特表 2024-515576 修飾ヌクレオシド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-10

(54)【発明の名称】修飾ヌクレオシド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20240403BHJP

   C12N 15/115 20100101ALI20240403BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240403BHJP

   A61K 31/7115 20060101ALI20240403BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20240403BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240403BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240403BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240403BHJP

   A61K 31/7068 20060101ALI20240403BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z ZNA

C12N15/115 Z

A61K31/7088

A61K31/7115

A61P17/02

A61P9/00

A61P29/00 101

A61P19/02

A61K31/7068

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023562187

(86)(22)【出願日】2022-04-12

(85)【翻訳文提出日】2023-10-10

(86)【国際出願番号】 US2022024361

(87)【国際公開番号】W WO2022221241

(87)【国際公開日】2022-10-20

(31)【優先権主張番号】63/174,495

(32)【優先日】2021-04-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/174,792

(32)【優先日】2021-04-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】505373306

【氏名又は名称】ソマロジック オペレーティング カンパニー インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ファウラー ケイト

(72)【発明者】

【氏名】カーター ジェフ

(72)【発明者】

【氏名】ローロフ ジョン

(72)【発明者】

【氏名】ジェリナス エイミー

(72)【発明者】

【氏名】ジャニック ネボイシャ

【テーマコード（参考）】

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA03

4C086MA05

4C086NA14

4C086ZA89

4C086ZA96

4C086ZB13

(57)【要約】

５位修飾ピリミジンを含む化合物を提供する。さらに、少なくとも１つの５位修飾ピリミジンを含む、アプタマー等のポリヌクレオチドを提供する。そのようなポリヌクレオチド、例えば、アプタマーを、選択及び使用する方法も提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

５位修飾ピリミジンヌクレオシドまたはその塩を含む化合物であって、
前記５位修飾ピリミジンが、第１のリンカーによって互いに共有結合で結合している２つのフェニル基を含む部分で置換されており、前記部分が、第２のリンカーによって前記ピリミジンの５位に共有結合で連結されている、前記化合物。

【請求項2】

前記第１のリンカーが、炭素及び酸素から選択される少なくとも１個の原子を含むかまたは結合である、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

前記５位修飾ピリミジンが、フェニルベンジル部分、フェノキシベンジル部分、及びジフェニルメチル部分から選択される部分を５位に含む、請求項１及び２のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項4】

前記第２のリンカーが、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバマートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される基を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項5】

前記第２のリンカーがアミドリンカーを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項6】

前記アミドリンカーが、１個以上の炭素原子または１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個の炭素原子をさらに含む、請求項５に記載の化合物。

【請求項7】

５位修飾ウリジンを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項8】

５位修飾シチジンを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項9】

式ＩＡまたは式ＩＢ：

【化1】

の構造、またはこれらのうちのいずれかの塩、を含む化合物であって、
式中、
各Ｌは、独立して－（ＣＨ_２）_ｎ－であり、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
各Ｒ_１は、独立して、

【化2】

から選択され、
式中、＊は、前記Ｌ基への前記Ｒ_１基の結合点を示し、
各Ｘは、独立して、－Ｈ、－ＯＨ、－ＯＭｅ、－Ｏ－アリル、－Ｏ－エチル、－Ｏ－プロピル、－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、－フルオロ、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルオキシ、－ＮＨ_２、及び－アジドから選択され、
各Ｒ_２は、独立して、－ＯＨ；－アセチル；－ＯＢｚ；－ＯＰ（Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２）（ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ）、－ＯＰ（Ｎ（Ｒ_ｘ）_２）（ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ）［式中、各Ｒ_ｘは、独立して（Ｃ_１－６）アルキルである］；ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルオキシ；－Ｏ－ｓｓ；－ＯＲ；－ＳＲ；－ＺＰ（Ｚ’）（Ｚ’’）－Ｏ－Ｒ［式中、ｓｓは固体支持体であり、Ｚ、Ｚ’、及びＺ’’はそれぞれ独立してＯ及びＳから選択され、Ｒは隣接ヌクレオチドである］から選択され、
各Ｒ_３は、独立して、－ＯＨ、－Ｏ－トリチル、－Ｏ－４，４’－ジメトキシトリチル、－Ｏ－三リン酸、－ＯＲ、－ＳＲ、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ、及び－Ｚ－Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ－Ｒ［式中、Ｚ、Ｚ’、及びＺ’’はそれぞれ独立してＯ及びＳから選択され、Ｒは隣接ヌクレオチドである］から選択される、前記化合物。

【請求項10】

ｎが、１、２、または３である、請求項９に記載の化合物。

【請求項11】

Ｘが－Ｈである、請求項９及び１０のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項12】

Ｘが－ＯＭｅである、請求項９及び１０のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項13】

各Ｒ_１が、独立して、

【化3】

から選択される、請求項９～１２のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項14】

前記５位修飾ピリミジンが、ＢＰＥｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｕ、２’－Ｆ－ＢＰＥ－Ｕ、ＰＢｎｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｕ、２’－Ｆ－ＰＢｎ－Ｕ、ＰＯＰｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｕ、２’－Ｆ－ＰＯＰ－Ｕ、ＤＰＰｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｕ、２’－Ｆ－ＤＰＰ－Ｕ、ＤＢＭｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｕ、２’－Ｆ－ＤＢＭ－Ｕ、ＢＨｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｕ、２’－Ｆ－ＢＨ－Ｕ、ＢＰＥｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｃ、２’－Ｆ－ＢＰＥ－Ｃ、ＰＢｎｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｃ、２’－Ｆ－ＰＢｎ－Ｃ、ＰＯＰｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｃ、２’－Ｆ－ＰＯＰ－Ｃ、ＤＰＰｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｃ、２’－Ｆ－ＤＰＰ－Ｃ、ＤＢＭｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｃ、２’－Ｆ－ＤＢＭ－Ｃ、ＢＨｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｃ、及び２’－Ｆ－ＢＨ－Ｃから選択される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項15】

式ＩＩＡまたは式ＩＩＢ：

【化4】

の構造、またはこれらのうちのいずれかの塩、を含む化合物であって、
式中、
各Ｌは、独立して－（ＣＨ_２）_ｎ－であり、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
各Ｒ_１は、独立して、

【化5】

から選択され、
式中、＊は、前記Ｌ基への前記Ｒ_１基の結合点を示し、
各Ｘは、独立して、－Ｈ、－ＯＨ、－ＯＭｅ、－Ｏ－アリル、－Ｏ－エチル、－Ｏ－プロピル、－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、－フルオロ、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルオキシ、－ＮＨ_２、及び－アジドから選択される、前記化合物。

【請求項16】

ｎが、１、２、または３である、請求項１５に記載の化合物。

【請求項17】

Ｘが－Ｈである、請求項１５及び１６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項18】

Ｘが－ＯＭｅである、請求項１５及び１６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項19】

各Ｒ_１が、独立して、

【化6】

から選択される、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項20】

化合物であって、以下の構造：

【化7-1】

【化7-2】

またはこれらのうちのいずれか１つの塩、を含み、
式中、各Ｘは、独立して、－Ｈ、－ＯＨ、－Ｏ－メチル、－Ｏ－アリル、－Ｏ－エチル、－Ｏ－プロピル、－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、－フルオロ、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルオキシ、－ＮＨ_２、及び－アジドから選択される、前記化合物。

【請求項21】

Ｘが－Ｈである、請求項２０に記載の化合物。

【請求項22】

Ｘが－ＯＭｅである、請求項２０に記載の化合物。

【請求項23】

請求項１～１４のいずれか１項に記載の化合物を含む、オリゴヌクレオチド。

【請求項24】

ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはその組み合わせを含む、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項25】

１５～１００、または１５～９０、または１５～８０、または１５～７０、または１５～６０、または１５～５０、または２０～１００、または２０～９０、または２０～８０、または２０～７０、または２０～６０、または２０～５０、または３０～１００、または３０～９０、または３０～８０、または３０～７０、または３０～６０、または３０～５０、または４０～１００、または４０～９０、または４０～８０、または４０～７０、または４０～６０、または４０～５０ヌクレオチド長である、請求項２３及び２４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項26】

標的と結合するアプタマーである、請求項２３～２５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項27】

請求項１～１４のいずれか１項に記載の化合物を含む、アプタマー。

【請求項28】

１５～１００、または１５～９０、または１５～８０、または１５～７０、または１５～６０、または１５～５０、または２０～１００、または２０～９０、または２０～８０、または２０～７０、または２０～６０、または２０～５０、または３０～１００、または３０～９０、または３０～８０、または３０～７０、または３０～６０、または３０～５０、または４０～１００、または４０～９０、または４０～８０、または４０～７０、または４０～６０、または４０～５０ヌクレオチド長である、請求項２６及び２７のいずれか１項に記載のアプタマー。

【請求項29】

ＢＰＥｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｕ、２’－Ｆ－ＢＰＥ－Ｕ、ＰＢｎｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｕ、２’－Ｆ－ＰＢｎ－Ｕ、ＰＯＰｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｕ、２’－Ｆ－ＰＯＰ－Ｕ、ＤＰＰｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｕ、２’－Ｆ－ＤＰＰ－Ｕ、ＤＢＭｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｕ、２’－Ｆ－ＤＢＭ－Ｕ、ＢＨｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｕ、２’－Ｆ－ＢＨ－Ｕ、ＢＰＥｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｃ、２’－Ｆ－ＢＰＥ－Ｃ、ＰＢｎｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｃ、２’－Ｆ－ＰＢｎ－Ｃ、ＰＯＰｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｃ、２’－Ｆ－ＰＯＰ－Ｃ、ＤＰＰｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｃ、２’－Ｆ－ＤＰＰ－Ｃ、ＤＢＭｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｃ、２’－Ｆ－ＤＢＭ－Ｃ、ＢＨｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｃ、及び２’－Ｆ－ＢＨ－Ｃから選択される５位修飾ピリミジンを含む、請求項２６～２８のいずれか１項に記載のアプタマー。

【請求項30】

ＢＰＥｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｕ、２’－Ｆ－ＢＰＥ－Ｕ、ＰＢｎｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｕ、２’－Ｆ－ＰＢｎ－Ｕ、ＰＯＰｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｕ、２’－Ｆ－ＰＯＰ－Ｕ、ＤＰＰｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｕ、２’－Ｆ－ＤＰＰ－Ｕ、ＤＢＭｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｕ、２’－Ｆ－ＤＢＭ－Ｕ、ＢＨｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｕ、２’－Ｆ－ＢＨ－Ｕから選択される少なくとも１つの５位修飾ウリジン、ならびにＢＰＥｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｃ、２’－Ｆ－ＢＰＥ－Ｃ、ＰＢｎｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｃ、２’－Ｆ－ＰＢｎ－Ｃ、ＰＯＰｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｃ、２’－Ｆ－ＰＯＰ－Ｃ、ＤＰＰｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｃ、２’－Ｆ－ＤＰＰ－Ｃ、ＤＢＭｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｃ、２’－Ｆ－ＤＢＭ－Ｃ、ＢＨｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｃ、及び２’－Ｆ－ＢＨ－Ｃから選択される少なくとも１つの５位修飾シチジンを含む、請求項２６～２９のいずれか１項に記載のアプタマー。

【請求項31】

前記アプタマーの５’末端に、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０ヌクレオチド長であるか、または５～３０、１０～３０、１５～３０、５～２０、もしくは１０～２０ヌクレオチド長である領域を含み、前記アプタマーの前記５’末端の前記領域が５位修飾ピリミジンを欠く、請求項２６～３０のいずれか１項に記載のアプタマー。

【請求項32】

前記アプタマーの３’末端に、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０ヌクレオチド長であるか、または５～３０、１０～３０、１５～３０、５～２０、もしくは１０～２０ヌクレオチド長である領域を含み、前記アプタマーの前記３’末端の前記領域が５位修飾ピリミジンを欠く、請求項２６～３１のいずれか１項に記載のアプタマー。

【請求項33】

少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジン及び少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含むアプタマーであって、前記第１の５位修飾ピリミジンと前記第２の５位修飾ピリミジンは異なる５位修飾ピリミジンであり、前記少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンが、請求項１～１４のいずれか１項に記載の化合物である、前記アプタマー。

【請求項34】

前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンが、ＢｎｄＣ、２’－ＯＭｅ－Ｂｎ－Ｃ、ＰＥｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＥ－Ｃ、ＰＰｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＰ－Ｃ、ＮａｐｄＣ、２’－ＯＭｅ－Ｎａｐ－Ｃ、２ＮａｐｄＣ、２’－ＯＭｅ－２Ｎａｐ－Ｃ、ＮＥｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＮＥ－Ｃ、２ＮＥｄＣ、２’－ＯＭｅ－２ＮＥ－Ｃ、ＴｙｒｄＣ、２’－ＯＭｅ－Ｔｙｒ－Ｃ、ＢｎｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｂｎ－Ｕ、ＮａｐｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｎａｐ－Ｕ、ＰＥｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＥ－Ｕ、ＩｂｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｉｂ－Ｕ、ＦＢｎｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＦＢｎ－Ｕ、２ＮａｐｄＵ、２’－ＯＭｅ－２Ｎａｐ－Ｕ、ＮＥｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＮＥ－Ｕ、ＭＢｎｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＭＢｎ－Ｕ、ＢＦｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＢＦ－Ｕ、ＢＴｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＢＴ－Ｕ、ＰＰｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＰ－Ｕ、ＭＯＥｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＭＯＥ－Ｕ、ＴｙｒｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｔｙｒ－Ｕ、ＴｒｐｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｔｒｐ－Ｕ、ＴｈｒｄＵ、及び２’－ＯＭｅ－Ｔｈｒ－Ｕから選択される、請求項３３に記載のアプタマー。

【請求項35】

前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンが、ＮａｐｄＣ、２’－ＯＭｅ－Ｎａｐ－Ｃ、２ＮａｐｄＣ、２’－ＯＭｅ－２Ｎａｐ－Ｃ、ＴｙｒｄＣ、２’－ＯＭｅ－Ｔｙｒ－Ｃ、ＰＰｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＰ－Ｃ、ＮａｐｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｎａｐ－Ｕ、ＰＰｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＰ－Ｕ、ＭＯＥｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＭＯＥ－Ｕ、ＴｙｒｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｔｙｒ－Ｕ、ＴｒｐｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｔｒｐ－Ｕ、ＴｈｒｄＵ、及び２’－ＯＭｅ－Ｔｈｒ－Ｕから選択される、請求項３３及び３４のいずれか１項に記載のアプタマー。

【請求項36】

前記アプタマーが、前記５位修飾ピリミジンの代わりに未修飾ピリミジンを含む、長さ及び核酸塩基配列が同じアプタマーと比較して、改善されたヌクレアーゼ安定性及び／またはヒト血清中でのより長い半減期及び／または改善された親和性及び／または改善された解離速度を有する、請求項２６～３５のいずれか１項に記載のアプタマー。

【請求項37】

請求項２６～３６のいずれか１項に記載の複数のアプタマーを含む、組成物。

【請求項38】

各アプタマーがランダム領域を含む、請求項３７に記載の組成物。

【請求項39】

前記ランダム領域が、２０～１００、または２０～９０、または２０～８０、または２０～７０、または２０～６０、または２０～５０、または２０～４０、または３０～１００、または３０～９０、または３０～７０、または３０～６０、または３０～５０、または３０～４０ヌクレオチド長である、請求項３８に記載の組成物。

【請求項40】

アプタマーと標的とを含む組成物であって、前記アプタマー及び前記標的が複合体を形成することができ、前記アプタマーが、請求項２６～３５のいずれか１項に記載のアプタマーである、前記組成物。

【請求項41】

第１のアプタマー、第２のアプタマー、及び標的を含む組成物であって、
前記第１のアプタマー、前記第２のアプタマー、及び前記標的が、三量体複合体を形成することができ、
前記第１のアプタマーが、請求項１～１４のいずれか１項に記載の化合物を含むアプタマーであり、かつ
前記第２のアプタマーが、少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含む、前記組成物。

【請求項42】

前記標的が、タンパク質、ペプチド、炭水化物、小分子、細胞及び組織から選択される、請求項４１に記載の組成物。

【請求項43】

前記標的が、ＩＬ－３３、ＸＩＡＰ、Ｋ－Ｒａｓ、及びＴＮＦ－αから選択される標的タンパク質である、請求項４１及び４２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項44】

請求項２６～３５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのアプタマー、またはその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

【請求項45】

ＩＬ－３３、ＸＩＡＰ、Ｋ－Ｒａｓ、及びＴＮＦ－αから選択されるタンパク質により媒介される疾患または状態を治療または予防するための、請求項４４に記載の医薬組成物。

【請求項46】

対象の疾患または状態を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に、請求項２６～３５のいずれか１項に記載のアプタマーまたは請求項４４及び４５のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。

【請求項47】

前記疾患または状態が、ＩＬ－３３、ＸＩＡＰ、Ｋ－Ｒａｓ、及びＴＮＦ－αから選択されるタンパク質により媒介される、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記疾患または状態が、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）または関節リウマチである、請求項４６及び４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

方法であって、
（ａ）標的分子への結合能のあるアプタマーを試料と接触させること、
（ｂ）アプタマー－標的複合体が形成されるよう前記アプタマーを前記試料と一緒にインキュベートすること、
（ｃ）前記試料中で前記アプタマー－標的複合体について濃縮すること、及び
（ｄ）前記アプタマー、前記アプタマー－標的複合体、または前記標的分子の存在を検出することであって前記アプタマー、前記アプタマー－標的複合体、または前記標的分子の検出は、前記試料中に前記標的分子が存在することを示し、前記アプタマー、前記アプタマー－標的複合体、または前記標的分子の検出がないことは、前記試料中に前記標的分子が存在しないことを示す、前記検出すること、を含み、
前記アプタマーが、請求項１～１４のいずれか１項に記載の化合物を含むかまたは請求項２６～３５のいずれか１項に記載のアプタマーである、前記方法。

【請求項50】

前記試料に競合分子を加えるステップ、前記アプタマー－標的複合体を固体支持体上に捕捉するステップ、及び競合分子を加えて前記試料を希釈するステップ、から選択される少なくとも１つの追加のステップを含み、前記少なくとも１つの追加のステップが、ステップ（ａ）またはステップ（ｂ）の後に行われる、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記競合分子がポリアニオン性競合物質から選択される、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記ポリアニオン性競合物質が、オリゴヌクレオチド、ポリデキストラン、ＤＮＡ、ヘパリン、及びｄＮＴＰから選択される、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記ポリデキストランがデキストラン硫酸であり、前記ＤＮＡがニシン精子ＤＮＡまたはサケ精子ＤＮＡである、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記標的分子が、タンパク質、ペプチド、炭水化物、小分子、細胞及び組織から選択される、請求項４９～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

前記試料が、全血、白血球、末梢血単核細胞、血漿、血清、喀痰、呼気、尿、精液、唾液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引物、気管支吸引物、滑液、関節吸引物、細胞、細胞抽出物、便、組織、組織生検、及び脳脊髄液から選択される、請求項４９～５４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項56】

試料中の標的を検出するための方法であって、
（ａ）前記試料と第１のアプタマーとを、混合物が形成されるよう接触させることであって、前記第１のアプタマーが、前記標的に結合して第１の複合体を形成することができる、前記接触させること、
（ｂ）前記混合物を、前記第１の複合体が形成可能な条件下でインキュベートすること、
（ｃ）前記混合物と第２のアプタマーとを接触させることであって、前記第２のアプタマーが、前記第１の複合体と結合して第２の複合体を形成することができる、前記接触させること、
（ｄ）前記混合物を、前記第２の複合体が形成可能な条件下でインキュベートすること、
（ｅ）前記混合物中の前記第１のアプタマー、前記第２のアプタマー、前記標的、前記第１の複合体または前記第２の複合体の有無を検出することであって、前記第１のアプタマー、前記第２のアプタマー、前記標的、前記第１の複合体または前記第２の複合体の存在が、前記試料中に前記標的が存在することを示す、前記検出すること、を含み、
ここで、前記第１のアプタマーが、請求項１～１４のいずれか１項に記載の化合物を含み、
前記第２のアプタマーが、少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含み、
前記第１のアプタマー、前記第２のアプタマー及び前記標的が、三量体複合体を形成することができる、前記方法。

【請求項57】

前記標的分子が、タンパク質、ペプチド、炭水化物、小分子、細胞及び組織から選択される、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

前記第１のアプタマー、前記第２のアプタマー及び前記標的が、三量体複合体を形成することができる、請求項５６及び５７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項59】

前記第２のアプタマーが、ＢｎｄＣ、２’－ＯＭｅ－Ｂｎ－Ｃ、ＰＥｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＥ－Ｃ、ＰＰｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＰ－Ｃ、ＮａｐｄＣ、２’－ＯＭｅ－Ｎａｐ－Ｃ、２ＮａｐｄＣ、２’－ＯＭｅ－２Ｎａｐ－Ｃ、ＮＥｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＮＥ－Ｃ、２ＮＥｄＣ、２’－ＯＭｅ－２ＮＥ－Ｃ、ＴｙｒｄＣ、２’－ＯＭｅ－Ｔｙｒ－Ｃ、ＢｎｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｂｎ－Ｕ、ＮａｐｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｎａｐ－Ｕ、ＰＥｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＥ－Ｕ、ＩｂｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｉｂ－Ｕ、ＦＢｎｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＦＢｎ－Ｕ、２ＮａｐｄＵ、２’－ＯＭｅ－２Ｎａｐ－Ｕ、ＮＥｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＮＥ－Ｕ、ＭＢｎｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＭＢｎ－Ｕ、ＢＦｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＢＦ－Ｕ、ＢＴｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＢＴ－Ｕ、ＰＰｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＰ－Ｕ、ＭＯＥｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＭＯＥ－Ｕ、ＴｙｒｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｔｙｒ－Ｕ、ＴｒｐｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｔｒｐ－Ｕ、ＴｈｒｄＵ、及び２’－ＯＭｅ－Ｔｈｒ－Ｕから選択される少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含む、請求項５６～５８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項60】

前記第２のアプタマーが、ＮａｐｄＣ、２’－ＯＭｅ－Ｎａｐ－Ｃ、２ＮａｐｄＣ、２’－ＯＭｅ－２Ｎａｐ－Ｃ、ＴｙｒｄＣ、２’－ＯＭｅ－Ｔｙｒ－Ｃ、ＰＰｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＰ－Ｃ、ＮａｐｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｎａｐ－Ｕ、ＰＰｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＰ－Ｕ、ＭＯＥｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＭＯＥ－Ｕ、ＴｙｒｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｔｙｒ－Ｕ、ＴｒｐｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｔｒｐ－Ｕ、ＴｈｒｄＵ、及び２’－ＯＭｅ－Ｔｈｒ－Ｕから選択される少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含む、請求項５６～５９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項61】

標的分子への結合能のある１つ以上のアプタマーを同定するための方法であって、
（ａ）アプタマーのライブラリーと前記標的分子とを、混合物が形成され、アプタマー－標的複合体の形成を可能にするよう接触させることであって、アプタマーが前記標的分子に対する親和性を有する場合に前記アプタマー－標的複合体が形成される、前記接触させること、
（ｂ）前記アプタマー－標的複合体を前記混合物の残部から分配すること（または前記アプタマー－標的複合体について濃縮すること）、
（ｃ）前記アプタマー－標的複合体を解離させること、及び
（ｄ）前記標的分子への結合能のある前記１つ以上のアプタマーを同定すること、を含み、
ここで、前記アプタマーのライブラリーが、複数のポリヌクレオチドを含み、かつ、請求項３７～４３のいずれか１項に記載の組成物である、前記方法。

【請求項62】

各ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドの５’末端に固定領域を含む、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

各ポリヌクレオチドの５’末端における前記固定領域が、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０ヌクレオチド長、または５～３０、１０～３０、１５～３０、５～２０、もしくは１０～２０ヌクレオチド長である、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

各ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドの３’末端に固定領域を含む、請求項６１～６３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項65】

前記ポリヌクレオチドの３’末端における前記固定領域が、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０ヌクレオチド長、または５～３０、１０～３０、１５～３０、５～２０、もしくは１０～２０ヌクレオチド長である、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

各ポリヌクレオチドがランダム領域を含む、請求項６１～６５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項67】

前記ランダム領域が、２０～１００、または２０～９０、または２０～８０、または２０～７０、または２０～６０、または２０～５０、または２０～４０、または３０～１００、または３０～９０、または３０～７０、または３０～６０、または３０～５０、または３０～４０ヌクレオチド長である、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

各ポリヌクレオチドが、１５～１００、または１５～９０、または１５～８０、または１５～７０、または１５～６０、または１５～５０、または２０～１００、または２０～９０、または２０～８０、または２０～７０、または２０～６０、または２０～５０、または３０～１００、または３０～９０、または３０～８０、または３０～７０、または３０～６０、または３０～５０、または４０～１００、または４０～９０、または４０～８０、または４０～７０、または４０～６０、または４０～５０ヌクレオチド長である、請求項６１～６７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項69】

各ポリヌクレオチドが、標的と結合するアプタマーであり、前記ライブラリーが少なくとも１０００アプタマーを含み、各アプタマーが異なるヌクレオチド配列を含む、請求項６１～６８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項70】

ステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、及び／またはステップ（ｃ）が、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回繰り返される、請求項６１～６９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項71】

前記標的分子への結合能のある前記１つ以上のアプタマーを増幅させる、請求項６１～７０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項72】

前記混合物がポリアニオン性競合分子を含む、請求項６１～７１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項73】

前記ポリアニオン性競合物質が、オリゴヌクレオチド、ポリデキストラン、ＤＮＡ、ヘパリン及びｄＮＴＰから選択される、請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

前記ポリデキストランがデキストラン硫酸であり、前記ＤＮＡがニシン精子ＤＮＡまたはサケ精子ＤＮＡである、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

前記標的分子が、タンパク質、ペプチド、炭水化物、小分子、細胞及び組織から選択される、請求項６１～７４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項76】

前記５位修飾ピリミジンがポリメラーゼ酵素によって取り込まれることができる、請求項１～１４のいずれか１項に記載の化合物、請求項２６～３５のいずれか１項に記載のアプタマー、請求項３７～４５のいずれか１項に記載の組成物、または請求項４６～７５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項77】

キットであって、請求項１～１４のいずれか１項に記載の化合物、請求項１５～２２のいずれか１項に記載の化合物、請求項２３～２５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項２６～３５のいずれか１項に記載のアプタマー、請求項３７～４３のいずれか１項に記載の組成物、ならびに任意選択で、（ａ）溶媒または溶液等の薬学的に許容される担体、（ｂ）安定剤または緩衝剤等の薬学的に許容される賦形剤、（ｃ）前記キット構成要素を保持及び／または混合するための、少なくとも１つの容器、バイアル、もしくは装置、ならびに（ｄ）送達装置、のうちの１つ以上、を含む、前記キット。

【請求項78】

任意選択で、（ｅ）アプタマーに結合している標的分子を検出するのに有用な標識物質、（ｆ）マイクロアレイまたはビーズ等の固体支持体、及び（ｇ）インターカレーター性の蛍光色素または蛍光ＤＮＡプローブ等の、ポリメラーゼ連鎖反応生成物の定量に関連した試薬、のうちの１つ以上をさらに含む、請求項７７に記載のキット。

【請求項79】

式ＩＩＩ、式ＩＶ、または式Ｖ：

【化8】

の構造、またはこれらのうちのいずれか１つの塩、を含む化合物であって、式中、
各Ｌは、独立して－（ＣＨ_２）_ｎ－であり、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
各Ｒ_１は、独立して、

【化9】

から選択され、
式中、＊は、前記Ｌ基への前記Ｒ_１基の結合点を示し、
各Ｘは、独立して、－Ｈ、－ＯＨ、－ＯＭｅ、－Ｏ－アリル、－Ｏ－エチル、－Ｏ－プロピル、－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、－フルオロ、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルオキシ、－ＮＨ_２、及び－アジドから選択される、前記化合物。

【請求項80】

ｎが、１、２、または３である、請求項７９に記載の化合物。

【請求項81】

Ｘが－Ｈである、請求項７９及び８０のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項82】

Ｘが－ＯＭｅである、請求項７９及び８０のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項83】

Ｒ_１が、

【化10】

から選択される、請求項７９～８２のいずれか１項に記載の化合物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月１３日に出願された米国仮出願第６３／１７４，４９５号、及び２０２１年４月１４日に出願された米国仮出願第６３／１７４，７９２号の優先権の利益を主張するものであり、その各々が、いかなる目的であっても参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は一般に、標的分子への結合能のあるアプタマー等の修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドの分野に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の塩基修飾ヌクレオシドを含む、アプタマー等のオリゴヌクレオチド、ならびにそのようなアプタマーを作製及び使用するする方法に関する。

【背景技術】

【0003】

修飾ヌクレオシドは、治療薬、診断薬として、及びそれらの特性（例えば、安定性）を改善するためのオリゴヌクレオチドへの組み込みに使用されている。

【0004】

ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）は、標的分子と選択的に結合するオリゴヌクレオチド（「アプタマー」と呼ばれる）を同定するための方法である。ＳＥＬＥＸ法は、例えば、米国特許第５，２７０，１６３号に記載されている。ＳＥＬＥＸ方法では、オリゴヌクレオチドのランダム混合物からのオリゴヌクレオチドの選択及び同定を伴い、事実上、いかなる所望基準の結合親和性及び結合選択性も達成される。ＳＥＬＥＸ法の過程で同定されたオリゴヌクレオチドに特定の種類の修飾ヌクレオシドを導入することにより、ヌクレアーゼ安定性、実効電荷、親水性または親油性が変化して、オリゴヌクレオチドの三次元構造及び標的結合能に差異をもたらし得る。

【0005】

アプタマー等のオリゴヌクレオチドに組み込むことができる、代替の修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドが当該技術分野において依然として必要とされている。本開示は、これらのニーズのうちの１つ以上を満たすか、または他の利益をもたらすことを目的とする。

【発明の概要】

【0006】

本発明の前述及び他の目的、特徴、及び利点は、添付の図を参照しながら進められる以下の詳細な説明からさらに明らかになる。

【0007】

ある特定の非限定的な例示的実施形態は、以下のとおりである。

【0008】

実施形態１．５位修飾ピリミジンヌクレオシドまたはその塩を含む化合物であって、前記５位修飾ピリミジンが、第１のリンカーによって互いに共有結合で結合している２つのフェニル基を含む部分で置換されており、前記部分が、第２のリンカーによって前記ピリミジンの前記５位に共有結合で連結されている、前記化合物。

【0009】

実施形態２．前記第１のリンカーが、炭素及び酸素から選択される少なくとも１個の原子を含むかまたは結合である、実施形態１に記載の化合物。

【0010】

実施形態３．前記５位修飾ピリミジンが、フェニルベンジル部分、フェノキシベンジル部分、及びジフェニルメチル部分から選択される部分を５位に含む、実施形態１及び２のいずれか１つに記載の化合物。

【0011】

実施形態４．前記第２のリンカーが、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバマートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される基を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の化合物。

【0012】

実施形態５．前記第２のリンカーがアミドリンカーを含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の化合物。

【0013】

実施形態６．前記アミドリンカーが、１個以上の炭素原子または１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個の炭素原子をさらに含む、実施形態５に記載の化合物。

【0014】

実施形態７．５位修飾ウリジンを含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の化合物。

【0015】

実施形態８．５位修飾シチジンを含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載の化合物。

【0016】

実施形態９．式ＩＡまたは式ＩＢ：

【化1】

の構造、またはこれらのうちのいずれかの塩、を含む化合物であって、
式中、
各Ｌは、独立して－（ＣＨ_２）_ｎ－であり、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
各Ｒ_１は、独立して、

【化2】

からなる群から選択され、
式中、＊は、前記Ｌ基への前記Ｒ_１基の結合点を示し、
各Ｘは、独立して、－Ｈ、－ＯＨ、－ＯＭｅ、－Ｏ－アリル、－Ｏ－エチル、－Ｏ－プロピル、－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、－フルオロ、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルオキシ、－ＮＨ_２、及び－アジドからなる群から選択され、
各Ｒ_２は、独立して、－ＯＨ；－アセチル；－ＯＢｚ；－ＯＰ（Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２）（ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ）、－ＯＰ（Ｎ（Ｒ_ｘ）_２）（ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ）［式中、各Ｒ_ｘは、独立して（Ｃ_１－６）アルキルである］；ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルオキシ；－Ｏ－ｓｓ；－ＯＲ；－ＳＲ；－ＺＰ（Ｚ’）（Ｚ’’）－Ｏ－Ｒ［式中、ｓｓは固体支持体であり、Ｚ、Ｚ’、及びＺ’’はそれぞれ独立してＯ及びＳから選択され、Ｒは隣接ヌクレオチドである］からなる群から選択され、
各Ｒ_３は、独立して、－ＯＨ、－Ｏ－トリチル、－Ｏ－４，４’－ジメトキシトリチル、－Ｏ－三リン酸、ＯＲ、－ＳＲ、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ、及びＺ－Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ－Ｒ［式中、Ｚ、Ｚ’、及びＺ’’はそれぞれ独立してＯ及びＳから選択され、Ｒは隣接ヌクレオチドである］からなる群から選択される、前記化合物。

【0017】

実施形態１０．ｎが、１、２、または３である、実施形態９に記載の化合物。

【0018】

実施形態１１．Ｘが－Ｈである、実施形態９及び１０のいずれか１つに記載の化合物。

【0019】

実施形態１２．Ｘが－ＯＭｅである、実施形態９及び１０のいずれか１つに記載の化合物。

【0020】

実施形態１３．各Ｒ_１が、独立して、

【化3】

からなる群から選択される、実施形態９～１２のいずれか１つに記載の化合物。

【0021】

実施形態１４．前記５位修飾ピリミジンが、ＢＰＥｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｕ、２’－Ｆ－ＢＰＥ－Ｕ、ＰＢｎｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｕ、２’－Ｆ－ＰＢｎ－Ｕ、ＰＯＰｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｕ、２’－Ｆ－ＰＯＰ－Ｕ、ＤＰＰｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｕ、２’－Ｆ－ＤＰＰ－Ｕ、ＤＢＭｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｕ、２’－Ｆ－ＤＢＭ－Ｕ、ＢＨｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｕ、２’－Ｆ－ＢＨ－Ｕ、ＢＰＥｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｃ、２’－Ｆ－ＢＰＥ－Ｃ、ＰＢｎｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｃ、２’－Ｆ－ＰＢｎ－Ｃ、ＰＯＰｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｃ、２’－Ｆ－ＰＯＰ－Ｃ、ＤＰＰｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｃ、２’－Ｆ－ＤＰＰ－Ｃ、ＤＢＭｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｃ、２’－Ｆ－ＤＢＭ－Ｃ、ＢＨｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｃ、及び２’－Ｆ－ＢＨ－Ｃから選択される、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の化合物。

