▶ ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニアの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-10
(54)【発明の名称】球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）の治療に有用な組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20240403BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240403BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240403BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240403BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20240403BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240403BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20240403BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
C12N7/01 ZNA
A61K35/76
A61P25/00
A61P21/00
A61K48/00
C12N15/113 140Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023562714
(86)(22)【出願日】2022-04-12
(85)【翻訳文提出日】2023-12-06
(86)【国際出願番号】 US2022024415
(87)【国際公開番号】W WO2022221276
(87)【国際公開日】2022-10-20
(31)【優先権主張番号】63/293,505
(32)【優先日】2021-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/187,883
(32)【優先日】2021-05-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/173,885
(32)【優先日】2021-04-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＬＡＢＲＡＳＯＬ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】502409813
【氏名又は名称】ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア
(74)【代理人】
【識別番号】110000741
【氏名又は名称】弁理士法人小田島特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ウイルソン，ジェームス・エム
(72)【発明者】
【氏名】ヒンデラー，クリスチャン
(72)【発明者】
【氏名】ワークマン，アイリーン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA23
4B065CA44
4C084AA13
4C084MA56
4C084NA14
4C084ZA01
4C084ZA94
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087MA56
4C087NA14
4C087ZA01
4C087ZA94
(57)【要約】
ＡＡＶカプシドと、ヒトアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ上の標的部位に結合する標的化配列を含む、少なくとも１つのヘアピン形成ｍｉＲＮＡをコードする配列を含むベクターゲノムであって、ｍｉＲＮＡがヒトアンドロゲン受容体の発現を阻害する、ベクターゲノムと、を有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの投与を含む、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）の治療に有用な組成物が提供される。また、ｒＡＡＶベクターを含有する組成物、及びｒＡＡＶベクターの投与を含む、患者においてＳＢＭＡを治療する方法も提供される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ベクターゲノムを中にパッケージングしたＡＡＶｈｕ６８カプシドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、対象における核酸配列の発現を指示する調節配列と作動可能に連結された、ヒトアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ標的部位に結合する標的化配列を含む、少なくとも１つのヘアピン形成ｍｉＲＮＡをコードする前記核酸配列を含む、発現カセットを含み、前記ｍｉＲＮＡが、ヒトアンドロゲン受容体の発現を阻害し、前記発現カセットが、５’ＡＡＶ ＩＴＲ及び３’ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
【請求項2】
前記ｍｉＲＮＡ標的部位が、ａ）ＧＡＡ ＣＴＡ ＣＡＴ ＣＡＡ ＧＧＡ ＡＣＴ ＣＧＡ（配列番号１）、又は
ｂ）ＣＴＡ ＣＡＴ ＣＡＡ ＧＧＡ ＡＣＴ ＣＧＡ ＴＣＧ（配列番号２７）を含む、請求項１に記載のＡＡＶ。
【請求項3】
前記ｍｉＲＮＡコード配列が、ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＡＧ ＴＴＣ（配列番号２）の配列又は最大１０個の置換を有する配列を含む、請求項１又は２に記載のＡＡＶ。
【請求項4】
前記ｍｉＲＮＡコード配列が、ＣＧＡ ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＡＧ（配列番号３）の配列又は最大１０個の置換を有する配列を含む、請求項１又は２に記載のＡＡＶ。
【請求項5】
前記ｍｉＲＮＡコード配列が、配列番号４若しくは配列番号５、又は最大３０個の置換を有する配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項6】
前記ｍｉＲＮＡコード配列が、配列番号１１若しくは配列番号１２、又は最大６０個の置換を有する配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項7】
前記調節配列が、プロモーター、イントロン、ＷＰＲＥ、及びポリＡのうちの１つ以上を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項8】
前記プロモーターが、ＣＢ７プロモーターである、請求項７に記載のＡＡＶ。
【請求項9】
前記調節配列が、ＷＰＲＥを含む、請求項７又は８に記載のＡＡＶ。
【請求項10】
前記調節配列が、イントロンを含む、請求項７～９のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項11】
前記調節配列が、ウサギベータグロビンポリＡを含む、請求項７～１０のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか一項に記載のＡＡＶと、薬学的に許容される水性懸濁液体、賦形剤、及び／又は希釈剤と、を含む、医薬組成物。
【請求項13】
球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）を有する対象を治療する方法であって、有効量の、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＡＡＶ、又は請求項１２に記載の組成物を、それを必要とする対象に送達することを含む、方法。
【請求項14】
球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）を有する患者の治療のための、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＡＡＶ、又は請求項１２若しくは２５に記載の組成物の、使用。
【請求項15】
前記組成物が、１ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～３．３３ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量のｒＡＡＶの用量で髄腔内に投与されるように製剤化される、請求項１３又は１４に記載の方法又は使用。
【請求項16】
前記患者が、ヒト成人であり、１．４４×１０１３～４．３３×１０１４ＧＣの用量の前記ｒＡＡＶを投与される、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項17】
前記ｒＡＡＶが、脳室内送達を介して、又は実質内送達を介して、髄腔内に送達される、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項18】
前記組成物が、大槽（大槽内）へのコンピュータ断層撮影（ＣＴ）ガイドによる後頭下注入を介して、単回用量として投与される、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項19】
前記患者が、ＳＢＭＡを有する、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項20】
前記患者が、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＡＡＶ又は請求項１２に記載の組成物を投与される、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項21】
前記患者が、１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～３．３３×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量の前記ｒＡＡＶを、髄腔内に投与される、請求項１３～２０のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項22】
前記患者が、ヒト成人であり、１．４４×１０１３～４．３３×１０１４ＧＣの用量の前記ｒＡＡＶを投与される、請求項１３～２１のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項23】
ｍｉＲのコード配列を含む前記ｒＡＡＶが、脳室内送達を介して、又は実質内送達を介して、髄腔内に送達される、請求項１３～２２のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項24】
前記ｒＡＡＶが、大槽（大槽内）へのコンピュータ断層撮影（ＣＴ）ガイドによる後頭下注入を介して、単回用量として投与される、請求項１３～２３のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項25】
対象における核酸配列の発現を指示する調節配列と作動可能に連結された、ヒトアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ標的部位に結合する標的化配列を含む、少なくとも１つのヘアピン形成ｍｉＲＮＡをコードする前記核酸配列を含む、発現カセットであって、前記ｍｉＲＮＡが、ヒトアンドロゲン受容体の発現を阻害し、前記発現カセットが、５’ＡＡＶ ＩＴＲ及び３’ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する、発現カセット。
【請求項26】
前記ｍｉＲＮＡ標的部位が、ａ）ＧＡＡ ＣＴＡ ＣＡＴ ＣＡＡ ＧＧＡ ＡＣＴ ＣＧＡ（配列番号１）、又は
ｂ）ＣＴＡ ＣＡＴ ＣＡＡ ＧＧＡ ＡＣＴ ＣＧＡ ＴＣＧ（配列番号２７）を含む、請求項２５に記載の発現カセット。
【請求項27】
前記ｍｉＲＮＡコード配列が、ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＡＧ ＴＴＣ（配列番号２）の配列又は最大１０個の置換を有する配列を含む、請求項２５又は２６に記載の発現カセット。
【請求項28】
前記ｍｉＲＮＡコード配列が、ＣＧＡ ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＡＧ（配列番号３）の配列又は最大１０個の置換を有する配列を含む、請求項２５又は２６に記載の発現カセット。
【請求項29】
前記調節配列が、プロモーター、イントロン、ＷＰＲＥ、及びポリＡのうちの１つ以上を含む、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項30】
前記プロモーターが、ＣＢ７プロモーターである、請求項２９に記載の発現カセット。
【請求項31】
前記調節配列が、ＷＰＲＥを含む、請求項２９又は３０に記載の発現カセット。
【請求項32】
前記調節配列が、イントロンを含む、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項33】
前記調節配列が、ウサギベータグロビンポリＡを含む、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の発現カセット。【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
球脊髄性筋萎縮症（本明細書ではＳＢＭＡ又はケネディ病と称される）は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）のエクソン１内のポリグルタミン（ＣＡＧ）伸長鎖によって引き起こされるＸ連鎖性の緩徐進行性運動ニューロン疾患である。この伸長は、アンドロゲンを介した毒性の活性化に起因して、ほぼ男性のみにおいて運動ニューロン変性を引き起こすＡＲタンパク質の核凝集をもたらす。これまで、ＳＢＭＡに対する有効な治療は承認されていない。ニューロン中のアンドロゲン受容体のノックダウンが有害作用をもたらすことは知られていないため、ＳＢＭＡ中のＡＲレベルを低下させることは、疾患の治療のための魅力的な戦略である。
【0002】
パルボウイルスファミリーのメンバーであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、約４．７キロ塩基（ｋｂ）の長さの一本鎖直鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを有する小さな非エンベロープ性の正二十面体ウイルスである。野生型ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端に逆位末端反復（ＩＴＲ）、並びに２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であるｒｅｐ及びｃａｐを含む。Ｒｅｐは、ＡＡＶの生活環に必要なｒｅｐタンパク質をコードする４つの重複遺伝子から構成され、ｃａｐは、カプシドタンパク質の重複ヌクレオチド配列であるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３を含有し、自己集合して二面体対称のカプシドを形成する。
【0003】
ＡＡＶは、このウイルスが精製されたアデノウイルスストック中の混入物として発見されたため、ディペンドウイルス属に割り当てられている。ＡＡＶの生活環には、感染後にＡＡＶゲノムが宿主染色体に特異的に組み込まれる潜伏相と、アデノウイルス又は単純ヘルペスウイルスのいずれかの感染後に、組み込まれたゲノムが、その後に感染性ウイルスへと救出、複製、及びパッケージングされる感染相とが含まれる。非病原性、非分裂細胞を含む広範な宿主範囲の感染性、及び潜在的な部位特異的染色体組み込みの特性により、ＡＡＶは、遺伝子導入のための魅力的なツールとなる。
【0004】
望まれるのは、ＳＢＭＡの治療のための治療薬である。
【発明の概要】
【0005】
ＳＢＭＡに関連する症状の治療及び／又は低減を必要とするヒト患者において、それを行うために有用である、治療用の組換え（ｒ）複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が提供される。ｒＡＡＶは、望ましくは複製欠損性であり、運動ニューロンに対してアンドロゲン受容体を標的とするｍｉＲＮＡを発現するベクターゲノムを担持する。
【0006】
一態様では、ヒトアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ標的部位に結合し、ヒトアンドロゲン受容体の発現を阻害する標的化配列を含む、少なくとも１つのヘアピン形成ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を含む、発現カセットが本明細書で提供される。コード配列は、対象における核酸配列の発現を指示する調節配列と作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的部位は、以下を含む：ＧＡＡ ＣＴＡ ＣＡＴ ＣＡＡ ＧＧＡ ＡＣＴ ＣＧＡ（配列番号１）、又は配列番号１と比較して、１、２、３、４、若しくは５個の置換（若しくは切断）を有する配列。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡコード配列は、ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＡＧ ＴＴＣ（配列番号２－３６１０標的化配列）の配列を含む。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡコード配列は、ＣＧＡ ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＡＧ（配列番号３－３６
１３標的化配列）の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的化配列は、ヒトアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ上の標的部位との正確な相補性より少なく共有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡコード配列は、ａ）ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＣＣ ＴＴＧ
ＡＴＧ ＴＡＧ ＴＴＣ（配列番号２－３６１０）、若しくは最大１０個の置換を有する配列、又はｂ）ＣＧＡ ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＡＧ（配列番号３－３６１３）、若しくは最大１０個の置換を有する配列の配列を含む。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡコード配列は、配列番号４（３６１０－６４ｍｅｒ）、又は最大３０個の置換を有する配列を含む。更に別の実施形態では、ｍｉＲＮＡコード配列は、配列番号５（３６１３－６４ｍｅｒ）、又は最大３０個の置換を有する配列を含む。
１３標的化配列）の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的化配列は、ヒトアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ上の標的部位との正確な相補性より少なく共有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡコード配列は、ａ）ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＣＣ ＴＴＧ
ＡＴＧ ＴＡＧ ＴＴＣ（配列番号２－３６１０）、若しくは最大１０個の置換を有する配列、又はｂ）ＣＧＡ ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＡＧ（配列番号３－３６１３）、若しくは最大１０個の置換を有する配列の配列を含む。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡコード配列は、配列番号４（３６１０－６４ｍｅｒ）、又は最大３０個の置換を有する配列を含む。更に別の実施形態では、ｍｉＲＮＡコード配列は、配列番号５（３６１３－６４ｍｅｒ）、又は最大３０個の置換を有する配列を含む。
【0007】
別の態様では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供される。ｒＡＡＶは、ベクターゲノムを中にパッケージングしたＡＡＶカプシドを含み、ベクターゲノムは、５’ＡＡＶ ＩＴＲ及び３’ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する、ヒトアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ標的部位に結合し、ヒトアンドロゲン受容体の発現を阻害する標的化配列を含む、少なくとも１つのヘアピン形成ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９、ＡＡＶｈｕ６８、ＡＡＶ１、及びＡＡＶｒｈ９１から選択される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｈｕ６８である。
【0008】
更に別の態様では、対象における核酸配列の発現を指示する調節配列と作動可能に連結された、ヒトアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ標的部位に結合する標的化配列を含む、少なくとも１つのヘアピン形成ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を含み、ｍｉＲＮＡが、ヒトアンドロゲン受容体の発現を阻害する、組成物が提供される。一実施形態では、組成物は、医薬組成物であり、薬学的に許容される水性懸濁液体、賦形剤、及び／又は希釈剤を含む。
【0009】
別の態様では、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）を有する対象を治療するための方法が提供される。本方法は、ヒトアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ標的部位に結合し、ヒトアンドロゲン受容体の発現を阻害する標的化配列を含む、少なくとも１つのヘアピン形成ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を含む、有効量の発現カセット、べクター、ｒＡＡＶ、又は組成物を、ＳＢＭＡを有する対象に送達することを含む。一実施形態では、標的部位は、配列番号１の配列、又は、配列番号１と比較して、１、２、３、４、若しくは５個の置換（若しくは切断）を有する配列を有する。
【0010】
別の態様では、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）を有する患者の治療のための発現カセット、ベクター、ｒＡＡＶ、又は組成物の使用が提供される。発現カセット、ベクター、ｒＡＡＶ、又は組成物は、ヒトアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ標的部位に結合し、ヒトアンドロゲン受容体の発現を阻害する標的化配列を含む、少なくとも１つのヘアピン形成ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、標的部位は、配列番号１の配列、又は、配列番号１と比較して、１、２、３、４、若しくは５個の置換（若しくは切断）を有する配列を有する。
【0011】
別の態様では、球脊髄性筋萎縮症を有するヒト患者を治療する方法が提供される。本方法は、アデノ随伴ウイルスｈｕ．６８（ＡＡＶｈｕ．６８）のＡＡＶカプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を中枢神経系（ＣＮＳ）に送達することを含み、当該ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムを更に含み、当該ベクターゲノムは、ＡＡＶ逆位末端反復と、ヒトアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ上の標的部位に結合する標的配列を含む、少なくとも１つのヘアピン形成ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列であって、ｍｉＲＮＡが、ヒトアンドロゲン受容体の発現を阻害する、核酸配列と、ｍｉＲＮＡの発現を指示する調節配列と、を含む。一実施形態では、ｍｉＲＮＡは
、ｍｉＲ３６１０である。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ３１６３である。一実施形態では、患者は、１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～３．３３×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量のｒＡＡＶを、髄腔内に投与される。別の実施形態では、患者は、ヒト成人であり、１．４４×１０１３～４．３３×１０１４ＧＣの用量のｒＡＡＶを投与される。別の実施形態では、ｍｉＲコード配列を含むｒＡＡＶは、脳室内送達を介して、又は実質内送達を介して、髄腔内に送達される。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、大槽（大槽内）へのコンピュータ断層撮影（ＣＴ）ガイドによる後頭下注入を介して、単回用量として投与される。
、ｍｉＲ３６１０である。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ３１６３である。一実施形態では、患者は、１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～３．３３×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量のｒＡＡＶを、髄腔内に投与される。別の実施形態では、患者は、ヒト成人であり、１．４４×１０１３～４．３３×１０１４ＧＣの用量のｒＡＡＶを投与される。別の実施形態では、ｍｉＲコード配列を含むｒＡＡＶは、脳室内送達を介して、又は実質内送達を介して、髄腔内に送達される。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、大槽（大槽内）へのコンピュータ断層撮影（ＣＴ）ガイドによる後頭下注入を介して、単回用量として投与される。
【0012】
本発明のこれらの及び他の態様は、以下の本発明の詳細な説明から明らかなる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1A】ＳＢＭＡの発病がＣＡＧの反復の数と相関することを示す４つのグラフである。
【図1B】ＳＢＭＡの発病がＣＡＧの反復の数と相関することを示す４つのグラフである。
【図1C】ＳＢＭＡの発病がＣＡＧの反復の数と相関することを示す４つのグラフである。
【図1D】ＳＢＭＡの発病がＣＡＧの反復の数と相関することを示す４つのグラフである。
【図2A】ＳＢＭＡ疾患の進行速度が、４７個未満のＣＡＧ又は４７個超のＣＡＧの反復を有する全ての患者について、類似していることを示す３つのグラフである。グラフは、各症状を示す患者の割合対年齢を示す。これらの群は、４７個未満の反復又は４７個超の反復を有する患者に分けられる。
【図2B】ＳＢＭＡ疾患の進行速度が、４７個未満のＣＡＧ又は４７個超のＣＡＧの反復を有する全ての患者について、類似していることを示す３つのグラフである。グラフは、各症状を示す患者の割合対年齢を示す。これらの群は、４７個未満の反復又は４７個超の反復を有する患者に分けられる。
【図2C】ＳＢＭＡ疾患の進行速度が、４７個未満のＣＡＧ又は４７個超のＣＡＧの反復を有する全ての患者について、類似していることを示す３つのグラフである。グラフは、各症状を示す患者の割合対年齢を示す。これらの群は、４７個未満の反復又は４７個超の反復を有する患者に分けられる。
【図3A】ＳＢＭＡ疾患の進行速度が、４７個未満のＣＡＧ又は４７個超のＣＡＧの反復を有する全ての患者について、類似していることを示す４つのグラフである。最初の症状（衰弱）から、階段を上るのに手すりが必要になるまでの時間、杖の使用、車いすの依存、及び死亡は、患者間で再現性が高い。４７個超のＣＡＧ反復を有する患者は、発病がより早いが、同一の進行を有する。
【図3B】ＳＢＭＡ疾患の進行速度が、４７個未満のＣＡＧ又は４７個超のＣＡＧの反復を有する全ての患者について、類似していることを示す４つのグラフである。最初の症状（衰弱）から、階段を上るのに手すりが必要になるまでの時間、杖の使用、車いすの依存、及び死亡は、患者間で再現性が高い。４７個超のＣＡＧ反復を有する患者は、発病がより早いが、同一の進行を有する。
【図3C】ＳＢＭＡ疾患の進行速度が、４７個未満のＣＡＧ又は４７個超のＣＡＧの反復を有する全ての患者について、類似していることを示す４つのグラフである。最初の症状（衰弱）から、階段を上るのに手すりが必要になるまでの時間、杖の使用、車いすの依存、及び死亡は、患者間で再現性が高い。４７個超のＣＡＧ反復を有する患者は、発病がより早いが、同一の進行を有する。
【図3D】ＳＢＭＡ疾患の進行速度が、４７個未満のＣＡＧ又は４７個超のＣＡＧの反復を有する全ての患者について、類似していることを示す４つのグラフである。最初の症状（衰弱）から、階段を上るのに手すりが必要になるまでの時間、杖の使用、車いすの依存、及び死亡は、患者間で再現性が高い。４７個超のＣＡＧ反復を有する患者は、発病がより早いが、同一の進行を有する。
【図4A】ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＲ標的化ｍｉＲＮＡのスクリーニング結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞をインビトロＢｌｏｃｋ－ｉＴプラスミドでトランスフェクトした。Ｂｌｏｃｋ－ＩＴプラスミドは、ＣＭＶプロモーター、ｅｍＧＦＰ、ｍｉＲＮＡのクローニング部位、及びＴＫポリＡを含む。ｍｉＲＮＡを、Ｂｌｏｃｋ－ｉＴオンラインソフトウェアを使用して設計した。図４Ａは、いくつかの個々のｍｉＲＮＡのノックダウン後のアンドロゲン受容体のｍＲＮＡレベルを示す。図４Ｂは、いくつかの個々のｍｉＲＮＡのノックダウン後のアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。ｍＲＮＡ及びタンパク質データの両方が、インビトロでアンドロゲン受容体をノックダウンする効果的なｍｉＲＮＡであるｍｉＲ３６１０を強調する。
【図4B】ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＲ標的化ｍｉＲＮＡのスクリーニング結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞をインビトロＢｌｏｃｋ－ｉＴプラスミドでトランスフェクトした。Ｂｌｏｃｋ－ＩＴプラスミドは、ＣＭＶプロモーター、ｅｍＧＦＰ、ｍｉＲＮＡのクローニング部位、及びＴＫポリＡを含む。ｍｉＲＮＡを、Ｂｌｏｃｋ－ｉＴオンラインソフトウェアを使用して設計した。図４Ａは、いくつかの個々のｍｉＲＮＡのノックダウン後のアンドロゲン受容体のｍＲＮＡレベルを示す。図４Ｂは、いくつかの個々のｍｉＲＮＡのノックダウン後のアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。ｍＲＮＡ及びタンパク質データの両方が、インビトロでアンドロゲン受容体をノックダウンする効果的なｍｉＲＮＡであるｍｉＲ３６１０を強調する。
【図5A】マウスにおける投与の評価を示す。図５Ａでは、新生児マウスに、ＩＣＶを介して、ＰＢＳ又は１ｅ１１ＧＣでｍｉＲ ＮｅｕＮのいずれかを注入した。脳を１４日目に採取し、ＮｅｕＮ抗体を用いたウエスタンブロット分析のために処理した。β－アクチンを負荷対照として使用した。図５Ｂは、各群におけるＮｅｕＮのパーセンテージとしてのタンパク質の定量を示す。図５Ｃでは、成体マウスに、ＩＶを介して、３ｅ１１ＧＣで、ＰＢＳ、ＡＡＶ．ＣＢ７．ｍｉＲ．ＮｅｕＮ、又はＡＡＶ．ＣＢ５７．ＧＦＰを注入した。脳を１４日目に採取し、ＮｅｕＮ抗体を用いたウエスタンブロット分析のために処理した。散布図は、各群におけるＮｅｕＮのパーセンテージとしてのタンパク質の定量を示す。
【図5B】マウスにおける投与の評価を示す。図５Ａでは、新生児マウスに、ＩＣＶを介して、ＰＢＳ又は１ｅ１１ＧＣでｍｉＲ ＮｅｕＮのいずれかを注入した。脳を１４日目に採取し、ＮｅｕＮ抗体を用いたウエスタンブロット分析のために処理した。β－アクチンを負荷対照として使用した。図５Ｂは、各群におけるＮｅｕＮのパーセンテージとしてのタンパク質の定量を示す。図５Ｃでは、成体マウスに、ＩＶを介して、３ｅ１１ＧＣで、ＰＢＳ、ＡＡＶ．ＣＢ７．ｍｉＲ．ＮｅｕＮ、又はＡＡＶ．ＣＢ５７．ＧＦＰを注入した。脳を１４日目に採取し、ＮｅｕＮ抗体を用いたウエスタンブロット分析のために処理した。散布図は、各群におけるＮｅｕＮのパーセンテージとしてのタンパク質の定量を示す。
【図5C】マウスにおける投与の評価を示す。図５Ａでは、新生児マウスに、ＩＣＶを介して、ＰＢＳ又は１ｅ１１ＧＣでｍｉＲ ＮｅｕＮのいずれかを注入した。脳を１４日目に採取し、ＮｅｕＮ抗体を用いたウエスタンブロット分析のために処理した。β－アクチンを負荷対照として使用した。図５Ｂは、各群におけるＮｅｕＮのパーセンテージとしてのタンパク質の定量を示す。図５Ｃでは、成体マウスに、ＩＶを介して、３ｅ１１ＧＣで、ＰＢＳ、ＡＡＶ．ＣＢ７．ｍｉＲ．ＮｅｕＮ、又はＡＡＶ．ＣＢ５７．ＧＦＰを注入した。脳を１４日目に採取し、ＮｅｕＮ抗体を用いたウエスタンブロット分析のために処理した。散布図は、各群におけるＮｅｕＮのパーセンテージとしてのタンパク質の定量を示す。
【図6A】ｍｉＲ３６１０を介したアンドロゲン受容体のノックダウン効率を示す。野生型マウスに、尾静脈を介して３ｅ１１ＧＣのＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ｍｉＲを注入した。脳及び脊髄を１４日目に採取し、ＲＮＡ及びタンパク質分析のために処理した。図６Ａ及び図６Ｂは、ＰＢＳ及びｍｉＲ３６１０で処置された脳におけるアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ発現レベルを示す。図６Ａ（対照に対する％）、図６Ｂ（倍率発現）。図６Ｃは、ＰＢＳ及びｍｉＲ３６１０で処置された脳におけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。
