ホーム > 特許ランキング > セルラリティ インク．
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-10
(54)【発明の名称】多層羊膜組織移植片及びその使用
(51)【国際特許分類】
A61L 27/36 20060101AFI20240403BHJP
A61K 35/50 20150101ALI20240403BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240403BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240403BHJP
A61P 27/06 20060101ALI20240403BHJP
【ＦＩ】
A61L27/36 130
A61K35/50
A61P29/00
A61P27/02
A61P27/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023562203
(86)(22)【出願日】2022-04-13
(85)【翻訳文提出日】2023-11-01
(86)【国際出願番号】 US2022071705
(87)【国際公開番号】W WO2022221852
(87)【国際公開日】2022-10-20
(31)【優先権主張番号】63/174,280
(32)【優先日】2021-04-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/267,820
(32)【優先日】2022-02-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520169074
【氏名又は名称】セルラリティ インク．
(74)【代理人】
【識別番号】110000659
【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】キューン，アダム
(72)【発明者】
【氏名】ロング，デジレー
(72)【発明者】
【氏名】シバレンカ，ラジャラジェスワリ
(72)【発明者】
【氏名】ゴシエウスカ，アンナ
(72)【発明者】
【氏名】ブリジド，ステファン エー．
(72)【発明者】
【氏名】ウィルク，ティモシー エフ．
(72)【発明者】
【氏名】トリンカ，アマンダ エル．
(72)【発明者】
【氏名】ハリリ，ロバート ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】マルティネス，ルイス
【テーマコード（参考）】
4C081
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C081AB21
4C081BA12
4C081CD34
4C081DA05
4C081DC04
4C081EA02
4C081EA13
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA05
4C087BB58
4C087CA03
4C087NA10
4C087ZA33
4C087ZB11
(57)【要約】
本発明は、細胞外マトリックスの複数の積層された層を含む組織移植片生成物であって、細胞外マトリックスが、羊膜に由来し、細胞外マトリックス層の間質側が、組織移植片生成物の上表面及び下表面の両方に提示される、組織移植片生成物を提供する。組織移植片生成物を作製及び使用する方法も提供される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
一緒に積層された細胞外マトリックスの複数の層を含む組織移植片生成物であって、前記細胞外マトリックスが、羊膜に由来し、細胞外マトリックス層の間質側が、前記組織移植片生成物の上表面及び下表面の両方に提示される、組織移植片生成物。
【請求項2】
前記生成物が、細胞外マトリックスの３つ以上の層を含む、請求項１に記載の組織移植片生成物。
【請求項3】
前記生成物が、細胞外マトリックスの正確に３つの層を含む、請求項１に記載の組織移植片生成物。
【請求項4】
前記羊膜が、脱細胞化される、請求項１～３のいずれか一項に記載の組織移植片生成物。
【請求項5】
前記羊膜が、洗剤及び又は機械的破壊で脱細胞化される、請求項４に記載の組織移植片生成物。
【請求項6】
前記洗剤が、デオキシコール酸である、請求項５に記載の組織移植片生成物。
【請求項7】
前記細胞外マトリックスの複数の層が、乾燥によって一緒に積層される、請求項１～６のいずれか一項に記載の組織移植片生成物。
【請求項8】
前記生成物が、加熱及び又は真空によって乾燥される、請求項７に記載の組織移植片生成物。
【請求項9】
前記組織移植片生成物が、脱水される、請求項１～８のいずれか一項に記載の組織移植片生成物。
【請求項10】
前記生成物が、乾燥重量で約２０％未満の水を含む、請求項９に記載の組織移植片生成物。
【請求項11】
前記生成物が、乾燥重量で約１５％未満の水を含む、請求項９に記載の組織移植片生成物。
【請求項12】
前記生成物が、乾燥重量で約１０％の水を含む、請求項９に記載の組織移植片生成物。
【請求項13】
前記生成物が、乾燥重量で約４０％～約７０％の総コラーゲンを含む、請求項９～１２のいずれか一項に記載の組織移植片生成物。
【請求項14】
前記生成物が、乾燥重量で約４５％～約６０％の総コラーゲンを含む、請求項１３に記載の組織移植片生成物。
【請求項15】
前記生成物が、乾燥重量で約５０％～約５５％の総コラーゲンを含む、請求項１３に記載の組織移植片生成物。
【請求項16】
前記コラーゲンが、主に、Ｉ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲンである、請求項９～１５のいずれか一項に記載の組織移植片生成物。
【請求項17】
前記生成物が、乾燥重量で約８％～約２４％のエラスチンを含む、請求項９～１６のいずれか一項に記載の組織移植片生成物。
【請求項18】
前記生成物が、乾燥重量で約１２％～約２０％のエラスチンを含む、請求項１７に記載の組織移植片生成物。
【請求項19】
前記生成物が、乾燥重量で約１５％～約２０％のエラスチンを含む、請求項１７に記載の組織移植片生成物。
【請求項20】
前記生成物が、乾燥重量で約１％未満のグリコサミノグリカンを含む、請求項９～１９のいずれか一項に記載の組織移植片生成物。
【請求項21】
前記生成物が、乾燥重量で約０．５％未満のグリコサミノグリカンを含む、請求項２０に記載の組織移植片生成物。
【請求項22】
前記生成物が、乾燥重量で約１％未満のフィブロネクチンを含む、請求項９～２１のいずれか一項に記載の組織移植片生成物。
【請求項23】
前記生成物が、乾燥重量で約０．５％未満のフィブロネクチンを含む、請求項２２に記載の組織移植片生成物。
【請求項24】
前記生成物が、乾燥重量で約１％未満のラミニンを含む、請求項９～２３のいずれか一項に記載の組織移植片生成物。
【請求項25】
前記生成物が、乾燥重量で約０．５％未満のラミニンを含む、請求項２４に記載の組織移植片生成物。
【請求項26】
前記羊膜が、ヒト羊膜である、請求項１～２５のいずれか一項に記載の組織移植片生成物。
【請求項27】
前記羊膜が、満期妊娠に由来する、請求項２６に記載の組織移植片生成物。
【請求項28】
請求項１～２７のいずれか一項に記載の組織移植片生成物を含む、眼球組織移植片。
【請求項29】
前記眼球組織移植片が、ほぼ円形である、請求項２８に記載の眼球組織移植片。
【請求項30】
前記眼球組織移植片が、球体の一部分の形状に湾曲部分を含む、請求項２８に記載の眼球組織移植片。
【請求項31】
前記形状が、前記組織移植片生成物を型上で乾燥させることによって付与される、請求項３０に記載の眼球組織移植片。
【請求項32】
対象における眼の疾患又は傷害を治療する方法であって、前記対象の前記眼を、請求項１～２７のいずれか一項に記載の組織移植片生成物、又は請求項２８～３１のいずれか一項に記載の眼球組織移植片と接触させ、それによって、前記対象を治療するステップを含む、方法。
【請求項33】
前記眼の前記傷害が、擦り傷を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記眼の前記傷害が、化学物質曝露を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項35】
前記眼の前記傷害が、切り傷又は裂傷を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項36】
前記眼の前記疾患又は傷害が、角膜の疾患又は傷害を含む、請求項３２～３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記治療が、損傷した組織の修復を含む、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
前記治療が、治療していない眼に対する瘢痕組織の低減又は瘢痕組織形成の低減を含む、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記治療が、治療していない眼に対する上皮細胞移動の増加を含む、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記治療が、治療していない眼に対する上皮細胞接着性の増加を含む、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記治療が、治療していない眼に対する上皮細胞増殖の増加を含む、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
前記治療が、治療していない眼に対する上皮細胞被覆率の増加を含む、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
前記対象が、哺乳動物である、請求項３２～４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
前記対象が、ヒトである、請求項４３に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２１年４月１３日出願の米国仮特許出願第６３／１７４，２８０号、及び２０２２年２月１０日出願の同第６３／２６７，８２０号に対する優先権を主張し、これらの内容はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、部分的に、多層状羊膜組織移植片、及びオクラー（ｏｃｌａｒ）用途におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0003】
ヒトの羊膜（ａｍｎｉｏｔｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）（羊膜（ａｍｎｉｏｎ））は、羊水と直接接触する羊膜嚢の最内層である。羊膜は、立方上皮細胞の単一層、基底膜、及び絨毛膜に緩く付着した無血管間質マトリックスからなる。ヒトの羊膜の主な成分は、コラーゲン及びエラスチンであることが報告されている。ラミニン及びプロテオグリカンなどの他の生化学的成分もまた、少量存在する。
【0004】
ＢＩＯＶＡＮＣＥは、ヒト羊膜から製造される。原材料羊膜は、血液成分の汚染を浄化し、天然コラーゲン系アーキテクチャを変更することなく膜から細胞を除去するように設計された、すすぎ及び脱細胞化プロセスを受ける。浄化及び脱細胞化された羊膜は、５０℃の穏やかな温度で脱水され、最終生成物は、貯蔵、輸送が容易であり、より長い貯蔵寿命を有するであろう。この生成物は、電子線放射を使用して最終的に滅菌される。
【0005】
羊膜（ＡＭ）を眼球表面再建に使用して、輪部上皮細胞のエクスビボ拡張、結膜表面の再建（例えば、翼状片除去、翼状片以外の大きい病変の除去後、瞼球癒着溶解後の）、緑内障、新生物、翼状片、並びに強膜融解及び強膜穿孔のための担体として、輪部幹細胞欠損症の有無にかかわらない角膜表面障害を含む、種々の眼球病態を治療する（Ｗａｌｋｄｅｎ，２０２０、Ｅｌｈａｓｓａｎ，２０１９、Ｍａｌｈｏｔｒａ＆Ｊａｉｎ，２０１４、Ｍａｍｅｄｅ ｅｔ ａｌ．２０１２）。
【0006】
ＡＭは、パッチ又は移植片のいずれかとして使用することができる。ＡＭ上皮細胞を上に配置することによって、ＡＭは、上皮細胞成長のための基質及び足場として作用する（Ｍａｌｈｏｔｒａ＆Ｊａｉｎ，２０１４）。パッチとして、ＡＭは、一時的な生体包帯又はコンタクトレンズとして作用し、パッチの真下の宿主組織の再上皮化を促進する（Ｗａｌｄｅｎ，２０２０，Ｍａｌｈｏｔｒａ＆Ｊａｉｎ，２０１４）。ＡＭをパッチ間質側として下にして配置することにより、炎症細胞を捕捉し、アポトーシスを誘導することによる炎症応答が下方制御されると考えられている（Ｄｕａ ｅｔ ａｌ．２００４）。したがって、特に上皮欠損に関連する場合、ＡＭを、急性炎症の存在下で間質側を下にして配置して、炎症細胞及びメディエーターから眼球表面を保護する（Ｍａｌｈｏｔｒａ＆Ｊａｉｎ，２０１４、Ｍａｍｅｄｅ ｅｔ ａｌ．２０１２）。
【0007】
ＡＭの向き及び適用方法：適用方法の選択は、使用の適応、所望の転帰、並びに創傷の深さ及びサイズに依存する（Ｗａｌｋｄｅｎ，２０２０、Ｅｌｈａｓｓａｎ，２０１９、Ｍａｌｈｏｔｒａ＆Ｊａｉｎ，２０１４）。
【0008】
３つの適用方法は、文献全体を通して一貫して報告される。
インレイ技術（永久的な移植片）、
オンレイ技術（一時的な生体包帯又はコンタクトレンズ）、及び
組み合わされたインレイ－オンレイ技術（永久的な移植片及び一時的な生体包帯）。
インレイ技術（永久的な移植片）、
オンレイ技術（一時的な生体包帯又はコンタクトレンズ）、及び
組み合わされたインレイ－オンレイ技術（永久的な移植片及び一時的な生体包帯）。
【0009】
インレイ技術（永久的な移植片）：ＡＭは、上皮／基底膜側を上にして配置されて、それらが成長することができる基質を宿主の細胞に提供する。経時的に、ＡＭマトリックスが宿主角膜に再形成される。したがって、ＡＭマトリックスは、永久的な移植片として働いている。
【0010】
ＡＭは、欠損に適合するようにトリミングされ、上皮側を上にして配置され、通常は角膜に縫合される。およそ２ｍｍの宿主の角膜上皮が創面切除される。これにより、再生上皮がＡＭの上皮／基底膜上で成長することができる。欠損のサイズに依存して、単一層技術又は多層技術を使用することができる。多層技術により、ＡＭをいくつかの部片に切断すること、又はブランケット状に折り畳むことができる。
【0011】
オンレイ技術（一時的な生体包帯又はコンタクトレンズ）：ＡＭは、宿主の上皮が膜の下で成長することが意図されているため、上皮／基底膜側を上にして又は間質側を上にして配置することができる。ＡＭは、一定期間にわたって脱落、除去、又は自己分解することが予想される。したがって、ＡＭは、一時的な生体包帯又はコンタクトレンズとして働いており、物理的なバリアを提供する。ＡＭが宿主組織に組み込まれることを意図するものではない。
【0012】
ＡＭは、欠損よりも大きいサイズであるため、膜の真下に宿主上皮が存在する。ＡＭは、縫合されるか、又は所定の位置に接合されるかのいずれかである。
【0013】
組み合わされたインレイ－オンレイ技術：これは、インレイ技術及びオンレイ技術の両方を組み合わせている。上述のように、ＡＭは、欠損の上皮側を上にして配置され、宿主組織に組み込まれると予想される。単一層技術又は多層技術のいずれかを使用することができる。これは、移植片が上皮／基底膜側を上して又は間質側を上にしてのいずれかで配置され、欠損の周囲を越えて延在している、オンレイ技術と組み合わされる。この技術の場合、上皮は、パッチの下であるが、最上部のインレイ移植片の上で成長すると予想される。
【発明の概要】
【0014】
本発明は、一緒に積層された細胞外マトリックスの複数の層を含む組織移植片生成物であって、細胞外マトリックスが、羊膜に由来し、細胞外マトリックス層の間質側が、組織移植片生成物の上表面及び下表面の両方に提示される、組織移植片生成物を提供する。
【0015】
本発明はまた、本発明の組織移植片生成物を含む眼球組織移植片を提供する。
【0016】
