げられる。少なくとも１つの農業上許容される担体、例えば水、固体または乾燥粉末を種子処理製剤に添加することができる。乾燥粉末は、炭酸カルシウム、石膏、バーミキュライト、タルク、フムス、活性炭、様々なリン化合物、および／またはそれらの組み合わせなどの様々な材料から誘導され得る。
【0090】
任意の実施形態において、種子および／または種子処理製剤は、活性成分を組み合わせて種子への施用を容易にする有機または無機、天然または合成成分である少なくとも１種のフィラーを含んでもよい。好ましくは、フィラーは、不活性固体、例えばクレイ、天然または合成ケイ酸塩、シリカ、樹脂、ワックス、固体肥料（例えばアンモニウム塩）、天然土壌鉱物、例えばカオリン、クレイ、タルク、石灰、石英、アタパルガイト、モンモリロナイト、ベントナイトまたは珪藻土、または合成鉱物、例えばシリカ、アルミナまたはケイ酸塩、特にアルミニウムまたはマグネシウムケイ酸塩である。
【0091】
種子および／または種子処理製剤は、以下の成分の１つ以上をさらに含むことができる：殺有害生物剤、地下でのみ作用する化合物を含む；殺菌剤、例えばカプタン、チラム、メタラキシル、フルジオキソニル、オキサジキシル、およびそれらの各材料の異性体など；除草剤、グリホサート、カルバメート、チオカルバメート、アセトアミド、トリアジン、ジニトロアニリン、グリセロールエーテル、ピリダジノン、ウラシル、フェノキシ、尿素、および安息香酸から選択される化合物を含む；除草剤薬害軽減剤、例えばベンゾオキサジン、ベンズヒドリル誘導体、Ｎ，Ｎ－ジアリルジクロロアセトアミド、様々なジハロアシル、オキサゾリジニルおよびチアゾリジニル化合物、エタノン、ナフタル酸無水物化合物、およびオキシム誘導体などの；化学肥料；および生物肥料。これらの成分は、種子上の別個の層として添加されてもよく、あるいは本明細書に記載されている種子コーティング組成物の一部として添加されてもよい。
【0092】
好ましくは、種子処理に使用されるカプセル化微生物組成物または他の成分の量は、種子の発芽を阻害すべきではなく、または種子に植物毒性損傷を引き起こすべきではない。
【0093】
種子を処理するために使用される製剤は、懸濁液；エマルジョン；水性媒体（例えば、水）中の粒子のスラリー；水和剤（粉末）；顆粒水和剤（ドライフロアブル）；および乾燥顆粒の形態であり得る。
【0094】
上記のように、他の従来の不活性（ｉｎａｃｔｉｖｅ）または不活性（ｉｎｅｒｔ）成分を製剤に組み込むことができる。そのような不活性成分としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：従来の粘着剤；メチルセルロースなどの分散剤、例えば、種子処理に使用するための混合分散剤／粘着剤としての役割を果たす、ポリビニルアルコール、レシチン、ポリマー分散剤（例えば、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニル）、増粘剤（例えば、粘度を改善し、粒子懸濁液の沈降を低減するためのクレイ増粘剤）、エマルジョン安定剤；界面活性剤；凍結防止化合物（例えば、尿素）、染料、着色剤など。
【0095】
本明細書に記載される微生物カプセル化組成物およびコーティング製剤は、容器（例えば、ボトルまたはバッグ）中での混合、機械的施用、タンブリング、噴霧および浸漬を含むが、これらに限定されない様々な方法によって種子に施用され得る。ＳＥＰＩＲＥＴ（商標）（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｊ．）およびＯＰＡＣＯＡＴ（商標）（Ｂｅｒｗｉｎｄ Ｐｈａｒｍ．Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐ．Ａ．）などの水系フィルムコーティング材料を含むがこれらに限定されない従来のフィルムコーティング材料などの、本明細書に記載されている微生物組成物と種子を接触させるために、様々な活性または不活性材料を使用することができる。本明細書に記載されている微生物カプセル化組成物およびコーティング製剤を、植物、植物の一部、植物環境、またはそれらの組み合わせに施用することができることも本明細書において企図される。例えば、種子は、ポリマーベースまたは糖ベースの結合剤でコーティングされ得、乾燥カプセル化微生物組成物は、種子に施用され得る。種子（単数または複数）および乾燥カプセル化微生物組成物（例えば、粉末形態）は、均一な分布を確実にするために、種子処理装置中で少なくとも約１分間混合され得る。
【0096】
種子の処理のために使用される組成物の量は、種子の種類および活性成分の種類に応じて変動し得るが、処理は、種子を農業上有効量のカプセル化微生物組成物と接触させることを含む。本明細書で使用される「有効量」は一般に、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与で施用することができる。
【0097】
コーティング層に加えて、種子は、以下の成分：殺菌剤および除草剤を含む他の殺有害生物剤、除草剤薬害軽減剤、肥料、および／または生物防除剤のうちの１つ以上で処理されてもよい。これらの成分は別個の層として添加されてもよく、あるいはコーティング層に添加されてもよい。
【0098】
カプセル化微生物組成物および／または種子コーティング製剤は、流動床技術、ローラーミル法、ロトスタティック（ｒｏｔｏｓｔａｔｉｃ）種子処理機、およびドラムコータなどの様々な技術および機械を使用して種子に施用され得る。噴流床などの他の方法も有用であり得る。種子は、コーティング前に予めサイズ調整することができる。コーティング後、種子は、典型的には乾燥され、次いで、サイジングのためにサイジング機に移される。そのような手順は、当技術分野で公知である。
【0099】
本明細書に記載されるカプセル化微生物組成物はまた、コーティングを保護するために（例えば、種子などに施用する前に）フィルムオーバーコーティングで包まれてもよく、そのようなオーバーコーティングは、流動床およびドラムフィルムコーティング技術を使用して適用されてもよい。例えば、任意の実施形態において、１つ以上の疎水性添加剤がカプセル化微生物組成物に追加的に適用され得る（例えば、流動床技術の一部としての乾燥中など）。そのような実施形態において、疎水性添加剤は例えば、乾燥中などに、組成物の周りにコーティングを提供し得る。
【0100】
任意の実施形態において、本明細書に記載されるカプセル化微生物組成物は、固体マトリックスプライミングの使用によって種子上に導入され得る。例えば、ある量のカプセル化微生物組成物を固体マトリックス材料と混合し、次いで、組成物を種子に導入することを可能にする期間、種子を固体マトリックス材料と接触させることができる。次いで、種子は場合により、固体マトリクス材料から分離され、貯蔵または使用され得るか、または固体マトリクス材料と種子との混合物は、直接貯蔵または植え付けられ得る。本明細書で有用な固体マトリックス材料としては、ポリアクリルアミド、デンプン、クレイ、シリカ、アルミナ、土壌、砂、ポリ尿素、ポリアクリレート、または本明細書の組成物をある時間吸収もしくは吸着し、その組成物を種子中または種子上に放出することができる任意の他の材料を挙げることができる。様々な例では、本明細書の組成物および固体マトリックス材料が互いに適合性であることが有用であり得る。例えば、固体マトリックス材料は適度な速度で、例えば、数分、数時間、または数日間にわたって組成物を放出することができるように選択することができる。
【0101】
本明細書では、発芽して植物を形成することができる任意の植物種子、例えば、野菜種子、果実種子、穀物種子、およびそれらの組み合わせを、上記のように処理することができることが企図される。好適な種子には、穀類、コーヒー、コール作物、繊維作物、花、果実、マメ科植物、油作物、樹木、塊茎作物、野菜、ならびに単子葉および双子葉種の他の植物の種子が含まれる。それにもかかわらず、コーティングされ得る例示的な作物種子としては、これらに限定されないが、マメ、キャノーラ、ニンジン、トウモロコシ、ワタ、ボクソウ、レタス、ピーナッツ、ピーナッツ、ピーマン、ジャガイモ、ナタネ、イネ、ライムギ、モロコシ、ダイズ、テンサイ、ヒマワリ、タバコ、トマト、およびコムギ種子が挙げられる。
ＩＩＩ．カプセル化微生物組成物の調製方法
ＩＩＩ．カプセル化微生物組成物の調製方法
【0102】
本明細書に記載されているカプセル化微生物組成物を調製するための方法も提供される。本方法は、（ａ）本明細書に記載されている微生物と本明細書に記載されている少なくとも１つのヒドロゲルを組み合わせて前駆体混合物を形成するステップと；（ｂ）前駆体混合物を架橋剤で固化して中間微生物組成物を形成するステップと；および（ｃ）中間微生物組成物を乾燥させてカプセル化微生物組成物を形成するステップとを含み得る。本明細書に記載されている方法は驚くべきことに、増加した貯蔵安定性を有するより安定なカプセル化微生物組成物を達成することができる。例えば、上記のように、本明細書に提供される方法によって形成されるカプセル化微生物組成物は本明細書に記載されるように、グラムあたりの微生物コロニー形成単位（ＣＦＵ／ｇ）の最小損失を示し得る。例えば、カプセル化微生物組成物は、２５℃および６５％のＲＨで、４週間、８週間または１２週間後に、コロニー形成単位／グラム（ＣＦＵ／ｇ）の２ｌｏｇ未満の損失または１ｌｏｇ未満の損失を有することができる。さらに、本明細書に提供される方法によって形成されるカプセル化微生物組成物は本明細書に記載されるように、より低い水分含量、例えば、約１０％以下または約５％以下の水分含量を有することができる。さらに、本明細書に提供される方法によって形成されるカプセル化微生物組成物は本明細書に記載されるように，増加したタップ密度、例えば、約０．５ｇ／ｍＬ以上～約１．５ｇ／ｍＬ以下のタップ密度を有し得る。
【0103】
任意の実施形態において、少なくとも１つのヒドロゲルは、本明細書に記載されているアルギン酸塩を含んでもよく、場合により、本明細書に記載されているさらなるヒドロゲルを含んでもよい。少なくとも１つのヒドロゲルは、前駆体混合物の総重量に基づいて、約２．５重量％以上、約５重量％以上、約１０重量％以上、約２０重量％以下、約６０重量％以下、約５０重量％以下、約４０重量％以下、または約３０重量％以下、または約５重量％～約６０重量％、約５重量％～約５０重量％、約５重量％～約４０重量％、約５重量％～約３０重量％、約５重量％および約２０重量、約１０重量％～約６０重量％、約１０重量％～約５０重量％、約１０重量％～約４０重量％、約１０重量％～約３０重量％、または約１０重量％および約２０重量％などの量で前駆体混合物中に存在し得る。任意の実施形態において、少なくとも１つのヒドロゲルは、前駆体混合物の総重量に基づいて、約５重量％～約５０重量％の量で前駆体混合物中に存在し得る。
【0104】
追加的にまたは代替的に、前駆体混合物は、本明細書に記載されるような窒素含有安定剤、本明細書に記載されるような糖含有安定剤、またはそれらの組み合わせなど、本明細書に記載されるような安定剤をさらに含み得る。安定剤、例えば、窒素含有安定剤および糖含有安定剤は、単独でまたは組み合わせて、前駆体混合物の総重量に基づいて、約２．５重量％以上、約５重量％以上、約１０重量％以上、約２０重量％以上、約６０重量％以下、約５０重量％以下、約４０重量％以下、または約３０重量％以下、または約５重量％～約６０重量％、約５重量％～約５０重量％、約５重量％～約４０重量％、約５重量％～約３０重量％、約５重量％～約２０重量％、約１０重量％～約６０重量％、約１０重量％～約５０重量％、約１０重量％～約４０重量％、約１０重量％～約３０重量％、または約１０重量％および約２０重量％などの量で前駆体混合物中に存在し得る。任意の実施形態において、窒素含有安定剤および糖含有安定剤は、単独でまたは組み合わせて、前駆体混合物の総重量に基づいて、約５重量％～約５０重量％の量で前駆体混合物中に存在し得る。
【0105】