【0022】

実施形態１５．式ＩＩＡまたは式ＩＩＢ：

【化4】

の構造、またはこれらのうちのいずれかの塩、を含む化合物であって、
式中、
各Ｌは、独立して－（ＣＨ_２）_ｎ－であり、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
各Ｒ_１は、独立して、

【化5】

からなる群から選択され、
式中、＊は、前記Ｌ基への前記Ｒ_１基の結合点を示し、
各Ｘは、独立して、－Ｈ、－ＯＨ、－ＯＭｅ、－Ｏ－アリル、－Ｏ－エチル、－Ｏ－プロピル、－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、－フルオロ、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルオキシ、－ＮＨ_２、及び－アジドからなる群から選択される、前記化合物。

【0023】

実施形態１６．ｎが、１、２、または３である、実施形態１５に記載の化合物。

【0024】

実施形態１７．Ｘが－Ｈである、実施形態１５及び１６のいずれか１つに記載の化合物。

【0025】

実施形態１８．Ｘが－ＯＭｅである、実施形態１５及び１６のいずれか１つに記載の化合物。

【0026】

実施形態１９．各Ｒ_１が、独立して、

【化6】

からなる群から選択される、実施形態１５～１８のいずれか１つに記載の化合物。

【0027】

実施形態２０．化合物であって、以下の構造：

【化7-1】

【化7-2】

またはこれらのうちのいずれか１つの塩、を含み、
式中、各Ｘは、独立して、－Ｈ、－ＯＨ、－Ｏ－メチル、－Ｏ－アリル、－Ｏ－エチル、－Ｏ－プロピル、－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、－フルオロ、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルオキシ、－ＮＨ_２、及び－アジドからなる群から選択される、前記化合物。

【0028】

実施形態２１．Ｘが－Ｈである、実施形態２０に記載の化合物。

【0029】

実施形態２２．Ｘが－ＯＭｅである、実施形態２０に記載の化合物。

【0030】

実施形態２３．実施形態１～１４のいずれか１つに記載の化合物を含む、オリゴヌクレオチド。

【0031】

実施形態２４．ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはその組み合わせを含む、実施形態２３に記載のオリゴヌクレオチド。

【0032】

実施形態２５．１５～１００、または１５～９０、または１５～８０、または１５～７０、または１５～６０、または１５～５０、または２０～１００、または２０～９０、または２０～８０、または２０～７０、または２０～６０、または２０～５０、または３０～１００、または３０～９０、または３０～８０、または３０～７０、または３０～６０、または３０～５０、または４０～１００、または４０～９０、または４０～８０、または４０～７０、または４０～６０、または４０～５０ヌクレオチド長である、実施形態２３及び２４のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。

【0033】

実施形態２６．標的と結合するアプタマーである、実施形態２３～２５のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。

【0034】

実施形態２７．実施形態１～１４のいずれか１つに記載の化合物を含む、アプタマー。

【0035】

実施形態２８．１５～１００、または１５～９０、または１５～８０、または１５～７０、または１５～６０、または１５～５０、または２０～１００、または２０～９０、または２０～８０、または２０～７０、または２０～６０、または２０～５０、または３０～１００、または３０～９０、または３０～８０、または３０～７０、または３０～６０、または３０～５０、または４０～１００、または４０～９０、または４０～８０、または４０～７０、または４０～６０、または４０～５０ヌクレオチド長である、実施形態２６及び２７のいずれか１つに記載のアプタマー。

【0036】

実施形態２９．ＢＰＥｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｕ、２’－Ｆ－ＢＰＥ－Ｕ、ＰＢｎｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｕ、２’－Ｆ－ＰＢｎ－Ｕ、ＰＯＰｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｕ、２’－Ｆ－ＰＯＰ－Ｕ、ＤＰＰｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｕ、２’－Ｆ－ＤＰＰ－Ｕ、ＤＢＭｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｕ、２’－Ｆ－ＤＢＭ－Ｕ、ＢＨｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｕ、２’－Ｆ－ＢＨ－Ｕ、ＢＰＥｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｃ、２’－Ｆ－ＢＰＥ－Ｃ、ＰＢｎｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｃ、２’－Ｆ－ＰＢｎ－Ｃ、ＰＯＰｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｃ、２’－Ｆ－ＰＯＰ－Ｃ、ＤＰＰｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｃ、２’－Ｆ－ＤＰＰ－Ｃ、ＤＢＭｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｃ、２’－Ｆ－ＤＢＭ－Ｃ、ＢＨｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｃ、及び２’－Ｆ－ＢＨ－Ｃから選択される５位修飾ピリミジンを含む、実施形態２６～２８のいずれか１つに記載のアプタマー。

【0037】

実施形態３０．ＢＰＥｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｕ、２’－Ｆ－ＢＰＥ－Ｕ、ＰＢｎｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｕ、２’－Ｆ－ＰＢｎ－Ｕ、ＰＯＰｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｕ、２’－Ｆ－ＰＯＰ－Ｕ、ＤＰＰｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｕ、２’－Ｆ－ＤＰＰ－Ｕ、ＤＢＭｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｕ、２’－Ｆ－ＤＢＭ－Ｕ、ＢＨｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｕ、２’－Ｆ－ＢＨ－Ｕから選択される少なくとも１つの５位修飾ウリジン、ならびにＢＰＥｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｃ、２’－Ｆ－ＢＰＥ－Ｃ、ＰＢｎｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｃ、２’－Ｆ－ＰＢｎ－Ｃ、ＰＯＰｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｃ、２’－Ｆ－ＰＯＰ－Ｃ、ＤＰＰｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｃ、２’－Ｆ－ＤＰＰ－Ｃ、ＤＢＭｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｃ、２’－Ｆ－ＤＢＭ－Ｃ、ＢＨｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｃ、及び２’－Ｆ－ＢＨ－Ｃから選択される少なくとも１つの５位修飾シチジンを含む、実施形態２６～２９のいずれか１つに記載のアプタマー。

【0038】

実施形態３１．前記アプタマーの５’末端に、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０ヌクレオチド長であるか、または５～３０、１０～３０、１５～３０、５～２０、もしくは１０～２０ヌクレオチド長である領域を含み、前記アプタマーの前記５’末端の前記領域が５位修飾ピリミジンを欠く、実施形態２６～３０のいずれか１つに記載のアプタマー。

【0039】

実施形態３２．前記アプタマーの３’末端に、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０ヌクレオチド長であるか、または５～３０、１０～３０、１５～３０、５～２０、もしくは１０～２０ヌクレオチド長である領域を含み、前記アプタマーの前記３’末端の前記領域が５位修飾ピリミジンを欠く、実施形態２６～３１のいずれか１つに記載のアプタマー。

【0040】

実施形態３３．少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジン及び少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含むアプタマーであって、前記第１の５位修飾ピリミジンと前記第２の５位修飾ピリミジンは異なる５位修飾ピリミジンであり、前記少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンが、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の化合物である、前記アプタマー。

【0041】

実施形態３４．前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンが、ＢｎｄＣ、２’－ＯＭｅ－Ｂｎ－Ｃ、２’－Ｆ－Ｂｎ－Ｃ、ＰＥｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＥ－Ｃ、２’－Ｆ－ＰＥ－Ｃ、ＰＰｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＰ－Ｃ、２’－Ｆ－ＰＰ－Ｃ、ＮａｐｄＣ、２’－ＯＭｅ－Ｎａｐ－Ｃ、２’－Ｆ－Ｎａｐ－Ｃ、２ＮａｐｄＣ、２’－ＯＭｅ－２Ｎａｐ－Ｃ、２’－Ｆ－２Ｎａｐ－Ｃ、ＮＥｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＮＥ－Ｃ、２’－Ｆ－ＮＥ－Ｃ、２ＮＥｄＣ、２’－ＯＭｅ－２ＮＥ－Ｃ、２’－Ｆ－２ＮＥ－Ｃ、ＴｙｒｄＣ、２’－ＯＭｅ－Ｔｙｒ－Ｃ、２’－Ｆ－Ｔｙｒ－Ｃ、ＢｎｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｂｎ－Ｕ、２’－Ｆ－Ｂｎ－Ｕ、ＮａｐｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｎａｐ－Ｕ、２’－Ｆ－Ｎａｐ－Ｕ、ＰＥｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＥ－Ｕ、２’－Ｆ－ＰＥ－Ｕ、ＩｂｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｉｂ－Ｕ、２’－Ｆ－Ｉｂ－Ｕ、ＦＢｎｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＦＢｎ－Ｕ、２’－Ｆ－ＦＢｎ－Ｕ、２ＮａｐｄＵ、２’－ＯＭｅ－２Ｎａｐ－Ｕ、２’－Ｆ－２Ｎａｐ－Ｕ、ＮＥｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＮＥ－Ｕ、２’－Ｆ－ＮＥ－Ｕ、ＭＢｎｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＭＢｎ－Ｕ、２’－Ｆ－ＭＢｎ－Ｕ、ＢＦｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＢＦ－Ｕ、２’－Ｆ－ＢＦ－Ｕ、ＢＴｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＢＴ－Ｕ、２’－Ｆ－ＢＴ－Ｕ、ＰＰｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＰ－Ｕ、２’－Ｆ－ＰＰ－Ｕ、ＭＯＥｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＭＯＥ－Ｕ、２’－Ｆ－ＭＯＥ－Ｕ、ＴｙｒｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｔｙｒ－Ｕ、２’－Ｆ－Ｔｙｒ－Ｕ、ＴｒｐｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｔｒｐ－Ｕ、２’－Ｆ－Ｔｒｐ－Ｕ、ＴｈｒｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｔｈｒ－Ｕ、及び２’－Ｆ－Ｔｈｒ－Ｕのうちの１つ以上からなる群から選択される、実施形態３３に記載のアプタマー。

【0042】

実施形態３５．前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンが、ＮａｐｄＣ、２’－ＯＭｅ－Ｎａｐ－Ｃ、２’－Ｆ－Ｎａｐ－Ｃ、２ＮａｐｄＣ、２’－ＯＭｅ－２Ｎａｐ－Ｃ、２’－Ｆ－２Ｎａｐ－Ｃ、ＴｙｒｄＣ、２’－ＯＭｅ－Ｔｙｒ－Ｃ、２’－Ｆ－Ｔｙｒ－Ｃ、ＰＰｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＰ－Ｃ、２’－Ｆ－ＰＰ－Ｃ、ＮａｐｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｎａｐ－Ｕ、２’－Ｆ－Ｎａｐ－Ｕ、ＰＰｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＰ－Ｕ、２’－Ｆ－ＰＰ－Ｕ、ＭＯＥｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＭＯＥ－Ｕ、２’－Ｆ－ＭＯＥ－Ｕ、ＴｙｒｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｔｙｒ－Ｕ、２’－Ｆ－Ｔｙｒ－Ｕ、ＴｒｐｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｔｒｐ－Ｕ、２’－Ｆ－Ｔｒｐ－Ｕ、ＴｈｒｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｔｈｒ－Ｕ、及び２’－Ｆ－Ｔｈｒ－Ｕのうちの１つ以上からなる群から選択される、実施形態３３及び３４のいずれか１つに記載のアプタマー。

【0043】

実施形態３６．前記アプタマーが、前記５位修飾ピリミジンの代わりに未修飾ピリミジンを含む、長さ及び核酸塩基配列が同じアプタマーと比較して、改善されたヌクレアーゼ安定性及び／またはヒト血清中でのより長い半減期及び／または改善された親和性及び／または改善された解離速度を有する、実施形態２６～３５のいずれか１つに記載のアプタマー。

【0044】

実施形態３７．実施形態２６～３６のいずれか１つに記載の複数のアプタマーを含む、組成物。

【0045】

実施形態３８．各アプタマーがランダム領域を含む、実施形態３７に記載の組成物。

【0046】

実施形態３９．前記ランダム領域が、２０～１００、または２０～９０、または２０～８０、または２０～７０、または２０～６０、または２０～５０、または２０～４０、または３０～１００、または３０～９０、または３０～７０、または３０～６０、または３０～５０、または３０～４０ヌクレオチド長である、実施形態３８に記載の組成物。

【0047】

実施形態４０．アプタマーと標的とを含む組成物であって、前記アプタマー及び前記標的が複合体を形成することができ、前記アプタマーが、実施形態２６～３５のいずれか１つに記載のアプタマーである、前記組成物。

【0048】

実施形態４１．第１のアプタマー、第２のアプタマー、及び標的を含む組成物であって、前記第１のアプタマー、前記第２のアプタマー、及び前記標的が、三量体複合体を形成することができ、前記第１のアプタマーが、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の化合物を含むアプタマーであり、前記第２のアプタマーが、少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含む、前記組成物。

【0049】

実施形態４２．前記標的が、タンパク質、ペプチド、炭水化物、小分子、細胞及び組織から選択される、実施形態４１に記載の組成物。

【0050】

実施形態４３．前記標的が、ＩＬ－３３、ＸＩＡＰ、Ｋ－Ｒａｓ、及びＴＮＦ－αから選択される標的タンパク質である、実施形態４１及び４２のいずれか１つに記載の組成物。

【0051】

実施形態４４．実施形態２６～３５のいずれか１つに記載の少なくとも１つのアプタマー、またはその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

【0052】

実施形態４５．ＩＬ－３３、ＸＩＡＰ、Ｋ－Ｒａｓ、及びＴＮＦ－αから選択されるタンパク質により媒介される疾患または状態を治療または予防するための、実施形態４４に記載の医薬組成物。

【0053】

実施形態４６．対象の疾患または状態を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に、実施形態２６～３５のいずれか１つに記載のアプタマーまたは実施形態４４及び４５のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。

【0054】

実施形態４７．前記疾患または状態が、ＩＬ－３３、ＸＩＡＰ、Ｋ－Ｒａｓ、及びＴＮＦ－αから選択されるタンパク質により媒介される、実施形態４６に記載の方法。

【0055】

実施形態４８．前記疾患または状態が、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）または関節リウマチである、実施形態４６及び４７のいずれか１つに記載の方法。

【0056】

実施形態４９．方法であって、（ａ）標的分子への結合能のあるアプタマーを試料と接触させること、（ｂ）アプタマー－標的複合体が形成されるよう前記アプタマーを前記試料と一緒にインキュベートすること、（ｃ）前記試料中で前記アプタマー－標的複合体について濃縮すること、及び（ｄ）前記アプタマー、前記アプタマー－標的複合体、または前記標的分子の存在を検出することであって前記アプタマー、前記アプタマー－標的複合体、または前記標的分子の検出は、前記試料中に前記標的分子が存在することを示し、前記アプタマー、前記アプタマー－標的複合体、または前記標的分子の検出がないことは、前記試料中に前記標的分子が存在しないことを示す、前記検出すること、を含み、前記アプタマーが、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の化合物を含むかまたは実施形態２６～３５のいずれか１つに記載のアプタマーである、前記方法。

【0057】

実施形態５０．前記試料に競合分子を加えるステップ、前記アプタマー－標的複合体を固体支持体上に捕捉するステップ、及び競合分子を加えて前記試料を希釈するステップ、から選択される少なくとも１つの追加のステップを含み、前記少なくとも１つの追加のステップが、ステップ（ａ）またはステップ（ｂ）の後に行われる、実施形態４９に記載の方法。

【0058】

実施形態５１．前記競合分子がポリアニオン性競合物質から選択される、実施形態５０に記載の方法。

【0059】

実施形態５２．前記ポリアニオン性競合物質が、オリゴヌクレオチド、ポリデキストラン、ＤＮＡ、ヘパリン、及びｄＮＴＰから選択される、実施形態５１に記載の方法。

【0060】

実施形態５３．前記ポリデキストランがデキストラン硫酸であり、前記ＤＮＡがニシン精子ＤＮＡまたはサケ精子ＤＮＡである、実施形態５２に記載の方法。

【0061】

実施形態５４．前記標的分子が、タンパク質、ペプチド、炭水化物、小分子、細胞及び組織から選択される、実施形態４９～５３のいずれか１つに記載の方法。

【0062】

実施形態５５．前記試料が、全血、白血球、末梢血単核細胞、血漿、血清、喀痰、呼気、尿、精液、唾液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引物、気管支吸引物、滑液、関節吸引物、細胞、細胞抽出物、便、組織、組織生検、及び脳脊髄液から選択される、請求項４９～５４のいずれか１項に記載の方法。

【0063】

実施形態５６．試料中の標的を検出するための方法であって、（ａ）前記試料と第１のアプタマーとを、混合物が形成されるよう接触させることであって、前記第１のアプタマーが、前記標的に結合して第１の複合体を形成することができる、前記接触させること、（ｂ）前記混合物を、前記第１の複合体が形成可能な条件下でインキュベートすること、（ｃ）前記混合物と第２のアプタマーとを接触させることであって、前記第２のアプタマーが、前記第１の複合体と結合して第２の複合体を形成することができる、前記接触させること、（ｄ）前記混合物を、前記第２の複合体が形成可能な条件下でインキュベートすること、（ｅ）前記混合物中の前記第１のアプタマー、前記第２のアプタマー、前記標的、前記第１の複合体または前記第２の複合体の有無を検出することであって、前記第１のアプタマー、前記第２のアプタマー、前記標的、前記第１の複合体または前記第２の複合体の存在が、前記試料中に前記標的が存在することを示す、前記検出すること、を含み、ここで、前記第１のアプタマーが、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の化合物を含み、前記第２のアプタマーが、少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含み、前記第１のアプタマー、前記第２のアプタマー及び前記標的が、三量体複合体を形成することができる、前記方法。

【0064】

実施形態５７．前記標的分子が、タンパク質、ペプチド、炭水化物、小分子、細胞及び組織から選択される、実施形態５６に記載の方法。

【0065】

実施形態５８．前記第１のアプタマー、前記第２のアプタマー及び前記標的が、三量体複合体を形成することができる、実施形態５６及び５７のいずれか１つに記載の方法。

【0066】

実施形態５９．前記第２のアプタマーが、ＢｎｄＣ、２’－ＯＭｅ－Ｂｎ－Ｃ、ＰＥｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＥ－Ｃ、ＰＰｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＰ－Ｃ、ＮａｐｄＣ、２’－ＯＭｅ－Ｎａｐ－Ｃ、２ＮａｐｄＣ、２’－ＯＭｅ－２Ｎａｐ－Ｃ、ＮＥｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＮＥ－Ｃ、２ＮＥｄＣ、２’－ＯＭｅ－２ＮＥ－Ｃ、ＴｙｒｄＣ、２’－ＯＭｅ－Ｔｙｒ－Ｃ、ＢｎｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｂｎ－Ｕ、ＮａｐｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｎａｐ－Ｕ、ＰＥｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＥ－Ｕ、ＩｂｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｉｂ－Ｕ、ＦＢｎｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＦＢｎ－Ｕ、２ＮａｐｄＵ、２’－ＯＭｅ－２Ｎａｐ－Ｕ、ＮＥｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＮＥ－Ｕ、ＭＢｎｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＭＢｎ－Ｕ、ＢＦｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＢＦ－Ｕ、ＢＴｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＢＴ－Ｕ、ＰＰｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＰ－Ｕ、ＭＯＥｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＭＯＥ－Ｕ、ＴｙｒｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｔｙｒ－Ｕ、ＴｒｐｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｔｒｐ－Ｕ、ＴｈｒｄＵ、及び２’－ＯＭｅ－Ｔｈｒ－Ｕのうちの１つ以上からなる群から選択される少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含む、実施形態５６～５８のいずれか１つに記載の方法。

【0067】

実施形態６０．前記第２のアプタマーが、ＮａｐｄＣ、２’－ＯＭｅ－Ｎａｐ－Ｃ、２ＮａｐｄＣ、２’－ＯＭｅ－２Ｎａｐ－Ｃ、ＴｙｒｄＣ、２’－ＯＭｅ－Ｔｙｒ－Ｃ、ＰＰｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＰ－Ｃ、ＮａｐｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｎａｐ－Ｕ、ＰＰｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＰ－Ｕ、ＭＯＥｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＭＯＥ－Ｕ、ＴｙｒｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｔｙｒ－Ｕ、ＴｒｐｄＵ、２’－ＯＭｅ－Ｔｒｐ－Ｕ、ＴｈｒｄＵ、及び２’－ＯＭｅ－Ｔｈｒ－Ｕのうちの１つ以上からなる群から選択される少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含む、実施形態５６～５９のいずれか１つに記載の方法。

【0068】

実施形態６１．標的分子への結合能のある１つ以上のアプタマーを同定するための方法であって、（ａ）アプタマーのライブラリーと前記標的分子とを、混合物が形成され、アプタマー－標的複合体の形成を可能にするよう接触させることであって、アプタマーが前記標的分子に対する親和性を有する場合に前記アプタマー－標的複合体が形成される、前記接触させること、（ｂ）前記アプタマー－標的複合体を前記混合物の残部から分配すること（または前記アプタマー－標的複合体について濃縮すること）、（ｃ）前記アプタマー－標的複合体を解離させること、及び（ｄ）前記標的分子への結合能のある前記１つ以上のアプタマーを同定すること、を含み、ここで、前記アプタマーのライブラリーが、複数のポリヌクレオチドを含み、かつ、実施形態３７～４３のいずれか１つに記載の組成物である、前記方法。

【0069】

実施形態６２．各ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドの５’末端に固定領域を含む、実施形態６１に記載の方法。

【0070】

実施形態６３．各ポリヌクレオチドの５’末端における前記固定領域が、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０ヌクレオチド長、または５～３０、１０～３０、１５～３０、５～２０、もしくは１０～２０ヌクレオチド長である、実施形態６２に記載の方法。

【0071】

実施形態６４．各ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドの３’末端に固定領域を含む、実施形態６１～６３のいずれか１つに記載の方法。

【0072】

実施形態６５．前記ポリヌクレオチドの３’末端における前記固定領域が、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０ヌクレオチド長、または５～３０、１０～３０、１５～３０、５～２０、もしくは１０～２０ヌクレオチド長である、実施形態６４に記載の方法。

【0073】

実施形態６６．各ポリヌクレオチドがランダム領域を含む、実施形態６１～６５のいずれか１つに記載の方法。

【0074】

実施形態６７．前記ランダム領域が、２０～１００、または２０～９０、または２０～８０、または２０～７０、または２０～６０、または２０～５０、または２０～４０、または３０～１００、または３０～９０、または３０～７０、または３０～６０、または３０～５０、または３０～４０ヌクレオチド長である、実施形態６６に記載の方法。

【0075】

実施形態６８．各ポリヌクレオチドが、１５～１００、または１５～９０、または１５～８０、または１５～７０、または１５～６０、または１５～５０、または２０～１００、または２０～９０、または２０～８０、または２０～７０、または２０～６０、または２０～５０、または３０～１００、または３０～９０、または３０～８０、または３０～７０、または３０～６０、または３０～５０、または４０～１００、または４０～９０、または４０～８０、または４０～７０、または４０～６０、または４０～５０ヌクレオチド長である、実施形態６１～６７のいずれか１つに記載の方法。

【0076】

実施形態６９．各ポリヌクレオチドが、標的と結合するアプタマーであり、前記ライブラリーが少なくとも１０００アプタマーを含み、各アプタマーが異なるヌクレオチド配列を含む、実施形態６１～６８のいずれか１つに記載の方法。

【0077】

実施形態７０．ステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、及び／またはステップ（ｃ）が、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回繰り返される、実施形態６１～６９のいずれか１つに記載の方法。

【0078】

実施形態７１．前記標的分子への結合能のある前記１つ以上のアプタマーを増幅させる、実施形態６１～７０のいずれか１つに記載の方法。

【0079】

実施形態７２．前記混合物がポリアニオン性競合分子を含む、実施形態６１～７１のいずれか１つに記載の方法。

【0080】

実施形態７３．前記ポリアニオン性競合物質が、オリゴヌクレオチド、ポリデキストラン、ＤＮＡ、ヘパリン及びｄＮＴＰから選択される、実施形態７２に記載の方法。

【0081】

実施形態７４．前記ポリデキストランがデキストラン硫酸であり、前記ＤＮＡがニシン精子ＤＮＡまたはサケ精子ＤＮＡである、実施形態７３に記載の方法。

【0082】

実施形態７５．前記標的分子が、タンパク質、ペプチド、炭水化物、小分子、細胞及び組織から選択される、実施形態６１～７４のいずれか１つに記載の方法。

【0083】

実施形態７６．前記５位修飾ピリミジンがポリメラーゼ酵素によって取り込まれることができる、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の化合物、実施形態２６～３５のいずれか１つに記載のアプタマー、実施形態３７～４５のいずれか１つに記載の組成物、または実施形態４６～７５のいずれか１つに記載の方法。

【0084】

実施形態７７．キットであって、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の化合物、実施形態１５～２２のいずれか１つに記載の化合物、実施形態２３～２５のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド、実施形態２６～３５のいずれか１つに記載のアプタマー、実施形態３７～４３のいずれか１つに記載の組成物、ならびに任意選択で、（ａ）溶媒または溶液等の薬学的に許容される担体、（ｂ）安定剤または緩衝剤等の薬学的に許容される賦形剤、（ｃ）前記キット構成要素を保持及び／または混合するための、少なくとも１つの容器、バイアル、もしくは装置、ならびに（ｄ）送達装置、のうちの１つ以上、を含む、前記キット。

【0085】

実施形態７８．任意選択で、（ｅ）アプタマーに結合している標的分子を検出するのに有用な標識物質、（ｆ）マイクロアレイまたはビーズ等の固体支持体、及び（ｇ）インターカレーター性の蛍光色素または蛍光ＤＮＡプローブ等の、ポリメラーゼ連鎖反応生成物の定量に関連した試薬、のうちの１つ以上をさらに含む、実施形態７７に記載のキット。

【0086】

実施形態７９．式ＩＩＩ、式ＩＶ、または式Ｖ：

【化8】

の構造、またはこれらのうちのいずれか１つの塩、を含む化合物であって、式中、
各Ｌは、独立して－（ＣＨ_２）_ｎ－であり、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
各Ｒ_１は、独立して、

【化9】

から選択され、
式中、＊は、前記Ｌ基への前記Ｒ_１基の結合点を示し、
各Ｘは、独立して、－Ｈ、－ＯＨ、－ＯＭｅ、－Ｏ－アリル、－Ｏ－エチル、－Ｏ－プロピル、－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、－フルオロ、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルオキシ、－ＮＨ_２、及び－アジドから選択される、前記化合物。

【0087】

実施形態８０．ｎが、１、２、または３である、請求項７９に記載の化合物。

【0088】

実施形態８１．Ｘが－Ｈである、請求項７９及び８０のいずれか１項に記載の化合物。

【0089】

実施形態８２．Ｘが－ＯＭｅである、請求項７９及び８０のいずれか１項に記載の化合物。

【0090】

実施形態８３．Ｒ_１が、

【化10】

から選択される、請求項７９～８２のいずれか１項に記載の化合物。

【図面の簡単な説明】

【0091】

【図1A】様々なタンパク質標的に対するラウンド７の濃縮ＳＥＬＥＸプールの用量依存的結合。各結合曲線について、ライブラリー－タンパク質複合体の割合をタンパク質濃度の関数としてプロットした。４パラメータシグモイド型用量反応モデルにデータを当てはめることにより平衡結合定数（Ｋｄ値）を決定した。ＸＩＡＰ標的に対するライブラリーを含有するＰＰ－ｄＵＴＰ及びＤＰＰ－ｄＵＴＰについてのラウンド７の濃縮ＳＥＬＥＸプールの比較。

【図1B】様々なタンパク質標的に対するラウンド７の濃縮ＳＥＬＥＸプールの用量依存的結合。各結合曲線について、ライブラリー－タンパク質複合体の割合をタンパク質濃度の関数としてプロットした。４パラメータシグモイド型用量反応モデルにデータを当てはめることにより平衡結合定数（Ｋｄ値）を決定した。ＸＩＡＰ標的に対するライブラリーを含有するＰＰ－ｄＵＴＰ及びＰＢｎ－ｄＵＴＰについてのラウンド７の濃縮ＳＥＬＥＸプールの比較。

【図1C】様々なタンパク質標的に対するラウンド７の濃縮ＳＥＬＥＸプールの用量依存的結合。各結合曲線について、ライブラリー－タンパク質複合体の割合をタンパク質濃度の関数としてプロットした。４パラメータシグモイド型用量反応モデルにデータを当てはめることにより平衡結合定数（Ｋｄ値）を決定した。ＩＬ－３３標的に対するライブラリーを含有するＰＰ－ｄＵＴＰ及びＤＰＰ－ｄＵＴＰについてのラウンド７の濃縮ＳＥＬＥＸプールの比較。

【図1D】様々なタンパク質標的に対するラウンド７の濃縮ＳＥＬＥＸプールの用量依存的結合。各結合曲線について、ライブラリー－タンパク質複合体の割合をタンパク質濃度の関数としてプロットした。４パラメータシグモイド型用量反応モデルにデータを当てはめることにより平衡結合定数（Ｋｄ値）を決定した。ＩＬ－３３標的に対するライブラリーを含有するＰＰ－ｄＵＴＰ及びＰＢｎ－ｄＵＴＰについてのラウンド７の濃縮ＳＥＬＥＸプールの比較。

【図1E】様々なタンパク質標的に対するラウンド７の濃縮ＳＥＬＥＸプールの用量依存的結合。各結合曲線について、ライブラリー－タンパク質複合体の割合をタンパク質濃度の関数としてプロットした。４パラメータシグモイド型用量反応モデルにデータを当てはめることにより平衡結合定数（Ｋｄ値）を決定した。Ｋ－Ｒａｓ標的に対するライブラリーを含有するＰＰ－ｄＵＴＰ及びＰＯＰ－ｄＵＴＰについてのラウンド７の濃縮ＳＥＬＥＸプールの比較。

【図1F】様々なタンパク質標的に対するラウンド７の濃縮ＳＥＬＥＸプールの用量依存的結合。各結合曲線について、ライブラリー－タンパク質複合体の割合をタンパク質濃度の関数としてプロットした。４パラメータシグモイド型用量反応モデルにデータを当てはめることにより平衡結合定数（Ｋｄ値）を決定した。Ｋ－Ｒａｓ標的に対するライブラリーを含有するＰＰ－ｄＵＴＰ及びＤＰＰ－ｄＵＴＰについてのラウンド７の濃縮ＳＥＬＥＸプールの比較。

【図1G】様々なタンパク質標的に対するラウンド７の濃縮ＳＥＬＥＸプールの用量依存的結合。各結合曲線について、ライブラリー－タンパク質複合体の割合をタンパク質濃度の関数としてプロットした。４パラメータシグモイド型用量反応モデルにデータを当てはめることにより平衡結合定数（Ｋｄ値）を決定した。Ｋ－Ｒａｓ標的に対するライブラリーを含有するＰＰ－ｄＵＴＰ及びＰＢｎ－ｄＵＴＰについてのラウンド７の濃縮ＳＥＬＥＸプールの比較。

【図1H】様々なタンパク質標的に対するラウンド７の濃縮ＳＥＬＥＸプールの用量依存的結合。各結合曲線について、ライブラリー－タンパク質複合体の割合をタンパク質濃度の関数としてプロットした。４パラメータシグモイド型用量反応モデルにデータを当てはめることにより平衡結合定数（Ｋｄ値）を決定した。Ｋ－Ｒａｓ標的に対するライブラリーを含有するＰＰ－ｄＵＴＰ及びＢＰＥ－ｄＵＴＰについてのラウンド７の濃縮ＳＥＬＥＸプールの比較。

【図1I】様々なタンパク質標的に対するラウンド７の濃縮ＳＥＬＥＸプールの用量依存的結合。各結合曲線について、ライブラリー－タンパク質複合体の割合をタンパク質濃度の関数としてプロットした。４パラメータシグモイド型用量反応モデルにデータを当てはめることにより平衡結合定数（Ｋｄ値）を決定した。ＴＮＦ－α標的に対するライブラリーを含有するＰＰ－ｄＵＴＰ及びＰＯＰ－ｄＵＴＰについてのラウンド７の濃縮ＳＥＬＥＸプールの比較。

【図2】アプタマーに組み込まれ得る、ある特定の例示的な５位修飾されたウリジン及びシチジン。

【図3】ウリジンの５位に存在し得る、ある特定の例示的修飾。Ｃ－５修飾の化学構造には、ウリジンの５位に修飾を連結する例示的アミド結合が含まれる。示されている５位部分には、互いに共有結合で結合している２つのフェニル基が含まれる。示されている５位部分には、フェニルベンジル部分（例えば、ＢＰＥ、ＰＢｎｄ、ＤＢＭ）、４－フェノキシベンジル部分（例えば、ＰＯＰ）、ジフェニルプロピル部分（例えば、ＤＰＰ）、ベンズヒドリル部分（例えば、ＢＨ）が含まれる。

【図4】シチジンの５位に存在し得る、ある特定の例示的修飾。Ｃ－５修飾の化学構造には、シチジンの５位に修飾を連結する例示的アミド結合が含まれる。示されている５位部分には、互いに共有結合で結合している２つのフェニル基が含まれる。示されている５位部分には、フェニルベンジル部分（例えば、ＢＰＥ、ＰＢｎｄ、ＤＢＭ）、４－フェノキシベンジル部分（例えば、ＰＯＰ）、ジフェニルプロピル部分（例えば、ＤＰＰ）、ベンズヒドリル部分（例えば、ＢＨ）が含まれる。

