特表 2024-515586 低分解能タンデム質量分析を用いた生物学的同定

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-10

(54)【発明の名称】低分解能タンデム質量分析を用いた生物学的同定

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/62 20210101AFI20240403BHJP

   H01J 49/00 20060101ALI20240403BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20240403BHJP

   C12Q 1/70 20060101ALI20240403BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20240403BHJP

【ＦＩ】

G01N27/62 D

H01J49/00 400

C12Q1/04

C12Q1/70

C12Q1/68

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023562260

(86)(22)【出願日】2022-04-06

(85)【翻訳文提出日】2023-12-05

(86)【国際出願番号】 US2022023616

(87)【国際公開番号】W WO2022216788

(87)【国際公開日】2022-10-13

(31)【優先権主張番号】63/171,767

(32)【優先日】2021-04-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】501271033

【氏名又は名称】バンダービルト・ユニバーシティ

【氏名又は名称原語表記】ＶＡＮＤＥＲＢＩＬＴ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

(71)【出願人】

【識別番号】523380977

【氏名又は名称】ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ・アズ・リプリゼンテッド・バイ・ザ・セクレタリー・オブ・ジ・アーミー・ワシントン・ディーシー

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ ＡＳ ＲＥＰＲＥＳＥＮＴＥＤ ＢＹ ＴＨＥ ＳＥＣＲＥＴＡＲＹ ＯＦ ＴＨＥ ＡＲＭＹ， ＷＡＳＨＩＮＧＴＯＮ， ＤＣ

(71)【出願人】

【識別番号】519018255

【氏名又は名称】トライアド ナショナル セキュリティ リミテッド ライアビリティ カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100156144

【弁理士】

【氏名又は名称】落合 康

(72)【発明者】

【氏名】グラロス，トレバー

(72)【発明者】

【氏名】マック，フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】カプリオーリ，リチャード

(72)【発明者】

【氏名】ノリス，ジェレミー

【テーマコード（参考）】

2G041

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G041CA01

2G041DA04

2G041FA10

2G041FA11

2G041FA12

2G041GA09

2G041KA01

2G041LA07

4B063QQ06

4B063QQ10

4B063QR75

4B063QR79

4B063QX10

(57)【要約】

システムおよび装置は、イオン化後フラグメント化を備えた低分解能質量分析計での同定を可能にする多次元質量フィンガープリントを生成することが開示されている。このアプローチでは、従来のフィンガープリンティングのように単一の高分解能ＭＳスキャンを使用してペプチドに加工されたサンプルをインターロゲートするのではなく、未加工の生サンプル（脂質、タンパク質、ペプチドおよび代謝物などのすべての生化学種を含有する）が、マトリックス支援レーザー解離イオン化（ＭＡＬＤＩ）イオン化と低分解能タンデム質量分析を組み合わせることによって分析される。提案されるシステムは、ＭＳハードウェアおよびソフトウェアの改良と最先端の機械学習（ＭＬ）アプローチを組み合わせて、迅速な生物学的検出を先導する。この技術は、事前の分離（液体クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィー）を必要としないため、迅速（例えば、５秒未満）であり、高スループット（例えば、３８４サンプル／時間を超える）に適している。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

生物学的分析物を分析する方法であって、
（ａ）生物学的分析物をイオン化して、イオン混合物を生成すること；
（ｂ）フラグメント化を伴わない第１段階の質量分析（ＭＳ１）において、該イオン混合物の親質量スペクトルを取得し、記録すること；
（ｃ）親スペクトル内の事前に定義された質量ウィンドウを使用して、フラグメント化を伴う第２段階の質量分析（ＭＳ２）において、該イオン混合物の一連の質量スペクトルを取得し、記録すること；ならびに
（ｄ）ＭＳ１質量スペクトルデータおよびＭＳ２質量スペクトルデータの組み合わせから多次元フィンガープリントを生成すること
を含む、方法。

【請求項2】

生物学的分析物が、病原性細菌またはウイルスに由来する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

生物学的分析物が、組織サンプルに由来する、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

生物学的分析物が、哺乳動物、微生物または外因性化合物のうちの１つ以上の供給源に由来する、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