追加的または代替的に、前駆体混合物は、本明細書に記載されているフィラーをさらに含んでもよい。フィラーは、前駆体混合物の総重量に基づいて、約０．１重量％以上、約１重量％以上、約２．５重量％以上、約５重量％以上、約１０重量％以上、約２０重量％以上、約３０重量％以上、約４０重量％以上、約５０重量％以上、約９５重量％以下、約９０重量％以下、約８０重量％以下、約７０重量％以下、または約６０重量％以下、または約０．１重量％～約９５重量％、約０．１重量％～約９０重量％、約０．１重量％～約８０重量％、約０．１重量％～約７０重量％、約０．１重量％～約６０重量％、約０．１重量％～約５０重量％、約０．１重量％～約４０重量％、約０．１重量％～約３０重量％、約０．１重量％～約２０重量％、約０．１重量％～約１０重量％、約０．１重量％～約５重量％、約０．１重量％～約２．５重量％、約１０重量％～約９５重量％、約１０重量％～約９０重量％、約１０重量％～約８０重量％、約１０重量％～約７０重量％、約１０重量％～約６０重量％、約１０重量％～約５０重量％、約１０重量％～約４０重量％、約１０重量％～約３０重量％、約１０重量％～約２０重量％、約５０重量％～約９５重量％、約５０重量％～約９０重量％、約５０重量％～約８０重量％、約５０重量％～約７０重量％、または約５０重量％～約６０重量％などの量で前駆体混合物中に存在してもよい。任意の実施形態において、フィラーは、前駆体混合物の総重量に基づいて、約０．１重量％～約９０重量％の量で前駆体混合物中に存在し得る。
【0106】
追加的または代替的に、前駆体混合物は、界面活性剤、分散剤、乳化剤、湿潤剤、アジュバント、可溶化剤、浸透促進剤、保護コロイド、接着剤、増粘剤、保湿剤、忌避剤、誘引剤、摂食刺激剤、相溶化剤、凍結防止剤、消泡剤、着色剤、粘着付与剤、疎水性添加剤、および／または結合剤などであるが、これらに限定されない、１つ以上の追加の成分をさらに含んでもよい。
【0107】
前駆体混合物の成分、例えば、微生物、ヒドロゲル、安定剤、任意のフィラー、および任意の追加の成分は、任意の適切な様式および順序で組み合わせることができる。例えば、微生物はヒドロゲルと組み合わされ、例えば、安定剤、任意のフィラー、および本明細書に記載される任意の他の任意の追加の成分を含む保護剤水溶液に添加され得る。本明細書では、ヒドロゲルが微生物との組み合わせの前に混合され得る水溶液として存在し得ることが企図される。あるいは、ヒドロゲルおよび微生物が保護剤水溶液に別々に添加され、そこで組み合わされてもよい。保護剤水溶液は、微生物および／またはヒドロゲルの添加前に混合されてもよい。
Ａ．前駆体混合物の固化
Ａ．前駆体混合物の固化
【0108】
架橋剤は、本明細書に記載されている二価カチオン、二価カチオン塩、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。例えば、二価カチオンは、バリウム（Ｂａ２＋）カチオン、カルシウム（Ｃａ２＋）カチオン、マグネシウム（Ｍｇ２＋）カチオン、ストロンチウム（Ｓｒ２＋）カチオン、コバルト（Ｃｏ２＋）カチオン、ニッケル（Ｎｉ２＋）カチオン、亜鉛（Ｚｎ２＋）カチオン、マンガン（Ｍｎ２＋）カチオン、およびこれらの組合せであり得る。二価カチオン塩の例としては、バリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、ストロンチウム塩、コバルト塩、亜鉛塩、マンガン塩、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。塩の例としては、塩化物塩、フッ化物塩、臭化物塩、ヨウ化物塩、炭酸塩、クエン酸塩、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。任意の実施形態において、架橋剤は、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）、またはそれらの組み合わせであってもよい。追加的または代替的に、架橋剤は溶媒、例えば、水との溶液中に存在してもよい。
ｉ．ビーズ（ＢＥＡＤ）固化法
ｉ．ビーズ（ＢＥＡＤ）固化法
【0109】
任意の実施形態において、固化ステップは、前駆体混合物の液滴を架橋剤と接触させて、架橋ビーズの形態である中間微生物組成物を形成するステップを含み得る。前駆体混合物の液滴を生成するために、任意の好適な装置を使用することができ、例えば、前駆体混合物は好適な断面を有するチューブを通してポンピングまたは流されて、液滴を生成し、次いで、架橋剤、例えば、架橋剤を含む水溶液と接触させることができる。場合により、架橋ビーズは、任意の過剰な二価カチオンを除去するために濾過および／または洗浄を受けてもよい。
【0110】
架橋ビーズは、約５００μｍ以上、約１ｍｍ以上、約１０ｍｍ以上、約１５ｍｍ以上、約２０ｍｍ以下、約５０ｍｍ以下、約４０ｍｍ以下、約３０ｍｍ以下、または約２５ｍｍ以下、または約５００μｍ～約５０ｍｍ、約５００μｍ～約３０ｍｍ、約５００μｍ～約２０ｍｍ、約１ｍｍ～約５０ｍｍ、約１ｍｍ～約４０ｍｍ、約１ｍｍ～約３０ｍｍ、約１ｍｍ～約２０ｍｍ、約１ｍｍ～約２５ｍｍ、または約１ｍｍ～約１５ｍｍなどの平均粒径を有し得る。
【0111】
かくして、種々の態様において、本明細書に記載されるカプセル化微生物組成物を調製する方法が提供され、ここで、その方法は一般に、（ａ）本明細書に記載されている微生物と、本明細書に記載されている少なくとも１つのハイドロゲル、例えばアルギン酸塩とを組み合わせて、本明細書に記載される前駆体混合物を形成するステップと；（ｂ）前駆体混合物を本明細書に記載されている架橋剤で固化して、架橋ビーズの形態で中間微生物組成物を形成するステップであって、固化が前駆体混合物の液滴を架橋剤と接触させるステップと；および（ｃ）中間微生物組成物を乾燥して、本明細書に記載されるカプセル化微生物組成物を形成するステップとを含む。
【0112】
代替の実施形態において、固化ステップは、好適な直径を有する開口部を通して前駆体混合物を流すステップと、前駆体混合物が開口部を出るときに前駆体混合物を架橋剤と接触させて、架橋マイクロビーズの形態である中間微生物組成物を形成するステップとを含み得る。開口部は、約５０μｍ以上、約１００μｍ以上、約１５０μｍ以上、約６５０μｍ以下、約５００μｍ以下、約４５０μｍ以下、または約３００μｍ以下；または約５０μｍ～約６５０μｍ、約５０μｍ～約５００μｍ、約５０μｍ～約４５０μｍ、約５０μｍ～約２５０μｍ、約５０μｍ～約１５０μｍ、約１００μｍ～約６５０μｍ、約１００μｍ～約５００μｍ、約１００μｍ～約４５０μｍ、約１００μｍ～約２５０μｍ、または約１００μｍ～約１５０μｍなどの直径を有する可能性がある。前駆体混合物を流すことができる装置の例としては、上述の直径を有する開口部（例えば、ノズル）を有する任意の市販のカプセル化装置を挙げることができる。ノズルは振動することができ、ビーズサイズは、ノズルサイズ、振動周波数、および流速、ならびにヒドロゲル粘度（温度）によって変化させることができる。市販されているカプセル化装置としては、例えば、Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｏｒ Ｂ－３９０（ＢＵＥＣＨＩ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ ＡＧより入手可能）がある。前駆体混合物はカプセル化デバイスを出るとき、架橋剤、例えば、架橋剤を含む水溶液に注入することができる。任意に、架橋マイクロビーズは、任意の過剰な二価カチオンを除去するために濾過および／または洗浄を受けてもよい。
【0113】
架橋マイクロビーズは、約５０μｍ以上、約１００μｍ以上、約２５０μｍ以上、約５００μｍ以上、約７５０μｍ以上、約３０ｍｍ以下、約２０ｍｍ以下、約１５ｍｍ以下、約１０ｍｍ以下、または約１ｍｍ以下、または約５０μｍ～約３０ｍｍ、約５０μｍ～約２０ｍｍ、約５０μｍ～約１ｍｍ、約１００μｍ～約３０ｍｍ、約１００μｍ～約２０ｍｍ、約１００μｍ～約１０ｍｍ、約１００μｍ～約１ｍｍ、約１００μｍ～約７５０μｍ、約１００μｍ～約５００μｍ、または約１００μｍ～約２５０μｍなどの平均粒径を有し得る。
【0114】
したがって、様々な態様において、本明細書に記載されているカプセル化微生物組成物を調製するための方法が提供され、ここで、この方法は一般に、（ａ）本明細書に記載されている微生物と本明細書に記載されている少なくとも１つのヒドロゲル、例えばアルギン酸塩とを組み合わせて、本明細書に記載されている前駆体混合物を形成するステップと；（ｂ）前駆体混合物を本明細書に記載されている架橋剤で固化して、本明細書に記載されている架橋マイクロビーズの形態の中間微生物組成物を形成するステップであって、固化が、前駆体混合物を、例えば約１００μｍ～約５００μｍの直径を有する開口部を通して流すステップと、および前駆体混合物を架橋剤と接触させることを含むステップと；ならびに（ｃ）中間微生物組成物を乾燥させて、本明細書に記載されているカプセル化微生物組成物を形成するステップとを含む。
ｉｉ．高せん断混合固化法
ｉｉ．高せん断混合固化法
【0115】
追加的にまたは代替的に、固化ステップは、本明細書に記載されている前駆体混合物と本明細書に記載されている架橋剤との高せん断混合を含むことができる。例えば、前駆体混合物は、架橋剤と、例えば、架橋剤を含む水溶液として組み合わせることができ、組み合わせは、高せん断混合を受けることができる。用語「高せん断混合」とは、１０００ｓ－１を超えるまたはそれを超えるせん断速度を伴う混合または混合ステップをいう。高せん断混合は、任意の好適な高せん断混合装置、例えば、ボルテックスミキサーおよびホモジナイザーなどを用いて達成することができるが、これらに限定されない。任意の適切な市販のボルテックスミキサーまたはホモジナイザーなどを使用することができる。市販のホモジナイザーの例は、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ ＰＯＬＹＴＲＯＮ（登録商標）ホモジナイザー（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ ＡＧから入手可能）である。
【0116】
任意の実施形態において、高せん断混合は、約２ｍ／ｓ以上、約３．５ｍ／ｓ以上、約５ｍ／ｓ以上、約７．５ｍ／ｓ以上、約１０ｍ／ｓ以上、約３０ｍ／ｓ以下、約２５ｍ／ｓ以下、約２０ｍ／ｓ以下、または約１５ｍ／ｓ以下、または約２ｍ／ｓ～約３０ｍ／ｓ、約２ｍ／ｓ～約２５ｍ／ｓ、約２ｍ／ｓ～約２０ｍ／ｓ、約３．５ｍ／ｓ～約３０ｍ／ｓ、約３．５ｍ／ｓ～約２５ｍ／ｓ、約３．５ｍ／ｓ～約２０ｍ／ｓ、約３．５ｍ／ｓ～約１５ｍ／ｓ、または約３．５ｍ／ｓ～約１０ｍ／ｓなどの混合先端速度で実施され得る。
【0117】
追加的または代替的に、高せん断混合は、約１，０００ｒｐｍ以上、約２，５００ｒｐｍ以上、約５，０００ｒｐｍ以上、約７，５００ｒｐｍ以上、約１０，０００ｒｐｍ以上、約１５，０００ｒｐｍ以下、または約１２，５００ｒｐｍ以下、または約１，０００ｒｐｍ～約１５，０００ｒｐｍ、約１，０００ｒｐｍ～約１２，５００ｒｐｍ、約１０，０００ｒｐｍ～約１０，０００ｒｐｍ、約１，０００ｒｐｍ～約７，５００ｒｐｍ、約１，０００ｒｐｍ～約５，０００ｒｐｍ、または約１，０００ｒｐｍ～約２，５００ｒｐｍなどで実施され得る。
【0118】
追加的にまたは代替的に、高せん断混合は、約２．５秒以上、約５秒以上、約３０秒以上、約１分以上、約５分以上、約２５分以下、約２０分以下、約１５分以下、または約１０分以下、または約２．５秒～約２５分、約２．５秒～約２０分、約２．５秒～約１５分、約２．５秒～約１０分、約２．５秒～約５分、約２．５秒～約１分、約２．５秒～約３０秒、約５秒～約２５分、約５秒～約２０分、約５秒～約１５分、約５秒～約１０分、約５秒～約５分、約５秒～約１分、または約５秒～約３０秒などで実施され得る。任意の実施形態において、高せん断混合は、約３．５ｍ／ｓ以上、例えば、約３．５ｍ／ｓ～約２５ｍ／ｓの先端速度で、約５秒以上、例えば、約５秒～約２０分実施され得る。
【0119】