【図6B】ｍｉＲ３６１０を介したアンドロゲン受容体のノックダウン効率を示す。野生型マウスに、尾静脈を介して３ｅ１１ＧＣのＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ｍｉＲを注入した。脳及び脊髄を１４日目に採取し、ＲＮＡ及びタンパク質分析のために処理した。図６Ａ及び図６Ｂは、ＰＢＳ及びｍｉＲ３６１０で処置された脳におけるアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ発現レベルを示す。図６Ａ（対照に対する％）、図６Ｂ（倍率発現）。図６Ｃは、ＰＢＳ及びｍｉＲ３６１０で処置された脳におけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。
【図6C】ｍｉＲ３６１０を介したアンドロゲン受容体のノックダウン効率を示す。野生型マウスに、尾静脈を介して３ｅ１１ＧＣのＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ｍｉＲを注入した。脳及び脊髄を１４日目に採取し、ＲＮＡ及びタンパク質分析のために処理した。図６Ａ及び図６Ｂは、ＰＢＳ及びｍｉＲ３６１０で処置された脳におけるアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ発現レベルを示す。図６Ａ（対照に対する％）、図６Ｂ（倍率発現）。図６Ｃは、ＰＢＳ及びｍｉＲ３６１０で処置された脳におけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。
【図7A】脳及び脊髄におけるアンドロゲン受容体に対して標的化された２つのｍｉＲＮＡを比較する。成体雄野生型マウス（６～８週齢）は、３．０×１０１１ＧＣ）の用量で、ＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ又はＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ＡＲ．ｍｉＲ３６１３．ＷＰＲＥ．ｒＢＧの単回静脈内投与を受けた（Ｎ＝５／群）。追加の野生型マウスに、対照としてビヒクル（ＰＢＳ）を投与した（Ｎ＝５）。１４日目に、マウスを剖検した。脳の半球の１つを採取して、マウスＡＲ ｍＲＮＡ発現を評価した（ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ）。図７Ａは、ＰＢＳ、ｍｉＲ３６１０、又はｍｉＲ３６１３で処置された脳におけるアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ発現レベルを示す。各動物の発現の倍率変化を、比較Ｃｔ法に基づいて計算し、Ｇａｐｄｈに対して正規化した。エラーバーは、標準偏差を表す。図７Ｂは、ＰＢＳ、ｍｉＲ３６１０、又はｍｉＲ３６１３で処置された脊髄におけるアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ発現レベルを示す。図７Ｃ及び７Ｄは、ｍｉＲ ＮＴ及びｍｉＲ３６１０で処置された脳（Ｃ）又はｍｉＲ３６１３で処置された脳（Ｄ）におけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。図７Ｅは、４つの群全ての中のパーセンテージでのアンドロゲンタンパク質レベルの定量化を示す。
【図7B】脳及び脊髄におけるアンドロゲン受容体に対して標的化された２つのｍｉＲＮＡを比較する。成体雄野生型マウス（６～８週齢）は、３．０×１０１１ＧＣ）の用量で、ＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ又はＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ＡＲ．ｍｉＲ３６１３．ＷＰＲＥ．ｒＢＧの単回静脈内投与を受けた（Ｎ＝５／群）。追加の野生型マウスに、対照としてビヒクル（ＰＢＳ）を投与した（Ｎ＝５）。１４日目に、マウスを剖検した。脳の半球の１つを採取して、マウスＡＲ ｍＲＮＡ発現を評価した（ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ）。図７Ａは、ＰＢＳ、ｍｉＲ３６１０、又はｍｉＲ３６１３で処置された脳におけるアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ発現レベルを示す。各動物の発現の倍率変化を、比較Ｃｔ法に基づいて計算し、Ｇａｐｄｈに対して正規化した。エラーバーは、標準偏差を表す。図７Ｂは、ＰＢＳ、ｍｉＲ３６１０、又はｍｉＲ３６１３で処置された脊髄におけるアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ発現レベルを示す。図７Ｃ及び７Ｄは、ｍｉＲ ＮＴ及びｍｉＲ３６１０で処置された脳（Ｃ）又はｍｉＲ３６１３で処置された脳（Ｄ）におけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。図７Ｅは、４つの群全ての中のパーセンテージでのアンドロゲンタンパク質レベルの定量化を示す。
【図7C】脳及び脊髄におけるアンドロゲン受容体に対して標的化された２つのｍｉＲＮＡを比較する。成体雄野生型マウス（６～８週齢）は、３．０×１０１１ＧＣ）の用量で、ＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ又はＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ＡＲ．ｍｉＲ３６１３．ＷＰＲＥ．ｒＢＧの単回静脈内投与を受けた（Ｎ＝５／群）。追加の野生型マウスに、対照としてビヒクル（ＰＢＳ）を投与した（Ｎ＝５）。１４日目に、マウスを剖検した。脳の半球の１つを採取して、マウスＡＲ ｍＲＮＡ発現を評価した（ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ）。図７Ａは、ＰＢＳ、ｍｉＲ３６１０、又はｍｉＲ３６１３で処置された脳におけるアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ発現レベルを示す。各動物の発現の倍率変化を、比較Ｃｔ法に基づいて計算し、Ｇａｐｄｈに対して正規化した。エラーバーは、標準偏差を表す。図７Ｂは、ＰＢＳ、ｍｉＲ３６１０、又はｍｉＲ３６１３で処置された脊髄におけるアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ発現レベルを示す。図７Ｃ及び７Ｄは、ｍｉＲ ＮＴ及びｍｉＲ３６１０で処置された脳（Ｃ）又はｍｉＲ３６１３で処置された脳（Ｄ）におけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。図７Ｅは、４つの群全ての中のパーセンテージでのアンドロゲンタンパク質レベルの定量化を示す。
【図7D】脳及び脊髄におけるアンドロゲン受容体に対して標的化された２つのｍｉＲＮＡを比較する。成体雄野生型マウス（６～８週齢）は、３．０×１０１１ＧＣ）の用量で、ＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ又はＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ＡＲ．ｍｉＲ３６１３．ＷＰＲＥ．ｒＢＧの単回静脈内投与を受けた（Ｎ＝５／群）。追加の野生型マウスに、対照としてビヒクル（ＰＢＳ）を投与した（Ｎ＝５）。１４日目に、マウスを剖検した。脳の半球の１つを採取して、マウスＡＲ ｍＲＮＡ発現を評価した（ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ）。図７Ａは、ＰＢＳ、ｍｉＲ３６１０、又はｍｉＲ３６１３で処置された脳におけるアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ発現レベルを示す。各動物の発現の倍率変化を、比較Ｃｔ法に基づいて計算し、Ｇａｐｄｈに対して正規化した。エラーバーは、標準偏差を表す。図７Ｂは、ＰＢＳ、ｍｉＲ３６１０、又はｍｉＲ３６１３で処置された脊髄におけるアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ発現レベルを示す。図７Ｃ及び７Ｄは、ｍｉＲ ＮＴ及びｍｉＲ３６１０で処置された脳（Ｃ）又はｍｉＲ３６１３で処置された脳（Ｄ）におけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。図７Ｅは、４つの群全ての中のパーセンテージでのアンドロゲンタンパク質レベルの定量化を示す。
【図7E】脳及び脊髄におけるアンドロゲン受容体に対して標的化された２つのｍｉＲＮＡを比較する。成体雄野生型マウス（６～８週齢）は、３．０×１０１１ＧＣ）の用量で、ＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ又はＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ＡＲ．ｍｉＲ３６１３．ＷＰＲＥ．ｒＢＧの単回静脈内投与を受けた（Ｎ＝５／群）。追加の野生型マウスに、対照としてビヒクル（ＰＢＳ）を投与した（Ｎ＝５）。１４日目に、マウスを剖検した。脳の半球の１つを採取して、マウスＡＲ ｍＲＮＡ発現を評価した（ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ）。図７Ａは、ＰＢＳ、ｍｉＲ３６１０、又はｍｉＲ３６１３で処置された脳におけるアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ発現レベルを示す。各動物の発現の倍率変化を、比較Ｃｔ法に基づいて計算し、Ｇａｐｄｈに対して正規化した。エラーバーは、標準偏差を表す。図７Ｂは、ＰＢＳ、ｍｉＲ３６１０、又はｍｉＲ３６１３で処置された脊髄におけるアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ発現レベルを示す。図７Ｃ及び７Ｄは、ｍｉＲ ＮＴ及びｍｉＲ３６１０で処置された脳（Ｃ）又はｍｉＲ３６１３で処置された脳（Ｄ）におけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。図７Ｅは、４つの群全ての中のパーセンテージでのアンドロゲンタンパク質レベルの定量化を示す。
【図8】ＣＢ７及びＳｙｎのプロモーター効率を評価する。野生型マウスに、３ｅ１１ＧＣの以下のベクターを注入した：ＡＡＶ９－ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ｍｉＲ．ＮＴ．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ、ＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ、ＡＡＶ９－ＰＨＰ．ｅＢ．Ｓｙｎ．ＰＩ．ｍｉＲ．ＮＴ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ、又はＡＡＶ９－ＰＨＰ．ｅＢ．ｈＳｙｎ．ＰＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ。脊髄を１４日目に採取し、ＲＮＡ単離及びｑＰＣＲのために処理した。グラフは、それらの対照に対して、２つのプロモーターにおけるアンドロゲン受容体のノックダウン効率を示す。
【図9A】ＡＲ９７Ｑ ＳＢＭＡトランスジェニックマウスコロニーにおけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベル及び生存を示す。図９Ａでは、脊髄をトランスジェニックマウスから採取し、ウエスタンブロッティングのために処理した。ブロットは、ＡＲ９７Ｑ ＷＴ及びＨＥＴ雄及び雌のマウスにおけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。図９Ｂは、雄及び雌のＡＲ９７Ｑトランスジェニックマウスの生存プロットを示す。
【図9B】ＡＲ９７Ｑ ＳＢＭＡトランスジェニックマウスコロニーにおけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベル及び生存を示す。図９Ａでは、脊髄をトランスジェニックマウスから採取し、ウエスタンブロッティングのために処理した。ブロットは、ＡＲ９７Ｑ ＷＴ及びＨＥＴ雄及び雌のマウスにおけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。図９Ｂは、雄及び雌のＡＲ９７Ｑトランスジェニックマウスの生存プロットを示す。
【図10A】ＡＲ９７Ｑ ＳＢＭＡトランスジェニックマウスにおけるｍｉＲ３６１０の効果を示す。５～６週齢の雄トランスジェニックマウスに、尾静脈を介して、３ｅ１１ＧＣのＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧを注入したか、又はマウスを注入されていないままにした。マウスを生存について追跡した。脳を採取し、ウエスタンブロッティングのために処理した。図１０Ａは、両方の群におけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。年齢は、注入後に脳が採取されたときを示す。図１０Ｂは、注入されていない群に対する、処置されたマウスにおける両方の形態のアンドロゲン受容体のタンパク質定量を示す。図１０Ｃは、注入されていない及び処置されたマウスの生存プロットを示す。
【図10B】ＡＲ９７Ｑ ＳＢＭＡトランスジェニックマウスにおけるｍｉＲ３６１０の効果を示す。５～６週齢の雄トランスジェニックマウスに、尾静脈を介して、３ｅ１１ＧＣのＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧを注入したか、又はマウスを注入されていないままにした。マウスを生存について追跡した。脳を採取し、ウエスタンブロッティングのために処理した。図１０Ａは、両方の群におけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。年齢は、注入後に脳が採取されたときを示す。図１０Ｂは、注入されていない群に対する、処置されたマウスにおける両方の形態のアンドロゲン受容体のタンパク質定量を示す。図１０Ｃは、注入されていない及び処置されたマウスの生存プロットを示す。
【図10C】ＡＲ９７Ｑ ＳＢＭＡトランスジェニックマウスにおけるｍｉＲ３６１０の効果を示す。５～６週齢の雄トランスジェニックマウスに、尾静脈を介して、３ｅ１１ＧＣのＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧを注入したか、又はマウスを注入されていないままにした。マウスを生存について追跡した。脳を採取し、ウエスタンブロッティングのために処理した。図１０Ａは、両方の群におけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。年齢は、注入後に脳が採取されたときを示す。図１０Ｂは、注入されていない群に対する、処置されたマウスにおける両方の形態のアンドロゲン受容体のタンパク質定量を示す。図１０Ｃは、注入されていない及び処置されたマウスの生存プロットを示す。
【図11A】ＡＲ９７Ｑ ＳＢＭＡトランスジェニックマウスにおけるｍｉＲ３６１０の効果を示す。３週齢の雄トランスジェニックマウスに、後眼窩静脈（ＲＯＶ）を介して、３ｅ１１ＧＣのＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧを注入したか、又はマウスを注入されていないままにした。マウスを生存について追跡した。脳を採取し、ウエスタンブロッティングのために処理した。図１１Ａは、処置されたマウス及びＡＲ９７Ｑトランスジェニックマウスの生存プロットを示す。図１１Ｂは、両方の群におけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。年齢は、注入後に脳が採取されたときを示す。図１１Ｃは、注入されていない群に対する、処置されたマウスにおける両方の形態のアンドロゲン受容体のタンパク質定量を示す。
【図11B】ＡＲ９７Ｑ ＳＢＭＡトランスジェニックマウスにおけるｍｉＲ３６１０の効果を示す。３週齢の雄トランスジェニックマウスに、後眼窩静脈（ＲＯＶ）を介して、３ｅ１１ＧＣのＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧを注入したか、又はマウスを注入されていないままにした。マウスを生存について追跡した。脳を採取し、ウエスタンブロッティングのために処理した。図１１Ａは、処置されたマウス及びＡＲ９７Ｑトランスジェニックマウスの生存プロットを示す。図１１Ｂは、両方の群におけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。年齢は、注入後に脳が採取されたときを示す。図１１Ｃは、注入されていない群に対する、処置されたマウスにおける両方の形態のアンドロゲン受容体のタンパク質定量を示す。
【図11C】ＡＲ９７Ｑ ＳＢＭＡトランスジェニックマウスにおけるｍｉＲ３６１０の効果を示す。３週齢の雄トランスジェニックマウスに、後眼窩静脈（ＲＯＶ）を介して、３ｅ１１ＧＣのＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧを注入したか、又はマウスを注入されていないままにした。マウスを生存について追跡した。脳を採取し、ウエスタンブロッティングのために処理した。図１１Ａは、処置されたマウス及びＡＲ９７Ｑトランスジェニックマウスの生存プロットを示す。図１１Ｂは、両方の群におけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。年齢は、注入後に脳が採取されたときを示す。図１１Ｃは、注入されていない群に対する、処置されたマウスにおける両方の形態のアンドロゲン受容体のタンパク質定量を示す。
【図12A】ＡＲ９７Ｑ ＳＢＭＡ新生児トランスジェニックマウスにおけるｍｉＲ３６１０の効果を示す。性別及び遺伝子型が不明な新生児トランスジェニックマウスに、側頭静脈を介して、３ｅ１１ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ（群２）又はＰＢＳ（群１）を注入した。マウスを生存について追跡し、遺伝子型／性別を決定した。脳を採取し、ウエスタンブロッティングのために処理した。各群の雄マウスを、約３か月齢でワイヤーハング試験に供した。図１２Ａは、両方の群におけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。図１２Ｂ及び１２Ｃは、雄（Ｂ）及び雌（Ｃ）の両方の群の生存プロットを示す。図１２Ｄは、雄ＷＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるマウスＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｅは、雌ＨＥＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるヒト及びマウスのＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｆは、雌ＷＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるマウスＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｇ及び１２Ｈは、経時的な、雄（Ｇ）及び雌（Ｈ）についてのＰＢＳ又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧのいずれかを与えられたＨＥＴ及びＷＴマウスの体重を示す。図１２Ｉでは、各群の雄マウスを、約３か月齢でワイヤーハング試験に供した。マウスをケージ上部の上部に配置し、次いで、それを反転させてホームケージの上に配置した。マウスが落下するときまでの潜時を秒単位で記録した。
【図12B】ＡＲ９７Ｑ ＳＢＭＡ新生児トランスジェニックマウスにおけるｍｉＲ３６１０の効果を示す。性別及び遺伝子型が不明な新生児トランスジェニックマウスに、側頭静脈を介して、３ｅ１１ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ（群２）又はＰＢＳ（群１）を注入した。マウスを生存について追跡し、遺伝子型／性別を決定した。脳を採取し、ウエスタンブロッティングのために処理した。各群の雄マウスを、約３か月齢でワイヤーハング試験に供した。図１２Ａは、両方の群におけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。図１２Ｂ及び１２Ｃは、雄（Ｂ）及び雌（Ｃ）の両方の群の生存プロットを示す。図１２Ｄは、雄ＷＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるマウスＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｅは、雌ＨＥＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるヒト及びマウスのＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｆは、雌ＷＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるマウスＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｇ及び１２Ｈは、経時的な、雄（Ｇ）及び雌（Ｈ）についてのＰＢＳ又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧのいずれかを与えられたＨＥＴ及びＷＴマウスの体重を示す。図１２Ｉでは、各群の雄マウスを、約３か月齢でワイヤーハング試験に供した。マウスをケージ上部の上部に配置し、次いで、それを反転させてホームケージの上に配置した。マウスが落下するときまでの潜時を秒単位で記録した。
【図12C】ＡＲ９７Ｑ ＳＢＭＡ新生児トランスジェニックマウスにおけるｍｉＲ３６１０の効果を示す。性別及び遺伝子型が不明な新生児トランスジェニックマウスに、側頭静脈を介して、３ｅ１１ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ（群２）又はＰＢＳ（群１）を注入した。マウスを生存について追跡し、遺伝子型／性別を決定した。脳を採取し、ウエスタンブロッティングのために処理した。各群の雄マウスを、約３か月齢でワイヤーハング試験に供した。図１２Ａは、両方の群におけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。図１２Ｂ及び１２Ｃは、雄（Ｂ）及び雌（Ｃ）の両方の群の生存プロットを示す。図１２Ｄは、雄ＷＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるマウスＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｅは、雌ＨＥＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるヒト及びマウスのＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｆは、雌ＷＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるマウスＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｇ及び１２Ｈは、経時的な、雄（Ｇ）及び雌（Ｈ）についてのＰＢＳ又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧのいずれかを与えられたＨＥＴ及びＷＴマウスの体重を示す。図１２Ｉでは、各群の雄マウスを、約３か月齢でワイヤーハング試験に供した。マウスをケージ上部の上部に配置し、次いで、それを反転させてホームケージの上に配置した。マウスが落下するときまでの潜時を秒単位で記録した。
【図12D】ＡＲ９７Ｑ ＳＢＭＡ新生児トランスジェニックマウスにおけるｍｉＲ３６１０の効果を示す。性別及び遺伝子型が不明な新生児トランスジェニックマウスに、側頭静脈を介して、３ｅ１１ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ（群２）又はＰＢＳ（群１）を注入した。マウスを生存について追跡し、遺伝子型／性別を決定した。脳を採取し、ウエスタンブロッティングのために処理した。各群の雄マウスを、約３か月齢でワイヤーハング試験に供した。図１２Ａは、両方の群におけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。図１２Ｂ及び１２Ｃは、雄（Ｂ）及び雌（Ｃ）の両方の群の生存プロットを示す。図１２Ｄは、雄ＷＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるマウスＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｅは、雌ＨＥＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるヒト及びマウスのＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｆは、雌ＷＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるマウスＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｇ及び１２Ｈは、経時的な、雄（Ｇ）及び雌（Ｈ）についてのＰＢＳ又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧのいずれかを与えられたＨＥＴ及びＷＴマウスの体重を示す。図１２Ｉでは、各群の雄マウスを、約３か月齢でワイヤーハング試験に供した。マウスをケージ上部の上部に配置し、次いで、それを反転させてホームケージの上に配置した。マウスが落下するときまでの潜時を秒単位で記録した。
【図12E】ＡＲ９７Ｑ ＳＢＭＡ新生児トランスジェニックマウスにおけるｍｉＲ３６１０の効果を示す。性別及び遺伝子型が不明な新生児トランスジェニックマウスに、側頭静脈を介して、３ｅ１１ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ（群２）又はＰＢＳ（群１）を注入した。マウスを生存について追跡し、遺伝子型／性別を決定した。脳を採取し、ウエスタンブロッティングのために処理した。各群の雄マウスを、約３か月齢でワイヤーハング試験に供した。図１２Ａは、両方の群におけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。図１２Ｂ及び１２Ｃは、雄（Ｂ）及び雌（Ｃ）の両方の群の生存プロットを示す。図１２Ｄは、雄ＷＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるマウスＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｅは、雌ＨＥＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるヒト及びマウスのＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｆは、雌ＷＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるマウスＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｇ及び１２Ｈは、経時的な、雄（Ｇ）及び雌（Ｈ）についてのＰＢＳ又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧのいずれかを与えられたＨＥＴ及びＷＴマウスの体重を示す。図１２Ｉでは、各群の雄マウスを、約３か月齢でワイヤーハング試験に供した。マウスをケージ上部の上部に配置し、次いで、それを反転させてホームケージの上に配置した。マウスが落下するときまでの潜時を秒単位で記録した。
【図12F】ＡＲ９７Ｑ ＳＢＭＡ新生児トランスジェニックマウスにおけるｍｉＲ３６１０の効果を示す。性別及び遺伝子型が不明な新生児トランスジェニックマウスに、側頭静脈を介して、３ｅ１１ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ（群２）又はＰＢＳ（群１）を注入した。マウスを生存について追跡し、遺伝子型／性別を決定した。脳を採取し、ウエスタンブロッティングのために処理した。各群の雄マウスを、約３か月齢でワイヤーハング試験に供した。図１２Ａは、両方の群におけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。図１２Ｂ及び１２Ｃは、雄（Ｂ）及び雌（Ｃ）の両方の群の生存プロットを示す。図１２Ｄは、雄ＷＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるマウスＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｅは、雌ＨＥＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるヒト及びマウスのＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｆは、雌ＷＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるマウスＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｇ及び１２Ｈは、経時的な、雄（Ｇ）及び雌（Ｈ）についてのＰＢＳ又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧのいずれかを与えられたＨＥＴ及びＷＴマウスの体重を示す。図１２Ｉでは、各群の雄マウスを、約３か月齢でワイヤーハング試験に供した。マウスをケージ上部の上部に配置し、次いで、それを反転させてホームケージの上に配置した。マウスが落下するときまでの潜時を秒単位で記録した。
【図12G】ＡＲ９７Ｑ ＳＢＭＡ新生児トランスジェニックマウスにおけるｍｉＲ３６１０の効果を示す。性別及び遺伝子型が不明な新生児トランスジェニックマウスに、側頭静脈を介して、３ｅ１１ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ（群２）又はＰＢＳ（群１）を注入した。マウスを生存について追跡し、遺伝子型／性別を決定した。脳を採取し、ウエスタンブロッティングのために処理した。各群の雄マウスを、約３か月齢でワイヤーハング試験に供した。図１２Ａは、両方の群におけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。図１２Ｂ及び１２Ｃは、雄（Ｂ）及び雌（Ｃ）の両方の群の生存プロットを示す。図１２Ｄは、雄ＷＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるマウスＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｅは、雌ＨＥＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるヒト及びマウスのＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｆは、雌ＷＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるマウスＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｇ及び１２Ｈは、経時的な、雄（Ｇ）及び雌（Ｈ）についてのＰＢＳ又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧのいずれかを与えられたＨＥＴ及びＷＴマウスの体重を示す。図１２Ｉでは、各群の雄マウスを、約３か月齢でワイヤーハング試験に供した。マウスをケージ上部の上部に配置し、次いで、それを反転させてホームケージの上に配置した。マウスが落下するときまでの潜時を秒単位で記録した。
【図12H】ＡＲ９７Ｑ ＳＢＭＡ新生児トランスジェニックマウスにおけるｍｉＲ３６１０の効果を示す。性別及び遺伝子型が不明な新生児トランスジェニックマウスに、側頭静脈を介して、３ｅ１１ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ（群２）又はＰＢＳ（群１）を注入した。マウスを生存について追跡し、遺伝子型／性別を決定した。脳を採取し、ウエスタンブロッティングのために処理した。各群の雄マウスを、約３か月齢でワイヤーハング試験に供した。図１２Ａは、両方の群におけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。図１２Ｂ及び１２Ｃは、雄（Ｂ）及び雌（Ｃ）の両方の群の生存プロットを示す。図１２Ｄは、雄ＷＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるマウスＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｅは、雌ＨＥＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるヒト及びマウスのＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｆは、雌ＷＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるマウスＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｇ及び１２Ｈは、経時的な、雄（Ｇ）及び雌（Ｈ）についてのＰＢＳ又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧのいずれかを与えられたＨＥＴ及びＷＴマウスの体重を示す。図１２Ｉでは、各群の雄マウスを、約３か月齢でワイヤーハング試験に供した。マウスをケージ上部の上部に配置し、次いで、それを反転させてホームケージの上に配置した。マウスが落下するときまでの潜時を秒単位で記録した。