生物学的分析物が、タンパク質、ペプチド、脂質、代謝物、核酸、薬物、毒素または他の外因性分子のうちの１つ以上の混合物を表す、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

生物学的分析物が、細菌病原体またはウイルス病原体を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

事前に定義された質量ウィンドウが、およそ１００～２００ｍ／ｚの大きさである、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

事前に定義された質量ウィンドウが、重複していない、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

事前に定義された質量ウィンドウが、重複している、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

工程（ｃ）が、親スペクトル内の少なくとも５つの事前に定義された質量ウィンドウに対して繰り返される、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

工程（ａ）および（ｂ）が，低分解能タンデム質量分析を用いて得られる、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

生物学的分析物の分析方法であって、
（ａ）関心のある領域からの空間的に定義された細胞型を選択的にイオン化すること；
（ｂ）生物学的分析物をイオン化して、イオン混合物を生成すること；
（ｃ）フラグメント化を伴わない第１段階の質量分析（ＭＳ１）において、該イオン混合物の親質量スペクトルを取得し、記録すること；
（ｄ）親スペクトル内の事前に定義された質量ウィンドウを使用して、フラグメント化を伴う第２段階の質量分析（ＭＳ２）において、該イオン混合物の一連の質量スペクトルを取得し、記録すること；
（ｅ）ＭＳ１質量スペクトルデータおよびＭＳ２の質量スペクトルデータの組み合わせから多次元フィンガープリントを生成すること
を含む、方法。

【請求項13】

空間情報が、定義された関心のある領域内の細胞の疾患状態を分類するために使用される、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

空間情報が、分子の位置または疾患状態に基づいて組織の画像をレンダリングするために使用される、請求項１２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０２１年４月７日出願の米国仮出願第６３／１７１,７６７（出典明示によりその全体として本明細書の一部とする）の利益を主張する。

【背景技術】

【0002】

過去２０年の間に、現場または臨床で使用できる新しい迅速な検出および診断アッセイが急増してきた。これらの技術のほとんどは抗体ベースであり、偽陽性および偽陰性が多く、原因生物に関する予備知識を必要とする。これらの検出方法は、遺伝子操作によって容易に破られるため、生物兵器および新興病原体に対する防御の弱点となる。ＰＣＲのような最新のゲノム技術は、特異性の問題に対処しているが、実施するにはコストがかかり、かなりの量のサンプル調製を必要とし、実在の研究室（brick and mortar laboratory）で実施しなければならず、遺伝子操作または自然に獲得された突然変異によって偽陰性を生じる可能性がある。総合すると、これらの制約は、スループットを制限し、リアルタイムとはほど遠く、サンプリング後４～５時間以内に結果を得ることはできない。

【発明の概要】

【0003】

イオン化後フラグメント化を備えた低分解能質量分析計での同定を可能にする多次元質量フィンガープリントが開示されている。このアプローチでは、従来のフィンガープリンティングのように単一の高分解能ＭＳスキャンを使用してペプチド／タンパク質に加工されたサンプルをインターロゲートするのではなく、イオン化と低分解能タンデム質量分析を組み合わせることによって、未加工の生サンプル（脂質、タンパク質、ペプチドおよび代謝物などのすべての生化学種を含有する）が分析される。提案されるシステムは、ＭＳハードウェアおよびソフトウェアの改良と最先端の機械学習（ＭＬ）アプローチを組み合わせて、迅速な生物学的検出を先導する。これらの取り組みの中心は、理想的にはサンプル処理に起因するばらつきを減少させるために最小限の処理を施した、すべてが単一のサンプルから得られる親質量スキャン（ＭＳ１）および一連のフラグメント質量スキャン（ＭＳ２）から構成される多次元質量フィンガープリントの作成である。この技術は、事前の分離（液体クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィー）を必要としないため、迅速（例えば、５秒未満）であり、高スループット（例えば、３８４サンプル／時間を超える）に適している。