追加的にまたは代替的に、高せん断混合を、例えば、約１℃以上、約４℃以上、約１０℃以上、約１５℃以上、約３５℃以下、約３０℃以下、約２５℃以下、または約２０℃以下、または約１℃～約３５℃、約１℃～約３０℃、約１℃～約２５℃、約１℃～約２０℃、約１℃～約１５℃、約１℃～約１０℃、約１℃～約４℃、約４℃～約３５℃、約４℃～約３０℃、約４℃～約２５℃、約４℃～約２０℃、約４℃～約１５℃、または約４℃～約１０℃などの温度、例えば周囲温度および／または前駆体混合体および架橋剤の混合物の温度で実施され得る。
【0120】
したがって、様々な態様において、本明細書に記載されているカプセル化微生物組成物を調製するための方法が提供され、ここで、この方法は一般に：（ａ）本明細書に記載されている微生物と本明細書に記載されている少なくとも１つのヒドロゲル、例えばアルギン酸塩とを組み合わせて、本明細書に記載されている前駆体混合物を形成するステップと；（ｂ）前駆体混合物を本明細書に記載されている架橋剤で固化して、中間微生物組成物を形成するステップであって、固化が、前駆体混合物と本明細書に記載されている架橋剤との高せん断混合を含むステップと；および（ｃ）中間微生物組成物を乾燥して、本明細書に記載されているカプセル化微生物組成物を形成するステップとを含む。
ｉｉｉ．炭酸塩固化法
ｉｉｉ．炭酸塩固化法
【0121】
追加的または代替的に、固化ステップは、前駆体混合物を架橋剤と組み合わせて中間微生物組成物を形成するステップを含み得、ここで、架橋剤は二価カチオン塩を含み、二価カチオン塩は二価カチオン炭酸塩であり得る。例えば、二価カチオン炭酸塩は、炭酸バリウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸ストロンチウム、炭酸コバルト、炭酸ニッケル、炭酸亜鉛、炭酸マンガン、またはそれらの組み合わせであってもよい。任意の実施形態において、二価カチオン炭酸塩は、炭酸カルシウムであってもよい。
【0122】
追加的にまたは代替的に、固化は、前駆体混合物および／または架橋剤に酸性緩衝剤を添加するステップをさらに含んでもよい。酢酸緩衝剤（例えば、酢酸と酢酸の塩（例えば、酢酸ナトリウム）の溶液）、グルコノ－デルタラクトン緩衝剤、弱酸（例えば、クエン酸、ギ酸、シュウ酸、フッ化水素酸、亜硝酸、亜硫酸、リン酸など）、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、約７以下のｐＨを有する任意の好適な酸性緩衝ジを添加することができる。
【0123】
酸性緩衝剤は、様々な方法および順序で添加することができる。例えば、酸性緩衝剤は：（ｉ）架橋剤が前駆体混合物と組み合わされる前に前駆体混合物および／または架橋剤に；（ｉｉ）架橋剤と共に実質的に同時に前駆体混合物に；（ｉｉｉ）前駆体混合物および架橋剤を含む混合物に；または（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の任意の組み合わせに添加され得る。架橋剤、前駆体混合物、および任意の酸性緩衝剤を含む混合物は、約２以上、約４以上、約５以上、約７以下、約６．５以下、または約６以下、または約２～約７、約２～約６．５、約２～約６、約２～約５、約２～約４、約４～約７、約４～約６．５、約４～約６、または約４～約５などのｐＨを有し得るか、および／またはそのｐＨに維持され得る。
【0124】
任意の実施形態において、前駆体混合物、架橋剤、および任意の酸性緩衝剤は、約５分以上、約３０分以上、約２時間以上、約６時間以上、約１２時間以上、約１８時間以上、約４８時間以下、約４２時間以下、約３６時間以下、約３０時間以下、または約２４時間以下、または約５分～約４８時間、約５分～約４２時間、約５分～約３６時間、約５分～約３０時間、約５分～約２４時間、約５分～約１８時間、約５分～約１２時間、約５分～約６時間、約５分～約２時間、または約５分～約３０時間などで組み合わされ得る。この前述の期間の間、前駆体混合物、架橋剤、および任意の酸性緩衝剤を含む混合物は上記の期間のいずれかの好適なミキサーで混合されてもよく、および／または混合物は上記の期間のいずれかの間、さらなる混合なしに静置されてもよい。例えば、前駆体混合物、架橋剤、および任意の酸性緩衝剤を含む混合物を、約５分間～約６時間混合し、次いで、さらに約１８時間～約３０時間静置してもよい。
【0125】
追加的または代替的に、前駆体混合物、架橋剤、および任意の酸性緩衝剤は、約１℃以上、約４℃以上、約１０℃以上、約１５℃以上、約４０℃以下、約３０℃以下、約２５℃以下、または約２０℃以下、または約１℃～約４０℃、約１℃～約３０℃、約１℃～約２５℃、約１℃～約２０℃、約１℃～約１５℃、約１℃～約１０℃、約１℃～約４℃、約４℃～約３５℃、約４℃～約４０℃、約４℃～約２５℃、約４℃～約２０℃、約４℃～約１５℃、または約４℃～約１０℃などの温度、例えば、周囲温度および／または前駆体混合物、架橋剤、および任意の酸性緩衝剤の混合物の温度で、組み合わせることができる。任意の実施形態において、前駆体混合物、架橋剤、および任意の酸性緩衝剤は、約５分以上、例えば、約５分～約４８時間組み合わされてもよく、約４℃以上、例えば、約４℃～約４０℃の温度で実施されてもよい。
【0126】
したがって、様々な態様において、本明細書に記載されているカプセル化微生物組成物を調製するための方法が提供され、ここで、この方法は一般に：（ａ）本明細書に記載されている微生物と本明細書に記載されている少なくとも１つのヒドロゲル、例えばアルギン酸塩とを組み合わせて、本明細書に記載されている前駆体混合物を形成するステップと；（ｂ）前駆体混合物を本明細書に記載されている二価カチオン塩、例えば二価カチオン炭酸塩を含む架橋剤で固化して、中間微生物組成物を形成するステップであって、固化が、前駆体混合物を架橋剤と組み合わせることを含むステップと；および（ｃ）中間微生物組成物を乾燥して、本明細書に記載されているカプセル化微生物組成物を形成するステップとを含む。
【0127】
上記の固化ステップ（例えば、ビーズ固化、高せん断混合、炭酸塩固化等）のいずれかを行う場合、２価陽イオンは、カプセル化微生物組成物の全乾燥重量の約０．００１％以上、約０．１％以上、約１％以上、約２．５％以上、約５％以上、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、または約７．５％以下、または約０．００１％から約２５％、約０．００１％から約２０％、約０．００１％から約１５％、約０．００１％から約１０％、約０．００１％から約７．５％、約０．００１％～約５％、約０．００１％～約２．５％、約０．００１％～約１％、約０．１％～約２５％、約０．１％～約２０％、約０．１％～約１５％、約０．１％～約１０％、約０．１％～約７．５％、約０．１％～約５％、約０．１％～約２．５％、または約０．１％～約２．５％などの量で存在し得る。例えば、ビーズ固化ステップのいずれかを実施する場合、二価カチオンは、カプセル化微生物組成物の総乾燥重量の約０．１％～約１０％の量で存在し得る。さらに、高せん断混合または炭酸塩固化ステップのいずれかを実施する場合、二価カチオンは、カプセル化微生物組成物の総乾燥重量の約０．００１％～約２５％の量で存在し得る。
【0128】
例えば、高せん断混合固化ステップまたは炭酸塩固化ステップの後に形成される中間微生物組成物は、任意の好適な基材に適用されてもよく、中間微生物組成物は基材上に配置されたフィルムの形態であってもよいことも、本明細書において企図される。フィルムは、約１ｍｍ以上、２．５ｍｍ以上、５ｍｍ以上、約７．５ｍｍ以上、約５ｃｍ以下、約２．５ｃｍ以下、または約１ｃｍ以下、または約１ｍｍ～約５ｃｍ、約１ｍｍ～約２．５ｃｍ、約１ｍｍ～約１ｃｍ、約１ｍｍ～約７．５ｍｍ、約１ｍｍ～約５ｍｍ、または約１ｍｍ～約２．５ｍｍなどの厚さを有し得る。
Ｂ．中間微生物組成物の乾燥
Ｂ．中間微生物組成物の乾燥
【0129】
上記のように、驚くべきことに、安定性が増加したカプセル化微生物組成物は、より遅い乾燥ステップを含む本明細書に記載されている方法によって、例えば、より低い温度でより遅い蒸発速度を利用することによって達成することができることが発見された。
【0130】
より遅い乾燥は例えば、中間微生物組成物のより遅い蒸発速度を維持することによって達成され得る。そのような乾燥は例えば、空気（例えば、空気乾燥、外気乾燥、強制または指向性空気乾燥）、真空乾燥、流動床乾燥などにおいて（またはそれらの使用によって）、乾燥機、オーブン、湿度制御チャンバー、またはそれらの任意の組み合わせによって（またはそれらの使用によって）達成（または実施、または完成など）され得る。例えば、乾燥は、約３０，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２以下、約２５，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２以下、約２０，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２以下、約１５，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２以下、約１０，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２以下、約５，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２以下、約１，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２以下、約５００ｇ／ｈｒ／ｍ２以下、約１００ｇ／ｈｒ／ｍ２以下、約５０ｇ／ｈｒ／ｍ２以下、約１０ｇ／ｈｒ／ｍ２以下、約１ｇ／ｈｒ／ｍ２以上、約１０ｇ／ｈｒ／ｍ２以上、約２５ｇ／ｈｒ／ｍ２以上、約５０ｇ／ｈｒ／ｍ２以上、約１００ｇ／ｈｒ／ｍ２以上、約２５０ｇ／ｈｒ／ｍ２以上、約５００ｇ／ｈｒ／ｍ２以上、または約１，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２以上、または約１ｇ／ｈｒ／ｍ２～約２５，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２、約１０ｇ／ｈｒ／ｍ２～約２５，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２、約２５ｇ／ｈｒ／ｍ２～約２５，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２、約５０ｇ／ｈｒ／ｍ２～約２５，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２、約１ｇ／ｈｒ／ｍ２～約２０，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２、約５０ｇ／ｈｒ／ｍ２～約２０，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２、約１ｇ／ｈｒ／ｍ２～約１５，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２、約５０ｇ／ｈｒ／ｍ２～約１５，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２、約１ｇ／ｈｒ／ｍ２～約１０，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２、約５０ｇ／ｈｒ／ｍ２～約１０，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２、約１ｇ／ｈｒ／ｍ２～約５，０００ｇ／ｍ／ｈｒ／ｍ２、約５０ｇ／ｈｒ／ｍ２～約５，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２、約１ｇ／ｈｒ／ｍ２～約１，０００ｇ／ｍ／ｈｒ／ｍ２、約５０ｇ／ｈｒ／ｍ２～約１，０００ｇ／ｈｒ／ｍ２、約１ｇ／ｈｒ／ｍ２～約５００ｇ／ｈｒ／ｍ２、約５０ｇ／ｈｒ／ｍ２～約５００ｇ／ｈｒ／ｍ２、約１ｇ／ｈｒ／ｍ２～約２５０ｇ／ｈｒ／ｍ２、約５０ｇ／ｈｒ／ｍ２～約２５０ｇ／ｈｒ／ｍ２、または約１ｇ／ｈｒ／ｍ２～約１００ｇ／ｈｒ／ｍ２、約５０ｇ／ｈｒ／ｍ２～約１００ｇ／ｈｒ／ｍ２、約１ｇ／ｈｒ／ｍ２～約５０ｇ／ｈｒ／ｍ２、約１ｇ／ｈｒ／ｍ２～約３０ｇ／ｈｒ／ｍ２などの蒸発速度で実施され得る。任意の実施形態において、蒸発速度は、約１ｇ／ｈｒ／ｍ２～約１５０ｇ／ｈｒ／ｍ、約５０ｇ／ｈｒ／ｍ２～約１５０ｇ／ｈｒ／ｍなどであり得る。