【図12I】ＡＲ９７Ｑ ＳＢＭＡ新生児トランスジェニックマウスにおけるｍｉＲ３６１０の効果を示す。性別及び遺伝子型が不明な新生児トランスジェニックマウスに、側頭静脈を介して、３ｅ１１ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ（群２）又はＰＢＳ（群１）を注入した。マウスを生存について追跡し、遺伝子型／性別を決定した。脳を採取し、ウエスタンブロッティングのために処理した。各群の雄マウスを、約３か月齢でワイヤーハング試験に供した。図１２Ａは、両方の群におけるアンドロゲン受容体のタンパク質レベルを示す。図１２Ｂ及び１２Ｃは、雄（Ｂ）及び雌（Ｃ）の両方の群の生存プロットを示す。図１２Ｄは、雄ＷＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるマウスＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｅは、雌ＨＥＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるヒト及びマウスのＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｆは、雌ＷＴ ＳＢＭＡマウスの脊髄におけるマウスＡＲ発現、ウエスタンブロット、及び定量プロットを示す。図１２Ｇ及び１２Ｈは、経時的な、雄（Ｇ）及び雌（Ｈ）についてのＰＢＳ又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧのいずれかを与えられたＨＥＴ及びＷＴマウスの体重を示す。図１２Ｉでは、各群の雄マウスを、約３か月齢でワイヤーハング試験に供した。マウスをケージ上部の上部に配置し、次いで、それを反転させてホームケージの上に配置した。マウスが落下するときまでの潜時を秒単位で記録した。
【図13A】非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるｍｉＲ３６１０の有効性を実証する。５歳の雄アカゲザルに、３ｅ１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧをＩＣＭ注入した。３５日目に動物を屠殺し、脊髄及び肝臓を採取した。脊髄を、レーザー捕捉微小解剖（ＬＣＭ）のために処理した。運動ニューロンを脊髄切片から切断し、ｑＰＣＲのために処理した。肝臓をまた、ｑＰＣＲのために処理した。脊髄（Ａ）及び肝臓（Ｂ）の両方が、ｍｉＲ３６１０での処置後のアンドロゲン受容体の有効なノックダウンを示す。図１３Ｃ アカゲザルＡＲタンパク質の発現は、対照動物に対する発現パーセントに基づいて、肝臓試料においても測定された（ウエスタンブロッティング）。発現は、β－アクチンに対して正規化された。エラーバーは、標準偏差を表す
【図13B】非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるｍｉＲ３６１０の有効性を実証する。５歳の雄アカゲザルに、３ｅ１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧをＩＣＭ注入した。３５日目に動物を屠殺し、脊髄及び肝臓を採取した。脊髄を、レーザー捕捉微小解剖（ＬＣＭ）のために処理した。運動ニューロンを脊髄切片から切断し、ｑＰＣＲのために処理した。肝臓をまた、ｑＰＣＲのために処理した。脊髄（Ａ）及び肝臓（Ｂ）の両方が、ｍｉＲ３６１０での処置後のアンドロゲン受容体の有効なノックダウンを示す。図１３Ｃ アカゲザルＡＲタンパク質の発現は、対照動物に対する発現パーセントに基づいて、肝臓試料においても測定された（ウエスタンブロッティング）。発現は、β－アクチンに対して正規化された。エラーバーは、標準偏差を表す
【図13C】非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるｍｉＲ３６１０の有効性を実証する。５歳の雄アカゲザルに、３ｅ１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧをＩＣＭ注入した。３５日目に動物を屠殺し、脊髄及び肝臓を採取した。脊髄を、レーザー捕捉微小解剖（ＬＣＭ）のために処理した。運動ニューロンを脊髄切片から切断し、ｑＰＣＲのために処理した。肝臓をまた、ｑＰＣＲのために処理した。脊髄（Ａ）及び肝臓（Ｂ）の両方が、ｍｉＲ３６１０での処置後のアンドロゲン受容体の有効なノックダウンを示す。図１３Ｃ アカゲザルＡＲタンパク質の発現は、対照動物に対する発現パーセントに基づいて、肝臓試料においても測定された（ウエスタンブロッティング）。発現は、β－アクチンに対して正規化された。エラーバーは、標準偏差を表す
【図14A】実施例９に記載される実験の結果を示す。図１４Ａは、ＰＢＳ及びｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ＡＲ．ｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ＲＢＧで処置されたＳＢＭＡ雄マウスの生存曲線を示す。図１４Ｂ、１４Ｃ、及び１４Ｄは、ＰＢＳで処置されたマウス及びベクターで処置されたマウスの落下までの潜時（秒）を示す。
【図14B】実施例９に記載される実験の結果を示す。図１４Ａは、ＰＢＳ及びｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ＡＲ．ｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ＲＢＧで処置されたＳＢＭＡ雄マウスの生存曲線を示す。図１４Ｂ、１４Ｃ、及び１４Ｄは、ＰＢＳで処置されたマウス及びベクターで処置されたマウスの落下までの潜時（秒）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
対象のヒトアンドロゲン受容体遺伝子又は転写物における部位を特異的に標的とする少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を対象に投与するための配列、ベクター、及び組成物が本明細書に提供される。新規ｍｉＲＮＡ配列及びそれを含む構築物が本明細書に提供される。これらは、ＳＢＭＡの治療のために、単独で、又は互いに及び／又は他の治療薬と組み合わせて使用され得る。
【0015】
本明細書で使用される場合、「アンドロゲン受容体」という用語は、ヒトにおけるタンパク質アンドロゲン受容体（ＡＲ）をコードするアンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子［配列番号６に再現される］（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０２７５－１）を指す。アンドロゲン受容体（ＡＲ）は、リガンド依存性核転写因子であり、ステロイドホルモン核受容体ファミリーのメンバーであり、広範囲の細胞及び組織で発現される。ＡＲタンパク質は、活性化クラスＩステロイド受容体と呼ばれる核受容体のクラスに属し、これはまた、グルココルチコイド受容体、プロゲステロン受容体、及びミネラルコルチコイド受容体を含む。これらの受容体は、標準的なアンドロゲン応答要素（ＡＲＥ）を認識する。ＡＲの主なドメインとしては、活性化機能－１（ＡＦ－１）及びＡＦ－２と称されるＮ末端及びＣ末端活性化ドメイン、リガンド結合ドメイン、並びにポリグルタミン鎖が挙げられる。この遺伝子は、代替的に、ジヒドロテストステロン受容体（ＤＨＴＲ）、核受容体サブファミリー３、グループＣ、メンバー４（ＮＲ３Ｃ４）とも称され得る。ＯＭＩＭ．ＯＲＧ／ｅｎｔｒｙ／３１３７００を参照されたい。
【0016】
ケネディ病としても知られているＸ連鎖性球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ、ＳＭＡＸ１）は、アンドロゲン受容体（ＡＲ、３１３７００．００１４）をコードする遺伝子のエクソン１におけるトリヌクレオチドＣＡＧ反復伸長によって引き起こされる。ＣＡＧ反復数は、ＳＢＭＡ患者において３８～６２の範囲であるが、健康な個体は、１０～３６のＣＡＧ反復を有する。ＳＢＭＡの発病は、ＣＡＧ反復の数と相関することが示されている（図１Ａ～図１Ｄ、Ｆｒａｔｔａ Ｐ，Ｎｉｒｍａｌａｎａｎｔｈａｎ Ｎ，Ｍａｓｓｅｔ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｉｎ ｓｐｉｎａｌ ｂｕｌｂａｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２０１４；８２（２３）：２０７７－２０８４．ｄｏｉ：１０．１２１２／ＷＮＬ．０００００００００００００５０７、これは参照により本明細書に組み込まれる）。しかしながら、進行速度は、全ての患者間で同様である（図２Ａ～図３Ｄ、Ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｓｐｉｎａｌ ａｎｄ ｂｕ
ｌｂａｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ（ＳＢＭＡ）：ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ２２３ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ；Ｂｒａｉｎ．２００６；１２９（６）：１４４６－１４５５、これは参照により本明細書に組み込まれる。）
ｌｂａｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ（ＳＢＭＡ）：ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ２２３ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ；Ｂｒａｉｎ．２００６；１２９（６）：１４４６－１４５５、これは参照により本明細書に組み込まれる。）
【0017】
内因性アンドロゲン受容体の発現を抑制する人工マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を発現するベクターが本明細書に記載される。ＳＢＭＡのトランスジェニックマウスモデルでは、これらのベクターは、脊髄における変異アンドロゲン受容体の発現を劇的に低減し、運動機能及び生存を改善することが示された。
【0018】
本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ」は、マイクロＲＮＡを指し、これは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を調節して、タンパク質の翻訳を阻害する小さな非コードＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、プレｍｉＲＮＡヘアピン構造（ステムループとも称される）に存在し、最終的に成熟ｍｉＲＮＡに処理される。本明細書で使用される「ｍｉＲＮＡ」及び「ｍｉＲ」という用語は、未処理又は成熟ｍｉＲＮＡ（又はそれをコードする配列）のいずれかを指すために使用され得る。一般に、ヘアピン形成ＲＮＡは、ループ配列によってアンチセンス鎖（例えば、ガイド鎖）と接続されたセンス鎖（例えば、パッセンジャー鎖）を含む二本鎖を有するステム部分をコードする単一の核酸を含む自己相補的な「ステムループ」構造を有する。パッセンジャー鎖及びガイド鎖は、相補性を共有する。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖及びガイド鎖は、１００％の相補性を共有する。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖及びガイド鎖は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の相補性を共有する。パッセンジャー鎖及びガイド鎖は、塩基対のミスマッチにより相補性を欠き得る。いくつかの実施形態では、ヘアピン形成ＲＮＡのパッセンジャー鎖及びガイド鎖は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０塩基対のミスマッチを有する。
【0019】
一般に、ステムの最初の２～８ヌクレオチド（ループに対して）は「シード」残基と称され、標的認識及び結合において重要な役割を果たす。ステムの最初の残基（ループに対して）は、「アンカー」残基と称される。いくつかの実施形態では、ヘアピン形成ＲＮＡは、アンカー残基でミスマッチを有する。本明細書で使用される場合、ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの破壊又はサイレンシングをもたらす、相補的塩基対形成によって標的ｍＲＮＡ（例えば、ヒトアンドロゲン受容体）と特異的に結合するヌクレオチドの領域である「シード配列」を含む。かかるサイレンシングは、内因性ｈＡＲの完全な消滅ではなく、下方制御をもたらし得る。本明細書で提供されるｍｉＲＮＡは、ヒトアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ上の標的部位に結合する標的化配列を含む。標的化配列は、シード配列を含む。
【0020】
本明細書で提供されるコードされたｍｉＲＮＡは、ＳＢＭＡを有する患者において内因性ヒトアンドロゲン受容体遺伝子を特異的に標的とするように設計されている。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡコード配列は、以下の表１のアンチセンス配列を含む。
【表1】
【0021】
本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ標的部位」、「標的配列」、又は「標的領域」は、ＤＮＡプラス鎖（５’から３’）（例えば、ｈＡＲの）上に位置する配列であり、ｍｉＲＮＡシード配列（又は標的化配列）を含むｍｉＲＮＡ配列と少なくとも部分的に相補的である。典型的には、ｍｉＲＮＡ標的配列は、少なくとも７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド、少なくとも８ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド、７ヌクレオチド～２８ヌクレオチド、８ヌクレオチド～１８ヌクレオチド、約１２～約２８ヌクレオチド、約２０～約２６ヌクレオチド、約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は２６ヌクレオチドであり、ｍｉＲＮＡシード配列に相補的である少なくとも１つの連続領域（例えば、７又は８ヌクレオチド）を含有する。ある特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と正確な相補性（１００％）を有する配列、又はｍｉＲＮＡシード配列といくつかのミスマッチを含む部分的な相補性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と１００％相補的である少なくとも７～８個のヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と１００％相補的である配列からなる。ある特定の実施形態では、標的配列は、シード配列と１００％相補的である配列を複数コピー（例えば、２又は３コピー）含む。ある特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。ある特定の実施形態では、標的配列の残部は、ｍｉＲＮＡに対して少なくとも約８０％～約９９％の相補性を有する。ある特定の実施形態では、ＤＮＡプラス鎖を含む発現カセットでは、ｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲＮＡの逆相補である。
【0022】
ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、以下のＡＲ標的部位に結合する標的化配列を含む：ＧＡＡ ＣＴＡ ＣＡＴ ＣＡＡ ＧＧＡ ＡＣＴ ＣＧＡ（配列番号１）、又はそれから１、２、３、４、若しくは５個の置換（若しくは切断）を有する配列。いくつかの実施形態では、標的化配列は、配列番号２である。他の実施形態では、標的化配列は、配列番号３である。ある特定の実施形態では、シード配列は、成熟ｍｉＲＮＡに位置し（５’から３’へ）、概して、ｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡセンス鎖の５’末端から（センス（＋）鎖の５’末端から）２～７、２～８、又は約６ヌクレオチドの位置から始まるが、それはより長い長さであり得る。ある特定の実施形態では、シード配列の長さは、成熟ｍｉＲＮＡ配列の長さの約３０％以上であり、少なくとも７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド、少なくとも８ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド、７ヌクレオチド～２８ヌクレオチド、８ヌクレオチド～１８ヌクレオチド、１２ヌクレオチド～２８ヌクレオチド、約２０～約２６ヌクレオチド、約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６ヌクレオチドであり得る。本明細書に提供される例では、ｍｉＲＮＡは、例えば、約５０～約８０ヌクレオチド長、又は約５５ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド、又は６０～６５ヌクレオチド長のステムループｍｉＲＮＡ前駆体配列の形態で送達される。いくつかの実施形態では、ステムループｍｉＲＮＡ前駆体配列は、６４ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、このｍｉＲＮＡ前駆体は、約５ヌクレオチド、約２１ヌクレオチドの標的化配列（シード配列を含有する）、約２１ヌクレオチドのステムループ、及び約２０
ヌクレオチドのセンス配列を含み、センス配列は、１、２、又は３ヌクレオチドがミスマッチであるアンチセンス配列に対応する。他の実施形態では、このｍｉＲＮＡ前駆体は、約５ヌクレオチド、約２１ヌクレオチドの標的化配列、約２１ヌクレオチドのステムループ、及び約１８ヌクレオチドのセンス配列を含み、センス配列は、１、２、又は３ヌクレオチドがミスマッチであるアンチセンス配列に対応する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ヒトアンドロゲン受容体上の配列番号１若しくは配列番号２７のｍｉＲＮＡ標的部位、又はそれから１、２、３、４、若しくは５個の置換（切断を含む）を有する配列を標的とする。
ヌクレオチドのセンス配列を含み、センス配列は、１、２、又は３ヌクレオチドがミスマッチであるアンチセンス配列に対応する。他の実施形態では、このｍｉＲＮＡ前駆体は、約５ヌクレオチド、約２１ヌクレオチドの標的化配列、約２１ヌクレオチドのステムループ、及び約１８ヌクレオチドのセンス配列を含み、センス配列は、１、２、又は３ヌクレオチドがミスマッチであるアンチセンス配列に対応する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ヒトアンドロゲン受容体上の配列番号１若しくは配列番号２７のｍｉＲＮＡ標的部位、又はそれから１、２、３、４、若しくは５個の置換（切断を含む）を有する配列を標的とする。
【0023】
一態様では、ヒトアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ標的部位に結合し、ヒトアンドロゲン受容体の発現を阻害する標的化配列を含む、少なくとも１つのヘアピン形成ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を含む、発現カセットが本明細書で提供される。コード配列は、対象における核酸配列の発現を指示する調節配列と作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的部位は、以下を含む：配列番号１又は配列番号１と比較して、１、２、３、４、若しくは５個の置換（若しくは切断）を有する配列。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡコード配列は、ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＡＧ ＴＴＣ（配列番号２－３６１０標的化配列）の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的部位は、以下を含む：配列番号２７又は配列番号２７と比較して、１、２、３、４、若しくは５個の置換（若しくは切断）を有する配列。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡコード配列は、ＣＧＡ ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＡＧ（配列番号３－３６１３標的化配列）の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的化配列は、ヒトアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ上の標的部位との正確な相補性より少なく共有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡコード配列は、ａ）ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＡＧ ＴＴＣ（配列番号２－３６１０）、若しくは最大１０個の置換を有する配列、又はｂ）ＣＧＡ ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＡＧ（配列番号３－３６１３）、若しくは最大１０個の置換を有する配列の配列を含む。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡコード配列は、配列番号４又は最大３０個の置換を有する配列を含む。更に別の実施形態では、ｍｉＲＮＡコード配列は、配列番号５又は最大３０個の置換を有する配列を含む。
【0024】
好適なｍｉＲＮＡコード配列の例は、配列番号４の配列であり、これは、プレｍｉＲＮＡヘアピンのコード配列を提供し、成熟ｍｉＲ、ｍｉＲ３６１０を含む。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡコード配列は、配列番号４、配列番号４の少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含むｍｉＲＮＡコード配列、又は配列番号４の約ヌクレオチド６～約ヌクレオチド２６と１００％の同一性を有する配列を含む、配列番号４と少なくとも９０％の同一性を含むｍｉＲＮＡコード配列を含む。更に別の実施形態では、配列番号４の６位～２６位が保持され、代替配列が、ステムループ骨格について選択される。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列は、５’及び／又は３’隣接配列を含む。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列は、配列番号１１、又は配列番号１１の少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含むｍｉＲＮＡ配列、又は配列番号１１と少なくとも９０％の同一性を含むｍｉＲＮＡ配列を含む。
【0025】
好適なｍｉＲＮＡコード配列の別の例は、配列番号５の配列であり、これは、プレｍｉＲＮＡヘアピンをコードする配列を提供し、成熟ｍｉＲ、ｍｉＲ３６１３を含む。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡコード配列は、配列番号５、配列番号５の少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含むｍｉＲＮＡコード配列、又は配列番号５の約ヌクレオチド９～約ヌクレオチド２９と１００％の同一性を有する配列を含む、配列番号５と少なくとも９０％の同一性を含むｍｉＲＮＡコード配列を含む。更に別の実施形態では、配列番号５の９位～２９位が保持され、代替配列が、ステムループ骨格について選択される。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列は、５’及び／又は３’隣接配列を含む。ある特定の実
施形態では、ｍｉＲＮＡ配列は、配列番号１２、又は配列番号１２の少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含むｍｉＲＮＡ配列、又は配列番号１２と少なくとも９０％の同一性を含むｍｉＲＮＡ配列を含む。
施形態では、ｍｉＲＮＡ配列は、配列番号１２、又は配列番号１２の少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含むｍｉＲＮＡ配列、又は配列番号１２と少なくとも９０％の同一性を含むｍｉＲＮＡ配列を含む。
【0026】
ある特定の実施形態では、配列番号２６、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．９％の同一性を共有する配列を含む発現カセットが提供される。
【0027】
ある特定の実施形態では、核酸分子（例えば、発現カセット又はベクターゲノム）は、１つ超のｍｉＲＮＡコード配列を含み得る。そのような核酸分子は、以下のうちの１、２個、又はそれ以上の配列を有するｍｉＲＮＡコード配列を含み得る：（ａ）配列番号４を含むｍｉＲＮＡコード配列、（ｂ）配列番号４の少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含むｍｉＲＮＡコード配列、（ｃ）配列番号４の約ヌクレオチド６～約ヌクレオチド２６と１００％の同一性を有する配列を含む、配列番号４と少なくとも５０％の同一性を含むｍｉＲＮＡコード配列、及び／又は（ｄ）ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＴＧ
ＴＡＧ ＴＴＣ、配列番号２を含むｍｉＲＮＡコード配列。別の実施形態では、核酸分子は、以下のうちの１、２個、又はそれ以上の配列を有するｍｉＲＮＡコード配列を含み得る。（ａ）配列番号５を含むｍｉＲＮＡコード配列、（ｂ）配列番号５の少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含むｍｉＲＮＡコード配列、（ｃ）配列番号５の約ヌクレオチド６～約ヌクレオチド２６と１００％の同一性を有する配列を含む、配列番号５と少なくとも５０％の同一性を含むｍｉＲＮＡコード配列、及び／又は（ｄ）ＣＧＡ ＴＣＧ
ＡＧＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＡＧ、配列番号３を含むｍｉＲＮＡコード配列。
ＴＡＧ ＴＴＣ、配列番号２を含むｍｉＲＮＡコード配列。別の実施形態では、核酸分子は、以下のうちの１、２個、又はそれ以上の配列を有するｍｉＲＮＡコード配列を含み得る。（ａ）配列番号５を含むｍｉＲＮＡコード配列、（ｂ）配列番号５の少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含むｍｉＲＮＡコード配列、（ｃ）配列番号５の約ヌクレオチド６～約ヌクレオチド２６と１００％の同一性を有する配列を含む、配列番号５と少なくとも５０％の同一性を含むｍｉＲＮＡコード配列、及び／又は（ｄ）ＣＧＡ ＴＣＧ
ＡＧＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＡＧ、配列番号３を含むｍｉＲＮＡコード配列。
【0028】
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ．ＡＲ－ｍｉＲ」又は「ｒＡＡＶ．ＡＲ．ｍｉＲ」という用語は、調節配列の制御下で、ヒトアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ標的部位に結合し、ヒトアンドロゲン受容体の発現を阻害する標的化配列を含む、少なくとも１つのヘアピン形成ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を含むベクターゲノムをその中に有するＡＡＶカプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルスを指すために使用される。いくつかの実施形態では、標的配列は、配列番号１に示されるものである。
【0029】
例えば、ＡＡＶ１カプシドを有する組換えＡＡＶを指すＡＡＶ１．ＡＲ．ｍｉＲ、ＡＡＶｈｕ６８カプシドを有する組換えＡＡＶを指すＡＡＶｈｕ６８．ＡＲ．ｍｉＲなどの特定のカプシドの種類が指定され得る。
【0030】
「組換えＡＡＶ」又は「ｒＡＡＶ」は、２つの要素、ＡＡＶカプシド、及びＡＡＶカプシド内にパッケージングされた少なくとも非ＡＡＶコード配列を含むベクターゲノムを含むＤＮＡｓｅ耐性ウイルス粒子である。特に明記しない限り、この用語は「ｒＡＡＶベクター」という句と互換的に使用され得る。ｒＡＡＶは、任意の機能的ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子又は機能的ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を欠き、子孫を生成することができないため、「複製欠損ウイルス」又は「複製欠損ウイルスベクター」である。ある特定の実施形態では、唯一のＡＡＶ配列は、ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）であり、ＩＴＲ間に位置する遺伝子及び調節配列がＡＡＶカプシド内にパッケージングされることを可能にするために、典型的にはベクターゲノムの５’及び３’最末端に位置する。５’及び３’ＩＴＲ配列は、それぞれ、配列番号７及び配列番号１４に示されている。一般に、ＡＡＶカプシドは、６０カプシド（ｃａｐ）タンパク質サブユニットであるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３で構成され、選択されるＡＡＶに応じて、およそ１：１：１０～１：１：２０の比で二十面体対称に配置される。様々なＡＡＶが、上記で特定されるＡＡＶウイルスベクターのカプシドの供給源として選択され得る。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｈｕ．６８カプシド又はそのバリアントである（例えば、ＷＯ２０１８／１６０５８２及び２０２０年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／０９３，２７５号を参照されたく、
それらは、参照により本明細書に組み込まれる）。配列番号１７を参照されたい。別の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅｂカプシド（配列番号２１）である。ある特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、ｒＡＡＶベクターの名称で「ＡＡＶ」という用語の後の数値又は数値及び文字の組み合わせによって指定される。特に明記しない限り、本明細書に記載のＡＡＶカプシド、ＩＴＲ、及び他の選択されるＡＡＶ成分は、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｈｕ３７、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶ８ｂｐ、ＡＡＶ７Ｍ８、及びＡＡＶＡｎｃ８０、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ－ＤＪ８、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶｈｕ６８として特定されているＡＡＶを含むがこれに限定されない任意のＡＡＶの中から容易に選択され得る。例えば、米国特許出願公開第２００７／００３６７６０－Ａ１号、米国特許出願公開第２００９／０１９７３３８－Ａ１号、ＥＰ１３１０５７１を参照されたい。また、ＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７及び他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号及び米国特許第７２８２１９９号（ＡＡＶ８）、ＷＯ２００５／０３３３２１及びＵＳ７，９０６，１１１（ＡＡＶ９）、並びにＷＯ２００６／１１０６８９、及びＷＯ２００３／０４２３９７（ｒｈ．１０）、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２０１８／１６０５８２、及び２０２０年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／０９３，２７５号（ＡＡＶｈｕ６８）も参照されたく、これらは参照により本明細書に組み込まれる。これら及び他のＡＡＶカプシドの脱アミド化プロファイルを記載する、ＷＯ２０１９／１６８９６１及びＷＯ２０１９／１６９００４も参照されたい。他の好適なＡＡＶには、ＡＡＶｒｈ９０［２０２０年４月２８日に出願された、ＰＣＴ／ＵＳ２０／３０２７３、］、ＡＡＶｒｈ９１［２０２０年４月２８日に出願された、ＰＣＴ／ＵＳ２０／３０２６６、及び２０２０年８月１４日に出願された、米国仮特許出願第６３／０６５，６１６号］、ＡＡＶｒｈ９２［２０２０年４月２８日に出願された、ＰＣＴ／ＵＳ２０／３０２８１］、ＡＡＶｒｈ９３［２０２０年４月２８日に出願された、ＰＣＴ／ＵＳ２０／３０２８１］、ＡＡＶｒｈ９１．９３［２０２０年４月２８日に出願された、ＰＣＴ／ＵＳ２０／３０２８１］が含まれ得るが、これらに限定されず、これらは参照により本明細書に組み込まれる。他の好適なＡＡＶには、２０１９年１０月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／９２４，１１２号、及び２０２０年５月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／０２５，７５３号に記載されるＡＡＶ３Ｂバリアントが含まれ、そこには、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０１、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０２、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０３、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０４、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０５、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０６、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０７、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０８、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１０、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１１、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１２、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１３、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１４、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１５、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１６、又はＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１７が記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。これらの文書はまた、ｒＡＡＶを生成するために選択され得る他のＡＡＶカプシドについても記載されており、参照により組み込まれる。ヒト又は非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離され、又は操作され、十分に特徴付けられたＡＡＶのうち、ヒトＡＡＶ２が、遺伝子導入ベクターとして開発された最初のＡＡＶであり、それは、異なる標的組織及び動物モデルにおいて、効率的な遺伝子導入実験に広く使用されている。