【図5】ウリジンの５位に存在し得る、ある特定の例示的修飾。Ｃ－５修飾の化学構造には、ウリジンの５位に修飾を連結する例示的アミド結合が含まれる。示されている５位部分には、ベンジル部分（例えば、Ｂｎ、ＰＥ及びＰＰ）、ナフチル部分（例えば、Ｎａｐ、２Ｎａｐ、ＮＥ）、ブチル部分（例えば、ｉＢｕ）、フルオロベンジル部分（例えば、ＦＢｎ）、チロシル部分（例えば、Ｔｙｒ）、３，４－メチレンジオキシベンジル（例えば、ＭＢｎ）、モルホリノ部分（例えば、ＭＯＥ）、ベンゾフラニル部分（例えば、ＢＦ）、インドール部分（例えば、Ｔｒｐ）及びヒドロキシプロピル部分（例えば、Ｔｈｒ）が含まれる。

【図6】シチジンの５位に存在し得る、ある特定の例示的修飾。Ｃ－５修飾の化学構造には、シチジンの５位に修飾を連結する例示的アミド結合が含まれる。示されている５位部分には、ベンジル部分（例えば、Ｂｎ、ＰＥ及びＰＰ）、ナフチル部分（例えば、Ｎａｐ、２Ｎａｐ、ＮＥ、及び２ＮＥ）及びチロシル部分（例えば、Ｔｙｒ）が含まれる。

【図7A】様々なタンパク質標的に対するラウンド８（ＴＮＦα及びｓＬ－セレクチン）またはラウンド６（Ｂ７－Ｈ４）の濃縮ＳＥＬＥＸプールの用量依存的結合。各結合曲線について、ライブラリー－タンパク質複合体の割合をタンパク質濃度の関数としてプロットした。４パラメータシグモイド型用量反応モデルにデータを当てはめることにより平衡結合定数（Ｋｄ値）を決定した。ＴＮＦα標的に対するライブラリーを含有するＢｎ－ｄＣＴＰ、ＰＰ－ｄＣＴＰ、及びＤＰＰ－ｄＣＴＰについてのラウンド８の濃縮ＳＥＬＥＸプールの比較。

【図7B】様々なタンパク質標的に対するラウンド８（ＴＮＦα及びｓＬ－セレクチン）またはラウンド６（Ｂ７－Ｈ４）の濃縮ＳＥＬＥＸプールの用量依存的結合。各結合曲線について、ライブラリー－タンパク質複合体の割合をタンパク質濃度の関数としてプロットした。４パラメータシグモイド型用量反応モデルにデータを当てはめることにより平衡結合定数（Ｋｄ値）を決定した。ＴＮＦα標的に対するライブラリーを含有するＢｎ－ｄＣＴＰ、ＰＰ－ｄＣＴＰ、及びＰＢｎ－ｄＣＴＰについてのラウンド８の濃縮ＳＥＬＥＸプールの比較。

【図7C】様々なタンパク質標的に対するラウンド８（ＴＮＦα及びｓＬ－セレクチン）またはラウンド６（Ｂ７－Ｈ４）の濃縮ＳＥＬＥＸプールの用量依存的結合。各結合曲線について、ライブラリー－タンパク質複合体の割合をタンパク質濃度の関数としてプロットした。４パラメータシグモイド型用量反応モデルにデータを当てはめることにより平衡結合定数（Ｋｄ値）を決定した。ＴＮＦα標的に対するライブラリーを含有するＢｎ－ｄＣＴＰ、ＰＰ－ｄＣＴＰ、及びＰＯＰ－ｄＣＴＰについてのラウンド８の濃縮ＳＥＬＥＸプールの比較。

【図7D】様々なタンパク質標的に対するラウンド８（ＴＮＦα及びｓＬ－セレクチン）またはラウンド６（Ｂ７－Ｈ４）の濃縮ＳＥＬＥＸプールの用量依存的結合。各結合曲線について、ライブラリー－タンパク質複合体の割合をタンパク質濃度の関数としてプロットした。４パラメータシグモイド型用量反応モデルにデータを当てはめることにより平衡結合定数（Ｋｄ値）を決定した。Ｂ７－Ｈ４標的に対するライブラリーを含有するＢｎ－ｄＣＴＰ及びＰＢｎ－ｄＣＴＰについてのラウンド８の濃縮ＳＥＬＥＸプールの比較。

【図7E】様々なタンパク質標的に対するラウンド８（ＴＮＦα及びｓＬ－セレクチン）またはラウンド６（Ｂ７－Ｈ４）の濃縮ＳＥＬＥＸプールの用量依存的結合。各結合曲線について、ライブラリー－タンパク質複合体の割合をタンパク質濃度の関数としてプロットした。４パラメータシグモイド型用量反応モデルにデータを当てはめることにより平衡結合定数（Ｋｄ値）を決定した。ｓＬ－セレクチン標的に対するライブラリーを含有するＰＰ－ｄＣＴＰ及びＰＢｎ－ｄＣＴＰについてのラウンド８の濃縮ＳＥＬＥＸプールの比較。様々なタンパク質標的に対するラウンド８（ＴＮＦα及びｓＬ－セレクチン）またはラウンド６（Ｂ７－Ｈ４）の濃縮ＳＥＬＥＸプールの用量依存的結合。各結合曲線について、ライブラリー－タンパク質複合体の割合をタンパク質濃度の関数としてプロットした。４パラメータシグモイド型用量反応モデルにデータを当てはめることにより平衡結合定数（Ｋｄ値）を決定した。ｓＬ－セレクチン標的に対するライブラリーを含有するＰＰ－ｄＣＴＰ及びＰＯＰ－ｄＣＴＰについてのラウンド８の濃縮ＳＥＬＥＸプールの比較。

【発明を実施するための形態】

【0092】

別段の注記がない限り、技術用語は従来の使用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓにより出版，１９９４（ＩＳＢＮ ０－１９－８５４２８７－９）、Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．により出版，１９９４（ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）、及びＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．により出版，１９９５（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）に見出され得る。

【0093】

別段の説明がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本開示が属する当該技術分野の当業者に共通して理解される意味と同一の意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈で特に明確な指示がない限り、複数の指示対象が含まれる。「ＡまたはＢを含む」とは、Ａ、またはＢ、またはＡとＢが含まれることを意味する。核酸またはポリペプチドについて与えられる、すべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、及びすべての分子量または分子質量の値は概数であり、説明のために提供されていることがさらに理解されるべきである。

【0094】

さらに、本明細書で提供される範囲は、その範囲内のすべての値の簡略表記であると理解される。例えば、１～５０という範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲（及び文脈で特に明確な指示がない限り、それらの分数）が含まれることが理解される。いかなる濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲も、別段の指示がない限り、記述範囲内のあらゆる整数値、及び適切な場合、その分数値（整数の１０分の１及び１００分の１等）を含むと理解されるべきである。また、ポリマーのサブユニット、サイズまたは厚さ等の任意の物理的特徴に関して本明細書で記述される任意の数字範囲は、別段の指示がない限り、記述範囲内のいかなる整数も含むと理解されるべきであ。本明細書で使用される場合、「約」または「から本質的になる」とは、別段の指示がない限り、示されている範囲、値、または構造の±２０％を意味する。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、非限定的であり、かつ同義で使用される。

【0095】

本開示の実施または試験においては本明細書に記載される方法及び材料と類似または同等のものを使用することができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾がある場合は、用語の説明も含め、本明細書が優先する。さらに、材料、方法、及び例は例示にすぎず、限定することを意図しない。

【0096】

本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」とは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはその修飾形態、及びその類似体を指す。ヌクレオチドには、プリン（例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン、ならびにそれらの誘導体及び類似体）ならびにピリミジン（例えば、シトシン、ウラシル、チミン、ならびにそれらの誘導体及び類似体）を含む種が含まれる。本明細書で使用される場合、用語「シチジン」は、別段の具体的な指示がない限り、シトシン塩基を含むリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドを指すために総称的に使用される。用語「シチジン」には、２’－修飾シチジン、例えば、２’－フルオロ、２’－メトキシ等が含まれる。同様に、用語「修飾シチジン」または特定の修飾シチジンはまた、別段の具体的な指示がない限り、修飾シトシン塩基を含むリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または修飾リボヌクレオチド（例えば、２’－フルオロ、２’－メトキシ等）を指す。用語「ウリジン」は、別段の具体的な指示がない限り、ウラシル塩基を含むリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または修飾リボヌクレオチド指すために総称的に使用される。用語「ウリジン」には、２’－修飾ウリジン、例えば、２’－フルオロ、２’－メトキシ等が含まれる。同様に、用語「修飾ウリジン」または特定の修飾ウリジンはまた、別段の具体的な指示がない限り、修飾ウラシル塩基を含むリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または修飾リボヌクレオチド（例えば、２’－フルオロ、２’－メトキシ等）を指す。

【0097】

本明細書で使用される場合、用語「５位修飾シチジン」または「Ｃ－５修飾シチジン」とは、例えば、図２及び図４に示すような、シチジンのＣ－５位に修飾を有するシチジンを指す。いくつかの実施形態では、Ｃ５修飾シチジン、例えば、それらの三リン酸形態にあるものは、ポリメラーゼ（例えば、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）によってオリゴヌクレオチド中に取り込まれることができる。非限定的な例示的５位修飾シチジンには、図４に示すものが含まれる。非限定的な例示的Ｃ－５修飾シチジンとしては、５－［Ｎ－（４－フェニルベンジル）カルボキサミド］－２’－デオキシシチジン（「ＰＢｎｄＣ」と呼ばれ、図４に示されており、Ｘ＝Ｈである）、５－［Ｎ－（４－フェニルベンジル）カルボキサミド］－２’－Ｏ－メチルシチジン（「２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｃ」と呼ばれ、図４に示されており、Ｘ＝ＯＭｅである）、５－［Ｎ－（４－フェニルベンジル）カルボキサミド］－２’－フルオロシチジン（「２’－Ｆ－ＰＢｎ－Ｃ」と呼ばれ、図４に示されており、Ｘ＝Ｆである）、５－［Ｎ－（４－フェノキシベンジル）カルボキサミド］－２’－デオキシシチジン（「ＰＯＰｄＣ」と呼ばれ、図４に示されており、Ｘ＝Ｈである）、５－［Ｎ－（４－フェノキシベンジル）カルボキサミド］－２’－Ｏ－メチルシチジン（「２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｃ」と呼ばれ、図４に示されており、Ｘ＝ＯＭｅである）、５－［Ｎ－（４－フェノキシベンジル）カルボキサミド］－２’－フルオロシチジン（「２’－Ｆ－ＰＯＰ－Ｃ」と呼ばれ、図４に示されており、Ｘ＝Ｆである）、５－［Ｎ－（３，３－ジフェニルプロピル）カルボキサミド］－２’－デオキシシチジン（「ＤＰＰｄＣ」と呼ばれ、図４に示されており、Ｘ＝Ｈである）、５－［Ｎ－（３，３－ジフェニルプロピル）カルボキサミド］－２’－Ｏ－メチルシチジン（「２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｃ」と呼ばれ、図４に示されており、Ｘ＝ＯＭｅである）、５－［Ｎ－（３，３－ジフェニルプロピル）カルボキサミド］－２’－フルオロシチジン（「２’－Ｆ－ＤＰＰ－Ｃ」と呼ばれ、図４に示されており、Ｘ＝Ｆである）、５－｛Ｎ－［（１，１’－ビフェニル）－４－イル）エチル］カルボキシアミド｝－２’－デオキシシチジン（「ＢＰＥｄＣ」と呼ばれ、図４に示されており、Ｘ＝Ｈである）、５－｛Ｎ－［（１，１’－ビフェニル）－４－イル）エチル］カルボキシアミド｝－２’－Ｏ－メチルシチジン（「２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｃ」と呼ばれ、図４に示されており、Ｘ＝ＯＭｅである）、５－｛Ｎ－［（１，１’－ビフェニル）－４－イル）エチル］カルボキシアミド｝－２’－フルオロシチジン（「２’－Ｆ－ＢＰＥ－Ｃ」と呼ばれ、図４に示されており、Ｘ＝Ｆである）、５－［Ｎ－（３－フェニルベンジル）カルボキサミド］－２’－デオキシシチジン（「ＤＢＭｄＣ」と呼ばれ、図４に示されており、Ｘ＝Ｈである）、５－［Ｎ－（３－フェニルベンジル）カルボキサミド］－２’－Ｏ－メチルシチジン（「２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｃ」と呼ばれ、図４に示されており、Ｘ＝ＯＭｅである）、５－［Ｎ－（３－フェニルベンジル）カルボキサミド］－２’－フルオロシチジン（「２’－Ｆ－ＤＢＭ－Ｃ」と呼ばれ、図４に示されており、Ｘ＝Ｆである）、５－［Ｎ－（３，３－ジフェニルメチル）カルボキサミド］－２’－デオキシシチジン（「ＢＨｄＣ」と呼ばれ、図４に示されており、Ｘ＝Ｈである）、及び５－［Ｎ－（３，３－ジフェニルメチル）カルボキサミド］－２’－Ｏ－メチルシチジン（「２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｃ」と呼ばれ、図４に示されており、Ｘ＝ＯＭｅである）、及び５－［Ｎ－（３，３－ジフェニルメチル）カルボキサミド］－２’－フルオロシチジン（「２’－Ｆ－ＢＨ－Ｃ」と呼ばれ、図４に示されており、Ｘ＝Ｆである）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに含まれ得る非限定的な例示的５位修飾シチジンには、図６に示すものが含まれる。非限定的な例示的５位修飾シチジンとしては、５－（Ｎ－ベンジルカルボキサミド）－２’－デオキシシチジン（「ＢｎｄＣ」と呼ばれる）、５－（Ｎ－ベンジルカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルシチジン（「２’－ＯＭｅ－Ｂｎ－Ｃ」と呼ばれる）、５－（Ｎ－ベンジルカルボキサミド）－２’－フルオロシチジン（「２’－Ｆ－Ｂｎ－Ｃ」と呼ばれる）、５－（Ｎ－２－フェニルエチルカルボキサミド）－２’－デオキシシチジン（「ＰＥｄＣ」と呼ばれる）、５－（Ｎ－２－フェニルエチルカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルシチジン（「２’－ＯＭｅ－ＰＥ－Ｃ」と呼ばれる）、５－（Ｎ－２－フェニルエチルカルボキサミド）－２’－フルオロシチジン（「２’－Ｆ－ＰＥ－Ｃ」と呼ばれる）、５－（Ｎ－３－フェニルプロピルカルボキサミド）－２’－デオキシシチジン（「ＰＰｄＣ」と呼ばれる）、５－（Ｎ－３－フェニルプロピルカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルシチジン（「２’－ＯＭｅ－ＰＰ－Ｃ」と呼ばれる）、５－（Ｎ－３－フェニルプロピルカルボキサミド）－２’－フルオロシチジン（「２’－Ｆ－ＰＰ－Ｃ」と呼ばれる）、５－（Ｎ－１－ナフチルメチルカルボキサミド）－２’－デオキシシチジン（「ＮａｐｄＣ」と呼ばれる）、５－（Ｎ－１－ナフチルメチルカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルシチジン（「２’－ＯＭｅ－Ｎａｐ－Ｃ」と呼ばれる）、５－（Ｎ－１－ナフチルメチルカルボキサミド）－２’－フルオロシチジン（「２’－Ｆ－Ｎａｐ－Ｃ」と呼ばれる）、５－（Ｎ－２－ナフチルメチルカルボキサミド）－２’－デオキシシチジン（「２ＮａｐｄＣ」と呼ばれる）、５－（Ｎ－２－ナフチルメチルカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルシチジン（「２’－ＯＭｅ－２Ｎａｐ－Ｃ」と呼ばれる）、５－（Ｎ－２－ナフチルメチルカルボキサミド）－２’－フルオロシチジン（「２’－Ｆ－２Ｎａｐ－Ｃ」と呼ばれる）、５－（Ｎ－１－ナフチル－２－エチルカルボキサミド）－２’－デオキシシチジン（「ＮＥｄＣ」と呼ばれる）、５－（Ｎ－１－ナフチル－２－エチルカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルシチジン（「２’－ＯＭｅ－ＮＥ－Ｃ」と呼ばれる）、５－（Ｎ－１－ナフチル－２－エチルカルボキサミド）－２’－フルオロシチジン（「２’－Ｆ－ＮＥ－Ｃ」と呼ばれる）、５－（Ｎ－２－ナフチル－２－エチルカルボキサミド）－２’－デオキシシチジン（「２ＮＥｄＣ」と呼ばれる）、５－（Ｎ－２－ナフチル－２－エチルカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルシチジン（「２’－ＯＭｅ－２ＮＥ－Ｃ」と呼ばれる）、５－（Ｎ－２－ナフチル－２－エチルカルボキサミド）－２’－フルオロシチジン（「２’－Ｆ－２ＮＥ－Ｃ」と呼ばれる）、５－（Ｎ－チロシルカルボキサミド）－２’－デオキシシチジン（「ＴｙｒｄＣ」と呼ばれる）、５－（Ｎ－チロシルカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルシチジン（「２’－ＯＭｅ－Ｔｙｒ－Ｃ」と呼ばれる）、及び５－（Ｎ－チロシルカルボキサミド）－２’－フルオロシチジン（「２’－Ｆ－Ｔｙｒ－Ｃ」と呼ばれる）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、Ｃ５修飾シチジン、例えば、それらの三リン酸形態にあるものは、ポリメラーゼ（例えば、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）によってオリゴヌクレオチド中に取り込まれることができる。

【0098】

本明細書に記載されるＣ－５修飾シチジンの化学修飾を、２’－位糖修飾（例えば、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ）、環外アミンにおける修飾、及び４－チオシチジンの置換等と、単独または任意の組み合わせで組み合わせることもできる。

【0099】

本明細書で使用される場合、用語「Ｃ－５修飾ウリジン」または「５位修飾ウリジン」とは、例えば、図２及び図３に示すような、ウリジンのＣ－５位に修飾を有するウリジンを指す。いくつかの実施形態では、Ｃ５修飾ウリジン、例えば、それらの三リン酸形態にあるものは、ポリメラーゼ（例えば、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）によってオリゴヌクレオチド中に取り込まれることができる。非限定的な例示的５位修飾ウリジンには、図３に示すものが含まれる。非限定的な例示的５位修飾ウリジンとしては、
５－［Ｎ－（４－フェニルベンジル）カルボキサミド］－２’－デオキシウリジン（ＰＢｎｄＵ）、
５－［Ｎ－（４－フェニルベンジル）カルボキサミド］－２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｕ）、
５－［Ｎ－（４－フェニルベンジル）カルボキサミド］－２’－フルオロウリジン（２’－Ｆ－ＰＢｎ－Ｕ）、
５－［Ｎ－（４－フェノキシベンジル）カルボキサミド］－２’－デオキシウリジン（ＰＯＰｄＵ）、
５－［Ｎ－（４－フェノキシベンジル）カルボキサミド］－２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｕ）、
５－［Ｎ－（４－フェノキシベンジル）カルボキサミド］－２’－フルオロウリジン（２’－Ｆ－ＰＯＰ－Ｕ）、
５－［Ｎ－（３，３－ジフェニルプロピル）カルボキサミド］－２’－デオキシウリジン（ＤＰＰｄＵ）、
５－［Ｎ－（３，３－ジフェニルプロピル）カルボキサミド］－２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｕ）、
５－［Ｎ－（３，３－ジフェニルプロピル）カルボキサミド］－２’－フルオロウリジン（２’－Ｆ－ＤＰＰ－Ｕ）、
５－｛Ｎ－［（１，１’－ビフェニル）－４－イル）エチル］カルボキシアミド｝－２’－デオキシウリジン（ＢＰＥｄＵ）、
５－｛Ｎ－［（１，１’－ビフェニル）－４－イル）エチル］カルボキシアミド｝－２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｕ）、
５－｛Ｎ－［（１，１’－ビフェニル）－４－イル）エチル］カルボキシアミド｝－２’－フルオロウリジン（２’－Ｆ－ＢＰＥ－Ｕ）、
５－［Ｎ－（３－フェニルベンジル）カルボキサミド］－２’－デオキシウリジン（ＤＢＭｄＵ）、
５－［Ｎ－（３－フェニルベンジル）カルボキサミド］－２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｕ）、
５－［Ｎ－（３－フェニルベンジル）カルボキサミド］－２’－フルオロウリジン（２’－Ｆ－ＤＢＭ－Ｕ）、
５－［Ｎ－（３，３－ジフェニルメチル）カルボキサミド］－２’－デオキシウリジン（ＢＨｄＵ）、
５－［Ｎ－（３，３－ジフェニルメチル）カルボキサミド］－２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｕ）、
５－［Ｎ－（３，３－ジフェニルメチル）カルボキサミド］－２’－フルオロウリジン（２’－Ｆ－ＢＨ－Ｕ）が挙げられるが、これらに限定されない。
さらに含まれ得る非限定的な例示的５位修飾ウリジンには、図５に示すものが含まれる。

【0100】

さらに含まれ得る非限定的な例示的５位修飾ウリジンとしては、５－（Ｎ－ベンジルカルボキサミド）－２’－デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５－（Ｎ－ベンジルカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－Ｂｎ－Ｕ）、５－（Ｎ－ベンジルカルボキサミド）－２’－フルオロウリジン（２’－Ｆ－Ｂｎ－Ｕ）、５－（Ｎ－フェネチルカルボキサミド）－２’－デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５－（Ｎ－フェネチルカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－ＰＥ－Ｕ）、５－（Ｎ－フェネチルカルボキサミド）－２’－フルオロウリジン（２’－Ｆ－ＰＥ－Ｕ）、５－（Ｎ－チオフェニルメチルカルボキサミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５－（Ｎ－チオフェニルメチルカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－Ｔｈ－Ｕ）、５－（Ｎ－チオフェニルメチルカルボキサミド）－２’－フルオロウリジン（２’－Ｆ－Ｔｈ－Ｕ）、５－（Ｎ－イソブチルカルボキサミド）－２’－デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５－（Ｎ－イソブチルカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－ｉＢｕ－Ｕ）、５－（Ｎ－イソブチルカルボキサミド）－２’－フルオロウリジン（２’－Ｆ－ｉＢｕ－Ｕ）、５－（Ｎ－チロシルカルボキサミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、５－（Ｎ－チロシルカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－Ｔｙｒ－Ｕ）、５－（Ｎ－チロシルカルボキサミド）－２’－フルオロウリジン（２’－Ｆ－Ｔｙｒ－Ｕ）、５－（Ｎ－３，４－メチレンジオキシベンジルカルボキサミド）－２’－デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、５－（Ｎ－３，４－メチレンジオキシベンジルカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－ＭＢｎ－Ｕ）、５－（Ｎ－３，４－メチレンジオキシベンジルカルボキサミド）－２’－フルオロウリジン（２’－Ｆ－ＭＢｎ－Ｕ）、５－（Ｎ－４－フルオロベンジルカルボキサミド）－２’－デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、５－（Ｎ－４－フルオロベンジルカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－ＦＢｎ－Ｕ）、５－（Ｎ－４－フルオロベンジルカルボキサミド）－２’－フルオロウリジン（２’－Ｆ－ＦＢｎ－Ｕ）、５－（Ｎ－３－フェニルプロピルカルボキサミド）－２’－デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、５－（Ｎ－３－フェニルプロピルカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－ＰＰ－Ｕ）、５－（Ｎ－３－フェニルプロピルカルボキサミド）－２’－フルオロウリジン（２’－Ｆ－ＰＰ－Ｕ）、５－（Ｎ－イミジゾリルエチルカルボキサミド）－２’－デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、５－（Ｎ－イミジゾリルエチルカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－Ｉｍ－Ｕ）、５－（Ｎ－イミジゾリルエチルカルボキサミド）－２’－フルオロウリジン（２’－Ｆ－Ｉｍ－Ｕ）、５－（Ｎ－トリプタミノカルボキサミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５－（Ｎ－トリプタミノカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－Ｔｒｐ－Ｕ）、５－（Ｎ－トリプタミノカルボキサミド）－２’－フルオロウリジン（２’－Ｆ－Ｔｒｐ－Ｕ）、５－（Ｎ－Ｒ－トレオニニルカルボキサミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、５－（Ｎ－Ｒ－トレオニニルカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－Ｔｈｒ－Ｕ）、５－（Ｎ－Ｒ－トレオニニルカルボキサミド）－２’－フルオロウリジン（２’－Ｆ－Ｔｈｒ－Ｕ）、５－（Ｎ－［１－（３－トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキサミド）－２’－デオキシウリジンクロリド、５－（Ｎ－［１－（３－トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルウリジンクロリド、５－（Ｎ－［１－（３－トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキサミド）－２’－フルオロウリジンクロリド、５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキサミド）－２’－デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－Ｎａｐ－Ｕ）、５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキサミド）－２’－フルオロウリジン（２’－Ｆ－Ｎａｐ－Ｕ）、５－（Ｎ－［１－（２，３－ジヒドロキシプロピル）］カルボキサミド）－２’－デオキシウリジン）、５－（Ｎ－［１－（２，３－ジヒドロキシプロピル）］カルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン）、５－（Ｎ－［１－（２，３－ジヒドロキシプロピル）］カルボキサミド）－２’－フルオロウリジン）、５－（Ｎ－２－ナフチルメチルカルボキサミド）－２’－デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５－（Ｎ－２－ナフチルメチルカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－２Ｎａｐ－Ｕ）、５－（Ｎ－２－ナフチルメチルカルボキサミド）－２’－フルオロウリジン（２’－Ｆ－２Ｎａｐ－Ｕ）、５－（Ｎ－１－ナフチルエチルカルボキサミド）－２’－デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、５－（Ｎ－１－ナフチルエチルカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－ＮＥ－Ｕ）、５－（Ｎ－１－ナフチルエチルカルボキサミド）－２’－フルオロウリジン（２’－Ｆ－ＮＥ－Ｕ）、５－（Ｎ－２－ナフチルエチルカルボキサミド）－２’－デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、５－（Ｎ－２－ナフチルエチルカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－２ＮＥ－Ｕ）、５－（Ｎ－２－ナフチルエチルカルボキサミド）－２’－フルオロウリジン（２’－Ｆ－２ＮＥ－Ｕ）、５－（Ｎ－３－ベンゾフラニルエチルカルボキサミド）－２’－デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、５－（Ｎ－３－ベンゾフラニルエチルカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－ＢＦ－Ｕ）、５－（Ｎ－３－ベンゾフラニルエチルカルボキサミド）－２’－フルオロウリジン（２’－Ｆ－ＢＦ－Ｕ）、５－（Ｎ－３－ベンゾチオフェニルエチルカルボキサミド）－２’－デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５－（Ｎ－３－ベンゾチオフェニルエチルカルボキサミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－ＢＴ－Ｕ）、５－（Ｎ－３－ベンゾチオフェニルエチルカルボキサミド）－２’－フルオロウリジン（２’－Ｆ－ＢＴ－Ｕ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0101】

本明細書で使用される場合、「修飾する」、「修飾された」、「修飾」という用語、及びその任意の変化形は、オリゴヌクレオチドに関して使用される場合、オリゴヌクレオチドの４つの構成ヌクレオチド塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｔ／Ｕ、及びＣ）のうち少なくとも１つが、天然に存在するヌクレオチドの類似体またはエステルであることを意味する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を付与する。追加の修飾としては、骨格修飾、メチル化、稀な塩基対合の組み合わせ、例えば、イソ塩基のイソシチジンとイソグアニジン等を挙げることができる。修飾として、キャッピング等の３’及び５’の修飾も含めることができる。他の修飾としては、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上と類似体との置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等）を用いるもの、荷電結合（例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等）を用いるもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレン等）を用いるもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属等）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、及び修飾結合（例えば、アルファアノマー型核酸等）を用いるもの等を挙げることができる。さらに、通常はヌクレオチドの糖上に存在するヒドロキシル基のいずれかが、ホスホナート基もしくはリン酸基で置き換えられる場合もあれば、標準的な保護基で保護される場合、または追加のヌクレオチドもしくは追加の固体支持体への追加の結合を調製するために活性化される場合もある。５’及び３’末端のＯＨ基は、リン酸化され得るか、またはアミン、約１～約２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分、いくつかの実施形態では約１０～約８０ｋＤａの範囲のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、別の実施形態では約２０～約６０ｋＤａの範囲のＰＥＧポリマー、または他の親水性もしくは疎水性の生体高分子もしくは合成ポリマーで置換され得る。

【0102】

本明細書で使用される場合、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、及び「ポリヌクレオチド」は同じ意味で使用されてヌクレオチドのポリマーを指し、それらには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ならびにこれらの種類の核酸、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの修飾が含まれ、ヌクレオチド単位に対する任意の位置における様々な実体または部分の結合が含まれる。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸」という用語には、二本鎖または一本鎖の分子及び三重らせん分子が含まれる。核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドは、アプタマーという用語より上位の用語であり、したがって、核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドという用語には、アプタマーであるヌクレオチドのポリマーが含まれるが、核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドという用語は、アプタマーに限定されるものではない。

【0103】

ポリヌクレオチドは、一般に当該技術分野で公知のリボース糖またはデオキシリボース糖の類似形態を含有することもでき、それらには、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｏ－エチル、２’－Ｏ－プロピル、２’－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、２’－フルオロ、２’－ＮＨ_２または２’－アジド、炭素環状糖類似体、α－アノマー型糖、エピマー型糖（アラビノース、キシロースまたはリキソース等）、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体及び脱塩基ヌクレオシド類似体（メチルリボシド等）が含まれる。本明細書に記載されるように、１つ以上のホスホジエステル結合を代替的連結基に置き換えてよい。これらの代替的連結基としては、リン酸塩がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオアート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオアート」）、（Ｏ）ＮＲ^Ｘ _２（「アミダート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ^Ｘ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ^Ｘ’、ＣＯまたはＣＨ_２（「ホルムアセタール」）に置き換えられる実施形態が挙げられ、式中、各Ｒ^ＸまたはＲ^Ｘ’は、独立して、Ｈであるか、または置換もしくは非置換の、エーテル（－Ｏ－）結合を任意選択で含有するアルキル（Ｃ１－Ｃ２０）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジルである。ポリヌクレオチド内のすべての結合が同一である必要はない。糖、プリン、及びピリミジンの類似形態の置換は、例えば、ポリアミド骨格のような代替的骨格構造が有利であり得るように、最終生成物を設計する際に有利になり得る。

【0104】

ポリヌクレオチドは、炭素環状糖類似体、α－アノマー型糖、エピマー型糖（アラビノース、キシロースまたはリキソース等）、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体及び脱塩基ヌクレオシド類似体（メチルリボシド等）の類似形態を含有することもできる。

【0105】

存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの会合の前でも後でも付与され得る。ヌクレオチドの配列には、非ヌクレオチド成分を割り込ませることができる。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば、標識成分とのコンジュゲーション等により、さらに修飾することができる。

【0106】

本明細書で使用される場合、核酸の修飾に言及する場合の「少なくとも１つのヌクレオチド」という用語とは、核酸中の１つ、いくつかまたはすべてのヌクレオチドを指し、核酸中のＡ、Ｃ、Ｔ、ＧまたはＵのいずれかもしくはすべての、いずれかまたはすべての出現が、修飾される場合もあれば修飾されない場合もあることを示している。

【0107】

本明細書で使用される場合、「核酸リガンド」、「アプタマー」、「ＳＯＭＡｍｅｒ」、及び「クローン」は同じ意味で使用され、標的分子に対して望ましい作用を有する天然には存在しない核酸を指す。望ましい作用としては、標的の結合、標的を触媒的に変化させること、標的または標的の機能活性を修飾するかもしくは変化させる様式で標的と反応すること、（自殺阻害剤の場合のように）標的に共有結合で結合すること、及び標的と別の分子間の反応を促進することが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、作用は、標的分子に対する特異的結合親和性であり、そのような標的分子は、ワトソン／クリック型塩基対合または三重らせん形成とは無関係な機構を介してアプタマーに結合するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造であり、アプタマーは、標的分子が結合するという既知の生理学的機能を有する核酸ではない。所与の標的に対するアプタマーには、核酸の候補混合物から同定される核酸が含まれ、その場合、アプタマーは標的のリガンドであり、手段とする方法は、（ａ）候補混合物を標的と接触させることであって、候補混合物中の他の核酸と比べて標的に対する親和性が高い核酸を、候補混合物の残部から分配することができる、接触させること、（ｂ）親和性の高い核酸を候補混合物の残部から分配すること、及び（ｃ）リガンドに富む核酸混合物が得られるよう親和性の高い核酸を増幅させることであって、それにより、標的分子のアプタマーが同定される、増幅させること、を含む。親和性相互作用は程度の問題であることが認識されるが、この文脈においては、あるアプタマーの、その標的に対する「特異的結合親和性」とは、アプタマーがその標的に、混合物または試料中の他の非標的成分に結合する場合の親和性の程度よりもはるかに高い程度で結合することを意味する。「アプタマー」、「ＳＯＭＡｍｅｒ」、または「核酸リガンド」は、特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子の１つの種類または種のコピーのセットである。アプタマーには、任意の好適な数のヌクレオチドを含めることができる。「アプタマー」とは、複数のそのような分子セットを指す。異なるアプタマーは、同数のヌクレオチドを有することも、異なる数のヌクレオチドを有することもできる。アプタマーはＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、一本鎖、二本鎖である場合もあれば、二本鎖または三本鎖領域を含有する場合もある。いくつかの実施形態では、アプタマーは、本明細書に記載されるかまたは当該技術分野で公知のＳＥＬＥＸ法を使用して調製される。

【0108】

本明細書で使用される場合、「ＳＯＭＡｍｅｒ」またはＳｌｏｗ Ｏｆｆ－Ｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｐｔａｍｅｒ（低解離速度の修飾アプタマー）とは、解離速度特性が改善されたアプタマーを指す。ＳＯＭＡｍｅｒは、“Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ａｐｔａｍｅｒｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｏｆｆ－Ｒａｔｅｓ”と題された米国特許第７，９４７，４４７号に記載の改良ＳＥＬＥＸ方法を使用して作製され得る。