【0131】
任意の実施形態において、乾燥は、約１０℃以上、約１５℃以上、約２０℃以上、約６０℃以下、約５０℃以下、約４０℃以下、約３０℃以下、または約２５℃以下、または約１０℃～約５０℃、約１０℃～約４０℃、約１０℃～約３０℃、約１０℃～約２５℃、約１０℃～約２０℃、約１０℃～約１５℃、約１５℃～約５０℃、約１５℃～約４０℃、約１５℃～約３０℃、約１５℃～約２５℃、または約１５℃～約２０℃などの乾燥温度で行われ得る。任意の実施形態において、乾燥温度は、約１５℃～約５０℃であってもよい。
【0132】
追加的にまたは代替的に、乾燥は、約１０分以上、約１５分以上、約３０分以上、約１時間以上、約１２時間以上、約２４時間以上、約４８時間以上、約７２時間以上、約２８８時間以下、約２４０時間以下、約２００時間以下、約１７０時間以下、約１４４時間以下、または約９６時間以下、または約１０分～約２８８時間、約１５分～約２８８時間、約１５分～約２４０時間、約１５分～約２００時間、約１５分～約１７０時間、約１５分～約１４４時間、約１５分～約９６時間、約１５分～約７２時間、約１５分～約４８時間、約１５分～約２４時間、約１５分～約１２時間、約１５分～約１時間、または約１５分～約３０分などの乾燥時間で実施され得る。任意の実施形態において、乾燥時間は、約１５分～約２００時間であり得る。
【0133】
記載されるように、本明細書において、中間微生物組成物の乾燥は、空気（例えば、空気乾燥、外気乾燥、強制または指向性空気乾燥）、真空乾燥、流動床乾燥など）、乾燥機、オーブン、湿度制御チャンバーにおいて（またはその使用によって）、またはそれらの任意の組み合わせにおいて（またはその使用によって）実施され得ることが企図される。例えば、中間微生物組成物を、上述の乾燥時間（例えば、約２４時間～約７２時間）、空気中で室温（例えば、約１５℃～約２５℃）に置いた後、任意に、約２０℃～約３０℃の温度で約１５分～約７２時間、湿度制御チャンバー中でさらに乾燥させ、任意に、続いて、約４０℃～約６０℃の温度で約１５分～約７２時間、乾燥機（例えば、流動床乾燥機）中でさらに乾燥させてもよい。
【0134】
任意の実施形態において、中間微生物組成物は上述の乾燥時間（例えば、約２４時間～約７２時間）の間、空気中で室温（例えば、約１５℃～約２５℃）に置かれ得る。そうすることで、上記のような中間微生物組成物の空気乾燥によって形成された得られた組成物のタップ密度は、噴霧乾燥などによって形成された組成物のタップ密度よりも相対的に高くなり得る。例えば、任意の実施形態において、上記のような中間微生物組成物の空気乾燥によって形成された組成物のタップ密度は、噴霧乾燥によって形成された組成物のタップ密度より、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、または約３００％、または約５％～約３００％など高くてもよい。
【0135】
任意の実施形態において、中間微生物組成物の乾燥は、空気乾燥によって実施、達成等され得る。その際、例えば、架橋アルギン酸塩微生物混合物（Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ Ａｌｇｉｎａｔｅ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｍｉｘｔｕｒｅｓ）（ＣＡＭＭｓ）は、本明細書のせん断混合法またはビーズ／マイクロビーズ法（例えば、実施例３などを参照されたい）のいずれかによって生成され、シートまたは表面（例えば、９”×１３”ベーキングシート、別のシートまたは表面など）上に広げられ、次いで、空気再循環を伴うバイオフード内に置かれ、混合物を室温（例えば、約１８℃～約２５℃（約６４°Ｆ～約７８°Ｆ）など）で２４～７２時間空気乾燥させる。室温で２４～７２時間後、ＣＡＭＭＳ（表面上の）を、一般的に（または比較的）低い相対湿度（ＲＨ）（例えば、約１０％～約２０％など）に設定された湿度制御チャンバーに、または完全な乾燥（例えば、乾燥アルギン酸塩中の約５％未満の水分含量など）を容易にするために乾燥空気パージ（例えば、約５％未満のＲＨなど）を有する乾燥チャンバーに移動させることができる。
【0136】
任意の実施形態において、中間微生物組成物の乾燥は、流動床乾燥によって実施、達成等され得る。その際、例えば、架橋アルギン酸塩微生物混合物（Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ Ａｌｇｉｎａｔｅ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｍｉｘｔｕｒｅｓ）（ＣＡＭＭｓ）を、本明細書のビーズ／マイクロビーズ法（例えば、実施例３などを参照）によって生成し、流動床乾燥機、例えば、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ．からのＳｈｅｒｗｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ５０１００２０１ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｆｌｕｉｄ Ｂｅｄ ＤｒｙｅｒまたはＦｒｅｕｎｄ－Ｖｅｃｔｏｒ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＦｒｅｕｎｄ Ｖｅｃｔｏｒ ＶＦＣ－Ｌａｂ Ｍｉｃｒｏ Ｆｌｏ－Ｃｏａｔｅｒに充填され得る。次いで、流動床乾燥機は、マイクロビーズの水分含量が約５％未満になるまで、約１時間～約８時間、約２０℃～約６０℃の間の温度で運転され得る。あるいは、マイクロビーズは、完全には乾燥していないが、依然として自由流動性粉末として流動床乾燥機から除去され、次いで、それらの水分含量が約５％未満になるまで、約２０℃～約４０℃の真空オーブン中で乾燥され得る。
【0137】
任意の実施形態において、中間微生物組成物の乾燥は、真空乾燥によって実施、達成等され得る。その際、例えば、架橋アルギン酸塩微生物混合物（Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ Ａｌｇｉｎａｔｅ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｍｉｘｔｕｒｅｓ）（ＣＡＭＭｓ）を、本明細書のビーズ／マイクロビーズ法（例えば、実施例３などを参照されたい）によって生成し、真空乾燥機、例えば、真空パドル乾燥機、撹拌真空乾燥機、または円錐スクリュー真空乾燥機に充填され得る。次いで、真空乾燥は、マイクロビーズの水分含量が約５％未満になるまで、約１時間～約８時間、約２０℃～約５０℃の温度で運転され得る。
Ｃ．任意の追加処理
Ｃ．任意の追加処理
【0138】
カプセル化微生物組成物はさらなる施用、例えば、種子処理としての使用、および／または種子への施用前に、任意のさらなる処理を受けてもよい。さらなる処理は例えば、カプセル化微生物粒子を形成するために、および／またはカプセル化微生物粒子のサイズをさらに低減するために、カプセル化微生物組成物を粉砕することを含み得る。例えば、ボールミル粉砕、凍結粉砕、またはそれらの組み合わせの当技術分野で公知の任意の好適な粉砕プロセスを使用して、カプセル化微生物粒子を形成することができる。
【0139】
任意の実施形態において、カプセル化微生物粒子は、約１μｍ以上、約１５μｍ以上、約２５μｍ以上、約５０μｍ以上、約７５μｍ以上、約１００μｍ以上、約５００μｍ以下、約３５０μｍ以下、または約２００μｍ以下、または約１μｍ～約５００μｍ、約１μｍ～約３５０μｍ、約１μｍ～約２００μｍ、約１μｍ～約１００μｍ、約１μｍ～約７５μｍ、約１μｍ～約５０μｍ、約１μｍ～約２５μｍ、または約１μｍ～約１５μｍなどの直径を有し得る。
【実施例】
【0140】
実施例
以下の非限定的な実施例は、本開示をさらに例証するために提供される。微生物製剤およびそのような製剤を作製および試験する方法の非限定的な例が提供され、これは、微生物、特に真菌株および芽胞非形成細菌株のカプセル化および改善された安定性に有用であり得る。
実施例１．微生物菌株の調製
微生物株と増殖条件
以下の非限定的な実施例は、本開示をさらに例証するために提供される。微生物製剤およびそのような製剤を作製および試験する方法の非限定的な例が提供され、これは、微生物、特に真菌株および芽胞非形成細菌株のカプセル化および改善された安定性に有用であり得る。
実施例１．微生物菌株の調製
微生物株と増殖条件
【0141】
ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）（ＯＰＴＩＭＩＺＥ（登録商標） ＸＣ）は４℃で保存して使用した。
【0142】
シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、ファイトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ハーバスピリラム・フリシンゲンス（Ｈｅｒｂａｓｐｒｉｌｌｕｍ ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｅ）、およびシュードアシドボラックス・インターメディウス（Ｐｓｅｕｄａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）発酵物を－８０℃の凍結ストックから各実験用に新鮮に調製した。細胞を、２８℃で１８～４８時間、振盪フラスコ中、リッチ複合培地（３ｇ／Ｌビーフエキス、５ｇ／Ｌペプトン水、６ｇ／Ｌマンニトール、３０ｇ／Ｌグルコース、１８．９ｇ／Ｌトレハロース、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤、ｐＨ約７．２）中で増殖させた。典型的には、６００ｎｍで測定された培養物の光学密度は、一晩の発酵中に０．０５から１．５から２．５の範囲内に上昇した。
ＣＦＵ（コロニー形成単位）測定
ＣＦＵ（コロニー形成単位）測定
【0143】
培養物をＰＢＳ緩衝液中で連続的に希釈して、１ミリリットル当たり所望量のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を得た。細菌は、寒天プレート上に適切な希釈物をプレーティングし、３０℃で一晩インキュベートすることによって定量した。プレート上で増殖させたコロニーを計数した。最終ＣＦＵ／ｍＬは、コロニー数に希釈係数を乗じることによって計算した。充填速度および安定性プロファイルを決定するために、菌株のＣＦＵ測定を、カプセル化前、カプセル化後、および異なる保存期間後に行ってもよい。
実施例２．アルギン酸塩微生物混合物（ＡＭＭ）の調製
実施例２．アルギン酸塩微生物混合物（ＡＭＭ）の調製
【0144】
保護剤、目的の微生物およびアルギン酸塩を含む混合物を、以下の溶液から調製した。調製した微生物培養物（２０ｍＬ、未希釈）およびアルギン酸塩溶液を保護剤溶液に添加して、架橋アルギン酸塩微生物混合物（ＣＡＭＭｓ）を調製するために使用したアルギン酸塩微生物混合物（Ａｌｇｉｎａｔｅ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｍｉｘｔｕｒｅｓ）（ＡＭＭｓ）を生成した。
保護剤溶液
保護剤溶液
【0145】
保護剤溶液を以下のように調製した：４グラムの可溶性デンプン、１０グラムのスキムミルク粉末、１０グラムのスクロース、５グラムのマルトデキストリン、０．００１２ｇ／ｍＬの硫酸マグネシウム、０．０１８ｇ／ｍＬのマンニトール、０．１１７ｇ／Ｌのベタイン、０．３４２ｇ／ｍＬのトレハロース、０．１６７ｇ／ｍＬのジピコリン酸、および２滴のＡｎｔｉｆｏａｍ ２０４からなる２００ｕＬの１０００Ｘの微量栄養成分を、１８０グラムのＭｉｌｌｉＱ水（すなわち、精製および脱イオン水）に添加し、高せん断ミキサー中で均質化した。