【0004】

図１に示されるように、システムおよび方法は、マトリックス支援レーザー解離イオン化（Matrix-Assisted Laser Dissociation Ionization）（ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、ナノスプレーイオン化（ＮＳＩ）、脱離エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）またはペーパースプレーイオン化（ＰＳＩ）などのイオン化技術によって質量分析計に導入された関心のあるサンプルの質量スキャン（ＭＳ１）を取得して記録することを含む。これを本明細書では「第１次元」と呼ぶ。ＭＳ１スキャンの例を図２に示す。

【0005】

システムおよび方法はさらに、段階的な事前に定義された質量ウィンドウから一連のフラグメント質量スキャン（ＭＳ２）を取得し、記録することを含む。これを本明細書では「第２次元」と呼ぶ。これらの質量ウィンドウは、大きさがさまざまであり得、例えば、単一イオンからＭＳ１質量範囲全体に及ぶ。いくつかの実施形態において、ウィンドウは約１００～２００ｍ／ｚである。ウィンドウは、均一にすることも、さまざまなサイズにすることもできる。ウィンドウは、スペクトル全体にわたることもできるし、ＭＳ１スキャンの情報が豊富な領域に焦点を絞ることもできる。いくつかの実施形態において、ウィンドウは図３に示されているように重複していない。他の実施形態において、ウィンドウは図４に示されているように重複している。

【0006】

実施形態において、質量分析の非限定的な例は、二次イオン質量分析、レーザー脱離質量分析、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析、エレクトロスプレー質量分析、または脱離エレクトロスプレーイオン化を含む。

【0007】

最後に、システムおよび方法はさらに、ＭＳ１およびＭＳ２スペクトルデータを組み合わせ、特有の多次元フィンガープリントを生成することを含む。該特有の質量フィンガープリントは、行われたすべてのスキャンで構成することができ、図５に示されているように、一度生成されると比較できるように固定されたままにする必要がある。この質量フィンガープリントは、ライブラリーの一部となり、種および株レベルの同定のために未知のサンプルと比較することができる。このライブラリーを編集することで、ＭＳ１とＭＳ２の両方のレベルで、ライブラリーにない生物の推定同定を（例えば、属または種レベルで）可能にする特有の特徴が同定される可能性も高い。

【0008】

いくつかの実施形態において、これらのデータは機械学習で分析されて、フィンガープリントが特定の生物（種／株）または生体材料と照合される。したがって、開示されたシステムおよび装置は、さらに、種々の生物および／または生体材料について開示された方法によって生成された質量フィンガープリントのデータベースを含むことができる。

【0009】

開示されたシステムおよび方法は、図６に示されるように、種レベル同定および増殖条件に直接相関するタンパク質、ペプチド、脂質、および関心のある他の分子を含む細菌学的種のフィンガープリントを提供するために使用することができる。

【0010】

開示された方法は、サンプル中の化学物質、化合物、細胞または生物を含むあらゆる生物学的または化学的実体の存在を検出および同定するために使用することができる。これは、病原体または疾患（例えば、癌）の場合に診断目的で行うことができる。開示されたシステムおよび方法は、例えば、組織生検と共に使用することができる。これは、人間の判断に頼る従来の組織染色および顕微鏡検査技術に取って代わるという点で有用である。

【0011】

いくつかの実施態様において、開示されたシステムおよび方法は、被験体または環境からのサンプル中の有害な化学物質または生物を検出および同定するために使用される。臨床サンプルには、純粋／培養サンプル、または事前のサンプル調製がほとんどまたは全くない臨床サンプルが含まれる。

【0012】

いくつかの実施形態において、開示されたシステムおよび方法は、有害な生物学的または化学的薬剤の存在を同定するために使用される。

【0013】

いくつかの実施形態において、開示されたシステムおよび方法は、ポイントオブケア用の感染または化学物質曝露を診断するために使用される。

【0014】

いくつかの実施形態において、開示されたシステムおよび方法は、癌、糖尿病および感染性疾患を含むがこれらに限定されない疾患状態に直接相関するタンパク質、ペプチド、脂質、および関心のある他の分子を含む組織サンプルのフィンガープリントを提供するために使用することができる。