【0109】

本明細書で使用される場合、２つの異なる種類の５位修飾ピリミジンまたはＣ－５修飾ピリミジンを含むアプタマーは、「二重修飾アプタマー」、「２つの修飾塩基」を有するアプタマー、「２塩基修飾」または「修飾された２塩基」を有するアプタマー、「二修飾塩基」を有するアプタマーと呼ばれる場合があり、それらのいずれも同じ意味で使用され得る。アプタマーのライブラリーまたはアプタマーライブラリーもまた、同じ用語が使用され得る。したがって、いくつかの実施形態では、アプタマーは、２つの異なる５位修飾ピリミジンを含み、それらは、ＢＰＥｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｕ）及びＢＰＥｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｃ）、ＢＰＥｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｕ）及びＰＢｎｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｃ）、ＢＰＥｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｕ）及びＰＯＰｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｃ）、ＢＰＥｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｕ）及びＤＰＰｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｃ）、ＢＰＥｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｕ）及びＤＢＭｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｃ）、ＢＰＥｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｕ）及びＢＨｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｃ）、ＰＢｎｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｕ）及びＢＰＥｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｃ）、ＰＢｎｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｕ）及びＰＢｎｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｃ）、ＰＢｎｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｕ）及びＰＯＰｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｃ）、ＰＢｎｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｕ）及びＤＰＰｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｃ）、ＰＯＰｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｕ）及びＢＰＥｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｃ）、ＰＯＰｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｕ）及びＰＢｎｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｃ）、ＰＯＰｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｕ）及びＰＯＰｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｃ）、ＰＯＰｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｕ）及びＤＰＰｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｃ）、ＤＰＰｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｕ）及びＢＰＥｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｃ）、ＤＰＰｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｕ）及びＰＢｎｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｃ）、ＤＰＰｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｕ）及びＰＯＰｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｃ）、ＤＰＰｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｕ）及びＤＰＰｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｃ）、ＤＢＭｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｕ）及びＢＰＥｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｃ）、ＤＢＭｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｕ）及びＰＢｎｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｃ）、ＤＢＭｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｕ）及びＰＯＰｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｃ）、ＤＢＭｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｕ）及びＤＰＰｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｃ）、ＤＢＭｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｕ）及びＤＢＭｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｃ）、ＤＢＭｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｕ）及びＢＨｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｃ）、ＢＨｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｕ）及びＢＰＥｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｃ）、ＢＨｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｕ）及びＰＢｎｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｃ）、ＢＨｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｕ）及びＰＯＰｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｃ）、ＢＨｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｕ）及びＤＰＰｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｃ）、ＢＨｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｕ）及びＤＢＭｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｃ）、ＢＨｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｕ）及びＢＨｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｃ）から選択される。いくつかの実施形態では、アプタマーは、２つの異なる５位修飾ピリミジンを含み、第１の５位修飾ピリミジンは、ＢＰＥｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｕ）、ＰＢｎｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｕ）、ＰＯＰｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｕ）、ＤＰＰｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｕ）、ＢＰＥｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｃ）、ＰＢｎｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｃ）、ＰＯＰｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｃ）、ＤＰＰｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｃ）から選択され、第２の５位修飾ピリミジンは異なる５位修飾ピリミジンであり、これは、ＮａｐｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－Ｎａｐ－Ｃ）、ＮａｐｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－Ｎａｐ－Ｕ）、ＰＰｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＰ－Ｕ）、ＭＯＥｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＭＯＥ－Ｕ）、ＴｙｒｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－Ｔｙｒ－Ｕ）、ＴｈｒｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－Ｔｈｒ－Ｕ）、ＰＰｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－ＰＰ－Ｃ）、２ＮａｐｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－２Ｎａｐ－Ｕ）、ＴｒｐｄＵ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－Ｔｒｐ－Ｕ）、２ＮａｐｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－２Ｎａｐ－Ｃ）、ＴｙｒｄＣ（またはその２’－修飾型、例えば、２’－ＯＭｅ－Ｔｙｒ－Ｃ）から選択される。いくつかの実施形態では、アプタマーは、少なくとも１つの第１の修飾ウリジン及び／またはチミジン、または少なくとも１つの第１の修飾シチジンを含み、少なくとも１つの第１の修飾ウリジン及び／またはチミジン、または少なくとも１つの第１の修飾シチジンは、５位において、互いに共有結合で結合している２つのフェニル基を含む部分で修飾されている。いくつかの実施形態では、アプタマーは、少なくとも１つの第２の修飾ウリジン及び／またはチミジン、及び少なくとも１つの第２の修飾シチジンを含み、少なくとも１つの第２の修飾ウリジン及び／またはチミジンは、５位において、ナフチル部分、ベンジル部分、フルオロベンジル部分、チロシル部分、インドール部分、モルホリノ部分、イソブチル部分、３，４－メチレンジオキシベンジル部分、ベンゾチオフェニル部分、及びベンゾフラニル部分から選択される部分で修飾されており、少なくとも１つの第２の修飾シチジンは、５位において、ナフチル部分、チロシル部分、及びベンジル部分から選択される部分で修飾されている。ある特定の実施形態では、部分は、アミドリンカー、カルボニルリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバマートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される基を含むリンカーを介して塩基の５位に共有結合で連結されている。

【0110】

本明細書で使用される場合、単一の種類の５位修飾ピリミジンまたはＣ－５修飾ピリミジンを含むアプタマーは、「単一修飾アプタマー」、「単一修飾塩基」を有するアプタマー、「単一塩基修飾」または「単一塩基の修飾」を有するアプタマーと呼ばれる場合があり、それらのいずれも同じ意味で使用され得る。アプタマーのライブラリーまたはアプタマーライブラリーもまた、同じ用語が使用され得る。本明細書で使用される場合、「タンパク質」は、「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「ペプチド断片」と同義で使用される。「精製された」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、またはペプチド断片は、アミノ酸配列を取得する元となる細胞、組織、もしくは無細胞材料からの細胞物質もしくは他の汚染タンパク質を実質的に含まないか、または化学合成される場合は化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。

【0111】

ある特定の実施形態では、アプタマーのウラシルの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が５位において修飾されている。ある特定の実施形態では、アプタマーのシトシンの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が５位において修飾されている。

【0112】

修飾ヌクレオチド
ある特定の実施形態では、本開示は、５位修飾ピリミジンを含む、アプタマー等のオリゴヌクレオチドを提供する。

【0113】

いくつかの実施形態では、本開示は、５位修飾ピリミジンヌクレオシドを含む化合物、またはそれらの塩を提供し、５位修飾ピリミジンが、第１のリンカーによって互いに共有結合で結合している２つのフェニル基を含む部分で置換されており、かかる部分が、第２のリンカーによってピリミジンの５位に共有結合で連結されている。

【0114】

いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、炭素及び酸素から選択される少なくとも１個の原子を含むかまたは結合である。

【0115】

いくつかの実施形態では、５位修飾ピリミジンは、フェニルベンジル部分、フェノキシベンジル部分、及びジフェニルメチル部分から選択される部分を５位に含む。

【0116】

いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバマートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される基を含む。いくつかの実施形態では、第２のリンカーはアミドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、アミドリンカーはさらに、１個以上の炭素原子または１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個の炭素原子を含む。

【0117】

いくつかの実施形態では、化合物は５位修飾ウリジンを含む。

【0118】

いくつかの実施形態では、化合物は５位修飾シチジンを含む。

【0119】

いくつかの実施形態では、本開示は、式ＩＡまたは式ＩＢ：

【化11】

の構造、またはこれらのうちのいずれかの塩、を含むオリゴヌクレオチドを提供する。

【0120】

いくつかの実施形態では、各Ｌは、独立して－（ＣＨ_２）_ｎ－であり、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。

【0121】

いくつかの実施形態では、各Ｒ_１は、独立して、

【化12】

からなる群から選択され、式中、＊は、Ｌ基へのＲ_１基の結合点を示す。

【0122】

いくつかの実施形態では、各Ｘは、独立して、－Ｈ、－ＯＨ、－ＯＭｅ、－Ｏ－アリル、－Ｏ－エチル、－Ｏ－プロピル、－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、－フルオロ、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルオキシ、－ＮＨ_２、及び－アジドからなる群から選択される。

【0123】

いくつかの実施形態では、各Ｒ_２は、独立して、－ＯＨ；－アセチル；－ＯＢｚ；－ＯＰ（Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２）（ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ）、－ＯＰ（Ｎ（Ｒ_ｘ）_２）（ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ）［式中、各Ｒ_ｘは、独立して（Ｃ_１－６）アルキルである］；ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルオキシ；－Ｏ－ｓｓ；－ＯＲ；－ＳＲ；－ＺＰ（Ｚ’）（Ｚ’’）－Ｏ－Ｒ［式中、ｓｓは固体支持体であり、Ｚ、Ｚ’、及びＺ’’はそれぞれ独立してＯ及びＳから選択され、Ｒは隣接ヌクレオチドである］からなる群から選択される。

【0124】

いくつかの実施形態では、各Ｒ_３は、独立して－ＯＨ、－Ｏ－トリチル、－Ｏ－４，４’－ジメトキシトリチル、－Ｏ－三リン酸、－ＯＲ、－ＳＲ、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ、及び－Ｚ－Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ－Ｒ、［式中、Ｚ、Ｚ’、及びＺ’’はそれぞれ独立してＯ及びＳから選択され、Ｒは隣接ヌクレオチドである］からなる群から選択される。

【0125】

いくつかの実施形態では、ｎは、１、２、または３である。

【0126】

いくつかの実施形態では、Ｘは－Ｈまたは－ＯＭｅである。

【0127】

いくつかの実施形態では、各Ｒ_１は、独立して、

【化13】

からなる群から選択される。

【0128】

いくつかの実施形態では、５位修飾ピリミジンは、ＢＰＥｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｕ、２’－Ｆ－ＢＰＥ－Ｕ、ＰＢｎｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｕ、２’－Ｆ－ＰＢｎ－Ｕ、ＰＯＰｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｕ、２’－Ｆ－ＰＯＰ－Ｕ、ＤＰＰｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｕ、２’－Ｆ－ＤＰＰ－Ｕ、ＤＢＭｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｕ、２’－Ｆ－ＤＢＭ－Ｕ、ＢＨｄＵ、２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｕ、２’－Ｆ－ＢＨ－Ｕ、ＢＰＥｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＢＰＥ－Ｃ、２’－Ｆ－ＢＰＥ－Ｃ、ＰＢｎｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＢｎ－Ｃ、２’－Ｆ－ＰＢｎ－Ｃ、ＰＯＰｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＰＯＰ－Ｃ、２’－Ｆ－ＰＯＰ－Ｃ、ＤＰＰｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＤＰＰ－Ｃ、２’－Ｆ－ＤＰＰ－Ｃ、ＤＢＭｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＤＢＭ－Ｃ、２’－Ｆ－ＤＢＭ－Ｃ、ＢＨｄＣ、２’－ＯＭｅ－ＢＨ－Ｃ、及び２’－Ｆ－ＢＨ－Ｃから選択される。

【0129】

いくつかの実施形態では、本開示は、式ＩＩＡまたは式ＩＩＢ：

【化14】

の構造、またはこれらのうちのいずれかの塩、を含む化合物を提供する。

【0130】

いくつかの実施形態では、各Ｌは、独立して－（ＣＨ_２）_ｎ－であり、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。
いくつかの実施形態では、各Ｒ_１は、独立して、

【化15】

からなる群から選択され、式中、＊は、Ｌ基へのＲ_１基の結合点を示す。

【0131】

いくつかの実施形態では、各Ｘは、独立して、－Ｈ、－ＯＨ、－ＯＭｅ、－Ｏ－アリル、－Ｏ－エチル、－Ｏ－プロピル、－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、－フルオロ、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルオキシ、－ＮＨ_２、及び－アジドからなる群から選択される。

【0132】

いくつかの実施形態では、ｎは、１、２、または３である。

【0133】

いくつかの実施形態では、Ｘは－Ｈまたは－ＯＭｅである。

【0134】

いくつかの実施形態では、各Ｒ_１は、独立して、

【化16】

からなる群から選択される。

【0135】

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、図３または図４に示すような少なくとも１つの修飾ピリミジンを含み、式中、各Ｘは、独立して、－Ｈ、－ＯＨ、－ＯＭｅ、－Ｏ－アリル、－Ｆ、－ＯＥｔ、－ＯＰｒ、－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、ＮＨ_２及び－アジドから選択される。

【0136】

いくつかの実施形態では、本開示は、

【化17-1】

【化17-2】

またはこれらのうちのいずれか１つの塩から選択される化合物を提供する。

【0137】

いくつかの実施形態では、各Ｘは、独立して－Ｈ、－ＯＨ、－Ｏ－メチル、－Ｏ－アリル、－Ｏ－エチル、－Ｏ－プロピル、－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、－フルオロ、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルオキシ、－ＮＨ_２、及び－アジドからなる群から選択される。

【0138】

いくつかの実施形態では、Ｘは－Ｈまたは－ＯＭｅである。

【0139】

いくつかの実施形態では、式ＩＩＩ、式ＩＶ、または式Ｖ：

【化18】

の構造、またはこれらのうちのいずれか１つの塩、を含む化合物が提供される。

【0140】

いくつかの実施形態では、各Ｌは、独立して－（ＣＨ_２）_ｎ－であり、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。

【0141】

いくつかの実施形態では、各Ｒ_１は、独立して、

【化19】

からなる群から選択され、式中、＊は、Ｌ基へのＲ_１基の結合点を示す。

【0142】

いくつかの実施形態では、各Ｘは、独立して、－Ｈ、－ＯＨ、－ＯＭｅ、－Ｏ－アリル、－Ｏ－エチル、－Ｏ－プロピル、－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、－フルオロ、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルオキシ、－ＮＨ_２、及び－アジドからなる群から選択される。

【0143】

いくつかの実施形態では、ｎは、１、２、または３である。

【0144】

いくつかの実施形態では、Ｘは－Ｈまたは－ＯＭｅである。

【0145】

いくつかの実施形態では、各Ｒ_１は、独立して、

【化20】

からなる群から選択される。

【0146】

本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、オリゴヌクレオチドはアプタマーであり得る。そのようないくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的ポリペプチドと特異的に結合するアプタマーである。

【0147】

オリゴヌクレオチドの調製
オリゴデオキシヌクレオシドの自動合成は、多くの研究機関で日常的に実施されている（例えば、その内容が、参照により全体が本明細書により組み込まれるＭａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，（１９９０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３：３１８５－３１９１を参照のこと）。オリゴリボヌクレオシドの合成もまた周知である（例えば、その内容が、参照により全体が本明細書により組み込まれるＳｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：５４３３－５４４１を参照のこと）。本明細書に記載されるように、ホスホロアミダイトは、化学合成によるオリゴヌクレオチドへの修飾ヌクレオシドの組み込みに有用であり、三リン酸は、酵素的合成によるオリゴヌクレオチドへの修飾ヌクレオシドの組み込みに有用である。（例えば、各々が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＶａｕｇｈｔ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２６：１１２３１－１１２３７、Ｖａｕｇｈｔ，Ｊ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３２，４１４１－４１５１、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”（１９８４）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（２００５）（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．）を参照のこと）。

【0148】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される化合物は、市販の合成装置を使用する自動化法を含め、標準的ホスホロアミダイトオリゴヌクレオチド合成法で使用され得る。

【0149】

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド合成における本明細書で提供される化合物の使用により、所望のオリゴヌクレオチド生成物の収率が改善する。

【0150】

ＳＥＬＥＸ方法
「ＳＥＬＥＸ」及び「ＳＥＬＥＸ法」という用語は本明細書では同じ意味で使用され、一般に、（１）望ましい様態で標的分子と相互作用する、例えば、タンパク質に高い親和性で結合する核酸の選択と、（２）それらの選択された核酸の増幅と、の組み合わせを指す。ＳＥＬＥＸ法は、特定の標的分子またはバイオマーカーに対する親和性が高いアプタマーを同定するために使用され得る。

【0151】

ＳＥＬＥＸには一般に、核酸の候補混合物を調製すること、所望の標的分子に候補混合物を結合させて親和性複合体を形成させること、親和性複合体を未結合候補核酸から分離すること、核酸を親和性複合体から分離及び単離すること、核酸を精製すること、及び特異的アプタマー配列を同定すること、が含まれる。この方法には、選択されたアプタマーの親和性をさらに高めるために複数のラウンドが含まれ得る。方法には、その工程の１つ以上のポイントにおいて増幅ステップを含めることができる。例えば、“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ”と題された米国特許第５，４７５，０９６号を参照のこと。ＳＥＬＥＸ法は、自身の標的に共有結合で結合するアプタマー及び自身の標的に非共有結合で結合するアプタマーを作製するために使用され得る。例えば、米国特許第５，７０５，３３７号と題された“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｃｈｅｍｉ－ＳＥＬＥＸ”を参照のこと。

【0152】

ＳＥＬＥＸ法は、例えば、改善されたインビボ安定性または改善された送達特性等の改善された特性をアプタマーに付与する修飾ヌクレオチドを含有する高親和性アプタマーを同定するために使用され得る。そのような修飾の例には、リボース及び／またはリン酸塩及び／または塩基の位置での化学的置換が含まれる。ＳＥＬＥＸ法で同定された、修飾ヌクレオチドを含有するアプタマーは、“Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”と題された米国特許第５，６６０，９８５号に記載されており、それには、ピリミジンの５’位及び２’位にて化学的に修飾されているヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。米国特許第５，５８０，７３７号には、２’－アミノ（２’－ＮＨ_２）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、及び／または２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）で修飾された１つ以上のヌクレオチドを含有する、高度に特異的なアプタマーが記載されている。物理的特性及び化学的特性が拡張された核酸ライブラリー、ならびにＳＥＬＥＸ及びフォトＳＥＬＥＸにおけるそれらの使用を記載している“ＳＥＬＥＸ ａｎｄ ＰＨＯＴＯＳＥＬＥＸ”と題された米国特許出願公開第２００９００９８５４９号も参照のこと。

【0153】

ＳＥＬＥＸはまた、望ましい解離速度特性を有するアプタマーを同定するためにも使用され得る。標的分子に結合することができるアプタマーを作製するための改良ＳＥＬＥＸ方法が記載された、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる“Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ａｐｔａｍｅｒｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｏｆｆ－Ｒａｔｅｓ”と題された米国特許第７，９４７，４４７号を参照のこと。各自の標的分子からの解離がより遅いアプタマー及びフォトアプタマーを生産するための方法が記載されている。この方法は、候補混合物を標的分子と接触させること、核酸－標的複合体の形成を生じさせること、及び低解離速度濃縮工程を実施することであって、工程において解離速度が速い核酸－標的複合体は解離して再形成しないが、解離速度が遅い複合体は完全な状態で残る、実施すること、を伴う。さらに、方法には、解離速度性能が改善されたアプタマーを作製するための、候補核酸混合物の生産における修飾ヌクレオチドの使用が含まれる（“ＳＥＬＥＸ ａｎｄ ＰｈｏｔｏＳＥＬＥＸ”と題された米国特許第８，４０９，７９５号を参照のこと）。（米国特許第７，８５５，０５４号及び米国特許公開第２００７０１６６７４０号も参照のこと）。これらの出願の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0154】

「標的」または「標的分子」または「標的」とは、本明細書では、核酸が、それに対して望ましい様態で作用することができる任意の化合物を指す。標的分子は、非限定的に、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、病原体、有害物質、基質、代謝物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬物、色素、栄養素、増殖因子、細胞、組織、前述のうちのいずれかの任意の部分または断片等であり得る。事実上、いかなる化学的または生物学的エフェクターも好適な標的であり得る。どの大きさの分子でも標的となり得る。標的はまた、標的と核酸の間の相互作用の可能性または強度を高めるために、特定の方法で修飾され得る。標的にはまた、特定の化合物または分子の任意の軽微な変形、例えば、タンパク質の場合は、例えば、アミノ酸配列の軽微な変形、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または他の任意の操作もしくは修飾、例えば、その分子の同一性を実質的に変化させることのない、標識成分とのコンジュゲーションも含まれ得る。「標的分子」または「標的」は、アプタマーに対する結合能のある分子または多分子構造の、１つの種類または種のコピーセットである。「標的分子」または「標的」とは、複数のそのような分子セットを指す。標的がペプチドであるＳＥＬＥＸ法の実施形態は、“Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＳＥＬＥＸ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ”と題された米国特許第６，３７６，１９０号に記載されている。いくつかの実施形態では、標的はタンパク質である。

【0155】

本明細書で使用される場合、「競合分子」及び「競合物質」は同じ意味で使用され、非標的分子と非特異的複合体を形成することができる任意の分子を指す。これに関連して、非標的分子には遊離アプタマーが含まれ、その場合、例えば、競合物質は、アプタマーが別の非標的分子に非特異的に結合（再結合）するのを阻害するために使用され得る。「競合分子」または「競合物質」は、分子の１つの種類または種のコピーセットである。「競合分子」または「競合物質」とは、複数のそのような分子セットを指す。競合分子としては、オリゴヌクレオチド、ポリアニオン（例えば、ヘパリン、ニシン精子ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、デキストラン硫酸、ポリデキストラン、脱塩基ホスホジエステルポリマー、ｄＮＴＰ、及びピロリン酸塩）が挙げられるが、これらに限定されない。様々な実施形態において、１つ以上の競合物質の組み合わせを使用することができる。

【0156】

本明細書で使用される場合、「非特異的複合体」とは、アプタマー以外の２つ以上の分子とアプタマーの標的分子との非共有結合での会合を指す。非特異的複合体は、分子クラス間の相互作用を表す。非特異的複合体には、アプタマーと非標的分子の間、競合物質と非標的分子の間、競合物質と標的分子の間、及び標的分子と非標的分子の間で形成される複合体が含まれる。

【0157】

本明細書で使用される場合、用語「低解離速度濃縮工程」とは、解離速度がより速く、かつ望ましくないアプタマー親和性複合体の濃度と比べて、解離速度の遅いアプタマー親和性複合体の相対濃度が高くなるよう、候補混合物のある特定の構成成分の相対濃度を変化させる工程を指す。いくつかの実施形態では、低解離速度濃縮工程は、溶液を用いる低解離速度濃縮工程である。したがって、溶液を用いる低解離速度濃縮工程は溶液中で行われ、低解離速度濃縮工程の際、標的も、混合物中でアプタマー親和性複合体を形成する核酸も、固体支持体上には固定化されない。様々な実施形態では、低解離速度（ｓｌｏｗ－ｏｆｆ ｒａｔｅ）濃縮工程には、競合分子の添加及びそれとのインキュベーション、混合物の希釈、またはこれらの組み合わせ（例えば、競合分子存在下での混合物の希釈）等の、１つ以上のステップを含めることができる。低解離速度濃縮工程の効果は一般に、異なるアプタマー親和性複合体（すなわち、標的分子と候補混合物中の異なる核酸との間で形成されるアプタマー親和性複合体）の解離速度が異なることに依存するため、低解離速度濃縮工程の持続時間は、解離速度の速いアプタマー親和性複合体の数を実質的に減少させながら、解離速度の遅いアプタマー親和性複合体が高い割合で保持されるよう選択される。低解離速度濃縮工程は、ＳＥＬＥＸ法の間に１回以上のサイクルで使用され得る。競合物質の希釈及び添加を組み合わせて使用する場合、それらを同時に実施しても、または任意の順序で連続して実施してもよい。混合物中の総標的（タンパク質）濃度が低い場合に低解離速度（ｓｌｏｗ－ｏｆｆ ｒａｔｅ）濃縮工程を使用することができる。いくつかの実施形態では、低解離速度濃縮工程に希釈が含まれる場合、アプタマー保持核酸がＳＥＬＥＸ法の後続ラウンド用に回収されることを念頭に置いて、混合物を実用的な程度に希釈することができる。いくつかの実施形態では、低解離速度濃縮工程には、競合物質及び希釈の使用が含まれ、混合物を、競合物質の使用がない場合に必要であり得るよりも少なく希釈することを可能にする。

【0158】

いくつかの実施形態では、低解離速度濃縮工程には、競合物質の添加が含まれ、かかる競合物質は、ポリアニオン（例えば、ヘパリンまたはデキストラン硫酸（デキストラン））である。ヘパリンまたはデキストランは、従来のＳＥＬＥＸ選択において特定のアプタマーの同定に使用されている。ただし、そのような方法では、標的とアプタマーが結合して複合体を形成する平衡化ステップの際にヘパリンまたはデキストランが存在する。そのような方法では、ヘパリンまたはデキストランの濃度が高くなるにつれ、高親和性標的／アプタマー複合体と低親和性標的／アプタマー複合体の比が高くなる。しかしながら、高濃度のヘパリンまたはデキストランは、核酸と競合物質との間で標的結合について競合するため、平衡時の高親和性標的／アプタマー複合体の数が減少し得る。対照的に、いくつかの実施形態では、本方法は、標的／アプタマー複合体を形成させた後で競合物質を添加するため、形成される複合体の数に影響を与えることはない。標的とアプタマーの間で平衡結合が起こった後での競合物質の添加により非平衡状態が生じ、これは、少ない標的／アプタマー複合体を含む新たな平衡へと経時的に進行する。新たな平衡に達する前に標的／アプタマー複合体を捕捉することで、解離速度の速い複合体は最初に解離するので解離速度の遅いアプタマーが試料に濃縮される。

【0159】

他の実施形態では、ポリアニオンの存在に難分解性であるアプタマーの同定を容易にするために、ポリアニオン性競合物質（例えば、デキストラン硫酸または別のポリアニオン性材料）が低解離速度濃縮工程で使用される。これに関連して、「ポリアニオン性難分解性アプタマー」は、非ポリアニオン性難分解性アプタマーが含まれるアプタマー／標的複合体よりも、ポリアニオン性難分解性材料も含有する溶液中で解離する可能性が低いアプタマー／標的複合体の形成能があるアプタマーである。このような方法で、試料中の標的の存在または量または濃度を検出するための分析方法の実施にポリアニオン性難分解性アプタマーを使用することができ、その場合、検出方法には、アプタマーが難分解性を示すポリアニオン性材料（例えば、デキストラン硫酸）の使用が含まれている。

【0160】

したがって、いくつかの実施形態では、ポリアニオン性難分解性アプタマーを生産する方法が提供される。核酸の候補混合物を標的と接触させた後、標的と候補混合物中の核酸を平衡状態にさせる。ポリアニオン性競合物質が導入され、候補混合物中の解離速度の速いアプタマーの大部分が確実に標的分子から解離するのに十分な期間、溶液中でインキュベートされる。また、ポリアニオン性競合物質の存在下で解離し得る候補混合物中のアプタマーは、標的分子から遊離する。混合物を分配し、標的分子と会合したままの高親和性の低解離速度アプタマーを単離し、複合体未形成材料をすべて溶液から除去する。その後、アプタマーを標的分子から遊離させ、単離することができる。単離されたアプタマーを増幅させ、追加の選択ラウンドを適用して選択されたアプタマーの全体的性能を高めることもできる。特定の用途に低解離速度アプタマーの選択が必要でなければ、この工程が最小限のインキュベーション時間で使用される場合もある。

【0161】

したがって、いくつかの実施形態では、解離速度が遅い（長い）アプタマーの同定または生産のための改変ＳＥＬＥＸ法であって、標的分子と候補混合物を接触させ、標的分子と候補混合物に含有される核酸との間で平衡結合が生じるのに十分な期間一緒にインキュベートする改変ＳＥＬＥＸ法が提供される。平衡結合に続いて、過剰の競合分子、例えば、ポリアニオン競合物質を混合物に加え、その混合物を、過剰の競合分子と一緒に所定の時間インキュベートする。解離速度がこの所定のインキュベーション期間より短いかなりの割合のアプタマーは、所定のインキュベーション期間中に標的から解離する。これらの解離速度が「速い」アプタマーと標的との再会合は、標的に非特異的に結合して、標的の結合部位を占有することができる過剰の競合分子のために最小限に抑えられる。解離速度がより長いかなりの割合のアプタマーは、所定のインキュベーション期間中、標的と複合体を形成したまま残る。インキュベーション期間終了時、核酸－標的複合体を混合物の残部から分配することにより、解離速度が速いアプタマーの集団からの低解離速度アプタマーの集団の分離が可能になる。解離ステップは、低解離速度アプタマーをそれらの標的から解離させるために使用することができ、標的分子に対する親和性及び特異性の高い低解離速度アプタマー（個々のアプタマーまたは一群の低解離速度アプタマー）の単離、同定、シークエンシング、合成及び増幅を可能にする。従来のＳＥＬＥＸの場合と同様に、改変ＳＥＬＥＸ法の１ラウンドから同定されたアプタマー配列を、新たな候補混合物の合成に使用することができ、接触、平衡結合、競合分子の添加、競合分子とのインキュベーション及び低解離速度アプタマーの分配のステップを、必要に応じて何回でも反復する／繰り返すことができる。

【0162】

競合物質の添加前に候補混合物と標的とを平衡結合させ、その後、過剰の競合物質を添加することと、競合物質との所定の期間のインキュベーションとの組み合わせにより、解離速度が以前に達成されたものよりはるかに高いアプタマー集団の選択を可能にする。

【0163】

平衡結合を達成するために、候補混合物は、標的と少なくとも約５分間、または少なくとも約１５分間、約３０分間、約４５分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間もしくは約６時間インキュベートされ得る。

【0164】

候補混合物と標的分子の混合物との競合分子の所定のインキュベーション期間は、標的の性質及びその標的に対する既知のアプタマーの既知の解離速度（得られる場合）等の要因を考慮して、必要に応じて選択され得る。所定のインキュベーション期間は、少なくとも約５分、少なくとも約１０分、少なくとも約２０分、少なくとも約３０分、少なくとも４５約分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間から選択され得る。

【0165】

他の実施形態では、解離速度増強工程として希釈が使用され、希釈された候補混合物、標的分子／アプタマー複合体のインキュベーションが、少なくとも約５分、少なくとも約１０分、少なくとも約２０分、少なくとも約３０分、少なくとも約４５分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間から選択され得る所定の時間行われ得る。

【0166】

本開示のいくつかの実施形態は、低解離速度アプタマーの同定、生産、合成及び使用に関する。これらは、非共有結合アプタマー－標的複合体の解離（ｔ_１／２）が、従来のＳＥＬＥＸにより通常取得されるアプタマーのそれよりも高いアプタマーである。アプタマーと標的の非共有結合複合体を含有する混合物の場合、ｔ_１／２は、アプタマー－標的複合体からアプタマーの半分が解離するのに要する時間を表す。本開示による低解離速度アプタマーのｔ_１／２は、約３０分以上、約３０分～約２４０分、約３０分～約６０分、約６０分～約９０分、約９０分～約１２０分、約１２０分～約１５０分、約１５０分～約１８０分、約１８０分～約２１０分、約２１０分～約２４０分のうちの１つから選択される。

【0167】

ＳＥＬＥＸ手法により同定されるアプタマーの特徴的な特性は、自身の標的に対するその高い親和性である。アプタマーは、その標的に対して、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約１００ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約１ｐＭ未満のうちの１つから選択される解離定数（ｋ_ｄ）を有する。

【0168】

オリゴヌクレオチドのライブラリー
いくつかの実施形態では、ランダム配列を含むオリゴヌクレオチドのライブラリーが提供される。そのようなライブラリーは、実施形態によっては、ＳＥＬＥＸを実施するために有用であり得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのライブラリーの各オリゴヌクレオチドは、多数のランダム化位置、例えば、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０、または２０～１００、２０～８０、２０～７０、２０～６０、２０～５０、２０～４０、もしくは３０～４０のランダム化位置を構成する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのライブラリーの各オリゴヌクレオチドは、ランダム化位置に隣接（ｆｌａｎｋｉｎｇ）する固定配列を構成する。そのような固定フランキング配列は、互いに同じであっても異なっていてもよく（すなわち、５’フランキング配列と３’フランキング配列が同じであっても異なっていてもよい）、実施形態によっては、ライブラリーのすべてのメンバーについて同じであってよい（すなわち、ライブラリーのすべてのメンバーが同じ５’フランキング配列を有してよく、及び／またはライブラリーのすべてのメンバーが同じ３’フランキング配列を有してよい）。

【0169】

いくつかの実施形態では、ランダム化位置は、４つ以上の異なるヌクレオチド塩基で構成されて、そのうちの１つ以上が修飾されている場合がある。いくつかの実施形態では、１種類のヌクレオチド塩基のすべてが修飾されているかまたは未修飾である（例えば、ランダム化領域内のすべてのシチジンが修飾されている、またはすべてが未修飾である）。いくつかの実施形態では、ランダム化領域内の１種類のヌクレオチド塩基は、修飾形態及び未修飾形態の両方で存在する。そのようないくつかの実施形態では、ランダム化位置は、２つの修飾ヌクレオチド塩基及び２つの未修飾ヌクレオチド塩基で構成される。そのようないくつかの実施形態では、ランダム化位置は、アデニン、グアニン、Ｃ５修飾シチジン、及びＣ５修飾ウリジンで構成される。非限定的な例示的Ｃ５修飾シチジン及びＣ５修飾ウリジンを図２～図６に示す。オリゴヌクレオチドのライブラリー及びそれらを作製する方法は、例えば、本明細書の実施例に詳述されている。

【0170】

例示的アプタマー
いくつかの実施形態では、標的分子と結合するアプタマーが提供される。いくつかの実施形態では、標的分子は標的タンパク質である。

【0171】

いくつかの実施形態では、ＩＬ－３３と結合するアプタマーが提供される。

【0172】

いくつかの実施形態では、ＩＬ－３３と結合するアプタマーは、１５～１００、または１５～９０、または１５～８０、または１５～７０、または１５～６０、または１５～５０、２０～１００、または２０～９０、または２０～８０、または２０～７０、または２０～６０、または２０～５０、または３０～１００、または３０～９０、または３０～８０、または３０～７０、または３０～６０、または３０～５０、または４０～１００、または４０～９０、または４０～８０、または４０～７０、または４０～６０、または４０～５０ヌクレオチド長である。

【0173】

いくつかの実施形態では、ＸＩＡＰと結合するアプタマーが提供される。

【0174】

いくつかの実施形態では、ＸＩＡＰと結合するアプタマーは、１５～１００、または１５～９０、または１５～８０、または１５～７０、または１５～６０、または１５～５０、２０～１００、または２０～９０、または２０～８０、または２０～７０、または２０～６０、または２０～５０、または３０～１００、または３０～９０、または３０～８０、または３０～７０、または３０～６０、または３０～５０、または４０～１００、または４０～９０、または４０～８０、または４０～７０、または４０～６０、または４０～５０ヌクレオチド長である。

【0175】

いくつかの実施形態では、Ｋ－Ｒａｓと結合するアプタマーが提供される。

【0176】

いくつかの実施形態では、Ｋ－Ｒａｓと結合するアプタマーは、１５～１００、または１５～９０、または１５～８０、または１５～７０、または１５～６０、または１５～５０、２０～１００、または２０～９０、または２０～８０、または２０～７０、または２０～６０、または２０～５０、または３０～１００、または３０～９０、または３０～８０、または３０～７０、または３０～６０、または３０～５０、または４０～１００、または４０～９０、または４０～８０、または４０～７０、または４０～６０、または４０～５０ヌクレオチド長である。