それらは、参照により本明細書に組み込まれる）。配列番号１７を参照されたい。別の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅｂカプシド（配列番号２１）である。ある特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、ｒＡＡＶベクターの名称で「ＡＡＶ」という用語の後の数値又は数値及び文字の組み合わせによって指定される。特に明記しない限り、本明細書に記載のＡＡＶカプシド、ＩＴＲ、及び他の選択されるＡＡＶ成分は、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｈｕ３７、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶ８ｂｐ、ＡＡＶ７Ｍ８、及びＡＡＶＡｎｃ８０、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ－ＤＪ８、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶｈｕ６８として特定されているＡＡＶを含むがこれに限定されない任意のＡＡＶの中から容易に選択され得る。例えば、米国特許出願公開第２００７／００３６７６０－Ａ１号、米国特許出願公開第２００９／０１９７３３８－Ａ１号、ＥＰ１３１０５７１を参照されたい。また、ＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７及び他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号及び米国特許第７２８２１９９号（ＡＡＶ８）、ＷＯ２００５／０３３３２１及びＵＳ７，９０６，１１１（ＡＡＶ９）、並びにＷＯ２００６／１１０６８９、及びＷＯ２００３／０４２３９７（ｒｈ．１０）、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２０１８／１６０５８２、及び２０２０年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／０９３，２７５号（ＡＡＶｈｕ６８）も参照されたく、これらは参照により本明細書に組み込まれる。これら及び他のＡＡＶカプシドの脱アミド化プロファイルを記載する、ＷＯ２０１９／１６８９６１及びＷＯ２０１９／１６９００４も参照されたい。他の好適なＡＡＶには、ＡＡＶｒｈ９０［２０２０年４月２８日に出願された、ＰＣＴ／ＵＳ２０／３０２７３、］、ＡＡＶｒｈ９１［２０２０年４月２８日に出願された、ＰＣＴ／ＵＳ２０／３０２６６、及び２０２０年８月１４日に出願された、米国仮特許出願第６３／０６５，６１６号］、ＡＡＶｒｈ９２［２０２０年４月２８日に出願された、ＰＣＴ／ＵＳ２０／３０２８１］、ＡＡＶｒｈ９３［２０２０年４月２８日に出願された、ＰＣＴ／ＵＳ２０／３０２８１］、ＡＡＶｒｈ９１．９３［２０２０年４月２８日に出願された、ＰＣＴ／ＵＳ２０／３０２８１］が含まれ得るが、これらに限定されず、これらは参照により本明細書に組み込まれる。他の好適なＡＡＶには、２０１９年１０月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／９２４，１１２号、及び２０２０年５月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／０２５，７５３号に記載されるＡＡＶ３Ｂバリアントが含まれ、そこには、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０１、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０２、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０３、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０４、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０５、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０６、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０７、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０８、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１０、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１１、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１２、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１３、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１４、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１５、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１６、又はＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１７が記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。これらの文書はまた、ｒＡＡＶを生成するために選択され得る他のＡＡＶカプシドについても記載されており、参照により組み込まれる。ヒト又は非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離され、又は操作され、十分に特徴付けられたＡＡＶのうち、ヒトＡＡＶ２が、遺伝子導入ベクターとして開発された最初のＡＡＶであり、それは、異なる標的組織及び動物モデルにおいて、効率的な遺伝子導入実験に広く使用されている。
【0031】
本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ウイルス粒子を形成するｒＡＡＶカプシドの内側にパッケージングされる核酸配列を指す。かかる核酸配列は、ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。本明細書の例では、ベクターゲノムは、少なくとも５’から３’に、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、ｍｉＲＮＡコード配列、及びＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。ＡＡＶ２からのＩＴＲ、カプシドとは異なる供給源ＡＡＶ、又は完全長ＩＴＲ以外が選択され得る。特定の実施形態では、ＩＴＲは、産生中のｒｅｐ機能又はトランス相補ＡＡ
Ｖを提供するＡＡＶと同じＡＡＶ供給源由来である。更に、他のＩＴＲが使用され得る。更に、ベクターゲノムは、ｍｉＲＮＡの発現を指示する調節配列を含む。ベクターゲノムの好適な成分が本明細書でより詳細に考察される。
Ｖを提供するＡＡＶと同じＡＡＶ供給源由来である。更に、他のＩＴＲが使用され得る。更に、ベクターゲノムは、ｍｉＲＮＡの発現を指示する調節配列を含む。ベクターゲノムの好適な成分が本明細書でより詳細に考察される。
【0032】
ある特定の実施形態では、髄腔内注入に好適な水性液体と、例えば、神経細胞（錐体細胞、プルキンエ細胞、顆粒細胞、紡錘体細胞、及び介在ニューロン細胞など）及びグリア細胞（星状膠細胞、乏突起膠細胞、ミクログリア、及び上衣細胞など）を含む、中枢神経系及び／又は後根神経節（例えば、ＣＮＳ）における細胞を優先的に標的とするＡＡＶカプシドを有するベクター（例えば、ｒＡＡＶ）のストックと、を含む組成物が提供され、ベクターは、中枢神経系（ＣＮＳ）への送達のための、少なくとも１つのＡＲに特異的なｍｉＲＮＡを有する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のベクターを含む組成物は、大槽（大槽内）への後頭下注入用に製剤化される。ある特定の実施形態では、組成物は、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）ｒＡＡＶ注入を介して投与される。ある特定の実施形態では、患者に、単回用量の組成物を投与する。
【0033】
本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、カセットが、ベクター（例えば、ｒＡＡＶ、レンチウイルス、レトロウイルスなど）にパッケージングされ得る、ヒトＡＲを標的とするｍｉＲＮＡコード配列、プロモーターを含み、そのための他の調節配列を含み得る、核酸ポリマーを指す。
【0034】
ｒＡＡＶ
組換えパルボウイルスは、特に、ＳＢＭＡの治療のためのベクターとして好適である。本明細書に記載されるように、組換えパルボウイルスは、ＡＡＶカプシド（又はボカウイルスカプシド）を含み得る。ある特定の実施形態では、カプシドは、後根神経節内の細胞並びに／又は下位運動ニューロン及び／若しくは一次感覚ニューロン内の細胞を標的とする。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、内因性ｈＡＲレベルを下方制御するために、ｈＡＲを特異的に標的とするｍｉＲＮＡを含むｒＡＡＶを含む単一のｒＡＡＶストックを有し得る。
組換えパルボウイルスは、特に、ＳＢＭＡの治療のためのベクターとして好適である。本明細書に記載されるように、組換えパルボウイルスは、ＡＡＶカプシド（又はボカウイルスカプシド）を含み得る。ある特定の実施形態では、カプシドは、後根神経節内の細胞並びに／又は下位運動ニューロン及び／若しくは一次感覚ニューロン内の細胞を標的とする。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、内因性ｈＡＲレベルを下方制御するために、ｈＡＲを特異的に標的とするｍｉＲＮＡを含むｒＡＡＶを含む単一のｒＡＡＶストックを有し得る。
【0035】
例えば、クレードＦ由来のＡＡＶカプシド（例えば、ＡＡＶｈｕ６８又はＡＡＶ９）を使用して生成されたベクターを使用して、ＣＮＳにおいてｍｉＲを標的にして発現するベクターを生成することができる。代替的に、クレードＡ由来のＡＡＶカプシド（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶｒｈ９１）を使用して生成されたベクターが選択され得る。更に他の実施形態では、他のパルボウイルス又は他のＡＡＶウイルスが、ＡＡＶカプシドの好適な供給源であり得る。
【0036】
ＡＡＶ１カプシドは、ＡＡＶ ｖｐ１タンパク質、ＡＡＶ ｖｐ２タンパク質、及びＡＡＶ ｖｐ３タンパク質を有するカプシドを指す。特定の実施形態では、ＡＡＶ１カプシドは、約１：１：１０の所定の比率のＡＡＶ ｖｐ１タンパク質、ＡＡＶ ｖｐ２タンパク質、及びＡＡＶ ｖｐ３タンパク質で構成され、６０個の総ｖｐタンパク質のＴ１正二十面体カプシドに組み立てられる。ＡＡＶ１カプシドは、ゲノム配列をパッケージングして、ＡＡＶ粒子（例えば、ゲノムがベクターゲノムである組換えＡＡＶ）を形成することができる。典型的には、最も長いｖｐタンパク質（すなわち、ＶＰ１）をコードするカプシド核酸配列は、ＡＡＶ１カプシドを有するｒＡＡＶの産生中にトランスで発現される。例えば、米国特許第６，７５９，２３７号、米国特許第７，１０５，３４５号、米国特許第７，１８６，５５２号、米国特許第８，６３７，２５５号、及び米国特許第９，５６７，６０７号に記載されている（これらは、参照により本明細書に援用される）。例えば、ＷＯ２０１８／１６８９６１も参照されたく、これは参照により組み込まれる。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ１は、質量分析を使用して決定されたカプシド中のＶＰタンパク質の総量に基づいて、以下の表で定義されるように脱アミド化されたＶＰアイソフォーム
の異質集団のカプシド組成によって特徴付けられる。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、質量分析を使用して決定される、以下に提供される範囲で、以下の位置のうちの１つ以上で修飾される。好適な修飾には、脱アミド化標識された上記段落に記載の修飾が含まれ、本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、以下の位置、又はＮに続くグリシンのうちの１つ以上は、本明細書に記載されるように修飾される。ある特定の実施形態では、５７位、３８３位、５１２位、及び／又は７１８位のＮに続くグリシンが保存されている（すなわち、未修飾のままである）ＡＡＶ１変異が構築される。ある特定の実施形態では、前文で示した４つの位置のＮＧは、天然配列で保存される。ある特定の実施形態では、人工ＮＧは示される、上の表で特定される位置のうちの１つとは異なる位置に導入される。
の異質集団のカプシド組成によって特徴付けられる。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、質量分析を使用して決定される、以下に提供される範囲で、以下の位置のうちの１つ以上で修飾される。好適な修飾には、脱アミド化標識された上記段落に記載の修飾が含まれ、本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、以下の位置、又はＮに続くグリシンのうちの１つ以上は、本明細書に記載されるように修飾される。ある特定の実施形態では、５７位、３８３位、５１２位、及び／又は７１８位のＮに続くグリシンが保存されている（すなわち、未修飾のままである）ＡＡＶ１変異が構築される。ある特定の実施形態では、前文で示した４つの位置のＮＧは、天然配列で保存される。ある特定の実施形態では、人工ＮＧは示される、上の表で特定される位置のうちの１つとは異なる位置に導入される。
【0037】
本明細書で使用される場合、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ＷＯ２０１８／１６０５８２で定義されるカプシドを指す（参照により本明細書に援用される）。配列番号１７を参照されたい。ＡＡＶｈｕ６８の産生配列は、配列番号１６及び配列番号１８（カプシドのみのコード配列）に見出され得る。
【0038】
単一のｖｐ１核酸配列を使用する産生から得られたｒＡＡＶｈｕ６８は、ｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質、及びｖｐ３タンパク質の異質集団を産生する。これらの亜集団は、最低限、脱アミド化アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）残基を含む。例えば、アスパラギン－グリシン対におけるアスパラギンは、高度に脱アミド化される。ある特定の実施形態では、ｖｐ２及び／又はｖｐ３タンパク質は、追加的又は代替的に、例えば、選択された発現系においてｖｐタンパク質の比を変化させるために、ｖｐ１とは異なる核酸配列から発現され得る。
【0039】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、それぞれ、配列番号１７のアミノ酸１～７３６、アミノ酸１３８～７３６、及びアミノ酸２０３～７３６、並びに／又はそれらのバリアントであるＡＡＶｈｕ６８ ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質を含み、当該バリアントは、当該ＡＡＶｈｕ６８ ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質であるが、（ｉ）アセチル化リジン、リン酸化セリン及び／若しくはトレオニン、異性化アスパラギン酸、酸化トリプトファン及び／若しくはメチオニン、又はアミド化アミノ酸から選択される１つ以上の修飾、並びに／あるいは（ｉｉ）好適な方法（例えば、質量分析）を使用して決定される、Ｎ５７、Ｎ６６、Ｎ９４、Ｎ１１３、Ｎ２５２、Ｎ２５３、Ｑ２５９、Ｎ２７０、Ｎ３０３、Ｎ３０４、Ｎ３０５、Ｎ３１４、Ｎ３１９、Ｎ３２８、Ｎ３２９、Ｎ３３６、Ｎ４０９、Ｎ４５２、Ｎ４７７、Ｎ５１２、Ｎ５１５、Ｎ５９８、Ｑ５９９、Ｎ６２８、Ｎ６５１、Ｎ６６３、Ｎ７０９、Ｎ７３５、又はそれらの組み合わせの脱アミノ化を有する。
【0040】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８キャプシドは、配列番号１７の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号１８から産生されるｖｐ１タンパク質、又は配列番号１７の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする、配列番号１８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質から選択されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質の異質集団と、配列番号１７の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ２タンパク質、配列番号１８の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、又は配列番号１７の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする、配列番号１８の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の核酸配列か
ら産生されるｖｐ２タンパク質から選択されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質の異質集団と、配列番号１７の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ３タンパク質、配列番号１８の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、又は配列番号１７の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする、配列番号１８の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質から選択されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質の異質集団と、を含む。
ら産生されるｖｐ２タンパク質から選択されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質の異質集団と、配列番号１７の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ３タンパク質、配列番号１８の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、又は配列番号１７の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする、配列番号１８の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質から選択されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質の異質集団と、を含む。
【0041】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、（ａ）配列番号１７の１～７３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるＡＡＶｈｕ６８ ＶＰ１、ＡＡＶｈｕ６８ ＶＰ２、及びＡＡＶｈｕ６８ ＶＰ３タンパク質、並びに／又は（ｂ）質量分析法を使用して決定される、配列番号１７の５７位、３２９位、４５２位、及び５１２位でのアスパラギンの少なくとも６０％の脱アミド化を更に含む、配列番号１７のアミノ酸１～７３６、アミノ酸１３８～７３６、及びアミノ酸２０３～７３６であるＡＡＶｈｕ６８ ＶＰ１、ＡＡＶｈｕ６８ ＶＰ２、及びＡＡＶｈｕ６８ ＶＰ３タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、脱アミド化は、質量分析法を使用して決定される、配列番号１７の５７位、３２９位、４５２位、及び５１２位で少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％である。ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、６７位にグルタミン酸及び１５７位にバリンを保持しながら、他の位置での脱アミド化を含む、他の翻訳後修飾を含み得る。
【0042】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、操作されたＡＡＶｈｕ６８コード配列を使用して産生される。例えば、２０２０年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／０９３，２７５号、及び２０２１年１０月１８日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２１／５５４３６号を参照されたく、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。カプシドは、細胞培養、接着細胞、又は細胞懸濁液を含む任意の好適な産生細胞系で産生され得る。
【0043】
ＡＡＶカプシド中にパッケージングされ宿主細胞に送達されるゲノム配列は、典型的には、最低でも導入遺伝子（ｍｉＲＮＡ）、及びその調節配列、及びＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）から構成される。一本鎖ＡＡＶ及び自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶの両方がｒＡＡＶに含まれる。導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）、又は他の遺伝子産物をコードするベクター配列とは異種の核酸コード配列である。核酸コード配列は、標的組織の細胞中で導入遺伝子の転写、翻訳、及び／又は発現を可能にする様式で調節要素に作動可能に連結される。
【0044】
ベクターのＡＡＶ配列は、典型的には、シス作用性５’及び３’逆位末端反復配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ”Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８（１９９０）を参照されたい）。ＩＴＲ配列は、約１３０又は１４５ｂｐ長である。好ましくは、実質的にＩＴＲをコードする全体配列が分子内で使用されるが、これらの配列のある程度の軽微な修飾が許容される。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は、当技術分野の範囲内である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；ａｎｄ Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）を参照されたい）。本発明で利用されるかかる分子の一例は、選択された導入遺伝子配列及び関連する調節要素が５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する導入遺伝
子を含む「シス作用性」プラスミドである。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給するものとは異なるＡＡＶ由来である。一実施形態では、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列である。ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮型が報告されており、Ｄ配列及び末端分離部位（ｔｒｓ）が欠失されている。他の実施形態では、全長ＡＡＶ５’及び３’ＩＴＲが使用される。しかしながら、他のＡＡＶ起源からのＩＴＲが選択されてもよい。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２由来であり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ供給源由来である場合、得られるベクターは、擬似型と称され得る。しかしながら、これらの要素の他の構成が好適であり得る。
子を含む「シス作用性」プラスミドである。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給するものとは異なるＡＡＶ由来である。一実施形態では、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列である。ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮型が報告されており、Ｄ配列及び末端分離部位（ｔｒｓ）が欠失されている。他の実施形態では、全長ＡＡＶ５’及び３’ＩＴＲが使用される。しかしながら、他のＡＡＶ起源からのＩＴＲが選択されてもよい。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２由来であり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ供給源由来である場合、得られるベクターは、擬似型と称され得る。しかしながら、これらの要素の他の構成が好適であり得る。
【0045】
ベクター（例えば、ｒＡＡＶ）について上記で特定された主要な要素に加えて、ベクターはまた、細胞内でのその転写、翻訳、及び／又は発現を可能にする様式で導入遺伝子と作動可能に連結される、必要な従来の調節要素を含む。本明細書で使用される場合、「発現」又は「遺伝子発現」という用語は、遺伝子からの情報が、機能的な遺伝子産物の合成に使用されるプロセスを指す。遺伝子産物は、ｍｉＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、又は核酸ポリマー（ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＰＮＡなど）であり得る。
【0046】
本明細書で使用される場合、「調節配列」又は「発現制御配列」という用語は、イニシエーター配列、エンハンサー配列、及びプロモーター配列などの核酸配列を指し、それらが操作可能に連結されるタンパク質コード核酸配列の転写を誘導するか、抑制するか、さもなければ制御する。
【0047】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」配列は、目的の遺伝子と隣接する発現制御配列、及び目的の遺伝子を制御するためにトランスで又は離れて作用する発現制御配列の両方が含まれる。
【0048】
調節制御要素は、典型的には、発現制御配列の一部として、例えば、選択される５’ＩＴＲ配列とコード配列との間に位置するプロモーター配列を含む。ある特定の実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶエンハンサー要素を有するニワトリベータアクチンプロモーター、例えば、ＣＢ７プロモーター（配列番号２３）である。一実施形態では、ＣＢ８プロモーターは、配列番号２４の配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＢ７プロモーターは、ＣＭＶエンハンサー（配列番号８）、ニワトリベータアクチンプロモーター（配列番号９）、及びキメライントロン（配列番号１０）を含む。特定の実施形態では、中枢神経系の組織特異的なプロモーターが選択される。例えば、プロモーターは神経細胞プロモーター、例えば、ｇｆａＡＢＣ（１）Ｄプロモーター（Ａｄｄｇｅｎｅ番号５０４７３））、又はヒトＳｙｎプロモーター（配列はＡｄｄｇｅｎｅから入手可能、参照番号５０４６５、配列番号１５）であり得る。
【0049】
他の好適なプロモーターとしては、例えば、構成的プロモーター、制御可能なプロモーター［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい］、又は生理学的合図に応答するプロモーターが挙げられる。プロモーターは、異なる供給源、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０最初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリモマウイルスプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）又は神経膠原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）潜伏関連プロモーター（ＬＡＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ニューロン特異的プロモーター（ＮＳＥ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）プロモーター、ＣＢＡ、マトリックス金属タンパク質プロモーター（ＭＰＰ）、及びニワトリベータアクチンプロモーターから選択され得る。
【0050】
プロモーターに加えて、ベクターは、１つ以上の他の適切な転写開始、終結、エンハン
サー配列、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、例えばＷＰＲＥ、翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を増強する配列、及び必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強する配列を含み得る。好適なエンハンサーの例は、ＣＭＶエンハンサーである。他の好適なエンハンサーには、所望の標的組織適応症に適切なものが含まれる。一実施形態では、発現カセットは、１つ以上の発現エンハンサーを含む。一実施形態では、発現カセットは、２つ以上の発現エンハンサーを含む。これらのエンハンサーは同じであっても、互いに異なっていてもよい。例えば、エンハンサーは、ＣＭＶ前初期エンハンサーを含み得る。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピーに存在し得る。代替的には、エンハンサーの二重コピーは、１つ以上の配列によって分離され得る。更に別の実施形態では、発現カセットは、イントロン、例えば、ニワトリベータアクチンイントロンを更に含む。他の好適なイントロンとしては、当該技術分野で既知のものが含まれ、例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８に記載される。好適なポリＡ配列の例には、例えば、ウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２５）、ＳＶ４０、ＳＶ５０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン、及び合成ポリＡが含まれる。任意選択的に、１つ以上の配列を選択して、ｍＲＮＡを安定させてもよい。かかる配列の一例は、修飾ＷＰＲＥ配列であり、これは、ポリＡ配列の上流及びコード配列の下流で操作され得る［例えば、ＭＡ Ｚａｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９）１６：６０５－６１９を参照されたい。好適なＷＰＲＥの例は、配列番号１３に示される。