本発明はまた、対象における眼の疾患又は傷害を治療する方法であって、対象の眼を、本発明の組織移植片生成物又は眼球組織移植片と接触させるステップを含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】側及び羊膜による細胞接着性を示す。平均値及び標準偏差をプロットしている。細胞接着性は、蛍光強度（ＡＵ）で測定した。
【0018】
【図2】細胞増殖を示す。平均値及び標準偏差をプロットしている。
【0019】
【図3】クレラティブ（ｃｒｅｌａｔｉｖｅ）増殖率を示す。平均値及び標準偏差をプロットしている。
【0020】
【図4】羊膜による移動面積を示す。平均値及び標準偏差をプロットしている。移動面積は、ｐｘ２として報告される。
【0021】
【図5】７日間にわたるＡＭのＥ＆Ｓ側における細胞生存率を示す。＊ｐ≦０．０５、ＤＤＨＡＭ－Ｓと比較した。
【0022】
【図6】４日後、ＡＭのＳ側上の細胞をＣａｌｃｅｉｎＡＭで染色して、生存細胞を可視化し（Ａ）、ファロイジンで染色して、アクチンを可視化した（Ｂ）ことを示す。
【0023】
【図7】ＡＭ上で２４時間、４８時間、及び７２時間培養したＨＣＥＣにおけるＴＮＦａの遺伝子発現を示す。＊ｐ≦０．０５。
【0024】
【図8A-8B】羊膜の免疫蛍光及びＨ＆Ｅ染色を示す。ＤＤＨＡＭ、ＤＨＡＭ、及びＣＨＡＭの免疫蛍光染色を示す（Ａ）。膜の断面を、Ｈｏｅｃｈｓｔ染料（青色のＤＮＡ）、ファロイジン（緑色のアクチン）、及び抗ヒトＩ型コラーゲン抗体（赤色のＣｏｌ１）で染色した。代表的な画像が示されており、スケールバー＝５０ｕｍである。ＤＤＨＡＭ、ＤＨＡＭ、及びＣＨＡＭのＨ＆Ｅ染色（青色の核、赤色の細胞質）が示されている（Ｂ）。代表的な画像を示しており、スケールバー＝２０ｕｍ。
【0025】
【図9】細胞接着性を示す。羊膜の上皮側及び間質側上に播種し、２４時間インキュベートしたヒト角膜上皮細胞。各羊膜の上皮側と間質側との間の比較を示し、各側についての羊膜間の比較を示す。平均値及び標準偏差をプロットしている。蛍光強度を任意単位（ＡＵ）で表している。示されるデータは、平均値±ＳＤである。＊ｐ≦０．０５。略語：ＣＨＡＭ、凍結保存ヒト羊膜；ＤＤＨＡＭ、脱細胞化脱水ヒト羊膜；ＤＨＡＭ、脱水ヒト羊膜。
【0026】
【図10】４日目のＡＭ上のヒト角膜上皮細胞の染色を示す。ヒト角膜上皮細胞を、３つのＡＭの間質側上に播種し、培養し、Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭで染色して、４日目に生存細胞を可視化した（Ａ）。ＡＭ上のヒト角膜上皮細胞の形態を、４日目のアクチン染色及び擬似着色した赤色によって監視した（Ｂ）。落射蛍光顕微鏡を使用して画像を取り込んだ。スケールバー＝１００μｍ。略語：ＣＨＡＭ、凍結保存ヒト羊膜；ＤＤＨＡＭ、脱細胞化脱水ヒト羊膜；ＤＨＡＭ、脱水ヒト羊膜。
【0027】
【図11A-11B】経時的な細胞生存率を示す。ヒト角膜上皮細胞を、羊膜の上皮側及び間質側上に播種し、１、４、及び７日間インキュベートした。ａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイによって、羊膜上の細胞の生存率を各時点で測定した。蛍光強度を任意単位（ＡＵ）で表している。平均値及び標準偏差を、羊膜の各側について経時的にプロットしている（Ａ）。１日目の百分率として表される相対的細胞生存率、及び標準偏差を、羊膜の各々について経時的にプロットしている。各羊膜の上皮側と間質側との間の比較を示し、各側についての羊膜間の比較を示す。示されるデータは、平均値±ＳＤである。＊ｐ≦０．０５。略語：ＣＨＡＭ、凍結保存ヒト羊膜；ＤＤＨＡＭ、脱細胞化脱水ヒト羊膜；ＤＨＡＭ、脱水ヒト羊膜。
【0028】
【図12A-12B】移動の定量化を示す。代表的なスクラッチ創傷の画像を、０時間及び２４時間でのヒト角膜上皮細胞移動に対する馴化培地の効果を実証するために示している（Ａ）。異なる羊膜からの馴化培地（細胞の有無にかかわらず）を試験して、ヒト角膜上皮細胞移動に対するＡＭ単独の効果を評価した（Ｂ）。画像Ｊを使用して、創傷面積を測定し、スクエアピクセルで表した（ｐｘ２）。移動した面積＝面積０時間－面積２４時間。示されるデータは、平均値±ＳＤである。＊ｐ≦０．０５。略語：ＣＨＡＭ、凍結保存ヒト羊膜；ＤＤＨＡＭ、脱細胞化脱水ヒト羊膜；ＤＨＡＭ、脱水ヒト羊膜；Ｍｅｄｉｕｍ Ｃｔｒｌ、対照。
【0029】
【図13A-13D】２４時間でのｍＲＮＡ発現を示す。２４時間でのＧＭ－ＣＳＦ（Ａ）、ＩＬ－６（Ｂ）、ＩＬ－８（Ｃ）、及びＴＮＦ－α（Ｄ）の相対的ｍＲＮＡ発現を示す。２４時間での相対的ｍＲＮＡ発現を、静止状態でＴＣＰに対して正規化する。示されるデータは、平均値±ＳＤである。＊ｐ≦０．０５。略語：ＣＨＡＭ、凍結保存ヒト羊膜；ＤＤＨＡＭ、脱細胞化脱水ヒト羊膜；ＤＨＡＭ、脱水ヒト羊膜；ＧＭ－ＣＳＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；ＩＬ－６、インターロイキン－６；ＩＬ－８、インターロイキン－８；ＴＮＦ－α、腫瘍壊死因子アルファ。
【0030】
【図14A-14D】時間ごとのｍＲＮＡ発現を示す。刺激された状態（＋ＴＮＦ－α）における時間ごとのＧＭ－ＣＳＦ（Ａ）、ＩＬ－６（Ｂ）、ＩＬ－８（Ｃ）、及びＴＮＦ－α（Ｄ）の相対的ｍＲＮＡ発現を示す。時間ごとの相対的ｍＲＮＡ発現を、２４時間で発現するように正規化する。統計的比較は、刺激された状態における各羊膜についての時点間である。示されるデータは、平均値±ＳＤである。＊ｐ≦０．０５。略語：ＣＨＡＭ、凍結保存ヒト羊膜；ＤＤＨＡＭ、脱細胞化脱水ヒト羊膜；ＤＨＡＭ、脱水ヒト羊膜；ＧＭ－ＣＳＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；ＩＬ－６、インターロイキン－６；ＩＬ－８、インターロイキン－８；ＴＮＦ－α、腫瘍壊死因子アルファ。
【0031】
【図15A-15F】臨床事例を示す。上皮表面の画像を撮影して、臨床過程を示した：術前には、上皮の貧弱で不規則的な表面（Ａ）、前部基底膜ジストロフィーからの目に見える上皮下破片を有する貧弱な上皮の除去後（Ｂ）、全ての上皮下瘢痕及び前部基底膜ジストロフィー破片のバーリング後（Ｃ）、ＤＤＨＡＭの配置（Ｄ）、ＤＤＨＡＭ上の包帯コンタクトレンズの配置（Ｅ）を示し、術後１ヶ月には、明瞭な表面を示している。
【0032】
【図16A-16C】眼球ＡＭの調製を示す。ＤＤＨＡＭを１０ｍｍディスクとしてパッケージ化する（Ａ）。研究のために、１０ｍｍ生検パンチを使用して、ＤＨＡＭ（Ｂ）及びＣＨＡＭ（Ｃ）を１０ｍｍディスクにした。略語：ＣＨＡＭ、凍結保存ヒト羊膜；ＤＤＨＡＭ、脱細胞化脱水ヒト羊膜；ＤＨＡＭ、脱水ヒト羊膜。
【0033】
【図17】湾曲した形状にＢｉｏｖａｎｃｅ ３Ｌ ｏｃｕｌａｒを乾燥させることを可能にする３Ｄプリントされた型のモデルを示す。
【0034】
【図18】湾曲した形状に乾燥させたＢｉｏｖａｎｃｅ ３Ｌ ｏｃｕｌａｒを示す。
【発明を実施するための形態】
【0035】
本発明は、一緒に積層された細胞外マトリックスの複数の層を含む組織移植片生成物であって、細胞外マトリックスが、羊膜に由来し、細胞外マトリックス層の間質側が、組織移植片生成物の上表面及び下表面の両方に提示される、組織移植片生成物を提供する。
【0036】
いくつかの実施形態では、生成物は、細胞外マトリックスの３つ以上の層を含む。いくつかの実施形態では、生成物は、正確に細胞外マトリックスの３つの層を含む。
【0037】
いくつかの実施形態では、羊膜は、脱細胞化される。いくつかの実施形態では、羊膜は、洗剤及び又は機械的破壊で脱細胞化される。いくつかの実施形態では、洗剤は、デオキシコール酸である。
【0038】
いくつかの実施形態では、細胞外マトリックスの複数の層は、乾燥によって一緒に積層される。いくつかの実施形態では、生成物は、加熱及び又は真空によって乾燥される。
【0039】
いくつかの実施形態では、組織移植片生成物は、脱水される。いくつかの実施形態では、生成物は、乾燥重量で約２０％未満の水を含む。いくつかの実施形態では、生成物は、乾燥重量で約１５％未満の水を含む。いくつかの実施形態では、生成物は、乾燥重量で約１０％の水を含む。
【0040】
いくつかの実施形態では、生成物は、乾燥重量で約４０％～約７０％の総コラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、生成物は、乾燥重量で約４５％～約６０％の総コラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、生成物は、乾燥重量で約５０％～約５５％の総コラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、コラーゲンは、主に、Ｉ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲンである。
【0041】
いくつかの実施形態では、生成物は、乾燥重量で約８％～約２４％のエラスチンを含む。いくつかの実施形態では、生成物は、乾燥重量で約１２％～約２０％のエラスチンを含む。いくつかの実施形態では、生成物は、乾燥重量で約１５％～約２０％のエラスチンを含む。
【0042】
いくつかの実施形態では、生成物は、乾燥重量で約１％未満のグリコサミノグリカンを含む。好ましい実施形態では、生成物は、乾燥重量で約０．５％未満のグリコサミノグリカンを含む。いくつかの実施形態では、生成物は、乾燥重量で約１％未満のフィブロネクチンを含む。好ましい実施形態では、生成物は、乾燥重量で約０．５％未満のフィブロネクチンを含む。いくつかの実施形態では、生成物は、乾燥重量で約１％未満のラミニンを含む。好ましい実施形態では、生成物は、約０．５％未満のラミニンを含む。
【0043】
いくつかの実施形態では、羊膜は、ヒト羊膜である。いくつかの実施形態では、羊膜は、満期妊娠に由来する。
【0044】
本発明はまた、本発明の組織移植片生成物を含む眼球組織移植片を提供する。
【0045】
いくつかの実施形態では、眼球組織移植片は、ほぼ円形である。いくつかの実施形態では、眼球組織移植片は、球体の一部分の形状に湾曲部分を含む。
【0046】
いくつかの実施形態では、形状は、組織移植片生成物を型上で乾燥させることによって付与される。
【0047】
本発明はまた、対象における眼の疾患又は傷害を治療する方法であって、対象の眼を、本発明の組織移植片生成物又は眼球組織移植片と接触させるステップを含む、方法を提供する。
【0048】
いくつかの実施形態では、眼の傷害は、擦り傷を含む。いくつかの実施形態では、眼の傷害は、化学物質曝露を含む。いくつかの実施形態では、眼の傷害は、切り傷又は裂傷を含む。いくつかの実施形態では、眼の疾患又は傷害は、角膜の疾患又は傷害を含む。
【0049】
いくつかの実施形態では、治療は、損傷した組織の修復を含む。いくつかの実施形態では、治療は、治療していない眼に対する瘢痕組織の低減又は瘢痕組織形成の低減を含む。いくつかの実施形態では、治療は、治療していない眼に対する上皮細胞移動の増加を含む。いくつかの実施形態では、治療は、治療していない眼に対する上皮細胞接着性の増加を含む。いくつかの実施形態では、治療は、治療していない眼に対する上皮細胞増殖の増加を含む。いくつかの実施形態では、治療は、治療していない眼に対する上皮細胞被覆率の増加を含む。
【0050】
いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物である。好ましい実施形態では、対象は、ヒトである。
【実施例】
【0051】
実施例１：Ｂｉｏｖａｎｃｅの生化学的組成
ＢＩＯＶＡＮＣＥは、主にコラーゲン及びエラスチンで構成される。グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、及びラミニンも少量存在する。
ＢＩＯＶＡＮＣＥは、主にコラーゲン及びエラスチンで構成される。グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、及びラミニンも少量存在する。
【0052】
実施例２：ヒト眼球上皮細胞に対する眼球足場の効果の比較研究
それらの独自の生物学的特性による羊膜足場は、様々な眼球疾患の治療に使用されてきた。ベンチトップデータは、足場の再生特性が先天的な治癒メカニズムに影響を及ぼし得ることを示している。羊膜足場は、自然治癒を速め、自覚的な痛み及び外科的合併症を軽減するのに役立ち得る。羊膜足場の固有の再生能力を文書化する広範な調査にもかかわらず、組織の取得及び処理は絶えず進化している。どの処理方法が眼科用途に理想的な足場を生成するかを解明するためには、更なる努力が必要である。
それらの独自の生物学的特性による羊膜足場は、様々な眼球疾患の治療に使用されてきた。ベンチトップデータは、足場の再生特性が先天的な治癒メカニズムに影響を及ぼし得ることを示している。羊膜足場は、自然治癒を速め、自覚的な痛み及び外科的合併症を軽減するのに役立ち得る。羊膜足場の固有の再生能力を文書化する広範な調査にもかかわらず、組織の取得及び処理は絶えず進化している。どの処理方法が眼科用途に理想的な足場を生成するかを解明するためには、更なる努力が必要である。
【0053】
目的：ヒト眼球上皮細胞の接着性及び増殖に対する３つの羊膜足場（Ｂｉｏｖａｎｃｅ３Ｌ Ｏｃｕｌａｒ、ＡＭＢＩＯ２（登録商標）、ＡｍｎｉｏＧｒａｆｔ（登録商標））の効果を判定するため。
【0054】
方法：ヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥＣ）及びヒト結膜上皮細胞（ＨＣｏｎＥｐｉＣ）をウェルに播種した。接着性及び増殖を、１、４、及び７日目に足場上で測定した。馴化培地をウェルから抽出し、成長アッセイに使用した。
【0055】
結果：２つの他の足場と比較して、Ｂｉｏｖａｎｃｅ３Ｌ Ｏｃｕｌａｒは、有意に高い上皮細胞生存率（Ｐ＜０．００１）を示し、有意に高い上皮細胞接着性（Ｐ≦０．０１１）を示した。更に、上皮細胞増殖の速度は、ＡｍｎｉｏＧｒａｆｔ（登録商標）よりもＢｉｏｖａｎｃｅ３Ｌで有意に高かった（Ｐ＜０．００１）。Ｂｉｏｖａｎｃｅ３Ｌ Ｏｃｕｌａｒ及びＡＭＢＩＯ２（登録商標）上で培養された細胞からの馴化培地の存在下でのＨＣＥＣ移動は、同等であり（Ｐ＝０．８８５）、ＡｍｎｉｏＧｒａｆｔ（登録商標）上で成長させた細胞よりも有意に大きい（Ｐ≦０．００６）。馴化培地の存在下での、眼球足場上で培養された細胞からのＨＣＥＣの移動は、組織培養プラスチック上で成長させた細胞からの対照馴化培地よりも有意に大きかった（Ｐ＜０．００１）。異なる足場からの馴化培地は、ＨＣｏｎＥｐｉＣの移動に影響を与えなかった。
【0056】
結論：Ｂｉｏｖａｎｃｅ３Ｌ Ｏｃｕｌａｒは、他の足場と比較した場合、ＨＣＥＣ及びＨＣｏｎＥｐｉＣの両方のより高い生存率、接着性、及び増殖を支持することによって、ヒト上皮細胞に対する有意な効果を有していた。これらの所見の臨床的影響を判断するには、追加の調査が必要である。
【0057】
概要：Ｂｉｏｖａｎｃｅ３Ｌ Ｏｃｕｌａｒを市場競合他社のＡＭＢＩＯ２（登録商標）及びＡｍｎｉｏＧｒａｆｔ（登録商標）に対して比較して、様々なアッセイにおける細胞成長の差を判定した。Ｂｉｏｖａｎｃｅ３Ｌは、他の足場と比較した場合、ＨＣＥＣ及びＨＣｏｎＥｐｉＣの優れた生存率、接着性、及び増殖を示した。残留細胞、ＤＮＡ、成長因子、及びサイトカインを欠いたＢｉｏｖａｎｃｅ３Ｌ Ｏｃｕｌａｒは、自然な修復及び再生を達成するために必須である眼球上皮細胞についての優れた成長測定値を示した。
【0058】
実施例３：Ｂｉｏｖａｎｃｅ ３Ｌ
背景：羊膜は、幅広い臨床用途を有する。典型的には、単一層膜は、臨床的応用にわたって利用される。
背景：羊膜は、幅広い臨床用途を有する。典型的には、単一層膜は、臨床的応用にわたって利用される。
【0059】
角膜上皮細胞の再上皮化のための好ましい向きは、間質側と比較して、再上皮化を支持する羊膜の上皮側であることが文書化されている。
【0060】
例えば、Ｄ．Ｊ Ｈｕ（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｍａｙ ２００３，Ｖｏｌ．４４，３１５１）は、角膜欠損上に縫合された羊膜（ＡＭ）上の角膜再上皮化を２つの向きで比較した。ＡＭ基底膜前部（ＢＭＡ）及びＡＭ基底膜後部（ＢＭＰ）側。彼の結論は、角膜再上皮化率がＡＭの向きによって影響されないというものであった。角膜上皮は、向きに関係なく、ＡＭの基底膜（上皮側）に向かってより高い親和性を有する。臨床医は、この所見を考慮し、上皮は羊膜の両側で成長し得るが、再上皮化の大部分は基底膜表面上で起こることを認識する必要がある。