【0177】

いくつかの実施形態では、ＴＮＦ－αと結合するアプタマーが提供される。

【0178】

いくつかの実施形態では、ＴＮＦ－αと結合するアプタマーは、１５～１００、または１５～９０、または１５～８０、または１５～７０、または１５～６０、または１５～５０、２０～１００、または２０～９０、または２０～８０、または２０～７０、または２０～６０、または２０～５０、または３０～１００、または３０～９０、または３０～８０、または３０～７０、または３０～６０、または３０～５０、または４０～１００、または４０～９０、または４０～８０、または４０～７０、または４０～６０、または４０～５０ヌクレオチド長である。

【0179】

いくつかの実施形態では、標的分子（例えば、ＩＬ－３３、ＸＩＡＰ、Ｋ－Ｒａｓ、ＴＮＦ－αのうちのいずれか）と結合するアプタマーは、アプタマーの５’末端に、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０ヌクレオチド長であるか、または５～３０、１０～３０、１５～３０、５～２０、もしくは１０～２０ヌクレオチド長である領域を含み、アプタマーの５’末端の領域は、５位修飾ピリミジンを欠く。

【0180】

いくつかの実施形態では、標的分子（例えば、ＩＬ－３３、ＸＩＡＰ、Ｋ－Ｒａｓ、ＴＮＦ－αのうちのいずれか）と結合するアプタマーは、アプタマーの３’末端に、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０ヌクレオチド長であるか、または５～３０、１０～３０、１５～３０、５～２０、もしくは１０～２０ヌクレオチド長である領域を含み、アプタマーの３’末端の領域は、５位修飾ピリミジンを欠く。

【0181】

いくつかの実施形態では、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）または関節リウマチを治療または予防する方法が提供され、それを必要とする対象に、本明細書で提供されるアプタマーを投与することを含む。

【0182】

塩
化合物の対応する塩、例えば、薬学的に許容される塩を調製する、精製する、及び／または取り扱うことが好都合もしくは望ましい場合がある。薬学的に許容される塩の例は、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９７７）“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ Ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ Ｓａｌｔｓ”Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１－１９で考察されている。

【0183】

例えば、化合物が、アニオン性であるかまたはアニオン性であり得る官能基（例えば、－ＣＯＯＨは－ＣＯＯ^－であり得る）を有する場合は、好適なカチオンを用いて塩が形成され得る。好適な無機カチオンの例としては、Ｎａ^＋及びＫ^＋等のアルカリ金属イオン、Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋等のアルカリ土類カチオン、及びＡｌ^＋３等の他のカチオンが挙げられるが、これらに限定されない。好適な有機カチオンの例としては、アンモニウムイオン（すなわち、ＮＨ_４ ^＋）及び置換アンモニウムイオン（例えば、ＮＨ_３Ｒ^Ｘ＋、ＮＨ_２Ｒ^Ｘ _２ ^＋、ＮＨＲ^Ｘ _３ ^＋、ＮＲ^Ｘ _４ ^＋）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの好適な置換アンモニウムイオンの例は、以下に由来するものである：エチルアミン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、及びトロメタミン、ならびにリジン及びアルギニン等のアミノ酸。一般的な第四級アンモニウムイオンの例は、Ｎ（ＣＨ_３）_４ ^＋である。

【0184】

化合物が、カチオン性であるかまたはカチオン性であり得る官能基（例えば、－ＮＨ_２は－ＮＨ_３ ^＋であり得る）を有する場合は、好適なアニオンを用いて塩が形成され得る。好適な無機アニオンの例としては、無機酸、すなわち、塩酸、臭化水素、ヨウ化水素酸、硫黄、亜硫酸、硝酸、亜硝酸、リン、及び亜リン酸に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0185】

好適な有機アニオンの例としては、有機酸、すなわち、２－アセトキシ安息香酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、ケイ皮酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフタレンカルボン酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、粘液酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモン酸、パントテン酸、フェニル酢酸、フェニルスルホン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、トルエンスルホン酸、及び吉草酸に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。好適なポリマー有機アニオンの例としては、ポリマー酸、すなわち、タンニン酸、カルボキシメチルセルロースに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0186】

特に明記しない限り、特定の化合物への言及には、その塩形態も含まれる。

【0187】

アプタマーを含むキット
本開示は、本明細書に記載のアプタマーうちのいずれかを含むキットを提供する。そのようなキットは、例えば、少なくとも１つのアプタマーを含むことができ、構成要素には、任意選択で、例えば、（ａ）溶媒または溶液等の薬学的に許容される担体、（ｂ）安定剤または緩衝剤等の薬学的に許容される賦形剤、（ｃ）キット構成要素を保持及び／または混合するための少なくとも１つの容器、バイアル、もしくは装置、ならびに（ｄ）送達装置、のうちの少なくとも１つが含まれ得る。キットはさらに、任意選択で、（ｅ）アプタマーに結合している標的分子を検出するのに有用な標識物質、（ｆ）マイクロアレイまたはビーズ等の固体支持体、及び（ｇ）インターカレーター性の蛍光色素または蛍光ＤＮＡプローブ等の、ポリメラーゼ連鎖反応生成物の定量に関連した試薬、のうちの１つ以上を含むことができる。

【実施例】

【0188】

以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をより詳細に例示するために提供される。ただし、それらは決して本発明の広い範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、本発明の趣旨から逸脱することなく、本発見の基礎にある原理を容易に採用して、様々な化合物を設計することができる。

【0189】

ヌクレオシド三リン酸の陰イオン交換ＨＰＬＣ精製の一般手順。
ヌクレオシド三リン酸を、分取ＨＰＬＣシステムに取り付けられたＳｏｕｒｃｅ Ｑ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）充填済みＨＰＬＣカラムを使用して陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、２７８ｎｍで検出した。線形溶離グラジエントでは２つの緩衝液（緩衝液Ａ：１０ｍＭの炭酸水素トリエチルアンモニウム／１０％アセトニトリル、及び緩衝液Ｂ：１Ｍの炭酸水素トリエチルアンモニウム／１０％アセトニトリル）が用いられ、溶出期間にわたり雰囲気温度にて低い緩衝液Ｂ含有量から高い緩衝液Ｂ含有量へのグラジエントで実施された。所望の生成物は典型的には、カラムから溶出する最後の物質であり、保持時間が約１０～１２分にわたる幅広なピークとして観察された（溶出の早い生成物には様々な反応副生成物が含まれており、最も顕著なものはヌクレオシド二リン酸であった）。生成物の溶出中、いくつかの画分を回収した。画分を、Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙカラム（ＰＮ：ＷＡＴ０５４２１５）を備えたＷａｔｅｒｓ ２７９５ ＨＰＬＣで逆相ＨＰＬＣにより分析した。純粋な生成物を含有する画分（典型的には９０％超）をＧｅｎｅｖａｃ ＨＴ－１２エバポレーター内で蒸発させ、無色～明るい黄褐色の樹脂を得た。

【0190】

ヌクレオシド三リン酸の逆相ＨＰＬＣ精製の一般手順。
ヌクレオシド三リン酸を、Ｗａｔｅｒｓ分取ＨＰＬＣシステムに取り付けられたＷａｔｅｒｓ Ｎｏｖａｐａｋ Ｃ８、３０ｍｍ×３００ｍｍカラム（ＰＮ：１８６００２４７３）を使用して逆相クロマトグラフィーにより精製し、２７８ｎｍで検出した。線形溶離グラジエントでは２つの緩衝液（緩衝液Ａ：１００ｍＭの炭酸水素トリエチルアンモニウム、及び緩衝液Ｂ：１００％アセトニトリル）が用いられ、溶出期間にわたり雰囲気温度にて低い緩衝液Ｂ含有量から高い緩衝液Ｂ含有量へのグラジエントで実施された。所望の生成物は典型的には、カラムから溶出する最後の物質であり、保持時間が約５～１２分にわたる幅広なピークとして観察された（溶出の早い生成物には様々な反応副生成物が含まれた）。生成物の溶出中、いくつかの画分を回収した。画分を、Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙカラム（ＰＮ：ＷＡＴ０５４２１５）を備えたＷａｔｅｒｓ ２７９５ ＨＰＬＣで逆相ＨＰＬＣにより分析した。純粋な生成物を含有する画分（典型的には９０％超）をＧｅｎｅｖａｃ ＨＴ－１２エバポレーター内で蒸発させ、無色～明るい黄褐色の樹脂を得た。

【0191】

画分を脱イオン水に再構成し、最終分析用にプールした。Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ８４５２Ａダイオードアレイ分光光度計を２７８ｎｍで使用する分析により、生成物の定量を実施した。生成物の収量を方程式Ａ＝εＣＬで計算した［式中、ＡはＵＶ吸光度であり、εは推定吸光係数であり、Ｌは光路長（１ｃｍ）である］。

【0192】

実施例１：修飾デオキシシチジンの調製
ステップ１：５－（Ｎ－カルボキサミド）－２’－デオキシシチジン誘導体（スキーム１、生成物２）の合成：
市販の５－ヨード－２’－デオキシシチジン（スキーム１、生成物１）を丸底フラスコに投入し、無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶かした。出発物質を、必要な芳香族第一級アミン（ＲＣＨ_２ＮＨ_２、４～８当量）、一酸化炭素（１ａｔｍ以下）及び（Ｐｈ_３Ｐ）_４Ｐｄ（２ｍｏｌ％）で室温にて２４～４８時間処理することにより、対応するＮ－置換カルボキサミドに変換した。反応の進行を、薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、溶離液：８～１２％メタノール／ジクロロメタン）または逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ２４８９検出器を備えた２７９５ ＨＰＬＣ、及びＷａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙカラムを使用、緩衝液Ａ：１００ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム、緩衝液Ｂ：アセトニトリル、グラジエント：３０分かけて緩衝液Ｂ３０％～７０％）によって追跡した。得られた粗反応混合物をセライトベッドにより濾過し、過剰な触媒及び固体副生成物を除去した。その後、濾液をジクロロメタンで希釈し、脱イオン水で洗浄して過剰のＤＭＦを除去したところ、ジクロロメタン層に白色～オフホワイトの結晶性固体の形成が生じた。固体物質を含有する有機層をＳｃｈｏｔｔ瓶に回収し、室温で数時間から一晩撹拌し、次いで濾過し、固形物を塩化メチレンで洗浄した。フィルターケーキを真空乾燥し、得られた白色～オフホワイトの固体の５－修飾シチジンカルボキサミドを約５０％～７０％の収率で回収した。

【0193】

ステップ２：４－Ｎ－アセチル－５－（Ｎ－カルボキサミド）－２’－デオキシシチジン誘導体（スキーム１、生成物３）の合成：
ステップ１の生成物を丸底フラスコに投入し、無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶かし、適切な無水物（無水酢酸またはプロピオン酸無水物、２当量）で処理し、混合物をアルゴン下で室温～４０℃にて最低１８時間撹拌した。反応の進行を、ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ２４８９検出器を備えた２７９５ ＨＰＬＣ、及びＷａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙカラムを使用、緩衝液Ａ：１００ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム、緩衝液Ｂ：アセトニトリル、グラジエント：３０分かけて緩衝液Ｂ３０％～７０％）によって追跡した。反応完了時、粗混合物を酢酸エチルで希釈して分液漏斗に移し、２％炭酸水素ナトリウム溶液（１回）、脱イオン水（１回）及びブライン（１回）で洗浄した。有機層をＳｃｈｏｔｔ瓶に回収し、室温で数時間から一晩撹拌した、その間に白色～オフホワイトの結晶性固体が形成された。混合物を濾過し、固形物及びガラス器具を酢酸エチルで洗浄した。フィルターケーキを真空乾燥し、得られた白色～オフホワイトの固体の４－Ｎ－アセチル－５－修飾シチジンカルボキサミドを約５０％～７０％の収率で回収した。

【0194】

ステップ３：５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－４－Ｎ－アセチル－５－（Ｎ－カルボキサミド）－２’－デオキシシチジン誘導体（スキーム１、生成物４）の合成：
マグネチックスターラー付き丸底フラスコ内で、ステップ２の生成物をアルゴン下で無水ピリジンに溶かした。１時間かけて、４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（１．１当量）を４～５回に分けて撹拌混合物に加えた。反応物をさらなる時間撹拌し、次いで、エタノール（６当量）でクエンチし、反応混合物を蒸発させて粘着性残渣を得た。粗物質を酢酸エチルに溶かし、２％炭酸水素ナトリウムで洗浄し（１回）、硫酸ナトリウムで乾燥させて濾過し、蒸発させ、帯橙色～黄色泡状物を得た。粗物質をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製した（シリカゲルを１％トリエチルアミン／９９％酢酸エチルで前処理；生成物を７５％酢酸エチル／２５％ヘキサンで溶出）。生成物含有画分を濃縮し、白色～オフホワイトの泡状物を収率７０％～８０％で得た。

【0195】

ステップ４：５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－４－Ｎ－アセチル－５－（Ｎ－カルボキサミド）－２’－デオキシシチジン－３’－Ｏ－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－Ｏ－２－シアノエチルホスホルアミダイト）誘導体（スキーム１、生成物５）の合成：
マグネチックスターラー付き丸底フラスコ内で、ステップ３の生成物をアルゴン下で無水ジクロロメタンに溶かした。反応混合物に、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトライソプロピルホスフィン（１．５当量）、続いてトリフルオロ酢酸ピリジン（１．７当量）を加えた。反応物を３０～６０分間撹拌し、次いで、薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、溶離液：５０～６０％酢酸エチル／ヘキサン）によって分析し、反応が完了したことが示された。粗混合物を、１％トリエチルアミン／９９％酢酸エチルで事前にコンディショニングされ、６０％酢酸エチル／４０％ヘキサンで平衡化されたシリカゲルフラッシュカラムに適用した。生成物を同じ移動相で溶出させ、０℃に冷却し、アルゴンを吹き込み、アルゴンパージした瓶に回収した。生成物含有画分を濃縮し、白色～オフホワイトの泡状物を収率７０％～８０％で得た。

【化21】

【0196】

２－シアノエチルホスホルアミダイト試薬（ＣＥＰ試薬）の調製では、５－（Ｎ－カルボキサミド）－２’－デオキシシチジン誘導体を選択的にＮ－保護し、次いで、４，４’－ジメトキシトリチルクロリド含有ピリジンとの反応によって（４，４’－ジメトキシトリチル）－誘導体（４）として５’Ｏ－保護した（例えば、Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２５，７６５－７７０（２００６）を参照のこと）。高純度（９８％超）のＣＥＰ試薬（５）の合成が、３’－アルコールと２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトライソプロピルホスフィンとのピリジニウムトリフルオロアセタート触媒縮合（例えば、Ｓａｎｇｈｖｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４，１７５－１８１（２０００）を参照のこと）及び脱気溶媒を用いるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによる最終精製によって完了した（例えば、Ｓｔｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４３，２９２３－２９２５（１９７８）を参照のこと）。

【0197】

５’－三リン酸試薬（ＴＰＰ試薬、スキーム２）の調製では、５’Ｏ－ＤＭＴ－保護されたヌクレオシド（スキーム１または２、生成物４）を無水酢酸含有ピリジンでアセチル化し、続いて、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールでＤＭＴ及び４－Ｎ－アセチル保護基の切断を行った（スキーム２、生成物６）（例えば、Ｌｅｏｎａｒｄ ａｎｄ Ｎｅｅｌｉｍａ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３６（４３），７８３３－７８３６（１９９５）を参照のこと）。得られた結晶性３’－Ｏ－アセタート化ヌクレオシドをＬｕｄｗｉｇ－Ｅｃｋｓｔｅｉｎプロセス（Ｌｕｄｗｉｇ，Ｊ．ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，５４：６３１）によって粗５’－Ｏ－三リン酸に変換した（スキーム２、生成物７）。これらの化学修飾ヌクレオチドには一般に、高純度（９０％超）を得るために二段階精製工程、すなわち、イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）、続く逆相分取ＨＰＬＣを必要とする。

【0198】

実施例１－１：５－［（Ｎ－（３，３－ジフェニルプロピル）カルボキサミド］－２’－デオキシシチジン（ＤＰＰｄＣ）誘導体の調製
５－［Ｎ－（３，３－ジフェニルプロピル）カルボキサミド］－２’－デオキシシチジンヌクレオシド（スキーム１、生成物２）の合成：市販の５－ヨード－２’－デオキシシチジン（スキーム１、生成物１、２０ｇ、５６．８ｍｍｏｌ）を丸底フラスコに投入し、無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１３７ｍＬ）に溶かした。出発物質を、必要な芳香族第一級アミン（３，３－ジフェニルプロピルアミン、（５１．６ｇ、２４４ｍｍｏｌ、４．３当量）、一酸化炭素（１ａｔｍ以下）、ビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム（０）（１．１４ｇ、２ｍｍｏｌ、０．０３５当量）及びトリフェニルホソフェン（２．３４ｇ、８．５ｍｍｏｌ、０．１５当量）で室温にて２４～４８時間処理することにより、対応するＮ－置換カルボキサミドに変換した。反応の進行を、薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、溶離液：８～１２％メタノール／ジクロロメタン）または逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ２４８９検出器を備えた２７９５ ＨＰＬＣ、及びＷａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙカラムを使用、緩衝液Ａ：１００ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム、緩衝液Ｂ：アセトニトリル、グラジエント：３０分かけて緩衝液Ｂ３０％～７０％）によって追跡した。得られた粗反応混合物をセライトベッドにより濾過し、過剰な触媒及び固体副生成物を除去した。その後、濾液をジクロロメタンで希釈し、脱イオン水で洗浄して過剰のＤＭＦを除去したところ、ジクロロメタン層に白色～オフホワイトの結晶性固体の形成が生じた。固体物質を含有する有機層をＳｃｈｏｔｔ瓶に回収し、室温で数時間から一晩撹拌し、次いで濾過し、固形物を塩化メチレンで洗浄した。フィルターケーキを真空乾燥し、得られた白色～オフホワイトの固体の５－修飾シチジンカルボキサミドを回収した（１４．６５ｇ、収率５６％）。^１Ｈ－ＮＭＲ （３００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ ８．３７ （ｓ， １Ｈ）， ８．１４（ｔ， Ｊ ＝ ５．３ Ｈｚ，１Ｈ）， ７．９９ （ｂｓ， １Ｈ）， ７．６９ （ｂｓ， １Ｈ）， ７．２４－７．３３ （ｍ， ８Ｈ）， ７．１３－７．２１ （ｍ， ２Ｈ）， ６．１２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．２４ （ｄ， Ｊ ＝ ４．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．０９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ）， ４．２２－４．３０ （ｍ， １Ｈ）， ４．０３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８３ （ｔ， Ｊ_Ａ ＝ ７．５， Ｊ_Ｂ ＝ ３．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５５－３．７２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０８ （ｄｄ， Ｊ_Ａ ＝ １３．５， Ｊ_Ｂ ＝ ６．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１０－２．３２ （ｍ， ４Ｈ）． ^１３Ｃ－ＮＭＲ （１００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １７０．５３ （１Ｃ）， １６５．７２ （１Ｃ）， １６３．９８ （１Ｃ）， １５３．９３ （１Ｃ）， １４５．１９ （２Ｃ）， １４５．１４ （２Ｃ）， １４４．１３ （１Ｃ）， １２８．９１ （４Ｃ）， １２８．０９ （２Ｃ）， １２８．０７ （２Ｃ）， １２６．５９ （２Ｃ）， ９９．７４ （１Ｃ）， ８６．４４ （１Ｃ）， ８５．５９ （１Ｃ）， ７５．０７ （１Ｃ）， ６１．６８ （１Ｃ）， ４８．５２ （１Ｃ）， ３８．３７ （１Ｃ）， ３７．９３ （１Ｃ）， ３４．６７ （１Ｃ）， ２１．３２ （１Ｃ）． ＭＳ （ｍ／ｚ） Ｃ_２５Ｈ_２８Ｎ_４Ｏ_５に対する計算値， ４６４．５２；実測値 ４６３．２ ［Ｍ－Ｈ］^－ （ＥＳＩ^－）．

【0199】

４－Ｎ－アセチル－５－［３，３－ジフェニルプロピル）カルボキサミド］－２’－デオキシシチジンヌクレオシド（スキーム１、１、生成物３）の合成：前のステップの生成物（スキーム１、生成物２、１４．５ｇ、３１．２ｍｍｏｌ））を丸底フラスコに投入し、無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２８４ｍＬ）に溶かし、無水酢酸（５．９ｍＬ、６２ｍｍｏｌ、２当量）で処理し、混合物をアルゴン下で室温～４０℃にて約５．５時間撹拌した。反応の進行を、ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ２４８９検出器を備えた２７９５ ＨＰＬＣ、及びＷａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙカラムを使用、緩衝液Ａ：１００ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム、緩衝液Ｂ：アセトニトリル、グラジエント：３０分かけて緩衝液Ｂ３０％～７０％）によって追跡した。反応完了時、粗混合物を酢酸エチルで希釈して分液漏斗に移し、２％炭酸水素ナトリウム溶液（１回）、脱イオン水（１回）及びブライン（１回）で洗浄した。有機層をＳｃｈｏｔｔ瓶に回収し、室温で数時間から一晩撹拌し、その間に微結晶性固体が形成された。混合物を濾過し、固形物及びガラス器具を酢酸エチルで洗浄した。フィルターケーキを真空乾燥し、得られた白色～オフホワイトの固体生成物を回収した（１２．０４ｇ、収率７６％）。^１Ｈ－ＮＭＲ （３００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １１．３２ （ｓ， １Ｈ）， ８．７０ （ｓ， １Ｈ）， ８．３６－８．４５ （ｍ， １Ｈ）， ７．２３－７．３６ （ｍ， ８Ｈ）， ７．１１－７．２０ （ｍ， ２Ｈ）， ６．０９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．２４－５．３１ （ｍ， １Ｈ）， ４．２２－４．３２ （ｍ， １Ｈ）， ３．８８－３．９４ （ｍ， １Ｈ）， ３．５７－３．７５ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０５－３．１６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３６－２．４１ （ｂｓ， ３Ｈ）， ２．１４－２．３６（ｍ， ４Ｈ）． ^１３Ｃ－ＮＭＲ （１００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １７０．６３ （１Ｃ）， １６４．８０ （１Ｃ）， １５９．１７ （１Ｃ）， １５２．６４ （１Ｃ）， １４５．４５ （１Ｃ）， １４４．５８／１４４．５６ （２Ｃ）， １４４．５６ （１Ｃ）， １２８．３６ （４Ｃ）， １２７．５２ （４Ｃ）， １２６．０３ （２Ｃ）， ９９．９４（１Ｃ）， ８８．０９ （１Ｃ）， ８６．８９ （１Ｃ）， ６９．３５ （１Ｃ）， ６０．５５ （１Ｃ）， ４７．９２ （１Ｃ）， ４０．５１ （１Ｃ）， ３７．９８ （１Ｃ）， ３３．９１ （１Ｃ）， ２６．１０ （１Ｃ）． ＭＳ （ｍ／ｚ） Ｃ_２７Ｈ_３０Ｎ_４Ｏ_６に対する計算値， ５０６．５６；実測値 ５０５．３ ［Ｍ－Ｈ］^－ （ＥＳＩ^－）．

【0200】

５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－４－Ｎ－アセチル－５－［Ｎ－（３，３－ジフェニルプロピル）カルボキサミド］－２’－デオキシシチジン（スキーム１、生成物４）の合成：マグネチックスターラー付き丸底フラスコ内で、前のステップの生成物（スキーム１、生成物３、１２．２ｇ、２４．１ｍｍｏｌ）を、アルゴン下、無水ピリジン（８０ｍＬ）に溶かした。１時間かけて、４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（９．２ｇ、２７．０ｍｍｏｌ、１．１当量）を４回に分けて撹拌混合物に加えた。反応物をさらなる時間撹拌し、次いで、エタノール（９．５ｍＬ、１６３ｍｍｏｌ、６．８当量）でクエンチし、反応混合物を蒸発させて粘着性残渣を得た。粗物質を酢酸エチルに溶かして分液漏斗に移し、２％炭酸水素ナトリウムで洗浄した（１回）。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥させて濾過し、蒸発させ、橙色～黄色泡状物を得た。粗物質をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製した（シリカゲルを１％トリエチルアミン／９９％酢酸エチルで前処理；生成物を８０％～９０％酢酸エチル／２０％～１０％ヘキサンで溶出）。生成物含有画分を濃縮し、白色～オフホワイトの泡状物を得た（１５．２７ｇ、収率７８％）。^１Ｈ－ＮＭＲ （３００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １１．３６ （ｓ， １Ｈ）， ８．５７ （ｔ， Ｊ ＝ ４．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．３７ （ｓ， １Ｈ）， ７．０９－７．３９ （ｍ， １９Ｈ）， ６．７２－６．８７ （ｄ， ４Ｈ）， ６．１０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．１５ （ｄ， Ｊ ＝ ４．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３５ （ｄｔ， Ｊ_Ａ ＝ ９．９， Ｊ_Ｂ ＝ ４．５ Ｈｚ １Ｈ）， ４．０８－３．９８ （ｍ， １Ｈ）， ３．９２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６８ （ｄ， Ｊ ＝ ２．４ Ｈｚ， ６Ｈ）， ３．１７－３．３１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７８－３．０２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３３－２．４６ （ｍ， ４Ｈ）， ２．１７－２．２９ （ｍ， １Ｈ）， １．９２－２．１１ （ｍ， ２Ｈ）． ^１３Ｃ－ＮＭＲ （１００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １７０．６１ （１Ｃ）， １６４．６１ （１Ｃ）， １５９．２６ （１Ｃ）， １５７．９３／１５７．９０ （２Ｃ）， １５２．５４ （１Ｃ）， １４４．９７ （１Ｃ）， １４４．６５ （１Ｃ）， １４４．２３ （２Ｃ）， １３５．４０／１３５．３５ （２Ｃ）， １２９．５７ （１Ｃ）， １２９．４９ （１Ｃ）， １２８．３４ （４Ｃ）， １２７．６６ １Ｃ）， １２７．５４ （１Ｃ）， １２７．４１／１２７．４０ （４Ｃ）， １２６．５１ （１Ｃ）， １２６．０４ （２Ｃ）， １１３．００ （４Ｃ）， ９９．９４（１Ｃ）， ８７．３９ （１Ｃ）， ８６．３２ （１Ｃ）， ８５．６０ （１Ｃ）， ６９．９０ （１Ｃ）， ５９．６６ （１Ｃ）， ５４．８５／５４．８２ （２Ｃ）， ４８．２７ （１Ｃ）， ４０．３７ （１Ｃ）， ３８．１６ （１Ｃ）， ３３．７３ （１Ｃ）， ２６．１３ （１Ｃ）． ＭＳ （ｍ／ｚ） Ｃ_４８Ｈ_４８Ｎ_４Ｏ_８に対する計算値， ８０８．９３；実測値 ８０７．３ ［Ｍ－Ｈ］^－ （ＥＳＩ^－）．

【0201】

５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－４－Ｎ－アセチル－５－［Ｎ－（３，３－ジフェニルプロピル）カルボキサミド］－２’－デオキシシチジン－３’－Ｏ－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－Ｏ－２－シアノエチルホスホルアミダイト）（スキーム１、生成物５）の合成：マグネチックスターラー付き丸底フラスコ内で、前のステップの生成物（スキーム１、生成物４、１４．０ｇ、１７．３ｍｍｏｌ）をアルゴン下で無水ジクロロメタン（４３ｍＬ）に溶かした。反応混合物に、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトライソプロピルホスフィン（８．２ｍＬ、２６ｍｍｏｌ、１．５当量）、続いてピリジニウムトリフルオロアセタート（５．４ｇ、２８．２ｍｍｏｌ、１．６当量）を加えた。反応物を３０分間撹拌し、次いで、薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、溶離液：６０％酢酸エチル／４０％ヘキサン）によって分析し、反応が完了したことが示された。粗混合物を、１％トリエチルアミン／９９％酢酸エチルで事前にコンディショニングされ、６０％酢酸エチル／４０％ヘキサンで平衡化されたシリカゲルフラッシュカラムに適用した。生成物を同じ移動相で溶出させ、０℃に冷却し、アルゴンを吹き込み、アルゴンパージした瓶に回収した。生成物含有画分を濃縮し、白色～オフホワイトの泡状物を得た（１３．８５ｇ、収率７９％）。^１Ｈ－ＮＭＲ （３００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １１．３６ （ｓ， １Ｈ）， ８．５６ （ｂｔ， １Ｈ）， ８．４１－８．４７ （ｄ， １Ｈ）， ７．１１－７．３７ （ｍ， １９Ｈ）， ６．７４－６．８３ （ｄ， ４Ｈ）， ６．０３－６．１０ （ｍ， １Ｈ）， ４．３０－４．４４ （ｍ， １Ｈ）， ４．１２－４．２２ （ｍ， １Ｈ）， ３．９１ （ｄｄ， Ｊ_Ａ ＝ １４．１， Ｊ_Ｂ ＝ ７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６３－３．７８ （ｍ， ７Ｈ）， ３．４３－３．６２ （ｍ， ３Ｈ）， ３．２２－３．３７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７９－３．０２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．６４ （ｔ， Ｊ ＝ ６．０， Ｈｚ， １Ｈ）， ２．３３－２．４５ （ｍ， ５Ｈ）， １．９４－２．０８ （ｍ， ２Ｈ）， １．１１ （ｄｄ， Ｊ_Ａ ＝ １２．３， Ｊ_Ｂ ＝ ６．６ Ｈｚ １２Ｈ）， ０．９７ （ｄ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ３Ｈ）． ^３１Ｐ－ＮＭＲ （３００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １４７．５６／１４７．５６ （ｓ， １Ｐ）． ＭＳ （ｍ／ｚ） Ｃ_５７Ｈ_６５Ｎ_６Ｏ_９Ｐに対する計算値， １００９．１５；実測値 １００７．３ ［Ｍ－Ｈ］^－ （ＥＳＩ^－）．

【0202】

５－［Ｎ－（３，３－ジフェニルプロピル）カルボキサミド］－３’－Ｏ－アセチル－２’－デオキシシチジンヌクレオシド（スキーム２、生成物６）の合成：マグネチックスターラー付き丸底フラスコ内で、出発物質（スキーム２、生成物４、１．２６ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）をアルゴン下で無水ピリジン（１０ｍＬ）に溶かした。無水酢酸（１ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ、６．７当量）を撹拌混合物に滴下。反応物を２９時間撹拌し、反応の進行を、ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ２４８９検出器を備えた２７９５ ＨＰＬＣ、及びＷａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙカラムを使用、緩衝液Ａ：１００ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム、緩衝液Ｂ：アセトニトリル、グラジエント：７５％緩衝液Ｂ、定組成で３０分かけて）によって追跡した。粗混合物を、２回のアセトン共蒸発で蒸発させ、淡黄色泡状物を回収した。残渣を、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（１０ｍＬ、９５ｍｍｏｌ））に溶かし（Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｎ．Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９５，３６：７８３３）、約５０℃で１６時間加熱した。ＤＭＴ基の完全な切断をＴＬＣ（５％メタノール／ジクロロメタン）によって確認した。赤色溶液を、よく撹拌したメタノール（約７５ｍＬ）に注いでクエンチした。得られた黄色溶液を真空濃縮し、残渣を熱酢酸エチル（２０ｍＬ）に溶かした。生成物は冷却時に結晶化し、得られたスラリーを０℃で撹拌し、その後、濾過して酢酸エチルで洗浄した。３’－Ｏ－アセチル－ヌクレオシド（生成物６）を白色固体として単離した（０．５５ｇ、収率７０％）。^１Ｈ－ＮＭＲ （３００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ ８．３８ （ｓ， １Ｈ）， ８．２６ （ｂｔ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．０４ （ｂｓ， １Ｈ）， ７．７７ （ｂｓ， １Ｈ）， ７．２４－７．４１ （ｍ， ８Ｈ）， ７．１２－７．２３ （ｍ， ２Ｈ）， ６．１７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．２３－５．３０ （ｍ， １Ｈ）， ５．１８ （ｔ， Ｊ ＝ ５．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９８－４．１４ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６２－３．７７ （ｍ， ２Ｈ）， ３．１０ （ｄｄ， Ｊ_Ａ ＝ １２．３， Ｊ_Ｂ ＝ ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３５－２．４８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２２－２．３５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．０８ （ｓ， ３Ｈ）． ^１３Ｃ－ＮＭＲ （１００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １７０．５３ （１Ｃ）， １６５．７２ （１Ｃ）， １６３．９８ （１Ｃ）， １５３．９３ （１Ｃ）， １４５．１９ （２Ｃ）， １４５．１４ （２Ｃ）， １４４．１３ （１Ｃ）， １２８．９１ （４Ｃ）， １２８．０９ （２Ｃ）， １２８．０７ （２Ｃ）， １２６．５９ （２Ｃ）， ９９．７４ （１Ｃ）， ８６．４４ （１Ｃ）， ８５．５９ （１Ｃ）， ７５．０７ （１Ｃ）， ６１．６８ （１Ｃ）， ４８．５２ （１Ｃ）， ３８．３７ （１Ｃ）， ３７．９３ （１Ｃ）， ３４．６７ （１Ｃ）， ２１．３２ （１Ｃ）． ＭＳ （ｍ／ｚ） Ｃ_２７Ｈ_３０Ｎ_４Ｏ_６に対する計算値， ５０６．５６；実測値 ５０６．２ ［Ｍ－Ｈ］^－ （ＥＳＩ^－）．