【0015】

いくつかの実施態様において、開示されたシステムおよび方法は、分子フィンガープリントを特定の細胞型または組織下部構造と相関させる目的で、生物学的サンプルの空間分析を組み込むことができる。この相関は、医師の指導を受ける標的化実験で達成することができる。別法として通常のサンプルラスターを用いて組織表面全体をインターロゲートし、分子フィンガープリントの各成分の画像をレンダリングし得る。

【0016】

実施形態において、本明細書に記載される方法は、さらに、前記被験体からサンプルを得る工程を含むことができる。例えば、被験体は、哺乳動物被験体、例えばヒト被験体であり得る。いくつかの実施態様において、哺乳動物は、イヌ、ネコまたはウマであり得る。この例では、被験体から組織サンプルを得、本明細書に記載される方法を用いて黒色腫のバイオマーカーについて試験することができる。組織は、当該技術分野において公知の方法を用いて得ることができる。

【0017】

実施形態において、本明細書に記載される方法は、さらに、既知の生物学的状態を有する検体の質量分析を行う工程を含むことができる。例えば、既知の癌性病変は、本明細書に記載される実施形態および方法を用いてサンプル組織が試験されている被験体から得ることができる。実施形態において、本明細書に記載される方法は、さらに、組織サンプルに対して組織学的分析を行うことを含むことができる。さらに、本明細書に記載される実施形態は、組織サンプルに対して免疫組織化学的分析を行うことを含むこともできる。本明細書に記載される実施形態は、被験体の診断、予後、または治療アプローチを決定することができる。本明細書に記載される実施形態は、被験体の診断、予後、または治療アプローチを決定するために、当該技術分野で公知の他の方法と組み合わせて使用することができる。

【0018】

本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的および利点は、明細書および図面ならびに特許請求の範囲から明らかである。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１は、多次元質量フィンガープリンティングを示す。多次元フィンガープリントを得るために、従来のプロセスと非常に同様に一次ＭＳ１スキャンを取得する。次いで、関心のある大きな質量領域（約１００～２００ｍ／ｚ）を分離し、フラグメント化する。次いで、フラグメントを、ＭＳ２スキャンを行うことによって「読み取り／スキャン」する。次いで、この一連のイベントを、サンプルが使い果たされるかまたは所望のデータがすべて取得されるまで、最初のＭＳ１スキャン内の他の関心のあるイオン領域で繰り返すことができる。次いで、すべてのスペクトルデータを処理し、編集して新しいフィンガープリントを生成した。第２次元の情報（ＭＳ２）を加えることにより、取得される分子の詳細は少なくとも１桁増加し、低分解能の可搬型質量分析計を用いた歪みレベルの同定が可能になる。

【図2】図２は、低分解能機器で得られた全質量スキャンの例を示す。

【図3】図３は、ＭＳ１スキャン上に示されたＭＳ２スキャンの非重複分離ウィンドウ（non-overlapping isolation windows）の例を示す。

【図4】図４は、ＭＳ２スキャンの重複分離ウィンドウ（overlapping isolation windows）の例を示す。

【図5】図５は、ＭＳ１レベルおよびＭＳ２レベルで取得された質量のライブラリーである最終的な多次元質量フィンガープリントの例を示す。このライブラリーにインデックスを付けることができ、各レベルの特有の質量を同定することができる。

【図6】図６は、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）およびスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）の各２株を、上記で定義した１次元アプローチおよび２次元アプローチの両方を用いて分析したことを示す。教師なし分類アプローチ、主成分分析および階層的クラスタリングを用い、第２次元スキャンを組み込むことによって、各微生物の識別を改善した。

【発明を実施するための形態】

【0020】

詳細な説明
本開示をより詳細に説明する前に、本開示は、記載された特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって、当然、変化し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することを意図していないことも理解されたい。

【0021】

値の範囲が規定されている場合には、当該範囲の上限及び下限と、当該範囲内の他の記載された又は介在する値との間で、文脈上明確に別段の指示がない限り、下限の単位の十分の一までの各介在値は、本開示の範囲内に包含されると理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立してより小さな範囲に含めることができ、また、記載された範囲の中で特に除外される制限に従うことを条件として、本開示の範囲内に包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限界の一方または両方を除く範囲も本開示に含まれる。