サー配列、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、例えばＷＰＲＥ、翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を増強する配列、及び必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強する配列を含み得る。好適なエンハンサーの例は、ＣＭＶエンハンサーである。他の好適なエンハンサーには、所望の標的組織適応症に適切なものが含まれる。一実施形態では、発現カセットは、１つ以上の発現エンハンサーを含む。一実施形態では、発現カセットは、２つ以上の発現エンハンサーを含む。これらのエンハンサーは同じであっても、互いに異なっていてもよい。例えば、エンハンサーは、ＣＭＶ前初期エンハンサーを含み得る。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピーに存在し得る。代替的には、エンハンサーの二重コピーは、１つ以上の配列によって分離され得る。更に別の実施形態では、発現カセットは、イントロン、例えば、ニワトリベータアクチンイントロンを更に含む。他の好適なイントロンとしては、当該技術分野で既知のものが含まれ、例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８に記載される。好適なポリＡ配列の例には、例えば、ウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２５）、ＳＶ４０、ＳＶ５０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン、及び合成ポリＡが含まれる。任意選択的に、１つ以上の配列を選択して、ｍＲＮＡを安定させてもよい。かかる配列の一例は、修飾ＷＰＲＥ配列であり、これは、ポリＡ配列の上流及びコード配列の下流で操作され得る［例えば、ＭＡ Ｚａｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９）１６：６０５－６１９を参照されたい。好適なＷＰＲＥの例は、配列番号１３に示される。
【0051】
一実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、プロモーター、任意選択のエンハンサー、任意選択のイントロン、ヒトアンドロゲン受容体を標的とするｍｉＲＮＡのコード配列、ポリＡ、及びＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、プロモーター、任意選択のエンハンサー、任意選択のイントロン、ヒトアンドロゲン受容体を標的とするｍｉＲＮＡのコード配列、任意選択のＷＰＲＥ、ポリＡ、及びＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、プロモーター、エンハンサー、イントロン、配列番号１のヒトアンドロゲン受容体配列を標的とするｍｉＲＮＡのコード配列、ＷＰＲＥ、ポリＡ、及びＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、ＣＢ７プロモーター／エンハンサー、ニワトリ－ベータイントロン、配列番号１のヒトアンドロゲン受容体配列を標的とするｍｉＲＮＡのコード配列、ＷＰＲＥ、ウサギベータグロビンポリＡ、及びＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、ＣＢ７プロモーター／エンハンサー、ニワトリ－ベータイントロン、配列番号２を含む配列番号１のヒトアンドロゲン受容体配列を標的とするｍｉＲＮＡのコード配列又はそれらから最大１０個の置換を有する配列、ＷＰＲＥ、ウサギベータグロビンポリＡ、及びＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、ＣＢ７プロモーター／エンハンサー、ニワトリ－ベータイントロン、配列番号３を含む配列番号２７のヒトアンドロゲン受容体配列を標的とするｍｉＲＮＡのコード配列又はそれらから最大１０個の置換を有する配列、ＷＰＲＥ、ウサギベータグロビンポリＡ、及びＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。ｍｉＲＮＡコード配列は、本明細書で定義される配列から選択される。ベクターゲノムの他の要素又はこれらの配列上のバリエーションは、本発明の特定の実施形態について、ベクターゲノムに対して選択され得る。
【0052】
ベクター産生
ＡＡＶウイルスベクター（例えば、組換え（ｒ）ＡＡＶ）の産生における使用のために、発現カセットは、パッケージング宿主細胞に送達される任意の好適なベクター、例えば、プラスミド上に担持され得る。本発明において有用なプラスミドは、とりわけ、原核細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞におけるインビトロでの複製及びパッケージングに適しているように操作され得る。好適なトランスフェクション技術及びパッケージング宿主細胞は、
既知であり、かつ／又は当業者によって容易に設計することができる。
ＡＡＶウイルスベクター（例えば、組換え（ｒ）ＡＡＶ）の産生における使用のために、発現カセットは、パッケージング宿主細胞に送達される任意の好適なベクター、例えば、プラスミド上に担持され得る。本発明において有用なプラスミドは、とりわけ、原核細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞におけるインビトロでの複製及びパッケージングに適しているように操作され得る。好適なトランスフェクション技術及びパッケージング宿主細胞は、
既知であり、かつ／又は当業者によって容易に設計することができる。
【0053】
ある特定の実施形態では、産生プラスミドは、ＳＢＭＡ患者におけるヒトアンドロゲン受容体に特異的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含み、患者におけるｍｉＲＮＡの発現を指示する調節配列に作動可能に連結される、カプシド中へのパッケージングのためのベクターゲノムを含む。
【0054】
ベクターとしての使用に好適なＡＡＶを生成及び単離するための方法は、当該技術分野において既知である。一般に、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ ＆ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，“Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５、Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，”Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３、及び以下に引用される参考文献を参照されたい（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）。導入遺伝子をビリオンにパッケージングするために、ＩＴＲは、発現カセットを含む核酸分子と同じ構築物中でシスに必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子は、トランスで供給され得る。
ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５、Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，”Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３、及び以下に引用される参考文献を参照されたい（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）。導入遺伝子をビリオンにパッケージングするために、ＩＴＲは、発現カセットを含む核酸分子と同じ構築物中でシスに必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子は、トランスで供給され得る。
【0055】
一実施形態では、本明細書に記載される発現カセットは、ウイルスベクターを産生するために、その上に担持されるｍｉＲＮＡ構築物配列をパッケージング宿主細胞に導入する遺伝子要素（例えば、シャトルプラスミド）に操作される。一実施形態では、選択される遺伝子要素は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によってＡＡＶパッケージング細胞に送達され得る。安定したＡＡＶパッケージング細胞も作製することができる。代替的には、発現カセットは、ＡＡＶ以外のウイルスベクターを生成するために、又はインビトロでの抗体の混合物の産生のために使用され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における技術者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術を含む。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｇｒｅｅｎ
ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。
ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。
【0056】
「ＡＡＶ中間体」又は「ＡＡＶベクター中間体」という用語は、それにパッケージングされた所望のゲノム配列を欠失している組み立てられたｒＡＡＶカプシドを指す。これらは、「空の」カプシドと称され得る。そのようなカプシドは、発現カセットの検出可能なゲノム配列を全く含まないか、又は遺伝子産物の発現を達成するには不十分な部分的にパッケージングされたゲノム配列のみを含み得る。これらの空のカプシドは、目的の遺伝子を宿主細胞に導入するために非機能的である。
【0057】
本明細書に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、既知の技法を使用して産生されてもよい。例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、ＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。かかる方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列、機能的ｒｅｐ遺伝子、最低限でもＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）及び導入遺伝子からなる発現カセット、並びに発現カセットをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングするのを許可する十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することを含む。カプシドを産生する方法、そのためのコード配列、及びｒＡＡＶウイルスベクターを産生するための方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅ
ｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）及びＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。
ｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）及びＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。
【0058】
一実施形態では、組換えＡＡＶを産生するために有用な産生細胞培養物が提供される。そのような細胞培養物は、宿主細胞中でＡＡＶカプシドタンパク質を発現する核酸、ＡＡＶカプシド中にパッケージングするのに好適な核酸分子、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲを含有するベクターゲノム、及び宿主細胞中の導入遺伝子の発現を指示する配列と作動可能に連結された導入遺伝子（例えば、ｍｉＲＮＡ）をコードする非ＡＡＶ核酸配列、並びに組換えＡＡＶカプシド中への核酸分子のパッケージングを可能にするのに十分なＡＡＶｒｅｐ機能及びアデノウイルスヘルパー機能を含む。一実施形態では、細胞培養物は、哺乳動物細胞（例えば、とりわけヒト胚性腎臓２９３細胞）又は昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス）で構成される。
【0059】
典型的には、ｒｅｐ機能は、ベクターゲノムに隣接するＩＴＲを提供するＡＡＶと同じＡＡＶソースに由来する。本明細書の実施例では、ＡＡＶ２ ＩＴＲを選択し、ＡＡＶ２
ｒｅｐを使用する。任意選択的に、他のｒｅｐ配列又は別のｒｅｐソース（及び任意選択的に別のＩＴＲソース）が選択されてもよい。例えば、ｒｅｐは、これらに限定されないが、ＡＡＶ１ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質、又はｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０、ｒｅｐ６８／７８、及びｒｅｐ４０／５２、若しくはそれらの断片であり得る。任意で、ｒｅｐ及びｃａｐ配列は、細胞培養物中の同じ遺伝子要素上にある。ｒｅｐ配列とｃａｐ遺伝子との間にスペーサーが存在し得る。これらのＡＡＶ又は変異ＡＡＶカプシド配列のいずれかは、宿主細胞中でそれらの発現を指示する外因性制御性調節配列の調節下にあり得る。
ｒｅｐを使用する。任意選択的に、他のｒｅｐ配列又は別のｒｅｐソース（及び任意選択的に別のＩＴＲソース）が選択されてもよい。例えば、ｒｅｐは、これらに限定されないが、ＡＡＶ１ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質、又はｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０、ｒｅｐ６８／７８、及びｒｅｐ４０／５２、若しくはそれらの断片であり得る。任意で、ｒｅｐ及びｃａｐ配列は、細胞培養物中の同じ遺伝子要素上にある。ｒｅｐ配列とｃａｐ遺伝子との間にスペーサーが存在し得る。これらのＡＡＶ又は変異ＡＡＶカプシド配列のいずれかは、宿主細胞中でそれらの発現を指示する外因性制御性調節配列の調節下にあり得る。
【0060】
一実施形態では、細胞は、好適な細胞培養物において製造される（例えば、ＨＥＫ２９３）。本明細書に記載の治療用ベクターを製造するための方法には、治療用ベクターの産生のために使用されるプラスミドＤＮＡの生成、ベクターの生成、及びベクターの精製などの、当該技術分野で周知の方法が含まれる。いくつかの実施形態では、治療用ベクターは、ＡＡＶベクターであり、生成されたプラスミドは、ＡＡＶゲノム及び目的の遺伝子をコードするＡＡＶシス－プラスミド（例えば、miRNA）、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶトランス－プラスミド、及びアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター生成プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクション、トランスフェクション後の無血清培地への培地交換、ベクターを含む細胞及び培養培地の回収などの方法ステップを含み得る。
【0061】
ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＡＲ－ｍｉＲの製造プロセスは、プラスミドＤＮＡでのＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションを伴う。単一バッチ又は複数バッチは、ＰＡＬＬ ｉＣＥＬＬｉｓバイオリアクターで、ＨＥＫ２９３細胞のＰＥＩ媒介性三重トランスフェクションによって産生される。回収したＡＡＶ材料は、可能な場合、使い捨ての閉鎖型バイオプロセッシングシステムにおいて、清澄化、ＴＦＦ、アフィニティクロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーによって順次精製される。
【0062】
回収したベクター含有細胞及び培養培地は、本明細書では粗細胞採取物と称される。更に別のシステムでは、治療用ベクターは、バキュロウイルスベースベクターでの感染によって昆虫細胞に導入される。これらの産生システムに関するレビューについては、概して、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照されたい（各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。これら及び他
のＡＡＶ生産システムの製造及び使用方法は、以下の米国特許にも記載され、それらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：５，１３９，９４１、５，７４１，６８３、６，０５７，１５２、６，２０４，０５９、６，２６８，２１３、６，４９１，９０７、６，６６０，５１４、６，９５１，７５３、７，０９４，６０４、７，１７２，８９３、７，２０１，８９８、７，２２９，８２３、及び７，４３９，０６５（これらは、参照により本明細書に援用される）。
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照されたい（各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。これら及び他
のＡＡＶ生産システムの製造及び使用方法は、以下の米国特許にも記載され、それらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：５，１３９，９４１、５，７４１，６８３、６，０５７，１５２、６，２０４，０５９、６，２６８，２１３、６，４９１，９０７、６，６６０，５１４、６，９５１，７５３、７，０９４，６０４、７，１７２，８９３、７，２０１，８９８、７，２２９，８２３、及び７，４３９，０６５（これらは、参照により本明細書に援用される）。
【0063】
粗細胞回収物は、その後、ベクター回収物の濃縮、ベクター回収物の透析濾過、ベクター回収物の顕微溶液化、ベクター回収物のヌクレアーゼ消化、顕微溶液化された中間体の濾過、クロマトグラフィーによる粗精製、超遠心分離による粗精製、接線流濾過による緩衝液交換、及び／又はバルクベクターを調製するための製剤化及び濾過などの、追加の方法ステップに供され得る。
【0064】
２ステップの高塩濃度でのアフィニティクロマトグラフィー精製、続いて、アニオン交換樹脂クロマトグラフィーを用いて、ベクター薬物製品を精製し、空のカプシドを除去する。これらの方法は、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７０号に更に詳細に記載されている（これは、参照により本明細書に援用される）。ＡＡＶ８の精製方法：２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７６号、及びｒｈ１０の精製方法：２０１６年１２月９日に出願され、「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶｒｈ１０」と題する国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６６０１３号（２０１５年１２月１１日にも出願されている）、並びにＡＡＶ１の精製方法：２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７４号、２０１５年１２月１１日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ１」は、全て参照により本明細書に援用される。
【0065】
空の及び完全粒子含有量を算出するために、選択された試料（例えば、本明細書の実施例では、イオジキサノール勾配－精製された調製物、ここで、ＧＣの数＝粒子の数）についてのＶＰ３バンド容量が、ロードされたＧＣ粒子に対してプロットされる。得られた線形方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を用いて、試験物ピークのバンド容量中の粒子の数を算出する。次いで、ロードされた２０μＬ当たりの粒子の数（ｐｔ）に５０を掛け、粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで除算することにより、ゲノムコピーに対する粒子の比（ｐｔ／ＧＣ）を得る。Ｐｔ／ｍＬ～ＧＣ／ｍＬは、空のｐｔ／ｍＬを与える。空ｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで割って、次いで１００を掛けることよって、空粒子のパーセンテージを得る。
【0066】
一般に、空のカプシド及びパッケージングされたゲノムを含むＡＡＶベクター粒子をアッセイするための方法は、当該分野において既知である。例えば、Ｇｒｉｍｍら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０；Ｓｏｍｍｅｒら、Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照されたい。変性したカプシドについて試験するために、方法は、例えば、緩衝液中３～８％のＴｒｉｓ－アセテートを含有する勾配ゲルなどの３つのカプシドタンパク質を分離可能な任意のゲルからなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に処理済みＡＡＶストックを供すること、次いで、試料材料が分離するまでゲルをランさせること、ナイロン又はニトロセルロースメンブレン、好ましくは、ナイロンにゲルをブロットすることを含む。抗－ＡＡＶカプシド抗体は、次いで、変性したカプシドタンパク質、好ましくは、抗－ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、Ｂ１抗－ＡＡＶ－２モノクローナル抗体に結合する主要な抗体として使用される（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体、より好ましくは、抗体に共有結合した検出分子を含有する抗－ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼ
に共有結合したヒツジ抗－マウスＩｇＧ抗体との結合を検出するための手段を含む、二次抗体が使用される。一次及び二次抗体との間の結合を半定量的に測定するために、結合を検出するための方法、好ましくは、放射性アイソトープ放射、電磁放射、又は発色変化を検出可能な検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットが使用される。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、カラムフラクションからの試料を取って、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥ充填緩衝液中で加熱することができ、カプシドタンパク質は、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）中で分解された。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を製造元の指示に従って用いて、銀染色を実施してもよく、又は他の適切な染色方法、すなわち、ＳＹＰＲＯルビー若しくはクーマシー染色を実施してもよい。一実施形態では、カラムフラクション中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）により測定されることができる。試料は希釈され、ＤＮａｓｅＩ（又は別の適切なヌクレアーゼ）で消化されて、外因性ＤＮＡが除去される。ヌクレアーゼの不活化後、試料は更に希釈され、プライマー及びプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用いて増幅される。規定レベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要とされるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム上で各試料について測定される。ＡＡＶベクター中に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを利用して、Ｑ－ＰＣＲ反応における標準曲線を作成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）値を用いて、プラスミド標準曲線のＣｔ値に対してそれを正規化することにより、ベクターゲノム力価を決定した。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用されることができる。
に共有結合したヒツジ抗－マウスＩｇＧ抗体との結合を検出するための手段を含む、二次抗体が使用される。一次及び二次抗体との間の結合を半定量的に測定するために、結合を検出するための方法、好ましくは、放射性アイソトープ放射、電磁放射、又は発色変化を検出可能な検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットが使用される。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、カラムフラクションからの試料を取って、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥ充填緩衝液中で加熱することができ、カプシドタンパク質は、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）中で分解された。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を製造元の指示に従って用いて、銀染色を実施してもよく、又は他の適切な染色方法、すなわち、ＳＹＰＲＯルビー若しくはクーマシー染色を実施してもよい。一実施形態では、カラムフラクション中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）により測定されることができる。試料は希釈され、ＤＮａｓｅＩ（又は別の適切なヌクレアーゼ）で消化されて、外因性ＤＮＡが除去される。ヌクレアーゼの不活化後、試料は更に希釈され、プライマー及びプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用いて増幅される。規定レベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要とされるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム上で各試料について測定される。ＡＡＶベクター中に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを利用して、Ｑ－ＰＣＲ反応における標準曲線を作成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）値を用いて、プラスミド標準曲線のＣｔ値に対してそれを正規化することにより、ベクターゲノム力価を決定した。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用されることができる。
【0067】
一態様では、広域スペクトル血清プロテアーゼ、例えば、プロテアーゼＫ（例えば、Ｑｉａｇｅｎから商業的に入手可能なもの）を利用する最適化されたｑ－ＰＣＲ方法が使用される。より具体的には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮａｓｅＩ消化の後に、試料をプロテアーゼＫ緩衝液で希釈し、プロテアーゼＫで処理し、続いて、熱失活させることを除き、標準的なアッセイと同様である。適切には、試料は、試料サイズと等しい量のプロテアーゼＫ緩衝液で希釈される。プロテアーゼＫ緩衝液は、２倍以上に濃縮され得る。典型的に、プロテアーゼＫ治療は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬで変動し得る。処理ステップは、一般に、約５５℃で約１５分間実施されるが、より低い温度（例えば、約３７℃～約５０℃）でより長時間（例えば、約２０分～約３０分）にわたって、又はより高い温度（例えば、最高約６０℃）でより短時間（例えば、約５～１０分）行われてもよい。同様に、熱不活性化は、一般に、約９５℃で約１５分間であるが、温度を下げてもよく（例えば、約７０～約９０℃）、時間を延ばしてもよい（例えば、約２０分～約３０分）。次いで、試料は希釈され（例えば、１０００倍）、標準的なアッセイで記載されるように、ＴａｑＭａｎ分析に供される。
【0068】
追加的に、又は代替的に、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が使用されてもよい。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖及び自己相補的なＡＡＶベクターゲノム力価を測定するための方法が記載されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。
【0069】
簡潔に言うと、パッケージングされたゲノム配列を有するｒＡＡＶ粒子をゲノム欠損ＡＡＶ中間体から分離するための方法は、組換えＡＡＶウイルス粒子及びＡＡＶカプシド中間体を含む懸濁液を高性能液体クロマトグラフィーに供することを含み、ＡＡＶウイルス粒子及びＡＡＶ中間体は、高ｐＨで平衡化された強力アニオン交換樹脂に結合され、約２６０及び約２８０で紫外吸光度のために溶出液をモニタリングしながら、塩勾配に供される。ｐＨは、選択されたＡＡＶに応じて調整され得る。例えば、ＷＯ２０１７／１６０３
６０（ＡＡＶ９）、ＷＯ２０１７／１００７０４（ＡＡＶｒｈ１０）、ＷＯ２０１７／１００６７６（例えば、ＡＡＶ８）、及びＷＯ２０１７／１００６７４（ＡＡＶ１）を参照されたい（これらは、参照により本明細書に援用される）。この方法では、ＡＡＶ完全カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比が感染ポイントに到達した場合に溶出するフラクションから回収される。一実施例では、アフィニティクロマトグラフィーステップのために、ダイアフィルトレーションされた産物を、ＡＡＶ２血清型を効率的に捕らえるＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９アフィニティ樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用してもよい。これらのイオン条件下、残留細胞ＤＮＡ及びタンパク質の有意なパーセンテージは、カラムの中を流れ、ＡＡＶ粒子は効率的に捕捉される。
６０（ＡＡＶ９）、ＷＯ２０１７／１００７０４（ＡＡＶｒｈ１０）、ＷＯ２０１７／１００６７６（例えば、ＡＡＶ８）、及びＷＯ２０１７／１００６７４（ＡＡＶ１）を参照されたい（これらは、参照により本明細書に援用される）。この方法では、ＡＡＶ完全カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比が感染ポイントに到達した場合に溶出するフラクションから回収される。一実施例では、アフィニティクロマトグラフィーステップのために、ダイアフィルトレーションされた産物を、ＡＡＶ２血清型を効率的に捕らえるＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９アフィニティ樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用してもよい。これらのイオン条件下、残留細胞ＤＮＡ及びタンパク質の有意なパーセンテージは、カラムの中を流れ、ＡＡＶ粒子は効率的に捕捉される。
【0070】
非ＡＡＶ及び非ウイルスベクター
本明細書で使用される「ベクター」は、核酸配列を含む生物学的又は化学的部分であり、当該核酸配列の複製又は発現のために適切な標的細胞に導入され得る。ベクターの例としては、組換えウイルス、プラスミド、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、デンドリマー、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）コンジュゲート、磁性粒子、又はナノ粒子が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ベクターは、外因性又は異種又は操作されたｍｉＲＮＡが挿入され得、次いで適切な標的細胞に導入され得る核酸分子である。かかるベクターは、好ましくは、１つ以上の複製起点と、組換えＤＮＡが挿入され得る１つ以上の部位とを有する。ベクターは、しばしば、ベクターを有する細胞を、有さない細胞から選択することができる手段を有しており、例えば、それらは薬剤耐性遺伝子をコードしている。一般的なベクターには、プラスミド、ウイルスゲノム、及び「人工染色体」が含まれる。ベクターの生成、産生、特徴付け、又は定量化の従来の方法は、当業者に利用可能である。
本明細書で使用される「ベクター」は、核酸配列を含む生物学的又は化学的部分であり、当該核酸配列の複製又は発現のために適切な標的細胞に導入され得る。ベクターの例としては、組換えウイルス、プラスミド、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、デンドリマー、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）コンジュゲート、磁性粒子、又はナノ粒子が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ベクターは、外因性又は異種又は操作されたｍｉＲＮＡが挿入され得、次いで適切な標的細胞に導入され得る核酸分子である。かかるベクターは、好ましくは、１つ以上の複製起点と、組換えＤＮＡが挿入され得る１つ以上の部位とを有する。ベクターは、しばしば、ベクターを有する細胞を、有さない細胞から選択することができる手段を有しており、例えば、それらは薬剤耐性遺伝子をコードしている。一般的なベクターには、プラスミド、ウイルスゲノム、及び「人工染色体」が含まれる。ベクターの生成、産生、特徴付け、又は定量化の従来の方法は、当業者に利用可能である。