【0203】

５－［Ｎ－（３，３－ジフェニルプロピル）カルボキサミド］－２’－デオキシシチジン－５’－Ｏ－三リン酸（トリス－トリエチルアンモニウム塩）（７）の合成：３’－Ｏ－アセチル－ヌクレオシド（６）から、５００μｍｏｌスケール（５×）のＬｕｄｗｉｇ及びＥｃｋｓｔｅｉｎの手順（Ｌｕｄｗｉｇ，Ｊ．ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９，５４：６３１）により三リン酸（７）を合成した。粗三リン酸生成物を、アンモノリシス及び蒸発の後、一般手順（上記）に記載のように陰イオン交換クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーによって精製した。［ε _ｅｓｔ． １３．７００ ｃｍ^－１ Ｍ^－１］単離された精製生成物は５９．８μｍｏｌであった（収率１２％）。^１Ｈ－ＮＭＲ （３００ ｍＨｚ， Ｄ_２Ｏ）： δ ＝ ７．９５ （ｓ， １Ｈ）， ７．２２－７．２８ （ｍ， ４Ｈ）， ７．１１－７．１９ （ｍ， ４Ｈ）， ６．９７－７．０５ （ｍ， ２Ｈ）， ６．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５１ （五重線， Ｊ ＝ ３．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１０－４．１７ （ｍ， ３Ｈ）， ３．９２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５Ｈｚ， １Ｈ）， ３．２９－３．４０ （ｍ， １Ｈ）， ３．１８．－３．２９ （ｍ， １Ｈ）， ３．００ （ｑ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， １９Ｈ）， ２．２５－２．３７ （ｍ， ３Ｈ）， ２．１１－２．２２ （ｍ， １Ｈ）， １．１１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２９Ｈ）． ^１３Ｃ－ＮＭＲ （８０ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １６５．５２ （１Ｃ）， １６３．５５ （１Ｃ）， １５５．７８ （１Ｃ）， １４５．３５／１４５．３８ （２Ｃ）， １４２．７０ （１Ｃ）， １２８．８１ （４Ｃ）， １２７．４５ （４Ｃ）， １２６．１８／１２６．２０ （２Ｃ）， １００．７４ （１Ｃ）， ８６．８４ （１Ｃ）， ８５．８６／８５．９８ （１Ｃ）， ７０．７０ （１Ｃ）， ６５．２７／６５．３４ （１Ｃ）， ４９．６０ （１Ｃ）， ４６．５０ （３Ｃ）， ３９．７６ （１Ｃ）， ３９．０１ （１Ｃ）， ３３．５０ （１Ｃ）， ８．１７ （３Ｃ）． ^３１Ｐ－ＮＭＲ （１００ ｍＨｚ， Ｄ_２Ｏ）： δ ＝ －９．９４ （ｄ， Ｊ ＝ １６．７ Ｈｚ， １Ｐ）， －１１．６０ （ｄ， Ｊ ＝ １７．０ Ｈｚ， １Ｐ）， －２３．３０ （ｔ， Ｊ ＝ １７ Ｈｚ， １Ｐ）． ＭＳ （ｍ／ｚ） Ｃ_２５Ｈ_３０Ｎ_４Ｏ_１４Ｐ_３に対する計算値， ７０３．４５；実測値 ７０３．１ ［Ｍ－Ｈ］^－ （ＥＳＩ^－）．

【0204】

実施例１－２：５－［Ｎ－（４－フェニルベンジル）カルボキサミド］－２’－デオキシシチジン（ＰＢｎｄＣ）誘導体の調製
５－［Ｎ－（４－フェニルベンジル）カルボキサミド］－２’－デオキシシチジンヌクレオシド（スキーム１、生成物２）の合成：市販の５－ヨード－２’－デオキシシチジン（スキーム１、生成物１、２０．８７ｇ、６９．１ｍｍｏｌ）を丸底フラスコに投入し、無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１５０ｍＬ）に溶かした。出発物質を、４－フェニルベンジルアミン、（４７．８３ｇ、２６１ｍｍｏｌ、４．２当量）、一酸化炭素（１ａｔｍ以下）、ビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム（０）（１．２５ｇ、２．１７ｍｍｏｌ、０．０３５当量）及びトリフェニルホスフェン（２．５４ｇ、９．７ｍｍｏｌ、０．１５当量）で室温にて２４～４８時間処理することにより、対応するＮ－置換カルボキサミドに変換した。反応の進行を、薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、溶離液：８～１２％メタノール／ジクロロメタン）または逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ２４８９検出器を備えた２７９５ ＨＰＬＣ、及びＷａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙカラムを使用、緩衝液Ａ：１００ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム、緩衝液Ｂ：アセトニトリル、グラジエント：３０分かけて緩衝液Ｂ３０％～７０％）によって追跡した。得られた粗反応混合物をセライトベッドにより濾過し、過剰な触媒及び固体副生成物を除去した。その後、濾液をジクロロメタンで希釈し、脱イオン水で洗浄して過剰のＤＭＦを除去したところ、水層とジクロロメタン層の両方に白色～オフホワイトの結晶性固体の形成が生じた。固体物質を含有する各層を別々にそれぞれの専用Ｓｃｈｏｔｔ瓶に回収し、室温で数時間から一晩撹拌した後、濾過し、固形物を塩化メチレンで洗浄した。フィルターケーキを真空乾燥し、得られた白色～オフホワイトの固体の５－修飾シチジンカルボキサミドを回収した（１７．００ｇ、収率６３％）。^１Ｈ－ＮＭＲ （３００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ ８．８５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ，１Ｈ）， ８．４９ （ｓ， １Ｈ）， ７．６２－７．７３ （ｍ， ４Ｈ）， ７．３６－７．５２ （ｍ， ５Ｈ）， ６．２０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．３０ （ｄ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．１２ （ｔ， Ｊ ＝ ５．４， １Ｈ）， ４．４３－４．５６ （ｍ， ２Ｈ）， ４．２８－４．３４ （１Ｈ）， ３．８８ （ｄｄ， Ｊ_Ａ ＝ ７．８， Ｊ_Ｂ ＝ ４．２ Ｈｚ）， ３．６０－３．７３ （ｄ， Ｊ ＝ ４．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２４ （ｔ， Ｊ ＝ ６．０， １Ｈ）． ^１３Ｃ－ＮＭＲ （１００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １６６．７０ （１Ｃ）， １６４．７５ （１Ｃ）， １５４．７７ （１Ｃ）， １４５．０８ （１Ｃ）， １４１．２０ （１Ｃ）， １４０．０４ （１Ｃ）， １３９．７０ （１Ｃ）， １３０．１８ （２Ｃ）， １２９．０３ （２Ｃ）， １２８．５９ （２Ｃ）， １２７．９２ （２Ｃ）， １２７．８２ （２Ｃ）， ９９．９８ （１Ｃ）， ８８．８８ （１Ｃ）， ８７．０７ （１Ｃ）， ７１．２４ （１Ｃ）， ６２．２８ （１Ｃ）， ４３．２４ （１Ｃ）， ４１．４１ （１Ｃ）． ＭＳ （ｍ／ｚ） Ｃ_２３Ｈ_２４Ｎ_４Ｏ_５に対する計算値， ４３６．４７；実測値 ４３５．２ ［Ｍ－Ｈ］^－ （ＥＳＩ^－）．

【0205】

４－Ｎ－プロピオニル－５－［（４－フェニルベンジル）カルボキサミド］－２’－デオキシシチジンヌクレオシド（スキーム１、生成物３）の合成：前のステップの生成物（スキーム１、生成物２、１６．８３ｇ、３８．６２ｍｍｏｌ）を丸底フラスコに投入し、無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、３５０ｍＬ）に溶かし、プロピオン酸無水物（１０ｍＬ、８０ｍｍｏｌ、２当量）で処理し、混合物をアルゴン下で４０℃にて約６時間撹拌した。反応の進行を、ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ２４８９検出器を備えた２７９５ ＨＰＬＣ、及びＷａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙカラムを使用、緩衝液Ａ：１００ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム、緩衝液Ｂ：アセトニトリル、グラジエント：３０分かけて緩衝液Ｂ３０％～７０％）によって追跡した。反応完了時、粗混合物をジクロロメタンで希釈して分液漏斗に移し、脱イオン水（１回）で洗浄した。有機層及び水層を別のＳｃｈｏｔｔ瓶に回収し、室温で数時間から一晩撹拌し、その間に微結晶性固体が形成された。得られた混合物を濾過し、固形物及びガラス器具を酢酸エチルで洗浄した。フィルターケーキを真空乾燥し、得られた白色～オフホワイトの固体生成物を回収した（１２．７４ｇ、収率７６７％）。^１Ｈ－ＮＭＲ （３００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １１．３９ （ｓ， １Ｈ）， ９．０３ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ，１Ｈ）， ８．７６ （ｓ， １Ｈ）， ７．６２－７．６９ （ｍ， ４Ｈ）， ７．４１－７．５０ （ｍ， ４Ｈ）， ７．３３－７．４０ （ｍ， １Ｈ）， ６．１２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．３０ （ｄ， Ｊ ＝ ４．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．１３ （ｔ， Ｊ ＝ ５．３， １Ｈ）， ４．４０－４．５８ （ｍ， ２Ｈ）， ４．２３－４．３４ （１Ｈ）， ３．９３ （ｄｄ， Ｊ_Ａ ＝ ７．８， Ｊ_Ｂ ＝ ３．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５８－３．７６ （ｄ， Ｊ ＝ ４．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．８１ （ｄｄ， Ｊ_Ａ ＝ １４．７， Ｊ_Ｂ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３１－２．４８ （ｍ， １Ｈ）， ２．１８－２．２９ （ｍ， １Ｈ）， １．０６ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ３Ｈ）． ^１３Ｃ－ＮＭＲ （８０ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １７４．５８ （１Ｃ）， １６５．５８ （１Ｃ）， １５９．７５ （１Ｃ）， １５３．２８ （１Ｃ）， １４６．１８ （１Ｃ）， １４０．４２ （１Ｃ）， １３９．３８ （１Ｃ）， １３８．４６ （１Ｃ）， １２９．３９ （２Ｃ）， １２８．４１ （２Ｃ）， １２７．８３ （１Ｃ）， １２７．１４ （２Ｃ）， １２７．０６ （２Ｃ）， １００．４９ （１Ｃ）， ８８．６９ （１Ｃ）， ８７．４９ （１Ｃ）， ７０．１５ （１Ｃ）， ６１．２２ （１Ｃ）， ４２．７５ （１Ｃ）， ４０．９８ （１Ｃ）， ３１．７４ （１Ｃ）， ９．０４ （１Ｃ）． ＭＳ （ｍ／ｚ） Ｃ_２６Ｈ_２８Ｎ_４Ｏ_６に対する計算値， ４９２．５３；実測値 ４９１．２ ［Ｍ－Ｈ］^－ （ＥＳＩ^－）．

【0206】

５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－４－Ｎ－アセチル－５－［Ｎ－（４－フェニルベンジル）カルボキサミド］－２’－デオキシシチジン誘導体（スキーム１、生成物４）の合成：マグネチックスターラー付き丸底フラスコ内で、前のステップの生成物（１６．０１ｇ、３２．５ｍｍｏｌ）をアルゴン下で無水ピリジン（１０８ｍＬ）に溶かした。１時間かけて、４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（１３．１３ｇ、３８．８ｍｍｏｌ、１．１当量）を５回に分けて撹拌混合物に加えた。反応物をさらに１５分間撹拌し、次いで、エタノール（１１．５ｍＬ、１９５ｍｍｏｌ、６当量）でクエンチし、反応混合物を蒸発させて粘着性残渣を得た。粗物質を温ジクロロメタンに溶かして分液漏斗に移し、２％炭酸水素ナトリウムで洗浄した（１回）。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥させて濾過し、蒸発させ、帯橙色～黄色泡状物を得た。粗物質をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製した（シリカゲルを１％トリエチルアミン／９９％酢酸エチルで前処理；生成物を８０％～９０％酢酸エチル／２０％～１０％ヘキサンで溶出）。生成物含有画分を濃縮し、白色～オフホワイトの泡状物を得た（１５．２７ｇ、収率７８％）。^１Ｈ－ＮＭＲ （３００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １１．４９ （ｓ， １Ｈ）， ９．１３ （ｔ， Ｊ ＝ ５．３ Ｈｚ，１Ｈ）， ８．４９ （ｓ， １Ｈ）， ７．５９－７．６８ （ｍ， ２Ｈ）， ７．５２－７．５９ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４２－７．５１ （ｍ， ２Ｈ）， ６．１２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．３３ （ｄ， Ｊ ＝ ４．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２６ （ｄ， Ｊ ＝ ５．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．１３－４．２２ （ｍ， １Ｈ）， ４．００－４．０９ （ｍ， １Ｈ）， ３．７１ （ｂｓ， ６Ｈ）， ３．１９－３．３３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８３ （ｄｄ， Ｊ_Ａ ＝ １４．４， Ｊ_Ｂ ＝ ７．２， ２Ｈ）， ２．３５－２．４６ （ｍ， １Ｈ）， ２．２１－２．３３ （ｍ， １Ｈ）， １．０７ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ３Ｈ）． ^１３Ｃ－ＮＭＲ （１００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １７４．５９ （１Ｃ）， １６５．４７ （１Ｃ）， １５９．８４ （１Ｃ）， １５８．５３ （１Ｃ）， １５３．１５ （１Ｃ）， １４６．０６ （１Ｃ）， １４５．２８ （１Ｃ）， １４０．３５ （１Ｃ）， １３９．４１ （１Ｃ）， １３８．１３ （１Ｃ）， １３６．００ （１Ｃ）， １３０．１７ （１Ｃ）， １３０．１１ （１Ｃ）， １２９．３９ （２Ｃ）， １２８．４９ （２Ｃ）， １２８．１３ （１Ｃ）， １２７．８５ （１Ｃ）， １２７．１４ （１Ｃ）， １２７．０７ （２Ｃ）， １２７．０４ （２Ｃ）， １１３．６１ （４Ｃ）， １００．４８ （１Ｃ）， ８７．９８ （１Ｃ）， ８６．１９ （１Ｃ）， ７０．７０ （１Ｃ）， ６４．４１ （１Ｃ）， ５５．４１ （２Ｃ）， ４２．７９ （１Ｃ）， ４０．７３ （１Ｃ）， ３１．８３ （１Ｃ）， ９．０４ （１Ｃ）． ＭＳ （ｍ／ｚ） Ｃ_４７Ｈ_４６Ｎ_４Ｏ_８に対する計算値， ７９４．９０；実測値 ７９３．３ ［Ｍ－Ｈ］^－ （ＥＳＩ^－）．

【0207】

５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－４－Ｎ－アセチル－５－［Ｎ－（４－フェニルベンジル）カルボキサミド］－２’－デオキシシチジン－３’－Ｏ－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－Ｏ－２－シアノエチルホスホルアミダイト）（スキーム１、生成物５）の合成：マグネチックスターラー付き丸底フラスコ内で、ステップ３の生成物（スキーム１、生成物４、１１．８８ｇ、１４．９ｍｍｏｌ）をアルゴン下で無水ジクロロメタン（３８ｍＬ）に溶かした。反応混合物に、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトライソプロピルホスフィン（８ｍＬ、２５．２ｍｍｏｌ、１．５当量）、続いてトリフルオロ酢酸ピリジン（４．７５ｇ、２４．６ｍｍｏｌ、２．１当量）を加えた。反応物を３０分間撹拌し、次いで、薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、溶離液：６０％酢酸エチル／４０％ヘキサン）によって分析し、反応が完了したことが示された。粗混合物を、１％トリエチルアミン／９９％酢酸エチルで事前にコンディショニングされ、６０％酢酸エチル／４０％ヘキサンで平衡化されたシリカゲルフラッシュカラムに適用した。生成物を同じ移動相で溶出させ、０℃に冷却し、アルゴンを吹き込み、アルゴンパージした瓶に回収した。生成物含有画分を濃縮し、白色～オフホワイトの泡状物を得た（１２．０４ｇ、収率８１％）。^１Ｈ－ＮＭＲ （３００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １１．４８ （ｓ， １Ｈ）， ９．１２ （ｔ， Ｊ ＝ ４．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．５４／８．５７ （ｓ， １Ｈ）， ７．５９－７．６６ （ｍ， ２Ｈ）， ７．５１－７．５８ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４３－７．５０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．１８－７．４０ （ｍ， １２Ｈ）． ６．７７－６．８９ （ｍ， ４Ｈ）， ６．０３－６．１３ （ｍ， １Ｈ）， ４．１２－４．４７ （ｍ， ４Ｈ）， ３．７０ （ｓ， ６Ｈ）， ３．４３－３．７８０ （ｍ， ４Ｈ）， ３．２２－３．３６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８２ （ｄｄ， Ｊ_Ａ ＝ １４．９， Ｊ_Ｂ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．７６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．６４ （ｔ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．３６－２．４６ （ｍ， ２Ｈ）， １．０２－１．１７ （ｍ， １２Ｈ）， ０．９８ （ｄ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， ２Ｈ）． ^３１Ｐ－ＮＭＲ （１００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １４７．５５／１４７．３５ （ｓ， １Ｐ）． ＭＳ （ｍ／ｚ） Ｃ_５６Ｈ_６３Ｎ_６Ｏ_９Ｐに対する計算値， ９９５．１３；実測値 ９９３．４ ［Ｍ－Ｈ］^－ （ＥＳＩ^－）．

【0208】

５－［Ｎ－（４－フェニルベンジル）カルボキサミド］－３’－Ｏ－アセチル－２’－デオキシシチジンヌクレオシド（スキーム２、生成物６）の合成：マグネチックスターラー付き丸底フラスコ内で、出発物質（スキーム２、生成物４、１．２６ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）をアルゴン下で無水ピリジン（１０ｍＬ）に溶かした。無水酢酸（１ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ、６．７当量）を撹拌混合物に滴下。反応物を１６．５時間撹拌し、反応の進行をＴＬＣ（８％メタノール／ジクロロメタン）によって追跡した。粗混合物を蒸発させ、淡黄色泡状物を回収した。残渣を、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（１０ｍＬ、９５ｍｍｏｌ））に溶かし（Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｎ．Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９５，３６：７８３３）、約５０℃で２２．２５時間加熱した。ＤＭＴ基の完全な切断をＴＬＣ（８％メタノール／ジクロロメタン）によって確認した。赤色溶液を、よく撹拌したメタノール（約７５ｍＬ）に注いでクエンチした。得られた黄色溶液を真空濃縮し、残渣を熱酢酸エチル（２０ｍＬ）に溶かした。生成物は冷却時に結晶化し、得られたスラリーを０℃で撹拌し、その後、濾過して酢酸エチルで洗浄した。３’－Ｏ－アセチル－ヌクレオシド（６）を白色固体として単離した（０．４５ｇ、収率５６％）。^１Ｈ－ＮＭＲ （３００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ ８．８６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．４４ （ｓ， １Ｈ）， ７．９９－８．１８ （ｂｓ， １Ｈ）， ７．７５－７．８８ （ｂｓ， １Ｈ）， ７．６０－７．６８ （ｍ， ４Ｈ）， ７．３２－７．５１ （ｍ， ５Ｈ）， ６．１６ （ｄｄ， Ｊ_Ａ ＝ ８．１， Ｊ_Ｂ ＝ ６．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．２０－５．２７ （ｍ， １Ｈ）， ５．１４ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３８－４．５３ （ｍ， ２Ｈ）， ４．０６ （ｄｄ， Ｊ_Ａ ＝ ５．７， Ｊ_Ｂ ＝ ３．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５９－３．７２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２８－２．４７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．０７ （ｓ， ３Ｈ）． ^１３Ｃ－ＮＭＲ （８０ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １７０．５２ （１Ｃ）， １６５．８５ （１Ｃ）， １６４．００ （１Ｃ）， １５３．８８ （１Ｃ）， １４４．４４ （１Ｃ）， １４０．４３ （１Ｃ）， １３９．２９ （１Ｃ）， １３８．５６ （１Ｃ）， １２９．４０ （２Ｃ）， １２８．２８ （２Ｃ）， １２７．８２ （１Ｃ）， １２７．１５４ （２Ｃ）， １２７．０５ （２Ｃ）， ９９．５２ （１Ｃ）， ８６．４４ （１Ｃ）， ８５．５５ （１Ｃ）， ７５．１１ （１Ｃ）， ６１．６７ （１Ｃ）， ４２．５０ （１Ｃ）， ３７．７９ （１Ｃ）， ２１．３３ （１Ｃ）． ＭＳ （ｍ／ｚ） Ｃ_２５Ｈ_２６Ｎ_４Ｏ_６に対する計算値， ４７８．５１；実測値 ４７７．２ ［Ｍ－Ｈ］^－ （ＥＳＩ^－）．

【0209】

５－［Ｎ－（４－フェニルベンジル）カルボキサミド］－２’－デオキシウリジン－５’－Ｏ－三リン酸（トリス－トリエチルアンモニウム塩）（スキーム２、生成物７）の合成：３’－Ｏ－アセチル－ヌクレオシド（６）から、５００μｍｏｌスケール（５×）のＬｕｄｗｉｇ及びＥｃｋｓｔｅｉｎの手順（Ｌｕｄｗｉｇ，Ｊ．ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９，５４：６３１）により三リン酸（７）を合成した。粗三リン酸生成物を、アンモノリシス及び蒸発の後、一般手順（上記）に記載のように陰イオン交換クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーによって精製した。［ε _ｅｓｔ． １３，７００ ｃｍ^－１ Ｍ^－１］単離された精製生成物は２７５μｍｏｌ（収率５５％）であった。^１Ｈ－ＮＭＲ （３００ ｍＨｚ， Ｄ_２Ｏ）： δ ＝ ８．４０ （ｓ， １Ｈ）， ７．５１－７．６０ （ｍ， ４Ｈ）， ７．３２－７．４３ （ｍ， ４Ｈ）， ７．２５－７．３３ （ｍ， １Ｈ）， ６．０９ （ｔ， Ｊ＝６．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５７ （五重線， Ｊ ＝ ３．６ ｍＨｚ， １Ｈ）， ４．４３ （ｑ， Ｊ ＝ １５．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．１１－４．２３ （ｍ， ３Ｈ）， ３．００ （ｑ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， １９Ｈ）， ２．３１－２．４２ （ｍ， １Ｈ）， ２．１６－２．９０ （ｍ， １Ｈ）， １．１３５ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３１Ｈ）． ^１３Ｃ－ＮＭＲ （７５ Ｈｚ， Ｄ_２Ｏ）： δ ＝ １６６．２９ （１Ｃ）， １６３．６７ （１Ｃ）， １５５．９２ （１Ｃ）， １４３．４０ （１Ｃ）， １４０．０４ （１Ｃ）， １３９．１４ （１Ｃ）， １３８．０２ （１Ｃ）， １２９．０７ （２Ｃ）， １２８．００ （２Ｃ）， ８６．８９ （１Ｃ）， ８６．０７／８５．９６ （１Ｃ）， ７０．５０ （１Ｃ）， ６５．２３／６５．１６ （１Ｃ）， ４１．０１ （３Ｃ）， ４２．９５ （１Ｃ）， ３９．８８ （１Ｃ）， ８．１６ （３Ｃ）． ^３１Ｐ－ＮＭＲ （１００ ｍＨｚ， Ｄ_２Ｏ）： δ ＝ ８．６０ （ｄ， Ｊ ＝ １６．９ Ｈｚ， １Ｐ）， －１１．４０ （ｄ， Ｊ ＝ １６．８ Ｈｚ， １Ｐ）， －２３．００ （ｔ， Ｊ ＝ １７．０ Ｈｚ， １Ｐ）． ＭＳ （ｍ／ｚ） Ｃ_２５Ｈ_２６Ｎ_４Ｏ_１４Ｐ_３に対する計算値， ６７５．４０；実測値 ６７５．１ ［Ｍ－Ｈ］^－ （ＥＳＩ^－）．

【化22】

【0210】

実施例２：修飾デオキシウリジンの調製
ステップ１：５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－５－（Ｎ－カルボキサミド）－２’－デオキシウリジン誘導体（スキーム３、生成物９）の合成：
出発物質である５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－５－トリフルオロエトキシカルボニル－２’－デオキシウリジン（スキーム３、生成物８）をＭａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ（Ｎｏｒｕｍａ，Ｙ．；Ｕｅｎｏ，Ｙ．；Ｍａｔｓｕｄａ，Ａ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９７，２５：２７８４－２７９１、Ｉｔｏ，Ｔ．；Ｕｅｎｏ，Ｙ．；Ｍａｔｓｕｄａ，Ａ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００３，３１：２５１４－２５２３）の手順によって調製した。（８）、必要な芳香族第一級アミン（ＲＣＨ_２ＮＨ_２（１．３当量）、トリエチルアミン（２当量）及び無水アセトニトリルの溶液を不活性雰囲気下、４０～５０℃で１８～２４時間加熱した。薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、５％メタノール／ジクロロメタン）またはＨＰＬＣによって（８）からアミド（９）への定量的変換を確認した。反応混合物を真空濃縮し、残渣を、０～３％メタノール含有１％トリエチルアミン／酢酸エチルの溶離液を使用してシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（Ｓｔｉｌｌ，Ｗ．Ｃ．；Ｋａｈｎ，Ｍ．；Ｍｉｔｒａ，Ａ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７８，４３：２９２３）によって精製した。純粋生成物含有画分を合わせ、蒸発させ、（９）を白色泡状物として収率８０～９０％で得た。

【0211】

ステップ２：５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－５－（Ｎ－カルボキサミド）－２’－デオキシウリジン－３’－ＣＥホスホロアミダイト誘導体（スキーム３、生成物１０）の合成：
マグネチックスターラー付き丸底フラスコ内で、ＤＭＴ－保護されたヌクレオシド（９）をアルゴン下で無水ジクロロメタンに溶かした。反応混合物に、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトライソプロピルホスフィン（１．０５当量）、続いてピリジニウムトリフルオロアセタート（１．１当量）を加えた。反応物を３０～６０分間撹拌し、次いで、薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、溶離液：５％メタノール／９５％ジクロロメタン）によって分析し、反応が完了したことが示された。粗混合物を、１％トリエチルアミン／２０％ヘキサン／７９％酢酸エチルで平衡化されたシリカゲルフラッシュカラムに適用し、生成物を同じ移動相で溶出させ、０℃に冷却し、アルゴンを吹き込み、アルゴンパージした瓶に回収した。生成物含有画分を濃縮し、白色～オフホワイトの泡状物を収率８０％～９０％で得た。

【化23】

【0212】

５’－三リン酸試薬（ＴＰＰ試薬、スキーム３、生成物１２）の調製では、５’Ｏ－ＤＭＴ－保護されたヌクレオシド（スキーム３、生成物９）を無水酢酸含有ピリジンでアセチル化し、続いて、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）でＤＭＴの切断を行った（スキーム３、生成物１１）（例えば、Ｌｅｏｎａｒｄ及びＮｅｅｌｉｍａ、１９９５を参照のこと）。得られた結晶性３’－Ｏ－アセチル化ヌクレオシドを、Ｌｕｄｗｉｇ－Ｅｃｋｓｔｅｉｎプロセス（Ｌｕｄｗｉｇ，Ｊ．ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，５４：６３１）によって粗５’－Ｏ－三リン酸に変換した（スキーム３、生成物１２）。これらの化学修飾ヌクレオチドには一般に、所望の生成物を高純度（９０％超）で得るために二段階精製工程、すなわち、イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）、続く逆相分取ＨＰＬＣを必要とする。

【0213】

実施例２－１：５－［Ｎ－（３，３－ジフェニルプロピル）カルボキサミド］－２’－デオキシウリジン（ＤＰＰｄＵ）誘導体（スキーム３）の調製
５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－５－［Ｎ－（３，３－ジフェニルプロピル）カルボキサミド］－２’－デオキシウリジン（スキーム３、生成物９）の合成：出発物質である５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－５－トリフルオロエトキシカルボニル－２’－デオキシウリジン（スキーム３、生成物８、１０．５５ｇ、１６．６ｍｍｏｌ））を、乾燥したアルゴンパージ済み丸底フラスコに投入した。乾燥アセトニトリル（２２ｍＬ）及び３，３－ジフェニルプロピルアミン（４．３８ｇ、２０．７ｍｍｏｌ、１．２５当量）をフラスコに加え、混合物を撹拌して固形物を溶かした。トリエチルアミン（４．６ｍＬ、３３．２ｍｍｏｌ、２当量）を撹拌混合物に加え、それを水浴に移し、不活性雰囲気下で４０℃にて加熱した。反応の進行を、逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ２４８９検出器を備えた２７９５ ＨＰＬＣ、及びＷａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙカラムを使用、緩衝液Ａ：１００ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム、緩衝液Ｂ：アセトニトリル、グラジエント：７０％緩衝液Ｂ、定組成、３０分かけて）によって追跡した。約６．５時間撹拌した後、分析により、反応が完了していることが示された。混合物を室温でさらに１６時間撹拌し、その時点で撹拌を中止し、溶媒を蒸発させて帯黄色泡状物を回収した。粗混合物を、１％トリエチルアミン／７９％酢酸エチル／２０％ヘキサンで平衡化されたシリカゲルフラッシュカラムに適用した。生成物を、最初は同じ移動相で溶出させ、それを溶出の進行とともに９９％酢酸エチル／１％トリエチルアミン、最終的には２％メタノール／９７％酢酸エチル／１％トリエチルアミンに変更して溶出を完了させた。生成物含有画分を濃縮し、白色～オフホワイトの泡状物を得た（１１．５８ｇ、収率９１％）。^１Ｈ－ＮＭＲ （３００ ｍＨｚ， ＣＤ_３ＣＮ）： δ ＝ ８．６５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ，１Ｈ）， ８．５４ （ｓ， １Ｈ）， ７．４３－７．４８ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２６－７．３８３ （ｍ， １４Ｈ）， ７．１６－７．２３ （ｍ， ３Ｈ）， ６．８７ （ｄｄ， Ｊ_Ａ ＝ ９．０， Ｊ_Ｂ ＝ ２．１ Ｈｚ， ４Ｈ）， ６．１２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２９ （ｔｄ， Ｊ_Ａ ＝ １０．１， Ｊ_Ｂ ＝ ３．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９８－４．０５ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７５ （ｄ， Ｊ ＝ ０．６， ６Ｈ）， ３．２９ （ｄ， Ｊ ＝ ４．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．１９－３．２７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１９－２．４４ （ｍ， ４Ｈ）． ^１３Ｃ－ＮＭＲ （１００ ｍＨｚ， ＣＤ_３ＣＮ）： δ ＝ １６３．２４ （１Ｃ）， ７．４３－７．４８ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２６－７．３８３ （ｍ， １４Ｈ）， ７．１６－７．２３ （ｍ， ３Ｈ）， ６．８７ （ｄｄ， ＪＡ＝９．０， ＪＢ＝２．１ Ｈｚ， ４Ｈ）， ６．１２ （ｔ， Ｊ＝６．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２９ （ｔｄ， Ｊ_Ａ＝１０．１， Ｊ_Ｂ ＝ ３．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９８－４．０５ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７５ （ｄ， Ｊ ＝ ０．６， ６Ｈ）， ３．２９ （ｄ， Ｊ ＝ ４．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．１９－３．２７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１９－２．４４ （ｍ， ４Ｈ）． ）． ＭＳ （ｍ／ｚ） Ｃ_４６Ｈ_４５Ｎ_３Ｏ_８に対する計算値， ７６７．８８；実測値 ７６６．２ ［Ｍ－Ｈ］^－ （ＥＳＩ^－）．

【0214】

５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－４－Ｎ－アセチル－５－［Ｎ－（３，３－ジフェニルプロピル）カルボキサミド］－２’－デオキシウリジン－３’－Ｏ－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－Ｏ－２－シアノエチルホスホルアミダイト）（スキーム３、生成物１０）の合成：マグネチックスターラー付き丸底フラスコ内で、前のステップの生成物（スキーム３、生成物９、１０．３６ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）をアルゴン下で無水ジクロロメタン（３４ｍＬ）に溶かした。反応混合物に、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトライソプロピルホスフィン（４．５ｍＬ、１４．２ｍｍｏｌ、１．０５当量）、続いてトリフルオロ酢酸ピリジン（２．９８ｇ、１４．９ｍｍｏｌ、１．１当量）を加えた。反応物を１．２５時間撹拌し、次いで、薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、溶離液：６０％酢酸エチル／４０％ヘキサン）によって分析し、反応が完了したことが示された。粗混合物を、５０％酢酸エチル／４９％ヘキサン／１％トリエチルアミンで平衡化されたシリカゲルフラッシュカラムに適用し、酢酸エチルの漸増濃度を使用して、最終画分を５９％酢酸エチル／４０％ヘキサン／１％トリエチルアミンを使用して溶出させ、生成物の溶出が達成された。すべての移動相を０℃に冷却し、アルゴンを吹き込み、アルゴンパージした瓶に生成物を回収した。生成物含有画分を濃縮し、白色～オフホワイトの泡状物を得た（８．９７ｇ、収率６９％）。^１Ｈ－ＮＭＲ （３００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １２．９３ （ｓ， １Ｈ）， ８．７０ （ｔ， Ｊ＝５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．４７／８．４６ （ｓ， １Ｈ）， ７．１２－７．４０ （ｍ， １９Ｈ）， ６．８６ （ｄｄ， Ｊ_Ａ ＝ ９．０， Ｊ_Ｂ ＝ ２．４ Ｈｚ， ４Ｈ）， ６．０４－６．１３ （ｍ， １Ｈ）， ４．２８－４．４０ （ｍ， １Ｈ）， ４．０３－４．１２ （ｍ， １Ｈ）， ３．９２－４．０１ （ｍ， １Ｈ）， ３．６９／３．６８ （ｓ， ６Ｈ）， ３．６４－３．７６ （ｍ， １Ｈ）， ３．４０－３．６２ （ｍ， ４Ｈ）， ３．１１－３．３１ （ｍ， ４Ｈ）， ２．７５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．６４ （ｔｄ， Ｊ_Ａ ＝ ６．０， Ｊ_Ｂ ＝ ０．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．３６－２．４７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２６ （ｄｄ， Ｊ_Ａ ＝ １４．４， Ｊ_Ｂ ＝ ７．２ Ｈｚ ２Ｈ）， １．１０ （ｄｄ， Ｊ_Ａ ＝ １２．３， Ｊ_Ｂ ＝ ６．６ Ｈｚ ９Ｈ）， ０．９５ （ｄ， Ｊ ＝ ９．３ Ｈｚ，３Ｈ）． ^３１Ｐ－ＮＭＲ （３００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １４７．２２／１４７．５８ （ｓ， １Ｐ）． ＭＳ （ｍ／ｚ） Ｃ_５５Ｈ_６２Ｎ_５Ｏ_９Ｐに対する計算値， ９６８．１０；実測値 ９６６．３ ［Ｍ－Ｈ］^－ （ＥＳＩ^－）．