【0061】
我々の調査の問題／仮説：羊膜（ＡＭ）の側性（すなわち、上皮、間質）及び異なる膜処理方法（すなわち、ＤＤＨＡＭ、ＤＨＡＭ、及びＣＨＡＭ）は、ＨＣＥＣの接着性、増殖、及び移動にどのように影響を及ぼすか？
【0062】
加えて、残留細胞成分、細胞、細胞破片、ＤＮＡ、成長因子、及びサイトカインの完全な除去、並びに本質的な細胞外マトリックス分子を有する無傷の先天的なコラーゲンフレームワークの保持を目的とする我々の独自の脱細胞化プロセスは、天然の３次元形態で、残留細胞、細胞破片、ＤＮＡ、並びに成長因子及びサイトカインを含有する他の羊膜由来の生成物と比較して、優れた生体適合性、及び細胞分化機能を支持する能力を提供するというのが我々の仮説である。
【0063】
我々は、単一層状膜とは異なる３Ｌと呼ばれる３層状膜を、１つではなくこれらの３つの層で一緒に乾燥させ、新しい材料構成を形成することを考案した。新規の層形成ステップは、膜乾燥プロセスの前に追加され、予想外の新しい特性及び臨床用途を有する生成物を作り出した。この新規組成物の一部として、羊膜は、３層の厚さになるように重ねられ、上部及び下部で外向きの間質側を有する。この膜をそれ自体の上に重ね、乾燥させて、同じ羊膜から３つの層の膜を作り出す。
【0064】
我々の新しい生成物は、胎盤から剥がされ、浸漬のために中性洗剤である１％デオキシコール酸に入れられた羊膜からなる。羊膜は、膜の表面から羊膜細胞及び絨毛細胞のほぼ１００％、並びに組織の物質から線維芽細胞の大部分を除去することを意図した機械的剥離を受ける。
【0065】
最終生成物は、コラーゲン及び他のマトリックス成分に結合するエラスチン及びフィブロネクチンを含む、羊膜の天然コラーゲン構造を保持する細胞外マトリックスで構成された三層羊膜構造組織である。
【0066】
新規の層形成ステップは、膜乾燥プロセスの前に追加され、予想外の新しい特性及び臨床用途を有する生成物を作り出した。
【0067】
この新規組成物の一部として、羊膜は、３層の厚さになるように重ねられ、上部及び下部で外向きの間質側を有する。乾燥後、羊膜を所望のサイズに切断し、各個々の部片を内側パウチに入れ、ラベル付けし、密封し、滅菌する。
【0068】
Ｂｉｏｖａｎｃｅ ３Ｌの予想外の結果は、３Ｌ ＢＩＯＶＡＮＣＥ Ｏｃｕｌａｒの間質側対上皮側におけるヒト角膜上皮及びヒト結膜細胞の付着、増殖、及び移動の違いに関連している。加えて、脱細胞化プロセスは、羊膜の性能に対する影響を有する。
【0069】
統計分析：独立変数は、ＡＭ（ＤＤＨＡＭ、ＤＨＡＭ、ＣＨＡＭ）、側（上皮、間質）、及び時間（１日目、４日目、及び７日目）である。従属変数は、細胞の接着性、増殖、及び移動である。以下の結果は、３つの羊膜（ＡＭ）の上皮側及び間質側の両方におけるヒト角膜上皮細胞についてのものである：Ｂｉｏｖａｎｃｅ３Ｌ Ｏｃｕｌａｒ（ＤＤＨＡＭ）、ＡＭＢＩＯ２（ＤＨＡＭ）、及びＡｍｎｉｏＧｒａｆｔ（ＣＨＡＭ）。
【0070】
データは、平均値±標準偏差（ＳＤ）として示される。データを試験し、ほぼ正規分布であることを見出した。細胞の接着性及び移動を、Ｔｕｋｅｙ事後検定を伴う二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）で分析した。細胞増殖を、Ｔｕｋｅｙ事後検定を伴う三元配置ＡＮＯＶＡで分析した。ＡＮＯＶＡ結果は、Ｆ統計量及びその関連する自由度として報告される。ペアリングされていないｔ検定を、指示されたときに事後検定として実施した。ｐ値＜０．０５を有意とみなした。ＩＢＭ ＳＰＳＳ（Ｂｕｉｌｄ １．０．０．１４４４）を使用して、全ての分析を実施した。
【0071】
Ｂｉｏｖａｎｃｅ（登録商標）Ｔｒｉ－ｌａｙｅｒは、保存された天然上皮基底膜、及びその生化学的成分を有する無傷の細胞外マトリックス構造を有する三層状の脱細胞化脱水ヒト羊膜（ＤＤＨＡＭ）である。この同種移植片の上皮基底膜及び細胞外マトリックスは、細胞付着又は浸潤及び成長因子貯蔵を可能にする天然足場を提供する。Ｂｉｏｖａｎｃｅ（登録商標）Ｔｒｉ－ｌａｙｅｒは、保護カバーを提供し、身体の創傷治癒プロセスを支持する。Ｂｉｏｖａｎｃｅ（登録商標）Ｔｒｉ－ｌａｙｅｒは、現在、３Ｌ Ｂｉｏｖａｎｃｅ（登録商標）及びＢｉｏｖａｎｃｅ（登録商標）３Ｌ Ｏｃｕｌａｒとして市販されている。
【0072】
Ｂｉｏｖａｎｃｅ（登録商標）Ｔｒｉ－ｌａｙｅｒ、脱細胞化脱水ヒト羊膜（ＤＤＨＡＭ）は、胎盤から剥がされ、浸漬のために中性洗剤である１％デオキシコール酸に入れられた羊膜からなる。羊膜は、膜の表面から羊膜細胞及び絨毛細胞のほぼ１００％を除去することを意図した機械的剥離を受ける。線維芽細胞の大部分も組織の物質から除去される。この膜をそれ自体の上に重ね、乾燥させて、Ｂｉｏｖａｎｃｅ（登録商標）の３層状生成物バージョンを作り出す。最終生成物は、コラーゲン及び他のマトリックス成分に結合するフィブロネクチンを含む、羊膜の天然コラーゲン構造を保持する細胞外マトリックスで構成された構造組織である。完成した生成物は、細胞、ホルモン、成長因子、及びサイトカインを欠いた三層羊膜である。
【0073】
Ｂｉｏｖａｎｃｅ（登録商標）Ｔｒｉ－ｌａｙｅｒの製造プロセスを合理化及び最適化するために、プロセス開発チームは、Ｂｉｏｖａｎｃｅ（登録商標）プロセスのための全ての処理ステップを活用した。膜を乾燥させる前に、層形成ステップを追加した。滅菌ステップ及び放出基準も、Ｂｉｏｖａｎｃｅ（登録商標）プロセスからＢｉｏｖａｎｃｅ（登録商標）Ｔｒｉ－ｌａｙｅｒプロセスに引き継がれた。
【0074】
羊膜は、１％デオキシコール酸溶液中に収穫され、最大１４日間２～８℃で貯蔵することができる。許容可能な母体血液結果が得られると、羊膜が貯蔵部から取り出され、処理が開始される。羊膜は、一連の手作業で剥離され、洗浄された後に重ねられる。羊膜は、３層の厚さになるように重ねられ、上部及び下部で外向きの間質側を有する。乾燥後、羊膜を所望のサイズに切断し、各個々の部片を内側パウチに入れ、ラベル付けし、密封し、目視検査のために提出する。目視検査中、組織は、サイズ、形状、穴、破れ／裂け目、破片、及び染みについて検査される。目視検査後、内側パウチ内の各部片を、ラベル付けされた外側パウチに入れ、密封し、滅菌する。
【0075】
結果：
細胞接着性：
細胞接着性は、ＡＭの上皮側（９，７８８．５０±５，７０４．１７ＡＵ）（側の主効果、Ｆ（１，１８）＝６．７１４、ｐ＝０．０１８）よりも間質側（１２，３４２．４２±４，５３６．６０ＡＵ）において高く、これは、ＤＨＡＭの間質側（１３，１００．２５±４，６７５．２４ＡＵ、ｐ＝０．０１７）、ＤＤＨＡＭの上皮側（１６，７２５．２５±１，４５３．６２ＡＵ、ｐ＜０．００１）、ＣＨＡＭの上皮側（８，３９２．５０±１，４２５．８６ＡＵ、ｐ＜０．００１）、ＤＤＨＡＭの間質側（１６，３３４．７５±５９１．８５ＡＵ、ｐ＝０．００２）、及びＣＨＡＭの間質側（７，５９２．２５±１，０７３．２２ＡＵ、ｐ＜０．００１）（側×ＡＭ、ｐ＝０．００１）と比較して、ＤＨＡＭの上皮側（４，２４７．７５±２，７３２．８７ＡＵ）におけるより低い細胞接着性に起因し得る。
細胞接着性：
細胞接着性は、ＡＭの上皮側（９，７８８．５０±５，７０４．１７ＡＵ）（側の主効果、Ｆ（１，１８）＝６．７１４、ｐ＝０．０１８）よりも間質側（１２，３４２．４２±４，５３６．６０ＡＵ）において高く、これは、ＤＨＡＭの間質側（１３，１００．２５±４，６７５．２４ＡＵ、ｐ＝０．０１７）、ＤＤＨＡＭの上皮側（１６，７２５．２５±１，４５３．６２ＡＵ、ｐ＜０．００１）、ＣＨＡＭの上皮側（８，３９２．５０±１，４２５．８６ＡＵ、ｐ＜０．００１）、ＤＤＨＡＭの間質側（１６，３３４．７５±５９１．８５ＡＵ、ｐ＝０．００２）、及びＣＨＡＭの間質側（７，５９２．２５±１，０７３．２２ＡＵ、ｐ＜０．００１）（側×ＡＭ、ｐ＝０．００１）と比較して、ＤＨＡＭの上皮側（４，２４７．７５±２，７３２．８７ＡＵ）におけるより低い細胞接着性に起因し得る。
【0076】
追加的に、ＡＭ（ＡＭの主効果、Ｆ（２，１８）＝３０．８９６、ｐ＜０．００１）間で細胞接着性に有意な差があり、ＤＨＡＭ（８，６７４．００±５，９１２．６１ＡＵ、ｐ＜０．００１）及びＣＨＡＭ（７，９９２．３８±１，２４４．１６ＡＵ、ｐ＜０．００１）よりもＤＤＨＡＭ（１６，５３０．００±１，０４８．４６ＡＵ）において有意に高い細胞接着性を有していた。しかしながら、上で示したように、細胞接着性は、側及びＡＭによって変動した。細胞接着性は、ＤＤＨＡＭの上皮側とＤＤＨＡＭの間質側との間（ｐ＝０．６４５）、及びＣＨＡＭの上皮側とＣＨＡＭの間質側との間（ｐ＝０．４０４）で類似していた。しかしながら、細胞接着性は、ＤＨＡＭの上皮側よりもＤＨＡＭの間質側において有意に高かった（Ｐ＝０．０１７）。したがって、細胞接着性は、ＤＨＡＭの上皮側（ｐ≦０．００２）、ＣＨＡＭの上皮側（事後試験、ｐ＜０．００１）、及びＣＨＡＭの間質側（事後検定、ｐ＜０．００１）よりもＤＤＨＡＭの間質側及び上皮側において有意に高く、一方、ＤＤＨＡＭの間質側とＤＨＡＭの間質側との間では細胞接着性が類似していた（ｐ＝０．２１９）。
【0077】
細胞増殖：
生存細胞の数は、７日間の培養にわたって有意に減少したが（時間の主効果；（Ｆ（２，５４）＝４４．８８０、ｐ＜０．００１）、細胞数は、側、ＡＭ、及び時間（側×ＡＭ×時間の相互作用；（Ｆ（４，５４）＝３．６３３、ｐ＝０．０１１）で有意に変動した。最も注目すべきは、細胞数は、４日目のＤＤＨＡＭの間質側を除いて、全ての変数について時間ごとに減少した。４日目には、相対的増殖率は、ＤＤＨＡＭの上皮側（５２．２７±１４．４１％、ｐ＜０．００１）、ＤＨＡＭの上皮側（１２．５４±１６．７９％、ｐ＝０．０１２）、及びＣＨＡＭの間質側（１５．００±６．７３％、ｐ＜０．００１）よりもＤＤＨＡＭの間質側（１１５．２９±１５．５４％）において有意に高かった。ＤＤＨＡＭの間質側とＣＨＡＭの上皮側（４６．８３±２５．６９％、ｐ＝０．７３１）との間、又はＤＤＨＡＭの間質側とＤＨＡＭの間質側（９５．５４±４４．２５％、ｐ＝０．４３０）との間の相対的増殖率に有意な差はなかった。しかしながら、ＤＨＡＭの間質側は、ＣＨＡＭの間質側よりも有意に高かった（ｐ＝０．０１２）。４日目からの細胞数の減少にもかかわらず、７日目には、相対的増殖率は、ＣＨＡＭの間質側（６．８７±１．７７％、ｐ＝０．０３５）及びＤＨＡＭの上皮側（７．５４±５．８４％、ｐ＝０．０１７）よりもＤＤＨＡＭの間質側（５９．４７±２８．４８％）において有意に高かった。
生存細胞の数は、７日間の培養にわたって有意に減少したが（時間の主効果；（Ｆ（２，５４）＝４４．８８０、ｐ＜０．００１）、細胞数は、側、ＡＭ、及び時間（側×ＡＭ×時間の相互作用；（Ｆ（４，５４）＝３．６３３、ｐ＝０．０１１）で有意に変動した。最も注目すべきは、細胞数は、４日目のＤＤＨＡＭの間質側を除いて、全ての変数について時間ごとに減少した。４日目には、相対的増殖率は、ＤＤＨＡＭの上皮側（５２．２７±１４．４１％、ｐ＜０．００１）、ＤＨＡＭの上皮側（１２．５４±１６．７９％、ｐ＝０．０１２）、及びＣＨＡＭの間質側（１５．００±６．７３％、ｐ＜０．００１）よりもＤＤＨＡＭの間質側（１１５．２９±１５．５４％）において有意に高かった。ＤＤＨＡＭの間質側とＣＨＡＭの上皮側（４６．８３±２５．６９％、ｐ＝０．７３１）との間、又はＤＤＨＡＭの間質側とＤＨＡＭの間質側（９５．５４±４４．２５％、ｐ＝０．４３０）との間の相対的増殖率に有意な差はなかった。しかしながら、ＤＨＡＭの間質側は、ＣＨＡＭの間質側よりも有意に高かった（ｐ＝０．０１２）。４日目からの細胞数の減少にもかかわらず、７日目には、相対的増殖率は、ＣＨＡＭの間質側（６．８７±１．７７％、ｐ＝０．０３５）及びＤＨＡＭの上皮側（７．５４±５．８４％、ｐ＝０．０１７）よりもＤＤＨＡＭの間質側（５９．４７±２８．４８％）において有意に高かった。
【0078】
細胞の数はまた、ＡＭの上皮側（５，６４８．００±５，３１２．５６ＡＵ、主効果側；Ｆ（１，５４）＝３９．５４５、ｐ＜０．００１）よりも間質側（９，３８３．３３±６，４６９．１５ＡＵ）において有意に多く、これは、ＤＤＨＡＭ及びＤＨＡＭの上皮側よりも間質側上の有意に多くの細胞によって主として引き起こされている（側×ＡＭ相互作用；ｐ＜０．００１）；ＤＤＨＡＭ間質：１４，９７２．００±４，９７３．００ＡＵ対ＤＤＨＡＭ上皮：１０，４３８．５０±５，５５５．９８ＡＵ、ｐ＝０．０４７；ＤＨＡＭ間質：１０，１０３．３３±４，３３６．４９ＡＵ対ＤＨＡＭ上皮：１，５９０．４２±２，４３１．２５ＡＵ、ｔ（２２）＝５．９３２、ｐ＜０．００１）。逆に、ＣＨＡＭ 上皮側（４，９１５．０８±３，０７２．４２ＡＵ）及び間質側（３，０７４．６７±３，４０１．０９ＡＵ、ｐ＝０．１７８）において類似した数の細胞。
【0079】
細胞数はまた、ＣＨＡＭ（３，９９４．８８±３，３０６．１３ＡＵ、ｐ＜０．００１）よりもＤＤＨＡＭ（１２，７０５．２５±５，６５２．６７ＡＵ）上に有意に多い細胞を有するＡＭ間で有意な差があった（主効果ＡＭ；Ｆ（２，５４）＝７９．５７０、ｐ＜０．００１）。ＤＤＨＡＭとＤＨＡＭとの間（５，８４６．８８±５，５４３．１０、Ｐ＝０．０６５）、又はＤＨＡＭとＣＨＡＭとの間（ｐ＝０．０８５）の細胞数に有意な差はなかった。ＤＨＡＭ及びＣＨＡＭの類似した細胞カウントは、ＤＨＡＭの上皮側における低い細胞カウント（１，５９０．４２±２，４３１．２５ＡＵ）によって説明することができ、これは、ＤＨＡＭの間質側（１０，１０３．３３±４，３３６．４９ＡＵ、ｐ＜０．００１）、ＤＤＨＡＭの間質側（１４，９７２．００±４，９７３．００ＡＵ、ｐ＜０．００１）、ＤＤＨＡＭの上皮側（１０，４３８．５０±５，５５５．９８ＡＵ、ｐ＜０．００１）、及びＣＨＡＭの上皮側（４，９１５．０８±３，０７２．４２ＡＵ、ｐ＝０．００８）よりも有意に低かった。ＤＨＡＭの上皮側及びＣＨＡＭの間質側における細胞カウントは、類似していた（３，０７４．６７±３，４０１．０９ＡＵ、ｐ＝０．１１７）。
【0080】
細胞移動：
細胞移動は、ＡＭ間で有意に異なり（ＡＭ主効果；Ｆ（２，４９）＝６．８１９、ｐ＝０．００２）、細胞移動は、ＣＨＡＭ（３４４，４７１．０６±１０６，０９４．１８ｐｘ２、ｐ＝０．００３）よりもＤＤＨＡＭにおいて有意に大きい（４６６，０８５．１３±９８，３３９．５２ｐｘ２）。加えて、細胞移動は、ＤＤＨＡＭ（ｐ＜０．００１）、ＤＨＡＭ（４２０，３４９．８８±９５，１０９．８６ｐｘ２、ｐ＜０．００１）、及びＣＨＡＭ（ｐ＜０．００１）よりも培地対照において有意に低かった。側の主効果はなく、これは、ＡＭの上皮側（４２１，６６９．９６±１１３，４３５．９５ｐｘ２）及び間質側（３８９，９３４．０８±１０７，９７９．５１ｐｘ２、Ｆ（１，４９）＝０．７０１、Ｐ＝０．４０７）において細胞移動が類似していたことを示している。細胞移動は、羊膜及び側で統計的に差はなかった（ｐ＝０．１５９）。
細胞移動は、ＡＭ間で有意に異なり（ＡＭ主効果；Ｆ（２，４９）＝６．８１９、ｐ＝０．００２）、細胞移動は、ＣＨＡＭ（３４４，４７１．０６±１０６，０９４．１８ｐｘ２、ｐ＝０．００３）よりもＤＤＨＡＭにおいて有意に大きい（４６６，０８５．１３±９８，３３９．５２ｐｘ２）。加えて、細胞移動は、ＤＤＨＡＭ（ｐ＜０．００１）、ＤＨＡＭ（４２０，３４９．８８±９５，１０９．８６ｐｘ２、ｐ＜０．００１）、及びＣＨＡＭ（ｐ＜０．００１）よりも培地対照において有意に低かった。側の主効果はなく、これは、ＡＭの上皮側（４２１，６６９．９６±１１３，４３５．９５ｐｘ２）及び間質側（３８９，９３４．０８±１０７，９７９．５１ｐｘ２、Ｆ（１，４９）＝０．７０１、Ｐ＝０．４０７）において細胞移動が類似していたことを示している。細胞移動は、羊膜及び側で統計的に差はなかった（ｐ＝０．１５９）。
【0081】
実施例４：脱細胞化脱水ヒト羊膜由来の生体材料は、ヒト角膜上皮細胞機能及び炎症応答を支持する
目的の記述：創傷治癒のための脱細胞化組織系生体材料の成功的な適用には、細胞の機能及び分化を支持するマトリックス成分が必要となる。羊膜（ＡＭ）は、眼球治癒に使用するのを好適にする独自の生物学的及び機械的特性を有するヒト胎盤組織からの天然由来の生体材料である（１，２）。この研究の目的は、ヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥＣ）機能に対する側性及びＡＭ処理方法のインビトロでの効果を評価することである。実験変数としては、ＡＭ側性（上皮［Ｅ］及び間質［Ｓ］）及びＡＭ処理方法（脱細胞化及び脱水［ＤＤＨＡＭ］、脱水［ＤＨＡＭ］、及び凍結保存［ＣＨＡＭ］）が挙げられる。従属変数としては、ＨＣＥＣ生存率、移動、及び炎症応答が挙げられる。