【0022】

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載された方法および材料と同様または同等の方法および材料は、本開示の実施または試験においても使用することができるが、好ましい方法および材料についてここで説明する。

【0023】

本明細書において引用されているすべての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許が参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示されていたかのように、参照により本明細書に組み込まれ、また、刊行物が引用されている方法および／または材料に関連して開示され、記載されるために、参照により本明細書に組み込まれる。刊行物の引用は、出願日前のその開示のためのものであり、本開示が先行開示により当該刊行物に先行する権利を有しないことを認めるものと解釈すべきではない。さらに、提供された公表日は、独立して確認する必要がある実際の公表日とは異なる可能性がある。

【0024】

本開示を読めば当業者に明らかなように、本明細書に記載され説明される個々の実施形態の各々は、本開示の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るかまたは該特徴と容易に組み合わされ得る個別の構成要素および特徴を有する。記載された方法は、記載されたイベントの順序で、または論理的に可能な他の任意の順序で実施することができる。

【0025】

本開示の実施形態は、別段の指示がない限り、当業者の技術の範囲内にある化学、生物学等の技術を用いる。

【0026】

以下の実施例は、本明細書で開示され、特許請求の範囲に記載されている方法の実行方法およびプローブの使用方法について、当業者に完全な開示と説明を提供するために提示されたものである。数値（例えば、量、温度など）に関する正確性を確保するための努力がなされているが、多少の誤差および逸脱は考慮されるべきである。特に断りのない限り、部は重量部であり、温度は℃であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。標準温度は２０℃であり、標準圧力は１気圧とする。

【0027】

本開示の実施形態を詳細に説明する前に、別段の指示がない限り、本開示は、特定の材料、試薬、反応材料、製造プロセスなどに限定されず、それ自体が変化し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定することを意図するものではないことを理解されたい。本開示において、論理的に可能である場合には、工程を異なる順序で実行することも可能である。

【0028】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでない場合を除き、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。

【0029】

質量分析技術は、質量フィンガープリンティングとして知られるアプローチを利用して、臨床環境における病原体の検出および同定に対してクラス最高の感度および特異性を有することが実証されている。簡単にいうと、タンパク質が臨床サンプルから抽出され、ペプチドに加工され、次いで、高分解能質量分析計で親質量スキャン（ＭＳ１）を行うことで分解され、特有の「質量フィンガープリント」が得られる。これらのＦＤＡ承認機器プラットフォームは、最前線へのまたはポイントオブケア環境での広範な展開に必要とされる過酷な環境で動作するようには設計されていない。直接的な結果として、診断質量分析技術は、高度な訓練を受けたスタッフを伴う実在の集中型研究室に限定されている。さらに、ゲノムシーケンサーと同様に、これらのシステムのコストは一般に３５万ドルを超え、大規模な展開の妨げとなっている。現在の技術では、高コストと複雑さの組み合わせにより、切望されている病原体曝露に関するリアルタイム情報の普及が遅れている。低コストの可搬型ＭＳシステムは現在も存在するが、その大部分が化学兵器剤の検出と定量のために開発されたものである。可搬性の必要性から、性能面での妥協が必要だった。これらの妥協が、この技術が生物学的検出分野に進出することを妨げている。過去５年間にいくつかの技術的改良があったにもかかわらず、機器の質量範囲と分解能における重大かつ基本的な限界は、なおも、従来の質量フィンガープリンティングアプローチを用いて細菌またはウイルスに特有の生体分子を検出する際の障壁となっている。

【0030】

本明細書に開示されるのは、既存の可搬型小型化機器設計を活用し改良するシステムおよび方法であり、低分解能タンデム質量分析を使用して、サンプル調製なしに複雑な環境および臨床背景において生物学的同定を行うために使用できる高忠実度データを取得し、したがって、高価な高分解能質量分析の必要性に取って代わる。