【0071】
一実施形態では、ベクターは、それについて記載された発現カセットを含む非ウイルスプラスミド、例えば、「ネイキッドＤＮＡ」、「ネイキッドプラスミドＤＮＡ」、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉなどである。任意選択で、プラスミド又は他の核酸配列は、好適なデバイスを介して、例えば、エレクトロスプレー、エレクトロポレーションを介して送達される。他の実施形態では、核酸分子は、例えば、ミセル、リポソーム、カチオン性脂質－核酸組成物、ポリグリカン組成物、及び他のポリマー、脂質及び／又はコレステロール系－核酸コンジュゲート、並びに本明細書に記載されるような他の構築物を含む様々な組成物及びナノ粒子と結合される。例えば、ＷＯ２０１４／０８９４８６、ＵＳ２０１８／０３５３６１６Ａ１、ＵＳ２０１３／００３７９７７Ａ１、ＷＯ２０１５／０７４０８５Ａ１、ＵＳ９６７０１５２Ｂ２、及びＵＳ８，８５３，３７７Ｂ２、Ｘ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１，８（３），ｐｐ７７４－７８７；ウェブ公開：Ｍａｒｃｈ ２１，２０１１、ＷＯ２０１３／１８２６８３、ＷＯ２０１０／０５３５７２、及びＷＯ２０１２／１７０９３０を参照されたく、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。
【0072】
ある特定の実施形態では、非ウイルスベクターは、例えば、配列番号１又は配列番号２７で内因性ｈＡＲを標的とするｍｉＲＮＡ転写産物の送達に使用される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、用量当たり約０．５ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、７．０ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、９．０ｍｇ／ｋｇ、又は１０．０ｍｇ／ｋｇを超える）体重を超えるｍｉＲＮＡの量で送達される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、用量当たり約０．１～１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．１～９０ｍｇ／ｋｇ、０．１～８０ｍｇ／ｋｇ、０．１～７０ｍｇ／ｋｇ、０．１～６０ｍｇ／ｋｇ、０．１～５０ｍｇ／ｋｇ、０．１～４０ｍｇ／ｋｇ、０．１～３０ｍｇ／ｋｇ、０．１～２０ｍｇ／ｋｇ、０．１～１０ｍｇ／ｋｇ）体重
のｍｉＲＮＡの範囲の量で送達される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、用量当たり約１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、５５ｍｇ、６０ｍｇ、６５ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、８５ｍｇ、９０ｍｇ、９５ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、又は５００ｍｇを超える量で送達される。
のｍｉＲＮＡの範囲の量で送達される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、用量当たり約１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、５５ｍｇ、６０ｍｇ、６５ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、８５ｍｇ、９０ｍｇ、９５ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、又は５００ｍｇを超える量で送達される。
【0073】
ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ転写物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）にカプセル化される。本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」という語句は、１つ以上の脂質（例えば、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及びＰＥＧ修飾脂質）を含む移送ビヒクルを指す。好ましくは、脂質ナノ粒子は、１つ以上のｍｉＲＮＡを１つ以上の標的細胞（例えば、後根神経節、下位運動ニューロン及び／又は上位運動ニューロン、又はＣＮＳにおいて上記で特定された細胞型）に送達するように製剤化される。好適な脂質の例には、例えば、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、及びガングリオシド）が含まれる。また、単独で、又は他の移送ビヒクルと組み合わせての、移送ビヒクルとしてのポリマーの使用も企図される。好適なポリマーには、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド－ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、デンドリマー、及びポリエチレンイミンが含まれ得る。一実施形態では、移送ビヒクルは、標的細胞へのｍｉＲＮＡのトランスフェクションを促進するその能力に基づいて選択される。ｍｉＲＮＡに有用な脂質ナノ粒子は、タンパク質産生のためのデポーとして機能する標的細胞へのｍｉＲＮＡの送達をカプセル化及び／又は増強するための陽イオン性脂質を含む。本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」という語句は、生理的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正電荷を担持するいくつかの脂質種のうちのいずれかを指す。企図される脂質ナノ粒子は、１つ以上のカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及びＰＥＧ修飾脂質を用いる変動する比の多成分脂質混合物を含むことによって調製され得る。いくつかのカチオン性脂質が文献に記載されており、その多くは市販されている。例えば、ＷＯ２０１４／０８９４８６、ＵＳ２０１８／０３５３６１６Ａ１、及びＵＳ８，８５３，３７７Ｂ２を参照されたく、これらは参照により組み込まれる。ある特定の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、コレステロール、イオン化性脂質、ヘルパー脂質、ＰＥＧ脂質、及びカプセル化されたｍＲＮＡの周囲に脂質二重層を形成するポリマーを含む慣例的な手順を使用して実施される（Ｋｏｗａｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２７（４）：７１０－７２８）。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ヘルパー脂質ＤＯＰＥを有するカチオン性脂質（すなわち、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、又は１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ））を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、イオン化性脂質Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡイオン化性脂質、又はジケトピペラジン系イオン化性脂質（ｃＫＫ－Ｅ１２）を含む。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）又はポリ（β－アミノ）エステル（ＰＢＡＥ）を含む。例えば、ＷＯ２０１４／０８９４８６、ＵＳ２０１８／０３５３６１６Ａ１、ＵＳ２０１３／００３７９７７Ａ１、ＷＯ２０１５／０７４０８５Ａ１、ＵＳ９６７０１５２Ｂ２、及びＵＳ８，８５３，３７７Ｂ２を参照されたく、これらは参照により組み込まれる。
【0074】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターは、合成又は人工のウイルス粒子を指す「複製欠損ウイルス」又は「ウイルスベクター」であり、その中の発現カセットは、ｈＡＲを標的とする少なくとも１つのｍｉＲＮＡコードする核酸配列を含有する。複製欠損ウイルスは、後代ビリオンを生成することができないが、標的細胞に感染する能力を保持する。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコ
ードする遺伝子を含まない（ゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要とされるシグナルに隣接するＥ２をコードする核酸配列のみを含む「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作されることができる）が、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、それは、後代ビリオンによる複製及び感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。
ードする遺伝子を含まない（ゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要とされるシグナルに隣接するＥ２をコードする核酸配列のみを含む「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作されることができる）が、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、それは、後代ビリオンによる複製及び感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。
【0075】
本明細書で使用される場合、組換えウイルスベクターは、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ボカウイルス、ハイブリッドＡＡＶ／ボカウイルス、単純ヘルペスウイルス、又はレンチウイルスを含む、任意の好適な複製欠損ウイルスベクターであり得る。
【0076】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ）が産生されるパッケージング細胞株を指し得る。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞（例えば、ヒト、昆虫、又は酵母）であり得、任意の手段、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染、トランスフェクション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合によって細胞に導入される、外因性ＤＮＡ又は異種ＤＮＡを含有する。宿主細胞の例としては、単離された細胞、細胞培養、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、非哺乳類細胞、昆虫細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、中枢神経系細胞、ニューロン、グリア細胞、又は幹細胞が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【0077】
本明細書で使用される場合、「標的細胞」という用語は、ｍｉＲＮＡの発現が所望される任意の標的細胞を指す。ある特定の実施形態では、「標的細胞」という用語は、ＳＢＭＡの治療を受けている対象の細胞の言及が意図される。標的細胞の例には、中枢神経系内の細胞が含まれ得るが、これに限定されない。
【0078】
組成物
ヒトアンドロゲン受容体を標的とするｍｉＲＮＡをコードする配列を含む少なくとも１つのベクター（例えば、ｒＡＡＶ．ＡＲ－ｍｉＲストック）、及び／又はＡＲ－ｍｉＲを含む少なくとも１つのベクター、及び／又はＡＲ－ｍｉＲストックを含む少なくとも１つのベクター、並びに任意選択の担体、賦形剤、及び／又は保存剤を含む組成物が本明細書で提供される。ベクター（例えば、ｒＡＡＶ）ストックは、例えば、濃度及び用量単位の考察において以下に記載される量などで同じである複数のベクターを指す。
ヒトアンドロゲン受容体を標的とするｍｉＲＮＡをコードする配列を含む少なくとも１つのベクター（例えば、ｒＡＡＶ．ＡＲ－ｍｉＲストック）、及び／又はＡＲ－ｍｉＲを含む少なくとも１つのベクター、及び／又はＡＲ－ｍｉＲストックを含む少なくとも１つのベクター、並びに任意選択の担体、賦形剤、及び／又は保存剤を含む組成物が本明細書で提供される。ベクター（例えば、ｒＡＡＶ）ストックは、例えば、濃度及び用量単位の考察において以下に記載される量などで同じである複数のベクターを指す。
【0079】
ある特定の実施形態では、組成物は、単独で、又は他のベクターストック若しくは組成物と組み合わせて、ＳＢＭＡの治療における使用に好適な組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）であるウイルスストックを少なくとも含む。ある特定の実施形態では、組成物は、ＳＢＭＡの治療における使用に好適な組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）であるウイルスストックを含み、当該ｒＡＡＶは、（ａ）アデノ随伴ウイルスカプシドと、（ｂ）ＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムであって、当該ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復、ヒトアンドロゲン受容体に対して特異的に標的化された少なくとも１つのｍｉＲＮＡのコード配列、及びｍｉＲＮＡの発現を指示する調節配列を含む、ベクターゲノムと、を含む。ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、配列番号１のｈＡＲ配列を標的とするｍｉＲＮＡコード配列、ＷＰＲＥ、及びポリアデニル化シグナルを含む。ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ及びＡＡＶ２ ３’ＩＴＲを更に含み、これらは、ベクターゲノムの全てのエレメントに隣接する。ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ｍｉＲ３６１０をコードするｍｉＲＮＡコード配列、ＷＰＲＥ、及び
ポリアデニル化シグナルを含む。ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ｍｉＲ３６１３をコードするｍｉＲＮＡコード配列、ＷＰＲＥ、及びポリアデニル化シグナルを含む。
ポリアデニル化シグナルを含む。ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ｍｉＲ３６１３をコードするｍｉＲＮＡコード配列、ＷＰＲＥ、及びポリアデニル化シグナルを含む。
【0080】
ｒＡＡＶ．ＡＲ－ｍｉＲは、ヒトＳＢＭＡ患者に投与される生理学的に適合性のある担体に懸濁され得る。ある特定の実施形態では、ヒト患者への投与のために、ベクターは、食塩水、界面活性剤、及び生理学的に適合性のある塩、又は塩の混合物を含有する水性溶液中に好適に懸濁される。好適には、配合物は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば、ｐＨ６～９、若しくはｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、又はｐＨ７．２～７．８の範囲に調整される。脳脊髄液のｐＨは、約７．２８～約７．３２、又は髄腔内送達の場合、約７．２～約７．４であるので、この範囲内のｐＨが望ましいが、静脈内送達の場合、約６．８～約７．２のｐＨが望ましい場合がある。しかしながら、より広範囲にある他のｐＨ、及びこれらの下位範囲が、他の送達経路のために選択され得る。
【0081】
ある特定の実施形態では、製剤は、重炭酸ナトリウムを含まない緩衝生理食塩水溶液を含有し得る。かかる製剤は、ハーバード緩衝液などの緩衝生理食塩水溶液を含有してもよく、水中に、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、及びそれらの混合物のうちの１つ以上を含む。水溶液は、ポロキサマーであるＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８を更に含んでもよく、これは、ＢＡＳＦから市販され、以前、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８という商品名で販売されていた。水溶液は、７．２のｐＨ又は７．４のｐＨを有し得る。
【0082】
別の実施形態では、製剤は、１ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｎａ３ＰＯ４）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、３ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、１．４ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、０．８ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、及び０．００１％のＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）１８８が含まれる、緩衝生理食塩水溶液を含み得る。例えば、ｈａｒｖａｒｄａｐｐａｒａｔｕｓ．ｃｏｍ／ｈａｒｖａｒｄ－ａｐｐａｒａｔｕｓ－ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ－ｆｌｕｉｄ．ｈｔｍｌを参照されたい。ある特定の実施形態では、ハーバード緩衝液が好ましい。
【0083】
他の実施形態では、製剤は、１つ以上の透過促進剤を含んでもよい。好適な浸透促進剤の例は、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、又はＥＤＴＡを含み得る。
【0084】
別の実施形態では、組成物は、担体、希釈剤、賦形剤及び／又はアジュバントを含む。好適な担体は、導入ウイルスが対象とする適応症を考慮して、当業者により容易に選択され得る。例えば、１つの好適な担体は、生理食塩水を含み、様々な緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）とともに製剤化され得る。他の例示的な担体としては、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、及び水が含まれる。緩衝液／担体は、ｒＡＡＶが注入チューブに付着するのを防ぐが、インビボでｒＡＡＶ結合活性を妨げない成分を含むべきである。
【0085】
任意に、組成物は、ベクター（例えば、ｒＡＡＶ）及び担体に加えて、防腐剤又は化学安定剤などの他の従来の医薬成分を含み得る。好適な例示的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、及びパラクロロフェノールが含まれる。好適な化学安定剤としては、ゼラチン及びアルブミンが含まれる。
【0086】
本明細書で使用される場合、「担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的活性物質に対するかかる媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補足有効成分を組成物中に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されるときにアレルギー又は類似の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などの送達ビヒクルが、本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するために使用され得る。詳細には、ｒＡＡＶベクター送達導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、又はナノ粒子などに封入化された送達のいずれかのために製剤化され得る。
【0087】
一実施形態では、組成物は、対象への送達に適した最終製剤を含み、例えば、生理的に適合するｐＨ及び塩濃度に緩衝される水性液体懸濁液である。任意選択的に、１つ以上の界面活性剤が配合物中に存在する。別の実施形態では、組成物は、対象への投与のために希釈される濃縮物として輸送され得る。他の実施形態では、組成物は、凍結乾燥され、投与時に再構成され得る。
【0088】
好適な界面活性剤、又は界面活性剤の組み合わせが、非毒性である非イオン界面活性剤のうちから選択され得る。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有するポロキサマー１８８としても知られているＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］などの、末端が一級ヒドロキシル基の二機能性ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤及び他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアラート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリン酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、及びポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、配合物は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、一般に、文字「Ｐ」（ポロキサマーについて）に続いて、３桁数字を用いて命名され、初めの２桁数字×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を示し、最後の数字×１０は、ポリオキシエチレン含有量パーセントを示す。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最高約０．０００５％～約０．００１％の量で存在し得る。
【0089】
ベクターは、細胞をトランスフェクトするのに十分な量で投与され、十分なレベルの遺伝子導入及び発現を提供して、過度の悪影響なしに、又は医学的に許容される生理的効果を伴う治療効果を提供し、これは当業者によって決定され得る。任意選択的に、髄腔内投与以外の経路、例えば、所望の臓器（例えば、肝臓（任意選択的に肝動脈を介して）、肺、心臓、眼、腎臓）への直接送達、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、及び他の親の投与経路などを使用することができる。投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。
【0090】
ベクターの用量は、主に、治療される状態、患者の年齢、体重、及び健康状態などの要因に依存し、したがって、患者間で異なり得る。例えば、ウイルスベクターの治療上有効なヒト投薬量は、概して、約２５～約１０００マイクロリットル～約１００ｍＬの範囲の、（体重が７０ｋｇの平均的な対象を治療するために）約１×１０９～１×１０１６ゲノムウイルスベクターの濃度（その範囲内の全ての整数又は分数量を含み、好ましくは、ヒト患者に対して、１．０×１０１２ＧＣ～１．０×１０１４ＧＣ）を含む溶液である。一実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１
×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、又は９×１０９ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、又は９×１０１０ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、又は９×１０１１ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、又は９×１０１２ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、又は９×１０１３ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、又は９×１０１４ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１５、２×１０１５、３×１０１５、４×１０１５、５×１０１５、６×１０１５、７×１０１５、８×１０１５、又は９×１０１５ＧＣを含むように製剤化される。一実施形態では、ヒトへの適用のために、用量は、範囲内の全ての整数又は少数を含む、用量当たり１×１０１０～約１×１０１２ＧＣの範囲であり得る。
×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、又は９×１０９ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、又は９×１０１０ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、又は９×１０１１ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、又は９×１０１２ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、又は９×１０１３ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、又は９×１０１４ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１５、２×１０１５、３×１０１５、４×１０１５、５×１０１５、６×１０１５、７×１０１５、８×１０１５、又は９×１０１５ＧＣを含むように製剤化される。一実施形態では、ヒトへの適用のために、用量は、範囲内の全ての整数又は少数を含む、用量当たり１×１０１０～約１×１０１２ＧＣの範囲であり得る。
【0091】
ある特定の実施形態では、用量は、約１×１０９ＧＣ／ｇ脳質量～約１×１０１２ＧＣ／ｇ脳質量の範囲である。ある特定の実施形態では、用量は、約１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３．３３×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲である。ある特定の実施形態では、用量は、約３．３３×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量～約１．１×１０１２ＧＣ／ｇ脳質量の範囲である。ある特定の実施形態では、用量は、約１．１×１０１２ＧＣ／ｇ脳質量～約３．３３×１０１３ＧＣ／ｇ脳質量の範囲である。ある特定の実施形態では、用量は、３．３３×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量よりも低い。ある特定の実施形態では、用量は、１．１×１０１２ＧＣ／ｇ脳質量よりも低い。ある特定の実施形態では、用量は、３．３３×１０１３ＧＣ／ｇ脳質量よりも低い。ある特定の実施形態では、用量は、約１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量である。ある特定の実施形態では、用量は、約２×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量である。ある特定の実施形態では、用量は、約２×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量である。ある特定の実施形態では、用量は、約３×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量である。ある特定の実施形態では、用量は、約４×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量である。ある特定の実施形態では、用量は、約５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量である。ある特定の実施形態では、用量は、約６×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量である。ある特定の実施形態では、用量は、約７×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量である。ある特定の実施形態では、用量は、約８×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量である。ある特定の実施形態では、用量は、約９×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量である。ある特定の実施形態では、用量は、約１×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。ある特定の実施形態では、用量は、約２×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。ある特定の実施形態では、用量は、約３×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。ある特定の実施形態では、用量は、約４×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。ある特定の実施形態では、用量は、ｒＡＡＶの約１．４４×１０１３～４．３３×１０１４ＧＣの範囲の均一用量として、ヒトに投与される。ある特定の実施形態では、用量は、ｒＡＡＶの約１．４４×１０１３～２×１０１４ＧＣの範囲の均一用量として、ヒトに投与される。ある特定の実施形態では、用量は、ｒＡＡＶの約３×１０１３～１×１０１４ＧＣの範囲の均一用量として、ヒトに投与される。ある特定の実施形態では、用量は、ｒＡＡＶの約５×１０１３～１×１０１４ＧＣの範囲の均一用量として、ヒトに投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、投薬量単位で製剤化され、
ｒＡＡＶの約１×１０１３～８×１０１４ＧＣの範囲にある量のＡＡＶを含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、投薬量単位で製剤化され、ｒＡＡＶの約１．４４×１０１３～４．３３×１０１４ＧＣの範囲にある量のｒＡＡＶを含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、投薬量単位で製剤化され、ｒＡＡＶの約３×１０１３～１×１０１４ＧＣの範囲にある量のｒＡＡＶを含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、投薬量単位で製剤化され、ｒＡＡＶの約５×１０１３～１×１０１４ＧＣの範囲にある量のｒＡＡＶを含み得る。
ｒＡＡＶの約１×１０１３～８×１０１４ＧＣの範囲にある量のＡＡＶを含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、投薬量単位で製剤化され、ｒＡＡＶの約１．４４×１０１３～４．３３×１０１４ＧＣの範囲にある量のｒＡＡＶを含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、投薬量単位で製剤化され、ｒＡＡＶの約３×１０１３～１×１０１４ＧＣの範囲にある量のｒＡＡＶを含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、投薬量単位で製剤化され、ｒＡＡＶの約５×１０１３～１×１０１４ＧＣの範囲にある量のｒＡＡＶを含み得る。
【0092】
ある特定の実施形態では、ベクターは、単回用量で対象に投与される。ある特定の実施形態では、複数回の注入（例えば、２用量）によってベクターを送達され得ることが所望される。
【0093】
投薬量を調整して、任意の副作用に対する治療的利益のバランスをとり、かかる投薬量は、組換えベクターが利用される治療適用に応じて変化し得る。導入遺伝子の発現レベルをモニタリングして、ウイルスベクター、好ましくはミニ遺伝子を含有するＡＡＶベクターをもたらす投薬頻度を決定することができる。任意に、治療目的で記載されているものと同様の投薬レジメンは、本明細書で提供される組成物を使用した免疫に利用され得る。
【0094】
本明細書で使用される場合、「髄腔内送達」又は「髄腔内投与」という用語は、脊柱管への、より詳細には、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ到達するようにクモ膜下腔空間内への注入を介した、投与経路を指す。髄腔内送達は、腰椎穿刺、脳室内（側脳室内（ＩＣＶ）を含む）、後頭下／槽内、及び／又はＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料は、腰部穿刺により、クモ膜下腔空間にわたって拡散させるために導入され得る。別の実施例では、注入は、大槽へのものであり得る。ある特定の実施形態では、送達は、Ｏｍｍａｙａリザーバなどの硬膜下植え込み可能なデバイスの使用によって達成される。
【0095】
本明細書で使用される場合、「槽内送達」又は「槽内投与」という用語は、大槽小脳延髄（ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｍｅｄｕｌａｒｉｓ）の脳脊髄液内への直接的な投与経路、より詳細には、後頭下穿刺を介した、又は大槽内への直接的な注入による、又は永久的に配置されたチューブを介した、投与経路を指す。
【0096】
（例えば、ＳＢＭＡ患者における）内因性ｈＡＲを抑制するための本明細書に記載のｍｉＲ標的配列を含む組成物は、概して、ニューロン（例えば、下位運動ニューロン及び／又は一次感覚ニューロンを含む。これらは、例えば、錐体細胞、プルキンエ細胞、顆粒細胞、紡錘体細胞、及び介在ニューロン細胞を含み得る）を含むがこれらに限定されない、中枢神経系内の１つ以上の異なる細胞型を標的とする。