目的の記述：創傷治癒のための脱細胞化組織系生体材料の成功的な適用には、細胞の機能及び分化を支持するマトリックス成分が必要となる。羊膜（ＡＭ）は、眼球治癒に使用するのを好適にする独自の生物学的及び機械的特性を有するヒト胎盤組織からの天然由来の生体材料である（１，２）。この研究の目的は、ヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥＣ）機能に対する側性及びＡＭ処理方法のインビトロでの効果を評価することである。実験変数としては、ＡＭ側性（上皮［Ｅ］及び間質［Ｓ］）及びＡＭ処理方法（脱細胞化及び脱水［ＤＤＨＡＭ］、脱水［ＤＨＡＭ］、及び凍結保存［ＣＨＡＭ］）が挙げられる。従属変数としては、ＨＣＥＣ生存率、移動、及び炎症応答が挙げられる。
【0082】
方法：異なって処理された市販されている眼球ＡＭを３つ選択した：Ｂｉｏｖａｎｃｅ３Ｌ Ｏｃｕｌａｒ（ＤＤＨＡＭ）、Ａｍｂｉｏ２（登録商標）（ＤＨＡＭ）、及びＡｍｎｉｏＧｒａｆｔ（登録商標）（ＣＨＡＭ）。ＨＣＥＣをＡＭのＥ側及びＳ側上に播種し、１、４、及び７日間インキュベートした。ａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイを使用して、細胞生存率をＡＭ上の各時点で測定した。ＡＭ上で培養したＨＣＥＣからの馴化培地を収集し、スクラッチ創傷アッセイを使用して、ＨＣＥＣの移動に対する馴化培地の効果を評価した。炎症応答は、ＴＮＦａ治療によって誘導された。ＨＣＥＣにおける炎症誘発性遺伝子の発現に対するＡＭの効果を、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を使用して比較した。全ての統計的試験についての有意なレベルを、ｐ＝０．０５に設定した。細胞生存率を二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）で、細胞増殖を三元配置ＡＮＯＶＡで、及びｍＲＮＡ発現を一元配置ＡＮＯＶＡで分析した。Ｔｕｋｅｙ検定及び対応のないｔ検定を事後分析に使用した。
【0083】
結果：１日目には、細胞生存率は、ＣＨＡＭ－Ｅ＆Ｓ（ｐ＜０．００１）及びＤＨＡＭ－Ｅ（ｐ≦０．００２）よりもＤＤＨＡＭ－Ｅ＆Ｓにおいて有意に高かった。４日目には、細胞生存率は、他の全ての変数よりもＤＤＨＡＭ－Ｓにおいて有意に高かった（ｐ≦０．００４、図１）。加えて、４日目には、細胞生存率は同等であった。
【0084】
ＤＤＨＡＭ－ＥとＤＨＡＭ－Ｓとの間（ｐ＝０．１４７）、及びＤＨＡＭ－Ｅ（ｐ≦０．００４）、ＣＨＡＭ－Ｓ＆Ｅ（ｐ≦０．０１７）よりも有意に高い。７日目には、細胞生存率は、ＤＨＡＭ－Ｅ（ｐ＝０．０２８）及びＣＨＡＭ－Ｓ＆Ｅ（ｐ≦０．０４９）よりもＤＤＨＡＭ－Ｓにおいて有意に高かった。細胞生存率は、ＤＤＨＡＭ－Ｅと他の全ての変数との間で類似していた（ｐ≧０．０９７）。ＤＤＨＡＭ及びＤＨＡＭ上で培養された細胞からの馴化培地の存在下でのＨＣＥＣ移動は、同等であり（ｐ＝０．８８５）、ＣＨＡＭ上で成長した細胞よりも有意に大きい（ｐ≦０．００５）。興味深いことに、ＤＤＨＡＭ上で培養されたＨＣＥＣは、インサイチュでの眼球上皮細胞の形態を模倣する石畳形態（図２）を適応させた（３）。馴化培地の存在下での、眼球足場上で培養された細胞からのＨＣＥＣの移動は、組織培養プラスチック上で成長させた細胞からの対照馴化培地よりも有意に大きかった（ｐ＜０．００１）。更に、ＴＮＦａによる炎症刺激に応答して、ＤＤＨＡＭ上のＨＣＥＣにおける炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－８、及びＴＮＦａ）の遺伝子発現は、初期の増加に続いて時間ごとに低下を示した（図３）。
【0085】
結論：このインビトロ研究では、ＤＤＨＡＭ－Ｓは、ＨＣＥＣ生存率及び移動を最良に支持した。ＤＤＨＡＭの存在はまた、経時的にＨＣＥＣの炎症応答を減衰させた。
【0086】
参考文献：
１．Ｗａｌｋｄｅｎ Ａ．Ｃｌｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０２０；１４：２０５７－２０７２．
２．Ｍａｌｈｏｔｒａ Ｃ．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１４；４（２）：１１１－１２１．
３．Ｓｏｓｎｏｖａ－Ｎｅｔｕｋｏｖａ Ｍ．Ｂｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２００７；９１（３）：３７２－３７８．
１．Ｗａｌｋｄｅｎ Ａ．Ｃｌｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０２０；１４：２０５７－２０７２．
２．Ｍａｌｈｏｔｒａ Ｃ．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１４；４（２）：１１１－１２１．
３．Ｓｏｓｎｏｖａ－Ｎｅｔｕｋｏｖａ Ｍ．Ｂｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２００７；９１（３）：３７２－３７８．
【0087】
実施例５：異なって設計された眼球羊膜におけるヒト角膜上皮細胞活性及び炎症応答のインビトロ比較、並びに臨床事例
羊膜（ＡＭ）は、眼科にとって重要な生物学的及び機械的特性を有する天然由来の生体材料である。ＡＭの上皮側は上皮化を促進し、一方、間質側は炎症を調節する。しかしながら、全てのＡＭが等しいとは限らない。ＡＭは、細胞含有量及び構造において得られた変化を伴う異なる処理を受ける。この研究では、ヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥＣ）活性に対する側性及び処理の効果、並びにＨＣＥＣ炎症応答に対する処理の効果を評価し、事例を提示する。異なって処理され、市販されている眼球ＡＭを３つ選択した：（１）Ｂｉｏｖａｎｃｅ３Ｌ Ｏｃｕｌａｒ、脱細胞化脱水ヒトＡＭ（ＤＤＨＡＭ）、（２）ＡＭＢＩＯ２（登録商標）、脱水ヒトＡＭ（ＤＨＡＭ）、及び（３）ＡｍｎｉｏＧｒａｆｔ（登録商標）、凍結保存ヒトＡＭ（ＣＨＡＭ）。ＨＣＥＣをＡＭ上に播種し、１、４、及び７日間インキュベートした。細胞の接着性及び生存率を、ａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイを使用して評価した。スクラッチ創傷アッセイを使用して、ＨＣＥＣ移動を評価した。炎症応答は、ＴＮＦα治療によって誘導された。ＨＣＥＣにおける炎症誘発性遺伝子の発現に対するＡＭの効果を、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を使用して比較した。染色により、ＤＤＨＡＭにおける完全な脱細胞化及び核の不存在を確認した。ＨＣＥＣ活性は、ＤＤＨＡＭの間質側において最良に支持された。炎症刺激下で、ＤＤＨＡＭは、より高い初期炎症応答を促進し、時間ごとに低下する傾向があった。臨床的に、ＤＤＨＡＭを使用して、前部基底膜ジストロフィーを成功的に治療した。ＤＨＡＭ及びＣＨＡＭと比較して、ＤＤＨＡＭは、インビトロでのＨＣＥＣの細胞活性に対して有意なプラスの効果を有し、インビボでのより高い眼球細胞適合性を示唆し得る。
羊膜（ＡＭ）は、眼科にとって重要な生物学的及び機械的特性を有する天然由来の生体材料である。ＡＭの上皮側は上皮化を促進し、一方、間質側は炎症を調節する。しかしながら、全てのＡＭが等しいとは限らない。ＡＭは、細胞含有量及び構造において得られた変化を伴う異なる処理を受ける。この研究では、ヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥＣ）活性に対する側性及び処理の効果、並びにＨＣＥＣ炎症応答に対する処理の効果を評価し、事例を提示する。異なって処理され、市販されている眼球ＡＭを３つ選択した：（１）Ｂｉｏｖａｎｃｅ３Ｌ Ｏｃｕｌａｒ、脱細胞化脱水ヒトＡＭ（ＤＤＨＡＭ）、（２）ＡＭＢＩＯ２（登録商標）、脱水ヒトＡＭ（ＤＨＡＭ）、及び（３）ＡｍｎｉｏＧｒａｆｔ（登録商標）、凍結保存ヒトＡＭ（ＣＨＡＭ）。ＨＣＥＣをＡＭ上に播種し、１、４、及び７日間インキュベートした。細胞の接着性及び生存率を、ａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイを使用して評価した。スクラッチ創傷アッセイを使用して、ＨＣＥＣ移動を評価した。炎症応答は、ＴＮＦα治療によって誘導された。ＨＣＥＣにおける炎症誘発性遺伝子の発現に対するＡＭの効果を、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を使用して比較した。染色により、ＤＤＨＡＭにおける完全な脱細胞化及び核の不存在を確認した。ＨＣＥＣ活性は、ＤＤＨＡＭの間質側において最良に支持された。炎症刺激下で、ＤＤＨＡＭは、より高い初期炎症応答を促進し、時間ごとに低下する傾向があった。臨床的に、ＤＤＨＡＭを使用して、前部基底膜ジストロフィーを成功的に治療した。ＤＨＡＭ及びＣＨＡＭと比較して、ＤＤＨＡＭは、インビトロでのＨＣＥＣの細胞活性に対して有意なプラスの効果を有し、インビボでのより高い眼球細胞適合性を示唆し得る。
【0088】
序論：羊膜（ＡＭ）は、眼科で使用するために特に好適なものとする独自の生物学的及び機械的特性を有する天然由来の生体材料である（Ｌｅａｌ－Ｍａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．２０２１、Ｗａｌｄｅｎ，２０２０、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．２０１９、Ｍａｌｈｏｔｒａ＆Ｊａｉｎ，２０１４、Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ．２００５）。羊膜組織は、上皮化の促進（Ｓｈａｙａｎ ｅｔ ａｌ．２０１９、Ｍｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２００２、Ｍｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９９）、炎症の軽減（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．２０１６、Ｔａｂａｔａｂａｅｉ ｅｔ ａｌ．２０１７、Ｔａｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１１）、瘢痕組織形成の阻害（Ｎｉｋｎｅｊａｄ ｅｔ ａｌ．２００８、Ｔｓｅｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９９ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．２０００）、新しい血管の遮断（Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．２０００）、及び抗微生物剤として作用する能力（Ｍａｍｅｄｅ＆Ｂｏｔｅｌｈｏ，２０１５、Ｔｅｈｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．２０１３、Ｓａｎｇｗａｎ ｅｔ ａｌ．２０１１、Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．２００１、Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．１９９９、Ｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．１９９１）を通して、眼球表面の治癒及び再建を促進すると考えられている。眼科では、ＡＭは、種々の眼球状態を治療するために広く使用される。臨床的に、ＡＭは、外科用パッチとして、損傷した眼球組織を置き換えるための基質として、又はパッチ及び基質の両方として組み合わせて使用することができる。
【0089】
パッチとして、ＡＭは、パッチの真下の宿主組織の再上皮化を促進する一時的な生体包帯又はコンタクトレンズとして作用し（Ｗａｌｄｅｎ，２０２０、Ｍａｌｈｏｔｒａ＆Ｊａｉｎ，２０１４）、間質側を下にして配置して、炎症細胞を捕捉し、アポトーシスを誘導することによって炎症応答を下方制御する（Ｄｕａ ｅｔ ａｌ．２００４、Ｓｈｉｍｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．２００１）。ＡＭ上皮側を上にして配置することによって、ＡＭは、上皮細胞の移動及び成長のための基質及び足場として作用する（Ｍａｌｈｏｔｒａ＆Ｊａｉｎ，２０１４）。ＡＭは再上皮化を促進するために上皮側を上にして配置するべきであると広く受け入れられているが（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．２００３）、膜の間質側は上皮細胞成長を支持することが示されている（Ｓｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．２００６）。注目すべきは、既存の調査の多くは、凍結保存されたＡＭに限定されており、これらの所見が、異なる処理方法を受けた他のＡＭにも適用されるかどうかは不明なままである。
【0090】
臨床的応用の前に、ＡＭは、細胞の含有量及び構造に結果として生じる変化を伴って滅菌及び処理される（Ｌｅａｌ－Ｍａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．２０２１、ｖｏｎ Ｖｅｒｓｅｎ－Ｈｏｅｙｎｃｋ ｅｔ ａｌ．２００４、Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．２０１０）。この組織は、直接使用することができるか、又は脱細胞化の追加のプロセスを受けることができる（Ｔｅｈｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．２０２１）。脱細胞化は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の天然の構造的及び化学的要素を保持しながら、免疫応答を阻止するために内因性細胞、細胞破片、及びＤＮＡ残留物を除去するプロセスである（Ｇｈｏｌｉｐｏｕｒｍａｌｅｋａｂａｄｉ ｅｔ ａｌ．２０１５）。以前の研究では、ＥＣＭ生成物中の残留ＤＮＡの量と宿主炎症応答との間の相関を示している（Ｋｅａｎｅ ｅｔ ａｌ．２０１２、Ｓｅｉｆ－Ｎａｒａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１３）。組織の保存と同様に、脱細胞化はＥＣＭ内の構造及び実体にも影響を与え得る（Ａａｍｏｄｔ＆Ｇｒａｉｎｇｅｒ，２０１６）。したがって、成功的な保存－脱細胞化プロトコルは、細胞物質の除去と、ＥＣＭの先天的な特性及び機能的特性の保持との微妙なバランスを取る必要がある（Ｇｈｏｌｉｐｏｕｒｍａｌｅｋａｂａｄｉ ｅｔ ａｌ．２０１５、Ａａｍｏｄｔ＆Ｇｒａｉｎｇｅｒ，２０１６、Ｂａｌｅｓｔｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．２０１５）。我々の知る限りでは、異なる保存－脱細胞化プロトコルがヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥＣ）の細胞活性及び炎症応答にどのように影響を与えるかを評価した研究はない。
【0091】
このプロジェクトは、初めて、
ＨＣＥＣの細胞活性（すなわち、接着性、生存率、及び移動）に対する羊膜の側性（すなわち、上皮対間質）及び処理方法の効果、
ＨＣＥＣの炎症応答（すなわち、炎症誘発性サイトカインの発現）に対する異なる処理方法の効果、を評価することを目的としている。
ＨＣＥＣの細胞活性（すなわち、接着性、生存率、及び移動）に対する羊膜の側性（すなわち、上皮対間質）及び処理方法の効果、
ＨＣＥＣの炎症応答（すなわち、炎症誘発性サイトカインの発現）に対する異なる処理方法の効果、を評価することを目的としている。