【0031】

細菌およびウイルスの同定を達成するための現在の最先端の小型化質量分析の限界を克服するために、ポストイオン化フラグメント化を備えた低分解能質量分析計で同定を可能にする多次元質量フィンガープリントを得ることができる。このアプローチでは、従来のフィンガープリンティングのように単一の高分解能ＭＳスキャンを用いてペプチドに加工されたサンプルをインターロゲートするのではなく、開示されたシステムおよび方法は、イオン化と低分解能タンデム質量分析を組み合わせることによって、未加工の生サンプル（脂質、タンパク質、ペプチドおよび代謝物などのすべての生化学種を含有する）を分析する。提案されている取り組みは、ＭＳハードウェアおよびソフトウェアの改良と機械学習（ＭＬ）アプローチを組み合わせて、迅速な生物学的検出を先導することを目的としている。

【0032】

これらの取り組みの中心は、すべてが単一のサンプルから得られる親質量スキャン（ＭＳ１）および一連のフラグメント質量スキャン（ＭＳ２）から構成される多次元質量フィンガープリントの作成である。この技術は、事前の分離（液体クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィー）を必要としないため、迅速（例えば、５秒未満）であり、高スループット（例えば、３８４サンプル／時間を超える）に適している。このアプローチの一実施形態を図１に示す。

【0033】

質量分析は、サンプルをイオン化して荷電分子にし、それらの質量対電荷比（ｍ／ｚ）を測定することができる分析技術である。いくつかの実施形態において、質量分析のためのイオン源はマトリックス支援レーザー脱離イオン化（matrix-assisted laser desorption/ionization）（ＭＡＬＤＩ）である。

【0034】

ＭＡＬＤＩは、低分子のマトリックスにレーザーを照射し、分析物分子をフラグメント化または分解することなく気相にするソフトイオン化である。生体分子の中には大きすぎて加熱すると分解し得るものがあり、従来の技術は高分子をフラグメント化または破壊する。ＭＡＬＤＩはペプチド、脂質、糖類、またはその他の有機高分子のような生体分子の分析に適している。

【0035】

ＭＡＬＤＩプロセスは、「Identification of Pathogens in Bodily Fluids」と題されたUlrich Wellerに対する国際公開第ＷＯ２００９／０６５５８０号Ａ１にさらに詳細に記載されており、その内容は出典明示によりその全体として本明細書の一部とする。

【0036】

いくつかの実施形態において、分析物は、通常導電性金属で作られていて適用されるいくつかの異なるサンプルのためのスポットを有する、ターゲットと称される固体表面上に堆積した非常に大過剰のマトリックス化合物中に埋め込まれる。非常に短いレーザーパルスの後、照射されたスポットは急速に加熱され、振動励起される。マトリックス分子は、サンプル表面からエネルギー的にアブレートされ、レーザーエネルギーを吸収し、分析物分子を気相中にも運ぶ。アブレーションプロセス中、分析物分子は通常、近傍のマトリックス分子でプロトン化または脱プロトン化されることによってイオン化される。最も一般的なＭＡＬＤＩイオン化フォーマットは、分析物分子が単一の正電荷を担持することである。

【0037】

ＭＡＬＤＩで使用されるレーザーには、紫外線（ＵＶ）と赤外線（ＩＲ）の両方の波長のレーザーを含むさまざまなタイプがあるが、分析用ＭＡＬＤＩではＵＶレーザーが最も一般的な光源である。これらのうち、窒素レーザーおよび周波数３倍または４倍のＮｄ：Ｙａｇレーザーは、多くの場合、大部分の用途に役立つ。ＩＲ－ＭＡＬＤＩはＥｒ：Ｙａｇレーザーが主流であるが、ＴＥＡ－ＣＯ₂レーザーが使用される場合もある。