【0215】

５－［Ｎ－（３，３－ジフェニルプロピル）カルボキサミド］－３’－Ｏ－アセチル－２’－デオキシウリジンヌクレオシド（スキーム３、生成物１１）の合成：マグネチックスターラー付き丸底フラスコ内で、出発物質（スキーム３、生成物９、０．９５３ｇ、１．２４ｍｍｏｌ）をアルゴン下で無水ピリジン（１０ｍＬ）に溶かした。無水酢酸（１ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ、８．５当量）を撹拌混合物に滴下。反応物を室温で２５時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、８０％酢酸エチル／２０％ヘキサン）によって反応完了を確認した。粗混合物をトルエンからの共蒸発で蒸発させ、淡黄色～黄褐色の泡状物を回収した。残渣を、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ、１０ｍＬ、９５ｍｍｏｌ））に溶かし（Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｎ．Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９５，３６：７８３３）、約５０℃で１８時間加熱した。ＤＭＴ基の完全な切断をＴＬＣ（５％メタノール／ジクロロメタン）によって確認した。赤色溶液を、よく撹拌したメタノール（約５０～７５ｍＬ）に注いでクエンチした。得られた黄色溶液を真空濃縮し、残渣を熱酢酸エチル（１０～２０ｍＬ）に溶かした。生成物は冷却時に結晶化し、得られたスラリーを０℃で撹拌し、その後、濾過して酢酸エチルで洗浄した。３’－Ｏ－アセチル－ヌクレオシド（生成物１１）を白色固体として単離した（０．４０ｇ、収率６４％）。^１Ｈ－ＮＭＲ （４００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １１．９４ （ｓ， １Ｈ）， ８．７７ （ｂｔ， Ｊ ＝ ５．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．７２ （ｓ， １Ｈ）， ７．２２－７．３５ （ｍ， ８Ｈ）， ７．１６ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．１４ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．２２－５．２６ （ｍ， １Ｈ）， ５．１９ （ｔ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６３ （ｄ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．１０ （ｄｄ， Ｊ_Ａ ＝ ５．２， Ｊ_Ｂ ＝ ３．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５８－３．６７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３１－２．４１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２６ （ｄｄ， Ｊ_Ａ ＝ １４．０， Ｊ_Ｂ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．０６ （ｓ， ３Ｈ）． ^１３Ｃ－ＮＭＲ （１００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １７０．４６ （１Ｃ）， １６３．６９ （１Ｃ）， １６１．８１ （１Ｃ）， １５０．０７ （１Ｃ）， １４６．１５ （１Ｃ）， １４４．９９ （２Ｃ）， １２８．９３ （４Ｃ）， １２８．０２ （４Ｃ）， １２６．６１ （２Ｃ）， １０６．１４ （１Ｃ）， ８５．８５ （１Ｃ）， ８５．７７ （１Ｃ）， ７５．２３ （１Ｃ）， ６１．６５ （１Ｃ）， ４８．７０ （１Ｃ）， ３８．０５ （１Ｃ）， ３７．８４ （１Ｃ）， ３４．９７ （１Ｃ）， ２１．３０ （１Ｃ）． ＭＳ （ｍ／ｚ） Ｃ_２７Ｈ_２９Ｎ_３Ｏ_７に対する計算値， ５０７．５４；実測値 ５０６．１ ［Ｍ－Ｈ］^－ （ＥＳＩ^－）．

【0216】

５－［Ｎ－（３，３－ジフェニルプロピル）カルボキサミド］－２’－デオキシウリジン－５’－Ｏ－三リン酸（トリス－トリエチルアンモニウム塩）（スキーム３、生成物１２）の合成：３’－Ｏ－アセチル－ヌクレオシド（１１）から、５００μｍｏｌスケール（５×）のＬｕｄｗｉｇ及びＥｃｋｓｔｅｉｎの手順（Ｌｕｄｗｉｇ，Ｊ．ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９，５４：６３１）により三リン酸（１２）を合成した。粗三リン酸生成物を、アンモノリシス及び蒸発の後、一般手順（上記）に記載のように陰イオン交換クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーによって精製した。［ε _ｅｓｔ． １３．７００ ｃｍ^－１ Ｍ^－１］単離された精製生成物は５９．８μｍｏｌであった（収率１２％）。^１Ｈ－ＮＭＲ （３００ ｍＨｚ， Ｄ_２Ｏ）： δ ＝ ７．９５ （ｓ， １Ｈ）， ７．２２－７．２８ （ｍ， ４Ｈ）， ７．１１－７．１９ （ｍ， ４Ｈ）， ６．９６－７．０５ （ｄ， ２Ｈ）， ６．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５１ （五重線， Ｊ ＝ ３．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１０－４．１８ （ｍ， ３Ｈ）， ３．９２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．１７－３．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．９０ （ｑ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， １９Ｈ）， ２．２５－２．３８ （ｍ， ３Ｈ）， ２．１１－２．２２ （ｍ， １Ｈ）， １．１１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２９Ｈ）． ^３１Ｐ－ＮＭＲ （１００ ｍＨｚ， Ｄ_２Ｏ）： δ ＝ －９．９３ （ｄ， Ｊ ＝ ２０．３ Ｈｚ， １Ｐ）， －１１．６３ （ｄ， Ｊ ＝ ２０．９ Ｈｚ， １Ｐ）， －１１．６３ （ｄ， Ｊ ＝ ２０．９ Ｈｚ， １Ｐ）． ＭＳ （ｍ／ｚ） Ｃ_２５Ｈ_２９Ｎ_３Ｏ_１５Ｐ_３に対する計算値， ７０４．４３；実測値 ７０４．１Ｍ－Ｈ］^－ （ＥＳＩ^－）．

【0217】

実施例２－１：５－｛Ｎ－［２－（４－ビフェニルエチル）カルボキサミド］｝－２’－デオキシウリジン（ＢＰＥｄＵ）誘導体（スキーム３）の調製
５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－５－｛Ｎ－［２－（４－ビフェニルエチル）カルボキサミド］｝－２’－デオキシウリジン（スキーム３、生成物９）の合成：出発物質である５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－５－トリフルオロエトキシカルボニル－２’－デオキシウリジン（スキーム３、生成物８、１０．４５ｇ、１５．９ｍｍｏｌ））を、乾燥したアルゴンパージ済み丸底フラスコに投入した。乾燥アセトニトリル（２０ｍＬ）及び２－（４－ビフェニル）エチルアミン（３．８１ｇ、１９．１ｍｍｏｌ、１．２当量）をフラスコに加え、混合物を撹拌して固形物を溶かした。トリエチルアミン（４．４ｍＬ、３１．８ｍｍｏｌ、２当量）を撹拌混合物に加え、それを水浴に移し、不活性雰囲気下で４０℃にて加熱した。反応の進行を、薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、溶離液：８％メタノール／ジクロロメタン）及び逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ２４８９検出器を備えた２７９５ ＨＰＬＣ、及びＷａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙカラムを使用、緩衝液Ａ：１００ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム、緩衝液Ｂ：アセトニトリル、グラジエント：７０％緩衝液Ｂ、定組成、３０分かけて）によって追跡した。約６時間撹拌した後、分析により、反応がまだ不完全であることが示された。混合物を室温でさらに１６時間撹拌して再分析し、完了が確認された。撹拌を中止し、溶媒を蒸発させて帯黄色泡状物を回収した。粗混合物を、１％トリエチルアミン／７９％酢酸エチル／２０％ヘキサンで平衡化されたシリカゲルフラッシュカラムに適用した。生成物を、最初は同じ移動相で溶出させ、それを溶出の進行とともに０～２％メタノール／１％トリエチルアミン／酢酸エチルに変更して溶出を完了させた。生成物含有画分を濃縮し、白色～オフホワイトの泡状物を得た（１０．８９ｇ、収率９１％）。^１Ｈ－ＮＭＲ （３００ ｍＨｚ， ＣＤ_３ＣＮ）： δ ＝ ８．６９ （ｔ， Ｊ＝５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．５７ （ｓ， １Ｈ）， ７．５７－７．６７ （ｍ， ４Ｈ）， ７．４４－７．５０ （ｍ， ４Ｈ）， ７．２９－７．４０ （ｍ， ８Ｈ）， ７．２０－７．２６ （ｍ， １Ｈ）， ６．８６－６．９２ （ｍ， ４Ｈ）， ６．１１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２８ （ｄｔ， Ｊ_Ａ ＝ ７．５， Ｊ_Ｂ ＝ ３．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０１ （ｄｄ， ＪＡ＝８．３， ＪＢ＝４．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６１ （ｑ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３０ （ｄ， Ｊ ＝ ４．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．９０ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３３－２．４３ （ｍ， １Ｈ）， ２．１９－２．２９ （ｍ， １Ｈ）． ^１３Ｃ－ＮＭＲ （１００ ｍＨｚ， ＣＤ_３ＣＮ）： δ ＝ １６３．０２ （１Ｃ）， １６１．５９ （１Ｃ）， １５８．６５ （１Ｃ）， １４９．４５ （１Ｃ）， １４５．５３ （１Ｃ）， １４５．０８ （１Ｃ）， １４０．６１ （１Ｃ）， １３８．９４ （１Ｃ）， １３８．８３ （１Ｃ）， １３５．８８ （１Ｃ）， １３５．８７ （１Ｃ）， １３０．０９ （１Ｃ）， １３０．０８ （１Ｃ）， １２９．３２ （２Ｃ）， １２８．８８ （２Ｃ）， １２８．０４ （２Ｃ）， １２７．８８ （２Ｃ）， １２７．２６ （１Ｃ）， １２６．９５ （２Ｃ）， １２６．７９ （２Ｃ）， １２６．７５ （１Ｃ）， １１３．１３ （２Ｃ）， １１３．１１ （２Ｃ）， １０５．７５ （１Ｃ）， ８６．４２ （１Ｃ）， ８６．３７ （１Ｃ）， ８６．３１ （１Ｃ）， ７１．０３ （１Ｃ）， ６３．５５ （１Ｃ）， ５４．８９ （２Ｃ）， ４０．３４ （１Ｃ）， ４０．２５ （１Ｃ）， ３４．９２ （１Ｃ）． ＭＳ （ｍ／ｚ） Ｃ_４５Ｈ_４３Ｎ_３Ｏ_８に対する計算値， ７５３．８５；実測値 ７４５．２ ［Ｍ－Ｈ］^－ （ＥＳＩ^－）．

【0218】

５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－５－｛Ｎ－［２－（４－ビフェニルエチル）カルボキサミド］｝－２’－デオキシウリジン－３’－Ｏ－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－Ｏ－２－シアノエチルホスホルアミダイト）（スキーム３、生成物１０）の合成：マグネチックスターラー付き丸底フラスコ内で、前のステップの生成物（スキーム３、生成物９、１８．７６ｇ、２４．９ｍｍｏｌ）をアルゴン下で無水ジクロロメタン（６２ｍＬ）に溶かした。反応混合物に、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトライソプロピルホスフィン（８．３ｍＬ、２６．１ｍｍｏｌ、１．０５当量）、続いてトリフルオロ酢酸ピリジン（５．４０ｇ、１４．９ｍｍｏｌ、１．１当量）を加えた。反応物を３０分間撹拌し、次いで、薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、溶離液：５％メタノール／ジクロロメタン）によって分析し、反応が完了したことが示された。粗混合物を、６９％酢酸エチル／３０％ヘキサン／１％トリエチルアミンで平衡化されたシリカゲルフラッシュカラムに適用し、酢酸エチルの漸増濃度を使用して、最終画分を７９％酢酸エチル／２０％ヘキサン／１％トリエチルアミンを使用して溶出させ、生成物の溶出が達成された。すべての移動相を０℃に冷却し、アルゴンを吹き込み、アルゴンパージした瓶に生成物を回収した。生成物含有画分を濃縮し、白色～オフホワイトの泡状物を得た（２０．９７ｇ、収率８８％）。^１Ｈ－ＮＭＲ （４００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １１．９３ （ｓ， １Ｈ）， ８．７８ （ｔ， Ｊ＝５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．５２／８．５０ （ｓ，１Ｈ）， ７．５５－７．６８ （ｍ， ４Ｈ）， ７．１１－７．４９ （ｍ， １６Ｈ）， ６．８４－６．９２ （ｍ， ４Ｈ）， ６．０３－６．１３ （ｍ， １Ｈ）， ４．２９－４．４１ （ｍ， １Ｈ）， ４．０７－４．１３ （ｍ， １Ｈ）， ３．７３ （ｓ， ６Ｈ）， ３．４２－３．７０ （ｍ， ６Ｈ）， ３．１８－３．３１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ，２Ｈ）， ２．７５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６４ （ｔｄ， Ｊ_Ａ＝ ６．０， Ｊ_Ｂ ＝ ０．９ Ｈｚ， １．５Ｈ）， ２．３６－２．４６ （ｍ， ２Ｈ）， １．１０ （ｄｄ， Ｊ_Ａ ＝ １２．３， Ｊ_Ｂ ＝ ６．６ Ｈｚ， １２Ｈ）， ０．９６ （ｄ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， ２Ｈ）． ^３１Ｐ－ＮＭＲ （４００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １４７．３２／１４７．６６ （ｓ， １Ｐ）． ＭＳ （ｍ／ｚ） Ｃ_５４Ｈ_６０Ｎ_５Ｏ_９Ｐに対する計算値， ９５４．０７；実測値 ９５２．６ ［Ｍ－Ｈ］^－ （ＥＳＩ^－）．

【0219】

５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－５－｛Ｎ－［２－（４－ビフェニル）エチルカルボキサミド］｝－３’－Ｏ－アセチル－２’－デオキシウリジンヌクレオシド（スキーム３、生成物１１）の合成：マグネチックスターラー付き丸底フラスコ内で、出発物質（スキーム３、生成物９、０．９８ｇ、１．３０ｍｍｏｌ）をアルゴン下で無水ピリジン（１０ｍＬ）に溶かした。無水酢酸（１ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ、８．１当量）を撹拌混合物に滴下。反応物を室温で２５時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、８０％酢酸エチル／２０％ヘキサン）によって反応完了を確認した。粗混合物を蒸発させて淡黄色～黄褐色の泡状物を回収した。残渣を、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（１０ｍＬ、９５ｍｍｏｌ））に溶かし（Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｎ．Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９５，３６：７８３３）、約５０℃で１７時間加熱した。ＤＭＴ基の完全な切断をＴＬＣ（５％メタノール／ジクロロメタン）によって確認した。赤色溶液を、よく撹拌したメタノール（約２５～３０ｍＬ）に注いでクエンチした。固形物がほぼ直ちに形成し始め、混合物を約１８時間撹拌し、その時点で、生成物を、冷イソプロピルエーテルを使用して濾過し、フィルターケーキを洗浄することによって回収した。３’－Ｏ－アセチル－ヌクレオシド（生成物１１）を白色固体として単離した（０．６８０ｇ、約収率１００％）。^１Ｈ－ＮＭＲ （５００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １１．９９ （ｓ， １Ｈ）， ８．８０ （ｔ， Ｊ ＝ ５．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．７６ （ｓ， １Ｈ）， ７．６４ （ｄ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．６０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３１－７．３７ （ｍ， ４Ｈ）， ６．１４ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．２２－５．２６ （ｍ， １Ｈ）， ５．１９ （ｔ， Ｊ ＝ ４．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０９ （ｄ， Ｊ＝１．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６２ （ｄｄ， Ｊ_Ａ ＝ ７．５， Ｊ_Ｂ ＝ ４．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６２ （ｄｄ， Ｊ_Ａ ＝ ７．５， Ｊ_Ｂ ＝ ４．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．８４ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３０－２．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．０６ （ｓ， ３Ｈ）． ^１３Ｃ－ＮＭＲ （１００ ｍＨｚ， ＣＤ_３ＣＮ）： δ ＝ １７０．５０ （１Ｃ）， １６５．５９ （１Ｃ）， １６１．８５ （１Ｃ）， １５０．０３ （１Ｃ）， １４６．３０ （１Ｃ）， １４０．４２ （１Ｃ）， １３９．０５ （１Ｃ）， １３８．５４ （１Ｃ）， １２９．７２ （２Ｃ）， １２９．３７ （１Ｃ）， １２７．７０ （１Ｃ）， １２７．１４ （２Ｃ）， １２６．９６ （２Ｃ）， １０６．０３ （１Ｃ）， ８５．８７ （１Ｃ）， ８５．８０ （１Ｃ）， ７５．２５ （１Ｃ）， ６１．６５（１Ｃ）， ４０．５７ （１Ｃ）， ３８．１０ （１Ｃ）， ３５．３３ （１Ｃ）， ２１．３０ （１Ｃ）． ＭＳ （ｍ／ｚ） Ｃ_２６Ｈ_２７Ｎ_３Ｏ_７に対する計算値， ４９３．５２；実測値 ４９２．１ ［Ｍ－Ｈ］^－ （ＥＳＩ^－）．

【0220】

５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－５－｛Ｎ－［２－（４－ビフェニルエチル）カルボキサミド］｝－２’－デオキシウリジン－５’－Ｏ－三リン酸（トリス－トリエチルアンモニウム塩）（スキーム３、生成物１２）の合成：３’－Ｏ－アセチル－ヌクレオシド（１１）から、５００μｍｏｌスケール（５×）のＬｕｄｗｉｇ及びＥｃｋｓｔｅｉｎの手順（Ｌｕｄｗｉｇ，Ｊ．ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９，５４：６３１）により三リン酸（１２）を合成した。粗三リン酸生成物を、アンモノリシス及び蒸発の後、一般手順（上記）に記載のように陰イオン交換クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーによって精製した。［ε _ｅｓｔ． １３．７００ ｃｍ^－１ Ｍ^－１］単離された精製生成物は１８２μｍｏｌ（収率３５．９％）であった。^１Ｈ－ＮＭＲ （３００ ｍＨｚ， Ｄ_２Ｏ）： δ ＝ ８．３８ （ｓ， １Ｈ）， ７．５５－７．６１ （ｍ， ５Ｈ）， ７．４０－７．４６ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３２－７．３７ （ｍ， ３Ｈ）， ６．１１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５３ （五重線， Ｊ ＝ ３．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１６－４．２１ （ｍ， １Ｈ）， ４．０９－４．１５ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．１４ （ｑ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２４Ｈ）， ２．８９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２５－２．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２６ （ｍ， １Ｈ）， １．２２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３６Ｈ）． ^３１Ｐ－ＮＭＲ （１００ ｍＨｚ， Ｄ_２Ｏ）： δ ＝ －１０．９１ （ｄ， Ｊ ＝ １９．８ Ｈｚ， １Ｐ）， －１１．４１ （ｄ， Ｊ ＝ １９．９ Ｈｚ， １Ｐ）， －２３．３２ （ｔ， Ｊ ＝ １９．８ Ｈｚ， １Ｐ）． ＭＳ （ｍ／ｚ） Ｃ_２４Ｈ_２７Ｎ_３Ｏ_１５Ｐ_３に対する計算値， ６９０．４１；実測値 ６９０．１ ［Ｍ－Ｈ］^－ （ＥＳＩ^－）．

【0221】

実施例２－３．５－［Ｎ－（４－フェノキシフェニルメチル）カルボキサミド］－２’－デオキシウリジン（ＰＯＰｄＵ）誘導体の調製（スキーム３）：
５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－５－［Ｎ－（４－フェノキシフェニルメチル）カルボキサミド］－２’－デオキシウリジン（スキーム３、生成物９）の合成：出発物質である５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－５－トリフルオロエトキシカルボニル－２’－デオキシウリジン（スキーム３、生成物８、２８．４７ｇ、４３．４ｍｍｏｌ））を、乾燥したアルゴンパージ済み丸底フラスコに投入した。乾燥アセトニトリル（５４ｍＬ）及び４－フェノキシフェニルメチルアミン（１０．３８ｇ、５２．１ｍｍｏｌ、１．２当量）をフラスコに加え、混合物を撹拌して固形物を溶かした。トリエチルアミン（１２ｍＬ、８６．８ｍｍｏｌ、２当量）を撹拌混合物に加えた。反応物を不活性雰囲気下で室温にて２２時間撹拌した。その時点で、反応の進行を逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ２４８９検出器を備えた２７９５ ＨＰＬＣ、及びＷａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙカラムを使用、緩衝液Ａ：１００ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム、緩衝液Ｂ：アセトニトリル、グラジエント：７０％緩衝液Ｂ、定組成、３０分かけて）によって評価し、完了していることが分かった。撹拌を中止し、溶媒を蒸発させて帯黄色泡状物を回収した。粗混合物を、９９％酢酸エチル／１％トリエチルアミンで平衡化されたシリカゲルフラッシュカラムに適用した。生成物を、最初は同じ移動相で溶出させ、それを溶出の進行とともに０～１．５％メタノール／１％トリエチルアミン／酢酸エチルに変更して溶出を完了させた。生成物含有画分を濃縮し、白色～オフホワイトの泡状物を得た（２８．８９ｇ、収率８８％）。^１Ｈ－ＮＭＲ （４００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ ９．２５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．４８ （ｓ， １Ｈ）， ７．４０－７．２２ （ｍ， １５Ｈ）， ７．１５－７．１９ （ｍ， １Ｈ）， ７．０８－７．１７ （ｍ， １Ｈ）， ６．９２－７．００ （ｍ， ６Ｈ）， ６．８４－６．９０ （ｍ， ４Ｈ）， ６．１０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４０－４．５２ （ｍ， ２Ｈ）， ４．１１ （ｄｔ， Ｊ_Ａ ＝ １０．４， Ｊ_Ｂ ＝ ４．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９５ （ｄｄ， Ｊ_Ａ ＝ ８．６， Ｊ_Ｂ ＝ ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．７０ （ｄ， Ｊ＝ １．６， ６Ｈ）， ３．１９ （ｄ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２５－２．３３ （ｍ， １Ｈ）， ２．１６－２．２４ （ｍ， １Ｈ）． ^１３Ｃ－ＮＭＲ （１００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １６３．３９ （１Ｃ）， １６１．２１ （１Ｃ）， １５８．４９ （１Ｃ）， １５８．４７ （１Ｃ）， １５７．３１ （１Ｃ）， １５５．８８ （１Ｃ）， １５０．４２ （１Ｃ）， １４５．８３ （１Ｃ）， １４５．３４ （１Ｃ）， １３５．９３（１Ｃ）， １３５．８１ （１Ｃ）， １３４．９８ （１Ｃ）， １３０．４５ （２Ｃ）， １３０．２６ （２Ｃ）， １３０．１５ （２Ｃ）， １２９．５４ （２Ｃ）， １２３．６３ （１Ｃ）， １１８．７４ （２Ｃ）， １１８．６９ （２Ｃ）， １１３．６８／ １１３．６７ （４Ｃ）， １０５．５６ （１Ｃ）， ８６．３８ （１Ｃ）， ８６．３１ （１Ｃ）， ８６．２０ （１Ｃ）， ７０．８８ （１Ｃ）， ６４．０９ （１Ｃ）， ５５．４１／５５．４０ （２Ｃ）， ４４．８５ （１Ｃ）， ４０．５６ （１Ｃ）． ＭＳ （ｍ／ｚ） Ｃ_４４Ｈ_４１Ｎ_３Ｏ_９に対する計算値， ７５５．８２；実測値 ７５４．２ ［Ｍ－Ｈ］^－ （ＥＳＩ^－）．

【0222】

５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－５－［Ｎ－（４－フェノキシフェニルメチル）カルボキサミド］－２’－デオキシウリジン－３’－Ｏ－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－Ｏ－２－シアノエチルホスホルアミダイト）（スキーム３、生成物１０）の合成：マグネチックスターラー付き丸底フラスコ内で、前のステップの生成物（スキーム３、生成物９、２９．１４ｇ、３８．６ｍｍｏｌ）をアルゴン下で無水ジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶かした。反応混合物に、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトライソプロピルホスフィン（１２ｍＬ、４０．５ｍｍｏｌ、１．０５当量）、続いてトリフルオロ酢酸ピリジン（８．３０ｇ、４３．０ｍｍｏｌ、１．１当量）を加えた。反応物を３時間撹拌し、次いで、薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、溶離液：５５％酢酸エチル／４５％ヘキサン）によって分析し、反応が完了したことが示された。粗混合物を、５９％酢酸エチル／４０％ヘキサン／１％トリエチルアミンで平衡化されたシリカゲルフラッシュカラムに適用し、同じ移動相で生成物の溶出が達成され、それを０℃に冷却し、アルゴンを吹き込み、アルゴンパージした瓶に生成物を回収した。生成物含有画分を濃縮し、白色～オフホワイトの泡状物を得た（３０．２５ｇ、収率８２％）。^１Ｈ－ＮＭＲ （３００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １１．９８ （ｓ， １Ｈ）， ９．０９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．５３ ８．５２ （ｓ， １Ｈ）， ７．０８－７．４０ （ｍ， １４Ｈ）， ６．９１－７．００ （ｍ， ４Ｈ）， ６．８２－６．８７ （ｍ， ４Ｈ）， ６．０４－６．１３ （ｍ， １Ｈ）， ４．２９－４．５５ （ｍ， ３Ｈ）， ４．０５－４．１４ （ｍ， １Ｈ）， ３．７１ （ｂｓ， ６Ｈ）， ３．４６－３．７０ （ｍ， ４Ｈ）， ３．１８－３．３１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．０， １Ｈ）， ２．６４ （ｔｄ， Ｊ_Ａ ＝ ６．０， Ｊ_Ｂ ＝ ０．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．３７－２．４８ （ｔ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ０．９７ （ｄ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， ２Ｈ）． ^３１Ｐ－ＮＭＲ （３００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １４７．３２／ １４７．６５ （ｓ， １Ｐ）． ＭＳ （ｍ／ｚ） Ｃ_５３Ｈ_５８Ｎ_３Ｏ_１０Ｐに対する計算値， ９５６．０５；実測値 ９５４．３ ［Ｍ－Ｈ］^－（ＥＳＩ^－）．

【0223】

５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－５－［Ｎ－（４－フェノキシフェニルメチル）カルボキサミド］－２’－デオキシウリジン（スキーム３、生成物１１）の合成：マグネチックスターラー付き丸底フラスコ内で、出発物質（スキーム３、生成物９、０．７９ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）をアルゴン下で無水ピリジン（１０ｍＬ）に溶かした。無水酢酸（１ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ、１０当量）を撹拌混合物に滴加した。反応物を室温で２０時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、８０％酢酸エチル／２０％ヘキサン）によって反応完了を確認した。粗混合物をトルエンとの共蒸発で蒸発させ、淡黄色～黄褐色の泡状物を回収した。残渣を、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ、１０ｍＬ、９５ｍｍｏｌ））に溶かし（Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｎ．Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９５，３６：７８３３）、約５０℃で１６時間加熱した。ＤＭＴ基の完全な切断をＴＬＣ（５％メタノール／ジクロロメタン）によって確認した。赤色溶液を、よく撹拌したメタノール（約２０～３０ｍＬ）に注いでクエンチした。少数の固形物がほぼ直ちに形成し始めた。混合物の体積は蒸発によって約５０％減少し、混合物を約１時間撹拌した。その時点までには、混合物は固形物で粘度が高くなっており、生成物を、冷イソプロピルエーテルを使用して濾過し、フィルターケーキを洗浄することによって回収した。３’－Ｏ－アセチル－ヌクレオシド（生成物１１）を白色固体として単離した（０．３６ｇ、収率６９％）。^１Ｈ－ＮＭＲ （４００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １１．９４ （ｓ， １Ｈ）， ９．１２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．７９ （ｓ， １Ｈ）， ７．２７－７．４１ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．１２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９２－７．０２ （ｍ， ４Ｈ）， ６．１５ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．２４ （ｂｔ， Ｊ ＝ ２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．１９ （ｂｔ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４６ （ｄ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．１０ （ｂｄｄ， Ｊ_Ａ ＝ ５．０， Ｊ_Ｂ ＝ ３．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５８－３．６８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２９－２．４２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．０６ （ｓ， ３Ｈ）． ）． ^１３Ｃ－ＮＭＲ （１００ ｍＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ＝ １７０．４８ （１Ｃ）， １６３．６３ （１Ｃ）， １６１．９６ （１Ｃ）， １５７．３２ （１Ｃ）， １５５．９１ （１Ｃ）， １５５．９１ （１Ｃ）， １４６．４９ （１Ｃ）， １３４．７８ （１Ｃ）， １３０．４７ （２Ｃ）， １２９．６０ （２Ｃ）， １２３．７５ （１Ｃ）， １１９．２０ （２Ｃ）， １１８．８３ （２Ｃ）， １０６．１０ （１Ｃ）， ８５．９１ （１Ｃ）， ８５．８１ （１Ｃ）， ７５．２２ （１Ｃ）， ６１．６５ （１Ｃ）， ４８．０４ （１Ｃ）， ３８．１２ （１Ｃ）， ３７．８４ （１Ｃ）， ３４．９７ （１Ｃ）， ２１．３０ （１Ｃ）． ＭＳ （ｍ／ｚ） Ｃ_２５Ｈ_２５Ｎ_３Ｏ_８に対する計算値， ４９５．４９；実測値 ４９４．１ ［Ｍ－Ｈ］^－ （ＥＳＩ^－）．

【0224】

５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－５－｛Ｎ－［２－（４－ビフェニルエチル）カルボキサミド］｝－２’－デオキシウリジン－５’－Ｏ－三リン酸（トリス－トリエチルアンモニウム塩）（スキーム３、生成物１２）の合成：３’－Ｏ－アセチル－ヌクレオシド（１１）から、５００μｍｏｌスケール（５×）のＬｕｄｗｉｇ及びＥｃｋｓｔｅｉｎの手順（Ｌｕｄｗｉｇ，Ｊ．ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９，５４：６３１）により三リン酸（１２）を合成した。粗三リン酸生成物を、アンモノリシス及び蒸発の後、一般手順（上記）に記載のように陰イオン交換クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーによって精製した。［ε _ｅｓｔ． １３．７００ ｃｍ^－１ Ｍ^－１］単離された精製生成物は１９２μｍｏｌ（収率３８．２％）であった。^１Ｈ－ＮＭＲ （３００ ｍＨｚ， Ｄ_２Ｏ）： δ ＝ ８．３８ （ｓ， １Ｈ）， ７．１４－７．２６ （ｍ， ４Ｈ）， ７．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７６－６．８２ （ｍ， ４Ｈ）， ６．０９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５ （五重線， Ｊ ＝ ３．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３９ （ｑ， Ｊ ＝ １５．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．６０ （ｄｄ， Ｊ_Ａ＝１５．１， Ｊ_Ｂ ＝ ３．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５－４．１７ （ｍ， ３Ｈ）， ３．０８ （ｑ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２３Ｈ）， ２．２６－２．３７ （ｍ， ２Ｈ）， １．１６ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ３５Ｈ）． ^１３Ｃ－ＮＭＲ （１００ ｍＨｚ， Ｄ_２Ｏ）： δ ＝ １６３．４９ （１Ｃ）， １５６．６０ （１Ｃ）， １５５．８２ （１Ｃ）， １５０．３８ （１Ｃ）， １４６．４５ （１Ｃ）， １３３．４１（１Ｃ）， １３０．０１ （２Ｃ）， １２９．０４ （２Ｃ）， １２３．７６ （１Ｃ）， １１８．８７ （２Ｃ）， １１８．６０ （２Ｃ）， １０５．７０ （１Ｃ）， １０１．５３ （１Ｃ）， ８６．９１ （１Ｃ）， ８５．９２／ ８５．８１ （１Ｃ）， ７０．８６ （１Ｃ）， ６５．４９ （１Ｃ）， ４６．５９ （８Ｃ）， ４２．２８ （１Ｃ）， ３８．７４ （１Ｃ）， ２２．７４ （１Ｃ）， ８．１９ （８Ｃ）． ＭＳ （ｍ／ｚ） Ｃ_２５Ｈ_２５Ｎ_３Ｏ_１６Ｐ_３に対する計算値 ６９２．３８；実測値 ６９２．０ ［Ｍ－Ｈ］^－ （ＥＳＩ^－）．

【0225】

実施例３：５位修飾ピリミジンヌクレオチドを有するアプタマーの選択
本実施例では、ビフェニル修飾ｄＵライブラリーを単一フェニル修飾ヌクレオチドライブラリーと直接比較して使用する、ＤＮＡアプタマーの選択及び生成のための代表的方法を提供する。

【0226】

候補混合物の調製
部分的ランダム化ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの候補混合物を、ビオチン化ｓｓＤＮＡテンプレートにアニールしたＤＮＡプライマー（下表１に示す）のポリメラーゼ伸長によって調製した。候補混合物には、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰと、５－（Ｎ－３－フェニルプロピルカルボキサミド）－２’－デオキシウリジン三リン酸（ＰＰ－ｄＵＴＰ）、５－［Ｎ－（４－フェニルベンジル）カルボキサミド］－２’－デオキシウリジン三リン酸（ＰＢｎ－ｄＵＴＰ）、５－［Ｎ－（４－フェノキシベンジル）カルボキサミド］－２’－デオキシウリジン三リン酸（ＰＯＰ－ｄＵＴＰ）、５－｛Ｎ－［（１，１’－ビフェニル）－４－イル）エチル］カルボキシアミド｝－２’－デオキシウリジン三リン酸（ＢＰＥ－ｄＵＴＰ）または５－［Ｎ－（３，３－ジフェニルプロピル）カルボキサミド］－２’－デオキシウリジン三リン酸（ＤＰＰ－ｄＵＴＰ））のいずれかと、を含有する４０ヌクレオチドのランダム化カセットが含有された。

【表1】

【0227】

９２００マイクロリットルの、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｐｌｕｓ ＵｌｔｒａＬｉｎｋ Ｒｅｓｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ）の５０％スラリーを３回洗浄し、４０ｍＬの１６ｍＭ ＮａＣｌで１回洗浄した。レジンを最終体積８．５ｍＬの１６ｍＭ ＮａＣｌに再懸濁させた。２つのビオチン残基（配列中Ｂ’と表記）と４０のランダム化位置（配列中Ｎ_４０と表記）とを有するテンプレート１（配列番号１）を３５２ナノモルにて洗浄済みＵｌｔｒａＬｉｎｋ ＳＡビーズに加え、３７℃で３０分間回転させた。その後、ビーズを１６ｍＭ ＮａＣｌで３回洗浄した。洗浄と洗浄の合間に、ビーズを遠心分離により回収した。ビーズはこの時点で捕捉したテンプレートを含有しており、これらのビーズを、１．１２５ｍＬの伸長反応緩衝液［１８ｎｍｏｌのプライマー１（配列番号２）、１×ＳＱ２０緩衝液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ＭｇＳＯ_４、６ｍＭ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．００１％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、１１２ユニットのＫＯＤ ＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＭＤ ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）、ならびに１ｍＭずつの、ＰＰ－ｄＵＴＰ、ＰＢｎ－ｄＵＴＰ、ＰＯＰ－ｄＵＴＰ、ＢＰＥ－ｄＵＴＰまたはＤＰＰ－ｄＵＴＰのうちの１つ、及びｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、を含有］に懸濁させた。ビーズを６８℃で２時間インキュベートした。その後、ビーズを１６ｍＭ ＮａＣｌで３回洗浄した。アプタマーライブラリーを、２ｍＬの２０ｍＭ ＮａＯＨでビーズから溶出させた。溶出したライブラリーを直ちに、５２μＬの１Ｎ ＨＣｌ及び１００μＬ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）及び２μＬの１０％ＴＷＥＥＮ－２０で中和した。ライブラリーをＡＭＩＣＯＮ Ｕｌｔｒａｃｅｌ ＹＭ－３フィルターで約０．３２ｍＬ～０．５２ｍＬに濃縮し、ライブラリーの濃度を紫外吸収分光法によって決定した。