【0092】
したがって、比較のために、異なって処理された市販されている眼球ＡＭを３つ選択した：
Ｂｉｏｖａｎｃｅ３Ｌ Ｏｃｕｌａｒ（Ｃｅｌｕｌａｒｉｔｙ，Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ，ＮＪ）、脱細胞化脱水ヒト羊膜（ＤＤＨＡＭ）、
ＡＭＢＩＯ２（登録商標）（Ｋａｔｅｎａ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）、脱水ヒト羊膜（ＤＨＡＭ）、
ＡｍｎｉｏＧｒａｆｔ（登録商標）（Ｂｉｏｔｉｓｓｕｅ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）、凍結保存ヒト羊膜（ＣＨＡＭ）。
Ｂｉｏｖａｎｃｅ３Ｌ Ｏｃｕｌａｒ（Ｃｅｌｕｌａｒｉｔｙ，Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ，ＮＪ）、脱細胞化脱水ヒト羊膜（ＤＤＨＡＭ）、
ＡＭＢＩＯ２（登録商標）（Ｋａｔｅｎａ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）、脱水ヒト羊膜（ＤＨＡＭ）、
ＡｍｎｉｏＧｒａｆｔ（登録商標）（Ｂｉｏｔｉｓｓｕｅ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）、凍結保存ヒト羊膜（ＣＨＡＭ）。
【0093】
Ｂｉｏｖａｎｃｅ（登録商標）３Ｌ Ｏｃｕｌａｒは、３層ＤＤＨＡＭである。Ｂｉｏｖａｎｃｅ（登録商標）３Ｌ Ｏｃｕｌａｒは、間質側が外側に面した状態で独自に設計されている。したがって、間質側は、その向きに関係なく、眼球表面と接する。更に、３つの層を有することにより、その取り扱い特性が強化される。ＡＭを適格な時期の胎盤から切除し、洗浄し、剥離して、無関係の組織及び細胞を除去する。次いで、組織を、浸透圧ショック法を使用した後、中性洗剤処理を行って脱細胞化し、乾燥させ、滅菌する。以前の調査では、この専用の脱細胞化プロセスが、フィブロネクチン、ラミニン、グリコサミノグリカン、及びエラスチンなどの高いコラーゲン含有量及び主要な生物活性分子を有するＥＣＭ構造を保持しながら、残留細胞、細胞破片、成長因子、及びサイトカインを除去することが確認されている（Ｂｈａｔｉａ ｅｔ ａｌ．２００７）。
【0094】
ＡＭＢＩＯ２（登録商標）は、単層、無菌で処理されたＤＨＡＭである。脱水プロセスは、成長因子及びサイトカインを含む組織の構造的マトリックス及び生物学的成分を保存しながら、水分を除去する（使用説明書、２０２１）。
【0095】
ＡｍｎｉｏＧｒａｆｔ（登録商標）は、単層ＣＨＡＭである。ＡＭは、ＣＲＹＯＴＥＫ（登録商標）という専用の凍結保存方法を使用して保存される。凍結保存プロセスは、無傷の細胞構造を維持し、成長因子及びサイトカインを保存しながら、羊膜上皮細胞を生存不能にする（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．２００９）。
【0096】
ＤＤＨＡＭは、その天然ＥＣＭを保持し、全ての細胞成分、ＤＮＡ、成長因子、及びサイトカインを欠いている。したがって、著者らは、ＤＤＨＡＭが、残留ＤＮＡ及び他の細胞成分を含有する他の２つの眼球ＡＭと比較して、ＨＣＥＣの細胞活性及び炎症応答を支持する、より細胞に優しいマトリックスを提供するであろうという仮説を立てている。このインビトロ研究の結果は、羊膜組織の保存及び脱細胞化がヒト眼球上皮細胞の活性にどのように影響を与えるかについての基本的な理解を加速させる。また、その結果は、角膜上皮欠損治癒、翼状片修復、結膜嚢再建、及び他の眼球処置などの、角膜及び結膜に関連する傷害又は欠損を支持するためのＤＤＨＡＭの臨床的応用を解明する可能性を有する。
【0097】
材料及び方法試験材料は市販の生成物であり、この研究ではヒト対象（ドナー）との直接的な相互作用を必要としなかったため、治験審査委員会の承認は必要なかった。
【0098】
眼球ＡＭ：この研究では、３つの眼球ＡＭを使用した：ＤＤＨＡＭ、ＤＨＡＭ、及びＣＨＡＭ。ＤＤＨＡＭ（ロット番号ＯＣＬＲ００１０）及びＤＨＡＭ試料を室温で貯蔵した。ＣＨＡＭ試料を－８０℃で貯蔵した。全てのＡＭを、製造業者の指示に従って取り扱った。ＤＤＨＡＭ試料は、個々にパッケージ化された１０ｍｍのディスクとして提供された。したがって、１０ｍｍの生検パンチ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、１０ｍｍのディスクをＤＨＡＭシートから作製した。ＣＨＡＭの各部片（５ｃｍ×１０ｃｍ）を解凍し、ペトリ皿内の２０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１０分間（分）洗浄して、抗凍結剤を除去し、１０ｍｍの生検パンチを使用して、洗浄したＡＭから１０ｍｍのディスクを作製した。ＤＤＨＡＭは、両側に面するＡＭの間質側を有する多層状（３層状）である。ＤＤＨＡＭの側性を評価するために、両側に面するＡＭの上皮側を有して異なって設計されたバージョン（３層状）のＤＤＨＡＭ（Ｅ）を調製した。各ＡＭ試料の１０ｍｍディスクを、ＡＭの間質側又は上皮側のいずれかが細胞と接触する４８ウェルプレート（１ディスク／ウェル）（Ｃｅｌｌ－Ｒｅｐｅｌｌｅｎｔ ４８－Ｗｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ，Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ，Ｍｏｎｒｏｅ，ＮＣ，ＵＳＡ）のウェルに配置した。幅２ｍｍ及び内径７ｍｍ寸法の無菌Ｏリング（ＭｃＭａｓｔｅｒ－Ｃａｒｒ，Ｒｏｂｂｉｎｓｖｉｌｌｅ，ＮＪ，ＵＳＡ）を各ＡＭの上部に配置して、ＡＭを所定の位置に保持した。羊膜を、３７℃で２時間（ｈ）、成長培地（０．４ｍＬ／ウェル）で事前馴化した後、細胞を播種した。この研究では、各タイプのＡＭの少なくとも２つのロット（ドナー）を使用した。各独立した実験では、各ＡＭから４つの試料（ｎ＝４）を使用し、これらのうち、２つの試料は、１つのロットからのものであり、２つの試料は、別のロットからのものであった。各個々のアッセイについて、少なくとも２つの独立した実験を行った。
【0099】
初代細胞ヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥＣ、カタログ番号ＰＣＳ－７００－０１０ ロット番号８０９１５１７０）、角膜上皮細胞基礎培地、及び角膜上皮細胞成長キットを、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から購入した。ＨＣＥＣのための完全な成長培地を製造業者の指示に従って調製した。
【0100】
ＡＭへの細胞接着性の判断：４代継代（Ｐ４）のＨＣＥＣを、製造業者の指示に従って１０ｃｍの細胞培養皿内で８０％のコンフルエンスまで培養した。細胞を５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／皿で１回すすいだ。１ミリリットルの０．２５％トリプシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を各皿に加え、３７℃で５分間インキュベートした。トリプシンを中和するために、１０％のＦＢＳを含有する２ミリリットルの最小必須培地－アルファ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）培地を皿に加えた。細胞を１５ｍＬの円錐形チューブに移し、１０００ＲＰＭ（毎分回転数）で５分間遠心分離した。細胞を完全成長培地中に再懸濁し、血球計を使用してカウントした。
【0101】
事前馴化したＡＭを含有する各ウェルに、ＨＣＥＣ（２×１０４／ウェル）を加えた。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２及び９５％湿度でインキュベートした。２４時間インキュベートした後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで一度洗浄した。接着した細胞の生存率を、ａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイを使用して検出した。簡潔に述べると、完全成長培地＋１０％ａｌａｍａｒＢｌｕｅ試薬（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）からなる０．２ｍＬ／ウェルのａｌａｍａｒＢｌｕｅ溶液を各ウェルに加え、３７℃で４５分間インキュベートした。インキュベートした後、０．１ｍＬ／ウェルの上清を９６ウェルプレートに移した。蛍光強度を、多重モードマイクロプレートリーダ（Ｓｐａｒｋ（登録商標），ＴＥＣＡＮ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、励起／発光（Ｅｘ／Ｅｍ）＝５４０ｎｍ／５９０ｎｍで測定した。蛍光強度を任意単位（ＡＵ）で表した。
【0102】
ＡＭ及び細胞の染色：ＡＭの構造的特徴を視覚化するために、３つの異なるＡＭを再水和し、洗浄し、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物（Ｓａｋｕｒａ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）中に垂直に埋め込んだ。５ミクロン／スライスの凍結切片を、Ｌｅｉｃａ ＣＭ１８５０クリオスタット（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して作製した。顕微鏡スライド上の凍結切片を、４％パラホルムアルデヒドで１時間固定し、ＰＢＳ中の０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００中で１時間透過処理した。固定して透過処理した試料を、抗ヒトＩ型抗体（ａｂ３４７１０，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）で一晩染色した。次いで、試料をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５－抗ウサギＩｇＧ、Ａｌｅｘａ ４８８－ファロイジン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、及びＨｏｅｃｈｓｔ染料３３２５８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で６０分間染色した。染色後、カバースリップを、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）の存在下で各試料上に取り付けた。
【0103】
異なるＡＭ上の生存細胞を視覚化するために、「羊膜への細胞接着性の判断」に記載されるように、ＨＣＥＣを異なるＡＭ上で１又は４日間培養した。各時点で、培地を各ウェルから除去し、５０ｎＭのＣａｌｃｅｉｎ ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を含有する０．２ｍＬ／ウェルの新鮮な完全成長培地を各ウェルに加えた。３７℃で３０分間インキュベートした後、培地を除去した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、撮像する準備をした。
【0104】
細胞形態を可視化するために、異なるＡＭで４日間培養したＨＣＥＣ細胞を、４％パラホルムアルデヒドで１時間固定し、ＰＢＳ中の０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００中で１時間透過処理した。固定及び透過処理した細胞を、Ａｌｅｘａ ４８８－ファロイジン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で３０分間染色し、落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｄ１，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）下で観察した。
【0105】
ＡＭのＨ＆Ｅ染色：ＡＭの凍結切片を６０℃で一晩焼成し、４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、ＰＢＳで３回すすいだ。試料をハリスヘマトキシリン溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で１０分間染色し、水道水を流して１分間すすいだ。次いで、スライドを分化溶液（１００ｍＬの７０％アルコールに対して０．２５ｍＬの濃塩酸）中に２回浸漬した。その後、スライドを、水道水を流して１分間すすぎ、続いて、スコット水道水代替物（１％硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）及び０．０６％重炭酸ナトリウム）に６０秒間浸漬した。９５％試薬アルコール中で３０秒間洗浄した後、試料をアルコール性エオシンＹ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ ６８１７８）中で１０分間対比染色した。染色が完了した後、スライドを１００％無水エタノール中での３回の洗浄、続いて３回のＨｉｓｔｏｃｌｅａｒ ＩＩ洗浄によって脱水した。スライドをＰｅｒｍｏｕｎｔ封入剤（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用して封入し、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ａ１顕微鏡を使用して撮像した。
【0106】
経時的なＡＭにおける細胞生存率の判断：事前馴化したＡＭを含有する４８ウェルプレートの各ウェルに、ＨＣＥＣ（１×１０４／ウェル）を加えた。各細胞型について３組のプレートを用意し、３７℃、５％のＣＯ２及び９５％の湿度で１、４、及び７日間インキュベートした。第１の時点で、全てのプレートの各ウェルから培地を除去し、新鮮な培地を加えた。第１の組のプレート中の細胞の生存率は、ａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイを使用して測定した。第２及び第３の組のプレートを３７℃で培養した。第２の時点で、第２の組のプレート中の細胞の生存率を測定した。第３の組のプレートを３７℃で新鮮な培地中で培養した。ａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイを使用して、第３の組のプレート中の細胞の生存率を第３の時点で測定した。
【0107】
移動アッセイのための馴化培地：試験条件において、ＨＣＥＣ（２×１０４／ウェル）を、事前馴化したＡＭを含有する４８ウェルプレートの各ウェルに加えた。対照条件では、事前馴化したＡＭにＨＣＥＣを加えなかった。２４時間培養した後、培地を除去した。０．４ｍＬ／ウェルの新鮮な成長培地を、細胞の有無にかかわらず各ウェルに加え、３７℃で２４時間インキュベートした。上清（２４時間馴化した培地）を各ウェルから収集し、直ちに移動アッセイに使用した。ＡＭの間質側をこの実験に使用した。
【0108】
スクラッチ創傷移動アッセイ：５×１０４／ウェルのＨＣＥＣを組織培養処理したポリスチレン４８ウェルプレートの各ウェルに加え、３７℃、５％のＣＯ２及び９５％の湿度で２日間培養した。滅菌金属ロッドの先端を使用して、コンフルエント単層上にスクラッチ創傷を作製した。培地を除去し、ＡＭ上で培養した細胞から収集した馴化培地を創傷に加えた。創傷領域の画像を０時間で取り込んだ。最少でも、各試験群について４つの面積を監視した。プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間で全く同じ創傷領域（マーカー参照を有する）を撮像した。創傷面積を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して任意単位（スクエアピクセル、ｐｘ２）で測定した。移動した面積＝面積０時間－面積２４時間。
【0109】