【0097】
使用
本明細書で提供されるベクター及び組成物は、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、又はそれに関連する様々な症状を有する患者を治療するのに有用である。ＳＢＭＡを有する患者を治療するためのレジメンが提供される。ある特定の実施形態では、このレジメンは、対象における核酸配列の発現を指示する調節配列と作動可能に連結された、ヒトアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ標的部位に結合する標的化配列を含む、少なくとも１つのヘアピン形成ｍｉＲＮＡをコードする組換え核酸配列を投与することを含み、ｍｉＲＮＡが、ヒトアンドロゲン受容体の発現を阻害する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的部位は、ＧＡＡ ＣＴＡ ＣＡＴ ＣＡＡ ＧＧＡ ＡＣＴ ＣＧＡ（配列番号１）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶ、発現カセット、核酸、又は組成物が使用される。
本明細書で提供されるベクター及び組成物は、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、又はそれに関連する様々な症状を有する患者を治療するのに有用である。ＳＢＭＡを有する患者を治療するためのレジメンが提供される。ある特定の実施形態では、このレジメンは、対象における核酸配列の発現を指示する調節配列と作動可能に連結された、ヒトアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ標的部位に結合する標的化配列を含む、少なくとも１つのヘアピン形成ｍｉＲＮＡをコードする組換え核酸配列を投与することを含み、ｍｉＲＮＡが、ヒトアンドロゲン受容体の発現を阻害する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的部位は、ＧＡＡ ＣＴＡ ＣＡＴ ＣＡＡ ＧＧＡ ＡＣＴ ＣＧＡ（配列番号１）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶ、発現カセット、核酸、又は組成物が使用される。
【0098】
ある特定の実施形態では、組成物は、１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～３．３３×１０１
１ＧＣ／ｇ脳質量のｒＡＡＶの用量で髄腔内に投与されるように製剤化される。他の実施形態では、患者は、ヒト成人であり、１．４４×１０１３～４．３３×１０１４ＧＣの用量のｒＡＡＶを投与される。他の実施形態では、組成物は、脳室内送達を介して、又は実質内送達を介して、髄腔内に送達される。別の実施形態では、組成物は、大槽（大槽内）（ＩＣＭ）へのコンピュータ断層撮影（ＣＴ）ガイドによる後頭下注入を介して、単回用量として投与される。
１ＧＣ／ｇ脳質量のｒＡＡＶの用量で髄腔内に投与されるように製剤化される。他の実施形態では、患者は、ヒト成人であり、１．４４×１０１３～４．３３×１０１４ＧＣの用量のｒＡＡＶを投与される。他の実施形態では、組成物は、脳室内送達を介して、又は実質内送達を介して、髄腔内に送達される。別の実施形態では、組成物は、大槽（大槽内）（ＩＣＭ）へのコンピュータ断層撮影（ＣＴ）ガイドによる後頭下注入を介して、単回用量として投与される。
【0099】
任意に、本明細書で提供されるベクター及び組成物は、アセトアミノフェン、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、三環系抗うつ薬、又は抗てんかん薬、例えば、カルバマゼピン又はガバペンチンから選択される１つ以上の併用療法と組み合わせて使用され得る。他の併用療法としては、ＰＥＧ化ＩＧＦ－１模倣物（例えば、ＢＶＳ８５７）（例えば、Ｇｒｕｎｓｅｉｃｈ Ｃ，ｅｔ ａｌ，ＢＶＳ８５７ ｓｔｕｄｙ ｇｒｏｕｐ．Ｓａｆｅｔｙ，ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｎ ＩＧＦ－１ ｍｉｍｅｔｉｃ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｐｉｎａｌ ａｎｄ ｂｕｌｂａｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ：ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１８ Ｄｅｃ；１７（１２）：１０４３－１０５２．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ１４７４－４４２２（１８）３０３２０－Ｘ．Ｅｐｕｂ ２０１８ Ｏｃｔ
１５．ＰＭＩＤ：３０３３７２７３を参照されたい）、ＡＲ遺伝子発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２０１４ Ｍａｙ ８；７（３）：７７４－７８４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１４．０２．００８を参照されたい）、イントラボディ（例えば、ＩＮＴ４１）、小分子Ｎｒｆ１又はＮｒｆ２活性化因子（例えば、ＡＪ２０１，ＡＬＺ００２ ａｋａ ＡＳＣ－ＪＭ１７）（例えば、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１６，Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．１０を参照されたい）、ロイプロレリンアセテート（例えば、Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１０；９：８７５－８４を参照されたい）、デュタステリド（合成４－アザステロイド化合物）（例えば、１ Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１１ Ｆｅｂｒｕａｒｙ；１０（２）：１４０－１４７．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ１４７４－４４２２（１０）７０３２１－５を参照されたい）、ｍｒＲ－１９６ａ、Ｓｒｃキナーゼ阻害剤（例えば、Ａ４１９２５９）、ＡＲアイソフォーム４５（例えば、ＡＡＶ９－ＡＲ４５）、及びクレンブテロール（例えば、Ｑｕｅｒｉｎ Ｇ，Ｄ’Ａｓｃｅｎｚｏ Ｃ，Ｐｅｔｅｒｌｅ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｐｉｌｏｔ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌ ｉｎ ｓｐｉｎａｌ ａｎｄ ｂｕｌｂａｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１３；８０：２０９５－８を参照されたい）が挙げられる。更に他の実施形態では、ベクターは、１つ以上のステロイド、例えば、プレドニゾンを含む免疫調節レジメンと組み合わせて送達され得る。
１５．ＰＭＩＤ：３０３３７２７３を参照されたい）、ＡＲ遺伝子発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２０１４ Ｍａｙ ８；７（３）：７７４－７８４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１４．０２．００８を参照されたい）、イントラボディ（例えば、ＩＮＴ４１）、小分子Ｎｒｆ１又はＮｒｆ２活性化因子（例えば、ＡＪ２０１，ＡＬＺ００２ ａｋａ ＡＳＣ－ＪＭ１７）（例えば、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１６，Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．１０を参照されたい）、ロイプロレリンアセテート（例えば、Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１０；９：８７５－８４を参照されたい）、デュタステリド（合成４－アザステロイド化合物）（例えば、１ Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１１ Ｆｅｂｒｕａｒｙ；１０（２）：１４０－１４７．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ１４７４－４４２２（１０）７０３２１－５を参照されたい）、ｍｒＲ－１９６ａ、Ｓｒｃキナーゼ阻害剤（例えば、Ａ４１９２５９）、ＡＲアイソフォーム４５（例えば、ＡＡＶ９－ＡＲ４５）、及びクレンブテロール（例えば、Ｑｕｅｒｉｎ Ｇ，Ｄ’Ａｓｃｅｎｚｏ Ｃ，Ｐｅｔｅｒｌｅ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｐｉｌｏｔ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌ ｉｎ ｓｐｉｎａｌ ａｎｄ ｂｕｌｂａｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１３；８０：２０９５－８を参照されたい）が挙げられる。更に他の実施形態では、ベクターは、１つ以上のステロイド、例えば、プレドニゾンを含む免疫調節レジメンと組み合わせて送達され得る。
【0100】
本明細書で使用される場合、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）という用語は、軸に沿って作成された一連の平面断面画像から、コンピュータによって身体構造の三次元画像が構築される放射線撮影を指す。
【0101】
「自己相補的核酸」とは、核酸鎖内のヌクレオチドの相補性（例えば、塩基対合）により、それ自体とハイブリダイズ（すなわち、それ自体を折り返す）して、一本鎖二重構造を形成することができる核酸を指す。自己相補的核酸は、ヘアピンループ、ループ、バルジ、接合部、及び内部バルジなどの様々な二次構造を形成することができる。ある特定の自己相補的核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ又はＡｍｉＲＮＡ（人工ｍｉＲＮＡ））は、遺伝子サイレンシングなどの調節機能を実施する。
【0102】
「実質的相同性」又は「実質的類似性」という用語は、核酸又はその断片に言及する場合、適切なヌクレオチドの挿入又は欠失を伴って別の核酸（又はその相補鎖）と最適に整
列した場合、整列した配列の少なくとも約９５～９９％においてヌクレオチド配列の同一性がある。好ましくは、相同性は、全長配列、又はそのオープンリーディングフレーム、又は少なくとも１５ヌクレオチド長である別の好適な断片にわたる。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
列した場合、整列した配列の少なくとも約９５～９９％においてヌクレオチド配列の同一性がある。好ましくは、相同性は、全長配列、又はそのオープンリーディングフレーム、又は少なくとも１５ヌクレオチド長である別の好適な断片にわたる。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
【0103】
核酸配列の文脈で「配列同一性」、「パーセント配列同一性」、又は「パーセント同一」という用語は、最大限対応するように整列させたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長、又は、望ましくは、少なくとも約５００～５０００個のヌクレオチドの断片にわたり得る。しかしながら、例えば、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドの、より小さい断片間の同一性も望まれ得る。同様に、「パーセント配列同一性」は、タンパク質の全長わたるアミノ酸配列又はその断片について容易に決定することができる。好適には、断片は、少なくとも約８アミノ酸長であり、最大で約７００アミノ酸長であり得る。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
【0104】
「実質的相同性」又は「実質的類似性」という用語は、アミノ酸又はその断片に言及する場合、適切なアミノ酸の挿入又は欠失を伴って別のアミノ酸（又はその相補鎖）と最適に整列した場合、整列した配列の少なくとも約９５～９９％においてアミノ酸配列の同一性がある。好ましくは、相同性は、全長配列、若しくはそのタンパク質、例えば、ｃａｐタンパク質、ｒｅｐタンパク質、又は少なくとも８アミノ酸長であるそれらの断片、若しくはより好ましくは、少なくとも１５アミノ酸長にわたる。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
【0105】
「高度に保存された」という用語は、少なくとも８０％の同一性、好ましくは、少なくとも９０％の同一性、より好ましくは９７％超の同一性を意味する。同一性は、当業者に既知のアルゴリズム及びコンピュータプログラムを用いることによって、当業者によって容易に決定される。
【0106】
一般に、２つの異なるアデノ随伴ウイルス間の「同一性」、「相同性」、又は「類似性」に言及する場合、「同一性」、「相同性」、又は「類似性」は、「整列された」配列を参照して決定される。「整列された」配列又は「整列」とは、複数の核酸配列又はタンパク質（アミノ酸）配列を指し、参照配列と比較して、多くの場合、欠損若しくは追加の塩基又はアミノ酸についての補正を含む。実施例では、公開されたＡＡＶ９配列を参照点として使用してＡＡＶ整列を行う。整列は、様々な公的又は商業的に利用可能である多重配列整列プログラムのいずれかを使用して行われる。かかるプログラムの例としては、インターネット上のウェブサーバを通してアクセス可能な「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＭＡＰ」、及び「ＭＥＭＥ」が挙げられる。かかるプログラムの他のソースは、当業者に既知である。代替的には、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティもまた使用される。また、当該技術分野で既知のいくつかのアルゴリズムが存在し、上記のプログラムに含まれるものを含め、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を用いて比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、照会配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）及び検索配列（ｓｅａｒｃｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の間の最良の重複領域の整列及びパーセント配列同一性を提供する。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、Ｆａｓｔａ（商標）を、そのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６及びスコアリングマトリックスについてＮＯＰＡＭ係数）を参照により本明細書に組み込まれるＧＣＧバージョン６．１に提供されるように用いて使用して決定することができる。「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ
」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、及び「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムなどの多重配列整列プログラムもまた、アミノ酸配列に対して利用可能である。一般に、これらのプログラムのいずれかがデフォルト設定で使用されるが、必要に応じて、当業者は、これらの設定を変更することができる。代替的には、当業者は、別のアルゴリズム又はコンピュータプログラムを利用することができ、参照のアルゴリズム及びプログラムによって提供されるように、少なくとも同一性のレベル又は整列が提供される。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。
」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、及び「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムなどの多重配列整列プログラムもまた、アミノ酸配列に対して利用可能である。一般に、これらのプログラムのいずれかがデフォルト設定で使用されるが、必要に応じて、当業者は、これらの設定を変更することができる。代替的には、当業者は、別のアルゴリズム又はコンピュータプログラムを利用することができ、参照のアルゴリズム及びプログラムによって提供されるように、少なくとも同一性のレベル又は整列が提供される。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。
【0107】
「ａ」又は「ａｎ」という用語は、１つ以上を指すことに留意されたい。したがって、「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、及び「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【0108】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。「なる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「なっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という用語、及びその変形は、包括的ではなく排他的に解釈されるべきである。本明細書の様々な実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉を用いて示されているが、他の状況では、関連する実施形態は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」又は「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という言葉を用いて解釈及び記載されるべきことも意図される。
【0109】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別途指定されない限り、与えられた参照から１０％（±１０％、例えば、±１、±２、±３、±４、±５、±６、±７、±８、±９、±１０、又はそれらの間の値）の可変性を意味する。
【0110】
本明細書で使用される場合、「疾患」、「障害」、及び「状態」は、対象における異常な状態を示すために互換的に使用される。
【0111】
本明細書で使用される場合、「ＳＢＭＡ関連症状」又は「症状」という用語は、ＳＢＭＡ患者及びＳＢＭＡ動物モデルで見られる症状を指す。ＳＢＭＡの初期症状には、腕及び脚の筋肉における衰弱／けいれん、顔、口、及び舌の筋肉の衰弱、話すこと及び嚥下の困難、れん縮（線維束性れん縮）、ある特定の位置での震え（ｔｒｅｍｏｒｓ）及び震え（ｔｒｅｍｂｌｉｎｇ）、乳房の肥大、（女性化乳房）、しびれ、不妊症、及び精巣萎縮のうちの１つ以上が含まれ得る。疾患は、脚、腕、口、及び喉の多くの筋肉の動きを担う下位運動ニューロンに影響を及ぼす。罹患した個体は、多くの場合、舌及び／又は手にれん縮の徴候を示し、続いて筋肉の衰弱及び顔の筋肉の問題を示す。脊髄を筋肉に接続するこれらのニューロンは、欠損して死滅するため、筋肉は収縮できない。これらの神経の破壊が、しびれ、筋肉の衰弱、及び筋肉の収縮を制御することができない主な理由である。正常な神経筋機能の欠如により、患者は、筋肉のけいれんによりふくらはぎの筋肉が厚くなる肥大したふくらはぎを経験する場合がある。いくつかの場合では、患者はまた、身体の片側が反対側よりも影響を受ける場合がある。
【0112】
この疾患はまた、呼吸、話すこと、及び嚥下に重要な球筋を制御する神経にも影響を及ぼす。アンドロゲン不感受性も生じ得、時には青年期に始まり、成人期まで続き、乳房の肥大、男性的な外観の減少、及び不妊症によって特徴付けられる。患者は、精子数の低下及び勃起不全などの問題を経験する場合がある。
【0113】
本明細書で使用される場合、「患者」又は「対象」は、臨床研究に使用される男性又は女性のヒト、イヌ、及び動物モデルを意味する。一実施形態では、これらの方法及び組成物の対象は、ＳＢＭＡと診断されたヒトである。ある特定の実施形態では、これらの方法及び組成物のヒト対象は、出生前、新生児、乳児、幼児、未就学児、小学生、十代、若年成人、又は成人である。更なる実施形態では、これらの方法及び組成物の対象は、成人ＳＢＭＡ患者である。更なる実施形態では、対象は、男性である。
【0114】
「発現」という用語は、本明細書で最も広い意味で使用され、ＲＮＡ又はＲＮＡ及びタンパク質の産生を含む。ＲＮＡに関して、「発現」又は「翻訳」という用語は、特に、ペプチド又はタンパク質の産生に関する。発現は、一過性又は安定であり得る。
【0115】
本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、コード配列、プロモーターを含む核酸分子を指し、それらのための他の調節配列を含み得、そのカセットは、遺伝子要素（例えば、プラスミド）によりパッケージング宿主細胞に送達され得、ウイルスベクターのカプシド（例えば、ウイルス粒子）へパッケージングされる。典型的に、ウイルスベクターを産生するためのそのような発現カセッは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに隣接する本明細書に記載のｍｉＲＮＡのコード配列、及び本明細書に記載のものなどの他の発現制御配列を含む。
【0116】
本明細書で使用される場合、「操作可能に連結された」という用語は、目的の遺伝子に連続している発現制御配列、及び目的の遺伝子にトランス又は離れて作用して制御する発現制御配列の両方を指す。
【0117】
タンパク質又は核酸を参照して使用される場合、「異種性」という用語は、タンパク質又は核酸が、天然における互いの関係と同じ関係で見出されない、２つ以上の配列又は下位配列を含むことを示す。例えば、新規の機能的核酸を作製するために配置された関連のない遺伝子からの２つ以上の配列を有する核酸は、典型的に、組換えにより産生される。例えば、一実施形態では、核酸は、異なる遺伝子からコーディング配列の発現を指示するように配置された１つの遺伝子からのプロモーターを有する。したがって、コーディング配列に関しては、プロモーターは、異種性である。
【0118】
本発明の文脈における「翻訳」という用語は、リボソームでのプロセスに関し、ｍＲＮＡ鎖は、アミノ酸配列の集合を制御して、タンパク質又はペプチドを生成する。
【0119】
具体的な実施形態
１．対象における核酸配列の発現を指示する調節配列と作動可能に連結された、ヒトアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ標的部位に結合する標的化配列を含む、少なくとも１つのヘアピン形成ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を含む発現カセットであって、ｍｉＲＮＡが、ヒトアンドロゲン受容体の発現を阻害する、発現カセット。
１．対象における核酸配列の発現を指示する調節配列と作動可能に連結された、ヒトアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ標的部位に結合する標的化配列を含む、少なくとも１つのヘアピン形成ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を含む発現カセットであって、ｍｉＲＮＡが、ヒトアンドロゲン受容体の発現を阻害する、発現カセット。
【0120】
２．ｍｉＲＮＡ標的部位が、ＧＡＡ ＣＴＡ ＣＡＴ ＣＡＡ ＧＧＡ ＡＣＴ ＣＧＡ（配列番号１）を含む、実施形態１の発現カセット。
【0121】
３．ｍｉＲＮＡコード配列が、ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＡＧ ＴＴＣ（配列番号２）の配列を含む、実施形態１又は２の発現カセット。
【0122】
４．ｍｉＲＮＡコード配列が、ＣＧＡ ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＡＧ（配列番号３）の配列を含む、実施形態１又は２の発現カセット。
【0123】
５．ｍｉＲＮＡ標的化配列が、ヒトアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ上の標的部位との正
確な相補性より少なく共有する、実施形態１～４のいずれか１つの発現カセット。
確な相補性より少なく共有する、実施形態１～４のいずれか１つの発現カセット。
【0124】
６．ｍｉＲＮＡコード配列が、
ａ）ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＡＧ ＴＴＣ（配列番号２）若しくは最大１０個の置換を有する配列、又は
ｂ）ＣＧＡ ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＡＧ（配列番号３）若しくは最大１０個の置換を有する配列の配列を含む、実施形態１～５のいずれか１つの発現カセット。
ａ）ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＡＧ ＴＴＣ（配列番号２）若しくは最大１０個の置換を有する配列、又は
ｂ）ＣＧＡ ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＡＧ（配列番号３）若しくは最大１０個の置換を有する配列の配列を含む、実施形態１～５のいずれか１つの発現カセット。
【0125】
７．ｍｉＲＮＡコード配列が、配列番号４、又は最大３０個の置換を有する配列を含む、実施形態１～６のいずれか１つの発現カセット。
【0126】
８．ｍｉＲＮＡコード配列が、配列番号５、又は最大３０個の置換を有する配列を含む、実施形態１～６のいずれか１つの発現カセット。
【0127】
９．ｍｉＲＮＡコード配列が、配列番号１１、又は最大６０個の置換を有する配列を含む、実施形態１～６のいずれか１つの発現カセット。
【0128】
１０．ｍｉＲＮＡコード配列が、配列番号１２、又は最大６０個の置換を有する配列を含む、実施形態１～６のいずれか１つの発現カセット。
【0129】
１１．調節配列が、プロモーター、イントロン、ＷＰＲＥ、及びポリＡのうちの１つ以上を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の発現カセット。
【0130】
１２．調節配列が、ＣＢ７プロモーター又はＳｙｎプロモーターを含む、実施形態１１に記載の発現カセット。
【0131】
１３．ベクターゲノムを中にパッケージングしたＡＡＶカプシドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であって、ベクターゲノムが、５’ＡＡＶ ＩＴＲ及び３’ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する、実施形態１～１２のうちのいずれかの発現カセットを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
【0132】
１４．ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ９、ＡＡＶｈｕ６８、ＡＡＶ１、又はＡＡＶｒｈ９１から選択される、実施形態１３に記載のＡＡＶ。
【0133】
１５．ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶｈｕ６８である、実施形態１４に記載のＡＡＶ。
【0134】
１６．調節配列が、ニューロン特異的プロモーターを含む、実施形態１３～１５のいずれか１つに記載のＡＡＶ。
【0135】
１７．プロモーターが、ヒトシナプシンプロモーターである、実施形態１６に記載のＡＡＶ。
【0136】
１８．調節配列が、構成的プロモーターを含む、実施形態１３～１７のいずれか１つに記載のＡＡＶ。
【0137】
１９．プロモーターが、ＣＢ７プロモーターである、実施形態１８に記載のＡＡＶ。
【0138】
２０．調節配列が、ＷＰＲＥを含む、実施形態１３～１９のいずれか１つに記載のＡＡＶ。
【0139】
２１．調節配列が、イントロンを含む、実施形態１３～２０のいずれか１つに記載のＡＡＶ。
【0140】
２２．調節配列が、ウサギベータグロビンポリＡを含む、実施形態１３～２１のいずれか１つに記載のＡＡＶ。
【0141】
２３．対象における核酸配列の発現を指示する調節配列と作動可能に連結された、ヒトアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ標的部位に結合する標的化配列を含む、少なくとも１つのヘアピン形成ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を含む組成物であって、ｍｉＲＮＡが、ヒトアンドロゲン受容体の発現を阻害する、組成物。
【0142】
２４．ｍｉＲＮＡが、ヒトアンドロゲン受容体ｍＲＮＡ上の以下の部位：ＧＡＡ ＣＴＡ ＣＡＴ ＣＡＡ ＧＧＡ ＡＣＴ ＣＧＡ（配列番号１）を標的とする、実施形態２３に記載の組成物。
【0143】
２５．実施形態１～１２のいずれか１つに記載の発現カセット、実施形態１３～２２に記載のＡＡＶ、又は実施形態２３若しくは２４に記載の組成物と、薬学的に許容される水性懸濁液体、賦形剤、及び／又は希釈剤と、を含む、医薬組成物。
【0144】
２６．球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）を有する対象を治療するための方法であって、有効量の、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の発現カセット、実施形態１３～２２に記載のＡＡＶ、又は実施形態２３若しくは２５に記載の組成物を、それを必要とする対象に送達することを含む、方法。
【0145】
２７．球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）を有する患者の治療のための、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の発現カセット、実施形態１３～２２に記載のＡＡＶ、又は実施形態２３若しくは２５に記載の組成物の、使用。
【0146】
２８．組成物が、１ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～３．３３ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量のｒＡＡＶの用量で髄腔内に投与されるように製剤化される、実施形態２７に記載の使用。
【0147】
２９．患者が、ヒト成人であり、１．４４×１０１３～４．３３×１０１４ＧＣの用量のｒＡＡＶを投与される、実施形態２７又は２８のいずれか１つに記載の使用。
【0148】
３０．ｒＡＡＶが、脳室内送達を介して、又は実質内送達を介して、髄腔内に送達される、実施形態２７～２９のいずれか１つに記載の使用。
【0149】
３１．組成物が、大槽（大槽内）へのコンピュータ断層撮影（ＣＴ）ガイドによる後頭下注入を介して、単回用量として投与される、実施形態２７～２９のいずれか１つに記載の使用。
【0150】
３２．患者が、ＳＢＭＡを有する、実施形態１９～２５のいずれか１つに記載の使用。
【0151】
３３．球脊髄性筋萎縮症を有するヒト患者を治療する方法であって、アデノ随伴ウイルスｈｕ．６８（ＡＡＶｈｕ．６８）のＡＡＶカプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を中枢神経系（ＣＮＳ）に送達することを含み、当該ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムを更に含み、当該ベクターゲノムは、ＡＡＶ逆位末端反復と、ヒトアンドロゲン受容体のｍＲＮＡ上の標的部位に結合する標的配列を含む、少なくとも１つのヘアピン形成ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列であって、ｍ
ｉＲＮＡが、ヒトアンドロゲン受容体の発現を阻害する、核酸配列と、ｍｉＲＮＡの発現を指示する調節配列と、を含む、方法。
ｉＲＮＡが、ヒトアンドロゲン受容体の発現を阻害する、核酸配列と、ｍｉＲＮＡの発現を指示する調節配列と、を含む、方法。
【0152】
３４．患者が、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の発現カセット、実施形態１３～２２に記載のＡＡＶ、又は実施形態２３若しくは２５に記載の組成物を投与される、実施形態３３に記載の方法。
【0153】
３５．患者が、１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～３．３３×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量のｒＡＡＶを、髄腔内に投与される、実施形態３３又は３４のいずれか１つに記載の方法。
【0154】
３６．患者が、ヒト成人であり、１．４４×１０１３～４．３３×１０１４ＧＣの用量のｒＡＡＶを投与される、実施形態３３～３５のいずれか１つに記載の方法。
【0155】
３７．ｍｉＲのコード配列を含むｒＡＡＶが、脳室内送達を介して、又は実質内送達を介して、髄腔内に送達される、実施形態３３～３６のいずれか１つに記載の方法。
【0156】
３８．ｒＡＡＶが、大槽（大槽内）へのコンピュータ断層撮影（ＣＴ）ガイドによる後頭下注入を介して、単回用量として投与される、実施形態３３～３７のいずれか１つに記載の方法。
【0157】
３９．患者が、ＳＢＭＡを有する、実施形態２７～３５のいずれか１つに記載の方法。
【0158】
本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者によって、及び本明細書で使用されている多数の用語に対して当業者に一般的な手引きを提供する公開された文書を参照することによって、一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
【実施例】
【0159】