【0228】

標的タンパク質の固定化
ＳＥＬＥＸで使用される以下のタンパク質標的を商業ベンダーから購入した：インターロイキン－３３（ＩＬ－３３）タンパク質（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、カタログ番号Ｃ２３３）、ＸＩＡＰタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８９５－ＸＢ－０５０）、ＴＮＦ－αタンパク質（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ ＴＮＡ－５２２８）、ＫＲＡＳ（Ｋ－Ｒａｓ）タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１２２５９－Ｈ０７Ｅ）。Ｈｉｓタグの付いた生成標的タンパク質を、ＳＥＬＥＸ（ラウンド１～７）用にＨｉｓ－ｔａｇ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）常磁性ビーズ（ＭｙＯｎｅ ＳＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、または以下、Ｈｉｓビーズと呼ぶ）に固定化した。ビーズ（４０ｍｇ）は、ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整した４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－エタンスルホン酸）緩衝液、１０２ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２及び０．０１％ＴＷＥＥＮ２０）で構成される２０ｍＬのＳＢ１８Ｔ０．０１緩衝液で３回洗浄することによって調製された。最後に、ビーズをＳＢ１８Ｔ０．０１中に２．５ｍｇ／ｍＬで懸濁させ、使用まで４℃で保存した。

【0229】

低解離速度濃縮工程によるアプタマーの選択
親和性及び低解離速度についての選択に関して合計７ラウンドのＳＥＬＥＸ法が完了した。バックグラウンドを抑制するため、及びタンパク質に非特異的に結合しているアプタマーが取得される可能性を減らすため、各ラウンドの前に対抗選択を実施した。対抗選択を以下のとおり実施した。

【0230】

ラウンド１では、約１ｎｍｏｌｅのＤＮＡを含むＳＢ１８Ｔ０．０１を含有する１００μＬのＤＮＡ候補混合物を９５℃で５分間加熱し、その後、７０℃に５分間、次いで４８℃に５分間冷却した後、３７℃でのブロックに５分間移した。その後、試料を、１０μＬのタンパク質競合混合物（０．１％ＨＳＡ、１０μＭのカゼイン、及び１０μＭプロトロンビンを含むＳＢ１８Ｔ０．０１）、及びＨＥＸＡ－Ｈｉｓ（Ａｎａｓｐｅｃ、カタログ番号２４４２０）でコートした０．０２５ｍｇ（１０μＬ）のＨｉｓビーズと合わせ、混合しながら３７℃で１０分間インキュベートした。ビーズを磁気分離によって除去した。

【0231】

ラウンド２～７では、前のラウンドから得られたＤＮＡ候補混合物の６５μＬのアリコート（前のラウンドから得られたｅＤＮＡの６５％）を、１６μＬの５×ＳＢ１８Ｔ０．０１と混合した。試料を９５℃まで３分間加熱し、０．１℃／秒の速度で３７℃まで冷却した。その後、試料を、９μＬのタンパク質競合混合物（０．１％ＨＳＡ、１０μＭのカゼイン、及び１０μＭプロトロンビンを含むＳＢ１８Ｔ０．０１）、及び０．０２５ｍｇ（１０ｕＬ）のＨｉｓビーズと合わせ、混合しながら３７℃で１０分間インキュベートした。ビーズを磁気分離によって除去した。

【0232】

最初の対抗選択に続いて、標的タンパク質を、ラウンド１の選択工程のためにＨｉｓビーズに事前に固定化した。これを達成するために、０．１２５ｍｇのタンパク質Ｈｉｓビーズを５０ｐｍｏｌｅの標的タンパク質と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。ビーズをＳＢ１８Ｔ０．０１で洗浄することによって未結合標的を除去した。対抗選択されたＤＮＡ候補混合物（１００μＬ）をビーズに加え、混合しながら３７℃で６０分間インキュベートした。最初のラウンドでは低解離速度濃縮プロセスは使用せず、ビーズを１００μＬのＳＢ１８Ｔ０．０１で５回、簡易洗浄した。洗浄に続き、１７０μＬの２ｍＭ ＮａＯＨを加え、混合しながら３７℃で５分間インキュベートすることによって、結合したアプタマーをビーズから溶出させた。ビーズの磁気分離後にアプタマー含有溶出液（１７０μＬ）を新しいチューブに移し、４０μＬの中和緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８ｍＭ ＨＣｌ）を加えて溶液を中和した。

【0233】

ラウンド２～７では、ＤＮＡ候補混合物及び以下に記載の標的タンパク質を用いて選択を実施し、並行して、ＤＮＡ候補混合物は用いるが標的タンパク質は用いずに同一の選択を実施した。標的タンパク質を含む試料（シグナルＳ）のＰＣＲと、標的タンパク質を含まない試料（バックグラウンドＢ）のＰＣＲから取得されたＣｔ値の比較を、次ラウンドでの標的濃度を減少させるための指標として使用した。デルタＣｔ値が４より大きいが８未満の場合、次ラウンドでは標的タンパク質を３分の１に減らした。デルタＣｔ値が８より大きい場合、次ラウンドでは標的を１０分の１に減らした。

【0234】

ラウンド２では、標識された標的タンパク質（１０μＬ中５ｐｍｏｌｅ）を、４０μＬの対抗選択されたＤＮＡ候補混合物と混合し、３７℃で１５分間インキュベートした。低解離速度濃縮プロセスは、１０ｍＭのデキストラン硫酸を５０μＬにて加えることにより開始され、その後、直ちに０．０１２５ｍｇのＨｉｓビーズが添加された。これを、混合しながら３７℃で１５分間インキュベートした。その後、ビーズを１００μＬのＳＢ１８Ｔ０．０１で５回洗浄した。１００μＬの過塩素酸ナトリウムを加え、混合しながら３７℃で１０分間インキュベートすることによって、ビーズからアプタマー鎖を溶出させた。ビーズを磁気分離によって除去し、１００μＬのアプタマー溶出液を新しいチューブに移した。

【0235】

ラウンド３～７をラウンド２で記載されているように実施したが、ただし、標的タンパク質の量を、標的とライブラリーの各組み合わせのデルタＣｔ値に基づいて必要に応じて少なくした。デキストラン硫酸を、Ｈｉｓビーズの添加の１５分前（ラウンド３及び４）、３０分前（ラウンド５及び６）、４５分前（ラウンド７）に加えた。

【0236】

ラウンド２～７では、過塩素酸溶出の後、０．０６２５ｍｇ（２５μＬ）の、プライマー２（配列番号３）と予め結合させたＳＡビーズ（以下、プライマービーズと呼ぶ）で１００μＬのアプタマー溶出液を捕捉し、振盪しながら５０℃で１０分間インキュベートし、続いて、振盪しながら２５℃でのインキュベーションを１０分間行った。ビーズを１００μＬのＳＢ１８Ｔ０．０１で２回、及び１６ｍＭのＮａＣｌで１回洗浄した。結合したアプタマーを１２０μＬの水で溶出させ、７５℃で２分間インキュベートした。ビーズを磁気分離によって除去し、１２０μＬのアプタマー溶出液を新しいチューブに移した。プライマービーズは、１５ｍｇのＳＡビーズ（１．５ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬ ＳＡビーズを２ｍＬの２０ｍＭ ＮａＯＨで１回、２ｍＬ ＳＢ１８Ｔ０．０１で２回洗浄したもの）を、０．５ｍＬの１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ｔｗｅｅｎ－２０中に再懸濁させ、７ｎｍｏｌｅのプライマー２（配列番号３）を加えることによって調製された。混合物を３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ビーズを１ｍＬのＳＢ１８Ｔ０．０１で２回、及び１ｍＬの１６ｍＭ ＮａＣｌで２回洗浄した。ビーズを、５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ｔｗｅｅｎ－２０中に２．５ｍｇ／ｍｌとなるよう再懸濁させた。

【0237】

アプタマーの増幅及び精製
各ラウンドからの選択されたアプタマーＤＮＡをＱＰＣＲにより増幅させ、定量した。１２μＬ ＱＰＣＲ Ｍｉｘ（１０Ｘ ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼバッファー；Ｎｏｖａｇｅｎ＃７１１５７、５倍希釈、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５μＭのフォワードＰＣＲプライマー（プライマー１、配列番号２）、５μＭのビオチン化リバースＰＣＲプライマー（プライマー２、配列番号３）、５×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、０．０７５Ｕ／μＬ ＫＯＤ ＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに１ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）に４８μＬのＤＮＡを加え、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＭｙＩＱ ＱＰＣＲ装置で以下のプロトコルに従ってサーマルサイクラーにかけた：９６℃で１５秒及び６８℃で３０分を１サイクル、続いて、９６℃で１５秒、６８℃で１分を２５サイクル。装置のソフトウェアで定量を実施し、標的タンパク質を含む場合と含まない場合の選択されたＤＮＡのコピー数を比較して、シグナル／バックグラウンド比を決定した。

【0238】

増幅後、ＰＣＲ産物をビオチン化アンチセンス鎖によりＳＡビーズに捕捉した。２５ｍＬのＳＡビーズ（１０ｍｇ／ｍＬ）を、２５ｍＬの２０ｍＭ ＮａＯＨで１回、２５ｍＬのＳＢ１８Ｔ０．０１で２回洗浄して２５ｍＬのＳＢ１８Ｔ０．０１に再懸濁させ、４℃で保存した。２５μＬのＳＡビーズ（ＳＢ１８Ｔ０．０１中１０ｍｇ／ｍＬ）を５０μＬの二本鎖ＱＰＣＲ産物に加え、混合しながら２５℃で５分間インキュベートした。１００μＬの２０ｍＭ ＮａＯＨを加え、混合しながら２５℃で１分間インキュベートすることによって、ビーズから「センス」鎖を溶出させた。溶出した鎖を廃棄し、ビーズをＳＢ１８Ｔ０．０１で２回、１６ｍＭのＮａＣｌで１回洗浄した。

【0239】

ＰＰ－ｄＵＴＰ、ＰＢｎ－ｄＵＴＰ、ＰＯＰ－ｄＵＴＰ、ＢＰＥ－ｄＵＴＰまたはＤＰＰ－ｄＵＴＰのいずれかを含有するアプタマーセンス鎖を、固定化したアンチセンス鎖からのプライマー伸長によって調製した。４０μＬのプライマー伸長反応混合物（１×プライマー伸長緩衝液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ＭｇＳＯ４、６ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００及び０．００１％ウシ血清アルブミン）、４μＭのフォワードプライマー（プライマー１、配列番号２）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰと、ＰＰ－ｄＵＴＰ、ＰＢｎ－ｄＵＴＰ、ＰＯＰ－ｄＵＴＰ、ＢＰＥ－ｄＵＴＰまたはＤＰＰ－ｄＵＴＰのいずれかと、を０．５ｍＭずつ、ならびに０．０７５Ｕ／μＬ ＫＯＤ ＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ）中にビーズを懸濁させ、混合しながら６８℃で４５分間インキュベートした。ビーズをＳＢ１８Ｔ０．０１で２回、１６ｍＭのＮａＣｌで１回洗浄し、アプタマー鎖を、８５μＬの２０ｍＭ ＮａＯＨを加えて混合しながら３７℃で２分間インキュベートすることによってビーズから溶出させた。磁気分離後に８３μＬのアプタマー溶出液を新しいチューブに移し、２０μＬの８０ｍＭ ＨＣｌで中和し、５μＬの０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５で緩衝した。

【0240】

選択の厳密性とフィードバック
選択ステップの相対標的タンパク質濃度を、以下の規則に従ってＱＰＣＲシグナル（ΔＣｔ）に応じてラウンドごとに下げた：
ΔＣｔ＜４の場合、［Ｐ］（ｉ＋１）＝［Ｐ］（ｉ）
４≦ΔＣｔ＜８の場合、［Ｐ］（ｉ＋１）＝［Ｐ］（ｉ）／３．２
ΔＣｔ≧８の場合、［Ｐ］（ｉ＋１）＝［Ｐ］（ｉ）／１０
式中、［Ｐ］＝タンパク質濃度、及びｉ＝現在のラウンド番号。

【0241】

各選択ラウンドの後で、濃縮ＤＮＡ混合物の収束状態を決定した。１０μＬの二本鎖ＱＰＣＲ産物を、１×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ含有４ｍＭ ＭｇＣｌ２で２００μＬに希釈した。二本鎖オリゴヌクレオチドの複合体混合物のハイブリダイゼーション時間を測定するＣ０ｔ分析を使用して、試料を収束について分析した。試料を、以下のプロトコルに従ってサーマルサイクラーにかけた：９８℃で１分、８５℃で１分を３サイクル、９８℃で１分、次いで８５℃で３０分を２サイクル。この８５℃で３０分の間に、５秒間隔で蛍光画像を測定した。蛍光強度を時間の対数の関数としてプロットしたところ、各ＳＥＬＥＸラウンドでハイブリダイゼーション速度の増加が観察され、配列の収束が示された。

【0242】

実施例４：タンパク質標的に対する濃縮ＳＥＬＥＸプールの平衡結合定数（Ｋｄ）
本実施例では、ＳＥＬＥＸプール－タンパク質の結合親和性を測定するため、及びＫｄを決定するために本明細書で使用される方法を提供する。

【0243】

下表２に示される、濃縮されたラウンド７のＳＥＬＥＸプールの結合親和性を決定した。簡単に言えば、組換えＸＩＡＰ、ＩＬ－３３、ＴＮＦ－α及びＫ－Ｒａｓタンパク質への結合についてのフィルター結合アッセイによって、濃縮ＳＥＬＥＸプールの結合定数（Ｋｄ値）を決定した。濃縮ＳＥＬＥＸプールのＫｄ値をＳＢ１８Ｔ緩衝液中で測定した。ラウンド７の濃縮ＳＥＬＥＸプールを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）及びγ－［３２Ｐ］ＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）を使用して５’末端標識した。放射標識アプタマー（２０，０００～４０，０００ＣＰＭ、約０．０３ｎＭ）を、１０－７～１０－１２Ｍの範囲の濃度の標的タンパク質と混合し、３７℃で４０分間インキュベートした。

【0244】

インキュベーション後、反応物を、同量の１０ｍＭのデキストラン硫酸及び０．０１４ｍｇのＨｉｓ－タグＤｙｎａビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、混合しながら３７℃で５分間インキュベートした。結合した複合体をＤｕｒａｐｏｒｅフィルタープレート（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に捕捉し、結合したアプタマーの画分をホスフォイメージャー（Ｔｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００，ＧＥ）で定量し、データをＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＧＥ）で分析した。

【0245】

結合親和性を決定するため、方程式：
ｙ＝（最大－最小）（タンパク質）／（Ｋ_ｄ＋タンパク質）＋最小
を使用してデータを当てはめ、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．００を使用してプロットするか、または４パラメータシグモイド型用量反応モデルを使用してデータを当てはめた。データはいずれも、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．００を使用してプロットされた。結果を図１Ａ～１Ｉ及び表２に示す。

【表2】

【0246】

実施例５：ビフェニル修飾ヌクレオチドを有するアプタマーの選択
本実施例では、ビフェニル修飾ｄＣライブラリーを単一フェニル修飾ヌクレオチドライブラリーと直接比較して使用する、ＤＮＡアプタマーの選択及び生成のための代表的方法を提供する。

【0247】

候補混合物の調製
部分的ランダム化ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの候補混合物を、ビオチン化ｓｓＤＮＡテンプレートにアニールしたＤＮＡプライマー（下表３に示す）のポリメラーゼ伸長によって調製した。候補混合物には、ＰＰ－ｄＣＴＰ、Ｂｎ－ｄＣＴＰ、ＤＰＰ－ｄＣＴＰ、ＰＢｎ－ｄＣＴＰ、またはＰＯＰ－ｄＣＴＰのうちの１つ、及びｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰを含有する４０ヌクレオチドのランダム化カセットが含有された。

【表3】

【0248】

４９００マイクロリットルの、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｐｌｕｓ ＵｌｔｒａＬｉｎｋ Ｒｅｓｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ）の５０％スラリーを、１×ＳＢ１８Ｔ緩衝液で１回、及び１６ｍＭ ＮａＣｌで３回洗浄した。レジンを６本のチューブに等分し、２つのビオチン残基（配列中Ｂ’と表記）と４０のランダム化位置（配列中Ｎ_４０と表記）とを有するテンプレート１（配列番号４）を２８ナノモルにて洗浄済みＵｌｔｒａＬｉｎｋ ＳＡビーズに加え、３７℃で３０分間回転させた。その後、ビーズを１６ｍＭ ＮａＣｌで３回洗浄した。洗浄と洗浄の合間に、ビーズを遠心分離により回収した。ビーズはこの時点で捕捉したテンプレートを含有しており、これらのビーズを、１．６７ｍＬの伸長反応緩衝液［５６ｎｍｏｌのプライマー１（配列番号５）、１×ＳＱ２０緩衝液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ＭｇＳＯ_４、６ｍＭ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．００１％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、１１２ユニットのＫＯＤ ＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＭＤ ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）、ならびに１ｍＭずつの、Ｂｎ－ｄＣＴＰ、ＰＰ－ｄＣＴＰ、ＰＢｎ－ｄＣＴＰ、ＰＯＰ－ｄＣＴＰ、またはＤＰＰ－ｄＣＴＰのいずれか、及びｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、を含有］に懸濁させた。ビーズを７１℃で２時間インキュベートした。その後、ビーズを１６ｍＭ ＮａＣｌで３回洗浄した。アプタマーライブラリーを、１ｍＬの２０ｍＭ ＮａＯＨでビーズから溶出させた。溶出したライブラリーを直ちに、１５μＬの１Ｎ ＨＣｌ及び１０μＬ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）及び１μＬの１０％ＴＷＥＥＮ－２０で中和した。各ライブラリーの濃度を紫外吸収分光法によって決定した。

【0249】

標的タンパク質の固定化
ＳＥＬＥＸで使用される以下のタンパク質標的を商業ベンダーから購入した：ＴＮＦα（Ａｃｒｏ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログＴＮＡ－５２２８）、Ｂ７－Ｈ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ６５７６－Ｂ７－０５０）、ｓＬ－セレクチン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ７２８－ＬＳ－１００）。Ｈｉｓタグの付いた生成標的タンパク質を、ＳＥＬＥＸ（ラウンド１～７）用にＨｉｓ－ｔａｇ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）常磁性ビーズ（ＭｙＯｎｅ ＳＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、または以下、Ｈｉｓビーズと呼ぶ）に固定化した。ビーズ（４０ｍｇ）を、２０ｍＬのＳＢ１８Ｔ０．０１で３回洗浄することによって調製した。最後に、ビーズをＳＢ１８Ｔ０．０１中に２．５ｍｇ／ｍＬで懸濁させ、使用まで４℃で保存した。

【0250】

低解離速度濃縮工程によるアプタマーの選択
親和性及び低解離速度についての選択に関して合計８ラウンドのＳＥＬＥＸ法が完了した。バックグラウンドを抑制するため、及びタンパク質に非特異的に結合しているアプタマーが取得される可能性を減らすため、各ラウンドの前に対抗選択を実施した。対抗選択を以下のとおり実施した。

【0251】

ラウンド１では、約１ｎｍｏｌｅのＤＮＡを含むＳＢ１８Ｔ０．０１を含有する１００μＬのＤＮＡ候補混合物を９５℃で５分間加熱し、その後、７０℃に５分間、次いで４８℃に５分間冷却した後、３７℃でのブロックに５分間移した。その後、試料を、１０μＬのタンパク質競合混合物（０．１％ＨＳＡ、１０μＭのカゼイン、及び１０μＭプロトロンビンを含むＳＢ１８Ｔ０．０１）、及びＨＥＸＡ－Ｈｉｓ（Ａｎａｓｐｅｃ、カタログ番号２４４２０）でコートした０．０２５ｍｇ（１０μＬ）のＨｉｓビーズと合わせ、混合しながら３７℃で１０分間インキュベートした。ビーズを磁気分離によって除去した。

【0252】

ラウンド２～８では、前のラウンドから得られたＤＮＡ候補混合物の６５μＬのアリコート（前のラウンドから得られたｅＤＮＡの６５％）を、１６μＬの５×ＳＢ１８Ｔ０．０１と混合した。試料を９５℃まで３分間加熱し、０．１℃／秒の速度で３７℃まで冷却した。その後、試料を、９μＬのタンパク質競合混合物（０．１％ＨＳＡ、１０μＭのカゼイン、及び１０μＭプロトロンビンを含むＳＢ１８Ｔ０．０１）、及び０．０２５ｍｇ（１０ｕＬ）のＨｉｓビーズと合わせ、混合しながら３７℃で１０分間インキュベートした。ビーズを磁気分離によって除去した。

【0253】

最初の対抗選択に続いて、標的タンパク質を、ラウンド１の選択工程のためにＨｉｓビーズに事前に固定化した。これを達成するために、０．１２５ｍｇのタンパク質Ｈｉｓビーズを５０ｐｍｏｌｅの標的タンパク質と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。ビーズをＳＢ１８Ｔ０．０１で洗浄することによって未結合標的を除去した。対抗選択されたＤＮＡ候補混合物（１００μＬ）をビーズに加え、混合しながら３７℃で６０分間インキュベートした。最初のラウンドでは低解離速度濃縮プロセスは使用せず、ビーズを１００μＬのＳＢ１８Ｔ０．０１で５回、簡易洗浄した。洗浄に続き、１７０μＬの２ｍＭ ＮａＯＨを加え、混合しながら３７℃で５分間インキュベートすることによって、結合したアプタマーをビーズから溶出させた。ビーズの磁気分離後にアプタマー含有溶出液（１７０μＬ）を新しいチューブに移し、４０μＬの中和緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８ｍＭ ＨＣｌ）を加えて溶液を中和した。

【0254】

ラウンド２～８では、ＤＮＡ候補混合物及び以下に記載の標的タンパク質を用いて選択を実施し、並行して、ＤＮＡ候補混合物は用いるが標的タンパク質は用いずに同一の選択を実施した。標的タンパク質を含む試料（シグナルＳ）のＰＣＲと、標的タンパク質を含まない試料（バックグラウンドＢ）のＰＣＲから取得されたＣｔ値の比較を、次ラウンドでの標的濃度を減少させるための指標として使用した。デルタＣｔ値が４より大きいが８未満の場合、次ラウンドでは標的タンパク質を３分の１に減らした。デルタＣｔ値が８より大きい場合、次ラウンドでは標的を１０分の１に減らした。

【0255】

ラウンド２では、標識された標的タンパク質（１０μＬ中５ｐｍｏｌｅ）を、４０μＬの対抗選択されたＤＮＡ候補混合物と混合し、３７℃で１５分間インキュベートした。低解離速度濃縮プロセスは、１０ｍＭのデキストラン硫酸を５０μＬにて加えることにより開始され、その後、直ちに０．０１２５ｍｇのＨｉｓビーズが添加された。これを、混合しながら３７℃で１５分間インキュベートした。その後、ビーズを１００μＬのＳＢ１８Ｔ０．０１で５回洗浄した。１００μＬの過塩素酸ナトリウムを加え、混合しながら３７℃で１０分間インキュベートすることによって、ビーズからアプタマー鎖を溶出させた。ビーズを磁気分離によって除去し、１００μＬのアプタマー溶出液を新しいチューブに移した。

【0256】

ラウンド３～８をラウンド２で記載されているように実施したが、ただし、標的タンパク質の量を、標的とライブラリーの各組み合わせのデルタＣｔ値に基づいて必要に応じて少なくした。デキストラン硫酸を、Ｈｉｓビーズの添加の１５分前（ラウンド３及び４）、３０分前（ラウンド５及び６）、４５分前（ラウンド７及び８）に加えた。

【0257】

ラウンド２～８では、過塩素酸溶出の後、０．０６２５ｍｇ（２５μＬ）の、プライマー２（配列番号６）と予め結合させたＳＡビーズ（以下、プライマービーズと呼ぶ）で１００μＬのアプタマー溶出液を捕捉し、振盪しながら５０℃で１０分間インキュベートし、続いて、振盪しながら２５℃でのインキュベーションを１０分間行った。ビーズを１００μＬのＳＢ１８Ｔ０．０１で２回、及び１６ｍＭのＮａＣｌで１回洗浄した。結合したアプタマーを１２０μＬの水で溶出させ、７５℃で２分間インキュベートした。ビーズを磁気分離によって除去し、１２０μＬのアプタマー溶出液を新しいチューブに移した。プライマービーズは、１２０ｍｇのＳＡビーズ（１．５ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬ ＳＡビーズを２ｍＬの２０ｍＭ ＮａＯＨで１回、２ｍＬ ＳＢ１８Ｔ０．０１で２回洗浄したもの）を、０．５ｍＬの１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ｔｗｅｅｎ－２０中に再懸濁させ、１４ｎｍｏｌｅのプライマー２（配列番号６）を加えることによって調製された。混合物を３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ビーズを１ｍＬのＳＢ１８Ｔ０．０１で２回、及び１ｍＬの１６ｍＭ ＮａＣｌで２回洗浄した。ビーズを、５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ｔｗｅｅｎ－２０中に２．５ｍｇ／ｍｌとなるよう再懸濁させた。

【0258】

アプタマーの増幅及び精製
各ラウンドからの選択されたアプタマーＤＮＡをＱＰＣＲにより増幅させ、定量した。１２μＬ ＱＰＣＲ Ｍｉｘ（１０Ｘ ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼバッファー；Ｎｏｖａｇｅｎ＃７１１５７、５倍希釈、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５μＭのフォワードＰＣＲプライマー（プライマー１、配列番号５）、５μＭのビオチン化リバースＰＣＲプライマー（プライマー２、配列番号６）、５×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、０．０７５Ｕ／μＬ ＫＯＤ ＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに１ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）に４８μＬのＤＮＡを加え、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＭｙＩＱ ＱＰＣＲ装置で以下のプロトコルに従ってサーマルサイクラーにかけた：９６℃で１５秒及び７１℃で３０分を１サイクル、続いて、９６℃で１５秒、７１℃で１分を２５サイクル。装置のソフトウェアで定量を実施し、標的タンパク質を含む場合と含まない場合の選択されたＤＮＡのコピー数を比較して、シグナル／バックグラウンド比を決定した。

【0259】

増幅後、ＰＣＲ産物をビオチン化アンチセンス鎖によりＳＡビーズに捕捉した。２５ｍＬのＳＡビーズ（１０ｍｇ／ｍＬ）を、２５ｍＬの２０ｍＭ ＮａＯＨで１回、２５ｍＬのＳＢ１８Ｔ０．０１で２回洗浄して２５ｍＬのＳＢ１８Ｔ０．０１に再懸濁させ、４℃で保存した。２５μＬのＳＡビーズ（ＳＢ１８Ｔ０．０１中１０ｍｇ／ｍＬ）を５０μＬの二本鎖ＱＰＣＲ産物に加え、混合しながら２５℃で５分間インキュベートした。１００μＬの２０ｍＭ ＮａＯＨを加え、混合しながら２５℃で１分間インキュベートすることによって、ビーズから「センス」鎖を溶出させた。溶出した鎖を廃棄し、ビーズをＳＢ１８Ｔ０．０１で２回、１６ｍＭのＮａＣｌで１回洗浄した。

【0260】

Ｂｎ－ｄＣＴＰ、ＰＰ－ｄＣＴＰ、ＰＢｎ－ｄＣＴＰ、ＰＯＰ－ｄＣＴＰ、またはＤＰＰ－ｄＣＴＰのいずれかを含有するアプタマーセンス鎖を、固定化したアンチセンス鎖からのプライマー伸長によって調製した。４０μＬのプライマー伸長反応混合物（１×プライマー伸長緩衝液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ＭｇＳＯ４、６ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００及び０．００１％ウシ血清アルブミン）、４μＭのフォワードプライマー（プライマー１、配列番号５）、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰと、Ｂｎ－ｄＣＴＰ、ＰＰ－ｄＣＴＰ、ＰＢｎ－ｄＣＴＰ、ＰＯＰ－ｄＣＴＰ、またはＤＰＰ－ｄＣＴＰのいずれかと、を０．５ｍＭずつ、ならびに０．０７５Ｕ／μＬ ＫＯＤ ＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ）中にビーズを懸濁させ、混合しながら７１℃で４５分間インキュベートした。ビーズをＳＢ１８Ｔ０．０１で２回、１６ｍＭのＮａＣｌで１回洗浄し、アプタマー鎖を、８５μＬの２０ｍＭ ＮａＯＨを加えて混合しながら３７℃で２分間インキュベートすることによってビーズから溶出させた。磁気分離後に８３μＬのアプタマー溶出液を新しいチューブに移し、２０μＬの８０ｍＭ ＨＣｌで中和し、５μＬの０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５で緩衝した。

【0261】

選択の厳密性とフィードバック
選択ステップの相対標的タンパク質濃度を、以下の規則に従ってＱＰＣＲシグナル（ΔＣｔ）に応じてラウンドごとに下げた：
ΔＣｔ＜４の場合、［Ｐ］（ｉ＋１）＝［Ｐ］（ｉ）
４≦ΔＣｔ＜８の場合、［Ｐ］（ｉ＋１）＝［Ｐ］（ｉ）／３．２
ΔＣｔ≧８の場合、［Ｐ］（ｉ＋１）＝［Ｐ］（ｉ）／１０
式中、［Ｐ］＝タンパク質濃度、及びｉ＝現在のラウンド番号。

【0262】

各選択ラウンドの後で、濃縮ＤＮＡ混合物の収束状態を決定した。１０μＬの二本鎖ＱＰＣＲ産物を、１×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ含有４ｍＭ ＭｇＣｌ２で２００μＬに希釈した。二本鎖オリゴヌクレオチドの複合体混合物のハイブリダイゼーション時間を測定するＣ０ｔ分析を使用して、試料を収束について分析した。試料を、以下のプロトコルに従ってサーマルサイクラーにかけた：９８℃で１分、８５℃で１分を３サイクル、９８℃で１分、次いで８５℃で３０分を２サイクル。この８５℃で３０分の間に、５秒間隔で蛍光画像を測定した。蛍光強度を時間の対数の関数としてプロットしたところ、各ＳＥＬＥＸラウンドでハイブリダイゼーション速度の増加が観察され、配列の収束が示された。

【0263】

実施例６：タンパク質標的に対する濃縮ＳＥＬＥＸプールの平衡結合定数（Ｋｄ）
ＳＥＬＥＸプール－タンパク質の結合親和性を測定するため、及びＫｄを決定するために以下の方法を使用した。

【0264】

下表４に示される、濃縮されたラウンド６またはラウンド８のＳＥＬＥＸプールの結合親和性を決定した。簡単に言えば、組換えのＴＮＦαタンパク質及びＢ７－Ｈ４タンパク質への結合についてのフィルター結合アッセイによって、濃縮ＳＥＬＥＸプールの結合定数（Ｋｄ値）を決定した。濃縮ＳＥＬＥＸプールのＫｄ値をＳＢ１８Ｔ緩衝液中で測定した。ラウンド６またはラウンド８の濃縮ＳＥＬＥＸプールを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）及びγ－［３２Ｐ］ＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）を使用して５’末端標識した。放射標識アプタマー（２０，０００～４０，０００ＣＰＭ、約０．０３ｎＭ）を、１０－７～１０－１２Ｍの範囲の濃度の標的タンパク質と混合し、３７℃で４０分間インキュベートした。インキュベーション後、反応物を、同量の１０ｍＭのデキストラン硫酸及び０．０１４ｍｇのＨｉｓ－タグＤｙｎａビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、混合しながら３７℃で５分間インキュベートした（ＴＮＦα及びｓＬ－セレクチン）。Ｂ７－Ｈ４タンパク質の場合、２．２ｍｇのＺｏｒｂａｘレジン（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を各反応物に加えた。結合した複合体をＤｕｒａｐｏｒｅフィルタープレート（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に捕捉し、結合したアプタマーの画分をホスフォイメージャー（Ｔｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００，ＧＥ）で定量し、データをＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＧＥ）で分析した。

【0265】

結合親和性を決定するため、方程式：
ｙ＝（最大－最小）（タンパク質）／（Ｋ_ｄ＋タンパク質）＋最小を使用してデータを当てはめ、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．００を使用してプロットするか、または４パラメータシグモイド型用量反応モデルを使用してデータを当てはめた。データはいずれも、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．００を使用してプロットされた。結果を図７Ａ～７Ｆ及び表４に示す。

【表4】

【0266】

結果
ＳＥＬＥＸのラウンド８の完了後、ラウンド６及びラウンド８からの親和性濃縮プールをフィルター結合アッセイで分析し、高親和性結合配列を含有するプールを同定し、ＳＥＬＥＸにおける、単一フェニル環ｄＣ修飾（Ｂｎ－ｄＣ、ＰＰ－ｄＣ）と比較したビフェニルｄＣ修飾（ＤＰＰ－ｄＣ、ＰＢｎ－ｄＣ、ＰＯＰ－ｄＣ）の値を評価した。ビフェニルｄＣ修飾のＤＰＰ－ｄＣ、ＰＢｎ－ｄＣ及びＰＯＰ－ｄＣが、ＳＥＬＥＸプール親和性結合における結果の改善を示すことが見出された。ＴＮＦαタンパク質は、Ｂｎ－ｄＣ及びＰＰ－ｄＣの修飾されたラウンド８のＳＥＬＥＸプールに対し、１．０×１０^－７Ｍのタンパク質濃度まで測定可能な結合親和性を示さなかった。しかし、ラウンド８プールのＤＰＰ－ｄＣ、ＰＢｎ－ｄＣ及びＰＯＰ－ｄＣの高親和性結合（表４）が測定されたことから、これらの修飾ライブラリーがＳＥＬＥＸにおいて成功であったことが示された。同様に、Ｂ７－Ｈ４タンパク質のラウンド６プールは、Ｂｎ－ｄＣに対して測定可能な結合親和性を示さなかったが、ＰＢｎ－ｄＣ修飾プールは８．０×１０^－９Ｍという高親和性を示した。ｓＬ－セレクチンタンパク質は、ラウンド８プールでは中程度のＰＰ－ｄＣ結合親和性（４．５×１０^－９Ｍ）を示したが、ビフェニルライブラリーのＰＢｎ－ｄＣ及びＰＯＰ－ｄＣでは、顕著に改善された親和性（それぞれ、６．１×１０^－１０Ｍ及び２．４×１０^－１０Ｍ）が示された。これらの結果は、ビフェニルライブラリープールが、単一フェニルＰＰ－ｄＣプールよりも高い親和性配列について濃縮されていることを示す。全体として、これらの結果は、ビフェニル修飾ｄＣライブラリーがＳＥＬＥＸにおける結果の改善をもたらすことを示している。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図1I】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図2-5】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6-1】

【図6-2】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【配列表】

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【国際調査報告】