ＨＣＥＣの炎症応答の刺激：２×１０４／ウェルのＨＣＥＣを播種し、異なるＡＭ上で２４時間培養した。培地を除去し、新鮮な培地「－腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）」、又は１０ｎｇ／ｍＬのヒトＴＮＦ－α（カタログ番号３００－０１Ａ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ Ｃｒａｎｂｕｒｙ，ＮＪ）「＋ＴＮＦ－α」を含有する新鮮な培地を細胞に加え、２４時間、４８時間、又は７２時間インキュベートした。各時点で、多重分析のために上清を収集し、以下に記載されるように、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）分析のために、細胞を０．２ｍＬのＲＮＡ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）中で溶解した。
【0110】
ｑＰＣＲによる相対的ｍＲＮＡ発現の判断：ｑＰＣＲによるサイトカインの相対的遺伝子発現の定量化を、以前に記載されるように行った（Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．２０２１）。簡潔に述べると、ＳＶ９６ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細胞溶解物からの全ＲＮＡを精製した。ＲＮＡ濃度及び純度を、ＴＥＣＡＮ Ｓｐａｒｋ Ｎａｎｏプレート（ＴＥＣＡＮ，Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ）を使用して測定した。ｃＤＮＡ調製及びｑＰＣＲを、記載されるように行った（Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．２０１７）。本研究に使用されたｑＰＣＲのためのプライマーは、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）：顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ：ＱＴ０００００８９６）、インターロイキン６（ＩＬ－６：ＱＴ０００８３７２０）、インターロイキン－８（ＩＬ－８：ＱＴ０００００３２２）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α：ＱＴ０１０７９５６１）、及びグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ：ＱＴ０１１９２６４６）からのものであった。各試料で２回ずつ実行した。実行が完了した後、生データを使用して二次導関数分析を行って、各試料ごとの平均Ｃｐ（クロスポイント－ＰＣＲ－サイクル）を判定した。各遺伝子発現について、ＧＡＰＤＨの発現は、内部対照として働いた。相対的ｍＲＮＡ発現を、Ｐｆａｆｆｌ分析（ＥΔＣｐ標的／ＥΔＣｐ参照）によって判定した。ここでは、プライマー効率Ｅ＝１０＾（－１／傾き）及びΔＣｐ＝試料の平均Ｃｐ－対照の平均Ｃｐ。組織培養ポリスチレン（ＴＣＰ）上の細胞の発現又は２４時間での細胞の発現を、「結果」における特定の分析で定義された、分析のための「対照」として使用した。
【0111】
統計的方法：ＨＣＥＣ活性の評価では、独立変数は、ＡＭ（ＤＤＨＡＭ、ＤＨＡＭ、ＣＨＡＭ）、側（上皮、間質）、及び時間（１日目、４日目、及び７日目）であった。従属変数は、細胞接着性、細胞生存率、及び移動であった。ｍＲＮＡ発現によるＨＣＥＣ炎症応答の評価では、独立変数は、羊膜（ＤＤＨＡＭ、ＤＨＡＭ、ＣＨＡＭ、対照［ＴＣＰ］）、状態（安静、刺激）、及び時間（２４時間、４８時間、及び７２時間）であった。タンパク質レベルによるＨＣＥＣ炎症応答の評価では、独立変数は、羊膜（ＤＤＨＡＭ、ＤＨＡＭ、ＣＨＡＭ、対照［ＴＣＰ］）及び状態（安静、刺激、ＡＭのみ）であった。従属変数は、サイトカイン（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、及びＴＮＦ－α）の相対的ｍＲＮＡ発現、並びにサイトカイン及びケモカイン（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＧＦβ２、及びＶＥＧＦ）のタンパク質レベルであった。
【0112】
ＩＢＭ ＳＰＳＳ（Ｂｕｉｌｄ １．０．０．１４４４）を使用して、全ての分析を実施した。全ての統計的試験についての有意なレベルを、ｐ＝０．０５に設定した。データを試験し、正規分布であることを見出した。細胞の接着性及び移動を、Ｔｕｋｅｙ事後検定を伴う二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）で分析した。細胞増殖を、Ｔｕｋｅｙ事後検定を伴う三元配置ＡＮＯＶＡで分析した。２４時間における相対的ｍＲＮＡ発現を、Ｔｕｋｅｙ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡで分析して、試験条件の各々における各従属変数を評価した。時間ごとの相対的ｍＲＮＡ発現を、Ｔｕｋｅｙ事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡで分析して、試験条件の各々における各従属変数を評価した。多重比較のために、シダック補正を用いた単純主効果分析を用いて有意な相互作用を評価した。データを、テキスト及び図における平均値±標準偏差（ＳＤ）として報告する。
【0113】
結果：
ＡＭの構造：これらの３つのＡＭの構造を評価するために、ＡＭの断面を、細胞成分（ＤＮＡ及びアクチン）及びＥＣＭ（Ｉ型コラーゲン）を染色した（図８Ａ）。強い核染色及びアクチン染色はＤＨＡＭ及びＣＨＡＭ中で検出されたが、アクチン及び核染色のどちらもＤＤＨＡＭで検出されなかった。Ｉ型コラーゲンの存在は、３つ全てのＡＭで検出された。３つのＡＭのＨ＆Ｅ染色（図８Ｂ）により、ＤＨＡＭ及びＣＨＡＭと比較して、ＤＤＨＡＭにおける完全な脱細胞化及び核の不存在が確認された。ＤＨＡＭは濃青色の核残留物のわずかな染色を示し、一方、ＣＨＡＭは核についての無傷の濃青色染色を示し、細胞の存在を示していた。
ＡＭの構造：これらの３つのＡＭの構造を評価するために、ＡＭの断面を、細胞成分（ＤＮＡ及びアクチン）及びＥＣＭ（Ｉ型コラーゲン）を染色した（図８Ａ）。強い核染色及びアクチン染色はＤＨＡＭ及びＣＨＡＭ中で検出されたが、アクチン及び核染色のどちらもＤＤＨＡＭで検出されなかった。Ｉ型コラーゲンの存在は、３つ全てのＡＭで検出された。３つのＡＭのＨ＆Ｅ染色（図８Ｂ）により、ＤＨＡＭ及びＣＨＡＭと比較して、ＤＤＨＡＭにおける完全な脱細胞化及び核の不存在が確認された。ＤＨＡＭは濃青色の核残留物のわずかな染色を示し、一方、ＣＨＡＭは核についての無傷の濃青色染色を示し、細胞の存在を示していた。
【0114】
異なるＡＭ上でのＨＣＥＣの接着性：異なるＡＭ及びＡＭの異なる側上での細胞接着性を、２４時間での細胞生存率（接着した細胞の量を反映する）を比較することによって評価した。蛍光強度を任意単位（ＡＵ）で表した。
【0115】
側性の効果。ＡＭの上皮側よりも間質側での細胞接着性が高く（側の主効果、ｐ＝０．０１８）、これは、ＤＨＡＭの間質側と比較してＤＨＡＭの上皮側でのより低い細胞接着性によって説明することができる（ｐ＜０．００１；側×ＡＭ、ｐ＝０．００１；図９）。ＤＤＨＡＭの上皮側と間質側との間（ｐ＝０．８２２）、及びＣＨＡＭの上皮側と間質側との間（ｐ＝０．６４５）に有意な差はなかった。
【0116】
ＡＭの効果。追加的に、ＡＭ（ＡＭ主効果、ｐ＜０．００１）間で細胞接着性に有意な差があり、ＤＨＡＭ（ｐ＜０．００１）及びＣＨＡＭ（ｐ＜０．００１）よりもＤＤＨＡＭにおいて有意に高い細胞接着性を有していた。しかしながら、前に示したように、細胞接着性は、側及びＡＭで変動した（ｐ＝０．００１；図９）。上皮側では、細胞接着性は、ＤＨＡＭ（ｐ＜０．００１）及びＣＨＡＭ（ｐ＜０．００１）よりもＤＤＨＡＭにおいて有意に高く、ＣＨＡＭとＤＨＡＭとの間に有意な差はなかった（ｐ＝０．０７６）。間質側では、細胞接着性は、ＤＤＨＡＭ（ｐ＜０．００１）及びＤＨＡＭ（ｐ＝０．０１４）よりもＣＨＡＭにおいて有意に低く、ＤＤＨＡＭとＤＨＡＭとの間に有意な差はなかった（ｐ＝０．２０７）。これらの結果は、これらの３つのＡＭのうち、ＤＤＨＡＭの上皮及び間質側が最良に細胞接着性を支持したことを示している。
【0117】
４日目の異なるＡＭにおけるＨＣＥＣの生存率及び形態：上皮細胞のライブ染色。異なるＡＭ（ＤＤＨＡＭ、ＣＨＡＭ、ＤＨＡＭ）の間質側におけるＨＣＥＣの生存率を、細胞播種の４日後に観察した（図１０）。定量的結果と一致して、ＤＤＨＡＭ及びＤＨＡＭ上のＨＣＥＣは、細胞播種後４日目に接着して広がっているように見えたのに対して、ＣＨＡＭ上のＨＣＥＣは乱れており、不均一な形態を取っているように見えた。ＡＭ上のＨＣＥＣの形態を、４日目のアクチン染色によって監視した（図１０）。ＤＤＨＡＭ上のＨＣＥＣは、高密度のアクチン環構造を有する石畳形態に適応した。
【0118】
経時的な異なるＡＭ上での細胞生存率：異なるＡＭ上での細胞の生存率を最大７日間監視した。生存細胞の数は、７日間の培養にわたって著しく減少したが（時間の主効果、ｐ＜０．００１）、細胞生存率は、側、ＡＭ、及び時間で著しく変動した（側×ＡＭ×時間相互作用、ｐ＝０．０１１）。最も注目すべきは、細胞生存率は、４日目のＤＤＨＡＭの間質側を除いて、全ての変数について時間ごとに低下した（図１１Ａ）。
【0119】
側性の効果。細胞生存率は、ＡＭの上皮側よりも間質側において有意に高く（主効果 側、ｐ＜０．００１）、これは、４日目及び７日目の側間での相対的細胞生存率の差によって説明することができる（図１１Ｂ）。４日目には、相対的細胞生存率は、ＤＤＨＡＭの上皮側よりもＤＤＨＡＭの間質側において有意に高く（ｐ＜０．００１）、相対的細胞生存率は、ＤＨＡＭの上皮側よりもＤＨＡＭの間質側において有意に高かった（ｐ＜０．００１）。逆に、相対的細胞生存率は、ＣＨＡＭの間質側よりもＣＨＡＭの上皮側において有意に高かった（ｐ＝０．０３９）。７日目には、ＤＤＨＡＭ（ｐ＝０．１０２）又はＣＨＡＭ（ｐ＝０．１５７）の上皮側と間質側との間で相対的細胞生存率に有意な差はなかった。しかしながら、相対的細胞生存率は、ＤＨＡＭの上皮側よりもＤＨＡＭの間質側において有意に高かった（ｐ＜０．００１）。
【0120】
ＡＭの効果。細胞数はまた、ＡＭ（主効果 ＡＭ、ｐ＜０．００１）間で有意に異なり、ＤＨＡＭ（ｐ＜０．００１）及びＣＨＡＭ（ｐ＜０．００１）よりもＤＤＨＡＭにおいて著しく多くの生存細胞を有し、ＣＨＡＭよりもＤＨＡＭにおいて有意に多くの生存細胞を有していた（ｐ＝０．０３６）。ＡＭの主効果を、４日目及び７日目の相対的細胞生存率における有意な差によって主として説明する（図１１Ｂ）。
【0121】
４日目の上皮側では、相対的細胞生存率はＤＨＡＭよりもＤＤＨＡＭにおいて有意に高く（ｐ＝０．０３２）、一方、相対的細胞生存率はＤＤＨＡＭとＣＨＡＭとの間（ｐ＝０．９７８）、及びＣＨＡＭとＤＨＡＭとの間（ｐ＝０．０７７）で類似していた。７日目の上皮側では、３つの羊膜間で有意な差はなかった（ｐ≧０．２１９）。
【0122】
４日目の間質側では、相対的細胞生存率はＣＨＡＭよりもＤＤＨＡＭにおいて有意に高く（ｐ＜０．００１）、相対的細胞生存率はＣＨＡＭよりもＤＨＡＭにおいて有意に高かった（ｐ＜０．００１）。ＤＤＨＡＭとＤＨＡＭとの間の４日目の間質側における相対的細胞生存率に有意な差はなかった（ｐ＝０．４７７）。しかしながら、７日目の間質側では、相対的細胞生存率は、ＤＤＨＡＭ（ｐ＝０．００３）及びＤＨＡＭ（ｐ＝０．００２）よりもＣＨＡＭにおいて有意に低かった。上皮側と同様に、７日目の間質側では、ＤＤＨＡＭとＤＨＡＭとの間で相対的細胞生存率に有意な差はなかった（ｐ＝０．９９９）。
【0123】
ＡＭの間質側におけるより高い細胞生存率、ＤＨＡＭ及びＣＨＡＭと比較してＤＤＨＡＭにおける生存率のより良好な維持という所見は、細胞生存率がＤＤＨＡＭの間質側において最良に維持されたことを示唆している。
【0124】
異なるＡＭ上でのＨＣＥＣの移動：ＨＣＥＣの不存在下での異なるＡＭからの馴化培地を試験して、ＨＣＥＣの移動に対するＡＭ単独の効果を評価した。追加的に、細胞の存在下でのＡＭ間の移動の差を比較して、異なるＡＭ上で培養したＨＣＥＣによって放出される因子が細胞移動に影響を与えるかどうかを判定した。ＡＭ上で培養した細胞を２４時間馴化した。異なるＡＭからの馴化培地の存在下でのＨＣＥＣの移動を、スクラッチ創傷アッセイを使用して評価した。創傷閉鎖を２４時間監視した（図１２Ａ及び１２Ｂ）。
【0125】
羊膜の効果と細胞の存在との間に有意な相互作用があった（ｐ＝０．００６；図１２Ａ及び１２Ｂ）。ＤＤＨＡＭ（ｐ＝０．００９）及びＤＨＡＭ（ｐ＜０．００１）では、細胞無しよりも細胞有りでの移動が有意に大きかった。移動は、ＣＨＡＭ（ｐ＝０．２９１）又は対照（ｐ＝０．２６５）上の細胞の有無にかかわらず有意な差はなかった。
【0126】
ＡＭの効果。更に、細胞の存在下で収集した馴化培地（ＣＭ）のうち、ＤＤＨＡＭ（ｐ＝０．００４）及びＤＨＡＭ（ｐ＝０．００２）よりも、ＣＭにおいて、ＣＨＡＭ上の細胞からの移動が有意に低かった。ＤＤＨＡＭとＤＨＡＭの間の移動に有意な差はなかった（ｐ＝１．０００）。細胞の存在下での対照と比較して、ＣＭにおいて、ＤＤＨＡＭ（ｐ＜０．００１）、ＤＨＡＭ（ｐ＜０．００１）、及びＣＨＡＭ（ｐ＝０．００５）上の細胞からの移動が有意に大きかった。
【0127】
ＨＣＥＣにおける炎症性サイトカインの遺伝子発現：ＡＭの間質側が炎症応答を調節することが報告されているため（Ｄｕａ ｅｔ ａｌ．２００４、Ｓｈｉｍｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．２００１）、ＨＣＥＣの炎症応答に対するこれらの３つのＡＭの間質側の効果を評価した。ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、又はＴＮＦ－αを含む、創傷治癒において以前に実証された役割を有するサイトカインを選択した（Ｒｈｏ ｅｔ ａｌ．２０１５、Ａｒｒａｎｚ－Ｖａｌｓｅｒｏ ｅｔ ａｌ．２０１４、Ｅｂｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．２０１１、Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．１９９２、Ｈａｆｅｚｉ ｅｔ ａｌ．２０１８、Ｓｔｒｉｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９２、Ｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．１９９２、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０２０、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１９）。この目的のために、インビトロ炎症条件下でのＨＣＥＣの炎症応答を、２４時間のＴＮＦ－αによる刺激によって模倣した。異なるＡＭ上のＨＣＥＣにおけるＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、又はＴＮＦ－αの遺伝子発現（相対的ｍＲＮＡレベル）を、標準細胞培養表面であるＴＣＰ上で培養した細胞における遺伝子発現と比較して、ｑＰＣＲによって判断した。
【0128】
ＧＭ－ＣＳＦ。２４時間でのＧＭ－ＣＳＦの発現は、刺激状態（±ＴＮＦα）及びＡＭ（ｐ＝０．０４９）によって有意に変動した（図１３Ａ）。刺激により、ＧＭ－ＣＳＦの発現は、ＤＨＡＭ（ｐ＜０．００１）では有意に増加したが、ＤＤＨＡＭ（ｐ＝０．２２６）、ＣＨＡＭ（ｐ＝０．６６４）、又はＴＣＰ（ｐ＝０．８２７）では増加しなかった。安静状態における羊膜間のＧＭ－ＣＳＦの発現を比較すると、ＤＤＨＡＭ、ＤＨＡＭ、ＣＨＡＭ、及びＴＣＰにおいてＧＭ－ＣＳＦの類似の発現を示した（ｐ≧０．１３４）。刺激した状態での羊膜間のＧＭ－ＣＳＦの発現を比較すると、ＤＤＨＡＭ（ｐ＝０．００１）、ＣＨＡＭ（ｐ＜０．００１）、及びＴＣＰ（ｐ＜０．００１）よりもＤＨＡＭにおいて有意に高い発現を示した。
【0129】