【0038】

マトリックスの第一の機能は、本質的に分析物分子を希釈して互いに分離することであると考えられている。これは、溶媒の蒸発とそれに伴う固溶体の形成の間に起こる。その後、レーザー照射により、エネルギー吸収のメディエーターとして機能する。適切なマトリックスの選択はＭＡＬＤＩの成功の鍵である。一般的に、高極性分析物は高極性マトリックスとより良く作用し、非極性分析物は、好ましくは、非極性マトリックスと組み合わせられる。ニコチン酸、ピコリン酸、３－ヒドロキシピコリン酸、３－アミノピコリン酸、６－アザ－２－チオチミン、２,５－ジヒドロキシ安息香酸、ＤＨＢベース混合物、３－アミノキノリン、α－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸、４－クロロ－α－シアノ－経皮酸、３,５－ジメトキシ－４－ヒドロキシ桂皮酸、２－(４－ヒドロキシフェニルアゾ)安息香酸、２－メルカプトベンゾチアゾール、５－クロロ－２－メルカプトベンゾチアゾール、２,６－ジヒドロキシアセトフェノン、２,４,６－トリヒドロキシアセトフェノン、ジトラノール（１,８,９－アントラセントリオール）、９－ニトロアントラセン、ベンゾ[ａ]ピレン、および２－[(２Ｅ)－３－(４－tert－ブチルフェニル)－２－メチルプロパ－２－エニリデン]マロンニトリルなどのさまざまなマトリックスが求められ、広く使用されている。現在、最も一般的に使用されているマトリックスは、α－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸、２,５－ジヒドロキシ安息香酸、３,５－ジメトキシ－４－ヒドロキシ桂皮酸、および２,６－ジヒドロキシアセトフェノンである。

【0039】

いくつかの実施形態において、タンデム質量分析は、それらの質量対電荷比（ｍ／ｚ）を測定するために使用される。ＭＳ／ＭＳとしても知られているタンデム質量分析は、化学サンプルを分析する能力を高めるために２つ以上の質量分析計を追加の反応ステップを使用して結合する機器分析における技術である。分析物がイオン化されると、第１の分光計（ＭＳ１と称する）は、質量対電荷比（しばしばｍ／ｚまたはｍ／Ｑとして与えられる）によってこれらのイオンを分離する。ＭＳ１からの特定のｍ／ｚ比のイオンが選択され、次いで、例えば衝突誘起解離、イオン分子反応または光解離によって、より小さなフラグメントイオンに分裂させられる。次いで、これらのフラグメントは第２の質量分析計（ＭＳ２）に導入され、次いで、該ＭＳ２が、それらのｍ／ｚ比によって該フラグメントを分離し、それらを検出する。選択－フラグメント化－検出のシーケンスは、さらに、第一世代プロダクトイオンにまで拡張することができる。例えば、ＭＳ２で生成された選択されたプロダクトイオンは、さらにフラグメント化されて、別のグループのプロダクトイオン（ＭＳ３）などを生成することができる。該フラグメント化工程は、通常の質量分析計において非常に類似したｍ／ｚ比を有するイオンを同定し、分離することを可能にする。

【0040】

タンデムＭＳは選択－フラグメント化－検出の３つの異なる工程を含むので，これら３つの工程の分離は空間的または時間的に実現することができる。代表的な空間的タンデムＭＳ機器としては、ＱｑＱ、ＱＴＯＦ、およびハイブリッドイオントラップ／ＦＴＭＳなどが挙げられ、代表的な時間的タンデム（Tandem-in-Time）ＭＳ／ＭＳ機器としては、イオントラップおよびＦＴ－ＩＣＲ ＭＳが挙げられる。

【0041】

プレカーサーイオンは多種多様な方法で（内部エネルギーを増加させて）活性化できる。フラグメント化パターンは、前駆体イオンへのエネルギーの伝達方法、伝達されるエネルギーの量、および伝達されたエネルギーの内部分布方法に依存する。衝突誘起解離および赤外多光子解離は、イオンのボルツマン温度を上昇させ、したがって最も弱い結合を優先的に開裂して主にｂイオンおよびｙイオンを生成する「低速加熱」技術である。これらの技術は、ペプチド、脂質および他の比較的小さな化合物に対して非常に効率的であるが、タンパク質の翻訳後修飾（例えば、リン酸塩および糖）を除去し得る。電子捕獲解離および電子移動解離は、主に、翻訳後修飾（ＰＴＭ）を保持しながらｃイオンおよびｚイオンを生成する。したがって、ＥＣＤおよびＥＴＤは、不安定なＰＴＭを有するタンパク質およびペプチドに広く適用されており、ＥＣＤ／ＥＴＤはまた、グリコシド結合の局在化に重要な交差環開裂ａイオンおよびｚイオンを生成することもできる。