アルギン酸塩溶液
アルギン酸塩溶液
【0146】
アルギン酸塩溶液を以下のように調製した：８．０グラムのアルギン酸ナトリウムを１９２グラムのＭｉｌｌｉＱ水に添加して、４％ｗ／ｗのアルギン酸ナトリウム混合物を形成した。混合物を５５℃に加熱し、均質になるまで振盪機中で混合し、室温に冷却した。
【0147】
以下の試薬を追加の精製なしで使用した：「Ｓｔｄ」褐藻類由来のアルギン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｗ２０１５０２）；褐藻類由来のアルギン酸ナトリウム、低粘度（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ａ１１１２）；褐藻類由来のアルギン酸ナトリウム、中粘度（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ａ２０３３）；アルギン酸ナトリウム、高粘度（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ Ｊ６１８８７）；水溶性キトサン（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ ＹＣ５８３２５）；ペクチン（リンゴ由来、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ９３８５４）；およびゼラチン（ウシ皮膚タイプＢ由来、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｇ９３９１）。
実施例３．架橋アルギン酸塩微生物混合物（ＣＡＭＭｓ）の調製
実施例３．架橋アルギン酸塩微生物混合物（ＣＡＭＭｓ）の調製
【0148】
異なるタイプの架橋アルギン酸塩微生物混合物（ＣＡＭＭｓ）を、以下の方法によって調製した。
ＣＡＭＭビーズ
ＣＡＭＭビーズ
【0149】
架橋アルギン酸塩微生物混合物（ＣＡＭＭ）ビーズを以下のように調製した：上記の実施例２におけるＡＭＭ調製物３００ｍＬを、１．６ｍｍ内径チューブ（Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ ＨＶ－０６５０８－１４）を通して５７ｒｐｍ（Ｗａｔｓｏｎ－Ｍａｒｌｏｗポンプ、モデル：１２０Ｕ／ＤＭ３）でポンピングし、ＡＭＭ調製物の液滴を生成した。液滴を１．０ｗ／ｗ％ ＣａＣｌ２液１リットル中に向けた。溶液中のカルシウムイオンと接触すると、固体架橋アルギン酸塩ビーズが形成された。ビーズを濾過し、水ですすぎ、過剰なカルシウムイオンを除去した。
【0150】
例えば、乾燥後のシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＣＡＭＭビーズの典型的な調製物は、１×１０８から１×１０９ＣＦＵ／グラムを含んでいた。この方法によって作製されたビーズは、典型的には直径が１センチメートルより大きかった。
ＣＡＭＭマイクロビーズ
ＣＡＭＭマイクロビーズ
【0151】
架橋アルギン酸塩微生物混合物（ＣＡＭＭ）マイクロビーズを以下のように調製した：市販のカプセル化ユニット（Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｏｒ Ｂ－３９０、ＢＵＣＨＩ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、上記実施例２のＡＭＭ調製物３００ｍＬを１．０ｗ／ｗ％ＣａＣｌ２液１Ｌに注入して、ヒドロゲルマイクロビーズを調製した。カプセル化装置は、固定条件下：周波数＝１５００Ｈｚ；電極電位＝１０００Ｖ；および動作圧力＝５００～１０００ｍｂａｒ、で動作させた。１５０、２００、および４５０μｍのノズルサイズは、それぞれ、カプセル化後に５６０μｍ、７５０μｍ、および１ｍｍ超の最終的な湿潤マイクロビーズサイズを生成した。
【0152】
例えば、乾燥後のシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＣＡＭＭマイクロビーズの典型的な調製物は、１×１０９から３×１０９ＣＦＵ／ｇを含有していた。これらの実施例に従って使用するためのこの方法によって作製されたマイクロビーズは、典型的には直径が１ミリメートル超であった。
せん断混合法
せん断混合法
【0153】
せん断混合架橋アルギン酸塩微生物製剤を以下のように調製した：２．５ｍＬの１％ｗ／ｗ塩化カルシウム溶液を、上記の実施例２のように調製したアルギン酸塩微生物混合物１００ｍＬに添加した。組合せをＫｉｎｅｍａｔｉｃａ ＰＯＬＹＴＲＯＮ（登録商標）ホモジナイザー（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ ＡＧ、Ｌｕｚｅｒｎｅｒｓｔｒａｓｓｅ １４７Ａ ＣＨ－６０１４ Ｌｉｔｔａｕ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能）で、１１，０００ｒｐｍで２０～３０秒間混合した。架橋アルギン酸塩の稠度は厚くなり、ペースト状になった。
炭酸カルシウム
炭酸カルシウム
【0154】
塩化カルシウムの代わりに、炭酸カルシウム溶液が架橋のために使用した。架橋アルギン酸塩微生物製剤を以下のように調製した：０．０９グラムの炭酸カルシウムを１００グラムのアルギン酸塩微生物混合物（ＡＭＭ）に添加した。混合物を水平振盪機中で４時間激しく混合し、室温でさらに２４時間静置した。炭酸カルシウムを、１０ｍＬの１００ｍＭ酢酸緩衝液（ＡＣ）または１００ｍＭグルコノデルタラクトン（ＧＤＬ）のいずれかを添加して中和し、水平振盪機中で４時間激しく混合し、室温でさらに２４時間静置した。
実施例４．架橋アルギン酸塩微生物混合物の乾燥
実施例４．架橋アルギン酸塩微生物混合物の乾燥
【0155】
架橋アルギン酸塩微生物混合物（ＣＡＭＭｓ）を９”×１３”ベーキングシート上に広げ、空気再循環を伴うバイオフード中に置き、水分含量が５～１０％に達するまで混合物を室温で少なくとも２日間空気乾燥した。例えば、ＣＡＭＭビーズまたはマイクロビーズを室温で３日間空気乾燥した。
【0156】
あるいは、架橋アルギン酸塩微生物混合物（ＣＡＭＭｓ）を９”×１３”ベーキングシート上に広げ、空気再循環を伴うバイオフード中に置いて、混合物を室温で２４時間空気乾燥させ、２３℃および相対湿度（ＲＨ）２０％の湿度制御チャンバー中に置いて、含水率を５～７％に低下させた。
【0157】
水分含量をさらに低減するために、架橋アルギン酸塩粒子を、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ５０１００２０１ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｆｌｕｉｄ Ｂｅｄ Ｄｒｙｅｒ流動床乾燥機中、４５～５５℃で、水分含量が約３％に低減されるまで乾燥した。
実施例５．架橋アルギン酸塩微生物混合物の粉砕
実施例５．架橋アルギン酸塩微生物混合物の粉砕
【0158】
架橋アルギン酸塩微生物混合物（ＣＡＭＭ）を粉砕して、長期貯蔵および種子処理に適した粉末粒子を生成した。架橋アルギン酸塩微生物混合物を、液体窒素（Ｓｐｅｘ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｍｏｄｅｌ ６９７０Ｄ）を用いて、以下のような粉砕パラメータで凍結粉砕した：サイクル：３分、予冷：０分、実行時間：７分、実行間冷却：１分、速度１３サイクル／秒（ｃｐｓ）。
【0159】
あるいは、材料は、ボールミルを使用して、粉砕機として３×２０ｍｍの金属ボールを有する１２５ｍＬの広口瓶に１０グラムの乾燥材料を充填することによって、大きさを縮小した。容器を、水平振とう機を用いて室温で１時間激しく振とうした。
【0160】
典型的な粉砕調製物は、Ｄ１０＝８～１５μｍ、Ｄ５０＝７５～１００μｍ、およびＤ９０＝３５０～５００μｍの粒径分布を生じた。
実施例６．噴霧乾燥方法
実施例６．噴霧乾燥方法
【0161】
架橋アルギン酸塩微生物混合物（ＣＡＭＭｓ）を、以下の噴霧乾燥法によって調製した。ＢＵＥＣＨＩ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｅｒ Ｂ－２９０（ＢＵＥＣＨＩ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ ＡＧ、Ｆｌａｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、カプセル化および乾燥を完了させた。
二流体ノズル噴霧乾燥およびポリマーカプセル化
二流体ノズル噴霧乾燥およびポリマーカプセル化
【0162】
標準的な二流体ノズルを備えたＢＵＥＣＨＩ（登録商標）Ｂ－２９０実験室噴霧乾燥機を用いて、ＣＡＭＭ製剤を噴霧乾燥した。架橋アルギン酸塩微粒子を製造するための噴霧乾燥手順は以下の通りであった：空気流を４０ｍｍに設定し、空気圧を９０ｐｓｉに設定した。吸引を１００％に設定し、除湿器を「オン」に設定し、ポンプ速度を、水を用いて～１０ｍＬ／分に較正し、３２％に設定した。入口温度は１１０～１７０℃であり、５０～８７℃の範囲の出口温度をもたらした。
三流体ノズル噴霧乾燥とポリマーカプセル化
三流体ノズル噴霧乾燥とポリマーカプセル化
【0163】
三流体ノズルを備えたＢＵＥＣＨＩ（登録商標）Ｂ－２９０実験室噴霧乾燥機を用いて、ＣＡＭＭ製剤を噴霧乾燥した。架橋アルギン酸塩微粒子を製造するための噴霧乾燥手順は以下の通りであった：空気流を最大に設定し、空気圧を９０ｐｓｉに設定した。吸引を１００％に設定し、除湿器を「オン」に設定し、１．４２ｍｍ×０．８ｍｍのチューブ（部品番号９８３．０１４２．０００）内部供給ポンプを備えたＷＡＴＳＯＮ ＭＡＲＬＯＷ（登録商標）１２０Ｕマルチチャンネルポンプを、水を用いて～５ｍＬ／分に較正し、５７％に設定した。内部流体は別段の記載がない限り、等量の微生物発酵物および水性４％アルギン酸ナトリウム／２％可溶性デンプン溶液を含有し、外部（ＢＵＥＣＨＩ（登録商標））供給ポンプ＝１７％（水を使用して～５ｍＬ／分に較正される）。外部流体：特に断りのない限り、希水性塩化カルシウム（典型的には０．１２５～０．２５重量％）。水道からの冷水を、スプレーノズル組立体を通してポンプで注入した。入口温度は１１０～１２０℃の範囲であり、５０～８７℃の範囲の出口温度をもたらした。
実施例７．種子処理
実施例７．種子処理
【0164】
以下の手順を用いて、微生物アルギン酸塩製剤を種子に施用した。製剤を、作物保護化学物質で未処理または処理したダイズ種子に施用した。
【0165】
湿潤または乾燥架橋アルギン酸塩性剤を種子に施用するために、２５０グラムのダイズ種子および１．０グラムの種子処理糖溶液（使用する場合）をガロンサイズの袋に入れ、密封し、激しく振盪した。袋を再び開け、架橋アルギン酸塩製剤１．５グラムを加え、袋を再密封し、激しく振とうして均一なコーティングを確実にした。糖溶液は種子の表面を「粘着性」にし、その結果、アルギン酸塩製剤粉末は種子の表面を被覆し、それに付着する。
【0166】
処理した種子を、２５℃／６５％ＲＨおよび／または１０℃／５０％ＲＨでの長期保存のために、通気性の裏打ち紙袋（３．３７５インチ×２．５インチ×１０．２５インチ；Ｍｉｄｃｏ ＴＴＸ５９１）に移した。
実施例８．ビーズ法を用いた乾燥架橋アルギン酸塩でカプセル化したシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の回収
実施例８．ビーズ法を用いた乾燥架橋アルギン酸塩でカプセル化したシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の回収
【0167】
シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）をＣＡＭＭビーズ法によりカプセル化し、乾燥し、上記実施例３、４および５に記載のように粉砕した。ビーズをゲル化するために使用した塩化カルシウム濃度を０．５％～５％で変化させて、ＣＦＵ回収に対するその影響を決定した。
【0168】