ＩＬ－６。２４時間でのＩＬ－６の発現は、刺激条件及び羊膜によって有意に変化した（ｐ＝０．００２）（図１３Ｂ）。刺激により、ＩＬ－６の発現は、ＤＤＨＡＭ（ｐ＜０．００１）、ＣＨＡＭ（ｐ＝０．０１７）、及びＴＣＰ（ｐ＝０．０１４）では有意に増加したが、ＤＨＡＭ（ｐ＝０．１２８）では増加しなかった。安静状態における羊膜間のＩＬ－６の発現を比較すると、ＤＤＨＡＭ、ＤＨＡＭ、ＣＨＡＭ、及びＴＣＰにおいてＩＬ－６の類似の発現を示した（ｐ≧０．７１７）。刺激した状態では、ＤＨＡＭ（ｐ＜０．００１）、ＣＨＡＭ（ｐ＜０．００１）、及びＴＣＰ（ｐ＜０．００１）よりもＤＤＨＡＭにおいてＩＬ－６の発現が有意に高かった。他の有意な差は見出されなかった。
【0130】
ＩＬ－８。２４時間でのＩＬ－８の発現は、刺激状態及びＡＭによって有意に変化しなかったが（ｐ＝０．１８８）、刺激状態（ｐ＜０．００１）及びＡＭ（ｐ＝０．００２）に主効果があった。ＩＬ－８の全体的な発現は、刺激によって有意に増加した。事後分析により、全体的なＩＬ－８発現がＣＨＡＭ（ｐ＝０．０１８）及びＴＣＰ（ｐ＝０．０１４）よりもＤＨＡＭにおいて有意に高く、ＣＨＡＭ（ｐ＝０．０２２）及びＴＣＰ（ｐ＝０．０１７）よりもＤＤＨＡＭにおいて有意に高かったことが明らかになった。ＤＨＡＭとＤＤＨＡＭとの間（ｐ＝１．０００）、又はＣＨＡＭとＴＣＰとの間（ｐ＝０．９９９）のＩＬ－８発現に有意な差はなかった。
【0131】
ＴＮＦα。２４時間でのＴＮＦαの発現は、刺激状態及びＡＭによって有意に変動しなかったがｐ＝０．１９４）、刺激状態（ｐ＝０．００１）及びＡＭ（ｐ＜０．００１）に主効果があった（図１３Ｄ）。ＴＮＦαの全体的な発現は、刺激によって有意に増加した。事後分析により、全体的なＴＮＦα発現がＣＨＡＭ（ｐ＜０．００１）及びＴＣＰ（ｐ＜０．００１）よりもＤＤＨＡＭにおいて有意に高く、ＣＨＡＭ（ｐ＝０．０２２）及びＴＣＰ（ｐ＝０．０２４）よりもＤＨＡＭにおいて高かったことが明らかになった。ＤＤＨＡＭとＤＨＡＭとの間（ｐ＝０．０９５）、又はＣＨＡＭとＴＣＰとの間（ｐ＝１．０００）のＴＮＦα発現に有意な差はなかった。
【0132】
これらの結果は、２４時間で、ＤＤＨＡＭ及びＤＨＡＭの存在が、ＨＣＥＣにおけるＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、及びＴＮＦ－αの発現を、ＣＨＡＭ又はＴＣＰ上の細胞よりも多く刺激したことを示す。
【0133】
経時的なＨＣＥＣにおける炎症性サイトカインの遺伝子発現：炎症応答は、動的プロセスである。異なる時点でのサイトカインの発現は、創傷治癒プロセスの段階を示す。７２時間の時間経過にわたるサイトカインの発現を評価するために、各サイトカインの発現を２４時間間隔で分析した（図１４Ａ～１４Ｄ）。
【0134】
ＤＤＨＡＭ（ｐ＝０．２０６）、ＤＨＡＭ（ｐ＝０．０７８）、又はＣＨＡＭ（ｐ＝０．２１５）に対する刺激状態では、ＧＭ－ＣＳＦの発現に時間ごとの有意な変化はなかった（図１４Ａ）。ＴＣＰは、刺激した状態でのＧＭ－ＣＳＦの発現に時間ごとの有意な変化を伴う例外であった（ｐ＜０．００１）。時間ごとのＴＣＰにおけるＧＭ－ＣＳＦの発現は、２４から７２時間まで（ｐ＜０．００１）、及び４８から７２時間まで（ｐ＜０．００１）有意に増加した。ＴＣＰにおけるＧＭ－ＣＳＦ発現は、２４から４８時間まで類似したままであった（ｐ＝０．７００）。
【0135】
ＩＬ－６。ＤＤＨＡＭ（ｐ＝０．００７）、ＤＨＡＭ（ｐ＜０．００１）、ＣＨＡＭ（ｐ＜０．００１）、及びＴＣＰ（ｐ＝０．００２）において、時間ごとに、刺激した状態におけるＩＬ－６の発現に統計的に有意な変化があった（図１４Ｂ）。ＤＤＨＡＭにおけるＩＬ－６の発現を比較すると、２４から７２時間まで（ｐ＝０．００７）、及び４８から７２時間まで（ｐ＝０．０２１）有意な低下を示した。ＤＤＨＡＭにおけるＩＬ－６発現は、２４から４８時間まで類似したままであった（ｐ＝０．６２３）。ＤＨＡＭにおけるＩＬ－６の発現を時間ごとに比較すると、２４から４８時間に有意な増加（ｐ＝０．００３）、次いで４８から７２時間まで有意な減少（ｐ＜０．００１）を示した。ＤＨＡＭにおけるＩＬ－６発現は、２４から７２時間まで類似したままであった（ｐ＝０．３２１）。ＣＨＡＭにおけるＩＬ－６の発現を時間ごとに比較すると、２４から４８時間まで（ｐ＜０．００１）、及び２４から７２時間まで（ｐ＜０．００１）有意な低下を示した。ＣＨＡＭにおけるＩＬ－６発現は、４８時間及び７２時間の両方では検出不可能であった。時間ごとのＴＣＰにおけるＩＬ－６の発現は、２４から４８時間まで有意な増加（ｐ＝０．００８）、次いで４８から７２時間まで有意な低下（ｐ＜０．００２）を示した。ＴＣＰにおけるＩＬ－６発現は、２４から７２時間まで類似したままであった（ｐ＝０．４０７）。
【0136】
ＩＬ－８。ＣＨＡＭ（ｐ＝０．０２４）及びＴＣＰ（ｐ＜０．００１）では、時間ごとに、刺激した状態でのＩＬ－８の発現に統計的に有意な変化があったが、ＤＤＨＡＭ（ｐ＝０．１７９）及びＤＨＡＭ（ｐ＝０．２８２）では、時間ごとに、ＩＬ－８発現は類似したままであった（図１４Ｃ）。ＣＨＡＭにおけるＩＬ－８の発現は、２４から７２時間まで（ｐ＝０．０４０）、及び４８から７２時間まで（ｐ＝０．０３３）有意に増加した。ＣＨＡＭにおけるＩＬ－８発現は、２４から４８時間まで類似したままであった（ｐ＝０．９８４）。ＣＨＡＭのように、ＴＣＰにおけるＩＬ－８の発現は、２４から７２時間まで（ｐ＜０．００１）、及び４８から７２時間まで（ｐ＜０．００１）有意に増加した。ＴＣＰにおけるＩＬ－８発現は、２４から４８時間まで類似したままであった（ｐ＝０．０７１）。
【0137】
ＴＮＦ－α。ＤＨＡＭ（ｐ＜０．００１）及びＴＣＰ（ｐ＝０．００５）では、時間ごとに、刺激した状態でのＴＮＦ－αの発現に統計的に有意な変化があったが、ＤＤＨＡＭ（ｐ＝０．１２５）及びＣＨＡＭ（ｐ＝０．５１９）では、時間ごとに、ＴＮＦ－α発現は類似したままであった（図１４Ｄ）。時間ごとのＤＨＡＭにおけるＴＮＦ－αの発現は、２４から４８時間まで有意に増加し（ｐ＝０．００９）、２４から７２時間まで（ｐ＝０．０４８）及び４８から７２時間まで（ｐ＜０．００１）有意に低下した。加えて、時間ごとのＴＣＰにおけるＴＮＦ－αの発現は、２４から４８時間まで（ｐ＝０．０３５）及び２４から７２時間まで（ｐ＝０．００４）有意な増加を示した。ＴＣＰにおけるＴＮＦ－α発現は、４８から７２時間まで類似したままであった（ｐ＝０．２０１）。
【0138】
時間ごとの相対的ｍＲＮＡレベルの変化は、異なるＡＭ及びサイトカインについて異なる傾向を示した。ＴＣＰ上で培養した細胞において、発現レベルは経時的に増加したが、そのようなサイトカインの発現は、ＤＤＨＡＭ上で培養した細胞において低下の傾向を示した。
【0139】
臨床症例研究：８７歳の女性は、過去数ヶ月間にわたって生じている左目の悪化の主訴を提示した。彼女は、長時間の読書による不快感及び異物感のために、小さい活字体を見ることが困難であると報告した。彼女の病歴は、ドライアイ症候群、原発性開放隅角緑内障、網膜上膜、及び両眼の黄斑ドルーゼンについて重篤であった。支持的治療としては、潤滑剤点眼薬、高浸透圧剤、及び包帯コンタクトレンズが挙げられた。彼女の眼科手術歴は、両眼の白内障摘出及び両眼のＹＡＧレーザ嚢切開からなっていた。検査時に、マップ／ドット構成における上皮及び上皮下の瘢痕化が指摘された。彼女の症状、病歴、及び角膜の慎重な検査に基づいて、患者は、前部基底膜ジストロフィー（ＡＢＭＤ）と診断された。患者の承諾により、ＤＤＨＡＭを基質として使用して前部基底膜ジストロフィーを外科的に治療して、前部角膜表面に正常なボーマン膜（すなわち、上皮及び上皮基底膜）を再投入することを判定した。
【0140】
角膜上皮及びボーマン膜の創面切除、並びにＡＭの配置（縫合糸無し）を外来処置として行った。局所麻酔剤を適用し、不規則的な表面上皮を可視化した（図１５Ａ）。ダイヤモンドバリを使用して、全ての異常で緩い角膜上皮（図１５Ｂ）、並びに基礎となる上皮下瘢痕化及びＡＢＭＤ破片を穏やかかつ均一に除去した（図１５Ｃ）。次いで、上皮表面をバランスの取れた食塩水ですすいだ。ＤＤＨＡＭを、不快感及び治癒を助けるために、創面切除した膜（図１５Ｄ）の上に慎重に配置し、包帯コンタクトレンズで被覆した（図１５Ｅ）。術後、患者は、ステロイド／抗生物質点眼薬を１日に４回、１０日間使用するように指示され、これを６週間にわたってゆっくりと減らしていった。彼女は、術後１週間、２週間、１ヶ月、及び２ヶ月に診察を受けた。患者は、日常生活の活動の快適性がほぼ即座に改善したと報告した。術後１ヶ月の来院時に、移植片は組織内に完全に溶解しており、残留物は見られなかった。角膜表面は滑らかであり、通常通りに認識可能であった（図１５Ｆ）。
【0141】
考察
ＡＭ基底膜の構造は眼球表面上の上皮化を促進するという仮説が立てられる。コラーゲン組成物は、結膜及び角膜のコラーゲン組成物によく似ており、ＡＭを上皮細胞の成長に好適な基質にする。ＡＭは、提案された４つのメカニズムを通して角膜上皮の成長を促進する（Ｍａｌｈｏｔｒａ＆Ｊａｉｎ，２０１４、Ｗａｌｋｄｅｎ ｅｔ ａｌ．２０２０）：１）上皮細胞移動の促進（Ｍｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２００２、Ｍｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９９）、２）基底上皮細胞接着性の補強（Ｋｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．１９８７、Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．１９９１、Ｔｅｒｒａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．１９８７）、３）上皮細胞分化の促進（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．１９８９、Ｓｔｒｅｕｌｉ ｅｔ ａｌ．１９９１、Ｋｕｒｐａｋｕｓ ｅｔ ａｌ．１９９２）、及び４）アポトーシスの阻止（Ｂｏｕｄｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．１９９６、Ｂｏｕｄｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．１９９５）。間質表面が上皮細胞成長を支持することができるという証拠があるが（Ｓｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．２００６）、上皮化は基底膜上で優先的に起こると考えられている（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．２００３）。しかしながら、既存の調査のほとんどは凍結保存ＡＭに限定されており、これらの所見が異なって処理されたＡＭに適用可能であるかどうかは不明である。
ＡＭ基底膜の構造は眼球表面上の上皮化を促進するという仮説が立てられる。コラーゲン組成物は、結膜及び角膜のコラーゲン組成物によく似ており、ＡＭを上皮細胞の成長に好適な基質にする。ＡＭは、提案された４つのメカニズムを通して角膜上皮の成長を促進する（Ｍａｌｈｏｔｒａ＆Ｊａｉｎ，２０１４、Ｗａｌｋｄｅｎ ｅｔ ａｌ．２０２０）：１）上皮細胞移動の促進（Ｍｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２００２、Ｍｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９９）、２）基底上皮細胞接着性の補強（Ｋｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．１９８７、Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．１９９１、Ｔｅｒｒａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．１９８７）、３）上皮細胞分化の促進（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．１９８９、Ｓｔｒｅｕｌｉ ｅｔ ａｌ．１９９１、Ｋｕｒｐａｋｕｓ ｅｔ ａｌ．１９９２）、及び４）アポトーシスの阻止（Ｂｏｕｄｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．１９９６、Ｂｏｕｄｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．１９９５）。間質表面が上皮細胞成長を支持することができるという証拠があるが（Ｓｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．２００６）、上皮化は基底膜上で優先的に起こると考えられている（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．２００３）。しかしながら、既存の調査のほとんどは凍結保存ＡＭに限定されており、これらの所見が異なって処理されたＡＭに適用可能であるかどうかは不明である。
【0142】
異なる処理方法は、ＡＭの細胞含有量及び構造を変更する可能性、及びＥＣＭの機能的特性に影響を及ぼす可能性を有する（Ｇｈｏｌｉｐｏｕｒｍａｌｅｋａｂａｄｉ ｅｔ ａｌ．２０１５）。以前の研究では、ＤＤＨＡＭとＣＨＡＭの間の組成及び超微細構造における有意な差を実証している（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．２０１０）。凍結保存は最も広く使用されている保存技術のうちの１つであるが、いくつかの欠点があり、つまり、細胞の生存率及び増殖能力に影響を及ぼし、－８０℃で出荷及び貯蔵する必要もある（Ｋｒｕｓｅ ｅｔ ａｌ．２０００）。したがって、本研究では、側性、並びに滅菌、保存、及び脱細胞化の異なる方法が、ＨＣＥＣ接着性、生存率、及び移動にどのように影響を及ぼすかを比較しようとした。以前の報告（Ｂｈａｔｉａ ｅｔ ａｌ．２００７）に示されているように、著者らは、理想的な眼球ＡＭは、細胞、ＤＮＡ、細胞破片、並びに残留成長因子及びサイトカインの除去と、炎症応答を阻止し、ＥＣＭと宿主細胞との間の動的相互作用を促進するための天然ＥＣＭアーキテクチャ及び生物活性成分の適切な保存と、を必要とすると仮定している。本研究結果は、ＤＤＨＡＭが完全に脱細胞化されたＡＭであるのに対して、ＤＨＡＭ及びＣＨＡＭが残留細胞及びＤＮＡを含有することを実証することによって、我々の仮説を裏付ける。次いで、ＤＤＨＡＭは、ＨＣＥＣの細胞活性を最良に支持することが見出された。加えて、ＤＤＨＡＭの存在は、初期の炎症応答を強化し、インビトロ炎症条件下でのＨＣＥＣにおける長期の炎症応答を阻止する。
【0143】
染色により、ＤＤＨＡＭ中の細胞及び核の不存在が確認される。以前の調査では、眼科におけるＡＭの生物学的有効性は、ＡＭ中に保存された細胞ではなく、そのＥＣＭによって促進されることが記録されている（Ｄｕａ ｅｔ ａｌ．２００４、Ｋｕｂｏ ｅｔ ａｌ．２００１、Ｋｒｕｓｅ ｅｔ ａｌ．２０００）。脱細胞化ＡＭにおいて、ＥＣＭは、細胞浸潤のための物理的導管として働くと推定され、それによって、宿主細胞及びＥＣＭは、相互作用して、治癒応答を活性化するために必要な生化学的刺激を提供する（Ｂｈａｔｉａ ｅｔ ａｌ．２００７）。したがって、予備ステップとして、細胞含有量及び構造を視覚化するために、３つのＡＭの各々に染色を行った。免疫蛍光及びＨ＆Ｅ染色の両方により、ＤＤＨＡＭにおける完全な脱細胞化及び核の不存在が確認されたのに対して、ＤＨＡＭ及びＣＨＡＭの両方により、核含有量、ＤＨＡＭ中の残留物、及びＣＨＡＭ中の細胞の存在が示された。
【0144】
ＤＤＨＡＭの間質側は、ＨＣＥＣの細胞活性を最良に支持する。このインビトロ調査からの結果は、ＤＤＨＡＭの間質側がＨＣＥＣ活性を最良に支持することを示唆している。側性は、ＤＤＨＡＭ又はＣＨＡＭではＨＣＥＣ接着性に影響を及ぼさなかったが、ＤＨＡＭの上皮側ではＨＣＥＣ接着性が有意に低かった。２つの脱水ＡＭであるＤＤＨＡＭとＤＨＡＭとの間の細胞接着性の差は、細胞成分、ＤＮＡ、成長因子、及びサイトカインの除去が、ＨＣＥＣの付着を支持する、より細胞に優しい環境を提供することを示唆している。
【0145】