【0042】

タンデム質量分析としては、トリプル四重極質量分析計（ＱｑＱ）、四重極飛行時間型（Ｑ－ＴＯＦ）、およびハイブリッド質量分析計が挙げられる。トリプル四重極質量分析計は、第１四重極および第３四重極を質量フィルタとして使用する。分析物が第２四重極を通過すると、ガスとの衝突によりフラグメント化が進行する。通常、製薬業界で使用される。四重極飛行時間型（Ｑ－ＴＯＦ）質量分析計は、ＴＯＦおよび四重極機器を組み合わせたものであり、プロダクトイオンの高い質量精度、正確な定量能力、およびフラグメント化実験の適用性をもたらす。これは、飛行時間測定によりイオンフラグメント化（ｍ／ｚ）比を決定する質量分析方法である。ハイブリッド質量分析計は、２つを超える質量分析計からなる。

【0043】

いくつかの実施形態において、開示されたシステムおよび方法で使用される分光計は低分解能機器である。低分解能機器は、典型的には、０.２質量単位（ｍ.ｕ.）の質量差（Ｍ＝２００の場合、Ｒ≒１０００）でイオンを識別するが、一方、高分解能機器は、質量差０.０００１ｍ.ｕ.の質量差（Ｍ＝２００の場合、Ｒ≒２,０００,０００）でイオンを識別することができる。

【0044】

開示された方法は、ＭＳ１質量スペクトルデータおよびＭＳ２質量スペクトルデータの組み合わせから多次元フィンガープリントを生成することを含む。いくつかの実施形態において、これは機械学習分類モデルを使用して行われる。いくつかの実施において、機械学習分類モデルは畳み込みニューラルネットワーク分類器を含む。実施形態において、サンプルは、所望の身体組織を含み、その非限定的な例は、血液、血清、脳脊髄液、尿、汗、唾液、皮膚、皮膚パンチまたは固形組織生検を含む。実施形態において、多次元フィンガープリントは、分子プロファイルとしても知られる。実施形態において、多次元フィンガープリントは、１つの分子または複数の分子を含む。質量分析プロファイルで表される分子のタイプの非限定的な例は、タンパク質、ペプチド、脂質、代謝物、核酸またはそれらの組み合わせを含む。実施形態において、被験体からのサンプルと既知のプロファイル、例えば既知の分子プロファイルとの類似性は、統計的アルゴリズムまたは機械学習アルゴリズムを使用して決定される。機械学習アルゴリズムの非限定的な例は、遺伝的アルゴリズム、サポートベクターマシン、または教師ありニューラルネットワークを含む。いくつかの実施形態において、類似性は、サンプル対象体から得られた質量分析プロファイルに表示されるピークが、既知のサンプル、対照サンプル、および／または参照サンプルから得られた質量分析プロファイルに表示されるピークと重複しているかどうかを評価することによって決定される。

【0045】

分類に使用される機械学習の方法および統計的アプローチは、米国特許第１０,８７７,０４０号、米国特許第８,８２２,１５９号および米国特許公開第２０１９０３９１１５７号に記載されている（これらの方法の教示のために出典明示により本明細書の一部とする）。

【0046】

いくつかの実施形態において、生成されたフィンガープリントは、特定の実体を同定するために既知のフィンガープリントと照合される。他の実施形態において、フィンガープリントは未知であるが、類似のフィンガープリントと比較して、生物の科または属のような分類を提供する。いくつかの実施形態において、フィンガープリントは、生物学的類似性に基づいて生物のグループに対して生成される。例えば、フィンガープリントは細菌がグラム陽性かグラム陰性かを決定することができる。

【0047】

本発明の多くの実施形態が説明されている。それにもかかわらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の修正を行うことができることが理解されるであろう。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に含まれる。

【0048】

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、開示されている発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で引用した刊行物およびそれらが引用されている資料は、具体的に出典明示により本明細書の一部とする。

【0049】

当業者は、本明細書に記載された本発明の具体的な実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または日常的な実験以上のことを行わずに確認することができるであろう。このような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【国際調査報告】