表１に示されるように、カプセル化直後のＣＡＭＭビーズからのシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）のＣＦＵ回収は、試験したより低い塩化カルシウム濃度で最も高かった（０．５％ＣａＣｌ２が最も高いＣＦＵ回収を有した）。ＣＦＵ回収は、寒天プレートにプレーティングすることによって決定した。
表１：異なる濃度の塩化カルシウムで作製された乾燥ＣＡＭＭビーズ中にカプセル化されたシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の初期ＣＦＵ回収
実施例９．せん断混合法により作製した乾燥架橋アルギン酸塩でカプセル化したシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の回収
表１：異なる濃度の塩化カルシウムで作製された乾燥ＣＡＭＭビーズ中にカプセル化されたシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の初期ＣＦＵ回収
【表1】
【0169】
シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）は、架橋前にアルギン酸塩微生物混合物にヒドロゲル（キトサン、ペクチン、ゼラチン）および／または不活性担体（バイオ炭）の異なる組み合わせを添加して、または添加せずに、上記実施例３に記載されたＣＡＭＭせん断混合法によってカプセル化した。添加した場合、アルギン酸塩対追加のヒドロゲルの比は１：１であり、全ヒドロゲル濃度は２％であった。追加のヒドロゲルを添加しなかった場合、アルギン酸塩の濃度は２％であったが、追加のヒドロゲルを添加した場合、アルギン酸塩およびヒドロゲルの濃度はそれぞれ１％であった（組み合わせて２％の合計）。添加した場合、アルギン酸塩対追加のバイオ炭の比は、乾燥重量で２：５であった。架橋製剤を乾燥し、上記実施例４および５に記載のように粉砕した。
【0170】
ヒドロゲルまたは不活性担体を含むまたは含まない全ての組み合わせは、１×１０８ＣＦＵ／グラムを超える回収をもたらし、多くの組み合わせは表２に示されるように、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）株の１×１０９ＣＦＵ／グラムを超える回収を有し、本明細書に記載される安定化方法のためのヒドロゲルのタイプの柔軟性を示した。
表２：せん断混合法により製造された架橋アルギン酸塩中でカプセル化されたシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の初期ＣＦＵ回収
実施例１０．炭酸カルシウム法により作製した乾燥架橋アルギン酸塩でカプセル化したシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の回収
表２：せん断混合法により製造された架橋アルギン酸塩中でカプセル化されたシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の初期ＣＦＵ回収
【表2】
【0171】
シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を、上記実施例３に記載の炭酸カルシウム法によって、異なるアルギン酸塩材料を用いて、および上記実施例９および表２に提供される組み合わせにおいて架橋する前に、アルギン酸塩微生物混合物にヒドロゲル（キトサン、ペクチン、ゼラチン）を添加して、または添加せずにカプセル化した。アルギン酸塩対追加のヒドロゲルの比は、１：１であり、全ヒドロゲル濃度は上記のように２％であった。架橋製剤を乾燥し、上記実施例４および５に記載のように粉砕した。
【0172】
様々な量の酢酸緩衝液（ＡＣ）またはグルコノデルタラクトン（ＧＤＬ）で作製されたＣＡＭＭｓは、１×１０８ＣＦＵ／グラムの回収を超えて達成され、多くの調製物は、表３に示されるように、１×１０９ＣＦＵ／グラムの回収を超えており、これは、架橋剤として炭酸カルシウムを使用する本明細書に記載されている安定化方法のための酸性化剤の量の柔軟性を示している。様々なタイプのヒドロゲルで作製されたＣＡＭＭｓは、表４に示されるように、１×１０９ＣＦＵ／グラムを超える回収を達成し、本明細書に記載される様々なアルギン酸塩による安定化方法のためのヒドロゲルのタイプの柔軟性を示している。
表３：炭酸カルシウム法により異なる量の酸性化剤で調製した架橋アルギン酸塩中にカプセル化したシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の初期ＣＦＵ回収
表４：炭酸カルシウム法による追加のヒドロゲルで調製した架橋アルギン酸塩中でカプセル化したシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の初期ＣＦＵ回収
実施例１１．三流体ノズル噴霧乾燥により作製した乾燥架橋アルギン酸塩でカプセル化したシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の回収
表３：炭酸カルシウム法により異なる量の酸性化剤で調製した架橋アルギン酸塩中にカプセル化したシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の初期ＣＦＵ回収
【表3】
【表4】
【0173】
シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を含有するせん断架橋アルギン酸塩を生成し、異なる量の塩化カルシウムを用いて、上記実施例３に記載されるような三流体ノズル噴霧乾燥機を使用して噴霧乾燥した。噴霧乾燥ＣＡＭＭ粉末の初期ＣＦＵ測定（開始力価）を表５に示す。
表５：Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を含有するイン・サイチュ（Ｉｎ－Ｓｉｔｕ）架橋噴霧乾燥製剤
実施例１２．種々の架橋アルギン酸塩調製物による種子上（Ｏｎ－Ｓｅｅｄ）のシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の生存率
噴霧乾燥前のアルギン酸塩架橋
表５：Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を含有するイン・サイチュ（Ｉｎ－Ｓｉｔｕ）架橋噴霧乾燥製剤
【表5】
噴霧乾燥前のアルギン酸塩架橋
【0174】
シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を含有する架橋アルギン酸塩を、上記実施例３に記載されるようなせん断混合法を用いて生成し、上記実施例６に記載されるような二流体ノズル噴霧乾燥機を用いて噴霧乾燥し、上記実施例７に提供されるようにダイズ種子に施用した。図１（ＦＩＧ．１）に示されるように、せん断架橋アルギン酸塩混合物中にカプセル化され、種子に施用されたシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）は、８週間を超えて１×１０５ＣＦＵ／種子を上回る生存率を維持した。
架橋アルギン酸塩ペーストによる直接種子処理
架橋アルギン酸塩ペーストによる直接種子処理
【0175】
シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を、上記実施例３に記載のせん断混合法によってアルギン酸塩にカプセル化し、本明細書に記載されているようにダイズ種子に施用したが、種子に施用する前に架橋アルギン酸塩ペーストを噴霧乾燥せずに施用した。この試験において、最初の微生物力価は、架橋アルギン酸塩ペーストについて１．７×１０９ＣＦＵ／ｇであった。化学（ＡＩ）、亜硫酸水素塩処理（化学スラリー中の殺生物剤を除去するため）、および浸透圧保護剤溶液の微生物の安定性に及ぼす影響を決定した。種子処理時のＣＦＵ／種子の理論的最大量は、ＣＦＵ損失がないと仮定すると、１×１０６ＣＦＵ／種子である。この試験における全ての試料について測定された実際の初期ＣＦＵ／種子は、１０４～１０５ＣＦＵ／種子であり、種子上で１週間後、ＣＦＵ／種子は、１～３ｌｏｇの減少を経験した（表６を参照）。
【0176】
直接種子処理後のシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の種子上の安定性は、アルギン酸塩ペースト中にカプセル化され、種子に施用されたものが低かった。噴霧乾燥に供されなかった架橋アルギン酸塩ペーストとして、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を種子に施用したところ、１週間内に１×１０２ＣＦＵ／種子未満まで生存率が低下した（すなわち、種子上の１週間だけで少なくとも２～３ｌｏｇのＣＦＵ／種子の低下）（図１を参照されたい）。
表６：架橋アルギン酸塩ペーストによる直接種子処理からの２５℃／６５％ＲＨでの種子上のシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の安定性
種々の温度および湿度でのカプセル化シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の安定性に及ぼすカプセル化方法および乾燥速度の影響
表６：架橋アルギン酸塩ペーストによる直接種子処理からの２５℃／６５％ＲＨでの種子上のシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の安定性
【表6】
【0177】
シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を、せん断混合（Ｓｈｅａｒ Ｍｉｘ）またはビーズ法（Ｂｅａｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ）を介して架橋アルギン酸塩にカプセル化し、粉砕し、上記のように種子上に置いた。図１に示されるように、種子に施用された噴霧乾燥液体発酵物についての１週間あたりのほぼ２ｌｏｇの低下とは対照的に、２５℃および６５％ＲＨで保存された種子について、種子上のＣＦＵ／種子の崩壊速度は０．１５ｌｏｇ／週であった。噴霧乾燥なしで、湿式せん断混合アルギン酸塩製剤で処理した種子は、１週間内に１×１０２ＣＦＵ／種子未満までの微生物株の生存率低下を示した。これらの結果は、架橋アルギン酸塩混合物のためのより遅い乾燥方法が、種子上での施用のためのより安定な微生物製剤を提供することを示す。
【0178】
図２（ＦＩＧ．２）にさらに示されるように、種子当たりのＣＦＵの数は、１０℃および５０％ＲＨでの２３週間の試験期間にわたって実質的に変化しないままであった。さらなる研究において、１０グラムのアルギン酸塩カプセル化シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を２０ｍＬのガラスシンチレーションバイアル中に保存し、２グラムの乾燥剤パッケージを加え、バイアルに蓋をして２５℃のチャンバーで保存した。図３に示すように、試料を定期的に採取して、その長期生存率を追跡した。
種子上の安定性に及ぼすカルシウム濃度の影響
種子上の安定性に及ぼすカルシウム濃度の影響
【0179】
シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を、せん断混合法によってアルギン酸塩でカプセル化し、粉砕し、本明細書に記載されているように種子上に置いた。アルギン酸塩を架橋するために使用される塩化カルシウムの量を変化させた。せん断混合法を用いてアルギン酸塩でカプセル化したシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）は、最初の４週間以内に良好な安定性を示した。（１００ｍＬのアルギン酸塩－微生物混合物に対して）２．５ｍＬの１％ｗ／ｗのカルシウムの充填で架橋された試料について、図６に示されるように、崩壊速度は、平均して０．１５ｌｏｇ／週であった。
追加のヒドロゲルまたはバイオ炭による種子上の安定性
追加のヒドロゲルまたはバイオ炭による種子上の安定性
【0180】
シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）は、架橋前にアルギン酸塩微生物混合物にヒドロゲル（キトサン、ペクチン、ゼラチン）および不活性担体（バイオ炭）を添加してＣＡＭＭせん断混合法によりカプセル化した。アルギン酸塩対追加のヒドロゲルの比は１：１であり、全ヒドロゲル濃度は２％であった。アルギン酸塩対追加のバイオ炭の比は、乾燥重量で２：５であった。架橋製剤を乾燥させ、上記のように粉砕し、種子上に置き、通気性紙袋中に保管し、２５℃／６５％ＲＨの温かい温度および湿度に曝露した。アルギン酸塩を唯一のヒドロゲルとしてカプセル化すると、最大の安定性が得られた。固体賦形剤としてのバイオ炭の添加は安定性をさらに改善し、３～７週目からの１ｌｏｇ未満の減少を伴い、バイオ炭が、図７に示されるような安定化剤として作用することを示す。
噴霧乾燥シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）製剤の種子上の安定性
噴霧乾燥シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）製剤の種子上の安定性
【0181】
シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を、三流体ノズル噴霧乾燥ＣＡＭＭせん断混合法によってカプセル化し、種子上に置き、通気性紙袋中に保存し、以下の表７に示すように、２５℃／６５％ＲＨで温かい温度および湿度に曝露した。それらの種子上の安定性の結果を図１に示す。乾燥および塩化カルシウムの充填は、安定性の傾向に影響しなかった。可溶性デンプンの含有はまた、有意な影響を有さなかった。
表７：種子上の安定性試験に使用したシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を含有するイン・サイチュ（ｉｎ－ｓｉｔｕ）架橋噴霧乾燥製剤
実施例１３．異なる架橋アルギン酸塩調製物による種子上のブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）の生存率
２５℃／６５％ＲＨおよび１０℃／５０％ＲＨでのカプセル化ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）の安定性に及ぼすカプセル化方法および乾燥速度の影響
表７：種子上の安定性試験に使用したシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を含有するイン・サイチュ（ｉｎ－ｓｉｔｕ）架橋噴霧乾燥製剤
【表7】
２５℃／６５％ＲＨおよび１０℃／５０％ＲＨでのカプセル化ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）の安定性に及ぼすカプセル化方法および乾燥速度の影響
【0182】
ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）を、せん断混合およびビーズ法によってアルギン酸塩でカプセル化し、粉砕し、本明細書に記載されているように種子上に置いた。対照的に、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）も噴霧乾燥し、種子上で処理して、安定性に対する乾燥速度の影響を比較した。図４（ＦＩＧ．４）に示すように、２５℃／６５％ＲＨでは、ビーズおよびせん断法の両方の種子上のＣＦＵ崩壊速度が０．２６～０．３１ｌｏｇ／週で同等であった。これは、噴霧乾燥したブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）については１週間当たり約１．５ｌｏｇの低下とは対照的である。図５（ＦＩＧ．５）は、１０℃／５０％ＲＨで、種子上のＣＦＵ崩壊は、２３週間にわたって０．７ｌｏｇに実質的に低減されることを示す。
噴霧乾燥ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）製剤の種子上の安定性
噴霧乾燥ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）製剤の種子上の安定性
【0183】
ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）を二流体ノズル噴霧乾燥ＣＡＭＭせん断混合法によりカプセル化し、種子上に置き、通気性紙袋中に保存し、２５℃／６５％ＲＨの温かい温度および湿度に曝露した。以下の表に示すように、製剤を市販のピートベースの製剤と比較した。これらの製剤のＣＦＵ／種子価を数週間評価し、ｌｏｇ１０崩壊速度を決定するために使用した。
表８：種々のブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）製剤の２５℃／６５％ＲＨでの保存安定性試験から計算した初期ＣＦＵ／種子値および種子上での崩壊速度（週当たり）
実施例１４．カプセル化微生物の放出研究
表８：種々のブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）製剤の２５℃／６５％ＲＨでの保存安定性試験から計算した初期ＣＦＵ／種子値および種子上での崩壊速度（週当たり）
【表8】
【0184】
０．５％ＣａＣｌ２のビーズ法で製剤化したアルギン酸塩カプセル化シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）をモデルカプセル化物質として用いて、カルシウム架橋アルギン酸塩カプセル化微生物の放出を評価した。この調製物が、模擬植え付け条件下で、時間および土壌水分含量の関数として、いかに容易に生存細胞を環境に送達することができるかを決定するために、研究を行った。
【0185】
グリーンビルＭＳ（Ｇｒｅｅｎｖｉｌｌｅ，ＭＳ）から採取した農場土壌を６５℃で一晩オーブン乾燥し、オートクレーブ処理（１２１℃、１５ｐｓｉ、３０分間）により滅菌した。滅菌土壌の５グラムアリコートを滅菌５０ｍＬ遠心管に分配し、約０％～約３０％の範囲の水分含量を有する試料を滅菌水の添加によって作製した。ダイズ種子をこれらの試料に播種し、表９に示すように、これらの条件下で、２２℃で９６時間後に発芽する能力について評価した。
表９：土壌試料の組成およびダイズの発芽に対する結果としての効果
表９：土壌試料の組成およびダイズの発芽に対する結果としての効果
【表9】
【0186】
この研究に使用したアルギン酸塩カプセル化微生物調製物は、約１×１０９ＣＦＵ／ｇを含有すると決定された。この物質を乾燥滅菌圃場土壌と組み合わせて、混合して、約２．４×１０３ＣＦＵ／ｇを含む新しい土壌調製物を作製した。土壌＋アルギン酸塩カプセル化Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）混合物の５ｇのアリコートを滅菌５０ｍＬ遠心分離管に分配し、約０％～約３０％の範囲の水分含量を有する試料を、上記のように滅菌水を添加することによって３回作製した。
【0187】
各試料を水添加後２２℃でインキュベートした。アリコートを２４時間および９６時間で採取し、連続希釈プレーティングおよびＲ２Ａ増殖培地上のコロニー計数を用いてＣＦＵ／ｇについてアッセイした。これらのカウントを表１０にまとめ、図８（ＦＩＧ．８）に示す。
表１０：多様な土壌水分含量での２４時間および９６時間インキュベーション後のＣＦＵ／ｇ
表１０：多様な土壌水分含量での２４時間および９６時間インキュベーション後のＣＦＵ／ｇ
【表10】
【0188】
この研究の結果は、微生物集団がこのアルギン酸塩カプセル化物から容易に放出され、１０～３０％の水分含量の土壌中で９６時間インキュベートした後、高力価まで活発に増殖することを示している。１０％の水分含量を有する土壌中で２４時間インキュベートした後の最初の成長の欠如によって示されるように、微生物の放出およびその後の増殖は、より乾燥した土壌中ではより遅い。生存細胞の濃度が約２．４×１０３ＣＦＵ／ｇの最初の基準力価のままであったので、カプセル化物質は乾燥土壌中でこの時間枠にわたって安定であると思われる。
実施例１５．シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を含む種々の架橋アルギン酸塩調製物のタップ密度測定と吸湿特性
実施例１５．シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を含む種々の架橋アルギン酸塩調製物のタップ密度測定と吸湿特性
【0189】
シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を含有する様々な乾燥アルギン酸塩製剤を、実施例３のＣＡＭＭせん断混合法および実施例６の噴霧乾燥法によって作製した。これらの粉末製剤のタップ密度を、測定容器として２ｍＬの極低温バイアルを使用する手動方法を使用して決定し、以下の表１１に示す。動的水蒸気収着（ＤＶＳ）システム（例えば、Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ＳｙｓｔｅｍｓからＤＶＳシステムなど）において、以下のプログラムを用いて、真空オーブン中で、４０℃で一晩乾燥させた後、これらの配合物の吸湿性を比較した：０％ＲＨで０．５時間（その後、１００％に質量調整された）、９０％ＲＨで１０時間、および０％ＲＨで１０時間。ＤＶＳデータ（図９（ＦＩＧ．９））は、より高密度の配合物が同じ％ＲＨ下でより少ない水分を吸収することを示す。吸湿率が高いほど、図１に示す噴霧乾燥製剤の種子上での安定性が低くなる。
表１１
実施例１６．架橋アルギン酸塩調製物での種子上のハーバスピリラム・フリシンゲンス（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｅ）の生存率
液体発酵物と比較した２５℃／６５％ＲＨでのカプセル化ハーバスピリラム・フリシンゲンス（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｅ）の安定性に及ぼす製剤添加剤の影響
表１１
【表11】
液体発酵物と比較した２５℃／６５％ＲＨでのカプセル化ハーバスピリラム・フリシンゲンス（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｅ）の安定性に及ぼす製剤添加剤の影響
【0190】
ハーバスピリラム・フリシンゲンス（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｅ）を、せん断混合法によりアルギン酸塩でカプセル化し、シートで乾燥させ、凍結粉砕により粉砕し、本明細書に記載されているように種子上に置いた。ハーバスピリラム・フリシンゲンス（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｅ）発酵物を直接種子上に施用して、カプセル化製剤の安定性を液体物の種子上の安定性と比較した。発酵物を、実施例７に記載の種子処理と同様の方法で施用し、１ｍＬの発酵ブロスを用いて、結合剤溶液なしで種子上に直接施用した。処理した種子をポリライニング紙袋（３．３７５インチ×２．５インチ×１０．２５インチ；Ｍｉｄｃｏ ＢＡ ＴＴ ＣＷ－６Ｌ）に移し、２５℃／６５％ＲＨで長期保存した。図１０（ＦＩＧ．１０）に示されるように、２５℃／６５％ＲＨでは、全てのカプセル化製剤の種子上の安定性が直接種子上に施用される液体発酵物よりも著しく良好である。
実施例１７．液体発酵物と比較した種子上のカプセル化シュードアシドボラックス・インターメディウス（Ｐｓｅｕｄａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）の生存率
実施例１７．液体発酵物と比較した種子上のカプセル化シュードアシドボラックス・インターメディウス（Ｐｓｅｕｄａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）の生存率
【0191】