以下の実施例は、例示的なものに過ぎず、本発明を限定することを意図するものではない。
【0160】
実施例１：インビトロでのアンドロゲン受容体（ＡＲ）標的化ｍｉＲＮＡのスクリーニング
ＨＥＫ２９３細胞を、Ｂｌｏｃｋ－ｉＴプラスミドでトランスフェクトした。Ｂｌｏｃｋ－ＩＴプラスミドは、ＣＭＶプロモーター、ｅｍＧＦＰ、ｍｉＲＮＡのクローニング部位、及びＴＫポリＡを含有し、ｍｉＲＮＡを、Ｂｌｏｃｋ－ｉＴオンラインソフトウェアを使用して設計した。ｍｉＲＮＡ隣接領域は、ｍｉＲ１５５に基づいた。細胞溶解物を抽出し、ＲＮＡ抽出及びｑＰＣＲ又はウエスタンブロッティングのために準備した。細胞から抽出されたＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、ＡＲに対するＴａｑＭａｎアッセイを使用してｑＰＣＲを実施した。グラフは、種々のｍｉＲＮＡでのトランスフェクション後のＡＲのノックダウンレベルを示す。ｑＰＣＲは、インビトロでＡＲをノックダウンする最も効率的なｍｉＲＮＡとしてｍｉＲ３１６０を強調した（図４Ａ）。限られた数のｍｉＲＮＡに関するタンパク質分析により、ｍｉＲ３６１０がＡＲのタンパク質発現を効果的にノックダウンすることが確認された（図４Ｂ）。
ＨＥＫ２９３細胞を、Ｂｌｏｃｋ－ｉＴプラスミドでトランスフェクトした。Ｂｌｏｃｋ－ＩＴプラスミドは、ＣＭＶプロモーター、ｅｍＧＦＰ、ｍｉＲＮＡのクローニング部位、及びＴＫポリＡを含有し、ｍｉＲＮＡを、Ｂｌｏｃｋ－ｉＴオンラインソフトウェアを使用して設計した。ｍｉＲＮＡ隣接領域は、ｍｉＲ１５５に基づいた。細胞溶解物を抽出し、ＲＮＡ抽出及びｑＰＣＲ又はウエスタンブロッティングのために準備した。細胞から抽出されたＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、ＡＲに対するＴａｑＭａｎアッセイを使用してｑＰＣＲを実施した。グラフは、種々のｍｉＲＮＡでのトランスフェクション後のＡＲのノックダウンレベルを示す。ｑＰＣＲは、インビトロでＡＲをノックダウンする最も効率的なｍｉＲＮＡとしてｍｉＲ３１６０を強調した（図４Ａ）。限られた数のｍｉＲＮＡに関するタンパク質分析により、ｍｉＲ３６１０がＡＲのタンパク質発現を効果的にノックダウンすることが確認された（図４Ｂ）。
【0161】
実施例２：投与経路の評価
投与経路を評価するために、以下のものを、野生型成体マウスには尾静脈を介して注入し、新生児マウスには脳室内を介して注入した：ＰＢＳ、ＡＡＶ．ＣＢ７．ｍｉＲ＿ＮｅｕＮ（３ｘ１０１１ＧＣ）、又はＡＡＶ．ＣＢ７．ＧＦＰ（３ｘ１０１１ＧＣ）。マウス
を注入から１４日後に安楽死させた。脳及び脊髄を採取し、均質化し、ウエスタンブロッティングのために処理した。ｍｉＲ ＮｅｕＮを注入した新生児マウス及び成体マウスの両方において、ＮｅｕＮタンパク質レベルが低減した（図５Ａ～５Ｃ）。
投与経路を評価するために、以下のものを、野生型成体マウスには尾静脈を介して注入し、新生児マウスには脳室内を介して注入した：ＰＢＳ、ＡＡＶ．ＣＢ７．ｍｉＲ＿ＮｅｕＮ（３ｘ１０１１ＧＣ）、又はＡＡＶ．ＣＢ７．ＧＦＰ（３ｘ１０１１ＧＣ）。マウス
を注入から１４日後に安楽死させた。脳及び脊髄を採取し、均質化し、ウエスタンブロッティングのために処理した。ｍｉＲ ＮｅｕＮを注入した新生児マウス及び成体マウスの両方において、ＮｅｕＮタンパク質レベルが低減した（図５Ａ～５Ｃ）。
【0162】
実施例３：インビボにおけるアンドロゲン受容体のノックダウンの評価
マウスに、ＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ（１００μＬ中の３×１０１１ＧＣ）又はＰＢＳを、尾静脈注入を介して投与した。マウスを注入から１４日後に屠殺した。脳及び脊髄を採取し、ＲＮＡ及びウエスタンブロッティングのために処理した。ｍｉＲ３６１０は、ヒト及びマウスＡＲｍＲＮＡと交差反応する。ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成し、ｈＡＲに対するＴａｑＭａｎプライマーを使用してｑＰＣＲを実施した。ｍｉＲ３６１０が注入された群における全てのマウスは、ＰＢＳが注入された群と比較して、ＡＲ ｍＲＮＡレベルの４０％の低減を示した（図６Ａ、６Ｂ）。ｍｉＲ３６１０が注入された群では、ＰＢＳが注入された群と比較して、ＡＲタンパク質レベルも低減した（図６Ｃ）。
マウスに、ＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ（１００μＬ中の３×１０１１ＧＣ）又はＰＢＳを、尾静脈注入を介して投与した。マウスを注入から１４日後に屠殺した。脳及び脊髄を採取し、ＲＮＡ及びウエスタンブロッティングのために処理した。ｍｉＲ３６１０は、ヒト及びマウスＡＲｍＲＮＡと交差反応する。ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成し、ｈＡＲに対するＴａｑＭａｎプライマーを使用してｑＰＣＲを実施した。ｍｉＲ３６１０が注入された群における全てのマウスは、ＰＢＳが注入された群と比較して、ＡＲ ｍＲＮＡレベルの４０％の低減を示した（図６Ａ、６Ｂ）。ｍｉＲ３６１０が注入された群では、ＰＢＳが注入された群と比較して、ＡＲタンパク質レベルも低減した（図６Ｃ）。
【0163】
種々のｍｉＲＮＡのインビトロスクリーニングはまた、ｍｉＲ３６１３を、ＡＲをノックダウンする潜在的な治療標的として特定した。ｍｉＲ３６１０と比較してインビボでｍｉＲ３６１３を評価するために、マウスに、尾静脈を介して、以下のベクターを投与した：ＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．Ｃｌ．ｈＡＲｍｉＲＮＴ．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ、ＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．Ｃｌ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ、ＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．Ｃｌ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ、又はＰＢＳ。１４日目に全てのマウスを屠殺した。脳及び脊髄を採取し、ＲＮＡ及びウエスタンブロッティングのために処理した。両方のｍｉＲＮＡは、脳（図７Ａ）及び脊髄（図７Ｂ）におけるＡＲ ｍＲＮＡレベルの低減を誘発した。脳におけるタンパク質レベルについて、両方のｍｉＲＮＡで同様の結果が見られた（図７Ｃ～Ｅ）が、ｍｉＲ３６１０は、ｍｉＲ３６１３と比較して、遺伝子及びタンパク質レベルに対してより顕著な効果を有した。
【0164】
実施例４：種々のプロモーターの評価
この研究は、非標的化人工ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ．ＮＴ）又はＡＲ標的化された人工ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ３６１０）のいずれかを発現する２つの異なるプロモーター（ＣＢ７又はｈＳｙｎ）を含有することを除いて、同一であった４つの異なるＡＡＶ９－ＰＨＰ．ｅＢベクターを評価した。ＣＢ７プロモーター（ＧＴＰ－２１１に含まれる）は、遍在性ニワトリβ－アクチンプロモーターであり、任意のＣＮＳ細胞型において高レベルの発現をもたらすため、評価された。ｈＳｙｎプロモーターは、ヒトシナプシンプロモーターであり、これは、ニューロンにおいて特異的に高レベルの発現をもたらし、非ニューロン細胞型での発現を最小限に抑えることが期待される。ｍｉＲ．ＮＴは、マウスにおいて他の発現された遺伝子との配列類似性がほとんどないか又は全くないことが期待される非標的化人工ｍｉＲＮＡであり、陰性対照ベクターとして機能する。ｈＡＲ．ｍｉＲ３６１０（ＧＴＰ－２１１に含まれる）は、ヒトＡＲ ｍＲＮＡを標的とする人工ｍｉＲＮＡ配列であり、以前に収集されたデータに基づいて選択された。
この研究は、非標的化人工ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ．ＮＴ）又はＡＲ標的化された人工ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ３６１０）のいずれかを発現する２つの異なるプロモーター（ＣＢ７又はｈＳｙｎ）を含有することを除いて、同一であった４つの異なるＡＡＶ９－ＰＨＰ．ｅＢベクターを評価した。ＣＢ７プロモーター（ＧＴＰ－２１１に含まれる）は、遍在性ニワトリβ－アクチンプロモーターであり、任意のＣＮＳ細胞型において高レベルの発現をもたらすため、評価された。ｈＳｙｎプロモーターは、ヒトシナプシンプロモーターであり、これは、ニューロンにおいて特異的に高レベルの発現をもたらし、非ニューロン細胞型での発現を最小限に抑えることが期待される。ｍｉＲ．ＮＴは、マウスにおいて他の発現された遺伝子との配列類似性がほとんどないか又は全くないことが期待される非標的化人工ｍｉＲＮＡであり、陰性対照ベクターとして機能する。ｈＡＲ．ｍｉＲ３６１０（ＧＴＰ－２１１に含まれる）は、ヒトＡＲ ｍＲＮＡを標的とする人工ｍｉＲＮＡ配列であり、以前に収集されたデータに基づいて選択された。
【0165】
成体雄野生型マウス（６～８週齢）は、３．０×１０１１ＧＣの用量で、ＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ｍｉＲ．ＮＴ．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ、ＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ、ＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．Ｓｙｎ．ＰＩ．ｍｉＲ．ＮＴ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ、又はＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ｈＳｙｎ．ＰＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｂＧＨの単回静脈内投与を受けた。１４日目に、マウスを剖検した。脊髄を採取して、マウスＡＲ ｍＲＮＡ発現を評価した（ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ）。
【0166】
ＡＡＶ投与は、良好な忍容性であり、全てのマウスは、予定された剖検まで生存した。
【0167】
図８に示されるように、非標的化人工ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ．ＮＴ）を発現するＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢベクターの投与は、ＡＲ ｍＲＮＡの発現に影響を与えず、ＣＢ７及びｈＳｙｎプロモーターの両方で同様の発現レベルが観察された。比較して、ヒトＡＲ ｍＲＮＡを標的とする人工ｍｉＲＮＡ配列（ｈＡＲ．ｍｉＲ３６１０）を発現するＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢベクターで処置されたマウスは、マウスＡＲ ｍＲＮＡ転写産物のノックダウンを示し、ＣＢ７及びｈＳｙｎプロモーターの両方がｈＡＲ．ｍｉＲ３６１０の堅牢な発現をもたらしたことを示した。
【0168】
実施例５：インビボＳＢＭＡ ＡＲ９７Ｑトランスジェニックマウス研究
ＳＢＭＡトランスジェニックマウスは、Ｋａｔｓｕｎｏらによって説明されている（Ｎｅｕｒｏｎ．２００２ Ａｕｇ ２９；３５（５）：８４３－５４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｓ０８９６－６２７３（０２）００８３４－６、参照により本明細書に組み込まれる）。マウスモデルは、９７個のＣＡＧを含有する全長ＡＲを担持する。ＡＲ９７Ｑトランスジェニックマウスで発現されるＡＲのレベルを評価するために、脊髄を、野生型の雄マウス、並びにヘテロ接合雄及び雌マウスから採取した。脊髄を、ウエスタンブロッティングのために処理した。雄及び雌のヘテロ接合マウスは、ｈＡＲ（ＡＲ９７Ｑ）の堅牢なレベルを示したが、ＷＴ雄マウスは、ｈＡＲの発現を示さなかった。全てのマウスは、ｍＡＲにおいて様々なレベルを示した（図９Ａ）。生存率もまた、このコロニーで追跡された。プロットは、生存中央値が９２日であるオスの生存の急激な低下を示したが、生存中央値が１９２日である雌については生存の緩やかな低下が観察された（図９Ｂ）。
ＳＢＭＡトランスジェニックマウスは、Ｋａｔｓｕｎｏらによって説明されている（Ｎｅｕｒｏｎ．２００２ Ａｕｇ ２９；３５（５）：８４３－５４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｓ０８９６－６２７３（０２）００８３４－６、参照により本明細書に組み込まれる）。マウスモデルは、９７個のＣＡＧを含有する全長ＡＲを担持する。ＡＲ９７Ｑトランスジェニックマウスで発現されるＡＲのレベルを評価するために、脊髄を、野生型の雄マウス、並びにヘテロ接合雄及び雌マウスから採取した。脊髄を、ウエスタンブロッティングのために処理した。雄及び雌のヘテロ接合マウスは、ｈＡＲ（ＡＲ９７Ｑ）の堅牢なレベルを示したが、ＷＴ雄マウスは、ｈＡＲの発現を示さなかった。全てのマウスは、ｍＡＲにおいて様々なレベルを示した（図９Ａ）。生存率もまた、このコロニーで追跡された。プロットは、生存中央値が９２日であるオスの生存の急激な低下を示したが、生存中央値が１９２日である雌については生存の緩やかな低下が観察された（図９Ｂ）。
【0169】
トランスジェニック系統におけるｍｉＲ３６１０の効果を評価するために、成体雄ＳＢＭＡマウス（５～６週齢）は、尾静脈を介して３．０×１０１１ＧＣの用量で、ＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧの単回ＩＶ投与を受けた。追加の年齢を一致させた雄ＳＢＭＡマウスは、対照として注入されていないままであった。動物は、生存率（生存）について、毎日チェックされた。人道的エンドポイントでは、マウスを剖検し、脳を採取して、ウエスタンブロットによって、変異ヒトＡＲタンパク質及び内因性マウスＡＲタンパク質の発現を評価した。
【0170】
ＡＡＶ投与は、良好な忍容性であった。全てのマウスは、２／５又はそれ以下の身体状態スコア、マウスが自分自身を正すことができないこと、又は２つ以上の四肢の麻痺によって特徴付けられる疾患進行に起因する人道的エンドポイントに達した。
【0171】
ＡＡＶで処置されたＳＢＭＡマウスの生存中央値は、８１日齢であったが、注入されていない対照のＳＢＭＡマウスの生存中央値は、７５日齢であった（図１０Ｃ）。ＡＡＶで処置されたＳＢＭＡマウスと注入されていない対照との間の生存の差は、統計的に有意ではなかった。
【0172】
脳では、内因性マウスＡＲタンパク質及び変異ヒトＡＲタンパク質の両方の実質的なノックダウンが、ＡＡＶで処置されたＳＢＭＡマウスにおいてウエスタンブロットによって観察されたが、注入されていない対照では観察されなかった（図１０Ａ）。ウエスタンブロット定量化により、ＡＡＶで処置されたＳＢＭＡマウスは、注入されていないＳＢＭＡ対照マウスと比較して、脳内の内因性マウスＡＲタンパク質及び変異ヒトＡＲタンパク質の発現の約２倍の低減を示したことが明らかになった（図１０Ｂ）。
【0173】
ＡＡＶで処置されたＳＢＭＡマウス中で、変異ヒトＡＲタンパク質のより大きなノックダウンを示した動物において、より長い生存が観察された。注目すべきことに、動物１４０及び動物１６３は、変異ヒトＡＲタンパク質発現の最も大きい低減を示し、それぞれ１１１日及び１５８日の生存を有した（図１０Ａ）。対照的に、動物１４７、１４９、及び
１５４は、変異ヒトＡＲタンパク質のより高い発現を示し、７３日～８１日の範囲のより短い生存を有した（図１０Ａ、１０Ｃ）。
１５４は、変異ヒトＡＲタンパク質のより高い発現を示し、７３日～８１日の範囲のより短い生存を有した（図１０Ａ、１０Ｃ）。
【0174】
若年雄ＳＢＭＡマウス（３週齢）は、後眼窩静脈を介して、３．０×１０１１ＧＣの用量で、ＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧの単回ＩＶ投与を受けた。ＳＢＭＡマウスコロニー又は注入されていないＳＢＭＡマウスからの自然歴データは、歴史的対照としての役割を果たした。動物は、生存率（生存）について、毎日チェックされた。人道的エンドポイントでは、マウスを剖検し、脳を採取して、ウエスタンブロットによって、変異ヒトＡＲタンパク質及び内因性マウスＡＲタンパク質の発現を評価した。
【0175】
ＡＡＶ投与は、良好な忍容性であった。全てのマウスは、２／５又はそれ以下の身体状態スコア、マウスが自分自身を正すことができないこと、又は２つ以上の四肢の麻痺によって特徴付けられる疾患進行に起因する人道的エンドポイントに達した。
【0176】
ＡＡＶで処置されたＳＢＭＡマウスの生存中央値は、１０５．５日であったが、注入されていない歴史的対照ＳＢＭＡマウスは、９２日の生存中央値であった（図１１Ａ）。ＡＡＶで処置されたＳＢＭＡマウスと注入されていない歴史的対照との間の生存の差は、統計的に有意ではなかった。
【0177】
脳では、内因性マウスＡＲタンパク質及び変異ヒトＡＲタンパク質の両方の実質的なノックダウンが、ＡＡＶで処置されたＳＢＭＡマウスにおいてウエスタンブロットによって観察されたが、注入されていない歴史的対照では観察されなかった（図１１Ｂ）。ウエスタンブロット定量は、ＡＡＶ処置ＳＢＭＡマウスが、未注入のＳＢＭＡ履歴対照マウスと比較して、それぞれ約５倍及び８倍の内因性マウスＡＲタンパク質及びヒト変異ＡＲタンパク質の発現の低減を示したことを明らかにした（図１１Ｃ）。
【0178】
ＡＡＶで処置されたＳＢＭＡマウス中で、変異ヒトＡＲタンパク質のより大きなノックダウンを示した動物において、より長い生存が観察された。注目すべきことに、動物２２５、２２６、及び２３０は、変異ヒトＡＲタンパク質発現の最も大きい低減を示し、１１２～１２３日の範囲の生存を有した（図１１Ｂ）。対照的に、動物２３２、２３５、及び２３７は、変異ヒトＡＲタンパク質発現のそれほど実質的な低減を示さず、８７～９９日の範囲の短い生存を有した（図１１Ｂ）。
【0179】
新生児（ＰＮＤ０－１）の雄及び雌のＳＢＭＡマウスは、側頭静脈を介して、３．０×１０１１ＧＣの用量でのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ又はビヒクル（ＰＢＳ）のいずれかの単回ＩＶ投与を受けた。追加の年齢を一致させた雄及び雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（野生型）は、対照として、及びＰＮＤ２１付近の離乳後まで遺伝子型を確認できなかったため、側頭静脈を介して、３．０×１０１１ＧＣの用量でのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ又はビヒクル（ＰＢＳ）いずれかの単回ＩＶ投与を受けた。動物を生存率（生存）について毎日チェックし、体重を毎週測定した。両方の処置群からの雄マウスは、約９０日齢でワイヤーハング試験を受けた。人道的エンドポイントでは、マウスを剖検し、脳を採取して、ウエスタンブロットによって変異ヒトＡＲタンパク質及び内因性マウスＡＲタンパク質の発現を評価する。ＡＲタンパク質の発現を図１２Ａに示す。
【0180】
ＡＡＶ投与は、毎日の生存率チェックに基づいて良好な忍容性であった。これまでに剖検された全てのＳＢＭＡマウスは、不確定な原因により、５５日目、１６８日目、及び２３８日目に死亡したことが見出された３／４のＡＡＶで処置された雄のＳＢＭＡマウスを除いて、疾患進行（２／５若しくはそれ以下の身体状態スコア、マウスが自分自身を正す
ことができないこと、又は２つ以上の四肢の麻痺として定義される）により、人道的エンドポイントに達した。不明な原因により１０９日目及び１４３日目に死亡が見出された２／１１のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧで処置された雄の野生型マウスを除き、全ての野生型マウスは、依然として生存している。
ことができないこと、又は２つ以上の四肢の麻痺として定義される）により、人道的エンドポイントに達した。不明な原因により１０９日目及び１４３日目に死亡が見出された２／１１のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧで処置された雄の野生型マウスを除き、全ての野生型マウスは、依然として生存している。
【0181】
ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ投与は、性別を一致させたビヒクルで処置されたＳＢＭＡ対照マウスと比較した場合、雄及び雌のＳＢＭＡマウスの両方の生存中央値の実質的な増加をもたらした。雄マウスの中で、ビヒクルで処置されたＳＢＭＡマウスの生存中央値は１０１．５日であったが、ＧＴＰ－２１１で処置されたＳＢＭＡマウスについては、有意に長い２０３日の生存中央値が観察された。雌マウスでは、ビヒクルで処置されたＳＢＭＡマウスの生存中央値は１７５日であったが、全てのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧで処置されたＳＢＭＡマウス（Ｎ＝８／８）は、現在３６６～３７３日齢の範囲の年齢で生存しており、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ処置後の生存の有意な増加を示した（図１２Ｂ及び１２Ｃ）。
【0182】
雄及び雌のＧＴＰ－２１１で処置されたＳＢＭＡマウスの両方が、性別を一致させたビヒクルで処置されたＳＢＭＡ対照と比較して、経時的に改善された体重増加及び維持を示し、疾患進行に関連する体消耗性表現型の改善を示した（図１２Ｇ、１２Ｈ）。
【0183】
約９０日齢で、ワイヤーハング試験を雄マウスに対して実施して、筋力及び協調を評価した。ビヒクルで処置されたＳＢＭＡマウスは、ビヒクル及びＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧで処置された野生型対照と比較して、落下潜時の有意な低減を示した。対照的に、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ投与は、ビヒクルで処置されたＳＢＭＡマウスと比較して、ＳＭＢＡマウスにおける落下潜時の有意な増加をもたらした。更に、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧで処置された動物は、野生型マウスと同様に、この行動アッセイを実施し、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧが、ＳＢＭＡマウスにおける筋力及び協調を完全に維持したことを示した（図１２Ｉ）。
【0184】
実施例６：ＮＨＰにおけるＭＩＲ３６１０の評価
５歳の雄アカゲザルに、大槽内（ＩＣＭ）を介して、３×１０１３ＧＣのＡＡＶｈｕ．６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧを投与した。対照試料は、注入されていないＮＨＰ試料に由来した。３５日目にＮＨＰを屠殺した。脊髄を採取し、ホルマリンで固定し、レーザー捕捉微小解剖（ＬＣＭ）のために包埋した。ホルマリン固定パラフィン包埋ブロックを切断し、ＬＣＭに好適なＰＥＮ膜スライド上に配置した。運動ニューロンを、脊髄切片から切断した。ＲＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施した。また、肝臓を採取し、ＲＮＡ単離及びｑＰＣＲのために処理した。運動ニューロン（図１３Ａ）及び肝臓（図１３Ｂ）の両方が、ｍｉＲ３６１０での注入後、ＡＲ ｍＲＮＡレベルの有意な低減（約７５％）を示した。ＡＲタンパク質の発現は、ｍｉＲ３６１０での注入後にも低減した（図１３Ｃ）。ケージ側の観察、血清化学、全血球計数、神経伝導研究、並びにＣＳＦ化学及び細胞学を含む生存中の安全性エンドポイントは、３５日後にベクター関連の毒性の証拠を示さなかった。ＤＲＧを含むいずれの組織においても、重大な病理学的所見は観察されなかった。
５歳の雄アカゲザルに、大槽内（ＩＣＭ）を介して、３×１０１３ＧＣのＡＡＶｈｕ．６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧを投与した。対照試料は、注入されていないＮＨＰ試料に由来した。３５日目にＮＨＰを屠殺した。脊髄を採取し、ホルマリンで固定し、レーザー捕捉微小解剖（ＬＣＭ）のために包埋した。ホルマリン固定パラフィン包埋ブロックを切断し、ＬＣＭに好適なＰＥＮ膜スライド上に配置した。運動ニューロンを、脊髄切片から切断した。ＲＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施した。また、肝臓を採取し、ＲＮＡ単離及びｑＰＣＲのために処理した。運動ニューロン（図１３Ａ）及び肝臓（図１３Ｂ）の両方が、ｍｉＲ３６１０での注入後、ＡＲ ｍＲＮＡレベルの有意な低減（約７５％）を示した。ＡＲタンパク質の発現は、ｍｉＲ３６１０での注入後にも低減した（図１３Ｃ）。ケージ側の観察、血清化学、全血球計数、神経伝導研究、並びにＣＳＦ化学及び細胞学を含む生存中の安全性エンドポイントは、３５日後にベクター関連の毒性の証拠を示さなかった。ＤＲＧを含むいずれの組織においても、重大な病理学的所見は観察されなかった。
【0185】
実施例７：マウスＭＥＤ研究
この計画されたＧＬＰ準拠薬理学研究は、雄ＳＢＭＡマウスモデル（ＡＲ－９７Ｑマウス）における、ＩＶ投与されたＡＡＶｈｕ．６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧの有効性を評価し、ＭＥＤを決定することを目的とする。
この計画されたＧＬＰ準拠薬理学研究は、雄ＳＢＭＡマウスモデル（ＡＲ－９７Ｑマウス）における、ＩＶ投与されたＡＡＶｈｕ．６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧの有効性を評価し、ＭＥＤを決定することを目的とする。
【0186】
本研究は、Ｎ＝６０の新生児（ＰＮＤ０－１）雄ＳＢＭＡマウス、及び対照として、Ｎ＝１２の年齢を一致させた雄野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを評価する。この研究には、１つの剖検時点（１８０日）が含まれるであろう。４つの用量レベルのＡＡＶｈｕ．６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧを、ＩＶ投与を使用して評価するであろう。用量レベルは、成体アカゲザルＮＨＰで実施された完了したパイロット安全性及び薬理学研究に加えて、新生児ＳＢＭＡマウスの治療を評価する進行中の研究におけるＰＯＣ有効性データに基づいて選択されるであろう。評価された用量レベルは、予想される臨床用量を一括するであろう。
【0187】
現在、ＩＶ投与が、この研究のために計画されているが、新生児マウスでの進行中のパイロット研究では、疾患関連細胞型（脊髄運動ニューロン）を標的とするために、ＣＳＦへの直接のベクター送達のためのＩＣＶ経路を評価している（データはまだ利用できない）。同様の脊髄運動ニューロン標的化が、全身投与としてのＩＣＶ投与で達成され得る場合、この髄腔内経路を本研究に用いて、意図された臨床ＲＯＡ（ＩＣＭ投与）をより密接にモデル化するであろう。
【0188】
実施例８：ＧＬＰ ＮＨＰ薬理／毒性研究
１８０日のＧＬＰ準拠毒性研究は、成体雄アカゲザル（５～７歳）への低用量、中用量、又は高用量（Ｎ＝４／用量）での単回ＩＣＭ投与後の安全性、忍容性、薬理学（アカゲザルＡＲの人工ｍｉＲＮＡ媒介ノックダウン）、生体内分布、及び排出プロファイルを評価するであろう。追加の年齢を一致させた雄ＮＨＰに、対照としてビヒクル（ＩＴＦＦＢ）を投与するであろう（Ｎ＝２）。
１８０日のＧＬＰ準拠毒性研究は、成体雄アカゲザル（５～７歳）への低用量、中用量、又は高用量（Ｎ＝４／用量）での単回ＩＣＭ投与後の安全性、忍容性、薬理学（アカゲザルＡＲの人工ｍｉＲＮＡ媒介ノックダウン）、生体内分布、及び排出プロファイルを評価するであろう。追加の年齢を一致させた雄ＮＨＰに、対照としてビヒクル（ＩＴＦＦＢ）を投与するであろう（Ｎ＝２）。
【0189】
１４匹の成体雄アカゲザルは、画像ガイドによる大槽内（ＩＣＭ）を介して、３用量（用量当たり４ＮＨＰ、２ＮＨＰはビヒクルを受ける）のＡＡＶｈｕ．６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧうちの１つを受ける。半分を９０日で屠殺し、残りを１８０日で屠殺する。脊髄を採取し、ホルマリンで固定し、レーザー捕捉微小解剖（ＬＣＭ）のために包埋する。ホルマリン固定パラフィン包埋ブロックを切断し、ＬＣＭに好適なＰＥＮ膜スライド上に配置する。運動ニューロンを、脊髄切片から切断する。ＲＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施する。また、肝臓を採取し、ＲＮＡ単離及びｑＰＣＲのために処理する。以下の試験も実施される：ＣＢＣ／ｃｈｅｍ／Ｃｏａｇｓ、ＣＳＦ化学及び細胞学、盲検神経学的検査、神経伝導速度試験、並びに組織病理学。
【0190】
実施例９：ＳＢＭＡ新生児マウスにおけるＡＡＶｈｕ．６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧのＩＣＶ送達の評価
新生児ＳＢＭＡトランスジェニックマウスに、ＩＣＶを介して３ｅ１１ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ、又はＰＢＳを投与した。マウスを生存及び体重について追跡し、性別及び遺伝子型を決定した。マウスをワイヤーハング試験に供した。脳を、死亡時に採取し、ウエスタンブロッティングのために処理した。
新生児ＳＢＭＡトランスジェニックマウスに、ＩＣＶを介して３ｅ１１ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＡＲｍｉＲ３６１０．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ、又はＰＢＳを投与した。マウスを生存及び体重について追跡し、性別及び遺伝子型を決定した。マウスをワイヤーハング試験に供した。脳を、死亡時に採取し、ウエスタンブロッティングのために処理した。
【0191】
雄ＳＢＭＡマウスは、ＰＢＳで処置されたマウスで１３５日、ＡＡＶで処置されたマウスで１８１．５日の平均寿命を有した（図１４Ａ）。ＰＢＳで処置されたマウスの平均発病齢は、ＰＢＳで処置された場合、８０日、ＡＡＶで処置されたマウスでは１５０日であった（図１４Ａ）。ＰＢＳで処置されたＨｅｔは、ＰＢＳで処置されたＷＴ及びＡＡＶで処置されたＨｅｔと比較して、つり下がり時間を有意に低減させた（図１４Ｂ）。ＰＢＳで処置されたＨｅｔについて、１４週（図１４Ｃ）及び１６週（図１４Ｄ）でのつり下がり時間が著しく減少した。
【0192】
実施例１０：第Ｉ／ＩＩ相臨床試験
ヒトにおける第Ｉ／ＩＩ相臨床試験が提案されている。このプロトコルには、最近のＦＤＡプレＩＮＤフィードバック及び同様の用途の業界向けガイダンスが組み込まれている。用量漸増／安全性研究はまた、主要なバイオマーカー（ＭＲＩによって測定された大腿筋容積）の評価を可能にするように設計されている。同時無作為化対照（ＦＤＡ当たり）は、比較データを提供する。
ヒトにおける第Ｉ／ＩＩ相臨床試験が提案されている。このプロトコルには、最近のＦＤＡプレＩＮＤフィードバック及び同様の用途の業界向けガイダンスが組み込まれている。用量漸増／安全性研究はまた、主要なバイオマーカー（ＭＲＩによって測定された大腿筋容積）の評価を可能にするように設計されている。同時無作為化対照（ＦＤＡ当たり）は、比較データを提供する。
【0193】
２つのベクター用量の安全性及び忍容性を評価する。合計１２人の対象が登録され、ベクター：プラセボが２：１で無作為化される。ベクター群に無作為化された８人の対象：低用量で２人、高用量で２人、ＭＴＤで４人。最初の４人の対象については、後続の対象の投薬前にＤＳＭＢによって３０日間のデータがレビューされた。プラセボ群に無作為化された４人の対象。１年での安全性及びＭＲＩ変化の分析、５年の長期フォローアップ。
【0194】
２９人のＳＢＭＡ患者のデンマーク自然歴研究を１８か月間追跡した（Ｄａｈｌｑｖｉｓｔ ＪＲ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｏｕｔｃｏｍｅ ｍｅａｓｕｒｅｓ ｉｎ ｓｐｉｎｏｂｕｌｂａｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１８ Ｎｏｖ；８４（５）：７５４－７６５（参照により本明細書に援用される））。Ｄａｈｌｑｖｉｓｔは、複数の筋肉の複合Ｄｉｘｏｎ ＭＲＩスコアが非常に有意な低下を示し、臨床試験でのＭＲＩスコアの使用を検証した。また、６ＭＷＴ、階段上昇、及び握力の統計的に有意な低下が示されたが、これらの転帰測定は介入試験でより大きな力を必要とする。
【0195】
本明細書に引用される全ての文書は、「２１－９５５７．ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」とラベル付けされた配列表と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。加えて、米国仮出願第６３／２９３，５０５号、同第６３／１８７，８８３号、及び同第６３／１７３，８８５号は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されよう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。
【0196】
（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、数値識別子＜２２３＞の下でフリーテキストを含む配列を提供する。
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【表2】
【図1A-1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図12E】
【図12F】
【図12G】
【図12H】
【図12I】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14A】
【図14B】
【図14C-14D】
【配列表】
【国際調査報告】