時間ごとに調べると、細胞生存率は、ＤＤＨＡＭの間質側を除いて、全ての側性及びＡＭの組み合わせで低下することが見出された。ＤＤＨＡＭの間質側において、細胞生存率は、１日目～４日目まで増加した。細胞生存率の全体的な低下の特定の原因は明らかでない。ＣＨＡＭ又はＤＨＡＭ中の羊膜細胞（凍結保存又は乾燥）の存在は、これらのＡＭが角膜細胞増殖を支持する能力を阻害し得る。脱細胞化羊膜が角膜上皮細胞のための新鮮な羊膜よりも良好な基質であることが以前に報告されているが（Ｋｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．２０００）、これらの結果は側性も因子であり得ることを示唆している。この研究により、ＤＤＨＡＭの間質側がＨＣＥＣの成長のための最も適合性のある基質であることが見出されたのに対して、ＣＨＡＭ及びＤＨＡＭの上皮側及び間質側のどちらも、それらの接着性及び成長を一貫して支持していないようである。
【0146】
これらの所見は、染色によって更に裏付けられる。４日目には、ＤＤＨＡＭは、ＨＣＥＣの最も均質な成長パターンを実証した（図１０）。アクチン染色によって示されるように、ＤＤＨＡＭ上の細胞の形態及び組織は、インサイチュでの角膜上皮細胞の形態と類似している（図１１Ａ及び１１Ｂ）（Ｓｏｓｎｏｖａ－Ｎｅｔｕｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．２００７）。これらの観察結果は、ＡＭ上での秩序ある成長を示唆している。逆に、ＤＨＡＭの成長パターンは乱れているように見え、ＣＨＡＭ上のＨＣＥＣが生存可能であるか、又は存在するかは不明なままである。細胞がストレスを受けると、細胞が表現型を変化させることは十分に確立されている（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．２０１３）。考慮するべき多くの因子があるが、これらの結果は、脱水、凍結保存、及び脱細胞化プロセスの差が、特に細胞接着性及び細胞生存率の点で、細胞がどのように膜と相互作用するかについて影響を及ぼし得ることを示唆している。
【0147】
異なって処理されたＡＭはまた、それらの上で培養された上皮細胞からの因子の放出に影響を与え得る。ＨＣＥＣの移動に対するＡＭ単独の効果を評価するために、本研究は、細胞の有無にかかわらず３つの異なるＡＭからの馴化培地を試験し、ＤＤＨＡＭ及びＤＨＡＭ上に細胞が無い馴化培地よりも、細胞を有する馴化培地の存在下でＨＣＥＣがより多く移動することを見出した。しかしながら、ＣＨＡＭ又は対照上の細胞の有無にかかわらず、馴化培地の存在下でＨＣＥＣ移動に差はなかった。これらの所見は、細胞によって放出された因子が、ＡＭ（すなわち、ＤＤＨＡＭ及びＤＨＡＭ）単独の細胞移動以上に細胞移動を促進することを示唆している。加えて、ＤＤＨＡＭ上の細胞及びＤＨＡＭ上の細胞からの馴化培地の存在下でのＨＣＥＣの移動は同等であり、両方ともＣＨＡＭ上の細胞よりも有意に大きかった。この所見の１つの可能な説明は、馴化培地を収集したときにＣＨＡＭ上の細胞が少なかったことである。より少ない細胞の場合、馴化培地の刺激効果が低くなり、結果として、ＣＨＡＭ上の細胞からの馴化培地の存在下での移動が小さくなり得る。追加的に、細胞を有する馴化培地の存在下でのＨＣＥＣの移動は、培地対照よりも３つ全てのＡＭにおいて有意に大きかった。総合すると、これらの所見は、細胞及びＡＭから放出された因子が細胞移動を促進すること、並びに放出された因子がＡＭによって変化することを示唆し、結果として、ＣＨＡＭよりもＤＤＨＡＭ及びＤＨＡＭ上のＨＣＥＣ移動が大きくなる。これらの因子の同一性及び供給源を判定するためには、追加の研究が必要である。
【0148】
側性がＨＣＥＣ移動に影響するかどうかを判定するために、追加の独立した実験を実施した。実験は、「移動アッセイのための馴化培地」及び「スクラッチ創傷移動アッセイ」のセクションに記載されているものと同じ方法に従った。しかしながら、この実験では、馴化培地の存在下でのＨＣＥＣの移動を、ＡＭの間質側及び上皮側の両方で評価した。この実験の結果、ＡＭの上皮側又は間質側上の細胞からの馴化培地の存在下でＨＣＥＣ移動に差がないことを確認した（ｐ＝０．４０７、データを示さず）。
【0149】
伝統的に、ＡＭは、欠損にわたる上皮化を促進するために上皮側を上にする移植片として配置される。ＤＨＡＭ及びＣＨＡＭの両方が、それらの側性のために、この臨床的応用性を有している。しかしながら、ＤＤＨＡＭは、向きに関係なく、眼球表面と接するように間質側が外向きに面した状態で製造される。このインビトロ研究からの結果は、ＨＣＥＣ活性がＤＤＨＡＭの間質側で最も高く、したがって、移植片としてのその臨床的応用性を支持していることを実証している。更に、含まれている事例は、前部基底膜ジストロフィーを治療するためのＤＤＨＡＭの成功的な適用を実証した。術後１ヶ月で、角膜表面は滑らかであり、正常であると認識可能であり、これにより、再上皮化が進行していることを示すことができる。しかしながら、追加の時点での組織学は、角膜上皮、その基底膜、及びボーマン層の再構成及び再構築を実証するために必要である。有望でありながら、ＤＤＨＡＭをより完全に評価し、眼球表面上での上皮化を促進するその能力を評価するには、より大きい試料サイズでの追加のインビボ調査が必要である。
【0150】
ＤＤＨＡＭは、初期の炎症応答を支持し、続いて時間ごとに低下する傾向にある。
【0151】
ＡＭの抗炎症特性は、十分に文書化されている（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．２０１６、Ｔａｂａｔａｂａｅｉ ｅｔ ａｌ．２０１７、Ｔａｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１１）。インビトロ調査に基づいて、ＡＭは、損傷した眼球組織からの成長因子及び炎症誘発性サイトカインの発現を低減し（Ｓｏｌｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ．２００１）、一方、更に炎症細胞を捕捉し、アポトーシスを誘導する（Ｄｕａ ｅｔ ａｌ．２００４、Ｓｈｉｍｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．２００１）。したがって、この調査の二次的な目的は、異なるＡＭ上のＨＣＥＣの炎症応答を評価することであった。即時のｍＲＮＡ発現及び時間ごとの傾向を調べることによって、これを実現した。角膜創傷治癒におけるそれらの既知の役割を考慮して、炎症誘発性サイトカイン、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、及びＴＮＦ－αを選択して、ＨＣＥＣの炎症応答を判断した。
【0152】
ＧＭ－ＣＳＦは、炎症性（ｖａｎ Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｊｚｅ ｅｔ ａｌ．２０１３）及び免疫調節性サイトカイン（Ｐａｒｍｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．２００７）の両方として認識され、その効果は用量及び状況に依存する（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ ｅｔ ａｌ．２０１５、Ｐａｒｍｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．２００７、Ｓｈａｃｈａｒ ａｎｄ Ｋａｒｉｎ ２０１３）。この多能性サイトカインは、炎症及び創傷治癒において重要な役割を有すると認識されており、より具体的には、インビトロ及びインビボの両方で角膜創傷治癒を強化する証明された能力を有する（Ｒｈｏ ｅｔ ａｌ．２０１５）。ＩＬ－６、ＩＬ－８、及びＴＮＦ－αは、より伝統的な炎症誘発性サイトカインである。炎症及び免疫応答を調節することに加えて、ＩＬ－６は、インビトロ及びインビボでの角膜創傷治癒を促進することが示されている（Ａｒｒａｎｚ－Ｖａｌｓｅｒｏ ｅｔ ａｌ．２０１４、Ｅｂｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．２０１１、Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．１９９２、Ｈａｆｅｚｉ ｅｔ ａｌ．２０１８）。ＩＬ－８は、新生血管形成を誘導する角膜因子であり、創傷治癒を調整すると考えられている（Ｓｔｒｉｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９２、Ｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．１９９２）。最後に、ＴＮＦ－αは、角膜傷害後の角膜炎症応答及び創傷治癒に関与する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０２０、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１９）。
【0153】
本研究では、最初の２４時間にＤＤＨＡＭ上で培養した細胞において、炎症性サイトカイン（すなわち、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ－α）のより高い発現があり、続いて時間ごとに低下する傾向があった。これらの観察結果は、ＤＤＨＡＭの存在が、初期の炎症応答を促進し、ＨＣＥＣ細胞における長期の炎症応答を阻止し得ることを示唆しており、これは、創傷治癒環境において有利であり得る。しかしながら、これらの所見をより完全に評価するためには、追加のインビボ調査が必要である。
【0154】
ＡＭを眼球表面再建に使用して、とりわけ、輪部上皮細胞のエクスビボ拡張（Ｒａｍａ ｅｔ ａｌ．２０１０、Ｓｈｏｒｔｔ ｅｔ ａｌ．２００９）、緑内障（Ｓｈｅｈａ ｅｔ ａｌ．２００８）、新生物（Ａｇｒａｖａｌ ｅｔ ａｌ．２０１７）、強膜融解及び強膜穿孔（Ｈａｎａｄａ ｅｔ ａｌ．２００１、Ｍａ ｅｔ ａｌ．２００２）のための担体として、輪部幹細胞欠損症（Ｍａｈａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．２００７、Ｓａｎｇｗａｎ ｅｔ ａｌ．２０１２）の有無にかかわらない角膜表面障害、結膜表面の再建（例えば、翼状片除去［Ｒｏｅｃｋ ｅｔ ａｌ．２０１９、Ａｋｂａｒｉ ｅｔ ａｌ．２０１７］）を含む、種々の眼球病態を治療する。治癒を強化し、宿主組織と一体化し、異物反応を回避する可能性を考慮して、脱細胞化ＡＭは、近年、ますます関心を集めている（Ｇｈｏｌｉｐｏｕｒｍａｌｅｋａｂａｄｉ ｅｔ ａｌ．２０１５、Ｆｅｎｅｌｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１９、Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．２０１０、Ｋｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．２０００、Ｓａｌａｈ ｅｔ ａｌ．２０１８、Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ．２０１６、Ｇｈｏｌｉｐｏｕｒｍａｌｅｋａｂａｄｉ ｅｔ ａｌ．２０１６、Ｔａｇｈｉａｂａｄｉ ｅｔ ａｌ．２０１５）。脱細胞化ＡＭにおけるＥＣＭの適切な保存は、ＡＭ内の様々な細胞タイプの相互作用を改善することが示されており、改善された細胞接着性、増殖、及び分化の証拠を有する（Ｆｅｎｅｌｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１９、Ｋｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．２０００、Ｓａｌａｈ ｅｔ ａｌ．２０１８、Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ．２０１６、Ｇｈｏｌｉｐｏｕｒｍａｌｅｋａｂａｄｉ ｅｔ ａｌ．２０１６、Ｔａｇｈｉａｂａｄｉ ｅｔ ａｌ．２０１５）。更に、及びおそらく最も重要なことに、脱細胞化ＡＭは、低い免疫原性を有する生体組織に一体化されることが示されている（Ｆｅｎｅｌｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１９、Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ．２０１６、Ｇｈｏｌｉｐｏｕｒｍａｌｅｋａｂａｄｉ ｅｔ ａｌ．２０１６）。
【0155】
ＡｍｂｉｏＤｒｙ（商標）は、低線量電子線滅菌され、機械的に排除された上皮層を用いた脱水を通して保存された単層ＡＭである（Ｈｏｖａｎｅｓｉａｎ，２０１２）。生成物はもはや入手することができないが、このＤＤＨＡＭ生成物の科学的評価から多くを得ることができる（Ｍｅｍａｒｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．２００８、Ｃｈｕｃｋ ｅｔ ａｌ．２００４）。Ｍｅｍａｒｚａｄｅｈらは、翼状片の再発を阻止するのに効果的な結膜自家移植片として作用するその能力を実証した（Ｍｅｍａｒｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．２００８）。追加的に、生体力学的調査により、このＤＤＨＡＭは、再水和時に望ましい弾性特徴を維持し、眼球表面再建のために操作しやすい組織であることが確認された（Ｃｈｕｃｋ ｅｔ ａｌ．２００４）。Ｂｉｏｖａｎｃｅ（登録商標）３Ｌ Ｏｃｕｌａｒの独自の３層設計、並びに細胞及び関連する成長因子のその完全な除去（Ｂｈａｔｉａ ｅｔ ａｌ．２００７）などの、ＡｍｂｉｏＤｒｙ（商標）とＢｉｏｖａｎｃｅ（登録商標）３Ｌ Ｏｃｕｌａｒとの間の明確な違いにもかかわらず、これらの以前の刊行物は、ＤＤＨＡＭ生成物への追加の洞察及び眼科におけるそれらの臨床的応用を提供する。
【0156】
本研究からの結果は有望であるが、いくつかの限定がある。何よりもまず、インビトロ調査からの所見は、臨床的応用に直接繋がらない。眼球上皮細胞との優れた適合性は、必ずしも眼球創傷治癒の臨床的改善に等しくはない。このインビトロ研究とは異なり、多くのタイプの細胞が存在し、インビボでの組織内で互いに相互作用する。１つの細胞タイプの細胞挙動は、必ずしも組織の応答を表すものではない。しかしながら、これらの限定にもかかわらず、この研究は、３つの市販のＡＭにおける眼球細胞活性及び炎症応答のその比較において独自のものである。更に、この研究は、細胞活性に対するＡＭ側性の効果を実証する最初の研究である。
【0157】
結論
全体として、ＤＤＨＡＭでは、インビトロでより良好なＨＣＥＣ機能を支持することを示し、これは、インビボでのより高い眼球細胞適合性を示唆し得る。ＤＤＨＡＭの創傷治癒応答、並びにその臨床的応用及び転帰を評価するために、追加の調査が必要である。
参考文献
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【0158】
実施例６：湾曲したＢｉｏｖａｎｃｅ ３Ｌ Ｏｃｕｌａｒ
本実施例では、角膜及び眼球により良好に適合するように、Ｂｉｏｖａｎｃｅ ３Ｌ ｏｃｕｌａｒを湾曲した形式で作り出す。
本実施例では、角膜及び眼球により良好に適合するように、Ｂｉｏｖａｎｃｅ ３Ｌ ｏｃｕｌａｒを湾曲した形式で作り出す。
【0159】
【0160】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際に、記載されるものに加えて、本発明の様々な修正は、前述の説明及び添付の図面から当業者には明白になるであろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
【0161】
本明細書に引用される全ての参考文献は、各個々の刊行物、特許又は特許出願が、あらゆる目的のために、その全体が参照により組み込まれることを具体的かつ個別に指示されている場合と同程度まで、参照によりそれらの全体が、あらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日の前のその開示のためのものであり、本発明が先行発明によりそのような刊行物に先行する権利を有しないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図15A-15F】
【図16A-16C】
【図17】
【図18】
【国際調査報告】