シュードアシドボラックス・インターメディウス（Ｐｓｅｕｄａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）を、せん断混合法によってアルギン酸塩でカプセル化し、シートで乾燥し、凍結粉砕によって粉砕し、本明細書に記載されているように種子上に置いた。シュードアシドボラックス・インターメディウス（Ｐｓｅｕｄａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）発酵物も、カプセル化製剤の安定性を液体物の種子上の安定性と比較するために、直接種子上に施用した。発酵物を、実施例７に記載の種子処理と同様の方法で施用し、１ｍＬの発酵ブロスを使用し、結合剤溶液を添加せずに、直接種子に施用した。これらの処理された種子を、２５℃／６５％ＲＨでの長期保存のために、ポリライニング紙袋（３．３７５インチ×２．５インチ×１０．２５インチ；Ｍｉｄｃｏ ＢＡ ＴＴ ＣＷ－６Ｌ）に移した。図１１に示されるように、２５℃／６５％ＲＨでは、全てのカプセル化製剤の種子上の安定性が直接種子上に施用される液体発酵物よりも著しく良好である。
実施例１８．異なる架橋アルギン酸塩調製物での種子上のファイトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）の生存率
液体発酵物と比較した２５℃／６５％ＲＨでのカプセル化ファイトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）の安定性に及ぼす製剤添加剤の影響
実施例１８．異なる架橋アルギン酸塩調製物での種子上のファイトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）の生存率
液体発酵物と比較した２５℃／６５％ＲＨでのカプセル化ファイトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）の安定性に及ぼす製剤添加剤の影響
【0192】
ファイトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）を、せん断混合法によりアルギン酸塩でカプセル化し、シートで乾燥させ、凍結粉砕機により粉砕し、本明細書に記載されているように種子上に置いた。表１２に示すいくつかの市販の疎水性添加剤を、混合物中１．５ｗｔ／ｖｏｌ％で架橋する前にＡＭＭ中に含めて、種子処理前の粉末製剤の水分取り込みおよび種子上の安定性に対するこれらの添加剤の影響を確認した。
表１２
表１２
【表12】
【0193】
乾燥および粉砕後、粉末製剤を真空オーブン中、４０℃で２４時間さらに乾燥させた。水分取り込みは、動的水蒸気収着（ＤＶＳ）装置（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＤＶＳ Ａｄｖａｎｔａｇｅ製）を介して６５％ＲＨで評価した。ＤＶＳプログラムは以下の通りであった：０％ＲＨで６時間（その後、１００％に質量調整）、６５％ＲＨで４０時間、および０％ＲＨで２０時間。図１２（ＦＩＧ．１２）は、疎水性添加剤の組み込みが、６５％ＲＨへの曝露時の質量変化を減少させ、添加剤＃２および＃３が水分取り込みの最大の減少を有することを示す。
【0194】
ファイトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）発酵物を直接種子上に施用して、異なるカプセル化製剤の安定性を液体物の種子上の安定性と比較した。発酵物を、実施例７に記載の種子処理と同様の方法で施用し、１ｍＬの発酵ブロスを、結合剤を全く含まずに種子上に直接施用した。これらの処理された種子を、２５℃／６５％ＲＨでの長期保存のために、ポリライニング紙袋（３．３７５インチ×２．５インチ×１０．２５インチ；Ｍｉｄｃｏ ＢＡ ＴＴ ＣＷ－６Ｌ）に移した。図１３（ＦＩＧ．１３）に示されるように、２５℃／６５％ＲＨにおいて、全てのカプセル化製剤の種子上の安定性は、直接種子上に施用される液体発酵物よりも著しく良好である。添加剤＃２および＃３で作製した製剤は、最良の種子上の安定性を有した。これらの製剤は、図１２に示されるＤＶＳデータにおいて最も低い水分取り込みを有した。
実施例１９．外部コーティングとしての疎水性添加剤の組み込み
噴霧乾燥機における疎水性コーティングの添加
実施例１９．外部コーティングとしての疎水性添加剤の組み込み
噴霧乾燥機における疎水性コーティングの添加
【0195】
シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を含有する２種類のＣＡＭＭｓを、実施例６に列挙した三流体ノズル噴霧乾燥手順を用いて作製した。第１の製剤は、噴霧乾燥機の外部流体中に０．１２５重量％の塩化カルシウムを使用して、イン・サイチュ架橋アルギン酸塩微粒子を作製した。第２の製剤は、０．１２５重量％塩化カルシウム＋１重量％シルクフィブロイン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから５重量％として供給される；カタログ♯５１５４－２０ＭＬ）を使用した。他の全ての噴霧乾燥機の設定は同じであった。これらの製剤の吸湿性を、真空オーブン中、４０℃で一晩、以下のプログラムを用いて乾燥させた後、ＤＶＳ機器において比較した：０％ＲＨで０．５時間（その後、１００％に質量調整）、９０％ＲＨで１０時間、および０％ＲＨで１０時間。ＤＶＳデータ（図１４（ＦＩＧ．１４））は、疎水性コーティングを有する製剤が同じ％ＲＨでより少ない水分を吸収することを示す。これらの製剤を、実施例７に記載されるように種子上に施用した。２５℃／６５％ＲＨで、噴霧乾燥イン・サイチュ架橋アルギン酸塩製剤は、１週間あたり～２．５ｌｏｇの崩壊速度を示したが、外部流体中にシルクフィブロインを含有する製剤は１週間あたり～１．５ｌｏｇの崩壊速度で種子上でより安定であった。
流動床乾燥機における疎水性コーティングの添加
流動床乾燥機における疎水性コーティングの添加
【0196】
ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）を含有するＣＡＭＭマイクロビーズを、実施例３に記載されるように、２００μｍノズルを使用して生成した。これらのマイクロビーズを、乾燥中に湿潤マイクロビーズ上に噴霧される１０重量％のＳＵＲＥＬＥＡＳＥ（登録商標）（Ｃｏｌｏｒｃｏｎ製；エチルセルロースの２５重量％水性分散液）を用いて、または用いずに、４０℃の流動床乾燥機中で乾燥させた。コーティングの添加量は、コーティングなしの乾燥ＣＡＭＭマイクロビーズの重量の～５％であった。これらの製剤の吸湿性を、以下のプログラムを用いて、真空オーブン中で、４０℃で一晩乾燥させた後、ＤＶＳ機器において比較した：６５％ＲＨで２４時間、続いて９０％ＲＨで１２時間。ＤＶＳデータ（図１５（ＦＩＧ．１５））は、疎水性コーティングを有する製剤が、同じ％ＲＨにおいてはるかに少ない水分を吸収することを示す。
【0197】
本開示の実施形態の完全な理解を提供するために、特定の組成物、構成要素、装置、および方法の例など、多数の特定の詳細が記載される。特定の詳細が採用される必要がないこと、例示的な実施形態が多くの異なる形態で具現化され得ること、およびどちらも本開示の範囲を限定すると解釈されるべきではないことが、当業者には明らかであろう。いくつかの例示的な実施形態において、周知のプロセス、周知の装置構造、および周知の技術は詳細には説明されない。
【0198】
本明細書で使用される用語は例示的な実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のことを示さない限り、複数形も含むことが意図され得る。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は包括的であり、したがって、記載された特徴、要素、組成物、ステップ、整数、操作、および／または構成要素の存在を特定するが、１つ以上の他の特徴、整数、ステップ、操作、要素、構成要素、および／またはそれらの群の存在または付加を排除しない。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という非限定的な用語は、本明細書に記載された様々な実施形態を説明し、特許請求するために使用される非限定的な用語として理解されるべきであるが、特定の態様ではその用語が代わりに、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「から本質的になる（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などのより限定的かつ制限的な用語であると理解され得る。したがって、組成物、材料、構成要素、要素、特徴、整数、動作、および／またはプロセスステップを列挙する任意の所与の実施形態について、本開示はまた、具体的には、そのような列挙された組成物、材料、構成要素、要素、特徴、整数、操作、および／またはプロセスステップからなる、または本質的にそれらからなる実施形態を含む。「からなる」の場合、代替の実施形態は、任意の追加の組成物、材料、構成要素、要素、特徴、整数、操作、および／またはプロセスステップを除外するが、「から本質的になる」の場合、基本的および新規な特徴に実質的に影響を及ぼす任意の追加の組成物、材料、構成要素、要素、特徴、整数、操作、および／またはプロセスステップはそのような実施形態から除外されるが、基本的および新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない任意の組成物、材料、構成要素、要素、特徴、整数、操作、および／またはプロセスステップは、実施形態に含まれ得る。
【0199】
本明細書で説明される任意の方法ステップ、プロセス、および操作は、実行順序として具体的に特定されない限り、説明または図示される特定の順序でそれらの実行を必ず必要とするものと解釈されるべきではない。また、別段の指示がない限り、追加のまたは代替のステップが使用されてもよいことを理解されたい。
【0200】
本開示を通して、数値は、言及された値を正確に有する実施形態と同様に、所与の値および言及された値からのわずかな逸脱およびほぼ言及された値を有する実施形態を包含する範囲に対する近似的な尺度または限界を表す。詳細な説明の最後に提供される実施例以外に、添付の特許請求の範囲を含む、本明細書におけるパラメータ（例えば、量または条件の）の全ての数値は、全ての場合において、数値の前に「約」が実際に現れるかどうかにかかわらず、用語「約」によって修飾されると理解されるべきである。「約」は、記載された数値がいくらかのわずかな不正確さを可能にすることを示す（値の正確さへのいくらかのアプローチを伴う；値におよそまたは合理的に近い；ほぼ）。「約」によって提供される不正確さが、この通常の意味で当技術分野において他に理解されない場合、本明細書で使用される「約」はそのようなパラメータを測定および使用する通常の方法から生じ得る少なくとも変動を示す。例えば、「約」は５％以下、任意で４％以下、任意で３％以下、任意で２％以下、任意で１％以下、任意で０．５％以下、特定の態様では任意で０．１％以下の変動を含むことができる。
【0201】
加えて、範囲の開示は、全ての値の開示、および範囲について与えられた端点および部分範囲を含む、全範囲内のさらなる分割された範囲を含む。
【0202】
上記の詳細な説明は、当業者が本開示を実施するのを助けるために提供される。しかしながら、本明細書に記載され、特許請求される開示は、これらの実施形態が本開示のいくつかの態様の例示として意図されるので、本明細書に開示される特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。任意の等価な実施形態は、本開示の範囲内であることが意図される。本明細書に示され、記載されたものに加えて、本開示の様々な修正が、前述の説明から、本開示の趣旨または範囲から逸脱しないことが当業者に明らかになるのであろう。また、そのような修正、は添付の特許請求の範囲内に該当する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【国際調査報告】